JPWO2012077649A1 - ヒトモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
[項1]
ヒトCD81に対する抗体であって、配列番号:22に記載のアミノ酸配列中80番目のアミノ酸から175番目のアミノ酸領域に結合する抗体。
[項2]
結合するアミノ酸領域が113番目のアミノ酸から175番目のアミノ酸領域である項1に記載の抗体。
[項3]
下記(1)〜(13)のいずれかに記載のヒトCD81変異体に対する結合親和性が、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に対する結合親和性を100%として、40%未満である項1または項2に記載の抗体。
(1)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の127番目のチロシンをフェニルアラニンまたはトリプトファンに置換したCD81変異体
(2)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の130番目のアラニンをスレオニンまたはバリンに置換したCD81変異体
(3)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の135番目のバリンをアラニンまたはロイシンに置換したCD81変異体
(4)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の137番目のアスパラギン酸をアラニンまたはグルタミン酸に置換したCD81変異体
(5)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の143番目のアラニンをスレオニンまたはバリンに置換したCD81変異体
(6)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の151番目のヒスチジンをアラニンまたはアルギニンに置換したCD81変異体
(7)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の154番目のロイシンをアラニンまたはイソロイシンに置換したCD81変異体
(8)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の158番目のグリシンをアラニンまたはセリンに置換したCD81変異体
(9)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の164番目のアラニンをスレオニンまたはバリンに置換したCD81変異体
(10)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の168番目のセリンをアラニンまたはスレオニンに置換したCD81変異体
(11)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の169番目のバリンをアラニンまたはロイシンに置換したCD81変異体
(12)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の170番目のロイシンをアラニンまたはイソロイシンに置換したCD81変異体
(13)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の172番目のアスパラギンをアラニンまたはグルタミンに置換したCD81変異体。
[項4]
前記(9)及び(11)に記載のヒトCD81変異体に対する結合親和性が、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に対する結合親和性を100%として、40%未満である項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
[項5]
項1〜4のいずれか1項に記載の抗体と同等の結合特性を有するか、もしくは、項1〜4のいずれか1項に記載の抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、抗体。
[項6]
項1〜4のいずれか1項に記載の抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合し、かつT細胞遊走抑制作用を有する抗体。
[項7]
下記群1〜24のうち、いずれか1つの群に記載の6種のCDRをすべて含む、ヒトCD81に対する抗体。
群1
(a−1)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−1)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−1)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−1)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−1)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−1)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群2
(a−2)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−2)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−2)配列番号:37で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−2)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−2)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−2)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群3
(a−3)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−3)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−3)配列番号:40で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−3)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−3)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−3)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群4
(a−4)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−4)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−4)配列番号:43で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−4)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−4)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−4)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群5
(a−5)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−5)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−5)配列番号:46で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−5)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−5)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−5)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群6
(a−6)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−6)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−6)配列番号:49で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−6)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−6)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−6)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群7
(a−7)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−7)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−7)配列番号:52で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−7)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−7)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−7)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群8
(a−8)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−8)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−8)配列番号:43で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−8)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−8)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−8)配列番号:55で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群9
(a−9)配列番号:60で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−9)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−9)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−9)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−9)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−9)配列番号:61で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群10
(a−10)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−10)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−10)配列番号:66で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−10)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−10)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−10)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群11
(a−11)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−11)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−11)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−11)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−11)配列番号:69で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−11)配列番号:70で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群12
(a−12)配列番号:60で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−12)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−12)配列番号:66で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−12)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−12)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−12)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群13
(a−13)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−13)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−13)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−13)配列番号:77で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−13)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−13)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群14
(a−14)配列番号:80で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−14)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−14)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−14)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−14)配列番号:81で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−14)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群15
(a−15)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−15)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−15)配列番号:66で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−15)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−15)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−15)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群16
(a−16)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−16)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−16)配列番号:90で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−16)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−16)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−16)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群17
(a−17)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−17)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−17)配列番号:52で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−17)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−17)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−17)配列番号:93で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群18
(a−18)配列番号:98で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−18)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−18)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−18)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−18)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−18)配列番号:99で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群19
(a−19)配列番号:60で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−19)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−19)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−19)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−19)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−19)配列番号:99で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群20
(a−20)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−20)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−20)配列番号:90で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−20)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−20)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−20)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群21
(a−21)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−21)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−21)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−21)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−21)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−21)配列番号:55で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群22
(a−22)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−22)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−22)配列番号:66で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−22)配列番号:110で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−22)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−22)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群23
(a−23)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−23)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−23)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−23)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−23)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−23)配列番号:115で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群24
(a−24)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−24)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−24)配列番号:90で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−24)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−24)配列番号:120で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−24)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR。
[項8]
下記群25〜48のうち、いずれか1つの群に記載の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の組み合わせを含む項7に記載の抗体。
群25
(g−1)前記(a−1)〜(c−1)を含む軽鎖可変領域及び
(h−1)前記(d−1)〜(f−1)を含む重鎖可変領域
群26
(g−2)前記(a−2)〜(c−2)を含む軽鎖可変領域及び
(h−2)前記(d−2)〜(f−2)を含む重鎖可変領域
群27
(g−3)前記(a−3)〜(c−3)を含む軽鎖可変領域及び
(h−3)前記(d−3)〜(f−3)を含む重鎖可変領域
群28
(g−4)前記(a−4)〜(c−4)を含む軽鎖可変領域及び
(h−4)前記(d−4)〜(f−4)を含む重鎖可変領域
群29
(g−5)前記(a−5)〜(c−5)を含む軽鎖可変領域及び
(h−5)前記(d−5)〜(f−5)を含む重鎖可変領域
群30
(g−6)前記(a−6)〜(c−6)を含む軽鎖可変領域及び
(h−6)前記(d−6)〜(f−6)を含む重鎖可変領域
群31
(g−7)前記(a−7)〜(c−7)を含む軽鎖可変領域及び
(h−7)前記(d−7)〜(f−7)を含む重鎖可変領域
群32
(g−8)前記(a−8)〜(c−8)を含む軽鎖可変領域及び
(h−8)前記(d−8)〜(f−8)を含む重鎖可変領域
群33
(g−9)前記(a−9)〜(c−9)を含む軽鎖可変領域及び
(h−9)前記(d−9)〜(f−9)を含む重鎖可変領域
群34
(g−10)前記(a−10)〜(c−10)を含む軽鎖可変領域及び
(h−10)前記(d−10)〜(f−10)を含む重鎖可変領域
群35
(g−11)前記(a−11)〜(c−11)を含む軽鎖可変領域及び
(h−11)前記(d−11)〜(f−11)を含む重鎖可変領域
群36
(g−12)前記(a−12)〜(c−12)を含む軽鎖可変領域及び
(h−12)前記(d−12)〜(f−12)を含む重鎖可変領域
群37
(g−13)前記(a−13)〜(c−13)を含む軽鎖可変領域及び
(h−13)前記(d−13)〜(f−13)を含む重鎖可変領域
群38
(g−14)前記(a−14)〜(c−14)を含む軽鎖可変領域及び
(h−14)前記(d−14)〜(f−14)を含む重鎖可変領域
群39
(g−15)前記(a−15)〜(c−15)を含む軽鎖可変領域及び
(h−15)前記(d−15)〜(f−15)を含む重鎖可変領域
群40
(g−16)前記(a−16)〜(c−16)を含む軽鎖可変領域及び
(h−16)前記(d−16)〜(f−16)を含む重鎖可変領域
群41
(g−17)前記(a−17)〜(c−17)を含む軽鎖可変領域及び
(h−17)前記(d−17)〜(f−17)を含む重鎖可変領域
群42
(g−18)前記(a−18)〜(c−18)を含む軽鎖可変領域及び
(h−18)前記(d−18)〜(f−18)を含む重鎖可変領域
群43
(g−19)前記(a−19)〜(c−19)を含む軽鎖可変領域及び
(h−19)前記(d−19)〜(f−19)を含む重鎖可変領域
群44
(g−20)前記(a−20)〜(c−20)を含む軽鎖可変領域及び
(h−20)前記(d−20)〜(f−20)を含む重鎖可変領域
群45
(g−21)前記(a−21)〜(c−21)を含む軽鎖可変領域及び
(h−21)前記(d−21)〜(f−21)を含む重鎖可変領域
群46
(g−22)前記(a−22)〜(c−22)を含む軽鎖可変領域及び
(h−22)前記(d−22)〜(f−22)を含む重鎖可変領域
群47
(g−23)前記(a−23)〜(c−23)を含む軽鎖可変領域及び
(h−23)前記(d−23)〜(f−23)を含む重鎖可変領域
群48
(g−24)前記(a−24)〜(c−24)を含む軽鎖可変領域及び
(h−24)前記(d−24)〜(f−24)を含む重鎖可変領域。
[項9]
下記群49〜72のうち、いずれか1つの群に記載の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の組み合わせを含む項8に記載の抗体。
群49
(i−1)配列番号:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−1)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群50
(i−2)配列番号:38に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−2)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群51
(i−3)配列番号:41に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−3)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群52
(i−4)配列番号:44に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−4)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群53
(i−5)配列番号:47に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−5)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群54
(i−6)配列番号:50に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−6)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群55
(i−7)配列番号:53に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−7)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群56
(i−8)配列番号:56に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−8)配列番号:57に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群57
(i−9)配列番号:62に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−9)配列番号:63に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群58
(i−10)配列番号:67に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−10)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群59
(i−11)配列番号:71に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−11)配列番号:72に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群60
(i−12)配列番号:75に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−12)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群61
(i−13)配列番号:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−13)配列番号:78に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群62
(i−14)配列番号:82に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−14)配列番号:83に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群63
(i−15)配列番号:86に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−15)配列番号:87に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群64
(i−16)配列番号:91に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−16)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群65
(i−17)配列番号:94に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−17)配列番号:95に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群66
(i−18)配列番号:100に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−18)配列番号:101に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群67
(i−19)配列番号:104に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−19)配列番号:101に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群68
(i−20)配列番号:106に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−20)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群69
(i−21)配列番号:108に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−21)配列番号:57に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群70
(i−22)配列番号:111に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−22)配列番号:112に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群71
(i−23)配列番号:116に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−23)配列番号:117に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群72
(i−24)配列番号:121に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−24)配列番号:122に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
[項10]
下記群73〜96のうち、いずれか1つの群に記載の軽鎖及び重鎖の組み合わせを含む項8または項9に記載の抗体。
群73
(k−1)配列番号:26に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−1)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群74
(k−2)配列番号:39に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−2)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群75
(k−3)配列番号:42に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−3)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群76
(k−4)配列番号:45に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−4)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群77
(k−5)配列番号:48に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−5)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群78
(k−6)配列番号:51に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−6)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群79
(k−7)配列番号:54に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−7)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群80
(k−8)配列番号:58に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−8)配列番号:59に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群81
(k−9)配列番号:64に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−9)配列番号:65に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群82
(k−10)配列番号:68に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−10)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群83
(k−11)配列番号:73に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−11)配列番号:74に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群84
(k−12)配列番号:76に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−12)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群85
(k−13)配列番号:26に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−13)配列番号:79に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群86
(k−14)配列番号:84に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−14)配列番号:85に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群87
(k−15)配列番号:88に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−15)配列番号:89に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群88
(k−16)配列番号:92に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−16)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群89
(k−17)配列番号:96に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−17)配列番号:97に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群90
(k−18)配列番号:102に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−18)配列番号:103に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群91
(k−19)配列番号:105に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−19)配列番号:103に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群92
(k−20)配列番号:107に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−20)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群93
(k−21)配列番号:109に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−21)配列番号:59に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群94
(k−22)配列番号:113に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−22)配列番号:114に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群95
(k−23)配列番号:118に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−23)配列番号:119に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群96
(k−24)配列番号:123に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−24)配列番号:124に示されるアミノ酸配列を含む重鎖。
[項11]
項7〜10のいずれか1項に記載の抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、抗体。
[項12]
項11に記載の抗体であって、T細胞遊走抑制作用を有する抗体。
[項13]
項7に記載の群1〜群24のいずれか1つの群に記載の6種から選択される少なくとも1つのCDRを含む抗体であって、当該群の6種のCDRをすべて含むヒトCD81に対する抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、ヒトCD81に対する抗体。
[項14]
項7に記載のいずれか1つの抗体と90%以上の相同性を持ち、当該抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、ヒトCD81に対する抗体。
[項15]
下記CDRを含むヒトCD81に対する抗体。
(a−25)配列番号:11で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−25)配列番号:12で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−25)配列番号:13で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−25)配列番号:14で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−25)配列番号:15で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−25)配列番号:16で示されるアミノ酸配列を含むCDR。
[項16]
下記可変領域を含む項15に記載の抗体。
(g−25)前記(a−25)〜(c−25)を含む軽鎖可変領域及び
(h−25)前記(d−25)〜(f−25)を含む重鎖可変領域。
[項17]
下記可変領域を含む項16に記載の抗体。
(i−25)配列番号:18に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−25)配列番号:20に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
[項18]
下記軽鎖及び重鎖を含む項16または項17に記載の抗体。
(k−25)配列番号:30に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−25)配列番号:32に示されるアミノ酸配列を含む重鎖。
[項19]
項15〜18のいずれか1項に記載の抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、抗体。
[項20]
項19に記載の抗体であって、T細胞遊走抑制作用を有する抗体。
[項21]
項15に記載の少なくとも1つのCDRを含む抗体であって、項15に記載の抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、ヒトCD81に対する抗体。
[項22]
項15に記載の抗体と90%以上の相同性を持ち、当該抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、ヒトCD81に対する抗体。
[項23]
ヒト化抗体もしくはヒト抗体である項1〜6、11〜14及び19〜22のいずれか1項に記載の抗体。
[項24]
ヒト化抗体もしくはヒト抗体である項7〜10及び15〜18のいずれか1項に記載の抗体。
[項25]
項1〜24のいずれか1項に記載の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
[項26]
項1〜6、11〜14及び19〜23のいずれか1項に記載の抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、項1〜6、11〜14及び19〜23のいずれか1項に記載の抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの組み合わせ。
[項27]
項7〜10、15〜18及び24のいずれか1項に記載の抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、項7〜10、15〜18及び24のいずれか1項に記載の、重鎖可変領域に対応する軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの組み合わせ。
[項28]
項1〜24のいずれか1項に記載の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
[項29]
項1〜6、11〜14及び19〜23のいずれか1項に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、項1〜6、11〜14及び19〜23のいずれか1項に記載の抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの組み合わせ。
[項30]
項7〜10、15〜18及び24のいずれか1項に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、項7〜10、15〜18及び24のいずれか1項に記載の、重鎖に対応する軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの組み合わせ。
[項31]
項25または28に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[項32]
項31に記載の発現ベクターにより形質転換した組換え細胞。
[項33]
項1〜6、11〜14及び19〜22のいずれか1項に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、項1〜6、11〜14及び19〜22のいずれか1項に記載の抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換した組換え細胞。
[項34]
項7〜10、15〜18及び24のいずれか1項に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、項7〜10、15〜18及び24のいずれか1項に記載の、重鎖に対応する軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換した組換え細胞。
[項35]
項32〜34のいずれか1項に記載の組換え細胞を培養し、得られた培養上清から抗体を回収することからなる、抗ヒトCD81抗体の製造方法。
[項36]
項1〜24のいずれか1項に記載の抗体を含有する、医薬組成物。
[項37]
項1〜24のいずれか1項に記載の抗体を有効成分とする、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬または血液がんの予防、改善または治療剤。
[項38]
前記(3)、(4)、(8)、(11)及び(12)に記載のヒトCD81変異体に対する結合親和性が、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に対する結合親和性を100%として、40%未満である項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
[項39]
前記(3)、(4)、(6)及び(8)〜(13)に記載のヒトCD81変異体に対する結合親和性が、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に対する結合親和性を100%として、40%未満である項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
[項40]
前記(1)〜(5)、(7)、(8)、(11)及び(12)に記載のヒトCD81変異体に対する結合親和性が、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に対する結合親和性を100%として、40%未満である項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
本明細書において「遺伝子」又は「DNA」とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各1本鎖DNAを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子(DNA)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む2本鎖DNA、cDNAを含む1本鎖DNA(正鎖)及び該正鎖と相補的な配列を有する1本鎖DNA(相補鎖)、並びにこれらの断片のいずれもが含まれる。
本明細書において「CD81遺伝子」の用語は、配列番号:21で示されるヒトCD81遺伝子(DNA)又はその天然の変異体もしくは多型バリアント(Polymorphic variant)(但し、当該変異もしくは多型の結果として、後述の(1)〜(13)の変異体タンパク質を生じるものを除く)を意味する。これらの変異体・多型バリアントとしては、例えばNCBIの提供するSNPデータベースに登録されているものが挙げられる。
本明細書において「CD81タンパク質」又は単に「CD81」といった用語は配列番号:22で示されるヒトCD81タンパク質又は上記天然の変異体もしくは多型バリアントDNAにコードされるタンパク質を意味する。
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、又はFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
本明細書においてエピトープとは、抗体が結合する抗原の領域である。ある種の実施形態では、免疫グロブリン又はT細胞レセプター又はB細胞レセプターに特異的に結合し得る抗原の任意の部位を含む。抗原決定基は、分子の化学的に活性な表面基、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基又はスルホニル基を含み、ある種の実施形態では、特異的な三次元構造特徴及び/又は特異的な荷電特徴を有してよい。ある種の実施形態では、抗体は、タンパク質及び/又は巨大分子の複雑な混合物において、この抗体が標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合するということができる。
抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量5-7万の重鎖と2-3万の軽鎖から構成される(免疫学イラストレイテッド (I. Roitt, J. Brostoff, D. Male編))。重鎖は、通常約440個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにIgGには、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4が存在し、それぞれγ1、γ2、γ3、γ4とよばれている。軽鎖は、通常約220個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、L型とK型の2種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な2本の重鎖及び2本の軽鎖が、ジスルフィド結合(S-S結合)及び非共有結合によって結合され、分子量15-19万である。2種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖2本と同一の重鎖2本からできている。
002-A07抗体の場合、重鎖可変領域のCDRは、配列番号:10で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号29〜42(CDR1-H)、49〜67(CDR2-H)及び97〜108(CDR3-H)であり、軽鎖可変領域のCDRは、配列番号:8で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号22〜36(CDR1-L)、52〜58(CDR2-L)及び90〜101(CDR3-L)の残基によって境界を示される。また、005-C01抗体の場合、重鎖可変領域のCDRは、配列番号:20で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号29〜42(CDR1-H)、49〜67(CDR2-H)及び97〜102(CDR3-H)であり、軽鎖可変領域のCDRは、配列番号:18で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号22〜35(CDR1-L)、51〜57(CDR2-L)及び89〜99(CDR3-L)の残基によって境界を示される。
抗体結合性の確認は任意の周知のアッセイ方法、例えば、直接及び間接サンドイッチアッセイ、フローサイトメトリー及び免疫沈降アッセイ等で行うことができる(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, (CRC Press, Inc. 1987) pp. 147-158)。本発明において、抗ヒトCD81ヒトモノクローナル抗体のヒトCD81ポリペプチド又はそれを表面上に提示する細胞との結合は、例えば、以下の方法に従って測定することができる。
本発明の抗ヒトCD81ヒトモノクローナル抗体の結合定数(Ka)の測定や、既に得られた本発明の抗体と競合的にヒトCD81に結合する本発明の他の抗体の同定には、競合ELISAなどの競合アッセイを用いることができる。競合アッセイは、上記の抗原固定化固相を用いる結合アッセイにおいて、固相と被検抗体との反応系に遊離の抗原もしくは既知抗体を共存させることにより実施される。例えば、既知濃度の被検抗体液、並びに種々の濃度の抗原を該被検抗体液に加えた混合液を抗原固定化固相に接触させてインキュベートし、固相上の標識量をそれぞれ測定する。各遊離抗原濃度における測定値からスキャッチャード解析を行い、グラフの傾きを結合定数として算出することができる。一方、抗原固定化固相に対して、標識した既知抗体(本発明の抗体)と、種々の濃度の被検抗体とを反応させ、固相上の標識量を濃度依存的に減少させた被検抗体を選択することにより、本発明の抗体と競合的にヒトCD81に結合する抗体を同定することができる。
本発明の抗体は、配列番号:22に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号80〜175、好ましくはアミノ酸番号113〜175のアミノ酸配列からなるペプチド領域に結合し得る抗ヒトCD81抗体、あるいは該抗体と競合的に、配列番号:22に示されるアミノ酸配列からなるヒトCD81に結合する抗体である。配列番号:22に示されるアミノ酸配列は、報告されているヒトCD81タンパク質のアミノ酸配列であり(EMBO J., 20: 12-18, 2001)、NCBIデータベースにRefseq ID: NP_004347として登録されている。本明細書では以後、該アミノ酸配列からなるタンパク質を、「天然のヒトCD81」、「野生型CD81」もしくは「野生型ヒトCD81」とも称する。
エピトープ解析は、公知の種々の方法で実施しうる(Epitope Mapping Protocols/Second Edition, Mike Schutkowski, Ulrich Reineke, Ann N Y Acad Sci. 2010 Jan;1183:267-87.)。本抗体のエピトープのより詳細な解析は、結合阻害アッセイ、ホモログスキャン及び/又はアラニンスキャンにより実施することができる(例えば、特開2009-159948号公報、Science, 244: 1081-1085 (1989))。
ホモログスキャンは、野生型ヒトCD81ポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸を他のホモログアミノ酸へ置換することにより、どのアミノ酸残基が活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失され得るかを決定する方法であり、この方法により、ヒトCD81ポリペプチドの配列を既知の相同タンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内に生じるアミノ酸配列変化の数を最小にする(Protein Science (2005),14,2405)。
(1) 野生型ヒトCD81の127番目のチロシン(Y)をフェニルアラニン(F)又はトリプトファン(W)に置換したCD81変異体(Y127F又はY127W)
(2) 野生型ヒトCD81の130番目のアラニン(A)をスレオニン(T)又はバリン(V)に置換したCD81変異体(A130T又はA130V)
(3) 野生型ヒトCD81の135番目のバリン(V)をアラニン又はロイシンに置換したCD81変異体(V135A又はV135L)
(4) 野生型ヒトCD81の137番目のアスパラギン酸(D)をアラニン(A)又はグルタミン酸(E)に置換したCD81変異体(D137A又はD137E)
(5) 野生型ヒトCD81の143番目のアラニン(A)をスレオニン(T)又はバリン(V)に置換したCD81変異体(A143T又はA143V)
(6) 野生型ヒトCD81の151番目のヒスチジン(H)をアラニン(A)又はアルギニン(R)に置換したCD81変異体(H151A又はH151R)
(7) 野生型ヒトCD81の154番目のロイシン(L)をアラニン(A)又はイソロイシン(I)に置換したCD81変異体(L154A又はL154I)
(8) 野生型ヒトCD81の158番目のグリシン(G)をアラニン(A)又はセリン(S)に置換したCD81変異体(G158A又はG158S)
(9) 野生型ヒトCD81の164番目のアラニン(A)をスレオニン(T)又はバリン(V)に置換したCD81変異体(A164T又はA164V)
(10) 野生型ヒトCD81の168番目のセリン(S)をアラニン(A)又はスレオニン(T)に置換したCD81変異体(S168A又はS168T)
(11) 野生型ヒトCD81の169番目のバリン(V)をアラニン(A)又はロイシン(L)に置換したCD81変異体(V169A又はV169L)
(12) 野生型ヒトCD81の170番目のロイシン(L)をアラニン(A)又はイソロイシン(I)に置換したCD81変異体(L170A又はL170I)
(13) 野生型ヒトCD81の172番目のアスパラギン(N)をアラニン(A)又はグルタミン(Q)に置換したCD81変異体(N172A又はN172Q)
(ここで、置換されるアミノ酸残基の位置は配列番号:22に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号で表す。)
別の好ましい態様においては、本発明の抗体は、野生型ヒトCD81に対する結合親和性を100%としたときの、上記(1)〜(5)、(7)、(8)、(11)及び(12)の各変異ヒトCD81に対する結合親和性が40%未満であることを特徴とする。当該結合特性を有する抗体シリーズについては、下記(ii)にて詳述する。尚、本抗体と、上記した下記(i)の具体的実施態様の抗体との間で、野生型ヒトCD81に対する結合親和性を100%としたときの相対結合親和性が40%未満である共通した変異ヒトCD81は上記(3)、(4)、(8)、(11)及び(12)の各変異ヒトCD81である。
好ましい一実施態様としては、野生型ヒトCD81に対する結合親和性を100%としたときの、上記(9)及び(11)の各変異ヒトCD81に対する結合親和性が40%未満である抗体である。
(1) 下記群1〜24:
群1
(a−1)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−1)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−1)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−1)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−1)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−1)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群2
(a−2)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−2)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−2)配列番号:37で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−2)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−2)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−2)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群3
(a−3)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−3)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−3)配列番号:40で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−3)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−3)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−3)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群4
(a−4)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−4)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−4)配列番号:43で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−4)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−4)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−4)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群5
(a−5)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−5)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−5)配列番号:46で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−5)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−5)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−5)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群6
(a−6)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−6)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−6)配列番号:49で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−6)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−6)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−6)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群7
(a−7)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−7)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−7)配列番号:52で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−7)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−7)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−7)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群8
(a−8)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−8)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−8)配列番号:43で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−8)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−8)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−8)配列番号:55で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群9
(a−9)配列番号:60で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−9)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−9)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−9)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−9)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−9)配列番号:61で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群10
(a−10)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−10)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−10)配列番号:66で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−10)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−10)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−10)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群11
(a−11)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−11)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−11)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−11)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−11)配列番号:69で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−11)配列番号:70で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群12
(a−12)配列番号:60で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−12)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−12)配列番号:66で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−12)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−12)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−12)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群13
(a−13)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−13)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−13)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−13)配列番号:77で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−13)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−13)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群14
(a−14)配列番号:80で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−14)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−14)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−14)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−14)配列番号:81で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−14)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群15
(a−15)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−15)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−15)配列番号:66で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−15)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−15)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−15)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群16
(a−16)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−16)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−16)配列番号:90で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−16)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−16)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−16)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群17
(a−17)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−17)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−17)配列番号:52で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−17)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−17)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−17)配列番号:93で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群18
(a−18)配列番号:98で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−18)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−18)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−18)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−18)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−18)配列番号:99で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群19
(a−19)配列番号:60で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−19)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−19)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−19)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−19)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−19)配列番号:99で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群20
(a−20)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−20)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−20)配列番号:90で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−20)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−20)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−20)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群21
(a−21)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−21)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−21)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−21)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−21)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−21)配列番号:55で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群22
(a−22)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−22)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−22)配列番号:66で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−22)配列番号:110で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−22)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−22)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群23
(a−23)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−23)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−23)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−23)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−23)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−23)配列番号:115で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群24
(a−24)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−24)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−24)配列番号:90で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−24)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−24)配列番号:120で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−24)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
のうち、いずれか1つの群に記載の6種のCDRをすべて含む抗体、又は
(2) (a−X)〜(f−X)(Xは1〜24、以下同じ)に示されるアミノ酸配列より選択される1以上(例、1、2、3、4、5もしくは6)のアミノ酸配列において、1以上、好ましくは1〜数(例、1、2、3、4もしくは5)個のアミノ酸残基が置換及び/又は欠失及び/又は付加及び/又は挿入された上記(a−X)〜(f−X)のCDRを含む抗体であって、上記のいずれかの抗体の結合特性と同等の結合特性を有するか、あるいは、上記のいずれかの抗体と競合的に野生型ヒトCD81に結合する抗体である。ここで「同等の結合特性」とは、少なくとも野生型ヒトCD81ポリペプチドの80番目〜175番目もしくは113番目〜175番目のアミノ酸残基からなるペプチド領域と結合することを意味し、好ましくは、さらに、野生型ヒトCD81に対する結合親和性を100%とすると、上記(1)〜(13)より選択される少なくとも1つのヒトCD81変異体(より好ましくは変異体(9)及び(11))と40%未満の結合親和性で結合することを意味する。
上記(2)の抗体は、例えば、上記(1)の抗体の可変領域の塩基配列をコードするベクターを鋳型とし、PCRを用いて網羅的に変異を導入することで、ファージディスプレイ変異抗体ライブラリーを調製し、ヒトCD81に対する結合活性、あるいは上記(1)の抗体との競合的結合を指標にしてライブラリーをスクリーニングし、パニングを行う等、公知の方法により得ることができる。
抗体の結合特性及び競合的結合は、上述の種々の結合アッセイ及び競合アッセイにより測定することができる。アッセイの結果、「同等の結合特性」又は「競合的結合」が確認されれば、次いで、その治療作用を後で詳述する細胞遊走試験により試験することができる。
(1) 上記(a−X)〜(c−X)のCDRを含む軽鎖可変領域と、上記(d−X)〜(f−X)のCDRを含む重鎖可変領域とを含む抗体、又は
(2) (a−X)〜(f−X)に示されるアミノ酸配列より選択される1以上(例、1、2、3、4、5もしくは6)のアミノ酸配列において、1以上、好ましくは1〜数(例、1、2、3、4もしくは5)個のアミノ酸残基が置換及び/又は欠失及び/又は付加及び/又は挿入された上記(1)の軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体であって、上記のいずれかの抗体の結合特性と同等の結合特性を有するか、あるいは、上記のいずれかの抗体と競合的に野生型ヒトCD81に結合する抗体である。ここで「同等の結合特性」とは上記と同義である。
(1) (i−X)に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(j−X)に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む抗体、又は
(2) (i−X)及び(j−X)のいずれか一方もしくは両方において、1以上、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、いっそう好ましくは1〜数(例、1、2、3、4もしくは5)個のアミノ酸残基が置換及び/又は欠失及び/又は付加及び/又は挿入された上記(1)の軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体であって、上記のいずれかの抗体の結合特性と同等の結合特性を有するか、あるいは、上記のいずれかの抗体と競合的に野生型ヒトCD81に結合する抗体である。ここで「同等の結合特性」とは上記と同義である。
別の好ましい実施態様としては、野生型ヒトCD81に対する結合親和性を100%としたときの、上記(1)〜(5)、(7)、(8)、(11)及び(12)の各変異ヒトCD81に対する結合親和性が40%未満である抗体である。
(1)(a−25)配列番号:11に示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−25)配列番号:12に示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−25)配列番号:13に示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−25)配列番号:14に示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−25)配列番号:15に示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−25)配列番号:16に示されるアミノ酸配列を含むCDR
を有する抗体、又は
(2) 配列番号:11〜16に示されるアミノ酸配列より選択される1以上(例、1、2、3、4、5もしくは6)のアミノ酸配列において、1以上、好ましくは1〜数(例、1、2、3、4もしくは5)個のアミノ酸残基が置換及び/又は欠失及び/又は付加及び/又は挿入された上記(a−25)〜(f−25)のCDRを含む抗体であって、上記のいずれかの抗体の結合特性と同等の結合特性を有するか、あるいは、上記のいずれかの抗体と競合的に野生型ヒトCD81に結合する抗体である。ここで「同等の結合特性」とは上記と同義である。
抗原の結合特性及び競合的結合は、上述の種々の結合アッセイ及び競合アッセイにより測定することができる。アッセイの結果、「同等の結合特性」又は「競合的結合」が確認されれば、次いで、その治療作用を後で詳述する細胞遊走試験により試験することができる。
(1) 上記(a−25)〜(c−25)のCDRを含む軽鎖可変領域と、上記(d−25)〜(f−25)のCDRを含む重鎖可変領域とを含む抗体、又は
(2) 配列番号:11〜16に示されるアミノ酸配列より選択される1以上(例、1、2、3、4、5もしくは6)のアミノ酸配列において、1以上、好ましくは1〜数(例、1、2、3、4もしくは5)個のアミノ酸残基が置換及び/又は欠失及び/又は付加及び/又は挿入された上記(1)の軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体であって、上記のいずれかの抗体の結合特性と同等の結合特性を有するか、あるいは、上記のいずれかの抗体と競合的に野生型ヒトCD81に結合する抗体である。ここで「同等の結合特性」とは上記と同義である。
(1) 配列番号:18に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:20に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む抗体、又は
(2) 配列番号:18及び20のいずれか一方もしくは両方において、1以上、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、いっそう好ましくは1〜数(例、1、2、3、4もしくは5)個のアミノ酸残基が置換及び/又は欠失及び/又は付加及び/又は挿入された上記(1)の軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体であって、上記のいずれかの抗体の結合特性と同等の結合特性を有するか、あるいは、上記のいずれかの抗体と競合的に野生型ヒトCD81に結合する抗体である。ここで「同等の結合特性」とは上記と同義である。
本発明の抗体は、上記した野生型ヒトCD81の特定のペプチド領域に結合する限り、いかなるモノクローナル抗体であってもよい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgM又はIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、抗体の分子タイプも特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab')2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール(PEG)等の安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
本発明の抗体は、後述の実施例に記載された方法又は公知の方法により作製することができる。
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、野生型ヒトCD81タンパク質もしくはその部分ペプチド、あるいはそれと同一の抗原決定基を1種以上有する(合成)ペプチドなどを使用することができる(以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある)。
ヒト抗体の作製はファージディスプレイによっても可能である(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985) 及びBoermer et al., J.Immunol., 147(1): 86-95 (1991))。ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。
内因性免疫グロブリン(Ig)遺伝子をノックアウト(KO)した非ヒト温血動物に機能的なヒトIg遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイブリドーマ作製技術が確立している動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。すなわち、ヒトIgの重鎖及び軽鎖のミニ遺伝子を通常のトランスジェニック(Tg)技術を用いて導入したマウスと、内因性マウスIg遺伝子を通常のKO技術を用いて不活性化したマウスとを交配して得られたヒト抗体産生マウス(Immunol. Today, 17: 391-397, 1996)を用いてヒトモノクローナル抗体が作製できる(国際公開第93/12227号、国際公開第92/03918号、国際公開第94/02602号、国際公開第94/25585号、国際公開第96/34096号、国際公開第96/33735号)。
本明細書において「キメラ抗体」とは、重鎖及び軽鎖の可変領域(VH及びVL)の配列が非ヒト動物種に由来し、定常領域(CH及びCL)の配列がヒトに由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス、ラット、ウサギ等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましく、定常領域の配列は投与対象となる動物種由来であることが好ましい。
本明細書において「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域(CDR)以外のすべての領域(即ち、定常領域及び可変領域中のフレームワーク領域(FR))の配列がヒト由来であり、CDRの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス、ラット、ウサギ等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種が好ましい。
上記した本発明の抗ヒトCD81抗体は、容易に、種々の変化、置換、挿入及び欠失を含むように調製されうる。例えば、抗体発現量を最大化するため、抗体遺伝子の塩基配列は、抗体発現に使用される細胞のコドン使用頻度に合わせ、最適化することができる。抗体安定性を増加させるための付加的な修飾方法として、ヒンジ領域の228番目のSerをProに置き換える後述のIgG4の修飾法がある。他には、抗体と薬物のコンジュゲートにおける効力を最適化するために必要とされるような置換もできる。例えば、抗体は、薬物付着のためのアミノ酸を含むように、そのカルボキシル末端で修飾されていてもよい。例えば、1以上のシステイン残基が付加されていてもよい。定常領域は、炭水化物又は他の基の結合のための部位を導入するように修飾されていてもよい。
本発明の抗CD81抗体の変異体は、部位特異的変異誘発を包含する標準的な組換え技術、又は組換えクローニングを用いて作製できる。
アフィニティーマチュレーション法により得られる好ましい抗体は、該抗体の作製に用いた出発抗体よりも5倍、より好ましくは10倍、なおより好ましくは20又は30倍大きい親和性を有する。
IgG4抗体をヒト及び一部の動物に投与した場合に生体内のIgG4とswappingをおこして血中の濃度が低下するという現象が観察されている。このIgG4交換は、ヒンジ領域の228番目のSerをProにポイントミューテーションすることで阻害されることが公知となっている(Mol. Immunol. 30, 105, 1993; Protein Sci. 6, 407, 1997; Mol Immunol. 38, 1, 2001; Nat Biotech. 27, 767, 2009)。
本発明の抗体はT細胞遊走抑制作用を有する。この作用は、広く知られているリンパ球の機能評価系を用いて検出することができる。たとえば遊走に対する影響は、サイトカイン(例えばPHA、IL-2、TNF-α、IL-22、IL-7及びVIP)の存在下で培養したヒト末梢血単核球(PBMC)や各種細胞株を被検抗体と接触させ、遊走刺激(例えばケモカインのstromal cell-derived factor 1(SDF-1、CXCL12としても知られる)を加え、遊走阻害を測定することによって評価される(Blood. 2009 August 13; 114(7): 1366-1373)。具体的には、以下の細胞遊走試験を用いることができる。
リンパ球としては、株化された細胞、例えばJurkat細胞 (Clone E6-1, ATCC Number TIB-152) や、ヒト末梢血由来細胞を用いることができる。ヒト末梢血由来細胞は市販されている(ケーエーシーなど)。あるいは、ヒト末梢血由来細胞は、The Journal of Immunology, 147, 2251 (1991) に従って、健常人の末梢血より、Ficoll/Paque密度勾配遠心法を用いて、単球及びリンパ球を含む単核球画分を単離することによっても調製可能である。
細胞遊走試験を用いて、抗原の細胞遊走に関連する機能を阻害する抗体又はその機能的断片の能力を評価することもできる。一般に、細胞遊走試験は、(白血球(例えば、リンパ球、好酸球、好塩基球)のような)適当な細胞と、遊走刺激因子とを、バリアー(例えば、内皮、フィルター)を隔てて配置し、該バリアーに向かっての、又はそれを通っての、該細胞の移動をモニターすることにより実施される。例えば、96-well遊走プレートのウェル(第一のチャンバー)にSDF-1等の遊走刺激因子を含む培地を添加し、細胞透過性の微多孔性膜からなる底面を有するトランスウェル(第二のチャンバー)をその上に載せ、被検抗体と細胞とを添加して、第二のチャンバーから第一のチャンバーへの細胞の移動を測定し、抗体の非存在下もしくは非特異的抗体の存在下における細胞の移動と比較することにより、被検抗体の細胞遊走抑制活性を検定することができる(Immunol. Invest. 17: 625-677 (1988)。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitro及びin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その3’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター/エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター/エンハンサー(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)を挙げることができる。
本発明はまた、本発明の抗体を含有してなる炎症性腸疾患(IBD)、多発性硬化症、乾癬又は血液がんの予防及び/又は治療剤を提供する。ここで「治療」なる用語は、完全治癒だけでなく症状の改善をも含む意味である。CD81がIBD患者で過剰発現し、抗CD81抗体がIBDの予防、改善又は治療に有用であることは知られている。ここで「炎症性腸疾患(IBD)」とは、潰瘍性大腸炎とクローン病を含む疾患である。
また、本発明者らは抗CD81抗体がT細胞の遊走を抑制するとの新たな知見も得たことから、本発明の抗体は、多発性硬化症、乾癬等のT細胞遊走が関連する疾患の予防、改善又は治療にも有用である。
(1)ヒト抗ヒトCD81抗体フラグメントの選抜
ヒトCD81との特異的結合に関し、CD81タンパク質とCD81にホモロジーを有するヒトCD9タンパク質、あるいはヒトCD81発現細胞とヒトCD81非発現細胞を用いて、完全ヒト抗体ライブラリーn-CoDeR(Nature Biotechnol. 18: 852-856, 2000、WO98/32845)のスクリーニングを実施し、ヒトCD81と特異的に結合するヒト抗体フラグメント(scFv)を得た。まず最初にCD9タンパクを競合させた状態でビオチン化CD81タンパク結合ファージをストレプトアビジンで標識した磁気ビ−ズで回収した。非結合ファージは洗浄し、結合ファージをトリプシン処理で溶出した。パニングを3回実施した後に、大腸菌で選抜されたファージライブラリーを抗体フラグメントとして発現させ、CD81発現細胞に結合してCD81非発現細胞に結合しない抗体フラグメントをFMAT(Fluorometric Microvolume Assay Techonology)を用いてスクリーニングした。FMATは384穴培養プレートに固定化した細胞に抗体フラグメントを添加し、結合の有無を蛍光標識した抗scFv抗体で検出した。スクリーニングの結果、2つのヒトCD81特異的なヒト抗体フラグメントを選抜し、シークエンスを行って各フラグメントのヌクレオチド配列 (scFv-002-A07:配列番号:33, scFv-005-C01:配列番号:35) 並びにアミノ酸配列を決定した(scFv-002-A07:配列番号:34, scFv-005-C01:配列番号:36)。
上記(1)で得られたフラグメントの情報を用い、抗ヒトCD81抗体遺伝子(重鎖可変領域(VH):配列番号:9(002-A07);配列番号:19(005-C01)、及び軽鎖可変領域(VL):配列番号:7(002-A07);配列番号:17(005-C01))を公知の方法(Nat Biotechnol., 18, 852-856, 2000)により作製し、BsmI及びNheIの認識部位を有するプライマー対を用いてPCRにて増幅した。増幅されたフラグメントはBsmI及びNheIで消化したのち、pCEP4 (invitrogen社) 由来のベクターにサブクローニングした。重鎖発現ベクターには、228番目のSerがProで置換された変異ヒトγ4(S288P)のゲノム領域が挿入されており、軽鎖発現ベクターには、ヒトλのゲノム領域が挿入されている。構築された重鎖及び軽鎖発現ベクターを、FuGene6(Roche)を用い、添付のプロトコールに従ってHEK-293−EBNA細胞(ATCC-CRL-10852)に同時トランスフェクションし、細胞を培養した。培養6日後に細胞上清からIgG4抗体の精製を行った。短時間で培養溶液を遠心し、上清をProteinAカラムにかけた。精製物を10 mM NaP buffer (0.15 M NaCl, pH 6.5) で透析した。こうして得られた002-A07 IgG4抗体は配列番号:28に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号:26に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖とを有する。また、005-C01 IgG4抗体は配列番号:32に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号:30に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する。
(1)細胞の準備
ヒトCD81発現細胞として公知情報(JOURNAL OF VIROLOGY., 79, 4316-4328, 2005)からJurkat E6.1細胞とヒトPBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cells:末梢血単核細胞)をヒトCD81発現細胞として使用し、実施例1で得られた本発明の抗体のヒトCD81発現細胞に対する結合を確認した。Jurkat E6.1 細胞はEuropean Collection of Cell Cultures(ECACC)(Cat No.88042803) より購入して実験に使用した。ヒトPBMCは株式会社ケー・エー・シー(KAC)より入手した。各々の細胞を遠心(4,000rpm 3分、4℃)し、FACS 染色buffer (0.09% アジ化ナトリウム、1% ウシ血清アルブミン(BSA; Hyclone社製) 含有リン酸buffer) に懸濁した。トリパンブルーで生細胞数を計測し、細胞106個/100 μlをエッペンドルフチューブに入れた。
上記(1)で調製した細胞をエッペンドルフチューブに入れ、106個/100 μlに対して、実施例1で作製した抗ヒトCD81抗体(002-A07及び005-C01)又はコントロールとしてヒトIgG4 (Acris社製) を0.1 μg添加し、4℃、20分間インキュベートした。FACS 染色bufferにて細胞を洗浄後、PE(フィコエリトリン)標識抗ヒトIgG4抗体 (Beckman coulter社製) を0.05 μg添加し、4℃、15分間インキュベートした。FACS 染色bufferにて細胞を2回洗浄した後、遠心分離(4,000rpm 3分、4℃)して上清を除き、沈殿した細胞をBD Cytefix/Cyteperm buffer (BD Biosciences社製) で固定した。洗浄後、該bufferをPBS (nacalai tesque社製) に置換した。抗ヒトCD81抗体の細胞結合率(%)は、FACS Calibur (BD Biosciences社製) を用いたフローサイトメトリーによりコントロールIgG4のPEに由来する蛍光強度より強い蛍光強度を有する細胞の割合で解析した。結果を表1に示す。002-A07及び005-C01は、Jurkat細胞、ヒトPBMCに強く結合することを確認できた。
(1)Jurkat細胞の継代培養
Jurkat E6.1細胞(ECACC(Cat No.88042803) より購入)は10% ウシ胎児血清(FCS;Hyclone社製) を添加したRPMI-1640培地 (GIBCO社製)中 、5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で維持した。培地で希釈することにより、細胞密度を2x105 cells/ml〜1x106 cells/mlの間で維持した。
Jurkat E6.1細胞を遊走培地(0.5% BSA (SIGMA社製), 50 mM HEPES (GIBCO社製) 含有RPMI1640培地(GIBCO社製))に4x106cells/mlとなるように懸濁した。抗ヒトCD81抗体(002-A07又は005-C01)又はコントロールとしてヒトIgG4(Acris社製) を、表2記載の最終濃度となるように該細胞に添加した。該細胞を5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で2時間インキュベートした。
96-well遊走プレート (Corning Coster社製;ポアサイズ5 μm) を用いて細胞遊走を試験した。下層部に10 ng/ml SDF-1 (PEPROTECH社製) を添加した遊走培地を235μlで充填した。Transwellを乗せた後、上記予備インキュベートした、抗ヒトCD81抗体含有又は非含有Jurkat細胞を各wellの上層部に75 μlずつ添加し、5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で2時間インキュベートした。インキュベーション終了後、Transwellを取り外し、下層部の細胞懸濁液50 μlを96-well black plate (Corning Coster社製) に移し、細胞検出試薬であるATPlite (Parkin Elmer社製) を50μl添加した。Envision 2102 multilabelreader(Perkin Elmer社製)を用いて発光強度を測定することによって遊走した細胞数を測定した。
細胞の遊走率は、コントロールIgG4を添加したJurkat細胞の遊走細胞数に対する、抗ヒトCD81抗体を添加したJurkat細胞の遊走細胞数に対する比として算出した。その結果、002-A07、005-C01いずれの抗ヒトCD81抗体ともJurkat細胞の遊走を阻害した(表2)。ヒトT細胞株であるJurkat細胞に対する002-A07と005-C01の細胞遊走抑制作用が認められたことから、抗CD81抗体(002-A07、005-C01)がIBD治療薬と成りうることが確認された。
ヒトPBMCに対する抗ヒトCD81抗体の遊走抑制効果を、Biologicals, 2007 Oct; 35(4): 227-33, Epub 2007 Aug 28に記載の方法に準じて試験した。
(1)細胞の調製
ヒトPBMCはKACより購入した。KACの添付情報によれば、使用したヒトPBMC中の60%はT細胞(CD3陽性細胞)であった。ヒトPBMC は10% ウシ胎児血清(FCS;Hyclone社製) を添加したRPMI1640培地 (GIBCO社製)中、5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で維持した。該細胞(1x106 cells/ml)は5 μg/ml フィトヘムアグルチニン(PHA, Wako社製) と、50 ng/ml 組換えヒトIL-2 (R&D system社製) を添加し、5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で4日間培養した。
ヒトPBMCを遊走培地(0.5% BSA (SIGMA社製), 50 mM HEPES (GIBCO社製) 含有RPMI1640培地(GIBCO社製))に4x106cells/mlとなるように懸濁した。抗ヒトCD81抗体(002-A07又は005-C01)又はコントロールとしてヒトIgG4(Acris社製) を、表3記載の種々の濃度で該細胞に添加した。該細胞を5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で2時間インキュベートした。
96-well遊走プレート (Corning Coster社製;ポアサイズ5 μm) を用いて細胞遊走を試験した。下層部を10 ng/ml SDF-1 (PEPROTECH社製) を添加した遊走培地を235μlで充填した。Transwellを乗せた後、上記予備インキュベートした、抗ヒトCD81抗体含有又は非含有ヒトPBMCを各wellの上層部に75 μlずつ添加し、5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で2時間インキュベートした。インキュベーション終了後、Transwellを取り外し、下層部の細胞懸濁液50 μlを96-well black plate (Corning Coster社製) に移し、細胞検出試薬であるATPlite (Parkin Elmer社製) を50μl添加した。Envision 2102 multilabelreader(Perkin Elmer)を用いて発光強度を測定することによって遊走した細胞数を測定した。
細胞の遊走率は、コントロールIgG4を添加した上記ヒトPBMCの遊走細胞数に対する、抗ヒトCD81抗体を添加したヒトPBMCの遊走細胞数の比から算出した。その結果、いずれの抗ヒトCD81抗体ともヒトPBMCの遊走を阻害した(表3)。初代ヒトT細胞を含有するヒトPBMCに対する002-A07と005-C01の細胞遊走抑制作用として認められたことから、抗CD81抗体(002-A07、005-C01)がIBD治療薬と成りうることが確認できた。
ヒトPBMCにおけるサイトカイン産生は、Life Sci. 2001 Nov 21; 70(1): 81-96に従って測定した。
(1)細胞の培養及び刺激
ヒトPBMCはKACより購入した。KACの添付情報から使用したヒトPBMC中のT細胞(CD3陽性細胞)は60%であった。ヒトPBMCは10% ウシ胎児血清 (FCS)(Hyclone社製) を添加したRPMI1640培地 (GIBCO社製) で、5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で維持した。96-wellプレート (IWAKI社製) に、抗ヒトCD81抗体(002-A07及び005-C01)又はコントロールとしてヒトIgG4(Acris社製) を、表4記載の種々の濃度で添加し、ヒトPBMC(1x105 cells/ml)を各100 μl/well添加した。該細胞に1000 ng/well 抗CD3抗体 (Clone: OKT3, BioLegend社製) 及び1000 ng/well 抗CD28抗体 (BD Biosciences社製) を50 μl/well添加して、5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で48時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を採取し、ELISA試験によりIL-2産生量を測定した。
抗体を添加したヒトPBMCから産生されるIL-2量はhuman IL-2 ELISA kit (R&D system社製) を用いて測定した。ELISA試験はkit添付のプロトコールに従って実施した。IL-2産生率は、コントロールIgG4を添加した際にヒトPBMC から産生されるIL-2量に対する、抗ヒトCD81抗体を添加した際にヒトPBMCから産生されるIL-2量の比から算出した。結果を表4に示す。
細胞増殖はAlamar blue (BIOSOURCE) を用いて測定した。本試験はkit添付のプロトコールに従って実施した。細胞増殖率は、コントロールIgG4を添加した際のヒトPBMCの細胞増殖に対する、抗ヒトCD81抗体を添加した際のヒトPBMCの細胞増殖の比から算出した。結果を表5に示す。
(1)細胞の調製
IBD患者のPBMC(Tissue solution社等より購入)は10% ウシ胎児血清 (FCS)(Hyclone社製) を添加したRPMI1640培地 (GIBCO社製) で、5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で維持する。該細胞に刺激剤(フィトヘムアグルチニン(PHA)、ヒトIL-2、ヒトTNFα、Vasoactive intestinal peptide、IL-22、IL-7) を添加あるいは無添加で、5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中にて4日間インキュベートする。
IBD患者由来PBMCを遊走培地(0.5% BSA (SIGMA社製), 50 mM HEPES (GIBCO社製) 含有RPMI1640培地(GIBCO社製))に懸濁する。抗ヒトCD81抗体(002-A07及び005-C01)又はコントロールとしてヒトIgG4(Acris社製) を、種々の濃度で該細胞に添加する。細胞を5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で2時間インキュベートする。
96-well遊走プレート (Corning Coster社製;ポアサイズ5 μm) を用いて細胞遊走を試験する。下層部にSDF-1 (PEPROTECH社製) を添加した遊走培地235μlを充填する。Transwellを乗せた後、上記予備インキュベートした抗ヒトCD81抗体含有又は非含有IBD患者由来PBMCを各wellの上層部に75 μlずつ添加し、5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で2時間インキュベートする。インキュベーション終了後、Transwellを取り外し、下層部の細胞懸濁液50 μlを96-well black plate (Corning Coster社製) に移し、細胞検出試薬であるATPlite (Parkin Elmer社製) を50μl添加する。Envision 2102 multilabelreader(Perkin Elmer社製)を用いて発光強度を測定することによって遊走した細胞数を測定する。
細胞の遊走率は、コントロールIgG4を添加したIBD患者由来PBMCの遊走細胞数に対する、抗ヒトCD81抗体を添加したIBD患者由来PBMCの遊走細胞数の比から算出する。
(1)細胞の培養及び刺激
IBD患者由来PBMCはTissue solution社等より購入する。IBD患者由来PBMCは10% ウシ胎児血清 (FCS)(Hyclone社製) を添加したRPMI1640培地 (GIBCO社製) で、5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で維持する。96-wellプレート (IWAKI社製) に、抗ヒトCD81抗体(002-A07及び005-C01)又はコントロールとしてヒトIgG4(Acris社製) を、種々の濃度で添加し、IBD患者由来PBMCを各wellに添加した。該細胞に1000 ng/well 抗CD3抗体(Clone: OKT3, BioLegend社製) 及び1000 ng/well 抗CD28抗体 (BD Biosciences社製) をそれぞれ50 μl/well添加して、5% CO2、37℃の加湿インキュベーター中で48時間インキュベートする。インキュベーション後、上清を採取し、ELISA試験によりIL-2産生量を測定する。
抗体を添加したIBD患者由来PBMCから産生されるIL-2量はhuman IL-2 ELISA kit (R&D system社製) を用いて測定する。ELISA試験はkit添付のプロトコールに従って実施する。IL-2産生率は、コントロールIgG4を添加した際にIBD患者由来PBMC から産生されるIL-2量に対する、抗ヒトCD81抗体を添加した際にIBD患者由来PBMCから産生されるIL-2量の比から算出する。
抗ヒトCD81抗体(002-A07及び005-C01)が結合するエピトープを同定するために、表6に示すヒト−ニワトリCD81キメラ構築物を用いてELISA試験を行った。各キメラ構築物をCHO細胞で一過的に発現させ、その細胞膜画分をdetergentにより可溶化してplateに固定した。結果を表7にまとめた。
ヒトCD81遺伝子(配列番号:21) 及びニワトリCD81遺伝子 (配列番号:23) を用い、表6に示す10種のヒト−ニワトリキメラCD81遺伝子を構築した。各キメラCD81遺伝子及び野生型ヒト及びニワトリCD81遺伝子の計12種類の遺伝子を、C末端にV5タグ、6xHisタグを有する融合タンパク質として発現するように、pcDNA-DEST40ベクターにサブクローニングした。遺伝子導入試薬TransIT-LT1(TAKARA BIO、code:MIR2304)を用い、メーカーの添付書に従って、各ヒト−ニワトリキメラCD81構築物を、一過的にCHO細胞で発現させ、48時間後に以下の手順で膜画分を調製した。キメラCD81発現CHO細胞に、1% (W/V) オクチルグルコシドを含むHBS(20 mM Hepes(Invitrogen、code:15630)、150 mM NaCl (ナカライテスク))を添加し、4℃で5分間インキュベートした。次いで、細胞懸濁液を10000gで20分間遠心し、上清を回収した。上清中のタンパク質量を、BCA Protein Assay Kit(ThermoScientific Pierce、code:23225)を用いて測定した。
コントロール抗体としてヒトIgG4抗体 (Acris Antibodies GmbH) とマウスIgG抗体とを用いた。ヒト−ニワトリキメラCD81タンパク質は、上記(1)で調製した膜画分(5 μg/100μl/well)を、1% (W/V) オクチルグルコシド存在下でNi NTA HisSorb plate(QIAGEN、code:35023)に添加し、4℃で3時間インキュベートすることにより、C末端に導入したHisタグを介してプレート上に捕捉した。該膜画分をTBST(0.05 %(V/V)Tween20を含むTBS)で3回洗浄後、各抗ヒトCD81抗体又はコントロール抗体(50 μL/well)を添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、2000倍希釈したHRP標識抗IgG4抗体(Mouse anti-human IgG4 HRP clone: HP6023 Beckman Coulter)もしくは1000倍希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体(Invitrogen)(50 μL/well)を添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした後、TBSTによる洗浄を3回行った。次いで、TMB One solution (Promega社、code:53025) を用いてペルオキシダーゼ活性を測定した。2 M H2SO4 50μLを加えて反応を停止させた後、450 nmにおける吸光度を測定した。
ヒトCD81は2つの細胞外ドメインを有している。002-A07及び005-C01は、hCD81、c80h、h175c及びh190cとは結合したが、cCD81、c138h、c156h、c175h、c190h、h80c、h138c及びh156cとは結合しなかった。これらの結果は、002-A07及び005-C01抗体がヒトCD81に結合し、認識するエピトープが、ヒトCD81ポリペプチドの80番目の残基と175番目の残基の間に存在することを示している。
試験例7に示すように、抗ヒトCD81抗体である002-A07及び005-C01抗体に対するヒトCD81のエピトープ領域が決定された。本試験例では、該抗ヒトCD81抗体と結合するエピトープ領域中の個々のアミノ酸残基を調べ、詳細なエピトープ残基を同定するために、試験例7で決定されたエピトープ領域中の配列においてアラニンスキャン変異誘発 (Cunningham & Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)) を実施した。ヒトCD81変異体は部位特異的な変異導入により作成し(タカラバイオに委託)、pcDNA-DEST40ベクターへサブクローニングした。続いて、これらの変異体をCHO細胞で発現させ、試験例7と同様にして、個々の変異体に対する002-A07及び005-C01抗体の結合を調べた。野生型ヒトCD81と002-A07及び005-C01抗体の結合親和性に対する、ヒトCD81の各変異体と002-A07及び005-C01抗体の結合親和性の比から、002-A07及び005-C01抗体との結合親和性の程度に基づき、変異体を3つのグループに分類した。ヒトCD81の各変異体の発現レベルは変異体のC末端に挿入したV5タグの発現レベルを用いて補正した。結果を表8に示す。
試験例7に示すように、抗ヒトCD81抗体である002-A07と005-C01は、ヒトCD81の80番目のアミノ酸残基と175番目のアミノ酸残基の間に位置する同一のエピトープ領域を認識する。アラニンスキャンの結果は、ヒトCD81は、002-A07抗体が結合するのに重要な13のアミノ酸残基 (V135, D137, A143, H151, G158, T163, A164, L165, S168, V169, L170, N172, L174) を有し、005-C01抗体が結合するのに重要な17のアミノ酸残基 (Y127, A130, L131, V135, V136, D137, N142, A143, L154, G158, T163, L165, S168, V169, L170, K171, L174) を有することを示している。
アラニンスキャンは望ましくない立体構造変化及び物理化学的破綻を引き起こす可能性があるので(Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989))、機能的なエピトープのエネルギー的プロファイリングをさらに深めるための別の体系的なスキャン方法であるホモログスキャン法を実施した。ホモログスキャン変異誘発は、タンパク質の構造及び機能が維持できるような置換基を導入することによって、側鎖の置換の際に生じる構造の破綻を最小にする設計となっている (Protein Science (2005), 14:2405-2413)。
試験例8に示すように、ヒトCD81は、002-A07に対しては13ヶ所、005-C01に対しては17ヶ所、エピトープ領域内にそれぞれの抗体が結合するために重要な残基を持っている。ホモログ変異体は Protein Science (2005), 14:2405-2413に記載の規則に従って、これらの残基について作製した。これらのホモログ変異体をCHO細胞で発現させ、試験例8と同様にして、個々の変異体に対する抗ヒトCD81抗体の結合を調べた。
結果を表9にまとめた。ホモログスキャンの結果、ヒトCD81は、エピトープ領域内に、002-A07に対しては9ヶ所の、005-C01に対しては9ヶ所の、それぞれの抗体の結合に対して重要なアミノ酸残基を有することが明らかとなった。また、002-A07に対しては、151、164、168及び172番目のアミノ酸残基、005-C01に対しては、127、130、143及び154番目のアミノ酸残基が、各抗体に対して固有の結合に重要なアミノ酸残基であった。
グリコシル化部位変異体の作製
n-CoDeR(登録商標)クローン002-A07からのVL領域を修飾してCDR3中に位置する潜在的N−グリコシル化部位(アミノ酸配列:NLS)を取り除いた。6つのVLバリアント:N113S、N113G、N113Q、S115A、S115G及びS115Nを設計してGeneart AG (Regensburg Germany)から購入した。これらを実施例1に記載のとおりのλ定常領域を含有する発現ベクターに挿入した。6つのバリアントの軽鎖は、002-A07 γ4 S228P重鎖と共にHEK293-EBNA細胞にトランスフェクションした。抗体を実施例1に記載のとおりに発現させ、精製した。
ライブラリーの作製
Fabをディスプレイするファージを、ヘルパーファージR408 (Stratagene)を用いてE. coliライブラリーから発現させ、PEG沈殿を用いて培養物上清から精製した。
1)抗Hisタグモノクローナル抗体のコーティング;2)親和性成熟からのHisタグ付きFab;3)FLAGタグ付き組換えヒトCD81タンパク質;4)AP-結合抗FLAG抗体;5)発光基質
の連続添加により構成されるELISAを用いて一次スクリーニングを行った。一次スクリーニングにおいて非常に高い活性を有するクローンを選択的に新たなマイクロタイタープレートに採取し、再発現させた。一次スクリーニングについて記載したELISAの構成と同一の構成により二次スクリーニングを行った。Fab型の親クローン002-A07に比べて結合性が向上したクローンをDNAシークエンシングにより解析した。E. coliのペリプラズムから、Ni-NTAクロマトグラフィーを用いてユニークなFabクローンを精製した。Jurkat細胞によるフローサイトメトリー及び固定化組換えヒトCD81タンパク質によるビアコアを用いて、精製Fabクローンの親和性の序列化を行った。
親クローンに比べて親和性が向上したクローンをIgG4-S228P型に変換し、実施例1に記載のとおりに発現させて精製した。
試験例2と同様に行った。その結果、いずれの002-A07変異抗体においても、ヒトT細胞株であるJurkat細胞に対する細胞遊走抑制作用が認められた(表11)。
試験例4と同様に行った。5A6は、T細胞遊走抑制作用を示すが、一方でIL-2産生増強作用を示す市販のマウス抗ヒトCD81抗体(santa cruz社製)であり、コントロールとして用いた。その結果、いずれの002-A07変異抗体も表12に示すようにヒトPBMCのIL-2産生増強作用を示さず、表13に示すように細胞増殖作用に対しても特に影響を与えないことが明らかになった。
試験例8と同様に行った。1から43番目、63から112番目、202番目以降は膜貫通もしくは細胞内ドメインである(Levy, S. et al., Annu. Rev. Immunol. (1998) 16, 89-109)ため、アラニン変異体は作製しなかった。また、156番目、157番目、175番目、190番目はシステイン残基であるため、アラニン変異体は作製しなかった。表14に示していないアラニン変異体への相対結合強度は、いずれの002-A07変異抗体においても野生型ヒトCD81と同等もしくはわずかに弱い(相対結合強度は40-100%)ものであった。
アラニンスキャンの結果から、002-A07変異抗体が結合するのに重要と考えられたアミノ酸残基についてホモログスキャンを行った。試験例9と同様に行った。その結果、002-A07変異抗体それぞれにおいて、下記に示した結合に重要なアミノ酸残基が特定された。いずれの002-A07変異抗体も、002-A07と同じエピトープに結合することがわかった。
002-A07 N113G:V135、D137、H151、G158、A164、S168、V169、L170
002-A07 N113Q:V135、D137、H151、G158、A164、S168、V169、L170
002-A07 N113S:V135、D137、H151、G158、A164、S168、V169、L170
002-A07 S115A:Y127、V135、D137、A143、H151、G158、A164、S168、V169、L170
002-A07 S115G:V135、D137、H151、G158、A164、S168、V169、L170、N172
002-A07 S115N:V135、D137、A164、S168、V169
001-B06 :A164、V169
002-B05 :V135、D137、H151、G158、A164、V169、L170
002-B07 :V135、A164、V169
002-C02 :V135、D137、A164、V169
002-C09 :A164、V169
002-D03 :V135、D137、A164、V169
002-D08 :A164、V169
002-D10 :A164、V169
002-F01 :V135、D137、G158、A164、S168、V169
002-F05 :V135、D137、A164、S168、V169
002-F07 :V135、D137、A164、V169
002-H02 :A164、V169
002-H03 :A164、V169
003-A10 :A164、V169
003-A11 :A164、V169
003-D07 :V135、D137、H151、G158、A164、V169
003-F08 :V135、D137、H151、G158、A164、V169、L170
002-A07のL鎖をコードする塩基配列のN末端部分にヒトIL-2シグナル配列を付加したDNA断片の両端にEcoRIサイトとXhoIサイトを付加し、pcDNA3.1(+)(Invitogen社)のEcoRI-XhoIサイトに組み込んだ(a)。同様に、002-A07のH鎖をコードする塩基配列のN末端部分にヒトIL-2シグナル配列を付加したDNA断片の両端にEcoRIサイトとXhoIサイトを付加し、pcDNA3.1(+)のEcoRI-XhoIサイトに組み込んだ。さらに、上記H鎖遺伝子が組み込まれたプラスミドを鋳型として、以下のDNAプライマーを用いてPCR法によりDNA断片を増幅した。
5’側DNAプライマー(EcoRIサイト部分の配列);5'-GGTGGAATTCCCACCATGTACAGGATGCAAC-3'(配列番号161)
3’側DNAプライマー(H鎖の可変領域のC末端部分配列にpFUSE-CHIg-hG1(Invitrogen社)のXhoIサイト部分配列を繋げた配列);5'-TGCACTCGAGACGGTGACCAGTGTACCTTGGCCCC-3'(配列番号162)
増幅されたDNAをEcoRIおよびXhoIで消化した後、pFUSE-CHIg-hG1のEcoRI-XhoIサイトへ挿入し、IgG1化されたH鎖発現プラスミドを取得した(b)。IgG1型ヒト抗CD81抗体蛋白を調製するために、(a),(b)のプラスミドをCHO-S細胞に一過性に導入し、浮遊培養した。培養上清を回収し、ProteinAカラムによりIgG1型ヒト抗CD81抗体を精製した。当該抗体のL鎖およびH鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を配列表に示す。
L鎖:
ヌクレオチド配列:配列番号163
アミノ酸配列: 配列番号164
H鎖:
ヌクレオチド配列:配列番号165
アミノ酸配列: 配列番号166
ヒト急性リンパ性白血病患者由来Jurkat E6.1 細胞(Cat No.88042803)とヒトバーキットリンパ腫患者由来Ramos (RA1)細胞(Cat No.EC85030802)に対するIgG1型ヒト抗CD81抗体の結合を試験例1と同様に調べた。ただし、コントロールにはヒトIgG (AbD Serotec社製)を用い、染色にはPE (フィコエリトリン)標識抗ヒトIg抗体 (Beckman Coulter社製)を用いた。FACS Calibur (BD Biosciences社製) で解析した結果を表16に示す。表中の数値はFACS Calibur のFL2におけるGeo.Meanの値を示している。その結果、Jurkat細胞、Ramos細胞に対するIgG1型ヒト抗CD81抗体の結合が確認された。
Jurkat細胞とRamos細胞を遠心(4,000rpm 3分、4℃)し回収後、CDC assay buffer (20 mM Hepes、0.1%牛血清アルブミン含有RPMI1640培地) に懸濁した。トリパンブルー (GIBCO社製) で生細胞数を計測し、細胞密度が106個/mLになるように細胞をCDC assay bufferで懸濁した。懸濁した細胞を96穴細胞培養用プレートに50μLずつ分注し、表17に記載した抗体を50μLずつ加えて37℃、30分間インキュベーションした。乾燥ウサギ補体(CEDARRLANE社製)を滅菌した蒸留水で戻し、CDC assay bufferで10倍希釈した後、各ウェルに50μLずつ加えてさらに2時間、37℃でインキュベーションした。培養上清100μLをLDH測定キット(Roche社製, Cat. No. 744934001)の反応液100μLと混合し、室温で30分反応後、プレートリーダーで490 nmの吸光度を測定した。CDC活性は、Triton X-100処理で完全に細胞を死滅させたときのLDH活性値との比率で算出した。その結果、Jurkat細胞、Ramos細胞に対するIgG1型ヒト抗CD81抗体の補体依存性細胞障害活性が確認された。
Claims (37)
- ヒトCD81に対する抗体であって、配列番号:22に記載のアミノ酸配列中80番目のアミノ酸から175番目のアミノ酸領域に結合する抗体。
- 結合するアミノ酸領域が113番目のアミノ酸から175番目のアミノ酸領域である請求項1に記載の抗体。
- 下記(1)〜(13)のいずれかに記載のヒトCD81変異体に対する結合親和性が、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に対する結合親和性を100%として、40%未満である請求項1または請求項2に記載の抗体。
(1)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の127番目のチロシンをフェニルアラニンまたはトリプトファンに置換したCD81変異体
(2)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の130番目のアラニンをスレオニンまたはバリンに置換したCD81変異体
(3)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の135番目のバリンをアラニンまたはロイシンに置換したCD81変異体
(4)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の137番目のアスパラギン酸をアラニンまたはグルタミン酸に置換したCD81変異体
(5)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の143番目のアラニンをスレオニンまたはバリンに置換したCD81変異体
(6)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の151番目のヒスチジンをアラニンまたはアルギニンに置換したCD81変異体
(7)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の154番目のロイシンをアラニンまたはイソロイシンに置換したCD81変異体
(8)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の158番目のグリシンをアラニンまたはセリンに置換したCD81変異体
(9)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の164番目のアラニンをスレオニンまたはバリンに置換したCD81変異体
(10)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の168番目のセリンをアラニンまたはスレオニンに置換したCD81変異体
(11)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の169番目のバリンをアラニンまたはロイシンに置換したCD81変異体
(12)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の170番目のロイシンをアラニンまたはイソロイシンに置換したCD81変異体
(13)配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81の172番目のアスパラギンをアラニンまたはグルタミンに置換したCD81変異体。 - 前記(9)及び(11)に記載のヒトCD81変異体に対する結合親和性が、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に対する結合親和性を100%として、40%未満である請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体と同等の結合特性を有するか、もしくは、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、抗体。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合し、かつT細胞遊走抑制作用を有する抗体。
- 下記群1〜24のうち、いずれか1つの群に記載の6種のCDRをすべて含む、ヒトCD81に対する抗体。
群1
(a−1)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−1)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−1)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−1)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−1)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−1)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群2
(a−2)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−2)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−2)配列番号:37で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−2)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−2)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−2)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群3
(a−3)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−3)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−3)配列番号:40で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−3)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−3)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−3)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群4
(a−4)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−4)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−4)配列番号:43で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−4)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−4)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−4)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群5
(a−5)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−5)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−5)配列番号:46で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−5)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−5)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−5)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群6
(a−6)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−6)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−6)配列番号:49で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−6)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−6)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−6)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群7
(a−7)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−7)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−7)配列番号:52で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−7)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−7)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−7)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群8
(a−8)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−8)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−8)配列番号:43で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−8)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−8)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−8)配列番号:55で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群9
(a−9)配列番号:60で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−9)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−9)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−9)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−9)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−9)配列番号:61で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群10
(a−10)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−10)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−10)配列番号:66で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−10)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−10)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−10)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群11
(a−11)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−11)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−11)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−11)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−11)配列番号:69で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−11)配列番号:70で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群12
(a−12)配列番号:60で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−12)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−12)配列番号:66で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−12)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−12)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−12)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群13
(a−13)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−13)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−13)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−13)配列番号:77で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−13)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−13)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群14
(a−14)配列番号:80で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−14)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−14)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−14)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−14)配列番号:81で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−14)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群15
(a−15)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−15)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−15)配列番号:66で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−15)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−15)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−15)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群16
(a−16)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−16)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−16)配列番号:90で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−16)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−16)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−16)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群17
(a−17)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−17)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−17)配列番号:52で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−17)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−17)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−17)配列番号:93で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群18
(a−18)配列番号:98で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−18)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−18)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−18)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−18)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−18)配列番号:99で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群19
(a−19)配列番号:60で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−19)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−19)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−19)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−19)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−19)配列番号:99で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群20
(a−20)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−20)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−20)配列番号:90で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−20)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−20)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−20)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群21
(a−21)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−21)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−21)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−21)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−21)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−21)配列番号:55で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群22
(a−22)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−22)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−22)配列番号:66で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−22)配列番号:110で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−22)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−22)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群23
(a−23)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−23)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−23)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−23)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−23)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−23)配列番号:115で示されるアミノ酸配列を含むCDR
群24
(a−24)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−24)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−24)配列番号:90で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−24)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−24)配列番号:120で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−24)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR。 - 下記群25〜48のうち、いずれか1つの群に記載の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の組み合わせを含む請求項7に記載の抗体。
群25
(g−1)前記(a−1)〜(c−1)を含む軽鎖可変領域及び
(h−1)前記(d−1)〜(f−1)を含む重鎖可変領域
群26
(g−2)前記(a−2)〜(c−2)を含む軽鎖可変領域及び
(h−2)前記(d−2)〜(f−2)を含む重鎖可変領域
群27
(g−3)前記(a−3)〜(c−3)を含む軽鎖可変領域及び
(h−3)前記(d−3)〜(f−3)を含む重鎖可変領域
群28
(g−4)前記(a−4)〜(c−4)を含む軽鎖可変領域及び
(h−4)前記(d−4)〜(f−4)を含む重鎖可変領域
群29
(g−5)前記(a−5)〜(c−5)を含む軽鎖可変領域及び
(h−5)前記(d−5)〜(f−5)を含む重鎖可変領域
群30
(g−6)前記(a−6)〜(c−6)を含む軽鎖可変領域及び
(h−6)前記(d−6)〜(f−6)を含む重鎖可変領域
群31
(g−7)前記(a−7)〜(c−7)を含む軽鎖可変領域及び
(h−7)前記(d−7)〜(f−7)を含む重鎖可変領域
群32
(g−8)前記(a−8)〜(c−8)を含む軽鎖可変領域及び
(h−8)前記(d−8)〜(f−8)を含む重鎖可変領域
群33
(g−9)前記(a−9)〜(c−9)を含む軽鎖可変領域及び
(h−9)前記(d−9)〜(f−9)を含む重鎖可変領域
群34
(g−10)前記(a−10)〜(c−10)を含む軽鎖可変領域及び
(h−10)前記(d−10)〜(f−10)を含む重鎖可変領域
群35
(g−11)前記(a−11)〜(c−11)を含む軽鎖可変領域及び
(h−11)前記(d−11)〜(f−11)を含む重鎖可変領域
群36
(g−12)前記(a−12)〜(c−12)を含む軽鎖可変領域及び
(h−12)前記(d−12)〜(f−12)を含む重鎖可変領域
群37
(g−13)前記(a−13)〜(c−13)を含む軽鎖可変領域及び
(h−13)前記(d−13)〜(f−13)を含む重鎖可変領域
群38
(g−14)前記(a−14)〜(c−14)を含む軽鎖可変領域及び
(h−14)前記(d−14)〜(f−14)を含む重鎖可変領域
群39
(g−15)前記(a−15)〜(c−15)を含む軽鎖可変領域及び
(h−15)前記(d−15)〜(f−15)を含む重鎖可変領域
群40
(g−16)前記(a−16)〜(c−16)を含む軽鎖可変領域及び
(h−16)前記(d−16)〜(f−16)を含む重鎖可変領域
群41
(g−17)前記(a−17)〜(c−17)を含む軽鎖可変領域及び
(h−17)前記(d−17)〜(f−17)を含む重鎖可変領域
群42
(g−18)前記(a−18)〜(c−18)を含む軽鎖可変領域及び
(h−18)前記(d−18)〜(f−18)を含む重鎖可変領域
群43
(g−19)前記(a−19)〜(c−19)を含む軽鎖可変領域及び
(h−19)前記(d−19)〜(f−19)を含む重鎖可変領域
群44
(g−20)前記(a−20)〜(c−20)を含む軽鎖可変領域及び
(h−20)前記(d−20)〜(f−20)を含む重鎖可変領域
群45
(g−21)前記(a−21)〜(c−21)を含む軽鎖可変領域及び
(h−21)前記(d−21)〜(f−21)を含む重鎖可変領域
群46
(g−22)前記(a−22)〜(c−22)を含む軽鎖可変領域及び
(h−22)前記(d−22)〜(f−22)を含む重鎖可変領域
群47
(g−23)前記(a−23)〜(c−23)を含む軽鎖可変領域及び
(h−23)前記(d−23)〜(f−23)を含む重鎖可変領域
群48
(g−24)前記(a−24)〜(c−24)を含む軽鎖可変領域及び
(h−24)前記(d−24)〜(f−24)を含む重鎖可変領域。 - 下記群49〜72のうち、いずれか1つの群に記載の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の組み合わせを含む請求項8に記載の抗体。
群49
(i−1)配列番号:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−1)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群50
(i−2)配列番号:38に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−2)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群51
(i−3)配列番号:41に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−3)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群52
(i−4)配列番号:44に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−4)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群53
(i−5)配列番号:47に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−5)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群54
(i−6)配列番号:50に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−6)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群55
(i−7)配列番号:53に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−7)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群56
(i−8)配列番号:56に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−8)配列番号:57に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群57
(i−9)配列番号:62に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−9)配列番号:63に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群58
(i−10)配列番号:67に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−10)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群59
(i−11)配列番号:71に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−11)配列番号:72に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群60
(i−12)配列番号:75に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−12)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群61
(i−13)配列番号:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−13)配列番号:78に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群62
(i−14)配列番号:82に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−14)配列番号:83に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群63
(i−15)配列番号:86に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−15)配列番号:87に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群64
(i−16)配列番号:91に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−16)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群65
(i−17)配列番号:94に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−17)配列番号:95に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群66
(i−18)配列番号:100に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−18)配列番号:101に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群67
(i−19)配列番号:104に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−19)配列番号:101に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群68
(i−20)配列番号:106に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−20)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群69
(i−21)配列番号:108に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−21)配列番号:57に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群70
(i−22)配列番号:111に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−22)配列番号:112に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群71
(i−23)配列番号:116に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−23)配列番号:117に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
群72
(i−24)配列番号:121に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−24)配列番号:122に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。 - 下記群73〜96のうち、いずれか1つの群に記載の軽鎖及び重鎖の組み合わせを含む請求項8または請求項9に記載の抗体。
群73
(k−1)配列番号:26に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−1)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群74
(k−2)配列番号:39に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−2)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群75
(k−3)配列番号:42に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−3)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群76
(k−4)配列番号:45に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−4)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群77
(k−5)配列番号:48に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−5)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群78
(k−6)配列番号:51に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−6)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群79
(k−7)配列番号:54に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−7)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群80
(k−8)配列番号:58に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−8)配列番号:59に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群81
(k−9)配列番号:64に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−9)配列番号:65に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群82
(k−10)配列番号:68に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−10)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群83
(k−11)配列番号:73に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−11)配列番号:74に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群84
(k−12)配列番号:76に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−12)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群85
(k−13)配列番号:26に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−13)配列番号:79に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群86
(k−14)配列番号:84に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−14)配列番号:85に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群87
(k−15)配列番号:88に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−15)配列番号:89に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群88
(k−16)配列番号:92に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−16)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群89
(k−17)配列番号:96に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−17)配列番号:97に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群90
(k−18)配列番号:102に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−18)配列番号:103に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群91
(k−19)配列番号:105に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−19)配列番号:103に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群92
(k−20)配列番号:107に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−20)配列番号:28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群93
(k−21)配列番号:109に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−21)配列番号:59に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群94
(k−22)配列番号:113に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−22)配列番号:114に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群95
(k−23)配列番号:118に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−23)配列番号:119に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
群96
(k−24)配列番号:123に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−24)配列番号:124に示されるアミノ酸配列を含む重鎖。 - 請求項7〜10のいずれか1項に記載の抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、抗体。
- 請求項11に記載の抗体であって、T細胞遊走抑制作用を有する抗体。
- 請求項7に記載の群1〜群24のいずれか1つの群に記載の6種から選択される少なくとも1つのCDRを含む抗体であって、当該群の6種のCDRをすべて含むヒトCD81に対する抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、ヒトCD81に対する抗体。
- 請求項7に記載のいずれか1つの抗体と90%以上の相同性を持ち、当該抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、ヒトCD81に対する抗体。
- 下記CDRを含むヒトCD81に対する抗体。
(a−25)配列番号:11で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b−25)配列番号:12で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c−25)配列番号:13で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d−25)配列番号:14で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e−25)配列番号:15で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f−25)配列番号:16で示されるアミノ酸配列を含むCDR。 - 下記可変領域を含む請求項15に記載の抗体。
(g−25)前記(a−25)〜(c−25)を含む軽鎖可変領域及び
(h−25)前記(d−25)〜(f−25)を含む重鎖可変領域。 - 下記可変領域を含む請求項16に記載の抗体。
(i−25)配列番号:18に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び
(j−25)配列番号:20に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。 - 下記軽鎖及び重鎖を含む請求項16または請求項17に記載の抗体。
(k−25)配列番号:30に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖及び
(l−25)配列番号:32に示されるアミノ酸配列を含む重鎖 - 請求項15〜18のいずれか1項に記載の抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、抗体。
- 請求項19に記載の抗体であって、T細胞遊走抑制作用を有する抗体。
- 請求項15に記載の少なくとも1つのCDRを含む抗体であって、請求項15に記載の抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、ヒトCD81に対する抗体。
- 請求項15に記載の抗体と90%以上の相同性を持ち、当該抗体と競合的に、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する天然のヒトCD81に結合する、ヒトCD81に対する抗体。
- ヒト化抗体もしくはヒト抗体である請求項1〜6、11〜14及び19〜22のいずれか1項に記載の抗体。
- ヒト化抗体もしくはヒト抗体である請求項7〜10及び15〜18のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項1〜6、11〜14及び19〜23のいずれか1項に記載の抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、請求項1〜6、11〜14及び19〜23のいずれか1項に記載の抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの組み合わせ。
- 請求項7〜10、15〜18及び24のいずれか1項に記載の抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、請求項7〜10、15〜18及び24のいずれか1項に記載の、重鎖可変領域に対応する軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの組み合わせ。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項1〜6、11〜14及び19〜23のいずれか1項に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、請求項1〜6、11〜14及び19〜23のいずれか1項に記載の抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの組み合わせ。
- 請求項7〜10、15〜18及び24のいずれか1項に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、請求項7〜10、15〜18及び24のいずれか1項に記載の、重鎖に対応する軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの組み合わせ。
- 請求項25または28に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項31に記載の発現ベクターにより形質転換した組換え細胞。
- 請求項1〜6、11〜14及び19〜22のいずれか1項に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、請求項1〜6、11〜14及び19〜22のいずれか1項に記載の抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換した組換え細胞。
- 請求項7〜10、15〜18及び24のいずれか1項に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、請求項7〜10、15〜18及び24のいずれか1項に記載の、重鎖に対応する軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換した組換え細胞。
- 請求項32〜34のいずれか1項に記載の組換え細胞を培養し、得られた培養上清から抗体を回収することからなる、抗ヒトCD81抗体の製造方法。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載の抗体を含有する、医薬組成物。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載の抗体を有効成分とする、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬または血液がんの予防、改善または治療剤。
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