CN117120469A - 抗tnfr2人源化抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能够特异性地结合TNFR2的人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段能够调节免疫细胞的功能，可作为药物治疗与免疫异常有关的疾病，例如肿瘤。
Description
本申请要求于2021年1月29日提交到中国国家知识产权局的发明名称为“抗TNFR2人源化抗体及其用途”的中国专利申请202110140980.5和于2021年8月31日提交到中国国家知识产权局的发明名称为“抗TNFR2人源化抗体及其用途”的中国专利申请202111016307.7的优先权，其内容均通过引用以整体并入本文。
本发明涉及生物医药和生物工程领域，具体而言，涉及抗TNFR2的人源化抗体或其抗原结合片段，以及所述抗TNFR2人源化或其抗原结合片段的药物组合物及其用途。
免疫是机体的一种保护反应，受到很多基因、蛋白质以及细胞的作用。免疫异常会引起许多疾病，包含肿瘤、免疫缺陷(如艾滋病等)、过敏和类风湿性关节炎等疾病。在过去几年中，肿瘤免疫疗法作为一种全新的治疗方式，已成为肿瘤治疗研究领域的一大热点。靶向免疫检查点蛋白的拮抗性抗体，如抗PD-1和抗CTLA-4单抗，已被用于治疗多种类型的癌症，且取得了革命性的结果，大大延长了恶行肿瘤患者的生存期。然而还是有许多癌症患者对于免疫检查点蛋白的拮抗性抗体的治疗没有反应或在短暂治疗后产生抗性或耐药性。因此需要开发新的治疗癌症的药物，可单用或与其它肿瘤治疗方法联用，包含与免疫检查点蛋白的拮抗性抗体联合使用，以进一步提高疗效和安全性。
发明人发现，人TNFR2在人Treg和人的多种肿瘤细胞表面过度表达，提示人TNFR2可能促进患者肿瘤发生并介导肿瘤微环境的免疫抑制和免疫逃逸。通过TNFR2调控Treg细胞的功能，从而抑制肿瘤的发生，可能是一条非常有潜力的抗肿瘤策略。发明人制备了针对TNFR2的拮抗性抗体，其可以1)特异性结合TNFR2，阻断TNFR2和其配体TNFα的结合，从而抑制Treg细胞的增殖及其介导的抑制功能，促进效应T细胞的扩增以及效应T细胞和其他免疫细胞介导的抗肿瘤功能；2)由于TNFR2在人的肿瘤细胞系上高表达，此抗体也可直接介导对TNFR2高表达肿瘤细胞的杀伤作用；3)和现有抗PD-1/L1联用有更好的抗肿瘤效果并形成持久的免疫记忆。针对上述抗TNFR2的拮抗性抗体的描述，请参见PCT/CN2020/106057，该专利申请的全部内容通过引用的方式结合于本申请中。
发明内容
本发明制备获得了抗TNFR2的人源化抗体或其抗原结合片段，以及制备了所述抗TNFR2人源化或其抗原结合片段的药物组合物，并验证了其用途。
在第一方面，本发明提供了一种特异性结合TNFR2的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；
(1)所述重链可变区包含：
a.选自SEQ ID NO.19～27任一所示的VH序列，
b.选自与SEQ ID NO.19～27任一序列相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VH序列，或，
c.选自与SEQ ID NO.19～27任一序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的VH序列；
(2)所述轻链可变区包含：
a.选自SEQ ID NO.28～37任一所示的VL序列，
b.选自与SEQ ID NO.28～37任一序列相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VL序列，或，
c.选自与SEQ ID NO.28～37任一序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的VL序列；
可选地，所述氨基酸插入、缺失和/或替换发生在重链可变区或/和轻链可变区的FR区；
可选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
在某些实施方案中，在本发明所述的抗体或其抗原结合片段中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.19～27任一序列相比CDR完全一致，FR具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VH序列；所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.28～37任一序列相比CDR完全一致，FR具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VL序列。
在某些实施方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段包含的重链可变区和轻链可变区选自如下组：
(1)具有SEQ ID NO.19所示的VH和SEQ ID NO.28所示的VL；
(2)具有SEQ ID NO.20所示的VH和SEQ ID NO.29所示的VL；
(3)具有SEQ ID NO.19所示的VH和SEQ ID NO.30所示的VL；
(4)具有SEQ ID NO.20所示的VH和SEQ ID NO.31所示的VL；
(5)具有SEQ ID NO.19所示的VH和SEQ ID NO.31所示的VL；
(6)具有SEQ ID NO.21所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
(7)具有SEQ ID NO.22所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
(8)具有SEQ ID NO.23所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
(9)具有SEQ ID NO.24所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
(10)具有SEQ ID NO.25所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；
(11)具有SEQ ID NO.26所示的VH和SEQ ID NO.33所示的VL；
(12)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.34所示的VL；
(13)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.35所示的VL；
(14)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.33所示的VL；
(15)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.36所示的VL；
(16)具有SEQ ID NO.26所示的VH和SEQ ID NO.34所示的VL；
(17)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.37所示的VL；
(18)具有与上述(1)～(17)任一序列组合相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VH和VL组合；
(19)具有与上述(1)～(17)任一项序列组合相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的VH和VL组合；或，
(20)具有与上述(1)～(17)任一项序列组合相比CDR完全一致，FR具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VH和VL组合；
可选地，所述氨基酸插入、缺失和/或替换发生在重链可变区或/和轻链可变区的FR区；
可选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
在某些实施方案中，在本发明所述的抗体或其抗原结合片段中，所述抗体或其抗原结合片段包含：CDR1-VH选自SEQ ID NO.1、7、或13；CDR2-VH选自SEQ ID NO.2、8、或14；CDR3-VH选自SEQ ID NO.3、9、或15；CDR1-VL选自SEQ ID NO.4、10、或16；CDR2-VL选自SEQ ID NO.5、11、或17；和CDR3-VL选自SEQ ID NO.6、12、或18。
在某些实施方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其与人TNFR2结合的解离常数(KD)不大于7nM，与食蟹猴TNFR2结合的解离常数(KD)不大于5nM。
在某些实施方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段包含或不包含重链恒定区和/或轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区包含全长重链恒定区或其片段，所述片段可选自CH1结构域、Fc结构域或CH3结构域；优选地，所述重链恒定区和/或轻链恒定区为人重链恒定区和/或人轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区可选自IgG重链恒定区，例如IgG1重链恒定区、IgG2重链恒定区、IgG3重链恒定区或IgG4重链恒定区；优选地，所述重链恒定区是人IgG1重链恒定区、人IgG2重链恒定区、人IgG3重链恒定区或人IgG4重链恒定区。
在某些实施方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段，选自单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、工程化抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、全长抗体、抗体片段、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、或双抗体(diabody)。
在某些实施方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段，通过或不通过接头(linker)偶联有另一分子；优选地，所述另一分子可选自治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂或光敏剂。
在某些实施方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段，具有以下特性：
(1)特异性结合细胞表面表达TNFR2的细胞；(2)特异性结合Treg细胞；(3)抑制TNFα与TNFR2蛋白的结合；(4)抑制TNFα与细胞表面表达的TNFR2的结合；(5)抑制TNFα介导的Treg的增殖和/或Treg功能；(6)抑制TNFα介导的IκBα降解；(7)抑制Treg对Tcon细胞增殖的抑制；(8)介导针对TNFR2表达细胞的ADCC功能；(9)提升肿瘤浸润免疫细胞TIL中CD8+T/Treg细胞比例；或/和(10)抑制肿瘤生长。
在第二方面，本发明提供了一种多特异性抗原结合分子，所述多特异性抗原结合分子至 少包含第一抗原结合模块和第二抗原结合模块，所述第一抗原结合模块包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段，所述第二抗原结合模块特异性结合TNFR2以外的其他抗原或结合与第一抗原结合模块不同的TNFR2抗原表位；优选地，所述其他抗原选自CD3、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD16A、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD80、CD86、CD126、CD138、B7、PD-1、PD-L1、PD-2、CTLA4、PRVIG、TIGHT、HAS、CLDN18.2、MSLN、MUC、Ia、HLA-DR、腱生蛋白、EGFR、VEGF、P1GF、ED-B纤连蛋白、癌基因产物、IL-2、IL-6、IL-15、IL-21、TRAIL-R1或TRAIL-R2；优选地，所述多特异性抗体为“双特异性”、“三特异性”或“四特异性”。
在第三方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域；所述细胞外抗原结合结构域包含本发明第一方面所述TNFR2人源化抗体或其抗原结合片段，或包含本发明第二方面所述多特异性抗原结合分子。
在第四方面，本发明提供了一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包含本发明第三方面所述嵌合抗原受体或包含编码本发明第三方面所述嵌合抗原受体的核酸的片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞；所述T细胞可选自炎性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞(Treg)或辅助性T细胞；优选地，所述免疫效应细胞为同种异体免疫效应细胞或自体免疫细胞。
在第五方面，本发明提供了一种分离的核酸片段，所述核酸片段编码本发明第一方面所述TNFR2人源化抗体或其抗原结合片段、第二方面所述多特异性抗原结合分子或第三方面所述的嵌合抗原受体。
在第六方面，本发明提供了一种载体(vector)，所述载体包含第五方面所述核酸片段。
在第七方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含第六方面所述载体；优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)；优选地，所述细胞缺乏岩藻糖基转移酶，更优选地，所述岩藻糖基转移酶是FUT8。
在第八方面，本发明提供了一种制备本发明任一项所述抗体或其抗原结合片段或本发明所述多特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括培养第七方面所述细胞，以及分离所述细胞表达的抗体或其抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
在第九方面，本发明提供了一种制备免疫效应细胞的方法，所述方法包括将编码前述CAR的核酸片段导入所述免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达所述CAR。
在第十方面，本发明提供了一种药物组合物，所述组合物包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段、本发明所述的多特异性抗原结合分子、本发明所述的嵌合抗原受体、本发明所述的免疫效应细胞、本发明所述的核酸片段、本发明所述的载体、本发明所述的细胞或本发明所述方法制备获得的产品；优选地，所述组合物还包含药学上可接受的载体(carrier)、稀 释剂或助剂；优选地，所述组合物还包含额外的抗肿瘤剂、免疫治疗剂或免疫抑制剂；优选地，所述额外的抗肿瘤剂选自PD-1抗体、PD-L1抗体或CTLA-4抗体。
在第十一方面，本发明提供了所述的抗体或其抗原结合片段、所述的多特异性抗原结合分子、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫效应细胞、所述的核酸片段、所述的载体、所述的细胞、所述方法制备获得的产品以及所述药物组合物在制备治疗和/或预防免疫异常相关疾病的药物中的用途；优选地，所述免疫异常相关疾病是Treg细胞和/或MDSC功能相关疾病；优选地，所述疾病是癌症或自身免疫性疾病；优选地，所述癌症选自卵巢癌、晚期表皮T细胞淋巴瘤、III/IV期转移性结直肠癌、三阴乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和/或对CTLA-4和PD-1疗法耐药的晚期实体瘤，如转移性黑色素瘤；优选地，所述自身免疫性疾病可选自类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性硬化症、视神经脊髓炎谱系病、系统性红斑狼疮、重症肌无力、IgG4相关性疾病。
在第十二方面，本发明提供了一种治疗和/或预防免疫异常相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明所述的抗体或其抗原结合片段、所述的多特异性抗原结合分子、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫效应细胞、所述的核酸片段、所述的载体、所述的细胞、所述方法制备获得的产品或所述药物组合物；优选地，所述免疫异常相关疾病是Treg细胞和/或MDSC功能相关疾病；优选地，所述疾病是癌症或自身免疫性疾病；优选地，所述癌症选自卵巢癌、晚期表皮T细胞淋巴瘤、III/IV期转移性结直肠癌、三阴乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、和/或对CTLA-4和PD-1疗法耐药的晚期实体瘤，如转移性黑色素瘤；优选地，所述自身免疫性疾病可选自类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性硬化症、视神经脊髓炎谱系病、系统性红斑狼疮、重症肌无力、IgG4相关性疾病。
在第十三方面，本发明还提供了向所述对象施用额外的抗肿瘤治疗，例如化疗剂、靶向治疗剂和免疫治疗剂，包括PD-1/PD-L1治疗如抗PD-1/PD-L1抗体、抗CTLA-4治疗剂如抗CTLA-4抗体；优选地，所述额外的抗肿瘤治疗选自PD-1/PD-L1治疗；优选地，所述PD-1/PD-L1治疗选自PD-L1抗体。
在第十四方面，本发明提供了一种体外检测TNFR2的方法，其包括使怀疑含有TNFR2的样品与本发明所述的抗体或其抗原结合片段相接触的步骤。
术语定义和说明
除非另外说明，本文所用术语具有所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。对于本文中明确定义的术语，则该术语的含义以所述定义为准。
如本文所用，术语“TNFR2”是指肿瘤坏死因子受体2，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员1B(TNFRSF1B)或CD120b，这是一种结合肿瘤坏死因子-α(TNFα)的膜受体。所述TNFR2优选地是人TNFR2。
如本文所用，术语“抗-肿瘤坏死因子受体2抗体”、“肿瘤坏死因子受体2抗体”、“抗TNFR2抗体”、“TNFR2抗体”、“抗-TNFR2抗体部分”和/或“抗-TNFR2抗体片段”等是指任何包含能够特异性结合TNFR2的免疫球蛋白分子的至少一部分(例如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分)的含蛋白质或肽的分子。TNFR2抗体还包括抗体样蛋白支架(如第十纤连蛋白 III型结构域(10Fn3))，其含有与抗体CDR在结构和溶剂可及性上相似的BC、DE和FG结构环。10Fn3结构域的三级结构类似于IgG重链可变区的三级结构，并且通过将10Fn3的BC、DE和FG环的残基用来自TNFR2单克隆抗体的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3区的残基替换，本领域技术人员可以将例如TNFR2单克隆抗体的CDR接枝到纤连蛋白支架上。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)是指与目标抗原特异性结合或具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，包括抗体的多克隆、单克隆、基因工程化和其他修饰形式(包括但不限于嵌合抗体，人源化抗体，全人源抗体，异源偶联抗体(例如双特异性、三特异性和四特异性抗体，双抗体，三抗体和四抗体)，抗体缀合物)以及抗体的抗原结合片段(包括例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)。此外，除非另有说明，否则术语“单克隆抗体”(mAb)意指包括能够特异性结合靶蛋白的完整抗体分子以及不完整的抗体片段(例如Fab和F(ab’)2片段，它们缺少完整抗体的Fc片段(从动物循环中更快地清除)，因此缺乏Fc介导的效应功能(effector function)(参见Wahl等人，J.Nucl.Med.24:316,1983；其内容援引加入本文)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆(包括任何真核、原核、或噬菌体克隆)的抗体，而不限于该抗体的产生方法。
如本文所用，术语“抗原结合片段”和“抗体片段”可互换，是指保留特异性结合靶抗原的能力的一个或更多个抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP、双抗体、三抗体、亲和体(affibody)、纳米抗体、适体或结构域抗体。涵盖术语抗体的“抗原结合片段”的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(V)包含VH和VL结构域的dAb；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341:544-546,1989)；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区(CDR)；以及(ix)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可以任选地由合成接头连接。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是通过独立的基因编码的，但是这两个结构域可以使用重组方法通过接头接合，该接头能够使其制成其中VL和VH区配对以形成单价分子的单蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，Science 242:423-426,1988以及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且这些片段被筛选用于与完整抗体相同的方式使用。可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解、或在一些实施方式中通过本领域已知的化学肽合成程序来产生抗原结合片段。
如本文所用，术语“互补决定区”(CDR)指在轻链和重链可变结构域中均发现的高变区。可变结构域中更高保守性的部分称为框架区(FR)。如本领域所理解的，表示抗体的高变区的氨基酸位置可以根据上下文和本领域已知的各种定义而变化。可变结构域内的一些位置可以被视为杂合高变位置，因为这些位置可以被认为是在一组标准(如IMGT或KABAT)下的可高变区之内，而被认为在不同组的标准(如KABAT或IMGT)下的可高变区之外。这些位置中的一个或更多个也可以在延伸的可高变区中找到。本发明包括在这些杂合可高变的位置中包含修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采用片层构型的四个框架区， 其通过三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)连接，这三个CDR形成连接片层结构的环，并且在一些情况下形成片层结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区按顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4紧密保持在一起，并且与来自其他抗体链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequences of Protein sofImmunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,Md.1987；其通过援引加入并入本文)。例如在本文中，CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH分别是指重链可变区(VH)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR，这三个CDR构成了重链(或其可变区)的CDR组合(VHCDR组合)；CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL分别是指轻链可变区(VL)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR，这三个CDR构成了轻链(或其可变区)的CDR组合(VLCDR组合)。
如本文所用，术语“Kabat编号系统”通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
如本文所用，术语“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链(包括Fv、scFv或Fab的重链)的可变区。术语“VL”是指免疫球蛋白轻链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链)的可变区。
本文术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”至少包含：CH1结构域，铰链区，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成；当抗体为IgE时，其还包括CH4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括CH1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自CH1、Fc或CH3结构域。
本文术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
本文术语“Fc”是指完整抗体经木瓜蛋白水解而成的抗体羧基端部分，典型地，其包含抗体的CH3和CH2结构域。Fc区包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链的Fc区通常被定义为从Cys226位置的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EUKabat编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化过程中，或通过对编码抗体重链的核酸重组工程化而除去，因此，Fc区可包括或不包括Lys447。
如本文所用，术语“百分比(％)序列一致性”和“百分比(％)序列同一性”可互换，是指在为达到最大百分比序列一致性而比对序列和引入空位(如果需要)(例如，为了最佳比对，可以在候选和参比序列中的一个或两个中引入空位，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)之后，候选序列的氨基酸(或核苷酸)残基与参比序列的氨基酸(或核苷酸)残基相同的百分比。出于确定百分比序列一致性的目的，可以用本领域技术人员熟知的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAIi) 软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。例如，用于与候选序列进行比较而比对的参比序列可以显示候选序列在候选序列的全长或候选序列的连续氨基酸(或核苷酸)残基的选定部分上表现出从50％至100％的序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列的长度可以是例如参比序列的长度的至少30％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的位置被与在参比序列中的相应位置相同的氨基酸(或核苷酸)残基占据时，则这些分子在那个位置是相同的。
本文术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。示例性地，下述每组内的氨基酸属于彼此的保守氨基酸残基，组内氨基酸残基的替换属于保守氨基酸的替换：
(1)酸性氨基酸：Asp(D)和Glu(E)；
(2)碱性氨基酸：Lys(K)、Arg(R)和His(H)；
(3)亲水性不带电荷氨基酸：Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)和Gln(Q)；
(4)脂肪族不带电荷氨基酸：Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)；
(5)非极性不带电荷的氨基酸：Cys(C)、Met(M)和Pro(P)；
(6)芳香族氨基酸：Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。
如本文所用，术语“特异性结合”是指一种结合反应，其决定抗原在蛋白质和其他生物分子的一个异质性群体中的存在状况，所述蛋白质和其他生物分子例如被抗体或其抗原结合片段特异性识别。与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段将以小于100nM的KD与抗原结合。例如，与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段将以高达100nM(例如，1pM至100nM之间)的KD与抗原结合。不显示与特定抗原或其表位特异性结合的抗体或其抗原结合片段将显示对该特定抗原或其表位的大于100nM(例如，大于500nM、1μM、100μΜ、500μΜ或1mM)的KD。可以使用多种免疫测定方式来选择与特定蛋白或碳水化合物进行特异性免疫反应的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定法来选择与蛋白质或碳水化合物进行特异性免疫反应的抗体。参见，Harlow & Lane，Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1988)以及Harlow & Lane,Using Antibodies，A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1999)，其描述了可以用于确定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指具有至少两个抗原结合位点，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的抗原具有单克隆结合特异性的抗体，其通常是人或人源化的抗体。在本发明中，结合特异性之一可以针对TNFR2的抗原表位而被检测，另一个可以针对TNFR2的另一个抗原表位或任何其他抗原，例如针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒来源蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌来源蛋白或细菌表面蛋白等而被检测。
如本文所用，术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此,术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、 两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指以下抗体，其具有源自一种来源生物(如大鼠或小鼠)的免疫球蛋白的可变序列以及源自不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人，1986,Bio Techniques 4:214-221；Gillies等人，1985J Immunol Methods 125:191-202；以上通过援引加入并入本文。
如本文所用，术语“抗体缀合物”是指抗体分子直接或者通过连接接头与另一个分子化学键合而形成的偶联体/缀合物。所述另一个分子可以是治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂或光敏剂。“抗体缀合物”例如抗体-药物缀合物(ADC)，其中药物分子就是所述的另一个分子。
本文术语“抗原嵌合受体(CAR)”是指经改造以在免疫效应细胞上表达并且特异性结合抗原的人工免疫效应细胞表面受体，其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域，例如抗体的可变重链或轻链，(2)锚定CAR进入免疫效应细胞的跨膜结构域，和(3)胞内信号传导结构域。CAR能够利用细胞外抗原结合结构域以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫效应细胞重定向至所选择的靶标，例如癌细胞。
如本文所用，术语“调节性T细胞”或“Treg”，也曾被称为抑制T细胞(suppressor T cells)，是一群负调节机体免疫反应的淋巴细胞，用以维持对自身抗原的耐受性，控制免疫反应过度，避免对正常细胞产生免疫损伤，防止自身免疫病的发生。Treg表达以下生物标志物：CD4、FOXP3和CD25，被认为与幼稚型CD47细胞源自同一谱系。Treg在肿瘤的发生中起到极其重要的作用，多项研究表明Treg细胞在肿瘤微环境中的数目显著增加，包括黑色素癌，卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，肺癌，胰腺癌等，同时Treg细胞的数目和肿瘤病人的存活率亦密切相关。此外，肿瘤细胞会诱导肿瘤浸润性Treg细胞的增殖，增殖的Treg细胞会大量分泌TGF-β等免疫抑制因子，抑制CD8+T细胞等免疫细胞的功能，阻碍免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，是多种实体瘤和血液瘤免疫治疗失败的重要耐药机制。近期研究表明，PD-1/PD-L1等免疫治疗病人的免疫耐受也与Treg密切相关。
如本文所用，术语“载体”(vector)包括核酸载体，例如DNA载体(如质粒)、RNA载体、病毒或其他适合的复制子(例如病毒载体)。已经开发了多种载体用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。本发明的表达载体含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的附加序列元件。可以用于表达本发明的抗体和抗体片段的某些载体包括含有指导基因转录的调控序列(如启动子和增强子区域)的质粒。用于表达抗体和抗体片段的其他有用的载体含有多核苷酸序列，其 增强这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括例如5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的表达载体还可以含有以下多核苷酸，该多核苷酸编码用于选择含有这种载体的细胞的标记。适合的标记的实例包括编码抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)抗性的基因。
如本文所用，术语“受试者”、“对象”和“患者”是指接受对如本文所述的特定疾病或病症(如癌症或传染性疾病)的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症(例如细胞增殖性病症，如癌症或传染性疾病)的治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科家族成员(如家牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、牛、绵羊、马和野牛等。
如本文所用，术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如细胞增殖性病症(如癌症或传染性疾病)的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
如本文所用，术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分的用量。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。
图1.显示受试抗体和人TNFR2重组蛋白的结合能力。图A、B、C分别为#001、#219、#224受试抗体人源化分子与人TNFR2重组蛋白的结合能力；其中WT为人鼠嵌合野生型分子，抗鸡蛋白溶菌酶(anti-Hel-WT)同型对照抗体为该实验的阴性对照。
图2.显示受试抗体和食蟹猴TNFR2重组蛋白的结合能力。图A、B、C分别为#001、#219、#224受试抗体人源化分子与食蟹猴TNFR2重组蛋白的结合能力；其中WT为人鼠嵌合野生型分子，抗鸡蛋白溶菌酶(anti-Hel-WT)同型对照抗体为该实验的阴性对照。
图3.显示受试抗体和高表达人TNFR2的CHO-TNFR2细胞的结合能力。图A、B、C分别为#001、#219、#224受试抗体人源化分子与CHO-TNFR2细胞的结合能力；其中anti-Hel-WT为阴性同型对照抗体。
图4.显示受试抗体和Treg细胞的结合能力。图A、B分别为#001、#219受试抗体人源化分子与Treg结合的重叠图。空心峰为anti-Hel-WT同型阴性对照抗体的结合图，实心峰为每个抗体与Treg细胞的结合图；“只加二抗”和“未染色”(未加任何抗体的空白细胞对照) 都为阴性对照，抗体浓度为200ng/ml。
图5.显示受试抗体和激活后的食蟹猴PBMC中CD8+T细胞的结合。图A为受试抗体分别在2μg/ml与0.2μg/ml浓度与食蟹猴CD8+T结合的重叠图。图B为受试抗体分别在2μg/ml与0.2μg/ml浓度与食蟹猴CD8+T结合的平均荧光强度倍数(受试样品结合的平均荧光强度与只加二抗样品的平均荧光强度的比值)。其中抗鸡蛋白溶菌酶(anti-Hel)同型对照抗体为该实验的阴性对照。
图6.显示受试抗体抑制人TNFα与人TNFR2重组蛋白间的相互作用。图A、B、C分别为#001、#219、#224受试抗体人源化分子对TNFα-TNFR2的抑制；其中抗鸡蛋白溶菌酶(anti-Hel-WT)同型对照抗体为该实验的阴性对照。
图7.显示受试抗体抑制人TNFα与CHO-TNFR2细胞表达的人TNFR2相互作用。图A、B、C分别为#001、#219、#224受试抗体人源化分子对TNFα与CHO-TNFR2相互作用的抑制；其中anti-Hel-WT为阴性同型对照抗体。
图8.显示受试抗体对TNFα引起的IκBα降解的抑制作用。图A为本实验的圈门策略。图B为受试抗体对TNFα引起的IκBα降解的抑制作用；左边图为不同浓度的抗体与IκBα
low的百分比做的柱状图，右边图为抗体浓度梯度对IκBα
low的百分比相对于阴性对照抗体anti-Hel的倍数的变化。抗体的试验浓度分别在0.25，2.5和25μg/ml；其中“不做处理的Treg细胞”是指没有任何处理的Treg细胞，TNF是指用10ng/ml TNFα处理过Treg细胞；Rat IgG2b-PE为Anti-IκBα-PE抗体的阴性同型对照(anti-Hel)。每个浓度受试抗体与阴性同型对照anti-Hel相比具有统计学差异(**p<0.01,***p<0.001,Two-Way ANOVA Analysis)。
图9.显示受试抗体对TNFα诱导的Treg细胞增殖的抑制。图A为不同受试抗体与阴性同型对照anti-Hel对Treg增殖影响的重叠图，其中虚线为anti-Hel，实线为受试抗体。图B为不同抗体对TNFα诱导Treg增殖的抑制作用，纵坐标为Treg增殖百分比，横坐标为受试抗体。其中“未加药处理”(即不加任何药物处理)和anti-Hel为本实验体系的阴性对照。每个抗体的实验浓度为12.5μg/ml。每个受试抗体与阴性同型对照anti-Hel相比具有统计学差异(**p<0.01,***p<0.001,One-Way ANOVA Analysis)。
图10.显示受试抗体对Treg对Tcon细胞增殖抑制活性的抑制作用。图A为不同受试抗体与阴性同型对照anti-Hel对Treg抑制Tcon细胞增殖影响的重叠图，其中虚线为anti-Hel，实线为受试抗体。图B为不同抗体对Treg抑制Tcon细胞增殖的抑制作用，纵坐标为Tcon细胞增殖百分比，横坐标为受试抗体。其中未加药处理(即No treat)和Anti-Hel为本实验体系的阴性对照，Tcon+beads为没有Treg细胞存在时的Tcon增殖，为实验体系的阳性对照。每个抗体的实验浓度为12.5μg/ml。每个受试抗体与阴性同型对照anti-Hel相比具有统计学差异(*p<0.05,**p<0.01,One-Way ANOVA Analysis)。
图11.显示受试抗体的ADCC杀伤作用。图A示受试抗体对Treg的ADCC杀伤作用。图B示受试抗体对高表达人TNFR2的CHO-TNFR2细胞的ADCC杀伤作用。其中anti-Hel为阴性对照抗体。
图12A-12C.显示hTNFR2转基因小鼠(TNFR2 HuGEMM)血液免疫细胞中hTNFR2和mTNFR2的表达鉴定。图12A示TNFR2 HuGEMM(亦可称为hTNFR2-GEMM)小鼠血液中 免疫细胞的FACS圈门策略及圈出的CD4+T细胞，CD8+T细胞和Treg细胞上mTNFR2和hTNFR2的表达水平及圈门的FMO对照(Fluorescence Minus One control)。图12B示TNFR2 HuGEMM和Balb/c野生型小鼠血液中CD4+T细胞，CD8+T细胞及Treg细胞中mTNFR2和hTNFR2的表达水平的峰图；点线:同型,虚线:BALB/c小鼠,实线:TNFR2 HuGEMM。图12C为TNFR2 HuGEMM和Balb/c野生型小鼠血液中CD4+T细胞，CD8+T细胞及Treg细胞中mTNFR2和hTNFR2的平均荧光强度统计图。
图13A-13C.显示TNFR2抗体抑制mTNFα诱导的TNFR2 HuGEMM(图中简称GEMM)小鼠的Treg细胞增殖。图13A示GEMM小鼠和野生型WT Balb/c小鼠脾脏中Treg细胞表达人TNFR2和小鼠TNFR2的水平。图13B和13C为受试TNFR2抗体在无激活剂(B)或有激活剂(C)Dynabeads mouse T-activator CD3/CD28下对mTNFα诱导的GEMM小鼠或WT Balb/c小鼠的Treg细胞增殖的抑制作用。每个抗体的实验浓度为10μg/ml。每个受试抗体与阴性同型对照相比具有统计学差异(***p<0.001,****p<0.0001，One-Way ANOVA Analysis)。
图14.显示抗TNFR2抗体能剂量依赖性抑制TNFR2 HuGEMM小鼠肿瘤生长。图A、B分别示219-Hu1-mIgG2a、001-Hu3-mIgG2a在剂量为30mg/kg,10mg/kg,3mg/kg时相比较载剂(Vehicle)对照组可剂量依赖性抑制CT26-hTNFR2 KI肿瘤的生长。
图15.显示抗TNFR2抗体抑制TNFR2 HuGEMM小鼠肿瘤生长的同时不引起小鼠的体重下降。图A-B示不同剂量219-Hu1-mIgG2a或001-Hu3-mIgG2a给药后小鼠体重绝对重量的变化。图C-D示219-Hu1-mIgG2a或001-Hu3-mIgG2a不同剂量给药后小鼠体重的变化率。
图16.显示抗TNFR2抗体在人PBMC免疫重建人源化小鼠结肠癌肿瘤模型中的两个不同PBMC供体中都能显著抑制肿瘤生长。图A示在donor#193中，抗TNFR2抗体219-Hu1具有显著的药效。图B示在donor#272中，肿瘤接种后第29天，与对照抗体组相比，001-Hu3、219-Hu1、Keytruda组的肿瘤增长均被显著抑制，且具有统计学差异(****:p<0.0001,vs.isotype,Two way ANOVA)。图C-D示在donor#193和donor#272中，对照组和给药组小鼠均出现体重下降。
图17.显示抗TNFR2抗体能显著提升肿瘤浸润免疫细胞TIL中CD8+T/Treg细胞比例。图A示肿瘤浸润TIL中CD4+T，CD8+T及Treg细胞的圈门策略。图B示在donor#193中，isotype抗体，001-Hu3抗体及219-Hu1抗体治疗后肿瘤浸润白细胞(TIL)中CD4+T，CD8+T及Treg占CD45+细胞的比例。图C示在donor#193中，isotype抗体，001-Hu3抗体及219-Hu1抗体治疗后TIL中CD4+T，CD8+T及Treg在每mg肿瘤组织中的绝对数量。图D示在donor#193中，isotype抗体，001-Hu3抗体及219-Hu1抗体治疗后TIL中CD8+T/Treg的比例。图E示在donor#272中，isotype抗体，001-Hu3抗体及219-Hu1抗体治疗后TIL中CD4+T，CD8+T及Treg占CD45+细胞的比例。图17F示在donor#272中，isotype抗体，001-Hu3抗体及219-Hu1抗体治疗后TIL中CD4+T，CD8+T及Treg在每g肿瘤组织中的绝对数量。图17G示在donor#272中，isotype抗体，001-Hu3抗体及219-Hu1抗体治疗后肿瘤浸润TIL中CD8+T/Treg的比例(*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,unpaired T test)。
图18.显示hTNFR2 KI-CT26.1C03结肠癌模型中各治疗组肿瘤体积变化曲线。
图19.显示hTNFR2 KI-CT26.1C03结肠癌模型中各治疗组动物体重变化曲线。本图表示 不同剂量219-Hu1-hIgG1抗体或联合anti-mPD-L1抗体给药后小鼠体重绝对重量的变化。
图20.显示hTNFR2 KI-CT26.1C03结肠癌模型中各治疗组动物体重变化率曲线。本图表示不同剂量219-Hu1-hIgG1抗体或联合anti-mPD-L1抗体给药后小鼠体重的变化率。
图21.显示hTNFR2 KI-CT26.1C03结肠癌模型中各治疗组实验终点肿瘤体重变化。本图表示不同剂量219-Hu1-hIgG1抗体或联合anti-mPD-L1抗体，在实验终点分离肿瘤并称重的肿瘤重量的变化。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 抗TNFR2人源化单克隆抗体的表达纯化
1.1抗TNFR2抗体人源化
采用“CDRs移植”方法进行抗体人源化，即基于序列挑选同源性最高的人源性抗体提供抗体骨架区(FRs)，把目标抗体中基于Kabat命名方法的抗原结合片段互补决定区(CDRs)，移植到前者形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的人源化抗体可变区序列。其次，为有效保持抗体活性和亲和力，基于抗体结构建模(MOE软件)，选择潜在回复突变点，选择标准：1).选择抗体骨架区位于VH-VL界面、靠近或与CDRs有直接相互作用等氨基酸残基进行回复突变，这类氨基酸残基对保持CDRs区构象多较重要；2).考虑到免疫原性，尽量选择包埋在蛋白内部的氨基酸进行回复突变；3).考虑到抗体稳定性和表达水平，优选分子能量降低的突变。通过测试含有不同突变的人源化抗体与人TNFR2的亲和力以及和表面表达TNFR2的细胞的结合，筛选与鼠源抗体亲和力、抗体表征和活性功能相当或更好的人源化抗体。
其中，TNFR2抗体Kabat命名方法的抗原结合片段互补决定区(CDRs)详见表1，表2示出人源化抗体分子的VH和VL序列，表3示出人源化抗TNFR2抗体的VH和VL序列配对情况。
表1.候选抗体CDRs的KABAT分析结果(人源化抗体CDR同鼠抗体CDR)
表2.人源化抗TNFR2抗体的VH和VL序列
表3.人源化抗TNFR2抗体的VH和VL序列配对情况
| 抗体ID | VH | VL |
| 001-Hu1 | VH1(SEQ ID NO.19) | VL1(SEQ ID NO.28) |
| 001-Hu2 | VH2(SEQ ID NO.20) | VL2(SEQ ID NO.29) |
| 001-Hu3 | VH1(SEQ ID NO.19) | VL3(SEQ ID NO.30) |
| 001-Hu4 | VH2(SEQ ID NO.20) | VL4(SEQ ID NO.31) |
| 001-Hu5 | VH1(SEQ ID NO.19) | VL4(SEQ ID NO.31) |
| 219-Hu1 | VH3(SEQ ID NO.21) | VL5(SEQ ID NO.32) |
| 219-Hu2 | VH4(SEQ ID NO.22) | VL5(SEQ ID NO.32) |
| 219-Hu3 | VH5(SEQ ID NO.23) | VL5(SEQ ID NO.32) |
| 219-Hu4 | VH6(SEQ ID NO.24) | VL5(SEQ ID NO.32) |
| 219-Hu5 | VH7(SEQ ID NO.25) | VL5(SEQ ID NO.32) |
| 224-Hu1 | VH8(SEQ ID NO.26) | VL6(SEQ ID NO.33) |
| 224-Hu2 | VH9(SEQ ID NO.27) | VL7(SEQ ID NO.34) |
| 224-Hu3 | VH9(SEQ ID NO.27) | VL8(SEQ ID NO.35) |
| 224-Hu4 | VH9(SEQ ID NO.27) | VL6(SEQ ID NO.33) |
| 224-Hu5 | VH9(SEQ ID NO.27) | VL9(SEQ ID NO.36) |
| 224-Hu6 | VH8(SEQ ID NO.26) | VL7(SEQ ID NO.34) |
| 224-Hu7 | VH9(SEQ ID NO.27) | VL10(SEQ ID NO.37) |
1.2抗TNFR2人源化抗体的表达
转染前一天，将ExpiCHO-S细胞进行计数，并以2.5～4×10
6细胞/mL的密度接种于新鲜预热的ExpiCHO表达培养基(英维捷基，A291002)中过夜培养。转染当天，取过夜培养的ExpiCHO-S细胞悬液进行计数，细胞浓度大概在7～10×10
6细胞/mL，转染用的细胞活率大于95％。根据转染个数，取所需的细胞数目，用ExpiCHO表达培养基稀释至终浓度为6×10
6细胞/mL的密度，置于37℃，8％CO
2，100rpm摇床备用。转染准备：将质粒用OptiPRO
TMSFM培养基(英维捷基，12309019)中稀释，轻轻摇转离心管使其混匀。将混匀的ExpiFectamine
TMCHO试剂(英维捷基，A29129)加入到质粒稀释液中，轻轻摇转离心管使其混匀后室温静置2分钟。将上述的质粒/ExpiFectamine
TMCHO试剂复合物缓慢滴入待转染的细胞悬液中，在滴加的过程中摇转摇瓶。转染结束后，将转染的细胞放入温度37℃，8％CO
2，100rpm的摇床中培养。转染后第一天，向转染的细胞中补加0.6％ExpiFectamine
TMCHO Enhancer(英维捷基，A29129)和16％ExpiCHO
TMFeed(英维捷基，A29129)，加入过程中轻轻摇转摇瓶，并且将细胞转移至温度32℃，5％CO
2，100rpm的摇床中培养。转染后第五天，向转染的细胞中补加16％ExpiCHO
TMFeed，加入过程中轻轻摇转摇瓶。转染后第十二天，收集细胞上清，并于4000g离心10分钟吸取上清，并进一步纯化抗体。
1.3抗TNFR2人源化抗体的纯化
经高速离心收集的细胞培养液上清，用0.45+0.22μM滤膜进行过滤，利用Akta Avant 150(Cytiva)进行亲和层析进行第一步纯化。层析介质为与Fc相互作用的Protein A填料Mabselect PrismA(Cytiva，货号：17549803)，平衡缓冲液为PBS(2.5g/L Na
2HPO
4 12H
2O，0.408g/L NaH
2PO
4，8.76g/L NaCl，pH7.2)，平衡4倍柱体积后，将细胞上清上样结合，流速控制为样品在柱上保留时间≥5min。上样结束后，用PBS(pH 7.2)冲洗柱子，直至A280紫外吸收降至基线。然后用20mM PB+1M NaCl(3.752g/L Na
2HPO4·12H
2O，1.314g/L NaH
2PO
4，58.44g/L NaCl pH6.2)淋洗2倍柱体积。再用PBS(pH 7.2)冲洗柱子，直至A280紫外吸收和电导达到基线。最后用20mM柠檬酸(2.184g/L柠檬酸，1.086g/L柠檬酸钠，pH 3.4)的洗脱缓冲液冲洗层析柱，根据A280紫外吸收峰收集洗脱峰，收集的洗脱样品用1M Tris(121.14g/L Tris)中和并用pH计Seven2Go(梅特勒-托利多)检测至中性。收集的抗体经SEC-HPLC鉴定纯度大于95％并用于后续研究。
实施例2 ELISA检测TNFR2人源化抗体与人和食蟹猴TNFR2蛋白的特异性结合
酶标板中预先包被100μl/孔的0.5μg/ml人TNFR2(Human TNFR2-His,Sino 10417-H08H)或食蟹猴TNFR2(Cynomolgus TNFR2-His,Sino 90102-C08H)；将受试抗TNFR2人源化抗体(实施例1所述可变区连接IgG-Fc构成；WT嵌合抗体同样采用IgG-Fc结构)进行3.33倍梯度稀释，100μl/孔加样，室温振荡孵育1.5小时；洗板后加入鼠抗人(mouse anti-human)IgG Fc-HRP工作液(1：10000稀释)，100μl/孔加样，室温振荡孵育1.0小时；再次洗板，加入HRP的底物TMB进行显色，加入终止液终止反应后用酶标仪(MD I3)读取吸光值。以抗体浓度为横坐标，对应的OD值为纵坐标绘制抗体的结合曲线，四参数拟合(GraphPad Prism9)，计算EC50值。EC50值越小，抗体与人/食蟹猴TNFR2结合的能力越强。将人源化抗体的结合效果均归一化到与其对应的人鼠嵌合抗体WT(序列参见SEQ ID NO.38-43)，百分比值越高，说明人源化抗体结合的效果越好。抗TNFR2抗体与人TNFR2蛋白的结合结果见图1和表4，与食蟹猴TNFR2的结合结果见图2和表4。数据表明，所有受试抗体均能和人或猴TNFR2蛋白特异性结合，且人源化抗体与人鼠嵌合抗体的结合能力基本一致。
表4.抗TNFR2抗体与人或食蟹猴TNFR2蛋白特异性结合的ELISA结果
001-WT VH氨基酸序列(SEQ ID NO.38)：
001-WT VL氨基酸序列(SEQ ID NO.39)：
219-WT VH氨基酸序列(SEQ ID NO.40)：
219-WT VL氨基酸序列(SEQ ID NO.41)：
224-WT VH氨基酸序列(SEQ ID NO.42)：
224-WT VL氨基酸序列(SEQ ID NO.43)：
实施例3 BIAcore检测TNFR2人源化抗体与人和食蟹猴TNFR2蛋白的亲和力
利用Biacore检测受试抗TNFR2抗体与人和食蟹猴TNFR2蛋白之间的特异性结合。该实验采用Protein A芯片，通过手工操作(manual run)测定出芯片捕获稀释后的抗体所需要的时间，以使得能饱和结合抗原Rmax为50RU。将人(Human TNFR2-His,Sino 10417-H08H)和食蟹猴(Cynomolgus TNFR2-His,Sino 90102-C08H)TNFR2均梯度稀释至32,16,8,4,2nM。采用多循环动力学测得抗体与抗原的亲和力。在每一个循环中，注射抗体后再注入梯度浓度的TNFR2蛋白，使抗原与抗体发生结合与解离过程。每个循环后用Glycine pH1.5进行Protein A芯片的再生(去除芯片上的蛋白)。应用BIAcore T200分析软件拟合抗体抗原的亲和力KD。表5结果可知，所有受试抗TNFR2抗体与人或食蟹猴TNFR2蛋白之间存在特异性结合，且亲和力水平较高。
表5.抗TNFR2抗体与人或食蟹猴TNFR2蛋白特异性结合的BIAcore结果
实施例4 FACS检测TNFR2抗体与CHO-TNFR2细胞表面人TNFR2的结合
取转染了人TNFR2高表达质粒的CHO-K1稳定细胞(命名为CHO-TNFR2)，转染的人TNFR2全长质粒购自Sino Biological(货号:HG10417-UT，NCBI Ref Seq:NM_001066.2),在细胞密度不超过80％时进行实验。弃去细胞培养基，用PBS润洗并加入1ml胰酶消化2分钟，用含10％FBS的Ham’s F12完全培养基终止消化后制成细胞悬液。计数后，取适量细胞悬液，350×g离心，弃上清，按照1×10
7个细胞/ml的密度，加入相应体积的封闭液(10％FBS+PBS)将细胞重悬，4℃孵育30分钟。孵育结束后，350×g离心去上清，用染色缓冲液(2％FBS+PBS)将细胞重悬为2×10
6个细胞/ml的密度，铺入96孔板，每孔加入50μl的细胞悬液，待用。用PBS将抗体从最高浓度20μg/ml(两倍浓度)开始进行10倍梯度稀释，将稀释好的抗体加至已含有50μl细胞悬液的孔中，置于微孔板振荡器上500rpm震荡1分钟，使抗体与细胞充分混合，4℃孵育1h。孵育结束后用染色缓冲液清洗细胞两次，每孔100μl，350×g离心5分钟弃上清。用染色缓冲液将PE goat anti-Human IgG Fc抗体(ebioscience，货号：12-4998-82)稀释250倍，以每孔100μl的体积加至洗完的细胞孔中，混合均匀，4℃染色30分钟。染色结束后同样用染色缓冲液清洗两次，最后用200μl染色缓冲液重悬细胞，流式上机检测信号(Thermo Attune NxT)，信号越强，表示抗体与TNFR2的结合能力越强。以抗体浓度为横坐标，对应的平均荧光强度MFI倍数为纵坐标绘制抗体的结合曲线，四参数拟合(GraphPad Prism9)，计算EC50值。EC50值越小，抗体与CHO-TNFR2细胞结合的能力越强。将人源化抗体的结合效果均归一化到与其对应的人鼠嵌合WT抗体，百分比值越高，说明人源化抗体结合的效果越好。如图3和表6所示检测所有受试抗TNFR2抗体均可与CHO-TNFR2细胞表面人TNFR2结合，且人源化抗体与人鼠嵌合WT抗体的结合能力基本一致。
表6.抗TNFR2抗体与CHO-TNFR2细胞表面人TNFR2特异性结合的流式结果
实施例5 FACS检测抗体与人调节性T细胞(Treg细胞)表面TNFR2的结合实验
人Treg细胞使用分选试剂盒(Stemcell,货号货号:18063)从人PBMC中分离获得，经过Dynabeads Human Treg Expander(Gibco,货号:11129D)体外刺激扩增15天后获得并分装冻存。取体外分离扩增的Treg细胞复苏过夜，第二天300×g离心5分钟，用DPBS重悬得到细胞悬液，计数。取实验所需的细胞数加入离心管，300×g离心5min，去上清，用染色缓冲液将细胞密度调整为2×10
6/ml，铺96孔板，每孔50μl。取所有受试抗体与对照抗体anti-Hel isotype(用PBS分别稀释到200ng/ml，总量为100μl)。将各个样品加到每个孔中，每孔50μl。将加有细胞悬液与抗体的孔板置于微孔板振荡器上，以500rpm的速度振荡1min，将细胞与抗体充分混匀。混匀后，将孔板置于4℃冰箱，孵育60min。孵育结束后，每孔加入100μl染色缓冲液，350×g离心5min，弃上清；每孔再加入200μl染色缓冲液重悬细胞，350×g离心5min，弃上清。将染色缓冲液按照250:1(染色缓冲液：荧光染色抗体)的比例加入PE goat anti-Human IgG Fc，制成染液，混匀后加入细胞孔，每孔100μl；将孔板置于微孔板振荡器上以500rpm的速度振荡1min，以将细胞与染液充分混匀。混匀后置于4℃冰箱，孵育30min。将细胞清洗两遍，最后每孔加入200μl的PBS将细胞重悬，流式上机检测信号(Thermo Attune NxT)。图4显示所有抗TNFR2人源化抗体均能与人Treg细胞有效结合。
实施例6 FACS检测抗体与激活后食蟹猴PBMC细胞的结合实验
冻存的食蟹猴PMBC细胞复苏后，用完全培养基(RPMI1640-Glutamax+10％FBS+1×P/S+1×ITS+50μMPM巯基乙醇)重悬得到细胞悬液，计数。根据计数结果重悬细胞密度为5×10
6/ml，在96孔U底板中，每孔铺100μl的细胞悬液。配置两成浓度的T细胞激活试剂Immunocult T cell(Stemcell,1：50)activator+rhIL-2(R&D,200IU)，将两成浓度的激活试剂加入到细胞中，每孔100μl，混匀后放置37℃，5％CO
2培养箱中培养三天。收 集激活后的细胞进行计数，染色缓冲液(含2％FBS的DPBS溶液)将细胞密度调整为4×10
6/ml，铺96孔V底板，每孔50μl。取所有受试抗体与anti-Hel对照抗体(用染色缓冲液分别稀释到0.4μg/ml和4μg/ml)，将各个样品加到每个孔中，每孔50μl。将加有细胞悬液与抗体的孔板置于微孔板振荡器上，以500rpm的速度振荡1min，将细胞与抗体充分混匀。混匀后，将孔板置于4℃冰箱，孵育30min。孵育结束后，每孔加入100μl染色缓冲液，350×g离心5min，弃上清；每孔再加入200μl染色缓冲液重悬细胞，350×g离心5min，弃上清。加入抗体Anti-Human CD8-FTIC(BD-555366，1μl/test)和PE goat anti-Human IgG Fc(Invitrogen-124998-82,0.5μl/test)；将孔板置于微孔板振荡器上以500rpm的速度振荡1min，以将细胞与染液充分混匀。混匀后置于4℃冰箱，孵育30min。将细胞清洗两遍，最后每孔加入200μl的染色缓冲液将细胞重悬，流式上机检测信号(Thermo Attune NxT)。图5显示Anti-Hel阴性同型对照抗体不与食蟹猴CD8T细胞结合，所有受试抗TNFR2人源化抗体均能与激活后的食蟹猴PBMC中的CD8+T细胞有效结合。
实施例7 ELISA检测抗TNFR2抗体阻断TNFα与TNFR2的结合
酶标板中预先包被1μg/ml 100μl/孔的人TNFR2(Novoprotein,货号C830)，将所有受试TNFR2抗体从最高浓度30μg/ml进行2.5倍梯度稀释，稀释后的抗体分别与15ng/ml人TNFα-Biotin(Acro Biosystem,货号TNA-H82E3)等体积混合，按100μl/孔加入酶标板中，室温振荡孵育2.0小时；洗板后加入Streptavidin-HRP工作液(1:10000稀释)，100μl/孔，室温振荡孵育40分钟；再次洗板，加入HRP的底物TMB进行显色，加入终止液终止反应后用酶标仪(MD I3)读取吸光值。以抗体浓度为横坐标，对应的OD值为纵坐标绘制抗体的抑制曲线，四参数拟合(GraphPad Prism9)，计算IC50值。IC50值越小，抗体抑制人TNFα与人TNFR2结合的能力越强。将人源化抗体的阻断效果均归一化到与其对应的人鼠嵌合抗体WT，百分比值越高，说明人源化抗体抑制的效果越好。受试抗体的阻断曲线见图6，抑制活性见表7。从图6及表7可知，所有受试抗体均能显著地抑制人TNFα与人TNFR2蛋白的结合，且人源化抗体与人鼠嵌合WT抗体的抑制能力基本一致。
表7.受试抗体阻断TNFα和TNFR2的结合
实施例8抗TNFR2抗体阻断高表达人TNFR2的CHO细胞上TNFR2与TNFα的结合
采用高表达人TNFR2的CHO稳定细胞进行实验(同实施例4中CHO-TNFR2)。将CHO-TNFR2细胞消化后，DPBS洗涤2次，经Live/Dead(L/D)染色(室温20分钟)后，按1×10
5细胞/50μl/孔进行铺板；受试抗TNFR2抗体用染色缓冲液稀释至6μg/ml作为起始浓度，3.33倍梯度稀释，共7个浓度点；稀释后的抗体按50μl/孔加入铺好的细胞中，轻柔吹打混匀，4℃孵育30分钟。之后加入100μl/孔稀释至100ng/ml的人TNFα-biotin轻柔吹打混匀，混匀后4℃孵育30分钟。染色缓冲液洗涤2次后，加入100μl/孔的0.12μg/ml PE-streptavidin(BioLegend，货号405204)4℃孵育30分钟。染色缓冲液洗涤2次后，150μl重悬，上流式机器检测(Thermo Attune NxT)。以抗体浓度为横坐标，对应的MFI值为纵坐标绘制抗体的抑制曲线，四参数拟合(GraphPad Prism9)，计算IC50值。IC50值越小，抗体抑制人TNFα与人TNFR2结合的能力越强。将人源化抗体的阻断效果均归一化到与其对应的人鼠嵌合WT抗体，百分比值越高，说明人源化抗体抑制的效果越好。受试抗体的阻断曲线见图7，抑制活性见表8。从图7及表8可知，所有受试抗体均能显著地抑制TNFα与CHO-TNFR2细胞上TNFR2的结合。
表8.TNFR2抗体阻断TNFα和CHO细胞表面TNFR2的结合
实施例9 FACS检测抗体抑制TNFα引起的人Treg细胞IκBα降解实验
人Treg细胞使用分选kit(Stemcell,货号货号:18063)从人PBMC中分离获得，经过Dynabeads Human Treg Expander(Gibco,货号:11129D)体外刺激扩增15天后获得并分装冻存。取体外分离扩增的Treg细胞复苏过夜，第二天300×g离心5分钟，用AIM-V培养基(品牌Gibco，货号31035025)，计数，根据细胞计数结果调整细胞密度至6×10
6个细胞/ml，铺96孔板，每孔25μl。取所有受试抗体与anti-Hel对照抗体(用AIM-V培养基分别稀释到四成浓度，1μg/ml，10μg/ml和100μg/ml)。将每个浓度的抗体加到对应的细胞孔中，每孔25μl。多通道移液枪混合后，放于37℃，5％CO
2培养箱中预孵育30min。使用AIM-V培养基将TNFα(品牌Novoprotein，货号C008)稀释至工作浓度的两倍即20ng/ml，向需要TNFα激活孔中加入50μl的TNFα，非激活对照孔加入50μl的AIM-V培养基，使抗体最终浓度为1乘，TNFα的最终浓度为10ng/ml，移液枪吹打混匀，将培养板放入37℃培养箱中孵育10min。孵育完成后，取出培养板，加入100μl预冷的DPBS，4℃进行离心300g，5min。然后细胞用100μl 1×live/dead violet(预冷DPBS稀释500倍)，冰上反应20min。每孔加入100μl染色缓冲液，4℃进行300g离心，5min。每孔加入100μl的1×fix-perm buffer(品牌BD，货号554714)，混合均匀，4℃固定30min。固定结束后，每孔加入100μl的1×perm buffer终止固定，400g离心5min，弃上清。再向每孔加入200μl 1×perm buffer二次洗涤细胞。向实验孔加入100μl IκBα染液(用1×perm buffer稀释100倍)，对照孔加入Rat IgG2bκ同型对照抗体1μl，混合均匀，4℃孵育30min。孵育结束后每孔加入100μl的1×perm buffer终止固定，400g离心5min，弃上清。再向每孔加入200μl 1×perm buffer二次洗涤细胞。上流式机器检测(Thermo Attune NxT)。流式检测分析活细胞中IκBα
low的百分比或所有活细胞的IκBα的MFI。IκBα
low的比例越低，说明抗TNFR2抗体抑制TNFα引起的IκBα降解能力越强。图8结果显示阴性对照抗体Anti-Hel对IκBα表达没有影响，而受试抗TNFR2人源化抗体均能抑制TNFα引起的IκBα降解。
实施例10 TNFR2抗体抑制TNFα和IL-2诱导的Treg细胞增殖
通过测定TNFR2抗体存在下TNFα和IL-2诱导Treg细胞的增殖情况，判断该抗体对TNFα和IL-2诱导Treg细胞增殖的抑制作用(Zaragoza B et al.,Nat Med.2016Jan；22(1):16-7)。取体外扩增分离后冻存的Treg细胞复苏过夜，第二天400×g离心5分钟，用培养基重悬得到细胞悬液，计数。将Treg用CellTrace Violet cell proliferation kit(Thermo货号C34557)进行染色，每1×10
7细胞使用1μl储存液配置成1ml染色液。37℃染色20min，用至少5倍体积的完全培养基中和反应，静置5min,离心400×g 5min。用培养基重悬清洗一次细胞，再次离心取上清。按照96孔板每孔1×10
5细胞密度进行铺板，每1×10
5细胞用50μl培养基的密度重悬细胞，转移至96孔板中。每孔加入50μl待测抗体，抗体的终浓度为12.5μg/ml，培养箱孵育30分钟。随后再每孔加入含IL-2(终浓度为300IU)和TNFα(终浓度50ng/ml)的培养基50μl，以及含有anti-CD3/CD28 Dynabeads(Gibco，货号：11129D，beads与Treg细胞比例为1：20)培养基50μl，补齐每孔终体积为200μl。每个条件设置两个平行孔，将上述孔板混匀后放入37℃培养箱培养三天进行FACS检测(Thermo Attune NxT)。通过Treg增殖的比例判断该抗体对TNFα和IL-2诱导的Treg增殖的抑制作用。结果如图9显示，相比对照anti-Hel抗体，所有抗TNFR2人源化抗体均可有效抑制TNFα和IL-2诱导的Treg细胞增殖，且具有显著性差异。
实施例11抗TNFR2抗体对Treg功能的抑制
通过测定含有抗TNFR2抗体的条件下Treg细胞对效应(responder)T细胞的抑制功能，判断抗体对Treg细胞抑制功能的抑制效果。取实验所需的Treg(CD4+CD25+FoxP3+T细胞)和Conventional T细胞(Tcon)效应细胞(CD4+CD25-T细胞)复苏过夜，第二天400×g离心5分钟，用完全培养基(RPMI1640-Glutamax+10％FBS+1×P/S+1×ITS+50μMPM巯基乙醇)重悬得到细胞悬液，计数。将Tcon细胞用CellTrace Violet cell proliferation kit(Thermo货号C34557)进行染色，每1×10
7细胞使用1μl储存液配置成1ml染色液。37℃染色20min，用至少5倍体积的完全培养基中和反应，静置5min,离心400×g 5min。用培养基重悬清洗一次细胞，再次离心弃上清。按照96孔板每孔1×10
5细胞密度进行铺板，每1×10
5细胞用50μl培养基的密度重悬细胞，转移至50mL离心管中。同时准备Treg细胞，Treg细胞和Tcon细胞按照1:1的比例进行共培养。根据Tcon细胞的数量，按照1/10的比例准备相应的anti-CD3/CD28 Dynabeads(Gibco，货号：11129D)。按照每孔50μl的体积加入Treg和Tcon的培养基中。每孔加入待测抗体，抗体的终浓度为12.5μg/ml。每个条件设置三个平行孔，将上述孔板混匀后放入37℃培养箱培养4天进行流式检测。Tcon增殖比例越高，说明抗体抑制Treg的能力越强。抑制结果如图10所示，三个受试抗TNFR2人源化抗体均能够显著抑制Treg对Tcon细胞的抑制作用，促进Tcon的增殖，且具有统计学差异。
实施例12 FACS检测抗TNFR2抗体介导的抗体依赖的细胞毒(ADCC)活性
提前一天将PBMC和冻存的Treg细胞培养于完全培养基(RPMI1640-Glutamax+10％FBS+1×P/S+1×ITS+50μMPM巯基乙醇),其中PBMC需要添加100IU/ml的IL-2。实验当天根据分离试剂盒(Stemcell，货号17955)要求将NK细胞从PBMC中分离出来，用完全培养基重悬(不含IL-2)，密度0.8×10
6/ml。用Cell Trace violet试剂标记靶细胞Treg细胞或CHO-TNFR2细胞，标记结束后将密度调整到0.4×10
6/ml。用完全培养基将待测抗体梯度稀释至终浓度的4倍，待用。按照实验板分布图将靶细胞种入细胞板中，每孔50μl,接着将稀释好的药物铺入对应的孔中，与靶细胞37℃共孵育30分钟。孵育结束后向需要加入效应细胞的孔中加入100μl的效应细胞悬液，不需要的孔补入100μl的培养基，37℃共孵育4h。反应结束后每孔加入1μl的PI染料，上机检测。靶细胞中PI阳性比例越高说明ADCC作用越显著。ADCC实验结果如图11所示，anti-Hel阴性对照抗体因没有作用靶点，没有出现ADCC杀伤作用；三个受试人源化抗体在靶细胞Treg或CHO-TNFR2细胞上均显示有ADCC活性作用。
实施例13 TNFR2转基因人源化小鼠(TNFR2 HuGEMM)hTNFR2和mTNFR2表达检测
采用CRISPR/Cas9技术,通过同源重组的方式，在Tnfrsf1b基因exon2位点定点敲入hTNFRSF1B-WPRE-PA表达框，获得Tnfrsf1b基因定点敲入hTNFRSF1B-WPRE-PA的杂合子BALB/c小鼠，然后通过繁育获得表达人Tnfrsf1b(TNFR2)基因的纯合子转基因小鼠(TNFR2 HuGEMM)。取6-8周龄雌性BALB/c小鼠(来自北京维通利华实验动物技术有限公司)和TNFR2 HuGEMM小鼠外周血，ACK(Gibco，货号A1049201)处理去除红细胞，进行FACS的免疫分型，检测小鼠外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞上mTNFR2和hTNFR2的表达情况，所有细胞群体的画门依据都为FMO对照(图12A)。结果显示TNFR2 HuGEMM小鼠不表达mTNFR2，CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞表面hTNFR2的表达谱/表达水平与BALB/c背景小鼠上mTNFR2的表达谱/表达水平一致，表明TNFR2 HuGEMM小鼠完成了hTNFR2对mTNFR2的替代(图12B-12C)。
实施例14抗TNFR2抗体抑制TNFα诱导的TNFR2 HuGEMM的Treg细胞增殖
通过测定TNFR2抗体存在下TNFα诱导TNFR2 HuGEMM小鼠Treg细胞的增殖情况，验证TNFR2 HuGEMM小鼠经基因改造后TNFR2信号通路及相应功能得以保留，确保改造后的转基因小鼠可以用于候选抗TNFR2抗体的体内药效评价。取5只TNFR2 HuGEMM小鼠和5只野生型Balb/c小鼠，在生物安全柜中无菌取出小鼠脾脏进行研磨，将磨好的细胞悬液全部转移至15ml离心管中，离心(320g，7分钟，4℃)。倾倒上清液。加入约2-3ml ACK红细胞裂解液(Gibco，货号A1049201)，混匀，室温放置3-5分钟，直至红细胞裂解完全，加入6-8ml RPMI1640培养基终止裂解，颠倒混匀。离心(200g，8分钟，4℃)。离心完成后，倾倒上清液用EasySep buffer重悬细胞，40μm滤膜过滤细胞，进行细胞计数。然后根据Mouse CD4+CD25+Regulatory T kit(品牌Stemcell，货号18783A)说明书进行分选Treg细胞。分好的Treg细胞用CellTrace Violet cell proliferation kit(Thermo货号C34557)进行染色，每1×10
7细胞使用1μl储存液配置成1ml染色液。37℃染色20min，用至少5倍体积的完全培养基中和反应，静置5min,离心400×g 5min。用培养基重悬清洗一次细胞，再次离心取上清。按照96孔板每孔1×10
5细胞密度进行铺板，每1×10
5细胞用50μl培养基的密度重悬细胞，转移至96孔板中。每孔加入50μl待测抗体(包括三个人源化TNFR2抗体，一个抗鼠TNFR2替代抗体Surrogate antibody clone#75-54.7(BioXcell,BE0247)以及同型对照抗体anti-Hel-mIgG1)，抗体的终浓度为10μg/ml，培养箱孵育30分钟。随后再每孔加入含小鼠IL-2(品牌义翘神州，货号51061-MNAE，终浓度为300IU)以及小鼠TNFα(品牌义翘神州，货号20180502，终浓度50ng/ml)的培养基50μl，以及不含有或者含有Dynabeads mouse T-activator CD3/CD28(Gibco，货号：11452D，beads与Treg细胞比例为1：20)培养基50μl，补齐每孔终体积为200μl。同时设置Treg细胞只加小鼠IL-2，Treg细胞只加小鼠TNFα，Treg细胞加小鼠IL-2和人TNFα的对照孔。每个条件设置两个平行孔，将上述孔板混匀后放入37℃培养箱培养三天进行FACS检测(Thermo Attune NxT)。通过Treg增殖的比例判断该抗体对TNFα诱导的Treg增殖的抑制作用。图13A显示TNFR2 HuGEMM小鼠的Treg细胞表达人TNFR2，不表达鼠TNFR2；WT Balb/c小鼠的Treg细胞只表达鼠TNFR2。图13B和13C显示,无论体系中是否有Dynabeads mouse T-activator CD3/CD28激动剂，TNFR2 HuGEMM Treg在加入了mIL-2和mTNFα或hTNFα下，增殖明显增加，说明TNFR2 HuGEMM小鼠基因改造后TNFR2介导的信号得以保留。而WT balb/c只在加入了mIL-2和mTNFα下增殖增加，而hTNFα没有影响增殖，说明hTNFα不与mTNFR2结合。TNFR2 HuGEMM Treg在mIL-2和mTNFα存在下加入抗TNFR2人源化抗体，与阴性对照anti-Hel-mIgG1相比，001-Hu3-mIgG1和219-Hu1-mIgG1可显著抑制TNFR2 HuGEMM Treg的增殖，且具有统计学差异(***p<0.001)，而抗鼠TNFR2替代抗体TR75-54.7无抑制作用；对于WT Balb/c Treg在mIL-2和mTNFα存在下加入抗TNFR2抗体，与阴性对照Hamster IgG相比，抗鼠TNFR2替代抗体TR75-54.7可显著抑制WT Balb/c Treg的增殖，且具有统计学差异(***p<0.001)， 而001-Hu3-mIgG1和219-Hu1-mIgG1均无抑制作用。
实施例15抗TNFR2抗体在TNFR2 HuGEMM小鼠肿瘤模型的药效评价
采用百奥赛图基因生物技术有限公司的基于CRISPR/Cas9开发的EGE系统，将小鼠CT26细胞系中的mTNFR2基因的部分Exon2和Exon3替换为PuroR cassette，以达到基因敲除的目的，破坏小鼠内源mTNFR2的表达，然后插入小鼠胞内区、跨膜区于人胞外区嵌合蛋白的CDS，以制备只表达hTNFR2基因的CT26细胞系(CT26-hTNFR2 KI)。利用TNFR2 HuGEMM建立敲入hTNFR2基因的CT26-hTNFR2 KI细胞系结肠癌动物模型并进行抗TNFR2抗体的药效实验。
细胞库中取出一支CT26-hTNFR2 KI细胞，用完全1640培养基(1640(Gibco，61870-036)+10％FBS(Gibco，10099-141C)+1％P/S(Gibco，15140-122)+1％NEAA(Gibco，11140-050)+1％Sodium Pyruvate(Gibco，11360-070)+16μg/ml puromycin(Gibco，A11138-03))复苏细胞，复苏后的细胞置细胞培养瓶中(在细胞瓶壁标记好细胞种类、代数、日期、培养人姓名等)置于CO
2培养箱中培养(培养箱温度37℃，CO
2浓度为5％)；待细胞铺满培养瓶底部80％-90％后传代，传代后细胞继续置于CO
2培养箱中培养，重复该过程直至细胞数目满足体内药效实验的需求，随后制备细胞悬液，使用全自动细胞计数仪(BECKMAN，Vi-Cell XR)计数，根据计数结果用PBS(HyClone，SH30256.01)溶液重悬细胞，制备成细胞悬液(密度2×10
6/ml)。在小鼠的右侧皮下接种上述细胞悬液100μl/只，当肿瘤体积达到约100mm
3左右时，挑选个体肿瘤体积适中的小鼠入组，将动物按肿瘤体积使用基于EXCEL随机数的随机分组方法，分配到8个实验组，分组见表9，并于当天开始给药(标记为Day 0)，给药体积10ml/kg，溶媒PBS，腹腔注射给药，每3天给药一次，一共给药4次。每周固定时间测量肿瘤体积和体重三次。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm
3)＝长(mm)×宽(mm)×宽(mm)/2，肿瘤抑制率计算公式为：肿瘤抑制率计算公式：TGI(％)＝[1-T/C]×100％，均采用Two-way ANOVA的统计学方式，进行实验数据的分析。在给药后的第11天，和对照组相比，测试的抗TNFR2抗体组的各个剂量组和PBS对照组相比均具有统计学差异，药效明显；且相同抗体间的不同剂量组间也有剂量依赖关系，同时，10mg/kg的阳性药anti-mPD-1(BioXcell，BE0146)的药效和测试抗TNFR2抗体219-Hu1-mIgG2a和001-Hu3-mIgG2a在3mg/kg的剂量下的药效相当，以上结果说明测试的抗TNFR2人源化抗体具有显著的体内肿瘤生长抑制药效，且有剂量依赖关系(图14中A和B，表10)。同时各组实验动物在给药期间活动和进食状态良好，体重以及体重变化率均有一定程度的上升，说明测试抗TNFR2人源化抗体的体内安全性风险较低(图15中A-D)。
表9.TNFR2 HuGEMM小鼠体内药效实验分组表
表10.TNFR2 HuGEMM小鼠体内肿瘤抑制量效关系
*:p<0.05,***:p<0.001,****:p<0.0001,Two-way ANOVA,vs.G1PBS对照组
实施例16抗TNFR2抗体在人PBMC免疫重建人源化小鼠结肠癌肿瘤模型中的药效评价
选用7-9周NOG雌性小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)皮下接种3.5×10
6HT-29细胞(设为实验第0天)，当天腹腔注射7×10
6人外周血单核细胞(PBMC,donor#193和donor#272,由中美冠科生物技术(太仓)有限公司依据SOP-CP-042从已筛选出捐献者全血中提取)，建立PBMC人源化结肠癌模型。当肿瘤体积达到～95mm
3时，挑选个体肿瘤体积适中的小鼠入组，将动物按肿瘤体积使用Study DirectorTM(版本号3.1.399.19，供应商Studylog System,Inc.,S.San Francisco,CA,USA)进行随机分组，分配到5个实验组(G1为PBS对照组、G2为对照抗体anti-Hel hIgG1组、G3为抗TNFR2抗体001-Hu3-hIgG1组、G4为抗TNFR2抗体219-Hu1-hIgG1组、G5为Keytruda组)，两个供体donor每组5-7只，用于体内药效学研究。分组(第13天)当天开始给药。给药剂量均为10mg/kg(与图中的计量单位mpk同一含义，下同)，每周腹腔注射给药两次。每周固定时间测量肿瘤体积和体重两次。肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：V＝1/2×a×b
2。其中a和b分别表示长和宽。在donor#193中，肿瘤接种后第29天，与对照抗体组相比，219-Hu1组的肿瘤增长被显著抑制，且具有统计学差异(P<0.0001)，其他组与对照抗体组相比无统计学差异。说明在donor#193中，抗TNFR2抗体219-Hu1具有显著的药效(图16中A)。在donor#272中，肿瘤接种后第29天，与对照抗体组相比，001-Hu3、219-Hu1、Keytruda组的肿瘤增长均被显著抑制，且具有统计学差异(P<0.0001)。说明在donor#272中，Keytruda和抗TNFR2抗体001-Hu3、219-Hu1均有药效(图16中B)。
实验过程中对照组和给药组小鼠均出现体重下降，且都有小鼠死亡，经兽医尸检结果推测小鼠死亡为注射PBMC后引起的宿主免疫排斥(GvHD)反应。测试药001-Hu3、219-Hu1和阳性药Keytruda在10mg/kg测试剂量下，动物没有表现明显的药物毒性，治疗可以耐受(图16中C-D)。
在最后一次给药后48h之后，分别选取G2对照抗体组、G3抗TNFR2抗体001-Hu3组、G4抗TNFR2抗体219-Hu1组的小鼠进行肿瘤浸润免疫细胞(TIL)分离(Miltenyi，货号 130-095-929)，进行FACS的免疫分型，并加入123 count eBeads(eBioscience，货号01-1234-42)进行细胞绝对计数，所有细胞群体的画门依据都为FMO对照(图17中A)。实验结果显示，与对照抗体组相比，donor#193抗TNFR2抗体治疗组CD4+T细胞比例降低，但数目无显著性差异,donor#272抗TNFR2抗体治疗组CD4+T细胞比例与数目均无显著性差异(图17中B-C,E-F)；与对照抗体组相比，donor#193抗TNFR2抗体治疗组CD8+T细胞数目比例增加，但数目无显著性差异，CD8+T细胞比例无显著性差异，但经001-Hu3抗体治疗组CD8+T细胞数目显著增加(图17中B-C,E-F)；两个donor的结果均显示抗TNFR2抗体治疗组的Treg(CD4+CD25+Foxp3+细胞)细胞比例和数目均显著低于对照抗体组，且具有显著性差异(图17中B-C,E-F)；同时抗TNFR2抗体治疗组的总CD8+T细胞数与Treg细胞数的比值(CD8+T/Treg)也明显高于对照抗体组，且具有统计学差异(图17中D，G)。以上的数据显示抗TNFR2抗体治疗后可显著提高TIL中CD8+T/Treg比例从而抑制肿瘤生长。
实施例17 219-Hu1-hIgG1单克隆抗体与抗鼠PD-L1单克隆抗体在TNFR2人源化BALBc小鼠模型中的联用药效检测
利用在表达人TNFR2的基因改造BALB/c小鼠(TNFR2 HuGEMM)皮下接种人TNFR2基因改造的CT26.1C03结肠癌细胞(hTNFR2 KI-CT26)的动物模型评价219-Hu1-hIgG1抗体和抗鼠PD-L1(anti-mPD-L1，BioXcell，BE0101)的联用药效实验。小鼠右侧皮下接种5×10
5CT26.1C03结肠癌细胞(设为实验第0天)。当肿瘤体积达到～100mm
3时，挑选个体肿瘤体积适中的小鼠入组，将动物按肿瘤体积使用基于EXCEL随机数的随机分组方法，分配到5个实验组(G1为对照组、G2为anti-mPD-L1 10mg/kg抗体组、G3为219-Hu1-hIgG1 10mg/kg抗体组、G4为219-Hu1-hIgG1 30mg/kg抗体组、G5为219-Hu1-hIgG1 10mg/kg+anti-mPD-L1 10mg/kg抗体联用组)，每组各10只动物，用于体内药效学研究，分组(第10天)当天开始给药。每周腹腔注射给药两次。每周固定时间测量肿瘤体积和体重三次。
在肿瘤接种后第18天(即给药第8天)，与对照组(G1)相比，G2 anti-mPD-L1 10mg/kg组、G3 219-Hu1-hIgG1 10mg/kg组和G4 219-Hu1-hIgG1 30mg/kg组的TGI
TV值分别为35.1％，28.2％和63.8％，这三个治疗组的肿瘤体积增长均被显著抑制(G2vs.G1，P值<0.0001；G3vs.G1，P值＝0.0002；G4vs.G1，P值<0.0001)，219-Hu1-hIgG1 10mg/kg和anti-mPD-L1 10mg/kg的TGI
TV值相当，但是219-Hu1-hIgG1 30mg/kg的TGI
TV值要显著高于219-Hu1-hIgG1 10mg/kg和anti-mPD-L1 10mg/kg组(G2vs.G4，P值＝0.0002；G3vs.G4，P值<0.0001)。以上结果说明219-Hu1-hIgG1在10～30mg/kg剂量范围内存在剂量依赖效应，肿瘤体积随剂量增加而减小，详情见表11、图18。
在肿瘤接种后第18天，与对照组(G1)相比，G5 219-Hu1-hIgG1 10mg/kg+anti-mPD-L1 10mg/kg联合给药组的肿瘤体积增长也显著被抑制(TGI
TV＝66.5，vs.G1，P值<0.0001)；且G5 219-Hu1-hIgG1 10mg/kg+anti-mPD-L1 10mg/kg联合给药组的平均瘤体积也显著地小于G3 219-Hu1-hIgG1 10mg/kg和G2 anti-mPD-L1 10mg/kg的单药组(TGI
TV G5vs.G3vs.G2＝66.5％vs.28.2％vs.35.1％；P值G5vs.G2<0.0001，P值G5vs.G3<0.0001)，说明当使用219-Hu1-hIgG1抗体与anti-mPD-L1抗体联合给药，相比两个单药组，更能抑制肿瘤的生长且有统计学差异(****，p<0.0001，单药组vs.联合给药组)。详情见表11、图18。
表11. 219-Hu1-hIgG1和/或anti-mPD-L1对CT26.1C03同种移植瘤模型的抑瘤药效评价(基 于接种后第18天肿瘤体积计算得出)
注：
a.平均值±SD。
b.相对肿瘤增长率T/C％＝T
RTV/C
RTV×100％(T
RTV：治疗组平均RTV；C
RTV：阴性对照组平均RTV)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为RTV＝V
t/V
0，其中V
0是分组给药时(即PO-D0)测量所得肿瘤体积，V
t为某一次测量时的肿瘤体积。
c.TGI
TV(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100％计算(Ti：治疗组在给药第i天的肿瘤体积均值，T0：治疗组在给药第0天的肿瘤体积均值；Vi：溶剂对照组在给药第i天的肿瘤体积均值，V0：溶剂对照组在给药第0天的肿瘤体积均值)。
d.数据采用Two-way ANOVA分析，vs.G1Veh，p<0.05为具有显著性差异，***:p<0.001,****:p<0.0001。
e.数据采用Two-way ANOVA，vs.G5联合给药组，p<0.05为具有显著性差异，****:p<0.0001。
f.数据采用Two-way ANOVA，vs.G4 219-Hu1-hIgG1 30mpk，p<0.05为具有显著性差异，***:p<0.001，****:p<0.0001。
各组实验动物在给药期间活动和进食状态良好，体重均有一定程度的上升。各组在实验周期内的观察中，均没有发现动物精神状况、活动状况以及体表观察的变差，动物均没有表现出药物毒性，安全性较好，说明219-Hu1-hIgG1抗体以及联合给药219-Hu1-hIgG1+anti-mPD-L1抗体的安全性较高，详情见图19-20、表12。
表12. 219-Hu1-hIgG1和/或anti-mPD-L1对CT26.1C03同种移植瘤模型的小鼠体重的影响
注:平均值±SD。
在肿瘤接种后的第18天，各组动物安乐死后，对肿瘤进行分离和称重，与对照组(G1)相比，G2 anti-mPD-L1 10mg/kg组的肿瘤重量显著降低(TGI
TW＝37.3％，P值0.0087)；G3 219-Hu1-hIgG1 10mg/kg组的肿瘤重量要低于对照组，但是不存在统计学差异(TGI
TW＝25.9％，P值0.0830)；G4 219-Hu1-hIgG1 30mg/kg组的肿瘤重量也显著低于对照组(TGI
TW＝47.9％，P值0.0013)；G5 219-Hu1-hIgG1 10mg/kg+anti-mPD-L1 10mg/kg联合给药组的肿瘤重量也 显著低于对照组(TGI
TW＝43.0％，P值0.0042)；219-Hu1-hIgG1在两个剂量下的瘤重有剂量依赖效应，肿瘤重量随着给药剂量的增加而降低；联合给药组肿瘤在重量上小于各单药组(G2、G3)的瘤重，但是没有统计学差异(图21，表13)。
表13. 219-Hu1-hIgG1和/或anti-mPD-L1对CT26.1C03同种移植瘤模型的实验终点的抑瘤药效评价(基于接种后第18天肿瘤重量计算得出)
注：
a.平均值±SD。
b.TGI
Tw(％)＝[1-Ti/Vi]×100％计算(Ti：治疗组在给药第i天的肿瘤重量均值，Vi：溶剂对照组在给药第i天的肿瘤重量均值)。
c.数据采用One-way ANOVA方法分析，vs.G1Veh，p<0.05为具有显著性差异，**:p<0.01
Claims (23)
- 一种特异性结合TNFR2的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；(1)所述重链可变区包含：a.选自SEQ ID NO.19～27任一所示的VH序列，b.选自与SEQ ID NO.19～27任一序列相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VH序列，或，c.选自与SEQ ID NO.19～27任一序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的VH序列；(2)所述轻链可变区包含：a.选自SEQ ID NO.28～37任一所示的VL序列，b.选自与SEQ ID NO.28～37任一序列相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VL序列，或，c.选自与SEQ ID NO.28～37任一序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的VL序列；可选地，所述氨基酸插入、缺失和/或替换发生在重链可变区或/和轻链可变区的FR区；可选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
- 根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.19～27任一序列相比完全一致的CDR，FR具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VH序列；和/或所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.28～37任一序列相比完全一致的CDR，FR具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VL序列。
- 根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区和轻链可变区选自如下组：(1)具有SEQ ID NO.19所示的VH和SEQ ID NO.28所示的VL；(2)具有SEQ ID NO.20所示的VH和SEQ ID NO.29所示的VL；(3)具有SEQ ID NO.19所示的VH和SEQ ID NO.30所示的VL；(4)具有SEQ ID NO.20所示的VH和SEQ ID NO.31所示的VL；(5)具有SEQ ID NO.19所示的VH和SEQ ID NO.31所示的VL；(6)具有SEQ ID NO.21所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；(7)具有SEQ ID NO.22所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；(8)具有SEQ ID NO.23所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；(9)具有SEQ ID NO.24所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；(10)具有SEQ ID NO.25所示的VH和SEQ ID NO.32所示的VL；(11)具有SEQ ID NO.26所示的VH和SEQ ID NO.33所示的VL；(12)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.34所示的VL；(13)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.35所示的VL；(14)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.33所示的VL；(15)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.36所示的VL；(16)具有SEQ ID NO.26所示的VH和SEQ ID NO.34所示的VL；(17)具有SEQ ID NO.27所示的VH和SEQ ID NO.37所示的VL；(18)具有与上述(1)～(17)任一序列组合相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VH和VL组合；(19)具有与上述(1)～(17)任一项序列组合相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的VH和VL组合；或，(20)具有与上述(1)～(17)任一项序列组合相比CDR完全一致，FR具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VH和VL组合；可选地，所述氨基酸插入、缺失和/或替换发生在重链可变区或/和轻链可变区的FR区；可选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
- 根据权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含：CDR1-VH选自SEQ ID NO.1、7、或13；CDR2-VH选自SEQ ID NO.2、8、或14；CDR3-VH选自SEQ ID NO.3、9、或15；CDR1-VL选自SEQ ID NO.4、10、或16；CDR2-VL选自SEQ ID NO.5、11、或17；和CDR3-VL选自SEQ ID NO.6、12、或18。
- 根据权利要求1～4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其与人TNFR2结合的解离常数(KD)不大于7nM，与食蟹猴TNFR2结合的解离常数(KD)不大于5nM。
- 根据权利要求1～5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含或不包含重链恒定区和/或轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区包含全长重链恒定区或其片段，所述片段选自CH1结构域、Fc结构域或CH3结构域；优选地，所述重链恒定区和/或轻链恒定区为人重链恒定区和/或人轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区可选自IgG重链恒定区，例如IgG1重链恒定区、IgG2重链恒定区、IgG3重链恒定区或IgG4重链恒定区；优选地，所述重链恒定区是人IgG1重链恒定区、人IgG2重链恒定区、人IgG3重链恒定区或人IgG4重链恒定区。
- 根据权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、工程化抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、全长抗体、抗体片段、Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fd、Fv、scFv、或双抗体(diabody)。
- 根据权利要求1～7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段通过或不通过接头(linker)偶联有另一分子；优选地，所述另一分子选自治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂或光敏剂。
- 根据权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段：(1)特异性结合细胞表面表达TNFR2的细胞；(2)特异性结合Treg细胞；(3)抑制TNFα与TNFR2蛋白的结合；(4)抑制TNFα与细胞表面表达的TNFR2的结合；(5)抑制TNFα介导的Treg的增殖和/或Treg功能；(6)抑制TNFα介导的IκBα降解；(7)抑制Treg对Tcon细胞增殖的抑制；(8)介导针对TNFR2表达细胞的ADCC功能；(9)提升肿瘤浸润免疫细胞TIL中CD8+T/Treg细胞比例；或/和,(10)抑制肿瘤生长。
- 一种多特异性抗原结合分子，其特征在于，所述多特异性抗原结合分子至少包含第一抗原结合模块和第二抗原结合模块，所述第一抗原结合模块包含权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述第二抗原结合模块特异性结合TNFR2以外的其他抗原或结合与第一抗原结合模块不同的TNFR2抗原表位；优选地，所述其他抗原选自CD3、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD16A、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD80、CD86、CD126、CD138、B7、PD-1、PD-L1、PD-2、CTLA4、PRVIG、TIGHT、HAS、CLDN18.2、MSLN、MUC、Ia、HLA-DR、腱生蛋白、EGFR、VEGF、P1GF、ED-B纤连蛋白、癌基因产物、IL-2、IL-6、IL-15、IL-21、TRAIL-R1或TRAIL-R2；优选地，所述多特异性抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
- 一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域；所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1～9任一项所述TNFR2人源化抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求10所述多特异性抗原结合分子。
- 一种免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞包含权利要求11所述嵌合抗原受体或包含编码权利要求11所述嵌合抗原受体的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞；所述T细胞可选自炎性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞(Treg)或辅助性T细胞；优选地，所述免疫效应细胞为同种异体免疫效应细胞或自体免疫细胞。
- 一种分离的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求10所述的多特异性抗原结合分子或权利要求11所述的嵌合抗原受体。
- 一种载体(vector)，其特征在于，所述载体包含权利要求13所述核酸片段。
- 一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求14所述载体；优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)；优选地，所述细胞缺乏岩藻糖基转移酶，更优选地，所述岩藻糖基转移酶是FUT8。
- 一种制备权利要求1～9任一项所述抗体或其抗原结合片段或权利要求10所述多特异性抗原结合分子的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求15所述的宿主细胞，以及分离所述宿主细胞表达的抗体或其抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
- 一种制备权利要求12所述免疫效应细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求11所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸片段导入所述免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达权利要求11所述CAR。
- 一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求10所述的多特异性抗原结合分子、权利要求11所述的嵌合抗原受体、权利要求12所述的免疫效应细胞、权利要求13所述的核酸片段、权利要求14所述的载体或权利要求15所述的细胞、权利要求16或17所述方法制备获得的产品；优选地，所述组合物还包含药学上可接受的载体(carrier)、稀释剂或助剂；优选地，所述组合物还包含额外的抗肿瘤剂、免疫治疗剂或免疫抑制剂；优选地，所述额外的抗肿瘤剂选自PD-1抗体、PD-L1抗体或CTLA-4抗体。
- 权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求10所述的多特异性抗原结合分子、权利要求11所述的嵌合抗原受体、权利要求12所述的免疫效应细胞、权利要求13所述的核酸片段、权利要求14所述的载体、权利要求15所述的细胞、权利要求16或17所述方法制备获得的产品、和/或权利要求18所述的药物组合物在制备治疗和/或预防免疫异常相关疾病的药物中的用途；优选地，所述免疫异常相关疾病是Treg细胞和/或MDSC功能相关疾病；优选地，所述疾病是癌症或自身免疫性疾病；优选地，所述癌症选自卵巢癌、晚期表皮T细胞淋巴瘤、III/IV期转移性结直肠癌、三阴乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、和/或对CTLA-4和PD-1疗法耐药的晚期实体瘤，如转 移性黑色素瘤；优选地，所述自身免疫性疾病可选自类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性硬化症、视神经脊髓炎谱系病、系统性红斑狼疮、重症肌无力、IgG4相关性疾病。
- 一种治疗和/或预防免疫异常相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求10所述的多特异性抗原结合分子、权利要求11所述的嵌合抗原受体、权利要求12所述的免疫效应细胞、权利要求13所述的核酸片段、权利要求14所述的载体、权利要求15所述的细胞、权利要求16或17所述方法制备获得的产品、和/或权利要求18所述的药物组合物；优选地，所述免疫异常相关疾病是Treg细胞和/或MDSC功能相关疾病；优选地，所述疾病是癌症或自身免疫性疾病；优选地，所述癌症选自卵巢癌、晚期表皮T细胞淋巴瘤、III/IV期转移性结直肠癌、三阴乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、和/或对CTLA-4和PD-1疗法耐药的晚期实体瘤，如转移性黑色素瘤；优选地，所述自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性硬化症、视神经脊髓炎谱系病、系统性红斑狼疮、重症肌无力、IgG4相关性疾病。
- 权利要求19所述用途或权利要求20所述的方法，其还包括向治疗和/或预防的对象施用额外的抗肿瘤治疗剂，例如化疗剂、靶向治疗剂和免疫治疗剂，包括PD-1/PD-L1治疗剂，如抗PD-1/PD-L1抗体、抗CTLA-4治疗剂如抗CTLA-4抗体；优选地，所述额外的抗肿瘤治疗剂选自PD-1/PD-L1治疗剂；优选地，所述PD-1/PD-L1治疗剂选自PD-1抗体或PD-L1抗体。
- 权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求10所述的多特异性抗原结合分子、权利要求11所述的嵌合抗原受体、权利要求12所述的免疫效应细胞、权利要求13所述的核酸片段、权利要求14所述的载体、权利要求15所述的细胞、权利要求16或17所述方法制备获得的产品、和/或权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，用于治疗和/或预防免疫异常相关疾病；优选地，所述免疫异常相关疾病是Treg细胞和/或MDSC功能相关疾病；优选地，所述免疫异常相关疾病是癌症或自身免疫性疾病；优选地，所述癌症选自卵巢癌、晚期表皮T细胞淋巴瘤、III/IV期转移性结直肠癌、三阴乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、和/或对CTLA-4和PD-1疗法耐药的晚期实体瘤，如转移性黑色素瘤；优选地，所述自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性硬化症、视神经脊髓炎谱系病、系统性红斑狼疮、重症肌无力、IgG4相关性疾病；优选地，其还包括向治疗和/或预防的对象施用额外的抗肿瘤治疗剂，例如化疗剂、靶向 治疗剂和免疫治疗剂，包括PD-1/PD-L1治疗剂，如抗PD-1/PD-L1抗体、抗CTLA-4治疗剂如抗CTLA-4抗体。
- 一种体外检测样品中TNFR2的方法，其包括使怀疑含有TNFR2的样品与权利要求1至9任一项所述的抗体或其抗原结合片段相接触的步骤。
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