JP6861349B2 - Ｃｄ８１ ｌｅｌ特異的モノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、関節リウマチの早期診断薬に関する。詳細には、本発明は、関節リウマチの滑液細胞において高発現しているタンパク質ＣＤ８１のLarge extracellular loop (LEL)（以下において「ＣＤ８１ ＬＥＬ」と称することがある）に対する新規な特異的抗体、該抗体を用いたＣＤ８１の検出および測定、ならびに該抗体を用いた関節リウマチの診断キット、サンドイッチＥＬＩＳＡ等に関する。
関節リウマチは多発性関節炎を特徴とする炎症性疾患であり、進行すると関節が変形、破壊される。関節リウマチにおいては、滑膜内のタンパク質「シノビオリン」が過剰に作用して症状が悪化することがわかっている。シノビオリンはユビキチンリガーゼの一種であり、ＲＥＡＤ小胞体関連分解機構の促進などによるアポトーシスを抑制することで関節チウマチ滑膜線維芽細胞の増殖を促進させている。一方、細胞膜上に存在する４回膜貫通型タンパク質テトラスパニンの一種であるＣＤ８１は関節リウマチ滑膜細胞で高発現しており、シノビオリン遺伝子発現調節に関与している。
従来の関節リウマチ治療は抗炎症剤と炎症性サイトカインの抑制による対症療法が主流であったが、ＣＤ８１の発現を抑制することがリウマチ根絶治療につながると期待されている。
関節ウマチは、治療が遅れれば遅れるほど関節の変形も進み、薬効も悪くなる。したがって、関節リウマチは早期診断、早期治療が肝要である。
テトラスパニンは保存された残基を含む４つの膜貫通ドメイン、２つの細胞外ループおよび３つの細胞内ドメインから構成されている。ＣＤ８１の２つの細胞外ループのうち大型のものがＣＤ８１ ＬＥＬである。ＣＤ８１ ＬＥＬは、ほとんどのテトラスパニンと異なり、潜在的な糖鎖付加部位を含んでいないので、これを特異的に認識する抗体を見いだすことができれば、サンプル中の微量のＣＤ８１を正確に検出、測定でき、関節リウマチの早期診断、早期治療に資することになる。
ＣＤ８１に対する抗体の作成が報告されているが（非特許文献１）、ＣＤ８１ ＬＥＬに特異的な抗体を作成し、サンプル中のＣＤ８１ ＬＥＬを実際に検出、測定したという報告はない。
E. Fujimoto et al., Journal of Hard Tissue Biology 23(1) (2014) 131-134
本発明が解決しようとする課題は、サンプル中の極めて微量のＣＤ８１であっても正確に検出、定量できるＣＤ８１ ＬＥＬ特異的モノクローナル抗体を得ること、これらの抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡなどの検出、測定系を構築し、関節リウマチの診断、とりわけ早期診断に用いることであった。
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究を重ね、ＣＤ８１ ＬＥＬ特異的モノクローナル抗体を作成することに成功した。さらに本発明者は、これらのモノクローナル抗体を用いて、ＤＣ８１ ＬＥＬ用のサンドイッチＥＬＩＳＡを構築し、極めて微量（ピコグラムオーダー）のＣＤ８１ ＬＥＬを特異的に高感度で検出、測定することに成功した。かくして、本発明は完成された。
したがって、本発明は以下のものを提供する。
（１）ＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体。
（２）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９２を付与されたハイブリドーマにより産生される（１）記載のモノクローナル抗体。
（３）標識されている（２）記載のモノクローナル抗体。
（４）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９３を付与されたハイブリドーマにより産生される（１）記載のモノクローナル抗体。
（５）標識されている（４）記載のモノクローナル抗体。
（６）（２）もしくは（３）記載のモノクローナル抗体および／または（４）もしくは（５）記載のモノクローナル抗体を含む、ＣＤ８１検出キット。
（７）対象が関節リウマチにかかっている可能性を検査、あるいは対象の関節リウマチの症状の重さを検査するための（６）記載のキット。
（８）（２）もしくは（３）記載のモノクローナル抗体および（４）もしくは（５）記載のモノクローナル抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡを含む、（６）または（７）記載のキット。
（９）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９２を付与されたハイブリドーマ。
（１０）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９３を付与されたハイブリドーマ。
（１１）（９）記載のハイブリドーマを培養し、培養液からモノクローナル抗体を回収することを特徴とする、ＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体の製造方法。
（１２）（１０）記載のハイブリドーマを培養し、培養液からモノクローナル抗体を回収することを特徴とする、ＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体の製造方法。
（１）ＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体。
（２）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９２を付与されたハイブリドーマにより産生される（１）記載のモノクローナル抗体。
（３）標識されている（２）記載のモノクローナル抗体。
（４）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９３を付与されたハイブリドーマにより産生される（１）記載のモノクローナル抗体。
（５）標識されている（４）記載のモノクローナル抗体。
（６）（２）もしくは（３）記載のモノクローナル抗体および／または（４）もしくは（５）記載のモノクローナル抗体を含む、ＣＤ８１検出キット。
（７）対象が関節リウマチにかかっている可能性を検査、あるいは対象の関節リウマチの症状の重さを検査するための（６）記載のキット。
（８）（２）もしくは（３）記載のモノクローナル抗体および（４）もしくは（５）記載のモノクローナル抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡを含む、（６）または（７）記載のキット。
（９）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９２を付与されたハイブリドーマ。
（１０）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９３を付与されたハイブリドーマ。
（１１）（９）記載のハイブリドーマを培養し、培養液からモノクローナル抗体を回収することを特徴とする、ＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体の製造方法。
（１２）（１０）記載のハイブリドーマを培養し、培養液からモノクローナル抗体を回収することを特徴とする、ＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体の製造方法。
本発明によれば、微量のＣＤ８１ ＬＥＬを特異的に高感度で検出、定量できるので、関節リウマチの早期診断が可能となる。
本発明は、１の態様において、ＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体に関するものである。ＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体とは、ＣＤ８１ ＬＥＬ中のアミノ酸配列を認識して、ＣＤ８１ ＬＥＬに結合するモノクローナル抗体をいう。ＣＤ８１ ＬＥＬは潜在的な糖鎖付加部位を含んでいないので、これを特異的に認識する本発明のモノクローナル抗体は、サンプル中の微量のＣＤ８１であっても正確に検出でき、関節リウマチの早期診断、早期治療に資するものである。
本発明のＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体は、ＣＤ８１ ＬＥＬの全体または一部のアミノ酸配列を有するペプチド（以下において「ＣＤ８１ ＬＥＬポリペプチド」と称することがある）を免疫原として用いて得ることができる。ＣＤ８１ ＬＥＬのアミノ酸配列は公知であるので、当業者は公知の遺伝子工学的手法および／または合成化学的手法を用いてＣＤ８１ ＬＥＬポリペプチドを作成することができる。
先ず、ＣＤ８１ ＬＥＬポリペプチドを動物に投与して免疫を行う。動物への免疫方法、手段は当業者に公知である。動物への免疫は、例えば皮下注射、皮内注射、静脈注射、脾臓への直接注射などの公知の経路によってＣＤ８１ ＬＥＬポリペプチドを投与して行う。動物としては、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、サル、などが例示されるが、これらに限定されない。ＣＤ８１ ＬＥＬポリペプチドを動物に投与する際にフロイントの完全または不完全アジュバント等のアジュバントを用いることが好ましい。アジュバントの種類や用法についても公知である。
次いで、免疫された動物から脾臓細胞を取り出し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得る。ハイブリドーマの取得方法は当業者に公知である。細胞融合法も公知であり、例えばポリエチレングリコールを用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合法などが挙げられるが、これらの方法に限定されない。目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、ハイブリドーマのクローン化を行う。ハイブリドーマの選択方法、抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング方法は当業者に公知である。抗体活性の測定方法についても、目的とする抗体の特性に応じて当業者が適宜選択することができる。ハイブリドーマのクローン化方法も公知である。上記の方法以外にも、所望のモノクローナル抗体を作成する方法が知られており、例えばファージディスプレイ法を用いてもよい。
本発明のＣＤ８１ ＬＥＬモノクローナル抗体はＣＤ８１ ＬＥＬに対する特異性が高く、サンプル中の微量のＣＤ８１タンパク質であっても検出することができる。本発明のＣＤ８１ ＬＥＬモノクローナル抗体の好ましい例としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９２を付与されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、および独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９３を付与されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
本発明のモノクローナル抗体の変異体や改変体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体も本発明のモノクローナル抗体に包含される。変異体や改変体は、元の本発明のモノクローナル抗体の特徴を維持しているものである。変異体や改変体は、例えば、元の本発明のモノクローナル抗体と同程度の強さでＣＤ８１ ＬＥＬに結合するものであってもよい。また、変異体や改変体は、元の本発明のモノクローナル抗体と同じエピトープを認識するものであってもよい。変異体や改変体の重鎖の３つの相補性決定領域（重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）および軽鎖の３つの相補性決定領域（軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、元の本発明のモノクローナル抗体の重鎖の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであってもよい。変異体や改変体の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、元の本発明のモノクローナル抗体の重鎖の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列と異なっていてもよいが、相補性決定領域のアミノ酸配列の相違は各ＣＤＲあたり１残基、２残基または３残基が好ましい。
本発明のモノクローナル抗体の変異体または改変体には、キメラ抗体やヒト化抗体も包含される。キメラ抗体およびヒト化抗体の作成法は当業者に公知であり、容易に作成することができる。
本発明のモノクローナル抗体を用いてＣＤ８１ ＬＥＬを検出、測定することによってＣＤ８１を検出、測定することができる。本発明のモノクローナル抗体を用いてＣＤ８１を検出、測定する態様の具体例の１つとしてＥＬＩＳＡ法が挙げられる。ＥＬＩＳＡ法は公知であり、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法などを用いて行うことができる。これらの方法は当業者が容易に実施することができる。サンドイッチＥＬＩＳＡの手順を以下に簡単に説明する。本発明のモノクローナル抗体（捕獲抗体または固相抗体という）を固相（プレートのウェル）に吸着させ、これにサンプルおよび本発明の別のモノクローナル抗体（一次抗体という）を添加し、次いで、検出可能な標識を付した抗体（二次抗体という）を添加する。固相としては、プレートのウェルのほかチップやビーズなどが公知であり、使用可能である。様々な二次抗体が市販されているので、適宜選択して用いることができる。反応後、標識を検出し、定量することができる。捕獲抗体と一次抗体は異なるエピトープを認識するものである。ＣＤ８１の検出、測定のためのサンドイッチＥＬＩＳＡに用いることのできる好ましい本発明のモノクローナル抗体の例としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９２を付与されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、および独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９３を付与されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。これらのモノクローナル抗体のいずれか一方を捕獲抗体として用い、もう一方を一次抗体として用いることができる。したがって、本発明は、さらなる態様において、２種類の本発明のモノクローナル抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡを含む、ＣＤ８１検出キットを提供するものでもある。通常、キットには取扱説明書が添付される。
本発明のモノクローナル抗体を用いてＣＤ８１を検出、測定する態様のさらなる具体例としてはウエスタンブロットが挙げられる。ウエスタンブロットの一般的手順としては、目的のタンパク質を含むサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開し、ニトロセルロース膜やＰＶＤＦ膜に転写し、この膜に対して免疫染色を行うことで、タンパク質を検出するものである。ウエスタンブロットは公知であり、当業者は容易に実施することができる。したがって、本発明は、さらなる態様において、本発明のモノクローナル抗体を含む、ＣＤ８１を検出するためのウエスタンブロット用キットを提供するものである。通常、キットには取扱説明書が添付される。本発明のモノクローナル抗体を用いてＣＤ８１を検出、測定する態様は上記のものに限定されず、様々な手段、方法が公知であり、当業者はそれらを適宜選択あるいは変形して用いることができる。
ＣＤ８１の検出、測定のために、本発明のモノクローナル抗体に標識を付してもよい。抗体に付する標識は公知であり、放射性同位元素、金粒子、蛍光色素、酵素などが例示されるが、これらに限らない。標識の検出方法も公知である。
上述のごとく、本発明のモノクローナル抗体およびキットをサンプル中のＣＤ８１ ＬＥＬの検出、測定に用いることができる。したがって、本発明のモノクローナル抗体およびキットを用いて対象の関節液サンプル中のＣＤ８１の量を測定することによって、対象が関節リウマチ等の関節液中のＣＤ８１レベルの上昇に関連する疾患にかかっている可能性あるいはその症状の重さを、診断、検査または判定することができる。本発明の好ましい態様において、かかる症状は関節リウマチである。関節液サンプル中のＣＤ８１の量が多いほど、対象が関節リウマチにかかっている可能性が高く、あるいは対象の関節リウマチの症状が重いとすることができる。
本発明は、別の態様において、ＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。本発明のＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの好ましい例としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９２を付与されたハイブリドーマおよび独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９３を付与されたハイブリドーマが挙げられる。
本発明は、さらなる態様において、ＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培養し、培養液からモノクローナル抗体を回収することを特徴とする、ＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体の製造方法に関する。ハイブリドーマの培養、培養液からのモノクローナル抗体の回収および精製は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
動物実験は就実大学薬学部動物実験指針に従って行った。大腸菌にて産生された組換え型ヒトＬＥＬポリペプチド（アミノ酸配列を配列番号：１に示す）を抗原として用いてＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。免疫したマウスから脾臓細胞を取り出し、ポリエチレングリコールを用いて１ｘ１０８個の脾臓細胞を１ｘ１０７個の骨髄腫細胞と融合させた。融合細胞を９６ウェルプレートに分注し、ＨＡＴ培地を用いてハイブリドーマ細胞を選択した。
ＥＬＩＳＡを用いて、ＬＥＬに対する抗体力価が高いハイブリドーマをスクリーニングした。抗原（組換え型ヒトＬＥＬポリペプチド（配列番号：１））を含む緩衝液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、ＢＳＡ（bovine serum albumin）をウェルに添加した。ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体（一次抗体）を含む培養上清を適宜希釈してウェルに添加し、二次抗体（アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、プロメガ社Ｓ３７２１）を添加した。次いで、パラニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を用いて発色させることにより、抗体力価を測定し、抗体力価が高いハイブリドーマを選択した。
選択したハイブリドーマを１０％ fetal calf serumを添加したＲＰＭＩ１６４０培地にて増殖させ、１０６個のハイブリドーマをプリスタン投与したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内投与し、１０〜１４日後に腹水を回収した。プロテインＧセファロース４（GE Healthcare UK Ltd., UK）カラムを用いて腹水中のモノクローナル抗体（ＩｇＧ）を精製した。HiTrap IgM Purification HP (GE Healthcare UK Ltd., UK)カラム を用いて腹水中のモノクローナル抗体（ＩｇＭ）を精製した。
最も高い抗体力価を示したハイブリドーマをＦ８（ＩｇＧモノクローナル抗体産生）およびＢ３（ＩｇＭモノクローナル抗体産生）と命名した。ハイブリドーマＦ８を千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託し、２０１５年８月２５日付けで受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９２を付与された。ハイブリドーマＢ３を千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託し、２０１５年８月２５日付けで受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９３を付与された。以下において、ハイブリドーマＦ８が産生するモノクローナル抗体をマウスＩｇＧ抗体Ｆ８と、ハイブリドーマＢ３が産生するモノクローナル抗体をマウスＩｇＭ抗体Ｂ３と称する。
１．実験方法
（１）固相抗体のプレートへの固相化
９６穴プレートを蒸留水で１回洗い、５０ｍＭ カーボネートバッファー（ｐＨ９．６）で固相抗体（実施例１で得たマウスＩｇＧ抗体Ｆ８：２．５１ｍｇ／ｍＬ）を１０００倍希釈した溶液を１００μｌずつ９６穴プレートに分注（外側の２つずつを外した４Ｘ８個のウェルを使用）した。これをサランラップ（登録商標）でおおい、室温で１時間放置した後、ウェル中の溶液をピペットにより除去し、さらにプレートを逆さにして液をよく切った。
（１）固相抗体のプレートへの固相化
９６穴プレートを蒸留水で１回洗い、５０ｍＭ カーボネートバッファー（ｐＨ９．６）で固相抗体（実施例１で得たマウスＩｇＧ抗体Ｆ８：２．５１ｍｇ／ｍＬ）を１０００倍希釈した溶液を１００μｌずつ９６穴プレートに分注（外側の２つずつを外した４Ｘ８個のウェルを使用）した。これをサランラップ（登録商標）でおおい、室温で１時間放置した後、ウェル中の溶液をピペットにより除去し、さらにプレートを逆さにして液をよく切った。
（２）ブロッキング
ＢＳＡ（３％）を各ウェルに分注し、サランラップ（登録商標）でおおい、室温で１時間放置した。その後、プレートを逆さにしてＢＳＡを廃棄し、各ウェルにＰＢＳ−Ｔを２５０μｌ分注して、逆さにして液をよく切った。この操作を３回繰り返して洗浄した。
ＢＳＡ（３％）を各ウェルに分注し、サランラップ（登録商標）でおおい、室温で１時間放置した。その後、プレートを逆さにしてＢＳＡを廃棄し、各ウェルにＰＢＳ−Ｔを２５０μｌ分注して、逆さにして液をよく切った。この操作を３回繰り返して洗浄した。
（３）抗原と一次抗体との反応
（ｉ）プレート１
抗原（組換え型ヒトＬＥＬポリペプチド（配列番号：１）：ＬＥＬ発現ベクターを導入した大腸菌からＬＥＬポリペプチドを培地５００ｍＬあたり６０μｇ調製した）をＴＢＳで各濃度に希釈し、一次抗体（実施例１で得たマウスＩｇＭ抗体Ｂ３：３．５４ｍｇ／ｍＬ）をＴＢＳで１０００倍希釈した。希釈した抗原と一次抗体を各５０μｌずつ各ウェルに分注、混合した。その後、サランラップ（登録商標）でおおい、室温で１時間放置した。その後、ウェル中の溶液をピペットで除去し、各ウェルにＰＢＳ−Ｔを２５０μｌ分注して、逆さにして液をよく切った。この操作を３回繰り返して洗浄した。
（ｉ）プレート１
抗原（組換え型ヒトＬＥＬポリペプチド（配列番号：１）：ＬＥＬ発現ベクターを導入した大腸菌からＬＥＬポリペプチドを培地５００ｍＬあたり６０μｇ調製した）をＴＢＳで各濃度に希釈し、一次抗体（実施例１で得たマウスＩｇＭ抗体Ｂ３：３．５４ｍｇ／ｍＬ）をＴＢＳで１０００倍希釈した。希釈した抗原と一次抗体を各５０μｌずつ各ウェルに分注、混合した。その後、サランラップ（登録商標）でおおい、室温で１時間放置した。その後、ウェル中の溶液をピペットで除去し、各ウェルにＰＢＳ−Ｔを２５０μｌ分注して、逆さにして液をよく切った。この操作を３回繰り返して洗浄した。
（ｉｉ）プレート２
関節リウマチ（ＲＡ）ヒト患者の関節液および変形性関節症（ＯＡ）ヒト患者の関節液を４℃、３０００ｒｐｍで１０分遠心分離後、上清を回収した。これらの上清をＴＢＳで１／２および１／４に希釈した（表２において原液１／２、原液１／４と表示）。これらのサンプルからアルブミンを除去したサンプルも調製した（表２においてア１／２、ア１／４と表示）。これらのサンプルおよび一次抗体（ＴＢＳで１０００倍希釈したマウスＩｇＭ抗体Ｂ３）を用いて、上記（ｉ）プレート１と同様に操作した。
関節リウマチ（ＲＡ）ヒト患者の関節液および変形性関節症（ＯＡ）ヒト患者の関節液を４℃、３０００ｒｐｍで１０分遠心分離後、上清を回収した。これらの上清をＴＢＳで１／２および１／４に希釈した（表２において原液１／２、原液１／４と表示）。これらのサンプルからアルブミンを除去したサンプルも調製した（表２においてア１／２、ア１／４と表示）。これらのサンプルおよび一次抗体（ＴＢＳで１０００倍希釈したマウスＩｇＭ抗体Ｂ３）を用いて、上記（ｉ）プレート１と同様に操作した。
（４）二次抗体反応
二次抗体（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体、サンタクルーズ社ＳＣ−２０６４）をＴＢＳで１０００倍希釈し、１００μｌずつ各ウェルに分注後、サランラップ（登録商標）でおおい、室温で１時間放置した。その後、ウェル中の溶液をピペットで除去し、各ウェルにＰＢＳ−Ｔを２５０μｌ分注して、逆さにして液をよく切った。この操作を３回繰り返して洗浄した。
二次抗体（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体、サンタクルーズ社ＳＣ−２０６４）をＴＢＳで１０００倍希釈し、１００μｌずつ各ウェルに分注後、サランラップ（登録商標）でおおい、室温で１時間放置した。その後、ウェル中の溶液をピペットで除去し、各ウェルにＰＢＳ−Ｔを２５０μｌ分注して、逆さにして液をよく切った。この操作を３回繰り返して洗浄した。
（５）検出反応
Thermo Scientific社のペルオキシダーゼ用化学蛍光基質QuantaBluTM Fluorogenic Peroxidase Substrate Kitを使用した。キット中のQuantaBluTM Substrate SolutionとQuantaBluTM Stable Peroxidase Solutionを９：１で混合したもの（ＷＳ）を１００μｌずつ各ウェルに分注し、フルオロスキャンアセントＦＬで測定した。５０分後にQuantaBluTM Stop Solutionを１００μｌずつ各ウェルに分注した。
Thermo Scientific社のペルオキシダーゼ用化学蛍光基質QuantaBluTM Fluorogenic Peroxidase Substrate Kitを使用した。キット中のQuantaBluTM Substrate SolutionとQuantaBluTM Stable Peroxidase Solutionを９：１で混合したもの（ＷＳ）を１００μｌずつ各ウェルに分注し、フルオロスキャンアセントＦＬで測定した。５０分後にQuantaBluTM Stop Solutionを１００μｌずつ各ウェルに分注した。
２．結果
プレート１の結果を図１（曲線ａ）に示す。実験を４系並行して行い、平均値を得た。図１に示す結果から、本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、１０ｆｇ／ウェル〜１００００ｆｇ／ウェル（０．２ｐｇ／ｍｌ〜２００ｐｇ／ｍｌ）の範囲の組換えＬＥＬポリペプチドに関して、濃度と吸光度に正の相関が見られた。本発明のモノクローナル抗体を用いて極めて微量（ピコグラムオーダー）のＣＤ８１ ＬＥＬを検出できることがわかった。低濃度サンプルの場合は、二次抗体あたりの酵素量（あるいは他の標識量）を増加させることによって測定感度を上げることが可能である。また、高濃度サンプルの場合は、サンプルの希釈倍率を上げることによって適切な測定が可能となる。
プレート１の結果を図１（曲線ａ）に示す。実験を４系並行して行い、平均値を得た。図１に示す結果から、本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、１０ｆｇ／ウェル〜１００００ｆｇ／ウェル（０．２ｐｇ／ｍｌ〜２００ｐｇ／ｍｌ）の範囲の組換えＬＥＬポリペプチドに関して、濃度と吸光度に正の相関が見られた。本発明のモノクローナル抗体を用いて極めて微量（ピコグラムオーダー）のＣＤ８１ ＬＥＬを検出できることがわかった。低濃度サンプルの場合は、二次抗体あたりの酵素量（あるいは他の標識量）を増加させることによって測定感度を上げることが可能である。また、高濃度サンプルの場合は、サンプルの希釈倍率を上げることによって適切な測定が可能となる。
比較のため、上記と同様にして、市販ウサギ抗体（サンタクルーズ社ｓｃ−９１５８）と市販マウス抗体（モノクローナル抗体、サンタクルーズ社ｓｃ−１６６０２９）による測定（図１の曲線ｂ）、ならびに市販マウス抗体（モノクローナル抗体、サンタクルーズ社ｓｃ−１６６０２９）と市販マウス抗体（モノクローナル抗体、サンタクルーズ社ｓｃ−１６６０２８）による測定（図１の曲線ｃ）も行った。いずれの場合も、試験したＬＥＬ濃度領域においては測定不可能であった。
プレート２の結果を表１に示す。実験を４系並行して行い、平均値を得た。
以上の実験結果から、本発明のモノクローナル抗体を用いて、関節リウマチ（ＲＡ）あるいは変形性関節症（ＯＡ）患者の関節液サンプル中のＣＤ８１（またはＬＥＬ）を検出、測定することが可能であることがわかった。
本発明は、生物学、医学等の研究分野、関節リウマチの診断薬の分野、および関節リウマチの研究分野において利用可能である。
本発明のモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ抗体Ｆ８）を産生するハイブリドーマＦ８を独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９２を付与された。
本発明のモノクローナル抗体（マウスＩｇＭ抗体Ｂ３）を産生するハイブリドーマＢ３を独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９３を付与された。
本発明のモノクローナル抗体（マウスＩｇＭ抗体Ｂ３）を産生するハイブリドーマＢ３を独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９３を付与された。
配列番号：１は、実施例１で用いた組換えＬＥＬポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
Claims (3)
- 下記のモノクローナル抗体（１）および（２）：
（１）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９２を付与されたハイブリドーマにより産生されるＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体または標識されている該モノクローナル抗体、
（２）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９３を付与されたハイブリドーマにより産生されるＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体または標識されている該モノクローナル抗体
を用いて、対象から得た関節液試料中のＣＤ８１を検出、あるいはその量を測定する方法であって、サンドイッチＥＬＩＳＡと組み合わせて実施される方法。 - 下記のモノクローナル抗体（１）および（２）：
（１）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９２を付与されたハイブリドーマにより産生されるＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体または標識されている該モノクローナル抗体、
（２）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０９３を付与されたハイブリドーマにより産生されるＣＤ８１ ＬＥＬに特異的なモノクローナル抗体または標識されている該モノクローナル抗体
を含む、ＣＤ８１を検出、あるいはその量を測定するためのキットであって、サンドイッチＥＬＩＳＡと組み合わせて用いられるキット。 - 対象が関節リウマチにかかっている可能性を検査するための、あるいは対象の関節リウマチの症状の重さを検査するための請求項２記載のキット。
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