CN113164766A - RGMc选择性抑制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

描述了排斥性导向分子C(RGMc)的选择性抑制剂。还提供了相关方法，包括这些抑制剂的制备方法以及这些抑制剂在障碍如贫血治疗中的治疗用途。

Description

RGMc选择性抑制剂及其用途
相关申请的交叉引用
本国际专利申请要求于2018年10月23日提交的美国临时专利申请系列第62/749,469号的利益和优先权，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明一般地涉及RGMc结合剂(例如，抗体和包含抗原结合片段的分子)，其特异性地和选择性地抑制RGMc而不抑制RGMa或RGMb。
发明背景
铁体内平衡的异常与许多可能难以治疗的疾病有关。此类障碍可大致分为两类：i)铁超载疾病，其包括肝硬化、心肌病、糖尿病等；和ii)缺铁性疾病，其包括铁限制性贫血、慢性病性贫血(“ACD”)等。
铁调素是系统性铁内稳态的关键调节剂，其表达主要局限于肝脏。铁调素作为原肽产生，并通过弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶加工成成熟的活性肽。铁调素通过结合其受体铁转运蛋白(唯一的细胞铁输出蛋白)并引起两者的内化和降解而负调节铁利用率。因此，铁调素阻断铁从对于膳食铁吸收(肠上皮细胞)、血红蛋白铁再循环(巨噬细胞)和储存铁从肝细胞释放的关键细胞的输出，从而导致系统铁利用率降低。通过发现铁调素基因的失活与肝脏和胰腺中的严重铁超载相关，很快明确地认识到铁调素在系统性铁内稳态中的重要作用。
已经显示，维持小鼠的铁内稳态需要BMP6和BMP2表达。骨形态发生蛋白6和2(分别BMP6和BMP2)都是生长因子TGFβ超家族的成员，其已知参与多种生物学过程，包括铁代谢/内稳态。已经显示出BMP6和BMP2表达是维持小鼠铁内稳态所需要的。与它参与铁调节的观点一致，BMP6的遗传损害导致严重的组织铁超载。类似地，在患有遗传性血色素沉着病的患者中发现了BMP6突变，遗传性血色素沉着病是以实质铁超载为特征的异质性遗传障碍组。
BMP6结合I型和II型丝氨酸苏氨酸激酶受体(例如，Alk2、Alk3、BMPR2和ActRIIA)。此外，BMP6还被证明直接结合其共受体，排斥性导向分子C或RGMc，也称为铁调素调节蛋白或HJV。BMP6与其受体结合，进而与更大的多聚体复合体(包括HJV、HFE、TFR2和再生蛋白(neogenin))结合，激活细胞内SMAD磷酸化，其诱导核易位和增加的铁调素转录。因此，BMP6/HJV/SMAD轴是响应于铁状态的铁调素表达的主要调节子。
目前可用于治疗涉及贫血(例如，化学疗法诱导的贫血和慢性肾脏病的贫血)的临床适应症的疗法包括静脉注射铁剂(例如，补铁剂和输血)和促红细胞生成刺激剂(ESA)。ESA的实例包括促红细胞生成素(Epo)；依泊汀α(Procrit/Epogen)；依泊汀β(NeoRecormon)；达贝泊汀α(Aranesp)；和甲氧基聚乙二醇-依泊汀β(Mircera)。这些疗法是次优的，并且还可能与不良副作用或不良事件(例如，铁超载、心血管疾病和致癌风险)相关。
在经常接受补铁剂(例如IV铁)的贫血患者中，铁超载是危险的副作用。过量的体内铁可能具有高毒性，其可能会影响许多器官，从而导致各种严重疾病，例如肝病、心脏病、糖尿病、激素异常和免疫系统功能异常。类似地，接受输血的患者也有与铁超载相关的毒性风险。例如，一单位输血含有大约250毫克的铁。在接受许多输血的患者中，特别是患有重型地中海贫血、镰状细胞病、骨髓增生异常综合症、再生障碍性贫血、溶血性贫血和难治性铁粒幼细胞性贫血的患者(其可能变成输血依赖的)，来自输血红细胞的过量铁逐渐积累在各种组织中，从而导致发病和死亡。因此，治疗引起的体内过量铁可导致严重的不良反应，包括对心血管、胃肠道、免疫、骨骼/软骨、生殖和肾脏系统的毒性。作为IV铁的附加或替代治疗选择，ESA(例如，EPO，如Amgen的
Figure BDA0003106722380000031
)治疗已广泛应用于众多患者群体，包括患有癌症相关和化疗诱导的贫血的患者。然而，自相矛盾的是，临床前和临床研究表明，ESA(例如，EPO)可能潜在地加速肿瘤的生长并危及癌症患者的生存。
为尝试避免与外用ESA和补铁剂(如输血)相关的这些不良副作用中的至少一些，低氧诱导因子脯氨酰羟化酶(HIF-PH)作为目标在于促进内源性EPO产生的潜在治疗靶标受到了广泛关注。为此，最近，正在开发许多HIF稳定剂(例如，HIF-PH抑制剂)。这些包括，例如，罗沙司他(Fibrogen)、达普司他(GSK)、伐度司他(Akebia)和莫立司他(Bayer)。尽管早期的疗效数据显示优于或不劣于ESA治疗，但是，长期的关心仍然在于主要的不良心血管事件风险和增加的癌症风险。特别是，由于HIF轴在体内调节广泛的关键生物学功能(例如，血管生成)，该途径的系统性干预可能导致超出预期的对红细胞生成作用的不良作用。
作为替代的途径，一些公司正在探索BMP6抑制剂(包括中和抗体)以试图治疗贫血患者(例如抗BMP6抗体，例如，WO 2016/098079，Novartis；和KY-1070，KyMab)。然而，这些抑制剂存在着不利地调节BMP6信号传导的其他方面的风险，包括骨骼和软骨形成、卵巢功能和脂肪代谢。
另外地，在2015年的一篇论文(The AAPS Journal 17(4):930-938)中，
Figure BDA0003106722380000032
等(AbbVie)描述了使用两种临床前模型在治疗与铁调素失调有关的贫血病症中与RGMa和RGMc两者(即RGMa/c)结合的两种抗体的治疗用途，这表明非选择性RGMa/c抗体增强体内铁动员。然而，尽管推测RGMa既可以起到肿瘤抑制作用，又可以起到免疫调节剂的作用，但该论文并未讨论抑制RGMa途径的潜在长期风险。
因此，仍然存在提供改善的治疗方法用于铁相关疾病，特别是由过量铁调素引起的铁限制性障碍，例如，慢性病性贫血(ACD)、铁难治性缺铁性贫血(IRIDA)和慢性肾脏病(CKD)贫血的显著未满足的需要。
发明概述
本公开的发明人认识到实现更高水平的选择性以更特异性地抑制调节铁内稳态的信号传导途径而同时使潜在的不希望的系统性效应最小化的益处。为此，发明人试图通过特异性靶向排斥性导向分子c(RGMc)，也称为铁调素调节蛋白(HJV)或2型血色素沉着症蛋白(HFE2)，而以肝选择性的方式抑制BMP6信号传导。有理由认为，与影响其他生物学功能所需的另外的途径的现有方法相比，以这种方式，RGMc-选择性抑制剂可以提供用于治疗铁限制性障碍的功效而同时获得改善的安全性特性。因此，可以预期，根据本发明的RGMc-选择性抑制剂可以实现改善的安全性特性(例如，降低的毒性或不良事件/作用)，例如降低主要的不良心脏事件(例如，中风)的风险和/或降低癌症发展的风险。有利地，RGMc-选择性抑制剂可以降低与外源施用的铁(例如，IV铁或输血)相关的铁超载的风险。RGMc-选择性抑制剂可以使铁限制性贫血患者需要较少剂量的ESA和/或铁补充疗法，例如，较低频率的IV铁或输血。
RGMc是RGM类蛋白质(即，RGMa、RGMb和RGMc)的成员。据报道，RGM与BMP类生长因子的多个成员(包括BMP6)相互作用。RGMc在哺乳动物中以膜结合和可溶形式表达，并在BMP6轴内的铁内稳态/代谢中起作用。
RGMa和RGMb两者都被发现于神经和免疫系统中，而RGMc则被发现于骨骼肌中，但主要存在于肝脏中。尽管这些家族成员中的每一个共有显著的结构同源性，尤其是在其BMP结合域上，但它们的生理作用却大不相同。据报道，RGMa和RGMb在神经系统生物学、免疫、炎症、血管生成和生长中起作用。与RGMa和RGMb不同，RGMc的已知功能主要局限于肝细胞。这样，识别不与RGMa或RGMb结合的RGMc选择性抗体可为BMP6生物学的肝脏特异性调节提供可能。
因此，RGMc是肝脏表达的对于某些BMP(例如BMP6)的专性共受体，该BMP增强铁调素的表达且因此抑制铁的转运。换句话说，通过靶向其表达比RGMa、RGMb和BMP6更具限制性的RGMc，可以实现更多的组织特异性作用而同时减少脱靶作用。这种方法呈现了同时解决铁限制性贫血和铁超载病症而不会广泛抑制全身的RGM和BMP6功能的可能。
因此，本发明包括认识到，与常规方法(例如，直接的BMP6拮抗剂和RGMc/RGMa/RGMb的非选择性抑制剂)相比，RGMc的选择性靶向为实现功效和安全性(降低的毒性)提供了有利的途径。有利地，不同于非选择性结合RGMc的现有技术的抗体(参见，例如，PCT/US2012/069586)，本发明的抗体相对于RGMa和RGMb对RGMc具有选择性。
因此，在一个方面，本发明提供了RGMc特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于它们选择性地与RGMc结合。在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其与人RGMc选择性结合，并且不与人RGMa和人RGMb结合或与其结合减少。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段抑制或减少RGMc与BMP(例如，BMP6)的整合。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不抑制或减少RGMc与再生蛋白的相互作用。
在其他方面，本发明提供了与RGMc上的特定部分结合的RGMc特异性抗体或其抗原结合片段，其可以提供特别有利的相对于RGMa/b对RGMc的选择性。在一些实施方式中，本发明涵盖的RGMc特异性抗体结合人RGMc的第一和/或第二结合区，其中该第一结合区是α1螺旋结构域内的YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)，以及该第二结合区域是α3螺旋结构域内的FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合第一结合区内的至少一个氨基酸残基和/或结合第二结合区内的至少一个氨基酸残基。
因此，本公开提供了结合包含YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的一个或多个氨基酸残基，任选地还包含FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的一个或多个氨基酸残基的表位的RGMc选择性抗体。
本公开提供了结合包含FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的一个或多个氨基酸残基，任选地进一步包含YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的一个或多个氨基酸残基的表位的RGMc选择性抗体。
在一些实施方式中，RGMc选择性抗体结合包含YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的一个或多个氨基酸残基和FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的一个或多个氨基酸残基的表位。
在其他方面，本发明提供了RGMc特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体由其互补决定区(CDR)的氨基酸序列和变体定义。例如，抗体可以包含一个或多个选自SEQ IDNO:6-11、SEQ ID NO:14-19、SEQ ID NO:22-27、SEQ ID NO:30-35和SEQ ID NO:38-43的CDR序列。在一些实施方式中，与相应的CDR序列相比，每一个CDR包含最多1、2、3、4或5个氨基酸残基变异。
在其他方面，本发明提供了RGMc特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体由其重链可变区和/或轻链可变区序列定义。例如，在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:44所示的氨基酸的重链可变区。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含本文公开的重链可变区和轻链可变区。在一些实施方式中，该重链可变区和/或轻链可变区所具有的氨基酸序列与本文公开的重链可变区和轻链可变区至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在其他方面，本发明提供了与本文公开的抗体竞争结合人RGMc和/或结合相同表位的RGMc特异性抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，根据本公开的优选抗体具有以下特征：i)这类抗体的作用机制为使得抗体结合RGMc，从而在BMP6-铁调素信号传导轴中直接竞争BMP6结合；ii)此类抗体是相对于RGMa或RGMb的RGMc选择性结合物，优选没有对于其的可检测的交叉反应性；iii)此类抗体对人RGMc、啮齿动物(小鼠和大鼠)和非人类灵长类(例如，食蟹猴)显示出物种交叉反应性；iv)此类抗体对人类且还优选对啮齿动物RGMc具有亲和力，其KD等于或小于1nM(即，KD≤1nM)，更优选地≤0.1nM；v)此类抗体在24-48小时后(优选24小时后)，在一种或多种合适的临床前模型(例如，大鼠)中以10mg/kg或更低剂量(优选5mg/kg或更低，例如，1mg/kg或更低)显示出体内功效；和/或vi)此类抗体允许制剂的溶解度至少为50mg/mL，更优选≥100mg/mL(用于潜在的皮下给药)。在特别优选的实施方式中，满足所有以上标准(i)-(vi)。
在其他方面，提供了包含本文公开的抗体的药物组合物，以及此类抗体/组合物的治疗用途。这样的抗体和组合物可以用于在人类受试者中治疗与RGMc相关的疾病的方法中。在一些实施方式中，与RGMc相关的疾病是贫血，例如，铁限制性贫血(或功能性铁缺乏症)。在一些实施方式中，贫血可以是缺铁性贫血(IRIDA)、慢性病性贫血(ACD)、治疗诱导的贫血(例如，化学疗法诱导的贫血)、癌症相关性贫血或与慢性肾病(CKD)相关的贫血。CKD可以是透析依赖性CKD。CKD可以是非透析依赖性CKD。
在一些实施方式中，可以将药物组合物/抗体施用于正在接受或已经接受另一种治疗剂(例如，促红细胞生成素刺激剂、HIF稳定剂、铁补充剂、铁输注、抗癌剂和/或抗炎药)的患者。在一些实施方式中，该方法降低了与ESAs、铁补充剂或铁输注相关的毒性。
因此，当与用于贫血的另一种疗法(例如，促红细胞生成素刺激剂、HIF稳定剂、铁补充剂、铁输注、抗癌剂和/或抗炎药)联合使用时，本文公开的RGMc选择性抑制剂可以减少对治疗的需要，从而可以减少治疗的剂量和/或频率。
在一些实施方式中，当与另一种贫血疗法(例如，促红细胞生成素刺激剂、HIF稳定剂、铁补充剂、铁输注、抗癌剂和/或抗炎药)结合使用时，该药物组合物/抗体可用于实现更快的贫血缓解。
在一些实施方式中，药物组合物/抗体可用于减少患者中与铁疗法例如输血和IV铁相关的铁超载。
在一些实施方式中，药物组合物/抗体可用于使ESA低反应性贫血致敏。例如，大约5-10％的接受ESA治疗的CKD患者显示出对ESA的低反应性(ESA抵抗)。本文公开的RGMc-选择性抑制剂可用于使这种类型的贫血对ESA疗法更敏感。
根据本发明，本文涵盖的RGMc-选择性抑制剂可以有效实现以下一项或多项的量用于治疗贫血：增加受试者的血清铁、下调受试者中铁调素的表达、增加受试者的转铁蛋白饱和度、增加受试者的红细胞生成、降低受试者的不饱和铁结合能力(UIBC)、降低受试者的总铁结合能力(TIBC)和/或提高受试者的血清铁蛋白水平。
另一方面，本发明提供了用于制备包含RGMc选择性抑制剂的药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：i)鉴定抗体或其抗原结合片段相对于RGMa和RGMb选择性地结合RGMc的能力；ii)基于步骤(i)鉴定抗体或抗原结合片段在体内抑制/中和RGMc活性的能力；iii)基于步骤(i)和(ii)选择抑制/中和抗体以配制成药物组合物。在一些实施方式中，制备方法还包括正向选择步骤和任选地负向选择步骤。在一些实施方式中，鉴别步骤(ii)还包括测量选自以下的铁参数：血清铁、TIBC、UIBC、铁调素表达和转铁蛋白饱和度。
附图简述
图1描绘了炎症/慢性病性贫血中铁调素和血清铁水平之间的关系。该图还显示了RGMc拮抗剂(例如，RGMc特异性抗体)如何预期降低铁调素水平并增加血清铁。
图2是显示第一代RGMc特异性抗体对RGMa、RGMb和RGMc的
Figure BDA0003106722380000081
结合亲和力的图。
图3A描绘了使用HepG2细胞的体外BMP6活性测定。BMP6活性(平均值±SD)增加表明抗体介导的BMP6与RGMc结合的抑制。图3B是显示在存在SR-RC-AB3和SR-RC-AB4的情况下BMP6活性(平均值±SD)增加的图。与阴性同种型对照一起，高亲和力非特异性RGM结合蛋白用作阳性对照。
图4A是显示亲和力成熟的RGMc抗体与RGMa-his(单价形式)或RGMa-Fc(avid形式)的结合的图。RGM01(高亲和力非特异性RGM结合蛋白)用作阳性对照。图4B显示与人和小鼠RGMc抗原两者的交叉反应性在整个亲和力成熟过程中维持。
图5A是显示在体外BMP6测定中亲和力成熟的抗体的SR-RC-AB3家族的活性(平均值±SD)的图。图5B是显示在体外BMP6测定中亲和力成熟的抗体的SR-RC-AB4家族的活性(平均值±SD)的图。与阴性同种型对照一起，高亲和力非特异性RGM结合蛋白用作阳性对照。
图6A是显示亲和力成熟的抗体对大鼠血清铁水平(平均值±SD)的影响的图。图6B是显示亲和力成熟的抗体对大鼠的未结合铁结合能力(UIBC)(平均值±SD)的影响的图。与阴性同种型对照一起，高亲和力非特异性RGM结合蛋白用作阳性对照。通过单因素方差分析相对于同种型对照确定显著性；*p值<0.05，**p值<0.01，***p值<0.001。
图7A是显示当用20mg/kg的单剂量SR-RC-AB8或SR-RC-AB9处理时，雌性Sprague-Dawley大鼠中随时间的血清铁水平(平均值±SEM)的图。同种型抗体用作对照。图7B显示了PK/PD研究中的血清铁(顶部)和UIBC(底部)测量值(平均值±SEM)，其中以0.6mg/kg至20mg/kg向雌性Sprague-Dawley大鼠施用单一IV剂量的SR-RC-AB8(n＝5-11只动物/组)。图7C显示了与图7B相同的动物体内的抗体血清浓度(平均值±SEM)。图7D示出了在20mg/kg下抗体暴露(PK)和铁参数(PD)之间的关系(所有值是平均值±SEM)。
图8A是显示在SR-RC-AB9 Fab存在下代表RGMc区域A和B的肽中氘吸收减少的图。
图8B描绘了RGM家族蛋白质比对的氘保护区域A和B的氨基酸序列。
图8C是在存在BMP2的情况下对RGMc的结构建模的图。突出显示的是H/D交换保护的区域A和B。
图8D是将SR-RC-AB9 fab表位映射到BMP2结合位点上并突出显示H/D交换保护的区域B内的潜在接触残基的图。
图8E是显示在RGMa/b/c的α螺旋1/2/3内H/D交换保护的区域A的结构同源性并突出显示相对于RGMa和RGMb，SR-RC-AB9对RGMc的特异性的潜在结构决定子的图。
图8F是突出显示CDR H1-H3的描绘抗体的Fab片段的典型结构的图，其可以跨越RGMc的结合区A和B的表面。
图9A显示了在雌性食蟹猴中10mg/kg的SR-RC-AB8单次I.V.剂量后随时间的血清铁参数(血清铁和UIBC，平均值±SEM)。图9B显示了给药后长达10周的SR-RC-AB8的平均血清浓度(平均值±SEM)。图9C示出了抗体暴露(PK)和血清铁参数(PD)之间的关系。所有值均为平均值±SD。
图10A显示了在雌性Lewis大鼠的慢性病性贫血(ACD)的PGPS模型中每周注射单独或与依泊汀(epoietin)α(EPO)(10μg/kg)组合的20mg/kg的SR-RC-AB8，血清铁相对于第-3天基线的变化(平均值±SEM)。图10B(平均值±SD)显示了第24天的绝对血清铁水平。通过单因素ANOVA相对于ACD同种型对照确定显著性；**p值<0.01。图10C显示了响应于每周给药SR-RC-AB8(20mg/kg)、EPO(10μg/kg)或两者的血红蛋白相对于第-3天的基线测量的变化(平均±SEM)。图10D中显示第24天的绝对血红蛋白水平(平均值±SD)。通过单因素ANOVA相对于ACD同种型对照来确定显著性；**p值<0.01。
发明详述
定义
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。这些定义应根据本公开的其余部分并如本领域普通技术人员所理解的来阅读。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。另外的定义在整个详细说明中阐述。
亲和力：亲和力是分子(例如，抗体)与其配体(例如，抗原)结合的强度。它通常通过平衡解离常数(KD)进行测量和报告。KD是抗体的抗体解离速率(“解离速率”或Koff)(抗体与其抗原多快解离)与抗体结合速率(“结合速率”或Kon)(抗体与抗原多快结合)的比率。例如，亲和力≤5nM的抗体具有的KD值为5nM或更低(即，5nM或更高的亲和力)，其通过合适的体外结合分析法(例如，基于生物膜层干涉术(BLI)的分析法(例如，
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)、基于表面等离子体共振(SPR)的分析(例如，Biacore)和基于溶液平衡滴定的分析(例如，Meso ScaleDiscovery或MDS)测定。
贫血：贫血是其中红细胞计数或血红蛋白低于正常的一种医学病症。对于男性，贫血通常定义为小于13.5克/100ml的血红蛋白水平，而对于女性，则定义为小于12.0克/100ml的血红蛋白。贫血可能由于红细胞或血红蛋白生成减少或者红细胞损失(通常是由于出血)或破坏的增加所导致。贫血可以通过例如测量血清铁参数来诊断，其中当其偏离正常范围时，血清铁参数可以指示贫血。有用的铁参数包含：血清铁、总铁结合能力(TIBC)、不饱和铁结合能力(UIBC)和转铁蛋白饱和度。转铁蛋白饱和度可以用血清铁除以总铁结合能力(TIBC)(以百分比表示)来计算。
慢性病性贫血：如本文所用，术语“慢性病性贫血”或“ACD”是指由另一种病症导致的贫血形式。此类病症可能与慢性感染、慢性免疫激活和/或恶性肿瘤(例如，慢性肾病或癌症)相关。
抗体：术语“抗体”涵盖任何天然存在的、重组的、修饰的或工程化的免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构或其抗原结合片段或部分或者其衍生物，如本文其他地方进一步描述的。因此，该术语是指特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，并且包括例如，嵌合的、人源化的、全人的和双特异性的抗体。完整的抗体通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包含较少的链，例如骆驼科动物中天然存在的抗体，其可包含仅重链。抗体可以仅源自单一来源，也可以是“嵌合”的，即抗体的不同部分可以源自两种不同的抗体。抗体或其抗原结合部分可以在杂交瘤中产生，通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解而产生。如本文所用，术语抗体分别包括单克隆抗体、双特异性抗体、小抗体、结构域抗体、合成抗体(有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、抗体融合体(本文有时称为“抗体缀合物”)。在一些实施方式中，该术语还涵盖肽体(peptibody)。
抗原：术语“抗原”广泛地包括在抗体或片段特异性与其结合的结合区域内包含抗原决定簇的任何分子。抗原可以是单亚基分子(例如，蛋白质单体或片段)或由多种成分组成的复合物。抗原提供能够被选择性结合剂如抗原结合蛋白(包括例如，抗体)结合的表位，例如分子或分子的一部分，或者分子或分子的部分的复合物。因此，选择性结合剂可以特异性结合由复合物中的两种或更多种组分形成的抗原。在一些实施方式中，抗原能够用于动物中以产生能够结合该抗原的抗体。抗原可以具有一个或多个能够与不同的抗原结合蛋白(例如，抗体)相互作用的表位。
抗原结合部分/片段：如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个片段，其保留与抗原(例如，RGMc/HJV)特异性结合的能力。抗原结合部分包括但不限于，特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或遗传工程的多肽或糖蛋白。在一些实施方式中，抗体的抗原结合部分可以，例如，使用任何合适的标准技术例如蛋白水解消化或重组遗传工程技术(涉及编码抗体可变域和任选地恒定域的DNA的操纵和表达)从全抗体分子衍生。抗原结合部分的非限制性实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子(参见，例如，Bird等，(1988)SCIENCE 242:423-426；和Huston等(1988)PROC.NAT’L.ACAD.SCI.USA 85:5879-5883)；(vi)dAb片段(参见，例如，Ward等，(1989)NATURE 341:544-546)；和(vii)由模拟抗体的高变区(例如，分离的互补决定区(CDR))的氨基酸残基组成的最小识别单元。也包含其他形式的单链抗体，例如双抗体。术语抗体的抗原结合部分包括“单链Fab片段”，另外称为“scFab”，其包含抗体重链可变区(VH)、抗体恒定区1(CH1)、抗体轻链可变区(VL)、抗体轻链恒定区(CL)和接头，其中所述抗体结构域和所述接头沿N端至C端方向具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；和其中所述接头是至少30个氨基酸，优选32至50个氨基酸的多肽。
结合区：如本文所用，“结合区”是抗原的一部分，当与抗体或其片段结合时，其可以形成抗体-抗原相互作用的界面。在抗体结合时，结合区变为受到保护而免于表面暴露，这可以通过合适的技术检测，例如氢氘交换质谱法(HDX-MS)。抗体-抗原相互作用可以通过多个(例如两个或更多个)结合区域来介导。结合区可包含抗原决定簇或表位。
生物膜层干涉术(BLI)：BLI是一种用于光学测量生物分子的相互作用，例如固定在生物传感器尖端表面上的配体与溶液中的分析物之间，的无标记技术，其能够抗体亲和力的实时测量。BLI提供了以精确度和准确性监测结合特异性、缔合(例如“结合”速率)和解离(例如“解离”速率)的速率或浓度的能力。BLI平台仪器可以从例如ForteBio商购获得，并通常被称为
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系统。
BMP6/BMP-6：如本文所用，术语“骨形态发生蛋白6”、“BMP6(或BMP-6)”、“VGR”和“VGR1”均指属于蛋白质的骨形态发生家族成员的蛋白质，该蛋白质与作为共受体的RGMc分子相互作用，例如，人类BMP6登录号NP_001709。
癌症相关的贫血：术语“癌症相关的贫血”或CRA，也可以称为“与癌症关联的贫血”，是指与癌症的存在有关、由其引起和/或加剧的贫血。
化疗诱导的贫血：术语“化疗诱导的贫血”或CIA，也称为“化学疗法相关的贫血”，是一种治疗诱导的贫血类型，并指由化学疗法引起和/或加重的贫血。在本公开的上下文中，术语“化学疗法”应涵盖旨在治疗患者的癌症(例如，杀死恶性细胞)的任何抗癌剂、药物和疗法，其损害造血作用。
慢性肾病：术语“慢性肾病”(CKD)是指其中肾脏功能在数月至数年期间逐渐丧失的肾脏疾病。例如，这种肾脏疾病可由糖尿病、高血压、肾小球肾炎和多囊肾疾病引起。CKD与肾细胞产生促红细胞生成素(EPO)的量不足相关，这导致骨髓中产生较少的红细胞，最终导致贫血。
临床益处：如本文所用，术语“临床益处”旨在包括治疗的功效和安全性。因此，达到期望的临床益处的治疗方法是有效又安全的(例如，具有可耐受或可接受的毒性或不良事件)。
联合疗法：“联合疗法”是指包含两种或更多种治疗剂的临床适应症的治疗方案。因此，该术语指其中将包含第一组合物(例如，活性成分)的第一疗法与包含第二组合物(活性成分)的第二疗法结合施用于受试者，旨在治疗相同或重叠的疾病或临床病症的治疗方案。该第一和第二组合物可作用于相同的细胞靶标或离散的细胞靶标。在联合疗法的情况中，短语“与...结合”是指在接受联合疗法的受试者中，第一疗法的治疗效果与第二疗法的治疗效果在时间上和/或在空间上重叠。因此，联合疗法可以配制为用于同时施用的单一制剂，或配制为用于依次施用疗法的单独的制剂。
联合或组合表位(combinatory or combinatorial epitope)：组合表位是在由抗原的一个或多个组分的非连续部分形成的位点(即抗原决定簇)处被组合抗体识别并结合的表位，它们以三维结构紧密结合在一起以形成表位。组合表位也称为不连续表位。因此，本发明的抗体可以结合由RGMc的两个或更多个组分(例如，部分或片段)形成的表位。组合表位可以包含来自RGMc的第一部分/组分的氨基酸残基和来自RGMc的第二部分/组分的氨基酸残基，等等。每一个部分/组分可以是单个蛋白质的部分/组分或者抗原复合物的两个或多个蛋白质的部分/组分。组合表位由抗原或抗原复合物的两个或更多的组分(例如，部分或区段，如氨基酸残基)的结构贡献形成。
竞争或交叉竞争：在用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的情况中时，术语“竞争”是指通过其中所测试的抗原结合蛋白阻止或抑制(例如，减少)参考抗原结合蛋白与共同抗原(例如，RGMc或其片段)的特异性结合的分析测定的抗原-结合蛋白之间的竞争。多种类型的竞争性结合分析可用于测定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争分析；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA；固相直接标记分析和固相直接标记夹心分析。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，它将抑制(例如，减少)参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或者更多。在一些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或者更多。在一些实施方式中，第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段相对于相同抗原彼此交叉阻断，例如，如使用标准测试条件，例如，根据制造商的说明(例如，在室温，
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下测定的结合)通过Biacor或Octet测定的。在一些实施方式中，第一抗体或其片段和第二抗体或其片段可以具有相同的表位。在其他实施方式中，第一抗体或其片段和第二抗体或其片段可以具有不同但重叠的表位。在再另外的实施方式中，第一抗体或其片段和第二抗体或其片段可以具有在三维空间中紧密邻近的分离的(不同的)表位，使得抗体结合通过空间位阻被交叉阻断。“交叉阻断”是指第一抗体与抗原的结合阻止第二抗体与相同抗原的结合，并且类似地，第二抗体与抗原的结合阻止第一抗体与相同抗原的结合。
互补决定区：如本文所用，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补性决定区。重链和轻链的每一个可变区中都有三个CDR，其对于每个可变区称为CDR1、CDR2和CDR3。如本文所用，术语“CDR组”是指在可以结合抗原的单个可变区中存在的三个CDR的组。这些CDR的确切边界已根据不同的系统进行了不同的定义。Kabat(Kabat等(1987；1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.)所描述的系统不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了定义三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；和Chothia等(1989)Nature 342:877-883)发现，尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性，Kabat CDR内的某些子部分采取几乎相同的肽主链构象。这些子部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区域。这些区域可称为Chothia CDR，其边界与Kabat CDR重叠，定义与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已由Padlan(1995)FASEB J.9:133-139和MacCallum(1996)J.Mol.Biol.262(5):732-45描述。再其他CDR边界定义可能并不严格遵循此处的系统之一，但仍会与KabatCDR重叠，尽管根据特定残基或残基组或者甚至整个CDR不会显著影响抗原结合的预测或实验发现它们可以缩短或延长。尽管某些实施方式使用Kabat或Chothia定义的CDR，但是本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一个定义的CDR。
构象表位：构象表位是在三维构象中被构象抗体识别并结合的表位，但在相同氨基酸序列的未折叠肽中不被识别。构象表位可以被称为构象特异性表位、构象依赖性表位或构象敏感性表位。特异性结合这样的表位的相应抗体或其片段可以被称为构象特异性抗体、构象选择性抗体或构象依赖性抗体。抗原与构象表位的结合取决于抗原或抗原复合物的三维结构(构象)。
恒定区：免疫球蛋白恒定域是指重链或轻链恒定域。人IgG重链和轻链恒定域氨基酸序列是本领域已知的。
有效量：“有效量”(或治疗有效量)是在患者群体中实现统计学显著的临床益处的剂量或给药方案。
表位：术语“表位”也可以称为抗原决定簇，是可以被结合剂、免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的分子决定子(例如，多肽决定子)。表位决定子包括分子的化学活性表面集群，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方式中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。抗体或抗体的抗原结合片段识别的表位是与抗体或片段的CDR(例如，互补位点)相互作用的抗原的结构元件。表位可以由来自几个氨基酸残基的成分形成，这些氨基酸残基与抗体的CDR相互作用以产生特异性。抗原性片段可以包含超过一个表位。在某些实施方式中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中识别其靶抗原时，它是特异性结合抗原。例如，如果抗体交叉竞争(一种阻止另一种的结合或调节作用)，则称该抗体“与相同的表位结合”。
促红细胞生成刺激剂：本文使用的术语“促红细胞生成刺激剂”或“ESA”是指刺激骨髓以产生红细胞的药物。促红细胞生成素或EPO是ESA的一个实例，并且可以包括促红细胞生成素α、δ、ω和ζ，包括促红细胞生成素的工程化形式，例如，达贝泊汀α。术语“EPO疗法”可用于广泛地涵盖采用一种或多种ESA剂的疗法。
人抗体：如本文所用，术语“人抗体”(或“全人抗体”)旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开的人抗体可以包括例如在CDR中和特别是在CDR3中，不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外的随机或定点诱变或者通过体内的体细胞突变引入的突变)。然而，本文所用的术语“人抗体”不意图包括其中衍生自另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已嫁接到人框架序列上的抗体。
人源化抗体：术语“人源化抗体”是指其包含来自非人类物种(例如小鼠)的重链和轻链可变区序列，但其中至少一部分VH和/或VL序列已被更改为更“类人的”，即与人类种系可变序列更相似的抗体。一种类型的人源化抗体是CDR嫁接的抗体，其中人CDR序列引入非人VH和VL序列中以替代相应的非人CDR序列。同样，“人源化抗体”是抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其免疫特异性地结合目的抗原，并且其包含具有基本上人抗体氨基酸序列的FR区和具有基本上非人抗体氨基酸序列的CDR区。如本文所用，术语“基本上”在CDR的情况中是指与非人类抗体CDR的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包含至少一个且通常两个可变域的基本上全部(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的那些，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一个实施方式中，人源化抗体还包含免疫球蛋白Fc区的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的Fc区。在一些实施方式中，人源化抗体包含轻链以及至少重链的可变结构域。该抗体还可以包含重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区域。在一些实施方式中，人源化抗体仅包含人源化轻链。在一些实施方式中，人源化抗体仅包含人源化重链。在具体的实施方式中，人源化抗体仅包含轻链的人源化可变域和/或人源化重链。
氢/氘交换质谱法(HDX-MS)：HDX-MS是一种用来通过测量溶剂可及性的程度来查询溶液中的蛋白质确认和蛋白质-蛋白质相互作用的众所周知的技术。参见，例如，Wei等，(2014)Drug Discov Today19(1):95-102.“Hydrogen/deuterium exchange massspectrometry for probing higher order structure of protein therapeutics:methodology and applications”。
缺氧诱导因子(HIF)稳定剂：HIF脯氨酰羟化酶(HIF-PH)抑制剂可以稳定HIF(例如，HIF-2α)，从而可以导致体内促红细胞生成素(EPO)的内源性产生增加。这些试剂也可以称为“HIF激活剂”。HIF稳定剂的实例包括但不限于：罗沙司他(FG-4592)；伐度司他(AKB-6548)、达普司他(GSK1278863)、Dsidustat(ZYAN-1)、莫立司他(Bay 85-3934)；MK-8617、YC-1、IOX-2、2-甲氧基雌二醇、GN-44028、AKB-4924、Bay 87-2243、FG-2216和FG-4497。
铁疗法：本文所用的“铁疗法”是指包含铁补充剂(例如，口服或静脉内(i.v.)铁)的治疗性疗法。
分离的：如本文所用，“分离的”抗体是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。在一些实施方式中，分离的抗体基本上不含其他非预期的细胞物质和/或化学物质。
效力：本文所用的术语“效力”是指药物的活性，例如，具有抑制活性的抑制性抗体(或片段)，相对于产生限定的作用的药物的浓度或量。例如，能够在给定剂量下产生某些作用的抗体比另一种需要两倍量(剂量)以产生同等作用的抗体有更高的效力。效力可以例如通过体外分析法来测定，例如，本文所述的BMP6激活/抑制测定法。效力也可以通过体内分析法来测量，例如，如本文所述的测量铁调素表达、血清铁、铁蛋白表达和铁结合能力的那些。通常，具有较高亲和力的抗体倾向于显示出比具有较低亲和力的抗体更高的效力。
保护(免于溶剂暴露)：在基于HDX-MS的蛋白质-蛋白质相互作用(例如，抗体-抗原结合)评估的情况中，蛋白质(例如，包含表位的蛋白质的区域)暴露于溶剂中从而允许质子交换发生的程度与结合/相互作用的程度反相关。因此，当本文描述的抗体结合抗原的区域时，结合区被“保护”以免于暴露于溶剂，因为蛋白质-蛋白质相互作用阻止结合区被周围的溶剂接近。因此，受保护的区域指示相互作用的位点。通常，合适的溶剂是生理缓冲液。
RGM：如本文所用，“RGM”是指属于排斥性导向分子家族的一类蛋白质。
RGMc：如本文所用，术语“排斥性导向分子C”、“RGMc”、“铁调素调节蛋白”、“HJV”、“血色素沉着症2型蛋白”和“HFE2A”均指为蛋白质的排斥性导向分子家族的成员的蛋白质，其与作为共受体的BMP分子相互作用，例如，人RGMc登录号NP_998818；SEQ ID NO:1。
RGMc相关障碍：“RGMc相关障碍”是指i)其中至少部分发病机理和/或进展归因于RGMc信号传导或其失调的任何疾病或病症，和/或ii)其中抑制RGMc可提供临床益处的病症。RGMc障碍可包括，例如：与炎症/慢性疾病(例如，Castleman综合征、慢性肾病、糖尿病、心力衰竭/心脏病、特发性自身免疫性溶血性贫血、特发性肺动脉高压、炎性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性幼年特发性关节炎)相关的贫血、与癌症/增生性疾病(例如，急性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、
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巨球蛋白血症、膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和肾癌)相关的贫血、与感染(例如，心内膜炎、幽门螺杆菌感染、肝炎、人类免疫缺陷病毒、疟疾)相关的贫血、与神经系统障碍(例如，急性缺血性脑卒中、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、局灶性脑缺血/再灌注、颅内脑出血和蛛网膜下腔出血)有关的贫血、治疗诱导的或治疗相关的贫血(例如，抗生素诱导的、减肥手术相关的、化学疗法诱导的、继发性铁超载)、与遗传性障碍或其他病症(例如，年龄相关的(老年人贫血)、重症贫血、手术贫血、失血/出血、钙化防御、腹腔疾病、铜缺乏症、范可尼贫血、遗传性血色素沉着病(类型4)、遗传性球囊病、IRIDA、肥胖症、器官移植、阵发性夜间血红蛋白尿、镰状细胞性贫血、运动/运动诱导性贫血、地中海贫血、血栓性血小板减少性紫癜)相关的贫血。
RGM抑制剂：术语“RGM抑制剂”或“RGM拮抗剂”是指能够拮抗RGM(例如，RGMa、RGMb和/或RGMc)的生物学活性或功能的任何药剂。该术语无意限制其作用机理，并且包括例如，中和抗体、竞争性抑制剂、受体拮抗剂、弗林蛋白酶和/或TMPRSS6裂解增强剂和可溶性RGM肽。
RGMc选择性抑制剂：术语“RGMc选择性”(或“RGMc特异性”)抑制剂是指能够相对于RGMa和RGMb选择性拮抗RGMc的生物学活性或功能的药剂(包括小分子和生物制剂，例如，抗体)。为了清楚起见，结合并抑制/中和RGMa和RGMc两者的单克隆抗体不是RGMc选择性抑制剂。
特异性结合：如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指抗体或其抗原结合片段与抗原的相互作用取决于特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。例如，抗体或其抗原结合片段与特定蛋白质结合而不是一般地与蛋白质结合。
在一些实施方式中，如果抗体对于靶标的KD为至少约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M或更少，则抗体或其抗原结合片段特异性结合靶标，例如RGMc。在一些实施方式中，本文所用的术语“与RGMc的表位特异性结合”、“与RGMc的表位特异性地结合”、“与RGMc特异性结合”或“与RGMc特异性地结合”是指与RGMc结合并具有1.0×10-7M或更小的解离常数(KD)的抗体或其抗原结合片段，如通过合适的体外结合分析法如表面等离振子共振和生物膜层干涉法(BLI)测定的。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以与RGMc的人类和非人类(例如，小鼠)直向同源物特异性结合。例如，在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与人、小鼠、大鼠和/或食蟹猴RGMc的交叉反应性的差异小于5倍。
该抗体或其抗原结合片段也可以与其他RGM家族成员(例如，人RGMa和人RGMb)具有低交叉反应性。因此，在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段以比人RGMa和/或人RGMb更高的亲和力结合人RGMc(即，具有低交叉反应性)。例如，在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段以比与人RGMa和/或人RGMb高至少1000倍的亲和力(即，低1000倍的KD)结合人RGMc。
受试者：在治疗性应用的情况中的术语“受试者”是指接受临床护理或干预(例如治疗、诊断等)的个体。合适的受试者包括脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，人类和非人类哺乳动物)。当受试者是人类受试者时，术语“患者”可以互换使用。在临床背景下，术语“患者群体”或“患者亚群”用于指落入一组标准，例如，临床标准(例如，疾病表现、疾病阶段、对某些病症的易感性、对治疗的反应性等)、病史、健康状况、性别、年龄组、遗传标准(例如，某些突变、多态性、基因重复、DNA序列重复等的携带者)和生活方式因素(例如，吸烟、饮酒、运动，等)的个体组。
表面等离子体共振(SPR)：表面等离子体共振是一种光学现象，其使得能够实时检测未标记的相互作用物。基于SPR的生物传感器，例如可从Biacore商购的那些传感器，可用于测量生物分子相互作用，包括蛋白质-蛋白质相互作用，例如抗原-抗体结合。该技术在本领域中是众所周知的，且可用于测定诸如结合亲和力、动力学速率常数和热力学的参数。
总铁结合能力：如本文所用，术语“总铁结合能力”、“TIBC”或“转铁蛋白铁结合能力”是指测量血液将铁与转铁蛋白结合的能力的实验室测试。TIBC是通过测量血液可以携带的最大铁量测定的，这是转铁蛋白的间接测量。通常，通过测量血清铁和血清不饱和铁结合能力(UIBC)并将这两个值相加在一起来计算TIBC。或者，可以通过向样品中添加过量的铁，去除未结合的铁并测量从转铁蛋白解离的铁来直接测定TIBC。通常，TIBC的“正常”范围是，例如，255-450ug/dL，尽管不同人群之间的测量值可以变化。
毒性：如本文所用，术语“毒性”或“毒力”是指患者中与对患者施予的疗法相关的不良体内作用，例如，不希望的副作用和不良事件。“耐受性”是指与疗法或治疗方案相关的毒性水平，其可以被患者合理地耐受，而不需要由于毒性而中止治疗。在本公开的上下文中，毒性可以包括但不限于：死亡的更大风险、不良心血管反应和/或中风(其可能与诸如慢性肾病(CKD)的慢性疾病有关)，以及癌症患者中缩短的总体生存、增加的肿瘤进展或复发的风险。
治疗/处理：术语“治疗”或“处理”包括治疗性治疗、预防性治疗和降低受试者发生障碍或其他危险因素的风险的应用。因此，该术语旨在广义地表示：例如通过增强或提高身体的免疫力对患者产生治疗益处；减少或逆转免疫抑制；减少、去除或消除身体有害细胞或物质；减轻疾病负担(例如，肿瘤负荷)；防止反复或复发；延长不应期和/或以其他方式提高生存率。该术语包括治疗性治疗、预防性治疗以及其中降低受试者发生障碍或其他危险因素的风险的应用。治疗不需要完全治愈障碍，并且涵盖其中减轻症状或基础危险因素的实施方式。在联合疗法的情况中，该术语还可以指：i)第二治疗降低第一治疗的有效剂量从而减少副作用和提高耐受性的能力；ii)第二疗法使患者对第一疗法更敏感(例如，敏化)的能力；iii)实现累加或协同临床益处的能力；和/或iv)获得更快地缓解(例如，治疗益处)的能力。
未结合铁结合能力：如本文所用，术语“未结合铁结合能力”或“UIBC”是指转铁蛋白的可用铁结合能力的量。通常通过评估TIBC和血清铁的量之间的差异来计算UIBC。或者，可以通过将已知量的过量铁添加到样品中并减去剩余的未结合铁来直接计算UIBC。通常，尽管测量值可在人群或个体间变化，但UIBC的“正常”范围为，例如120-470ug/dL(21-84umol/L)。
可变区：术语“可变区”或“可变域”是指抗体的轻链和/或重链的一部分，通常包括重链中的大约氨基末端120至130个氨基酸和轻链中约100至110个氨基末端氨基酸。在某些实施方式中，即使在相同物种的抗体之间，不同抗体的可变区在氨基酸序列上也有很大差异。抗体的可变区通常决定特定抗体对其靶标的特异性。
除了在操作实施例中或在另外指出的地方，表示在本文中使用的成分或反应条件的量的所有数字应理解为在所有情况下用术语“约”修饰。
除非明确指出相反，否则如在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个”应理解为表示“至少一个”。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，短语“和/或”应被理解为表示如此结合的元素中的“任一个或两者”，即，在某些情况下连接地存在和在其他情况下分离地存在的元素。除非明确指出相反的意思，否则通过“和/或”子句具体标识的元素以外，其他元素可以任选地存在，无论与那些具体指出的元素相关还是无关。因此，作为非限制性实例，在一个实施方式中，当与诸如“包含”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用可以指代A而无B(任选地包括B以外的元素)；在另一个实施方式中，指B而无A(任选地包括A以外的元素)；在又一个实施方式中，指A和B两者(任选地包括其他元素)；等等。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，在提及一个或多个元素的列表时，短语“至少一个”应理解为表示从元素列表中的任何一个或多个元素中选择的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的各个和每个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许短语“至少一个”所指代的元素列表中特别指出的元素之外的元素可以任选地存在，无论与那些特别指出的元素有关还是无关。因此，作为非限制性实例，在一个实施方式中，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”，或等同地“A和/或B中的至少一个”)可以指至少一个，任选地包括超过一个，A，而不存在B(并且任选地包括B以外的元素)；在另一个实施方式中，指至少一个，任选地包括超过一个，B，而不存在A(并且任选地包括A以外的元素)；在又一个实施方式中，指至少一个，任选地包括超过一个，A，以及至少一个，任选地包括超过一个，B(以及任选地包括其他元素)；等等。
在权利要求中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等的序数术语来修饰权利要求元件本身并不意味着一个权利要求元件相对于另一个权利要求元件的任何优先权、位次或顺序或者执行方法动作的时间顺序，但仅用作标记，以区分具有某个名称的一个权利要求元件与具有相同名称的另一个元件(但用于序数词)来区分权利要求元件。
本文提供的范围应理解为该范围内所有值的简略表达。例如，范围1到50理解为包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50的任何数字、数字的组合或子范围，例如，10-20、1-10、30-40等。
通过BMP6/铁调素轴调节铁内稳态
铁调素是一种小的肝分泌肽，并且是体内铁内稳态的中心调节剂。它的主要功能是抑制从三个主要来源的铁从细胞转运到血液的血浆区室：膳食铁跨十二指肠肠上皮细胞的吸收、血红蛋白铁从再循环的红细胞的释放以及储存的铁从肝细胞的释放。铁的调节是通过铁调素介导的位于十二指肠肠上皮细胞、肝和脾驻留的网状内皮巨噬细胞以及肝细胞表面上的铁输出蛋白铁转运蛋白的降解来实现的。由于铁转运蛋白被降解，巨噬细胞和十二指肠肠上皮细胞不再能够将铁释放到血液中，因此减少了铁向转铁蛋白的转移。因此，如图1所示，随着铁调素表达的增加，铁的输出减少。相反，随着铁调素表达的减少，铁的输出增加。因此，打乱正常铁调素产生的遗传性和获得性障碍可导致铁缺乏症(高铁调素水平)或铁超载(铁调素缺乏)。
作为维持铁内稳态的主要参与者，铁调素合成受到多种刺激的转录调控，包含细胞内和细胞外铁浓度、促红细胞生成的需求和炎症。在健康个体中，由于铁调节复合物中一组协调蛋白的活性，铁调素维持在稳态水平。对患有遗传性血色素沉着病(HH)的患者(其中遗传突变导致过量的饮食铁的吸收和外围存储及组织/器官毒性)进行的遗传分析导致确定了调节铁内稳态的关键蛋白。HH最常见的类型是由HFE基因中的突变引起的，该基因编码非典型的MHC类蛋白，该蛋白干扰转铁蛋白-转铁蛋白受体的结合。罕见形式的HH发生在具有TFR2、铁调素和HJV(以下称为“RGMc”)中的突变的患者中。这些罕见形式中的每一种特征在于不适当的低铁调素水平，从而支持RGMc、HFE和TFR2在铁调素表达的上游调节中的作用。有趣的是，RGMc中的突变是导致严重形式的青少年HH的最常见原因，如果不加以治疗，它可能是致命的。
铁调素的表达受到细胞外刺激的刺激，包括炎性信号IL-6和发育信号传导骨形态发生蛋白(BMP)。BMP信号传导组分(特定的配体、受体和共受体)被靶向删除的小鼠特征在于铁超载表型，突出了BMP信号传导在铁调素表达中的关键作用。BMP信号传导的调节发生在多个水平以产生信号的特异性和微调；共受体增强或干扰配体-受体相互作用是BMP信号传导调节的主要机制。RGMc是肝脏中BMP介导的铁调素表达增强的关键共受体，并被认为在正常生理条件下使肝细胞对低BMP水平致敏，从而增强铁调素表达并调节铁内稳态。由于其在铁调节中的效力和局限性作用，RGMc是其中铁调素相关的铁限制起关键作用的障碍(例如慢性病的贫血)的有吸引力的治疗靶标。
BMP是TGFβ超家族中的生长因子的宽泛亚家族，其最初是通过它们诱导骨骼和软骨形成的能力而被发现的。与许多其他生长因子一样，除了与骨骼的关联外，BMP还参与了多样的生物学过程。例如，虽然BMP6在许多不同的生物学中起作用，包括脂肪代谢和卵巢生理，但在肝脏中，BMP6通过调节铁调素(铁内稳态的主要调节子)在人类的铁调节中作为关键控制点发挥作用。
因此，BMP6已成为用于治疗涉及铁失调的疾病和障碍的可选的治疗靶标。包含EliLilly和Novartis的多个小组已经开发出特异性结合并中和BMP6的抗体，并建议将此类抗体用于治疗诸如贫血的病症的治疗用途。然而，这些旨在直接系统地抑制BMP6信号传导的方法很可能会扰乱其中涉及BMP6的许多不同的生理过程，从而增加了引起意外和不希望的效应(例如，毒性)的风险。
最近，排斥性导向分子(RGM)已被确定为BMP相互作用的蛋白。RGM蛋白质家族包含至少三个已知成员，即RGMa、RGMb和RGMc，并且由于创始成员RGMa在胚胎发生过程中指导轴突生长的作用而被如此称呼。
从结构上讲，RGM是由N端信号序列、RGD基序(RGMa和RGMc)、部分von WillebrandD型(vWFD)结构域和自催化Gly-Asp-Pro-His(GDPH)裂解位点组成的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白。据报道，RGM与BMP类生长因子的多个成员相互作用，包括作为共受体的BMP6。每一个RGM家族成员共有显著的结构同源性(请参见表1)，尤其是在其BMP结合域上。RGMa和RGMc尤其具有高序列同源性。
尽管家庭成员之间存在相当的同源性，但他们的表达和生物学功能却表现为不同。据报道，RGMa和RGMb在神经系统生物学、免疫、炎症、血管生成和生长中具有作用，而RGMc主要在肝脏(例如，肝细胞)中表达(肝脏是铁调素合成的主要部位)，并参与调节铁代谢。
有证据支持抑制BMP6/RGMc轴可能是治疗铁失调的有吸引力的治疗途径的观点。例如，US2013/0330343A1公开了一种结合并中和RGMa/c的单克隆抗体能够在处理的动物中：1)降低铁调素水平，2)提高血清铁水平和转铁蛋白饱和度，以及3)降低不饱和铁结合能力(UIBC)。
本公开的发明人认识到RGMc选择性抑制可以提供改善的安全性特征。有理由认为，此类抑制剂应仅靶向肝表达的RGMc，同时保持RGMa和RGMb的正常生物学功能完整。这样，发明人试图识别不结合RGMa或RGMb的RGMc选择性抗体，以实现BMP6活性的肝脏特异性调节。
表1：
Figure BDA0003106722380000271
RGMc/铁调素调节蛋白(HJV)
人类RGMc至少有三种亚型，包括前体蛋白(亚型a；SEQ ID NO:1)和两个剪接变体(亚型b和亚型c；分别为SEQ ID NO：2和3)。人类RGMc亚型“a”是主要亚型，由426个氨基酸组成并代表最长的转录本。除非本文另有说明，否则术语“RGMc”是指RGMc亚型a的全长蛋白质、异二聚体或切割产物。以下是RGMc亚型、RGMa和RGMb的氨基酸序列。
人RGMc亚型a(登录号NP_998818；SEQ ID NO:1)：
Figure BDA0003106722380000281
人RGMc亚型b(登录号NP_660320；SEQ ID NO:2)：
Figure BDA0003106722380000282
人RGMc亚型c(登录号NP_998817；SEQ ID NO:3)：
Figure BDA0003106722380000283
人RGMa(登录号NP_001159755；SEQ ID NO:4)：
Figure BDA0003106722380000284
Figure BDA0003106722380000291
人RGMb(登录号NP_001012779；SEQ ID NO:5):
Figure BDA0003106722380000292
RGMc是BMP6的共受体，BMP6是包含BMP6、BMP6结合I型和II型丝氨酸苏氨酸激酶受体(例如Alk2、Alk3、BMPR2和ActRIIA)、再生蛋白、RGMc(HJV)、HFE和TFR2的更大多聚体蛋白质复合物的一部分。BMP6与其受体结合，进而与较大的多聚体复合物结合，诱导下游SMAD磷酸化，从而诱导介导铁调素转录增加的转录因子的核易位。因此，已经显示BMP6信号传导通过铁调素表达的调节直接调节铁内稳态。
RGMc以膜结合和可溶形式在哺乳动物中表达。膜结合的RGMc以两种不同的形式存在于细胞表面上，即单链全长形式和二硫键连接的两链(异二聚体)形式。RGMc的异二聚体形式是在FGDPH基序处发生自身蛋白水解而产生约35kD的C端片段和约20kD的N端片段的结果，该片段仍通过二硫键保持连接。尽管已显示出单链全长RGMc与BMP2相互作用，但先前的研究表明自身蛋白水解对于蛋白质的正确折叠非常重要，且自催化加工是RGM的普遍和重要的特征。例如，已经表明，只有RGMc的异二聚体形式在体外激活铁调素表达，并且RGMa自催化加工对于其对轴突的生长抑制作用是必需的。此外，几种JHH相关的突变位于RGMc自催化切割位点附近，并且这些突变体具有低的信号传导活性，且通常保留在ER中。
另外，已经显示至少两种蛋白酶，弗林蛋白酶和TMPRSS6，切割RGMc以产生几种可溶形式的RGMc(s-RGMc或s-HJV)。具体而言，弗林蛋白酶切割产生
Figure BDA0003106722380000301
的s-RGMc片段。已显示该片段充当诱饵受体，其与膜结合的RGMc竞争结合BMP配体，从而降低铁调素的表达并提高血清铁水平。有趣的是，弗林蛋白酶活性已显示出在铁缺乏和缺氧时增强。但是，由于弗林蛋白酶也参与前铁调素的加工，因此弗林蛋白酶对铁调素表达的作用可能很复杂，并且最可能依赖于特定的细胞条件。
另一方面，TMPRSS6可以在多个位点切割RGMc，从而导致具有不同功能的切割片段。研究表明，TMPRSS6在调节铁调素表达中的作用通过表明其在小鼠中的失活导致铁调素水平增加、铁吸收阻断和贫血的研究证明。此外，铁难治性缺铁性贫血(IRIDA)可能由编码TMPRSS6/膜型丝氨酸蛋白酶(matriptase)-2的基因中的突变引起。但是，还显示通过TMPRSS6脱落的RGMc片段结合BMP的能力降低。
如上所述，铁调素是全身铁动员的关键调节子，并随之由骨形态发生蛋白(BMP)介导的信号传导，特别是BMP6进行调节。RGMc结合BMP6并调节Smad介导的途径，从而导致铁调素表达的调节，进而使铁转运蛋白(铁转运蛋白质)降解，从而阻止铁从巨噬细胞和肠上皮细胞释放到循环中。因此，增加的RGMc活性可能增加铁调素的表达，从而导致铁从细胞释放的减少。在这种情况下，RGMc活性可能由于全身性铁耗竭而导致铁内稳态失衡，从而引起铁相关疾病。换句话说，RGMc介导的铁调素水平的升高可能导致贫血，而其表达下降可能是许多血色素沉着病(铁超载)疾病的病因特征。
因此，本申请提供了RGMc选择性单克隆抗体及其片段，其在体内特异性结合并抑制RGMc活性，而不与RGMa或RGMb发生交叉反应。据申请人所知，这些抗体和片段代表了这类抑制剂的新类别。此途径的基本原理包含以下内容。首先，基于认识到铁调素是铁内稳态的关键调节子并且在该过程中需要BMP6，需要的是能阻断该信号转导轴的抑制剂。第二，由于BMP6广泛表达并起广泛多样的生物学作用，因此避免直接靶向BMP6是有利的。由于已知RGM蛋白家族与BMP(例如BMP6、BMP2和BMP4)的共受体相互作用，因此靶向共受体可以提供可选的和有吸引力的途径来阻断调节铁调素的信号传导。第三，然而认识到RGMa和RGMb发挥独特的生物学功能，此类抑制剂应选择性地抑制RGMc，而不影响RGMa/b。以这种方式，可以实现对肝脏RGMc的选择性抑制，同时最小化可能由于无意和系统地阻断BMP6、RGMa和RGMb的正常功能而引起的潜在有害副作用。
本公开提供了特异性结合RGMc或含RGMc的复合物并抑制其功能但不结合或抑制RGMa和RGMb的功能的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方式中，本文所述的抗体及其抗原结合片段抑制RGMc与BMP(例如，BMP6)的相互作用。在一些实施方式中，本文所述的抗体或片段不抑制RGMc与再生蛋白的相互作用。在任何实施方式中，本发明涵盖的抗体和片段提供了RGMc途径的精确特异性和靶向性。有利地，此类抗体或片段可实现降低的毒性。重要的是，由于RGMc表达局限于组织的子集，因此与直接拮抗BMP6本身或广泛抑制RGM家族相反，RGMc介导的BMP6途径的抑制应实现组织选择性的作用，从而减少了由于全身性作用引起的毒性。
因此，本发明包含，与非选择性抑制剂相比，使用RGMc的选择性抑制剂为治疗涉及铁失调的病症提供了有利的途径的认识。为此，本公开的发明人试图设计和产生在体内特异性和选择性地靶向RGMc而不靶向RGMa或RGMb的抗体或其片段。这至少部分基于这样的观念，即选择性提供了在体内施用这样的抑制剂的改善的安全性特征(例如，降低的毒性或不良反应)。
例如，靶向RGMc以及RGMa和/或RGMb可能会增加与RGMa/b的广泛非肝组织表达及其各种生理过程的已知作用相关的潜在毒性。特别是，RGMa已显示出对胚胎发育至关重要，并在多种组织中表达，包括成年小鼠的大脑、皮肤、心脏、肝脏、肺、肾脏、睾丸和肠道。与这些数据一致，RGMa基因缺陷的小鼠约有一半死于子宫内，具有无脑(exancephalic)表型和主要的形态学和发育缺陷。还显示RGMa在损伤后的神经元再生、恢复和存活中起关键作用。病理上，RGMa水平升高在损伤和缺血性中风的脑损伤；阿尔茨海默氏病淀粉样斑块；和帕金森氏病患者的黑质中观察到。然而，已经显示降低的RGMa表达和增加的启动子甲基化状态与结肠直肠癌的发生和进展密切相关(Zhao等，Oncol Rep 2012；27(5):1653-9)。这些证据线表明RGMa/c交叉反应抗体，例如，可能导致或加剧癌症进展。
除了胚胎发育和神经元再生外，RGMa还显示出调节针对损伤的免疫反应；它由脑和脊髓病变中的树突状细胞表达，并调节T细胞反应。具体而言，在多发性硬化症(实验性自身免疫性脑脊髓炎；EAE)的小鼠模型中，抑制RGMa已显示出抑制T细胞应答。在人类中，RGMa抑制降低T细胞增殖和外周血单核细胞(PBMC)中的促炎性细胞因子产生。而且，在T细胞亚群中，已显示RGMa在Th17细胞上高度表达。由于Th17细胞通过募集嗜中性粒细胞和巨噬细胞到感染的组织而特别地在抵抗感染的宿主防御中起重要作用，因此不希望药理学干扰正常免疫功能。有利地，通过选择性地靶向和抑制RGMc而不是RGMa，可以有效地避免这种副作用。
尽管这些功能中有许多与损伤有关，但RGMa也可以调节健康个体中的神经元再生。考虑到它在调节中枢神经系统对损伤的反应、免疫反应中的重要作用以及在各种器官中的未知作用，抑制RGMa活性由于潜在的脱靶副作用的风险而是不可取的。
RGMb也显示在包括成年小鼠的脑、骨、心脏、肺、肝脏、肾脏、睾丸、卵巢、子宫、附睾和垂体的多种组织中表达。RGMb敲除小鼠在出生后第12天死亡，并且生长发育迟缓。像RGMa一样，RGMb在免疫反应中也有作用。具体而言，RGMb在肺巨噬细胞和树突状细胞中高水平表达。在其不存在的情况下，这些细胞类型中的IL-6水平升高，表明其在调节炎症中起作用。RGMb也已显示出促进神经突增生。最近，RGMb被描述为肺中PD-L2的结合伴体，且阻断这种相互作用阻止了呼吸耐受的发生，突出了RGMb在肺免疫中的作用。它增加了干扰RGMb功能的抑制剂可能导致免疫反应失调的可能性。
此外，已经提出RGMb可以充当肿瘤抑制物，可能是通过抑制SMAD活化。实际上，在非小细胞肺癌中，RGMb的表达降低与预后不良相关。RGMb基因在结直肠癌的亚型中失活，并且已显示RGMb是体外乳腺癌增殖的负调节子。因此，抑制RGMb不仅可以对免疫和神经系统产生作用，而且这种抑制作用还可以增强癌症的进展和/或发展。
总之，相关家族成员RGMa和RGMb的广泛表达谱和在多种生物学过程中的多效性功能与RGMc的限制性表达模式和在维持铁内稳态中集中作用相反。这强调了采用RGMc特异性方式来发现铁限制性贫血的新疗法而不使脱靶效应复杂化的重要性。
因此，在一个方面，本发明旨在抑制RGMc功能而不引起与体内干扰RGMa和RGMb活性相关的潜在副作用或毒性。预期通过RGMc功能的干预对BMP6信号传导的肝选择性抑制可以提供靶向多种铁限制性贫血的途径，所述铁限制性贫血包括慢性肾病的贫血、癌症的贫血和慢性炎症的贫血。
根据本发明，RGMc的选择性抑制剂不抑制其他密切相关的因子，例如RGMa和RGMb。这种抑制剂可用于使铁内稳态正常化，包括用于治疗各种形式的贫血或涉及铁限制性贫血的疾病。实际上，如本文所证明的，RGMc特异性抗体显示出选择性抑制骨形态发生蛋白6(BMP6)-铁调素轴，并提高了用于红细胞生成的铁的利用率。
RGMc抑制剂
为了实施本发明的方法，可以使用任何合适的RGM/HJV的抑制性药剂，只要这些药剂以对RGMc亚型以足够的选择性抑制或拮抗RGM。优选地，这样的RGMc抑制性药剂在施用于人类受试者时提供临床益处(例如，治疗功效和可接受的毒性特征)的剂量下，对RGMa和RGMb没有可测量的抑制性活性。
如本文所用，术语“抑制剂”是指能够阻断或拮抗RGMc信号传导的任何药剂。合适的抑制性药剂包括小分子、基于核酸的药剂、生物制剂(例如，基于多肽的试剂，例如，抗体和其他发现剂(finding agent))及其任何组合。
在一些实施方式中，此类药剂可通过抑制RGMc与BMP受体复合物的结合来预防或降低RGMc活性。在一些实施方式中，此类药剂可通过抑制RGMc与BMP的结合来预防或降低RGMc活性。在一些实施方式中，此类药剂可通过抑制RGMc与BMP6的结合来预防或降低RGMc活性。在一些实施方式中，这样的药剂可以通过抑制RGMc与再生蛋白的结合来预防或降低RGMc活性。在一些实施方式中，此类药剂是RGMc/BMP6结合的竞争性抑制剂。在一些实施方式中，这样的药剂是RGMc/再生蛋白结合的竞争性抑制剂。
在一些实施方式中，抑制剂可以是抗体(包括其片段，例如，结构域抗体(dAb)，如被描述于，例如，美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197和6,696,245中)、小分子抑制剂、Adnectin、亲和体(Affibody)、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody或基因疗法。本发明涵盖的抑制剂的使用还包括抗体模拟物，例如，单体抗体(monobodies)和单结构域抗体。单体抗体是合成结合蛋白，其通常采用纤连蛋白III型结构域(FN3)作为分子支架。单体抗体包括基于第十个纤连蛋白III型结构域的AdnectinsTM。
RGMc特异性抗体
最近，特异性结合RGMa/RGMc的单克隆抗体证明通过下调铁调素来增加大鼠和食蟹猴中的血清铁(
Figure BDA0003106722380000341
等(2015)AAPS J.2015Jul；17(4):930–938)。在这种情况下，研究人员报告，接受RGMa/RGMc抗体的健康动物中没有明显的毒性，并且接着在给药期的恢复期(约12周)后观察到血液参数的正常化。但是，从已发表的著作中无法分辨出与同时抑制RGMa有关的潜在风险，例如对于神经系统。此外，如上所述，人类可能还有许多其他毒性，例如，与RGMa的非肝细胞表达有关的那些毒性(例如，与脑、皮肤、心脏、肺、肾脏、睾丸和肠有关的毒性)。RGMa表达的降低也已被证明与结肠直肠癌的发生和进展有关。此外，已经显示RGMa表达调节对损伤的免疫反应。因此，本发明提供了不结合和抑制RGMa和/或RGMb活性/功能的新颖的RGMc选择性抑制剂。
在本发明的一些实施方式中，RGMc选择性抑制剂(例如，抗体)抑制或减少RGMc与BMP的相互作用。在另一个实施方式中，RGMc选择性抑制剂(例如，抗体)抑制或减少RGMc与BMP6的相互作用。在另一个实施方式中，RGMc-选择性抑制剂不抑制或减少与再生蛋白的相互作用。
在一些实施方式中，RGMc选择性抑制剂(例如，抗体)调节RGMc与以下相互作用蛋白质中的一种或多种的相互作用：HFE、TFR2、ALK2、ALK3、BMPR2、ACVR2A和TMPRSS6。在另一个实施方式中，RGMc选择性抑制剂(例如，抗体)抑制RGMc与以下相互作用蛋白质中的一种或多种的相互作用：HFE、TFR2、ALK2、ALK3、BMPR2、ACVR2A和TMPRSS6。在另一个实施方式中，RGMc选择性抑制剂(例如，抗体)抑制RGMc与HFE的相互作用。在另一个实施方式中，RGMc选择性抑制剂(例如，抗体)抑制RGMc与TFR2的相互作用。在另一个实施方式中，RGMc选择性抑制剂(例如，抗体)抑制RGMc与ALK2的相互作用。在另一个实施方式中，RGMc选择性抑制剂(例如，抗体)抑制RGMc与ALK3的相互作用。在另一个实施方式中，RGMc选择性抑制剂(例如，抗体)抑制RGMc与BMPR2的相互作用。在另一个实施方式中，RGMc选择性抑制剂(例如，抗体)抑制RGMc与ACVR2A的相互作用。在另一个实施方式中，RGMc选择性抑制剂(例如，抗体)抑制RGMc与TMPRSS6的相互作用。
在一些实施方式中，RGMc包含天然存在的哺乳动物氨基酸序列。在一些实施方式中，RGMc包含天然存在的人类氨基酸序列。在一些实施方式中，RGMc包含人、猴、大鼠或小鼠氨基酸序列。在一些实施方式中，RGMc是人RGMc序列或其片段，如SEQ ID NO:1所示。在一些实施方式中，RGMa是RGMc的可溶性形式。
在一些实施方式中，在合适的体外结合分析(如
Figure BDA0003106722380000361
或MSD)中，RGMc-选择性抑制剂以≤5nM(例如，≤0.1nM)的KD与RGMc结合。另一方面，与先前描述的RGMc抗体不同，这些RGMc特异性抗体在相同的测定条件下不显示与RGMa或RGMb的任何可检测的结合。例如，RGMc-选择性抑制剂可以以≤0.1nM的KD结合RGMc，但是在相同的测定条件下通过MSD不显示任何可检测的与RGMa或RGMb的结合。
在一些实施方式中，RGMa包含天然存在的哺乳动物氨基酸序列。在一些实施方式中，RGMa包含天然存在的人类氨基酸序列。在一些实施方式中，RGMa包含人、猴、大鼠或小鼠氨基酸序列。在一些实施方式中，RGMa是人RGMa序列或其片段，如SEQ ID NO:4所示。在一些实施方式中，RGMa是RGMa的可溶性形式。
在一些实施方式中，RGMb包含天然存在的哺乳动物氨基酸序列。在一些实施方式中，RGMb包含天然存在的人类氨基酸序列。在一些实施方式中，RGMb包含人、猴、大鼠或小鼠氨基酸序列。在一些实施方式中，RGMb是人RGMb序列或其片段，如SEQ ID NO:5所示。在一些实施方式中，RGMb是RGMb的可溶性形式。
本发明的方面涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与RGMc选择性结合并包含六个互补决定区(CDR)：CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在一个方面，抗体或其抗原结合片段与RGMc选择性结合并且与相应的CDR区域相比，具有与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3基本相似的一个或多个CDR序列。例如，抗体可以包含一个或多个CDR序列(例如，SEQ ID NO:6-11、SEQ ID NO:14-19、SEQ IDNO:22-27、SEQ ID NO:30-35或SEQ ID NO:38-43)，其各自与SEQ ID NO:6-11、SEQ ID NO:14-19、SEQ ID NO:22-27、SEQ ID NO:30-35或SEQ ID NO:38-43的任一个中的相应CDR区相比含有最多1、2、3、4或5个氨基酸残基变异。
如本文所用，短语“氨基酸变异”或“氨基酸改变”或“氨基酸残基的改变”包含氨基酸置换和/或缺失。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少三个CDR，任选地包含至多3个氨基酸改变，例如，对于以下CDR中的每一个1、2或3个氨基酸改变：CDR-H1：SEQID NO:6；CDR-H2：SEQ ID NO:7；CDR-H3：SEQ ID NO:8；CDR-L1：SEQ ID NO:9；CDR-L2：SEQID NO:10；和CDR-L3：SEQ ID NO:11。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少三个CDR，任选地包含至多3个氨基酸改变，例如，对于以下CDR中的每一个1、2或3个氨基酸改变：CDR-H1：SEQID NO:14；CDR-H2：SEQ ID NO:15；CDR-H3：SEQ ID NO:16；CDR-L1：SEQ ID NO:17；CDR-L2：SEQ ID NO:18；和CDR-L3：SEQ ID NO:19。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少三个CDR，任选地包含至多3个氨基酸改变，例如，对于以下CDR中的每一个1、2或3个氨基酸改变：CDR-H1：SEQID NO:22；CDR-H2：SEQ ID NO:23；CDR-H3：SEQ ID NO:24；CDR-L1：SEQ ID NO:25；CDR-L2：SEQ ID NO:26；和CDR-L3：SEQ ID NO:27。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少三个(例如3、4、5或优选全部6个)CDR，任选地包含最多3个氨基酸改变，例如，对于以下CDR中的每一个1、2或3个氨基酸改变：CDR-H1：SEQ ID NO:30；CDR-H2：SEQ ID NO:31；CDR-H3：SEQ ID NO:32；CDR-L1：SEQ ID NO:33；CDR-L2：SEQ ID NO:34；和CDR-L3：SEQ ID NO:35。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少三个CDR，任选地包含至多3个氨基酸改变，例如，对于以下CDR中的每一个1、2或3个氨基酸改变：CDR-H1：SEQID NO:38；CDR-H2：SEQ ID NO:39；CDR-H3：SEQ ID NO:40；CDR-L1：SEQ ID NO:41；CDR-L2：SEQ ID NO:42；和CDR-L3：SEQ ID NO:43。
另一方面，本发明提供了包含重链可变区的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含具有特定氨基酸改变的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:14所示的CDR-H1，条件是SEQ ID NO:14的4位的丝氨酸残基可以被精氨酸置换。在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:14所示的CDR-H1，条件是SEQ ID NO:14的7位的丙氨酸残基可以被丝氨酸置换。在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:14所示的CDR-H1，条件是SEQ ID NO:14的9位上的丝氨酸残基可以被谷氨酰胺置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:14所示的CDR-H1，条件是(i)SEQ ID NO:14的4位的丝氨酸残基可以被精氨酸置换；(ii)SEQ ID NO:14的7位的丙氨酸残基可以被丝氨酸置换；和/或(iii)SEQ ID NO:14的9位的丝氨酸残基可以被谷氨酰胺置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:15所示的CDR-H2，条件是SEQ ID NO:15的8位的苏氨酸残基可以被缬氨酸置换。在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:15所示的CDR-H2，条件是SEQ ID NO:15的10位的天冬酰胺残基可以被丝氨酸置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:15所示的CDR-H2，条件是(i)SEQ ID NO:15的8位的苏氨酸残基可以被缬氨酸置换；和/或(ii)SEQID NO:15的10位的天冬酰胺残基可以被丝氨酸置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16所示的CDR-H3，条件是SEQ ID NO:16的5位的异亮氨酸残基可以被酪氨酸置换。在另一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16所示的CDR-H3，条件是SEQ ID NO:16的6位的丙氨酸残基可以被缬氨酸置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16所示的CDR-H3，条件是(i)SEQ ID NO:16的5位的异亮氨酸残基可以被酪氨酸置换，和/或(ii)SEQ ID NO:16的6位的丙氨酸残基可以被缬氨酸置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:17所示的CDR-L1，其任选地包含最多3个氨基酸改变。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含如SEQID NO:18所示的CDR-L2，其任选地包含最多3个氨基酸改变。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:19所示的CDR-L3，其任选地包含最多3个氨基酸改变。
在特定的实施方式中，本发明提供了一种特异性结合人类RGMc的分离的抗体，其中所述抗体是全长抗体或其抗原结合片段，并且其中所述抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO:14，条件是：
i)SEQ ID NO:14的4位的丝氨酸残基可以被精氨酸置换；
ii)SEQ ID NO:14的7位的丙氨酸残基可以被丝氨酸置换；和/或
iii)SEQ ID NO:14的9位的丝氨酸残基可以被谷氨酰胺置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO:15，条件是：
i)SEQ ID NO:15的8位的苏氨酸残基可以被缬氨酸置换；和/或
ii)SEQ ID NO:15的10位的天冬酰胺残基可以被丝氨酸置换；
c)CDR-H3：SEQ ID NO:16，条件是：
i)SEQ ID NO:16的5位的异亮氨酸残基可以被酪氨酸置换；和/或
ii)SEQ ID NO:16的6位的丙氨酸残基可以被缬氨酸置换；
d)CDR-L1：SEQ ID NO:17；
e)CDR-L2：SEQ ID NO:18；和
f)CDR-L3：SEQ ID NO:19。
在一些实施方式中，如在合适的体外结合分析如
Figure BDA0003106722380000391
或MSD中所测量的，这样的抗体以＜1nM(优选＜0.1nM)的KD结合人RGMc。在优选的实施方式中，这样的抗体也是亚型特异性的，因为它选择性地结合并抑制RGMc的活性，并且不结合和抑制RGMa和RGMb的活性。
在一些实施方式中，重链CDR和/或轻链CDR序列不包含任何氨基酸改变。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:6所示的序列的CDR-H1。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7所示的序列的CDR-H2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:8所示的序列的CDR-H3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:9所示序列的CDR-L1。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10所示的序列的CDR-L2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:11所示的序列的CDR-L3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H3的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L3的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H2的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L2的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H1的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L1的轻链可变区。
在特定的实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID NO:6、7和8所示的重链CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，以及分别如SEQ ID NO:9、10和11所示的轻链CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14所示的序列的CDR-H1。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:15所示的序列的CDR-H2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:16所示的序列的CDR-H3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:17所示的序列的CDR-L1。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:18所示的序列的CDR-L2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:19所示的序列的CDR-L3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H3的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L3的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H2的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-L2的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H1的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L1的轻链可变区。
在特定的实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID NO:14、15和16所示的重链CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列和分别如SEQ ID NO:17、18和19所示的轻链CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:22所示的序列的CDR-H1。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:23所示的序列的CDR-H2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:24所示的序列的CDR-H3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:25所示的序列的CDR-L1。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:26所示的序列的CDR-L2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:27所示的序列的CDR-L3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-L3的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L2的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1的轻链可变区。
在特定的实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID NO:22、23和24所示的重链CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列和分别如SEQ ID NO:25、26和27所示的轻链CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:30所示的序列的CDR-H1。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:31所示的序列的CDR-H2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:32所示的序列的CDR-H3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:33所示的序列的CDR-L1。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:34所示的序列的CDR-L2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:35所示的序列的CDR-L3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H3的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L3的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-H2的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-L2轻链可变区。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H1的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L1的轻链可变区。
在特定的实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID NO:30、31和32所示的重链CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列以及分别如SEQ ID NO:33、34和35所示的轻链CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:38所示的序列的CDR-H1。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:39所示的序列的CDR-H2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:40所示的序列的CDR-H3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:41所示的序列的CDR-L1。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:42所示的序列的CDR-L2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:43所示的序列的CDR-L3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-H3的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-L3的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-H2的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-H1的重链可变区和含有具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L1的轻链可变区。
在特定的实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID NO:38、39和40所示的重链CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列以及分别如SEQ ID NO:41、42和43所示的轻链CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
本发明的方面涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其选择性地与RGMc结合，并且包含重链可变区序列和轻链可变区序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其具有与SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:44至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其具有与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQID NO:37或SEQ ID NO:45至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:12至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:13至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:12至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:13至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:12至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:13至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:20至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:21至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:20至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:21至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:20至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:21至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:28至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:29至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:28至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:29至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:28至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:29至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:36至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:37至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:36至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:37至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:36至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:37至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:44至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:45至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:44至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:45至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区具有与SEQ ID NO:44至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链可变区具有与SEQ ID NO:45至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，重链可变区和/或轻链可变区序列在本文提供的任何CDR序列内不变化。例如，在一些实施方式中，序列变异的程度(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)可以出现在除了本文提供的任何CDR序列之外的重链可变和/或轻链可变氨基酸序列内。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的重链可变域和/或含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的重链可变域或含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的重链可变域和含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的重链可变域和/或含有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的重链可变域或含有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的重链可变域和含有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的重链可变域和/或含有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的重链可变域或含有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的重链可变域和含有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的重链可变域和/或含有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的重链可变域或含有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的重链可变域和含有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变域和/或含有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变域或含有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变域和含有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，使用Karlin和Altschul Proc Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990,如在Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中改进的算法测定两个氨基酸序列的“同一性百分比”。将这样的算法整合到Altschul等J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行，以获得与目的蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在缺口的情况下，可以如Altschul等Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所述的利用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在本文所述的任何抗体或抗原结合片段中，可以在残基不太可能参与抗体-抗原相互作用的位置处将一种或多种保守突变引入CDR或框架序列中。在一些实施方式中，如基于晶体结构所确定的，可以在残基不太可能参与与RGMc相互作用的位置处将这样的保守突变引入CDR或构架序列中。在一些实施方式中，可以从关于共有结构相似性的其他抗原的已知结构信息中推导可能的界面(例如，参与抗原-抗体相互作用的残基)。
如本文所用，“保守氨基酸置换”是指不改变其中进行氨基酸置换的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸置换。可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体，例如可以在编译此类方法的参考文献中找到的，例如，MolecularCloning：A Laboratory Manual,J.Sambrook等编辑，第二版，Cold Spring HarborLaboratory出版，Cold Spring Harbor,New York,1989或者Current Protocols inMolecular Biology,F.M.Ausubel等编辑，John Wiley&Sons,Inc.,New York。氨基酸的保守置换包括在以下组内的氨基酸之间进行的置换：(a)M,I,L,V；(b)F,Y,W；(c)K,R,H；(d)A,G；(e)S,T；(f)Q,N；和(g)E,D。
在一些实施方式中，本文提供的抗体包含赋予抗体所需性质的突变。例如，为避免由于Fab-臂交换(其已知对于天然IgG4 mAb发生)而引起的潜在复杂性，本文提供的抗体可包含稳定的'Adair'突变(Angal等，“A single amino acid substitution abolishes theheterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody,”Mol Immunol 30,105-108；1993)，其中丝氨酸228(EU编号；残基241，Kabat编号)被转化为脯氨酸，从而产生IgG1样(CPPCP(SEQ ID ID NO：48))铰链序列。因此，任何抗体都可以包含稳定的“Adair”突变或氨基酸序列CPPCP(SEQ ID NO:48)。在一个实施方式中，本文所述的抗体包含具有Ser到Pro的骨架置换的人IgG4的重链免疫球蛋白恒定域，其产生IgG1样铰链并允许形成链间二硫键。
选择性地结合RGMc的本公开的抗体可以任选地包含抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可以在其C末端连接至轻链恒定域，例如Cκ或Cλ。类似地，VH结构域或其片段可以连接至全部或部分重链，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及任何同种型亚类。抗体可包含合适的恒定区(参见，例如，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,No.91-3242,National Institutes of Health Publications,Bethesda,Md.(1991))。因此，在本公开范围内的抗体可以包含与任何合适的恒定区组合的VH和VL结构域或其抗原结合片段。在示例性实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链免疫球蛋白恒定域，其包含人IgG1或人IgG4恒定域的全部或片段。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链免疫球蛋白恒定域，其包含人Igλ恒定域或人类Igκ恒定域的全部或片段。
在一些实施方式中，选择性结合RGMc的抗体可以包含或不包含本文公开的抗体的框架区。在一些实施方式中，选择性结合RGMc的抗体是鼠抗体，并包含鼠构架区序列。在其他实施方式中，抗体是嵌合抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，抗体是人源化抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，抗体是全人抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，抗体包含含有人种系氨基酸序列的框架区。
本文所述的抗体及其抗原结合片段可以具有适合于结合抗原的任何构型。例如，在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含四个多肽链，包括两个重链可变区和两个轻链可变区。在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含一个重链可变区和一个轻链可变区。在示例性实施方式中，抗体或其抗原结合片段是Fab片段、F(ab’)2片段、scFab片段、scFv或双抗体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含人IgG1恒定域或人IgG4恒定域的重链免疫球蛋白恒定域。在示例性的实施方式中，重链免疫球蛋白恒定域是人IgG4恒定域。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合构象表位。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合组合或不连续表位。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含人IgG4恒定域的重链免疫球蛋白恒定域，其具有Ser至Pro的骨架置换，其产生IgG1样铰链并允许形成链间二硫键。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段还包含含有人Igλ恒定域或人Igκ恒定域的轻链免疫球蛋白恒定域。
在一个实施方式中，该抗体是具有四个多肽链的IgG，该四个多肽链是两个重链和两个轻链。在示例性的实施方式中，抗体可以是人源化抗体、人抗体或嵌合抗体。在一个实施方式中，抗体包含具有人种系氨基酸序列的框架。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其与本文所述的抗体或其抗原结合片段竞争结合。在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其与本文所述的抗体或其抗原结合片段结合相同的表位。
在本发明的另一方面，提供了一类RGMc特异性抗体，其中每一种不与RGMa和/或RGMb结合。这样的特异性结合RGMc的抗体(例如，本文所述的抗体)以≤5nM(例如，≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.5nM、≤0.1nM和≤0.05nM)的KD结合。在一个实施方式中，抗体以≤5nM的KD结合人RGMc。在另一个实施方式中，抗体以≤4nM的KD结合人RGMc。在另一个实施方式中，抗体以≤3nM的KD结合人RGMc。在另一个实施方式中，抗体以≤2nM的KD结合人RGMc。在另一个实施方式中，抗体以≤1nM的KD结合人RGMc。在另一个实施方式中，抗体以≤0.5nM的KD结合人RGMc。在另一个实施方式中，抗体以≤0.1nM的KD结合人RGMc。在另一个实施方式中，抗体以≤0.05nM的KD结合人RGMc。本领域熟悉可用于测定体外结合活性的合适技术和分析法。
在优选的实施方式中，测量抗体对其抗原的亲和力的合适方式包括但不限于所谓的生物膜层干涉术(BLI)技术和基于表面等离子体共振(SPR)的分析。前者包括
Figure BDA0003106722380000511
系统，和后者包括Biacore系统。在另一个实施方式中，测量抗体对其抗原的亲和力的合适方式包括Meso Scale Discovery(MSD)。
本公开的方面涉及与本文提供的任何特异性抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体，例如，如上所述具有一个或多个CDR序列(1、2、3、4、5或6个CDR序列)的抗体。在一个实施方式中，本发明提供了与具有如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的重链CDR序列和/或如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11中所示的轻链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争的抗体及其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供了与具有包含SEQ ID NO:12的重链可变区序列和/或包含SEQ ID NO:13的轻链可变区序列的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体及其抗原结合片段，其与具有如SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的重链CDR序列和/或如SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的轻链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争。在一个实施方式中，本发明提供了与具有包含SEQ ID NO:20的重链可变区序列和/或包含SEQ ID NO:21的轻链可变区序列的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体及其抗原结合片段，其与具有如SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的重链CDR序列和/或如SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26和SEQ ID NO:27所示的轻链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争。在一个实施方式中，本发明提供了与具有包含SEQ ID NO:28的重链可变区序列和/或包含SEQ ID NO:29的轻链可变区序列的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体及其抗原结合片段，其与具有如SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的重链CDR序列和/或如SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:35所示的轻链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争。在一个实施方式中，本发明提供了与具有包含SEQ ID NO:36的重链可变区序列和/或包含SEQ ID NO:37的轻链可变区序列的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体及其抗原结合片段，其与具有如SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示的重链CDR序列和/或如SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42和SEQ ID NO:43所示的轻链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争。在一个实施方式中，本发明提供了与具有包含SEQ ID NO:44的重链可变区序列和/或包含SEQ ID NO:45的轻链可变区序列的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段在与本文提供的任何抗体相同的表位处或其附近结合。在一些实施方式中，如果抗体或其抗原结合片段在表位的15个或更少的氨基酸残基内结合，则其在表位附近结合。在一些实施方式中，本文提供的任何抗体或其抗原结合片段在本文提供的任何抗体结合的表位的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基内结合。
在另一个实施方式中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其以抗体与蛋白质之间小于10-8M的平衡解离常数KD竞争或交叉竞争结合本文提供的任何抗原(例如，人RGMc)。在其他实施方式中，抗体以10-11M至10-8M范围内的KD竞争或交叉竞争结合RGMc。在一些实施方式中，本文提供了RGMc特异性抗体或其抗原结合片段，其与本文所述的抗体或其抗原结合片段竞争结合。在一些实施方式中，本文提供了RGMc特异性抗体或其抗原结合片段，其与本文描述的抗体或其抗原结合片段结合相同的表位。
本文提供的抗体可以使用任何合适的方法表征。例如，一种方法是识别抗原与其结合的表位或“表位作图”。有许多合适的方法用于定位和表征蛋白质上表位的位置，包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争分析、基因片段表达分析和基于合成肽的分析，例如，如Harlow和Lane，Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999的第11章中所述的。在另外的实例中，表位作图可用于测定抗体与其结合的序列。该表位可以是线性表位，即包含在单一氨基酸片段中，或可能不一定在单一片段(一级结构线性序列)中包含的氨基酸的三维相互作用形成的构象表位。
可以分离或合成(例如，重组地)不同长度(例如，至少4-6个氨基酸长)的肽，并将其用于抗体的结合分析。在另一个实例中，可以通过使用来源于靶抗原序列的重叠肽和测定抗体的结合而在系统性筛选中确定抗体与其结合的表位。根据基因片段表达分析，编码靶抗原的开放阅读框被随机地或通过特定的遗传构建片段化，并且测定抗原的表达片段与待测试抗体的反应性。例如，可以通过PCR产生基因片段，和然后在存在放射性氨基酸的情况下在体外转录和翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳测定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。也可以通过使用噬菌体颗粒表面上显示的大型随机肽序列文库(噬菌体文库)识别某些表位。或者，可以在简单的结合分析中测试限定的重叠肽片段文库与测试抗体的结合。在另外的实例中，可以进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以识别表位结合所需的、充分的和/或必需的残基。例如，可以使用靶抗原的突变体进行结构域交换实验，其中RGMc的各个片段被来自密切相关但抗原性不同的蛋白质(例如RGMc蛋白质家族的另一个成员，例如RGMa或RGMb)的序列替换(交换)。通过评估抗体与突变体RGMc的结合，可以评估特定抗原片段对抗体结合的重要性。
可选地，可以使用已知与相同抗原结合的其他抗体进行竞争分析，以测定抗体是否结合与其他抗体相同的表位。竞争分析是本领域技术人员众所周知的。
此外，本文提供的任何抗体与RGMc中一个或多个残基的相互作用可以通过常规技术测定。例如，可以测定晶体结构，并且可以相应地测定RGMc中的残基与抗体(或抗原结合片段)中的一个或多个残基之间的距离。基于这样的距离，可以测定RGMc中的特定残基是否与抗体中的一个或多个残基相互作用。此外，可以应用诸如竞争分析法和靶诱变分析法的合适方法来测定候选抗体的优先结合。
在一些实施方式中，与RGMc选择性结合的本发明的抗体或其抗原结合片段包含如本文所述的一个或多个互补决定区(CDR)。在一些实施方式中，如本文所述，本发明提供了编码选择性结合RGMc的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。在一个实施方式中，核酸分子编码如本文所述的一个或多个CDR序列。
通过H/DX-MS确定的RGMc特异性抗体结合区域
在本公开的上下文中，抗原的“结合区”为抗体-抗原相互作用提供了结构基础。如本文所用，“结合区”是指抗体和抗原之间的界面区域，使得当在生理溶液中与RGMc结合时，抗体或片段保护结合区免于溶剂暴露，如通过合适的技术如氢/氘交换质谱法(H/DX-MS)测定的。
本领域熟悉H/DX-MS，它是一种广泛用于探索溶液中蛋白质构象或蛋白质-蛋白质相互作用的技术。该方法依赖于蛋白质主链酰胺中的氢与溶液中存在的氘的交换。通过测量氢-氘交换速率，人们可以获得有关蛋白质动力学和构象的信息(综述于：Wei等(2014)“Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry for probing higher orderstructure of protein therapeutics:methodology and applications.”Drug DiscoToday.19(1):95-102；通过引用并入)。该技术的应用是基于这样的前提：当抗体-抗原复合物形成时，结合伴体之间的界面可能会阻塞溶剂，从而由于空间上排除溶剂而降低或阻止H/D交换速率。
使用该技术，可以确定抗体(或片段，例如Fab)对RGMc的结合区。在一些实施方式中，识别为对结合满足本文所述选择标准的抗体或片段重要的人RGMc上的一部分包含氨基酸片段YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的至少一部分，其存在于RGMc的α-1螺旋结构域内。在全长RGMc(SEQ ID NO:1)上相同区域可以识别为氨基酸残基46-53。如图8B所示，该结合区域显示了RGM家族成员之间的序列多样性。因此，不受特定理论的束缚，可以预期，该第一结合区域(区域A)可有助于相对于RGMa和RGMb的RGMc特异性。在一些实施方式中，对于抗体(或抗原结合片段)的表位包含结合区YVSSTLSL的至少一个氨基酸残基。在一些实施方式中，对于抗体(或抗原结合片段)的表位包含结合区的两个或更多个氨基酸残基。
在一些实施方式中，识别为对结合满足本文所述选择标准的抗体或片段重要的人RGMc上的一部分包含氨基酸片段FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的至少一部分，其存在于RGMc的α-3螺旋结构域内。如RGMc/BMP2结构模型所示(图8C)，α-3螺旋密切接近BMP2。因此，不受特定理论的束缚，可以预期，该第二结合区(区域B)可有助于本文所述的BMP竞争性抗体的功能性(例如，抑制性)作用。在一些实施方式中，对于抗体(或抗原结合片段)的表位包含结合区FHSAVHGIEDL的至少一个氨基酸残基。在一些实施方式中，对于抗体(或抗原结合片段)的表位包含结合区的两个或更多个氨基酸残基。
几个观察结果支持以下观点：源自SR-RC-AB3的抗体(例如，SR-RC-AB9)结合RGMc的区域A和/或区域B中的至少一个氨基酸。
首先，基于RGMc与SR-RC-AB9 Fab的HDX-MS数据，区域A和B相对柔性和溶剂可及。因此，它们可用于结合抗体。这些区域在RGMc的未结合形式中的相对氘吸收显示
Figure BDA0003106722380000551
相对氘吸收。较少可及的区域相对氘吸收通常不到30％。考虑到RGMc N末端结构域的高构象动力学，很可能的是该结构域可以获得增加了抗体结合的可能性的几种构象(参见，例如，图8C，PDB ID 4UI1，与BMP2结合的RGMc)。
第二，区域A和B也具有对于BMP2的几个接触点(见图8D和8E)，表明这些区域是结合相互作用的“热点”。而且，在仔细检查区域A和B时，一些残基可以用作相对于RGMa和RGMb的RGMc特异性的结构决定子(参见图8E)。
第三，抗体的CDR(H1-H3)可以跨越RGMc N末端结构域的区域A和B的表面(见图8F)。这可以表明每一个区域的至少一个(例如，一个或多个)残基参与为抗体结合的表位。另外，氘吸收曲线的形状(图8A)显示出跨时间点的显著的H/D交换，表明抗体-抗原相互作用在区域A和B内是相当稳定的。
以及最后，RGMc N-末端与RGMc SR-RC-AB9 fab的结合数据也可以阐明抗体结合可能需要两个螺旋(1&3)的概念。特别地，SR-RC-AB9对RGMc的高结合亲和力表明必须存在抗原/抗体相互作用的显著界面包埋表面。当区域A(螺旋1)和区域B(螺旋3)都参与与抗体的结合时，这些高度包埋的表面区域是可能的。
因此，在一个实施方式中，本发明的RGMc特异性抗体至少结合YVSSTLSL(SEQ IDNO:46)的至少一个氨基酸残基。在另一个实施方式中，本发明的RGMc特异性抗体至少结合FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的至少一个氨基酸残基。在另一个实施方式中，本发明的RGMc特异性抗体至少结合YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的至少一个氨基酸残基和/或FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的至少一个氨基酸残基。在另一个实施方式中，本发明的RGMc特异性抗体至少结合YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的至少一个氨基酸残基和FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的至少一个氨基酸残基。在另一个实施方式中，RGMc特异性抗体结合包含人RGMc内第一和第二结合区各自的至少一个氨基酸的不连续表位，其中所述第一结合区包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；和/或其中第二结合区包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。在特定的实施方式中，RGMc特异性抗体结合包含人RGMc内的第一和第二结合区各自的至少一个氨基酸不连续的表位，其中第一结合区包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；和其中第二结合区包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文提供的人RGMc特异性抗体结合具有氨基酸序列YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的结合区(区域A)的至少一部分。在另一个实施方式中，本文提供的RGMc特异性抗体结合具有氨基酸序列FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的结合区(区域B)的至少一部分。在另一个实施方式中，本文提供的RGMc特异性抗体结合具有氨基酸序列YVSSTLSL(SEQID NO:46)的结合区的至少一部分和/或具有氨基酸序列FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的结合区的一部分。在另一个实施方式中，本文提供的RGMc特异性抗体结合具有氨基酸序列YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的结合区的至少一部分，和具有氨基酸序列FHSAVHGIEDL(SEQ IDNO:47)的结合区的一部分，或其一部分。在另一个实施方式中，RGMc特异性抗体结合包含人RGMc内的第一和第二结合区的至少一部分的不连续表位，其中第一结合区包含如SEQ IDNO:46所示的氨基酸序列；和/或其中第二结合区包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。在特定的实施方式中，RGMc特异性抗体结合包含人RGMc内第一和第二结合区的至少一部分的不连续的表位，其中第一结合区包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；和其中第二结合区包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明的RGMc特异性抗体结合人RGMc内的不连续表位，其中a)该抗体是全长抗体或其抗原结合片段；和b)抗体与包含YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的至少一个氨基酸残基的第一结合区结合。在另一个实施方式中，本发明的RGMc特异性抗体结合人RGMc内的不连续表位，其中a)该抗体是全长抗体或其抗原结合片段；和b)抗体与包含FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的至少一个氨基酸残基的第二结合区结合。在另一个实施方式中，本发明的RGMc特异性抗体结合人RGMc内的不连续表位，其中a)该抗体是全长抗体或其抗原结合片段；b)抗体与包含YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的至少一个氨基酸残基的第一结合区结合；和c)该抗体与包含FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的至少一个氨基酸残基的第二结合区结合。
核酸
在一些实施方式中，本公开的抗体、其抗原结合片段和/或组合物可以由核酸分子编码。这样的核酸分子包括但不限于DNA分子、RNA分子、多核苷酸、寡核苷酸、mRNA分子、载体、质粒等。在一些实施方式中，本公开可以包含被编程或产生以表达编码本公开的化合物和/或组合物的核酸分子的细胞。
在一些实施方式中，本发明提供了编码前述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。例如，在一个实施方式中，本发明提供了编码包含本文所述的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或其组合的多肽的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子可以编码包含本文所述的CDRH1、CDRH2和CDRH3的多肽。在一些实施方式中，核酸分子可以编码包含本文所述的CDRL1、CDRL2和CDRL3的多肽。在一些实施方式中，与如本文所述的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或其组合的任何一个中的相应CDR区相比，核酸分子编码的多肽可包含多达5、4、3、2或1个氨基酸残基变异。
在一个实施方式中，核酸分子编码包含与SEQ ID NO:12所示氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变域，和/或与SEQ ID NO:13所示氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链可变域的多肽。在一个实施方式中，核酸分子编码包含与SEQ IDNO:20所示氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变域，和/或与SEQ ID NO:21所示氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链可变域的多肽。在一个实施方式中，核酸分子编码包含与SEQ ID NO:28所示氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变域，和/或与SEQ ID NO:29所示氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链可变域的多肽。在一个实施方式中，核酸分子编码包含与SEQ ID NO:36所示氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变域，和/或与SEQ ID NO:37所示氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链可变域的多肽。在一个实施方式中，核酸分子编码包含与SEQ IDNO:44所示氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变域，和/或与SEQ ID NO:45所示氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链可变域的多肽。
在一些实施方式中，核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:44所示的重链可变域氨基酸序列，和SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:45所示的轻链可变域氨基酸序列。在一些实施方式中，核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:12所示的重链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:13所示的轻链可变域氨基酸序列。在一些实施方式中，核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:20所示的重链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:21所示的轻链可变域氨基酸序列。在一些实施方式中，核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:28所示的重链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:29所示的轻链可变域氨基酸序列。在一些实施方式中，核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:36所示的重链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:37所示的轻链可变域氨基酸序列。在一些实施方式中，核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:44所示的重链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:45所示的轻链可变域氨基酸序列。
在某些情况下，本发明的核酸包括密码子优化的核酸。产生密码子优化的核酸的方法是本领域已知的，并且可以包括但不限于美国专利号5,786,464和6,114,148中描述的方法，其每一个的内容通过引用整体并入本文。
结合RGMc的抗体的产生
本发明包括以高亲和力结合RGMc并且不结合RGMa和/或RGMb的抗体或其片段的筛选方法、产生方法和制备方法，以及包含它们的药物组合物和相关试剂盒。本领域熟悉可用于获得本公开的抗体或其抗原结合片段的各种技术和方法。例如，可以使用重组DNA方法、杂交瘤技术、噬菌体或酵母展示技术、转基因动物(例如，
Figure BDA0003106722380000601
)或它们的一些组合来产生抗体。
i.免疫和杂交瘤
在本文所述的一些方法中，特定的抗原(例如，RGMc肽或蛋白质，例如，可溶性RGMc肽或蛋白质)可用于免疫非人类动物(“宿主”)，例如，啮齿动物，例如小鼠、仓鼠或大鼠。在一个实施方式中，非人类动物是小鼠。在另一个实施方式中，宿主可以是骆驼科动物。在进一步的实施方式中，宿主可以是鲨鱼。
在免疫(其可以包括抗原暴露(例如，注射)的单个或多个步骤)后，从动物收获脾细胞，并将相关的B细胞与永生化骨髓瘤细胞融合以形成用于产生抗体的杂交瘤。可根据已知方法(参见例如，Kohler和Milstein(1975)Nature，256：495-499)产生杂交瘤。然后使用标准方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、生物膜层干涉技术(BLI)技术(例如，OCTET)和表面等离振子共振(例如，BIACORE)分析)筛选以此方式形成的杂交瘤，以识别一种或多种产生特异性结合指定抗原的抗体的杂交瘤。任何形式的指定抗原可以用作免疫原，例如，重组抗原、天然存在的形式、其任何变体或片段以及其抗原肽(例如，本文中描述为线性表位或在支架内作为构象表位的任何表位)。
ii.筛选文库/多个文库
在一些实施方式中，制备或识别抗体的方法或过程包括筛选表达抗体或其片段(例如，scFv)的蛋白质表达文库(例如，噬菌体、酵母或核糖体展示文库)的步骤。例如，可以在噬菌体或酵母上合成人组合抗体或scFv片段的文库，然后用目的抗原或其抗体结合片段筛选文库，并分离结合抗原的噬菌体或酵母，可以从其中获得抗体或免疫反应性片段(Vaughan等，1996,PMID:9630891；Sheets等，1998,PMID:9600934；Boder等，1997,PMID:9181578；Pepper等,2008,PMID:18336206)。
噬菌体展示被进一步描述于，例如，Ladner等，美国专利号5,223,409；Smith(1985)Science 228:1315-1317；Clackson等(1991)Nature,352:624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；和WO 90/02809中。酵母展示被进一步描述于，例如，US 7,700,302和US 8,877,688中。在特定方法中，酵母展示文库表达全长抗体。
用于产生噬菌体或酵母展示文库的试剂盒是可商购的。还存在可用于产生和筛选抗体展示文库的其他方法和试剂(参见US 5,223,409；WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；和Barbas等，1991，PMID：1896445)。此类技术有利地允许筛选大量的候选抗体。
无论如何获得，可以选择、克隆和进一步筛选产生抗体的细胞(例如，酵母菌落、杂交瘤等)的所需的特征，包括例如强劲的生长、高的抗体产量和所需的抗体特性/性质，例如对目标抗原的高亲和力和特异性结合。优选地，这样的抗体显示出具有≤5nM，优选≤1nM，更优选≤0.1nM的KD值的体外结合活性。因此，本文中本发明涵盖的RGMc抗体对于重组RGMc具有≤5nM，优选≤1nM，更优选≤0.1nM的KD值。
其他选择标准可以包括多特异性试剂(PSR)评分和/或疏水相互作用色谱法(HIC)保留时间。PSR评分是测定与蛋白质的一般结合(即，非特异性结合)的水平/程度的一种方法。例如，在某些情况下，多特异性试剂(PSR)是由293和/或CHO细胞的可溶性膜的制备物。低(0.1-0.33)或零(0-0.10)PSR评分是最理想的分布，而中等(0.33-0.66)或高(0.66-1.00)评分则较不理想。测定PSR评分的方法是本领域普通技术人员公知的。在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段的PSR评分＜0.1。在其他实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段的PSR评分为0。
另一方面，HIC保留时间是测定抗体自我相互作用的倾向(prosperity)的一种方法，其预测它们是否在溶液中保持可溶/单分散(也称为聚集倾向)。高HIC保留时间表示更大的聚集倾向。该性质可能是由于抗体中疏水残基/氨基酸的补片。可选地，翻译后修饰，特别是糖的存在可以导致抗体具有低的HIC保留时间。因此，在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段具有低的HIC保留时间(例如，＜10.5分钟)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段具有中等的HIC保留时间(例如，≥10.5min且≤11.5min)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段具有高的HIC保留时间(例如，≥11.5分钟)。
选择、克隆和扩增菌落和/或杂交瘤的方法是本领域普通技术人员公知的。一旦确定所需的抗体，可以使用本领域公认的常见分子生物学和生化技术分离、操纵和表达相关的遗传物质。
iii.人源化
本发明的抗体或片段优选是全人抗体或人源化抗体。因此，无论来源如何，应理解该方法可以包括将一种或多种抗体或其片段人源化，其中可以使用本领域已知的分子工程技术来制备人抗体序列，并将其引入本文所述的表达系统和宿主细胞中。这样的非天然重组产生的人抗体(和主题组合物)与本公开的教导完全相容，并且明确地保持在本发明的范围内。在某些选择的方面，本发明的RGMc抗体将包含重组产生的人抗体。
iv.亲和力成熟和优化
在一些实施方式中，通过上述方法产生的抗体可以具有中等亲和力(例如，Ka为约106至107M-1或KD为约10-6至10-7M)。因此，如果需要，可以将抗体或其片段作为优化的部分进行亲和力成熟的过程。术语“亲和力成熟”应具有技术人员容易理解的含义。简而言之，它是指进一步修饰候选抗体或片段(通常称为“亲本”或“亲本的”)的氨基酸序列以实现与特定抗原的结合特征的改善。通常，亲本抗体和亲和力成熟的对应物(有时称为“子代”或“后代”)保留相同的表位。可以在亲和力成熟过程中的适当步骤进行合适的体外结合分析以筛选改进的结合体。任选地，在一些实施方式中，还可进行功能分析(例如，基于细胞的效能分析，体外功能分析，等)以确认所需的功能。
亲和力成熟通常涉及序列多样化和/或诱变，而引入或产生突变或序列改变的确切方法不受限制。在一些实施方式中，诱变包含在一个或多个CDR的氨基酸残基中引入一个或多个改变(例如，置换或缺失)。因此，在一些实施方式中，本文所述的VR或CDR序列可包含相对于参考序列(例如，亲本序列的参考序列)最多1、2、3或4个氨基酸改变。在一些实施方式中，本文所述的VR或CDR序列可包含最多1、2、3或4个氨基酸置换。在一些实施方式中，本文所述的VR或CDR序列可包含最多1、2、3或4个缺失。另外地或可选地，诱变的过程可以包含可变区或CDR的所谓的寡聚体步移(oligo-walking)。
例如，抗体的亲和力成熟可以通过多种方法完成，包括随机诱变(Gram H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1992)89,3576-3580和Hawkins RE等，J.Mol.Biol.(1992)226,889-896)，CDR序列的随机诱变，例如CDR步移(Yang WP等，J.Mol.Biol.(1995)254,392-403)，残基的定向诱变(Ho M.等，J.Biol.Chem.(2005)280,607-617和Ho M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103,9637-9642)，以及在体外重现体细胞超突变(SHM)的方法(Bowers P.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2011)108,20455-20460)。
在一个实施方式中，可以通过在可变重链或可变轻链区上进行诱变而使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过对可变重链CDR或可变轻链CDR中的任一个进行诱变来使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过对可变重链CDR3进行诱变来使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过对可变重链CDR2进行诱变来使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过对可变重链CDR1进行诱变来使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过在可变轻链CDR3上进行诱变而使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过在可变轻链CDR2上进行诱变而使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过在可变轻链CDR1上进行诱变而使抗体亲和力成熟。
在一些实施方式中，亲和力成熟涉及筛选包含一个或多个CDR的变体的抗体文库(“库”)，其可以与亲本抗体的至少一个CDR组合。此过程有时称为CDR改组或CDR多样化。在一些实施方式中，可变重链CDR3(例如，CDR-H3)可用于筛选包含变体的可变重链CDR1和CDR2(例如，CDR-H1和CDR-H2)库的文库(也称为CDR-H1/H2多样化)。在一些实施方式中，可变轻链CDR3(例如，CDR-L3)可用于筛选包含变体的可变轻链CDR1和CDR2(例如，CDR-L1和CDR-L2)库的文库(也称为CDR-L1/L2多样化)。
在一些实施方式中，亲和力成熟涉及筛选包含轻链变体的抗体文库(“库”)，其可以与亲本抗体的重链组合(轻链改组)。例如，在一些实施方式中，将选择的重链引入包含轻链变体的抗体文库中，从而产生可以针对改善的亲和力进行筛选的新的抗体文库。在一些实施方式中，天然存在的可变区变体的库可得自未免疫的供体。重链或轻链改组的实例描述于以下文件中：Marks等，(1992)Nature Biotech 10:779-78；Schier等,(1996)J.Mol.Biol.255,28-43；Park等,(2000)BBRC.275.553-557；和Chames等,(2002)J.Immunol1110-1118。在一些实施方式中，轻链文库包含λ轻链变体。在一些实施方式中，轻链文库包含κ轻链变体。在一些实施方式中，轻链文库包含λ和κ轻链变体两者。
应当理解，可以按任何顺序组合用于亲和力成熟的各种方法。例如，在一个实施方式中，选择的抗体可以经历重链CDR多样化，然后进行CDR-H3诱变。在另一个实施方式中，选择的抗体可以经历重链CDR多样化，然后进行CDR-H3诱变，然后进行轻链改组。在另一个实施方式中，选择的抗体可以进行重链CDR改组，随后进行轻链改组，然后进行CDR-H3诱变。在优选的实施方式中，选择的抗体可以进行轻链改组，然后进行CDR-H1/H2多样化，然后进行CDR-H3诱变。
在上述用于亲和力成熟的任何方法中，可以使用已知技术(例如，FACS)针对与靶抗原(例如，可溶性RGMc)的结合选择所得的新抗体。可以通过改变抗原浓度和/或对于未标记的(冷)抗原的竞争来测试使用FACS的结合特异性和亲和力。可以使用本领域已知的其他技术进一步评估结合亲和力，例如ELISA、BLI(例如，OCTET)和SPR(例如，BIACORE)。
除了上面讨论的亲和力成熟过程之外，可以进行进一步的优化以实现期望的产品谱。因此，可以对抗体进一步进行优化步骤，并根据某些有利的物理化学性质进行选择。对于治疗性抗体(生物制剂)，可评估的对于可开发性的物理化学标准包括但不限于：溶解度、稳定性、免疫原性、缺乏自身缔合或聚集、Fc功能、内化特性、pH敏感性、糖基化和可制造性，例如，细胞存活力和/或基因表达。在一些实施方式中，优化过程涉及恒定区内一个或多个氨基酸序列的诱变。
在一个方面，本发明提供了一种用于制备药物组合物的方法，该药物组合物包含特异性结合人RGMc但不结合人RGMa或人RGMb的抗体或其抗原结合片段；其中该抗体或其抗原结合片段抑制RGMc但不抑制RGMa或RGMb，该方法包括含以下步骤：i)提供至少一种包含人RGMc的抗原(例如可溶性人RGMc)，ii)选择第一组特异性结合人RGMc的抗体或其抗原结合片段以提供人RGMc的特异性结合体；iii)选择第二组抑制RGMc相关的BMP6信号传导的抗体或其抗原结合片段，从而产生RGMc/BMP6活性的特异性抑制剂；iv)将存在于第一组抗体和第二组抗体中的抗体或其抗原结合片段配制成药物组合物，从而制备包含抗体或其抗原结合片段的组合物。
在优选的实施方式中，该方法进一步包括从第一组抗体或其抗原结合片段中除去结合人RGMa和/或人RGMb的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。在一个实施方式中，该方法进一步包括测定或确认在步骤(ii)和/或(iii)中选择的抗体或其抗原结合片段的特异性的步骤。在一个实施方式中，该方法进一步包括选择与人类和啮齿动物抗原交叉反应的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一个实施方式中，该方法进一步包括产生存在于第一组抗体和第二组抗体中的抗体或其抗原结合片段的全人或人源化抗体或其抗原结合片段的步骤。在一个实施方式中，该方法进一步包括使存在于第一组抗体和第二组抗体中的抗体或其抗原结合片段经历亲和力成熟和/或优化的步骤，以提供亲和力成熟的和/或优化的抗体或其片段。
在一些实施方式中，用于制备药物组合物的方法还包括在至少一种体内模型中测试一种或多种候选RGMc抑制剂以评估或确认用于实现或校正铁调节的功效的步骤。在一些实施方式中，用于制备药物组合物的方法还包括在至少一种体内模型中测试一种或多种候选RGMc抑制剂(例如，显示体内功效的此类抗体)以评估在等于或高于治疗有效剂量的剂量下的安全性/耐受性的步骤。合适的治疗性抗体应在充分大于动物模型中的有效剂量的剂量下显示可接受的毒性。在一些实施方式中，可以使用一种或多种抗体来进行体内功效和/或安全性研究，所述抗体包含非CDR部分或与临床前研究中使用的特定物种(例如，鼠对应物等)更紧密匹配的部分。
在另一个实施方式中，从非人类动物获得单克隆抗体，然后使用合适的重组DNA技术对其进行修饰，例如制成嵌合的。已经描述了多种用于制备嵌合抗体的方法。参见，例如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851,1985；Takeda等,Nature 314:452,1985,Cabilly等,4,816,567号美国专利；Boss等,4,816,397号美国专利；Tanaguchi等,欧洲专利公开号EP171496；欧洲专利公开号0173494，英国专利GB 2177096B。
关于其他抗体产生技术，参见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual，编辑Harlow等，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。本公开不一定限于抗体的任何特定来源、生产方法或其他特殊特征。
本公开的一些方面涉及用多核苷酸或载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。存在于宿主细胞中的多核苷酸或载体可以被整合到宿主细胞的基因组中，或者可以保持在染色体外。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如，细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人类细胞。在一些实施方式中，真菌细胞是，例如，酵母属的那些，特别是酿酒酵母(S.cerevisiae)种的那些。术语“原核”包含可以用DNA或RNA分子转化或转染以表达抗体或相应的免疫球蛋白链的所有细菌。原核宿主可以包含革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，如例如，大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌和枯草芽孢杆菌。术语“真核”包含酵母、高等植物、昆虫和脊椎动物细胞，例如，哺乳动物细胞，例如NSO和CHO细胞。取决于重组生产程序中使用的宿主，由多核苷酸编码的抗体或免疫球蛋白链可以是糖基化的或可以是非糖基化的。抗体或相应的免疫球蛋白链也可包含起始甲硫氨酸氨基酸残基。
在一些实施方式中，一旦将载体整合入合适的宿主中，该宿主可以维持在适合于核苷酸序列的高水平表达的条件下，并且根据需要，随后可以收集和纯化免疫球蛋白轻链、重链、轻/重链二聚体或完整抗体、抗原结合片段或其他免疫球蛋白形式；参见，Beychok，Cells of Immunoglobulin Synthesis,Academic Press,N.Y.,(1979)。因此，将多核苷酸或载体引入细胞，该细胞随之产生抗体或抗原结合片段。此外，包含上述宿主细胞的转基因动物，优选哺乳动物，可用于大规模生产抗体或抗体片段。
可以在发酵罐中使转化的宿主细胞生长，并使用任何合适的技术进行培养以实现最佳的细胞生长。一旦表达，可以根据本领域的标准程序，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等，纯化全抗体、其二聚体、单个轻链和重链、其他免疫球蛋白形式或抗原结合片段；参见Scopes，"Protein Purification",Springer Verlag,N.Y.(1982)。然后可以从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜级分中分离抗体或抗原结合片段。例如，微生物表达的抗体或抗原结合片段的分离和纯化可以通过任何常规手段进行，例如，制备型色谱分离和免疫学分离，如涉及使用针对例如，针对抗体的恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体的那些。
本公开的方面涉及杂交瘤，其提供无限延长的单克隆抗体源。作为直接从杂交瘤的培养物中获得免疫球蛋白的替代方式，永生化的杂交瘤细胞可以用作重排重链和轻链基因座的来源用于随后的表达和/或遗传操作。重排的抗体基因可以从适当的mRNA逆转录以产生cDNA。在一些实施方式中，重链恒定区可以交换为不同同种型的恒定区或完全消除。可变区可被连接以编码单链Fv区。可以连接多个Fv区以赋予与超过一种靶标的结合能力，或者可以采用嵌合的重链和轻链组合。可以使用任何适当的方法来克隆抗体可变区和产生重组抗体。
在一些实施方式中，获得了编码重链和/或轻链的可变区的合适核酸，并将其插入表达载体中，所述表达载体可以被转染到标准的重组宿主细胞中。可以使用多种这样的宿主细胞。在一些实施方式中，哺乳动物宿主细胞对于有效的加工和生产可能是有利的。可用于此目的的典型哺乳动物细胞系包括CHO细胞、293细胞或NSO细胞。可以通过在适于宿主细胞生长和编码序列表达的培养条件下培养修饰的重组宿主而进行抗体或抗原结合片段的产生。可以通过从培养物分离抗体或抗原结合片段来回收它们。可以将表达系统设计为包含信号肽，以便将所得抗体分泌到培养基中；然而，细胞内产生也是可能的。
本公开还包括编码本文所述抗体的免疫球蛋白链的至少可变区的多核苷酸。在一些实施方式中，由多核苷酸编码的可变区包含由上述杂交瘤中的任一种产生的抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
编码抗体或抗原结合片段的多核苷酸可以是，例如DNA、cDNA、RNA或者合成产生的DNA或RNA或者重组产生的嵌合核酸分子，其单独或组合地包含那些多核苷酸的任何一种。在一些实施方式中，多核苷酸是载体的部分。这样的载体可以包含其他基因，例如标记基因，其允许β在合适的宿主细胞中并且在合适的条件下成为载体。
在一些实施方式中，多核苷酸与表达控制序列可操作地连接，以允许在原核或真核细胞中表达。多核苷酸的表达包括将多核苷酸转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞，优选哺乳动物细胞中表达的调控元件是本领域技术人员众所周知的。它们可以包括促进转录起始的调控序列和任选地促进转录终止和转录物稳定的聚-A信号。其他调控元件可包含转录以及翻译增强子，和/或天然相关或异源启动子区域。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括，例如大肠杆菌中的PL、Lac、Trp或Tac启动子，并且允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或者哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-启动子、SV40启动子、RSV启动子(劳斯肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。
除了负责转录起始的元件之外，这类调控元件还可以包括多核苷酸下游的转录终止信号，例如SV40-聚-A位点或tk-聚-A位点。此外，取决于所采用的表达系统，可以将能够将多肽引导至细胞区室或将其分泌至培养基中的前导序列添加至多核苷酸的编码序列且先前已经进行描述。前导序列在适当的相中与翻译、起始和终止序列，和优选地，能够指导翻译的蛋白质或其一部分分泌到例如细胞外培养基中的前导序列组装在一起。任选地，可以使用编码融合蛋白的异源多核苷酸序列，所述融合蛋白包含C-或N-末端识别肽，其赋予所需特征，例如，表达的重组产物的稳定或简化的纯化。
在一些实施方式中，至少编码轻链和/或重链的可变域的多核苷酸可以编码两条免疫球蛋白链或仅一个的可变域。同样地，多核苷酸可以在相同启动子的控制下，或者可以单独控制用于表达。此外，一些方面涉及载体，特别是在基因工程中常规使用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体，其包含编码抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白链可变域的多核苷酸；任选地与编码抗体的另一免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸组合。
在一些实施方式中，在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中以真核启动子系统提供表达控制序列，但是也可以使用原核宿主的控制序列。衍生自病毒(如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒)的表达载体可用于将多核苷酸或载体递送至靶细胞群体中(例如，工程改造细胞以表达抗体或抗原结合片段)。可以使用多种合适的方法来构建重组病毒载体。在一些实施方式中，可将多核苷酸和载体重构至脂质体中以递送至靶细胞。可以通过合适的方法将含有多核苷酸(例如，免疫球蛋白链的重和/或轻可变域编码序列和表达控制序列)的载体转移到宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而变化。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种用于制备包含RGMc选择性抑制剂(例如，中和抗体)的药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：i)识别抗体或抗原结合片段相对于RGMa和RGMb选择性结合RGMc的能力；ii)基于步骤(i)识别抗体或抗原结合片段在体内抑制/中和RGMc活性的能力；iii)基于步骤(i)和(ii)选择抑制/中和抗体以配制成药物组合物。在一个实施方式中，步骤(i)包括正向选择，并且任选地还包括负向选择。在一些实施方式中，识别步骤(i)包括筛选文库。在一些实施方式中，该文库是噬菌体文库或酵母文库。在一些实施方式中，识别步骤(ii)包括测定选自以下的铁参数：血清铁、总铁结合能力(TIBC)、不饱和铁结合能力(UIBC)和转铁蛋白饱和度。在一些实施方式中，步骤(ii)包括测量铁调素表达。在一些实施方式中，铁调素表达是肝铁调素水平和/或血清铁调素水平。在一些实施方式中，步骤(ii)包括识别能够在体内升高血清铁水平和/或抑制铁调素表达的中和抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，步骤(i)包括确认相对于RGMa和RGMb的对RGMc的选择性。
在另一个实施方式中，通过本文公开的方法产生的抗体或抗原结合片段结合排除BMP6结合位点的表位。在一些实施方式中，该表位排除了再生蛋白结合位点。在一些实施方式中，该表位排除了BMP6结合位点和再生蛋白结合位点。在一些实施方式中，与可溶性RGMc相比，抗体或抗原结合片段优先结合膜结合的RGMc。在一些实施方式中，抗体诱导抗体-抗原复合物的内化。
在另一个实施方式中，将通过本文公开的方法产生的药物组合物配制成用于静脉内或皮下施用。
修饰
可以用可检测的标记或可检测的基团修饰本公开的抗体或其抗原结合片段，所述可检测的标记或可检测的基团包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属、非放射性顺磁性金属离子以及用于检测和分离RGMc的亲和标记。可以使用合适的技术将可检测的物质或基团直接偶联或缀合本公开的多肽或者通过中间体(如例如，接头(例如，可裂解的接头))间接地偶联或缀合本公开的多肽。合适的酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的非限制性实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的非限制性实例包括生物素、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的非限制性实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；和合适的放射性材料的实例包括放射性金属离子，例如，α-发射体或其他放射性同位素，例如，碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)和锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、86R、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se和锡(113Sn、117Sn)。
使用合适的技术可以将可检测的物质直接偶联或缀合与RGMc特异性结合的本公开的抗体或者通过中间体(如例如，接头)间接偶联或缀合。与可检测物质缀合的本文提供的任何抗体可用于任何合适的诊断分析，例如本文所述的那些。
此外，也可以用药物修饰本公开的抗体或其抗原结合片段。可以使用合适的技术将药物直接偶联或缀合本公开的多肽或通过中间体(如例如，接头(例如，可裂解的接头))间接偶联或缀合。
药物组合物、制剂
进一步提供了用作适于在人类和非人类受试者中施用的药物的药物组合物/制剂。例如，可以将本发明涵盖的一种或多种RGMc特异性拮抗剂(例如，抗体)与药学上可接受的载体(赋形剂)(包括例如缓冲剂)一起配制或混合，以形成药物组合物。这样的制剂可以用于治疗涉及RGMc信号传导的疾病或障碍。在特别优选的实施方式中，所述制剂可以用于治疗如本文所述的贫血。
可以将本发明的药物组合物施用于患者以缓解RGMc相关的适应症。例如，RGMc相关的适应症可以是铁限制性贫血。本发明涵盖的铁限制性贫血的实例包括但不限于，慢性病性贫血(例如CKD)、铁难治性缺铁性贫血(IRIDA)、癌症诱导的贫血和/或化疗诱导的贫血。
“可接受的”是指载体与组合物的活性成分相容(并且优选地能够稳定该活性成分)，并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的赋形剂(载体)(包括缓冲剂)的实例对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且先前已经进行了描述。参见，例如，Remington:TheScience and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams和Wilkins,Ed.K.E.Hoover。
用于本发明方法中的药物组合物可以包含冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20thEd.(2000)Lippincott Williams和Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包含生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可以将活性化合物(例如，抗体、免疫缀合物或双特异性分子)包被在材料中，以保护该化合物免受酸和可能使该化合物失活的其他自然条件的作用。
本文所述的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不希望的毒理作用的盐(参见，例如，Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸的那些，例如，盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及衍生自无毒有机酸的那些，如脂族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如，钠、钾、镁、钙等)的那些，以及衍生自无毒有机胺(例如，N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱，二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些。
本文所述的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本文所述的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇，多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如，橄榄油)以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。例如，通过使用包衣材料(例如，卵磷脂)，在分散液的情况下通过保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。
这些组合物还可包含辅助剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序以及通过包含各种抗菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，来确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可通过包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射药物形式的吸收。
其他可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可以包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如，十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如，锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。药学上可接受的赋形剂在本文中进一步描述。
在一些实施例中，本文所述的药物组合物包含含有与RGMc特异性结合的抗体的脂质体，其可以通过任何合适的方法来制备，例如描述于Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；以及4,485,045和4,544,545号美国专利。具有延长的循环时间的脂质体公开于5,013,556号美国专利。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。通过具有确定孔径的过滤器挤出脂质体，以产生具有所需直径的脂质体。
本文所述的抗体也可以被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如，分别羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳液中。先前已经描述了示例性技术，参见，例如，Remington，The Science and Practice of Pharmacy20th Ed.Mack Publishing(2000)。
在其他实例中，本文所述的药物组合物可以配制成持续释放形式。持续释放制剂的合适实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质呈成型制品的形式，例如膜，或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸酯共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯和聚D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这很容易通过例如通过无菌滤膜的过滤来完成。通常将治疗性抗体组合物放入具有无菌进入端口的容器中，例如，具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
本文所述的药物组合物可以是单位剂型，例如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂或栓剂，用于口服、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入施用。
为了制备固体组合物例如片剂，可以将主要活性成分与药用载体混合，例如常规的压片成分例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶和其他药用稀释剂(例如水)，以形成包含本公开化合物或其无毒药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预配制组合物。当将这些预配制组合物称为均匀的时，是指将活性成分均匀地分散在整个组合物中，从而可以将组合物容易地细分为等效单位剂量形式，例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体预配制组合物细分为包含0.1mg至约500mg本发明活性成分的上述类型的单位剂型。可以将新组合物的片剂或丸剂包衣或以其他方式复配以提供具有延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内剂量和外剂量组分，后者为前者上的包封的形式。这两种组分可以由肠溶层分开，该肠溶层用于抵抗胃中的崩解并允许内组分完整地进入十二指肠中或使其延迟释放。多种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括多种聚合酸以及聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的材料的混合物。
合适的表面活性试剂包括，尤其非离子试剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇(例如，TweenTM 20、40、60、80或85)和其他山梨聚糖(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性试剂的组合物方便地包含0.05至5％之间的表面活性试剂，并且可以在0.1至2.5％之间。将理解的是，如果需要，可以添加其他成分，例如甘露醇或其他药学上可接受的媒介物。
可以使用可商购的脂肪乳剂，例如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM来制备合适的乳剂。可以将活性成分溶解在预混合的乳液组合物中，或者可以将其溶解在油(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中并在与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合时形成乳液。应当理解，可以添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳液的张度。合适的乳液通常将包含至多20％的油，例如5％至20％之间。
乳液组合物可以是通过将本发明的抗体与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些。
用于吸入或吹入的药物组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉剂。液体或固体组合物可以包含如上所述的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，通过口腔或鼻呼吸路径施用组合物以产生局部或全身作用。
可以通过使用气体雾化优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物。雾化的溶液可以直接从雾化装置中呼吸，或者雾化装置可以连接到面罩、帐篷或间歇性正压呼吸机上。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适当方式递送制剂的装置优选经口或经鼻施用。
治疗用途、治疗方法、患者群体
铁内稳态的异常与许多可能难以诊断和治疗的疾病相关。可以将此类障碍可大致分为两类：i)铁超载疾病，其包括肝硬化、心肌病、糖尿病等；和ii)缺铁性疾病，包括贫血、慢性病性贫血(“ACD”)等。缺铁性贫血(IDA)可以分为两种主要形式：绝对缺铁(AID)和功能性缺铁(FID)。AID的定义是体内铁储备的减少，而FID是其中全身铁储备正常或增加而向骨髓的铁供应(例如，铁动员)失调或不足的障碍。
当前与铁有关的疾病的治疗选择包括诸如IV铁的外部铁补充和ESA疗法(例如，EPO和类似药物)。然而，这些疗法与不希望的副作用有关。例如，已显示接受频繁补充铁剂(例如IV铁)的慢性贫血患者可能会出现铁超载。体内过多的铁可能具有高毒性，其可能会影响许多器官，从而导致各种严重病症，例如肝病、心脏病、糖尿病、激素异常和免疫系统功能异常。类似地，接受输血的患者也有与铁超载相关的毒性风险。例如，在接受多次输血的患者中，特别是患有重型地中海贫血、镰状细胞病、骨髓增生异常综合症、再生障碍性贫血、溶血性贫血和难治性铁粒幼细胞性贫血的患者(其可能变成依赖于输血)，来自输血红细胞中的过量铁(每次输血约250毫克)逐渐积累在各种组织中，从而导致发病和死亡。因此，治疗引起的体内过量铁可导致严重的不良反应，包括对心血管、胃肠道、免疫、骨骼/软骨、生殖和肾脏系统的毒性。
作为IV铁的附加或替代的治疗选择，ESA疗法(例如，EPO)已被广泛地施用于广泛的患者群体，包括患有癌症相关和化疗诱导的贫血的那些患者。然而，矛盾的是，最近的临床前和临床研究表明，ESA可能潜在地加速肿瘤的生长并危及癌症患者的生存。
HIF稳定剂代替外源添加的促红细胞生成素或其等效物旨在刺激身体产生内源性促红细胞生成素的能力，以便通过HIF信号传导级联增加红细胞。假设该方法可以潜在地减少与ESA治疗相关的危险因素，例如增加的癌症进展和严重的不良心脏事件(例如，中风)。然而，迄今为止，尚未明确建立改善的安全性。
最近，已显示特异性结合RGMa/RGMc的单克隆抗体可通过下调铁调素来增加大鼠和食蟹猴的血清铁(
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等(2015)AAPS J.20157；17(4):930–93)。在这种情况下，研究人员没有观察到接受RGMa/RGMc抗体的健康动物中的明显毒性，并且在给药期后的恢复期(
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12周)后，可见血液参数正常化。但是，与RGMa的同时抑制有关的潜在风险，例如对于神经系统和免疫调节作用，尚无法从已发表的著作中辨别出来。
因此，需要用于实现铁内稳态的改进疗法，其可以有效且安全地用于治疗患有涉及铁内稳态失衡的疾病和障碍(例如贫血)的患者。
因此，在一个方面，本发明提供了用于治疗和/或预防与铁代谢紊乱有关的病症，特别是与铁缺乏症(例如贫血)有关的病症的改进方法。RGMc-选择性抑制剂(例如，选择性结合并抑制RGMc而不是RGMa/b的单克隆抗体及其抗原结合片段)可用于治疗涉及受试者的功能性铁缺乏的病症。治疗用途包含以有效治疗受试者的量施用一种或多种根据本发明的RGMc-选择性抑制剂。治疗可包括减轻、缓解、正常化或维持一种或多种贫血的症状/参数，例如血清铁水平、转铁蛋白饱和度(TAST)、网织红细胞血红蛋白含量(CHr)、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和血细胞比容。RGMc-选择性抑制剂可以在治疗效果的程度和/或这种效果的动力学或时机(例如更快的缓解、更长时间的效果等)方面提供临床益处。RGMc-选择性抑制剂可在减少与旨在治疗贫血或引起贫血的基础疾病的疗法相关的毒性或不良事件方面提供临床益处。
可以使用本发明的方法治疗和/或预防的病症包括与铁代谢紊乱有关的任何疾病、障碍或综合征。铁代谢紊乱可能与铁摄取、铁吸收、铁运输、铁储存、铁加工、铁动员和铁利用中的一种或多种的干扰有关。通常，铁代谢紊乱会导致铁超载或铁缺乏。
铁代谢的疾病或障碍可以是其中受试者体内铁内稳态被扰动的任何疾病或障碍。这种内稳态取决于适当的血浆铁水平的正确调节。与转铁蛋白结合的铁在血浆中循环，转铁蛋白是铁传送到细胞中的载体。血浆转铁蛋白通常被铁约30％饱和。因此，必须响应于来自与铁消耗的途径的多种信号将转铁蛋白饱和度维持在适当的生理水平。
与铁缺乏症有关的疾病包括但不限于慢性病性贫血、铁缺乏性贫血、绝对铁缺乏症、功能性铁缺乏症和小红细胞性贫血。铁内稳态的这种破坏也可能导致慢性疾病的贫血，其中患有疾病的受试者表现出高的血铁调素水平。术语“慢性病性贫血”(ACD)是指由于例如延长的感染、炎症、赘生性障碍等发生的任何贫血。所发生的贫血通常特征是缩短的红细胞寿命和铁在巨噬细胞中的隔离，这导致可用于制造新红细胞的铁量减少。与慢性疾病的贫血有关的病症包括但不限于，慢性细菌性心内膜炎、骨髓炎、风湿热、溃疡性结肠炎、慢性肾脏疾病和赘生性障碍。
此外，患有与铁缺乏有关的疾病(例如，ACD)的受试者可能患有疾病或障碍或处于患疾病或障碍的风险中，例如疲劳、关节痛、骨骼或关节疾病(骨关节炎、骨质疏松)、类风湿性关节炎、炎症性肠病、呼吸急促、心律不齐、肝病、糖尿病、不育、阳痿、抑郁、情绪或精神障碍、认知能力差或神经退行性疾病、铁难治性缺铁性贫血、慢性肾病贫血、对红细胞生成刺激剂的抗性、再生障碍性贫血、癌症、发育不良性贫血、阵发性夜间血红蛋白尿、vonWillebrand病和血友病遗传性出血性毛细血管扩张。
进一步的病症包括与感染、炎症和肿瘤有关的疾病和障碍，包括例如炎性感染(例如，肺脓肿、结核等)、非传染性炎性障碍(例如，类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩氏病、肝炎、炎症性肠病等)以及各种癌症、肿瘤和恶性肿瘤(例如，癌、肉瘤、淋巴瘤等)。缺铁性贫血也可能由化学疗法治疗或如怀孕、月经、婴儿期和童年、受伤造成的失血的病症引起。
与铁超载有关的病症包括原发性和继发性铁超载疾病、综合征或障碍，其包括但不限于遗传性血色素沉着症、迟发性皮肤卟啉症、遗传性球囊细胞增多症、色素减退性贫血、红细胞生成障碍性贫血(hysererythropoietic anemia)(CDAI)、先天性红细胞生成障碍性贫血(CDAII)、面生殖发育异常(faciogenital dysplasia)(FGDY)、Aarskog综合征、无转铁蛋白血症、铁粒幼细胞性贫血(SA)、吡哆醇反应性铁粒幼细胞性贫血、红细胞酶病，如葡萄糖-6磷酸脱氢酶(G6PD)或丙酮酸激酶缺乏症(PKD)和血红蛋白病，如地中海贫血和镰状细胞。一些研究表明，铁代谢紊乱(例如，地中海贫血和血色素沉着症)与许多疾病状态(例如II型(非胰岛素依赖性)糖尿病和动脉粥样硬化)之间存在关联(A.J.Matthews等,J.Surg.Res.,1997,73:3540:T.P.Tuomainen等,Diabetes Care,1997,20:426-428)。
研究还表明，铁代谢在许多其他疾病状态(包括心血管疾病)中起作用(参见例如，P.Tuo mainen等，Circulation,1997,97:1461-1466:J.M.McCord,Circulation,1991,83:1112-1114；J.L.Sullivan,J.Clin.Epidemiol.,1996,49:1345-1352)。
最近提出了铁调素和铁在神经系统病症中的作用。例如，已在各种神经系统疾病中显示铁调素水平的升高，包括例如局灶性脑缺血/再灌注、脑内出血、蛛网膜下腔出血、急性缺血性中风、缺血性中风、阿尔茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和慢性轻度应激(Vela等，J Transl Med 2018；16:25)。
另外，铁代谢也可在不宁腿综合征中起关键作用(Daubian-Nose P.等，Sleep Sci2014；7(4):234-7和Connor等，Sleep Medicine2017；31:61-70)。事实上，不宁腿综合征患者的脑组织中已显示前铁调素水平升高，而在早发性疾病的脑脊髓液中观察到前铁调蛋白水平降低(Clardy等，J Neurol Sci 2006；247:173-9)。RLS患者大脑中的铁储备低，并且与脑铁调素的较高表达有关(Rizzo G.等，Mov Disord2013；28:1886-90和Clardy等,JNeurol Sci 2006；247:173-9)。即使在存在HH的情况下，RLS患者大脑中的低铁水平仍然持续(Haba-Rubio J.等，J Neurol Neurosurg Psychiatry 2005；76:1009-10)。此外，RLS患者的大脑微脉管系统中转铁蛋白受体的表达较低，表明铁跨BBB的转运较低(Connor JR等，Brain 2011；134:959-68)。有趣的是，不宁腿综合征被认为是类风湿性关节炎的共病-两种疾病都与铁失调关联(John A.Gjevre和Regina M.Taylor Gjevre，AutoimmuneDiseases2013；文章ID 352782)。
i.铁难治性缺铁性贫血(IRIDA)
铁难治性缺铁性贫血是由Tmprss6中的突变引起的常染色体隐性遗传疾病。TMPRSS6是铁调素的负调节子，其通过切割膜结合的RGMc产生可溶性RGMc(s-RGMc)，该RGMc充当BMP6的诱饵受体。降低的BMP6信号传导导致铁调素表达的降低。因此，抑制TMPRSS6功能的突变促进了膜结合RGMc的积累，这导致铁调素表达的增加和缺铁性贫血。患有IRIDA的患者血液中的铁太少，这导致红细胞尺寸小(微红细胞)和颜色苍白(血红蛋白过少)。该疾病的其他表型可包含低转铁蛋白饱和度、低血清铁蛋白和低血清铁水平。不幸的是，这些患者中的高铁调素水平使其成为口服施用铁难治的。
鉴于IRIDA的明确机制导致膜结合RGMc的增加(并增加铁调素水平)，与RGMc特异性结合并降低铁调素水平的药剂在限制了靶向相关RGM蛋白(例如，RGMa和RGMb)的潜在副作用的同时也是有益的。
因此，RGMc-选择性抑制剂(例如，本文公开的单克隆抗体、其衍生物、与其竞争的单克隆抗体以及包含其抗原结合片段的工程分子)可用于治疗受试者(例如，人类患者)的IRIDA。因此，在一个方面，公开了用于治疗、预防或改善与IRIDA有关的症状的方法。在一个实施方式中，该方法包括向患有IRIDA的患者施用RGMc拮抗剂。在另一个实施方式中，该方法包括向患有IRIDA的患者施用特异性结合RGMc并抑制其功能的抗体。在另一个实施方式中，RGMc特异性抗体不与RGMa和/或RGMb结合(或具有降低的结合)。在另一个实施方式中，RGMc特异性抗体是本文所述的RGMc特异性抗体中的任何一种或其任何衍生物。在一些实施方式中，RGMc特异性(RGMc选择性)抗体与本文公开的一种或多种RGMc抗体竞争(例如，交叉竞争或交叉阻断)抗原结合。
ii.慢性病性贫血(ACD)
慢性疾病的贫血(例如，慢性炎症的贫血)是慢性感染、慢性免疫激活(例如，炎症)和/或恶性肿瘤等导致的贫血形式，并且是住院患者中最常见的贫血形式。
通常，ACD开始于炎症反应，随后是炎性细胞因子释放介导疾病进展。细胞因子减少红细胞的产生，促进红细胞的溶解，并刺激巨噬细胞以铁蛋白的形式存储和保留铁，最终导致铁可用性不足。此外，存在白细胞介素6(IL-6)的大幅升高，其刺激铁调素的表达，进而引起铁转运蛋白的降解，从而阻止铁从巨噬细胞和肠上皮细胞释放进入循环。除炎症反应外，其他机制也可在ACD中起作用，例如，通过降低骨髓对促红细胞生成素的反应能力来减少促红细胞生成。
如上所述，有许多病症可以引起导致贫血的炎症，包括：自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎(RA)或狼疮、癌症、慢性感染(例如HIV/AIDS)和结核病、慢性肾病(CKD)、胃肠道炎症性疾病(例如炎症性肠病(IBD)，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、糖尿病和心力衰竭。尽管炎性贫血通常发展缓慢，但因严重急性感染、创伤或其他可能引起炎症的病症而住院的患者中，可迅速发生危重疾病的贫血。此外，特定的药物治疗，例如化学疗法，可以迅速诱发炎症和贫血。
其他与贫血有关的炎性疾病可包含，例如Castleman综合征、慢性肾病、糖尿病、心力衰竭/心脏病、特发性自身免疫性溶血性贫血、特发性肺动脉高压、炎性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和系统性青少年特发性关节炎。引起贫血的传染病可包含例如心内膜炎、幽门螺杆菌感染、肝炎、人类免疫缺陷病毒和疟疾。与贫血有关的神经系统疾病可包含，例如急性缺血性中风、肌萎缩性侧索硬化、局灶性脑缺血/再灌注、颅内脑出血和蛛网膜下腔出血。
因此，RGMc选择性抑制剂(例如，本文公开的单克隆抗体、其衍生物、与其竞争的单克隆抗体以及包含其抗原结合片段的工程分子)可以用于治疗受试者(例如人类患者)中的ACD(例如，一种或多种此处包含的ACD适应症)因此，在一个方面，公开了在人类患者中用于治疗慢性病性贫血(ACD)(例如，预防或改善与之相关的症状)的方法。在一些实施方式中，该方法包括向患有ACD的患者施用RGMc拮抗剂。在一些实施方式中，该方法包括向患有ACD的患者施用与RGMc特异性结合并抑制其功能的抗体。在一些实施方式中，RGMc特异性(RGMc选择性)抗体不与RGMa和/或RGMb结合(或具有降低的结合)。在一些实施方式中，RGMc特异性抗体是本文所述的RGMc特异性抗体中的任一种，或其任何衍生物。在一些实施方式中，RGMc特异性(RGMc选择性)抗体与本文公开的一种或多种RGMc抗体竞争(例如，交叉竞争或交叉阻断)抗原结合。
iii.癌症相关贫血
大约30-90％的癌症患者受到贫血的影响(Knight等，Am J Med2004；116Suppl7A:11S-26S)。例如，大约32％的非霍奇金淋巴瘤患者和49％的妇科癌症患者在诊断时患有贫血(Moullet等，Ann Oncol1998；8:1109-1115和Ludwig等,Eur J Cancer 2004；40:2293-2306)。贫血可能是由与癌症本身相关的因素引起的(癌症引起的贫血)，或者作为化疗的结果(化疗诱导的贫血)。此外，已经证明对骨骼的放射治疗与血液学毒性相关(Jefferies等，Radiother Oncol1998；48:23-27)。贫血的病理可分为三类：1)功能性红细胞(RBC)产生减少；2)RBC的破坏增加；和3)失血。但是，贫血的原因可能是多方面的，这可能会使评估和治疗复杂化。贫血可能由出血、溶血、营养不足、遗传性疾病、肾功能不全、激素功能障碍和/或其组合引起。另外，癌细胞本身可通过渗入骨髓、产生导致铁螯合(导致RBC产生减少)、缩短RBC存活时间和/或凝血改变的细胞因子而导致和/或加重贫血。
此外，癌症患者还可能因血管或器官损伤而在肿瘤部位出现慢性失血。导致癌症患者贫血的其他因素可能包含食欲不振、免疫介导的抗体引起的溶血或凝血能力的改变。
最后，贫血也已被确定为癌症患者的不良预后因子。例如，据预测，死亡风险增加了65％，每名患者的平均年度医疗费用增加了近四倍。因此，治疗癌症患者贫血的目标是改善患者的生活质量(QoL)并减少对输血的依赖。输血与传染病传播、输血反应、肺损伤和同种异体免疫的潜在风险有关。输血还可能增加死亡和发病(包含中风、心肌梗塞、急性肾功能衰竭和癌症复发)的风险(Annals of Oncology21(增刊7):vii167-vii172,2010；PLOSONE,DOI:10.1371/journal.pone.0163817(Sept 28,2016)；Annals of Oncology23:1954-1962,2012；和Annals of Clinical&Laboratory Science,47卷,第2期,2017)。
如本文所用，术语“癌症”是指多细胞真核生物中的生理状况，其通常特征在于不受调节的细胞增殖和恶性肿瘤。该术语广泛地包含固体和液体恶性肿瘤，包括肿瘤、血液癌(例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)以及骨髓纤维化。引起贫血的癌症可包含，例如急性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病(例如，骨髓纤维化)、非霍奇金淋巴瘤、
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巨球蛋白血症、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、头和颈癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、肝癌、肾细胞癌、睾丸癌和甲状腺癌(Maccio等，Haematologica 2015；100(1):124-132和Vela等,Exp&Mol Medicine2018；50:e436)。
因此，RGMc选择性抑制剂(例如，本文公开的单克隆抗体、其衍生物、与其竞争的单克隆抗体以及包含其抗原结合片段的工程分子)可以用于治疗受试者(例如人类患者)中癌症诱导的或癌症-相关的贫血。因此，在一个方面，用于治疗癌症引起的贫血(例如，预防或改善与之相关的症状)的方法。在一些实施方式中，该方法包括向患有癌症引起的贫血的患者施用RGMc拮抗剂。在一些实施方式中，癌症是急性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、
Figure BDA0003106722380000851
巨球蛋白血症、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、肾细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌或骨髓纤维化。在一些实施方式中，该方法包括向患者施用特异性结合RGMc并抑制其功能的抗体。在一些实施方式中，RGMc特异性抗体不与RGMa和/或RGMb结合(或具有降低的结合)。在一些实施方式中，RGMc特异性抗体是本文所述的RGMc特异性抗体中的任何一种或其任何衍生物。在一些实施方式中，RGMc特异性(RGMc选择性)抗体与本文公开的一种或多种RGMc抗体竞争(例如，交叉竞争或交叉阻断)抗原结合。
iv.治疗诱导的贫血
施用于患者的各种疗法与不期望的副作用相关，包含在治疗的患者中的贫血。在某些情况下，患者可能已经患有贫血，但是他们接受的疗法可能会进一步加重病情。
接受癌症治疗(例如化学疗法和放射治疗)的患者中，有相当一部分经历了由治疗引起的贫血。通常，这些疗法旨在杀死体内的癌细胞，但也影响健康细胞，包括血细胞(例如，造血细胞和造血干细胞)，其导致贫血。
已显示化学治疗剂可通过直接损害骨髓的造血作用来诱发贫血。另外，细胞毒性对肾功能的影响可通过减少促红细胞生成素的产生而导致贫血。特别地，已知在肺癌、卵巢癌和头颈癌中普遍使用的铂基疗法可通过骨髓和肾毒性诱发贫血(Groopman等，J NatlCancer Inst1999；91:1616-1634)。此外，也已经表明化学疗法的重复循环会增加这些患者的贫血的严重程度(Ludwig等，Eur J Cancer2004；40:2293-2306)。
有趣的是，最近的数据表明免疫疗法也可能导致癌症患者的贫血(和/或增加其风险)。例如，最近的一项研究将溶血性贫血确定为使用纳武单抗(抗PD-1抗体)治疗的潜在并发症(Palla等，Case Rep Oncol 2016；9:691-697)。还报告了使用纳武单抗后自身免疫性溶血性贫血的其他病例，包括接受伊匹单抗(抗CTLA-4抗体)和alloimmunisation(抗PD-1抗体)的患者贫血的情况。因此，术语“化学疗法诱导的贫血”涵盖了通过施用抗癌剂/药物(包含免疫疗法)引起的或增加发生的机会/风险的贫血。
最后，如上所述，已经暗示贫血的存在是癌症存活的预后因子(Caro JJ等，Cancer2001 15；91(12):2214-21)。因此，在癌症患者或正在接受化学疗法的患者中治疗贫血有很强的理由，因为它可能导致改善的预后。此外，鉴于癌症、化学疗法和贫血之间的广为人知的关联，国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)定期发布诊断、评估和治疗癌症和化学疗法诱导的贫血的指南(例如，参见Rodgers等，Cancer-andChemotherapy Induced Anemia,JNCCN 2012；10:628-53)。
因此，RGMc选择性抑制剂(例如，本文公开的单克隆抗体、其衍生物、与其竞争的单克隆抗体以及包含其抗原结合片段的工程分子)可以用于治疗受试者(例如人类患者)中治疗引起的贫血(例如，化学疗法诱导的贫血)。
因此，在一个方面，提供了用于治疗、预防或改善与化疗诱导的贫血有关的症状的方法。在一个实施方式中，该方法包括向患有化学疗法诱导的贫血的患者施用RGMc拮抗剂。
在另一个实施方式中，该方法包括向患者施用特异性结合RGMc并抑制其功能的抗体。在另一个实施方式中，RGMc特异性抗体不与RGMa和/或RGMb结合(或具有降低的结合)。在另一个实施方式中，RGMc特异性抗体是本文所述的RGMc特异性抗体中的任何一种或其任何衍生物。在一些实施方式中，RGMc特异性(RGMc选择性)抗体与本文公开的一种或多种RGMc抗体竞争(例如，交叉竞争或交叉阻断)抗原结合。
v.慢性肾病(CKD)
贫血是与慢性肾病(CKD)相关的常见并发症。实际上，在2007-2010年间，约有14％的美国成年人患有CKD，并且贫血的发病率在CKD患者几乎是两倍，在CKD患者中为15.4％，而在普通人群中为8.4％(Stauffer和Fan，PLoS One 2014；9:e84943)。
虽然众所周知肾脏可以充当血液过滤器，清除废物并控制液体和电解质的平衡，但肾脏的较少为人所知的作用是产生刺激红细胞产生的促红细胞生成素。因此，肾脏功能的紊乱有可能引起贫血。此外，CKD患者的潜在炎症也可能导致和/或加重这些患者的贫血。
CKD的特征是一段时间(数月或数年)内肾功能的逐渐丧失。CKD的病因包含，例如，糖尿病、高血压、肾小球肾炎和多囊肾病。但是，也有特发性病例(即原因不明)，其通常与小肾有关。
减慢或阻止CKD进展的治疗通常需要治疗原始疾病，但是用血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素II受体拮抗剂控制血压是一种常见的治疗方法，因为已发现它们减慢疾病的进展。但是，在严重的情况下(例如，终末期肾病)，患者将不得不进行透析甚至肾脏移植。该患者可以是透析依赖的(例如，长期血液透析患者)；患者可以是非透析依赖的。
贫血的CKD患者可以口服或静脉注射铁剂治疗。在某些情况下，治疗可包含注射基因工程形式的促红细胞生成素(EPO)和/或输血。然而，铁替代并不总是有效的；例如，某些患者对ESA治疗低反应或发展为低反应。此外，ESA(例如EPO治疗)与心血管事件(例如心脏病发作和中风)的可能性增加有关。因此，需要能够调节铁水平且具有减少的副作用的改进疗法。
因此，RGMc选择性抑制剂(例如，本文公开的单克隆抗体、其衍生物、与其竞争的单克隆抗体以及包含其抗原结合片段的工程分子)可以用于治疗受试者(例如人类患者)中癌症诱导的或癌症相关的贫血。因此，在一个方面，提供了用于治疗、预防或改善与慢性肾脏疾病(例如贫血)有关的症状的方法。在一个实施方式中，该方法包括向患有慢性肾脏疾病的患者施用RGMc拮抗剂。在另一个实施方式中，该方法包括向患者施用特异性结合RGMc并抑制其功能的抗体。在另一个实施方式中，RGMc特异性抗体不与RGMa和/或RGMb结合(或具有降低的结合)。在另一个实施方式中，RGMc特异性抗体是本文所述的RGMc特异性抗体中的任何一种或其任何衍生物。在一些实施方式中，RGMc特异性(RGMc选择性)抗体与本文公开的一种或多种RGMc抗体竞争(例如，交叉竞争或交叉阻断)抗原结合。
在治疗贫血或者以贫血为特征或与贫血有关的疾病的上述任何实施方式中，本文所述的RGMc抑制剂疗法可部分地或完全地代替施用于患者的一种或多种目前或标准的疗法，例如ESA、HIF稳定剂、铁补充剂(例如，IV铁)和输血。在一些实施方式中，在根据本发明的治疗方案中添加RGMc抑制剂疗法允许患者接受降低的剂量或给药频率的这种治疗。这可以减轻或避免有害的副作用或其他风险，例如患者体内的铁超载。在一些实施方式中，RGMc抑制剂疗法可以完全地代替其他疗法来治疗患者的贫血。
在治疗贫血或者以贫血为特征或与贫血有关的疾病的上述任何实施方式中，本文所述的RGMc抑制剂疗法可以作为附加疗法或辅助疗法与另一种疗法联合使用。在某些实施方式中，患者可以接受或继续接受其他疗法来治疗贫血，但是以更低的剂量或更低的频率。在一些实施方式中，当用RGMc抑制剂与该疗法联合治疗时，可使对这种疗法具有抗性或反应较差的患者对该疗法具有更高的响应性(例如，敏化)。
选择使用RGMc抑制剂治疗的受试者
本文所述的治疗方法还可包含测量一种或多种因子以确定受试者中疾病(例如贫血)的存在和/或严重性的步骤。通常，贫血的定义是女性Hb<12g/dl，和男性Hb<13g/dl。尽管测量血红蛋白公认为一种贫血量度，但确定贫血的类型(AID或FID)和贫血的病因可能涉及许多不同的测试。例如，有几种众所周知的测试可以帮助确定受试者贫血的类型和严重程度，包括但不限于，血红蛋白(Hb)、血清铁蛋白(SF)、转铁蛋白饱和度(TSAT)、可溶性转铁蛋白受体(sTfR)、铁蛋白指数(FI＝sTfR/log SF)、低色素性网织红细胞(CHR)和C反应蛋白(CRP)的测量。平均红细胞容积(MCV)或平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)也是可能与贫血类型相关的测量值。
定义AID和FID的确切标准是争论的主题，并且根据研究、疾病、性别和职权而不同。例如，不受特定理论的束缚，FID可以定义为1)血清转铁蛋白饱和度(TSAT)<20％和铁蛋白≥100ng/mL(Ludwig等，Ann Oncol 2013；24(7):1886-1892)；2)TSAT<16％和铁蛋白>100ng/ml(轻度)或血清铁蛋白30-100ng/ml(中度)(Bach等，Clinical Interventions InAging 2014；9:1187-1196)；3)TSAT 20-50％和铁蛋白30-800ng/ml(Gilreath等，Am JHematol2014；89(2):203-212)；4)TSAT<20％和铁蛋白>30ng/ml和癌症患者中>100ng/ml(Ludwig等，Wien Klin Wochenschr 2015；127:907-919)或5)TSAT<20％且铁蛋白>30ng/ml(女性)或>40ng/ml(男性)(Hedenus等，Med Oncol 2014；31(12):302)。在其他情况下，可以使用百分低色素性红细胞来检测FID(参见，例如，Bovy等，Nephrol Dial Tranplant 2007；22(4):1156-1162和Murphy等,Ann Hematol2006；85(7):455-457)。在其他情况下，FID定义为患者的Hb<110g/l，铁限制性红细胞生成(％血红蛋白过少>5)，全身性炎症(CRP>10)以及任选地铁蛋白值为30-800ng/ml(Neoh等，Support Care Cancer2017；25:1209-1214)。
另一方面，不受特定理论的约束，AID可以定义为，例如，1)TSAT<20％，和铁蛋白<30ng/ml(Ludwig等，Ann Oncol 2013；24(7):1886-1892)；2)在癌症患者中TSAT<20％和铁蛋白<100ng/ml(Ludwig等，Wien Klin Wochenschr 2015；127:907-919)；或3)TSAT<20％和铁蛋白水平<40ug/L(Hashemi等，Int J Hematol Oncol Stem Cell Res 2017；11(3):192-198)。
治疗方法也可包括如本文所讨论的和本领域已知的其他标志物的测量。例如，铁调素(参见，例如，US20150202224A1和Kroot等，Clinical Chemistry 2011；57(12):1650-1669)、再生蛋白、生长分化因子15(GDF-15)、中性粒细胞明胶酶相关的脂钙蛋白(NGAL)、白介素6(IL-6)和/或BMP6的测量。
另外，对其他风险因子和/或疾病的识别可以帮助确定贫血的存在和类型，例如，患者可能患有感染、癌症或慢性肾病。遗传学检查也可以有助于测定特定的铁相关疾病，例如，铁难治性缺铁性贫血(IRIDA)、地中海贫血、遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、无β脂蛋白血症、镰状细胞性贫血、先天性红细胞生成障碍性贫血、遗传性血色素沉着病(HH)和青少年血色素沉着症。
在本文描述的任何方法中的受试者可以是患有、诊断为、怀疑患有铁缺乏性贫血或与铁缺乏性贫血有关的疾病、病症或病状或者处于其发生的风险中的受试者。受试者可以是哺乳动物，其可以是人类或非人类。在一个特定的实施方式中，所述受试者是人类受试者。在另一个实施方式中，所述受试者可以是人类男性受试者。在另一个实施方式中，所述受试者可以是人类女性受试者。在另一个实施方式中，所述受试者可以是重症监护患者，正在接受化学疗法、从手术中康复，或者可能处于感染、癌症、自身免疫性疾病或障碍、慢性器官疾病和/或炎症的风险中或患有感染、癌症、自身免疫性疾病或障碍、慢性器官疾病和/或炎症，和/或实体器官移植后器官的慢性排斥反应。感染可以是急性或慢性的。感染可能是病毒、细菌、寄生虫或真菌的。癌症可以是任何癌症，例如，血液学或实体肿瘤。自身免疫性疾病可以是任何自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和结缔组织疾病、脉管炎、结节病和炎性肠病。慢性器官疾病可以是慢性肾病，其中受试者可以正接受透析或未接受透析。病毒感染可能是乙型或丙型肝炎感染，或人类免疫缺陷病毒感染。任何疾病和障碍都可能是ACD的基础原因。手术可以是围手术期的或术后的。手术可以是肿瘤手术。
通常需要通过与所讨论的疾病或病症相符的病史和身体检查来评估需要治疗的受试者。可通过本文描述的方法治疗的各种病症的诊断在本领域技术范围内。可将本文所述的RGMc拮抗剂施用于具有递送铁的临床需要的受试者或患有功能性铁缺乏的受试者，例如接受促红细胞生成素治疗的受试者。确定是否需要肠胃外或静脉注射铁治疗在本领域技术人员的能力范围内。例如，可以通过监测受试者的铁状态来评估需求。铁缺乏症的诊断可以基于如上所述的适当实验室检查，例如，根据表2的Hg水平或低于基线水平>2g/dl，和/或MCV低于80飞升(femtoliters，fL)的红细胞。诊断铁缺乏症的其他测量可基于血清铁蛋白(SF)、转铁蛋白饱和度(TSAT)、可溶性转铁蛋白受体(sTfR)、铁蛋白指数(FI＝sTfR/logSF)、低色素性网织红细胞(CHR)、C反应蛋白(CRP)，平均红细胞容积(MCV)和/或平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)的测量。
表2.截至2011年的WHO血红蛋白阈值
年龄或性别组 Hb阈值(g/dl)
儿童(0.5-5.0岁) 11.0
儿童(5-12岁) 11.5
青少年(12-15岁) 12.0
女性，未怀孕(>15岁) 12.0
女性，怀孕 11.0
男性(>15岁) 13.0
还可以通过诊断患有与铁缺乏性贫血有关的疾病、障碍或病症的受试者来确定需要治疗的受试者。例如，许多接受促红细胞生成素的慢性肾功能衰竭患者将需要铁剂来维持目标铁水平。作为另一个实例，由于透析相关的失血和导致的负铁平衡，大多数血液透析患者将需要施用铁剂。
监测频率可以取决于受试者所患或处于其危险之中的疾病、障碍或病症。例如，在开始促红细胞生成素疗法的受试者中，每月监测铁指数。作为另一个实例，在已经达到目标范围Hb或正在接受静脉内铁疗法的受试者中，可以每3个月监测TSAT和铁蛋白水平。
受试者的铁状态可以指示绝对铁缺乏症(AID)或功能性铁缺乏症(FID)，两者都可以用本文所述的组合物和治疗方法进行治疗。当铁的量不足以满足身体需要时，就会出现绝对铁缺乏。这种不足可能是由于铁摄入不足、膳食铁的生物利用度降低、铁的利用增加或慢性失血。长期缺铁会导致缺铁性贫血，这是一种微红细胞的低色素性贫血，其中铁的存储不足。通常在TSAT<20％和铁蛋白<100ng/mL的情况下指示AID。
TSAT是血清铁与总铁结合能力的比值乘以100。在可用于结合铁的转铁蛋白中，TSAT值告知临床医生实际上结合了多少血清铁。例如，值为15％表示转铁蛋白的15％的铁结合位点被铁占据
尽管总的体内铁储备充足，但当未能足够快地释放铁以跟上骨髓对红细胞生成的需求时，FID仍可能发生。在这些情况下，铁蛋白水平可能正常或较高，但向红细胞系的铁供应受到限制，如通过低的转铁蛋白饱和度和增加的微红细胞的低色素性红细胞数量所表明的。FID可通过以下特征表征：血红蛋白对促红细胞生成素的反应不足；血清铁蛋白可能正常或高；转铁蛋白饱和度(TSAT)通常<20％；和/或严重情况下降低的平均红细胞容积(MCV；例如小于80fL)或平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC；例如小于34±2g/dl)。通常在TSAT<20％和铁蛋白>100ng/mL的情况下指示功能性铁缺乏症(即铁存储被认为足够但不能用于铁投送)。
例如，可以根据国家肾脏基金会的肾脏疾病结果质量倡议(National KidneyFoundation's Kidney Disease Outcomes Quality Initiative)来评估对铁疗法的需要。参见NKF-K/DOQI，Clinical Practice Guidelines for Anemia of Chronic KidneyDisease(2000)；Am J Kidney Dis(2001)37(supp 1),S182-S238。DOQI为治疗慢性肾衰竭的贫血提供了最佳的临床实践。DOQI指南根据血红蛋白、转铁蛋白饱和度(TSAT)和铁蛋白水平详细说明了肾脏疾病的静脉内铁治疗。
还建议了在癌症和/或化学疗法患者中进行铁管理和测定AID与FID的其他指南，例如，参见Steinmetz等，Ther Adv Hematol2012；3(3):177-91,Mikhael等,Curr Oncol2007；14:209-217,欧洲癌症研究与治疗组织(European Organization for Research andTreatment of Cancer)(EORTC；Bokemeyer等,Eur J Cancer 2007；43:258-270；及Aapro和Link,Oncologist 2008；13(Suppl.3):33-36)，美国血液病学会(American Society ofHematology，ASH)和美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology，ASCO)(参见，例如，Rizzo等，Blood 2010；100:2303-2320)，美国国家综合癌症网络(NationalComprehensive Cancer Network，NCCN)指南3.2018版Cancer-and Chemotherapy-inducedAnemia，欧洲医学肿瘤学会(European Society for Medical Oncology，ESMO)(参见，例如，Aepro等，Annals of Oncology 2018；0:1-15)和美国国立健康和护理卓越研究院(National institute for Health and Care Excellence，NICE)(参见，例如，2014年11月26日发布的Technology appraisal guidance；nice.org.uk/guidance/ta323)。
可以通过受试者的目标铁水平确定需要治疗的受试者。例如，受试者的目标血红蛋白水平可以选择为11.0g/dL至12.0g/dL(血细胞比容约为33％至36％)。为了用最佳促红细胞生成素剂量达到目标血红蛋白，可提供足够的铁以维持TSAT≥20％和铁蛋白100ng/mL。用最佳促红细胞生成素剂量达到目标血红蛋白水平与提供足够的铁以使TSAT维持在20％以上有关。
可以给予铁疗法以维持目标血红蛋白，同时防止铁缺乏并且还防止铁超载。调节铁的剂量以维持血红蛋白、血细胞比容的目标水平，并且铁存储的实验室参数在本领域普通技术范围内。例如，在受试者贫血或铁缺乏的情况下，当患者的铁蛋白<800ng/mL，TSAT<50％和/或血红蛋白<12g/dL时，可以施用铁剂。可以通过在TSAT>50％和/或铁蛋白>800ng/mL时停止给予铁来避免铁超载。
如果受试者并非贫血或铁缺乏，但仍需要RGMc拮抗剂，例如，患有不宁腿综合征的受试者，则血红蛋白和TSAT水平不一定相关，而铁蛋白>800仍可提供用于施用的一般截止点。
施用
为了实施本文公开的方法，可以通过合适的途径向需要治疗的受试者(例如人类)施用有效量的上述药物组合物，其中所述合适的途径如静脉内施用，例如推注或一段时间内连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。用于液体制剂的市售喷雾器，包含喷射喷雾器和超声喷雾器，可用于给药。液体制剂可以直接雾化而冻干粉可以重构后雾化。或者，可以使用碳氟化合物制剂和定量吸入器雾化与RGMc特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或者以冻干和研磨的粉末形式吸入。
通过本文所述方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选为人类。哺乳动物包括但不限于，农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人类受试者可以是患有、处于其危险之中或被怀疑患有RGMc相关的适应症(例如上述那些，例如，贫血)的人类患者。可以通过常规医学检查，例如，实验室检查、器官功能检查、CT扫描或超声来确定患有RGMc有关的适应症的受试者。怀疑患有任何这样的适应症的受试者可能显示该适应症的一种或多种症状。具有适应症的风险的受试者可以是具有该适应症的一种或多种风险因子的受试者。
如本文所用，术语“有效量”和“有效剂量”是指足以实现预期目的的化合物或组合物的任何量或剂量，即以可接受的利益/风险比在组织或受试者中的所需的生物学或医学(临床的)反应。例如，在本发明的某些实施方式中，预期目的可以是抑制体内RGMc活性，实现与RGMc抑制有关的临床上有意义的结果。例如，临床上有意义的作用可以包含血清铁水平升高、血红蛋白或红细胞计数恢复或正常化、转铁蛋白饱和度增加等。在某些实施方式中，临床上有意义的作用可包含降低毒性或危害风险，例如心血管风险(例如，中风或心力衰竭)和癌症。在一些实施方式中，临床上有意义的作用可以包含减少对其他疗法如铁补充剂的需求。在一些实施方式中，临床上有意义的作用可以包含改善生活质量或患者感觉的总体健康。在一些实施方式中，临床上有意义的作用可以包含加速或加快地缓解指示贫血的一个或多个参数。这种缓解可以通过包含RGMc抑制剂和另一种疗法(例如ESA、HIF稳定剂等)的附加疗法或联合疗法来实现。例如，通常，当开始EPO疗法(例如，单一疗法)时，治疗需要1-2个月(例如6-8周)以显示效果。因此，在此期间患有严重贫血的患者可能还需要IV铁或输血。然而，与RGMc选择性抑制剂例如本文公开的那些联合使用，治疗作用的起效可能明显更快(例如，1-4周)，这可以减少对额外的IV铁或输血的需要。
如本领域技术人员所知，有效量根据所治疗的特定病症，病症的严重程度，包含年龄、身体状况、大小、性别和体重的个体患者参数，治疗的持续时间，共同治疗(如果有)的性质，特定的给药途径以及卫生从业人员的知识和专长内的类似因素而变化。这些因素是本领域普通技术人员众所周知的，并且仅通过常规实验即可解决。通常优选使用单个组分或其组合的最大剂量，即根据合理医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，患者可能出于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因而坚持较低剂量或可耐受剂量。
经验因素，例如半衰期，通常将有助于确定剂量。例如，与人类免疫系统相容的抗体，例如人源化抗体或全人抗体，可用于延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主的免疫系统攻击。可以在治疗过程中确定和调整给药频率，并且通常但并非必须基于RGMc相关适应症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可选地，特异性结合RGMc的抗体的持续的连续释放制剂可能是合适的。用于实现持续释放的各种制剂和装置对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且在本公开的范围内。
在一个实施例中，可以在已经被给予一次或多次抗体施用的个体中凭经验确定如本文所述的特异性结合RGMc的抗体的剂量。给个体增加剂量的RGMc拮抗剂。为了评估疗效，可以遵循RGMc相关适应症的指标。例如，用于测量贫血的方法在本领域中是众所周知的，并且在本文中进一步描述。
本发明涵盖了这样的认识，即相对于RGMa和/或RGMb，能够特异性调节RGMc信号传导的药剂在用作药物时可以提供改善的安全性。因此，本发明包含特异性结合并抑制RGMc而不是RGMa和/或RGMb的激活，从而赋予RGMc体内信号转导的特异性抑制，同时使由影响RGMa和/或RGMb信号传导导致的不希望的副作用最小化的抗体及其抗原结合片段。
在一些实施方式中，当被施用于受试者时，本文所述的抗体或其抗原结合片段是无毒的。在一些实施方式中，当被施用于受试者时，本文所述的抗体或其抗原结合片段与特异性结合RGMc和RGMa的抗体相比，显示出降低的毒性。在一些实施方式中，当被施用于受试者时，本文所述的抗体或其抗原结合片段与特异性结合RGMc和RGMb的抗体相比，显示出降低的毒性。在一些实施方式中，当被施用于受试者时，本文所述的抗体或其抗原结合片段与特异性结合RGMa、RGMb和RGMc的抗体相比，显示出降低的毒性。
通常，为了施用本文所述的任何抗体，的初始候选剂量可以是每次施用约0.1-20mg/kg，例如1-20mg/kg，例如，每周、每2周、每次3周、每月、每三个月等。例如，患者可以以有效治疗疾病(例如癌症)的量，每1周、每2周、每3周或每4周等接受注射大约1-10mg/kg，其中该量是耐受良好的(在可接受的毒性或不良事件范围内)。
出于本公开的目的，典型剂量(每次施用，例如注射和输注)可以在约0.1mg/kg至1mg/kg至2mg/kg至3mg/kg至5mg/kg至10mg/kg至20mg/kg至30mg/kg或更高的任何范围内，取决于上述因素。对于几天或更长时间内的重复施用，根据病情，治疗持续直至出现所需的症状抑制或直至达到足以减轻RGMc相关适应症或其症状的治疗水平。
示例性的给药方案包含施用初始剂量，然后施用一个或多个维持剂量，其中后者通常低于前者。例如，初始剂量可以在约2至30mg/kg之间，例如每周一次或每周两次。此后，维持剂量可以遵循例如约0.1至20mg/kg之间(例如1、2、3、5、10、15mg/kg)，例如每周一次、每隔一周一次、每月一次等。但是，其他剂量方案可能有用，这取决于实施者希望达到的药代动力学衰减模式。药效学(PD)实验表明，向临床前动物模型(例如，大鼠模型)施用本文公开的抗体(例如，Ab8；20mg/kg)后至少3周存在持续的PD效果(例如，血清铁水平升高)。不希望受任何特定理论的束缚，这种持续的给药后效果可能是有利的，因为可以在被施用抗体的受试者(例如，人类受试者)中降低给药频率同时维持临床有效的血清浓度。在一些实施方式中，给药频率是每周一次，每2周、每3周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次；或每月，每2个月或每3个月或更长时间一次。通过常规技术和分析很容易监测该疗法的进展。给药方案(包含使用的抗体)可以随时间变化。
在一些实施方式中，对于体重正常的成年患者，可以施用从约0.3至5.00mg/kg范围的剂量。特定的剂量方案，例如，剂量、时间和重复剂量将取决于特定的个体和该个体的病史，以及单个药物的特性(例如，药物的半衰期和其他相关考虑因素)。
出于本公开的目的，特异性结合RGMc的抗体的合适剂量将取决于所使用的特定抗体(或其组合物)、适应症的类型和严重性、是否为预防或治疗目的而施用该抗体、先前的治疗方法、患者的临床病史和对拮抗剂的反应以及主治医师的判断。在一些实施方式中，临床医生将施用特异性结合RGMc的抗体，直到达到获得期望结果的剂量。特异性结合RGMc的抗体的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况，施用的目的是治疗性的还是预防性的，以及本领域技术人员已知的其他因素。特异性结合RGMc的抗体的施用可以在预定的时间段内基本上连续，或者可以以一系列间隔剂量施用，例如在发生与RGMc有关的适应症(例如，贫血)之前、期间或之后。
如本文所用，术语“治疗”是指以治愈、复原、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响适应症、适应症的症状或对适应症的易感性为目的，向具有RGMc相关适应症、该适应症的症状或对该适应症的易感性的受试者应用或施用包括一种或多种活性剂的组合物。
用特异性结合RGMc的抗体缓解RGMc相关适应症包含延迟适应症的发展或进程，或降低适应症的严重程度。缓解适应症并不一定需要治愈的结果。如本文所用，“延迟”与RGMc相关适应症相关的适应症的发展意味着延缓、阻碍、减慢、延迟、稳定和/或推迟适应症的进展。取决于被治疗适应症和/或个体的病史，该延迟可以是不同的时间长度。一种“延迟”或减轻适应症发展或延迟适应症发作的方法是一种与不使用该方法的情况相比，在给定时间范围内降低发生适应症的一种或多种症状的可能性和/或在给定的时间范围内减轻症状程度的方法。这样的比较通常基于使用足以给出统计学上显著结果的多个受试者的临床研究。
联合疗法
本公开还包含用作联合疗法的药物组合物和相关方法，其用于治疗可从体内RGMc抑制受益的受试者。在这些实施方式的任何一个中，此类受试者可以接受组合疗法，所述组合疗法包含包括至少一种本文所述的RGMc拮抗剂，例如，抗体或其抗原结合片段的第一组合物，与包括至少一种旨在治疗相同或重叠的疾病或临床状况的其他治疗剂的第二种组合物联合使用。该第一和第二组合物可作用于相同的细胞靶或离散的细胞靶。在一些实施方式中，该第一和第二组合物可以治疗或减轻相同的或重叠的疾病或临床状况的一组症状或方面。在一些实施方式中，该第一和第二组合物可以治疗或减轻疾病或临床状况的一组单独的症状或方面。仅举一个实例，第一组合物可以治疗疾病或病症(例如，CKD或癌症)，而第二组合物可以治疗炎症、红细胞生成减少或与相同疾病相关的贫血等。这种组合疗法可以彼此结合施用。在组合疗法的上下文中，短语“与...结合”是指在接受组合疗法的受试者中，第一疗法的治疗效果与第二疗法的治疗效果时间上和/或空间上重叠。因此，可以将组合疗法配制为用于同时施用的单一制剂，或配制为用于依次施用疗法的单独制剂。
在优选的实施方式中，组合疗法在疾病的治疗中产生协同作用。术语“协同”是指效果大于每一种单一疗法的总和的累加效果(例如，更大的功效)。
在一些实施方式中，组合疗法可以比单一疗法实现更快的治疗效果。
在一些实施方式中，包含本文描述的药物组合物的组合疗法产生的功效总体上等同于另一种疗法(例如第二药剂的单一疗法)产生的功效，但是与第二药剂的单一疗法相比，该组合疗法关联的与第二药剂相关的不良副作用较少或毒性较轻。在一些实施方式中，这样的组合疗法允许较低剂量的第二药剂但保持总体功效。这种组合疗法可能特别适合需要长期治疗和/或涉及儿科患者的患者人群。
因此，在一个方面，本发明提供了如本文所述用于降低RGMc活性和治疗或预防与RGMc信号传导相关的疾病或病症的组合疗法中的药物组合物和方法。因此，所述方法或药物组合物还包含第二疗法。在一些实施方式中，第二疗法可用于治疗或预防与RGMc信号传导相关的疾病或病症。第二疗法可以减少或治疗与目标疾病有关的至少一种症状。第一和第二疗法可以通过相似或不相关的作用机制发挥其生物学作用；或者第一和第二疗法中的一种或两种可以通过多种作用机制发挥其生物学作用。例如，在贫血的情况下，可以将RGMc抑制剂与增加红细胞生成的第二疗法(例如，EPO疗法、输血等)组合(例如，顺序地或同时地)施用。或者，在慢性病性贫血的情况下，可以将RGMc抑制剂与治疗基础疾病(例如，癌症和免疫疾病)的第二疗法(例如，化学疗法、放射疗法、免疫疗法)组合(例如，顺序地或同时地)施用。
应当理解，对于每一个所述的实施方式，本文所述的药物组合物可以具有在相同的药学上可接受的载体中或在不同的药学上可接受的载体中的第一和第二疗法。还应该理解的是，在所述的实施方式中，可以同时或相继施用第一疗法和第二疗法。
可以将本发明的一种或多种RGMc抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)施用于已经接受或正在接受一种或多种另外的治疗剂的患者。可与RGMc抗体或本发明一起使用的其他治疗剂的实例包括但不限于，促红细胞生成素刺激剂(ESA)、低氧诱导因子(HIF)稳定剂、铁调素拮抗剂、铁补充剂(例如，口服或静脉注射)、抗炎药和/或抗癌药。
ESA是刺激骨髓产生红细胞的药物，并可用于治疗患者的各种类型的贫血。但是，即使存在增加的红细胞产生，如果没有足够的铁，贫血也会持续存在。这是因为红细胞需要血红蛋白来运输氧气，而铁在血红蛋白的合成中至关重要。因此，如果没有足够的铁，则新产生的红细胞将缺乏血红蛋白，并且将是着色不足的(缺少红色血红蛋白色素)和微红细胞的(比正常小)。
因此，在一个实施方式中，可以将本文所述的RGMc拮抗剂(例如，RGMc抗体)施用于已经接受或正在接受ESA以治疗铁相关疾病的患者。ESA的实例包括但不限于：依泊汀α、依泊汀β、依泊汀δ(例如，
Figure BDA0003106722380001001
)、依泊汀ω(例如，
Figure BDA00031067223800010014
)、达贝泊汀α
Figure BDA0003106722380001002
(Lupin pharma)、
Figure BDA00031067223800010015
(Nanogen制药生物技术)、
Figure BDA0003106722380001003
(Intas pharma)、
Figure BDA00031067223800010016
(Amgen生产)、
Figure BDA0003106722380001004
(Chugai Pharma)、
Figure BDA0003106722380001005
(Janssen-Cilag生产)、
Figure BDA00031067223800010017
(Sandoz生产)、
Figure BDA0003106722380001006
(Pooyeshdarou生物制药公司生产)、
Figure BDA0003106722380001007
(Probiomed生产)、
Figure BDA00031067223800010018
(Hoffmann–La Roche生产)、
Figure BDA0003106722380001008
(Stada/Hospira生产)、
Figure BDA0003106722380001009
(Panacea生物科技有限公司生产)、Erypro SafeTM(Biocon有限公司生产)、
Figure BDA00031067223800010012
(印度血清研究所有限公司生产)、
Figure BDA00031067223800010010
(Emcure制药生产)、Erykine(Intas生物制药生产)、
Figure BDA00031067223800010011
(Wockhardt生物技术生产)、EspogenTM(LG生命科学生产)、ReliPoietinTM(Reliance生命科学生产)、ShanpoietinTM(Shantha生物技术有限公司生产)、
Figure BDA00031067223800010013
(Cadila Healthcare有限公司生产)、
Figure BDA00031067223800010019
(rHuEPO)(沈阳阳光药业有限公司生产)和中国
Figure BDA00031067223800010020
(CinnaGen生物制药公司生产)。
ESA通常是有效的，但有证据表明，即使在高剂量下，也有一部分患者对治疗无反应(Solak Y等，Blood Purification.2016；42(2):160-7)。此外，多项研究表明，使用ESA可能导致更高的脑血管和心血管(CV)事件率和死亡率(Biggar P.等，Kidney Research andClinical Practice 2017Sep；36(3):209-223)。ESA也可能与某些患者中癌症的风险增加相关，和在某些情况下，与对抗癌治疗的较差反应相关。因此，不受特定理论约束，在已接受或正在接受ESA的患者中使用RGMc抑制剂可改善反应率并减少产生作用所需的ESA剂量，从而减少不良反应的发生。
缺氧诱导因子(HIF)脯氨酰羟化酶(PH)抑制剂(又称HIF-PHIs或HIF稳定剂)是一类用于治疗贫血的药剂。这些药剂通过稳定HIF复合物和刺激内源性促红细胞生成素产生发挥作用。因此，可以通过增加血清铁水平的药物(例如，RGMc抑制剂)来补充增加促红细胞生成素产生的HIF-PH抑制剂。因此，在一些实施方式中，本文所述的RGMc抑制剂(例如，RGMc抗体)可以施用于已经接受或正在接受HIF稳定剂或脯氨酰羟化酶(PH)抑制剂以治疗铁相关疾病的患者。HIF稳定剂或HIF-PH抑制剂的实例包括但不限于罗沙司他(FG-4592)、伐度司他(AKB-6548)、达普司他(GSK-1278863)、莫立司他(BAY 85-3934)、德度司他(Desidustat)(ZYAN1)、DMOG(N-(2-甲氧基-2-氧代乙酰基)甘氨酸甲酯)、IOX2(N-[[1,2-二氢-4-羟基-2-氧-1-(苯基甲基)-3-喹啉基]羰基]甘氨酸)、JNJ-42041935(1-[6-氯-5-(三氟甲氧基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸)、N-草酰甘氨酸(2-(羧甲基氨基)-2-氧代乙酸)、1,4-二氢邻菲啰啉(phenonthrolin)-4-酮-3-羧酸和Adaptaquin(7-[(4-氯苯基)[(3-羟基-2-吡啶基)氨基]甲基]-8-喹啉)。
在一些实施方式中，本文所述的RGMc特异性抑制剂可以施用于已接受或正在接受铁补充剂(例如，口服或静脉内(i.v.)铁)的患者。静脉内铁制剂的实例包括但不限于，右旋糖酐铁、氢氧化铁-右旋糖酐复合物、氢氧化铁-蔗糖铁复合物、葡萄糖酸铁、葡萄糖酸铁钠、蔗糖铁、糖酸铁、纳米氧化铁(ferumoxytol)、羧基麦芽糖铁和异麦芽糖苷铁。口服铁补充剂的实例可包括但不限于焦磷酸铁、葡萄糖酸亚铁、硫酸亚铁、富马酸亚铁、碳酸亚铁和羰基铁。
静脉内和口服铁补充剂通常都是有效的，但研究表明与铁有关的多种毒性或不良事件。不良事件的实例包含细胞毒性、肾小管坏死、嗜中性粒细胞功能改变、动脉粥样硬化的促进、肿瘤生长的促进和自由基的产生(Cancado和Munoz，Rev Bras HematolHemoter2011；33(6):461-9)。因此，不受特定理论的束缚，将RGMc特异性抑制剂与静脉注射或口服铁一起使用可提高反应率并减少具有治疗作用所需剂量的铁，并从而减少不良事件/毒性的发生和/或程度。
人们认识到，某些旨在治疗各种疾病的药物通常会在被治疗的患者中诱发或加剧贫血(例如，治疗或药物诱导的贫血，例如，化疗诱导的贫血和放疗诱导的贫血)。在一些实施方式中，用骨髓抑制药物治疗患者，该药物可能引起包括贫血的副作用。此类患者可受益于与骨髓抑制疗法联合使用的本公开的RGMc抑制剂。骨髓抑制疗法的实例包括但不限于：聚乙二醇化干扰素α-2a、干扰素α-n3、聚乙二醇化干扰素α-2b、阿地白介素、吉妥单抗、干扰素alfacon-1、利妥昔单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、L-苯丙氨酸、硼替佐米、克拉屈滨、卡莫司汀、安吖啶、苯丁酸氮芥、雷替曲塞、丝裂霉素、蓓萨罗丁、长春地辛、氟尿苷、硫鸟嘌呤、长春瑞滨、右雷佐生、索拉非尼、链脲霉素、吉西他滨、替尼泊苷、表柔比星、氯霉素、来那度胺、六甲蜜胺、齐多夫定、顺铂、奥沙利铂、环磷酰胺、氟尿嘧啶、丙基硫氧嘧啶、喷司他丁、甲氨蝶呤、卡马西平、长春花碱、利奈唑胺、伊马替尼、氯法拉滨、培美曲塞、柔红霉素、伊立替康、甲巯咪唑、依托泊苷、达卡巴嗪、替莫唑胺、他克莫司、西罗莫司、氮芥、阿扎胞苷、卡铂、放线菌素D、阿糖胞苷、阿霉素、羟基脲、白消安、拓扑替康、巯基嘌呤、沙利度胺、美法仑、氟达拉滨、氟胞嘧啶、卡培他滨、甲基苄肼、三氧化二砷、伊达比星、异环磷酰胺、米托蒽醌、洛莫司汀、紫杉醇、多西他赛、达沙替尼、地西他滨、奈拉滨、依维莫司、伏立诺他、噻替派、伊沙匹隆、尼洛替尼、贝利司他、曲贝替定、曲妥单抗、替西罗莫司、博舒替尼、苯达莫司汀、卡巴他赛、艾日布林、鲁索替尼、卡非佐米、托法替尼、帕纳替尼、泊马度胺、阿托珠单抗(obinutuzumab)、磷酸特地唑胺、博纳吐单抗、依鲁替尼、帕博西尼、奥拉帕尼、dinutuximab和秋水仙碱。
在一些实施方式中，可以将本文所述的RGMc特异性抑制剂施用于已经接受或正在接受癌症治疗的患者。这样的癌症疗法可以包括但不限于化学疗法、放疗/放射性疗法、小分子药物或治疗性抗体，例如癌症疫苗；工程化免疫细胞疗法；化疗；放射疗法；VEGF激动剂；IGF1激动剂；FXR激动剂；CCR2抑制剂；CCR5抑制剂；双重CCR2/CCR5抑制剂；赖氨酰氧化酶样2抑制剂；ASK1抑制剂；乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂；p38激酶抑制剂；吡非尼酮；尼达尼布(Nintedanib)；M-CSF抑制剂(例如，M-CSF受体拮抗剂和M-CSF中和剂)；MAPK抑制剂(例如Erk抑制剂)，免疫检查点激动剂或拮抗剂(例如抗PD-1和抗PD-L1)；IL-11拮抗剂；和IL-6拮抗剂等。可以与RGMc特异性抑制剂一起使用的其他治疗剂的其他实例包括但不限于吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、Ser/Thr激酶抑制剂、双重特异性激酶抑制剂。在一些实施方式中，这样的药剂可以是PI3K抑制剂、PKC抑制剂或JAK抑制剂。在一些实施方式中，JAK抑制剂可以是JAK1抑制剂和/或JAK2抑制剂，其可以用于治疗骨髓增生性疾病，例如原发性骨髓纤维化。
还应理解，其他癌症治疗方法，例如放疗，可导致癌症患者的贫血。因此，在一个实施方式中，本文所述的RGMc特异性抑制剂可以与放疗结合使用。
在一些实施方式中，待作为组合疗法施用或与RGMc抑制剂联合使用的另外的药剂是或包含生长因子的TGFβ超家族成员或其调节子的抑制剂。在一些实施方式中，这样的抑制剂是或包含TGFβ抑制剂，例如TGFβ中和抗体。在一些实施方式中，TGFβ抑制剂是抑制TGFβ1和TGFβ2的抗体。在一些实施方式中，TGFβ抑制剂是抑制TGFβ1和TGFβ3的抗体。在一些实施方式中，TGFβ抑制剂是TGFβ1的亚型选择性抑制剂，如TGFβ1活化抑制剂。在一些实施方式中，TGFβ抑制剂是TGFβ3的亚型选择性抑制剂，例如TGFβ3活化抑制剂。
在一些实施方式中，用于治疗受试者的癌症的联合疗法包含癌症免疫疗法(例如检查点抑制剂)、TGFβ1-选择性抑制剂和本文公开的RGMc-选择性抑制剂，其中任选地，检查点抑制剂是PD-(L)1抗体，并且进一步任选地，TGFβ1选择性抑制剂是TGFβ1选择性激活抑制剂。
在一些实施方式中，本文所述的RGMc特异性抑制剂可以与用于治疗炎症相关疾病或慢性肾脏疾病的其他化合物、药物和/或药剂联合使用。此类化合物、药物和/或药剂可包括但不限于，非甾体抗炎药(NSAID)、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)、利尿剂、β-阻滞剂、钙通道阻滞剂、中枢交感神经阻滞剂、碳酸氢盐补充剂、胰岛素、维生素D补充剂、尿酸减少剂(例如，别嘌醇)、HMG-CaA还原酶抑制剂(他汀类药物)、吡非尼酮、TGFβ途径抑制剂、抗炎药(包含非甾体抗炎药)、抗氧化剂炎症调节剂(例如，甲基巴多索酮)、内皮素1拮抗剂(例如，avosentan和阿曲生坦)、高级聚糖终产物抑制剂、阿司匹林、二甲双胍、氨基胍、骨化三醇、促红细胞生成素、雄激素、磷酸盐结合剂、维生素B12和维生素B6及其衍生物(例如，吡哆胺)。
在一些实施方式中，本文所述的RGMc特异性抑制剂可以与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其衍生物例如
Figure BDA0003106722380001041
或
Figure BDA0003106722380001042
结合使用。G-CSF是用于刺激血细胞(例如白细胞或造血干细胞)产生并增强其发挥功能的能力的糖蛋白。因此，G-CSF可用于降低接受骨髓抑制治疗(例如化学疗法)后患者发生感染、贫血和出血问题的风险。但是，使用G-CSF会有副作用，包括：血小板减少症、恶心、发烧、骨痛、乳酸脱氢酶升高、碱性磷酸酶升高、瘀斑、背部疼痛、鼻衄(鼻出血)、咳嗽和/或呼吸困难(气促)。因此，预期本文所述的RGMc特异性抑制剂可补充G-CSF的药理作用(例如，减少贫血并促进红细胞产生)和/或降低G-CSF的有效剂量，从而减少副作用并提高耐受性。因此，在一个实施方式中，可以将本文所述的RGMc特异性抑制剂施用于已经接受或正在接受G-CSF疗法的患者。在另一个实施方式中，本文所述的RGMc特异性抑制剂降低了实现有利的药理作用例如促进血细胞产生和/或减少贫血所必需的G-CSF的有效剂量。在另一个实施方式中，本文所述的RGMc特异性抑制剂补充了G-CSF的作用，例如，进一步增加了红细胞的产生和/或减少了贫血。
本文考虑的联合疗法可以有利地利用较低剂量的所施用的治疗剂，从而避免了与各种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。在一些实施方式中，本文所述的RGMc特异性抑制剂的使用可以使对治疗(例如，标准护理)反应较差或不反应的患者更具反应性。在一些实施方式中，本文所述的RGMc特异性抑制剂的使用可允许减少的治疗(例如，标准护理)剂量，其仍在患者中产生等效的临床功效，但产生更少或更低程度的药物相关毒性或不良事件。
抑制RGMc活性
本公开的方法包括在一种或多种生物系统中抑制RGMc活性的方法。这样的方法可以包含使一种或多种生物系统与本公开的抗体和/或组合物接触。根据此类方法的抑制剂(例如，抗体)和/或组合物可包括但不限于生物分子，其包括但不限于重组蛋白、蛋白质复合物和/或抗体或其抗原片段，如本文所述。
本文所述的选择性结合RGMc的抑制剂，例如，抗体及其抗原结合片段可用于其中需要调节RGMc活性的广泛应用中。在一个实施方式中，本发明提供了一种通过将RGMc肽或蛋白质暴露于选择性结合RGMc的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)来抑制RGMc活化的方法。前述方法可以在体外进行，例如以抑制培养细胞中的RGMc活性。前述方法也可以在体内进行，例如在需要RGMc抑制的受试者中，或在要评估RGMc抑制的作用的动物模型中。
选择性结合RGMc的本文所述的任何抑制剂，例如，抗体或其抗原结合片段，以及包含此类抑制剂或抗体的任何药物组合物，均适用于本发明的方法。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种通过将RGMc暴露于与RGMc选择性结合的抑制剂例如抗体或其抗原结合片段而抑制RGMc活性的方法。在一些实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)与BMP竞争结合RGMc。在一些实施方式中，BMP是BMP2和/或BMP6。在一些实施方式中，BMP是BMP6。
在另一个实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)抑制再生蛋白与RGMc的结合。在一些实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)与再生蛋白竞争与RGMc的结合。
在一些实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)不抑制再生蛋白与RGMc的结合。在一些实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)不与再生蛋白竞争与RGMc的结合。
在另一个实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)抑制RGMc与其他结合伴体或与RGMc复合的蛋白质的结合。例如，与RGMc、BMP和/或再生蛋白复合的其他结合伴体包含HFE、TFR2、ALK2、ALK3、BMPR2、ACVR2A和TMPRSS6。
在另一个实施方式中，抑制RGMc活性的抗体或其抗原结合片段也可以调节其他生物学过程(例如，下游作用)。例如，抑制RGMc活性的抗体或其抗原结合片段降低了受试者中铁调素的表达。在一些实施方式中，抑制RGMc活性的抗体或其抗原结合片段增加受试者中铁转运蛋白的表达。在一些实施方式中，抑制RGMc活性的抗体或其抗原结合片段增加了受试者的转铁蛋白饱和度。在一些实施方式中，抑制RGMc活性的抗体或其抗原结合片段增加了受试者的红细胞生成。在一些实施方式中，抑制RGMc活性的抗体或其抗原结合片段降低了受试者的不饱和铁结合能力(UIBC)。在一些实施方式中，抑制RGMc活性的抗体或其抗原结合片段降低了受试者的总铁结合能力(TIBC)。在一些实施方式中，抑制RGMc活性的抗体或其抗原结合片段增加受试者的血清铁蛋白水平。
在一些实施方式中，可以在受试者中进行本文所述的方法。通过本文描述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选地是人类。哺乳动物包括但不限于，农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人类受试者可以是患有与RGMc相关的适应症(例如，上述那些，例如贫血)，处于患病的风险之中或被怀疑患有与RGMc相关的适应症(例如，上述那些，例如贫血)的人类患者。
因此，在一个实施方式中，提供了一种用于增加受试者中血清铁水平的方法，该方法包括以有效下调受试者中的铁调素的量向受试者施用本发明的药物组合物(例如，本文所公开的RGMc特异性抑制剂)。在一些实施方式中，提供了用于下调受试者中铁调素的方法，该方法包括以有效下调受试者中铁调素的量向受试者施用本发明的药物组合物(例如，本文所公开的RGMc特异性抑制剂)。在一些实施方式中，药物组合物降低肝铁调素mRNA水平。在一些实施方式中，药物组合物降低肝铁调素蛋白质水平、血清(循环的)铁调素蛋白质水平或两者。
在一个实施方式中，提供了一种用于增加受试者中血清铁水平的方法，该方法包括以与基线相比有效增加受试者的铁转运蛋白表达的量向受试者施用本发明的药物组合物(例如，本文公开的RGMc特异性抑制剂)。在一些实施方式中，提供了一种用于增加受试者中铁转运蛋白表达的方法，该方法包括以有效地增加受试者中铁转运蛋白表达的量向受试者施用本发明的药物组合物(例如，本文所公开的RGMc特异性抑制剂)。在一些实施方式中，药物组合物增加肠内皮细胞(肠)铁转运蛋白蛋白质水平。在一些实施方式中，药物组合物增加肝细胞(肝)铁转运蛋白蛋白质水平。在一些实施方式中，药物组合物增加巨噬细胞铁转运蛋白蛋白质水平。在一些实施方式中，药物组合物增加脂肪细胞铁转运蛋白蛋白质水平。
在一些实施方式中，提供了一种用于增加受试者中转铁蛋白饱和度的方法，该方法包括以有效增加受试者的转铁蛋白饱和度(TSAT)的量向受试者施用本发明的药物组合物(例如，本文所公开的RGMc特异性抑制剂)。在一些实施方式中，该方法使转铁蛋白饱和度与基线相比增加≥1％、≥2％、≥3％、≥4％、≥5％、≥6％、≥7％、≥8％、≥9％或≥10％。在一些实施方式中，该方法使转铁蛋白饱和度增加≥1％。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使转铁蛋白饱和度增加≥2％。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使转铁蛋白饱和度增加≥3％。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使转铁蛋白饱和度增加≥4％。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使转铁蛋白饱和度增加≥5％。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使转铁蛋白饱和度增加≥6％。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使转铁蛋白饱和度增加≥7％。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使转铁蛋白饱和度增加≥8％。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使转铁蛋白饱和度增加≥9％。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使转铁蛋白饱和度增加≥10％。
在一些实施方式中，该方法将受试者中的转铁蛋白饱和度增加至≥15％、≥16％、≥17％、≥18％、≥19％、≥20％、≥21％、≥22％、≥23％、≥24％或≥25％的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的转铁蛋白饱和度增加至≥15％的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的转铁蛋白饱和度增加至≥16％的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的转铁蛋白饱和度增加至≥17％的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的转铁蛋白饱和度增加至≥18％的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的转铁蛋白饱和度增加至≥19％的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的转铁蛋白饱和度增加至≥20％的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的转铁蛋白饱和度增加至≥21％的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的转铁蛋白饱和度增加至≥22％的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的转铁蛋白饱和度增加至≥23％的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的转铁蛋白饱和度增加至≥24％的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的转铁蛋白饱和度增加至≥25％的水平。
在一些实施方式中，提供了一种用于增加受试者的红细胞生成的方法，该方法包括以有效增加受试者的红细胞生成的量向受试者施用本发明的药物组合物(例如，本文所公开的RGMc特异性抑制剂)。
在一些实施方式中，提供了一种用于增加受试者中血红蛋白(Hb)水平的方法，该方法包括以有效增加血红蛋白水平的量向受试者施用本发明的药物组合物(例如，本文所公开的RGMc特异性抑制剂)。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使Hb水平提高≥1、≥2或≥3g/dl。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使Hb水平增加≥1g/dl。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使Hb水平增加≥2g/dl。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使Hb水平增加≥3g/dl。在一些实施方式中，该方法使受试者中的Hb增加至≥10g/dl的水平。在一些实施方式中，该方法使Hb增加至≥11g/dl的水平。在一些实施方式中，该方法使Hb增加至≥12g/dl的水平。在一些实施方式中，该方法使Hb增加至≥13g/dl的水平。
在一些实施方式中，提供了用于降低受试者中的不饱和铁结合能力(UIBC)的方法，该方法包括以有效降低受试者中不饱和铁结合能力的量向受试者施用本发明的药物组合物(例如，本文公开的RGMc特异性抑制剂)。UIBC在受试者中的典型范围是120–470ug/dL(21–84umol/L)，尽管水平可能因人群而异。因此，在一些实施方式中，受试者的UIBC≥400、≥450、≥500、≥550、≥600、≥650、≥700、≥750或≥800ug/dL。在其他实施方式中，有效量的RGMc特异性抑制剂使受试者的UIBC降低≥50、≥100、≥150、≥200、≥250、≥300、≥350或≥450ug/dL。
在一些实施方式中，提供了用于降低受试者中的总铁结合能力(TIBC)的方法，该方法包括以有效降低受试者中总铁结合能力的量向受试者施用本发明的药物组合物(例如，本文公开的RGMc特异性抑制剂)。TIBC的典型范围是255–450ug/dL，尽管水平会因人群而异。因此，在一些实施方式中，受试者具有的TIBC≥400、≥450、≥500、≥550、≥600、≥650、≥700、≥750或≥800ug/dL。在其他实施方式中，有效量的RGMc特异性抑制剂使受试者的TIBC降低≥50、≥100、≥150、≥200、≥250、≥300、≥350或≥450ug/dL。
在一些实施方式中，提供了一种用于增加受试者中血清铁蛋白水平的方法，该方法包括以有效增加受试者的血清铁蛋白水平的量向受试者施用本发明的药物组合物(例如，本文所公开的RGMc特异性抑制剂)。在一些实施方式中，该方法使受试者的血清铁蛋白水平与基线相比增加≥5、≥10、≥15、≥20、≥30、≥40、≥50、≥60、≥70、≥80、≥90或≥100ng/ml。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使受试者的血清铁蛋白水平增加≥5ng/ml。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使受试者的血清铁蛋白水平增加≥10ng/ml。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使受试者的血清铁蛋白水平增加≥15ng/ml。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使受试者的血清铁蛋白水平增加≥20ng/ml。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使受试者的血清铁蛋白水平增加≥30ng/ml。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使受试者的血清铁蛋白水平增加≥40ng/ml。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使受试者的血清铁蛋白水平增加≥50ng/ml。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使受试者的血清铁蛋白水平增加≥60ng/ml。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使受试者的血清铁蛋白水平增加≥70ng/ml。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使受试者的血清铁蛋白水平增加≥80ng/ml。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使受试者的血清铁蛋白水平增加≥90ng/ml。在一些实施方式中，与基线相比，该方法使受试者的血清铁蛋白水平增加≥100ng/ml。
在一些实施方式中，该方法将受试者中的血清铁蛋白增加至≥30ng/ml的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的血清铁蛋白增加至≥40ng/ml的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的血清铁蛋白增加至≥50ng/ml的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的血清铁蛋白增加至≥60ng/ml的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的血清铁蛋白增加至≥70ng/ml的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的血清铁蛋白增加至≥80ng/ml的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者的血清铁蛋白增加至≥90ng/ml的水平。在一些实施方式中，该方法将受试者中的血清铁蛋白增加至≥100ng/ml的水平。
在一些实施方式中，提供了用于治疗受试者中与RGMc有关的疾病的方法，该方法包括以有效治疗这种疾病的量向受试者施用本发明的药物组合物(例如，本文所公开的RGMc特异性抑制剂)。在一些实施方式中，与RGMc有关的疾病是贫血。在一些实施方式中，所述贫血是铁难治性缺铁性贫血(IRIDA)。在一些实施方式中，贫血是慢性疾病的贫血(ACD)。在一些实施方式中，ACD是癌症相关的贫血。在另一个实施方式中，ACD是与慢性肾病(CKD)有关的贫血。在一些实施方式中，贫血是化学疗法诱导的贫血。
用于缓解与RGMc相关适应症相关的疾病/障碍的试剂盒
本公开还提供了用于减轻与RGMc相关适应症(例如贫血)有关的疾病/障碍的试剂盒。这样的试剂盒可以包含一个或多个容器，该容器包含选择性结合RGMc的抑制剂，例如，抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，试剂盒可包含用于根据本文所述的任何方法的使用说明。所包含的说明可包含对施用抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的描述，该抑制剂选择性地结合RGMc以治疗如本文所述的目标疾病、延迟其发作或减轻该目标疾病。该试剂盒可进一步包含基于识别该个体是否患有目标疾病来选择适合治疗的个体的描述。在其他实施方式中，说明包含将抗体或其抗原结合片段施用于处于目标疾病的风险中的个体的描述。
与使用选择性结合RGMc的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)有关的说明通常包含有关用于预期治疗的剂量、给药方案和给药途径的信息。容器可以是单位剂量、散装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。在本公开的试剂盒中提供的说明通常是在标签或包装插页(例如，试剂盒中包含的纸片)上的书面说明，但是机器可读的说明(例如，在磁性或光学存储盘上携带的指令)也是可以接受的。标签或包装插页可指示该组合物用于治疗与TGFβ相关适应症有关的疾病或障碍、延迟其发作和/或减轻该疾病或障碍。可以提供用于实践本文描述的任何方法的说明。
可以以合适的包装提供本公开的试剂盒。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还考虑用于与特定装置例如吸入器、鼻腔给药装置(例如雾化器)或输注装置(例如微型泵)组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进入口(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。该容器也可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的选择性结合RGMc的抑制剂，例如，抗体或其抗原结合片段。
试剂盒可以任选地提供其他组分如缓冲剂和解释性信息。通常，试剂盒包含容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。在一些实施方式中，本公开提供了包含上述试剂盒内容物的制品。
虽然本文已经描述和示出了本公开的一些实施方式，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得本文描述的结果和/或一个或多个优势的多种其他手段和/或结构，并且这样的变化和/或修改中的每一个都被认为在本公开的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和构造均是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于本公开的教导所应用的一个或多个特定应用。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文描述的本公开的具体实施方式的许多等同形式。因此，应当理解，前述实施方式仅以举例的方式给出，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，可以以不同于具体描述和要求保护的方式来实施本公开。本公开针对本文所述的每一个单独的特征、系统、制品、材料和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、制品、材料和/或方法不是相互矛盾的，则两个或更多的这样的特征、系统、制品、材料和/或方法的任何组合都包含在本发明公开的范围内。
优选实施方式的列表
1.一种分离的抗体，其特异性结合人排斥性导向分子C(RGMc)，其中：
a)该抗体是全长抗体或其抗原结合片段；
b)该抗体不结合人排斥性导向分子A(RGMa)和人排斥性导向分子B(RGMb)；和
c)该抗体抑制或减少RGMc与BMP6的相互作用。
3.如实施方式1或实施方式2的抗体，其中所述抗体结合不连续表位，所述不连续表位包含人RGMc内第一和第二结合区各自的至少一个片段，其中所述第一结合区包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，其中任选地第二结合区包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
4.一种结合人RGMc内的表位的分离的抗体，其中：
a)该抗体是全长抗体或其抗原结合片段；和
b)该抗体结合包含YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的至少一个氨基酸残基和/或FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的至少一个氨基酸残基的表位。
5.如实施方式4的抗体，其中所述表位包含YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的至少一个氨基酸残基和FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的至少一个氨基酸残基。
6.如实施方式4或5的抗体，其中所述抗体不结合人RGMa和人RGMb。
7.如实施方式4-76中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制或减少RGMc与BMP6的相互作用。
8.如实施方式4-7中任一项所述的抗体，其中该抗体不抑制或减少RGMc与再生蛋白的相互作用。
9.一种特异性结合人RGMc的分离的抗体，其中该抗体是全长抗体或其抗原结合片段，并且其中该抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO:14，条件是：
i.SEQ ID NO:14的4位的丝氨酸残基可以被精氨酸置换；
ii.SEQ ID NO:14的7位的丙氨酸残基可以被丝氨酸置换；和/或
iii.SEQ ID NO:14的9位的丝氨酸残基可以被谷氨酰胺置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO:15，条件是：
i.SEQ ID NO:15的8位的苏氨酸残基可以被缬氨酸置换；和/或
ii.SEQ ID NO:15的10位的天冬酰胺残基可以被丝氨酸置换；
c)CDR-H3：SEQ ID NO:16，条件是：
i.SEQ ID NO:16的5位的异亮氨酸残基可以被酪氨酸置换；和/或
ii.SEQ ID NO:16的6位的丙氨酸残基可以被缬氨酸置换；
d)CDR-L1：SEQ ID NO:17；
e)CDR-L2：SEQ ID NO:18；和，
f)CDR-L3：SEQ ID NO:19。
10.如前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含分别如SEQ ID NO:30、31和32中所示的重链CDR1(H-CDR1)、重链CDR2(H-CDR2)和重链CDR3(H-CDR3)序列，以及分别如SEQ ID NO:33、34和35中所示的轻链CDR1(L-CDR1)、轻链CDR2(L-CDR2)和轻链CDR3(L-CDR3)序列；其中任选地：
H-CDR1的4位的R残基被K或S替代；H-CDR1的5位的S残基被T替代；H-CDR1的7位的S残基被A替代；和/或H-CDR1的9位的S残基被Q替代；
其中进一步任选地：
H-CDR2的8位的V残基被H或T替代；和/或H-CDR2的10位的N残基被S、T或E替代。
11.如前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
a)重链可变区，其具有与SEQ ID NO:36至少90％同一的氨基酸序列；和/或
b)可变轻链可变区，其具有与SEQ ID NO:37至少90％同一的氨基酸序列。
12.如前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
a)SEQ ID NO:36所示的重链可变区序列；和
b)SEQ ID NO:37所示的轻链可变区序列。
13.如前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含分别如SEQ ID NO:38、39和40所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:41、42和43所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
14.如前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
c)重链可变区，其具有与SEQ ID NO:44至少90％同一的氨基酸序列；和/或
d)可变轻链可变区，其具有与SEQ ID NO:45至少90％同一的氨基酸序列。
15.如前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
a)SEQ ID NO:44所示的重链可变区序列；和
b)SEQ ID NO:45所示的轻链可变区序列。
16.如前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体是全人或人源化抗体。
17.如前述实施方式中任一项所述的抗体，其是人IgG1、IgG2或IgG4抗体。
18.如前述实施方式中任一项所述的抗体，其是人IgG4抗体，其中任选地所述人IgG4抗体包含Ser到Pro的骨架置换，其产生IgG1样铰链。
19.如前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体与表达膜结合人RGMc的细胞结合。
20.如前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体以小于0.1×10-9(0.1nM)的KD值结合RGMc。
21.如前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体调节RGMc与一种或多种以下相互作用蛋白的相互作用：HFE、TFR2、ALK2、ALK3、BMPR2、ACVR2A和TMPRSS6。
22.一种特异性结合人RGMc的分离的抗体，其中所述抗体与实施方式4-21中任一项所述的抗体竞争与人RGMc的结合和/或与实施方式4-21中任一项所述的抗体结合相同的表位。
23.一种药物组合物，其包含前述实施方式中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
24.用于在人类受试者中治疗与RGMc相关的疾病的方法中使用的实施方式23的组合物，其中所述治疗包含以有效治疗所述病症的量向所述受试者施用所述组合物。
25.用于根据实施方式24使用的组合物，其中与RGMc相关的疾病是贫血。
26.用于根据实施方式25使用的组合物，其中所述贫血是铁难治性缺铁性贫血(IRIDA)或慢性病性贫血(ACD)。
27.用于根据实施方式26使用的组合物，其中所述ACD是癌症相关的贫血。
28.用于根据实施方式25使用的组合物，其中所述贫血是化疗诱导的贫血。
29.用于根据实施方式26使用的组合物，其中所述ACD是与慢性肾病(CKD)相关的贫血。
30.用于根据实施方式24-29中任一项使用的组合物，其中所述组合物与另外的治疗剂组合施用。
31.用于根据实施方式30使用的组合物，其中所述另外的治疗剂是促红细胞生成素刺激剂(ESA)、HIF稳定剂、铁补充剂或输血。
32.用于根据实施方式31使用的组合物，其中所述方法降低与ESA、HIF稳定剂、铁补充剂或输血有关的毒性。
33.用于根据实施方式32使用的组合物，其中所述毒性包含铁超载、癌症风险和/或心血管事件(例如，主要的心脏不良事件如中风)的风险。
34.用于根据实施方式24-33中任一项使用的组合物，其中所述受试者：
a)正接受铁疗法，但受益于减少铁疗法的剂量；
b)已经接受了铁疗法，但由于毒性而中止；
c)已经接受了铁疗法，并受益于减少铁疗法的剂量；
d)有患癌症的风险；和/或
e)已被诊断出患有癌症。
35.一种用于在受试者中治疗与RGMc相关的疾病的方法，该方法包括以有效治疗疾病的量向受试者施用实施方式23的药物组合物。
36.一种用于增加受试者中血清铁水平的方法，该方法包括以有效增加受试者中血清铁水平的量向受试者施用实施方式23的药物组合物。
37.一种用于下调受试者中铁调素的方法，该方法包括以有效下调受试者中铁调素的量向受试者施用实施方式23的药物组合物。
38.如实施方式37所述的方法，其中所述药物组合物降低肝铁调素mRNA水平。
39.如实施方式37所述的方法，其中所述药物组合物降低肝铁调素蛋白质水平、血清(循环)铁调素蛋白质水平或两者。
40.一种用于增加受试者中转铁蛋白饱和度的方法，其中该方法包括以有效增加受试者中转铁蛋白饱和度的量向受试者施用实施方式23的药物组合物。
41.一种用于增加受试者中红细胞生成的方法，该方法包括以有效地增加受试者中红细胞生成的量向受试者施用实施方式23或24的药物组合物。
42.一种用于降低受试者中的不饱和铁结合能力(UIBC)的方法，该方法包括以有效降低受试者中的不饱和铁结合能力的量向受试者施用实施方式23的药物组合物。
43.一种用于降低受试者中总铁结合能力(TIBC)的方法，该方法包括以有效降低受试者中总铁结合能力的量向受试者施用实施方式23的药物组合物。
44.一种用于增加受试者中血清铁蛋白水平的方法，该方法包括以有效增加受试者中血清铁蛋白水平的量向受试者施用实施方式23的药物组合物。
45.如实施方式44的方法，其中所述量是有效达到每毫升血液≥20纳克的血清铁蛋白水平的量。
46.用于根据实施方式24-34中任一项使用的药物组合物或根据实施方式35-45中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受促红细胞生成素(例如，EPO)疗法、HIF稳定剂疗法、IV铁补充或其组合。
47.用于根据实施方式24-34中任一项使用的药物组合物或根据实施方式35-45中任一项所述的方法，其中所述受试者已经表现出与EPO治疗或IV铁补充相关的不良事件或处于与EPO治疗或IV铁补充相关的不良事件的风险中。
48.一种用于制备包括RGMc-选择性抑制剂(例如，中和抗体)的药物组合物的方法，其中该方法包括以下步骤：
i)识别抗体或抗原结合片段相对于RGMa和RGMb选择性结合RGMc的能力；
ii)基于步骤(i)识别抗体或抗原结合片段在体内抑制/中和RGMc活性的能力；
iii)基于步骤(i)和(ii)选择抑制/中和抗体用于配制成药物组合物。
49.如实施方式48的方法，其中步骤(i)包含正向选择，和任选地还包含负向选择。
50.如实施方式48或49的方法，其中所述表位排除再生蛋白结合位点。
51.如实施方式48或实施方式49的方法，其中所述抗体相对于可溶性RGMc优先结合膜结合的RGMc。
52.如实施方式48或实施方式49的方法，其中所述抗体诱导抗体-抗原复合物的内化。
53.如实施方式48-52中任一项所述的方法，其中所述识别步骤(i)包含筛选文库。
54.如实施方式53的方法，其中所述文库是噬菌体文库或酵母文库。
55.如实施方式48-54中任一项所述的方法，其中所述识别步骤(ii)包含测量选自以下的铁参数：血清铁、总铁结合能力(TIBC)、不饱和铁结合能力(UIBC)和转铁蛋白饱和度。
56.如实施方式48-55中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包含测量铁调素表达。
57.如实施方式56的方法，其中所述铁调素表达是肝铁调素水平和/或血清铁调素水平。
58.如实施方式48-57中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包含识别能够在体内升高血清铁水平和/或抑制铁调素表达的中和抗体或抗原结合片段。
59.如实施方式48-58中任一项所述的方法，其中所述药物组合物被配制用于静脉内或皮下施用。
60.如实施方式48-59中任一项所述的方法，其中步骤(i)包含确认相对于RGMa和RGMb的RGMc选择性。
61.一种用于治疗受试者中铁失调的方法中的RGMc-选择性抑制剂，其中所述RGMc-特异性抑制剂不抑制RGMa和RGMb，并且其中所述铁失调导致所述受试者的贫血。
62.一种用于减少与铁疗法有关的毒性的方法中的RGMc选择性抑制剂，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的RGMc选择性抑制剂。
63.根据实施方式62使用的RGMc-选择性抑制剂，其中所述铁疗法是EPO疗法、铁补充剂或输血。
64.根据实施方式62或63使用的RGMc-选择性抑制剂，其中所述毒性包含铁超载或癌症的风险。
65.根据实施方式62-64中任一项使用的RGMc-选择性抑制剂，其中所述受试者a)正在接受铁疗法，但是受益于铁疗法的剂量减少；b)已经接受了铁疗法，但由于毒性而中止；c)已经接受了铁疗法，并受益于铁疗法的剂量减少；d)有患癌症的风险；e)已被诊断出患有癌症。
66.根据实施方式61-65中任一项使用的RGMc-选择性抑制剂，其中RGMc-选择性抑制剂是RGMc-选择性抗体，其中任选地RGMc-选择性抗体是中和抗体。
67.根据实施方式66使用的RGMc选择性抑制剂，其中所述RGMc选择性抗体结合RGMc的细胞外部分或包含其的复合物。
68.根据实施方式67使用的RGMc-选择性抑制剂，其中所述RGMc-选择性抗体结合RGMc的细胞外部分或存在于细胞表面的包含其的复合物。
69.一种用于治疗受试者中功能性铁缺乏症的RGMc-选择性抑制剂，其中所述受试者已接受ESA和/或HIF稳定剂。
70.一种RGMc-选择性抑制剂和促红细胞生成素疗法(例如ESA、HIF稳定剂)，用于治疗受试者中的功能性铁缺乏症。
71.根据实施方式70使用的RGMc-选择性抑制剂和促红细胞生成素疗法(例如，ESA、HIF稳定剂)，其中与单独的促红细胞生成素疗法相比，该治疗实现了更快的缓解或治疗益处的起效，其中任选地该治疗益处包含血清铁增加、转铁蛋白饱和度增加、血红蛋白增加或其任何组合。
72.根据实施方式70使用的RGMc-选择性抑制剂，其中所述RGMc-选择性抑制剂对促红细胞生成素疗法致敏。
73.一种用于降低铁疗法的剂量或频率的RGMc-选择性抑制剂，其中所述铁疗法选自口服或IV铁补充剂、输血、ESA和HIF稳定剂，其中当与铁疗法联合施用时，该RGMc-选择性抑制剂实现治疗益处。
74.一种用于治疗患有癌症的受试者的贫血的RGMc-选择性抑制剂。
75.根据实施方式74使用的RGMc-选择性抑制剂，其中所述受试者是化疗的候选者或正在接受化疗。
76.根据实施方式74使用的RGMc-选择性抑制剂，其中所述受试者已接受化疗。
77.根据实施方式74使用的RGMc-选择性抑制剂，其中所述受试者不是接受ESA疗法或HIF稳定剂疗法的候选者。
78.一种RGMc-选择性抑制剂，用于治疗对促红细胞生成素疗法或铁补充剂反应低下的受试者的功能性铁缺乏症。
79.一种RGMc-选择性抑制剂，用于治疗对促红细胞生成素疗法或铁补充剂不耐受的受试者的功能性铁缺乏症。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例无意于以任何方式进行限制。贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及附图的全部内容在此通过引用并入本文。
实施例
RGMc是某些BMP(例如BMP6)的肝表达专性共受体，其增强铁调素的表达并因此抑制铁的转运。另一方面，其他RGM家族成员如RGMa和RGMb在例如神经系统、脑、皮肤、心脏、肝脏、肺、肾脏、睾丸和肠中被更广泛地表达。另外，BMP6在身体例如脑、骨、肝脏、肺、肾脏、胰腺、睾丸和肠中广泛表达。因此，通过靶向其表达比RGMa、RGMb和BMP6更具限制性的RGMc，可以实现更多组织特异性的作用，同时减少脱靶作用。这种方法具有解决铁限制性贫血和铁超载病症的潜力，而不会广泛抑制全身的RGM和BMP6功能(这可能会导致不希望的毒性)。
因此，本发明包含与常规方法例如直接BMP6拮抗剂和RGMa/RGMb/RGMc的非选择性抑制剂相比，RGMc的选择性靶向提供了一种实现功效和安全性(降低的毒性)的有利方法的认识。
实施例1：识别RGMc特异性抗体
使用本文所述的已知技术产生对RGMc具有选择性的抗体。使用体外结合分析法(即
Figure BDA0003106722380001221
)验证了相对于RGMa和RGMb的RGMc特异性。通过将每一抗体以7.5ug/ml(或50nM)加入1×Kinetics缓冲液中，并将其加载到来自
Figure BDA0003106722380001222
的抗hIgG FcCapture(AHC)生物传感器上进行测试抗体与其靶标的结合亲和力分析。上样后，通过将尖头放置在1×Kinetics缓冲液中而获得基线读数，然后通过将抗体以不同浓度(900nM、300nM、100nM和33nM)呈递于组氨酸标记的hRGMc、hRGMa或hRGMb来计算抗体的结合速率或缔合。达到结合饱和后，执行解离步骤以通过将尖头移回1×Kinetics缓冲液中来计算解离速率。然后可以使用结合和解离的速率来计算KD，或每一种抗体对主要靶标(RGMc)的结合亲和力，同时确保不与RGM家族成员(RGMa和RGMb)发生交叉结合。
图2显示了RGMc特异性抗体SR-RC-AB3、SR-RC-AB4和SR-RC-AB5的结合特征和亲和力数据(KD)。值得注意的是，所有三种抗体均以纳摩尔亲和力结合RGMc，而这些抗体均未显示出任何可检测到的与RGMa或RGMb的结合。
实施例2：RGMc-选择性抗体在体外抑制BMP6活性
改进的BMP报告分析法用于评估抗体对BMP活性的抑制。简而言之，将HEPG2BRA报告细胞以10,000个细胞/孔接种在96孔板中。24小时后，将抗体与融合至Fc的重组可溶性人RGMc(CF
Figure BDA0003106722380001225
40nM)在DMEM/0.1％BSA中单独预孵育1小时，然后向溶液中加入BMP6(CF＝0.2nM)持续一小时。将100uL/孔的所得抗体-RGMc-BMP6复合物一式三份加入HEPG2BRA平板中，并返回培养箱持续18小时。将100ul的BrightGloTM荧光素酶底物
Figure BDA0003106722380001223
添加到每一个孔中，并使用读板器
Figure BDA0003106722380001224
测定RLU。由于可溶性RGMc螯合BMP6并抑制其下游转录活性，因此在此测定中阻断BMP6与可溶性RGMc结合的抗体会激活BMP6报告活性，并被称为BMP6竞争性抗体。SR-RC-AB3和SR-RC-AB4的剂量反应滴定表明，它们在BRE报告分析中具有证实的效力，EC50分别为6.83nM和1.68nM。
实施例3：亲和力成熟的RGMc-选择性抗体的开发
选择SR-RC-AB3和SR-RC-AB4进行亲和力成熟。使用已知技术进行亲和力成熟，例如，本文所述的酵母展示。
为了测定与RGMa-his(单价的)或RGMa-Fc(avid)的结合亲和力，将测试抗体固定在抗人Fc捕获生物传感器(AHC)
Figure BDA0003106722380001231
的表面，然后将传感器用过量的阴性对照抗体封闭。然后在100nM下测试与Fc或组氨酸标记的RGMa的结合。使抗原缔合3分钟，然后解离3分钟。在整个实验过程中使用Kinetics缓冲液
Figure BDA0003106722380001232
并使用1：1拟合模型为每一个抗体抗原对确定KD。没有一个抗体显示出与组氨酸标记的RGMa蛋白的结合，而一些克隆的确显示了对avid(Fc-标记的形式)的反应(图4A)。显示出与RGMa-Fc结合的克隆均来自同一谱系，表明该家族中潜在的交叉反应性表位。不选择具有与RGMa-Fc结合的克隆进行进一步测试。
为通过MSD-SET(中等规模测定-溶液平衡滴定)测量亲和力，将RGMc特异性抗体(在这种情况下为Fab形式的抗体)的滴定与恒定浓度的抗原预孵育20-24小时以达到平衡。然后将滴定添加到耗尽溶液中的所有游离抗原的具有捕获抗体(用NHS-磺基标签预标记)的预涂覆的板中。在150秒的孵育之后，将板洗涤3次并且添加SA-磺基标签试剂并孵育3分钟。再次洗涤后，在MesoQuickPlex SQ120上读板。测定了对人类和小鼠RGMc抗原的Fab亲和力，并表明在整个亲和力成熟过程中维持了对两种物种的交叉反应性(图4B)。
用针对人RGMc-his抗原的全长抗体进行了类似的MSD-SET分析以测定结合亲和力(KD)。如表3所示，与亲本抗体相比，选择的后代抗体达到了亚纳摩尔亲和力。
如上文实施例2中所述进行BRE-荧光素酶活性(其在体外测量BMP-6竞争)。如表4所示，与亲本抗体相比，亲和力成熟的抗体也显示出BMP竞争性的改善。
表3：RGMc亲和力成熟的抗体的KD
Figure BDA0003106722380001241
实施例4：亲和力成熟的RGMc选择性抗体在体外抑制BMP6活性
为了测定亲和力成熟的RGMc-选择性抗体是否抑制了BMP6与RGMc的结合，如上文实施例2中所述进行BMP6测定。如图5A所示，与亲本抗体(即，SR-RC-AB3)相比，亲和力成熟的抗体的SR-RC-AB3家族显示出改善的抑制BMP与RGMc结合的能力(如通过增加的BMP活性所显示)。如图5B所示，与亲本抗体(即SR-RC-AB3)相比，亲和力成熟的抗体的SR-RC-AB4家族显示出改善的抑制BMP与RGMc结合的能力(如通过相对的BMP活性增加所示)。高亲和力的RGM结合剂与同种型对照一起用作对照。表4显示了BMP活性分析中计算的EC50值。总之，这些结果表明，亲和力成熟的抗体具有提高的通过BMP抑制RGMc活性的能力。
表4：亲和力成熟的抗体显示出BMP竞争增加。
Figure BDA0003106722380001242
实施例5：亲和力成熟的RGMc-选择性抗体在体内调节铁内稳态
为评估抗体的体内作用，在啮齿动物中单次抗体给药(0.2mg/kg，n＝5动物/组)后24小时测量了铁参数(血清铁、不饱和铁结合能力(UIBC)和转铁蛋白饱和度)。对雌性Sprague Dawley大鼠(7至9周龄，Charles River Laboratories)施用单一静脉注射剂量的抗体。24小时后，处死动物，收集血清用于在ModP或Cobas临床化学分析仪上进行铁分析或用于铁调素ELISA，并收获肝脏用于分析铁调素RNA表达。选择的BMP竞争性抗体强力地抑制铁调素并增加啮齿动物中铁的动员。更具体地，如图6A和6B所示，与对照组相比，SR-RC-AB1、SR-RC-AB7、SR-RC-11、SR-RC-AB8、SR-RC-AB9、SR-RC-AB2和SR-RC-AB10增加了大鼠中血清铁，和降低健康大鼠中的不饱和铁结合能力(UIBC)。数据表明，根据本发明的RGMc-选择性抑制剂在大鼠中通过显著降低不饱和铁结合能力(UIBC)(图6B)并在24小时后达到0.2mg/kg的转铁蛋白饱和度显著增加有效地在体内动员铁(图6A)。
为检查RGMc选择性抗体的药代动力学(PK)和药效学(PD)关系，在雌性SpragueDawley大鼠中进行了单剂量PK/PD研究。以0.6、2、6和20mg/kg的剂量向动物施用单一静脉内(IV)剂量的抗体，并测定血清铁参数(例如，血清铁和UIBC水平)作为药效学指标，而测量抗体的血清浓度以确定抗体的PK分布。用RX Daytona临床化学分析仪测定血清铁和UIBC且用ELISA测定抗体浓度。
图7A显示了当以20mg/kg的单剂量SR-RC-AB8(n＝2)或SR-RC-AB9(n＝5)处理时动物中随时间的血清铁水平(平均值±SEM)。与对照组相比，SR-RC-AB8和SR-RC-AB9增加了血清铁水平并降低了UIBC水平。图7B显示了在后续PK/PD研究中的血清铁(上图)和UIBC(下图)测量结果，其中雌性Sprague-Dawleyere以0.6mg/kg至20mg/kg(n＝5-11只动物/组)施用单一静脉注射剂量的SR-RC-AB8。与对照组相比，在所有评估剂量下，SR-RC-AB8升高血清铁水平并降低UIBC水平。血清铁参数变化的持续时间是剂量依赖性的，其中在单剂量20mg/kg后效果持续长达21天。图7C显示了相同动物内的抗体血清浓度。使用Phoenix WinNonlin软件计算PK参数，并汇总在表5中。在所有剂量水平下均观察到靶标介导的药物处置(TMDD)，但是在6和20mg/kg的较高剂量下，靶标在早期时间点似乎已饱和且在PK曲线的稍后时间点注意到TMDD的观察结果和清除率变化的时机。给药后1小时达到最大浓度，和Cmax证明剂量成比例的增加。抗体的半衰期范围为1.2-6.7天，表明在较低剂量下观察到更快的清除和更短的保留时间。这与具有靶标介导的药物处置(TMDD)的人IgG4分子是一致的。最后，正如表现出TMDD的分子所预期的那样，观察到通过AUC0-8测量的暴露量的剂量成比例的增加。图7D示出了20mg/kg下抗体暴露(PK)和血清铁参数(PD)之间的关系。数据表明，连续的PD作用需要3μg/mL以上的浓度。
Figure BDA0003106722380001261
总之，这些数据表明，RGMc特异性抗体对BMP6-铁调素信号传导途径的靶向破坏增加体内铁的利用率。这些结果支持这样的观点，即对BMP6信号的肝脏选择性抑制可能为靶向多种铁限制性贫血(包括CKD贫血和癌症或化学疗法诱导的贫血)提供一种安全有效的方法。
实施例6：HDX表位作图以确定RGMc-选择性抗体结合区
氢/氘交换质谱(HDX-MS)是探索溶液中蛋白质构象的一种广泛使用的技术。HDX-MS方法被描述于Wei等，Drug Discov Today,2014January；19(1):95–102，在此全文引入作为参考。简而言之，HDX-MS依赖于蛋白质骨架酰胺氢与溶液中氘的交换。参与弱氢键或位于蛋白质表面的骨架酰胺氢可以迅速地交换，而埋在内部的或参与稳定氢键的那些交换较慢。通过测量骨架酰胺氢的氢/氘(H/D)交换速率，可以获得有关蛋白质动力学和构象的信息。
进行HDX-MS以确定在RGMc SR-RC-AB9中结合的位置。在HDX-MS中，由于蛋白质-蛋白质相互作用，被抗体紧密结合的抗原区域被保护免于H/D交换，而暴露于溶剂的区域可以很容易地进行H/D交换。基于此，识别了抗原的结合区域。图8A显示了两个H/D交换保护的区域，表明SR-RC-AB9潜在地结合包含分别在RGMc的α1和α3螺旋中的两个结合区域(区域A和区域B)的独特表位。α3螺旋包含BMP结合结构域的一部分。图8B是对应于区域A和区域B的RGMa/b/c肽的比对。图8C示出了在已知RGMa结构结合于BMP2之后建模的RGMc的结构。
事实上，基于潜在的接触残基的存在，RGMc特异性抗体可以与α3螺旋(例如，区域B)结合(参见，例如，图8D)。此外，在亚型之间存在几个氨基酸变异，特别是在α1螺旋中，这些变异可能造成SR-RC-AB3后代抗体(例如，SR-RC-AB8和SR-RC-AB9)的亚型特异性。同样，在区域A内有几个残基可以用作相对地RGMa和RGMb的RGMc特异性的结构决定子(图8E)。
实施例7：RGMC-选择性抗体调节非人灵长类动物中的铁内稳态
为了评估RGMC选择性抗体调节非人灵长类动物体内的铁内稳态的能力，在雌性食蟹猕猴(2-7岁，Covance)中以10mg/kg的SR-RC-AB8单次静脉注射剂量后测量血清铁参数。在单剂抗体剂量后的10周内，定期从动物中收集血清。在Cobras血液分析仪上测量血清铁和UIBC，并通过ELISA测定血清抗体暴露。
如图9A所示，在施用抗体后，SR-RC-AB8有效地增加了血清铁和降低了UIBC，并且在给药后6周血清铁水平保持升高。到8周时，所有用SR-RC-AB8给药的动物中的血清铁已恢复到基线。图9B显示了给药后长达10周的SR-RC-AB8的平均血清浓度。PK分布符合单克隆抗体的预期，给药后1小时达到Cmax 242μg/mL(±21.3)。通过将抗体暴露(PK)与血清铁参数(PD)进行比较来评估的PK/PD关系表明高于3μg/mL的浓度可产生连续或延长的PD效应(图9C)。
这些结果证实，在单一抗体剂量后，RGMC选择性抗体可对非人灵长类动物的血清铁产生持续影响，这使得可以实现不频繁的静脉输注的机会(例如，每3个月或6个月)和/或皮下给药方案。
实施例8：在慢性病性贫血的大鼠模型中，当与ESA组合给药时RGMC-选择性抗体调节血清铁并增加血红蛋白。
为了在慢性病性贫血(ACD)模型中检查RGMC选择性抗体对血清铁和血液参数的影响，使用了Lewis PG-APS ACD模型。这是大鼠慢性疾病贫血的长期模型，因此能够研究铁调素调节药物对红细胞生成的影响。由于RGMC选择性抗体具有增强ESA功能的潜力，因此抗体可以单独或与依泊汀α(EPO)联合给药。用PG-APS[15mg/kg]腹腔注射大鼠来诱发关节炎，和在14天后测定血液和血清铁参数。根据这些结果，将大鼠随机分组进行给药，给药的第一天标记为第0天。用同种型对照或SR-RC-AB8抗体(20mg/kg)和/或EPO(10ug/kg)每周一次处理动物(每组n＝6-8)。总共向动物给药4周(第0、7、14、21天)，并在第3、10、17、24和28天每周测量血清铁和血液参数。
图10A显示了每一个剂量组相对于第-3天基线测量的血清铁的变化。在ACD动物中，与单独的IgG相比，每周用SR-RC-AB8单独以及与EPO联合给药增加了血清铁。图10B显示了从研究的第24天起的绝对血清铁(μg/dL)数据。注意健康对照和ACD动物之间血清铁的显著差异，以及SR-RC-AB8给药的动物组中血清铁增加。图10C示出了对于每一个剂量组相对于第-3天基线测量的血红蛋白变化。数据显示，当与EPO联合给药时，SR-RC-AB8对血红蛋白有强力的影响，平均比单独的EPO或抗体更快且更高地升高血红蛋白水平。在图10D中示出仅第24天的绝对血红蛋白(g/dL)数据。与ACD:同种型对照组相比，ACD:SR-RC-AB8+EPO给药组的血红蛋白增加了58％。这些数据一起表明，在ACD模型中，SR-RC-AB8可以调节血清铁，且当与EPO联合给药时，SR-RC-AB8在调节Hgb方面可以比单独的EPO发挥更大的作用。
下面提供了本公开中包含的某些序列的列表。
序列表
Figure BDA0003106722380001291
Figure BDA0003106722380001301
Figure BDA0003106722380001311
Figure BDA0003106722380001321

Claims (19)

1.一种分离的抗体，其特异性结合人排斥性导向分子C(RGMc)，其中：
a)该抗体是全长抗体或其抗原结合片段；
b)该抗体不结合人排斥性导向分子A(RGMa)和人排斥性导向分子B(RGMb)；和
c)该抗体抑制或减少RGMc与BMP6的相互作用。
2.一种分离的抗体，其结合人RGMc内的表位，其中：
a)该抗体是全长抗体或其抗原结合片段；和
b)该抗体结合包含YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的至少一个氨基酸残基和/或FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的至少一个氨基酸残基的表位，其中任选地该表位包含YVSSTLSL(SEQ ID NO:46)的至少一个氨基酸残基和FHSAVHGIEDL(SEQ ID NO:47)的至少一个氨基酸残基。
3.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含分别如SEQ ID NO:30、31和32所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:33、34和35所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列；其中任选地：
所述H-CDR1的4位的R残基被K或S替代；所述H-CDR1的5位的S残基被T替代；所述H-CDR1的7位的S残基被A替代；和/或所述H-CDR1的9位的S残基被Q替代；
其中进一步任选地：
所述H-CDR2的8位的V残基被H或T替代；和/或所述H-CDR2的10位的N残基被S、T或E替代。
4.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
a)重链可变区，其具有与SEQ ID NO:36至少90％相同的氨基酸序列；和/或
b)可变的轻链可变区，其具有与SEQ ID NO:37至少90％相同的氨基酸序列，
其中任选地该抗体包含：
c)SEQ ID NO:36所示的重链可变区序列；和
d)SEQ ID NO:37所示的轻链可变区序列。
5.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是全人抗体或人源化抗体，其中任选地所述抗体是人IgG1、IgG2或IgG4抗体，其中任选地所述抗体是人IgG4抗体，其中进一步任选地，所述人IgG4抗体包含Ser至Pro的骨架置换，其产生IgG1样铰链。
6.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体以小于0.1×10-9(0.1nM)的KD值结合RGMc，其中任选地所述抗体诱导抗体-抗原复合物的内化。
7.一种特异性结合人RGMc的分离的抗体，其中所述抗体与权利要求2的抗体竞争(例如，交叉竞争)与人RGMc的结合，和/或与权利要求2的抗体结合相同的表位。
8.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
9.如权利要求8所述的组合物，其用于治疗人类受试者中的贫血的方法，其中所述治疗包括以有效治疗所述贫血的量向所述受试者施用所述组合物，
其中任选地所述贫血为铁难治性缺铁性贫血(IRIDA)或慢性病性贫血(ACD)。
10.根据权利要求9所述的用途的组合物，其中所述贫血是癌症相关的贫血或化疗诱导的贫血。
11.根据权利要求9所述的用途的组合物，其中所述ACD是慢性肾病(CKD)的贫血，其中任选地所述受试者是透析依赖性或非透析依赖性的。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的用途的组合物，其中所述组合物与另外的治疗剂组合施用，其中任选地所述另外的治疗剂是促红细胞生成素刺激剂(ESA)、HIF稳定剂、铁补充剂或输血。
13.根据权利要求12所述的用途的组合物，其中所述方法降低与ESA、HIF稳定剂、铁补充剂或输血相关的毒性，其中任选地所述毒性包括铁超载或癌症的风险。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的用途的组合物，其中所述受试者是：
a)接受铁疗法，但受益于铁疗法的剂量减少；
b)已经接受了铁疗法，但由于毒性而中止；
c)已经接受了铁疗法，并受益于铁疗法的剂量减少；
d)有患癌症的风险；和/或
e)已被诊断患癌症。
15.一种用于增加受试者中血清铁水平的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效地用于以下的量的权利要求8的药物组合物：i)增加所述受试者中的血清铁水平；ii)下调所述受试者中的铁调素；iii)降低肝脏铁调素mRNA水平；iv)降低肝脏铁调素蛋白水平、血清(循环)铁调素蛋白水平，或两者；v)增加所述受试者的转铁蛋白饱和度；vi)增加所述受试者的红细胞生成；vii)降低所述受试者的不饱和铁结合能力；viii)降低所述受试者的总铁结合能力；和/或，ix)增加所述受试者的血清铁蛋白水平，其中任选地所述量是有效地达到每毫升血液≥20纳克的血清铁蛋白水平的量。
16.根据权利要求9-14中任一项所述的用途的药物组合物或根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者已经接受了促红细胞生成素(EPO/ESA)疗法、HIF稳定剂疗法、IV铁补充或其组合，其中任选地所述受试者已经表现出或具有与EPO疗法、HIF稳定剂疗法或IV铁补充相关的不良事件的风险。
17.一种用于制备包含RGMc选择性抑制剂(例如，中和抗体)的药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：
i)鉴定抗体或抗原结合片段相对于RGMa和RGMb选择性结合RGMc的能力；
ii)基于步骤(i)鉴定所述抗体或抗原结合片段在体内抑制/中和RGMc活性的能力；
iii)基于步骤(i)和(ii)选择抑制/中和抗体以配制成药物组合物，其中任选地步骤(i)包括正向选择并且任选地进一步包括负向选择。
18.根据权利要求17任一项所述的方法，其中所述鉴定步骤(i)包括筛选文库，其中任选地所述文库是噬菌体文库或酵母文库；其中任选地所述鉴定步骤(ii)包括测量选自以下的铁参数：血清铁、总铁结合能力(TIBC)、不饱和铁结合能力(UIBC)和转铁蛋白饱和度，其中进一步任选地步骤(ii)包括测量铁调素表达，其中任选地所述铁调素表达是肝铁调素水平和/或血清铁调素水平，其中进一步任选地步骤(ii)包含鉴别能够在体内升高血清铁水平和/或抑制铁调素表达的中和抗体或抗原结合片段，其中进一步任选地所述药物组合物被配制用于静脉内或皮下施用，其中进一步任选地步骤(i)包括相对于RGMa和RGMb确认对于RGMc的选择性。
19.一种用于治疗受试者的铁失调的方法中的RGMc-选择性抑制剂，其中所述RGMc-选择性抑制剂不抑制RGMa和RGMb，并且其中所述铁失调导致所述受试者的贫血。
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