TW202313696A - 抗人程序性死亡配體-1(pd-l1)的抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明公開了特異性結合人程序性死亡配體-1(PD-L1)的抗體或抗原結合片段,所述抗體或抗原結合片段能夠增強T細胞的功能,上調T細胞介導的免疫應答和用於治療PD-L1表達異常相關和/或T細胞功能異常的疾病,例如腫瘤的用途。
Description
本發明涉及抗人程序性死亡配體-1(PD-L1)的抗體或其抗原結合片段,其編碼核酸、表達載體和表達細胞、製備方法、藥物組合物、以及它們用於增強T細胞的功能,上調T細胞介導的免疫應答和用於治療PD-L1表達異常和T細胞功能異常相關的疾病,如腫瘤的用途。
免疫治療已成為腫瘤治療中發展最為迅速、最具前景的研究領域之一,而運用免疫檢查點抑制劑,如PD-1/PD-L1單抗,CTLA-4單抗則是腫瘤免疫療法革命性的治療方法,大大地提高了惡行腫瘤患者地生存期。
T細胞介導的免疫反應受到共刺激和共抑制機制的嚴格調控,在抗原免疫反應和維持自我耐受之間保持最佳平衡。該平衡由多種啟動性和抑制性蛋白參與。抑制性蛋白,也被稱為免疫檢查點類蛋白,調節殺傷性T細胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)的啟動和效應功能,以維持自我耐受性。免疫檢查點類抑制性蛋白在腫瘤的調節通路中起著關鍵作用。其中一個重要的免疫檢查點蛋白PD-1,與其配體PD-L1結合後,會傳導免疫抑制信號,降低T細胞的活性。同時腫瘤細胞也可以通過在細胞表面表達PD-L1來抑制T細胞的啟動和增殖,從而逃避CTL的攻擊和殺傷。利用PD-1或PD-L1單抗,阻止PD-1/PD-L1的結合和相互作用,可以部分恢復T細胞的功能,從而增強殺傷腫瘤細胞的能
力。
2011年,第一個免疫檢測點抑制劑伊普利單抗作為一種抗CTLA-4單克隆抗體,成為成功用於治療黑色素瘤的腫瘤免疫療法,至今治療的很多患者已獲得相比與傳統治療方法更好的5年生存期。之後,FDA又先後批準了3個PD-1單抗和3個PD-L1單抗,成功地用於免疫治療除黑色素瘤之外的十幾種腫瘤,並成為多種癌症的一線治療手段,如非小細胞肺癌(NSCLC)、腎細胞癌(RCC)和膀胱或尿路上皮癌等。中國至今已批準了2個進口PD-1抗體和3個國產PD-1抗體上市,但是還沒有PD-L1抗體獲批,並且鑒於PD-L1抗體與PD-1抗體治療機理上及目前臨床試驗聯用藥物和適用適應症的不同,研發新的PD-L1單抗和基於PD-L1的雙抗仍然有重大的社會和經濟意義。
本發明提供特異性結合人程序性死亡配體-1(PD-L1)的抗體及抗原結合片段,編碼這些抗體及抗原結合片段的核酸,包含所述抗體及抗原結合片段和藥物組合物和試劑盒,以及它們用於增強T細胞的功能,上調T細胞介導的免疫應答和用於治療PD-L1表達異常和T細胞功能異常相關的病症,例如腫瘤免疫的用途。該抗體不僅可以與人和食蟹猴PD-L1蛋白結合,還可以阻斷人PD-L1和人PD-1之間的相互作用。
在一些實施方案中,特異性結合人程序性死亡配體-1(PD-L1)的分離的抗體或抗原結合片段,包含重鏈CDRs組合和輕鏈CDRs組合:
(1)所述重鏈CDRs組合包含:CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH;所述CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH具有選自以下的任意序列組合或者與所述序列組合相比具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的序列組合:
和,
(2)所述輕鏈CDRs組合包含:CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL,所述CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL具有選自以下任意序列組合或者與所述序列組合相比具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的序列組合:
各個CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH、CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL為根據KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法編碼。
在一些實施方案中,特異性結合人程序性死亡配體-1(PD-L1)的分離的人源化抗體或抗原結合片段,包含重鏈CDRs組合
和輕鏈CDRs組合:
(1)所述重鏈CDRs組合包含:CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH;所述CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH具有選自以下的任意序列組合或者與所述序列組合相比具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的序列組合:
和,
(2)所述輕鏈CDRs組合包含:CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL,所述CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL具有選自以下任意序列組合或者與所述序列組合相比具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的序列組合:
各個CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH、CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL為根據KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法編碼。
特別地,例如本發明的抗體或其抗原結合片段包含選自以下的重鏈CDRs和輕鏈CDRs組合:VH1+VL1、VH2+VL2、VH3+VL3、VH4+VL4、VH5+VL5、VH6+VL6、VH7+VL7、VH8+VL8、VH9+VL9、VH10+VL10、VH11+VL11、VH12+VL12、VH13+VL13、VH14+VL14、VH15+VL15、VH16+VL16、VH17+VL17、VH18+VL18、VH19+VL19、VH20+VL20、VH21+VL21、VH22+VL22、VH23+VL23、VH24+VL24、VH25+VL25、或VH26+VL26,以及與所述重鏈和輕鏈CDRs組合之序列相比具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的CDRs組合。
在另一個具體實施方案中,本發明提供這樣的抗體或其抗原結合片段,其中:
1)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列;
2)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列;
3)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列;
4)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列;
5)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列;
6)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列;
7)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列;
8)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列;
9)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列;
10)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列;
11)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列;
12)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:132所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、
95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列;或,
13)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:134所示序列,或者與所示序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列。
在一個優選實施方案中,本發明的抗體或其抗原結合片段是嵌合的或人源化的或全人源的。
在一個優選實施方案中,本發明的抗體或其抗原結合片段,其與人程序性死亡配體-1(PD-L1)結合的解離常數(KD)不大於10nM,與食蟹猴程序性死亡配體-1(PD-L1)結合的解離常數(KD)不大於100nM。
在一個優選實施方案中,本發明的抗體或其抗原結合片段,包含人或鼠抗體IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一恒定區的序列;優選包含人或鼠抗體IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定區的序列;或攜帶突變的人或鼠抗體IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定區的序列。
在一個優選實施方案中,本發明所述抗原結合片段選自F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、雙特異抗體、納米抗體和抗體最小識別單位中的一種或多種。
在一個優選實施方案中,本發明的抗體或其抗原結合片段可與選自編號34、50、90、130、156、370、373、413、或794的抗體競爭性的結合PD-L1,並且具備以下特性:
1)特異性結合PD-L1重組蛋白及表達PD-L1的細胞;
2)阻斷PD-L1與PD-1蛋白的結合;
3)抑制PD-1與細胞表面表達的PD-L1的結合;
4)增強T細胞活性;
5)介導抗體依賴的細胞殺傷(ADCC)活性;或/和
6)抑制腫瘤生長。
在一些實施方案中,本發明提供一種分離的核酸分子,所述核酸分子編碼本發明上述所述的抗體、抗原結合片段、或其任意組合。
在一些實施方案中,本發明提供一種表達載體,其包含本發明上述所述分離的核酸分子。
在一些實施方案中,本發明提供一種宿主細胞,其包含本發明上述所述分離的核酸分子或表達載體。
在一個優選實施方案中,所述宿主細胞是真核細胞或原核細胞;更優選,所述宿主細胞來源於哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、大腸桿菌和/或枯草桿菌;更優選,所述宿主細胞選自中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。
在一些實施方案中,本發明提供一種抗體或抗原結合片段的製備方法,在適當的條件下培養本發明上述所述的宿主細胞,並分離抗體或抗原結合片段。
在一些實施方案中,本發明提供一種藥物組合物,組合物包含本發明上述所述的抗體或抗原結合片段、本發明上述所述分離的核酸分子、本發明上述所述表達載體、本發明上述所述細胞,或本發明上述所述方法製備的產品(例如抗體和抗原結合片段),以及藥學上可接受的載體。
在一個優選實施方案中,所述藥物組合物還包含額外的抗腫瘤劑。
在一些實施方案中,本發明提供一種預防和/或治療PD-L1表達異常和/或T細胞功能異常相關的疾病的方法,包含向有此需要的患者施用本發明上述所述的抗體或抗原結合片段、本發明上述所述的分離的核酸分子、本發明上述所述的表達載體、本發明上述所述的細胞、本發明上述所述的方法製備的產品(例如抗體和抗原結合片段)、或本發明上述所述藥物組合物;所述疾病優選腫瘤;所述腫瘤優選結直腸癌。
在一些實施方案中,本發明提供上述所述的抗體或抗原結合片段、本發明上述所述的分離的核酸分子、本發明上述所述的表達載體、本發明上述所述的細胞、本發明上述所述的方法製備的產品(例如抗體和抗原結合片段)、或本發明上述所述藥物組合物在製備預防和/或治療PD-L1表達異常相關的疾病的藥物中的用途,所述疾病優選腫瘤;所述腫瘤優選結直腸癌。
在一些實施方案中,本發明提供一種試劑盒,其包含本發明上述所述的抗體或抗原結合片段、本發明上述所述的分離的核酸分子、本發明上述所述的表達載體、本發明上述所述的細胞、或本發明上述所述的方法製備的產品(例如抗體和抗原結合片段),以及使用說明。
術語和定義:
除非另外說明,本文所用術語具有所屬技術領域普通技術人員通常理解的含義。對於本文中明確定義的術語,則該術語的含義以所述定義為準。
如本文所用,術語“抗體”(Ab)是指與目標抗原特異性結合或具有免疫反應性的免疫球蛋白分子,包括抗體的多克隆、單克隆、基因工程化和其他修飾形式(包括但不限於嵌合抗體,人源化抗體,全人源抗體,異源偶聯抗體(例如雙特異性、三特異性和四特異性抗體,雙抗體,三抗體和四抗體),抗體綴合物)以及抗體的抗原結合片段(包括例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)。此外,除非另有說明,否則術語“單克隆抗體”(mAb)意指包括能夠特異性結合靶蛋白的完整抗體分子以及不完整的抗體片段(例如Fab和F(ab’)2片段,它們缺少完整抗體的Fc片段(從動物迴圈中更快地清除),因此缺乏Fc介導的效應功能(effector function)(參見Wahl等人,J.Nucl.Med.24:316,1983;其內容援引加入本文))。
如本文所用,術語“抗原結合片段”是指保留特異性結合靶抗原的能力的一個或更多個抗體片段。抗體的抗原結合功能可以由全
長抗體的片段執行。抗體片段可以是Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP、雙抗體、三抗體、親和體(affibody)、納米抗體、適體或結構域抗體。涵蓋術語抗體的“抗原結合片段”的結合片段的實例包括但不限於:(i)Fab片段,一種由VL、VH、CL和CHl結構域組成的單價片段;(ii)F(ab)2片段,一種包含由二硫鍵在鉸鏈區連接的兩個Fab片段的雙價片段;(iii)由VH和CHl結構域組成的Fd片段;(iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段;(V)包含VH和VL結構域的dAb;(vi)由VH結構域組成的dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989);(vii)由VH或VL結構域組成的dAb;(viii)分離的互補決定區(CDR);以及(ix)兩個或更多個分離的CDR的組合,所述CDR可以任選地由合成接頭連接。此外,雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH是通過獨立的基因編碼的,但是這兩個結構域可以使用重組方法通過接頭接合,該接頭能夠使其製成其中VL和VH區配對以形成單價分子的單蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv);參見例如,Bird等人,Science 242:423-426,1988以及Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。這些抗體片段可以使用本領域技術人員已知的常規技術獲得,並且這些片段被篩選用於與完整抗體相同的方式使用。可以通過重組DNA技術、完整免疫球蛋白的酶促或化學裂解、或在一些實施方式中通過本領域已知的化學肽合成程序來產生抗原結合片段。
如本文所用,術語“PD-L1”是指程序性死亡配體-1,也稱為CD279(分化簇279),是一種重要的免疫抑制分子。所述PD-L1優選地是人PD-L1。
如本文所用,術語“抗-程序性死亡配體-1抗體”、“程序性死亡配體-1抗體”、“抗PD-L1抗體”、“PD-L1抗體”、“抗-PD-L1抗體部分”和/或“抗-PD-L1抗體片段”等是指任何包含能夠特異性結合PD-L1的免疫球蛋白分子的至少一部分(例如但不限於重鏈或輕鏈的至少一個互補決定區(CDR)或其配體結合部分、重鏈或輕鏈可變區、重鏈
或輕鏈恒定區、框架區或其任何部分)的含蛋白質或肽的分子。PD-L1抗體還包括抗體樣蛋白支架(如第十纖連蛋白III型結構域(10Fn3)),其含有與抗體CDR在結構和溶劑可及性上相似的BC、DE和FG結構環。10Fn3結構域的三級結構類似於IgG重鏈可變區的三級結構,並且通過將10Fn3的BC、DE和FG環的殘基用來自PD-L1單克隆抗體的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3區的殘基替換,本領域技術人員可以將例如PD-L1單克隆抗體的CDR接枝到纖連蛋白支架上。
如本文所用,術語“雙特異性抗體”是指對至少兩種不同的抗原具有單克隆結合特異性的抗體,其通常是人或人源化的抗體。在本發明中,結合特異性之一可以針對PD-L1的抗原表位而被檢測,另一個可以針對PD-L1的另一個抗原表位或任何其他抗原,例如針對細胞表面蛋白、受體、受體亞基、組織特異性抗原、病毒來源蛋白、病毒編碼的包膜蛋白、細菌來源蛋白或細菌表面蛋白等而被檢測。
如本文所用,術語“嵌合”抗體是指以下抗體,其具有源自一種來源生物(如大鼠或小鼠)的免疫球蛋白的可變序列以及源自不同生物體(例如人)的免疫球蛋白的恒定區。用於生產嵌合抗體的方法是本領域已知的。參見例如,Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7;Oi等人,1986,Bio Techniques 4:214-221;Gillies等人,1985 J Immunol Methods 125:191-202;以上通過援引加入併入本文。
如本文所用,術語“互補決定區”(CDR)指在輕鏈和重鏈可變結構域中均發現的高變區。可變結構域中更高保守性的部分稱為框架區(FR)。如本領域所理解的,表示抗體的高變區的氨基酸位置可以根據上下文和本領域已知的各種定義而變化。可變結構域內的一些位置可以被視為雜合高變位置,因為這些位置可以被認為是在一組標準(如IMGT或KABAT)下的高變區之內,而被認為在不同組的標準(如KABAT或IMGT)下的高變區之外。這些位置中的一個或更多個也可以在延伸的高變區中找到。本發明包括在這些雜合高變的位置中包含修
飾的抗體。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含主要採用片層構型的四個框架區,其通過三個CDR(CDR1、CDR2和CDR3)連接,這三個CDR形成連接片層結構的環,並且在一些情況下形成片層結構的一部分。每條鏈中的CDR通過FR區按順序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4緊密保持在一起,並且與來自其他抗體鏈的CDR促成了抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat等人,Sequences of Protein sofImmunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,Md.1987;其通過援引加入併入本文)。例如在本文中,CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH分別是指重鏈可變區(VH)的第一個CDR、第二個CDR和第三個CDR,這三個CDR構成了重鏈(或其可變區)的CDR組合(VHCDR組合);CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL分別是指輕鏈可變區(VL)的第一個CDR、第二個CDR和第三個CDR,這三個CDR構成了輕鏈(或其可變區)的CDR組合(VLCDR組合)。
如本文所用,術語“抗體綴合物”是指抗體分子直接或者通過連接接頭與另一個分子化學鍵合而形成的偶聯體/綴合物。例如抗體-藥物綴合物(ADC),其中藥物分子就是所述的另一個分子。
如本文所用,術語“單克隆抗體”是指來源於單個克隆(包括任何真核、原核、或噬菌體克隆)的抗體,而不限於該抗體的產生方法。
如本文所用,術語“VH”是指抗體的免疫球蛋白重鏈(包括Fv、scFv或Fab的重鏈)的可變區。術語“VL”是指免疫球蛋白輕鏈(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的輕鏈)的可變區。
如本文所用,術語“百分比(%)序列一致性”是指在為達到最大百分比序列一致性而比對序列和引入空位(如果需要)(例如,為了最佳比對,可以在候選和參比序列中的一個或兩個中引入空位,並且出於比較的目的,可以忽略非同源序列)之後,候選序列的氨基酸(或核苷酸)殘基與參比序列的氨基酸(或核苷酸)殘基相同的百分比。出
於確定百分比序列一致性的目的,可以用本領域技術人員熟知的多種方式來實現比對,例如使用公眾可得的電腦軟體,如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAIi)軟體。本領域技術人員可以確定用於測量比對的適當參數,包括需要在被比較序列的全長範圍實現最大比對的任何演算法。例如,用於與候選序列進行比較而比對的參比序列可以顯示候選序列在候選序列的全長或候選序列的連續氨基酸(或核苷酸)殘基的選定部分上表現出從50%至100%的序列同一性。出於比較目的而比對的候選序列的長度可以是例如參比序列的長度的至少30%(例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%)。當候選序列中的位置被與在參比序列中的相應位置相同的氨基酸(或核苷酸)殘基佔據時,則這些分子在那個位置是相同的。
如本文所用,術語“特異性結合”是指一種結合反應,其決定抗原在蛋白質和其他生物分子的一個異質性群體中的存在狀況,所述蛋白質和其他生物分子例如被抗體或其抗原結合片段特異性識別。與抗原特異性結合的抗體或其抗原結合片段將以小於100nM的KD與抗原結合。例如,與抗原特異性結合的抗體或其抗原結合片段將以高達100nM((例如,1pM至100nM之間)的KD與抗原結合。不顯示與特定抗原或其表位特異性結合的抗體或其抗原結合片段將顯示對該特定抗原或其表位的大於100nM(例如,大於500nM、1μM、100μM、500μM或1mM)的KD。可以使用多種免疫測定方式來選擇與特定蛋白或碳水化合物進行特異性免疫反應的抗體。例如,常規地使用固相ELISA免疫測定法來選擇與蛋白質或碳水化合物進行特異性免疫反應的抗體。參見,Harlow & Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1988)以及Harlow & Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1999),其描述了可以用於確定特異免疫反應性的免疫測定方式和條件。
如本文所用,術語“載體”包括核酸載體,例如DNA載體
(如質粒),RNA載體,病毒或其他適合的複製子(例如病毒載體)。已經開發了多種載體用於將編碼外源蛋白質的多核苷酸遞送到原核或真核細胞中。本發明的表達載體含有多核苷酸序列以及例如用於表達蛋白質和/或將這些多核苷酸序列整合到哺乳動物細胞基因組中的附加序列元件。可以用於表達本發明的抗體和抗體片段的某些載體包括含有指導基因轉錄的調控序列(如啟動子和增強子區域)的質粒。用於表達抗體和抗體片段的其他有用的載體含有多核苷酸序列,其增強這些基因的翻譯速率或改善由基因轉錄產生的mRNA的穩定性或核輸出。這些序列元件包括例如5’和3’非翻譯區、內部核糖體進入位點(IRES)和聚腺苷酸化信號位元點,以便指導表達載體上攜帶的基因的有效轉錄。本發明的表達載體還可以含有以下多核苷酸,該多核苷酸編碼用於選擇含有這種載體的細胞的標記。適合的標記的實例包括編碼抗生素(如氨苄青黴素、氯黴素、卡那黴素或諾爾絲菌素)抗性的基因。
如本文所用,術語“受試者”、“對象”和“患者”是指接受對如本文所述的特定疾病或病症(如癌症或傳染性疾病)的治療的生物體。物件和患者的實例包括接受疾病或病症(例如細胞增殖性病症,如癌症或傳染性疾病)的治療的哺乳動物,如人、靈長類動物、豬、山羊、兔、倉鼠、貓、狗、豚鼠、牛科家族成員(如家牛、野牛、水牛、麋鹿和犛牛等)、牛、綿羊、馬和野牛等。
如本文所用,術語“治療”是指外科手術或藥物處理(surgical or therapeutic treatment),其目的是預防、減緩(減少)治療物件中不希望的生理變化或病變,如細胞增殖性病症(如癌症或傳染性疾病)的進展。有益的或所希望的臨床結果包括但不限於症狀的減輕、疾病程度減弱、疾病狀態穩定(即,未惡化)、疾病進展的延遲或減慢、疾病狀態的改善或緩和、以及緩解(無論是部分緩解或完全緩解),無論是可檢測的或不可檢測的。需要治療的物件包括已患有病症或疾病的物件以及易於患上病症或疾病的物件或打算預防病症或疾病的對象。當
提到減緩、減輕、減弱、緩和、緩解等術語時,其含義也包括消除、消失、不發生等情況。
下面通過對本發明的詳細描述以及圖式來清楚地說明本發明前面敘述的方面以及其他方面。本文中圖式是為了舉例說明本發明的一些優選的實施方案,然而,可以理解,本發明並不限於所公開的特定實施方案。
圖1、末次免疫後測定的小鼠血清結合人PD-L1-mFc(A)和PD-L1-His(B)重組蛋白的滴度。
圖2、PD-L1特異性B細胞的流式細胞染色分選(FACS)和圈門策略圖。
圖3、競爭性ELISA方法測定抗PD-L1抗體阻斷PD-L1蛋白與PD-1蛋白結合。
圖4、FACS測定抗PD-L1抗體結合細胞表面PD-L1蛋白的EC50。
圖5、抗PD-L1抗體增加Jurkat-PD-1-CHO-PD-L1-NFAT體系中報告基因的表達和活性。
圖6、抗PD-L1抗體促進混合淋巴細胞反應中IFN-γ的分泌。
圖7、抗PD-L1抗體對A431細胞的抗體依賴的細胞殺傷(ADCC)活性。
圖8、鼠源抗PD-L1抗體抑制人PD-1/PD-L1轉基因小鼠體內MC38-hPD-L1結腸癌腫瘤生長。
圖9、人源化抗PD-L1抗體抑制人PD-L1轉基因小鼠體內MC38-hPD-L1結腸癌腫瘤生長。
下面結合實施例和圖式對本發明進行詳細描述,本文中圖式是為了舉例說明本發明的一些優選的實施方案,然而,可以理解,
本發明並不限於所公開的特定實施方案或看作對本發明範圍的限制。實施例中未注明具體條件者,按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者,均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
實施例1 小鼠免疫產生PD-L1抗體
對6-8周齡的雌性SJL小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)或者Balb/c小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限公司),使用融合了小鼠Fc的人PD-L1蛋白(PD-L1-mFc,Novoprotein,Cat.CM06,或Sino Biological,Cat.10084-H05H)或人PD-L1-His(Novoprotein,Cat.C315或Sino Biological,Cat:.10084-H08H)與弗氏完全佐劑(complete freund's adjuvant,CFA,Sigma,Cat.F5881)進行第一次免疫;使用上述PD-L1-mFc或人PD-L1-His與弗氏不完全佐劑(incomplete freund's adjuvant,IFA,Sigma,Cat.F5506)和加未甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(CpGODN1826,合成自上海生工生物)進行後三次免疫,免疫時注射50μg/只/次通過乳化操作形成的均一穩定的乳劑。特別地,第一次和第二次免疫注射後足墊和背部,第三次和第四次免疫注射尾部皮下及背部,以獲得高滴度高親和力高特異性的抗血清及特異性的免疫細胞。在末次免疫(第四次免疫)後的第5-7天,安樂死小鼠並無菌取出脾臟,無菌分離提取小鼠脾臟淋巴細胞,分裝至凍存管中,凍存於液氮中。分別在二次免疫,三次免疫後10天及安樂死小鼠當天進行小鼠的采血操作,分離血清,使用酶聯免疫吸附(ELISA)方法測定血清中抗PD-L1特異性抗體的滴度。
實驗結果如圖1,顯示經過四次免疫後,所免疫小鼠的血清與人PD-L1-mFc和PD-L1-His結合的滴度都很高。說明瞭使用此方法進行小鼠的免疫,可以使小鼠產生高滴度的抗PD-L1抗體。
實施例2 PD-L1特異性單個B細胞的流式細胞螢光分選
(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)
PD-L1蛋白免疫的小鼠脾臟細胞,經抗原PD-L1-His蛋白(Novoprotein,Cat.C315或Sino Biological,Cat.10084-H08H)及間接標記抗體anti-His-APC(R&D Systems,Cat.IC050A)和針對小鼠B細胞表面特有標誌的抗體(anti-mouse B220-Pacfic Blue,R&D Systems,Cat.553089;anti-mouse IgD-PE,R&D Systems,Cat.558597;anti-mouse IgM-PE Cy7,R&D Systems,Cat.552867)染色,並在分選前加入區分死細胞和活細胞的染料7-AAD(R&D Systems,Cat.51-68981E),用AriaIII(BD公司)流式細胞分選儀分選PD-L1特異性的單個B細胞(7AAD-B220+IgD-IgM-PDL1-His+)至含有細胞裂解液,RNA酶抑制劑的PCR孔中,每個孔收集一個細胞。結果顯示(圖2)空白對照未免疫的小鼠脾臟(A),或使用帶His的不相關蛋白CREG-His染色的PD-L1免疫的小鼠脾臟(B)均未檢測到明顯的PD-L1+抗原特異性B細胞亞群,而使用PD-L1-His染色的PD-L1免疫的小鼠脾臟(C)則檢測到一群PD-L1+B細胞,每106個脾臟細胞中約有114個PD-L1+B細胞。
實施例3 單克隆抗體的擴增和高通量表達
採用專利“一種用於巢式擴增的組合引物及其應用”專利申請號:201811618134.4中實施例1的方法,將單細胞的mRNA反轉錄成cDNA。然後以cDNA為範本進行巢式PCR,分別進行抗體重鏈和輕鏈擴增。擴增得到抗體重鏈可變區和輕鏈可變區,分別通過同源重組方法克隆到重鏈表達載體和輕鏈表達載體。重鏈表達載體和輕鏈表達載體的恒定區都來自於人IgG1。完整重鏈表達序列是信號肽-VH-CH1-鉸鏈區-CH2-CH3,完整輕鏈表達序列是信號肽-Vκ-Cκ。以上所述單B細胞抗體克隆和表達皆在96孔板內以高通量方式達到抗體的快速鑒定和發現。經過一系列理化和功能篩選324對克隆表達的抗體重鏈和輕鏈後,共獲得9個與已上市的PD-L1抗體Avelumab或Atezolizumab理化
和功能活性相當或更好的候選鼠源抗體分子,其序列的CDRs分別用IMGT和KABAT軟體分析,對應的序列資訊如下表1至2所示,其中表1示出鼠源抗體分子的VH和VL序列,表2示出鼠源抗體分子的IMGT和KABAT分析結果。
分別使用KABAT和IMGT軟體分析各抗體的CDRs,具體的序列資訊如下表2:
實施例4 抗體人源化
首先採用經典“CDRs移植”方法進行抗體人源化,即通過
序列挑選同源性最高的人源性抗體提供抗體骨架區(FRs),把目標抗體的基於Kabat命名方法的抗原結合片段互補決定區(CDRs),移植到前者形成人源化抗體。其次,為更好保持抗體活性和親和力,基於抗體結構建模分析(MOE軟體):1).選擇抗體骨架區位於VH-VL介面、靠近或與CDRs有直接相互作用等氨基酸殘基進行回復突變,這類氨基酸殘基對保持CDRs區構象多較重要;2).考慮到免疫原性,儘量選擇包埋在蛋白內部的氨基酸進行回復突變;3).考慮到抗體穩定性和表達水準,優先考慮分子能量降低突變;4).在人源化過程中通過CDRs區的氨基酸定點突變嘗試進一步提升人源化抗體親和力。通過測試含有不同突變的人源化抗體與人PD-L1的親和力以及和表面表達PD-L1的細胞的結合,篩選與鼠源PD-L1抗體親和力、抗體表徵和活性功能相當或更好的人源化抗體。
其中,PDL1-156抗體經過人源化後的優選候選抗體分子的序列的CDRs如下,分別用IMGT和KABAT軟體分析,對應的序列資訊如下表3和表4所示,其中表3示出人源化抗體分子的VH和VL序列,表4示出人源化抗體分子的IMGT和KABAT分析結果)。
分別使用KABAT和IMGT軟體分析各人源化抗體的CDRs,具體的序列資訊如下:
實施例5 分子排阻色譜法測定抗體純度
採用TSKgel G3000SWXL色譜柱(TOSOH,0008541),預柱Tskgel guard column SWXL(TOSOH,Cat.0008543)進行分子排阻色譜法測定抗體純度。流動相為磷酸鹽緩衝液(NaH2PO4-Na2HPO4),配製:稱取8.88g的NaH2PO4‧2H2O,33.33g的Na2HPO4‧12H2O。流動相平衡色譜柱,流速為1mL/min。待基線走平後進樣,其中進樣體積10μL,紫外檢測波長280nm,頻寬16nm,參比波長關閉。測定結果如表5所示。
實施例6 抗體與人以及食蟹猴PD-L1重組蛋白結合的KD測定
使用Biacore T200(GE Healthcare)測定PD-L1抗體對於人和食蟹猴PD-L1-His蛋白的結合親和力。25℃下在CM5晶片(GE Healthcare,Cat.BR-1005-30)上固定anti-human IgGFc(Genway,Cat.GWB-20A705)。將anti-human Fc(Genway,Cat.GWB-20A705)用Acetate pH5.0(GE Healthcare,BR-1003-51)稀釋至20μg/mL。使用Immobilization method中Amine方法進行固定。或者使用商品化Protein A(GE Healthcare,Cat.29127556)晶片進行檢測。25℃下採用多迴圈動力學法測定抗體與抗原的親和力,在每一個迴圈中,首先將待測抗體捕獲到固定好的CM5晶片,然後注入重組人PD-L1-His(Novoprotein,Cat.315)和食蟹猴PD-L1-His蛋白(Sino Biological,Cat.90251-C08H),最後用Glycine pH1.5再生。流動相為HBS-EP+ Buffer(GE Healthcare,Cat.BR-1006-69),流速30μL/min,結合時間為300秒。再生流速30μL/min,時間為30秒。應用Biacore T200 Evaluation Software(version 3.0),以1:1結合模型,分析試驗資料,擬合抗體抗原的平衡解離常數KD,確定結合速率常數ka和解離速率常數kd。
從結果可知所測試的PD-L1抗體對人PD-L1重組蛋白的結合,都表現出nM或更高的親和力,且都與食蟹猴的PD-L1重組蛋白的親和力在62.5nM到0.375nM之間,詳見下表6。
表7則顯示鼠源抗體PDL1-156來源的人源化抗體156-1H、156-7H、156-10H和156-11H對人PD-L1蛋白的結合,表現出與PDL1-156相當的親和力。
實施例7 抗體阻斷PD-L1和PD-1相互作用的IC50測定
通過競爭性ELISA方法確定抗PD-L1抗體阻斷PD-L1蛋白與PD-1蛋白結合的IC50。
使用碳酸鹽緩衝液稀釋人PD-L1重組蛋白(Sino Biological,Cat.10084-H05H),加入96孔酶標板,終濃度為1μg/ml。用含3% BSA的PBS溶液封閉,加入梯度稀釋的抗PD-L1抗體(6000ng/ml~2ng/ml)以及人PD-1-His重組蛋白(Sino Biological,Cat.10377-H08H)進行共孵育後,加入HRP標記的抗His標籤抗體(MBL,Cat.D291-7),TMB顯色,1M硫酸終止後讀取OD值(雙波長450nm-630nm)。將抗體濃度與OD值對應即可繪製出測試抗體的競爭結合曲線,計算出IC50值。圖3顯示了抗PD-L1抗體與人PD-L1重組蛋白的競爭結合曲線。結果表明,圖中所示與沒有任何阻斷作用的抗體同型陰性對照anti-Hel(百英生物製備)相比,被測試的9個鼠源抗PD-L1抗體(A)和4個人源化抗體(B)均可以有效的阻斷人PD-L1蛋白與人PD-1蛋
白的相互作用,且人源化抗體與人源化之前的鼠源PDL1-156的抑制活性相當(B),IC50分別為197.0ng/mL(156-1H)、230.5ng/mL(156-7H)、250.1ng/mL(156-10H)、207.2ng/mL(156-11H)。鼠源PD-L1-156的IC50則為221.3ng/ml,陽性對照Atezolizumab(百英生物製備)為446.4ng/ml、Avelumab(Pfizer,lot AU020322)為190.3ng/ml。
實施例8 FACS測定PD-L1抗體對細胞表面PD-L1結合的EC
50
將梯度濃度的待檢測抗體(抗體終濃度:10000ng/ml-0.1ng/ml,10倍系列稀釋)與細胞表面高表達PD-L1的CHO-PD-L1細胞(南京勇山生物科技有限公司,105個/孔),4℃共同孵育30min。孵育結束後,加入1:250稀釋的anti-human IgG PE螢光抗體(eBioscience,Cat.12-4998-8),4℃下共同孵育30min,螢光抗體與待檢測抗體的Fc段產生特異性結合,通過FACS檢測PE螢光強度的高低而對待檢測抗體的結合細胞表面高表達的PD-L1蛋白的能力進行分析。圖4結果顯示,待測的鼠源PD-L1抗體EC50均與本次實驗的陽性對照Avelumab(EC50為58.2ng/ml)和Atezolizumab(~99.73ng/ml)相近,其中PDL1-156和PDL1-370的EC50最低,被檢測的人源化抗體156-1H,156-7H,156-10H和156-11H的EC50分別為49.42ng/ml,78.37ng/ml,63.5ng/ml和49.97ng/ml,與本次實驗的陽性對照Avelumab(EC50為56.88ng/ml)相近。該檢測定量地證實了待測各PD-L1抗體對細胞表面上PD-L1靶點劑量依賴性結合的能力。MFI fold=實驗組MFI值/未加藥物的對照組MFI值。
實施例9 PD-1/PD-L1-NFAT報告基因測試抗PD-L1抗體阻抑PD-1:PD-L1結合和信號傳導
利用穩定轉染PD-1的Jurkat細胞株(GenScript,Cat.00612)和穩定轉染PD-L1的CHO細胞株(GenScript,Cat.M00613)比較PD-
L1抗體對PD-1/PD-L1蛋白相互作用及其信號通路的拮抗作用。當抑制信號通路阻抑,NFAT控制的發光報告基因表達增強,發光信號值增加。通過發光讀值的強弱(relative light units,RLU)反應抗體對PD-L1的阻斷作用強弱。
將穩轉PD-L1的CHO細胞株種在96孔白底板上,每孔40000個細胞,100μl/孔,放回培養箱過夜;第二天,取出孔板,吸去培養基,加入穩轉PD-1的細胞株及待測的PD-L1抗體共孵育,PD-1細胞每孔加樣量為16000個/孔,抗體則做梯度稀釋,每個劑量3複孔,孵育體積為100μl/孔,孵育時長為6小時,待孵育完成時,取出孔板,等體積(100μl)加入發光檢測試劑,讀值。根據檢測值用Graphpad進行4參數分析做回歸曲線,得到各抗體的EC50值,結果詳見圖5A,被測的鼠源PD-L1抗體的EC50值均與陽性對照抗體Avelumab和Atezolizumab的EC50值(222.9ng/ml,321.6ng/ml)相近,圖5B和5C則顯示4個人源化PD-L1抗體156-1H,156-7H和156-10H,156-11H的EC50分別為:342ng/ml,313.7ng/ml,357.1ng/ml和282.2ng/ml,和陽性對照Avelumab的EC50相近。該檢測定量地證實了鼠源和人源化的抗PD-L1抗體對細胞表面PD-1:PD-L1相互作用導致的T細胞活性抑制呈現劑量依賴性的阻抑能力,從而劑量依賴地增強Jurkat細胞內報告基因的活性。
實施例10 ELISA檢測混合淋巴細胞反應中T細胞分泌的IFN-γ
通過混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction,MLR)來測定PD-L1單抗增強T細胞的活性。從健康人供體1的外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中分離CD14+單核細胞,應用重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因數(GM-CSF,Peprotech,Cat.300-03)和重組人白介素4(rhIL-4,Peprotech,Cat.200-04)進行體外誘導分化為樹突狀細胞(dendritic cell,DC),於培養第6天加入
LPS(Sigma,Cat:L4516)刺激成熟DC,第7天將供體1的DC細胞與從健康供體2的PBMC富集的CD4+T細胞混合共培養,DC:CD4+T細胞數比例為1:10,加入待測抗體或陽性對照抗體Avelumab或Atezolizumab(抗體濃度為1000ng/ml,100ng/ml,10ng/ml,1ng/ml),共培養4天。4天后收集細胞培養上清,用ELISA方法檢測上清中IFN-γ的含量如圖6顯示,所有測試的鼠源抗體及陽性對照抗體Avelumab、Atezolizumab相比anti-HEL單抗和no treatment(即沒有給藥)陰性對照組,均可明顯增強MLR實驗中CD4+T細胞分泌IFN-γ的能力,並且隨著PD-L1抗體藥物濃度降低,增加分泌IFN-γ的活性也降低。該結果表明PD-L1抗體可增強T細胞的功能,且具有劑量依賴性。T-test,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001.
實施例11 抗PD-L1抗體的抗體依賴的細胞殺傷(Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicit,ADCC)活性檢測
通過分離純化的正常人PBMC中的天然殺傷(natural killer,NK)細胞對高表達人PD-L1的A431細胞的殺傷實驗來測定抗PD-L1單抗介導的抗體依賴的細胞殺傷活性。
效應細胞的製備:復蘇凍存的人PBMC細胞(Stemexpress公司)後,在補充有100IU/ml重組人白介素2(rhIL-2,Peprotech,Cat.200-02)的RPMI1640培養基(Invitrogen,Cat.11835030)中孵育過夜。其後,收集細胞後進行活細胞計數。然後使用NK細胞磁珠分離試劑盒(Stemcell,Cat.17955),從PBMC中純化NK細胞,將NK細胞用補充有10%滅活的胎牛血清的DMEM(Invitrogen,Cat.11965084)重懸後進行計數,用作效應細胞。
靶細胞的製備:靶細胞A431用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養,ADCC實驗前一天,加上終濃度為500IU幹擾素IFN-γ(Peprotech,Cat.300-02)進行刺激培養過夜後待用。
用含有10%胎牛血清的DMEM培養基稀釋抗PD-L1抗體,稀釋好的抗體以25μl/孔分至白壁96孔板(Corning,Cat.3610)中,並且將靶細胞加入孔中(25μl/孔,10000細胞/孔)。使板在37℃,5%CO2培養箱中孵育30分鐘。隨後,將效應細胞加入孔中(25μl/孔,40000細胞/孔,即效靶比NK:A431為4:1),總體積為100μl,使板在37℃,5%CO2培養箱中孵育4個小時。
需同時設置培養基背景對照孔(即孔中加入100μl培養基),靶細胞自發死亡釋放孔(即孔中只有靶細胞),效應細胞自發死亡釋放孔(即孔中只有NK細胞),靶細胞最大死亡釋放孔(即靶細胞加CytoTox-GloTM Cytotoxicity試劑盒(Promega,Cat.G9291)中提供的lysis buffer,所有對照孔的體積最後用培養基統一補充至100μl。培養4小時後,將板取出,每孔加入50μl CytoTox-GloTM Cytotoxicity Assay Reagent,放於搖床上混勻後,室溫放置15分鐘後進行讀數化學發光(luminescence,RLU)。
根據下面步驟進行計算由ADCC活性引起的細胞裂解率:先將所有孔的讀值減去培養基背景對照孔的平均讀值,然後計算裂解率%=(實驗孔讀值-靶細胞自發死亡釋放孔讀值-效應細胞自發死亡釋放孔)/(靶細胞最大死亡釋放孔讀值-靶細胞自發死亡釋放孔讀值)*100
結果顯示於圖7中,實驗結果顯示所測試的3個鼠源PD-L1抗體和FDA已批準上市的陽性對照抗PD-L1藥物Avelumab均顯示出對靶細胞A431細胞的抗體濃度依賴性的裂解殺傷活性和相近的EC50數值,同時,陰性同型對照抗體hIgG1,K(Abdserotec,PHP010)即使在最高濃度時也顯示沒有ADCC活性。
實施例12 鼠源PD-L1抗體PDL1-156的小鼠體內藥效檢測
利用B-hPD-1/hPD-L1轉基因小鼠(北京百奧賽圖基因生物技術有限公司)建立MC38-hPD-L1結腸癌動物模型並進行PD-L1抗
體藥效實驗。小鼠右側皮下接種5×105 MC38-hPD-L1結腸癌細胞。當腫瘤體積達到~110mm3時,挑選個體腫瘤體積適中的小鼠入組,將動物按腫瘤體積使用隨機分組軟體分配到3個實驗組:anti-Hel hIgG同型對照組、抗PDL1-156抗體組、陽性藥Avelumab組(Pfizer,lot AU020322),每組8只,分組當天開始給藥(定義為研究第0天)。各組均按照10mg/kg劑量,每週腹腔注射給藥兩次,共7次。每週兩次測量腫瘤體積和小鼠體重,並記錄測量值,計算腫瘤體積(長徑x短徑2/2)和生長抑制率(tumor growth inhibition %,TGITV(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100%;Ti:治療組在給藥第i天的腫瘤體積均值,T0:治療組在給藥第0天的腫瘤體積均值;Vi:溶劑對照組在給藥第i天的腫瘤體積均值,V0:溶劑對照組在給藥第0天的腫瘤體積均值),同時對腫瘤體積進行統計學分析,P<0.05認為有顯著性差異。
在分組給藥第21天,與對照組相比,陽性藥Avelumab組和PDL1-156鼠源抗PD-L1抗體組在腫瘤體積上有顯著且相近的抑制效果,且具有統計學差異(P<0.05)。見圖8A、B、C,表8。
此外,在實驗過程中,除hIgG對照組有1只小鼠提前異常死亡。其餘實驗動物在給藥期間活動和進食狀態良好,體重均有一定程度的上升,結果說明該抗體安全性較高,見圖8D、表9。
實施例13 人源化抗PD-L1抗體的小鼠體內藥效檢測
MC38-hPD-L1細胞以5×105個/0.1mL濃度接種於雌性6-8周B-hPD-L1轉基因小鼠(百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司)的右側皮下,待腫瘤生長到大約108mm3時按腫瘤體積挑選24只隨機分組,每組8只,共3組,分別為:生理鹽水、Avelumab(5mg/kg)、156-10H(5mg/kg)。所有組給藥途徑均為腹腔注射,每週給藥2次,連續給藥6次,末次給藥5天后結束實驗。給藥和觀察期間每週測量3次小鼠體重和腫瘤體積,並記錄測量值,計算腫瘤體積(長徑x短徑2/2)和生長抑制率(TGITV(%),在分組給藥第21天,與生理鹽水對照組相比,陽性藥Avelumab組和PD-L1抗體156-10H組在腫瘤體積上有顯著且相近的抑制效果,且具有統計學差異(P<0.05)。見圖9A、B、C,表10。
實驗動物在給藥期間活動和進食狀態良好,體重均有一定程度的上升,見圖9D、表11。
以上結果表明人源化的PD-L1抗體156-10H對MC38-hPD-L1腫瘤皮下移植瘤生長具有顯著抑制作用且表現出較高安全性。與陽性對照抗體Avelumab相比,兩者TGI水準相當,且156-10H顯示更均一抗腫瘤效果。
以上對本發明所提供的抗人程序性死亡配體-1(PD-L1)的抗體及其用途進行了詳細介紹。本文應用了具體個例對本發明的原理
及實施方式進行了闡述,以上實施例的說明只是用於幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出,對於本技術領域技術人員來說,在不脫離本發明原理的前提下,還可以對本發明進行若干改進和修飾,這些改進和修飾也落入本發明請求項的保護範圍內。
Claims (22)
- 一種特異性結合人程序性死亡配體-1(PD-L1)的分離的抗體或抗原結合片段,其特徵在於,所述抗體或抗原結合片段包含重鏈CDRs組合和輕鏈CDRs組合:(1)所述重鏈CDRs組合包含:CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH;所述CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH具有選自以下的任意序列組合或者與所述序列組合相比具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的序列組合:和,(2)所述輕鏈CDRs組合包含:CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL,所述CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL具有選自以下任意序列組合或者與所述序列組合相比具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的序列組合:各個CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH、CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL為根據KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法編碼。
- 如請求項1所述的抗體或抗原結合片段,其中,其包含選自以下的重鏈CDRs和輕鏈CDRs組合:VH1+VL1、VH2+VL2、VH3+VL3、VH4+VL4、VH6+VL6、VH7+VL7、VH8+VL8、VH9+VL9、VH10+VL10、VH11+VL11、VH12+VL12、VH13+VL13、VH15+VL15、VH16+VL16、VH17+VL17或VH18+VL18以及與所述重鏈和輕鏈CDRs組合之序列相比具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的CDRs組合。
- 如請求項1所述的抗體或抗原結合片段,其中,1)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列;2)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列;3)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列;4)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列;5)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示序列;6)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示序列;7)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示序列;或8)重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示序列。
- 如請求項1所述的抗體或抗原結合片段,其中,其與人程 序性死亡配體-1(PD-L1)結合的解離常數(KD)不大於10nM,與食蟹猴程序性死亡配體-1(PD-L1)結合的解離常數(KD)不大於100nM。
- 如請求項1所述的抗體或抗原結合片段,其中,所述抗體或抗原結合片段為:(1)嵌合抗體或其片段;(2)人源化抗體或其片段;(3)全人源抗體或其片段。
- 如請求項1所述的抗體或抗原結合片段,其中,所述抗體包含人或鼠抗體IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一恒定區的序列。
- 如請求項6所述的抗體或抗原結合片段,其中,所述抗體包含人或鼠抗體IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定區的序列。
- 如請求項1所述的抗體或抗原結合片段,其中,所述抗原結合片段選自F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、雙特異抗體、納米抗體和抗體最小識別單位中的一種或多種。
- 一種抗體或抗原結合片段,其中,所述抗體或抗原結合片段與請求項1至8任一項所述的抗體或抗原結合片段競爭性地結合PD-L1或其抗原表位,並且具備以下特性:1)特異性結合PD-L1重組蛋白及表達PD-L1的細胞;2)阻斷PD-L1與PD-1蛋白的結合;3)抑制PD-1與細胞表面表達的PD-L1的結合;4)增強T細胞活性;5)介導抗體依賴的細胞殺傷(ADCC)活性;或/和6)抑制腫瘤生長。
- 一種分離的核酸分子,其特徵在於,所述核酸分子編碼如請求項1至9任一項所述的抗體、抗原結合片段、或其任意組合。
- 一種包含如請求項10所述分離的核酸分子的表達載體。
- 一種包含如請求項10所述的分離的核酸分子、或請求項11所述的表達載體的分離的宿主細胞。
- 如請求項12所述的宿主細胞,其中,所述宿主細胞是真核細胞或原核細胞。
- 如請求項13所述的宿主細胞,其中,所述宿主細胞來源於哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、大腸桿菌和/或枯草桿菌。
- 如請求項14所述的宿主細胞,其中,所述宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。
- 一種抗體或抗原結合片段的製備方法,其特徵在於,在適當的條件下培養如請求項12至15任一項所述的宿主細胞,並分離抗體或抗原結合片段。
- 一種藥物組合物,其特徵在於,所述組合物包含如請求項1至9任一項所述的抗體或抗原結合片段、如請求項10所述的分離的核酸分子、如請求項11所述的表達載體、如請求項12所述的細胞,或如請求項16所述的方法製備的產品,以及藥學上可接受的載體。
- 如請求項17所述的藥物組合物,其中,所述藥物組合物還包含額外的抗腫瘤劑。
- 如請求項1至9任一項所述的抗體或抗原結合片段、如請求項10所述的分離的核酸分子、如請求項11所述的表達載體、如請求項12所述的細胞、如請求項16所述的方法製備的產品、或如請求項17所述的藥物組合物在製備預防和/或治療PD-L1表達異常相關的疾病的藥物中的用途。
- 如請求項19所述的用途,所述疾病為腫瘤。
- 如請求項20所述的用途,所述腫瘤為結直腸癌。
- 一種試劑盒,其包含如請求項1至9任一項所述的抗體或其抗原結合片段、如請求項10所述的分離的核酸分子、如請求項11所述的表達載體、如請求項12所述的細胞、如請求項16所述的方法製備的產 品,以及使用說明。
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