TW202237658A - 抗ｔｎｆｒ２人源化抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一種能夠特異性地結合TNFR2的人源化抗體或其抗原結合片段，所述人源化抗體或其抗原結合片段能夠調節免疫細胞的功能，可作為藥物治療與免疫異常有關的疾病，例如腫瘤。

Description

抗TNFR2人源化抗體及其用途
本發明涉及生物醫藥和生物工程領域，具體而言，涉及抗TNFR2的人源化抗體或其抗原結合片段，以及所述抗TNFR2人源化或其抗原結合片段的藥物組合物及其用途。
本申請要求於2021年1月29日提交到中國國家智慧財產權局的發明名稱為“抗TNFR2人源化抗體及其用途”的中國專利申請202110140980.5和於2021年8月31日提交到中國國家智慧財產權局的發明名稱為“抗TNFR2人源化抗體及其用途”的中國專利申請202111016307.7的優先權，其內容均通過引用以整體併入本文。
免疫是機體的一種保護反應，受到很多基因、蛋白質以及細胞的作用。免疫異常會引起許多疾病，包含腫瘤、免疫缺陷(如愛滋病等)、過敏和類風濕性關節炎等疾病。在過去幾年中，腫瘤免疫療法作為一種全新的治療方式，已成為腫瘤治療研究領域的一大熱點。靶向免疫檢查點蛋白的拮抗性抗體，如抗PD-1和抗CTLA-4單抗，已被用於治療多種類型的癌症，且取得了革命性的結果，大大延長了惡行腫瘤患者的生存期。然而還是有許多癌症患者對於免疫檢查點蛋白的拮抗性抗體的治療沒有反應或在短暫治療後產生抗性或耐藥性。因此需要開發新的治療癌症的藥物，可單用或與其它腫瘤治療方法聯用，包含與免疫檢查點蛋白的拮抗性抗體聯合使用，以進一步提高療效和安全性。
發明人發現，人TNFR2在人調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)和人的多種腫瘤細胞表面過度表達，提示人TNFR2可能促進患者腫瘤發生並介導腫瘤微環境的免疫抑制和免疫逃逸。通過TNFR2調控Treg細胞的功能，從而抑制腫瘤的發生，可能是一條非常有潛力的抗腫瘤策略。發明人製備了針對 TNFR2的拮抗性抗體，其可以1)特異性結合TNFR2，阻斷TNFR2和其配體TNFα的結合，從而抑制Treg細胞的增殖及其介導的抑制功能，促進效應T細胞的擴增以及效應T細胞和其他免疫細胞介導的抗腫瘤功能；2)由於TNFR2在人的腫瘤細胞系上高表達，此抗體也可直接介導對TNFR2高表達腫瘤細胞的殺傷作用；3)和現有抗PD-1/L1聯用有更好的抗腫瘤效果並形成持久的免疫記憶。針對上述抗TNFR2的拮抗性抗體的描述，請參見PCT/CN2020/106057，該專利申請的全部內容通過引用的方式結合於本申請中。
本發明製備獲得了抗TNFR2的人源化抗體或其抗原結合片段，以及製備了所述抗TNFR2人源化或其抗原結合片段的藥物組合物，並驗證了其用途。
在第一方面，本發明提供了一種特異性結合TNFR2的人源化抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區；
(1)所述重鏈可變區(heavy chain variable region,VH)包含：
a.選自SEQ ID NO.19~27任一所示的VH序列，
b.選自與SEQ ID NO.19~27任一序列相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH序列，或，
c.選自與SEQ ID NO.19~27任一序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的VH序列；
(2)所述輕鏈可變區(light chain variable region,VL)包含：
a.選自SEQ ID NO.28~37任一所示的VL序列，
b.選自與SEQ ID NO.28~37任一序列相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VL序列，或，
c.選自與SEQ ID NO.28~37任一序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的VL序列；
可選地，所述氨基酸插入、缺失和/或替換發生在重鏈可變區或/和輕鏈可變區的骨架區(framework region,FR)區；
可選地，所述替換為保守氨基酸的替換。
在某些實施方案中，在本發明所述的抗體或其抗原結合片段中，所述重鏈可變區包含與SEQ ID NO.19~27任一序列相比互補決定區(Complementarity-determining region,CDR)完全一致，FR具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH序列；所述輕鏈可變區包含與SEQ ID NO.28~37任一序列相比CDR完全一致，FR具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VL序列。
在某些實施方案中，本發明所述的抗體或其抗原結合片段包含的重鏈可變區和輕鏈可變區選自如下組：
(1)具有SEQ ID NO.19所示的VH和SEQ ID NO.28所示的VL；
(2)具有SEQ ID NO.20所示的VH和SEQ ID NO.29所示的VL；
(3)具有SEQ ID NO.19所示的VH和SEQ ID NO.30所示的VL；
(4)具有SEQ ID NO.20所示的VH和SEQ ID NO.31所示的VL；
(5)具有SEQ ID NO.19所示的VH和SEQ ID NO.31所示的VL；
(6)具有SEQ ID NO.21所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
(7)具有SEQ ID NO.22所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
(8)具有SEQ ID NO.23所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
(9)具有SEQ ID NO.24所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
(10)具有SEQ ID NO.25所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
(11)具有SEQ ID NO.26所示的VH和SEQ ID NO.33所示的VL；
(12)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.34所示的VL；
(13)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.35所示的VL；
(14)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.33所示的VL；
(15)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.36所示的VL；
(16)具有SEQ ID NO.26所示的VH和SEQ ID NO.34所示的VL；
(17)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.37所示的VL；
(18)具有與上述(1)~(17)任一序列組合相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH和VL組合；
(19)具有與上述(1)~(17)任一項序列組合相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的VH和VL組合；或，
(20)具有與上述(1)~(17)任一項序列組合相比CDR完全一致，FR具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH和VL組合；
可選地，所述氨基酸插入、缺失和/或替換發生在重鏈可變區或/和輕鏈可變區的FR區；
可選地，所述替換為保守氨基酸的替換。
在某些實施方案中，在本發明所述的抗體或其抗原結合片段中，所述抗體或其抗原結合片段包含：CDR1-VH選自SEQ ID NO.1、7、或13；CDR2-VH選自SEQ ID NO.2、8、或14；CDR3-VH選自SEQ ID NO.3、9、或15；CDR1-VL選自SEQ ID NO.4、10、或16；CDR2-VL選自SEQ ID NO.5、11、或17；和CDR3-VL選自SEQ ID NO.6、12、或18。
在某些實施方案中，本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其與人TNFR2結合的解離常數(KD)不大於7nM，與食蟹猴TNFR2結合的解離常數(KD)不大於5nM。
在某些實施方案中，本發明所述的抗體或其抗原結合片段包含或不包含重鏈恒定區(heavy chain constant region,CH)和/或輕鏈恒定區(light chain constant region,CL)；優選地，所述重鏈恒定區包含全長重鏈恒定區或其片段，所述片段可選自CH1結構域、Fc結構域或CH3結構域；優選地，所述重鏈恒定區和/或輕鏈恒定區為人重鏈恒定區和/或人輕鏈恒定區；優選地，所述重鏈恒 定區可選自免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)重鏈恒定區，例如IgG1重鏈恒定區、IgG2重鏈恒定區、IgG3重鏈恒定區或IgG4重鏈恒定區；優選地，所述重鏈恒定區是人IgG1重鏈恒定區、人IgG2重鏈恒定區、人IgG3重鏈恒定區或人IgG4重鏈恒定區。
在某些實施方案中，本發明所述的抗體或其抗原結合片段，選自單株抗體、多株抗體、天然抗體、工程化抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、單價抗體、多價抗體、全長抗體、抗體片段、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv(single-chain fragment variable)、或雙抗體(diabody)。
在某些實施方案中，本發明所述的抗體或其抗原結合片段，通過或不通過接頭(linker)偶聯有另一分子；優選地，所述另一分子可選自治療劑或示蹤劑；優選地，所述治療劑選自放射性同位素、化療藥或免疫調節劑，所述示蹤劑選自放射學造影劑、順磁離子、金屬、螢光標記、化學發光標記、超聲造影劑或光敏劑。
在某些實施方案中，本發明所述的抗體或其抗原結合片段，具有以下特性：
(1)特異性結合細胞表面表達TNFR2的細胞；(2)特異性結合Treg細胞；(3)抑制TNFα與TNFR2蛋白的結合；(4)抑制TNFα與細胞表面表達的TNFR2的結合；(5)抑制TNFα介導的Treg的增殖和/或Treg功能；(6)抑制TNFα介導的IκBα降解；(7)抑制Treg對Tcon細胞增殖的抑制；(8)介導針對TNFR2表達細胞的抗體依賴性的細胞媒介之細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)功能；(9)提升腫瘤浸潤免疫細胞TIL中CD8+ T/Treg細胞比例；或/和(10)抑制腫瘤生長。
在第二方面，本發明提供了一種多特異性抗原結合分子，所述多特異性抗原結合分子至少包含第一抗原結合模組和第二抗原結合模組，所述第一抗原結合模組包含本發明所述的抗體或其抗原結合片段，所述第二抗原結合模組特異性結合TNFR2以外的其他抗原或結合與第一抗原結合模組不同的TNFR2抗原表位；優選地，所述其他抗原選自CD3、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD16A、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、 CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD80、CD86、CD126、CD138、B7、PD-1、PD-L1、PD-2、CTLA4、PRVIG、TIGHT、HAS、CLDN18.2、MSLN、MUC、Ia、HLA-DR、腱生蛋白、EGFR、VEGF、P1GF、ED-B纖連蛋白、癌基因產物、IL-2、IL-6、IL-15、IL-21、TRAIL-R1或TRAIL-R2；優選地，所述多特異性抗體為“雙特異性”、“三特異性”或“四特異性”。
在第三方面，本發明提供了一種嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor,CAR)，所述嵌合抗原受體包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域；所述細胞外抗原結合結構域包含本發明第一方面所述TNFR2人源化抗體或其抗原結合片段，或包含本發明第二方面所述多特異性抗原結合分子。
在第四方面，本發明提供了一種免疫效應細胞，所述免疫效應細胞包含本發明第三方面所述嵌合抗原受體或包含編碼本發明第三方面所述嵌合抗原受體的核酸的片段；優選地，所述免疫效應細胞選自T細胞、NK細胞(natural killer cell)、NKT細胞(natural killer Tcell)、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞或肥大細胞；所述T細胞可選自炎性T細胞、細胞毒性T細胞、調節性T細胞(Treg)或輔助性T細胞；優選地，所述免疫效應細胞為同種異體免疫效應細胞或自體免疫細胞。
在第五方面，本發明提供了一種分離的核酸片段，所述核酸片段編碼本發明第一方面所述TNFR2人源化抗體或其抗原結合片段、第二方面所述多特異性抗原結合分子或第三方面所述的嵌合抗原受體。
在第六方面，本發明提供了一種載體(vector)，所述載體包含第五方面所述核酸片段。
在第七方面，本發明提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包含第六方面所述載體；優選地，所述細胞為原核細胞或真核細胞，例如細菌(大腸桿菌)、真菌(酵母)、昆蟲細胞或哺乳動物細胞(CHO細胞系或293T細胞系)；優選地，所述細胞缺乏岩藻糖基轉移酶，更優選地，所述岩藻糖基轉移酶是FUT8。
在第八方面，本發明提供了一種製備本發明任一項所述抗體或其抗原結合片段或本發明所述多特異性抗原結合分子的方法，所述方法包括培養第七方面所述細胞，以及分離所述細胞表達的抗體或其抗原結合片段或多特異性抗原結合分子。
在第九方面，本發明提供了一種製備免疫效應細胞的方法，所述方法包括將編碼前述CAR的核酸片段導入所述免疫效應細胞，可選地，所述方法還包括啟動所述免疫效應細胞表達所述CAR。
在第十方面，本發明提供了一種藥物組合物，所述組合物包含本發明所述的抗體或其抗原結合片段、本發明所述的多特異性抗原結合分子、本發明所述的嵌合抗原受體、本發明所述的免疫效應細胞、本發明所述的核酸片段、本發明所述的載體、本發明所述的細胞或本發明所述方法製備獲得的產品；優選地，所述組合物還包含藥學上可接受的載體(carrier)、稀釋劑或助劑；優選地，所述組合物還包含額外的抗腫瘤劑、免疫治療劑或免疫抑制劑；優選地，所述額外的抗腫瘤劑選自PD-1抗體、PD-L1抗體或CTLA-4抗體。
在第十一方面，本發明提供了所述的抗體或其抗原結合片段、所述的多特異性抗原結合分子、所述的嵌合抗原受體、所述的免疫效應細胞、所述的核酸片段、所述的載體、所述的細胞、所述方法製備獲得的產品以及所述藥物組合物在製備治療和/或預防免疫異常相關疾病的藥物中的用途；優選地，所述免疫異常相關疾病是Treg細胞和/或髓源性抑制型細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)功能相關疾病；優選地，所述疾病是癌症或自身免疫性疾病；優選地，所述癌症選自卵巢癌、晚期表皮T細胞淋巴瘤、III/IV期轉移性結直腸癌、三陰乳腺癌、胰腺癌、非小細胞肺癌和/或對CTLA-4和PD-1療法耐藥的晚期實體瘤，如轉移性黑色素瘤；優選地，所述自身免疫性疾病可選自類風濕性關節炎、多發性硬化症、系統性硬化症、視神經脊髓炎譜系病、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力、IgG4相關性疾病。
在第十二方面，本發明提供了一種治療和/或預防免疫異常相關疾病的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的本發明所述的抗體或其抗原結合片段、所述的多特異性抗原結合分子、所述的嵌合抗原受體、所述的免疫效應 細胞、所述的核酸片段、所述的載體、所述的細胞、所述方法製備獲得的產品或所述藥物組合物；優選地，所述免疫異常相關疾病是Treg細胞和/或MDSC功能相關疾病；優選地，所述疾病是癌症或自身免疫性疾病；優選地，所述癌症選自卵巢癌、晚期表皮T細胞淋巴瘤、III/IV期轉移性結直腸癌、三陰乳腺癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、和/或對CTLA-4和PD-1療法耐藥的晚期實體瘤，如轉移性黑色素瘤；優選地，所述自身免疫性疾病可選自類風濕性關節炎、多發性硬化症、系統性硬化症、視神經脊髓炎譜系病、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力、IgG4相關性疾病。
在第十三方面，本發明還提供了向所述物件施用額外的抗腫瘤治療，例如化療劑、靶向治療劑和免疫治療劑，包括PD-1/PD-L1治療如抗PD-1/PD-L1抗體、抗CTLA-4治療劑如抗CTLA-4抗體；優選地，所述額外的抗腫瘤治療選自PD-1/PD-L1治療；優選地，所述PD-1/PD-L1治療選自PD-L1抗體。
在第十四方面，本發明提供了一種體外檢測TNFR2的方法，其包括使懷疑含有TNFR2的樣品與本發明所述的抗體或其抗原結合片段相接觸的步驟。
術語定義和說明
除非另外說明，本文所用術語具有所屬技術領域普通技術人員通常理解的含義。對於本文中明確定義的術語，則該術語的含義以所述定義為準。
如本文所用，術語“TNFR2”是指腫瘤壞死因數受體2，也稱為腫瘤壞死因數受體超家族成員1B(TNFRSF1B)或CD120b，這是一種結合腫瘤壞死因數-α(TNFα)的膜受體。所述TNFR2優選地是人TNFR2。
如本文所用，術語“抗-腫瘤壞死因數受體2抗體”、“腫瘤壞死因數受體2抗體”、“抗TNFR2抗體”、“TNFR2抗體”、“抗-TNFR2抗體部分”和/或“抗-TNFR2抗體片段”等是指任何包含能夠特異性結合TNFR2的免疫球蛋白分子的至少一部分(例如但不限於重鏈或輕鏈的至少一個互補決定區(CDR)或其配體結合部分、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恒定區、骨架區或其任何部分)的含蛋白質或肽的分子。TNFR2抗體還包括抗體樣蛋白支架(如第十纖連蛋白 III型結構域(10Fn3))，其含有與抗體CDR在結構和溶劑可及性上相似的BC、DE和FG結構環。10Fn3結構域的三級結構類似於IgG重鏈可變區的三級結構，並且通過將10Fn3的BC、DE和FG環的殘基用來自TNFR2單株抗體的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3區的殘基替換，本領域技術人員可以將例如TNFR2單株抗體的CDR接枝到纖連蛋白支架上。
如本文所用，術語“抗體”(Ab)是指與目標抗原特異性結合或具有免疫反應性的免疫球蛋白分子，包括抗體的多株、單株、基因工程化和其他修飾形式(包括但不限於嵌合抗體，人源化抗體，全人源抗體，異源偶聯抗體(例如雙特異性、三特異性和四特異性抗體，雙抗體，三抗體和四抗體)，抗體綴合物)以及抗體的抗原結合片段(包括例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)。此外，除非另有說明，否則術語“單株抗體”(monoclonal antibody,mAb)意指包括能夠特異性結合靶蛋白的完整抗體分子以及不完整的抗體片段(例如Fab和F(ab’)2片段，它們缺少完整抗體的Fc片段(從動物迴圈中更快地清除)，因此缺乏Fc介導的效應功能(effector function)(參見Wahl等人，J.Nucl.Med.24：316,1983；其內容援引加入本文)。
如本文所用，術語“單株抗體”是指來源於單個株(包括任何真核、原核、或噬菌體株)的抗體，而不限於該抗體的產生方法。
如本文所用，術語“抗原結合片段V和“抗體片段”可互換，是指保留特異性結合靶抗原的能力的一個或更多個抗體片段。抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段執行。抗體片段可以是Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP(Small Modular Immunopharmaceutical)、雙抗體、三抗體、親和體(affibody)、奈米抗體、適體或結構域抗體。涵蓋術語抗體的“抗原結合片段”的結合片段的實例包括但不限於：(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL和CHl結構域組成的單價片段；(ii)F(ab)2片段，一種包含由二硫鍵在鉸鏈區連接的兩個Fab片段的雙價片段；(iii)由VH和CHl結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；(V)包含VH和VL結構域的dAb；(vi)由VH結構域組成的dAb片段(Ward等人，Nature 341：544-546,1989)；(vii)由VH或VL結構域組成的dAb；(viii)分離的互補決定區(CDR)；以及(ix)兩個或更多個分離 的CDR的組合，所述CDR可以任選地由合成接頭連接。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH是通過獨立的基因編碼的，但是這兩個結構域可以使用重組方法通過接頭接合，該接頭能夠使其製成其中VL和VH區配對以形成單價分子的單蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等人，Science 242：423-426,1988以及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883,1988)。這些抗體片段可以使用本領域技術人員已知的常規技術獲得，並且這些片段被篩選用於與完整抗體相同的方式使用。可以通過重組DNA技術、完整免疫球蛋白的酶促或化學裂解、或在一些實施方式中通過本領域已知的化學肽合成程式來產生抗原結合片段。
如本文所用，術語“互補決定區”(Complementarity-determining regions,CDR)指在輕鏈和重鏈可變結構域中均發現的高度變異區(hypervariable region)。可變結構域中更高保守性的部分稱為骨架區(FR)。如本領域所理解的，表示抗體的高度變異區的氨基酸位置可以根據上下文和本領域已知的各種定義而變化。可變結構域內的一些位置可以被視為雜合高變位置，因為這些位置可以被認為是在一組標準(如IMGT或KABAT)下的可高度變異區之內，而被認為在不同組的標準(如KABAT或IMGT)下的可高度變異區之外。這些位置中的一個或更多個也可以在延伸的可高度變異區中找到。本發明包括在這些雜合可高變的位置中包含修飾的抗體。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含主要採用片層構型的四個骨架區，其通過三個CDR(CDR1、CDR2和CDR3)連接，這三個CDR形成連接片層結構的環，並且在一些情況下形成片層結構的一部分。每條鏈中的CDR通過FR區按順序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4緊密保持在一起，並且與來自其他抗體鏈的CDR促成了抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat等人，Sequences of Protein sofImmunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,Md.1987；其通過援引加入併入本文)。例如在本文中，CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH分別是指重鏈可變區(VH)的第一個CDR、第二個CDR和第三個CDR，這三個CDR構成了重鏈(或其可變區)的CDR組合(VHCDR組合)；CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL分別是指輕鏈 可變區(VL)的第一個CDR、第二個CDR和第三個CDR，這三個CDR構成了輕鏈(或其可變區)的CDR組合(VLCDR組合)。
如本文所用，術語“Kabat編號系統”通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比對及編號系統(參見，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
如本文所用，術語“VH”是指抗體的免疫球蛋白重鏈(包括Fv、scFv或Fab的重鏈)的可變區。術語“VL”是指免疫球蛋白輕鏈(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的輕鏈)的可變區。
本文術語“重鏈恒定區”是指抗體重鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現出效應子功能，諸如與Fc受體的相互作用，其相對於抗體的可變結構域具有更保守的氨基酸序列。“重鏈恒定區”至少包含：CH1結構域，鉸鏈區，CH2結構域，CH3結構域，或其變體或片段。“重鏈恒定區”包括“全長重鏈恒定區”和“重鏈恒定區片段”，前者具有基本上與天然抗體恒定區基本相似的結構，而後者僅包括“全長重鏈恒定區的一部分”。示例性地，典型的“全長抗體重鏈恒定區”由CH1結構域-鉸鏈區-CH2結構域-CH3結構域組成；當抗體為免疫球蛋白E(Immunoglobulin E,IgE)時，其還包括CH4結構域；當抗體為重鏈抗體時，則其不包括CH1結構域。示例性地，典型的“重鏈恒定區片段”可選自CH1、Fc或CH3結構域。
本文術語“輕鏈恒定區”是指抗體輕鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，所述輕鏈恒定區可選自恒定κ結構域或恒定λ結構域。
本文術語“Fc”是指完整抗體經木瓜蛋白水解而成的抗體羧基端部分，典型地，其包含抗體的CH3和CH2結構域。Fc區包括例如天然序列Fc區、重組Fc區和變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈的Fc區的邊界可以略微變化，但是人IgG重鏈的Fc區通常被定義為從Cys226位置的氨基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。Fc區的C末端賴氨酸(根據EUKabat編號系統的殘基447)可 以例如在抗體的產生或純化過程中，或通過對編碼抗體重鏈的核酸重組工程化而除去，因此，Fc區可包括或不包括Lys447。
如本文所用，術語“百分比(%)序列一致性”和“百分比(%)序列同一性”可互換，是指在為達到最大百分比序列一致性而比對序列和引入空位(如果需要)(例如，為了最佳比對，可以在候選和參比序列中的一個或兩個中引入空位，並且出於比較的目的，可以忽略非同源序列)之後，候選序列的氨基酸(或核苷酸)殘基與參比序列的氨基酸(或核苷酸)殘基相同的百分比。出於確定百分比序列一致性的目的，可以用本領域技術人員熟知的多種方式來實現比對，例如使用公眾可得的電腦軟體，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAIi)軟體。本領域技術人員可以確定用於測量比對的適當參數，包括需要在被比較序列的全長範圍實現最大比對的任何演算法。例如，用於與候選序列進行比較而比對的參比序列可以顯示候選序列在候選序列的全長或候選序列的連續氨基酸(或核苷酸)殘基的選定部分上表現出從50%至100%的序列同一性。出於比較目的而比對的候選序列的長度可以是例如參比序列的長度的至少30%(例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%)。當候選序列中的位置被與在參比序列中的相應位置相同的氨基酸(或核苷酸)殘基佔據時，則這些分子在那個位置是相同的。
本文術語“保守氨基酸”通常是指屬於同一類或具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性、親水性、主鏈構象和剛性)的氨基酸。示例性地，下述每組內的氨基酸屬於彼此的保守氨基酸殘基，組內氨基酸殘基的替換屬於保守氨基酸的替換：
(1)酸性氨基酸：Asp(D)和Glu(E)：
(2)鹼性氨基酸：Lys(K)、Arg(R)和His(H)；
(3)親水性不帶電荷氨基酸：Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)和Gln(Q)；
(4)脂肪族不帶電荷氨基酸：Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)；
(5)非極性不帶電荷的氨基酸：Cys(C)、Met(M)和Pro(P)；
(6)芳香族氨基酸：Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。
如本文所用，術語“特異性結合”是指一種結合反應，其決定抗原在蛋白質和其他生物分子的一個異質性群體中的存在狀況，所述蛋白質和其他生物分子例如被抗體或其抗原結合片段特異性識別。與抗原特異性結合的抗體或其抗原結合片段將以小於100nM的KD與抗原結合。例如，與抗原特異性結合的抗體或其抗原結合片段將以高達100nM(例如，1pM至100nM之間)的KD與抗原結合。不顯示與特定抗原或其表位特異性結合的抗體或其抗原結合片段將顯示對該特定抗原或其表位的大於100nM(例如，大於500nM、1μM、100μM、500μM或1mM)的KD。可以使用多種免疫測定方式來選擇與特定蛋白或碳水化合物進行特異性免疫反應的抗體。例如，常規地使用固相酵素結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)來選擇與蛋白質或碳水化合物進行特異性免疫反應的抗體。參見，Harlow & Lane，Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1988)以及Harlow & Lane,Using Antibodies，A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1999)，其描述了可以用於確定特異免疫反應性的免疫測定方式和條件。
如本文所用，術語“多特異性抗體”是指具有至少兩個抗原結合位點，所述至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點與相同抗原的不同表位或與不同抗原的不同表位結合。因此，諸如“雙特異性”、“三特異性”、“四特異性”等術語是指抗體/抗原結合分子可以結合的不同表位元的數目。術語“雙特異性抗體”是指對至少兩種不同的抗原具有單株結合特異性的抗體，其通常是人或人源化的抗體。在本發明中，結合特異性之一可以針對TNFR2的抗原表位而被檢測，另一個可以針對TNFR2的另一個抗原表位或任何其他抗原，例如針對細胞表面蛋白、受體、受體亞基、組織特異性抗原、病毒來源蛋白、病毒編碼的包膜蛋白、細菌來源蛋白或細菌表面蛋白等而被檢測。
如本文所用，術語“價”表示抗體/抗原結合分子中規定數目的結合位元元點的存在。因此，術語“單價”、“二價”、“四價”和“六價”分別表示抗體/抗原結合分子中一個結合位點、兩個結合位點、四個結合位點和六個結合位點的存在。
如本文所用，術語“人源化抗體”是指，經基因工程改造的非人源抗體，其氨基酸序列經修飾以提高與人源抗體的序列的同源性。通常而言，人源化抗體的全部或部分CDR區來自於非人源抗體(供體抗體)，全部或部分的非CDR區(例如，可變區FR和/或恒定區)來自於人源免疫球蛋白(受體抗體)。人源化抗體通常保留或部分保留了供體抗體的預期性質，包括但不限於，抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性的能力、增強免疫應答的能力等。
如本文所用，術語“嵌合抗體”是指以下抗體，其具有源自一種來源生物(如大鼠或小鼠)的免疫球蛋白的可變序列以及源自不同生物體(例如人)的免疫球蛋白的恒定區。用於生產嵌合抗體的方法是本領域已知的。參見例如，Morrison,1985,Science 229(4719)：1202-7；Oi等人，1986,Bio Techniques 4：214-221；Gillies等人，1985J Immunol Methods 125：191-202；以上通過援引加入併入本文。
如本文所用，術語“抗體綴合物”是指抗體分子直接或者通過連接接頭與另一個分子化學鍵合而形成的偶聯體/綴合物。所述另一個分子可以是治療劑或示蹤劑；優選地，所述治療劑選自放射性同位素、化療藥或免疫調節劑，所述示蹤劑選自放射學造影劑、順磁離子、金屬、螢光標記、化學發光標記、超聲造影劑或光敏劑。“抗體綴合物”例如抗體-藥物複合體(antibody-drug conjugate,ADC)，其中藥物分子就是所述的另一個分子。
本文術語“抗原嵌合受體(CAR)”是指經改造以在免疫效應細胞上表達並且特異性結合抗原的人工免疫效應細胞表面受體，其包含至少(1)細胞外抗原結合結構域，例如抗體的可變重鏈或輕鏈，(2)錨定CAR進入免疫效應細胞的跨膜結構域，和(3)胞內信號傳導結構域。CAR能夠利用細胞外抗原結合結構域以非主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex,MHC)限制性的方式將T細胞和其它免疫效應細胞重定向至所選擇的靶標，例如癌細胞。
如本文所用，術語“調節性T細胞”或“Treg”，也曾被稱為抑制性T細胞(suppressor T cells)，是一群負調節機體免疫反應的淋巴細胞，用以維持對自身抗原的耐受性，控制免疫反應過度，避免對正常細胞產生免疫損傷，防止自身免疫病的發生。Treg表達以下生物標誌物：CD4、FOXP3和CD25，被 認為與幼稚型CD47細胞源自同一譜系。Treg在腫瘤的發生中起到極其重要的作用，多項研究表明Treg細胞在腫瘤微環境中的數目顯著增加，包括黑色素癌，卵巢癌，乳腺癌，結腸癌，肺癌，胰腺癌等，同時Treg細胞的數目和腫瘤病人的存活率亦密切相關。此外，腫瘤細胞會誘導腫瘤浸潤性Treg細胞的增殖，增殖的Treg細胞會大量分泌TGF-β等免疫抑制因數，抑制CD8+T細胞等免疫細胞的功能，阻礙免疫細胞對腫瘤的殺傷作用，是多種實體瘤和血液瘤免疫治療失敗的重要耐藥機制。近期研究表明，PD-1/PD-L1等免疫治療病人的免疫耐受也與Treg密切相關。
如本文所用，術語“載體”(vector)包括核酸載體，例如DNA載體(如質粒)、核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)載體、病毒或其他適合的複製子(例如病毒載體)。已經開發了多種載體用於將編碼外源蛋白質的多核苷酸遞送到原核或真核細胞中。本發明的表達載體含有多核苷酸序列以及例如用於表達蛋白質和/或將這些多核苷酸序列整合到哺乳動物細胞基因組中的附加序列元件。可以用於表達本發明的抗體和抗體片段的某些載體包括含有指導基因轉錄的調控序列(如啟動子和增強子區域)的質粒。用於表達抗體和抗體片段的其他有用的載體含有多核苷酸序列，其增強這些基因的翻譯速率或改善由基因轉錄產生的mRNA的穩定性或核輸出。這些序列元件包括例如5’和3’非翻譯區、內部核糖體進入點(Internal ribosome entry site,IRES)和聚腺苷酸化信號位元點，以便指導表達載體上攜帶的基因的有效轉錄。本發明的表達載體還可以含有以下多核苷酸，該多核苷酸編碼用於選擇含有這種載體的細胞的標記。適合的標記的實例包括編碼抗生素(如氨苄青黴素、氯黴素、卡那黴素或諾爾絲菌素)抗性的基因。
如本文所用，術語“受試者”、“對象”和“患者”是指接受對如本文所述的特定疾病或病症(如癌症或傳染性疾病)的治療的生物體。物件和患者的實例包括接受疾病或病症(例如細胞增殖性病症，如癌症或傳染性疾病)的治療的哺乳動物，如人、靈長類動物、豬、山羊、兔、倉鼠、貓、狗、豚鼠、牛科家族成員(如家牛、野牛、水牛、麋鹿和犛牛等)、牛、綿羊、馬和野牛等。
如本文所用，術語“治療”是指外科手術或藥物處理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是預防、減緩(減少)治療物件中不希望的生理變化或病變，如細胞增殖性病症(如癌症或傳染性疾病)的進展。有益的或所希望的臨床結果包括但不限於症狀的減輕、疾病程度減弱、疾病狀態穩定(即，未惡化)、疾病進展的延遲或減慢、疾病狀態的改善或緩和、以及緩解(無論是部分緩解或完全緩解)，無論是可檢測的或不可檢測的。需要治療的物件包括已患有病症或疾病的物件以及易於患上病症或疾病的物件或打算預防病症或疾病的對象。當提到減緩、減輕、減弱、緩和、緩解等術語時，其含義也包括消除、消失、不發生等情況。
如本文所用，術語“有效量”指單獨給予或與另一治療劑組合給予細胞、組織或物件時能有效防止或緩解疾病病症或該疾病進展的治療劑用量。“有效量”還指足以緩解症狀，例如治療、治癒、防止或緩解相關醫學病症，或治療、治癒、防止或緩解這些病症的速度增加的化合物用量。當將活性成分單獨給予個體時，治療有效劑量單指該成分的用量。當應用某一組合時，治療有效劑量指產生治療作用的活性成分的組合用量，而無論是組合、連續或同時給予。
圖1. 顯示受試抗體和人TNFR2重組蛋白的結合能力。圖A、B、C分別為#001、#219、#224受試抗體人源化分子與人TNFR2重組蛋白的結合能力；其中WT為人鼠嵌合野生型分子，抗雞蛋白溶菌酶(anti-Hel-WT)同型對照抗體為該實驗的陰性對照。
圖2. 顯示受試抗體和食蟹猴TNFR2重組蛋白的結合能力。圖A、B、C分別為#001、#219、#224受試抗體人源化分子與食蟹猴TNFR2重組蛋白的結合能力；其中WT為人鼠嵌合野生型分子，抗雞蛋白溶菌酶(anti-Hel-WT)同型對照抗體為該實驗的陰性對照。
圖3. 顯示受試抗體和高表達人TNFR2的CHO-TNFR2細胞的結合能力。圖A、B、C分別為#001、#219、#224受試抗體人源化分子與CHO-TNFR2細胞的結合能力；其中anti-Hel-WT為陰性同型對照抗體。
圖4. 顯示受試抗體和Treg細胞的結合能力。圖A、B分別為#001、#219受試抗體人源化分子與Treg結合的重疊圖。空心峰為anti-Hel-WT同型陰性對照抗體的結合圖，實心峰為每個抗體與Treg細胞的結合圖；“只加二抗”和“未染色”(未加任何抗體的空白細胞對照)都為陰性對照，抗體濃度為200ng/ml。
圖5. 顯示受試抗體和啟動後的食蟹猴PBMC中CD8+ T細胞的結合。圖A為受試抗體分別在2μg/ml與0.2μg/ml濃度與食蟹猴CD8+ T結合的重疊圖。圖B為受試抗體分別在2μg/ml與0.2μg/ml濃度與食蟹猴CD8+ T結合的平均螢光強度倍數(受試樣品結合的平均螢光強度與只加二抗樣品的平均螢光強度的比值)。其中抗雞蛋白溶菌酶(anti-Hel)同型對照抗體為該實驗的陰性對照。
圖6. 顯示受試抗體抑制人TNFα與人TNFR2重組蛋白間的相互作用。圖A、B、C分別為#001、#219、#224受試抗體人源化分子對TNFα-TNFR2的抑制；其中抗雞蛋白溶菌酶(anti-Hel-WT)同型對照抗體為該實驗的陰性對照。
圖7. 顯示受試抗體抑制人TNFα與CHO-TNFR2細胞表達的人TNFR2相互作用。圖A、B、C分別為#001、#219、#224受試抗體人源化分子對TNFα與CHO-TNFR2相互作用的抑制；其中anti-Hel-WT為陰性同型對照抗體。
圖8. 顯示受試抗體對TNFα引起的IκBα降解的抑制作用。圖A為本實驗的圈門策略。圖B為受試抗體對TNFα引起的IκBα降解的抑制作用；左邊圖為不同濃度的抗體與IκBαlow的百分比做的柱狀圖，右邊圖為抗體濃度梯度對IκBαlow的百分比相對於陰性對照抗體anti-Hel的倍數的變化。抗體的試驗濃度分別在0.25，2.5和25μg/ml；其中“不做處理的Treg細胞”是指沒有任何處理的Treg細胞，TNF是指用10ng/ml TNFα處理過Treg細胞；Rat IgG2b-PE為Anti-IκBα-PE抗體的陰性同型對照(anti-Hel)。每個濃度受試抗體與陰性同型對照anti-Hel相比具有統計學差異(** p<0.01,***p<0.001,Two-Way ANOVA Analysis)。
圖9. 顯示受試抗體對TNFα誘導的Treg細胞增殖的抑制。圖A為不同受試抗體與陰性同型對照anti-Hel對Treg增殖影響的重疊圖，其中虛線為anti-Hel，實線為受試抗體。圖B為不同抗體對TNFα誘導Treg增殖的抑制作用，縱坐標為Treg增殖百分比，橫坐標為受試抗體。其中“未加藥處理”(即不加任何藥 物處理)和anti-Hel為本實驗體系的陰性對照。每個抗體的實驗濃度為12.5μg/ml。每個受試抗體與陰性同型對照anti-Hel相比具有統計學差異(**p<0.01,***p<0.001,One-Way ANOVA Analysis)。
圖10. 顯示受試抗體對Treg對Tcon細胞增殖抑制活性的抑制作用。圖A為不同受試抗體與陰性同型對照anti-Hel對Treg抑制Tcon細胞增殖影響的重疊圖，其中虛線為anti-Hel，實線為受試抗體。圖B為不同抗體對Treg抑制Tcon細胞增殖的抑制作用，縱坐標為Tcon細胞增殖百分比，橫坐標為受試抗體。其中未加藥處理(即No treat)和Anti-Hel為本實驗體系的陰性對照，Tcon+beads為沒有Treg細胞存在時的Tcon增殖，為實驗體系的陽性對照。每個抗體的實驗濃度為12.5μg/ml。每個受試抗體與陰性同型對照anti-Hel相比具有統計學差異(*p<0.05,**p<0.01,One-Way ANOVA Analysis)。
圖11. 顯示受試抗體的ADCC殺傷作用。圖A示受試抗體對Treg的ADCC殺傷作用。圖B示受試抗體對高表達人TNFR2的CHO-TNFR2細胞的ADCC殺傷作用。其中anti-Hel為陰性對照抗體。
圖12A-12C. 顯示hTNFR2轉基因小鼠(TNFR2 HuGEMM)血液免疫細胞中hTNFR2和mTNFR2的表達鑒定。圖12A示TNFR2 HuGEMM(亦可稱為hTNFR2-GEMM)小鼠血液中免疫細胞的FACS圈門策略及圈出的CD4+ T細胞，CD8+ T細胞和Treg細胞上mTNFR2和hTNFR2的表達水準及圈門的FMO對照(Fluorescence Minus One control)。圖12B示TNFR2 HuGEMM和Balb/c野生型小鼠血液中CD4+ T細胞，CD8+ T細胞及Treg細胞中mTNFR2和hTNFR2的表達水準的峰圖；點線：同型，虛線：BALB/c小鼠，實線：TNFR2 HuGEMM。圖12C為TNFR2 HuGEMM和Balb/c野生型小鼠血液中CD4+ T細胞，CD8+ T細胞及Treg細胞中mTNFR2和hTNFR2的平均螢光強度統計圖。
圖13A-13C. 顯示TNFR2抗體抑制mTNFα誘導的TNFR2 HuGEMM(圖中簡稱GEMM)小鼠的Treg細胞增殖。圖13A示GEMM小鼠和野生型WT Balb/c小鼠脾臟中Treg細胞表達人TNFR2和小鼠TNFR2的水準。圖13B和13C為受試TNFR2抗體在無啟動劑(B)或有啟動劑(C)Dynabeads mouse T-activator CD3/CD28下對mTNFα誘導的GEMM小鼠或WT Balb/c小鼠的Treg細胞增殖 的抑制作用。每個抗體的實驗濃度為10μg/ml。每個受試抗體與陰性同型對照相比具有統計學差異(***p<0.001,****p<0.0001，One-Way ANOVA Analysis)。
圖14. 顯示抗TNFR2抗體能劑量依賴性抑制TNFR2 HuGEMM小鼠腫瘤生長。圖A、B分別示219-Hu1-mIgG2a、001-Hu3-mIgG2a在劑量為30mg/kg,10mg/kg,3mg/kg時相比較載劑(Vehicle)對照組可劑量依賴性抑制CT26-hTNFR2 KI腫瘤的生長。
圖15. 顯示抗TNFR2抗體抑制TNFR2 HuGEMM小鼠腫瘤生長的同時不引起小鼠的體重下降。圖A-B示不同劑量219-Hu1-mIgG2a或001-Hu3-mIgG2a給藥後小鼠體重絕對重量的變化。圖C-D示219-Hu1-mIgG2a或001-Hu3-mIgG2a不同劑量給藥後小鼠體重的變化率。
圖16. 顯示抗TNFR2抗體在人PBMC免疫重建人源化小鼠結腸癌腫瘤模型中的兩個不同PBMC供體中都能顯著抑制腫瘤生長。圖A示在donor #193中，抗TNFR2抗體219-Hu1具有顯著的藥效。圖B示在donor#272中，腫瘤接種後第29天，與對照抗體組相比，001-Hu3、219-Hu1、Keytruda組的腫瘤增長均被顯著抑制，且具有統計學差異(****：p<0.0001,vs.isotype,Two way ANOVA)。圖C-D示在donor #193和donor #272中，對照組和給藥組小鼠均出現體重下降。
圖17. 顯示抗TNFR2抗體能顯著提升腫瘤浸潤免疫細胞TIL中CD8+ T/Treg細胞比例。圖A示腫瘤浸潤TIL中CD4+ T，CD8+ T及Treg細胞的圈門策略。圖B示在donor#193中，isotype抗體，001-Hu3抗體及219-Hu1抗體治療後腫瘤浸潤白細胞(TIL)中CD4+ T，CD8+ T及Treg占CD45+細胞的比例。圖C示在donor#193中，isotype抗體，001-Hu3抗體及219-Hu1抗體治療後TIL中CD4+ T，CD8+ T及Treg在每mg腫瘤組織中的絕對數量。圖D示在donor#193中，isotype抗體，001-Hu3抗體及219-Hu1抗體治療後TIL中CD8+ T/Treg的比例。圖E示在donor#272中，isotype抗體，001-Hu3抗體及219-Hu1抗體治療後TIL中CD4+ T，CD8+ T及Treg占CD45+細胞的比例。圖17F示在donor#272中，isotype抗體，001-Hu3抗體及219-Hu1抗體治療後TIL中CD4+ T，CD8+ T及Treg在每g腫瘤組織中的絕對數量。圖17G示在donor#272中，isotype抗體，001-Hu3抗體及219-Hu1抗體治療後腫瘤浸潤TIL中CD8+ T/Treg的比例 (*：p<0.05,**：p<0.01,***：p<0.001,unpaired T test)。
圖18. 顯示hTNFR2 KI-CT26.1C03結腸癌模型中各治療組腫瘤體積變化曲線。
圖19. 顯示hTNFR2 KI-CT26.1C03結腸癌模型中各治療組動物體重變化曲線。本圖表示不同劑量219-Hu1-hIgG1抗體或聯合anti-mPD-L1抗體給藥後小鼠體重絕對重量的變化。
圖20. 顯示hTNFR2 KI-CT26.1C03結腸癌模型中各治療組動物體重變化率曲線。本圖表示不同劑量219-Hu1-hIgG1抗體或聯合anti-mPD-L1抗體給藥後小鼠體重的變化率。
圖21. 顯示hTNFR2 KI-CT26.1C03結腸癌模型中各治療組實驗終點腫瘤體重變化。本圖表示不同劑量219-Hu1-hIgG1抗體或聯合anti-mPD-L1抗體，在實驗終點分離腫瘤並秤重的腫瘤重量的變化。
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
本發明實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
實施例1 抗TNFR2人源化單株抗體的表達純化
1.1 抗TNFR2抗體人源化
採用“CDRs移植”方法進行抗體人源化，即基於序列挑選同源性最高的人源性抗體提供抗體骨架區(framework regions,FRs)，把目標抗體中基於Kabat命名方法的抗原結合片段互補決定區(Complementarity-determining regions,CDRs)，移植到前者形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的人源化抗體可變區序列。其次，為有效保持抗體活性和親和力，基於抗體結構建模 (MOE軟體)，選擇潛在回復突變點，選擇標準：1).選擇抗體骨架區位於VH-VL介面、靠近或與CDRs有直接相互作用等氨基酸殘基進行回復突變，這類氨基酸殘基對保持CDRs區構象多較重要；2).考慮到免疫原性，儘量選擇包埋在蛋白內部的氨基酸進行回復突變；3).考慮到抗體穩定性和表達水準，優選分子能量降低的突變。通過測試含有不同突變的人源化抗體與人TNFR2的親和力以及和表面表達TNFR2的細胞的結合，篩選與鼠源抗體親和力、抗體表徵和活性功能相當或更好的人源化抗體。
其中，TNFR2抗體Kabat命名方法的抗原結合片段互補決定區(CDRs)詳見表1，表2示出人源化抗體分子的VH和VL序列，表3示出人源化抗TNFR2抗體的VH和VL序列配對情況。
Figure 111103685-A0202-12-0021-1
Figure 111103685-A0202-12-0021-2
Figure 111103685-A0202-12-0022-3
Figure 111103685-A0202-12-0022-4
Figure 111103685-A0202-12-0023-5
1.2 抗TNFR2人源化抗體的表達
轉染前一天，將ExpiCHO-S細胞進行計數，並以2.5~4×106細胞/mL的密度接種於新鮮預熱的ExpiCHO表達培養基(英維捷基，A291002)中過夜培養。轉染當天，取過夜培養的ExpiCHO-S細胞懸液進行計數，細胞濃度大概在7~10×106細胞/mL，轉染用的細胞活率大於95%。根據轉染個數，取所需的細胞數目，用ExpiCHO表達培養基稀釋至終濃度為6×106細胞/mL的密度，置於37℃，8% CO2，100rpm搖床備用。轉染準備：將質粒用OptiPROTM SFM培養基(英維捷基，12309019)中稀釋，輕輕搖轉離心管使其混勻。將混勻的ExpiFectamineTM CHO試劑(英維捷基，A29129)加入到質粒稀釋液中，輕輕搖轉離心管使其混勻後室溫靜置2分鐘。將上述的質粒/ExpiFectamineTM CHO試劑複合物緩慢滴入待轉染的細胞懸液中，在滴加的過程中搖轉搖瓶。轉染結束後，將轉染的細胞放入溫度37℃，8% CO2，100rpm的搖床中培養。轉染後第一天，向轉染的細胞中補加0.6% ExpiFectamineTM CHO Enhancer(英維捷基，A29129)和16% ExpiCHOTM Feed(英維捷基，A29129)，加入過程中輕輕搖轉搖瓶，並且將細胞轉移至溫度32℃，5% CO2，100rpm的搖床中培養。轉染後第五天，向轉染的細胞中補加16% ExpiCHOTM Feed，加入過程中輕輕搖轉搖瓶。轉染後第十二天，收集細胞上清，並於4000g離心10分鐘吸取上清，並進一步純化抗體。
1.3 抗TNFR2人源化抗體的純化
經高速離心收集的細胞培養液上清，用0.45+0.22μM濾膜進行過濾，利用Akta Avant 150(Cytiva)進行親和層析進行第一步純化。層析介質為與Fc相互作用的Protein A填料Mabselect PrismA(Cytiva，貨號：17549803)， 平衡緩衝液為PBS(2.5g/L Na2HPO4 12H2O，0.408g/L NaH2PO4，8.76g/L NaCl，pH7.2)，平衡4倍柱體積後，將細胞上清上樣結合，流速控制為樣品在柱上保留時間
Figure 111103685-A0202-12-0024-45
5min。上樣結束後，用PBS(pH 7.2)沖洗柱子，直至A280紫外吸收降至基線。然後用20mM PB+1M NaCl(3.752g/L Na2HPO4．12H2O，1.314g/L NaH2PO4，58.44g/L NaCl pH6.2)淋洗2倍柱體積。再用PBS(pH 7.2)沖洗柱子，直至A280紫外吸收和電導達到基線。最後用20mM檸檬酸(2.184g/L檸檬酸，1.086g/L檸檬酸鈉，pH 3.4)的洗脫緩衝液沖洗層析柱，根據A280紫外吸收峰收集洗脫峰，收集的洗脫樣品用1M Tris(121.14g/L Tris)中和並用pH計Seven2Go(梅特勒-托利多)檢測至中性。收集的抗體經粒徑篩析層析法(size exclusion chromatography-HPLC,SEC-HPLC)鑒定純度大於95%並用於後續研究。
實施例2 ELISA檢測TNFR2人源化抗體與人和食蟹猴TNFR2蛋白的特異性結合
酶標板中預先包被100μl/孔的0.5μg/ml人TNFR2(Human TNFR2-His,Sino 10417-H08H)或食蟹猴TNFR2(Cynomolgus TNFR2-His,Sino 90102-C08H)；將受試抗TNFR2人源化抗體(實施例1所述可變區連接IgG-Fc構成；WT嵌合抗體同樣採用IgG-Fc結構)進行3.33倍梯度稀釋，100μl/孔加樣，室溫振盪孵育1.5小時；洗板後加入鼠抗人(mouse anti-human)IgG Fc-HRP工作液(1：10000稀釋)，100μl/孔加樣，室溫振盪孵育1.0小時；再次洗板，加入HRP的底物TMB進行顯色，加入終止液終止反應後用酶標儀(MD I3)讀取吸光值。以抗體濃度為橫坐標，對應的OD值為縱坐標繪製抗體的結合曲線，四參數擬合(GraphPad Prism9)，計算EC50值。EC50值越小，抗體與人/食蟹猴TNFR2結合的能力越強。將人源化抗體的結合效果均歸一化到與其對應的人鼠嵌合抗體WT(序列參見SEQ ID NO.38-43)，百分比值越高，說明人源化抗體結合的效果越好。抗TNFR2抗體與人TNFR2蛋白的結合結果見圖1和表4，與食蟹猴TNFR2的結合結果見圖2和表4。資料表明，所有受試抗體均能和人或猴TNFR2蛋白特異性結合，且人源化抗體與人鼠嵌合抗體的結合能力基本一致。
表4. 抗TNFR2抗體與人或食蟹猴TNFR2蛋白特異性結合的ELISA結果
Figure 111103685-A0202-12-0025-7
001-WT VH氨基酸序列(SEQ ID NO.38)：
EVQLQESGGGLVQPGGSLNLSCAASGFAFSTYDLSWVRQTPEKRLEWVAYINNGGISTYYSDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGPFYGSANYFDYWGQGTTVTVSS
001-WT VL氨基酸序列(SEQ ID NO.39)：
EIVMTQSPASLSLSVGETVTITCRTSESIYSNLPWYQQKQGKSPQLLVYDATKLAEGVPSRFSGSESGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWVTPWTFGGGTKLEIK
219-WT VH氨基酸序列(SEQ ID NO.40)：
EVQLQESGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTNYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDTETRLNQNFKDKATLTVDKSSSTSYMQLSSPTSEDSAVYYCARGEGLGAARSVSMDYWGQGTTVTVSS
219-WT VL氨基酸序列(SEQ ID NO.41)：
DILMTQSPSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKVLIYYTAILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK
224-WT VH氨基酸序列(SEQ ID NO.42)：
EVQLQESGPEIVKPGASVKLSCTASGFNNKDIYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPATGNTKHDPKFQDKATLSSDTSSNTAYLQFSSLTSEDTAVYYCAHSPYGDFGAMDYWGQGTTVTVSS
224-WT VL氨基酸序列(SEQ ID NO.43)：
DIQMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSNYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLPSGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPWTFGGGTKLEIK
實施例3 BIAcore檢測TNFR2人源化抗體與人和食蟹猴TNFR2蛋白的親和力
利用Biacore檢測受試抗TNFR2抗體與人和食蟹猴TNFR2蛋白之間的特異性結合。該實驗採用Protein A晶片，通過手工操作(manual run)測定 出晶片捕獲稀釋後的抗體所需要的時間，以使得能飽和結合抗原Rmax為50 RU。將人(Human TNFR2-His,Sino 10417-H08H)和食蟹猴(Cynomolgus TNFR2-His,Sino 90102-C08H)TNFR2均梯度稀釋至32,16,8,4,2nM。採用多迴圈動力學測得抗體與抗原的親和力。在每一個迴圈中，注射抗體後再注入梯度濃度的TNFR2蛋白，使抗原與抗體發生結合與解離過程。每個迴圈後用Glycine pH1.5進行Protein A晶片的再生(去除晶片上的蛋白)。應用BIAcore T200分析軟體擬合抗體抗原的親和力KD。表5結果可知，所有受試抗TNFR2抗體與人或食蟹猴TNFR2蛋白之間存在特異性結合，且親和力水準較高。
Figure 111103685-A0202-12-0026-8
Figure 111103685-A0202-12-0027-9
實施例4 FACS檢測TNFR2抗體與CHO-TNFR2細胞表面人TNFR2的結合
取轉染了人TNFR2高表達質粒的CHO-K1穩定細胞(命名為CHO-TNFR2)，轉染的人TNFR2全長質粒購自Sino Biological(貨號：HG10417-UT，NCBI Ref Seq：NM_001066.2)，在細胞密度不超過80%時進行實驗。棄去細胞培養基，用PBS潤洗並加入1ml胰酶消化2分鐘，用含10% FBS的Ham’s F12完全培養基終止消化後製成細胞懸液。計數後，取適量細胞懸液，350×g離心，棄上清，按照1×107個細胞/ml的密度，加入相應體積的封閉液(10%FBS+PBS)將細胞重懸，4℃孵育30分鐘。孵育結束後，350×g離心去上清，用染色緩衝液(2% FBS+PBS)將細胞重懸為2×106個細胞/ml的密度，鋪入96孔板，每孔加入50μl的細胞懸液，待用。用PBS將抗體從最高濃度20μg/ml(兩倍濃度)開始進行10倍梯度稀釋，將稀釋好的抗體加至已含有50μl細胞懸液的孔中，置於微孔板振盪器上500rpm震盪1分鐘，使抗體與細胞充分混合，4℃孵育1h。孵育結束後用染色緩衝液清洗細胞兩次，每孔100μl，350×g離心5分鐘棄上清。用染色緩衝液將PE goat anti-Human IgG Fc抗體(ebioscience，貨號：12-4998-82)稀釋250倍，以每孔100μl的體積加至洗完的細胞孔中，混合均勻，4℃染色30分鐘。染色結束後同樣用染色緩衝液清洗兩次，最後用200μl染色緩衝液重懸細胞，流式上機檢測信號(Thermo Attune NxT)，信號越強，表示抗體與TNFR2的結合能力越強。以抗體濃度為橫坐標，對應的平均螢光強度MFI倍數為縱坐標繪製抗體的結合曲線，四參數擬合(GraphPad Prism9)，計算EC50值。EC50值越小，抗體與CHO-TNFR2細胞結合的能力越強。將人源化抗體的結合效果均歸一化到與其對應的人鼠嵌合WT抗體，百分比值越高，說明人源化抗體結合的效果越好。如圖3和表6所示檢測所有受試抗TNFR2抗體均可與CHO-TNFR2細胞表面人TNFR2結合，且人源化抗體與人鼠嵌合WT抗體的結合能力基本一致。
表6. 抗TNFR2抗體與CHO-TNFR2細胞表面人TNFR2特異性結合的流式結果
Figure 111103685-A0202-12-0028-10
實施例5 FACS檢測抗體與人調節性T細胞(Treg細胞)表面TNFR2的結合實驗
人Treg細胞使用分選試劑盒(Stemcell，貨號貨號：18063)從人PBMC中分離獲得，經過Dynabeads Human Treg Expander(Gibco，貨號：11129D)體外刺激擴增15天後獲得並分裝凍存。取體外分離擴增的Treg細胞復蘇過夜，第二天300×g離心5分鐘，用DPBS重懸得到細胞懸液，計數。取實驗所需的細胞數加入離心管，300×g離心5min，去上清，用染色緩衝液將細胞密度調整為2×106/ml，鋪96孔板，每孔50μl。取所有受試抗體與對照抗體anti-Hel isotype(用PBS分別稀釋到200ng/ml，總量為100μl)。將各個樣品加到每個孔中，每孔50μl。將加有細胞懸液與抗體的孔板置於微孔板振盪器上，以500rpm的速度振盪1min，將細胞與抗體充分混勻。混勻後，將孔板置於4℃冰箱，孵育60min。孵育結束後，每孔加入100μl染色緩衝液，350×g離心5min，棄上清；每孔再加入200μl染色緩衝液重懸細胞，350×g離心5min，棄上清。將染色緩衝液按照250：1(染色緩衝液：螢光染色抗體)的比例加入PE goat anti-Human IgG Fc，製成染液，混勻後加入細胞孔，每孔100μl；將孔板置於微孔板振盪器上以500rpm的速度振盪1min，以將細胞與染液充分混勻。混勻後置於4℃冰箱，孵育30min。 將細胞清洗兩遍，最後每孔加入200μl的PBS將細胞重懸，流式上機檢測信號(Thermo Attune NxT)。圖4顯示所有抗TNFR2人源化抗體均能與人Treg細胞有效結合。
實施例6 FACS檢測抗體與啟動後食蟹猴PBMC細胞的結合實驗
凍存的食蟹猴PMBC細胞復蘇後，用完全培養基(RPMI1640-Glutamax +10%FBS+1×P/S+1×ITS+50μMPM巰基乙醇)重懸得到細胞懸液，計數。根據計數結果重懸細胞密度為5×106/ml，在96孔U底板中，每孔鋪100μl的細胞懸液。配置兩成濃度的T細胞啟動試劑Immunocult T cell(Stemcell,1：50)activator +rhIL-2(R&D,200IU)，將兩成濃度的啟動試劑加入到細胞中，每孔100μl，混勻後放置37℃，5%CO2培養箱中培養三天。收集啟動後的細胞進行計數，染色緩衝液(含2%FBS的DPBS溶液)將細胞密度調整為4×106/ml，鋪96孔V底板，每孔50μl。取所有受試抗體與anti-Hel對照抗體(用染色緩衝液分別稀釋到0.4μg/ml和4μg/ml)，將各個樣品加到每個孔中，每孔50μl。將加有細胞懸液與抗體的孔板置於微孔板振盪器上，以500rpm的速度振盪lmin，將細胞與抗體充分混勻。混勻後，將孔板置於4℃冰箱，孵育30min。孵育結束後，每孔加入100μl染色緩衝液，350×g離心5min，棄上清；每孔再加入200μl染色緩衝液重懸細胞，350×g離心5min，棄上清。加入抗體Anti-Human CD8-FTIC(BD-555366，1μl/test)和PE goat anti-Human IgG Fc(Invitrogen-124998-82,0.5μl/test)；將孔板置於微孔板振盪器上以500rpm的速度振盪1min，以將細胞與染液充分混勻。混勻後置於4℃冰箱，孵育30min。將細胞清洗兩遍，最後每孔加入200μl的染色緩衝液將細胞重懸，流式上機檢測信號(Thermo Attune NxT)。圖5顯示Anti-Hel陰性同型對照抗體不與食蟹猴CD8 T細胞結合，所有受試抗TNFR2人源化抗體均能與啟動後的食蟹猴PBMC中的CD8+ T細胞有效結合。
實施例7 ELISA檢測抗TNFR2抗體阻斷TNFα與TNFR2的結合
酶標板中預先包被1μg/ml 100μl/孔的人TNFR2(Novoprotein，貨號C830)，將所有受試TNFR2抗體從最高濃度30μg/ml進行2.5倍梯度稀釋，稀釋後的抗體分別與15ng/ml人TNFα-Biotin(Acro Biosystem，貨號TNA-H82E3)等體積混合，按100μl/孔加入酶標板中，室溫振盪孵育2.0小時；洗板後加入 Streptavidin-HRP工作液(1：10000稀釋)，100μl/孔，室溫振盪孵育40分鐘；再次洗板，加入HRP的底物TMB進行顯色，加入終止液終止反應後用酶標儀(MD I3)讀取吸光值。以抗體濃度為橫坐標，對應的OD值為縱坐標繪製抗體的抑制曲線，四參數擬合(GraphPad Prism9)，計算IC50值。IC50值越小，抗體抑制人TNFα與人TNFR2結合的能力越強。將人源化抗體的阻斷效果均歸一化到與其對應的人鼠嵌合抗體WT，百分比值越高，說明人源化抗體抑制的效果越好。受試抗體的阻斷曲線見圖6，抑制活性見表7。從圖6及表7可知，所有受試抗體均能顯著地抑制人TNFα與人TNFR2蛋白的結合，且人源化抗體與人鼠嵌合WT抗體的抑制能力基本一致。
Figure 111103685-A0202-12-0030-11
實施例8 抗TNFR2抗體阻斷高表達人TNFR2的CHO細胞上TNFR2與TNFα的結合
採用高表達人TNFR2的CHO穩定細胞進行實驗(同實施例4中CHO-TNFR2)。將CHO-TNFR2細胞消化後，DPBS洗滌2次，經Live/Dead(L/D)染色(室溫20分鐘)後，按1×105細胞/50μl/孔進行鋪板；受試抗TNFR2抗體用染色緩衝液稀釋至6μg/ml作為起始濃度，3.33倍梯度稀釋，共7個濃度 點；稀釋後的抗體按50μl/孔加入鋪好的細胞中，輕柔吹打混勻，4℃孵育30分鐘。之後加入100μl/孔稀釋至100ng/ml的人TNFα-biotin輕柔吹打混勻，混勻後4℃孵育30分鐘。染色緩衝液洗滌2次後，加入100μl/孔的0.12μg/ml PE-streptavidin(BioLegend，貨號405204)4℃孵育30分鐘。染色緩衝液洗滌2次後，150μl重懸，上流式機器檢測(Thermo Attune NxT)。以抗體濃度為橫坐標，對應的MFI值為縱坐標繪製抗體的抑制曲線，四參數擬合(GraphPad Prism9)，計算IC50值。IC50值越小，抗體抑制人TNFα與人TNFR2結合的能力越強。將人源化抗體的阻斷效果均歸一化到與其對應的人鼠嵌合WT抗體，百分比值越高，說明人源化抗體抑制的效果越好。受試抗體的阻斷曲線見圖7，抑制活性見表8。從圖7及表8可知，所有受試抗體均能顯著地抑制TNFα與CHO-TNFR2細胞上TNFR2的結合。
Figure 111103685-A0202-12-0031-12
實施例9 FACS檢測抗體抑制TNFα引起的人Treg細胞IκBα降解實驗
人Treg細胞使用分選kit(Stemcell，貨號貨號：18063)從人PBMC中分離獲得，經過Dynabeads Human Treg Expander(Gibco，貨號：11129D)體外刺激擴增15天後獲得並分裝凍存。取體外分離擴增的Treg細胞復蘇過夜，第二天300×g離心5分鐘，用AIM-V培養基(品牌Gibco，貨號31035025)，計數， 根據細胞計數結果調整細胞密度至6×106個細胞/ml，鋪96孔板，每孔25μl。取所有受試抗體與anti-Hel對照抗體(用AIM-V培養基分別稀釋到四成濃度，1μg/ml，10μg/ml和100μg/ml)。將每個濃度的抗體加到對應的細胞孔中，每孔25μl。多通道移液槍混合後，放於37℃，5%CO2培養箱中預孵育30min。使用AIM-V培養基將TNFα(品牌Novoprotein，貨號C008)稀釋至工作濃度的兩倍即20ng/ml，向需要TNFα啟動孔中加入50μl的TNFα，非啟動對照孔加入50μl的AIM-V培養基，使抗體最終濃度為1乘，TNFα的最終濃度為10ng/ml，移液槍吹打混勻，將培養板放入37℃培養箱中孵育10min。孵育完成後，取出培養板，加入100μl預冷的DPBS，4℃進行離心300g，5min。然後細胞用100μl 1× live/dead violet(預冷DPBS稀釋500倍)，冰上反應20min。每孔加入100μl染色緩衝液，4℃進行300g離心，5min。每孔加入100μl的1×fix-perm buffer(品牌BD，貨號554714)，混合均勻，4℃固定30min。固定結束後，每孔加入100μl的1×perm buffer終止固定，400g離心5min，棄上清。再向每孔加入200μl 1×perm buffer二次洗滌細胞。向實驗孔加入100μl IκBα染液(用1×perm buffer稀釋100倍)，對照孔加入Rat IgG2b κ同型對照抗體1μl，混合均勻，4℃孵育30min。孵育結束後每孔加入100μl的1×perm buffer終止固定，400g離心5min，棄上清。再向每孔加入200μl 1×perm buffer二次洗滌細胞。上流式機器檢測(Thermo Attune NxT)。流式檢測分析活細胞中IκBαlow的百分比或所有活細胞的IκBα的MFI。IκBα low的比例越低，說明抗TNFR2抗體抑制TNFα引起的IκBα降解能力越強。圖8結果顯示陰性對照抗體Anti-Hel對IκBα表達沒有影響，而受試抗TNFR2人源化抗體均能抑制TNFα引起的IκBα降解。
實施例10 TNFR2抗體抑制TNFα和IL-2誘導的Treg細胞增殖
通過測定TNFR2抗體存在下TNFα和IL-2誘導Treg細胞的增殖情況，判斷該抗體對TNFα和IL-2誘導Treg細胞增殖的抑制作用(Zaragoza B et al.,Nat Med.2016 Jan；22(1)：16-7)。取體外擴增分離後凍存的Treg細胞復蘇過夜，第二天400×g離心5分鐘，用培養基重懸得到細胞懸液，計數。將Treg用CellTrace Violet cell proliferation kit(Thermo貨號C34557)進行染色，每1×107細胞使用1μl儲存液配置成1ml染色液。37℃染色20min，用至少5倍體積的完 全培養基中和反應，靜置5min，離心400×g 5min。用培養基重懸清洗一次細胞，再次離心取上清。按照96孔板每孔1×105細胞密度進行鋪板，每1×105細胞用50μl培養基的密度重懸細胞，轉移至96孔板中。每孔加入50μl待測抗體，抗體的終濃度為12.5μg/ml，培養箱孵育30分鐘。隨後再每孔加入含IL-2(終濃度為300IU)和TNFα(終濃度50ng/ml)的培養基50μl，以及含有anti-CD3/CD28 Dynabeads(Gibco，貨號：11129D，beads與Treg細胞比例為1：20)培養基50μl，補齊每孔終體積為200μl。每個條件設置兩個平行孔，將上述孔板混勻後放入37℃培養箱培養三天進行FACS檢測(Thermo Attune NxT)。通過Treg增殖的比例判斷該抗體對TNFα和IL-2誘導的Treg增殖的抑制作用。結果如圖9顯示，相比對照anti-Hel抗體，所有抗TNFR2人源化抗體均可有效抑制TNFα和IL-2誘導的Treg細胞增殖，且具有顯著性差異。
實施例11 抗TNFR2抗體對Treg功能的抑制
通過測定含有抗TNFR2抗體的條件下Treg細胞對效應(responder)T細胞的抑制功能，判斷抗體對Treg細胞抑制功能的抑制效果。取實驗所需的Treg(CD4+CD25+FoxP3+ T細胞)和Conventional T細胞(Tcon)效應細胞(CD4+CD25- T細胞)復蘇過夜，第二天400×g離心5分鐘，用完全培養基(RPMI1640-Glutamax +10%FBS+1×P/S+1×ITS+50μMPM巰基乙醇)重懸得到細胞懸液，計數。將Tcon細胞用CellTrace Violet cell proliferation kit(Thermo貨號C34557)進行染色，每1×107細胞使用1μl儲存液配置成1ml染色液。37℃染色20min，用至少5倍體積的完全培養基中和反應，靜置5min，離心400×g 5min。用培養基重懸清洗一次細胞，再次離心棄上清。按照96孔板每孔1×105細胞密度進行鋪板，每1×105細胞用50μl培養基的密度重懸細胞，轉移至50mL離心管中。同時準備Treg細胞，Treg細胞和Tcon細胞按照1：1的比例進行共培養。根據Tcon細胞的數量，按照1/10的比例準備相應的anti-CD3/CD28 Dynabeads(Gibco，貨號：11129D)。按照每孔50μl的體積加入Treg和Tcon的培養基中。每孔加入待測抗體，抗體的終濃度為12.5μg/ml。每個條件設置三個平行孔，將上述孔板混勻後放入37℃培養箱培養4天進行流式檢測。Tcon增殖比例越高，說明抗體抑制Treg的能力越強。抑制結果如圖10所示，三個受試抗TNFR2人 源化抗體均能夠顯著抑制Treg對Tcon細胞的抑制作用，促進Tcon的增殖，且具有統計學差異。
實施例12 FACS檢測抗TNFR2抗體介導的抗體依賴的細胞毒(ADCC)活性
提前一天將PBMC和凍存的Treg細胞培養於完全培養基(RPMI1640-Glutamax+10%FBS+1×P/S+1×ITS+50μMPM巰基乙醇)，其中PBMC需要添加100IU/ml的IL-2。實驗當天根據分離試劑盒(Stemcell，貨號17955)要求將NK細胞從PBMC中分離出來，用完全培養基重懸(不含IL-2)，密度0.8×106/ml。用Cell Trace violet試劑標記靶細胞Treg細胞或CHO-TNFR2細胞，標記結束後將密度調整到0.4×106/ml。用完全培養基將待測抗體梯度稀釋至終濃度的4倍，待用。按照實驗板分佈圖將靶細胞種入細胞板中，每孔50μl，接著將稀釋好的藥物鋪入對應的孔中，與靶細胞37℃共孵育30分鐘。孵育結束後向需要加入效應細胞的孔中加入100μl的效應細胞懸液，不需要的孔補入100μl的培養基，37℃共孵育4h。反應結束後每孔加入1μl的PI染料，上機檢測。靶細胞中PI陽性比例越高說明ADCC作用越顯著。ADCC實驗結果如圖11所示，anti-Hel陰性對照抗體因沒有作用靶點，沒有出現ADCC殺傷作用；三個受試人源化抗體在靶細胞Treg或CHO-TNFR2細胞上均顯示有ADCC活性作用。
實施例13 TNFR2轉基因人源化小鼠(TNFR2 HuGEMM)hTNFR2和mTNFR2表達檢測
採用CRISPR/Cas9技術，通過同源重組的方式，在Tnfrsf1b基因exon2位元點定點敲入hTNFRSF1B-WPRE-PA表達框，獲得Tnfrsf1b基因定點敲入hTNFRSF1B-WPRE-PA的雜合子BALB/c小鼠，然後通過繁育獲得表達人Tnfrsf1b(TNFR2)基因的純合子轉基因小鼠(TNFR2 HuGEMM)。取6-8周齡雌性BALB/c小鼠(來自北京維通利華實驗動物技術有限公司)和TNFR2 HuGEMM小鼠外周血，ACK(Gibco，貨號A1049201)處理去除紅細胞，進行FACS的免疫分型，檢測小鼠外周血中CD4+ T細胞、CD8+ T細胞和CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞上mTNFR2和hTNFR2的表達情況，所有細胞群體的畫門依據都為FMO對照(圖12A)。結果顯示TNFR2 HuGEMM小鼠不表 達mTNFR2，CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、Treg細胞表面hTNFR2的表達譜/表達水準與BALB/c背景小鼠上mTNFR2的表達譜/表達水準一致，表明TNFR2 HuGEMM小鼠完成了hTNFR2對mTNFR2的替代(圖12B-12C)。
實施例14 抗TNFR2抗體抑制TNFα誘導的TNFR2 HuGEMM的Treg細胞增殖
通過測定TNFR2抗體存在下TNFα誘導TNFR2 HuGEMM小鼠Treg細胞的增殖情況，驗證TNFR2 HuGEMM小鼠經基因改造後TNFR2信號通路及相應功能得以保留，確保改造後的轉基因小鼠可以用於候選抗TNFR2抗體的體內藥效評價。取5隻TNFR2 HuGEMM小鼠和5隻野生型Balb/c小鼠，在生物安全櫃中無菌取出小鼠脾臟進行研磨，將磨好的細胞懸液全部轉移至15ml離心管中，離心(320g，7分鐘，4℃)。傾倒上清液。加入約2-3ml ACK紅細胞裂解液(Gibco，貨號A1049201)，混勻，室溫放置3-5分鐘，直至紅細胞裂解完全，加入6-8ml RPMI1640培養基終止裂解，顛倒混勻。離心(200g，8分鐘，4℃)。離心完成後，傾倒上清液用EasySep buffer重懸細胞，40μm濾膜過濾細胞，進行細胞計數。然後根據Mouse CD4+CD25+ Regulatory T kit(品牌Stemcell，貨號18783A)說明書進行分選Treg細胞。分好的Treg細胞用CellTrace Violet cell proliferation kit(Thermo貨號C34557)進行染色，每1×107細胞使用1μl儲存液配置成1ml染色液。37℃染色20min，用至少5倍體積的完全培養基中和反應，靜置5min，離心400×g 5min。用培養基重懸清洗一次細胞，再次離心取上清。按照96孔板每孔1×105細胞密度進行鋪板，每1×105細胞用50μl培養基的密度重懸細胞，轉移至96孔板中。每孔加入50μl待測抗體(包括三個人源化TNFR2抗體，一個抗鼠TNFR2替代抗體Surrogate antibody clone#75-54.7(BioXcell,BE0247)以及同型對照抗體anti-Hel-mIgG1)，抗體的終濃度為10μg/ml，培養箱孵育30分鐘。隨後再每孔加入含小鼠IL-2(品牌義翹神州，貨號51061-MNAE，終濃度為300IU)以及小鼠TNFα(品牌義翹神州，貨號20180502，終濃度50ng/ml)的培養基50μl，以及不含有或者含有Dynabeads mouse T-activator CD3/CD28(Gibco，貨號：11452D，beads與Treg細胞比例為1：20)培養基50μl，補齊每孔終體積為200μl。同時設置Treg細胞只加小鼠IL-2，Treg細胞只 加小鼠TNFα，Treg細胞加小鼠IL-2和人TNFα的對照孔。每個條件設置兩個平行孔，將上述孔板混勻後放入37℃培養箱培養三天進行FACS檢測(Thermo Attune NxT)。通過Treg增殖的比例判斷該抗體對TNFα誘導的Treg增殖的抑制作用。圖13A顯示TNFR2 HuGEMM小鼠的Treg細胞表達人TNFR2，不表達鼠TNFR2；WT Balb/c小鼠的Treg細胞只表達鼠TNFR2。圖13B和13C顯示，無論體系中是否有Dynabeads mouse T-activator CD3/CD28激動劑，TNFR2 HuGEMM Treg在加入了mIL-2和mTNFα或hTNFα下，增殖明顯增加，說明TNFR2 HuGEMM小鼠基因改造後TNFR2介導的信號得以保留。而WT balb/c只在加入了mIL-2和mTNFα下增殖增加，而hTNFα沒有影響增殖，說明hTNFα不與mTNFR2結合。TNFR2 HuGEMM Treg在mIL-2和mTNFα存在下加入抗TNFR2人源化抗體，與陰性對照anti-Hel-mIgG1相比，001-Hu3-mIgG1和219-Hu1-mIgG1可顯著抑制TNFR2 HuGEMM Treg的增殖，且具有統計學差異(*** p<0.001)，而抗鼠TNFR2替代抗體TR75-54.7無抑制作用；對於WT Balb/c Treg在mIL-2和mTNFα存在下加入抗TNFR2抗體，與陰性對照Hamster IgG相比，抗鼠TNFR2替代抗體TR75-54.7可顯著抑制WT Balb/c Treg的增殖，且具有統計學差異(*** p<0.001)，而001-Hu3-mIgG1和219-Hu1-mIgG1均無抑制作用。
實施例15 抗TNFR2抗體在TNFR2 HuGEMM小鼠腫瘤模型的藥效評價
採用百奧賽圖基因生物技術有限公司的基於CRISPR/Cas9開發的EGE系統，將小鼠CT26細胞系中的mTNFR2基因的部分Exon2和Exon3替換為PuroR cassette，以達到基因剔除(gene knockout)的目的，破壞小鼠內源mTNFR2的表達，然後插入小鼠胞內區、跨膜區於人胞外區嵌合蛋白的CDS，以製備只表達hTNFR2基因的CT26細胞系(CT26-hTNFR2 KI)。利用TNFR2 HuGEMM建立敲入hTNFR2基因的CT26-hTNFR2 KI細胞系結腸癌動物模型並進行抗TNFR2抗體的藥效實驗。
細胞庫中取出一支CT26-hTNFR2 KI細胞，用完全1640培養基(1640(Gibco，61870-036)+10% FBS(Gibco，10099-141C)+1% P/S(Gibco， 15140-122)+1% NEAA(Gibco，11140-050)+1% Sodium Pyruvate(Gibco，11360-070)+16μg/ml puromycin(Gibco，A11138-03))復蘇細胞，復蘇後的細胞置細胞培養瓶中(在細胞瓶壁標記好細胞種類、代數、日期、培養人姓名等)置於CO2培養箱中培養(培養箱溫度37℃，CO2濃度為5%)；待細胞鋪滿培養瓶底部80%-90%後傳代，傳代後細胞繼續置於CO2培養箱中培養，重複該過程直至細胞數目滿足體內藥效實驗的需求，隨後製備細胞懸液，使用全自動細胞計數儀(BECKMAN，Vi-Cell XR)計數，根據計數結果用PBS(HyClone，SH30256.01)溶液重懸細胞，製備成細胞懸液(密度2×106/ml)。在小鼠的右側皮下接種上述細胞懸液100μl/隻，當腫瘤體積達到約100mm3左右時，挑選個體腫瘤體積適中的小鼠入組，將動物按腫瘤體積使用基於EXCEL亂數的隨機分組方法，分配到8個實驗組，分組見表9，並於當天開始給藥(標記為Day 0)，給藥體積10ml/kg，溶媒PBS，腹腔注射給藥，每3天給藥一次，一共給藥4次。每週固定時間測量腫瘤體積和體重三次。腫瘤體積計算公式：腫瘤體積(mm3)=長(mm)×寬(mm)×寬(mm)/2，腫瘤抑制率計算公式為：腫瘤抑制率計算公式：TGI(%)=[1-T/C]×100%，均採用Two-way ANOVA的統計學方式，進行實驗資料的分析。在給藥後的第11天，和對照組相比，測試的抗TNFR2抗體組的各個劑量組和PBS對照組相比均具有統計學差異，藥效明顯；且相同抗體間的不同劑量組間也有劑量依賴關係，同時，10mg/kg的陽性藥anti-mPD-1(BioXcell，BE0146)的藥效和測試抗TNFR2抗體219-Hul-mIgG2a和001-Hu3-mIgG2a在3mg/kg的劑量下的藥效相當，以上結果說明測試的抗TNFR2人源化抗體具有顯著的體內腫瘤生長抑制藥效，且有劑量依賴關係(圖14中A和B，表10)。同時各組實驗動物在給藥期間活動和進食狀態良好，體重以及體重變化率均有一定程度的上升，說明測試抗TNFR2人源化抗體的體內安全性風險較低(圖15中A-D)。
Figure 111103685-A0202-12-0037-13
Figure 111103685-A0202-12-0038-14
Figure 111103685-A0202-12-0038-15
實施例16 抗TNFR2抗體在人PBMC免疫重建人源化小鼠結腸癌腫瘤模型中的藥效評價
選用7-9周NOG雌性小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)皮下接種3.5×106 HT-29細胞(設為實驗第0天)，當天腹腔注射7×106人外周血單核細胞(PBMC,donor#193和donor #272，由中美冠科生物技術(太倉)有限公司依據SOP-CP-042從已篩選出捐獻者全血中提取)，建立PBMC人源化結腸癌模型。當腫瘤體積達到~95mm3時，挑選個體腫瘤體積適中的小鼠入組，將動物按腫瘤體積使用Study DirectorTM(版本號3.1.399.19，供應商Studylog System,Inc.,S.San Francisco,CA,USA)進行隨機分組，分配到5個實驗組(G1為PBS對照組、G2為對照抗體anti-Hel hIgG1組、G3為抗TNFR2抗體001-Hu3-hIgG1組、G4為抗TNFR2抗體219-Hu1-hIgG1組、G5為Keytruda組)，兩個供體donor每組5-7隻，用於體內藥效學研究。分組(第13天)當天開始給藥。給藥劑量均為10mg/kg(與圖中的計量單位mpk同一含義，下同)，每週腹腔注射給藥兩次。每週固定時間測量腫瘤體積和體重兩次。腫瘤體積(tumor volume,TV)的計算公式為：V=1/2×a×b2。其中a和b分別表示長和寬。在donor#193中，腫瘤接種後第29天，與對照抗體組相比，219-Hu1組的腫瘤增長被顯著抑制，且具有統計學差異(P<0.0001)，其他組與對照抗體組相比無統計 學差異。說明在donor #193中，抗TNFR2抗體219-Hu1具有顯著的藥效(圖16中A)。在donor#272中，腫瘤接種後第29天，與對照抗體組相比，001-Hu3、219-Hu1、Keytruda組的腫瘤增長均被顯著抑制，且具有統計學差異(P<0.0001)。說明在donor #272中，Keytruda和抗TNFR2抗體001-Hu3、219-Hu1均有藥效(圖16中B)。
實驗過程中對照組和給藥組小鼠均出現體重下降，且都有小鼠死亡，經獸醫屍檢結果推測小鼠死亡為注射PBMC後引起的宿主免疫排斥(GvHD)反應。測試藥001-Hu3、219-Hu1和陽性藥Keytruda在10mg/kg測試劑量下，動物沒有表現明顯的藥物毒性，治療可以耐受(圖16中C-D)。在最後一次給藥後48h之後，分別選取G2對照抗體組、G3抗TNFR2抗體001-Hu3組、G4抗TNFR2抗體219-Hu1組的小鼠進行腫瘤浸潤免疫細胞(TIL)分離(Miltenyi，貨號130-095-929)，進行FACS的免疫分型，並加入123 count eBeads(eBioscience，貨號01-1234-42)進行細胞絕對計數，所有細胞群體的畫門依據都為FMO對照(圖17中A)。實驗結果顯示，與對照抗體組相比，donor #193抗TNFR2抗體治療組CD4+ T細胞比例降低，但數目無顯著性差異，donor #272抗TNFR2抗體治療組CD4+ T細胞比例與數目均無顯著性差異(圖17中B-C,E-F)；與對照抗體組相比，donor #193抗TNFR2抗體治療組CD8+ T細胞數目比例增加，但數目無顯著性差異，CD8+ T細胞比例無顯著性差異，但經001-Hu3抗體治療組CD8+ T細胞數目顯著增加(圖17中B-C,E-F)；兩個donor的結果均顯示抗TNFR2抗體治療組的Treg(CD4+CD25+Foxp3+細胞)細胞比例和數目均顯著低於對照抗體組，且具有顯著性差異(圖17中B-C,E-F)；同時抗TNFR2抗體治療組的總CD8+T細胞數與Treg細胞數的比值(CD8+ T/Treg)也明顯高於對照抗體組，且具有統計學差異(圖17中D，G)。以上的資料顯示抗TNFR2抗體治療後可顯著提高TIL中CD8+T/Treg比例從而抑制腫瘤生長。
實施例17 219-Hu1-hIgG1單株抗體與抗鼠PD-L1單株抗體在TNFR2人源化BALBc小鼠模型中的聯用藥效檢測
利用在表達人TNFR2的基因改造BALB/c小鼠(TNFR2 HuGEMM)皮下接種人TNFR2基因改造的CT26.1C03結腸癌細胞(hTNFR2 KI-CT26)的 動物模型評價219-Hu1-hIgG1抗體和抗鼠PD-L1(anti-mPD-L1，BioXcell，BE0101)的聯用藥效實驗。小鼠右側皮下接種5×105 CT26.1C03結腸癌細胞(設為實驗第0天)。當腫瘤體積達到~100mm3時，挑選個體腫瘤體積適中的小鼠入組，將動物按腫瘤體積使用基於EXCEL亂數的隨機分組方法，分配到5個實驗組(G1為對照組、G2為anti-mPD-L1 10mg/kg抗體組、G3為219-Hu1-hIgG1 10mg/kg抗體組、G4為219-Hu1-hIgG1 30mg/kg抗體組、G5為219-Hu1-hIgG1 10mg/kg+anti-mPD-L1 10mg/kg抗體聯用組)，每組各10隻動物，用於體內藥效學研究，分組(第10天)當天開始給藥。每週腹腔注射給藥兩次。每週固定時間測量腫瘤體積和體重三次。
在腫瘤接種後第18天(即給藥第8天)，與對照組(G1)相比，G2 anti-mPD-L1 10mg/kg組、G3 219-Hu1-hIgG1 10mg/kg組和G4 219-Hu1-hIgG1 30mg/kg組的TGITV值分別為35.1%，28.2%和63.8%，這三個治療組的腫瘤體積增長均被顯著抑制(G2 vs.G1，P值<0.0001；G3 vs.G1，P值=0.0002；G4 vs.G1，P值<0.0001)，219-Hu1-hIgG1 10mg/kg和anti-mPD-L1 10mg/kg的TGITV值相當，但是219-Hu1-hIgG1 30mg/kg的TGITV值要顯著高於219-Hu1-hIgG1 10mg/kg和anti-mPD-L1 10mg/kg組(G2 vs.G4，P值=0.0002；G3 vs.G4，P值<0.0001)。以上結果說明219-Hu1-hIgG1在10~30mg/kg劑量範圍記憶體在劑量依賴效應，腫瘤體積隨劑量增加而減小，詳情見表11、圖18。
在腫瘤接種後第18天，與對照組(G1)相比，G5 219-Hu1-hIgG1 10mg/kg+anti-mPD-L1 10mg/kg聯合給藥組的腫瘤體積增長也顯著被抑制(TGITV=66.5，vs.G1，P值<0.0001)；且G5 219-Hu1-hIgG1 10mg/kg+anti-mPD-L1 10mg/kg聯合給藥組的平均瘤體積也顯著地小於G3 219-Hu1-hIgG1 10mg/kg和G2 anti-mPD-L1 10mg/kg的單藥組(TGITV G5 vs.G3 vs.G2=66.5% vs.28.2% vs.35.1%；P值G5 vs.G2<0.0001，P值G5 vs.G3<0.0001)，說明當使用219-Hu1-hIgG1抗體與anti-mPD-L1抗體聯合給藥，相比兩個單藥組，更能抑制腫瘤的生長且有統計學差異(****，p<0.0001，單藥組vs.聯合給藥組)。詳情見表11、圖18。
Figure 111103685-A0202-12-0041-16
各組實驗動物在給藥期間活動和進食狀態良好，體重均有一定程度的上升。各組在實驗週期內的觀察中，均沒有發現動物精神狀況、活動狀況以及體表觀察的變差，動物均沒有表現出藥物毒性，安全性較好，說明219-Hu1-hIgG1抗體以及聯合給藥219-Hu1-hIgG1+anti-mPD-L1抗體的安全性較高，詳情見圖19-20、表12。
表12. 219-Hu1-hIgG1和/或anti-mPD-L1對CT26.1C03同種移植瘤模型的小鼠體重
Figure 111103685-A0202-12-0042-17
Figure 111103685-A0202-12-0042-18

Claims (23)

  1. 一種特異性結合TNFR2的人源化抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)；
    (1)所述重鏈可變區包含：
    a.選自SEQ ID NO.19~27任一所示的VH序列，
    b.選自與SEQ ID NO.19~27任一序列相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH序列，或，
    c.選自與SEQ ID NO.19~27任一序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的VH序列；
    (2)所述輕鏈可變區包含：
    a.選自SEQ ID NO.28~37任一所示的VL序列，
    b.選自與SEQ ID NO.28~37任一序列相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VL序列，或，
    c.選自與SEQ ID NO.28~37任一序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的VL序列；
    可選地，所述氨基酸插入、缺失和/或替換發生在重鏈可變區或/和輕鏈可變區的FR區；
    可選地，所述替換為保守氨基酸的替換。
  2. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述重鏈可變區包含與SEQ ID NO.19~27任一序列相比完全一致的CDR，FR具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH序列；和/或所述輕鏈可變區包含與SEQ ID NO.28~37任一序列相比完全一致的CDR，FR具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VL序列。
  3. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述重鏈可變區和輕鏈可變區選自如下組：
    (1)具有SEQ ID NO.19所示的VH和SEQ ID NO.28所示的VL；
    (2)具有SEQ ID NO.20所示的VH和SEQ ID NO.29所示的VL；
    (3)具有SEQ ID NO.19所示的VH和SEQ ID NO.30所示的VL；
    (4)具有SEQ ID NO.20所示的VH和SEQ ID NO.31所示的VL；
    (5)具有SEQ ID NO.19所示的VH和SEQ ID NO.31所示的VL；
    (6)具有SEQ ID NO.21所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
    (7)具有SEQ ID NO.22所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
    (8)具有SEQ ID NO.23所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
    (9)具有SEQ ID NO.24所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
    (10)具有SEQ ID NO.25所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
    (11)具有SEQ ID NO.26所示的VH和SEQ ID NO.33所示的VL；
    (12)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.34所示的VL；
    (13)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.35所示的VL；
    (14)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.33所示的VL；
    (15)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.36所示的VL；
    (16)具有SEQ ID NO.26所示的VH和SEQ ID NO.34所示的VL；
    (17)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.37所示的VL；
    (18)具有與上述(1)~(17)任一序列組合相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH和VL組合；
    (19)具有與上述(1)~(17)任一項序列組合相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的VH和VL組合；或，
    (20)具有與上述(1)~(17)任一項序列組合相比CDR完全一致，FR具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%序列一致性的VH和VL組合；
    可選地，所述氨基酸插入、缺失和/或替換發生在重鏈可變區或/和輕鏈可變區的FR區；
    可選地，所述替換為保守氨基酸的替換。
  4. 如請求項1~3任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段包含：
    CDR1-VH選自SEQ ID NO.1、7、或13；
    CDR2-VH選自SEQ ID NO.2、8、或14；
    CDR3-VH選自SEQ ID NO.3、9、或15；
    CDR1-VL選自SEQ ID NO.4、10、或16；
    CDR2-VL選自SEQ ID NO.5、11、或17；和
    CDR3-VL選自SEQ ID NO.6、12、或18。
  5. 如請求項1~4任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，其與人TNFR2結合的解離常數(KD)不大於7nM，與食蟹猴TNFR2結合的解離常數(KD)不大於5nM。
  6. 如請求項1~5任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段包含或不包含重鏈恒定區和/或輕鏈恒定區；
    優選地，所述重鏈恒定區包含全長重鏈恒定區或其片段，所述片段選自CH1結構域、Fc結構域或CH3結構域；
    優選地，所述重鏈恒定區和/或輕鏈恒定區為人重鏈恒定區和/或人輕鏈恒定區；
    優選地，所述重鏈恒定區可選自IgG重鏈恒定區，例如IgG1重鏈恒定區、IgG2重鏈恒定區、IgG3重鏈恒定區或IgG4重鏈恒定區；
    優選地，所述重鏈恒定區是人IgG1重鏈恒定區、人IgG2重鏈恒定區、人IgG3重鏈恒定區或人IgG4重鏈恒定區。
  7. 如請求項1~6任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段選自單株抗體、多株抗體、天然抗體、工程化抗體、單 特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、單價抗體、多價抗體、全長抗體、抗體片段、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、或雙抗體(diabody)。
  8. 如請求項1~7任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段通過或不通過接頭(linker)偶聯有另一分子；優選地，所述另一分子選自治療劑或示蹤劑；優選地，所述治療劑選自放射性同位素、化療藥或免疫調節劑，所述示蹤劑選自放射學造影劑、順磁離子、金屬、螢光標記、化學發光標記、超聲造影劑或光敏劑。
  9. 如請求項1~8任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段：
    (1)特異性結合細胞表面表達TNFR2的細胞；
    (2)特異性結合Treg細胞；
    (3)抑制TNFα與TNFR2蛋白的結合；
    (4)抑制TNFα與細胞表面表達的TNFR2的結合；
    (5)抑制TNFα介導的Treg的增殖和/或Treg功能；
    (6)抑制TNFα介導的IκBα降解；
    (7)抑制Treg對Tcon細胞增殖的抑制；
    (8)介導針對TNFR2表達細胞的ADCC功能；
    (9)提升腫瘤浸潤免疫細胞TIL中CD8+ T/Treg細胞比例；或/和，
    (10)抑制腫瘤生長。
  10. 一種多特異性抗原結合分子，其特徵在於，所述多特異性抗原結合分子至少包含第一抗原結合模組和第二抗原結合模組，所述第一抗原結合模組包含請求項1~9任一項所述的抗體或其抗原結合片段，所述第二抗原結合模組特異性結合TNFR2以外的其他抗原或結合與第一抗原結合模組不同的TNFR2抗原表位；
    優選地，所述其他抗原選自CD3、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD16A、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD80、CD86、CD126、 CD138、B7、PD-1、PD-L1、PD-2、CTLA4、PRVIG、TIGHT、HAS、CLDN18.2、MSLN、MUC、Ia、HLA-DR、腱生蛋白、EGFR、VEGF、P1GF、ED-B纖連蛋白、癌基因產物、IL-2、IL-6、IL-15、IL-21、TRAIL-R1或TRAIL-R2；
    優選地，所述多特異性抗體為雙特異性抗體、三特異性抗體或四特異性抗體。
  11. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其特徵在於，所述嵌合抗原受體包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域；所述細胞外抗原結合結構域包含請求項1~9任一項所述TNFR2人源化抗體或其抗原結合片段，或包含請求項10所述多特異性抗原結合分子。
  12. 一種免疫效應細胞，其特徵在於，所述免疫效應細胞包含請求項11所述嵌合抗原受體或包含編碼請求項11所述嵌合抗原受體的核酸片段；
    優選地，所述免疫效應細胞選自T細胞、NK細胞(natural killer cell)、NKT細胞(natural killer cell)、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞或肥大細胞；所述T細胞可選自炎性T細胞、細胞毒性T細胞、調節性T細胞(Treg)或輔助性T細胞；
    優選地，所述免疫效應細胞為同種異體免疫效應細胞或自體免疫細胞。
  13. 一種分離的核酸片段，其特徵在於，所述核酸片段編碼請求項1~9任一項所述的抗體或其抗原結合片段、請求項10所述的多特異性抗原結合分子或請求項11所述的嵌合抗原受體。
  14. 一種載體(vector)，其特徵在於，所述載體包含請求項13所述核酸片段。
  15. 一種宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞包含請求項14所述載體；優選地，所述細胞為原核細胞或真核細胞，例如細菌(大腸桿菌)、真菌(酵母)、昆蟲細胞或哺乳動物細胞(CHO細胞系或293T細胞系)；優選地，所述細胞缺乏岩藻糖基轉移酶，更優選地，所述岩藻糖基轉移酶是FUT8。
  16. 一種製備請求項1~9任一項所述抗體或其抗原結合片段或請求項10所述多特異性抗原結合分子的方法，其中，所述方法包括培養請求項15所述的宿主細胞，以及分離所述宿主細胞表達的抗體或其抗原結合片段或多特異性抗原結合分子。
  17. 一種製備請求項12所述免疫效應細胞的方法，其中，所述方法包括將編碼請求項11所述的嵌合抗原受體(CAR)的核酸片段導入所述免疫效應細胞，可選地，所述方法還包括啟動所述免疫效應細胞表達請求項11所述CAR。
  18. 一種藥物組合物，其特徵在於，所述組合物包含請求項1~9任一項所述的抗體或其抗原結合片段、請求項10所述的多特異性抗原結合分子、請求項11所述的嵌合抗原受體、請求項12所述的免疫效應細胞、請求項13所述的核酸片段、請求項14所述的載體或請求項15所述的細胞、請求項16或17所述方法製備獲得的產品；
    優選地，所述組合物還包含藥學上可接受的載體(carrier)、稀釋劑或助劑；
    優選地，所述組合物還包含額外的抗腫瘤劑、免疫治療劑或免疫抑制劑；
    優選地，所述額外的抗腫瘤劑選自PD-1抗體、PD-L1抗體或CTLA-4抗體。
  19. 請求項1~9任一項所述的抗體或其抗原結合片段、請求項10所述的多特異性抗原結合分子、請求項11所述的嵌合抗原受體、請求項12所述的免疫效應細胞、請求項13所述的核酸片段、請求項14所述的載體、請求項15所述的細胞、請求項16或17所述方法製備獲得的產品、和/或請求項18所述的藥物組合物在製備治療和/或預防免疫異常相關疾病的藥物中的用途；
    優選地，所述免疫異常相關疾病是Treg細胞和/或MDSC功能相關疾病；
    優選地，所述疾病是癌症或自身免疫性疾病；
    優選地，所述癌症選自卵巢癌、晚期表皮T細胞淋巴瘤、III/IV期轉移性結直腸癌、三陰乳腺癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、和/或對CTLA-4和PD-1療法耐藥的晚期實體瘤，如轉移性黑色素瘤；
    優選地，所述自身免疫性疾病可選自類風濕性關節炎、多發性硬化症、系統性硬化症、視神經脊髓炎譜系病、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力、IgG4相關性疾病。
  20. 一種治療和/或預防免疫異常相關疾病的方法，其特徵在於，所述方法包括向受試者施用有效量的請求項1~9任一項所述的抗體或其抗原結 合片段、請求項10所述的多特異性抗原結合分子、請求項11所述的嵌合抗原受體、請求項12所述的免疫效應細胞、請求項13所述的核酸片段、請求項14所述的載體、請求項15所述的細胞、請求項16或17所述方法製備獲得的產品、和/或請求項18所述的藥物組合物；
    優選地，所述免疫異常相關疾病是Treg細胞和/或MDSC功能相關疾病；
    優選地，所述疾病是癌症或自身免疫性疾病；
    優選地，所述癌症選自卵巢癌、晚期表皮T細胞淋巴瘤、III/IV期轉移性結直腸癌、三陰乳腺癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、和/或對CTLA-4和PD-1療法耐藥的晚期實體瘤，如轉移性黑色素瘤；
    優選地，所述自身免疫性疾病選自類風濕性關節炎、多發性硬化症、系統性硬化症、視神經脊髓炎譜系病、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力、IgG4相關性疾病。
  21. 請求項19所述用途或請求項20所述的方法，其還包括向治療和/或預防的物件施用額外的抗腫瘤治療劑，例如化療劑、靶向治療劑和免疫治療劑，包括PD-1/PD-L1治療劑，如抗PD-1/PD-L1抗體、抗CTLA-4治療劑如抗CTLA-4抗體；
    優選地，所述額外的抗腫瘤治療劑選自PD-1/PD-L1治療劑；
    優選地，所述PD-1/PD-L1治療劑選自PD-1抗體或PD-L1抗體。
  22. 請求項1~9任一項所述的抗體或其抗原結合片段、請求項10所述的多特異性抗原結合分子、請求項11所述的嵌合抗原受體、請求項12所述的免疫效應細胞、請求項13所述的核酸片段、請求項14所述的載體、請求項15所述的細胞、請求項16或17所述方法製備獲得的產品、和/或請求項18所述的藥物組合物，其中，用於治療和/或預防免疫異常相關疾病；
    優選地，所述免疫異常相關疾病是Treg細胞和/或MDSC功能相關疾病；
    優選地，所述免疫異常相關疾病是癌症或自身免疫性疾病；
    優選地，所述癌症選自卵巢癌、晚期表皮T細胞淋巴瘤、III/IV期轉移性結 直腸癌、三陰乳腺癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、和/或對CTLA-4和PD-1療法耐藥的晚期實體瘤，如轉移性黑色素瘤；
    優選地，所述自身免疫性疾病選自類風濕性關節炎、多發性硬化症、系統性硬化症、視神經脊髓炎譜系病、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力、IgG4相關性疾病；
    優選地，其還包括向治療和/或預防的物件施用額外的抗腫瘤治療劑，例如化療劑、靶向治療劑和免疫治療劑，包括PD-1/PD-L1治療劑，如抗PD-1/PD-L1抗體、抗CTLA-4治療劑如抗CTLA-4抗體。
  23. 一種體外檢測樣品中TNFR2的方法，其包括使懷疑含有TNFR2的樣品與請求項1至9任一項所述的抗體或其抗原結合片段相接觸的步驟。
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