JP7378509B2 - 抗ｔｎｆｒ２抗体およびその使用 - Google Patents

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Description

本願は、２０１９年８月２日に中国特許庁に出願された中国特許出願２０１９１０７１３７４２．１に基づく優先権を主張し、その全内容をここに援用する。
本発明は、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント、該ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、およびそれらの使用に関する。
免疫は、多くの遺伝子、たんぱく質、及び細胞の作用を受けている体の保護反応である。免疫異常は、腫瘍、免疫不全（エイズなど）、アレルギー、関節リウマチなど、多くの病気を引き起こす可能性がある。過去数年間で、腫瘍免疫療法は全く新しい治療方式として、腫瘍治療研究分野の大きなホットスポットになった。抗ＰＤ－１や抗ＣＴＬＡ－４マブなどの免疫チェックポイントタンパク質を標的とする拮抗抗体は、様々な種類のがんの治療に使用されており、悪性腫瘍患者の生存期間を大幅に延長する画期的な結果を得た。しかし、多くのがん患者は免疫チェックポイントタンパク質の拮抗性抗体の治療に反応しないか、短期治療の後に抵抗性または薬剤耐性が生じる。そのため、免疫チェックポイントタンパク質を含む拮抗性抗体を単独または他の腫瘍治療法と組み合わせて使用することにより、治療効果と安全性をさらに向上させることができる、がんを治療する新しい薬剤を開発する必要がある。
本発明者らは、ヒトＴＮＦＲ２がヒトＴｒｅｇおよび様々なヒト腫瘍細胞表面で過剰に発現し、ヒトＴＮＦＲ２が患者の腫瘍形成を促進し、腫瘍微小環境の免疫抑制および免疫回避を媒介する可能性があること提示することを見出した。
ＴＮＦＲ２を介してＴｒｅｇ細胞の機能を制御することにより、腫瘍の発生を抑制することは、非常に潜在力のある抗腫瘍策略であるかもしれない。本発明者らは以下の機能があるＴＮＦＲ２に対するアンタゴニスト抗体を製造した。１）ＴＮＦＲ２に特異的に結合し、ＴＮＦＲ２とそのリガンドであるＴＮＦαとの結合を阻害することにより、Ｔｒｅｇ細胞の増殖およびそれが介した阻害機能を阻害し、Ｔ細胞の増幅、およびＴ細胞と他の免疫細胞が介した抗腫瘍機能を促進することができる。また、２）ＴＮＦＲ２はヒトの腫瘍細胞株に高度に発現しているため、この抗体はＴＮＦＲ２の発現が高い腫瘍細胞に対する殺傷作用を直接媒介することもできる。
発明者はまた、マウスのインビボ関連実験により、ＴＮＦＲ２標的の潜在的な機能をさらに検証した。マウスの結腸直腸癌のＣＴ２６モデルの結果から示しているように、ＴＮＦＲ２拮抗抗体は、ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１マブと比較して、ＰＤ－１抗体耐性腫瘍の増殖を有意に抑制し、腫瘍サイズを縮小し、ＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇの比を効果的に向上させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫枯渇状態を部分的に逆転えきる。そのため、ＴＮＦＲ２は腫瘍免疫治療の全く新しい標的になる可能性があり、ＴＮＦＲ２拮抗性抗体が腫瘍の微小環境の変化を助けることは期待され、単独及び／又は既存の免疫チェックポイント拮抗性抗体と併用することができ、広範な応用前景がある。本発明者らは、この目的のために様々なＴＮＦＲ２抗体を作製し、それに基づいて本発明を完成した。
第１の態様において、本発明は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、免疫細胞の機能を調節することができ、腫瘍などの免疫異常に関連する疾患の治療薬として有用である抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
１つの実施形態において、前記調節は、Ｔｒｅｇ細胞および／または骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の増殖および／または活性化への抑制を含む。別の実施形態では、調節は、ＴＮＦαとＴＮＦＲ２との結合をブロックすることによって達成される。
特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下（１）及び（２）を含む。
（１）ＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ及びＣＤＲ３－ＶＨの重鎖ＣＤＲの組み合わせ、
ＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ、およびＣＤＲ３－ＶＨは、以下の配列の組み合わせから選択されるか、または配列の組み合わせと比較して１、２、３またはそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換を有する配列の組み合わせを有する。
（２）ＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ及びＣＤＲ３－ＶＬの軽鎖ＣＤＲの組み合わせ、
ＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ、およびＣＤＲ３－ＶＬは、以下のいずれかの配列の組み合わせから選択される、または前記配列の組み合わせと比較して１、２、３又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換を有する配列の組み合わせを有する。
特に、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＶＨ１＋ＶＬ１、ＶＨ２＋ＶＬ２、ＶＨ３＋ＶＬ３、ＶＨ４＋ＶＬ４、ＶＨ５＋ＶＬ５、ＶＨ６＋ＶＬ６、ＶＨ７＋ＶＬ７、ＶＨ８＋ＶＬ８、ＶＨ９＋ＶＬ９、ＶＨ１０＋ＶＬ１０、ＶＨ１１＋ＶＬ１１、ＶＨ１２＋ＶＬ１２、ＶＨ１３＋ＶＬ１３、ＶＨ１４＋ＶＬ１４、ＶＨ１５＋ＶＬ１５、ＶＨ１６＋ＶＬ１６、VH１７＋VL１７、ＶＨ１８＋ＶＬ１８、VH１９＋VH１９、ＶＨ２０＋ＶＬ２０、ＶＨ２１＋ＶＬ２１およびＶＨ２２＋VL２２、および前記重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲと比較して１、２又は３以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換を有するものからなる群から選択される重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲの組み合わせを含む。
別の具体的な実施形態において、本発明は、そのような抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
１）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示された配列、又は示された配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有し、
２）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号３及び配列番号４に示された配列、又は示された配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有し、
３）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号５及び配列番号６に示された配列、又は示された配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有し、
４）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号７及び配列番号８に示された配列、又は示された配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有し、
５）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号９及び配列番号１０に示された配列、又は示された配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有し、
６）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示された配列、又は示された配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有し
７）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示された配列、又は示された配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有し、
８）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６に示された配列、又は示された配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有し、
９）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号１７及び配列番号１８に示された配列、又は示された配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有し、
１０）重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号１９および配列番号２０に示された配列、または示された配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有する配列を有し、または
１１）重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２１および配列番号２２に示された配列、または示された配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有する配列を有する。
好ましい実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＮＦＲ２に結合する解離定数（ＫＤ）が５ｎＭ以下であり、カニクイザルＴＮＦＲ２に結合する解離定数（ＫＤ）が５ｎＭ以下である。
好ましい実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、キメラ抗体またはヒト化された抗体、または完全ヒト化された抗体である。
好ましい実施形態おいて、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤからなる群から選択される定常領域を含み、抗体または抗原結合フラグメントは、
１）細胞表面にＴＮＦＲ２を発現している細胞へ、特異的に結合する、
２）Ｔｒｅｇ細胞に特異的に結合する、
３）ＴＮＦαとＴＮＦＲ２タンパク質の結合を抑制する、
４）ＴＮＦαと細胞表面に発現されるＴＮＦＲ２との結合を抑制する、
５）ＴＮＦαを介したＴｒｅｇの増殖および／またはＴｒｅｇ機能を抑制する、
６）ＴＮＦＲ２発現細胞に対するＡＤＣＣ機能を媒介する、又は／及び
７）腫瘍の増殖を抑制する。
別の好ましい実施形態において、本発明の抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異抗体、ナノ抗体、および抗体最小認識単位からなる群から選択される。
別の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、番号００１、０８８、１２５、１３３、２１９、２２４、２２６、３０９、３５２、３６５および３９５からなる群から選択される抗体とＴＮＦＲ２に競合的に結合することができる。
第２の態様において、本発明は、上記第１の態様に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、またはそれらの任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチドを提供する。
第３の態様において、本発明は、上記第２の態様に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
第４の態様において、本発明は、上記第３の態様に記載の発現ベクターを含む細胞を提供する。細胞は、例えば、原核細胞または真核細胞であり、チャイニーズハムスター卵巣細胞、酵母細胞、昆虫細胞、大腸菌および枯草菌を含む。
第５の態様において、本発明は、上記第１の態様に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、第２の態様に記載のポリヌクレオチド、第３の態様に記載の発現ベクター、または第４の態様に記載の細胞、および薬学的に受容可能なベクターを含む医薬組成物を提供する。
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物はさらに追加の抗腫瘍剤を含む。例えば、前記追加の抗腫瘍剤は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療剤（抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む）、および抗ＣＴＬＡ－４治療剤（抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む）といった化学療法剤、標的治療剤、および免疫治療剤から選択される。
第６の態様において、本発明は、上記第１の態様に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、第２の態様に記載のポリヌクレオチド、第４の態様に記載の発現ベクター、または第４の態様に記載の細胞、および使用説明書を含むキットを提供する。
第７の様態において、本発明は、上記の第１の態様に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、第２の態様に記載のポリヌクレオチド、第３の態様に記載の発現ベクター、第４の態様に記載の細胞、または第５の態様に記載の医薬組成物を、必要性を有する対象に投与することを含む免疫異常関連疾患の治療および／または予防方法を提供する。前記免疫異常関連疾患は、例えばｓＴＮＦＲ２異常を特徴とし、Ｔｒｅｇ細胞および／またはＭＤＳＣ機能に関連する疾患、具体的には腫瘍などである免疫異常疾患である。
一実施形態では、本発明の方法は、化学治療、放射線療法、標的治療化療、および免疫療法、例えば抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療、例えば抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体などの抗ＣＴＬＡ－４治療剤を含む治療剤で行われる追加の抗腫瘍治療を対象に投与することをさらに含む。
１つの実施形態において、関連する疾患は腫瘍であり、好ましくは：
１）卵巣がん、進行性表皮Ｔ細胞リンパ腫、第ＩＩＩ／ＩＶ期転移性結腸直腸がん、トリプルネガティブ乳がんおよび／または膵臓がん、または、
２）ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１療法に耐性の転移性黒色腫または他の可能性のある進行固形腫。
第８の態様において、本発明は、第７の態様に記載の予防および／または治療方法において使用される、上記第７の態様に記載の方法に対応する医薬品を提供する。さらに、上記第１～第５の態様の製品を用いて製造された、上記第７の態様の予防および／または治療方法に使用される、上記第７の態様の方法に対応する医薬またはキットの調製のための使用を提供する。
第９の態様において、本発明は、ｓＴＮＦＲ２を含有可能な試料を、第１の態様に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることを含む、ｓＴＮＦＲ２の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、ｓＴＮＦＲ２異常を特徴する免疫異常疾患の診断に有用であり、例えば、サンプル由来の被験者が免疫異常関連疾患（例えば、Ｔｒｅｇ細胞および／またはＭＤＳＣ機能関連疾患）に罹患しているか、または発症の危険性があるかの診断に有用である。従って、本発明は、ｓＴＮＦＲ２を検出するための試薬を用いて、サンプル由来の被検体が免疫異常関連疾患（例えば、ＴＮＦＲ２発現異常に関連する免疫異常疾患）に罹患しているか否か、または発症の危険性を診断するための診断キットを製造するための使用を提供する。
以下では、本発明の詳細な説明および添付の図面を介して、本発明の前に述べた態様および他の態様を明確に説明する。本願の添付図面は、本発明のいくつかの好ましい実施形態を例示するためのものであるが、本発明は開示された特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。
図１は１３株のヒト腫瘍細胞株のＴＮＦＲ２発現状況を示し、陽性割合は同亜型蛍光対照の陰性抗体のフローサイトフルオレオソート（ＦＡＣＳ）染色後の検出値から決定し、図中に示したパーセンテージはＴＮＦＲ２の発現パーセンテージである。 図２は、ヒト末梢単核血細胞（ＰＢＭＣ）のＴｒｅｇ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎ細胞におけるＴＮＦＲ２の発現を示したものである。図２ＡはＴｒｅｇ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｃｏｎ細胞のフロー細胞染色とループゲート策略及び細胞上のＴＮＦＲ２の発現割合のフロー散布図である。図２Ｂは活性化Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉ Ｔｒｅｇ），非活性化Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ），Ｔｃｏｎ（ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞）およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＮＦＲ２発現の割合および平均蛍光強度（ＭＦＩ）値である。 図３は、被測抗体とヒトＴＮＦＲ２を高発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＴＮＦＲ２）との結合能を示したものである。図３Ａ ＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞表面におけるヒトＴＮＦＲ２の発現検証である。図３Ｂは１１例の被験者の細胞表面標的結合能力の検証である。その中のａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｆｃ－ＰＥ ｏｎｌｙ、および抗卵白リゾチーム（ａｎｔｉ－Ｈｅｌ）ホモタイプ対照抗体（卵白リゾチームは細胞内抗原であり、ヒト体内に存在しないため、良好な無関係対照抗体であり、百英生物（Ｂｉｏｔｒｏｎ）からアウトソーシング生産された）はいずれもこの実験の陰性対照であり、Ｕｎｓｔａｉｎｅｄはいかなる抗体も加えていない空白細胞対照である。 図４に被測抗体とＴｒｅｇ細胞の結合能を示す。図４Ａに示す実験に用いたＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の純度は９１．４％，ＴＮＦＲ２の発現割合は９９．５％であった（中空ピークはＴＮＦＲ２抗体のａｎｔｉ－Ｈｅｌホモタイプ対照抗体、ソリッドピークはａｎｔｉ－ＴＮＦＲ２ ＰＥ抗体）。図４Ｂは１１個の抗体それぞれのＴｒｅｇ細胞への結合能（ソリッドピーク）を示しており、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｆｃ－ＰＥ ｏｎｌｙとＵｎｓｔａｉｎｅｄ（抗体を加えていないブランク細胞対照）はいずれも陰性対照であり、抗体濃度は２００ｎｇ／ｍｌであった。 図５は、被測抗体がヒトＴＮＦαとＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞上のヒトＴＮＦＲ２との相互作用を抑制することを示している。００２＃Ａｂはツール抗体（ｔｏｏｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であり、この実験では陽性対照抗体である。ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌは陰性同型対照抗体である。細胞コントロールはＣＨＯ－Ｋ１（ヒトＴＮＦＲ２を発現しないＣＨＯ－ＴＮＦＲ２を構築するための芽細胞）である。 図５は、被測抗体がヒトＴＮＦαとＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞上のヒトＴＮＦＲ２との相互作用を抑制することを示している。００２＃Ａｂはツール抗体（ｔｏｏｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であり、この実験では陽性対照抗体である。ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌは陰性同型対照抗体である。細胞コントロールはＣＨＯ－Ｋ１（ヒトＴＮＦＲ２を発現しないＣＨＯ－ＴＮＦＲ２を構築するための芽細胞）である。 図６は、ＴｒｅｇのＴｃｏｎ細胞増殖抑制活性に対する被測抗体の抑制作用を示したものである。縦軸は異なる抗体、横軸は（抗体ごとのエフェクター細胞の増殖割合－コントロール抗体ごとのエフェクター細胞の増殖割合）／コントロール抗体ごとのエフェクター細胞の増殖割合＊１００％、コントロール抗体はａｎｔｉ－Ｈｅｌ、各抗体の実験濃度は１２．５ｕｇ／ｍｌ、エフェクター細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎ細胞を使用した。 図７は、Ｔｒｅｇ機能抑制活性実験の細胞上清ｓＴＮＦＲ２発現に対する被測抗体の影響を示したものである。縦軸は異なる抗体、横軸は（各抗体に対応する細胞上清中ｓＴＮＦＲ２の発現量－コントロール抗体の細胞上清中ｓＴＮＦＲ２の発現量）／コントロール抗体の細胞上清中ｓＴＮＦＲ２の発現量＊１００％、コントロール抗体はａｎｔｉ－Ｈｅｌ、各抗体の実験濃度は１２．５ｕｇ／ｍｌである。 図８は試験抗体によるＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ細胞増殖の抑制を示す。図８ＡはＴｒｅｇ細胞のサイトカイン無添加、ＩＬ－２単独添加、またはＩＬ－２とＴＮＦαを添加して培養３日後の増殖を示したものである。図８Ｂは異なる抗体によるＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ増殖に対する抑制作用である。縦軸は異なる抗体，横軸は（抗体ごとのＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ増殖抑制能－対照抗体のＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ増殖抑制能）／対照抗体のＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ増殖抑制能＊１００％、対照抗体はａｎｔｉ－Ｈｅｌ、抗体ごとの実験濃度は１２．５ｕｇ／ｍｌであった。 図９は、ＥＬＩＳＡ検出対象抗体によるＩＬ－２およびＴＮＦ－α抗ＣＤ４＋Ｔ細胞分泌ｓＴＮＦＲ２の抑制作用を示す。統計的分析方法：Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ６、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図１０はＴｒｅｇに対する被測抗体のＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）殺傷作用を示す。図１０Ａは標的細胞すなわちＴｒｅｇ上のＴＮＦＲ２の発現状況である。図１０Ｂはヒト末梢血細胞ＰＢＭＣから分離して濃縮したエフェクター細胞ＮＫ細胞の純度の検証である。図１０Ｃは被測抗体ＡＤＣＣ作用の強弱であり、＃５２サンプルはＴＮＦＲ２標的に対してスクリーニングされたＡＤＣＣ陽性対照抗体であり、ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌｔはホモ抗体陰性対照である。 図１０はＴｒｅｇに対する被測抗体のＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）殺傷作用を示す。図１０Ａは標的細胞すなわちＴｒｅｇ上のＴＮＦＲ２の発現状況である。図１０Ｂはヒト末梢血細胞ＰＢＭＣから分離して濃縮したエフェクター細胞ＮＫ細胞の純度の検証である。図１０Ｃは被測抗体ＡＤＣＣ作用の強弱であり、＃５２サンプルはＴＮＦＲ２標的に対してスクリーニングされたＡＤＣＣ陽性対照抗体であり、ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ 図１１は、ヒトＴＮＦＲ２を高発現するＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞に対する被測抗体のＡＤＣＣ殺傷作用を示す。ここで、＃２１９、＃２２４、＃００１は被測抗体であり、ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌは陰性対照抗体である。 図１２は、ＰＤ－１抗体耐性ＣＴ２６腫瘍細胞のインビボ薬効試験における各投与群の腫瘍体積ｍｍ３の変化曲線（１２Ａ）と腫瘍成長抑制率（ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ％，ＴＧＩ％）の変化曲線（１２Ｂ）およびマウス体重の変化曲線（１２Ｃ）を示す。 図１３は、マウス体内ＣＴ ２６腫瘍細胞体内薬効実験のマウス体内腫瘍組織内浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＴＩＬ）中の各免疫細胞亜群の分析を示す。１３Ａと１３ＢはＦＡＣＳ免疫タイピング中のｐａｎｅｌ １とｐａｎｅｌ ２のラップゲートストラテジーである。１３ＣはＦＡＣＳ免疫タイピングによるＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ及びＴｒｅｇ細胞の割合に対する研究を示す。図１３ＤはＦＡＣＳ免疫タイピングがその中の総（ｔｏｔａｌ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数とＴｒｅｇ細胞数の比に対する研究を示す。図１３ＥはＦＡＣＳ免疫タイピングによる記憶（ｍｅｍｏｒｙ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数とＴｒｅｇ細胞数の比の研究を示す。図１３ＦはＦＡＣＳ免疫タイピングがその中のＣＤ８＋Ｔ発現のＰＤ－１、ＬＡＧ－３とＴＮＦＲ２の高低に対する研究を示した。 図１３は、マウス体内ＣＴ ２６腫瘍細胞体内薬効実験のマウス体内腫瘍組織内浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＴＩＬ）中の各免疫細胞亜群の分析を示す。１３Ａと１３ＢはＦＡＣＳ免疫タイピング中のｐａｎｅｌ １とｐａｎｅｌ ２のラップゲートストラテジーである。１３ＣはＦＡＣＳ免疫タイピングによるＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ及びＴｒｅｇ細胞の割合に対する研究を示す。図１３ＤはＦＡＣＳ免疫タイピングがその中の総（ｔｏｔａｌ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数とＴｒｅｇ細胞数の比に対する研究を示す。図１３ＥはＦＡＣＳ免疫タイピングによる記憶（ｍｅｍｏｒｙ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数とＴｒｅｇ細胞数の比の研究を示す。図１３ＦはＦＡＣＳ免疫タイピングがその中のＣＤ８＋Ｔ発現のＰＤ－１、ＬＡＧ－３とＴＮＦＲ２の高低に対する研究を示した。 図１４は、ＣＴ２６腫瘍細胞マウスのインビボ薬効実験における抗ＴＮＦＲ２抗体または抗ＰＤ－１抗体単独または２抗体併用による４つの実験群の腫瘍体積ｍｍ３の変化曲線（１４Ａ）と腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ％）の変化（１４Ｂ）、およびマウスの生存曲線（１４Ｃ）を比較したものである。
具体的な実施形態
特に明記されていない限り、本願で使用される用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。本願において明示的に定義されている用語については、用語の意味は、記載されている定義に基づいている。
本願に記載されている通り、「抗体」（Ａｂ）という用語は、標的抗原に特異的に結合するか、または免疫反応性を有する免疫グロブリン分子を意味し、抗体のポリクローナル、モノクローナル、遺伝子操作および他の修飾形態（キメラ抗体、ヒト化抗体、全ヒト抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性、三特異性および四特異性抗体、二重抗体、三抗体および四抗体）、抗体結合体を含むがこれらに限定されない）、ならびに抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧおよびｓｃＦｖ断片を含む）を含む。さらに、特に明記されていない限り、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、標的タンパク質に特異的に結合することができる完全な抗体分子と、不完全な抗体フラグメントとを含むことを意味し、不完全な抗体フラグメントは例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのように、完全な抗体のＦｃフラグメントを欠如している（動物循環からより迅速に除去される）ため、Ｆｃ媒介エフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を欠如している（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１ ６，１９８ ３参照。その内容は本願に引用される）。
本願で使用されるように、「抗原結合フラグメント」という用語は、標的抗原に特異的に結合する能力を保持する１つまたは複数のフラグメント抗体フラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって実行することができる。 フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ、二重抗体、三抗体、アフィニティー（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ナノ抗体、アプタマー、またはドメイン抗体である。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語をカバーする結合フラグメントの例には以下のいずれかが含まれるが、それらに制限されていない。
（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなる１価のフラグメント、
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ）２フラグメントであって、ヒンジ領域においてジスルフィド結合により結合された二個のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント、
（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨドメインからなるＦａｂフラグメント、
（ｉｖ）抗体の片方のアームのVLドメインとVHドメインで構成されるFvフラグメント、
（Ｖ）ＶＨ及びＶＬドメインを含むｄＡｂ、
（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ等、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６、１９８９）、
（ｖｉｉ）ＶＨ又はＶＬドメインからなるｄＡｂ、
（ｖｉｉｉ）分離相補決定領域（ＣＤＲ）、
（ｉｘ）任意に合成リンカーで結合することができる２つ以上の分離されたＣＤＲの組み合わせ。
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは、独立した遺伝子によってコードされているが、この２つのドメインは、組換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が１価の分子の単一タンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる。例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６，１９８８およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３，１９８８を参照）を形成するようにアダプターを介して結合することができる。これらのフラグメント抗体フラグメントは、当業者に知られている従来技術を用いて入手することができ、完全抗体と同様に使用するためにスクリーニングされる。抗原結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術、完全免疫グロブリンの酵素的または化学的切断、またはいくつかの実施形態において当技術分野で知られている化学的ペプチド合成手順によって生成されてもよい。
本願で使用するように、「ＴＮＦＲ２」という用語は腫瘍壊死因子受容体２を指し、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）またはＣＤ１２０ｂとも呼ばれ、これは腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）に結合する膜受容体である。ＴＮＦＲ２は、ヒトＴＮＦＲ２であることが好ましい。
本願で使用したように、用語「抗－腫瘍壊死因子受容体２抗体」、「腫瘍壊死因子受容体２抗体」、「抗ＴＮＦＲ２抗体」、「ＴＮＦＲ２抗体」、「抗ＴＮＦＲ２抗体」および／または「抗ＴＮＦＲ２抗体部分」ＴＮＦＲ２フラグメント抗体フラグメント」等とは、ＴＮＦＲ２に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子の少なくとも一部（例えば、重鎖または軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク領域またはその任意の部分）を含むタンパク質またはペプチドを含む分子を指す。ＴＮＦＲ２抗体はまた、抗体ＣＤＲと構造および溶媒アクセス性が類似したＢＣ、ＤＥおよびＦＧ構造ループを含む抗体様タンパク質足場（例えば、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３））を含み、１０Ｆｎ３ドメインの三次構造はＩｇＧ重鎖可変領域の三次構造に類似しており、１０Ｆｎ３のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの残基がＴＮＦＲ２モノクローナル抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２またはＣＤＲ－Ｈ３領域からの残基で置換されており、当業者は、例えばＴＮＦＲ２モノクローナル抗体のＣＤＲをフィブロネクチン足場にグラフトすることができる。
本願で使用されるように、「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる抗原に対してモノクローナル結合特異性を有する抗体を意味し、通常はヒトまたはヒト化された抗体である。本発明では、結合特異性の１つは、ＴＮＦＲ２の抗原エピトープに対して検出することができ、もう１つは、ＴＮＦＲ２の別の抗原エピトープまたは任意の他の抗原、例えば、細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異性抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスがコードするエンベロープタンパク質、細菌由来タンパク質または細菌表面タンパク質などに対して検出することができる。
本願で使用されるように、「キメラ」抗体という用語は、ある由来生物（例えば、ラットまたはマウス）由来の免疫グロブリンの可変配列と、異なる生物（例えば、ヒト）由来の免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体を意味する。本発明のキメラ抗体の製造方法は、本発明の技術分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１９）：１２０２－７；Ｏｉら，１９８６，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１ ４－２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓら，１９８５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２、以上の内容を引用して本願に組み込む。
本願で使用されるように、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、軽鎖および重鎖の可変領域の両方に見なされる高可変領域を指す。可変ドメインのうちより保守性の高い部分をフレーム領域（ＦＲ）と呼ぶ。当技術分野で理解されているように、抗体の高変異領域を表すアミノ酸の位置は、文脈および当技術分野で知られている様々な定義に従って変化することができる。可変領域内のいくつかの位置は、ＩＭＧＴまたはＫＡＢＡＴのような標準下の可変領域内にあると見なされ、ＫＡＢＡＴまたはＩＭＧＴのような異なる標準下の可変領域外にあると見なされるため、ヘテロ接合高可変位置と見なされる。これらの位置のうちの１つまたは複数は、拡張可変領域内にも見出されることができる。本発明は、これらのヘテロ接合の可変位置に修飾抗体を含むことを含む。天然重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、主にシート構造を採用する４つのフレーム領域を含み、これらは３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）によって連結され、これら３つのＣＤＲはシート構造を連結するループを形成し、ある場合にはシート構造の一部を形成する。各鎖中のＣＤＲはＦＲ領域を介してＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順で緊密に保持され、他の抗体鎖からのＣＤＲと抗体の抗原結合部位の形成を促進する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．１９８７参照。その内容を引用して本願に組み込む）。例えば、本願では、ＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ、およびＣＤＲ３－ＶＨは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）の第１のＣＤＲ、第２のＣＤＲ、および第３のＣＤＲを指し、これら３つのＣＤＲは、重鎖（またはその可変領域）のＣＤＲ組み合わせ（ＶＨＣＤＲ組み合わせ）を構成する。ＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬおよびＣＤＲ３－ＶＬは、それぞれ軽鎖可変領域（ＶＬ）の第１のＣＤＲ、第２のＣＤＲおよび第３のＣＤＲを指し、これら３つのＣＤＲは軽鎖（またはその可変領域）のＣＤＲ組み合わせ（ＶＬＣＤＲ組み合わせ）を構成する。
本願で使用される「抗体結合体」とは、抗体分子が直接又はリンカーを介して他の分子と化学的に結合して形成されるコンジュゲート／複合体をいう。例えば、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）を例にとると、薬物分子は上記の他の分子である。
本願で使用されるように、「モノクローナル抗体」という用語は、単一のクローン（真核、原核、またはファージクローンを含む）に由来する抗体を意味し、抗体の産生方法に限定されるものではない。
本願で使用されるように、「ＶＨ」という用語は、抗体の免疫グロブリン重鎖（Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂの重鎖を含む）の可変領域を意味する。用語「ＶＬ」は、免疫グロブリン軽鎖（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの軽鎖を含む）の可変領域を意味する。
本願で使用するように、用語「制御性T細胞」或いは「Ｔｒｅｇ」はかつて抑制Ｔ細胞（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ）と呼ばれ、生体免疫反応を負に調節するリンパ細胞であり、自己抗原に対する耐性を維持し、免疫反応の過度を制御し、正常細胞に対する免疫損傷を避け、自己免疫病の発生を防止する。Ｔｒｅｇは以下のバイオマーカー：ＣＤ４、ＦＯＸＰ３とＣＤ２５を発現し、幼若型ＣＤ４７細胞と同一系統由来と考えられている。Ｔｒｅｇは腫瘍の発生において非常に重要な役割を果たし、多くの研究により、メラニン癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌などを含む腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞の数が顕著に増加することが示されており、同時にＴｒｅｇ細胞の数と腫瘍患者の生存率も密接に関連している。また、腫瘍細胞は腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導し、増殖したＴｒｅｇ細胞はＴＧＦ－βなどの免疫抑制因子を大量に分泌し、ＣＤ８＋Ｔ細胞などの免疫細胞の機能を抑制し、免疫細胞の腫瘍に対する殺傷作用を抑制し、多種の固形腫瘍と血液腫瘍の免疫治療失敗の重要な薬剤耐性機序である。最近の研究により、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１などの免疫治療患者の免疫寛容もＴｒｅｇと密接に関連していることが明らかになった。
本願で使用するように、用語「髄源性抑制細胞」或いは「ＭＤＳＣ」は免疫応答と腫瘍免疫反応を抑制する作用がある、未熟な好中球、単球と樹状細胞からなる免疫系の異質性細胞群である。ＭＤＳＣは多種のエフェクター細胞と抗原提示細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞とマクロファージなど）の活性を調節する。骨髄由来サプレッサー細胞は遺伝子発現プロファイルにより区別され、B7-1(CD80)、B7-H1(PD-Ll)、CCR2、CD1d、CD1dl、CD2、CD31(PECAM-I)、CD43、CD44、補体成分C5aRl、F4/80(EMRl)、FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)、FcγRIIA(CD32a)、FcγRIIB(CD32b)、FcγRIIB/C(CD32b/c)、FcγRIIC(CD32c)、FcγRIIIA(CD16A)、FcγRIIIB(CD16b)、ガレクチン-3、GP130、Gr-1(Ly-6G)、ICAM-1(CD54)、IL-1RI、IL-4Ra、IL-6Ra、インテグリンa4(CD49d)、インテグリンaL(CDlla)、インテグリンaM(CDllb)、M-CSFR、MGL1(CD301a)、MGL1/2(CD301a/b)、MGL2(CD301b)、一酸化窒素、PSGL-1(CD162)、L-セレクチン（CD62L)、シアル酸結合Ig様レクチン-3(CD33)(Sialic acid-binding Ig-like lectin-3(CD33))、トランスフェリン受容体(TfR)、VEGFRl(Flt-I)及びVEGFR2(KDRまたはFlk-1)からなる群より選択されるタンパク質および小分子の全部または一部を発現する。特に、ＭＤＳＣは、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ２１、ＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）、ＨＬＡ－ＤＲおよびＳｃａ－Ｉ（Ｌｙ６）からなる群から選択されるタンパク質を発現しない。
本願で使用したように、「パーセンテージ（％）配列一致性」という用語は、配列一致性の最大パーセンテージを達成するために、必要に応じてシーケンスを比較し、空孔を導入する際に（例えば、最適な比較のために、候補配列および参照配列の一方または両方に空孔を導入することができ、比較のために非相同性配列は無視することができる）の後に、候補配列のアミノ酸（またはヌクレオチド）残基では、参照配列のアミノ酸（またはヌクレオチド）残基と同じ残基の割合である。パーセンテージ配列一致性を決定するために、当業者が熟知している複数の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＩｉ）ソフトウェアのような公衆に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用することで前記比較を実現することができる。当業者は、比較測定のに対して適切なパラメータを決定することができ、適切なパラメータとしては、例えば、比較対象配列の全長範囲にわたって最大の比較を達成するための任意のアルゴリズムが含まれる。一方、候補配列と比較するための比較配列は、候補配列の全長または候補配列の連続するアミノ酸（またはヌクレオチド）残基の選択された部分において、候補配列が５０％から１００％の配列同一性を示すことを示してもよい。比較のために比較される候補配列の長さは、例えば、参照配列の長さの少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）であってもよい。候補配列中の位置が参照配列中の対応する位置と同じアミノ酸（またはヌクレオチド）残基によって占められている場合、これらの分子はその位置で同じである。
本願で使用されるように、「特異的結合」という用語は、例えば抗体またはその抗原結合フラグメントによって特異的に認識されるタンパク質および他の生体分子の異質な集団における抗原の存在状態を決定する結合反応を意味する。抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、１００ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する。例えば、抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、１００ｎＭ（例えば、１ｐＭから１００ｎＭの間）までのＫＤで抗原に結合する。特定の抗原またはそのエピトープに特異的に結合することを示さない抗体またはその抗原結合フラグメントは、特定の抗原またはそのエピトープに対して１００ｎＭより大きい（例えば、５００ｎＭ、１μＭ、１００μＣＳＳ、５００μＣＳＳまたは１ｍＭより大きい）ＫＤを示す。いつくかの免疫測定方法を使用することで、特定のタンパク質または炭水化物と特異的な免疫反応を行う抗体を選択することができる。例えば、一般的に、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ法を用いて、タンパク質や炭水化物に対して特異的な免疫反応を行う抗体を選択する。特定の免疫反応性を決定することができる免疫測定方法および条件を記載している、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）およびＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照できる。
本願で使用されるように、「ベクター」という用語は、ＤＮＡベクター（プラスミドなど）、ＲＮＡベクター、ウイルスまたは他の適切なレプリコン（ウイルスベクターなど）などの核酸ベクターを含む。外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞に送達するための複数のベクターが開発されてきた。本発明の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列と、例えばタンパク質の発現および／またはこれらのポリヌクレオチド配列を哺乳動物細胞ゲノムに組み込むための追加の配列要素とを含む。本発明の抗体およびフラグメント抗体フラグメントの発現に使用できる特定のベクターは、遺伝子転写を指示する調節配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサー領域）を含むプラスミドを含む。抗体およびフラグメント抗体フラグメントを発現するための他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を増強するか、または遺伝子の転写によって産生されるｍＲＮＡの安定性または核出力を改善するポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列要素は、例えば、発現ベクター上に担持された遺伝子の効率的な転写を指示するために、５’および３’の非翻訳領域、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、およびポリアデニル化シグナル部位を含む。本発明の発現ベクターは、さらに、このようなベクターを含む細胞を選択するためのマーカーをコードする以下のポリヌクレオチドを含むことができる。適切なマーカーの例は、抗生物質（例えば、アンピニシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはノルセリン）に対する耐性をコードする遺伝子を含む。
本願で使用されるように、「対象」、「対象」、および「患者」という用語は、本願で説明されるような特定の疾患または状態（例えば、癌または伝染性疾患）の治療を受ける生物を意味する。対象および患者の例には、ヒト、霊長類、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ネコ、イヌ、モルモット、ウシ科ファミリーメンバー（家牛、バイソン、水牛、ヘラジカ、ヤクなど）、ウシ、ヒツジ、ウマ、バイソンなど、疾患または状態（例えば、がんまたは伝染性疾患などの細胞増殖性状態）の治療を受けている哺乳動物が含まれる。
本願で使用するように、用語「治療」は外科手術或いは薬物処理（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を指し、その目的は治療対象中の望ましくない生理変化或いは病変、例えば細胞増殖性病症（例えば癌或いは伝染性疾病）の進展を予防、緩和（減少）することである。有益なまたは望ましい臨床結果には、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患状態の安定（すなわち、悪化していない）、疾患の進行の遅延または遅延、疾患状態の改善または緩和、および検出可能であるか検出不可能であるかを問わず、緩和（部分的であるか完全であるかを問わない）が含まれるが、これらに限定されない。治療を必要とする対象には、既に病気や病気に罹患している対象と、病気や病気に罹患しやすい対象や病気や病気を予防しようとする対象とが含まれる。緩和、軽減、減弱、緩和、緩和などの用語に言及する場合、その意味には除去、消失、発生しないなどの状況も含まれる。
以下では、実施形態に関連して本発明の実施形態を詳細に説明するが、以下の実施形態は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものとはみなされないことを当業者は理解するであろう。実施例に具体的な条件が明記されていない場合は、通常の条件又は製造業者が提案した条件に従って実施する。使用する試薬又は機器にメーカーが明記されていない場合は、いずれも市販購入により取得できる通常の製品である。
実施例１．ＴＮＦＲ２モノクローナル抗体の調製
６－８週齢の雌ＳＪＬマウス（北京維通利華実験動物技術有限公司より購入）又はＢａｌｂ／ｃマウス（上海斯莱克実験動物有限公司より購入）に対して、コンプリートフルアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅｆｒｅｕｎｄ‘ｓａｄｊｕｖａｎｔ，ＣＦＡ，ＳＩＧＭＡより購入，商品番号：Ｆ５８８１）とヒトＴＮＦＲ２組換え蛋白質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，１０４１７－Ｈ０８Ｈ及びＮｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃ８３０）を混合して第一次免疫注射用とし、フセリ不完全アジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅｆｒｅｕｎｄ’ｓａｄｊｕｖａｎｔ、ＩＦＡ、ＳＩＧＭＡから購入、商品番号：Ｆ５５０６）とＣｐＧＯＤＮ１８２６（上海生工生物から合成）を使用して、最後の３回の免疫注射のアジュバントとした。特に、１回目と２回目は後足パッドと背中を免疫注射し、３回目と４回目は尾部皮下と背中を免疫注射することにより、高力価、高親和性、高特異性の抗血清と特異性の免疫細胞を得た。最終免疫（４回目の免疫）後７日目に安楽死したマウスは無菌で脾臓を取り出し、マウス脾臓リンパ球を無菌分離して抽出し、後で使用する時に細胞を蘇生させるために、液体窒素中に分けて凍結保存した。免疫後のマウスの脾臓またはリンパ節中のＴＮＦＲ２特異的な単一Ｂ細胞をＢＤＡｒｉａＩＩＩフローソーターにより９６ウェルプレートにて選別し、単一細胞のｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。その後、ｃＤＮＡを鋳型として巣ＰＣＲを行い、それぞれ抗体重鎖増幅と軽鎖増幅を行った。増幅して抗体重鎖可変領域と軽鎖可変領域を得て、それぞれ相同組換え法により重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターにクローニングした。重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの定常領域はいずれもヒトＩｇＧ１に由来した。完全重鎖発現配列はシグナルペプチド－ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３であり、完全軽鎖発現配列はシグナルペプチド－Ｖκ－Ｃκであった。上記の単Ｂ細胞抗体のクローニングと発現はすべて９６ウェルプレート内で高スループット方式で抗体の迅速な同定と発見を達成した。一連の理化学と機能スクリーニングを経て、５２３対クローン発現した抗体重鎖と軽鎖を得た後、計１１個の陽性候補抗体分子を得て、それぞれ配列のＣＤＲをＩＭＧＴおよびＫＡＢＡＴソフトウェアで解析した。抗体候補分子のＶＨ配列およびＶＬ配列を表１に、抗体候補分子のＩＭＧＴ解析結果を表２に、抗体候補分子のＫＡＢＡＴ解析結果を表３にそれぞれ示している。
表１．候補抗体分子のＶＨおよびＶＬ配列
表２．候補抗体のＩＭＧＴ解析結果
表３．候補抗体のＫＡＢＡＴ解析結果
実施例２．ＦＡＣＳによる腫瘍細胞株ＴＮＦＲ２の発現の検出
成長良好な細胞を収集し、計数した後、各種類の腫瘍細胞ごとに、２×１０６個の細胞を取得し、それぞれｉｓｏｔｙｐｅ対照群、ＴＮＦＲ２染色群（１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｔｅｓｔ）に応用した。ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、３００ｇ×５ｍｉｎ遠心した後、上清を捨て、１×Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ作動液（Ｚｏｍｂｉｅ ｖｉｏｌｅｔ Ｌ／Ｄ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号：４２３１１４）１００μｌ／ｔｅｓｔを加え、室温で２０分間染色した。２０分後、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で細胞を２回洗浄し、３００ｇ×５ｍｉｎ遠心した後、上清を捨て，以下のように１×染色抗体作動液１００μｌ／ｔｅｓｔを加え、４℃で３０分間光を避けて培養した。
ヒト腫瘍細胞に対して：１）ｉｓｏｔｙｐｅ対照群：１μｌ ＰＥ ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ，κｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号：５５３９８９）／１００μｌ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ／ｔｅｓｔを加える。２）ＴＮＦＲ２染色群：ヒト由来腫瘍細胞に８μｌ ＰＥ Ｒａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１２０ｂ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、商品番号：５５２４１８）／１００μｌ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ／ｔｅｓｔを加えた。培養終了後、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで細胞を２回洗浄し、３００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離した後、上清を捨て、３００μｌのＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで細胞を細胞懸濁液に再懸濁させ、上向流式計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で検出し、データを導出した後、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアで解析して図１に示すように、異なる腫瘍細胞の異なる発現レベルのＴＮＦＲ２を作成し、結果を表４にまとめた。
表４．１３株ヒト腫瘍細胞株のＴＮＦＲ２発現結果
実施例３．ＦＡＣＳによるヒトの異なるＴ細胞におけるＴＮＦＲ２発現レベルの検出
商用凍結保存したヒトＰＢＭＣ（Ｈｅｍａｃａｒｅ）を蘇生し、ａｎｔｉ－ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号：１１１２９Ｄ）で増幅活性化したＴｒｅｇ細胞を用いて一晩培養した。翌日、ヒトＰＢＭＣを３００×ｇ条件下で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清に捨てた。計数後、２×１０６個のＰＢＭＣ細胞を獲得し、それぞれｉｓｏｔｙｐｅ対照群、ＴＮＦＲ２染色群（１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｔｅｓｔ）に用いた。ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、３００ｇ×５ｍｉｎ遠心した後、上清を捨て、１×Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ作動液（Ｚｏｍｂｉｅ ｖｉｏｌｅｔ Ｌ／Ｄ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，品番：４２３１１４）１００μｌ／ｔｅｓｔを加え、室温で２０分間染色した。２０分後、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で細胞を２回洗浄し、３００ｇ×５ｍｉｎ遠心した後、上清を捨て、以下のように１×染色抗体作動液１００μｌ／ｔｅｓｔを加え、４℃で３０分間光を避けて培養した。
ＰＢＭＣ細胞の場合：１）ＦＭＯ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）群：次の表に示す抗体１μｌ／１００μｌ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ／ｔｅｓｔを加えた。
ＴＮＦＲ２染色群：次の表に示す抗体１μｌ／１００μｌ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ／ｔｅｓｔを加えた。
Ｔｒｅｇ細胞の場合：１）ＦＭＯ対照群：次の表に示す抗体１μｌ／１００μｌ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ／ｔｅｓｔを加えた。
ＴＮＦＲ２染色群：次の表に示す抗体１μｌ／１００μｌ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ／ｔｅｓｔを加えた。
培養が終わった後、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで細胞を２回洗浄し、３００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離した後、上清を捨て、３００μｌ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで細胞を再懸濁させて細胞懸濁液になり、上向流式計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で検出し、データを導出した後、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアで解析して図２に示すように、ＴＮＦＲ２はＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞でＴｒｅｇの発現レベルよりも大幅に低く、非活性化と活性化Ｔｒｅｇ細胞ではいずれも高発現であり、活性化Ｔｒｅｇ細胞では最も発現レベルが高い。
実施例４．ＢＩＡｃｏｒｅによるＴＮＦＲ２抗体とヒトおよびカニクイザルのＴＮＦＲ２タンパク質との特異的結合の検出
Ｂｉａｃｏｒｅにより、実施例１で得られた１１株のＴＮＦＲ２抗体とヒトおよびサルのＴＮＦＲ２タンパク質との特異的結合て検出した。この実験は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップによって、チップが希釈した抗体を捕捉するとともに、飽和結合抗原Ｒｍａｘが５０ ＲＵになるのに要する時間を、手動操作（ｍａｎｕａｌ ｒｕｎ）で測定した。ヒト（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦＲ２，Ｓｉｎｏ １０４１７－Ｈ０８Ｈ）とカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ＴＮＦＲ２，Ｓｉｎｏ ９０１０２－Ｃ０８Ｈ）のＴＮＦＲ２を３２，１６，８，４，２ｎＭに段階希釈した。抗体と抗原との親和性は、多重循環動力学を用いて測定される。各サイクルにおいて、抗体注入後に段階濃度のＴＮＦＲ２を注入することで、抗原と抗体に結合・解離過程を発生させる。各サイクルの後、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐＨ１．５でＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップの再生（チップ上のタンパク質の除去）を行った。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００解析ソフトウェアによって抗体抗原の親和性ＫＤをフィッティングした。
表５．ＴＮＦＲ２抗体とヒトまたはサルのＴＮＦＲ２タンパク質と特異的結合のＢｉａｃｏｒｅ結果
表５の結果から分かるように、実施例１で得られた１１個の抗ＴＮＦＲ２抗体はヒトとサルのＴＮＦＲ２タンパク質と特異的に結合しており、親和性レベルが比較的に高い。
実施例５．ＥＬＩＳＡによるヒトおよびサルのＴＮＦＲ２タンパク質へのＴＮＦＲ２抗体の特異的結合の検出
酵素標識板にあらかじめ１００μｌ／ウェルで０．５μｇ／ｍｌヒトＴＮＦＲ２またはカニクイザルＴＮＦＲ２（実施例４と同じ抗原蛋白）をコーティングした。精製後の実施例１で得られた抗ＴＮＦＲ２抗体を２８ｎｇ／ｍｌ（抗体＃１結合曲線のＥＣ８０に対応する）になるように希釈し、１００μｌ／ウェルに添加して、室温で１．５ｈ振とう培養した。板を洗った後、マウス抗ヒト（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ）ＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰワーキング溶液（１：１０ ０００希釈）を加え、１００μｌ／ウェルに添加して、室温で１．０ｈ振とう培養した。プレートを再度洗浄し、ＨＲＰの基質ＴＭＢを添加して発色させ、停止液を添加して反応を停止させた後、酵素標識器で吸光値を読みとった。表６のデータから分かるように、１１の抗体はすべてサルＴＮＦＲ２タンパク質に特異的に結合したが、マウスＴＮＦＲ２または対照のヒトＣＲＥＧ－Ｈｉｓタンパク質には結合しなかった。
表６．ＴＮＦＲ２抗体とヒトおよびサルのＴＮＦＲ２タンパク質との特異的な結合に関するＥＬＩＳＡの結果

備考：１、００２＃はツール抗体（ｔｏｏｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＷＯ２０１７／０８３５２５ Ａ１のＳＢＴ－００２から由来）であった。
２、抗体は単一の濃度点のみが測定され、ＯＤ値で表し、その中、＃０８８と＃３０９抗体濃度は１２ｎｇ／ｍＬで、他の抗体濃度は２８ｎｇ／ｍＬであった。
実施例６．ＦＡＣＳによって抗体とＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞表面のヒトＴＮＦＲ２との結合を検出する
ＴＮＦＲ２高発現プラスミドがトランスフェクションされたＣＨＯ安定化細胞を用いて、細胞密度が８０％を超えない範囲で実験を行った。前記プラスミドはＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（商品番号：ＨＧ１０４１７－ＵＴ）から購入したものであった。細胞培地を捨て、ＰＢＳで洗浄し、パンクレアチン１ｍｌを加えて２分間消化し、１０％ＦＢＳを含むＨａｍＦＢＳ培地で消化を停止させたことにより、細胞懸濁液を作製した。計数後、適量の細胞懸濁液を取り、３５０×ｇ遠心分離し、上清を捨て、１×１０７細胞／ｍｌの密度で、相応体積のブロッキング液 （１０％ＦＢＳ＋ＰＢＳ）を加えて細胞を重懸濁し、４℃で３０分間培養した。培養終了後、３５０×ｇ遠心分離して上清を除去し、染色緩衝液（２％ＦＢＳ＋ＰＢＳ）で細胞を２×１０６細胞／ｍｌの密度に重懸濁させ、１ウェルあたり５０μｌの細胞懸濁液を添加するように、９６ウェルプレートに播種した。抗体をＰＢＳで８０ｎｇ／ｍｌに希釈し、希釈した抗体を５０μｌの細胞懸濁液が含まれていたウェルに添加して、マイクロプレートシェーカー上で５００ｒｐｍで１分間振とうさせ、抗体と細胞を十分に混合し、４℃で１時間培養した。培養終了後、染色緩衝液で細胞を２回洗浄した。ウェル当たり１００μｌ、３５０×ｇで５分間遠心分離して上清を捨てた。ＰＥ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，品番：１２－４９９８－８２）を染色緩衝液で２５０倍に希釈し、洗浄したウェルに１ウェル当たり１００μｌの体積で加え、均一に混合し、４℃で３０分間染色した。染色終了後も同様に染色緩衝液で２回洗浄してから、２００μｌ染色緩衝液で細胞を重懸濁させ、フローサイトメトリーでシグナル強度を測定し、シグナルが強いほど抗体とＴＮＦＲ２の結合能が強いことを示した。図３Ａに示すように、ＰＥ Ｒａｔ－ＩｇＧ２ｂ ＰＥ Ｒａｔ－ＩｇＧ２ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号：４００６３６）とＰＥ Ｒａｔ ａｎｔｉ－ｈＴＮＦＲ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，商品番号：５５２４１８）で測定した結果、ＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞表面のＴＮＦＲ２発現強度は、同型対照の約１３４倍であった。これに基づいて、実施例１の１１個のＴＮＦＲ２抗体と細胞表面のＴＮＦＲ２との結合能力を測定した結果、図３Ｂに示すように、すべて陽性であった。
実施例７．ＦＡＣＳにより抗体とＴｒｅｇ細胞表面のヒトＴＮＦＲ２との結合を検出する実験
選別ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、商品番号：１８０６３）によって、ヒトＰＢＭＣを単離してから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ、商品番号：１１１２９Ｄ）での体外刺激により１７日増幅した後、ヒトＴｒｅｇ細胞を得て、得られた細胞を分けて凍結保存した。体外で単離増幅したＴｒｅｇ細胞を取って一晩蘇生し、翌日３００×ｇで５分間遠心分離し、ＤＰＢＳで重懸濁して細胞懸濁液を得て、計数した。実験に必要な数の細胞を遠心管に加え、３００×ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を除去し、ブロッキング液 で細胞濃度を１×１０７個／ｍｌに調整し、４°Ｃで３０ｍｉｎ培養した。ブロッキングされた細胞３００×ｇを５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、染色緩衝液で細胞密度を２×１０６／ｍｌに調整し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０μｌ播種した。実施例１の１１個の被検抗体＃００１、＃０８８、＃１２５、＃１３３、＃２１９、＃２２４、＃２２６、＃３０９、＃３５２、＃３６５、＃３９５と対照抗体ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ（ＰＢＳでそれぞれ２００ｎｇ／ｍｌに希釈、総量１００μｌ）を用いた。各試料をウェルごとに５０μｌずつ加えた。細胞懸濁液と抗体を加えたウェルプレートをマイクロプレートシェーカーに置き、５００ｒｐｍの速度で１分間振とうし、細胞と抗体を十分に混合した。混合後、ウェルプレートを４°Ｃ冷蔵庫に置き、６０分間培養した。培養終了後、ウェルごとに１００μｌ染色緩衝液を加え、３５０×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。１ウェル当たり２００μｌ染色緩衝液を加えて細胞を重懸濁させ、３５０×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。染色緩衝液を２５０：１（染色緩衝液：染料）の割合でＰＥ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃに加えて染色液を作製し、染色液を混合した後にウェルに１００μｌずつ加える。ウェルプレートをマイクロウェルプレート振とう器に載せて５００ｒｐｍの速度で１分間振とうさせ、細胞と染色液を十分に混合した。混合した後、４°Ｃ冷蔵庫に置き、３０分間培養した。細胞を２回洗浄し、最後に１ウェル当たり２００μｌのＰＢＳを加えて細胞を重懸濁させ、シグナルを検出した。図４Ａに示したＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋の細胞がヒトＴｒｅｇ細胞であり、丸印のＴｒｅｇ細胞におけるＴＮＦＲ２の発現割合は９９．５％に達しており、ヒトＴｒｅｇ細胞がＴＮＦＲ２を非常に高発現していることが分かった。図４Ｂが示しているように、対照抗体ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅがＴｒｅｇに結合しなったが、実施例１の１１個の抗体はすべてＴｒｅｇ細胞に有効に結合した。
実施例８．ＥＬＩＳＡで抗ＴＮＦＲ２抗体のＴＮＦα／ＴＮＦＲ２の結合に対する抑制を検出
酵素標識板にはあらかじめ１μｇ／ｍｌ １００μｌ／ウェルのヒトＴＮＦＲ２（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，商品番号Ｃ８３０）をコーティングし、実施例１の各ＴＮＦＲ２抗体を４０ｎＭと４ｎＭに希釈し、希釈した抗体をそれぞれ１５ｎｇ／ｍｌヒトＴＮＦａ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，商品番号ＴＮＡ－Ｈ８２Ｅ３）と等体積混合し、１００μｌ／ウェルごと酵素標識板に加え、室温振とう２．０ｈ培養した。プレートを洗った後にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰワーキング溶液（１：１０ ０００希釈）を加え、１００μｌ／ウェル、室温で４０分間振とう培養した。プレートを再度洗浄し、ＨＲＰの基質ＴＭＢを添加して発色させ、停止液を添加して反応を停止させた後、酵素標識器で吸光値を読み取った。ＯＤ値が低いほど、抗体がＴＮＦａとＴＮＦＲ２の結合を抑制する能力が高いことを意味した。最終的にすべての抗体のＯＤ値を、ツール抗体００２＃のＯＤ値に対して正規化し、パーセンテージ値が高いほど抑制能力が高いことを意味した。表７のデータから分かったように、実施例１の１１抗体は、２０ｎＭと２ｎＭの濃度でＴＮＦａとＴＮＦＲ２の結合を抑制する活性を示した。００２＃Ａｂと比較して抑制活性に高低があった（表７）。
表７ａ．ＥＬＩＳＡ結果－１：一部の被測抗体はＴＮＦαとＴＮＦＲ２の結合を抑制できた
表７ｂ. ＥＬＩＳＡ結果－２ 一部の被測抗体はＴＮＦαとＴＮＦＲ２の結合を抑制できた。

備考：１．００２＃はツール抗体であった。２．％ｔｏ ００２＃ＯＤ＝００２＃（２０ｎＭ または ２ｎＭ）のＥＬＩＳＡ ＯＤ／抗体のＥＬＩＳＡ ＯＤ（２０ｎＭ または ２ｎＭ）×１００
実施例９．抗ＴＮＦＲ２抗体のヒトＴＮＦＲ２を高発現するＣＨＯ細胞におけるＴＮＦαとＴＮＦＲ２との結合に対する抑制
ヒトＴＮＦＲ２を高発現するＣＨＯ安定化細胞を用いて実験を行った。細胞を蘇生させ、状態が良好になるまで継代し、細胞のヒトＴＮＦＲ２発現レベルを測定した。ホモタイプ対照を比較して平均蛍光強度（ＭＦＩ）シフト倍数が１００倍以上であれば検出できた。
ＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞消化後、ＤＰＢＳ２回洗浄、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（Ｌ／Ｄ）染色（室温２０ｍｉｎ）後、１×１０５細胞／５０μｌ／ウェルで播種した。実施例１のａｎｔｉ－ＴＮＦＲ２抗体を染色緩衝液で４０ｎＭまで希釈して初期濃度とし、３倍段階で希釈し、計７つの濃度点であった。希釈した抗体を５０μｌ／ウェルに播種された細胞に加え、柔らかく吹き混ぜ、抗体の最終濃度はそれぞれ２０，６．６７，２．２２，０．７４，０．２４７，０．０８，０．０２７と０ｎＭであり、４°Ｃで３０ｍｉｎ培養した。その後１００μｌ／ウェルで１００ｎｇ／ｍｌに希釈したヒトＴＮＦα－ｂｉｏｔｉｎを加えて軽く吹いて混合し、混合後４°Ｃで３０ｍｉｎ培養した。染色緩衝液を２回洗浄した後、１００μｌ／ウェルでＰＥ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを加えて４°Ｃ３０分間培養した。染色緩衝液を２回洗浄した後、１５０μｌに重懸濁させてから測定した。抗体濃度の対数値を横軸とし、対応のＭＦＩ値を縦軸として抗体の抑制曲線をプロットし、４パラメータでフィッティングしてＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０値が小さいほど、抗体のヒトＴＮＦαとヒトＴＮＦＲ２の結合に対する抑制能力が高かった。一部の抗体の遮断曲線の形状が異なったため、すべての抗体の遮断効果を００２＃ＡＵＣに正規化し、パーセンテージ値が高いほど、抗体抑制の効果が良かったことを示した。１１抗体の遮断曲線は図５に、抑制活性は表８にそれぞれ示された。
図５および表８から分かるように、実施例１の１１抗体はいずれもＴＮＦαとＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞上のＴＮＦＲ２の結合を有意に抑制した。ツール抗体００２＃と比較して１１抗体の抑制活性に高低があった。
表８．ＴＮＦＲ２抗体のＴＮＦαと細胞表面ＴＮＦＲ２の結合に対する遮断

備考：ＡＵＣ％＝００２＃のＡＵＣ÷抗体のＡＵＣ×１００
実施例１０．ＴＮＦＲ２抗体によるＴｒｅｇ機能の抑制
ＴＮＦＲ２抗体が含まれた条件下で、エフェクター（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）Ｔ細胞に対するＴｒｅｇ細胞の抑制機能を測定したことにより、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能に対する抗体の干渉効果を判定した。実験に必要なＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞）とＴｃｏｎエフェクター細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞）を取って一晩蘇生し、翌日４００×ｇで５分間遠心分離し、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，商品番号７２４０００４７）で重懸濁して細胞懸濁液を得、計数した。Ｔｃｏｎ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ品番４２３８０１）で染色し、４×１０６細胞ごとに１μｌの貯留液を用いて１ｍｌの染色液に調製した。染色５ｍｉｎ、同体積の血清で反応を中和し、５ｍｉｎ静置し、４００×ｇ ５ｍｉｎ遠心分離した。細胞を培地で重懸濁洗浄し、再度遠心分離して上清を得た。９６ウェルプレートにウェル当たり１×１０５細胞密度で播種し、５０μｌ培地当たり１×１０＾５細胞の密度で細胞を重懸濁させ、５０ｍＬ遠心チューブに移送した。その同時に、Ｔｒｅｇ細胞を準備した。Ｔｒｅｇ細胞とＴｃｏｎ細胞を１：１，１：２，１：４，１：８の比例で共培養した。各９６ウェルプレートは、それぞれ異なるＴｒｅｇ細胞密度に対応し、ウェルごとに５０μｌ培地に懸濁された。Ｔｃｏｎ細胞の総数に応じて１：８の比例で対応するａｎｔｉ－ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号１１１２９Ｄ）を用意した。ＴｒｅｇとＴｃｏｎの培地に１ウェルあたり５０μｌの体積で添加した。被測抗体を毎ウェルに添加し、抗体の最終濃度は１２．５μｇ／ｍｌとなった。条件ごとに並列の２つのウェルを設け、上記ウェルプレートを混合した後、３７℃インキュベータで４日間培養してＦＡＣＳ検査を行った。その結果、特に＃００１抗体と＃２２４抗体は異なるＴｒｅｇ／Ｔｃｏｎ比例条件下でＴｒｅｇのＴｃｏｎ細胞に対する抑制作用を著しく抑制し、Ｔｃｏｎの増殖を促進した（図６）。
実施例１被検抗体と対照抗体ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅとを比較した場合のＴｒｅｇ細胞の抑制機能への影響の計算式：（被検抗体存在時のエフェクターＴ細胞の増殖能－ａｎｔｉ－Ｈｅｌ抗体存在時のエフェクターＴ細胞の増殖能）／ａｎｔｉ－Ｈｅｌ抗体存在時のエフェクターＴ細胞の増殖能×１００％。
実施例１１．ＴＮＦＲ２抗体のＴｒｅｇ機能抑制実験における細胞上清ｓＴＮＦＲ２発現に対する影響
細胞上清のｓＴＮＦＲ２の発現を測定したことで、ＴＮＦＲ２抗体によるＴｒｅｇ機能の抑制効果を判定した。ＴｒｅｇとエフェクターＴ細胞を実施例１の抗体で処理して４日後に培養上清をサンプルとして採取し、上清を１ウェル当たり１００μｌ採取した。上清を５倍希釈した後、ｓＴＮＦＲ２の測定を行った。ｓＴＮＦＲ２の測定方法はＲ＆Ｄ社ｈｕｍａｎＴＮＦＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂキット（品番ＤＲＴ２００）を参照した。その結果、＃００１、＃０８８、＃１２５、＃２１９、＃２２４、＃２２６と＃３０９は、異なるＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎの比例でも細胞上清中ｓＴＮＦＲ２の発現レベルを著しく低下させることができた（図７）。
実施例１２．ＴＮＦＲ２抗体のＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ細胞増殖に対する抑制
ＴＮＦＲ２抗体の存在下でＴＮＦαによるＴｒｅｇ細胞の増殖誘導を測定したことで、ＴＮＦαによるＴｒｅｇ細胞の増殖誘導に対する当該抗体の抑制作用を判断した（Ｚａｒａｇｏｚａ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１６ Ｊａｎ；２２（１）：１６－７）。体外増幅分離後に凍結保存したＴｒｅｇ細胞を取って一晩蘇生させ、翌日４００×ｇで５分間遠心分離し、培地で重懸濁して細胞懸濁液を得て、計数した。ＴｒｅｇをＣＦＳＥで染色し，４×１０６細胞ごとに１μｌの貯留液を用いて染色液１ｍｌに調製した。染色５ｍｉｎ、同体積の血清で反応を中和し、静止５ｍｉｎ、遠心４００×ｇ ５ｍｉｎ。細胞を培地で重懸濁洗浄し、再度遠心分離して上清を取った。９６ウェルプレートを１ウェルあたり１×１０＾５細胞密度で播種し、１×１０５細胞あたり５０μｌ培地の密度で細胞を重懸濁させ、９６ウェルプレートに移した。実施例１の被検抗体をウェル当たり１２．５μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、インキュベータで３０分間培養した。その後、ＩＬ－２（終濃度３００ＩＵ）が含まれた培地５０μｌとＴＮＦα終濃度５０ｎｇ／ｍｌの培地５０μｌを１ウェル当たり添加し、１ウェル当たりの終体積を２００μｌとした。条件ごとに並列の３つのウェルを設定し、上記ウェルプレートを混合した後、３７℃インキュベータで３日間培養してＦＡＣＳ検出を行った。Ｔｒｅｇ増殖の割合から、この抗体のＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ増殖に対する抑制作用を判断した。図８に示すように、対照ａｎｔｉ－Ｈｅｌ抗体と比較して、＃００１（１７．１％抑制），＃０８８（６．９％抑制），＃１２５（５．２％抑制），＃１３３（９．７％抑制），＃２１９（１３．６％抑制），＃２２６（１０．３％抑制），＃３６５（１１．０％抑制）の抗体はＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ細胞増殖を効果的に抑制した。被測抗体が対照抗体と比較して、ＴＮＦαにより誘導されるＴｒｅｇ細胞増殖を抑制する割合の計算式：（被測抗体存在時のＴＮＦαによるＴｒｅｇ増殖誘導割合－ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ抗体存在時のＴＮＦαによるＴｒｅｇ増殖誘導割合）／ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ抗体存在時のＴＮＦαによるＴｒｅｇ増殖誘導割合×１００％。図８Ａでは、ＴｒｅｇはＩＬ－２添加後に増殖が有意に高く（２０％ｖｓ．４％），ＴＮＦα添加後に増加率がさらに高く（４０％ｖｓ．２０％）なった。図８Ｂに示したように、１１個の抗体はＩＬ－２とＴＮＦα添加後のＴｒｅｇの増殖の誘導能に対する抑制作用を示し、＃２２４，＃３５２，＃３９５を除く８個の候補抗体は、すべてＩＬ－２とＴＮＦαによるＴｒｅｇの増殖を抑制していた。
実施例１３．ＥＬＩＳＡによるＣＤ４＋Ｔ細胞培養上清におけるｓＴＮＦＲ２発現レベルへのＴＮＦＲ２抗体の影響の検出
商用凍結保存ヒトＰＢＭＣ細胞を蘇生し、一晩培養する。翌日、ヒトＰＢＭＣを３００×ｇ条件下で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、キット分離液Ｅａｓｙｂｕｆｆｅｒで細胞を２回洗浄した後、細胞を計数した。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット取扱説明書（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，ＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，品番１７９５２）によりヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の分離を行った。分離したＣＤ４＋Ｔ細胞を再度計数し、適切な濃度まで懸濁させた後、９６ウェルプレートに４×１０５細胞／ウェルを５０μｌ／ウェルで接種した。抗体作動液（５０μｇ／ｍｌ，４×）を調製し、５０μｌ／ウェルをウェルプレートに加え、３７°Ｃ，５％ＣＯ２条件下で３０分間培養した。次に，ＩＬ－２作動液（８００ＩＵ／ｍｌ，４×）とＴＮＦα作動液（２００ｎｇ／ｍｌ，４×）を調製し、それぞれ５０μｌ／ウェルで添加した。実験群には、非刺激群，ＩＬ－２単独刺激群，ＴＮＦα単独刺激群，ＩＬ－２＋ＴＮＦα共刺激群，抗体＋ＩＬ－２＋ＴＮＦα共刺激群（すなわち被検試料群）があった。播種完了のウェルプレートをインキュベータに入れ、３７度Ｃ，５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。３日後、培養上清を収集し、ｓＴＮＦＲ２測定を行った。
ヒトｓＴＮＦＲ２標準品を調製し、上記実験中の細胞上清を取り出し、ＥＬＩＳＡキット仕様書の指示に従って操作した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｏｌｕｂｌｅ ＴＮＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩ Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ，品番ＤＲＴ２００）。ステップは次の通りである：１）高親和性プレートに細胞上清と標准品１００μｌ／ウェルを加え、室温（１８－２５°Ｃ）で２．５ｈ軽く振とうして培養する。２）上清を捨て、洗浄液（Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）で４回、３００μｌ／ウェルを洗う。３）水分を除去した後、１００μｌ／ウェルの１×Ｂｉｏｔｉｎ標識可溶性ヒトＴＮＦＲ２抗体を加え、室温（１８－２５°Ｃ）でわずかに振とうして１ｈ培養する。４）上清を捨て、洗浄液で板を４回、３００μｌ／ウェルに洗浄、５）水分を除去した後、１００μｌ／ウェルの１×ＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ溶液を加え、室温（１８－２５°Ｃ）で４５分間軽く揺さぶって培養し、６）上清を捨て，洗浄液で板を４回，３００μｌ／ウェルに洗浄，７）水分を除去した後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液を加え、室温（１８－２５°Ｃ）遮光条件下で３０分間軽く振とう培養し、８）５０μｌ／ウェルの反応停止液を加え、直ちに酵素標識器でＯＤ４５０読み取り値を検出した。
実験結果は、図９に示された通り、陰性対照Ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ群と比較して、実施例１の１１抗体はいずれも細胞上清中のｓＴＮＦＲ２分泌を抑制した。ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ－２とＴＮＦαの共刺激下で活性化されるため、細胞上清中のｓＴＮＦＲ２の分泌が増加した。１１個の抗体はすべて異なる程度にＩＬ－２とＴＮＦαのＣＤ４＋Ｔ細胞に対する活性化効果を遮断することができ、そのうち、番号＃８８、＃２１９、＃００１（Ｐ＜０．００１）、＃１２５、＃２２４（Ｐ＜０．０１）の抗体の抑制作用は特に顕著であり、統計学的意義上の有意差があった。ＯＤ４５０の読み取り値が低いほど、ｓＴＮＦＲ２の発現レベルが低いこと、すなわち抗体の拮抗活性が強いことを示していた。
実施例１４．ＦＡＣＳによりＴＮＦＲ２抗体が介したＴｒｅｇ細胞に対するＡＤＣＣ活性を検出
１日に前もってＰＢＭＣと凍結保存したＴｒｅｇ細胞を完全培地（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ＦＢＳ＋１*Ｐ／Ｓ＋１*ＩＴＳ＋５０μｌＭＰＭメルカプトエタノール）で培養し、ＰＢＭＣに１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２添加を必要とした。実験当日に分離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，商品番号１７９５５）の要求によりＮＫ細胞をＰＢＭＣから分離し、完全培地で重懸濁（ＩＬ－２を含まない）させ、密度０．４５×１０６／ｍｌとした。Ｔｒｅｇ細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ試薬で標識し、標識終了後に密度を０．３×１０６／ｍｌに調整した。１１個の候補抗体を最終濃度の４倍まで完全培地で段階希釈しておいた。実験プレート分布図に従って標的細胞を５０μｌ／ｍｌ細胞プレートに播種し、次に希釈した薬物を対応するウェルに播種し、標的細胞と３０分間、３７°Ｃで共培養した。培養終了後、エフェクター細胞を加える必要のあるウェルに１００μｌのエフェクター細胞懸濁液を加え、不要なウェルに１００μｌの培地を補充し、３７°Ｃ４時間共培養した。１ウェル当たり１μｌのＰＩ染料を加えてから検出を行った。標的細胞中のＰＩシグナルが強いほどＡＤＣＣ作用が顕著であることを示した。ＡＤＣＣ実験結果（図１０と表９）により、陰性対照ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅは作用標的がないため、ＡＤＣＣ殺傷作用が現れなかった。陽性対照＃５２号サンプルは明らかなＡＤＣＣ作用曲線を示した。１１個の抗体はすべて微弱なＡＤＣＣ活性作用を示した。図１０ＡにヒトＴｒｅｇはＴＮＦＲ２を高発現し、ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ対照抗体染色と比較して８０倍のシフトを示した。図１０Ｂに示された通り、キット分離前のＰＢＭＣ中のＮＫ細胞の割合が１４．５％であり、キット分離後のＮＫ細胞の純度は８８．３％であった。図１０Ｃは１１抗体のＡＤＣＣ作用を示しており，＃５２抗体は陽性対照抗体，ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ抗体は陰性対照抗体、Ｔａｒｇｅｔ ａｌｏｎｅはＮＫ細胞がなく標的細胞Ｔｒｅｇのみの細胞陰性対照である。
表９：Ｔｒｅｇに対する被測抗体のＡＤＣＣキラー作用曲線ＡＵＣ（Ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ＲＯＣ Ｃｕｒｖｅ）の比較

備考：被検抗体のＡＤＣＣ作用曲線のＡＵＣ値と上陽性対照＃５２抗体サンプルとを比較し、相対的なＡＤＣＣ活性を得た。
実施例１５．ＴＮＦＲ２抗体を介したＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞に対するＡＤＣＣ活性のレポーター遺伝子法による検出
１日に前もってターゲット細胞（ＣＨＯ－ＴＮＦＲ２）を透明底白色９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，商品番号：３６１０）に播種し、検出緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ，商品番号：２２４００１０５）＋０．５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号：１００９９１４１）＋１*Ｐ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ，品番：１５１４０－１２２））を用いて播種し，１ウェルあたり１００００個の細胞を播種し、一晩で細胞を壁に貼り付けた。翌日には検出緩衝液を用いて最終濃度の２倍に段階希釈して置いた。プレート中の検出緩衝液を捨てて、１ウェル当たり２５ｕｌの新しい検出緩衝液を加えた後、希釈した薬物を対応するウェルに１ウェル当たり２５ｕｌ添加し、標的細胞と１時間，３７℃で共培養した。培養終了後、対応するウェルに２倍の薬物を２５ｕｌ加え、ＡＤＣＣ細胞懸濁液（ＢＰＳ，商品番号６０５４１）を２５ｕｌ、ウェル当たり７５０００細胞を指定のウェルに加えた。このとき各ウェル内に１００ｕｌの混合液を入れ、インキュベータで６時間培養した。培養終了後、ウェルプレートを室温で１０分間放置し、あらかじめ室温まで融解したＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，商品番号：２６２０）試薬を１ウェル当たり１００ｕｌ添加し，ウェルプレートをウェルプレートで５００ｒｐｍで１０分間振とうさせてから、発光値を検出した。発光信号が強いほどＡＤＣＣの作用が顕著であることを示していた。ＡＤＣＣ実験の結果、陰性対照ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ同型対照抗体は作用標的がなかったため、ＡＤＣＣ殺傷作用を検出しなかった。一方、検出された＃００１、＃２１９、＃２２４の３つの抗ＴＮＦＲ２抗体はすべてＡＤＣＣ作用を有した（図１１）。
実施例１６．抗ＴＮＦＲ２抗体とヒトＴＮＦＲ２タンパク質上の抗原エピトープ群（Ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ）との結合
ヒトＴＮＦＲ２タンパク質に結合する際にＴＮＦＲ２抗体が競合するか否かをＢｉａｃｏｒｅを用いて検出したことにより、いくつかの抗原エピトープボックス（ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎ）（ＡｂｄｉｃｈｅＹＮ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏｓＯｎｅ．Ｍａｒ２０，２０１４）に属することを事前に決定した。ヒトＴＮＦＲ２はアミノ結合で固定され、選択された固定抗体を注射で結合させ、さらに他の抗体をそれぞれ注射で結合させ、その後固定抗体と他の抗体の注射順序を交互に行った。固定抗体と他の抗体との結合シグナルに前後２つの状態に差があるか否かを比較分析したことにより、ヒトＴＮＦＲ２タンパク質上の抗体間のｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅの関係を判定した。具体的には、各サイクルにおいて、すべての抗体の測定に３００ｎＭの濃度で１８０ｓ注入し、６５０ｍＭのＨＣｌ溶液を用いて被測定抗体を溶出させた。
表１０の結果から分かったように、抗体２２４が結合するＴＮＦＲ２抗原エピトープは他の１０個の抗体と異なった。
表１０．ＢｉａｃｏｒｅによるＴＮＦＲ２抗体のヒトＴＮＦＲ２タンパク質でのＥｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇに対する測定結果

注：Ｙ：エピトープ競合がある。Ｎ：エピトープ競合なし
実施例１７．抗マウスＴＮＦＲ２代替抗体のインビボ薬効検出
例１の１１個の抗ヒトＴＮＦＲ２抗体はヒトとカニクイザルのＴＮＦＲ２に特異的に結合し、いずれもマウスのＴＮＦＲ２に結合しなかったため、抗ｍＴＮＦＲ２抗体を代替抗体（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）としてＢａｌｂ／ｃマウスにＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法耐性ＣＴ２６．ＷＴ大腸癌動物モデルを作成し、ＴＮＦＲ２標的に関する薬効実験を行った。代替抗体ａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２はＢｉｏＸｃｅｌｌ（商品番号ＢＥ０２４７）から購入した。マウス右側皮下に１×１０５ＣＴ２６結腸癌細胞を接種した（実験０日目とした）。腫瘍体積が～１１０ｍｍ３に達した場合には、個体の腫瘍体積が適度なマウスを群に選び、動物を腫瘍体積ごとにＥＸＣＥＬ乱数に基づくランダムグルーピング方法を用いて、４つの実験群（Ｇ１は対照群、Ｇ２はａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２代替抗体群、Ｇ３はａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、商品番号ＢＥ０１０１）抗体群、Ｇ４はａｎｔｉ－ｍＰＤ－１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、商品番号ＢＥ０１４６）抗体群に８匹ずつ分配し、グルーピング（１３日目）当日に投与を開始した。投与量は，ａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２ ５ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ），ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ），ａｎｔｉ－ｍＰＤ－１ １０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）で週２回腹腔内投与した。腫瘍の体積と体重は週に３回一定時間測定された。
腫瘍接種後２１日目に、ａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２群とａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１群の腫瘍体積増加は対照群と比較して有意に抑制され、統計学的差があった（Ｐ＜０．０５）。また、ａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２グループは、ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１グループよりも大きなＴＧＩ値を有する。その結果、このａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２抗体は、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体よりも、この腫瘍モデルにおいて優れた薬効を有することが示された（図１２Ａ－Ｂ）。
各グループの実験動物は投与期間中の活動と食事状態が良好で、体重がある程度上昇した。その結果、このａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２抗体は安全性に優れていたことが示された（図１２Ｃ）。
最後の投与の２４ｈ後、それぞれＧ１対照群とＧ２ ａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２抗体群の大部分のマウスを選んでＴＩＬの分離を行い、ＦＡＣＳの免疫タイピングを行い、すべての細胞群のゲートの根拠はすべてＦＭＯ対照（図１３Ａ－Ｂ）であり、結果から示された通り、ａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２代替抗体治療群のＣＤ８＋Ｔ細胞は対照群より明らかに多く、しかも有意差があった（ｐ＜０．０１）（図１３Ｃ）。同時にａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２治療群の総ＣＤ８＋Ｔ及び記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞数とＴｒｅｇ細胞数の比（ＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇ）も対照群より明らかに高く、しかも統計学的差異があった（ｐ＜０．００１）（図１３Ｄ－Ｅ）。ａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２治療群のＣＤ８＋Ｔ発現ＰＤ－１の平均蛍光強度は、同型対照群により低く、有意差があった（ｐ＜０．００１）（図１３Ｆ）。以上のデータから示唆された通り、抗ｍＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍効果が、ＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇの割合を向上し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫消耗状態を部分的に逆転したことにで実現された可能性があった。
腫瘍体積（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ，ＴＶ）は、Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２として計算された。ここで、ａとｂはそれぞれ長さと幅を表した。測定結果から、相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ，ＲＴＶ）を、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０として算出した。その中、Ｖ０は分籠投与時（すなわちＤａｙ ０）に測定して得られた腫瘍体積であり、Ｖｔは１回の測定時の腫瘍体積であった。ＴＧＩ％＝［１－ＲＴＶ（試験群）／ＲＴＶ（対照群）］×１００％。
実施例１８．抗マウスＴＮＦＲ２置換抗体と抗マウスＰＤ－１置換抗体との併用のインビボ薬効を検出
マウス右側皮下に１×１０５ ＣＴ２６．ＷＴ結腸癌細胞を接種した（実験０日目とした）。腫瘍体積が～１００ｍｍ３に達した場合、個体の腫瘍体積が適度なマウスを群に選び、動物を腫瘍体積ごとにＥＸＣＥＬ乱数に基づくランダム群分け方法を用い、6つの実験群（Ｇ１は対照群、Ｇ２はａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２抗体群、Ｇ３はａｎｔｉ－ｍＰＤ－１抗体群、Ｇ４はａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２＋ａｎｔｉ－ｍＰＤ－１抗体群）に９匹ずつ分配し、体内薬効学研究に用いられた。グループ分け（１４日目）当日に投与を開始した。投与量はａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２ ５ｍｐｋ，ａｎｔｉ－ｍＰＤ－１ １０ｍｐｋで週２回腹腔内投与した。腫瘍の体積と体重は週に３回一定時間測定された。
腫瘍接種後２８日目に、Ｇ２ ａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２群とＧ３ ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１群の腫瘍体積増加は対照群と比較して有意に抑制され、統計学的差があった（Ｐ＜０．０５）。また、ａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２グループは、ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１グループよりも大きなＴＧＩ値を有した。その結果からわかったように、このａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２抗体はこの動物モデル上でより良い薬効を有した。Ｇ４併用治療群が最も薬効が良く、各単剤群と比較して統計学的差があり（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）、ａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２抗体とａｎｔｉ－ｍＰＤ－１抗体を併用投与すると相乗効果があった（図１４Ａ－Ｂ）。
２８日目に投与を停止した後、前の４グループのマウスは薬を停止した後の観察段階に入り、毎週少なくとも１回マウス腫瘍を記録し、薬を停止した後、Ｇ２ ａｎｔｉ－ｍＴＮＦＲ２グループとＧ３ ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１グループの腫瘍体積は緩やかに増加し始め、そして遅くとも５５日目にこの２グループのマウスは完全に死亡し、Ｇ４連合治療グループは６８日目に、依然として生存しているマウスが残っており、このグループの生存率はずっと５０％（５５．６％）より高い。Ｇ４連合治療群の３匹のマウス腫瘍体積は次第に消退し、しかもずっと成長せず、単剤群及び対照群と比べて有意差があり（ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０００１）、連合群は各単剤群より更に良い薬効を示した（図１４Ｃ）。

Claims (17)

  1. ＣＤＲ１－ＶＨと、ＣＤＲ２－ＶＨと、ＣＤＲ３－ＶＨとの重鎖ＣＤＲ組み合わせであって、ＩＭＧＴ解析によれば、ＣＤＲ１－ＶＨは配列番号７４の配列を含み、ＣＤＲ２－ＶＨは配列番号７５の配列を含み、ＣＤＲ３－ＶＨは配列番号７６の配列を含む重鎖ＣＤＲ組み合わせ、及び
    ＣＤＲ１－ＶＬと、ＣＤＲ２－ＶＬと、ＣＤＲ３－ＶＬとの軽鎖ＣＤＲ組み合わせであって、ＩＭＧＴ解析によれば、ＣＤＲ１－ＶＬは配列番号８０の配列を含み、ＣＤＲ２－ＶＬは配列番号８１の配列を含み、ＣＤＲ３－ＶＬは配列番号８２の配列を含む軽鎖ＣＤＲ組み合わせ、
    を含むか、あるいは
    ＣＤＲ１－ＶＨと、ＣＤＲ２－ＶＨと、ＣＤＲ３－ＶＨとの重鎖ＣＤＲ組み合わせであって、ＫＡＢＡＴ解析によれば、ＣＤＲ１－ＶＨは配列番号７１の配列を含み、ＣＤＲ２－ＶＨは配列番号７２の配列を含み、ＣＤＲ３－ＶＨは配列番号７３の配列を含む重鎖ＣＤＲ組み合わせ、及び
    ＣＤＲ１－ＶＬと、ＣＤＲ２－ＶＬと、ＣＤＲ３－ＶＬとの軽鎖ＣＤＲ組み合わせであって、ＫＡＢＡＴ解析によれば、ＣＤＲ１－ＶＬは配列番号７７の配列を含み、ＣＤＲ２－ＶＬは配列番号７８の配列を含み、ＣＤＲ３－ＶＬは配列番号７９の配列を含む軽鎖ＣＤＲ組み合わせ、
    を含む、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ、配列番号９及び配列番号１０に示された配列を有する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. ヒトＴＮＦＲ２に結合する解離定数（ＫＤ）が５ｎＭ以下であり、カニクイザルＴＮＦＲ２に結合する解離定数（ＫＤ）が５ｎＭ以下である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントはキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤからなる群から選択される定常領域を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. 前記抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び二重特異抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  7. 請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
  8. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  9. 原核細胞又は真核細胞である、請求項８に記載の発現ベクターを含む細胞。
  10. 前記細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、酵母細胞、昆虫細胞、大腸菌の細胞、及び枯草菌の細胞から選択される、請求項９に記載の細胞。
  11. 請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項７に記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載の発現ベクター、又は請求項９に記載の細胞、及び、薬学上許容されるベクターを含む医薬組成物。
  12. 追加の抗腫瘍剤をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 前記抗腫瘍剤は、化学療法剤、標的治療剤、又は免疫治療剤である、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 前記免疫治療剤は抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項７に記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載の発現ベクター、又は請求項９に記載の細胞、及び使用説明書を含むキット。
  16. 請求項１から１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項７に記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の細胞、又は請求項１１に記載の医薬組成物を含む、免疫異常関連疾患を治療するための医薬であって、
    前記免疫異常関連疾患は腫瘍である、前記医薬。
  17. 可溶性ＴＮＦＲ２を検出するための方法であって、
    可溶性ＴＮＦＲ２（ｓＴＮＦＲ２）を含む疑いがある試料を、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることを含む、方法。
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