CN101512337A - 跨物种与多物种展示系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了表达载体和辅助展示载体,它们可以不同的组合用作在原核基因包装和/或真核宿主细胞的外表面上多物种及跨物种展示多肽的载体组。用本发明的载体组可实现多物种和跨物种展示系统,不需要改变或重新构建展示载体。本发明的展示系统特别适用于在噬菌体、细菌宿主细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞表面展示遗传上不同的多肽总文库或文库。
Description
相关申请的交叉参考
根据35 USC 119(e)的规定本申请要求2006年5月4日提交的名称为“多物种展示系统”的美国临时申请No.60/746,489的权益。
技术领域
本发明涉及蛋白展示(display),并提供展示系统,该系统在不对表达载体进行任何分子操控的情况下,允许蛋白文库在原核和/或真核宿主细胞表面进行连续的多物种展示或跨物种展示。
背景技术
噬菌体展示系统被认为是构建和筛选多肽文库(例如抗体文库)的核心技术平台。这归因于大量的实际考虑,包括各种基因工具的可得性(availability)、操作的方便性、大肠杆菌细胞的高转化效率(通常109-1010cfu/ug pUC18 DNA)。目前,展示在噬菌体上的天然(naive)抗体文库已常规地用于抗体的发现,从而无需进行动物免疫接种及使用传统的杂交瘤技术。噬菌体展示文库的复杂性(complexity)已达到1011。然而,虽然噬菌体展示成功应用在抗体发现和抗体工程,但是真核蛋白在原核系统中的表达与展示仍存在一些缺点。例如,有些真核蛋白在原核细胞中不能功能性表达,原核宿主细胞不能完成全部的翻译后修饰,而翻译后修饰是真核宿主细胞的特征。
使用原核展示系统的一些限制因素可以用真核展示系统来克服。例如,真核宿主细胞通常可适于比较大的蛋白的展示,而且能够进行复合物糖基化等翻译后蛋白修饰。使用酵母展示系统的独特优点包括酵母细胞可以在相对简单而便宜的培养基中培养至高密度。而且,因为真核细胞较大,所以文库可以通过流式细胞术筛选出表达具有目的特性的蛋白的单个细胞。
虽然如此,真核宿主细胞在蛋白展示方面的大规模应用被一些基本的问题所限制,例如宿主细胞转化效率。例如,酵母细胞的转化效率一般是104-105cfu/ug DNA,这极大地限制了酵母细胞展示大容量(size)文库的能力。目前,报道的最大酵母细胞展示文库容量大约为109。
多物种展示系统能够让研究者将原核与真核展示系统的优点应用到抗体发现及分子进化应用,体现了蛋白展示系统的显著进步。先前发展多物种及跨物种展示系统的努力受到了阻碍,原因是展示策略是建立在将目标蛋白序列的文库与特定的外表面蛋白融合的基础上的,这种策略受限于表达所述表面蛋白的宿主细胞单一物种。例如,展示策略中目标蛋白以包含酵母细胞壁蛋白的融合蛋白形式展示的酵母展示系统,顾名思义只限于酵母,不能用噬菌体和哺乳动物宿主细胞实现。
如Hufton等人(美国专利申请20030186374 A1)所表明的,现有的展示系统一般使用的载体都需要将原核(噬菌体)展示载体中的编码序列转入到真核(酵母)展示载体中。总体来说,为了将载体从第一展示系统转入到使用不同的遗传包装(genetic package)的第二展示系统,载体必须进行剪切、连接以进行改造而在第二宿主细胞(例如物种)中使用,所用的克隆策略是使用同样的一组限制性内切酶位点将表达盒(cassette)从第一载体穿梭(shuttle)到第二载体。在实际操作中,为了使编码序列的文库适于在第二物种中展示而进行的DNA剪切和连接的过程是低效的,而且此过程可能会使具有独特性质的潜在目的序列丢失,从而对文库的多样性产生负面影响。
因此,需要一个理想的蛋白展示系统,不用对展示载体或是展示载体文库进行任何分子操作,就可以让展示载体能在不同物种的原核(噬菌体或细菌)遗传包装,或原核遗传包装与真核(酵母、哺乳动物细胞)系统,或两个真核宿主细胞(酵母和哺乳动物细胞)之间穿梭。
发明概述
本发明提供了能够进行不同的多肽文库的跨物种、多物种展示的蛋白展示系统。跨物种和多物种展示方法可以使用同样的表达载体,不需要进行任何分子操作(例如DNA剪切和连接)。本发明的组合物和方法能用来展示多物种遗传包装(例如噬菌体和细菌细胞,或者噬菌体和酵母细胞,或者噬菌体和哺乳动物细胞)表面的编码序列不同的总文库(repertoire)编码的蛋白产物。本发明的组合物和方法在展示与发现(如筛选)和分子进化过程有关的蛋白收集物时尤其有用。
更特别的是,本发明提供了一种蛋白展示系统,它允许研究者不使用任何对展示载体或展示载体文库的分子操作,便能将表达/展示载体在原核(如噬菌体,或者细菌)与真核(酵母、哺乳动物细胞)宿主细胞之间,或者在不同物种的真核宿主细胞(如酵母和哺乳动物细胞)之间穿梭使用。
如图1中所描述,已公开的展示系统允许外源序列展示在不同物种的遗传包装或者宿主细胞的外表面。每种展示系统通常具有两种组成成分:1)多物种或者跨物种表达载体,和2)针对各物种的相应辅助载体。在一个实施方案中本发明提供了跨物种或者多物种表达载体pMAG1、pMAG9、pMAT4、pMAT2、pMAT6和pMAT5。在pMAG1和pMAG9载体中,适配体(adapter)1融合蛋白的表达是在哺乳动物启动子和细菌启动子的控制下的。在载体pMAT2、pMAT4、pMAT5和pMAT6载体中,适配体1融合蛋白的表达是在酵母启动子和细菌启动子的控制下的。
在另一实施方案中,本发明提供了辅助展示载体GMCT、pMAG2、pMAL1、pMAL2、pMAT3、pMAT7和pMAT8。细菌辅助展示载体pMAL1(见图15A)和pMAL2(见图15B)包含一种表达盒,所述表达盒表达一种融合蛋白,所述融合蛋白包含与Lpp-OmpA细菌外膜结构域融合的适配体2。各酵母辅助展示载体指导融合蛋白的表达,所述融合蛋白包含与不同的酵母细胞外壁蛋白融合的适配体2(见图11)。更特别的是,pMAT3指导与Flo1的C端结构域融合的适配体2的表达,pMAT7表达适配体2Aga2融合蛋白,pMAT8表达适配体2Cwp2融合蛋白。
单独将跨物种或多物种表达载体导入相应宿主细胞(如大肠杆菌、酵母细胞或是哺乳动物细胞)会导致与第一适配体元件(本文称之为“适配体1”)框内(in-frame)融合的外源多肽的表达与分泌。本发明的表达载体与特定展示载体组(set)的相应辅助载体的共表达指导蛋白文库的外源多肽在遗传包装或宿主细胞表面展示。表面展示来自于特定载体组的辅助载体成分包含第二适配体元件(本文称之为“适配体2”),其依据配对指导第一适配体与第二适配体相互作用,所述适配体与外表面锚蛋白融合,外表面锚蛋白在用于展示蛋白序列文库的遗传包装或宿主细胞中是有功能的。
例如,将包含与噬菌体衣壳蛋白融合的适配体2的辅助载体与多物种或跨物种展示载体共表达,会产生在噬菌体颗粒上的展示的外源多肽文库,所述多物种或跨物种展示载体指导大肠杆菌细胞中外源多肽-适配体1融合蛋白表达。类似地,将包含与细菌外表面锚蛋白融合的适配体2的细菌辅助载体与多物种展示载体共表达,会产生细菌展示文库,所述多物种展示载体指导外源多肽-适配体1融合蛋白表达。或者,使用包含与酵母外表面锚蛋白融合的适配体2的酵母辅助载体与多物种展示载体会产生酵母展示文库,所述多物种展示载体指导外源多肽-适配体1融合蛋白表达。哺乳动物展示文库可通过共表达包含与哺乳动物细胞外表面蛋白融合的适配体2的哺乳动物辅助载体与本发明的多物种展示载体来制备。
在一个实施方案中,本发明提供了一种跨物种展示系统,该系统适于在原核和真核展示系统之间穿梭目标蛋白文库。更特别地,本发明为原核和真核宿主细胞中目标多肽序列总文库的序列展示提供了跨物种展示系统,不需要操作编码目标多肽序列的表达载体。
一般来说,本发明的每个跨物种展示载体组均包含1)展示载体,其包含一个或更多启动子,和编码与第一适配体序列框内融合的目标蛋白的跨物种表达盒;2)第一辅助载体,其编码由与外表面蛋白融合的第二适配体序列组成的融合蛋白,所述第二适配体序列通过配对方式和展示载体的第一适配体序列相互作用,所述外表面蛋白是由原核宿主表达的;以及3)第二辅助载体,其编码由与外表面蛋白融合的第二适配体序列组成的融合蛋白,所述外表面蛋白由真核宿主细胞表达。所公开的细菌/酵母跨物种展示载体包含以下几种功能元件:酵母启动子和后面的细菌启动子;细菌/酵母双功能信号序列;目标基因;适配体1编码序列;酵母转录终止序列。细菌辅助载体包含编码适配体2与细菌外表面蛋白的基因融合物的至少一个拷贝。适配体1与适配体2融合物在大肠杆菌细胞中的共表达会引起目标蛋白在大肠杆菌细胞表面的展示。相应地,酵母细胞中适配体1与适配体2融合物的共表达会引起目标蛋白在酵母细胞表面的展示。
本发明这一方面的特别实施方案提供了在噬菌体病毒颗粒(原核宿主细胞)以及酵母或哺乳动物细胞(真核宿主细胞)上依次展示目标蛋白或蛋白文库的方法。一般来说,噬菌体/哺乳动物细胞跨物种展示载体包含以下功能元件:(1)哺乳动物启动子和后面的细菌启动子;(2)细菌/哺乳动物双功能信号序列;(3)目标基因;(4)适配体1编码序列;(5)哺乳动物polyA序列。如US专利7,175,983所述,噬菌体的辅助载体包含病毒颗粒组装所必需的所有噬菌体基因,以及编码适配体2与外表面蛋白的蛋白融合物的至少一个拷贝。哺乳动物细胞的辅助载体包含表达适配体2融合物(fusion)与哺乳动物表面锚定信号的表达盒。适配体1与适配体2融合物在大肠杆菌中的共表达会导致目标蛋白在噬菌体颗粒表面的展示。相应地,适配体1与适配体2融合物在哺乳动物细胞中的共表达会导致目标蛋白在哺乳动物细胞表面的展示。
本发明的跨物种展示系统的一个实施方案提供了在大肠杆菌与哺乳动物细胞表面依次展示蛋白序列文库的系统。使用所公开的噬菌体/哺乳动物交叉展示载体及上述的细菌辅助载体,在大肠杆菌细胞中共表达适配体1和适配体2融合物会导致目标蛋白在细菌细胞表面的展示。相应地,使用噬菌体/哺乳动物交叉展示载体及哺乳动物辅助载体,适配体1与适配体2融合物在哺乳动物细胞中的共表达会导致目标蛋白在哺乳动物细胞表面的展示。
在另一实施方案中,本发明提供了在超过二个物种的接受者(recipient)宿主细胞上跨物种展示的方法。例如,本发明可用于蛋白序列文库在噬菌体、酵母或哺乳动物宿主细胞上以任何组合或顺序进行依次展示。噬菌体/酵母/哺乳动物细胞交叉展示载体包含:(1)哺乳动物启动子、在内含子序列中的酵母启动子,和位于内含子后面的短的细菌启动子;(2)在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中有功能的信号序列;(3)目标基因;(4)适配体1编码序列;(5)转录终止序列。单个物种的辅助载体如上面所述。相应地,通过使用噬菌体/酵母/哺乳动物交叉展示载体及每个物种的相应辅助载体,相应物种中适配体1与适配体2融合物的共表达会导致目标蛋白在噬菌体、酵母细胞或哺乳动物细胞表面展示。
本发明也提供了包含本发明的展示载体组的试剂盒,包括跨物种、多物种表达载体和适于指导多种原核、真核宿主细胞表面蛋白展示的辅助展示载体的特定组。例如,适用于指导噬菌体和哺乳动物宿主细胞表面上蛋白表达文库依次展示的跨物种展示试剂盒可包含有利于噬菌体展示的载体组pMAG9(图2)和GMCT(图4),以及在合适的包装中指导哺乳动物细胞表面展示的哺乳动物辅助展示载体pMAG2(图5)。或者,适用于指导酵母和哺乳动物细胞上蛋白表达文库依次展示的多物种展示试剂盒可包含载体组,所述载体组包括在合适的包装中用于哺乳动物细胞展示的载体pMAG9(图2)和pMAG2(图5),以及用于酵母展示的载体pMAT5(图10)和pMAT3(图11)。
本发明另一个实施方案包括含有本发明的辅助展示载体的宿主细胞。合适的原核宿主包括大肠杆菌细胞或噬菌体。合适的真核宿主是酵母细胞或哺乳动物细胞。优选的原核和真核宿主是丝状噬菌体病毒和酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞。
本发明的噬菌体/酵母跨物种展示载体组一般包含下述功能元件:(1)酵母启动子和后面的细菌启动子;(2)细菌/酵母双功能信号序列;(3)目标基因;(4)适配体1编码序列;和(5)酵母转录终止序列。如US专利7,175,983所述,噬菌体辅助载体包含病毒颗粒组装所必需的所有噬菌体基因,以及编码适配体2与外表面蛋白的基因融合物的至少一个拷贝。酿酒酵母的辅助载体含有指导融合蛋白的表达的表达盒,所述融合蛋白包含与酵母外壁蛋白融合的适配体2。适配体1与适配体2融合物在大肠杆菌细胞中的共表达会导致目标蛋白在噬菌体颗粒表面的展示。相应地,适配体1与适配体2融合物在酵母细胞中的共表达会导致目标蛋白在酵母细胞表面的展示。
本发明也提供了在可选物种(alternative species)的宿主细胞中表达可溶性蛋白的通用方法。使用本发明的表达载体能够在包括大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞的多种宿主细胞中可溶性表达蛋白,而不需要辅助载体,所述辅助载体包含融合蛋白,所述融合蛋白包含外表面锚蛋白与适配体序列,所述适配体序列能够通过配对的方式与相容的适配体序列相互作用,所述相容的适配体序列与跨物种表达盒的蛋白产物融合。使用本发明的多物种和跨物种表达/展示载体不需要对载体进行任何分子操作就能在不同的宿主细胞中依次产生目标蛋白。
在另一个实施方案中,本发明提供了多物种展示方法,该方法可用于在两种不同物种的原核或真核宿主细胞上展示目标蛋白或各种蛋白的蛋白文库。合适的原核细胞包括革兰氏阴性细菌细胞。合适的真核宿主包括酵母细胞(例如但不限于酿酒酵母细胞)或哺乳动物细胞。
在特定的多物种实施方案中,本发明提供了在酵母和哺乳动物细胞的细胞表面依次展示目标蛋白序列文库的方法。本发明的酵母/哺乳动物多物种展示载体包含以下功能元件:(1)哺乳动物启动子和位于内含子序列中的酵母启动子;(2)酵母/哺乳动物双功能信号序列;(3)目标基因;(4)适配体1编码序列;以及(5)酵母和哺乳动物细胞转录终止序列。酵母或哺乳动物细胞的辅助载体包含表达适配体2融合物与上述酵母或哺乳动物细胞表面锚定信号的表达盒。相应地,适配体1与适配体2融合物在相应物种中的共表达会导致目标蛋白在酵母细胞或哺乳动物细胞的表面展示。
另外,本发明提供了可用于分离目标蛋白的方法,所述蛋白的特征在于来自目标蛋白文库的所期望的蛋白特性。一个优选的方法是首先由展示在噬菌体上的蛋白序列文库鉴定具有所期望特性的蛋白,随后使用酵母或哺乳动物展示系统重新评估前导(lead)蛋白。例如,为了构建(engineer)人类蛋白,在噬菌体/酵母/哺乳动物细胞交叉展示载体上制造一个大容量(large size)文库(多样性>10e9),利用噬菌体展示技术的独特优势,该大容量文库可以随同噬菌体辅助载体首先在噬菌体展示框架(format)中产生,进行几轮文库淘选(panning)。从噬菌体筛选(多样性<10e6)得到的前导文库的DNA同酵母辅助载体一起被直接转化到酵母细胞,形成小型酵母展示文库。流式(FACS)分选酵母展示文库得到的前导物(leads)会具有期望的真核细胞产物的特性如折叠和糖基化,这两种特性将极有利于下游进程如发挥作用和生产。而且,如果需要的话,从酵母细胞展示分离得到的前导物可以直接展示在哺乳动物细胞表面以进行功能分析。
如果文库的容量适合构建酵母展示文库,本发明也提供了分离蛋白的方法,所述蛋白的特征在于酵母/哺乳动物细胞交叉展示文库中的所期望的结合特异性。使用本发明的酵母辅助展示载体,包含目标蛋白的文库可以首先展示在酵母细胞上。随后,由酵母文库筛选分离得到前导DNA可直接转染到哺乳动物细胞中进行第二轮细胞表面展示和筛选。上述的跨物种(酵母到哺乳动物细胞)可以不需要对表达/展示载体进行任何分子操作而实现。本发明的跨物种展示能力允许研究者进行筛选测试的同时对第一展示系统鉴定的前导物进行功能确认。
在另一实施方案中,本发明提供了分离信号序列的方法,所述信号序列具有所期望特性,例如跨多物种的功能。信号序列文库可以通过使用相应的跨物种展示载体构建。相应物种中具有功能的信号序列可以从相应物种的展示文库的穿梭筛选中分离得到。
附图简述
图1是本发明的跨物种和多物种展示系统的实验设计的图示。
图2A和2B提供噬菌体和哺乳动物细胞跨物种或多物种展示载体pMAG1(图2A)和pMAG9(图2B)的图示。在pMAG1和pMAG9载体中,适配体1融合蛋白的表达受哺乳动物启动子和细菌启动子的控制。
图3提供了卡那霉素抗性KO7Kpn载体噬菌体阳性克隆的抗噬菌体ELISA筛选结果的图示。克隆#C2、B3、B7、B9、A12代表了KO7kpn辅助噬菌体阳性克隆。F1和F2代表了亲代M13KO7噬菌体的两个阳性对照。
图4提供了噬菌体辅助载体GMCT的图示。载体包含编码与适配体GR2和KO7kpn噬菌体载体中Myc-tag融合的工程化基因III的附加拷贝的核苷酸序列。
图5提供了哺乳动物辅助载体pMAG2的图示,其产生包含与人类EGF受体跨膜结构域融合的适配体2的融合蛋白。
图6A和6B提供了使用跨物种展示载体pMAG9在大肠杆菌细胞(图6A)和哺乳动物细胞(图6B)中表达可溶性抗VEGF scFv的功能性表达测试结果的图示。数据显示培养物上清液中scFv抗体结合VEGF的活性,并显示载体pMAG9的跨物种表达功能。
图7A和7B显示用跨物种展示载体pMAG9和pMAT6在哺乳动物细胞中表达可溶性scFv的结果。图7A是使用抗HA抗体western印迹的结果,表明pMAG9和pMAT6载体由293细胞和COS细胞在细胞培养上清液分泌35KD scFv蛋白。图7B总结了ELISA实验结果,显示pMAT6载体表达在COS细胞上清液中的scFv结合VEFG的活性,以及载体pMAT6多物种表达功能。
图8显示了使用载体pMAG9的噬菌体表面scFv的功能展示。数据显示展示在噬菌体表面的抗VEGF scFv抗体的剂量依赖型VEGF结合活性。
图9A、B和C显示COS6细胞表面展示抗VEGF scFv的荧光显微图像。用pMAG9和pMAG2载体转染的COS6细胞在小室载玻片(chamber slides)中生长。转染细胞用抗HA抗体-Alexa Fluor-488(绿色)和DAPI(蓝色)核染色剂染色。图9A为融合(merged)染色模式。图9B为Alex Fluor-488染色,图9C为DAPI核染色。数据表明载体pMAG9的哺乳动物细胞展示功能。
图10A和10B提供噬菌体和酵母跨物种或多物种表达载体pMAT2和pMAT5的图示。图10A显示载体pMAT2的组分。图10B显示载体pMAT5的组分。在pMAT2和pMAT5载体中,适配体1融合蛋白的表达受酵母启动子和细菌启动子的控制。
图11A、B和C提供酵母辅助展示载体pMAT3、pMAT7和pMAT8的图示。这些载体中,适配体2与不同的酵母外壁蛋白融合:pMAT3为Flo1的C端结构域;pMAT7为Aga2;pMAT8为Cwp2。
图12显示了大肠杆菌细胞中用表达载体pMAT5的可溶性scFv功能性表达实验结果。ELISA数据显示TG1细胞培养上清液中抗VEGFscFv抗体的剂量依赖型VEGF结合活性。
图13显示用跨物种展示载体pMAT5在噬菌体表面上的scFv功能性展示。数据显示展示在pMAT5噬菌体表面上的抗VEGF scFv抗体的剂量依赖型VEGF结合活性
图14A和B提供酵母和哺乳动物跨物种或多物种表达载体pMAT4(14A)和pMAT6(14B)的图示。在载体pMAT4和pMAT6中,适配体1融合蛋白的表达受三种启动子的控制:哺乳动物、酵母和细菌启动子。信号肽在酵母和哺乳动物细胞中有功能。
图15A和B提供细菌辅助载体pMAT1(15A)和pMAL2(15B)的图示。这些载体包含了用于抗生素选择的氯霉素抗性基因(Cam),和用于适配体与细菌外膜Lpp-OmpA结构域融合的表达盒。
发明详述
在说明书和权利要求书中,除非特别说明,否则单数形式的“a”,“an”和“the”均包括复数。本文中的术语“物种(species)”是指因具有相对近期的共同祖先而在形态学、解剖学、生理学和遗传学上非常相似的一类生物体。尽管有其它方面的不同,不同的物种经常具有同样的特点,执行同样的生物功能。例如人类和小鼠的细胞公用某些分子标记,被认为属于同一物种(即哺乳动物细胞),而人类细胞和酵母细胞是真核宿主细胞的不同物种。
本文中的术语“遗传包装”是病毒或细胞,其中包装了编码目标蛋白的多聚核苷酸序列以进行表达和/或表面展示。
本文中的术语“多物种展示”是指一种允许研究者在不同类型的原核遗传包装(例如噬菌体或细菌)或不同类型的真核宿主细胞(例如酵母或哺乳动物细胞)表面依次展示编码多肽序列文库的多聚核苷酸序列不同的总文库的策略。例如一个多物种展示策略可以让抗体在酵母和哺乳动物细胞表面展示。
本文中的术语“跨物种展示”是指一种允许研究者在原核遗传包装和真核宿主细胞的表面展示编码蛋白序列文库的多聚核苷酸序列不同的总文库的展示策略。例如跨物种展示策略可以将抗体文库展示在噬菌体上,然后展示在酵母上
术语“原核系统”和“原核遗传包装”在本文中互换使用,是指原核细胞,如细菌细胞或是原核病毒如噬菌体及细菌孢子。
术语“真核系统”和“真核宿主细胞”在本文中互换使用,是指真核细胞,包括动物细胞、植物细胞、真菌和原生生物(protist)细胞和反转录病毒、腺病毒、杆状病毒(beculovirus)等真核病毒。
本文中的术语“基因”是指编码蛋白的DNA序列。该术语不包括不翻译的侧翼区,例如RNA转录起始信号、多腺苷酸化添加位点、启动子或增强子。
本文中的术语“表达盒”是指构成载体以表达重组蛋白或多肽的功能单位。一般它由一个或多个启动子,一个或多个核糖体结合位点以及表达靶标的cDNA组成。可以加入其它辅助性组分以构建表达盒。
本文中的术语“载体”是指一种核苷酸分子,能够自我复制,能将一段插入的核苷酸分子转入到宿主细胞。典型的载体是环状DNA,包括复制起始区域,选择标记,和/或病毒包装信号,和其它调控元件。载体、载体DNA、质粒DNA在本发明的描述中交替使用。这个名词包括主要功能是向细胞中插入DNA或RNA的载体,主要用于复制DNA或RNA的复制载体,用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达载体。同样也包括具有一个以上上述功能的载体。
本文中的术语“表达载体”是指多聚核苷酸分子,其导入合适的宿主细胞后可以转录翻译生成多肽片段。
本文中的术语“表达载体”,“多物种表达载体”和“跨物种表达载体”是指指导目标蛋白可溶性表达的载体,其中目标蛋白和适配体序列框内融合,所述适配体序列的特征是与本发明的辅助载体产生的适配体序列以配对的方式作用。
术语“辅助载体”是指遗传包装或是宿主细胞特异载体,其被设计用来生产融合蛋白,所述融合蛋白包含锚蛋白,所述锚蛋白与适配体序列框内融合,所述适配体序列的特征是与本发明的表达载体产生的适配体序列以配对方式相互作用。辅助载体同表达载体结合,能够通过共转染暂时被导入到受体宿主细胞,或者通过整合到宿主基因组永久导入受体的宿主细胞中。
本文中的术语“多物种展示载体组”指的是表达载体与设计成含有互补的适配体序列并具有在遗传包装或是宿主细胞的特定物种中展示多肽功能的辅助载体的特殊组合。例如用于哺乳动物细胞展示的pMAG9(图2)与pMAG2(图5)的载体组,用于酵母细胞展示的pMAT5(图10)与pMAT3(图11)的载体组。
本文中的术语“跨物种展示系统组”指的是表达载体与经过设计包含互补适配体序列并具有允许多肽顺序展示在原核与真核系统功能的辅助载体的特殊组合。例如促进噬菌体展示的载体组pMAG9(图2)和GMCT(图4),指导哺乳动物细胞表面展示的组合pMAG9(图2)和pMAG2(图5)。
本文中的术语“表达系统”通常是指一种适合的宿主细胞,它含有能够功能性表达期望的表达产物的表达载体。
本文中的术语“表面抗原”指的是细胞的细胞质膜成分。它包括内嵌和外周膜蛋白,糖蛋白,构成细胞膜的多糖和脂类。“内嵌膜蛋白”是指穿过细胞膜脂双层的跨膜蛋白。典型的内嵌膜蛋白包含至少一个具有疏水氨基酸残基的“跨膜片段”。外周膜蛋白不伸入到脂双层的疏水内部,它们通过与其它膜蛋白的非共价键作用结合到膜上。
本文中的术语“外表面锚蛋白”指的是被整合或是粘附在遗传包装外表面的多肽,或是蛋白,或是蛋白的结构域。它可以是天然的,也可以使通过任何途径人工形成的。本文中与该名词交替使用的名词有“膜锚蛋白序列”、“信号衣壳蛋白”、“外表面序列”、“外膜蛋白”、“膜锚蛋白”、“锚蛋白”、“细胞壁蛋白”、“GPI锚蛋白信号”和“信号锚蛋白序列”。
术语“信号序列”和“前导(leader)序列”在本文互换使用,是指一段编码分泌肽的DNA序列,其中分泌肽在DNA水平上是一个更大的肽的组成成分。它也可以指分泌肽的氨酸序列。分泌肽的功能是指导更大的多肽通过细胞分泌途径。
本文中的术语“多聚核苷酸”、“核酸”和“核苷酸”可互换使用。它们指的是任何长度核苷酸的多聚形式,可以是脱氧核苷酸或是核糖核苷酸或是其它类似物。多聚核苷酸可能具有三种空间结构,多种知道的或未知的功能。以下为几种多聚核苷酸的例子:基因或基因片段的编码或非编码基因、连接位点、外显子、内含子、信号RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多聚核苷酸、支链多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多聚核苷酸可能包含经过修饰的核酸,如甲基化核酸以及核酸类似物。对核酸结构的修饰可能发生在多聚物聚合之前或之后。核酸序列中可能插入非核酸成分。在聚合之后,核酸序列可能要经过进一步的修饰,如与标记成分连接。
本文中的术语“氨基酸”只是天然和/或非天然或是合成的氨基酸。包括氨基乙酸,D或L型异构体,氨基酸类似物和模拟肽。
本文中的术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“目标蛋白”可互换使用,指的是所有长度的氨基酸多聚物。多聚物可以是线形的、环形的和分支状的。它可能包括经过修饰的氨基酸,也可能插入非氨基酸物质。这个名词也包括被修饰的氨基酸多聚物,如经过硫化、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化、碘化、甲基化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、消旋化、硒化、转运RNA介导的蛋白质添加氨基酸作用,如精氨酰化、泛素化或其它的操作如与标记成分连接。
本文中的术语“抗体”指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性成分,例如含有特异性结合(免疫作用)抗原的抗原结合位点的分子。从结构上来说,最简单的天然发生的抗体(如IgG)包括四段肽链,两条重链(H)和两条轻链(L),之间由二硫键连接。免疫球蛋白代表了一个大的分子家族,该家族包括多种分子,如IgD、IgG、IgA、IgM和IgE。“免疫球蛋白分子”包括了如杂交抗体、嵌合抗体,人类化抗体等类似片段。抗体片段的非限制性示例包括了由VL、VH、CL和CL结构域组成的Fab片段;(4)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(5)由抗体单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;(6)F(ab’)2片段,该二价体片段包含两条Fab片段,在铰链区由二硫键桥连接;(7)由带有短接头的两条相同的单链Fv组成的双价小分子;(8)由通过一对卷曲螺旋结构域稳定的Fv组成的ccFv抗体。
本文中的术语“配对相互作用”指的是两个适配体可以相互作用,一个与另一个结合形成稳定复合物。这个稳定复合物必须持续足够长时间以便多肽能够被包装展示到遗传包装的外表面。该复合物或是二聚体必须能够承受各种已经存在的或是在合成或是检测展示多肽的时候产生的环境,这些环境是正在发生的反应或是检测的一个功能。
本文中的术语“宿主细胞”指的是可以容纳或是已经容纳目标载体的单个细胞或者细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的祖先。因为天然地、偶然的或是有意的突变,始祖细胞也许与原始亲代细胞不完全相同(总DNA的形态学和基因组学)。体内转染进本发明的载体的细胞属于宿主细胞。
本文中的术语“总文库(repertoire)”指的是功能性或是物理性起源的不同成员的总集合。文库是同源的不同成员的总集合。一般来说,总文库所描述的功能和物理范围更宽、更大。因此,总文库包括功能上限定的文库,例如一个物种中的免疫球蛋白的所有遗传容量(capacity)就是免疫球蛋白的总文库;为了构建蛋白,文库经常用来指起源于一个或固定数目祖先的不同分子的集合。某种实用目的(如产生治疗性抗体)的总文库,包括了所有为此目的产生的文库。
本文中的术语“适配体”指的是补充元件或成分,基于两个不同的相互作用的适配体间物理和/或功能上的匹配,适配体彼此能够通过配对作用结合形成物理联合体。适配体可以是来源于天然或是人工合成的蛋白质、蛋白质结构域、肽、非多肽化合物等。适配体典型的例子包括形成卷曲螺旋(coiled-coil)异二聚体的两个相互作用的多肽,如GR1和GR2(如SEQ#.19和20所示);c-fos和c-jun;天然和人工亮氨酸拉链等;源于配体与其对应的受体间特异性结合的特异性蛋白-蛋白相互作用;两个不同蛋白的异二聚体复合物形成功能单元等;两个不同的非多肽复合物(如生物素与链亲和素(strepavidin))的特异性结合等。本发明中描述的表面展示所用的适配体可以是宿主细胞内源的和/或外源的,和/或是人工合成的。
如本文所用,如果两段序列大量的氨基酸或是核苷酸序列同源性,那么一段多肽的线性序列对与另一个线性序列是“本质上相同的”。一般本质上相同的序列在经过同源区域比对后,至少要彼此至少约60%相同。优选地,序列至少约70%相同;更优选地,序列至少约80%相同;更优选地,序列至少约90%相同;更优选地,序列至少约95%相同;更优选地,序列100%相同;。
现有的真核展示系统
噬菌体展示
多肽在遗传包装表面的展示体现了一套强大的多肽序列文库筛选的方法。构建巨大分子多样性文库与选则预期特性分子的能力让这个技术广泛应用在很多申请中,包括筛选/发现说明说和分子进化说明书。噬菌体展示起源于1980s,George Smith通过将外源序列同噬菌体衣壳蛋白融合,首先在细菌噬菌体M13病毒颗粒表面表达外源性蛋白片段(Science(1985)228:13151317)。从那以后,在George Smith的发现上发展出一系列展示系统。这些系统背分成2大类(U.S.Pat.Nos.5,969,108和5,837,500)。第一代系统是单载体系统。系统中的载体包含整个噬菌体基因组,其中与衣壳蛋白基因框内插入外源序列。因为所得噬菌体颗粒带有整个噬菌体基因组,所以它们相对不稳定而且感染性比较低。第二代系统,一般指的是噬菌粒(phagemid)系统,有两个成分:(1)带有与噬菌体衣壳蛋白融合的外源序列的噬菌粒载体,和由噬菌体衍生的复制起点,能够允许噬菌粒包装成噬菌体颗粒;(2)携带噬菌体包装需要的所有其它序列的辅助噬菌体。
辅助噬菌体典型复制缺陷,如Amershanm Pharmacia Biotech生产的M13KO7辅助载体和Stratagen生产的它的派生物VCSM13。基于带有辅助噬菌体的细菌细胞的强大侵染力,带有噬菌粒载体并展示外源序列的新的包装噬菌体产生了。就其本身来说,现有的噬菌粒需要外源序列与至少一个噬菌体外表面序列(即衣壳蛋白序列)的部分融合。虽然基因VI、VII和IX融合无都被报道过,但是最常用的融合蛋白或展示位点是在M13细菌噬菌体基因III和VIII。
取代衣壳蛋白融合系统,对融合噬菌粒系统的各种修饰都被描述过。Crameri et al.发展了一套展示cDNA产物的系统,系统中Fos癌基因被插入到外源基因的临近位置展示在噬菌粒载体上,Jun癌基因插入到同一个载体的临近基因III的位置(见Crameri et al.(1993)Gene137:6975)。Carmeri方法利用了fos和jun蛋白间的优选地相互作用:因为Fos-外源多肽表达并分泌在周质空间,它与pIII-jun形成了复合物,基于强大的侵染力与M13ko7辅助噬菌体一起随后被包装进噬菌体颗粒。
Crameri系统的一个相似的变化是WO 01/05950,US专利6753136所描述的“半胱氨酸偶联”展示系统。外源多肽的附属与展示是通过细菌周质空间中两个半胱氨酸之间二硫键的形成所介导,其中一个半胱氨酸位于外源序列中,另一个被插入在外表面序列中。虽然这两个系统都避免了外源蛋白与外表面蛋白连接的融合蛋白的表达,但是因为展示载体中衣壳蛋白pIII的组成型表达,系统不能够减小衣壳蛋白对宿主细胞的毒性。而且两个半胱氨酸之间二硫键的形成需要高水平表达的外源序列和衣壳蛋白pIII。因此,表达水平低的细胞都不能展示。
最近,Wang等人在适配体指导展示系统(US专利7,175,983)基础上提出了一个替换的噬菌体展示系统。它包括:(a)表达载体,包含编码外源多肽与第一适配体框内融合的编码序列;(b)辅助载体,包含了编码包装噬菌体颗粒必须得外表面蛋白的外表面序列,其中外表面蛋白与第二适配体框内融合。因此,外源多肽的展示是通过第一适配体与第二适配体间的配对作用完成的。
大肠杆菌展示
大肠杆菌表面的多肽展示发展成为噬菌体展示技术的另一个选择。同噬菌体展示,由于各种基因工具和突变菌株的可用性以及他的高转化率使他成为大容量文库构建和筛选的理想细胞,大肠杆菌展示成为一个极具吸引力的方法。在革兰氏阴性的大肠杆菌中,表面展示系统是基于将要展示的蛋白与各种已经报导过的锚蛋白融合的基础上的。用于展示的锚蛋白有外膜蛋白(Chang and Lo 2000,J Biotechnol78:115-122;Lee et al.2004,Appl Environ Microbiol 70:5074-5080),菌毛和鞭毛(Westerlund-Wikstrom et al.1997,Protein Eng 10:1319-1326),经过修饰的脂蛋白(Georgiou et al.1996,Protein Eng 9:239-247),冰核蛋白(Jung et al.1998,Nat Biotechnol 16:576-580)和自主转运蛋白(Veiga et al.2003,J Bacteriol 185:5585-5590)
现有的真核展示系统酵母展示技术
异源蛋白在真核宿主细胞酿酒酵母细胞壁上的展示首先在1993被报道,报道中α-半乳糖苷酶与C端半细胞壁蛋白α凝集素AGA1的一半融合(Schreuder MP et al,Yeast 9:399-409)。从那以后,各种酵母展示系统都是建立在目标蛋白与各种已经被报导过的各种细胞壁蛋白(Kondo M et al,review)融合基础上。几乎所有的适用于酵母细胞的细胞表面展示系统都是糖基化磷脂肌醇(GPI)锚蛋白依赖性的。很多C端具有一个公认的GPI附属信号的酵母细胞壁蛋白具有展示多肽和蛋白的能力,这些多肽和蛋白包括酿酒酵母中a-凝集素(Aga1和Aga2)、Cwp1、Cwp2、Gas1p、Yap3p、Flo1p、Crh2p、Pir1、Pir2、Pir4和Icwp;多形汉逊酵母中HpSED1、HpGAS1、HpTIP1、HPWP1、白色念珠菌中Hwp1p、Als3p、Rbt5p。迄今为止,大约20个异源蛋白质成功在酵母细胞表面展示。
上述所有细胞表面展示系统中,Dane Wittrup发明的基于a凝集素受体的系统广泛使用在展示各种多肽和蛋白如scFv抗体和抗体文库(US patent 6300065,6423538,6696251和6699658)。在酿酒酵母中,α凝集素受体作为粘连分子稳定细胞与细胞间的相互作用,促进匹配“a”与α单适配体酵母细胞间的融合。受体由核心亚单位Aga1和小亚单位Aga2组成。Aga1从细胞中分泌,并与酵母细胞壁外基质中的葡聚糖共价连接。Aga2通过两个二硫键与Aga1结合,很可能发生在高尔基体,Aga2分泌后通过Aga1与细胞保持连接。这个酵母这那是系统利用了Aga1与Aga2蛋白结合的优点通过将蛋白与Aga3亚单位的融合在酵母细胞表面展示重组蛋白。
Wittrup系统适用于多链多肽如免疫球蛋白Fab片段(Hufton et al,US patent application 20030186374 A1)。Hufton等人提出把Fos/Jun之间相互作用作为在真核细胞中适用的展示系统的基础的可能性。尽管如此,Hufton等人没有提供一个有力的描述解释Fos/Jun之间的相互作用是如何用来指导蛋白在真核宿主细胞里展示。不管怎样,参考中仅提到如何用Dane Wittrup开发的Aga2融合物(US专利6300065,6423538,6696251和6699658)用于Fab抗体的酵母展示,以及如何运用分子克隆将噬菌体展示载体中的基因转到酵母载体中。
哺乳动物细胞展示
许多方法通过与各种细胞膜锚蛋白融合用来完成蛋白在哺乳动物细胞表面的展示,其中细胞膜锚蛋白包括了细胞表面受体的细胞膜结构域(Chesnut et al,1996,J Immunological Methods;Ho et al,2006,PNAS,103;9637-9642)、GPI锚序列(US patent 6838446)、II型信号锚序列(US patent 7125973)。一个典型的例子是pDisplay载体,它是一个商业载体,能够在Invitrogen Corp提供的哺乳动物细胞表面展示蛋白。另一个方法在US专利6919183中被报导。在这个系统中,细胞表面捕获分子如G蛋白,A蛋白在哺乳动物细胞表面捕获抗体分子。
本发明的多物种和跨物种展示系统
噬菌体展示在很多实验中是最常用的技术,例如筛选受体配体,抗体构建和蛋白抗原决定簇识别。由于噬菌体基因操作的方便与高效,单个噬菌体文库中很多大容量文库的容量能达到109。然而,噬菌体系统仅能用于翻译后修饰和其它非必须的或是非期望的细胞内处理。对于大多数真核蛋白,如抗体片段,他们的生物学功能与糖基化等细胞内处理有关。而且,一些真核蛋白在原核细胞中不能功能性折叠。
外来蛋白在真核细胞表面的展示克服了原核系统的限制性。它允许表达的真核蛋白折叠和糖基化,允许展示相对大的蛋白。尽管如此,真核细胞转化的低效率限制了它的应用,只能形成小容量文库,不可能与噬菌体展示系统提供的文库匹敌。
因此,发展结合真核和原核展示技术优点的展示系统是最终的挑战。当目标蛋白与特意的外表面序列融合,该蛋白可以展示在相应物种的表面。为了从噬菌体展示系统转入酵母展示系统,Hufton等(US专利申请20030186372 A1)阐述了一种方法,能够利用剪切和连接将目标基因从原核展示载体(噬菌体pIII衣壳蛋白融合载体)转入到真核展示载体(酵母Aga2融合载体)。
本发明提供了一种新的多物种展示系统。更具体地说,利用同样的展示载体,不需要任何DNA剪切和克隆等分子操作,目标蛋白便能在多物种如噬菌体,细菌细胞,和/或酵母细胞,和/或哺乳动物细胞表面展示。此外,该展示系统提供了跨物种展示方法的功能。例如,使用本发明的载体组,目标蛋白可以展示在原核系统中,如噬菌体和细菌细胞中,随后蛋白或多种目标蛋白(对蛋白重组文库而言)同样能展示在真核细胞(例如酵母细胞或哺乳动物细胞)的表面,而不需要任何对载体的分子操作。本发明的每个展示系统利用了特定的展示载体组。本发明的不同的载体组包括了多物种表达载体,该载体编码与第一适配体(即适配体1)融合的多肽序列文库,以及遗传包装或宿主细胞特异性的辅助载体。每个辅助载体包含了细胞表面锚蛋白,其与第二适配体(即适配体2)融合。如本文所示,多物种展示载体与包含相应适配体的辅助载体的共表达,形成了遗传包装(或是宿主细胞)的集合,其具有通过适配体(即适配体1和适配体2)的配对作用展示在表面的多肽序列总文库。
载体的成分
适配体
适于构建目标展示系统的展示载体和辅助载体的适配体序列来源广泛。大体上,可参与形成稳定多聚体的任何蛋白序列都可以成为适配体序列。
而且,这些序列可能来自任何同源多聚体或异源多聚体蛋白复合物。现有的同源多聚体蛋白有同二聚体受体(如血小板生长因子同二聚体BB分子(PDGF)),同二聚体转录因子(如马科斯同二聚体,NF-kappa B p65(RelA)同二聚体),和生长因子(如神经营养因子同二聚体)。异源多聚体蛋白的非限制性例子有蛋白激酶与包含SH2结构域蛋白的复合物(Cantley et al.(1993)Cell 72:767 778;Cantley etal.(1995)J.Biol.Chem.270(44):2602926032),异源转录因子和异二聚体受体。
已经知道了大量的异二聚体受体,其中包括但不限于结合生长因子(如heregulin)的受体,神经递质(如γ氨基丁酸),和其它有机或无机小分子(如盐皮质激素、糖皮质激素)。优选的异二聚体受体有核激素受体(Belshaw et al(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A93(10):46044607),erbB和erB2受体复合物以及G蛋白偶联受体家族如opioid(Gomes et al.(2000)J.Neuroscience 20(22):RC110);Jordanet al.(19999)Nature 399:697700)、毒蕈碱、多巴胺、5-羟色胺、腺苷、多巴胺和γ氨基丁酸受体B亚家族。发现对于大多数已知的异二聚体受体,它们的C端序列介导了异二聚体的形成。
GABAB-R1/GABA-R2受体具有上述物理性质,这两个受体基本上不能够在生理环境(如体内)和体温下形成同二聚体。Kuner等人与White等人(Science(1999)283:7477);Nature(1998)396:679682)的研究已经发现了这两个受体在体内异二聚体化的特异性。事实上,White等人基于这对异二聚体的专有特异性从酵母细胞中克隆到GABAB-R2。Kammerer等人(Biochemistry,1999,38:13263-13269)做的体内研究显示:当实验温度为体温时,GABAB-R1和GABAB-R2C末端序列都不能在生理缓冲条件下形成同二聚体。特别的是,Kammerer等人通过沉降实验说明当单独测试时,GABAB受体1和2的异二聚体序列在生理环境及体温下沉降在单体分子质量处。当两者以等摩尔数混合时,GABAB受体1和2异二聚体序列沉降在两端序列异二聚体分子质量处(见Kammerer等人文章的图1)。尽管如此,当GABAB-R1和GABAB-R2C末端序列连接半胱氨酸残基,同二聚体便会通过二硫键的形成而发生。
多聚体形成中所涉及的多种卷曲螺旋可以在目标展示系统中作为适配体。优选的卷曲螺旋来源于异二聚体受体。因此,本发明包括来源于GABAB受体1和2的卷曲螺旋适配体。目标卷曲螺旋适配体包括GABAB受体1的C末端序列,即本文所提到的GR1(SEQ ID NO:19)EEKSRLLEKENRELEKILAEKEERVSELRHQLQSVGGC;和GABAB受体2的序列,即本文所提的GR2(SEQ ID NO:20)TSRLEGLQSENHRLRMKITELDKDLEEVTMQLQDVGGC。
需要理解的是,虽然这些例子描述了包含同样适配体序列配对(指的是表达载体中的适配体1和辅助载体中的适配体2)的载体组的使用,但是使用其它的适配体和这里所描述的载体,可对本发明中的方法进行实践。例如,基于本文所提供的发现,合适适配体序列能够从大量包含卷曲螺旋结构域中任何一个得到。这些卷曲螺旋序列包括Winzip-A2B1(Katja M Arndt et al,Structure,2002,10;1325-1248);Winzip-A1B1(Katja M Arndt et al,JMB,2000,295:627-639);FNfn10(Sanjib Dutta et al,Protein Science,2005,14;2838-2848),IAAL-E3/K3(Jennifer R.Litowski and Robert S Hodges,JBC,2002,277(40):37272-37279),PcrV/PcrG(Max Nanao et al,BMC Microbiology,2003:1-9),bZip及其衍生物(Jumi A.Shin,Pure Appl.Chem.,2004,76(7-8):1579-1590),ESCRT-I/II(David J.Gill et al,The EMBO Journal,2007,26:600-612),EE1234/RR1234及其衍生物(Johnthan R.Moll et al,Protein Science,2001,10:649-655),Laminin a、b、g,.(Atsushi Utani et al,JBC 1995,270(7):3292-3298),Peptides A/B及其衍生物(Ilian Jelesarovand Hans Rudolf Bosshard,JMB,1996,263:344-358),人工设计的肽(Derek N.Woolfson and Tom Alber,Protein Science,1995,4:1596-1607),DcoH-HNF-pl(Robert.B Rose et al,Nat.Struct.Biol.,2000,7(9):744-748),以及APC肽(Catherine L.Day and Tom Alber,JMB,2000,301:147-156)。
依赖于适配体亚基与适配体亚基的特殊配对之间作用的紧密程度,不需使用二硫键稳定卷曲螺旋相互作用是可能的。例如,文章中报导的一些上述列出的卷曲螺旋结构域结合的程度变化范围为从.00001nM到70nM(Winzip-A2B1为4.5,Winzip-A1B1为24nM,FNfn10为3nM,IAAL-E3/K3为70nM,PcrV/PcrG为15.6nM,EE1234/RR1234及其衍生物为0.0001nM)。
适合做适配体的替代的异二聚体转录因子有α-Pal/Max复合物和Hox/Pbx复合物,Hox代表了大的与胚胎发育过程中与前后轴形成相关的转录因子家族。Hox蛋白通过三个α螺旋同源结构域与DNA结合。为了结合特异性DNA序列,Hox蛋白需要像Pbx同源结构域一样的同源伙伴。Wolberger等人解决了HoxB1-Pbx1-DNA三元复合物的2.35.ANG晶体结构,以了解Hox-Pbx复合物是如何形成的以及该复合物如何与DNA结合。该复合物的晶体结构显示了每个结合DNA反面临近识别序列的蛋白同源结构域。
同二聚体通过六肽N末端与HoxB1同源结构域之间的连接和Pbx1中螺旋3和1、2螺旋形成的口袋而发生。Pbx1同源结构域的C末端形成了α螺旋,该螺旋与螺旋1作用形成一个更大的四螺旋同原序列(Wolberger er al.(1999)Cell 96:587 597;Wolberger er al.J MolBiol.291:521530)。
例如,从典型异源多聚体得来的序列可以作为适配体。在这种条件下,与异源多聚体形成相关的候选序列的鉴定可以不需要其它多于的实验,使用任何基因或生化实验便能决定。另外计算机模型及搜寻为基于出现在相同或不同的基因中的相同结构域的序列同源性的异源多聚体的检测提供了便利。允许同源搜索的非限制性的例子有Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)、Fasta(Genetics ComptingGroup package,Madison,Wis)、DNA Star、Clustlaw、TOFFEE、COBLATH、Genthreader和MegAlign。包含靶受体或片段的DNA序列的任何序列文库可以用于序列分析。普遍使用的数据库有GenBank、EMBL、DDBL、PDB、SWISS-PROT、EST、STS、GSS和HTGS等。
来源于异二聚体序列的合适的适配体通过他们的物理特性能够进一步表征。优选的异二聚体序列展示了能够引起异二聚体主导形成到同二聚体的分离的两两亲和力。优选地,主导形成能够得到包含至少60%异二聚体的异源多聚体文库,更优选至少80%异二聚体,更优选至少85-90%异二聚体,更优选90-95%异二聚体,最好能够达到96-99%异二聚体,能够允许在生理缓冲环境和/或体温下形成。在本发明的某些实施方案中,至少一个适配体对的异二聚体序列基本上不能在生理缓冲环境和/或体温下形成。“基本不能”指的是当单独测试时,选择的异二聚体序列在体内沉降实验中(Kammerer et al.(1999)Biochemistry 38:1326313269中描述)或体内双杂交酵母分析中(见White et al.Nature(1998)395:679682)不能得到同二聚体可检测的数目。另外,每个异二聚体序列能够在宿主细胞中表达,宿主细胞中同二聚体的丢失可以通过SDS-PAGE、Western印迹及免疫沉淀等一系列蛋白分析手段测出。体外实验必须在生理缓冲环境和/或最好是体温下进行。一般来说,生理缓冲条件包含了生理浓度的盐分以及调整到中性约6.5-7.8范围内变化的PH值,最好是从约7.0-7.5。各种生理缓冲条件在Sambrook et al.(1989)supra中列出,这里将不详述。优选的生理环境在Kammerer等人的文章(Biochemistry,1999,38:13263-13269)中进行了描述。
根据适配体的二级结构,适配体可被进一步表征。优选的适配体结构中包含两亲性的形成卷曲螺旋结构的多肽。螺旋的卷曲螺旋是一种重要的蛋白中低聚序列亚基。第一序列分析检测出大约23%的卷曲螺旋蛋白质残基(Wolf et al.(1997)Protein Sci.6:11791189)。已经表明过含有卷曲螺旋结果的蛋白有细胞骨架蛋白(例如α角蛋白、波形蛋白),细胞骨架运动家族(例如肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白),病毒膜蛋白(例如Ebola或HIV膜蛋白),DNA结合蛋白和细胞表面受体(例如GABAB受体1和2)。
广义上讲,现有研究中的卷曲螺旋适配体被分为两组,即左手和右手卷曲螺旋。左手卷曲螺旋的特征是具有七肽重复的“abcdefg”,无极性残基一般位于第一个(a)和第四个(d)之间。两个位点之间的残基组成了一个“钮洞(knobs and holes)”的zig-zag模式,与其它成分形成紧凑的疏水中心。相比之下,覆盖了卷曲螺旋外围的第二个(b)、第三个(c)和第六个(f)位置是优选的带点残基。带电的氨基酸的例子包括了基本的残基如赖氨酸、精氨酸、组氨酸和酸性残基如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。适合形成异二聚体卷曲螺旋的未带电的或极性的氨基酸有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸。未带电的残基基本上形成了疏水中心,而包含带电残基的甚至在中心位置的螺旋间或螺旋内的盐桥也许能用来稳定整个螺旋的卷曲螺旋结构(Burkhard.et al(2000)J.Biol Chem.275:1167211677)。尽管各种长度的卷曲螺旋都很能适用,目标卷曲螺旋适配体优选地含有两个到十个七肽(heptad)重复。更好的是,适配体包含三个到八个七肽重复结构,优选包含四到五个七肽重复。
在设计的理想的卷曲螺旋适配体中,很多已经存在计算机软件程序能够预测可以使用的多肽的二级结构。一个例示性的计算机分析用COILS算法将一段氨基酸序列与已知的双链卷曲螺旋数据库中序列进行比较,并预测出卷曲螺旋伸展的高可能性(Kammerer et al.(1999)Biochemistry 38:1326313269)。基于设计与选择,亲和力从纳摩尔到飞摩尔(fentomole)的很多构建的卷曲螺旋序列被报导(Structure,2002,10(9):1235-48;J Mol Biol.2000,21,295(3):627-39;Protein Sci.2005,14(11):2838-48;J Biol Chem.2002,277(40):37272-9;BMC Microbiol.2003,18;3:21;Protein Science,2001,10:649-655)。例如,从人类B-AIP而来的重新设计的异二聚体卷曲螺旋序列具有飞摩尔解离常数,同生物素/抗生物素之间作用。
另一个优选的卷曲螺旋适配体是亮氨酸拉链。亮氨酸拉链曾被定义为含有大概35个氨基酸,其中有45亮氨酸残基,亮氨酸之间被六个氨基酸分隔(Maniatic and Abel,(1989)Nature 341:24)。亮氨酸拉链已被发现存在于各种真核DNA结合蛋白如GCN4,C/EBP,c-fos基因产物(Fos),c-jun基因产物(Jun)和c-Myc基因产物。这些蛋白中,亮氨酸拉链产生了二聚体相互作用,包含亮氨酸拉链的蛋白也许会在这里形成稳定的同二聚体和/或异二聚体。c-fos和c-jun两个原癌基因编码的蛋白产物的分子分析显示了优选地异二聚体结构(Gentz etal.,(1989)Science 243:1695;Nakabeppu et al.,(1988)Cell 555:907;Cohen et al.,(1989)Genes Dev.3:173)。包含Fos和Jun亮氨酸拉链区域的合成多肽已经被显示介导异二聚体的形成,而且,当合成多肽的每个氨基酸末端包含半胱氨酸残基从而允许分子间二硫键形成时,异二聚体的形成基本上排除了同二聚体化。
本发明的亮氨酸拉链适配体具有具有通式结构,称为七肽重复(亮氨酸-X1-X2-X3-X4-X5-X6)n,其中X可以是通常的20个氨基酸中的任何一个,但是最有可能是具有形成α螺旋结构潜质的氨基酸,如丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸。n可以是2或以上,典型地是3-10,优选是4-8,更优选是4-5。优选的序列是Fos和Jun亮氨酸拉链。
与L和H链二聚化相关的抗体链的序列同样也可以用作适配体,构建目标展示系统。这些序列包括但不限于L和H链的恒定区序列。另外,适配体序列可来源于抗原结合位点序列和它结合的抗原。这种情况下,成对适配体中的一个包含抗原结合位点氨基酸残基,它能被其它含有相应抗原残基的适配体识别(即能够稳定地相互作用)。
第一适配体与第二适配体之间的配对相互作用可以是共价或是非共价相互作用。非共价相互作用包含了每一种存在的不能引起共价键形成的稳定连接。非共价相互作用的非限制性例子包括静电结合、氢键、范德华力、两性肽的空间交替分布(steric interdigitation)等。相反,共价相互作用引起共价键形成,包括但不限于两个半胱氨酸残基间的二硫键,两个含碳分子间的C-C连接,碳分别与含氧或含氢分子间的C-O或C-H连接,以及含氧与含磷分子的O-P连接。
基于丰富的大量基因家族的遗传和生化数据,普通技术人员能够筛选并获得适合的适配体序列用来构建目标展示系统,而不需要多余的实验。
外表面锚蛋白
合适的噬菌体展示锚蛋白包括了任何一种衣壳蛋白,如pIII、pVI、pVII、pVIII和pIX,或是这些衣壳蛋白的结构域,或是任何一个能够聚集或是连接在噬菌体颗粒外表面的人工序列。如实施例7所示,scFv抗体使用辅助载体YGMCT展示在噬菌体上,这里外表面锚蛋白是图4中所说明的pIII的C末端结构域。
合适的细菌展示锚蛋白包括了细菌外表面膜蛋白如菌毛和鞭毛,脂蛋白,冰核蛋白及自动转运蛋白。锚蛋白也可以是能够聚集或是连接在大肠杆菌外表面的人工序列。实施例29-32显示了通过辅助载体pMAL1和pMAL2的使用展示scFv,这里细菌外表面结构域Lpp-OmpA是外表面锚蛋白。
对于酵母展示,合适的外表面锚蛋白可以使任何一个外表面壁蛋白,该蛋白有或没有GPI信号,包括酿酒酵母中的α凝集素(Aga1和Aga2;注:Aga1具有GPI,Aga2没有)、Cwp1、Cwp2、Gas1p、Yap3p、Flo1p、Crh2p、Pir1、Pir2、Pir4和Icwp;多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)中的HpSED1、HpGAS1、HpTIP1、HPWP1,白色念珠菌(Candida albicans)中的Hwp1p、Als3p、Rbt5p。或者使用可以组装或是粘附到酵母外壁的人工序列的细胞表面锚蛋白,本发明的方法可以在酵母中实现。实施例18显示了借助辅助载体pMAT3或是pMAT7或pMAT8scFv抗体的酵母展示,这里酵母外表面锚蛋白来自图11中描述的Flo1、Cwp2或是Aga2的C末端序列。
通过使用任何一种已知的细胞膜蛋白的跨膜结构域或是含有GPI锚序列多肽或是裂解II型信号锚序列作为表面锚蛋白,哺乳动物细胞表面展示便能实现。或者,使用能够聚集或是连接到哺乳动物细胞膜上的人工序列的细胞表面锚蛋白,本发明的方法也能实现。实施例8显示了通过使用辅助载体pMAT2(图5)scFv展示在哺乳动物细胞膜上。这里人类EGF受体的跨膜结构域与适配体2的融合蛋白是用来展示的表面锚蛋白。
信号序列
原核细胞和真核细胞中的信号序列都是按照同样的通用路线构建而成。它们大约有15-30个氨基酸的长度,由3个区域构成:带正电的N-末端区域,中心的疏水区域,和极性C-末端区域。在原核细胞和真核细胞系统的信号肽中存在着巨大的功能和结构同源性。因此,可以预期一些天然(native)信号肽可以作用于原核细胞和真核细胞。
与所期待的一致,有报导证实一些真核细胞中的信号肽可以作用于原核细胞。例如,来源于人类生长激素的信号肽和大鼠前胰岛素蛋白信号肽可以作用于大肠杆菌(Gene,1985,39:247-254);酵母信号肽的内源性-β-1,3-葡聚糖酶同样可以作用于大肠杆菌(Protein Exp.Puri,2000,20:252-264)。另外,原核细胞的信号肽葡萄球菌蛋白A,细菌b-内酰胺酶蛋白和细菌OmpA可以作用于哺乳动物细胞(Humphreys et al,Protein Exp.Purif.2000,20:252-264)。实施例6和7显示来自人类生长激素1的信号肽可以作用于大肠杆菌细胞,起着scFv分泌和噬菌体展示的作用。同样,酵母信号肽的内源性-β-1,3-葡聚糖酶作用大肠杆菌,起着scFv分泌和噬菌体展示的作用,在本发明的实施例16和17中得到描述。
例如,来自于人的信号肽,如:胰脂肪酶蛋白1(HPLRP1),干扰素,胆盐刺激脂酶,酿酒酵母蔗糖酶(SUC2)(Tohoku J Exp Med,1996,180:297-308;Protein Exp.Puri,2006,47:415-421;Protein Exp.Purif,1998,14:425-433),它们的作用横跨酵母和哺乳动物细胞。实施例22证明人胰脂肪酶蛋白1信号肽用于酵母/哺乳动物横跨物种展示。
以上所确定的任何一个天然信号肽在多个物种中具有功能,基于这个发现,在本发明中用这类信号肽做多物种的表达载体。另外,人工信号肽的特征是在不同物种的宿主细胞中都能发挥功能。这种人工信号肽序列可以从设计的信号肽文库中通过实施例28所公开描述的方法所获得,或者也可以通过其它方法。
本发明的载体通常含有转录和翻译调控序列,它们是表达内源性多肽所必需的。完整的转录和翻译调控序列包括复制起始点、启动子、增强子、阻抑物结合区、转录起始位点、核糖体结合位点、翻译起始位点和终止位点,它们是转录和翻译所必需的。
复制起始点(通常称为ori序列)允许载体在合适的宿主细胞内进行复制。ori的选择将依赖于所选择的宿主细胞和/或遗传包装的类型。当宿主细胞是原核细胞,遗传包装是噬菌体颗粒时,表达载体典型地含有两个ori序列,一个在原核细胞中指导载体自主复制,另一个ori支持噬菌体颗粒的包装。优选的原核ori可以指导载体在细菌细胞中复制。这类ori的非限制性的例子包括pMB1、pUC,以及其它大肠杆菌起始序列。支持噬菌体颗粒包装的优选ori包括但是不局限于fl ori,Pf3噬菌体复制ori。例如,在本发明中,pUC ori和fll ori构建在跨物种表达载体,用于噬菌体展示。
在真核细胞系统中,高等的真核细胞含有多个DNA复制起始点(估计104-106 ori/哺乳动物基因组),但是,ori序列并没有被清楚地限定。哺乳动物载体合适的起始点一般来源于真核病毒。优选的真核细胞的ori包括但是不局限于SV40 ori、EBV ori、HSV oris。酵母细胞中合适的ori包括但不局限于2u ori CEN6/ARS4 ori。
本文中的“启动子”是一段DNA区域,其可以在一定的条件下与RNA聚合酶结合,并引发下游(3’方向)编码区的转录。它可以被构建和可以被诱导。总体来说,启动子序列通过它的转录起始位点与它的3’端结合,并且扩展上游序列(5’端)至包括最小碱基数量和元件,这些元件是转录起始所必需的,在以上的背景下处于可测水平。启动子序列是转录起始位点,就像蛋白结构域是RNA聚合酶结合点一样。真核细胞的启动子常常包括但不是总是含有TATA盒和CAT盒。
启动子的选择将很大程度上依赖于表达载体的宿主细胞。对于原核细胞来说,在本领域有很多熟悉的强启动。优选的启动子包括lac启动子、Trc启动子、T7启动子和pBA启动子。正常情况下,为了获得多种物种的内源序列的表达,原核细胞的启动子可以被迅速置于真核细胞的启动子后,或者内在的内含子序列放在真核细胞的启动子后。
对于其它的真核细胞来说,合适的启动子序列包括3-磷酸甘油酸酯激酶的启动子,或其它糖酵解酶包括磷酸丙酮酸水合酶、甘油醛-3-磷酸激酶、己糖(磷酸)激酸、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶的启动子序列。其它启动子在一些可调控生长条件下具有另外的转录优势,它们包括酒精乙醛还原酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酯酶、伴随氮代谢的降解酶,前面提到的甘油醛-3-磷酸脱氢酶和与麦芽糖和半乳糖利用有关的酶的启动子区域。哺乳动物细胞中优选的启动子包括SV40启动子、CMV启动子、β-肌动蛋白启动子和它们的杂交体。酵母细胞中优选的启动子包括但是不局限于酿酒酵母中的GAL10启动子、GAL1启动子、TEF1启动子,和巴斯德毕赤氏酵母(P.Pastoris)中的GAP启动子、AOX1启动子。
在构建目标载体时,在待转录序列的3’末端插入外源序列和终止序列,生成mRNA的多腺苷酸序列和/或转录终止信号。这类终止序列优选含有一个或多个转录终止序列(例如多腺苷酸化序列),并且有可能通过含有额外的DNA序列被延长,以进一步打断转录通读(read-through)。本发明的优选终止序列(或终止位点)是一个基因,后接转录终止序列,该转录终止序列可以是自身的转录终止序列,也可以是异源的转录终止序列。这类转录终止序列的例子包括与许多酵母转录终止序列偶联的终止密码子,或哺乳动物细胞多腺苷酸化序列,它们在本领域被熟知,并容易得到,在下面会例示。当终止序列包含基因时,该基因编码可检测或可选择的标志将是有利的;从而可以提供一种方法来检测和/或选择转录终止序列的存在和/或缺失(或者相应的转录单位的失活和/或激活)。
除以上所说的元件外,载体还可以含有可选择的标记(例如:一种编码蛋白的基因,它是载体转化的宿主细胞生存和生长所必需的),尽管这种基因标记可以标记在另外一种多核苷酸序列上,这个序列可以共存于宿主细胞。可选择的标记基因是在某种可选择的条件下,这些宿主细胞生存和/或生长中所必需的。典型选择基因编码这样一些蛋白,所述蛋白(a)抗抗生素或其它毒素,例如:青霉素、卡那霉素、新霉素、G418、甲氨喋呤等,(b)弥补营养缺陷,或(c)能提供不能从培养介质中获得的重要营养物质。正确的基因标记的选择将依赖于宿主细胞,不同宿主中恰当的标记基因是本领域公知的。
在本发明的一个实施方案中,表达载体是穿梭载体,能够在至少两种不相关的表达体系中复制。为了使这类复制更加方便,载体一般含有至少两种复制起始点,它们在单个表达体系中都是有效的。典型的穿梭载体在原核细胞的表达系统和真核系统的表达系统中都能被复制。在真核细胞宿主中(可表达细胞型)可检测到这些蛋白表达和在原核细胞宿主中(可扩增的细胞型)这类载体可以扩增。优选地,一种复制起始点来源于SV40,另一种复制起始点来源于pUC,尽管本领域的任何一类复制的起始点都能用于载体复制。当载体是一种穿梭载体时,它们优选含有至少两种可选择的标记,一种用于表达细胞型,一种用于扩增细胞型。在本领域所熟知的标记或者是本文所描述的那些标记都可以用来在所使用的表达系统发挥作用。
本发明的载体可以用重组克隆的方法和/或化学合成的方法来获得。大量的重组克隆技术例如:PCR,限制性核酸内切酶消化和连接技术在本领域是众所周知的,不需要详细描述。本领域技术人员也可用本文提供的序列数据或者在公共或私人数据库中,通过可行的任何的合成方法来获得理想的载体。另外,用大家所熟知的限制和连接技术,可以从各种DNA中获得合适的序列,并且可以与本发明待表达的外源序列进行有效的整合。
本发明的实施例和附图证实了在原核细胞和真核细胞中可以进行多物种和跨物种的目标蛋白展示。随后的实施例被用来说明本发明的一项实施方案,无论如何本发明的应用范围不应受其限制。技术人员阅读这些公开内容后可以作出许多修饰和改变。这些修饰和改变构成了本发明的一部分。
除了特殊指明的,本发明的是本领域技术人员公知的实验技术,其中包括细胞生物学、分子生物学、细胞培养等的常规实验技术。说明书引用的所有出版物和专利申请显示了现有技术水平,它们完整地在此引入作为参考。
尽管本发明的不同组合物和方法(多物种和跨物种的展示策略)是用抗VEGF抗体的编码序列例示的,本领域技术人员会容易地认识到可在本发明的表达和展示载体中使用编码不同抗体序列文库的表达盒文库,以进行抗体发现和工程研究。
本发明的实施将利用,除了特殊指明的,本领域技术人员熟知的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学、重组DNA的传统技术。见噬菌体多肽和蛋白质(B.K.Kay etal,1996);噬菌体展示技术,实验室手册(C.F.Barbas III et al,2001),Fritsch和Maniatis,分子克隆:实验指南,第二版(1989);现代分子生物学实验指南(F.M.Ausubel,et al.eds,(1987));酶学方法系列:PCR2:实用方法(M.JMacpherson,B.D.Hames and G.R.Tayloreds.(1995)),Harlow and Lane,eds.(1988).抗体:实验室操作手册和动物细胞培养(R.I.Freshney,ed.(1987))。
噬菌体和哺乳动物细胞跨物种展示系统
实施例1:展示载体pMAG1
pMAG1载体例示了适用于跨物种展示和制备方案的表达载体,其中多肽文库首先在原核细胞展示系统(噬菌体和细菌细胞)中被展示和/或被构建,随后在真核细胞展示系统(哺乳动物细胞)中被展示和/或被构建。
pMAG1载体,如图2A中所描述的那样,以商业化的载体pUC19为骨架进行构建,在其EcoR I和Pci I这两个限制性内切酶位点之间插入一个完全合成的,长度为3799bp的DNA片段。这个完全合成的DNA序列包含以下几个元件:(1)噬菌体包装的f1起始位点;(2)跨物种表达盒,其中GR1适配体融合蛋白的表达由两种启动子驱动:一种是哺乳动物细胞的CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子,另一种是细菌的pLac启动子。目的基因的多克隆位点序列构建在人类生长激素1信号序列的下游,人类生长激素1能够在大肠杆菌和哺乳动物细胞发挥作用。DH-tag序列存在于GR1序列(适配体1)的编码序列的上游,用来进行蛋白的检测和Ni-NTA纯化。(3)用于哺乳动物筛选标记新霉素的表达盒。
简而言之,基因的合成涉及到将合成的DNA分成3个小片段:1379bp、1227bp和1289bp,通过Codon Devices BioFab平台技术(Boston)进行基因合成。来源于寡聚核苷酸的合成产生的错误,可以通过合成基因与有选择性的寡聚核苷酸序列互补以及Muts蛋白亲合纯化柱进行修正。这些合成的带有tag序列并包含有II型限制性酶切位点的DNA片段可以被消化和连接成一个完整的DNA片段,然后将它们克隆到pUC19载体上。最后用标准DNA测序的方法对载体序列(SEQ ID NO:1)进行确定。
实施例2:展示载体pMAG9
载体pMAG9(SEQ ID NO:2)来自pMAG1载体,方法是在Sac I和Not I位点之间插入一个基因,这个基因编码抗-VEGF的抗体scFv下游的信号序列。本领域技术人员会容易地认识到pMAG9用于展示编码多种类型的抗体的编码序列文库。scFv基因通过PCR扩增。简而言之,用pABMX268DNA(美国专利申请20040133357A1)作为模板,PCR引物如下:
AM-9:5’-AGTCAGGTAAGCGCTCGCGCTCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCG-3’(SEQ ID NO:3)
AM-91:5’-ATGACCTTCCTGCGTAGTCTGGTACGTC-3’(SEQ IDNO:4)
根据Stratagene的说明书,混匀模板,引物和pfuUtra Hotstart PCRMaster混合物溶液后进行PCR反应。设置循环条件如下:94℃变性3min;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸30s,30个循环;然后72℃ 10min。1%的琼脂糖凝胶进行PCR产物的消化与纯化,然后经SacI和NotI位点克隆至pMAG1载体。通过标准DNA测序的方法对scFv序列进行鉴定。图2B是pMAG1载体结果。
此载体具有用于DNA复制的pUC复制起始点,用于氨苄青霉素筛选的β-内酰胺酶基因,和噬菌粒DNA包装的f1复制起始点,可在大肠杆菌细胞内起作用。另外,scFv-适配体GR1融合蛋白的转录和表达由大肠杆菌细胞中的pLac启动子和哺乳动物细胞中的鸡β-肌动蛋白启动子驱动。作用于哺乳动物细胞和细菌细胞的人类生长激素1信号肽(Gene,1985,39:247-254)指导适配体融合蛋白进入哺乳动物细胞和细菌细胞的分泌途径。
实施例3:噬菌体辅助载体GMCT
GMCT载体构建于被充分表征的名为M13KO7的载体(来自于Amersham Pharmacia),其详细步骤可分为两步:第一步,通过PCR技术为基础的定点突变在KO7辅助噬菌体载体的基因III信号序列上构建Kpn I位点。沉默突变并没有改变pIII信号肽的编码序列,包含有Kpn I位点的KO7基因组用如下引物进行PCR扩增:
p3KN15’-TTTAGTGGTACCTTTCTATTCTCACTCCGCTG-3’(SEQ ID NO:5)
p3KN25’-TAGAAAGGTACCACTAAAGGAATTGCGAATAA-3’(SEQ ID NO:6)
这些引物与基因III信号序列具有部分同源性。100μl的反应混合物包含100ng的KO7载体,引物各200pmol,dNTP 250μM,和1×pfu缓冲液,pfu DNA聚合酶(Stratagene),进行PCR反应。反应混合物首先在96℃孵育,然后进行15个循环的PCR反应:96℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸10min,30个循环。扩增后,对产物进行凝胶纯化,Kpn I酶切和消化。然后通过电穿孔法转化到TG1细菌细胞。
细菌细胞通过卡那霉素筛选。具体来说,抗卡那霉素克隆生长在2YT培养基中加并有70μg/ml的卡那霉素的96孔酶标板上,培养上清液通过噬菌体ELISA的方法检测噬菌体来减少由PCR出错生成的没有功能的突变体。简单来说,噬菌体ELISA方法如下:在有包被的ELISA板中加入含有噬菌体颗粒的上清液100μl 4℃过液。在室温下,用含5%牛奶的PBS缓冲液封闭30分钟,在结合到ELISA板的噬菌体颗粒中进一步加入100μl的HRP-偶联的抗-M13抗体(AmershamPharmcia)室温孵育1个小时。
用含有0.05%Tween-20的PBS洗去游离的抗-M13抗体。然后加入底物ABTS(2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))。噬菌体的阳性克隆C2,B3,B7,B9和A12明示在图3中。从TG1培养物中制备从克隆B7、B9和A12提取的DNA。用Acc65I(Kpn I的同切点酶)和BamH I对载体DNA进行双酶切,切出600bp的DNA片段,这个片段能够证实Kpn I位点存在于所有具有3种KO7kpn的载体克隆中。结果说明载体上独特的Kpn I限制性酶切位点与KO7一致,这个位点加入至基因III信号序列(工程化基因III信号,SEQ ID NO:7)并没有破坏基因III的编码序列。
噬菌体辅助载体GMCT通过用合成的DNA片段来替代KO7kpnB7辅助载体上基因III的Kpn I/BamH I的片段(SEQ ID NO:8)。结果显示,噬菌体载体GMCT编码另外的复制工程化pIII衣壳,它包含GR2结构域(SEQ ID NO:20),用于检测工程化pIII蛋白的myc-tag序列和pIII的C末端结构域(CT结构域)。工程化基因III下游的核糖体结合序列(S/D)和来源于细菌蛋白OmpA的信号序列融合至基因III序列中。包含有这两种拷贝的基因III序列置于原始基因III启动子的控制下。
连接的载体DNA转化至TG1细胞,抗卡那霉素克隆生长在2YT培养基中加并有70μg/ml的卡那霉素的96孔酶标板上,培养上清液通过噬菌体ELISA的方法检测噬菌体来挑选阳性克隆,描述如上。发现选取的10个克隆都可以产生噬菌体颗粒。克隆3被用来进行大规模噬菌体制备。
实施例4:GMCT辅助噬菌体的生成
来源于克隆3的含有噬菌体辅助载体GMCT的上清在2TY平板上孵育,4ml软琼脂与0.5ml的TG1培养基混合后在培养皿上孵育。在37℃孵育过液后形成噬菌体斑。挑取单个噬菌体斑接种于10ml 2YT培养基中,加入70μg/ml卡那霉素,置于37℃,250rpm摇床孵育2小时后,将培养基转移到2L培养瓶中,在培养瓶中加入含有70μg/ml卡那霉素500ml 2YT,置于37℃摇床孵育过液。然后将上清中的噬菌体用聚乙二醇(PEG)/Nacl沉淀后用PBS重新悬浮。用OD268来测定噬菌体浓度。一般来说,阅读1单位OD268表明,1ml上清含有大约5×1012病毒颗粒。在培养基中,噬菌体产生大约8×1011/ml的GMCT辅助噬菌体,与M13KO7相同,这些结果表明适配体GR2-pIII融合蛋白并不影响噬菌体颗粒的包装。
通过抗-Myc tag噬菌体ELISA方法证实GR2-Myc在辅助噬菌体颗粒中包装。简单地说,将抗-Myc tag抗体9E10(BD抗体公司)涂在ELISA板上,噬菌体与9E10抗体结合,通过HRP-偶联的抗-M13抗体与底物ABTS(2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))结合进行检测。
实施例5:哺乳动物辅助载体pMAG2
哺乳动物辅助载体pMAG2(图5)通过在商业载体pUC19骨架上的EcoRI和PciI位点间插入一个完整的长度为3134bp的合成DNA片段创建而来。这个完整的DNA片段包含以下两部分序列:(1)含有SV40复制起始点/启动子和SV40polyA的zeocil表达盒;(2)适配体2(GR2,SEQ ID NO:20)与人类表皮生长因子受体(hEGFR)的膜蛋白结构域融合,通过一种CMV启动子和带有BGH polyA末端进行驱动。适配体GR2融合蛋白的分泌信号肽序列来自于人类表皮生长因子受体。
简单来说,载体的合成通过用BioFab平台技术(Codon Devices)将合成的DNA分成808、790、892和817bp的4个小片段。来源于寡聚核苷酸合成中产生的错误可以通过合成基因与有选择性的寡聚核苷酸序列互补以及Muts蛋白亲合纯化柱进行修正。这些含有II类限制性酶切位点tag序列的DNA片段被消化和连接成一个完整的DNA片段,最后用标准DNA测序的方法对载体序列(SEQ ID NO:9)进行确定。
实施例6:在大肠杆菌细胞中用pMAG9载体进行可溶性Fv蛋白(scFv)的表达
使用pMAG9表达载体而不使用辅助载体,导致目标蛋白以包含编码序列产物与适配体1(GR2)融合蛋白的形式表达和分泌。
为了使表达的融合蛋白展示在遗传包装表面,需要在辅助载体存在下进行共表达,所述辅助载体提供第二融合蛋白,所述第二融合蛋白包含与第二适配体(例如GR2)框内融合的锚蛋白,所述第二适配体可以与适配体1以成对的方式相互作用。这两种适配体成对的作用使目标蛋白在遗传包装和宿主细胞中的展示更加方便。
为了研究在缺乏辅助载体的情况下,pMAG9作为表达载体的功能,把pMAG9载体转化到TG1细胞中作为可溶蛋白表达。转化了pMAG9载体的细胞用含有100μg/ml氨苄青霉素的2YT培养基培养,置于37℃摇床至OD600=0.9。然后加入终浓度为0.5mM的IPTG在30℃摇床诱导过夜。
上清中的可溶性scFv蛋白通过ELISA检测。简而言之,在包被了VEGF的ELISA板中加入100μl上清液,与包被在板上的抗原结合的scFv的抗体用HRP-偶联的抗HA标签抗体检测(12CA5)。然后加入底物ABTS(2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))检测HRP的活性。图6A的ELISA结果显示在pMAG9培养上清中的可溶性scFv抗体能与以一种剂量依赖的方式结合VEGF抗原。相反,带有pUC18载体的阴性对照细胞产生的上清没有VEGF结合活性。图6A提供的这些结果表明pMAG9是一种表达载体,其功能是能够指导可溶性蛋白在大肠杆菌细胞中表达,但是不会使目标基因从展示载体转移到表达载体。
而且,这种可溶性蛋白可以从上清和细胞外周提取物中纯化。简而言之,细胞沉淀重悬在1/40生长培养基体积的预冷的PPB缓冲溶液中(200mg/ml蔗糖,1mM EDTA,30mM Tris-Hcl,PH8.0),在冰上孵育30分钟。然后用预冷的5mM硫酸镁重复以上步骤。细胞沉泻和培养上清中的周质提取物结合并加到Ni-NAT柱。结合到His-tag上的蛋白用含500mM咪唑的PBS洗脱。收集的组分用抗HA抗体进行SDS-PAGE和Western印迹分析。
实施例7:使用pMAG9在噬菌体上展示scFv蛋白
使用pMAG9载体与辅助载体结合可以在遗传包装或目标宿主细胞表面展示目标蛋白或蛋白文库。例如,为了在噬菌体的表面展示scFv,pMAG9与实施例4中提到的GMCT辅助噬菌体结合使用。
为了证明pMAG9能作为展示载体的作用,当它与辅助噬菌体共表达的时候能够指导噬菌体展示,该辅助噬菌体表达融合蛋白,该蛋白由病毒衣壳蛋白与适配体2框内融合而成,该适配体2能够与适配体配对结合,适配体1存在于由pMAG9产生的scFv-适配体/GR1融合蛋白中,含有pMAG9载体的TG1细胞对感染复数为10时的GMCT辅助噬菌体超级易感。感染的TG1细胞在2YT/Amp/Kan培养基的30℃摇床中培养过夜。在培养基上清中的噬菌体质粒病毒颗粒用PEG/NaCl沉淀两次,并用PBS重悬。
展示在噬菌体表面的单链抗体用包被了VEGF抗原的培养板通过噬菌体Elisa的方法检测。简而言之,就是将96孔的ELISA板,用100μl的2μg/ml的VEGF于4℃包被过夜。用含5%牛奶的PBS缓冲溶液在室温阻断一个小时。因此,用含5%牛奶的PBS稀释的100μl噬菌体用于在室温包被ELISA板的每个孔一个小时。结合到ELISA板的噬菌体颗粒进一步用100μl的HRP-偶联的抗M13抗体(AmershamPharmcia)在室温孵育1个小时。未结合的抗M13抗体用含0.05%Tween20的PBS洗去。然后加入底物ABTS(2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))。测定405nm的吸光度以检测HRP活性。图8中显示的ELISA结果证明从含有pMAG9载体的超感染细胞中产生的噬菌体能以一种剂量依赖的方式结合VEGF。在阴性对照中,从带有pUC18载体和pMAT6载体(在图14B中提到的一种酵母/哺乳动物跨物种展示载体)的细胞中产生的噬菌体没有显示出任何与VEGF结合的活性。这些结果证明PMAG9/GMCT载体能满足噬菌体展示的目的。
实施例8:用pMAG9在哺乳动物细胞中表达可溶性Fv(scFv)
实施例6中的实验表明pMAG9可以在细菌细胞(如大肠杆菌)中起作用。pMAG9载体也可以作为跨物种的表达和展示载体。为了验证其跨物种性能,pMAG9被用来指导抗VEGF scFv的表达和在哺乳动物细胞中的生产。
简单地说,在Freestyle 293F细胞(人胚肾细胞系,Invitrogen)和COS6(转化的猴肾细胞)中表达了可溶性的抗VEGF scFv蛋白。转染实验所用试剂为FuGENE6(Roche Applied Science),按照说明书使用。在无血清培养基中,1~2μg的pMAG9载体以6:1,3:1或3:2的比例加入到稀释的FuGENE6试剂中,孵育15min后,FuGENE6试剂-DNA复合物转染到六孔板中的细胞(2ml表达培养基(Invitrogen)含1.0×106个细胞),然后在37℃,95% CO2培养箱中孵育72h。收集上清用以在western印迹和抗VEGF-ELISA中检测scFv-HA-GR1蛋白。
按照ProFound HA Taq IP/Co-IP试剂盒的使用方法,用抗HA的柱子,从800μl培养上清中纯化得到抗VEGF的scFv蛋白。纯化的scFv蛋白经过4~12%的SDS-PAGE进行蛋白分离,转到0.45的硝酸纤维素膜上按照ECL pus的western印迹检测系统(Amersham)的方法做western印迹分析。简单地说,膜用含5%脱脂牛奶的TBST封闭,然后用鼠抗HA-probe F7(Santa Cruz Biotech)室温孵育1h。然后用TBST洗膜三次之后,在过氧化物酶标记的抗小鼠的抗体孵育1h,再用检测液孵育洗过的膜5min,化学发光信号用X线胶片检测。抗HA的印迹结果如图7所示。Western印迹的结果显示在293和COS6细胞的培养上清中均存在scFv蛋白(~35KD),表明跨物种的展示载体pMAG9可以在哺乳动物细胞中表达可溶性的蛋白。
随后,用抗VEGF ELISA来进一步分析从哺乳动物细胞培养上清中得到的scFv蛋白的功能。简单来说,MaxiSorp板子用100μl pH9.6的碳酸氢盐溶液稀释的2μg/ml的重组人VEGF(R&D System)包被过夜。用PBS洗两次,以含5%牛奶的PBS室温封闭1h。再经PBS洗2次之后,含有纯化的scFv蛋白的不同稀释度的溶液50μl加入到板孔中,室温孵育1h。洗板之后,用50μl含鼠抗HA-探针F7(SantaCruz Biotech)室温孵育1h,再用含5%牛奶的PBS以1:2000稀释的抗小鼠的抗HRP抗体(Santa Cruz Biotech)孵育1h。最后加入底物ABTS(Pierce)显色,在OD405的吸光度下用96孔板阅读器(MolecularDevices)读数。
图6B中ELISA结果显示,从3次293细胞转染和4次COS6细胞转染后的培养上清来看,pMAG9转染细胞后收集的上清与VEGF的结合活性成剂量依赖性。从图6A和7A的结果来看,ELISA实验结果表明pMAG9作为跨物种的表达载体,在大肠杆菌和哺乳动物细胞中都可以发挥作用。
实施例9:用pMAG9载体在哺乳动物细胞中展示scFv蛋白
已经证明了pMAG9在辅助载体GMCT的共同作用下可以指导scFv在噬菌体上的展示(见实施例7所述),而且pMAG9在哺乳动物细胞中可以不依赖于辅助载体而指导可溶性scFv在哺乳动物细胞中的表达(见实施例8)。下面的实验将证明这个载体的跨物种展示功能。
COS6细胞在6孔板中用含10%胎牛血清、100单位/ml青霉素G、100μg/ml链霉素的DMEM培养基中培养过夜。表达载体pMAG9和辅助载体pMAG2用FuGENE转染试剂(Roche Applied Science)按照说明书的方法共转染到COS6细胞中。简单来说,将800ng质粒DNA(400ng pMAG9+400ng pMAG2)以FuGENE试剂(μl):DNA复合物(μg)为3:2的比例加入到用无血清培养基稀释的FuGENE试剂中。FuGENE试剂DNA复合物室温混合孵育15min后加入到细胞中。培养48h后,细胞表面展示的HA标记的scFv-GR1融合蛋白(来自pMAG9)便可以用Alexa488标记的抗HA抗体检测到。即,用4%的甲醛固定20min,用含5%BSA的PBS溶液25℃封闭30min,再用经PBS以1:500稀释的Alexa488标记的抗HA的抗体(1:100稀释,Invitrogen)孵育60min。用DAPI(Invitrogen)染色细胞以观察细胞核。在Zeiss Axiovert 135显微镜下用Plan-Neofluar 100/1.30的油镜观察细胞。图9所示的结果可以清楚的看到定位在表面的HA标记的scFv-GR1,这就表明用pMAG9载体可以对scFv进行细胞表面展示。
另外,在转染后48h仍可进行流式细胞仪分析以检测表面的抗VEGF-scFv的存在情况。简单地说,生物素化重组人VEGF或VEGF-Fc加入到25μl细胞悬液(4×106细胞/ml)中4℃孵育60min。同样的细胞样品,用生物素化的大豆胰蛋白酶抑制剂染色作为阴性对照。然后在抗生物素蛋白-异硫氰酸荧光素(avidin-FITC)或抗-Fc抗体-异硫氰酸荧光素中4℃避光孵育30min。用RDF1缓冲液洗细胞两次,再用0.2ml的RDF1重悬细胞,以在FACSvantage流式细胞仪(BDBiosciences)或Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent technology)中进行检测。(注:这是一个FACS预实验)
实施例10:目标多肽在噬菌体和哺乳动物细胞中的筛选和跨物种展示(注:预实验)
编码多肽的不同总文库的DNA文库可克隆到pMAG1或pMAG9载体上,以期可以表达可溶性多肽,或在大肠杆菌和/或哺乳动物细胞中展示可溶性多肽。
表达文库可以在辅助载体(如GMCT辅助载体用作噬菌体展示,pMAG2辅助载体用作哺乳动物细胞展示)共表达的作用下,在原核遗传包装或真核宿主细胞表面得到展示。有特异性表征(结合活性)的多肽可以通过顺序几轮筛选得到富集。简单来说噬菌体筛选过程如下:96孔板用含1-10μg/ml特异性抗原的溶液4℃包被过夜。含5%牛奶的PBS缓冲液封闭之后,加入含1011-12个噬菌体和5%牛奶的PBS缓冲液室温孵育2h。用PBST和PBS洗几遍之后,因为辅助噬菌体在与pIII蛋白融合的Myc-tag处有酶切位点,所以用10μg/ml的胰蛋白酶孵育30min可以洗脱结合的噬菌体。在实验中,胰蛋白酶洗脱液比100mM的三乙胺(常用于噬菌体筛选)溶液效率更高。重复这个过程2-3次之后,展示了目标多肽的噬菌体便可得到富集。这些富集的噬菌体可以感染大肠杆菌细胞,以扩增可以编码目标多肽的载体。
这些从噬菌体文库中筛选到的载体DNA的小合并物可直接用于转染哺乳动物细胞,在哺乳动物辅助载体pMAG2共转染的作用下以进行细胞表面展示。具有目标性能的前导物可以通过几轮FACS分选而分离出来。简单来讲,10-20μg DNA在电转化杯中与用冰冷的PBS洗过的3×106的HEK 293细胞或COS细胞混合,冰上孵育10min,将细胞/DNA混合物用GenePulser Xcell(Bio-Rad)仪,在250μF、660V进行点击转化。然后室温孵育10min,将细胞转入75cm含有20ml培养基的培养瓶中,37℃,5% CO2培养箱中培养2-3天。也可以用FuGENE 6转染试剂按照Roche Applied Science介绍的方案进行转染。
检测对靶标抗原有结合特异性的抗体的适当的筛选过程包括约107个转染的细胞用含0.2nM生物素化的靶标抗原和20μg/ml的抗HA标记的mAb 12CA5(Santa Cluze Biotech)的PBS缓冲液25℃孵育1h,用冰冷的PBS缓冲液漂洗细胞,再用FITC标记的羊抗鼠FITC(AMI0408;BioSource International,Crmarillo,CA用于监测抗体表达)和链亲和素-R-PE标记(S866;分子探针,用于与细胞结合的抗原)4℃孵育1h。这样细胞便可以在FACSVantageSE(BD Biosciences)上用合适的分类窗进行分类,从而收集上面0.1%的PE阳性细胞,从分选的细胞中回收的展示载体和辅助载体的DNA再转化到大肠杆菌细胞中。只有带有F1起始序列的展示载体才可以被辅助噬菌体如K07包装,这样就可以从哺乳动物辅助载体中分离出来。接着,回收的展示载体DNA又可以用作下一轮的FACS分选或者用于DNA测序。
噬菌体和酵母跨物种展示系统
实施例11:展示载体pMAT2
pMAT2是一种表达载体,可以用于表达,也可以用于原核系统(噬菌体和细菌细胞)和真核系统(酵母细胞)的跨物种展示。如图10A所示,pMAT2是在商品化载体pUC19基础上在AatII和PciI位点之间插入3184bp的全长DNA片段设计而成的。这个全长的DNA片段包含(1)噬菌体包装所需的f1起始序列;(2)由两个启动子(可以在酵母细胞中表达的pGAL1启动子,和可以在细菌细胞中表达的plac启动子)启动的GR1(SEQ ID:19)融合蛋白的跨物种的表达盒。克隆目标基因的多克隆位点(MCS)设计在双功能信号序列(酵母内源性-β-1,3-葡聚糖酶蛋白Bg12p)的下游。用于蛋白检测和Ni-NTA纯化的HA-His6标签(DH-tag)序列在GR1序列的上游。(3)酵母复制所需的GEN/ARS起始序列;(4)酵母营养缺陷标记TRP1表达盒。
简单来说,这个载体是通过BioFab平台技术(Codon Devices)将DNA分为1196、804和1294bp节段而合成的。寡核苷酸合成所产生的错误可以通过寡核苷酸选择与合成基因的互补序列特意结合,以及Mut-S蛋白柱的亲和纯化来纠正。这些合成的包含II型限制性位点的带有标签序列的DNA通过酶切消化,链接到全长的DNA片段上,然后克隆到pUC19载体上。这样得到的载体序列(SEQ ID NO:10)通过标准DNA测序方法确定。(注:这是没有scFv基因的噬菌体/酵母表达载体。)
实施例12:跨物种展示载体pMAT5
pMAT5载体(SEQ ID NO:11)是在pMAT2载体的基础上,通过SacI和NotI位点在信号序列下游插入编码抗VEGF抗体的scFv基因(表达盒)构建而成的。pMAT2可以用来展示编码多种抗体的编码序列文库。scFv基因用PCR的方法扩增得到。简单地说,pABMX268 DNA作为模板,PCR引物序列如下:AM-90:5’-AGTCAGGTAAGCGCTCGCGCTCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCG-3’(SEQ.ID.NO3)和AM-91:5’-ATGACCTCCTGCGTAGTCTGGTACGTC-3’(SEQ.ID.NO4)。
PCR反应体系按照Stratagene说明书的方法,在pfuUtra热启动PCR预混液体中加入模板和引物制备。反应条件如下:94℃预变性3min;30个循环的94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1min30s;最后72℃延伸10min。PCR产物酶切消化后,用1%的琼脂糖凝胶分离,通过SacI和NotI克隆到pMAT2载体上。
scFv的序列通过DNA测序确定。pMAT5载体的组成如图10B所示。在pMAT5中,融合的目标多肽/GR1-蛋白的转录和表达,在大肠杆菌细胞中由pLAC启动子启动,在酵母中由GAL1启动子启动。酵母信号肽内-β-1,3-葡聚糖酶蛋白Bg12p在酵母和细菌细胞(Protein Exp.Puri,2000,20:252-264)中都可以起作用,从而指导表达的融合蛋白在酵母和细菌细胞中通过分泌途径。
实施例13:酵母辅助载体pMAT3
pMAT3载体的图谱如图11A所示,pMAT3是酵母展示辅助载体,可以与适配体2框内表达含有C-末端酵母外表面GPI锚定蛋白Flo1的融合蛋白。这个载体是在商品化载体pUC19基础上,在AatII和PciI位点之间插入全长的7030bp的DNA片段构建而成。全长的合成DNA包含三个表达盒:(1)酵母URA3选择标记;(2)用于酵母筛选的Zeocin标记;(3)融合在酵母外壁蛋白Flo1 C-末端1100个氨基酸,由酵母pGAL1启动子和Flo1分泌信号序列调控的适配体2GR2(SEQID NO:20)。简单来说,全长DNA可以分为1112、740、748、1042、897、1152、802和821bp(#1~#8)八个节段,通过Dodon Devices的BioFab平台技术合成。寡核苷酸合成所产生的错误可以通过寡核苷酸选择与合成基因的互补序列特意结合,以及Mut-S蛋白柱的亲和纯化来纠正。
合成DNA的#1~4节段用II型限制性酶消化,连接到一个DNA片段上,再克隆到pUC19载体上。合成DNA的#5~8节段用II型限制性酶消化,连接到另一个DNA片段上,随后通过第一个片段克隆到pUC19载体上。这样得到的载体序列(SEQ ID NO:12)通过标准DNA测序方法确定。
实施例14:酵母辅助载体pMAT7
pMAT7的图谱如图11B所示,是另外一种酵母展示辅助载体,可以表达框内(in frame)包含酵母外表面蛋白Aga2与适配体2(GR2)(SEQ ID NO:20)的融合蛋白。这个载体是在酵母辅助载体pMAT3的基础上,通过用208bp的合成DNA片段取代BamHI~HindIII之间的序列构建而成。合成的DNA包含酵母外壁蛋白Aga2的编码序列。用Codon Devices的BioFab平台技术,寡核苷酸合成所产生的错误可以通过寡核苷酸选择与合成基因的互补序列特意结合,以及Mut-S蛋白柱的亲和纯化来纠正。最后得到的载体序列(SEQ ID NO:13)通过标准DNA测序方法确定。
实施例15:酵母辅助载体pMAT8
pMAT8的图谱如图11C所示,作为另外一个酵母展示辅助载体,可以表达框内包含C-末端酵母外表面蛋白GPI锚定蛋白Cwp2和适配体2(GR2)(SEQ ID NO:20)的融合蛋白。这个载体是在酵母辅助载体pMAT3的基础上,通过用一个1252bp的合成DNA片段取代BamHI~HindIII之间的序列构建而成。合成的DNA包含融合于Flo1高S/T区的酵母外壁蛋白Cwp2的编码序列。用波士顿的CodonDevices公司的BioFab平台技术,寡核苷酸合成所产生的错误可以通过寡核苷酸选择与合成基因的互补序列特意结合,以及Mut-S蛋白柱的亲和纯化来纠正。最后得到的载体序列(SEQ ID NO:14)通过标准DNA测序方法确定。
实施例16:用pMAT5在大肠杆菌细胞中表达可溶性scFv蛋白
噬菌体/酵母表达载体pMAT5直接转化到大肠杆菌TG1细胞中以表达可溶性蛋白。从转化的细胞中挑取三个克隆,在含100μg/ml氨苄青霉素的2YD培养基中37℃振荡培养至OD600为0.9。加入终浓度为0.5mM的IPTG,30℃振荡培养过夜。上清中的可溶性scFv蛋白用ELISA检测。简单来说,VEGF包被的ELISA板子中加入100μl上清,平板上结合了抗原的scFv的抗体用HRP标记的抗HA抗体(12CA5)进行检测。然后加入底物ABTS[2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]以检测HRP的活性。
图12中的数据表明,从挑取的3个克隆得到的结果来看,pMAG5转化细胞后得到的培养上清与VEGF的结合活性成剂量依赖性。表明pMAT5在大肠杆菌细胞中可表达可溶性蛋白。
实施例17:用pMAT5在噬菌体表面展示scFv蛋白
实施例16中的数据表明pMAT5在大肠杆菌细胞中可表达可溶性scFv蛋白。为了进一步阐明在pMAT5和GMCT辅助噬菌体的共表达作用下,可以在噬菌体表面展示scFv(或scFv文库),将pMAT5载体转到TG1细胞中,用GMCT辅助噬菌体以10个感染复数(MOI)超感染转化的大肠杆菌细胞。
感染的TG1细胞在2YT/Amp/Kan的平板上30℃培养过夜。培养上清中的噬粒用PEG/NaCl沉淀两次,再用PBS重悬。在噬菌体表面表达的单链抗体通过噬菌体ELISA实验,在板子上包被VEGF抗原进行检测。简单来说,在96孔板上包被100μl 2μg/ml的VEGF,4℃过夜,然后在含5%牛奶的PBS缓冲液中室温封闭1h。这样,100μl用含5%牛奶的PBS稀释的噬菌体在ELISA板孔中室温包被1h。结合在ELISA板子上的噬菌体颗粒再在100μl HRP标记的M13抗体(Amersham Pharmcia)中孵育1h。未结合的M13抗体用含0.05%Tween 20的PBS洗掉。然后加入底物ABTS[2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]。在405nm的吸光度下检测HRP的活性。
图13中显示的ELISA结果表明含有pMAT5载体的细胞产生的噬菌体与VEGF的结合呈剂量依赖性。作为阴性对照,含有pUC18载体的细胞产生的噬菌体以及含有pMAT6载体(图14B所示的酵母/哺乳动物交叉展示载体)的细胞产生的噬菌体均未显示出对VEGF的结合活性。这些结果表明pMAT5和辅助载体GMCT载体用于指导多肽序列在噬菌体表面的展示。
实施例18:用pMAT5载体在酵母中表达可溶性Fv(scFv)
pMAT5载体是跨物种表达载体。实施例16中的数据表明pMAT5可以在细菌细胞中指导可溶性融合蛋白的表达,所述融合蛋白包含框内融合于适配体1(GR1蛋白)的scFv多肽。为了阐明pMAT5也可以在酵母细胞中表达蛋白,将该载体用酵母转化试剂盒II按照ZymoResearch说明书的方法转到酵母YHP499细胞中。
从上述转化子中挑取单菌落在50ml SD-CAA/Trp-选择培养基中30℃培养直至饱和(OD600=2~3),用含100μg/ml Amp、0.1% Dex的50ml SG/R-CAA/Trip培养基重悬。诱导三天后,收集上清,在PBS缓冲液中透析。
上清中的可溶性scFv蛋白可以通过ELISA检测。简单地说,100μl上清或通过抗-HA珠子纯化的scFv加入到VEGF包被了的ELISA板子上,结合在板子上的scFv抗体可以通过HRP标记的抗-HA的抗体(12CA5)检测到。然后加入底物ABTS[2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]检测HRP的活性。ELISA的结果表明pMAT5载体可以在酵母细胞中表达可溶性蛋白。另外,培养上清可以通过Ni-NTA柱子进行纯化。结合的带有His标签的蛋白可以用含500mM咪唑的PBS洗脱掉。回收的部分可以作SDS-PAGE检测,也可用抗-HA抗体western印迹检测。
实施例19:用pMAT5载体在酵母细胞表面展示scFv蛋白
pMAT5表达载体也可以用来指导scFv抗体在酵母宿主细胞表面的展示。简单来讲,将pMAT5载体在酵母展示辅助载体(如pMAT3,pMAT7,pMAT8)存在时,用一个合适的方案(如II型Frozen-EZ酵母转化试剂盒)转到酵母细胞中。或者说,将pMAT5载体转到在其基因组中含有酵母辅助载体pMAT3,pMAT7或pMAT8的酵母细胞中。
同时包含表达载体和辅助展示载体(如酵母展示载体)可以在SD-CAA/Trp-/Ura-琼脂平板或SD-CAA/Trp-/Zeocine上进行筛选,而且可以在同种选择培养基中生长直至饱和。然后将细胞转到含有100μg/ml氨苄青霉素和0.1%地塞米松的诱导培养基中,20℃或25℃振荡培养过夜。用冰冷的PBS缓冲液洗涤酵母细胞之后,酵母细胞用含100mM生物素化VEGF和5mg/ml抗-HA(12CA5)抗体的FACS缓冲液(PBS/0.5%BSA/2mM EDTA)室温孵育30min,再用冰冷的洗涤缓冲液洗三次。随后细胞用5mg/ml链亲和素-R-PE标记(SA-PE)和羊抗-小鼠-488冰上避光孵育30min,洗涤三次,用1ml FACS缓冲液悬浮。在酵母细胞中展示的与scFv结合的荧光便可以通过流式细胞术,用FACS Cailibur流式细胞仪或Agilent 2100生物分析仪检测到。
实施例20:在噬菌体和酵母细胞上展示的目标多肽的筛选
多种DNA序列的不同集合(即总文库)可以克隆到pMAT2上以在原核(如大肠杆菌)和真核细胞(如酵母细胞)中依次表达可溶性多肽。得到的表达文库可以在不同的辅助展示载体的帮助下在噬菌体或酵母细胞表面得到展示。更具体地说,GMCT可以用于噬菌体展示辅助载体,而pMAT3、pMAT7或pMAT8可以用于酵母细胞展示辅助载体。
噬菌体展示的特异的蛋白或多肽可以通过几轮筛选进行富集。简单来说一个合适的筛选过程包括:96孔板用含1-10μg/ml靶标抗原的溶液4℃包被过夜。含5%牛奶的PBS缓冲液封闭之后,加入含1011-12个噬菌体和5%牛奶的PBS缓冲液室温孵育2h。用PBST和PBS洗几遍之后,因为辅助噬菌体在与pIII蛋白融合的Myc-tag处有酶切位点,所以用10μg/ml的胰蛋白酶孵育30min可以洗脱结合的噬菌体。TG1细胞用洗脱的噬菌体进行感染,又可以进行下一轮的噬菌体扩增和筛选。重复这个过程2-3次之后,展示了目标多肽的噬菌体便可得到富集。这些富集的噬菌体可以感染大肠杆菌细胞,以扩增可以编码目标多肽的载体。
这些从噬菌体文库中筛选到的载体DNA可随后直接转化到含有一个拷贝酵母辅助载体pMAT3、pMAT7或pMAT8的酵母宿主受体细胞中。展示具有目标特性的前导物的转化酵母细胞可以通过几轮流式细胞术分选而分离出来。简单来说,酵母细胞在SD-CAA选择培养基上30℃培养18-22h,再转到SG/R-CAA表达培养基中20℃或25℃培养。用含生物素化抗原和5mg/ml抗-HA(12CA5)抗体的FACS洗涤缓冲液(PBS/0.5%BSA/2mM EDTA)室温孵育酵母细胞30min,再用冰冷的洗涤缓冲液洗涤细胞。由此得到的细胞用5mg/ml链亲和素-R-PE标记(SA-PE)和羊抗-小鼠-488冰上避光孵育30min,再用FACS缓冲液悬浮以通过流式细胞术进行分选。分选可以用BD BioscienceFACS Vantage DiVa仪器进行纯化筛选,得到目标双阳性的细胞。将收集的细胞铺于含Penn/Strep的SD-CAA平板上,30℃培养2天,重悬细胞进行下一轮的扩增。筛选之后便可挑取单克隆。随后酵母细胞中的载体DNA用Zymoprep酵母质粒小量提取试剂盒(ZymoResearch)参照说明书的方法进行回收以测序。
酵母和哺乳动物宿主细胞的多物种展示
实施例21:展示载体pMAT4
如图14A所示的pMAT4载体,是一个在酵母和哺乳动物细胞中对多肽文库进行序列表达、展示的多或跨物种的表达载体。这个载体是在pMAT2的基础上,通过用一个1420bp的合成DNA片段取代PacI~SacII之间的序列构建而成。全长DNA用BioFab平台技术(CodonDevices)合成,包含位于内含子序列中的酵母pGAL10启动子。这样,框内融合于适配体1(GR1)(SEQ ID NO:19)的文库蛋白的表达由三个启动子驱动:在哺乳动物细胞中由SV40启动子启动;在酵母细胞中由pGAL10启动子启动;在大肠杆菌中由pLac启动子启动。人胰脂肪酶蛋白1(HPLRP1)的信号肽在酵母和哺乳动物细胞中都可以起作用(Protein Exp.Puri,2006,47:415-421)。寡核苷酸合成所产生的错误可以通过寡核苷酸选择与合成基因的互补序列特意结合,以及Mut-S蛋白柱的亲和纯化来纠正。最后得到的pMAT4载体多核苷酸序列(SEQ ID NO:15)通过标准DNA测序方法确定。
实施例22:展示载体pMAT6
pMAT6是在pMAT4载体基础上,通过XhoI和NotI位点在信号序列下游插入抗-VEGF的scFv基因构建而成。scFv基因是从pABMX268DNA中由PCR扩增得到。PCR引物序列如下:
AM-90:5’-AGTCAGGTAAGCGCTCGCGCTCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCG-3’(SEQ.ID.NO3);AM-91:5’-ATGACCTCCTGCGTAGTCTGGTACGTC-3’(SEQ.ID.NO4)。PCR反应体系按照Stratagene说明书的方法,在pfuUtra热启动PCR预混液体中加入模板和引物制备。反应条件如下:94℃预变性3min;30个循环的94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1min 30s;最后72℃延伸10min。PCR产物酶切消化后,用1%的琼脂糖凝胶分离,通过XhoI和NotI克隆到pMAT4载体上。scFv序列通过DNA测序确定。
pMAT6载体(SEQ ID NO:16)的图谱如图14B所示。人胰脂肪酶蛋白1(HPLRP1)的信号肽在酵母和哺乳动物细胞中都可以起作用(Protein Exp.Puri,2006,47:415-421),并且能够指导表达的融合蛋白(scFv多肽与适配体1处于框内)在真核宿主细胞(酵母和哺乳动物细胞)中通过分泌途径。
实施例23:用pMAT6在酵母细胞中表达可溶性scFv
表达载体pMAT6可以用Frozen-EZ II型酵母转化试剂盒按照ZymoResearch说明书的方法转到酵母细胞YHP499中。从上述转化子中挑取单菌落在50ml SD-CAA/Trp-选择培养基中30℃培养直至饱和,用含100μg/ml Amp、0.1% Dex的50ml TEP G/R培养基重悬。诱导三天后,收集上清,在PBS缓冲液中透析。
上清中的可溶性scFv蛋白可以通过ELISA检测。简单地说,将100μl上清加入到VEGF包被了的ELISA板子上,结合在板子上的scFv抗体可以通过HRP标记的抗-HA的抗体(12CA5)检测到。然后加入底物ABTS[2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]检测HRP的活性。另外,培养上清可以通过Ni-NTA柱子进行纯化。结合的带有His标签的蛋白可以用含500mM咪唑的PBS洗脱掉。回收的部分可以作SDS-PAGE检测,也可用抗-HA抗体western印迹检测。
实施例24:用pMAT6在酵母上展示scFv
表达载体载体pMAT6和酵母辅助表达载体,例如pMAT3或pMAT7或pMAT8能够以上述方法共转化入酵母细胞。或者说,携带酵母辅助表达载体pMAT3或pMAT7或pMAT8拷贝的酵母细胞只能用于交叉展示载体的转化。
携带展示载体和辅助载体的受体宿主细胞可以在SD-CAA/Trp-/Ura-或SD-CAA/Trp-/zeocine琼脂板上分离,并在相同的选择培养基中生长知道达到饱和状态。然后细胞可以转移到含有100ug/ml氨苄青霉素,0.1%的地塞米松的诱导培养基中20℃下摇动过夜。用0℃预冷的PBS缓冲液洗涤后,用100nM生物素标记的VEGF和5mg/ml的抗HA(12CA5)抗体在室温下FACS缓冲液(PBS/0.5%BSA/2Mm EDTA)中孵育30分钟,然后用0℃预冷的PBS缓冲液洗涤3次。细胞可以通过用浓度都是5mg/ml的SA-PE和GaM-488在暗室中冰浴30分钟来检测,然后再洗三次,并用1ml的FACS缓冲液重悬。细胞中表现出的与scFv相关的荧光可以用荧光激活的细胞分选术(FACs)Cailibur流式细胞仪或Agilent 2100生物分析仪(Agilent技术公司)来测定。
实施例25:用pMAT6在哺乳动物细胞中表达可溶性scFv
用COS细胞依据实施例8介绍的方法来评估pMAT6在哺乳动物细胞中指导表达可溶性抗VEGF scFv融合蛋白的能力。简单地说,在无血清培养基中用1或2ug的pMAT6载体DNA来稀释FuGENE6试剂到3:1或3:2的比例。孵育15分钟后,将pMAT6载体DNA复合体转移到六孔板中的细胞中(2ml表达培养基(invitrogen)中有1.0 x 106个细胞)。细胞在37℃,95%的CO2条件下孵育72小时。收集上清液,用抗HAwestern印迹分析检测scFv-HA-GR1蛋白,并用抗VEGF酶联免疫吸附测定(ELISA)检测功能性scFv蛋白。
首先,用抗HA抗体珠依据Profound HA TagIP/Co-IP试剂盒(pierce)的说明从800ul的培养上清液中纯化scFv蛋白。然后,将纯化的scFv蛋白上到4-12%的SDS-PAGE胶(invitrogen)中进行电泳分离,然后转移到0.45的硝酸纤维素膜上依据ECLpus western印迹系统(amersham)的说明进行western印迹分析。简要地说,膜用5%的脱脂牛奶TBST溶液封闭,然后用鼠抗HA探针F7(SANTA CRUZBIOTECH)室温下孵育1小时。在用TBST洗涤三次以后,膜用过氧化物酶标记的抗鼠抗体孵育作用1小时。将洗过的膜放入检测溶液中作用5分钟。然后用x光片记录化学发光信号。图7A中所示的抗HA印迹实验结果标明pMAT6能够指导表达的scFv蛋白(大约35kd)进入COS6细胞培养上清液中。
用抗VEGF抗体ELISA分析方法进一步分析了从COS6细胞培养上清液中得到的ScFv蛋白的功能。简单地说,用100ul的浓度为2ug/ml的稀释rh VEGF(R&D系统)包被Maxisorp板过夜。用PBS洗涤两次后,用5%的牛奶PBS液室温下封闭1小时。再一次洗涤后,将50ul的各种浓度纯化scFv蛋白溶液放入孔中,室温下孵育1小时。洗涤后,加入50ul的鼠抗HA-探针F7(santa cruz biotech)室温下孵育1小时,在5%的牛奶PBS溶液中用1:2,000稀释的抗鼠抗体-HRP交联剂(Santa Cruz Biotech)孵育作用1小时。最后,加入ABTS底物进行显色反应。然后用96孔板监测器在OD405下监测(分子装置)。图7B中所示的ELISA结果说明了从两个独立的COS6细胞转染个体中监测到的VEGF在pMAT6培养上清液中的剂量依赖性结合活性,表明在哺乳动物细胞中酵母/哺乳动物pMAT6载体上的scFv的功能性表达。
实施例26:用pMAT6在哺乳动物细胞中展示scFv
pMAT6在哺乳动物细胞中的跨物种展示功能可以用以下的方法测定。在有混合了10%的胚胎牛血清,100单位/ml青霉素,100ug/ml链霉素的Dulbecco’s改性Eagle’s培养基的条件下,COS6细胞在六孔板的盖玻片上生长。pMAT6交叉展示载体和哺乳动物辅助载体pMAT2用FuGene 6转染试剂(Roche Applied Science)依据生产商的说明共转染入COS6细胞。简单地说,将800ng的质粒DNA(400ug的pMAT6加400ug的pMAT2)以FuGENE6试剂(ul):DNA复合物(ug)3:2的比例加入到无血清培养基中的稀释FuGENE6试剂中。FuGENE试剂DNA复合物在室温下孵育15分钟然后加入细胞中。
48小时后,在细胞表面展示的HA标记的scFv/GR1融合蛋白(来自pMAT6载体)可以用Alexa488交联的抗HA抗体监测。简单地说,COS6细胞用4%甲醛固定20分钟,用5%的BSA PBS溶液在25℃下封闭30分钟,然后用Alexa488结合的抗HA抗体(1:1000稀释,invitrogen)在PBS(1:500)中孵育60分钟。还用DAPI(Invitrogen)对细胞染色以观察细胞核。细胞在Zeiss Axiovert135显微镜用Plan-Neofluar100/1.30油物镜头观察。在细胞表面的HA标记的scFv-GR1就会发绿色荧光。
或者可以用FACS分析来鉴定表达目标多肽的宿主细胞。转染后48小时,最终密度为4 x 106个/ml的细胞可以用来染色。生物素标记的rh VEGF或VEGF-Fc加入细胞悬浊液中4℃下孵育60分钟。作为阴性染色对照,另外的细胞标本用生物素标记的大豆胰蛋白酶抑制剂染处理。然后用抗生物素蛋白-FITC或抗Fc抗体FITC在4℃下暗室中进一步孵育30分钟。用RDF1缓冲液洗涤细胞两次并用0.2ml RDF1缓冲液将细胞重悬,以便在FACS增强流式细胞仪(BD Biosciences)或Agilent2100生物分析仪(Agilent技术公司)下进行流式细胞分析。
实施例27:酵母和哺乳动物细胞上展示的目标蛋白的选择
可以将DNA文库插入pMAT4载体中,然后直接转化入基因组中已经整合了的酵母辅助载体pMAT3或pMAT7或pMAT8的拷贝的酵母细胞中。
展示具有目标特性的前导物的转化酵母细胞可以通过进行几轮流式细胞分选来分离。简单地说,酵母细胞可以在SD-CAA选择培养基中30℃下生长18-22小时,然后转移进SG/R-CAA表达培养基中20℃下生长16-18个小时。酵母细胞可以用生物素标记的抗原和5mg/ml的抗HA(12CA5)抗体室温下在FACS(PBS/0.5%BSA/2m MEDTA)洗涤缓冲液中孵育30分钟,再用冰预冷的洗涤缓冲液洗涤。用5mg/ml SA-PE和GaM-488在暗室里冰中处理细胞样品30分钟,用FACS洗涤缓冲液重悬细胞以进行流式细胞分析。
可以用BD Bioscience FACS升级DiVa纯化选择装置进行选择,可以确定分类门以分选目标双阳性细胞。收集的细胞和Penn/Strep铺在SD-CAA板上,在30℃下生长2天。然后细胞可以重悬并应用于下一个循环。经过2-3轮选择后,从酵母细胞中得到的载体DNA前导物的合并物可以用Zymoprep酵母质粒miniprep盒回收(ZymoResearch)。
最终得到的从酵母展示文库中分离的载体DNA可以直接通过和哺乳动物辅助载体pMAT2的共转染来转染入哺乳动物细胞进行表面展示。具有目标特性的前导物可以用几轮流式细胞分选来鉴定和收集。简单地说,10-20ug的DNA和在小玻璃管中用冰预冷PBS洗涤过的3x的106或HEK293或COS6细胞混合。在冰中静置10分钟后,细胞/DNA混合物用Genepulser X细胞装置(bio-rad)在250uF,660V下进行电穿孔转染。经过室温下孵育10分钟,细胞转移到75cm培养皿中的20ml的培养基上,在3℃,5%CO2条件下孵育2-3天。另外,FuGene 6转染试剂也可以用于转染。
下面是适合的选择程序。估计已经转染的107细胞可以用0.2nM生物素标记的抗原蛋白和20ug/ml的抗HA膜抗体(12CA5)在PBS缓冲液中25℃下孵育1小时。最后,细胞用冰预冷PBS缓冲液冲洗并用FITC标记的羊抗鼠FITC抗体(AMI0408;Biosource international,camarillo,CA)和亲和素R-PE偶联剂(S866;molecular probes)4℃下标记1小时。然后细胞就可以通过在FACS vantage SE(BDbiosciences)上用合适的分类窗口进行分类。收集最高的0.1%PE阳性细胞。从选择的细胞中回收的展示和辅助载体DNA转化入大肠杆菌细胞。只有含有f1复制起始点的展示载体可以被常规辅助噬菌体如KO7包装,KO7能够从哺乳动物辅助载体中将载体分离出来。回收的展示载体DNA可以进行下一轮FACS分选或进行DNA测序。
实施例28:在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中选择有功能的信号肽
在pMAT6载体中,适配体GR1/多肽融合蛋白的表达受3个启动子的驱动:哺乳动物细胞的SV40启动子;酵母细胞的pGAL10启动子;细菌细胞的pLac启动子。因此,如果载体包含在大肠杆菌,酵母和哺乳动物细胞中都起作用的信号肽(例如,将融合蛋白导向分泌途径),那么这个载体就可以用于在噬菌体、酵母和哺乳动物细胞中指导多肽的跨物种展示。
为了在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中分离具有分泌功能的信号肽,可以将信号序列文库克隆入包含测试蛋白例如抗VEGF cFv的表达盒的pMAT6载体中。得到的文库可以在噬菌体上展示并且可以用利用VEGF抗原的淘选程序选择。分离的噬菌体可以通过大肠杆菌中起作用的信号肽的存在来定性,该噬菌体可以通过VEGF结合活性来鉴定。合适的淘选程序包括用浓度为5ug/ml的VEGF在4℃下包被96孔板过夜,用PBS洗涤孔板然后用5%的牛奶/PBS溶液封闭。加入100ul的1011-12的噬菌体在室温下孵育2小时。经过用PBST和PBS若干次冲洗,结合的噬菌体用10ug/ml的胰酶洗脱30分钟。TG1细胞用洗脱的噬菌体感染,进行下一轮的噬菌体制备和淘选。经过重复这个过程2-3个循环,可以富集展示的噬菌体文库。富集的噬菌体用于感染大肠杆菌细胞,大肠杆菌细胞可以用来制备进行下一次酵母展示的载体DNA。
从噬菌体文库中选择出来的载体DNA小合并物(pool)随后可以直接转化入含有酵母辅助载体pMAT3或pMAT7或pMAT8拷贝的酵母细胞中。为了在酵母细胞表面展示功能性scFv,需要导向分泌途径的信号肽。携带功能性信号肽的酵母细胞可以通过进行几轮流式细胞分选来分离。合适的分类程序包含让酵母细胞在SD-CAA选择培养基上30℃下生长18-22小时,然后转移到SG/R-CAA表达培养基上20℃下培养16-18个小时。细胞可以用抗生物素标记的VEGF和5mg/ml的抗HA(12CA5)抗体室温下在FACS清洗缓冲液(PBS/0.5%BSA/2mMEDTA)中孵育30分钟,然后用冰预冷清洗缓冲液清洗。细胞随后可以通过和5mg/ml SA-PE和羊抗鼠抗体488暗室中冰上孵育30分钟来标记,然后用FACS清洗缓冲液重悬以进行流式细胞分选。选择可以通过纯化选择用的BD Bioscience FACS Vantage DiVa装置来进行,可以确定分类门来选择目标双阳性细胞。收集的细胞和Penn/Strep铺在SD-CAA板上,在30℃下生长两天。然后细胞可以重悬用于下一轮循环。经过2-3轮循环,从酵母细胞中得到的载体DNA可以用zymoprep酵母质粒miniprep试剂盒(Zymo Research)依照说明回收。
如果上述的噬菌体和酵母的选择程序已经用于鉴定在大肠杆菌和酵母中起作用的信号肽,另外具有可以在哺乳动物细胞中起作用的特性的信号肽的鉴定可以通过将文库引入哺乳动物展示系统来进行第三次选择实现。从噬菌体和酵母展示系统中选择出来的前导(lead)DNA可以直接转染到哺乳动物细胞中进行表面表达。简要地说,20ug的前导DNA通过上述方法转染入HEK293细胞或COS6细胞。经过两天的培养,转染细胞可以用0.2nM的生物素标记抗原VEGF和20ug/ml的抗HA膜抗体12CA5在PBS缓冲液中25℃下孵育1小时。最后,细胞用冰预冷PBS缓冲液洗涤,用FITC标记的羊抗鼠FITC(AMI0408;biosource international.Camarillo.CA)和亲和素-R-PE偶联剂(S866;molecular probes)通过在4℃下孵育1小时来标记。然后细胞就可以通过在FACS Vantage SE(BD bioscience)上在合适的分类窗中分类。收集最高的0.1%PE阳性细胞。含有f1起始位点的载体DNA可以通过噬菌体包分离。在这些分离后,通过噬菌体、酵母和哺乳动物展示来分离的信号肽在大肠杆菌,酵母和哺乳动物中是有功能的。为了确证这一点,从各个克隆中得到的DNA直接用于分别转化大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞。从这些细胞中分泌的可溶性scFv可以用抗VEGFELISA依前述方法检测。
在原核和真核宿主细胞上的跨物种展示
实施例29:细菌辅助载体pMAL1
图13A中的pMAL1是从完全人工合成的3822bp的片段中通过Pcil位点的自主连接得到的。这个完全人工合成的DNA包含(1)细菌调节元件序列,包括复制所需的pUC起始位点,噬菌体包装所需的f1起始位点和氯霉素选择标记的表达盒;(2)具有细菌外表面结构域(PelB signal-Lpp-ompA)的适配体2(GR2)(SEQ ID:20)的表达盒。简单地说,合成的DNA分成2个片段1851bp和2019bp来通过用CodonDevices’BioFab平台技术进行基因的合成。寡核苷酸合成中的错误可以通过与合成基因序列互补的寡核苷酸选择和Mut-S蛋白柱的亲和力纯化来纠正。在两端有PciI限制性位点的合成DNA片段被消化和连接。得到的载体(SEQ ID NO:17)用标准DNA测序来证实。
实施例30:细菌辅助载体pMAL2
图13B中的pMAL通过在pMAL1载体中用完全人工合成的1006bp的DNA片段替换PciI-BssHII片段得到的,这个人工片段包含与适配体2(GR2)(SEQ ID NO:20)融合的Lpp-OmpA细菌外表面结构域的表达盒。融合蛋白的表达由p8噬菌体信号肽引导。
简要地说,合成DNA是通过使用Codon device’BioFab平台技术来生成。寡核苷酸合成中的错误可以通过与合成基因序列互补的寡核苷酸选择和Mut-S蛋白柱的亲和纯化来纠正。得到的载体(SEQ IDNO:17)用标准DNA测序来证实。
实施例31:scFv在大肠杆菌和哺乳动物宿主细胞上跨物种展示
如上所述,载体pMAG9用来在多种物种的宿主细胞中表达多肽,实施例2、6、9中描述了pMAG9和辅助表达载体一同来引导蛋白文库在噬菌体和哺乳动物细胞表面展示。相似的是,此载体同样也可以用于在细菌和哺乳动物细胞上的交叉展示。细菌细胞的展示可以按下述方法进行。
表达载体pMAG9载体和细菌辅助表达载体pMAL1或pMAL2的共转化会诱导大肠杆菌表达两种融合蛋白:可溶性scFv-GR1(蛋白/适配体1)和Lpp-OmpA-GR2(表面蛋白/适配体2)。GR1和GR2融合蛋白分泌入细菌周围环境中,并且会通过GR1和GR2的相互作用装配形成蛋白复合物。得到的蛋白复合物通过Lpp-OmpA外膜锚定结构域的作用展示在细胞表面。
简单地说,细胞可以用携带氨苄青霉素选择标记的pMAG9表达载体转化,然后用携带氯霉素选择标记的质粒包装辅助载体pMAL1或Pma12感染。携带展示和辅助载体的细胞可以在包含1%的葡萄糖和100ug/ml氨苄青霉素和30ug/ml氯霉素的2YT培养集中生长直到OD600=0.5,然后转移到不含葡萄糖的适于适配体融合蛋白表达的生长培养基上。经过4-6小时的孵育,细胞用生物素标记的抗原VEGF和5mg/ml的抗HA(12CA5)抗体在FACS清洗缓冲液(PBS/0.5%BSA/2mM EDTA)中室温下孵育30分钟,用冰预冷缓冲液清洗。然后细胞通过和5mg/ml的SA-PE和GAM-488暗室中冰上孵育30分钟来标记,然后在FACS清洗液中重悬以备FACS分析。当抗VEGF scFv文库用这种方法展示的时候,展示scFv蛋白的细胞可以通过上述方法标记,并且可以通过流式细胞术进行分选。表达载体的前导物(leads)可以通过在只含有氨苄青霉素的2YT/葡萄糖培养基上生长来同辅助载体区分开来。
实施例32:scFv在大肠杆菌和酵母之间的跨物种展示
如本文所述,Pmat5可以用于噬菌体和酵母细胞(见实施例12到19)之间的交叉展示,以及细菌和酵母细胞的细胞表面展示。共转染pMAT6载体和细菌辅助载体pMAL1或pMAL2的受体宿主细胞表达两种融合蛋白:可溶性scFv-GR1和Lpp-OmpA-GR2融合体。GR1和GR2融合蛋白分泌入细菌周围环境中,并且会通过GR1和GR2的相互作用装配形成蛋白复合物。scFv-GR1蛋白通过Lpp-OmpA外膜锚定结构域的作用展示在细胞表面。
简单地说,细胞可以用携带氨苄青霉素选择标记的展示载体转化,然后用携带氯霉素选择标记的质粒包装辅助载体pMAL1或pMAL2感染。携带展示和辅助载体的细胞可以在包含1%的葡萄糖和100ug/ml氨苄青霉素和30ug/ml氯霉素的2YT培养集中生长直到OD600=0.5,然后转移到不含葡萄糖的适配体融合蛋白表达的生长培养基上。经过4-6小时的孵育,细胞用生物素标记的抗原VEGF和5mg/ml的抗HA(12CA5)抗体在FACS清洗缓冲液(PBS/0.5%BSA/2mM EDTA)中室温下孵育30分钟,用冰预冷缓冲液清洗。然后细胞通过和5mg/ml的SA-PE和GaM-488暗室中冰上孵育30分钟来标记,然后在FACS清洗液中重悬以备FACS分析。当抗VEGF scFv文库用这种方法展示的时候,展示scFv蛋白的细胞可能可以通过上述方法标记,并且可以通过流式细胞术进行分选。展示载体的前导物可以通过在只含有氨苄青霉素的2YT/葡萄糖培养基上生长来同辅助载体区分开来。
酵母细胞展示用的pMAT5展示载体见实施例19。
序列表
<110>Abmaxis,Inc.
<120>多物种展示系统
<130>AX0006Y PCT
<150>60/746,489
<151>2006-05-04
<160>20
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>载体pMAG1
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<212>PRT
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<220>
<223>GR2
<400>20
Claims (20)
1.一种跨物种展示系统,用于在原核宿主细胞和真核宿主细胞中依次展示目标多肽序列总文库,不需要操作编码目标多肽序列的表达载体,所述系统包含跨物种展示载体组,所述载体组由以下组分组成:1)包含一个或多个启动子和跨物种表达盒的跨物种表达载体,所述跨物种表达盒编码与第一适配体序列框内融合的目标蛋白;2)编码融合蛋白的第一辅助载体,所述融合蛋白由与原核宿主表达的外表面蛋白融合的第二适配体序列组成,所述第二适配体序列以配对方式与展示载体的第一适配体序列相互作用;3)编码融合蛋白的第二辅助载体,所述融合蛋白由与真核宿主细胞表达的外表面蛋白融合的第二适配体序列组成。
2.权利要求1的跨物种展示系统,其中目标多肽序列总文库是抗体文库。
3.权利要求2的跨物种展示系统,其中原核宿主是噬菌体,真核宿主是酵母菌。
4.权利要求3的展示系统,其中跨物种表达载体选自pMAG1、pMAG9、pMAT2、pMAT4、pMAT6或pMAT5,第一和第二辅助载体选自GMCT、pMAG2、pMAL1、pMAL2、pMAT3、pMAT7和pMAT8。
5.权利要求4的跨物种展示系统,其中跨物种表达组包含:a)展示载体pMAT5,b)辅助载体GMCT和c)选自pMAT3、pMAT7或pMAT8的第二酵母辅助载体。
6.权利要求2的展示系统,其中第一和第二适配体序列来源于卷曲螺旋结构域。
7.权利要求6的展示系统,其中第一适配体序列由SEQ ID NO:19组成,第二适配体序列由SEQ ID NO:20组成。
8.权利要求2的展示系统,其中原核宿主是噬菌体,真核宿主是哺乳动物,并且跨物种载体组包含展示载体pAMG9和辅助载体GMCT和pMAG2。
9.用选自pMAT3、pMAT7或pMAT8的辅助载体转化的酵母宿主细胞。
10.在适当的包装中包含权利要求1的跨物种展示载体组的试剂盒。
11.多物种展示系统,其包含:1)多物种表达载体,该载体包含一个或多个启动子、编码目标蛋白的表达盒,所述目标蛋白与第一适配体序列框内融合;2)编码融合蛋白的辅助载体,所述融合蛋白由与外表面蛋白融合的第二适配体序列组成,所述第二适配体序列以配对方式与第一适配体序列相互作用,所述外表面蛋白由被选择进行展示的某物种宿主细胞表达;3)至少两种不同物种的宿主细胞。
12.权利要求11的展示系统,其中目标蛋白是抗体文库。
13.权利要求11的展示系统,其中第一和第二适配体序列来源于卷曲螺旋结构域。
14.权利要求13的展示系统,其中第一适配体序列由SEQ IDNO:19组成,第二适配体序列由SEQ ID NO:20组成。
15.权利要求12的多物种展示系统,其中两种不同物种的宿主细胞是原核的。
16.权利要求15的展示系统,其中展示载体选自pMAG1或pMAG9。
17.权利要求3的展示系统,其中跨物种表达载体选自pMAG1、pMAG9、pMAT2、pMAT4、pMAT6或pMAT5,第一和第二辅助载体选自GMCT、pMAG2、pMAL1、pMAL2、pMAT3、pMAT7和pMAT8。
18.权利要求11的展示系统,其中两种不同物种的宿主细胞是真核的。
19.权利要求18的展示系统,其中展示载体选自pMAG1(SEQ IDNO:1)或pMAG9(SEQ ID NO:2)。
20.权利要求18的展示系统,其中展示载体是pMAG9,辅助载体是pMAG2,宿主细胞是酵母和哺乳动物细胞。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20090819 |