CN115947855A - 抗cd24抗体的制备及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了抗CD24抗体、其抗原结合片段及其医药用途，还提供了包含所述抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体、包含抗CD24抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及所述抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。本发明的抗体能够与CD24特异性结合，具有高吞噬活性和ADCC效应，展现出良好的抑制肿瘤生长的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的涉及一种针对CD24的抗体或其抗原结合片段。
背景技术
CD24也被称为热稳定抗原或小细胞肺癌簇4抗原，是一种高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phoshphafidyl-inositol，GPI)锚定表面蛋白。CD24基因位于染色体6q21上，成熟的CD24是31个氨基酸组成的小的高度糖基化唾液酸糖蛋白，具有16个潜在的O-糖基化位点和2个预测的N-糖基化位点。CD24的糖基化高且和细胞类型相关，高度糖基化的CD24通过磷脂酰肌醇锚定在细胞膜内的脂质筏上，作为细胞连接位点上分子间相互作用的媒介，介导细胞间、细胞和基质间的黏附。此外CD24作为一种细胞黏附分子，还参与细胞的识别、活化、信号转导、细胞增殖与分化、细胞的伸展与运动等。
CD24主要表达于造血系统如B淋巴细胞、活化的T淋巴细胞，人的红细胞及胸腺细胞中不表达CD24。此外CD24还在恶性肿瘤中大量表达，如乳腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、直肠癌(Molecular Mechanism of Tumor Cell ImmuneEscape Mediated by CD24/Siglec-10[J].frontiers in Immunology，2020，11：1324)、胰腺癌(Expression of CD24in Adenocarcinomas of the Pancreas Correlates withHigher Tumor Grade[J]).Pancreatology 2004；4：454-460)等。Barkal等人的研究表明CD24的表达与卵巢癌、乳腺癌患者的生存率密切相关，三阴性乳腺癌和卵巢癌细胞表面的CD24都高表达，而且肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)上的唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素10(Siglec-10)也高表达。研究发现CD24通过与Siglec10的相互作用，促进肿瘤发生免疫逃逸，主要是通过CD24与Siglec-10结合后产生了“别吃我”信号，抑制了巨噬细胞的抗肿瘤功能，而通过CD24阻断抗体的作用能够在体内外模型中有效促进巨噬细胞的抗肿瘤活性(CD24 signalling through macrophage Siglec-10 is a target for cancerimmunotherapy[J].Nature，2019，572：392-396)。CD24作为一种在多种癌症中高表达的“别吃我”信号，是肿瘤免疫治疗的潜在新靶点。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的抗CD24的抗体或其抗原结合片段，其能够与CD24特异性结合，具有高吞噬活性和ADCC效应、展现出良好的抑制肿瘤生长的效果，同时本发明所述抗体对正常细胞或生物体没有毒副作用，具有较好的安全性。
本发明提供一种抗CD24抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，所述重链可变区包含至少1个如下HCDR：
HCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；
HCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；
HCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，或包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；
和/或
轻链可变区，所述轻链可变区包含至少1个如下LCDR：
LCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22所示，或包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22所示氨基酸序列；
LCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，或包含SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；
LCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，或包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。
在本发明一个优选的实施方案中，其中所述的重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或，其中所述的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，其中所述的重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且其中所述的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，其中所述的重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且其中所述的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，其中所述的重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且其中所述的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，其中所述的重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且其中所述的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD24抗体或其抗原结合片段，所述的重链可变区进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链FR区，和/或所述的轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD24抗体或其抗原结合片段，所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，或与SEQ ID NO：7具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD24抗体或其抗原结合片段，所述的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，或与SEQ ID NO：8具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的抗CD24抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其抗原结合片段，进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，和/或进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的抗CD24抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其抗原结合片段，进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG4或其变体的重链恒定区；和/或进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，优选包含人源κ或其变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的嵌合抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源IgG1或其变体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，或与SEQ ID NO：9具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者，所述的人源IgG4或其变体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，或与SEQ ID NO：10具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的嵌合抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源κ或其变体的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，或与SEQID NO：11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的抗CD24抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其抗原结合片段，所述的重链可变区进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链FR区，优选包含人种系重链IGHV1-2*06或其变体的FR区；和/或所述的轻链可变区进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链FR区，优选包含人种系轻链IGKV2D-29*02或其变体的FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示，或与SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；和/或本发明提供的人源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示，或与SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，或与SEQ ID NO：12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO：14所示，或与SEQ ID NO：14具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，或与SEQ ID NO：13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO：14所示，或与SEQ ID NO：14具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，或与SEQ ID NO：12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO：15所示，或与SEQ ID NO：15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，或与SEQ ID NO：12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO：16所示，或与SEQ ID NO：16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，或与SEQ ID NO：13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO：15所示，或与SEQ ID NO：15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，或与SEQ ID NO：13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO：17所示，或与SEQ ID NO：17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，或与SEQ ID NO：13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO：18所示，或与SEQ ID NO：18具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的人源化抗体或其抗原结合片段，进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，更优选包含人源IgG1、IgG4或其变体的重链恒定区；和/或进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，更优选包含人源κ或其变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源IgG1或其变体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，或与SEQ ID NO：9具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者，所述人源IgG4或其变体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，或与SEQ ID NO：10具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；和/或人源κ或其变体的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，或与SEQ IDNO：11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
本领域技术人员根据上述的抗体重轻链可变区和恒定区的氨基酸序列，可以容易地知道上述抗体重链、轻链的全序列，并以此得知抗体序列全信息。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD24抗体或其片段，其轻链变体优选在轻链可变区有0-10个氨基酸变化，且同时具有与变化前类似的理化性质和生物学性质。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD24抗体或其片段，其重链变体优选在重链可变区有0-10个氨基酸变化，且同时具有与变化前类似的理化性质和生物学性质。
在本发明上述的实施方案中，重链或轻链的氨基酸序列与特定序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，是指在该特定序列的基础上发生相应比例的氨基酸变化，且同时具有与该特定序列类似的理化性质和生物学性质。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供的抗CD24抗体的抗原结合片段选自Fab、Fv、scFv、Fab’或F(ab’)2。
本发明进一步提供一种生物材料，所述生物材料可以是如下任意一项或多项：
(1)一种编码如上所述的任意一种抗CD24抗体或其抗原结合片段的DNA分子；所述DNA分子可以分别编码抗体的重链和轻链部分，本领域技术人员根据抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，可以推知DNA序列，并为其设置合适的表达元件，使DNA分子能够表达本发明的抗体或其抗原结合片段；
(2)含有如(1)所述的DNA分子的表达载体；
(3)含有如(1)所述的DNA分子或如(2)所述的表达载体的宿主细胞或上述宿主细胞经培养后获得的培养液、菌悬液等培养物，其中所述的宿主细胞优选为人胚肾293细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
本发明进一步提供一种生产抗CD24抗体或其抗原结合片段的方法，包括步骤：培养如上所述的宿主细胞；优选地，还包括从获得的培养物中分离抗体，以及对所述抗体进行纯化。
本发明进一步提供一种药物组合物，其含有任意一种本发明所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段，和/或任意一种本发明所述的生物材料(如DNA分子、表达载体、宿主细胞及其培养物)；所述药物组合物还包含可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明进一步提供一种检测或诊断试剂盒，其含有任意一种本发明所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段，和/或任意一种本发明所述的生物材料(如DNA分子、表达载体、宿主细胞及其培养物)；用于检测、诊断、预后CD24或CD24介导的疾病或病症。
本发明进一步提供一种根据本发明所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段、生物材料(如DNA分子、表达载体、宿主细胞及其培养物)在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防CD24介导的疾病或病症。
本发明进一步提供一种治疗或预防CD24介导的疾病或病症的方法，包括给予所需患者治疗有效量的根据本发明所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段、生物材料(如DNA分子、表达载体、宿主细胞及其培养物)或药物组合物。
本发明进一步提供一种根据本发明所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段、生物材料(如DNA分子、表达载体、宿主细胞及其培养物)、药物组合物或试剂盒在检测、诊断、预后CD24或CD24介导的疾病或病症中的用途。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明所述的CD24介导的疾病或病症为表达CD24的肿瘤，更优选为乳腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、直肠癌、胰腺癌或鼻咽癌。
附图说明：
图1：本发明的抗CD24鼠抗与MCF7肿瘤细胞的亲和活性。
图2：本发明的抗CD24嵌合抗体介导的巨噬细胞对HEK293-hCD24细胞的吞噬活性。
图3：本发明的抗CD24嵌合抗体介导的巨噬细胞对SKOV3肿瘤细胞的吞噬活性。
图4：本发明的抗CD24嵌合抗体介导的巨噬细胞对MCF7肿瘤细胞的吞噬活性。
图5：本发明的抗CD24嵌合抗体介导的效应细胞对SKOV3肿瘤细胞的ADCC效应。
图6：本发明的抗CD24人源化抗体与MCF7肿瘤细胞的结合能力。
图7：本发明去除翻译后修饰位点的抗CD24人源化抗体与MCF7肿瘤细胞的结合能力。
图8：本发明的抗CD24人源化抗体介导的巨噬细胞对MCF7肿瘤细胞的吞噬活性。
图9：本发明去除翻译后修饰位点的抗CD24人源化抗体介导的巨噬细胞对MCF7肿瘤细胞的吞噬活性。
具体实施方式
术语和定义
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
本发明所述的抗体是指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有K链或λ链。
在本发明中，本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、2、3、4或其变体的重链恒定区。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则。
术语“鼠源抗体”或简称“鼠抗”，为根据本领域知识和技能制备的与抗原特异性结合的单克隆抗体。制备时用抗原注射试验对象(鼠)，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人抗体恒定区基因连接成嵌合基因后插入载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指在不显著影响抗原结合特性的情况下，将非人来源(如小鼠)的CDR序列移植到人的抗体可变区框架。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应的缺点。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区进行最少回复突变，以保持活性。
本发明中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段和scFv片段，其包含抗体的一个或多个CDR区。
Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(scFv)。
Fab片段即由VL、VH、CL、CH1结构域组成的单价片段。
F(ab’)2即由通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab’片段形成的二价片段。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。
本发明所述的单克隆抗体、单抗或mAb，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到，包括鼠源单抗、嵌合单抗、人源化单抗。
“亲和性(affinity)”或“结合性”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合对象(例如抗原)之间非共价交互作用的总和强度。除非另外表明，本发明中所使用的“亲和性(binding affinity)”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1∶1交互作用的固有结合亲和力。分子X对其结合对象Y的亲和性通常以解离常数(KD)表示。亲和性可通过本领域已知的常用方法进行测定，包括本发明所述的那些。
“特异性结合(specific binding或specifically binds to)”、“对...具有特异性(specific for)”、“选择性结合(selectivelybinds)”和“对...具有选择性(selectivefor)”特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原的表位意指与非特异性或选择性交互作用有测定上不同的结合。特异性结合可通过例如测定分子的结合相较于对照分子的结合来测定。特异性结合亦可通过与类似于靶标的对照分子(诸如过量的未标示靶标)的竞争来测定。本发明使用的术语“kd”(sec-1)是指特定抗体-抗原交互作用的解离速率常数。此值亦称为k解离值。本发明使用的术语“ka”(M-1×sec-1)是指特定抗体-抗原交互作用的缔合速率常数。此值亦称为k缔合值。本发明使用的术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原交互作用的解离平衡常数。KD＝kd/ka。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种抗CD24抗体或其抗原结合片段的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻，如根据本领域已知的统计学检验方法如Studentt检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson(1987)Molecular Biology of the Gene，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
在本发明中，所述抗体轻链或重链的变体即包括在轻链或重链中发生0-10个氨基酸的“保守修饰”或“保守置换或取代”，本领域技术人员可以预期该变体具有与修饰或取代前基本相同的活性。此外，本发明中所述的抗体轻链或重链的变体还包括回复突变后的结果，即将人源化抗体FR区个别人源模板的氨基酸回复突变回相应位点的鼠源氨基酸。本领域技术人员可以预期该变体与回复突变前的人源化抗体以及包含相同CDR的鼠源抗体具有类似或更好的活性。
“有效量”包含足以改善或预防医学病症或症状的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指要根据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。
“序列同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同一的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同一性。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同一性百分率时进行比较。本领域技术人员可以判断序列同一性百分比所表示的变化的碱基数或氨基酸数量。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞株”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同，包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述抗CD24抗体或其抗原结合片段的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
MCF7是一种人乳腺癌细胞系，其细胞表面天然表达人CD24蛋白，用于检测抗CD24抗体对CD24抗原的亲和力以及吞噬活性；
SKOV3是一种人卵巢癌细胞系，其细胞表面天然表达人CD24蛋白，用于检测抗CD24抗体对CD24抗原的亲和力以及吞噬活性；
本发明中涉及的编码抗CD24抗体的CDR、可变区或轻重链的DNA序列可以根据相应的氨基酸序列设计，这是本领域的常规技术。
“CD24”和“CD24抗原(CD24 antigen)”以及“CD24蛋白”在本发明中可互换使用，均指热稳定抗原或小细胞肺癌簇4抗原，是一种高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phoshphatidyl-inositol，GPI)锚定表面蛋白。除非另行说明，所述术语包括由细胞天然表达或由经CD24基因转染的细胞表达的人CD24的任何变体、亚型及物种同源物。
本发明中，“抗CD24鼠源/嵌合/人源化抗体或其抗原结合片段”和“CD24鼠源/嵌合/人源化抗体或其抗原结合片段”、“针对CD24的鼠源/嵌合/人源化抗体或其抗原结合片段”、“CD24抗体”、“本发明抗体”具有相同含义，均指和CD24具有特异性结合活性的鼠源、嵌合或人源化抗体或其抗原结合片段。
本发明的吞噬活性是指：抗体通过阻断肿瘤细胞上CD24抗原与肿瘤相关巨噬细胞上Siglec-10蛋白的结合，从而抑制CD24与Siglec10结合后引起的信号级联，阻断肿瘤细胞的“别吃我”信号，恢复巨噬细胞对肿瘤细胞正常的吞噬活性。
ADCC活性：即抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，当IgG抗体通过Fab段与靶细胞表面抗原决定簇特异性结合后，其Fc段可与有FcγR的杀伤细胞等效应细胞结合，触发效应细胞的杀伤活性，直接杀伤靶细胞。
本发明的对照抗体Control-IgG1和Control-IgG4分别是指：将不与靶抗原结合的轻重链可变区片段与IgG1或IgG4抗体的轻重链恒定区组成的抗体作为对照抗体。
以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，包括但不限于如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂或材料，为市场购买的常规试剂或材料。
实施例1抗CD24鼠源抗体的制备
1.1动物免疫
通过动物免疫和融合方法制备针对人CD24的杂交瘤抗体，即抗CD24鼠源抗体：将编码人CD24全长氨基酸序列(GenBank：ACI46150.1)的核苷酸序列(GeneID：100133941)克隆到pLVX-IRES-Puro载体(Clontech，产品目录号：632183)，标记为pLVX-IRES-hCD24-Puro。将pLVX-IRES-hCD24-Puro转染至空白细胞HEK293(Invitrogen)细胞和CHO-K1(ATCC)细胞，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，得到过表达人CD24的稳定细胞系HEK293-hCD24和CHO-K1-hCD24。
将5只6-8周龄的SJL雌鼠(上海斯莱克)饲养在SPF(无特定病原体)条件下。将上述HEK293-hCD24细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬为1E07细胞/mL的细胞悬液。每只小鼠免疫时腹腔注射0.5mLHEK293-hCD24细胞悬液。初次和第二次加强免疫之间间隔2周，以后每次加强免疫间隔3周，共免疫3次。
除初次免疫以外，每次加强免疫1周后采血，用FACS检测血清中产生抗人CD24抗体的效价，具体检测方法如下：将CHO-K1-hCD24细胞用PBS重悬至细胞密度为4E06。将细胞按照2E05/孔加入到96孔板中，添加100μL按照1∶100和1∶1000稀释的免疫小鼠血清，并添加终浓度为1μg/mL市售抗体SN3(Novus，NB100-64861)作为阳性对照。将细胞在4℃孵育30分钟，然后用PBS缓冲液洗涤两次。将细胞用100μL驴抗鼠IgG(H+L)-Alexa Flour488二抗(Invitrogen，A21202)1∶1000稀释液重悬，4℃孵育30分钟并用PBS缓冲液洗涤两次，通过流式细胞术进行分析。
1.2杂交瘤融合和筛选
选择血清抗体效价较好的小鼠，使用抗原CD24-hFc(R&D)按照25μg/只的量对小鼠进行加强免疫，3-5天后处死加强免疫的小鼠，提取脾脏并进行均质化以产生单细胞悬液，同时准备骨髓瘤细胞(SP2/0)(ATCC)单细胞悬液。将脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞按照4∶1的比例，使用电融合程序进行融合。将融合的细胞重悬于含杂交瘤细胞选择剂DMEM(Invitrogen)+20％FBS+HAT(Corning)的完全培养基中，并以200μL/孔接种至96孔板中。将96孔板在37℃、5％CO2的孵箱中培养10～14天，取细胞上清，采用FACS方法检测鼠源抗体与CHO-K1-hCD24的结合情况，挑选平均荧光强度(MFI)较高的阳性母克隆进行亚克隆。通过有限稀释法将阳性母克隆进行亚克隆，将包含亚克隆细胞的96孔板在37℃、5％CO2培养箱中孵育7天。用
eX3细胞生物学高内涵分析平台对第一次亚克隆板进行Acumen检测，将Acumen检测的阳性单克隆挑至24孔板，在100μLDMEM+20％FBS+1×HT培养基中扩大培养。培养三天后，FACS测定细胞上清对CHOK1-hCD24的结合活性。
根据鼠源抗体与CHO-K1-hCD24结合选出针对CD24最优的鼠源抗体mM01。
1.3杂交瘤测序
对鼠源抗体mM01可变区进行测序：提取杂交瘤细胞的mRNA，逆转录为cDNA后，通过通用引物进行PCR，将PCR得到的DNA产物进行测序分析，再翻译成氨基酸序列，并对可变区序列使用Kabat规则进行CDR区分析，其中，重链CDR1根据IMGT原则增加了5个氨基酸，得到结果如表1所示。
表1：抗CD24鼠源抗体mM01的氨基酸序列
| 名称 | 序列编号 |
| 重链CDR1 | SEQ D NO：1 |
| 重链CDR2 | SEQ ID NO：2 |
| 重链CDR3 | SEQ ID NO：3 |
| 轻链CDR1 | SEQ D NO：4 |
| 轻链CDR2 | SEQ ID NO：5 |
| 轻链CDR3 | SEQ D NO：6 |
| 重链可变区 | SEQ ID NO：7 |
| 轻链可变区 | SEQ ID NO：8 |
实施例2鼠抗mM01对CD24阳性肿瘤细胞MCF7亲和活性检测
收集MCF7(乳腺癌细胞，ATCC)细胞，用PBS重悬至细胞密度为4E06。将细胞按照50μL/孔加入到96孔板中，并分别添加50μL终浓度范围为25、5、1、0.2、0.04μg/ml的鼠抗mM01和对照抗体SN3(Novus，NB100-64861)。将细胞在4℃孵育30分钟，然后用PBS缓冲液洗涤两次。将细胞用100μL山羊抗鼠IgG-FITC二抗(Jackson Immunoresearch，115-095-071)1：200的稀释液重悬，4℃孵育30分钟，用PBS缓冲液洗涤两次，通过流式细胞术进行分析，结果如图1所示。
结果表明，本发明的鼠抗mM01与MCF7细胞的亲和活性显著优于对照鼠抗SN3。
实施例3抗CD24嵌合抗体的制备
将鼠源抗体mM01的重链可变区定向插入含有信号肽和人源重链IgG1恒定区，或含有信号肽和人源重链IgG4(S228P)恒定区的表达载体pcDNA3.4(Invitrogen，A14697)中；将鼠源抗体mM01的轻链可变区定向插入含有信号肽和人轻链kappa恒定区的表达载体pcDNA3.4(Invitrogen，A14697)中。
复苏Expi293F细胞至Expi293表达培养基(Gibco)中，在37℃、8％CO2的摇床中培养；转染前24小时将细胞密度调至2E06，转染前对细胞计数；将2ml预热的Opti-MEM(Gibco)培养基平分至两个离心管中，其中一管中加入等量的抗体轻、重链质粒，并进行混匀；将100μL的转染试剂加入另一离心管，室温孵育5分钟：将质粒与转染试剂混合，并室温孵育20分钟，然后加入到Expi293F细胞中；转染16小时后加入相应量的Enhancer1和Enhancer 2培养基(Gibco)至细胞培养液中；培养表达5天后收集上清液，采用MabSelect PrismA(GE，10293703)进行纯化，得到抗CD24嵌合抗体。
表2：本发明抗CD24嵌合抗体的氨基酸序列
| 抗体名称 | 重链可变区 | 轻链可变区 | 人源重链恒定区 | 人源轻链恒定区 |
| ChM01-IgG1 | SEQ ID NO：7 | SEQ ID NO：8 | SEQ ID NO：9 | SEQ ID NO：11 |
| ChM01-IgG4 | SEQ ID NO：7 | SEQ ID NO：8 | SEQ ID NO：10 | SEQ ID NO：11 |
实施例4抗CD24嵌合抗体的吞噬活性检测
单核细胞诱导巨噬细胞：抽取健康志愿者的外周血，利用密度梯度离心方法分离人外周血淋巴细胞(PBMC)，实验前将冻存的PBMC复苏，将PBMC在10cm培养皿中按照1～2E07/培养皿的细胞数量铺于培养皿中贴壁处理附着2～4h，去除未附着的细胞，剩余的贴壁细胞即为单核细胞；将RPMI1640+10％FBS+20ng/ml rhMCSF(Peprotech，300-25-100)加入至单核细胞(第0天)，放入细胞孵箱进行培养，第2天用含细胞因子rhMCSF的新鲜培养基进行换液；第4天和第6天，用PBS冲洗细胞，用含细胞因子rhMCSF的新鲜培养基换液；第7天，用胰酶(TrypLETM Express Enzyme)(Gibco，12604013)处理细胞，将诱导成熟的巨噬细胞从培养皿上分离。用RPMI1640+10％FBS洗涤细胞2次，并重悬至5E05的细胞密度。
CFSE标记肿瘤细胞：收集表达CD24抗原的HEK293-hCD24、MCF7和SKOV3(ATCC)肿瘤细胞，用PBS洗涤细胞两次，去除游离蛋白。PBS重悬肿瘤细胞，加入2μM CFSE染料(羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，Invitrogen)室温处理8min，标记肿瘤细胞，加入与PBS等体积的FBS终止染色，37℃孵育10分钟。用2％FBS+PBS洗涤细胞2次后，重悬至1E06的细胞密度。
分别将抗CD24嵌合抗体(ChM01-IgG1与ChM01-IgG4)和阳性对照抗体SN3以及阴性对照抗体(Control-IgG1和Control-IgG4)按照10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001μg/mL的终浓度，每孔50μL的量加入到96孔板中。将CFSE标记的肿瘤细胞与巨噬细胞按照1∶1细胞比例(肿瘤细胞50μL与巨噬细胞100μL)添加到96孔板中，在细胞孵箱37℃、5％CO2孵育3～4h。然后收集细胞，FACS缓冲液洗涤2次，用APC标记的小鼠抗人的CD11b抗体(BioLegend，301350)对细胞进行标记，4℃孵育30分钟，再用FACS缓冲液洗涤2次，用200μL FACS缓冲液重悬后用流式细胞仪检测。根据公式计算吞噬率，吞噬率％＝CD11b+CFSE+阳性比例/CD11b+阳性比例×100％。
检测结果如图2、图3、图4所示，结果表明本发明所述的抗CD24嵌合抗体ChM01-IgG1、ChM01-IgG4在HEK293-hCD24、MCF7肿瘤细胞上的吞噬活性均优于对照抗体SN3，且在SKOV3肿瘤细胞上也展现出较好的吞噬活性，-此外IgG1和IgG4亚型的嵌合抗体吞噬活性相当。
实施例5抗CD24嵌合抗体对CD24阳性肿瘤细胞引发的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性
抽取健康志愿者的外周血，利用密度梯度离心方法分离人外周血淋巴细胞(PBMC)，实验前将冻存的PBMC复苏，用无酚红RPMI1640+10％FBS培养基培养6h。将本申请嵌合抗体ChM01-IgG1用无酚红RPMI1640+0.5％FBS培养基配成首浓度2μg/mL母液，按照3倍梯度稀释5个浓度，50μL/孔铺于96孔细胞板，抗体终浓度分别为1、0.3、0.1、0.03、0.01μg/mL；细胞处理：收集肿瘤细胞SKOV3，用无酚红RPMI1640+0.5％FBS培养基重悬细胞；收集PBMC细胞并离心，PBS洗涤一遍后，用无酚红RPMI1640+0.5％FBS培养基重悬细胞；将肿瘤细胞与PBMC细胞按照1：20的细胞比例混合，将细胞密度调节至5E06，按照50μL/孔铺板，作用16～24h，使用乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(Roche)对样品孔进行显色处理，常温避光放置10～20分钟，终止显色反应后用MD SpectraMax 190酶标仪读板，OD490读值越高代表ADCC效应越强。
实验结果如图5所示，本发明嵌合抗体ChM01-IgG1在CD24阳性肿瘤细胞系SKOV3上显示出较好的ADCC活性。
实施例6抗CD24嵌合抗体的体内抗肿瘤活性
本发明采用SKOV3卵巢癌体内肿瘤模型测量本发明抗体的体内抗肿瘤活性。
NSG雌鼠(南模生物)，6～8周；收集SKOV3肿瘤细胞，PBS洗涤2遍后重悬至5E06的细胞密度，按照200μL/只的细胞量接种于NSG小鼠的右侧腋下。接瘤后将小鼠随机分组，每组4只，接瘤2小时后开始腹腔给药，每只小鼠注射抗体20mg/kg，一周给药两次，共给药6次；每周3次测量小鼠体重和肿瘤大小，按(长度×宽度^2)×0.5计算肿瘤体积，每组小鼠取肿瘤体积的平均值作肿瘤生长曲线图，并计算给药组的抑瘤率，抑瘤率％＝(对照组肿瘤体积-给药组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100％。
结果如表3所示，抗CD24嵌合抗体ChM01-IgG1和ChM01-IgG4在SKOV3卵巢癌模型中可以显著抑制肿瘤的生长，抑瘤率可以达到50％左右。
表3：抗CD24嵌合抗体在SKOV3卵巢癌模型中抗肿瘤活性
| 抗体 | ChM01-IgG1 | ChM01-IgG4 |
| 抑瘤率％ | 47.12 | 53.65 |
实施例7抗CD24人源化抗体的设计和抗体制备
在上述实施例1获得鼠源抗体mM01轻链可变区、重链可变区的基础上进行人源化改造。将鼠源抗体mM01重链和轻链的6个CDR嫁接到与鼠源FR区具有较高相似度的人源模板上，人源模板是在PDB数据库通过BLAST获得与鼠源抗体序列相似度较高的germline序列，其中轻链可变区模板为人种系轻链IGKV2D-29*02，重链可变区的模板为人种系重链IGHV1-2*06。
CDR移植完成的抗体通过同源建模，预测在鼠抗FR区中可能决定抗体结构的关键氨基酸，采用回复突变的方法，将FR区个别人源模板的氨基酸回复突变回鼠源氨基酸，通过亲和筛选，获得人源化的抗体。回复突变后的重链可变区的氨基酸序列为：SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13，轻链可变区的氨基酸序列为：SEQ ID NO：14。
对回复突变完成的CD24人源化抗体的序列进行翻译后修饰(PTM)分析，对轻链CDR1中PTM位点进行随机突变，通过亲和筛选，获得去除翻译后修饰位点的人源化抗体，其轻链CDR1的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22，相应的去除翻译后修饰位点的人源化抗体轻链可变区人源化抗体氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18。
对得到的人源化抗体进行表达和纯化：根据人源化抗体轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列合成cDNA，并分别插入含有信号肽和人IgG4(S228P)重链恒定区、含有信号肽和人轻链kappa恒定区的pcDNA3.4表达载体(Invitrogen，A14697)中，得到全长抗体的表达质粒。重链和轻链表达质粒共转染Expi293F细胞，培养6～7天后收获上清进行ProteinA纯化，得到本发明的人源化抗体。
表4：人源化抗体氨基酸序列
表5：去除翻译后修饰位点的人源化抗体氨基酸序列
实施例8人源化抗体亲和力测定
采用Biacore 8K生物大分子相互作用仪(GE Healthcare)进行人源化抗体亲和测定。在芯片上偶联抗人IgG-Fc抗体，利用抗人IgG抗体捕获抗CD24人源化抗体，以抗原CD24-mFc(Kactus Biosystems)为流动相，使用6个浓度梯度(400，200，100，50，25，12.5nM)，然后进行120秒缔合步骤和进行360秒的解离步骤。使用10mM甘氨酸-盐酸缓冲液进行再生，时间为30s，流速为30μl/min；使用Biacore 8K数据分析软件1.1处理数据。检测结果如表6、7所示。
结果显示，本发明的人源化抗体M01-1和M01-2以及去除翻译后修饰位点的人源化抗体M01-3至M01-7亲和水平与嵌合抗体ChM01-IgG4相当。
表6：人源化抗体的亲和力测定结果
表7：去除翻译后修饰位点的人源化抗体的亲和力测定结果
实施例9 FACS测定抗CD24人源化抗体对于MCF7细胞的结合
收集MCF7细胞，用PBS重悬至细胞密度为4E06。将细胞按照50μL/孔加入到96孔板中，并添加50μL终浓度范围为30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01μg/ml的人源化抗体(M01-1至M01-7)和嵌合抗体ChM01-IgG4。将细胞在4℃孵育30分钟，然后用PBS缓冲液洗涤两次。将细胞用100μL山羊抗人IgG-FITC二抗(Jackson Immunoresearch，109-545-003)1∶200稀释液重悬，4℃孵育30分钟，用PBS缓冲液洗涤两次，通过流式细胞仪进行分析，结果如图6和图7所示。
结果表明，本发明的人源化抗体M01-1和M01-2(图6和图7)以及去除翻译后修饰位点的人源化抗体M01-3至M01-7(图7)亲和水平与嵌合抗体ChM01-IgG4相当。
实施例10人源化抗体在MCF7肿瘤细胞上的吞噬活性
具体步骤参照实施例4
实验结果如图8和图9所示，抗CD24人源化抗体M01-1和M01-2和嵌合抗体ChM01-IgG4在MCF7肿瘤细胞上的吞噬活性相当；去除翻译后修饰位点的人源化抗体M01-3至M01-7在MCF7肿瘤细胞上的吞噬活性与未去除翻译后修饰位点的抗CD24人源化抗体的吞噬活性相当。
表8：本发明相关氨基酸序列编号与具体序列对应表
Claims (11)
1.抗CD24抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
HCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
HCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
HCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
LCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22所示；
LCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
LCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
优选地，其中所述的重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且所述的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者，
所述的重链可变区包含分别如SEQ D NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且所述的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者，
所述的重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且所述的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者，
所述的重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且所述的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者，
所述的重链可变区包含分别如SEQ D NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且所述的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.如权利要求1所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段，所述的重链可变区进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链FR区，和/或所述的轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区；
优选地，其中所述的重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，或与SEQ ID NO：7具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；和/或所述的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，或与SEQ ID NO：8具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
3.如权利要求1—2任一项所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段，为鼠源抗体或其抗原结合片段，进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，和/或进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
4.如权利要求1—2任一项所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段，为嵌合抗体或其抗原结合片段，进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG4或其变体的重链恒定区；和/或进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，优选包含人源κ或其变体的轻链恒定区；
更优选地，所述人源IgG1或其变体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，或与SEQ ID NO：9具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者，所述人源IgG4或其变体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，或与SEQ ID NO：10具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；
和/或所述人源κ或其变体的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，或与SEQID NO：11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
5.如权利要求1所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段，为人源化抗体或其抗原结合片段，所述的重链可变区进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链FR区，优选包含人种系重链IGHV1—2*06或其变体的FR区；和/或所述的轻链可变区进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链FR区，优选包含人种系轻链IGKV2D-29*02或其变体的FR区；
更优选地，所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示，或与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；和/或所述的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示，或与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；
进一步优选地，所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，或与SEQ ID NO：12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，或与SEQ ID NO：14具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ D NO：13所示，或与SEQ ID NO：13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，或与SEQ ID NO：14具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，或与SEQ ID NO：12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ D NO：15所示，或与SEQ ID NO：15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ D NO：12所示，或与SEQ ID NO：12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ D NO：16所示，或与SEQ ID NO：16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ D NO：13所示，或与SEQ ID NO：13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，或与SEQ ID NO：15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，或与SEQ ID NO：13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ D NO：17所示，或与SEQ ID NO：17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性∶或者
所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ D NO：13所示，或与SEQ ID NO：13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ D NO：18所示，或与SEQ ID NO：18具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；
进一步优选地，所述的人源化抗CD24抗体或其抗原结合片段，进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，更优选包含人源IgG1、IgG4或其变体的重链恒定区；和/或进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，更优选包含人源κ或其变体的轻链恒定区；
进一步优选地，所述人源IgG1或其变体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，或与SEQ ID NO：9具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者，所述人源IgG4或其变体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，或与SEQ ID NO：10具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；
和/或人源κ或其变体的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，或与SEQ IDNO：11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
6.如权利要求1-5任一项所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段选自Fab、Fv、scFv、Fab’或F(ab’)2。
7.一种生物材料，选自如下任意一项或多项：
(1)编码如权利要求1—6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的DNA分子；
(2)含有如(1)所述的DNA分子的表达载体；
(3)含有如(1)所述的DNA分子或如(2)所述的表达载体的宿主细胞或其培养物，其中所述的宿主细胞优选为人胚肾293细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
8.一种生产抗CD24抗体或其抗原结合片段的方法，包括步骤：培养权利要求7所述的宿主细胞；优选地，还包括从获得的培养物中分离抗体，以及对所述抗体进行纯化。
9.一种药物组合物，其含有如权利要求1-6任一项所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段，和/或权利要求7所述的生物材料；所述药物组合物还包含可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
10.一种检测或诊断试剂盒，其含有权利要求1-6任一项所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段，和/或权利要求7所述的生物材料。
11.如权利要求1—6任一项所述的抗CD24抗体或其抗原结合片段、如权利要求7所述的生物材料在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防CD24介导的疾病或病症；优选地，所述的CD24介导的疾病或病症为表达CD24的肿瘤，更优选为乳腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、直肠癌、胰腺癌或鼻咽癌。
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|---|---|
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Citations (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030185827A1 (en) * | 1994-04-29 | 2003-10-02 | Mayo Foundation | Human IgM antibodies, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system |
| DE69920062D1 (de) * | 1998-03-11 | 2004-10-14 | Genentech Inc | Protein das die überlebensrate der Stäbchen-Photorezeptor erhöht und Nukleinsäure die dafür kodieren. |
| US20100166649A1 (en) * | 2006-06-30 | 2010-07-01 | Young Kee Shin | Method to inhibit cancer targeting cd24 |
| US20110064746A1 (en) * | 2009-03-04 | 2011-03-17 | Yang Liu | Treatment of drug-related side effect and tissue damage by targeting the cd24-hmgb1-siglec10 axis |
| CN103819561A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-05-28 | 中国药科大学 | 抗cd24单克隆抗体、其可变区序列及其应用 |
| CN106046160A (zh) * | 2009-10-06 | 2016-10-26 | 阿莱斯亚生物疗法股份有限公司 | 治疗骨丢失相关疾病的 siglec 15 抗体 |
| US20160318997A1 (en) * | 2013-12-30 | 2016-11-03 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Opsonic and Protective Monoclonal Antibodies Against Gram-Positive Pathogens |
| CN106589126A (zh) * | 2016-12-07 | 2017-04-26 | 中国药科大学 | 一种抗人cd24抗体突变体的设计及其应用 |
| CN108373504A (zh) * | 2017-01-30 | 2018-08-07 | 亘喜生物科技（上海）有限公司 | Cd24特异性抗体和抗cd24-car-t细胞 |
| US20190119397A1 (en) * | 2016-04-08 | 2019-04-25 | Iti Health, Inc. D/B/A Zielbio | Plectin-1 binding antibodies and uses thereof |
| CN112480254A (zh) * | 2019-09-12 | 2021-03-12 | 上海麦济生物技术有限公司 | 抗人白细胞介素-33受体的抗体及其制备方法和应用 |
| WO2021080541A1 (en) * | 2019-10-23 | 2021-04-29 | Ankara Üniversitesi Rektörlüğü | Production of monoclonal antibody specific to cell receptor cd24 |
| US20210214458A1 (en) * | 2018-05-14 | 2021-07-15 | Oncoimmune, Inc | Anti-cd24 compositions and uses thereof |
| CN113544156A (zh) * | 2019-04-01 | 2021-10-22 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 抗Claudin18.2抗体及其应用 |
| CN113831412A (zh) * | 2021-10-13 | 2021-12-24 | 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司 | 靶向cd24的抗体及其制备和用途 |
| CN113956363A (zh) * | 2021-10-13 | 2022-01-21 | 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司 | 靶向cd47和cd24的重组融合蛋白及其制备和用途 |
| CN114269789A (zh) * | 2019-06-25 | 2022-04-01 | 伊奇罗夫科技有限公司 | 抗cd24的抗体及其用途 |
-
2023
- 2023-02-14 CN CN202310111450.7A patent/CN115947855B/zh active Active
Patent Citations (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030185827A1 (en) * | 1994-04-29 | 2003-10-02 | Mayo Foundation | Human IgM antibodies, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system |
| DE69920062D1 (de) * | 1998-03-11 | 2004-10-14 | Genentech Inc | Protein das die überlebensrate der Stäbchen-Photorezeptor erhöht und Nukleinsäure die dafür kodieren. |
| US20100166649A1 (en) * | 2006-06-30 | 2010-07-01 | Young Kee Shin | Method to inhibit cancer targeting cd24 |
| US20110064746A1 (en) * | 2009-03-04 | 2011-03-17 | Yang Liu | Treatment of drug-related side effect and tissue damage by targeting the cd24-hmgb1-siglec10 axis |
| CN106046160A (zh) * | 2009-10-06 | 2016-10-26 | 阿莱斯亚生物疗法股份有限公司 | 治疗骨丢失相关疾病的 siglec 15 抗体 |
| US20160318997A1 (en) * | 2013-12-30 | 2016-11-03 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Opsonic and Protective Monoclonal Antibodies Against Gram-Positive Pathogens |
| CN103819561A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-05-28 | 中国药科大学 | 抗cd24单克隆抗体、其可变区序列及其应用 |
| US20190119397A1 (en) * | 2016-04-08 | 2019-04-25 | Iti Health, Inc. D/B/A Zielbio | Plectin-1 binding antibodies and uses thereof |
| CN106589126A (zh) * | 2016-12-07 | 2017-04-26 | 中国药科大学 | 一种抗人cd24抗体突变体的设计及其应用 |
| CN108373504A (zh) * | 2017-01-30 | 2018-08-07 | 亘喜生物科技（上海）有限公司 | Cd24特异性抗体和抗cd24-car-t细胞 |
| US20210214458A1 (en) * | 2018-05-14 | 2021-07-15 | Oncoimmune, Inc | Anti-cd24 compositions and uses thereof |
| CN113544156A (zh) * | 2019-04-01 | 2021-10-22 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 抗Claudin18.2抗体及其应用 |
| CN114269789A (zh) * | 2019-06-25 | 2022-04-01 | 伊奇罗夫科技有限公司 | 抗cd24的抗体及其用途 |
| CN112480254A (zh) * | 2019-09-12 | 2021-03-12 | 上海麦济生物技术有限公司 | 抗人白细胞介素-33受体的抗体及其制备方法和应用 |
| WO2021080541A1 (en) * | 2019-10-23 | 2021-04-29 | Ankara Üniversitesi Rektörlüğü | Production of monoclonal antibody specific to cell receptor cd24 |
| CN113831412A (zh) * | 2021-10-13 | 2021-12-24 | 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司 | 靶向cd24的抗体及其制备和用途 |
| CN113956363A (zh) * | 2021-10-13 | 2022-01-21 | 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司 | 靶向cd47和cd24的重组融合蛋白及其制备和用途 |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| A V SALNIKOV等: "Antibody targeting of CD24 efficiently retards growth and influences cytokine milieu in experimental carcinomas", 《BRITISH JOURNAL OF CANCER》, vol. 108, no. 07, pages 1449 - 1459, XP055838697, DOI: 10.1038/bjc.2013.102 * |
| FUMOU SUN等: "Engineering a high-affinity humanized anti-CD24 antibody to target hepatocellular carcinoma by a novel CDR grafting design", 《ONCOTARGET》, vol. 08, no. 31, pages 51238 - 51252, XP055779989, DOI: 10.18632/oncotarget.17228 * |
| GENBANK: "AAB32552.1: anti-Sm autoantibody SM2K, partial [Mus sp.]", 《GENBANK》 * |
| GENBANK: "BAC54683.1: V23-D-J-IgG1, partial [Mus musculus]", 《GENBANK》 * |
| GENBANK: "CAG26868.1: immunoglobulin heavy chain variable region, partial [Mus musculus]", 《GENBANK》 * |
| YUE HAN等: "CD24 targeting bi-specific antibody that simultaneously stimulates NKG2D enhances the efficacy of cancer immunotherapy", 《JOURNAL OF CANCER RESEARCH AND CLINICAL ONCOLOGY》, vol. 145, no. 05, pages 1179 - 1190, XP036766044, DOI: 10.1007/s00432-019-02865-8 * |
| 丛鹏: "胰腺癌CD24CD44表面抗体阳性细胞被携带特异Smo慢病毒转染后的表达及细胞生物特性影响", 《中国博士学位论文全文数据库》, no. 2019 * |
| 林洁等: "人CD24分子成熟多肽的原核表达及抗体制备", 《中国生物工程杂志》, vol. 31, no. 12, pages 39 - 45 * |
| 马招兄等: "基于酶催化抗体药物偶联物中抗体的定点突变及鉴定", 《药学学报》, vol. 52, no. 03, pages 403 - 408 * |
| 黄泽坚等: "靶向CD24分子3E10增强肝癌HuH-7细胞的化疗敏感度", 《肿瘤防治研究》, vol. 45, no. 08, pages 540 - 544 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115947855B (zh) | 2023-10-27 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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