JP7071935B2 - 抗Ａｘｌアンタゴニスト抗体 - Google Patents

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Description

本開示は、Ａｘｌタンパク質に特異的に結合する抗体に関する。抗Ａｘｌ抗体の産生および使用のための方法も開示する。
Ａｘｌは、ビタミンＫ依存性リガンドＧａｓ６（成長停止特異的（ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）６）を共通して含むＴＡＭ（Ｔｙｒｏ３－Ａｘｌ－Ｍｅｒ）受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のメンバーである。ＴＡＭファミリーのＲＴＫは、細胞の生存、増殖、オートファジー、遊走、血管新生、血小板凝集およびナチュラルキラー細胞の分化を含め、多種多様な細胞応答を制御する。Ａｘｌは、多くの胚組織で発現し、間葉系および神経系の発達に関与していると考えられており、成人組織での発現は、大部分は平滑筋細胞に限られている（ＭＧＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ；ｗｗｗ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ）。Ａｘｌの活性化は、Ａｋｔ、ＭＡＰキナーゼ、ＮＦ－κＢ、ＳＴＡＴなどを含め、いくつかのシグナルトランスダクション経路に関連している。元々は慢性骨髄性白血病患者に由来するトランスフォーミング遺伝子として同定されたＡｘｌは、以前から種々の悪性度の高い癌と関係があり、予後不良と相関関係にあるとされてきた。
Ａｘｌ受容体の過剰発現は、広範囲の固形腫瘍および骨髄性白血病で検出されてきた（Ｌｉｎｇｅｒら、Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１００：３５、２００８；Ｌｉｎｇｅｒら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ．１４：１０７３、２０１０）。
Ａｘｌ発現は、悪性進行と相関関係にあり、膵臓癌（Ｓｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ．１１７：７３４、２０１１）、前立腺癌（Ｐａｃｃｅｚら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．３２：６９８、２０１３）、肺癌（Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ．２０１２；Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４４：８５２、２０１２）、乳癌（Ｇｊｅｒｄｒｕｍ、Ｐｒｏｃ ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：１１２４、２０１０）、結腸癌（Ｙｕｅｎら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、８：ｅ５４２１１、２０１３）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｂｅｎ－Ｂａｔａｌｌａら、Ｂｌｏｏｄ １２２：２４４３、２０１３）を含め、いくつかの悪性腫瘍における患者の全生存期間が高リスクであることの独立した予測因子である。
Ａｘｌシグナルトランスダクションは、腫瘍に関連するマクロファージ（Ｌｏｇｅｓら、Ｂｌｏｏｄ．１１５：２２６４、２０１０）または自己分泌機構（Ｇｊｅｒｄｒｕｍ、Ｐｒｏｃ ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：１１２４、２０１０）によって分泌されるタンパク質リガンド（Ｇａｓ６）によって活性化され、例えば、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）－ＡＫＴ、特にＡＫＴおよび分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路（Ｋｏｒｓｈｕｎｏｖ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２：３６１、２０１２）を介し、受容体の二量化、自己リン酸化および下流のシグナル伝達を推進する。他のチロシンキナーゼ受容体、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）とのヘテロ二量体化も起こることが報告されている（Ｌｉｎｇｅｒら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ．１４：１０７３、２０１０；Ｍｅｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ６：ｒａ６６、２０１３）。
腫瘍細胞におけるＡｘｌの異常な活性化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの標的治療に対する薬物耐性獲得と広く関係がある（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４４：８５２、２０１２；Ｂｙｅｒｓら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：２７９、２０１３）。Ａｘｌを標的とする薬剤は、トリプルネガティブ乳癌、ホルモン抵抗性前立腺癌および肺腺癌を含むいくつかの実験癌モデルにおいて、ＥＭＴ／ＣＳＣの特徴を逆転させることによって、腫瘍の生成、転移をブロックし、薬物耐性（例えばエルロチニブに対する）をなくす（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０：１５４４、２０１０；Ｇｊｅｒｄｒｕｍ、Ｐｒｏｃ ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：１１２４、２０１０；Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４４：８５２、２０１２；Ｐａｃｃｅｚら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．３２：６９８、２０１３）。
Ａｘｌおよび抗Ａｘｌ抗体に関連する他の用途としては、ＥＰ２２６７４５４Ａ２号［Ａｘｌ・・・を測定する癌細胞浸潤の診断および予防－Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ］；ＷＯ２００９０６３９６５号［抗Ａｘｌ－Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ］；ＷＯ２０１１１５９９８０Ａ１号［抗Ａｘｌ－Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］、ＷＯ２０１１０１４４５７Ａ１号［ＡｘｌとＶＥＧＦアンタゴニストの併用治療－Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００９）２８、３４４２－３４５５、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０１０）２９、５２５４－５２６４［抗Ａｘｌ－Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］；ＷＯ２０１２－１７５６９１Ａ１号［抗Ａｘｌ ２０Ｇ７－Ｄ９－ＩＮＳＥＲＭ］、ＷＯ２０１２－１７５６９２Ａ１号［抗Ａｘｌ ３Ｅ３－Ｅ８－ＩＮＳＥＲＭ］、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３３、５４０５－５４１４（２０１４年１１月２０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｏｎｃ．２０１３．４８７）；ＷＯ２００９／０６２６９０Ａ１号［抗Ａｘｌ－Ｕ３ Ｐｈａｒｍａ］およびＷＯ２０１０／１３０７５１Ａ１号［ヒト化抗Ａｘｌ－Ｕ３ Ｐｈａｒｍａ］が挙げられる。
上述の文書に記載される抗Ａｘｌ抗体は、多様な特性を有している。例えば、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００９）２８、３４４２－３４５５は、３Ｇ９、８Ｂ５および１２Ａ１１と命名されたＧｅｎｅｎｔｅｃｈからの３種類の抗Ａｘｌ抗体を記載している。この著者らは、３種類全ての抗体がＡｘｌ発現のダウンレギュレーションを誘発するが、３Ｇ９と８Ｂ５のみが、Ａｘｌ受容体に対するリガンド結合をブロックすることを報告している（同上、ページ３４５３、右側の欄、上側を参照）。同じ著者らの多くによる、さらに最近の論文（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０１０）２９、５２５４－５２６４）は、リガンド結合をブロックする抗体（ＹＷ３２７．６Ｓ２）が、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植腫瘍成長を弱め、抗ｖＥＧＦ治療の効果を高めることができ、一方、１２Ａ１１抗体はそうではないことを報告している（同上、図４を参照）。
別の例では、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３３、５４０５－５４１４（２０１４年１１月２０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｏｎｃ．２０１３．４８７）に記載される「Ｄ９」抗体および「Ｅ８」抗体は、成長停止特異的因子６（ＧＡＳ６）の結合に影響を与えることなく、Ａｘｌのリン酸化およびその下流の標的ＡＫＴのリン酸化を阻害することを報告している（同上、要約を参照）。同じ著者らは、ＷＯ２０１６／０９１８９１号において、Ｄ４抗体も記載している（この公報の配列番号１および２）。
最後の例では、ＷＯ ２００９０６２６９０ Ａ１号に記載される１１Ｂ７抗体が、受容体Ａｘｌに対するＧＡＳ６リガンドの結合を阻害することは報告されていない。
腫瘍形成におけるＡｘｌの役割という観点で、Ａｘｌに特異的に結合する有利な特性を有するさらなる抗体を同定することが望ましい。本開示は、このような抗体に関するものである。
キメラＭＡｂ １０Ｇ５と、組換えヒト（ｒｈ）Ａｘｌ、ｒｈＭｅｒおよびｒｈＴｙｒｏ３との相互作用を示す結合分析から得たセンサーグラムのオーバーレイプロット。ブランク表面シグナルを引き算した後の曲線を示している。 ｒｈＡｘｌ、組換えマウス（ｒｍ）ＡｘｌおよびｒｈＴｙｒｏ３でコーティングされたセンサチップＣＭ５と相互作用するリガンド（マウスＭＡｂ １０Ｇ５およびｒｍＧａｓ６）のＢｉａｃｏｒｅ分析。ブランク表面シグナルを引き算した後の曲線を示している。 組換えヒトＡｘｌ（ｒｈＡｘｌ）およびカニクイザル由来のＡｘｌ抗原（ｃｙｎｏ－Ａｘｌ）でコーティングされたセンサチップＣＭ５と相互作用するリガンド（マウスＭＡｂ １０Ｇ５）のＢｉａｃｏｒｅ分析。ブランク表面シグナルを引き算した後の曲線を示している。 Ｂｉａｃｏｒｅセンサチップの表面に固定されたｒｈＡｘｌと相互作用するマウスＭＡｂ １０Ｇ５の速度論的分析。さまざまな抗体濃度（マウス１０Ｇ５について０．３～１６６．７ｎＭ）についてのセンサーグラムのオーバーレイプロットを示している。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアと、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに従うカーブフィッティングを用い、正確な速度論的分析を行った。親和定数（動的状態および定常状態）と、２５℃での抗原結合半減期の計算値を以下の表１に示す。
Figure 0007071935000001
 Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００を用いた、マウス ＭＡｂ １０Ｇ５（第１のサンプル）と、抗Ａｘｌ ＭＡｂ ＭＡＢ１５４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウス抗体１０Ｇ５、ｒｈＧａｓ６およびｒｍＧａｓ６（第２のサンプル）との競合分析。さまざまな第２のサンプルを用いたセンサーグラムのオーバーレイプロットを示している。第１のサンプル（マウス１０Ｇ５）および第２のサンプルの注射開始点を矢印で示している。 三次元（３Ｄ）の器官型腫瘍塊での成長に対する抗Ａｘｌ抗体の効果。侵攻性が高いヒト乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を、細胞外マトリックス存在下で成長させつつ、コントロールＩｇＧ（中央上側のパネルに示される）または抗Ａｘｌ ＭＡｂ（下側パネル）のいずれかで処理し、３Ｄの器官型モデルを作成する。ポジティブコントロールとして、Ａｘｌ発現をノックダウンしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を示している。 確立された３Ｄの器官型腫瘍塊に対する抗Ａｘｌ抗体マウス１０Ｇ５の影響。ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）の進行９日目の星形の３Ｄの器官型腫瘍塊を、コントロールＩｇＧまたは抗Ａｘｌ抗体マウス１０Ｇ５のいずれかで７２時間処理した。明視野を用いて画像をキャプチャーした。矢印は、アポトーシスを示し、星形の細胞を分解している。 Ａｘｌ受容体発現に対するマルチキナーゼ阻害剤フォレチニブのいずれかの抗体を用いた処理の効果を示すウエスタンブロット分析。侵攻性が高いヒト乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を、抗体（無関係なＩｇＧコントロール、抗Ａｘｌ ＭＡｂマウス１０Ｇ５およびＭＡｂ３番）またはフォレチニブのいずれかで２４時間処理した後、ＳＤＳ－ＰＡＡゲルにロードした。アクチンタンパク質のレベルをローディングコントロールとして使用した。 マウスモノクローナル抗体であるマウス１０Ｇ５存在下、Ｇａｓ６が介在するＡｘｌシグナル伝達の阻害を示すウエスタンブロット分析。Ｓｅｒ４７３上のＡｋｔのリン酸化を、Ａｘｌ活性のためのサロゲート読み出しとして使用した。Ｍ、分子量マーカー。全細胞溶解物のイムノブロットを、ローディングコントロールとして抗ホスホ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）または抗ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）でプローブ化した。 抗Ａｘｌモノクローナル抗体１０Ｇ５から誘導されるヒト化したＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列。重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域に下線が引かれている。 Ａｘｌ陽性細胞に対する抗体１０Ｇ５（ｃ１０Ｇ５）のキメラバリアントの用量依存性結合。トリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する結合についてのフローサイトメトリーにおいて、さまざまな濃度のキメラ抗体を試験した。結合したキメラ抗体を、マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００希釈）またはヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：３００希釈）のいずれかにそれぞれ特異的なＡＰＣ接合したロバＦ（ａｂ’）２フラグメント（両方ともＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ製）を用いて検出した。Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、細胞染色を測定した。ＭＦＩ、幾何平均蛍光強度。 キメラ抗体ｃ１０Ｇ５およびそのマウス相当物と組換えヒト（ｒｈ）Ａｘｌとの相互作用を示す、Ｂｉａｃｏｒｅ結合分析からのセンサーグラムのオーバーレイプロット。ブランク表面シグナルを引き算した後の曲線を示している。 Ｂｉａｃｏｒｅセンサチップの表面に固定されたｒｈＡｘｌと相互作用するキメラ抗体ｃ１０Ｇ５の速度論的分析。さまざまな抗体濃度（ｃ１０Ｇ５について０．３～１６６．７ｎＭ）についてのセンサーグラムのオーバーレイプロットを示している。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアと、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに従うカーブフィッティングを用い、正確な速度論的分析を行った。親和定数（動的状態および定常状態）と、２５℃での抗原結合半減期の計算値を以下の表２に示す。
Figure 0007071935000002
 キメラ抗体１０Ｇ５によるＡ５４９異種移植腫瘍成長の阻害。平均腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したときから開始して、この抗体を腹腔内に２０ｍｇ／ｋｇで週に２回投与した。ビヒクル（滅菌ＰＢＳ）またはキメラ１０Ｇ５のいずれかで治療した群についての腫瘍成長曲線を示している。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。二元配置ＡＮＯＶＡを用い、統計分析を行った。＊＊、Ｐ＜０．０１。 キメラ抗体１０Ｇ５によるＭｖ４－１１異種移植腫瘍成長の阻害。平均腫瘍サイズが２００ｍｍ３に達したときから開始して、この抗体を腹腔内に３０ｍｇ／ｋｇで週に２回投与した。ビヒクル（滅菌ＰＢＳ）またはキメラ１０Ｇ５のいずれかで治療した群についての腫瘍成長曲線を示している。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。二元配置ＡＮＯＶＡを用い、統計分析を行った。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 実施例１６からのデータ。抗体Ｇｌｙｍａｘ－ｃ１０Ｇ５は、ｃ１０Ｇ５と比較して、Ａ５４９腫瘍の成長を有意に弱めた（二元配置ＡＮＯＶＡによって決定される場合、Ｐ＜０．０００１）。キメラ１０Ｇ５の野生型および脱フコシル化態様における活性の有意な差は、腫瘍成長の阻害における抗体依存性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）の重要性を示している。 実施例１７からのデータ。ｈｕ１０Ｇ５ Ｈ２Ｌ１抗体は、コントロールと比較して、Ａ５４９腫瘍の成長を有意に弱めた（二元配置ＡＮＯＶＡによって決定される場合、Ｐ＜０．０５１）。２週間の治療の後、ほぼ２５％の阻害が観察された。 実施例１８からのデータ。ｈｕ１０Ｇ５（Ｈ１Ｌ１－ＧＬＹＭＡＸＸ）抗体は、抗ＥＧＦＲ治療抗体セツキシマブ（エルビタックス）の抗腫瘍効果と同様の中程度の抗腫瘍活性を示した。両抗体の組み合わせによって、アイソタイプコントロールで治療した動物と比較したときに、有意な腫瘍成長の遅れが生じた（二元配置ＡＮＯＶＡによって決定される場合、Ｐ＜０．０００１）。ｈｕ１０Ｇ５（Ｈ１Ｌ１－ＧＬＹＭＡＸＸ）またはエルビタックスのいずれかを単独で用いて治療した群と比較しても、併用した影響が有意であった（二元配置ＡＮＯＶＡによって決定される場合、Ｐ＜０．０５）。 Ａｘｌ陽性細胞に対するヒト化抗体１０Ｇ５（ｃ１０Ｇ５）の用量依存性の結合（図１９Ａ）。Ｂｉａｃｏｒｅセンサチップの表面に固定されたｒｈＡｘｌと相互作用するヒト化抗体の速度論的分析（図１９Ｂ）。実験の詳細は、実施例１９に与えられる。 抗体－サポリン接合体を用いた腫瘍細胞殺滅。キメラ１０Ｇ５および２種類のヒト化１０Ｇ５バリアントの比較。実験の詳細は、実施例２０に与えられる。 Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる、第１のサンプルとしてのＭＡｂ ｃ１０Ｇ５またはＹＷ３２７．６Ｓ２－ｖａｒと第２のサンプルとしてのＭＡｂ ＹＷ３２７．６Ｓ２－ｖａｒとの間の結合競合を示すオーバーレイプロット（図２１Ａ）。図２１Ｂは、ＹＷ３２７．６Ｓ２－ｖａｒを第１のサンプルとして注射した後、ＭＡｂ ＹＷ３２７．６Ｓ２－ｖａｒまたはｃ１０Ｇ５を第２のサンプルとして注射したときの競合の結果を示す。 Ｇａｓ６または架橋抗体によるＡｘｌの活性化によって、Ａｋｔのリン酸化が起こる。キメラ１Ｈ１２と架橋することによるＡｘｌシグナル伝達の刺激によって、組換えＡｘｌリガンドＧａｓ６を用いた刺激よりもＡｋｔを強く活性化する（ａ）。ｍＡｂ １Ｈ１２を用いて架橋することによるＡｘｌシグナル伝達の刺激は、ＢＧＢ３２４を用いて阻害することができる（ｂ）。 抗Ａｘｌ抗体１０Ｇ５およびＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒによる線維化マーカーの阻害。各棒グラフは、ｘ軸に対して、表題のマーカーの相対的なｍＲＮＡ発現を報告している。ｙ軸には、ｍＲＮＡ定量化の前にＬＸ２細胞の集合と共にインキュベートした抗体が示されている。１Ｈ１２＝Ａｘｌの自己リン酸化および活性化を引き起こすクラスタリング抗Ａｘｌ抗体。１０Ｇ５＝本明細書に記載するＢｅｒＧｅｎＢｉｏの抗Ａｘｌ。ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ＝本明細書で参照されるＧｅｎｅｎｔｅｃｈの抗Ａｘｌ。 実施例２２に記載されるように、ＧｌｙｍａｘＸ－ｃ１０Ｇ５、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ （ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ）由来の抗Ａｘｌヒト抗体のバリアントのいずれかで治療したマウスにおける個々の腫瘍の腫瘍成長を示すプロット。
本開示は、症例と好ましい特徴の組み合わせが明らかに許容されないか、または明示的に避けられている場合を除き、記載される症例と好ましい特徴の組み合わせを含む。
本明細書に使用される章の見出しは、単に構成的にまとめるためのものであり、記載される特定事項を限定するものと解釈すべきではない。
ここに、添付の図面を参照しつつ、実施例によって、本開示の症例および実施形態を示す。さらなる症例および実施形態は、当業者には明らかであろう。本文書で述べられる全ての文献は、本明細書に参考として組み込まれる。
以下の特許請求の範囲を含め、本明細書全体で、その内容が他の意味であることを必要とする場合を除き、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」との用語および「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形語は、述べられている整数または工程、または整数または工程の群を含むことを暗に示しているが、任意の他の整数または工程、または整数または工程の群を除外しないものであると理解されるだろう。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その内容が明らかに他の意味を示していない限り、複数の対象物を含むことを注記しておかねばならない。範囲は、本明細書で「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表されてもよい。このような範囲が表されている場合、別の実施形態は、そのある特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が概算値として表されている場合、「約」を前に付けて使用することによって、その特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるだろう。
本発明は、Ａｘｌタンパク質に結合し、ＡｘｌのそのリガンドＧａｓ６に対する結合を阻害するヒト化抗体を提供する。抗体は、好ましくは、さらに、Ａｘｌ発現をダウンレギュレーションし、Ａｘｌ受容体シグナル伝達を阻害し、および／または腫瘍成長を阻害する。
本発明には、Ａｘｌに結合し、ＡｘｌのそのリガンドＧａｓ６に対する結合を阻害するこのようなヒト化抗体の具体例が開示されている。これらの抗体は、本明細書に開示するＧＨ１、ＧＨ２、ＧＬ１およびＧＬ２ドメインから選択される可変重鎖（ＶＨ）ドメインと可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む。第１の実施形態では、抗体は、ＧＨ１とＧＬ１とを含む。第２の実施形態では、抗体は、ＧＨ２とＧＬ１とを含む。第３の実施形態では、抗体は、ＧＨ１とＧＬ２とを含む。第４の実施形態では、抗体は、ＧＨ２とＧＬ２とを含む。
好ましくは、抗体は、ＡｘｌのそのリガンドＧａｓ６に対する結合を阻害する。さらになお好ましくは、抗体は、さらに、Ａｘｌ発現をダウンレギュレーションし、Ａｘｌ受容体シグナル伝達を阻害し、および／または腫瘍成長を阻害する。
本明細書に記載する抗体と同じＣＤＲと結合特異性を有する抗体が、ＷＯ２０１６／０９７３７０号に記載されている。しかし、本明細書に記載する特異的なＶＨ配列とＶＬ配列とを含む抗体は、ＷＯ２０１６／０９７３７０号に例示されるマウス抗体およびキメラ抗体と比較して、優れた特性を有することがわかっている。具体的には、本明細書に記載する抗体は、有利なことに、ＷＯ２０１６／０９７３７０号に例示されるマウス抗体およびキメラ抗体と比較して、結合親和性および細胞死滅活性が増加している。
本明細書に開示する抗体と、ＷＯ２０１６／０９７３７０の抗体が、同じＣＤＲ配列を共に有しており、それどころか、これらの天然のフレームワークから外に出てヒトフレームワークへのマウスＣＤＲの移動が、抗体の結合特性を下げてしまうと予想されたため、これらの優れた特性は、驚くべきことである。
さらに、本明細書に開示するヒト化１０Ｇ５抗Ａｘｌ抗体と、従来の抗Ａｘｌ抗体との比較は、ヒト化１０Ｇ５抗Ａｘｌ抗体の多くの利点を強調するものであり、例えば、
・１０Ｇ５抗体は、新規Ａｘｌエピトープに結合し、従来の抗体と組み合わせて使用することができる。
・上述のように、１０Ｇ５は、ＡｘｌのそのリガンドＧａｓ６に対する結合を阻害し、試験した従来技術の抗体のうち、ＹＷ３２７．６Ｓ２だけがこの特性を有していた。
・１０Ｇ５と共にインキュベートすると、Ａｘｌ自己リン酸化のレベルによって測定されるように、Ａｘｌ活性化を阻害する。対照的に、ＹＷ３２７．６Ｓ２と共にインキュベートすると、Ａｘｌ活性化のレベルが増加する。
・線維性疾患モデルにおいて、１０Ｇ５と共にインキュベートすると、Ａｘｌ活性化と線維化マーカーの発現を阻害した。これとは対照的に、ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ抗体と共にインキュベートすると、線維化マーカーの発現レベルが上昇した。
・１０Ｇ５は、ＹＷ３２７．６Ｓ２よりも低い交差反応性を有する（ＹＷ３２７．６Ｓ２は、マウスＡｘｌと交差反応し、一方、１０Ｇ５は交差反応しない）。このことにより、ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、腫瘍対宿主細胞に対する抗体の影響を分離することができる。
・１０Ｇ５は、マウス異種移植癌モデルにおいて、ＹＷ３２７．６Ｓ２に対する同様の有効性を有するが、マウス宿主細胞に対する影響はない。ヒト被験体において、１０Ｇ５は、宿主細胞も標的とし、さらなる治療効果を有する。
これらの利点を以下にさらに詳細に記載し、実験の詳細は、実施例２１および２２に与えられている。
（配列）
以下の配列が本明細書で開示される（全配列については、以下の「配列」の章を参照）。
配列番号１→ヒト化１０Ｇ５ ＶＨドメインＧＨ１のアミノ酸
配列番号２→ヒト化１０Ｇ５ ＶＨドメインＧＨ２のアミノ酸
配列番号３→ヒト化１０Ｇ５ ＶＬドメインＧＬ１のアミノ酸
配列番号４→ヒト化１０Ｇ５ ＶＬドメインＧＬ２のアミノ酸
配列番号５→重鎖定常領域の例のアミノ酸
配列番号６→１０Ｇ５ ＧＨ１重鎖のアミノ酸
配列番号７→１０Ｇ５ ＧＨ２重鎖のアミノ酸
配列番号８→軽鎖定常領域のアミノ酸
配列番号９→１０Ｇ５ ＧＬ１軽鎖のアミノ酸
配列番号１０→１０Ｇ５ ＧＬ２軽鎖のアミノ酸
配列番号１１→ヒト化１０Ｇ５ ＶＨドメインＧＨ１の核酸
配列番号１２→ヒト化１０Ｇ５ ＶＨドメインＧＨ２の核酸
配列番号１３→ヒト化１０Ｇ５ ＶＬドメインＧＬ１の核酸
配列番号１４→ヒト化１０Ｇ５ ＶＬドメインＧＬ２の核酸
配列番号１５→重鎖定常領域の例の核酸
配列番号１６→１０Ｇ５ ＧＨ１重鎖の核酸
配列番号１７→１０Ｇ５ ＧＨ２重鎖の核酸
配列番号１８→軽鎖定常領域の核酸
配列番号１９→１０Ｇ５ ＧＬ１軽鎖の核酸
配列番号２０→１０Ｇ５ ＧＬ２軽鎖の核酸
配列番号２１→ヒトＡｘｌをコードするアミノ酸配列
配列番号２２→マウスＡｘｌをコードするアミノ酸配列
配列番号２３→ヒトＴｙｒｏ３をコードするアミノ酸配列
配列番号２４→ヒトＭｅｒをコードするアミノ酸配列
配列番号２５→ヒトＡｋｔ３をコードするアミノ酸配列
配列番号２６→ヒトＧａｓ６をコードするアミノ酸配列
配列番号２７→「Ｃｙｎｏ－Ａｘｌ」をコードするアミノ酸配列
配列番号２８→マウス１０Ｇ５ ＶＨドメイン
配列番号２９→マウス１０Ｇ５ ＶＬドメイン
配列番号３０→１０Ｇ５ ＶＨ ＣＤＲ１
配列番号３１→１０Ｇ５ ＶＨ ＣＤＲ２
配列番号３２→１０Ｇ５ ＶＨ ＣＤＲ３
配列番号３３→１０Ｇ５ ＶＬ ＣＤＲ１
配列番号３４→１０Ｇ５ ＶＬ ＣＤＲ２
配列番号３５→１０Ｇ５ ＶＬ ＣＤＲ３
本発明の一態様では、Ａｘｌに結合し、
ヒト化１０Ｇ５ ＶＨドメインＧＨ１（配列番号１）、ヒト化１０Ｇ５ ＶＨドメインＧＨ２（配列番号２）、および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３と、場合により配列番号３１および配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＨ ＣＤＲを含むＶＨドメインからなる群から選択される抗体ＶＨドメイン；および／または
ヒト化１０Ｇ５ ＶＬドメインＧＬ１（配列番号３）、ヒト化１０Ｇ５ ＶＬドメインＧＬ２（配列番号４）、および配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメインからなる群から選択される抗体ＶＬドメインを含む、抗体が提供される。
例えば、抗体は、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む抗体ＶＨドメインを含んでいてもよい。抗体は、さらに、配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む抗体ＶＬドメインを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む抗体ＶＨドメインと、（ｉｉ）配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む抗体ＶＬドメインとを含む。
一態様では、本発明は、Ａｘｌに結合し、１０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ１）ドメイン（配列番号１）または１０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ２）ドメイン（配列番号２）を含む、単離された抗体を提供する。好ましくは、結合したＡｘｌは、ヒトＡｘｌである。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＧＨ１）ドメイン（配列番号１）または１０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ２）ドメイン（配列番号２）が、１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ１）ドメイン（配列番号３）と対を形成し、その結果、１０Ｇ５ ＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体の抗原結合部位が作られる。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＧＨ１）ドメイン（配列番号１）または１０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ２）ドメイン（配列番号２）が、１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ２）ドメイン（配列番号４）と対を形成し、その結果、１０Ｇ５ ＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体の抗原結合部位が作られる。
いくつかの実施形態では、抗体は、ＶＨ（ＧＨ１）ドメイン（配列番号１）と１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ１）ドメイン（配列番号３）とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＶＨ（ＧＨ１）ドメイン（配列番号１）と１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ２）ドメイン（配列番号４）とを含む。
好ましい実施形態では、抗体は、ＶＨ（ＧＨ２）ドメイン（配列番号２）と、１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ１）ドメイン（配列番号３）とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＶＨ（ＧＨ２）ドメイン（配列番号２）と、１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ２）ドメイン（配列番号４）とを含む。
他の実施形態では、１０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ１）ドメイン（配列番号１）または１０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ２）ドメイン（配列番号２）が、１０Ｇ５ ＶＬ以外のＶＬドメインと対を形成し、軽鎖の多種類混合は、当該技術分野で十分に確立されている。
いくつかの実施形態では、抗体は、さらに、重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、配列番号５で提示される配列を有する。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、Ａｘｌに結合し、１０Ｇ５ ＧＨ１重鎖（配列番号６）または１０Ｇ５ ＧＨ２重鎖（配列番号７）を含む、単離された抗体を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体は、さらに、軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域は、配列番号８で提示される配列を有する。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、Ａｘｌに結合し、１０Ｇ５ ＧＬ１軽鎖（配列番号９）または１０Ｇ５ ＧＬ２軽鎖（配列番号１０）を含む、単離された抗体を提供する。
いくつかの実施形態では、１０Ｇ５ ＧＨ１重鎖（配列番号６）または１０Ｇ５ ＧＨ２重鎖（配列番号７）が、１０Ｇ５ ＧＬ１軽鎖（配列番号９）と対を形成し、その結果、１０Ｇ５ ＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体の抗原結合部位が作られる。
いくつかの実施形態では、１０Ｇ５ ＧＨ１重鎖（配列番号６）または１０Ｇ５ ＧＨ２重鎖（配列番号７）が、１０Ｇ５ ＧＬ２軽鎖（配列番号１０）と対を形成し、その結果、１０Ｇ５ ＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体の抗原結合部位が作られる。
好ましい実施形態では、抗体は、１０Ｇ５ ＧＨ２重鎖（配列番号７）と１０Ｇ５ ＧＬ１軽鎖（配列番号９）とを含む。別の実施形態では、抗体は、１０Ｇ５ ＧＨ２重鎖（配列番号７）と１０Ｇ５ ＧＬ２軽鎖（配列番号１０）とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、１０Ｇ５ ＧＨ１重鎖（配列番号６）と１０Ｇ５ ＧＬ１軽鎖（配列番号９）とを含む。別の実施形態では、抗体は、１０Ｇ５ ＧＨ１重鎖（配列番号６）と１０Ｇ５ ＧＬ２軽鎖（配列番号１０）とを含む。
好ましくは、抗体は、ヒトＡｘｌに対する結合について、１０Ｇ５ ＶＨドメイン（配列番号１２）と１０Ｇ５ ＶＬドメイン（配列番号１３）とを含む抗体のＡｘｌ結合ドメインと競合する。
好ましくは、抗体は、ＷＯ２０１６／０９７３７０号に記載されるような、ハイブリドーマＷＲ－１０Ｇ５－Ｅ５から得ることができる抗体によって結合されるエピトープに結合する。
好ましくは、抗体は、ＡｘｌのそのリガンドＧａｓ６に対する結合を阻害する。より好ましくは、抗体は、さらに、Ａｘｌ発現をダウンレギュレーションし、Ａｘｌ受容体のシグナル伝達を阻害し、および／または腫瘍成長を阻害する。
抗体の配列に加えて、本発明の抗体は、他のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド、例えば、折り畳まれたドメインを形成するもの）、または抗原に結合する能力に加えて別の機能的特徴を分子に付与するための他のアミノ酸を含んでいてもよい。
本発明の抗体は、検出可能な標識を有していてもよく、または毒素（例えば細胞毒素）、酵素または有機部分に対して（例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して）接合されてもよい。
当業者は、タンパク質に対して分子を化学的に接合するための多くの手法に気づいている。本発明の一実施形態では、抗体は、検出可能な蛍光標識、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、またはレポーター酵素、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に対して接合されてもよい。
好ましい実施形態では、抗体は、抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）の生成と共に、細胞毒性薬物に対して接合される。抗体が医薬使用のためのものである場合、抗体と薬物を接続する結合は、好ましくは、循環（例えば、血液循環）中で安定であるが、接合体が細胞内に捕捉されると不安定になる。したがって、免疫接合体として接合された抗体を、例えば癌を治療する方法で使用してもよい。
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする配列を含む、単離された核酸、および本発明の抗体、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを調製する方法であって、前記抗体、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを産生させる条件下で前記核酸を発現させ、それを回収することを含む方法を提供する。
本発明の抗体を、ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法、例えば、有効な量の本発明の抗体、またはその接合体、またはその薬物－接合体をヒト患者に投与することを含む、ヒト患者において疾患または障害を治療する方法（予防的な治療を含んでいてもよい）に使用してもよい。本発明にしたがって治療可能な状態は、本明細書のいずれかの場所に記載されている状態を含む。
本発明の抗体を、例えば抗体が結合する細胞の存在または位置を決定するために、画像化する方法で使用してもよい。
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体と、１つ以上の試薬とを含み、抗原に対する抗体の結合を決定するための診断キットを提供する。
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示する抗体ＶＨ可変ドメイン（配列番号１）、抗体ＶＨ可変ドメイン（配列番号２）、抗体ＶＬ可変ドメイン（配列番号３）および／または抗体ＶＬ可変ドメイン（配列番号４）をコードする核酸、一般的に、単離された抗体を提供する。このような核酸の例は、本明細書の７ページから８ページにわたる配列識別子の説明に提示される通り、本明細書に開示される（上を参照）。例えば、配列番号１１で提示される配列を有する核酸は、配列番号１で提示される配列を有する抗体ＶＨ可変ドメインをコードし、配列番号１２で提示される配列を有する核酸は、配列番号２で提示される配列を有する抗体ＶＨ可変ドメインをコードする、など。
さらなる態様は、本発明の核酸を用いて形質転換された宿主細胞を提供する。
なおさらなる態様は、抗体ＶＨ可変ドメインを産生する方法であって、核酸をコードすることから発現させることを含む方法を提供する。このような方法は、前記抗体ＶＨ可変ドメインを産生するための条件下で宿主細胞を培養することを含んでいてもよい。
ＶＬ可変ドメイン、およびＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む抗体を産生するための類似の方法が、本発明のさらなる態様として提供される。
産生する方法は、産物を単離および／または精製する工程を含んでいてもよい。
産生する方法は、産物を、少なくとも１つのさらなる構成要素、例えば、医薬的に許容される賦形剤を含む組成物に配合することを含んでいてもよい。
本発明のこれらの態様および他の態様を、以下にさらに詳細に記載する。
（ヒト化１０Ｇ５抗体の特性）
（Ａｘｌに対する高い親和性）
本明細書に記載のヒト化１０Ｇ５抗体は、高い親和性でヒトＡｘｌに結合する。表３に示されるように、ヒト化抗体Ｈ１Ｌ１は、配列番号１２のＶＨと配列番号１３のＶＬとを含むキメラ抗体よりも少なくとも３０％小さいＫＤを有する。同様に、ヒト化抗体Ｈ２Ｌ１は、配列番号１２のＶＨと配列番号１３のＶＬとを含むキメラ抗体よりも少なくとも５０％小さいＫＤを有する。
したがって、本明細書に記載されるヒト化１０Ｇ５抗体およびそのバリアントは、高い親和性でＡｘｌに結合する。好ましくは、ヒトＡｘｌは、高い親和性で結合される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のＶＨと配列番号１３のＶＬとを含むキメラ抗体よりも少なくとも１５％小さいＫＤで、例えば、配列番号１２のＶＨと配列番号１３のＶＬとを含むキメラ抗体よりも少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％または少なくとも５０％小さいＫＤでＡｘｌ（またはヒトＡｘｌ）に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、１０－６Ｍ以下、例えば５×１０－７Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、６×１０－１０Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、１．１×１０－１０Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、５×１０－１１Ｍ以下、１０－１１Ｍ以下、５×１０－１２Ｍ以下、６×１０－１２Ｍ以下、１０－１２Ｍ以下、５×１０－１３Ｍ以下、１０－１３Ｍ以下、５×１０－１４Ｍ以下、１０－１４Ｍ以下、５×１０－１５Ｍ以下、または１０－１５Ｍ以下のＫＤで、Ａｘｌ（またはヒトＡｘｌ）に結合する。
いくつかの実施形態では、抗体は、１０－８Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ～１０－１２、１０－１２Ｍ～１０－１４、または１０－１４Ｍ～１０－１６のＫＤで、Ａｘｌ（またはヒトＡｘｌ）に結合する。
ＫＤは、実施例１９に提示されるように決定され、計算されてもよい。
（高い細胞殺滅活性）
本明細書に記載のヒト化１０Ｇ５抗体は、低いＥＣ５０値によって示されるように、高い細胞活性を有する。表４に示されるように、ヒト化抗体Ｈ１Ｌ１は、配列番号１２のＶＨと配列番号１３のＶＬとを含むキメラ抗体よりも少なくとも３５％低いＥＣ５０を有する。同様に、ヒト化抗体Ｈ２Ｌ１は、配列番号１２のＶＨと配列番号１３のＶＬとを含むキメラ抗体よりも少なくとも５０％低いＥＣ５０を有する。
したがって、本明細書に記載されるヒト化１０Ｇ５抗体およびそのバリアントは、高い親和性でＡｘｌに結合する。好ましくは、ヒトＡｘｌは、高い親和性で結合される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のＶＨと配列番号１３のＶＬとを含むキメラ抗体よりも少なくとも１５％低く、例えば、配列番号１２のＶＨと配列番号１３のＶＬとを含むキメラ抗体よりも少なくとも２０％低く、少なくとも２５％低く、少なくとも３０％低く、少なくとも３５％低く、少なくとも４０％低く、少なくとも４５％低く、または少なくとも５０％低いＥＣ５０を有する。
ＥＣ５０は、実施例２０に提示されるように決定され、計算されてもよい。
（特異的な結合）
一般的に、「特異的な」および「特異的に結合する」との用語は、抗体が、その特異的な結合相手以外の分子に対して顕著な結合を示さない状況を指すために使用されてもよい。例えば、ヒトＡｘｌに「特異的に結合する」抗体は、マウスＡｘｌについて顕著な結合を示さないだろう。
この用語は、例えば、ある抗体が、多くの抗原が有する特定のエピトープに特異的な場合にも適用可能であり、この場合、あるエピトープに「特異的に結合する」抗体は、認識されるエピトープを有する種々の抗原の全てに結合することができるだろう。
典型的には、特異性は、結合アッセイ、例えば、抗原のパネルを使用するＥＬＩＳＡを用いることによって決定されてもよい。
本明細書に記載の１０Ｇ５抗体は、高い特異性でヒトＡｘｌに結合する。すなわち、１０Ｇ５抗体は、ヒトＡｘｌに「特異的に結合する」。このことは、実施例で示されており、以下のことが示されている。
（１）実施例２では、１０Ｇ５は、ヒトＴＡＭ受容体型チロシンキナーゼファミリーの他のメンバーであるｈＭｅｒおよびｈＴｙｒｏ３に由来する組換え抗原に対して顕著な結合を示さない。
（２）実施例３では、１０Ｇ５は、ヒトＡｘｌに強く結合するが、マウスＡｘｌに対する結合を示さない（これは、マウスＡｘｌおよびヒトＡｘｌの両方に強く結合し、（これより弱いが）ヒトＴｙｒｏ３に結合するマウスＡｘｌリガンドであるマウスＧａｓ６とは対照的である）。
（３）実施例４では、１０Ｇ５は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来のＡｘｌに強く結合する。
この特異性によって、有利なことに、マウス異種移植ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、マウス宿主細胞に対し、ヒト腫瘍細胞に対する抗体の影響を分離することができる。
したがって、本明細書に記載の抗体は、好ましくは、霊長類Ａｘｌに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトおよびサル（例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＡｘｌに特異的に結合する。一実施形態では、抗体は、ヒトＡｘｌにのみ特異的に結合する。
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＴｙｒｏ３および／またはヒトＭｅｒに対して顕著な結合を示さない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、マウスＡｘｌに対して顕著な結合を示さない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＴｙｒｏ３、ヒトＭｅｒまたはマウスＡｘｌのいずれかに対して顕著な結合を示さない。
ある抗体が、ある抗原に対して「顕著な結合」を示さ「ない」かどうかは、例えば、実施２および３に記載の技術を用い、当業者が容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、特定の抗原に対して、１０－３Ｍより大きく、例えば、１０－２Ｍより大きく、１０－１Ｍより大きく、または１Ｍより大きいＫＤで抗原に結合する場合、「顕著な結合」を示さ「ない」とみなされる。ＫＤは、実施例５に提示されるように決定され、計算されてもよい。
（Ａｘｌ／Ｇａｓ６結合の阻害）
本明細書に記載の１０Ｇ５抗体は、ＡｘｌのそのリガンドＧａｓ６に対する結合を阻害する。
図５は、実施例６に記載する競合結合アッセイの結果を示す。この結果は、固定されたｒｈＡｘｌを１０Ｇ５で飽和すると、このｒｈＡｘｌには、その後に添加された１０Ｇ５、ｒｈＧａｓ６（ｒｈＡｘｌの既知のリガンド）またはｒｍＧａｓ６が結合することができないことを示す。このことは、１０Ｇ５およびＧａｓ６によって結合されるＡｘｌ分子の領域は、互いにすぐそばにあることを示す。対照的に、１０Ｇ５の結合は、ＭＡＢ１５４抗Ａｘｌ抗体の結合を阻害しなかった。このことは、１０Ｇ５とＭＡＢ１５４が、Ａｘｌ分子の別個の部分に結合することを示している。
したがって、好ましい実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ＡｘｌのＧａｓ６に対する結合（例えば、ｒｈＡｘｌのｒｈＧａｓ６に対する結合）を阻害する。すなわち、好ましくは、本明細書に記載の抗体は、ヒトＡｘｌに対する結合について、ヒトＧａｓ６と競合する。最も好ましくは、Ａｘｌ／Ｇａｓ６結合の阻害は、抗体で飽和されたＡｘｌサンプルに対し、Ｇａｓ６の顕著な結合を観察することができない（例えば、以前に抗体にさらされていないＡｘｌサンプルに対して、１％以下の結合が観察される）ようなものである。Ｇａｓ６結合の阻害は、実施例６に記載される競合結合アッセイを用いて評価されてもよい。
（Ａｘｌ受容体発現の阻害）
本発明の抗体は、Ａｘｌの発現を顕著に減少させる。
図８は、実施例９に記載されるウエスタンブロット分析の結果を示し、ここでは、ＭＢＡ－ＭＤ－２３１細胞を、さまざまな抗体の１つと共に一晩インキュベートし、次いで、Ａｘｌ発現について試験している。結果は、１０Ｇ５と共にインキュベートすると、細胞中に存在するＡｘｌ受容体タンパク質の量が顕著に減少することを示しており、このことは、１０Ｇ５抗体の結合が、Ａｘｌ受容体の発現をダウンレギュレーションすることを示している。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌ受容体の発現をダウンレギュレーションする。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗体と接触しない以外は同一の処理をされたサンプルで観察されたレベルの８０％未満まで、Ａｘｌ受容体の発現を減少させる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗体と接触しない以外は同一の処理をされたサンプルで観察されたレベルの７０％未満まで、６０％未満まで、５０％未満まで、４０％未満まで、３０％未満まで、２０％未満まで、または１０％未満まで、Ａｘｌ受容体の発現を減少させる。Ａｘｌ受容体の発現のレベルは、実施例９に記載されるアッセイを用いて評価されてもよい。ウエスタンブロットでのバンドを正確に定量化するための多くの方法が当該技術分野で知られている。例えば、Ｔａｙｌｏｒら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；５５（３）：２１７－２２６を参照。
いくつかの実施形態では、Ａｘｌ受容体の発現のダウンレギュレーションは、迅速に起こる。例えば、いくつかの実施形態では、抗体と接触しない以外は同一の処理をされたサンプルで観察されたレベルの８０％未満までのＡｘｌ受容体の発現の減少が、サンプルと抗体とを接触させて１２時間以内に、例えば、サンプルと抗体を接触させて１２時間以内、６時間以内、３時間以内、または１時間以内に観察される。
いくつかの実施形態では、抗体は、Ａｘｌ受容体の発現を永続的にダウンレギュレーションする。例えば、いくつかの実施形態では、抗体と接触したサンプルにおけるＡｘｌ受容体の発現レベルが、サンプルと抗体とを接触させてから少なくとも６時間、例えば、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間または少なくとも９６時間、前記抗体と接触しない以外は同一の処理をされたサンプルで観察されたレベルの５０％未満にとどまる。
理論によって束縛されることを望まないが、観察されるＡｘｌ発現のダウンレギュレーションは、細胞によってインターナリゼーションされ、分解された抗体／Ａｘｌ受容体複合体によって引き起こされると考えられる。抗体のインターナリゼーションは、標的細胞の中で、抗体、または抗体に連結した分子を得ることが望ましい用途にとって、例えば、標的が癌性細胞であり、抗体が細胞毒性薬物に連結している場合に、非常に有利である。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌ受容体のインターナリゼーション速度を高める。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌ受容体のインターナリゼーション速度を、前記抗体と接触しない以外は同一の処理をされたサンプルで観察されたレベルの少なくとも１１０％まで高める。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌ受容体のインターナリゼーション速度を、前記抗体と接触しない以外は同一の処理をされたサンプルで観察されたレベルの少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％まで高める。
Ａｘｌ受容体のインターナリゼーションのレベルは、当該技術分野で知られている受容体インターナリゼーションアッセイのいずれか１つ、例えば、Ｋｏｅｎｉｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２５９、２００４、ｐｐ２４９－２７３に記載される方法を用いて評価されてもよい。
（Ａｘｌ活性化の阻害）
本発明の抗体は、Ａｘｌの自己リン酸化のレベルによって評価されるように、Ａｘｌ活性化を顕著に低下させる。
実施例２２は、Ｈ２Ｌ１調製物またはＢＧＢ３２４のいずれかが存在する状態でＧａｓ６を用いて刺激を受けた細胞由来の溶解物が、Ｇａｓ６によって刺激を受けたコントロール細胞のｐＡＸＬの読み（０．０７７）よりも有意に低いｐＡＸＬの読み（０．０４０、０．０５５、０．０４５）を与えたことを示す。Ｈ２Ｌ１－ＥｖｉｔｒｉａおよびＢＧＢ３２４は、特に低く、この読みは、飢餓状態のコントロール（０．４４）に匹敵する。
対照的に、ｐＡｘｌの結果は、ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ抗体が、Ａｘｌの自己リン酸化を強く活性化することを示し、ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ単独だと、Ｇａｓ６によって刺激を受けたコントロール細胞のｐＡｘｌの読み（０．０７７）よりも高いｐＡｘｌの読み０．０９２を与える。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、Ｇａｓ６による刺激の後のＡｘｌの自己リン酸化を阻害する。抗体と共にインキュベートした後にＧａｓ６の刺激から生じるＡｘｌの自己リン酸化のレベルは、Ｇａｓ６刺激の前に抗Ａｘｌ抗体と共にインキュベートしていないコントロールのレベルの５０％以下、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、７５％以下、８０％以下、８５％以下、または９０％以下であってもよい。Ａｘｌの自己リン酸化のレベルは、実施例２２に記載されるように評価されてもよい。
（Ａｘｌ受容体シグナル伝達の阻害）
本発明の抗体が、（１）天然リガンド、例えばＧａｓ６に対するＡｘｌ受容体の結合を阻害し、（２）Ａｘｌ受容体の発現をダウンレギュレーションするという観察結果と一致して、本発明の抗体は、Ａｘｌ受容体の下流のリガンドによって誘発されるシグナル伝達を阻害する。このことは図９に示されており、１０Ｇ５抗体が存在すると、Ａｋｔのセリン４７３が、ＡｘｌリガンドＧａｓ６を付加するときにリン酸化される程度が有意に減少することがわかるだろう。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌ活性を阻害する。阻害された活性は、構成的なＡｘｌ活性であってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌの下流のシグナル伝達（例えば、セリン４７３にあるＡｋｔのリン酸化）を阻害する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体と接触したサンプル中のセリン４７３にあるＡｋｔのリン酸化は、前記抗体と接触しない以外は同一の処理をされたサンプルで観察されたレベルの８０％未満である。いくつかの実施形態では、本発明の抗体と接触したサンプル中のセリン４７３にあるＡｋｔのリン酸化は、前記抗体と接触しない以外は同一の処理をされたサンプルで観察されたレベルの７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満である。セリン４７３にあるＡｋｔのリン酸化のレベルは、実施例１０に記載されるアッセイを用いて評価されてもよい。ウエスタンブロットでのバンドを正確に定量化するための多くの方法が当該技術分野で知られている。例えば、Ｔａｙｌｏｒら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；５５（３）：２１７－２２６を参照。
Ａｘｌ受容体のシグナル伝達を阻害するという観点で、本発明の抗体は、Ａｘｌ－受容体シグナル伝達が何らかの役割を果たすさまざまなプロセスに影響を与えることも予想される。
例えば、Ａｘｌ－受容体シグナル伝達が、Ｇａｓ６依存性の細胞増殖を刺激し、細胞死を阻害し、それにより、腫瘍成長を補助することが知られている。Ａｘｌ－受容体シグナル伝達が、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を刺激し、それにより、腫瘍の転移を促進することも知られている。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、細胞死を、例えばアポトーシスによって促進する。好ましくは、この細胞は、腫瘍細胞であり、例えば、循環腫瘍細胞または転移性細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、細胞死の速度を、前記抗体と接触しない以外は同一の処理をされたサンプルで観察されたレベルの少なくとも１１０％まで高める。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、細胞死の速度を、前記抗体にさらされない以外は同一の処理をされたサンプルで観察されたレベルの少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％まで高める。細胞死の速度は、例えば、ＢｒｄＵ組み込みアッセイ、ＭＴＴ、［３Ｈ］－チミジン組み込み（例えば、ＴｏｐＣｏｕｎｔアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））、細胞生存能力アッセイ（例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ＤＮＡフラグメント化アッセイ、カスパーゼ活性化アッセイ、トリプタンブルー排除、クロマチン形態アッセイなどによって測定されてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌの下流のシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ｇａｓ６依存性細胞増殖を阻害する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、腫瘍に関連するマクロファージからの炎症性サイトカインの発現を阻害する。
（線維化障害の阻害）
Ａｘｌ活性化、発現および受容体シグナル伝達を減少させる際の１０Ｇ５の示されている特性と一致して、１０Ｇ５は、線維性疾患モデルにおける炎症マーカーおよび線維化マーカーの発現を減らすことも示されている。
線維化マーカーに対する有利な効果は、抗Ａｘｌ抗体の一般的な特徴ではなく、１０Ｇ５がＹＷ３２７．６Ｓ２と比較される実施例２２で示されるように、他の抗Ａｘｌ抗体は、Ａｘｌに対するＧａｓ６の結合を阻害することが示されている。
実施例２２では、Ａｘｌ活性化の前に１０Ｇ５で処理された細胞は、４種類全てのアッセイしたマーカーについて一貫した発現レベルを示し、このレベルは、刺激を受けていないコントロール細胞と同様であった。対照的に、ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ抗体を用いて前処理した後、Ａｘｌ刺激後の４種類全てのアッセイしたマーカーについて、上昇した発現レベルが観察された。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、線維化障害の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、線維化マーカー、例えば、α－ＳＭＡ、Ｃｏｌ１Ａ１、ＭＣＰ１および／またはＴＧＦ－βの発現を阻害するか、または減らす。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、線維化マーカーα－ＳＭＡ、Ｃｏｌ１Ａ１、ＭＣＰ１およびＴＧＦ－βの発現を阻害するか、または減らす。
（腫瘍成長の阻害）
腫瘍成長におけるＡｘｌおよびＥＭＴ経路の役割と一致して、本発明の抗体は、血液腫瘍および非血液腫瘍の両方の成長速度を下げる。このことは、実施例１４および１５に記載される方法によって得られ、図１４および１５に示されるデータによって示されている。
これに加えて、実施例２２では、キメラ１０Ｇ５は、マウス異種移植ＮＳＣＬＣモデルにおいて、ＹＷ３２７．６Ｓ２に対して同様の有効性を示すが、ＹＷ３２７．６Ｓ２は、ヒト腫瘍および宿主マウス細胞の両方に対して活性であり、１０Ｇ５は、ヒト腫瘍細胞に対してのみ活性であることが示されている。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、例えば、腫瘍のストロマ機能を調整することによって、腫瘍成長および／または転移を阻害する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、コントロール腫瘍と比較して、腫瘍成長を少なくとも１０％まで阻害する。すなわち、抗体で治療された腫瘍の体積は、コントロール腫瘍の体積の９０％以下である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、腫瘍成長を、コントロール腫瘍と比較して少なくとも２０％まで、例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％まで下げる。
いくつかの実施形態では、腫瘍成長に対する抗体の効果は、実施例１４に記載されるようにアッセイされる。いくつかの実施形態では、腫瘍成長に対する抗体の効果は、実施例１５に記載されるようにアッセイされる。
（定義）
（抗体）
この用語は、天然であるか、または部分的または完全に合成によって作られているかによらず、免疫グロブリンを記述する。この用語は、抗体の抗原結合ドメインを含む任意のポリペプチドまたはタンパク質も包含する。抗体の抗原結合ドメインを含む抗体フラグメントとしては、全抗体（例えば、カノニカル配置にＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＬおよびＣＬドメインを含むＩｇＧ抗体）、または標的抗原への結合活性を保持する全抗体のフラグメントが挙げられる。このようなフラグメントとしては、Ｆｖ（フラグメント可変）、Ｆａｂ（フラグメント抗体結合）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、および一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ、ＴａｎｄＡｂ、ビーボディ、トリボディ、κ（λ）ボディ、ＢｉＴＥ、ＤＶＤ－ｌｇ、ＳＩＰ、ＳＭＩＰまたはＤＡＲＴが挙げられる。さらに、抗体およびそのフラグメントは、例えばＥＰ２３９４００Ａ号に記載されるようなヒト化抗体であってもよい。例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、組換え抗体、抗体のタンパク質分解フラグメントおよび組換えフラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ）、シングルドメイン抗体（ＶＨＨ、ｓｄＡｂ、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ、ＶＮＡＲ）、および抗体に似た特異的な結合を有するように操作された、抗体に関連しないタンパク質（抗体模倣物）、例えば、限定されないが、以下のものが挙げられる。
名称 由来
アドネクチン／モノボディ ヒトフィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）、１０ｋＤａ
アフィボディ タンパク質Ａ、Ｚドメイン、６ｋＤａ
アフィリン ヒト γ－クリスタリン／ヒトユビキチン（１０～２０ｋＤａ）
アフィチン Ｓａｃ７ｄ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来）、７ｋＤａ
アンチカリン リポカリン、２０ｋＤａ
アビマー 種々の膜受容体のドメイン、９～１８ｋＤａ
ＤＡＲＰｉｎ アンキリンリピートモチーフ、１４ｋＤａ
エビボディ 細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、１５ｋＤａ
フィノマー Ｆｙｎ、ＳＨ３ドメイン、７ｋＤａ
クーニッツドメインペプチド 種々のプロテアーゼ阻害剤、６ｋＤａ
抗体は、抗体重鎖定常領域および／または抗体軽鎖定常領域の全てまたは一部を含んでいてもよい。
元々の抗体の特異性を保持する、操作された抗体またはキメラ抗体を産生するために、モノクローナル抗体および他の抗体を利用し、組換えＤＮＡ技術の技術を使用することができる。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡフラグメントと、異なる免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域、または定常領域とフレームワーク領域をコードする遺伝子とのライゲーションを含んでいてもよい。例えば、ＥＰ－Ａ－１８４１８７号、ＧＢ ２１８８６３８Ａ号またはＥＰ－Ａ－２３９４００号を参照。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は、遺伝子突然変異または他の変化を受けてもよく、産生される抗体の結合特異性を変更してもよく、または、変更しなくてもよい。
抗体は、多くの様式で改変することができるため、「抗体分子」との用語は、必要な特異性を有する、抗体由来の抗体結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたは他の分子を包含すると解釈すべきである。したがって、この用語は、天然であるか、または部分的または完全に合成によって作られているかによらず、免疫グロブリンの結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含め、抗体フラグメントおよび誘導体を包含する。したがって、別のポリペプチドに融合した免疫グロブリンの結合ドメインを含むキメラ分子または等価体が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ－Ａ－０１２０６９４号およびＥＰ－Ａ－０１２５０２３号に記載されている。
全抗体のフラグメントは、結合抗原の機能を発揮し得ることが示されている。結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）一本鎖抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ、Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４－５４６（１９８９））；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、２つの連結したＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインがペプチドリンカーによって連結し、この２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成する一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３－４２６、１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８５、５８７９－５８８３、１９８８）；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号）および（ｉｘ）「ダイアボディ」、遺伝子融合によって構築される多価または多重特異性フラグメント（ＷＯ９４／１３８０４号；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、６４４４－６４４８、１９９３）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋を組み込むことによって安定化されてもよい（Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４、１２３９－１２４５、１９９６）。ＣＨ３ドメインに接続したｓｃＦｖを含むミニボディも作られてもよい（Ｓ．Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６、３０５５－３０６１、１９９６）。
抗体は、二重特異性であってもよく、または多重特異性であってもよい。二重特異性抗体が使用される場合、これらは、従来の二重特異性抗体であってもよく、種々の様式で製造することができ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４、４４６－４４９（１９９３））、例えば、化学的に、またはハイブリッドハイブリドーマから調製することができ、または上述の二重特異性抗体のフラグメントのいずれかであってもよい。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用して、Ｆｃ領域を含まずに構築することができ、潜在的に副作用、例えば、抗体のエフェクター機能、またはマウス由来の抗体を用いた場合のヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の応答に起因するものを下げる。
二重特異性ダイアボディは、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で容易に構築され、発現させることができるため、二重特異性全抗体とは対照的に、特に有用な場合がある。適切な結合特異性を有するダイアボディ（および多くの他のポリペプチド、例えば、抗体フラグメント）は、抗体ライブラリからのファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４号）を用いて容易に選択することができる。ダイアボディの１つのアームが、例えば、Ａｘｌに対する特異性を有しつつ、一定に維持される場合、他のアームが変動し、選択した適切な特異性を有する抗体であるライブラリを作成することができる。二重特異性全抗体は、「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」操作によって作成されてもよい（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、９、６１６－６２１、１９９６）。
（サンプル）
本明細書で使用される場合、「サンプル」は、１個の細胞であってもよく、または細胞の集合であってもよい。細胞は、正常で健康な細胞であってもよく、または腫瘍細胞、例えば、循環腫瘍細胞であってもよい。
サンプルは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでのサンプルであってもよい。例えば、サンプルは、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍塊であってもよく、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞集合であってもよい。
（抗原結合ドメイン）
これは、抗体の相補性部分または全てを認識し、これに特異的に結合する領域を含む抗体分子の一部を記述する。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の部位にのみ結合してもよく、この部分がエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメインによって与えられてもよい（例えば、いわゆる、ＶＨドメインからなるＦｄ抗体フラグメント）。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
（特異的なタンパク質）
（ヒトＡｘｌ）
本明細書で使用される場合、「ヒトＡｘｌ」は、受容体型チロシンキナーゼのヒトＴＡＭファミリーのＡｘｌメンバーを指す。ヒトＡｘｌは、以下のアイソフォームで見出される。
Figure 0007071935000003
いくつかの実施形態では、ヒトＡｘｌポリペプチドは、上に示すアイソフォーム「Ａ」に対応する。いくつかの実施形態では、ヒトＡｘｌポリペプチドは、上に示すアイソフォーム「Ｂ」に対応する。好ましい実施形態では、ヒトＡｘｌポリペプチドは、上に示すアイソフォーム「Ｃ」に対応する。
（マウスＡｘｌ）
本明細書で使用される場合、「マウスＡｘｌ」は、受容体型チロシンキナーゼのマウスＴＡＭファミリーのＡｘｌメンバーを指す。マウスＡｘｌは、以下のアイソフォームで見出される。
Figure 0007071935000004
いくつかの実施形態では、マウスＡｘｌポリペプチドは、上に示されるアイソフォーム「Ａ」に対応する。いくつかの実施形態では、マウスＡｘｌポリペプチドは、上に示されるアイソフォーム「Ｂ」に対応する。好ましい実施形態では、マウスＡｘｌポリペプチドは、上に示されるアイソフォーム「Ｃ」に対応する。
（ヒトＴｙｒｏ３）
本明細書で使用される場合、「ヒトＴｙｒｏ３」は、受容体型チロシンキナーゼのヒトＴＡＭファミリーのＴｙｒｏ３メンバーを指す。いくつかの実施形態では、ヒトＴｙｒｏ３ポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００６２８４．２、ＧＩ：２７５９７０７８、記録更新日：２０１４年１１月２８日午前１２：３０（配列番号２３）に対応する。一実施形態では、ヒトＴｙｒｏ３ポリペプチドをコードする核酸は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００６２９３．３、ＧＩ：２９５８４２１８３、記録更新日：２０１４年１１月２８日午前１２：３０に対応する。
（ヒトＭｅｒ）
本明細書で使用される場合、「ヒトＭｅｒ」は、受容体型チロシンキナーゼのヒトＴＡＭファミリーのＭｅｒメンバーを指す。いくつかの実施形態では、ヒトＭｅｒポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００６３３４．２、ＧＩ：６６９３２９１８、記録更新日：２０１４年９月６日午前０４：０３（配列番号２４）に対応する。一実施形態では、ヒトＭｅｒポリペプチドをコードする核酸は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００６３４３、バージョン番号ＮＭ＿００６３４３．２ ＧＩ：６６９３２９１７、記録更新日：２０１４年９月６日午前０４：０３に対応する。
（ヒトＡｋｔ３）
本明細書で使用される場合、「ヒトＡｋｔ３」は、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼのヒトＡＫＴサブファミリーのＡｋｔ３メンバーを指す。ヒトＡｋｔ３は、以下のアイソフォームで見出される。
Figure 0007071935000005
いくつかの実施形態では、ヒトＡｋｔポリペプチドは、上に示すアイソフォーム「Ａ」に対応している。いくつかの実施形態では、ヒトＡｋｔポリペプチドは、上に示すアイソフォーム「Ｂ」に対応している。いくつかの実施形態では、ヒトＡｋｔポリペプチドは、上に示すアイソフォーム「Ｃ」に対応している。
（ヒトＧａｓ６）
本明細書で使用される場合、「ヒトＧａｓ６」（成長停止特異的（Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）６）は、受容体型チロシンキナーゼのＴＡＭファミリーのリガンドを指す。いくつかの実施形態では、ヒトＧａｓ６ポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００８１１．１、ＧＩ：４５５７６１７、記録更新日：２０１４年９月６日午前０２：４４（配列番号２６）に対応する。一実施形態では、ヒトＧａｓ６ポリペプチドをコードする核酸は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００８２０．３、ＧＩ：６７３０３８８７７、記録更新日：２０１４年９月６日午前０２：４４に対応する。
（ＢＳＡ）
本明細書で使用される場合、「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを指す。いくつかの実施形態では、ＢＳＡは、「Ａ９６４７－ウシ血清アルブミン」（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に対応する。いくつかの実施形態では、ＢＳＡは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ７６８４７、バージョン番号ＣＡＡ７６８４７．１ ＧＩ：３３３６８４２、記録更新日：２０１１年１月７日午後０２：３０に対応する。
（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ））
これは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」の意味で一般的に使用され、すなわち、１つ以上の特徴または構成要素の存在を許容している。
（単離された）
これは、本発明の抗体、またはこのような抗体をコードする核酸が、一般的に、本発明に従うものである状態を指す。この抗体および核酸は、これらが天然で会合している物質（例えば、これらの天然環境で、またはこれらの調製が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施される組換えＤＮＡ技術による場合に、これらが調製される環境（例えば、細胞培養物）で見出される他のポリペプチドまたは核酸）を含まないか、または全く含まないだろう。抗体および核酸は、希釈剤またはアジュバントと共に配合されてもよく、さらに実際的な用途のために単離されてもよい。例えば、抗体は、免疫アッセイに使用するためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合、通常、ゼラチンまたは他の担体と混合されてもよく、または、診断または治療に使用される場合、医薬的に許容される担体または希釈剤と混合されてもよい。抗体は、天然で、または異種真核細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＮＳ０（ＥＣＡＣＣ ８５１１０５０３）細胞）の系によってグリコシル化されてもよく、または（例えば、原核細胞での発現によって作られる場合）グリコシル化されていなくてもよい。
（実質的に～として提示される）
「実質的に～として提示される」とは、本発明の関連するＣＤＲまたはＶＨまたはＶＬドメインが、配列が本明細書に提示される特定の配列と同一であってもよく、またはその特定の配列と高度に類似であってもよいことを意味する。「高度に類似」とは、１～５、好ましくは１～４、例えば、１～３または１または２、または３または４のアミノ酸置換が、ＣＤＲおよび／またはＶＨまたはＶＬドメイン中でなされていてもよいことを想定している。
本発明の抗体は、さらに、抗体定常領域またはその一部を含んでいてもよい。例えば、本発明の抗体は、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン（またはこれらの任意の組み合わせ）を含んでいてもよい。ＶＬドメインは、そのＣ末端で、ヒトＣκ鎖またはＣλ鎖、好ましくはＣκ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに接続していてもよい。同様に、ＶＨドメインに基づく抗体は、そのＣ末端で、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭおよび任意のアイソタイプのサブクラスに由来する免疫グロブリン重鎖の全てまたは一部に接続していてもよい。Ｆｃ領域、例えば、ＷＯ９９／５８５７２号に開示されるようなΔｎａｂおよびΔｎａｃを使用してもよい。
（キメラ、ヒト化およびＣＤＲをグラフト接合した抗体）
本明細書で使用される場合、「キメラ」抗体または「ヒト化」抗体または「ＣＤＲをグラフト接合した」は、非マウス、好ましくは、ヒト抗体に由来する１つ以上のタンパク質またはペプチドと合わせた、本明細書に開示される抗Ａｘｌ抗体、またはこれらに由来する任意のＣＤＲの任意の組み合わせを含む。
キメラまたはヒト化抗体は、ＣＤＲが、本明細書に記載される抗Ａｘｌ抗体のうち１つ以上および少なくとも一部に由来するか、または抗体の残りの部分が１つ以上のヒト抗体に由来するものを含む。したがって、抗体のヒト部分は、フレームワーク、ＣＬ（例えば、ＣκまたはＣλ）、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であるヒンジ領域を含んでいてもよい。
ヒト抗体に由来する抗体の領域は、ヒト抗体との同一性が１００％である必要はない。好ましい実施形態では、免疫原性を無視することができるように、できるだけ少ない数のマウスアミノ酸残基が保持されているが、マウス残基は、抗体のヒト化を最大化しつつ、同時に、ＣＤＲによって作られる抗原結合部位を支持するのに必要なように保持されてもよい。このような変化または変動は、場合により、好ましくは、非改変抗体と比較して、ヒトまたは他の種における免疫原性を保持するか、または減らす。
ヒト化抗体が、機能的に再配置されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することが可能な非ヒト動物または原核細胞または真核細胞から作られてもよいことを注記しておくべきである。さらに、抗体が一本鎖抗体である場合、抗体は、ネイティブヒト抗体中にはみられないリンカーペプチドを含んでいてもよい。例えば、ｓｃＦｖは、リンカーペプチド、例えば、２～約２０個のグリシンまたは他のアミノ酸残基（好ましくは、グリシン残基およびセリン残基（例えば、Ｇｌｙ４ＳｅｒまたはＧｌｙ２Ｓｅｒの繰り返し））を含んでいてもよく、これが、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とを接続する。このようなリンカーペプチドは、ヒトにおいて非免疫原性であると考えられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１２アミノ酸長である。
抗体のヒト化は、例えば、個々のヒトフレームワークのプールに対し、フレーム内に融合された非ヒト標的モノクローナル抗体の６個全てのＣＤＲを含むコンビナトリアルライブラリを合成することによって行うことができる。全ての既知の重鎖および軽鎖のヒト生殖細胞配列の代表的な遺伝子を含むヒトフレームワークライブラリを利用してもよい。次いで、得られるコンビナトリアルライブラリを、目的の抗原に対する結合についてスクリーニングしてもよい。この手法によって、親抗体に対する結合活性を維持するという観点で、全ヒトフレームワークの最も望ましい組み合わせを選択することができる。次いで、ヒト化抗体を、種々の技術によってさらに最適化してもよい。
全長抗体分子について、免疫グロブリン遺伝子は、ハイブリドーマ細胞株のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから得ることができる。抗体の重鎖および軽鎖は、哺乳動物ベクター系へクローニングされる。アセンブリは、当該技術分野で既知の方法を用い、シークエンシングによって確認される。抗体構築物は、他のヒトまたは哺乳動物宿主細胞系で発現することができる。次いで、構築物を、目的の発現した抗体の一時的なトランスフェクションアッセイおよびウエスタンブロット分析によって検証してもよい。最も高い生産性を有する安定な細胞株を単離し、迅速なアッセイ方法を用いてスクリーニングしてもよい。
ヒト化抗体の定常（Ｃ）領域、フラグメントおよび領域をコードするヒト遺伝子は、既知の方法によって、ヒト胎児肝臓ライブラリから誘導することができる。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現し、産生するものを含め、任意のヒト細胞から誘導することができる。ヒトＣＨ領域は、γ、μ、α、δ、εを含むヒト重鎖の既知のクラスまたはアイソタイプ、およびこれらのサブクラス、例えば、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４のいずれかから誘導することができる。重鎖アイソタイプは、抗体の種々のエフェクター機能を担うため、ＣＨドメインの選択は、望ましいエフェクター機能（例えば、補体結合反応、または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）における活性）によって導かれる。好ましくは、ＣＨドメインは、γ１（ＩｇＧ１）から誘導される。
ヒトＣＬ領域は、ヒトＬ鎖アイソタイプ、κまたはλのいずれか、好ましくはκから誘導することができる。
ヒト免疫グロブリンＣ領域をコードする遺伝子は、標準的なクローニング技術によって、ヒト細胞から得られる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７－１９９３））。ヒトＣ領域遺伝子は、２種類の軽鎖、５種類のクラスの重鎖およびこれらのサブクラスを表す遺伝子を含む既知のクローンから容易に入手することができる。
キメラ抗体フラグメント、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２は、適切にトランケーションされたキメラ重鎖遺伝子を設計することによって調製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列と、その後に、トランケーションされた分子を得るための翻訳停止コドンを含んでいるだろう。
非ヒト抗体またはヒト抗体を操作またはヒト化するための方法を使用してもよく、これらは当該技術分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体または操作された抗体は、非ヒト、例えば、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類または他の哺乳動物である供給源に由来する１つ以上のアミノ酸残基を含む。これらのヒトアミノ酸残基は、多くは、「インポートされた（ｉｍｐｏｒｔｅｄ）」残基と呼ばれ、典型的には、既知のヒト配列の「インポートされた」可変、定常または他のドメインから得られる。既知のヒトＩｇ配列は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ－ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ－ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰＳｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ－ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｖｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ－ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ－ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒ＿ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｎ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）に開示されており、それぞれ、全体的に本明細書に参考として組み込まれる。
このようなインポートされた配列を使用し、当該技術分野で知られているように、免疫原性を減らすか、または結合、親和性、オンレート、オフレート、アビディティ、特異性、半減期、または任意の他の適切な特徴を減らすか、向上させるか、または改変することができる。一般的に、非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列の一部または全てが維持され、一方、可変領域および定常領域の非ヒト配列が、ヒトまたは他のアミノ酸と交換されている。
また、抗体は、場合により、抗原に対する高い親和性および他の望ましい生物学的特性を保持しつつ、ヒト化されていてもよい。この目標を達成するために、ヒト化抗体は、場合により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた、親配列の分析プロセスおよび種々の概念的なヒト化産物によって、調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは、市販されており、当業者にはよく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の可能な三次元配座構造を示し、表示するコンピュータプログラムは、入手可能である。これらの表示を精査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能発揮における残基の考えられる役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析を行うことができる。この様式で、ＦＲ残基を、望ましい抗体特徴、例えば、標的抗原に対する親和性の増加が達成されるように、コンセンサス配列およびインポート配列から選択し、組み合わせることができる。
一般的に、ＣＤＲ残基は、直接的かつ、最も実質的に、影響を与える抗原結合に関与する。抗体のヒト化または操作は、任意の既知の方法、例えば、限定されないが、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，７２３，３２３号、第５，９７６，８６２号、第５，８２４，５１４号、第５，８１７，４８３号、第５，８１４，４７６号、第５，７６３，１９２号、第５，７２３，３２３号、第５，７６６，８８６号、第５，７１４，３５２号、第６，２０４，０２３号、第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，２２５，５３９号、第４，８１６，５６７号、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０号、ＵＳ９６／１８９７８号、ＵＳ９１／０９６３０号、ＵＳ９１／０５９３９号、ＵＳ９４／０１２３４号、ＧＢ８９／０１３３４号、ＧＢ９１／０１１３４号、ＧＢ９２／０１７５５号；ＷＯ９０／１４４４３号、ＷＯ９０／１４４２４号、ＷＯ９０／１４４３０号、ＥＰ ２２９２４６号に記載されるものを用いて行うことができる。
ヒト化抗体のヒト定常領域は、任意のクラスまたはアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）のものであってもよく、κまたはλの軽鎖を含んでいてもよい。一実施形態では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ重鎖または定義されるフラグメント、例えば、ＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の少なくとも１つを含む。
（標識抗体）
本発明の抗体は、検出可能な標識または機能性標識で標識されていてもよい。検出可能な標識としては、放射性標識、例えば［１３１Ｉ］または［９９Ｔｃ］を含み、放射線免疫接合体の分野で知られている従来の化学を用い、本発明の抗体に接続されてもよい。標識は、さらに、酵素標識、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼを含む。標識は、さらに、化学部分、例えば、ビオチンを含み、特異的な同系の検出可能な部分、例えば、標識されたアビジンまたはストレプトアビジンに対する結合を介して検出されてもよい。好ましくは、標識としては、蛍光標識、例えばＦＩＴＣが挙げられる。
（有機部分）
改変抗体および抗原結合フラグメントは、抗体に直接的または間接的に共有結合する１つ以上の有機部分を含んでいてもよい。本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントに結合する各有機部分は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基であってもよい。本明細書で使用される場合、「脂肪酸」との用語は、モノカルボン酸およびジカルボン酸を包含する。「親水性ポリマー基」は、この用語が本明細書で使用される場合、オクタンよりも水への可溶性が高い有機ポリマーを指す。例えば、ポリ－リジンは、オクタンよりも水への可溶性が高い。したがって、ポリ－リジンの共有結合によって改変された抗体は、本開示に包含される。本明細書に記載の抗体を改変するための適切な親水性ポリマーは、直鎖または分枝鎖であってもよく、例えば、ポリ－アルカングリコール、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ－ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖類、多糖類など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリ－リジン、ポリ－アルギニン、ポリ－アスパルテートなど）、ポリ－アルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）およびポリビニルピロリドンを含む。好ましくは、本明細書に記載の抗体を改変する親水性ポリマーは、別個の分子部分として、分子量が約８００～約１５０，０００ダルトンである。例えば、ＰＥＧ５０００およびＰＥＧ２０，０００（添え字は、ダルトン単位でのポリマーの平均分子量である）を使用してもよい。親水性ポリマー基は、１個～約６個のアルキル基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基で置換されていてもよい。脂肪酸基または脂肪酸エステル基で置換された親水性ポリマーは、適切な方法を使用することによって調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーを、脂肪酸または脂肪酸エステルのカルボキシレートとカップリングさせてもよく、脂肪酸または脂肪酸エステル上の活性化されたカルボキシレート（例えば、Ｎ，Ｎ－カルボニルジ－イミダゾールで活性化されたもの）を、ポリマー上のヒドロキシル基にカップリングさせてもよい。
本明細書に記載の抗体を改変するのに適した脂肪酸および脂肪酸エステルは、飽和であってもよく、または１つ以上の不飽和単位を含有していてもよい。本明細書に記載の抗体を改変するのに適した脂肪酸としては、例えば、ｎ－ドデカノエート（Ｃ１２、ラウレート）、ｎ－テトラデカノエート（Ｃ１４、ミリステート）、ｎ－オクタデカノエート（Ｃ１８、ステアレート）、ｎ－エイコサノエート（Ｃ２０、アラキデート）、ｎ－ドコサノエート（Ｃ２２、ベヘネート）、ｎ－トリアコンタノエート（Ｃ３０）、ｎ－テトラコンタノエート（Ｃ４０）、ｃｉｓ－δ ９－オクタデカノエート（Ｃ１８、オレエート）、全てのｃｉｓ－δ ５，８，１１，１４－エイコサテトラエノエート（Ｃ２０、アラキドネート）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが挙げられる。適切な脂肪酸エステルとしては、直鎖または分枝鎖の低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルが挙げられる。低級アルキル基は、１～約１２個、好ましくは１～約６個の炭素原子を含んでいてもよい。
改変ヒト抗体および抗原結合フラグメントは、適切な方法を用いて、例えば、１つ以上の改変剤と反応させることによって調製することができる。「改変剤」は、この用語が本明細書で使用される場合、活性化基を含む適切な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性化基」は、適切な条件で第２の化学基と反応し、改変剤と第２の化学基との間に共有結合を生成することができる化学部分または官能基である。例えば、アミン反応性活性化基としては、求電子性基、例えば、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などが挙げられる。チオールと反応することができる活性化基としては、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５－チオール－２－ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ－チオール）などが挙げられる。アルデヒド官能基は、アミンを含有する分子またはヒドラジンを含有する分子とカップリングすることができ、アジド基は、三価リン基と反応し、ホスホロアミデート結合またはリンイミド結合を生成することができる。活性化基を分子に導入するのに適した方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｈｅｒｎａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：サンディエゴ、カリフォルニア（１９９６）を参照）。活性化基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接的に結合することができ、またはリンカー部分（例えば、１個以上の炭素原子を、ヘテロ原子、例えば、酸素、窒素または硫黄と置き換えてもよい二価Ｃ１－Ｃ１２基）を介して結合することができる。適切なリンカー部分としては、例えば、テトラエチレングリコール、－（ＣＨ２）３－、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＮＨ－および－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ－ＮＨ－が挙げられる。リンカー部分を含む改変剤は、例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）存在下、モノ－Ｂｏｃ－アルキルジアミン（例えば、モノ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン、モノ－Ｂｏｃ－ジアミノヘキサン）と脂肪酸とを反応させ、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間にアミド結合を生成することによって製造することができる。Ｂｏｃ保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、上述の別のカルボキシレートにカップリングすることができる一級アミンを露出させることによって、生成物から除去することができ、または無水マレイン酸と反応させ、得られた生成物を環化させ、脂肪酸の活性化されたマレイミド誘導体を生成してもよい（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、ＷＯ ９２／１６２２１号を参照）。
改変抗体は、ヒト抗体または抗原結合フラグメントと改変剤とを反応させることによって製造することができる。例えば、有機部分を、アミン反応性改変剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを使用することによって、非部位特異的な様式で抗体に結合することができる。改変ヒト抗体または抗原結合フラグメントは、抗体または抗原結合フラグメントのジスルフィド結合（例えば、鎖内ジスルフィド結合）を還元することによっても調製することができる。次いで、還元された抗体または抗原結合フラグメントを、チオール反応性改変剤と反応させ、本明細書に記載の改変抗体を製造することができる。本明細書に記載の抗体の特異的な部位に結合される有機部分を含む改変ヒト抗体および抗原結合フラグメントは、適切な方法、例えば、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、３：１４７－１５３（１９９２）；Ｗｅｒｌｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５：４１１－４１７（１９９４）；Ｋｕｍａｒａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３－２２４１（１９９７）；Ｉｔｏｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２４（１）：５９－６８（１９９６）；Ｃａｐｅｌｌａｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、５６（４）：４５６－４６３（１９９７））、およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９６）に記載される方法を用いて調製することができる。
（免疫接合体）
本発明は、１つ以上の細胞毒性薬剤、例えば、化学治療剤または薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素的に活性な毒素またはそのフラグメント）、または放射性同位体に接合される本明細書の抗Ａｘｌ抗体を含む免疫接合体も提供する。
一実施形態では、免疫接合体は、抗体が１つ以上の薬物に接合している抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）であり、１つ以上の薬物としては、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号および欧州特許第ＥＰ ０ ４２５ ２３５ Ｂ１号を参照）；オーリスタチン、例えば、モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号および第５，７８０，５８８号および第７，４９８，２９８号を参照）；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号および第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３）；およびＬｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５－２９２８（１９９８）を参照）；アントラサイクリン、例えば、ダウノマイシンまたはドキソルビシン（Ｋｒａｔｚら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．１３：４７７－５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８－３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｒｎ．１６：７１７－７２１（２００５）；Ｎａｇｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９－８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９－１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．４５：４３３６－４３４３（２００２）；および米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセルおよびオルタタキセル；トリコテセンおよびＣＣ１０６５が挙げられる。
別の実施形態では、免疫接合体は、酵素的に活性な毒素またはそのフラグメントに接合した、本明細書に記載される抗体を含み、酵素的に活性な毒素またはそのフラグメントとしては、限定されないが、ジフテリア毒素Ａ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（Ｐ ＡＰＩ、Ｐ ＡＰＩＩおよびＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。
別の実施形態では、免疫接合体は、放射性原子に接合され、放射性免疫接合体を形成する、本明細書に記載される抗体を含む。放射性免疫接合体の生成のために、種々の放射性同位体が利用可能である。例としては、［２１１Ａｔ］、［１３１Ｉ］、［１２５Ｉ］、［９０Ｙ］、［１８６Ｒｅ］、［１８８Ｒｅ］、［１５３Ｓｍ］、［２１２Ｂｉ］、［３２Ｐ］、［２１２Ｐｂ］およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。検出のために放射性免疫接合体が使用される場合、シンチグラフィー試験のための放射性原子（例えば、例えば、［９９Ｔｃ］または［１２３Ｉ］）または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても知られている）のためのスピン標識、例えば、ここでもヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含んでいてもよい。
抗体と細胞毒性薬剤の接合体は、種々の二官能タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン ２，６－ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を用いて作られてもよい。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素－１４標識された１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸＤＴＰＡ）は、抗体に放射性ヌクレオチドを接合するための例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞内への細胞毒性薬物の放出を容易にする「開裂性リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィドを含有するリンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
本明細書の免疫接合体またはＡＤＣは、明示的に、限定されないが、架橋試薬を用いて調製されるこのような接合体を想定しており、架橋試薬としては、限定されないが、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳｌＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣおよびスルホ－ＳＭＰＢ、およびＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）が挙げられ、これらは市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、ロックフォード、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａ製）。
（グリコシル化バリアント）
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変更される。抗体に対するグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作成されるか、または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって、簡便に達成されてもよい。
抗体がＦｃ領域を含む場合、これに接続する炭水化物は、変更されてもよい。哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に対するＮ結合によって一般的に接続する、分岐した、二分岐のオリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照。オリゴ糖は、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトースおよびシアル酸、および二分岐のオリゴ糖構造の「幹」にあるＧｌｃＮＡｃに接続するフコースを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、特定の改良された特性を有する抗体バリアントを作成するために行われてもよい。
一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）接続するフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントが提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％または２０％～４０％であってもよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ ２００８／０７７５４６号によって記載されるように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定される場合、Ａｓｎ２９７に接続する全ての糖構造（例えば複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）の合計に対し、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域のほぼ位置２９７（Ｆｃ領域の残基のＥｕナンバリング）にあるアスパラギン残基を指す。しかし、Ａｓｎ２９７は、抗体中の小さな配列変動に起因して、位置２９７の上流または下流の約±３アミノ酸に、すなわち、位置２９４から３００の間に位置していてもよい。このようなフコシル化バリアントは、改良されたＡＤＣＣ機能を有する場合がある。例えば、ＵＳ特許出願公開第ＵＳ ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；ＵＳ ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｌｗ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄを参照）。「脱フコシル化」または「フコースを欠いた」抗体バリアントに関連する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１号；ＷＯ２０００／６１７３９号；ＷＯ２００１／２９２４６号；ＵＳ２００３／０１１５６１４号；ＵＳ２００２／０１６４３２８号；ＵＳ２００４／００９３６２１号；ＵＳ２００４／０１３２１４０号；ＵＳ２００４／０１１０７０４号；ＵＳ２００４／０１１０２８２号；ＵＳ２００４／０１０９８６５号；ＷＯ２００３／０８５１１９号；ＷＯ２００３／０８４５７０号；ＷＯ２００５／０３５５８６号；ＷＯ２００５／０３５７７８号；ＷＯ２００５／０５３７４２号；ＷＯ２００２／０３１１４０号；Ｏｋａｚａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。
脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質のフコシル化がされていないＬｅＣＬ３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願第ＵＳ ２００３／０１５７１０８ Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ、Ｌ；およびＷＯ ２００４／０５６３１２ Ａ１号、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、およびノックアウト細胞株、例えば、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８）ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ、Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９４（４）：６８０－６８８（２００６）；およびＷ０２００３／０８５１０７号）が挙げられる。
二分されたオリゴ糖類（例えば、抗体のＦｃ領域に接続する二分岐のオリゴ糖が、ＧｌｃＮＡｃによって二分されたオリゴ糖）を含む抗体バリアントが、さらに提供される。このような抗体バリアントは、フコシル化度が低く、および／または改良されたＡＤＣＣ機能を有していてもよい。このような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ ２００３／０１１８７８号（ＪｅａＮ－Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）；およびＵＳ２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載される。Ｆｅ領域に接続するオリゴ糖の中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改良されたＣＤＣ機能を有している場合がある。このような抗体バリアントは、例えば、ＷＯ １９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；ＷＯ １９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ、Ｓ．）号およびＷＯ １９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載される。
（Ｆｃ領域バリアント）
特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それによって、Ｆｃ領域バリアントを生成する。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでいてもよい。
特定の実施形態では、本発明は、エフェクター機能を全てではないが一部保有する抗体バリアントを想定しており、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば、補体結合反応およびＡＤＣＣ）は不必要であるか、有害であるような用途にとって望ましい候補物質となる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで、細胞毒性アッセイを行い、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の減少／喪失を確認してもよい。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行い、抗体がＦｃγ結合を欠いている（したがって、おそらくＡＤＣＣ活性を欠いている）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認してもよい。ＡＤＣＣに介在する主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号に記載されている（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６））およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）。または、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ；およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩを参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、またはこれに加えて、例えば、動物モデル、例えば、ＣＬｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示される動物モデルにおいて、目的の分子のＡＤＣＣ活性をｉｎ ｖｉｖｏで評価してもよい。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行い、その抗体が、Ｃ１ｑに結合することができず、したがって、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）活性を欠くことを確認してもよい。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９号およびＷＯ２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．およびＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。ＦｃＲｎ結合およびｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス／半減期Ｆｃの決定も、当該技術分野で既知の方法を用いて行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ、Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照）。
エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９のうち１つ以上を置換したものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体としては、残基２６５および２９７をアラニンに置換した、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７および３２７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＦｃＲに対する結合が向上しているか、または減少している特定の抗体バリアントが記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ ２００４／０５６３１２号およびＳｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照）。
特定の実施形態では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣ活性を向上させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３（残基のＥＵナンバリング）での置換を有するＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ ９９／５１６４２号およびＩｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されているように、Ｆｃ領域で変更がなされ、変更された（すなわち、向上しているか、または減少している）Ｃ１ｑ結合および／またはＣＤＣ活性を生じる。
胎児への母系ＩｇＧの移動を担う、半減期が長く、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合が向上した抗体（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合が向上した、１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントとしては、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のうち１つ以上で置換したもの、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換したものが挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。また、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＦｃ領域バリアントの他の例に関するＷＯ ９４／２９３５１号を参照。
（システイン操作された抗体バリアント）
特定の実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体（例えば、「チオＭＡｂ」）を作成することが望ましい場合がある。
特定の実施形態では、置換された残基は、抗体の接近可能な部位で起こる。さらに本明細書に記載されるように、これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、これにより、抗体の接近可能な部位に配置され、これを使用し、他の部分（例えば、薬物部分またはリンカー－薬物部分）に対して抗体を接合し、免疫接合体を作成してもよい。特定の実施形態では、軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）といった残基のうち任意の１つ以上が、システインで置換されていてもよい。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように作られてもよい。
（診断および治療の方法）
本発明の抗体は、ヒト被験体または動物被験体、好ましくはヒトの診断または治療の方法に使用されるように設計される。
したがって、本発明のさらなる態様は、１つ以上の試薬と共に提供されるような抗体（例えば、ＦＩＴＣなどの検出可能な標識に接合されたもの）の投与を含む、診断の方法を提供する。提供されるような抗体を、生検組織に由来する癌細胞のための迅速かつ信頼性の高い試験の開発に使用してもよい。例えば、この抗体を、血液またはリンパ液などの体液中の循環することがわかっていてもよい転移性癌細胞（例えば循環腫瘍細胞）のための試験として使用してもよい。目的の他の癌としては、乳癌、肺癌、胃癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌および前立腺癌、およびリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ＮＨＬ）および白血病（特に急性骨髄性白血病、ＡＭＬ）が挙げられる。
本発明のさらなる態様は、提供されるような抗体、このような抗体を含む医薬組成物、ある治療の方法に使用するための本明細書に記載の抗体、本明細書に記載の特定の臨床的適用の治療の方法に使用するための本明細書に記載の抗体の投与を含む治療の方法、および投与のための医薬の製造におけるこのような抗体の使用、例えば、抗体を、医薬的に許容される賦形剤を用いて配合することを含む、医薬または医薬組成物を製造する方法における使用を提供する。
（臨床的適用）
ヒトＡｘｌに対して高い特異性を有する抗体を使用して治療薬の便益を与え得る臨床的適用としては、Ａｘｌが過剰発現される任意の状態、またはＡｘｌ拮抗作用が臨床上の便益を与え得る任意の状態が挙げられる。これらの臨床的適用としては、障害、心血管の障害、血栓症、糖尿病、免疫チェックポイント障害、線維化障害（線維症）または増殖性疾患、例えば癌、特に転移性癌が挙げられる。さらに、Ａｘｌは、上皮由来の多くの癌において、何らかの役割を果たすことが知られている。
目的の線維化障害としては、斜視、強皮症、ケロイド、腎性全身性線維症、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、全身性硬化症、心筋線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、他の種類の肝線維症、原発性胆汁性肝硬変、腎臓線維症、癌およびアテローム性動脈硬化症が挙げられる。これらの疾患において、組織における線維症の慢性的な進行によって、罹患した臓器の構造に顕著な変化が起こり、その後、臓器機能不全が起こる。臓器に対する継続的な損耗が起こるこのプロセスの結果として、線維症が関与する多くの疾患は、進行性の状態であることが多く、長期予後が不良である（Ｒｏｃｋｅｙ，Ｄ．Ｃ．、Ｂｅｌｌ，Ｐ．Ｄ．およびＨｉｌｌ，Ｊ．Ａ．（２０１５）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｍｅｄ．、Ｖｏｌ．３７２、ｐｐ．１１３８－１１４９を参照）。
目的の免疫チェックポイント障害としては、慢性ウイルス感染、黒色腫、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、腎臓細胞癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、骨髄腫、腎臓癌、膀胱癌、脳腫瘍およびリンパ腫が挙げられる。
目的の癌としては、白血病、例えば、限定されないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単核性、単球性、赤白血病性の白血病および骨髄異形成症候群、慢性白血病、例えば、限定されないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞性白血病；真性多血症；リンパ腫、例えば、限定されないが、ホジキン病、非ホジキン病；多発性骨髄腫、例えば、限定されないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫；ワルデンストレームマクログロブリン血症；意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症；良性単クローン性ガンマグロブリン血症；Ｈ鎖病；骨および結合組織の肉腫、例えば、限定されないが、骨の肉腫（ｂｏｎｅ ｓａｒｃｏｍａ）、骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫瘍、骨の繊維肉腫、脊索腫、骨膜性肉腫、軟組織肉腫、脈管肉腫（血管肉腫）、繊維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ液血管肉腫、転移性癌、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫；脳腫瘍、例えば、限定されないが、グリオーマ、膠芽細胞腫、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、上衣腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リンパ腫；乳癌、限定されないが、腺癌、小葉（小細胞）癌腫、腺管内癌腫、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状腺乳癌、乳頭の乳癌、原発性癌、ページェット病、および炎症性乳癌を含む；副腎癌、例えば、限定されないが、褐色細胞腫、および副腎皮質癌腫；甲状腺癌、例えば、限定されないが、乳頭型または濾胞型の甲状腺癌、甲状腺髄様癌腫、甲状腺髄様癌および甲状腺未分化癌；ＧＩＳＴ－消化管間質腫瘍；膵臓癌、例えば、限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ＶＩＰ産生腫瘍、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは島細胞腫瘍；下垂体癌、例えば、限定されないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症および尿崩症；眼の癌、例えば、限定されないが、眼内黒色腫、例えば、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫および毛様体黒色腫および網膜芽細胞腫；膣癌、例えば、扁平上皮細胞癌腫、腺癌および黒色腫；外陰癌、例えば、扁平上皮細胞癌腫、黒色腫、腺癌、基底細胞癌腫、肉腫およびページェット病；子宮頸癌、例えば、限定されないが、扁平上皮細胞癌腫および腺癌；子宮癌、例えば、限定されないが、子宮内膜癌腫および子宮肉腫；卵巣癌、例えば、限定されないが、卵巣上皮癌腫、卵巣境界腫瘍、胚細胞腫瘍および間質腫瘍；食道癌、例えば、限定されないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌腫、粘表皮癌腫、胃腺扁平上皮癌腫、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣贅癌腫および燕麦細胞（小細胞）癌腫；胃癌、例えば、限定されないが、腺癌、菌状（ポリープ状）の潰瘍化した表面での広がり、広範囲に広がる悪性リンパ腫、脂肪肉腫、繊維肉腫および癌肉腫；結腸癌；直腸癌；肝臓癌、例えば、限定されないが、肝細胞癌腫および肝芽腫、胆嚢癌、例えば、腺癌；胆管癌腫、例えば、限定されないが、乳頭製、結節性および拡散性のもの；肺癌、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮細胞癌腫（類表皮癌腫）、腺癌、大細胞癌腫および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）；精巣癌、例えば、限定されないが、セルトリ細胞腫瘍、セミノーマ、退形成性のもの、伝統的な（典型的な）もの、精母細胞、非セミノーマ、胎児性癌腫、奇形腫、絨毛癌（卵黄嚢腫）、前立腺癌、例えば、限定されないが、腺癌、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫；生殖器癌、例えば、陰茎癌；口腔癌、例えば、限定されないが、扁平上皮細胞癌腫；基底細胞癌；唾液腺癌、例えば、限定されないが、腺癌、粘表皮癌腫および腺様嚢胞癌腫；咽頭癌、例えば、限定されないが、扁平上皮細胞癌および疣状癌；皮膚癌、例えば、限定されないが、基底細胞癌腫、扁平上皮細胞癌腫および黒色腫、表面に広がる黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫；腎臓癌、例えば、限定されないが、腎臓細胞癌、腎明細胞腎臓細胞癌腫、腺癌、副腎腫、繊維肉腫、移行上皮癌（腎盤および／または尿管）；腎芽腫；膀胱癌、例えば、限定されないが、移行細胞癌腫、扁平上皮細胞癌、腺癌、癌肉腫が挙げられる。これに加えて、癌としては、粘液肉腫、骨肉腫、内皮肉腫、リンパ液リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑液腫瘍、血管芽腫、上皮癌腫、肝内胆管嚢胞腺癌、気管支原性癌腫、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭の癌腫および乳頭の腺癌が挙げられる。好ましくは、癌は、乳房、黒色腫、前立腺、卵巣癌、結腸直腸、肺またはグリオーマ癌から選択される。より好ましくは、癌は、転移性乳房または肺癌である。循環腫瘍細胞を標的とし、治療することが想定される。
転移性癌の治療は、原発腫瘍が位置する場所によって変わる。乳癌が肺にまで広がるとき、例えば、乳癌が残っている場合、治療は、乳房の中にある転移性癌の由来によって決定され、現在肺にあるという事実によって決定されるのではない。この時点の約５％では、転移性癌が発見されるが、原発腫瘍を同定することができない。これらの転移性癌の治療は、その由来ではなく、その位置によって示される。転移性癌は、元々の腫瘍の組織によって命名される（わかっている場合には）。例えば、脳に広がった乳癌は、脳への転移性乳癌と呼ばれる。
本発明による抗Ａｘｌ治療を使用し、Ａｘｌが過剰発現される状態を有する患者にとって明確な便益を与えてもよく、またはＡｘｌ拮抗作用が、臨床上の便益を与えるだろう。治療は、注射によって（例えば、静脈内）または局所送達方法によって与えられてもよい。提供されるような抗体を使用し、医薬組成物を標的組織に直接送達してもよく、または例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または他の転移性細胞を標的とするために、全身に送達してもよい。
本発明のさらなる態様では、被験体における癌幹細胞を阻害する方法であって、この方法が、前記被験体と、本明細書に記載される抗体（またはその接合体）とを接触させることを含む方法が提供される。このような方法に使用するための抗体および接合体も想定される。
（ＥＧＦＲ拮抗作用）
本発明は、有効な量の本明細書に開示のいずれかの抗Ａｘｌ抗体を個体に投与し、構成的なＡｘｌを阻害することを含む、構成的なＡｘｌ活性化を阻害する方法も提供する。
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲを活性化する突然変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌を患う被験体を治療するための方法であって、被験体が、ＥＧＦＲアンタゴニストを用いる治療に対する抵抗性を生じており、被験体が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を有しているかどうかを決定することと、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を有している被験体に、ＥＧＦＲアンタゴニストと本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体とを投与することとを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲを活性化する突然変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌を患う被験体を治療するための方法であって、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストを用いて治療される被験体をモニタリングし、その被験体が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を生じているかどうかを決定することと、（ｉｉ）その被験体が、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を生じている場合には、ＥＧＦＲアンタゴニストに加え、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体を含むように被験体の治療レジメンを改変することとを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲを活性化する突然変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌を患う被験体を治療するための方法であって、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストを用いて治療される被験体をモニタリングし、その被験体が、その阻害剤に対する抵抗性を生じているかどうかを決定することと、（ｉｉ）その被験体を試験し、その被験体が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を有しているかどうかを決定することと、（ｉｉｉ）その被験体が、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を有している場合には、ＥＧＦＲアンタゴニストに加え、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体を含むように被験体の治療レジメンを改変することとを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストを評価するための方法であって、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストを用いて治療される被験体の集合をモニタリングし、その治療薬に対する抵抗性を生じている被験体を同定することと、（ｉｉ）その抵抗性の被験体を試験し、その被験体が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を有しているかどうかを決定することと、（ｉｉｉ）その被験体が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を有している場合には、ＥＧＦＲアンタゴニストに加え、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体を含むように被験体の治療レジメンを改変することとを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、癌細胞におけるＥＧＦＲリン酸化を減らすための方法であって、前記癌細胞が、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する獲得抵抗性を有しており、前記細胞が、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含み、前記細胞を、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体およびＥＧＦＲアンタゴニストと接触させる工程を含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、癌細胞におけるＰＢＫが介在するシグナル伝達を減らすための方法であって、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する獲得抵抗性を有し、前記細胞が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含み、前記細胞と、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体およびＥＧＦＲアンタゴニストとを接触させる工程を含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、癌細胞におけるＥＧＦＲが介在するシグナル伝達を減らすための方法であって、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する獲得抵抗性を有し、前記細胞が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含み、前記細胞と、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体およびＥＧＦＲアンタゴニストとを接触させる工程を含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する癌細胞の感受性を回復させるための方法であって、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する獲得抵抗性を有し、前記細胞が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含み、前記細胞と、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体およびＥＧＦＲアンタゴニストとを接触させる工程を含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、癌細胞の成長または増殖を減らすための方法であって、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する獲得抵抗性を有し、前記細胞が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含み、前記細胞と、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体およびＥＧＦＲアンタゴニストとを接触させる工程を含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、癌細胞のアポトーシスを増やすための方法であって、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する獲得抵抗性を有し、前記細胞が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含み、前記細胞と、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体およびＥＧＦＲアンタゴニストとを接触させる工程を含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する癌細胞の抵抗性を減らすための方法であって、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する獲得抵抗性を有し、前記細胞が、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含み、前記細胞と、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体およびＥＧＦＲアンタゴニストとを接触させる工程を含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、癌細胞において獲得したＥＧＦＲアンタゴニスト抵抗性を治療するための方法であって、前記細胞が、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含み、前記細胞と、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体およびＥＧＦＲアンタゴニストとを接触させる工程を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、癌細胞は、任意のＥＧＦＲによって促進される癌である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲを活性化する突然変異を含む。いくつかの実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子増幅を含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ遺伝子増幅は、少なくとも２倍である。いくつかの実施形態では、Ａｘｌ増幅は、少なくとも２倍である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する抵抗性の増加に関連するＥＧＦＲ遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する抵抗性の増加に関連するＥＧＦＲ遺伝子突然変異は、ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ突然変異である。
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、低分子治療薬、核酸治療薬またはタンパク質治療薬である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、抗体、アンチセンス分子または低分子キナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、パニツムマブからなる群から選択されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、セツキシマブ、パニツムマブからなる群から選択される抗ＥＧＦＲ抗体である。いくつかの実施形態では、核酸治療薬は、ｓｉＲＮＡ分子である。
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストおよび本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体を用いる治療の候補としての被験体を同定するための方法であって、前記被験体が、過去にＥＧＦＲアンタゴニストで治療されており、獲得した前記ＥＧＦＲアンタゴニストに対する抵抗性を有する癌を患っており、前記被検体由来の癌細胞において、Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を検出することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストを用いて治療され、前記ＥＧＦＲアンタゴニストに対する抵抗性を獲得するリスクがある被験体を同定するための方法であって、前記被検体由来の癌細胞において、Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅の存在を検出することを含み、前記Ａｘｌ発現、Ａｘｌを活性化する突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅の存在が、前記抵抗性を獲得するリスクを示す方法を提供する。
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストを用いる治療に対して抵抗性の癌を患う被験体を治療するための方法であって、前記被験体に、ＥＧＦＲアンタゴニストおよび本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体を投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲを活性化する突然変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌を患う被験体を治療するための方法であって、前記被験体は、ＥＧＦＲアンタゴニストを用いる治療に対する抵抗性を生じており、前記被験体が、Ａｘｌ発現、例えば、Ａｘｌレベルおよび／または活性の上昇を有するかどうかを決定することと、Ａｘｌ発現、例えば、Ａｘｌ活性の上昇を有する被験体に、ＥＧＦＲアンタゴニストおよび本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体を投与することとを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲを活性化する突然変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌を患う被験体を治療するための方法であって、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストで治療される被験体をモニタリングし、その被験体が、Ａｘｌ発現、例えば、レベルおよび／またはＡｘｌ活性の上昇を生じているかどうかを決定することと、（ｉｉ）その被験体が、Ａｘｌ発現、例えば、Ａｘｌレベルおよび／または活性の上昇を生じている場合に、ＥＧＦＲアンタゴニストに加えて、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体を含むように被験体の治療レジメンを改変することとを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲを活性化する突然変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌を患う被験体を治療するための方法であって、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストで治療される被験体をモニタリングし、その被験体が、阻害剤に対する抵抗性を生じているかどうかを決定することと、（ｉｉ）その被験体を試験し、その被験体が、Ａｘｌ発現、例えば、Ａｘｌレベルおよび／または活性の上昇を有しているかどうかを決定することと、（ｉｉｉ）その被験体が、Ａｘｌレベルおよび／または活性の上昇を有している場合に、ＥＧＦＲアンタゴニストに加えて、本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体を含むように被験体の治療レジメンを改変することとを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、癌細胞と、ＥＧＦＲアンタゴニストおよび本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体とを接触させることによって、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストに対する癌細胞の感度を回復させ、（ｉｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストに対する癌細胞の抵抗性を減らし、および／または癌細胞において獲得したＥＧＦＲアンタゴニスト抵抗性を治療するための方法を提供する。
例示的な実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する抵抗性を獲得しており、例えば、Ａｘｌ遺伝子、Ａｘｌ遺伝子増幅またはＧａｓ６が介在するＡｘｌ活性化における活性化突然変異と関連する、Ａｘｌ活性および／または発現のレベルの上昇を含む。本明細書に開示の方法を使用し、癌細胞の感度を回復させ、抵抗性を減らし、および／または獲得した抵抗性を治療してもよい。
別の態様では、本発明は、癌細胞の成長および／または増殖を減らすための方法、または癌細胞のアポトーシスを増やすための方法であって、前記細胞と、ＥＧＦＲアンタゴニストおよび本明細書に記載のいずれかの抗Ａｘｌ抗体とを接触させることによる方法を提供する。例示的な実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する抵抗性を獲得しており、例えば、Ａｘｌ遺伝子、Ａｘｌ遺伝子増幅、またはＧａｓ６が介在するＡｘｌ活性化における活性化突然変異に関連する、Ａｘｌ活性および／または発現の上昇を含む。
（医薬組成物）
本発明の抗体は、通常、医薬組成物の形態で投与され、医薬組成物は、抗体に加え、少なくとも１つの構成要素を含んでいてもよい。
したがって、本発明の医薬組成物は、本発明に係る使用のために、活性成分に加えて、医薬的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定化剤、または当業者によく知られた他の物質を含んでいてもよい。このような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨害しないものであるべきである。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路によって変わり、投与経路は、経口、または注射、例えば、静脈注射によるものであってもよい。医薬組成物は、ヒト用および動物用の医薬でのヒトまたは動物への使用のためのものであってもよい。
本明細書に記載する種々の異なる形態の医薬組成物のためのこのような適切な賦形剤の例は、Ａ ＷａｄｅおよびＰＪ Ｗｅｌｌｅｒによって編集された「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第２版（１９９４）の中に見出すことができる。
治療薬の使用のための許容される担体または希釈剤は、医薬分野でよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ編集、１９８５）に記載される。適切な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。適切な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、水および緩衝化生理食塩水が挙げられる。
医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な薬務に関して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、またはこれらに加えて、任意の適切なバインダー、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、バッファー、香味剤、表面活性薬剤、増粘剤、防腐剤（酸化防止剤を含む）など、および意図する受容者の血液と製剤とを等張性にする目的のために含まれる物質を含んでいてもよい。
適切なバインダーの例としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えば、グルコース、無水ラクトース、自由に流動するラクトース、β－ラクトース、コーン甘味料、天然および合成のガム、例えば、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
適切な滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。防腐剤、安定化剤、染料およびさらなる香味剤が医薬組成物に与えられてもよい。防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。酸化防止剤および懸濁剤も使用してもよい。
医薬製剤としては、経口、局所（真皮、口腔および舌下を含む）、直腸または非経口（皮下、皮内、筋肉内および静脈を含む）、経鼻投与および肺投与に適したもの（例えば、吸入によるもの）が挙げられる。製剤は、適切な場合、別個の投薬単位で簡便に提示されてもよく、医薬分野でよく知られた任意の方法によって調製されてもよい。全ての方法は、活性化合物と、液体担体または細かく分割された固体担体、またはこれら両方とを会合させる工程と、次いで、必要な場合には、生成物を望ましい製剤に成形する工程を含む。担体が固体である経口投与に適した医薬製剤は、最も好ましくは、それぞれが所定量の活性薬剤を含む単位用量製剤、例えば、ボーラス、カプセルまたは錠剤として提示される。錠剤は、場合により１つ以上の補助成分を含み、圧縮または成型によって作られてもよい。圧縮錠剤は、適切な機械で、自由に流動する形態（例えば、粉末または顆粒）の活性薬剤を、場合により、バインダー、滑沢剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性薬剤または分散剤と混合し、圧縮することによって調製されてもよい。成型錠剤は、不活性液体希釈剤を用い、活性薬剤を成型することによって作られてもよい。錠剤は、場合により、コーティングされていてもよく、コーティングされていない場合、場合により、割線が入れられてもよい。カプセルは、活性薬剤を単独で、または１つ以上の補助成分と混合し、カプセルシェルに充填し、次いで、これを通常の様式で密封することによって調製されてもよい。カシェーは、カプセルと似ており、活性薬剤を任意の補助成分と共に、米製シートで包んで密封する。また、活性薬剤は、分散性顆粒として配合されてもよく、例えば、投与前に水に懸濁させてもよく、食べ物に振りかけてもよい。顆粒は、例えば、小袋に封入されてもよい。担体が液体である、経口投与に適した製剤は、水性液体または非水性液体の溶液または懸濁物として提示されてもよく、または水中油液体エマルションとして提示されてもよい。
経口投与のための製剤としては、徐放性剤形、例えば、活性薬剤が、適切な放出を制御するマトリックスに配合されるか、または適切な放出を制御する膜でコーティングされた錠剤が挙げられる。このような製剤は、特に、予防的使用にとって好都合であろう。
担体が固体である直腸投与に適した医薬製剤は、最も好ましくは、単位用量の坐剤として提示される。適切な担体としては、ココアバター、および当該技術分野で一般的に使用される他の物質が挙げられる。坐剤は、簡便には、活性薬剤と、軟化または溶融した担体とを混合し，その後、冷却し、型の中で成型することによって作られてもよい。
非経口投与に適した医薬製剤としては、水性または油性のビヒクル中の活性薬剤の滅菌溶液または懸濁物が挙げられる。
注射可能な調製物は、ボーラス注射または連続点滴に適応したものであってもよい。このような調製物は、簡便には、使用のために必要となるまでは、製剤を導入した後に密閉された単位用量または複数回用量の容器内に存在している。または、活性薬剤は、使用前は、粉末形態であり、適切なビヒクル（例えば、滅菌のパイロジェンフリー水）を用いて構築される。
また、活性化合物は、長く作用するデポ剤として配合されてもよく、筋肉内注射または移植によって、例えば、皮下または筋肉内に投与されてもよい。デポ剤は、例えば、適切なポリマー物質または疎水性物質、またはイオン交換樹脂を含んでいてもよい。このような長く作用する製剤は、特に、予防的使用にとって好都合である。
口腔を介する肺投与に適した製剤は、活性化合物を含有し、望ましくは直径が０．５～７ミクロンの粒子が受容者の気管支樹に送達されるように提示される。１つの可能性として、このような製剤は、細かく粉砕された粉末の形態であり、簡便には、吸入デバイスで使用するための穿孔可能なカプセル、適切には、例えばゼラチンのカプセルで、または活性薬剤、適切な液体または気体噴射剤と、場合により、他の成分、例えば、界面活性剤および／または固体希釈剤を含む自己噴射性製剤として提示されてもよい。適切な液体噴射剤としては、プロパンおよびクロロフルオロカーボンが挙げられ、適切な気体噴射剤としては、二酸化炭素が挙げられる。また、自己噴射性製剤を使用してもよく、活性薬剤は、溶液または懸濁物の液滴の形態で分散している。
このような自己噴射性製剤は、当該技術分野で知られているものに類似しており、確立された手順によって調製されてもよい。適切には、自己噴射性製剤は、望ましい噴霧特徴を有する手動で操作可能なバルブまたは自動的に機能するバルブのいずれかを備える容器内に存在しており、有利には、このバルブは、操作ごとに一定の体積（例えば、２５～１００マイクロリットル）を送達する計量型である。
さらなる可能性として、活性薬剤は、アトマイザまたはネブライザで使用するための溶液または懸濁物の形態であってもよく、これによって、加速された空気流または超音波撹拌が使用され、吸入のための微細な液滴のミストを生成する。
経鼻投与に適した製剤としては、肺投与について上に記載したものと一般的によく似た調製物が挙げられる。分散している場合、このような製剤は、望ましくは、鼻腔でとどまることができるように、粒子の直径が１０～２００ミクロンの範囲である。このことは、適切な場合、適切な粒径の粉末の使用または適切なバルブの選択によって達成されてもよい。他の適切な製剤としては、鼻まで閉じた状態で保持した容器から鼻腔を通って迅速に吸入することによって投与するための粒径が２０～５００ミクロンの範囲の粗い粉末、水性または油性の溶液または懸濁物に０．２～５％（ｗ／ｖ）の活性薬剤を含む点鼻薬が挙げられる。
医薬的に許容される担体は、当業者によく知られており、限定されないが、０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸バッファーまたは０．８％生理食塩水が挙げられる。さらに、このような医薬的に許容される担体は、水性または非水性の溶液、懸濁物およびエマルションであってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁物が挙げられ、生理食塩水および緩衝化媒体を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、Ｒｉｎｇｅｒデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸Ｒｉｎｇｅｒ液または固定油が挙げられる。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、不活性気体なども存在していてもよい。
局所製剤に適した製剤は、例えば、ゲル、クリームまたは軟膏として与えられてもよい。このような調製物を、例えば、直接的に創傷または潰瘍の表面に塗り広げるか、または治療すべき領域に、またはその領域の上に貼り付けてもよい適切な支持材（例えば、包帯、ガーゼ、メッシュなど）に乗せることによって、創傷または潰瘍に塗布してもよい。
治療すべき部位（例えば、創傷または潰瘍）に直接的に噴霧するか、または振りかけることが可能な液体製剤または粉末製剤も、提供されてもよい。または、包帯、ガーゼ、メッシュなどの担体を、製剤と共に噴霧するか、または振りかけ、次いで、治療すべき部位に貼り付けてもよい。
本発明のさらなる態様によれば、上述のような医薬または動物用組成物を調製するためのプロセスが提供され、このプロセスは、活性化合物を、例えば混合によって担体と会合させることを含む。一般的に、製剤は、活性薬剤と、液体担体または細かく分割された固体担体、またはこれら両方とを均一に密に会合させ、次いで、必要な場合には、製品へと成形することによって調製される。本発明は、薬剤を、医薬的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルと会合させることを含む、医薬組成物を調製するための方法にまで拡張される。
（投与）
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、経鼻、気管支内、局所（口腔および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈、動脈内および皮内を含む）、腹腔内またはクモ膜下投与に適応したものであってもよい。好ましくは、製剤は、静脈内投与または皮下投与される製剤である。
製剤は、簡便には、単位剤形で、すなわち、単位用量、または複数の単位用量または単位用量の何分の一かの単位を含有する別個の部分の形態で存在していてもよい。例として、製剤は、錠剤および徐放性カプセルの形態であってもよく、医薬分野でよく知られている任意の方法によって調製されてもよい。
本発明の経口投与のための製剤は、所定量の活性薬剤をそれぞれ含有するカプセル、カプセル剤（ｇｅｌｌｕｌｅ）、液滴、カシェー、丸薬または錠剤などの別個の単位として、粉末または顆粒として、水性液体または非水性液体中の活性薬剤の溶液、エマルションまたは懸濁物として、または水中油液体エマルションまたは油中水液体エマルションとして、またはボーラスなどとして提示されてもよい。好ましくは、これらの組成物は、用量あたり、１～２５０ｍｇ、より好ましくは１０～１００ｍｇの活性成分を含有する。
経口投与のための組成物（例えば、錠剤およびカプセル）について、「許容される担体」との用語は、ビヒクル、例えば、一般的な賦形剤、例えば、結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピル－メチルセルロース、ショ糖およびデンプン；フィラーおよび担体、例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチン、ラクトース、ショ糖、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸；および滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウムおよび他のステアリン酸金属塩、グリセロールステアラートステアリン酸、シリコーン液、タルクワックス、油およびコロイド状シリカが挙げられる。香味剤、例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリーフレーバーなどを使用することもできる。剤形を容易に識別可能にするために、着色剤を加えることも望ましいだろう。錠剤は、当該技術分野でよく知られた方法によってコーティングされていてもよい。
錠剤は、場合により１つ以上の補助成分を含み、圧縮または成型によって作られてもよい。圧縮錠剤は、適切な機械で、自由に流動する形態（例えば、粉末または顆粒）の活性薬剤を、場合により、バインダー、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、表面活性薬剤または分散剤と混合し、圧縮することによって調製されてもよい。成型錠剤は、適切な機械中、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を成型することによって作られてもよい。錠剤は、場合により、コーティングされていてもよく、または割線が入れられてもよく、活性成分を遅延放出されるか、または徐々に放出させるように配合されていてもよい。
経口投与に適した他の製剤としては、フレーバー付き基剤、通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントに活性薬剤を含む薬用ドロップ；不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアカシアに活性薬剤を含むトローチ剤；および適切な液体担体に活性薬剤を含むマウスウォッシュが挙げられる。
他の投薬形態は、溶液またはエマルションを含み、静脈内、動脈内、クモ膜下、皮下、皮内、腹腔内または筋肉内に注射されてもよく、滅菌溶液または滅菌可能な溶液から調製される。注射可能な形態は、典型的には、用量あたり１０～１０００ｍｇ、好ましくは１０～２５０ｍｇの活性成分を含有する。
また、本発明の医薬組成物は、坐剤、ペッサリー、懸濁物、エマルション、ローション、軟膏、クリーム、ゲル、スプレー、溶液または粉剤の形態であってもよい。
経皮投与の代替的な手段は、皮膚パッチの使用によるものである。例えば、活性成分を、ポリエチレングリコールまたは液体パラフィンの水性エマルションからなるクリームに組み込んでもよい。さらに、活性成分を、１～１０重量％の濃度で、白ロウまたは白色軟質パラフィン基剤からなる軟膏に、必要な場合には、このような安定化剤および防腐剤と共に組み込むこともできる。
代替的な製剤戦略は、経口または坐剤経路に適した調製物を与えてもよい。投与経路は、疾患を具体的に考慮することによって、有効性を最適化するため、または副作用を最小限にするために、治療の物理化学的特徴によって決定されてもよい。
さらなる投与態様は、留置デバイスのプレコーティング、または他の方法での留置デバイスへの組み込みを使用し、抗体の最適量は、適切な実験によって決定される。
抗体分子は、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、モノマーフラグメント、例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖである。このような抗体フラグメントは、半減期が比較的短いという特徴を有していてもよい。
（投薬量）
当業者は、過度な実験を行うことなく、本発明の組成物のいずれかを被験体に投与するのに適切な用量を容易に決定することができる。典型的には、医師は、個々の患者にとって最も適切であると思われる実際の投薬量を決定し、この量は、使用される特定の薬剤の活性、代謝安定性および薬物が作用する長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与態様および投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の状態の重篤度、個々が受けている治療を含め、種々の因子に依存するだろう。
本発明によれば、提供される組成物を個々の患者に投与してもよい。投与は、好ましくは、「治療に有効な量」での投与であり、治療に有効な量は、患者に便益を示すのに十分な量である。このような便益は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であってもよい。投与される実際の量、投与速度および投与の時間推移は、治療される性質および重篤度によって変わるだろう。治療の処方、例えば、投薬量の決定などは、一般的な実施者および他の医師の責任の範囲内である。抗体の適切な用量は、当該技術分野でよく知られている。Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ Ｊ．Ａ．ら（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４７：６５９－６６４；Ｂａｇｓｈａｗｅ、Ｋ．Ｄ．ら（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ４：９１５－９２２を参照。
正確な用量は、抗体が診断のためであるか、治療のためであるか、治療すべき領域の大きさと位置、抗体の正確な性質（例えば、全抗体、抗体フラグメントまたはダイアボディ）、抗体に接続する任意の検出可能な標識または他の分子の性質を含め、多くの因子に依存するだろう。典型的な用量の抗体が、ボーラスとして静脈内投与されてもよい。他の投与態様としては、同様の累積的な合計容量を達成するための数時間にわたる静脈点滴が挙げられる。これは、成人患者の１回の治療のための用量であり、子供および幼児にはこれに比例して調整してもよく、他の抗体形態についても、分子量に比例して調整してもよい。治療は、医師の判断で、１日に１回、週に２回、週に１回または１ヶ月に１回の間隔で繰り返されてもよい。
本明細書に開示される投薬量は、平均的な症例の例である。もちろん、これより多い投薬量範囲またはこれより少ない投薬量範囲の方が優れている個々の場合が存在することがあり、このような範囲も、本発明の範囲内である。
本発明によれば、Ａｘｌを阻害するのに有効な量の薬剤を投与してもよい。もちろん、この投薬量は、さらに、薬剤投与の種類によって変わるだろう。例えば、急性治療のための「有効な量」を達成するために、非経口投与が好ましい。化合物の５％デキストロース水溶液または生理食塩水溶液、または適切な賦形剤を用いた同様の製剤の静脈点滴が最も効果的であるが、筋肉内ボーラス注射も有用である。典型的には、非経口の用量は、キナーゼを阻害し、または標的受容体を飽和させるのに有効な濃度に血漿中の薬物濃度を維持する様式で、約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｋｇであろう。薬剤は、約０．４～約４００ｍｇ／ｋｇ／日の合計１日用量を達成するレベルで、１日に１～４回投与されてもよい。治療に有効な活性薬剤の正確な量と、このような薬剤を投与する最良の経路は、薬剤の血中レベルと、治療効果を有するのに必要な濃度とを比較することによって、当業者によって容易に決定される。
また、本発明の薬剤は、薬物の濃度が、本明細書に開示する１つ以上の治療適応を達成するのに十分な様式で、患者に経口投与されてもよい。典型的には、薬剤を含有する医薬組成物は、患者の状態に合致する様式で、約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇの経口用量で投与される。好ましくは、経口用量は、約０．５～約２０ｍｇ／ｋｇであろう。
本発明の薬剤は、所与の薬理学的効果を有するのに必要な薬剤の濃度を決定するために、いくつかの生物学的アッセイの１つで試験されてもよい。
（併用療法）
本発明の抗Ａｘｌ抗体は、単独で投与されてもよく、または治療される状態に依存して、同時に、または逐次的に、他の治療と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の抗体またはその接合体を抗癌単剤療法として使用してもよく、または以下に述べるような他の癌治療との併用療法で使用してもよい。他の治療としては、適切な用量の疼痛緩和薬、例えば、非ステロイド系抗炎症性薬（例えば、アスピリン、イブプロフェンまたはケトプロフェン）またはアヘン剤、例えばモルヒネ、または抗制吐薬を投与することが挙げられるだろう。
（併用療法で使用するための適切な薬剤）
これらの薬剤としては、アルキル化剤、例えば、アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン；
ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メルファランおよびウラムスチン、エチレンイミン誘導体、例えば、チオテパ；
ニトロソウレア類、例えば、カルムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン、トリアゼン類、例えば、ダカルバジン、プロカルバジンおよびテモゾロミド；
白金化合物、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチンおよびピコプラチン、オンナプラチン、テトラプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、クロロ（ジエチレンジアミノ）－塩化白金（ＩＩ）、ジクロロ（エチレンジアミノ）－白金（ＩＩ）、ジアミノ（２－エチルマロナト）白金（ＩＩ）、（１，２－ジアミノシクロヘキサン）マロナト白金（ＩＩ）、（４－カルボキシフタロ）－（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）、（１，２－ジアミノシクロヘキサン）－（イソシトラト）白金（ＩＩ）および（１，２－ジアミノシクロヘキサン）－ｃｉｓ－（ピルバト）白金（ＩＩ）；
代謝拮抗剤、抗葉酸剤、例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセドおよびトリメトレキサートを含む；
ピリミジン類似体、例えば、アザシチジン、カペシタビン、シタラビン、エダトレキサート、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビンおよびトロキサシタビン；
プリン類似体、例えば、クラドリビン、クロロデオキシアデノシン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチンおよびチオグアニン；
天然産物、抗腫瘍性抗生物質、例えば、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ポルフィロマイシン、およびアントラサイクリン、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびバルルビシン；
有糸分裂阻害剤、例えば、ビンカアルカロイド類であるビンブラスチン、ビンベシル、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン；
酵素、例えば、Ｌ－アスパラギナーゼおよびＰＥＧ－Ｌ－アスパラギナーゼ；
微小管ポリマー安定化剤、例えば、タキサン類であるパクリタキセルおよびドセタキセル；
Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトテシン類であるイリノテカンおよびトポテカン；ＩＩ型トポイソメラーゼ、例えば、ポドフィロトキシン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、ロソキサントロンおよびアクチノマイシン；
ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、アンドロゲン類、例えば、フルオキシメステロンおよびテストラクトンを含む、
抗アンドロゲン類、例えば、ビカルタミド、シプロテロン、フルタミドおよびニルタミド；
コルチコステロイド類、例えば、デキサメタゾンおよびプレドニゾン；
アロマターゼ阻害剤、例えば、アミノグルテチミド、アナストロゾール、エキセメスタン、ホルメスタンおよびレトロゾール；
エストロゲン類、例えば、ジエチルスチルベストロール；
抗エストロゲン類、例えば、フルベストラント、ラロキシフェン、タモキシフェンおよびトレミフェン；
黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）のアゴニストおよびアンタゴニスト、例えば、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、ロイプロリド、ヒストレリン、デソレリン、酢酸ナファレリンおよびトリプトレリン；
プロゲスチン類、例えば、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール、および
甲状腺ホルモン、例えば、レボチロキシンおよびリオチロニン；
ＰＫＢ経路阻害剤、ペリフォシン、塩酸エンザスタウリンおよびトリシリビンを含む；
ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、セマフォアおよびＳＦ１１２６；
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンおよび類似体；
ＣＤＫ阻害剤、セリシクリブ、アルボシジブおよび７－ヒドロキシスタウロスポリンを含む；
ＣＯＸ－２阻害剤、セレコクシブを含む；
ＨＤＡＣ阻害剤、トリコスタチンＡ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸およびクラミドシンを含む；
ＤＮＡメチラーゼ阻害剤、テモゾロミドを含む；および
アルトレタミン、三酸化ヒ素、サリドマイド、レナリドミド、硝酸ガリウム、レバミゾール、ミトタン、ヒドロキシウレア、オクトレオチド、プロカルバジン、スラミン、光線力学療法用化合物、例えば、メトキサレンおよびポルフィマーナトリウム、およびプロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブを含む種々雑多な薬剤が挙げられる。
分子標的治療薬剤として、
機能性治療薬剤、例えば、遺伝子治療薬剤；
アンチセンス治療薬剤；
チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、塩酸エルロチニブ、ゲフィチニブ、メシル酸イマチニブおよびセマキサニブ；
ＲＡＦ阻害剤、例えば、ソラフェニブ；
遺伝子発現調節剤、例えば、レチノイド類およびレキシノイド類、例えば、アダパレン、ベキサロテン、ｔｒａｎｓ－レチノイン酸、９－ｃｉｓ－レチノイン酸およびＮ－（４－ヒドロキシフェニル）レチンアミド；
表現型に関する治療薬剤、モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、リツキシマブおよびトラスツズマブを含む；
免疫毒素、例えば、エムタンシン、放射性免疫接合体、例えば、Ｉ－トシツモバブ、および
癌ワクチン類が挙げられる。
生物学的治療薬剤として、
インターフェロン類、例えば、インターフェロン－［α］２ａおよびインターフェロン－［α］２ｂ、および
インターロイキン類、例えば、アルデスロイキン、デニロイキン・ディフティトックスおよびオプレルベキンが挙げられる。Ａｘｌ阻害剤として、１－（６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２－ｃ］ピリダジン－３－イル）－Ｎ３－（（７－（Ｓ）－ピロリジン－１－イル）－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－２－イル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－３，５－ジアミン（ＢＧＢ３２４／Ｒ４２８）、ＣＨ５４５１０９８（Ｒｏｃｈｅ）、および本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ０７／０８９１７７号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２１２７５号およびＰＣＴ／ＥＰ２０１１／００４４５１号に記載されるＡｘｌ阻害剤が挙げられる。
癌細胞に対して作用することを意図したこれらの薬剤に加えて、抗癌治療は、保護薬剤および補助薬剤の使用を含み、
細胞保護薬剤、例えば、アミホスチンおよびデクスラゾキサン；
ホスホナート類、例えば、パミドロン酸塩およびゾレドロン酸；および
刺激因子、例えば、エポエチン、ダルベオペチン、フィルグラスチム、ＰＥＧ－フィルグラスチムおよびサルグラモスチムを含む。
多くの化学治療薬の組み合わせレジメンが、当該技術分野で知られており、例えば、カルボプラチン／パクリタキセル、カペシタビン／ドセタキセル、フルオラウラシル／レバミゾール、フルオラウラシル／ロイコボリン、メトトレキサート／ロイコボリン、およびトラスツズマブ／パクリタキセルの組み合わせを単独で、または、さらにカルボプラチンとの組み合わせなどが知られている。
（免疫チェックポイント調整剤）
本明細書に開示の抗Ａｘｌ抗体と組み合わせて使用するのに特に好ましい種類の薬剤は、免疫チェックポイント調整剤（ＩＣＭ）、例えば、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）である。
免疫チェックポイントは、免疫系の阻害経路であり、腫瘍によって、免疫抵抗性を誘発するように機能変換される場合がある。免疫チェックポイントをブロックするか、または調整し、それにより、癌の免疫抵抗性を減らすか、または逆行させるために、Ｔ細胞刺激受容体および阻害受容体、樹状細胞刺激受容体を含む抗体を使用することは、癌研究における重要な手段である。
免疫チェックポイントを調整する抗体の使用によって調整され得るＴ細胞刺激受容体としては、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＴＷＥＡＫＲ、ＨＶＥＭおよびＴＩＭ－１が挙げられる。免疫チェックポイントを調整する抗体の使用によって調整され得るＴ細胞阻害受容体としては、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３およびＴＩＧＩＴが挙げられる。免疫チェックポイントを調整する抗体の使用によって調整され得る樹状細胞刺激受容体としては、ＣＤ４０および４－１ＢＢが挙げられる。
したがって、本明細書に開示の抗Ａｘｌ抗体と組み合わせて使用するのに適したＩＣＭとしては、当該技術分野で多くのものが知られている、免疫チェックポイントを調整するか、または阻害する抗体が挙げられる。特に適切な免疫チェックポイントを調整する抗体としては、以下のものが挙げられる。
イピリムマブおよびトレメリムマブを含む、ＣＴＬＡ－４標的抗体。
ペムブロリズマブ、ニボルマブおよびＡＭＰ－５１４／ＭＥＤＩ０６８０を含む、ＰＤ－１標的抗体。
ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８ＣおよびＢＭＳ－９３６５５９を含む、ＢＤ－Ｌ１標的抗体。
ウレルマブおよびＰＦ－０５０８２５６６を含む、４－１ＢＢ標的抗体。
ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３（ｒＯＸ４０Ｌ）およびＭＯＸＲ０９１６を含む、ＯＸ－４０標的抗体。
ＴＲＸ５１８を含む、ＧＩＴＲ標的抗体。
ＣＤＸ－１１２７を含む、ＣＤ２７標的抗体。
ＣＰ－８７０，８９３を含む、ＣＤ４０標的抗体。
ＢＭＳ－９８６０１６を含む、ＬＡＧ３標的抗体。
ＩＣＭ抗体の組み合わせを、本発明の抗Ａｘｌ抗体と組み合わせて使用する場合、使用する全てのＩＣＭ抗体が、阻害受容体を標的としていてもよく、使用する全てのＩＣＭ抗体が、刺激受容体を標的としていてもよく、または阻害受容体と刺激受容体の組み合わせを標的とするＩＣＭ抗体を使用してもよい。
したがって、本開示は、Ａｘｌに結合し、本明細書に記載されるように、治療（例えば、癌などの増殖性疾患の治療）に使用するための抗体を提供し、ここで、治療は、さらに、１つ以上の免疫チェックポイントを調整する抗体を含む。同様に、本明細書に記載されるように、増殖性疾患（例えば、癌）の治療のための医薬の製造における、Ａｘｌに結合する抗体が提供され、ここで、治療は、さらに、１つ以上の免疫チェックポイントを調整する抗体を含む。抗体は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ＡＭＰ－５１４／ＭＥＤＩ０６８０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＭＳ－９３６５５９、ウレルマブ、ＰＦ－０５０８２５６６、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３（ｒＯＸ４０Ｌ）、ＭＯＸＲ０９１６、ＴＲＸ５１８、ＣＤＸ－１１２７、ＣＰ－８７０，８９３およびＢＭＳ－９８６０１６から選択されてもよい。癌は、肺癌、黒色腫、乳癌、卵巣癌または癌腫から選択されてもよい。
本発明の化合物を、１つ以上の免疫チェックポイントを調整する抗体を投与する前に、１つ以上の免疫チェックポイントを調整する抗体と同時に、１つ以上の免疫チェックポイントを調整する抗体を投与した後に投与してもよい。
（抗腫瘍抗体）
本発明の抗Ａｘｌ抗体と組み合わせて使用するための別の特に好ましい種類の薬剤は、Ａｘｌ以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体である。このような本発明の抗Ａｘｌ抗体と組み合わせて使用するのに適した抗体を、以下の表に提示する。
Figure 0007071935000006
Figure 0007071935000007
本明細書全体で、好ましくは、本明細書に記載の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる。本方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行うこともできる。
（レポーターおよびアッセイ）
本発明は、Ａｘｌに対する、本明細書に提供されるような抗体の結合を引き起こし、または可能にすることを含む方法を提供する。示したように、このような結合をｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、抗体、または抗体をコードする核酸の投与の後に行ってもよく、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析、免疫細胞化学、免疫組織化学、免疫沈降またはアフィニティクロマトグラフィーで行ってもよい。
Ａｘｌ受容体に結合した抗体の量を決定してもよい。定量化は、試験サンプル中の抗原の量に関連していてもよく、試験サンプルは、診断目的のサンプルであってもよい。
サンプル中の抗体の反応性は、任意の適切な手段によって決定されてもよい。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、１つの可能性である。放射性標識された抗原を、非標識抗原（試験サンプル）と混合し、抗体に結合させる。結合した抗原は、結合していない抗原から物理的に分離され、抗体に結合した放射性抗原の量を決定する。試験サンプル中に存在する抗原が多いほど、抗体に結合する放射性抗原が少なくなるだろう。また、抗原またはレポーター分子に連結するアナログを用い、競合結合アッセイを非放射性抗原と共に使用してもよい。レポーター分子は、蛍光色素、リン光物質、または分光学的に単離される吸光度または発光特徴を有するレーザー染料であってもよい。適切な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリンおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが挙げられる。適切な発色性染料としては、ジアミノベンジジンが挙げられる。
他のレポーターとしては、高分子コロイド状粒子または粒状物質、例えば、着色した磁性または常磁性のラテックスビーズ、検出可能なシグナルを直接的または間接的に、目で見て観察されるか、電気的に検出されるか、または他の様式で記録されるようにすることができる生物学的または化学的に活性な薬剤が挙げられる。これらの分子は、例えば、発色または色変化を起こすか、または電気特性を変化させる反応を触媒する酵素であってもよい。これらのレポーターは、分子的に励起可能であってもよく、その結果、エネルギー状態間の電子遷移によって、特徴的なスペクトル吸収または発光が生じる。これらのレポーターとしては、バイオセンサと組み合わせて使用される化学部分が挙げられるだろう。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出系を使用してもよい。
個々の抗体－レポーター接合体によって作られるシグナルを使用し、サンプル（正常および試験）中の関連する抗体結合の定量可能な絶対的または相対的なデータを誘導してもよい。
本発明は、競合アッセイにおいて抗原レベルを測定するための上述のような抗体の使用、すなわち、競合アッセイにおいて、本発明によって提供される抗体を使用することによって、サンプル中の抗原レベルを測定する方法も提供する。結合していない抗原から結合した抗原を物理的に分離することが必要ではない場合もある。結合に対して物理的変化または光学的変化を起こすような抗体へのレポーター分子の接続も１つの可能性である。レポーター分子は、直接的または間接的に検出可能なシグナル、好ましくは測定可能なシグナルを生成してもよい。レポーター分子の接続は、例えば、直接的または間接的に、共有結合によるものであってもよく（例えば、ペプチド結合を介する）、または非共有結合によるものであってもよい。ペプチド結合を介する接続は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合の組換え発現の結果としてであってもよい。
本発明は、例えば、バイオセンサシステムにおいて、本発明の抗体を使用することによって、抗体のレベルを直接的に測定することも提供する。
結合を決定する態様は、本発明の特徴ではなく、当業者は、好みおよび一般的な知識にしたがって、適切な態様を選択することができる。
（競合する抗体）
本発明は、さらに、抗原に結合し、本明細書に実質的に提示されるアミノ酸を有するＣＤＲまたは本明細書に実質的に提示されるアミノ酸配列を有する可変ドメインを含む抗体可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬのいずれか、または両方）を含む抗体とＡｘｌとに対する結合と競合する抗体にまで拡張される。抗体間の競合は、例えば、他のタグ化されていない結合メンバー存在下で検出可能な１つの結合メンバーに対して特異的なレポーター分子をタグ化し、同じエピトープまたは重なり合っているエピトープに結合する抗体の同定を可能にすることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで容易にアッセイすることができる。競合は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーを用いて決定されてもよい。または、競合する抗体は、実施例６に記載されるように、Ｂｉｏｃｏｒｅ装置を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって同定されてもよい。
別の方法では、目的の抗体によって結合されるＡｘｌ上のエピトープに結合する抗体（例えば、Ａｘｌに対する１０Ｇ５抗体の結合をブロックするもの）についてスクリーニングするために、通常の交差ブロックアッセイ、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるアッセイを行ってもよい。
競合について試験する際に、抗原のペプチドフラグメント、特に、目的のエピトープを含むペプチドを使用してもよい。エピトープ配列と１つ以上のアミノ酸をいずれかの末端に有するペプチドを使用してもよい。このようなペプチドは、特定の配列から「本質的になる」と言われる場合がある。本発明の抗体は、抗原に対する結合が、所与の配列を有するペプチドまたは所与の配列を含むペプチドによって阻害されるような抗体であってもよい。これを試験する際に、いずれかの配列と１つ以上のアミノ酸を含むペプチドを使用してもよい。
特異的なペプチドに結合する抗体は、例えば、ペプチドパンニングによって、ファージディスプレイライブラリから単離されてもよい。
（核酸、構築物および発現）
本発明は、さらに、本発明の抗体をコードする、単離された核酸を提供する。核酸には、ＤＮＡとＲＮＡが含まれる。好ましい態様では、本発明は、上に定義する本発明のＣＤＲ、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする核酸を提供する。
本発明は、上述の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態での構築物も提供する。
本発明は、上述の１つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞も提供する。任意のＣＤＲ、ＶＨまたはＶＬドメイン、または提供されるような抗体をコードする核酸は、それ自体が本発明の一態様を形成し、コードされる産物を産生する方法を行う場合、この方法は、コードする核酸からのそれらの発現を含む。発現は、簡便には、核酸を含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって達成されてもよい。発現による産生の後、ＶＨまたはＶＬドメイン、または抗体を、当該技術分野で知られている任意の適切な技術を用いて単離および／または精製してもよい。
本発明の抗体、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、コードする核酸分子およびベクターは、例えば、その天然環境から、実質的に純粋または均一な形態で、単離および／または精製された状態で提供されてもよく、または核酸の場合には、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の元々の核酸または遺伝子を含まないか、または実質的に含まない。本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいてもよく、全体的または部分的に合成であってもよい。本明細書に提示されるヌクレオチドとの言及は、その内容が他の意味であることが必要な場合を除き、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、ＴをＵで置換した特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
種々の異なる宿主細胞中のポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は、よく知られている。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母、バキュロウイルスおよび昆虫細胞の系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のための当該技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０およびＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト細胞株ＨＥＫ－２９３およびＰＥＲ．Ｃ６およびその他多くが挙げられる。一般的に、好ましい細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中の抗体および抗体フラグメントの発現は、当該技術分野で十分に確立されている。総説としては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５－５５１ （１９９１）を参照。培養物における真核細胞中の発現も、抗体産生のための選択肢として、当業者には利用可能である。総説として、例えば、Ｒｅｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３－５７６；Ｔｒｉｌｌ Ｊ．Ｊ．ら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ６：５５３－５６０を参照。
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適切な他の配列を含め、適切な制御配列を含む適切なベクターが選択され、または構築されてもよい。ベクターは、適切な場合、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、またはファージミドであってもよい（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、シークエンシング、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現を含む核酸の操作、タンパク質の分析のための多くの既知の技術およびプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２に詳細に記載されている。
したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書に開示の核酸を含有する宿主細胞を提供する。なおさらなる態様は、このような核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。導入は、任意の利用可能な技術を使用してもよい。真核細胞の場合、適切な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、レトロウイルスまたは他のウイルス（例えば牛痘、または昆虫細胞の場合はバキュロウイルス）を用いる、リポソームが介在するトランスフェクションおよび形質導入が挙げられるだろう。細菌細胞の場合、適切な技術としては、塩化カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いるトランスフェクションが挙げられる。
導入の後に、例えば、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することによって、核酸から発現させてもよく、または核酸からの発現を可能にしてもよい。
一実施形態では、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込まれる。組み込みは、標準的な技術にしたがって、ゲノムとの組換えを促進する配列を含むことによって促進されてもよい。
本発明は、上述の抗体またはポリペプチドを発現するために、発現系に上述の構築物を用いることを含む方法も提供する。
本発明の態様および実施形態を、以下の実験を参照しつつ、実施例によって説明する。
本明細書のいずれかの箇所で引用される全ての文献が、本明細書に参考として組み込まれる。
（発明の提示）
以下の段落は、多くの特定的に想定される本発明の実施形態と組み合わせを記載する。
１． Ａｘｌに結合し、
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、配列番号３１および配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＨ ＣＤＲを含んでいてもよい、ＶＨドメイン；および／または
配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＬ ＣＤＲを含む、ＶＬドメインを含む、抗体。
２． 配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含むＶＨドメインを含む、段落１に記載の抗体。
３． 配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む、提示１または２のいずれか１つに記載の抗体。
４． １０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ１）ドメイン（配列番号１）および１０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ２）ドメイン（配列番号２）からなる群から選択される抗体ＶＨドメイン；および／または
１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ１）ドメイン（配列番号３）および１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ２）ドメイン（配列番号４）からなる群から選択される抗体ＶＬドメインを含む、提示１～３のいずれかに記載の抗体。
５． １０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ１）ドメイン（配列番号１）を含む、段落１～４のいずれかに記載の抗体。
６． １０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ２）ドメイン（配列番号２）を含む、段落１～５のいずれかに記載の抗体。
７． １０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ１）ドメイン（配列番号３）を含む、段落１～６のいずれかに記載の抗体。
８． １０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ２）ドメイン（配列番号４）含む、段落１～７のいずれかに記載の抗体。
９． ｓｃＦｖ抗体分子を含む、段落１～８のいずれかに記載の抗体。
１０． 抗体定常領域を含む、段落１～９のいずれかに記載の抗体。
１１． 重鎖定常領域が、配列番号５で述べられる配列を有する、段落１０に記載の抗体。
１２． １０Ｇ５ ＧＨ１重鎖（配列番号６）を含む、段落１～１１のいずれかに記載の抗体。
１３． １０Ｇ５ ＧＨ２重鎖（配列番号７）を含む、段落１～１２のいずれかに記載の抗体。
１４． 軽鎖定常領域を含む、段落１～１３のいずれかに記載の抗体。
１５． 軽鎖定常領域が、配列番号８で述べられる配列を有する、段落１４に記載の抗体。
１６． １０Ｇ５ ＧＬ１軽鎖（配列番号９）を含む、段落１～１５のいずれかに記載の抗体。
１７． １０Ｇ５ ＧＬ２軽鎖（配列番号１０）を含む、段落１～１６のいずれかに記載の抗体。
１８． 全抗体を含む、段落１７に記載の抗体。
１９． 抗原に結合する能力に加え、さらなる機能的特徴を与えるさらなるアミノ酸を含む、段落１～１８のいずれか１つに記載の抗体。
２０． 配列番号１２のＶＨと配列番号１３のＶＬとを含むキメラ抗体よりも少なくとも１５％小さなＫＤでＡｘｌに結合する、段落１～１９のいずれか１つに記載の抗体。
２１． １０－９Ｍ以下のＫＤでＡｘｌに結合する、段落１～２０のいずれか１つに記載の抗体。
２２． 配列番号１２のＶＨと配列番号１３のＶＬとを含むキメラ抗体よりも少なくとも１５％小さなＥＣ５０を有する、段落１～２１のいずれか１つに記載の抗体。
２３． 脱フコシル化されている、段落１～２２のいずれか１つに記載の抗体。
２４． ＡｘｌがヒトＡｘｌである、段落１～２３のいずれか１つに記載の抗体。
２５． 霊長類Ａｘｌに特異的に結合する、段落１～２４のいずれか１つに記載の抗体。
２６． （ｉ）１０－３Ｍより大きなＫＤでマウスＡｘｌに結合し；
（ｉｉ）１０－３Ｍより大きなＫＤでヒトＭｅｒに結合し；および／または
（ｉｉｉ）１０－３Ｍより大きなＫＤでヒトＴｙｒｏ３に結合する、段落１～２５のいずれか１つに記載の抗体。
２７． Ｇａｓ６に対するＡｘｌの結合を阻害する、段落１～２６のいずれか１つに記載の抗体。
２８． Ａｘｌ受容体の発現をダウンレギュレーションする、段落１～２７のいずれか１つに記載の抗体。
２９． 前記抗体が、Ａｘｌ受容体の発現を、前記抗体と接触しない以外は同一の処理をされたサンプルで観察されるレベルの５０％未満まで減少させる、段落２８に記載の抗体。
３０． Ａｘｌ受容体の発現のダウンレギュレーションが、前記サンプルと前記抗体とを接触させてから１２時間以内に観察される、段落２８または２９のいずれか１つに記載の抗体。
３１． Ａｘｌ受容体の発現のダウンレギュレーションが、前記サンプルと前記抗体とを接触させてから少なくとも２４時間持続する、段落２８～３０のいずれか１つに記載の抗体。
３２． Ａｘｌ受容体のインターナリゼーション速度を高める、段落１～３１のいずれか１つに記載の抗体。
３３． Ａｘｌ活性を阻害する、段落１～３２のいずれか１つに記載の抗体。
３４． 前記抗体が、Ａｘｌの自己リン酸化を阻害する、段落１～３３のいずれかに記載の抗体。
３５． 前記抗体が、Ａｘｌ受容体の下流のシグナル伝達を阻害する、段落３３または３４のいずれか１つに記載の抗体。
３６． 本発明の抗体と接触したサンプルにおけるセリン４７３でのＡｋｔのリン酸化が、前記抗体と接触しない以外は同一の処理をされたサンプルで観察されるレベルの５０％未満である、段落３３～３５のいずれか１つに記載の抗体。
３７． 細胞死の速度を高める、段落１～３６のいずれか１つに記載の抗体。
３８． 腫瘍成長を阻害する、段落１～３７のいずれか１つに記載の抗体。
３９． 線維化マーカー、例えば、α－ＳＭＡ、Ｃｏｌ１Ａ１、ＭＣＰ１および／またはＴＧＦ－βの発現を減らす、段落１～３８のいずれか１つに記載の抗体。
４０． 検出可能な標識、酵素または毒素に対して接合され、この接合体化がペプチジル結合またはリンカーを介していてもよい、段落１～３９のいずれか１つに記載の抗体。
４１． 前記毒素が、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦを含む群から選択される、段落４０に記載の抗体。
４２． 前記検出可能な標識がＦＩＴＣである、段落４０に記載の抗体。
４３． ハイブリドーマＷＲ－１０Ｇ５－Ｅ５から得ることができる１０Ｇ５抗体によって結合するエピトープに結合する、段落１～４２のいずれか１つに記載の抗体。
４４． 段落１～３９のいずれか１つに記載の抗体または抗体ＶＨドメインまたは抗体ＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
４５． 段落４４に記載の核酸を用いて形質転換された宿主細胞。
４６． 抗体または抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを産生する方法であって、前記抗体または抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを産生するための条件下で、段落４０に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
４７． 前記抗体または抗体ＶＨ可変ドメインまたは抗体ＶＬ可変ドメインを単離および／または精製することをさらに含む、段落４６に記載の方法。
４８． 前記抗体または抗体ＶＨ可変ドメインまたは抗体ＶＬ可変ドメインを、少なくとも１つのさらなる構成要素を含む組成物に配合することをさらに含む、段落４６または段落４７に記載の方法。
４９． 段落１～３９のいずれか１つに記載の抗体またはその免疫接合体を、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、組成物。
５０． 免疫チェックポイントモジュレーターおよび／またはＡｘｌ以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体をさらに含む、段落４９に記載の組成物。
５１． 第２の抗Ａｘｌ抗体をさらに含み、この第２の抗Ａｘｌ抗体が、Ａｘｌ結合について、ハイブリドーマＷＲ－１０Ｇ５－Ｅ５から得ることができる１０Ｇ５抗体と競合しない、段落４９に記載の組成物。
５２． 前記免疫チェックポイントモジュレーターが、抗体、例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペンブロリズマブ、ミボルマブ（ニボルマブ）、ＡＭＰ－５１４／ＭＥＤＩ０６８０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＭＳ－９３６５５９、ウレルマブ、ＰＦ－０５０８２５６６、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３（ｒＯＸ４０Ｌ）、ＭＯＸＲ０９１６、ＴＲＸ５１８、ＣＤＸ－１１２７、ＣＰ－８７０，８９３またはＢＭＳ－９８６０１６である、段落５０に記載の組成物。
５３． 前記Ａｘｌ以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体が、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、ＩＧＮ１０１、アデカツムマブ、ラベツズマブ、ｈｕＡ３３、ペムツモマブ、オレゴボマブ、ＣＣ４９（ミンレツモマブ）、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ１８、ＭＯＲＡｂ－００３（ファルレツズマブ）、３Ｆ８、ＣＨ１４．１８、ＫＷ－２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ＩｇＮ３１１、ベバシズマブ、ＩＭ－２Ｃ６、ＣＤＰ７９１、エタラシズマブ、ボロシキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ８０６、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＭＭ－１２１、ＡＭＧ １０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ－Ａ１２、ＭＫ－０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ（ＨＧＳ－ＥＴＲ１）、ＨＧＳ－ＥＴＲ２，ＣＳ－１００８、デノスマブ、シブロツズマブ、Ｆ１９、８１Ｃ６からなる群から選択される、段落５０に記載の組成物。
５４． ある治療方法で使用するための、段落１～４２のいずれか１つに記載の抗体、または段落４９～５３のいずれか１つに記載の組成物。
５５． 線維化障害を治療する方法で使用するための段落５４に記載の抗体または組成物。
５６． 増殖性疾患を治療する方法で使用するための段落５４に記載の抗体または組成物。
５７． 前記増殖性疾患が癌である、段落５６に記載の抗体または組成物。
５８． 前記癌が転移性癌である、段落５７に記載の抗体または組成物。
５９． Ａｘｌの発現または活性の増加によって特徴付けられる疾患または障害を治療するための医薬の製造における、段落１～４２のいずれか１つに記載の抗体または段落４９～５３のいずれか１つに記載の組成物の使用。
６０． Ａｘｌの発現または活性の増加によって特徴付けられる疾患または障害を治療する方法であって、当該方法が、前記疾患または障害を患う患者、または前記疾患または障害が進行するリスクがある患者に対し、段落１～４３のいずれか１つに記載の抗体または段落４９～５３のいずれか１つに記載の組成物を投与することを含む、方法。
６１． 前記治療する方法が、免疫チェックポイントモジュレーターおよび／またはＡｘｌ以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体と組み合わせて、段落１～４１のいずれか１つに記載の抗体または段落４９～５３のいずれか１つに記載の組成物を投与することを含む、段落５４～５８のいずれか１つに記載の抗体、または請求項６０に記載の方法。
６２． 前記抗体が、転移性癌細胞を標的とするための医薬組成物の送達に介在する、段落６０に記載の方法。
６３． Ａｘｌの過剰発現によって特徴付けられる疾患または障害を検出するための診断薬剤の製造における、段落１～４１のいずれか１つに記載の抗体と、転移性癌細胞に対する前記抗体の結合を決定することが可能な１つ以上の試薬の使用。
６４． Ａｘｌの過剰発現によって特徴付けられる疾患または障害を診断する方法であって、当該方法が、前記疾患または障害を患う患者、または前記疾患または障害が進行するリスクがある患者に対し、段落１～３２のいずれか１つに記載の抗体または段落４９～５３のいずれか１つに記載の組成物と、転移性癌細胞に対する前記抗体の結合を決定することが可能な１つ以上の試薬を投与することを含む、方法。
６５． 段落１～４１のいずれか１つに記載の抗体と、転移性癌細胞に対する前記いずれかの抗体の結合を決定することが可能な１つ以上の試薬とを含む、診断キット。
６６． 段落１～４１のいずれか１つに記載の抗体または段落４９～５３のいずれか１つに記載の組成物を含む、キット。
６７． 薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、有効成分として、段落１～４１のいずれか１つに記載の抗体を有効な量で含む、医薬組成物。
（実施例１：マウス抗Ａｘｌモノクローナル抗体の作成）
ヒトＡｘｌ受容体に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を、Ｃ末端のＭｙｃエピトープに融合した全長ヒトＡｘｌをコードするプラスミドを用いた免疫応答ＮＭＲＩマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）のＤＮＡ免疫付与によって作成した。
標準プロトコルに従い、血中にｒｈＡｘｌ特異的抗体の存在を示すマウス由来の脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞と融合させるために使用した。この細胞を、ハイブリドーマ選択のためのヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）培地を用い、プレート中で培養した（ウェルあたり１０５細胞）。１２日間の選択の後、１４種類の生成したハイブリドーマの上清を集め、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）およびフローサイトメトリーにおいて、Ａｘｌ結合について試験した。限界希釈による２回目のサブクローニングの後に最も高い抗原結合活性を示す３種類の陽性クローンを、大規模抗体産生のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティクロマトグラフィーによって、細胞培養物の上清からＭＡｂを精製した。
フローサイトメトリーにおいて、Ａｘｌ＋細胞に特異的な結合を示す抗体クローン１０Ｇ５を、さらなる特性決定のために選択した。
フローサイトメトリーのために、培養物中の接着細胞をＰＢＳで洗浄し、１分間のトリプシン（０．２５％）処理と、完全に剥離させるために培養皿を叩くことによって、剥離させた。組織培養フラスコに完全培地を添加し、その後、細胞をＰＢＳで洗浄することによって、トリプシンの働きを止めた。この洗浄工程の間に、２００ｇで５分間、遠心分離処理することによって、細胞を集めた。この抗体を、０．０２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中、合計濃度になるように希釈した。
１０５個の細胞を含む細胞懸濁物２００μＬを用い、室温で２０分間かけて細胞染色を行った。ＰＢＳ／０．０２％ＢＳＡを用いた２回の洗浄工程の後、細胞を、２００μＬに再懸濁させ、濃度２μｇ／ｍＬのＡＰＣが接合したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号７１５－１３６－１５０）と共に、室温で２０分間インキュベートした。染色した細胞をＰＢＳ／０．０２％ＢＳＡで２回洗浄し、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ細胞分析機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析するまで、氷上で保存した。
（実施例２：マウスモノクローナル抗体１０Ｇ５は、ヒトＴＡＭ受容体ファミリーの他のメンバーと交差反応しない）
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、全ての結合実験を２５℃で行った。ヒトＴＡＭ受容体ファミリーのメンバーであるＡｘｌ（ｒｈＡｘｌ－Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４－ＡＬ）、Ｍｅｒ（ｒｈＭｅｒ－Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８９１－ＭＲ）およびＴｙｒｏ３（ｒｈＴｙｒｏ３／Ｄｔｋ－Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５９－ＤＫ）の細胞外ドメインに対応する可溶性組換え抗原を、それぞれ３９３．０、３０３．６および３６４．０レゾナンスユニット（ＲＵ）の表面密度で、アミンカップリングを用い、ＣＭ５センサチップの表面に固定した。Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓウィザードを用い、自動モードでＢｉａｃｏｒｅの試行を行った。ＨＢＳ－ＥＰバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中にＭＡｂ １０Ｇ５を濃度１０μｇ／ｍＬで含有するサンプルを、固定された抗原を有する表面の上に、３０μＬ／分の流速で３分間注入し（会合）、その後、５分間かけて解離させた。
図１に示される結果は、マウスモノクローナル抗体１０Ｇ５がヒトＡｘｌに対して特異的に結合することと、組換えヒトＭｅｒおよびＴｙｒｏ３抗原に結合しないことを示す。
（実施例３：マウスモノクローナル抗体１０Ｇ５は、マウスＡｘｌと交差反応しない）
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃で結合実験を行った。ヒトＡｘｌ（ｒｈＡｘｌ－Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４－ＡＬ）、マウスＡｘｌ（ｒｍＡｘｌ－Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号８５４－ＡＸ）およびヒトＴｙｒｏ３（ｒｈＴｙｒｏ３／Ｄｔｋ－Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５９－ＤＫ）に対応する可溶性組換え抗原を、それぞれ１，３０８．０、２，１１５．９および１，４２９．０ＲＵの表面密度で、アミンカップリングを用い、ＣＭ５センサチップの表面に固定した。Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓウィザードを用い、自動モードでＢｉａｃｏｒｅの試行を行った。
ＨＢＳ－ＥＰバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中にＭＡｂ １０Ｇ５または組換えマウス（ｒｍ）Ａｘｌ－リガンドＧａｓ６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９８６－ＧＳ／ＣＦ）を濃度１０μｇ／ｍＬで含有するサンプルを、固定された抗原を有する表面の上に、３０μＬ／分の流速で３分間注入し（会合）、その後、５分間かけて解離させた。
図２に示される結果は、ＭＡｂ １０Ｇ５とヒトＡｘｌの特異的な相互作用と、組換えマウスＡｘｌ抗原およびヒトＭｅｒ抗原には結合しないことを示す（図２、それぞれ上側および中央のパネル）。対照的に、コントロールとして使用したマウスＧａｓ６は、ヒトＡｘｌおよびマウスＡｘｌの両方に対する強い結合と、これよりいくらか弱いが、ヒトＴｙｒｏ３に対する結合を示した（図２、下側のパネル）。
（実施例４：マウスモノクローナル抗体１０Ｇ５は、非ヒト霊長類由来のＡｘｌ受容体に特異的に結合する）
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；配列番号２７）由来のＡｘｌ受容体の配列を、ＷＯ２００９０６２６９０Ａ１号から検索した。その配列に基づき、ヒトＦｃとの融合タンパク質として、ＣＨＯ細胞中の一時的な発現によって、Ｃｙｎｏ－Ａｘｌの組換え細胞外ドメインを作成した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、均質になるように、組換えＣｙｎｏ－Ａｘｌ－Ｆｃを精製した。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃で結合実験を行った。ヒトＡｘｌ（ｒｈＡｘｌ－Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４－ＡＬ）に対応可溶性組換え抗原とＣｙｎｏ－Ａｘｌを、アミンカップリングを用い、それぞれ７７５ＲＵおよび８８０ＲＵの表面密度でＣＭ５センサチップ表面に固定した。Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓウィザードを用い、自動モードでＢｉａｃｏｒｅの試行を行った。
ＨＢＳ－ＥＰバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中にＭＡｂ １０Ｇ５またはヒトＡｘｌ－特異的なＭＡｂ ５Ｆ１１（コントロール）を濃度１０μｇ／ｍＬで含有するサンプルを、固定された抗原を有する表面の上に、３０μＬ／分の流速で３分間注入し（会合）、その後、５分間かけて解離させた。
図３に示される結果は、ＭＡｂ １０Ｇ５と、ヒトおよびカニクイザルに由来する両方のＡｘｌ抗原との強く特異的な相互作用を示す。対照的に、コントロール抗体５Ｆ１１は、ヒトＡｘｌに対する強い結合を示し、カニクイザル由来のＡｘｌとの交差反応性はなかった。
（実施例５：マウスモノクローナル抗体１０Ｇ５の親和性決定）
抗Ａｘｌ抗体１０Ｇ５の親和性決定を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、表面プラズモン共鳴測定によって２５℃で行った。固体抗原でコーティングされた表面として、固定されたｒｈＡｘｌ－Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４－ＡＬ）を密度１９０ＲＵで含むセンサチップＣＭ５を使用した。
速度論的測定のために、ＨＢＳ－ＥＰバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ－１００１－８８）中のさまざまな濃度の抗Ａｘｌ抗体（０．３～６６６．７ｎＭ）を、流速３０μＬ／分、３分の注射時間で注射し、その後、５分間解離させた（バッファーのみ）。それぞれのサイクルの後、再生溶液（１０ｍＭ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ）を流速５０μＬ／分で３０分間注射することによって、表面を再生した。
物質移動コントロール実験は、ＭＡｂ １０Ｇ５について、顕著な物質移動の制限がないことを示した。１種類の検体濃度（ＭＡｂ １０Ｇ５について１６０ｎＭ）を１分間、３分間、２０分間注射した後に、解離段階が実質的に同じであったことから、Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎのコントロール実験から、結合様式は明らかにならなかった。
速度論的な会合速度（オンレート、ｋｏｎ）および解離速度（オフレート、ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアと１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて計算された。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算された。生成した抗体－抗原複合体の半減期（ｔ１／２）は、ｌｎ２／ｋｏｆｆ比として計算された。
図４に示されるように、マウスＭＡｂ １０Ｇ５は、ナノモル未満の範囲で高い親和性を示し、ＫＤ値は０．５３ｎＭである。
（実施例６：マウスモノクローナル抗体１０Ｇ５は、Ａｋｌに対するＧａｓ６の結合をブロックする）
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＢｉｎｄｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓウィザードを用い、２種類のサンプル注射の何回かのサイクルを用いて競合結合試験を行った。第１のサンプルとして、飽和濃度のＭＡｂ １０Ｇ５（１６０ｎＭまたは２４μｇ／ｍＬ）を、ｒｈＡｘｌ－Ｆｃで（アミンカップリングを用いて）コーティングされたＣＭ５センサチップ表面の上に注射した後、流速３０μＬ／分で３分間、次いで、２．５分間安定化（ＨＢＳ－ＥＰバッファーのみ）した後、第２のサンプルを注射した。以下の第２のサンプルを使用した。組換えヒト（ｒｈ）Ｇａｓ６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８８５－ＧＳ）、組換えマウス（ｒｍ）Ｇａｓ６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９８６－ＧＳ／ＣＦ）および抗Ａｘｌ抗体のパネル、例えば ＭＡＢ１５４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ１５４）と１０Ｇ５（全て濃度は２５μｇ／ｍＬ）。第２のサンプルを３分間かけて注射した後、２．５分間安定化させ（バッファーのみ）、再生溶液（１０ｍＭ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ）を流速５０μＬ／分で３０秒間注射することによって表面を再生した。
図５に示される結果は、ＭＡｂ １０Ｇ５が、Ａｘｌ結合に対して、市販のコントロール抗体ＭＡＢ１５４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と競合しないことを示した。しかし、抗体１０Ｇ５は、ヒト由来およびマウス由来の両方で、そのリガンドＧａｓ６によるＡｘｌの結合を阻害した。
（実施例７：マウスモノクローナル抗体１０Ｇ５は、３次元（３Ｄ）表現器官型モデルにおいて侵攻性が高い乳癌細胞の成長を阻害する）
侵攻性が高いトリプルネガティブヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－２６ＴＭ）を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを追加した、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養素混合物Ｆ－１２ Ｈａｍ培地中、推奨される条件で培養した。細胞外マトリックスに入れる前に、細胞表面に対する抗体の適切な結合を確実にするために、細胞を懸濁物中、３７℃で少なくとも１時間前処理した。細胞培養物を毎日観察し、１日おきに新しい処理を行った。抗体を濃度５０～１００μｇ／ｍＬで使用した。カバースリップ３Ｄアッセイ（３５ｍｍ皿）のイメージングを、Ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔとＨｏｆｆｍａｎ ｏｐｔｉｃｓを両方とも用い、ＮＩＫＯＮ光顕微鏡を用いて行った。既に３日目に、ＭＡｂ１０Ｇ５で処理した細胞の成長と、コントロールの無関係なＩｇＧで処理した細胞の成長に差がみられた。６日目に、抗体１０Ｇ５で処理した細胞は、細胞外マトリックスにおいて、コントロールで処理された細胞と比較して、増殖および腫瘍塊の成長を有意に阻害することが明らかになった（図６）。核染色から、ＭＡｂ １０Ｇ５で処理された細胞は、増殖が阻害されたが、まだ生存可能であることがわかった。この実験は、抗Ａｘｌ抗体１０Ｇ５が、表現器官型の腫瘍塊の成長を阻害する可能性を有することを示した。
（実施例８：抗体１０Ｇ５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで３Ｄ腫瘍コロニーの形態変化を誘発する）
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を細胞外マトリックス上で成長させ、侵攻性が高い星形の形態を形成させた。次いで、この星形の腫瘍塊を、実施例７に記載したように、コントロールＩｇＧおよび抗体１０Ｇ５で処理した。抗体１０Ｇ５は、細胞死およびＤＮＡフラグメント化に伴う星形パターンの分解を引き起こした（図７）。これらの結果は、特異的なモノクローナル抗体１０Ｇ５を用いてＡｘｌをブロックすると、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、３Ｄモデルにおいて強い抗腫瘍効果を有することを示した。
（実施例９：抗体１０Ｇ５は、Ａｘｌ受容体のインターナリゼーションを誘発する）
さまざまな抗体で処理したＭＢＡ－ＭＤ－２３１細胞におけるＡｘｌ受容体タンパク質の発現をウエスタンブロット分析によって試験した。この細胞を、密度５×１０５細胞／ウェルで６－ウェルプレートに播種し、処理開始まで一晩培養した。この細胞を、アイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ２ｂ）、濃度１００μｇ／ｍＬの抗Ａｘｌ抗体（１０Ｇ５およびＭＡｂ３番）または濃度０．５μＭのマルチキナーゼ阻害剤フォレチニブ（Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、Ａｘｌ、Ｔｉｅ－２およびＶＥＧＦＲ２を標的とする）存在下、２０時間処理し、その後、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離処理することによって集め、滅菌ＰＢＳで洗浄した。この細胞を遠心分離処理することによって集め、ＮＰ４０－溶解バッファーに再懸濁させ、その後、氷上で３０分間インキュベートした。細胞溶解物を遠心分離処理（１２，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）によって透明にし、ＢＣＡタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定した。３５μｇの総タンパク質を含有する細胞溶解物サンプルを、還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）存在下で編成させ、ＮｕＰＡＧＥ １０％ ビス－Ｔｒｉｓポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル（１．０ｍｍ×１２ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のウェルにロードした。ビス－Ｔｒｉｓ ＳＤＳランニングバッファーを用い、推奨された条件（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で電気泳動を行い、２０％メタノールを含む移動バッファーを用い、ＸＣｅｌｌ ＩＩＴＭＢｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）についてのマニュアルの２種類のゲルについて記載されるように、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。この膜を、１０ｍＬのブロッキングバッファー、５％の脱脂粉乳を含むＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中、室温で１時間インキュベートし、その後、抗Ａｘｌ ＭＡＢ１５４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の１：１０００希釈を含む５ｍＬのインキュベーションバッファー（３％の脱脂粉乳を含むＴＢＳＴ）中、４℃で一晩インキュベートした。この膜を、それぞれ１０ｍＬのＴＢＳＴを用いて５分間、３回洗浄し、その後、５ｍＬのインキュベーションバッファー中、室温で穏やかに回転させつつ、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰが接合した二次抗体（１：２０００）と共に１時間インキュベートした。その後、この膜を、１０ｍＬのＴＢＳＴを用いて５分間、３回洗浄し、１０ｍＬのＴＢＳバッファーを用い、２回洗浄した。この膜を、１ｍＬのＥＣＬ基質と共に、室温で１分間インキュベートした。過剰な基質溶液を吸引し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＸＲＳ＋イメージャー（Ｂｉｏ Ｒａｄ）およびＩｍａｇｅ ｌａｂソフトウェアを用い、ブロットを可視化した。ローディングコントロールとして、抗マウスアクチン抗体（１：１０，０００；Ｓｉｇｍａ）を用いた検出を同じ条件で使用した。
図８に示される結果は、ＭＡｂ １０Ｇ５で処理された細胞において、無関係なＩｇＧまたはＭＡｂ３番のいずれかで処理された細胞と比較して、Ａｘｌタンパク質が有意に減少していることを示した。この結果は、ＭＡｂ １０Ｇ５が、Ａｘｌ受容体のインターナリゼーションおよび細胞内分解を誘発することを示している。
（実施例１０：抗体１０Ｇ５は、リガンドによって誘発されるＡｘｌの下流のシグナル伝達をブロックする）
ヒト子宮頸癌に由来する細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２ＴＭ）を用いて実験を行った。この細胞をＴ１７５フラスコ中、１０％のＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよびＬ－グルタミンを追加したＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）中で８０％のコンフルエンシーになるまで成長させた。この細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いた処理によって脱着させ、その後、遠心分離処理し、新鮮な培地（ＭＥＭ／０．５％ＦＢＳ）に再懸濁させた。この細胞を、１０％ＦＢＳを追加したＭＥＭ培地中、Ｐｅｔｒｉ皿に播種した（３×１０６細胞／皿）。３７℃で３時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、飢餓培地（ＭＥＭ／０．５％ ＦＢＳ）中、一晩維持した。この細胞を、濃度１μｇ／ｍＬの抗Ａｘｌ抗体１０Ｇ５と共に、あらかじめ１時間インキュベートした後、濃度１０μｇ／ｍＬのＡｘｌリガンド、組換えマウスＧａｓ６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて２０分間刺激した。細胞溶解物を実施例９に記載したように調製し、抗－ホスホ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、次いで、ヤギ抗ウサギセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用い、ウエスタンブロット分析を行った。抗ホスホ－Ａｋｔは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２およびＡＫＴ３を区別せず、したがって、「ホスホ－Ａｋｔ」の合計レベルをブロットに示している。抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた検出を、ローディングコントロールとして使用した。
図９に示される結果は、Ａｘｌに特異的なリガンドＧａｓ６が、読み出しとしてＳｅｒ４７３上のＡｋｔの下流のリン酸化に使用したＨｅＬａ細胞において強いＡｘｌシグナル伝達を誘発することを示した。このシグナル伝達は、抗体１０Ｇ５の存在下で顕著に減少させることができた。
（実施例１１：マウスモノクローナル抗体１０Ｇ５のシークエンシング）
ハイブリドーマ細胞を、標準的な条件で繁殖させた。５×１０６個のハイブリドーマ細胞を、標準的なプロトコルにしたがって、ｍＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成に使用した。重鎖および軽鎖の可変領域（それぞれＶＨおよびＶＬ）をコードする遺伝子のＰＣＲ増幅のために、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｐｒｏｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ｆ２０１０）を使用した。
ハイブリドーマ１０Ｇ５について、異なるプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲ増幅により、ＶＨ遺伝子について６種類の異なるプライマーの組み合わせを用い、ＰＣＲから１２種類の配列が得られ、ＶＬ遺伝子について２種類の異なるプライマーの組み合わせを用い、ＰＣＲから５種類の配列が得られた。ＩＭＧＴデータベースを用いたヌクレオチドアラインメントによって決定されるように、対応する生殖細胞配列との最も高いホモロジーに基づき、さらなる作業のためにクローンＶＨ１（Ｂ６－４）およびＶκ１（Ｆ１－３）の配列を選択した。
抗体１０Ｇ５について、ＶＨおよびＶＬドメインの推定アミノ酸配列を図１０に示す。
（実施例１２：キメラモノクローナル抗体１０Ｇ５の作成および試験）
マウスハイブリドーマ１０Ｇ５から検索したＶＨ配列およびＶＬ配列を、哺乳動物細胞（ＧｅｎｅＡｒｔ）における発現のためにコドン最適化した合成遺伝子の作成に使用した。哺乳動物細胞における抗体産生に適した発現ベクターにおいて、これらのマウスのＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を、それぞれヒトＩｇＧ１の重鎖および軽（Ｃ－κ）鎖の定常ドメインをコードする遺伝的要素と共に、フレーム内でライゲーションした。キメラ（マウス可変／ヒト定常）ＩｇＧ１抗体の産生は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での一時的な発現、次いで、タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーを用いた精製によって達成された。
フローサイトメトリーにおいて、Ａｘｌ陽性乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する結合について、精製されたキメラ抗体（純度は９５％を超える）を分析した。比較のために、親マウスＭＡｂ １０Ｇ５を使用した。フローサイトメトリーのために、培養物中の付着性細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン（０．２５％）で１分間処理することによって脱着させ、完全に脱着させるために培養皿を叩いた。組織培養フラスコに完全培地を加え、その後、細胞をＰＢＳで洗浄することによって、トリプシンの機能を完全に消滅させた。洗浄工程の間、２００ｇで５分間の遠心分離処理によって細胞を集めた。０．０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中の合計濃度について、抗体を希釈した。１０５個の細胞を含む２００μＬの細胞懸濁物を用い、室温で２０分間、細胞染色を行った。ＡＰＣが接合したロバ抗ヒトまたは抗マウスのＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をそれぞれ用い、細胞に結合した抗体を検出した。ＰＢＳ／０．０２％ＢＳＡを用いた２回の洗浄工程の後、細胞を２００μＬに再懸濁させ、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析するまで、氷上で保存した。図１１に示される結果は、フローサイトメトリーにおいて、Ａｘｌ陽性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するキメラ抗体の強い結合を示していた。
これに加えて、キメラ抗体ｃ１０Ｇ５のＡｘｌ結合特性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と、表面密度１，３０８．０ＲＵでヒトＡｘｌ（ｒｈＡｘｌ－Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４－ＡＬ）でコーティングされたセンサチップＣＭ５を用いて試験した。Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓウィザードを用い、自動モードでＢｉａｃｏｒｅの試行を行った。ＨＢＳ－ＥＰバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中にキメラ抗体ｃ１０Ｇ５またはそのマウス相当物のいずれかを濃度１０μｇ／ｍＬで含むサンプルを、固定された抗原を有する表面の上に、３０μＬ／分の流速で３分間注入し（会合）、その後、５分間かけて解離させた。
図１２に示される結果は、キメラ抗体ｃ１０Ｇ５が、ハイブリドーマ１０Ｇ５ｙに由来する対応するマウス抗体の結合プロフィールと非常によく似たプロフィールで、固定されたＡｘｌに結合することを示している。
（実施例１３：キメラ抗体１０Ｇ５は、親マウス抗体と同じ親和性でＡｘｌに結合する）
キメラ抗Ａｘｌ抗体ｃ１０Ｇ５の親和性決定を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、表面プラズモン共鳴測定によって２５℃で行った。固体抗原がコーティングされた表面として、固定されたｒｈＡｘｌ－Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４－ＡＬ）を密度１９０ＲＵで含むセンサチップＣＭ５を使用した。
速度論的測定のために、ＨＢＳ－ＥＰバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ－１００１－８８）中のさまざまな濃度の抗Ａｘｌ抗体（０．３～３３３．３ｎＭ）を、流速３０μＬ／分、３分の注射時間で注射し、その後、５分間解離させた（バッファーのみ）。それぞれのサイクルの後、再生溶液（１０ｍＭ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ）を流速５０μＬ／分で３０分間注射することによって、表面を再生した。
物質移動コントロール実験は、キメラＭＡｂ ｃ１０Ｇ５について、顕著な物質移動の制限がないことを示した。
速度論的な会合速度（オンレート、ｋｏｎ）および解離速度（オフレート、ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアと１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて計算された。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算された。生成した抗体－抗原複合体の半減期（ｔ１／２）は、ｌｎ２／ｋｏｆｆ比として計算された。
図１３に示されるように、キメラＭＡｂ ｃ１０Ｇ５は、ナノモル濃度未満で高い親和性を示し、ＫＤ値が０．１０ｎＭであり、親マウス抗体の親和性よりもいくらか良い（実施例５を参照）。
（実施例１４：キメラ抗体１０Ｇ５は、ヒト非小細胞肺癌のマウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害する）
ｉｎ ｖｉｖｏで抗Ａｘｌキメラ抗体の抗腫瘍活性を評価するために、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のマウス異種移植モデルを使用した。ヒトＮＳＣＬＣＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－１８５）Ａ５４９細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１ＭのＨＥＰＥＳバッファー、０．４５％のＤ－（＋）－グルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを追加したＤＭＥＭ培地中、単層培養物として繁殖させた。無血清培地／マトリゲル（１：１）に再懸濁させた５×１０６個のＡ５４９細胞を用い、ヌードマウスの脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ３に達したら（図１４では０日目）、動物を無作為に分け、ビヒクル（滅菌ＰＢＳ）または２０ｍｇ／ｋｇの抗Ａｘｌキメラ抗体１０Ｇ５のいずれで、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を週に２回、４週間行うことによって治療した。
図１４に示されるように、キメラ抗体１０Ｇ５は、コントロールと比較して、Ａ５４９腫瘍の成長を有意に弱めた（二元配置ＡＮＯＶＡによって決定される場合、Ｐ＜０．０１）。治療４週間後に、ほぼ４０％の阻害が観察された。
（実施例１５：キメラ抗体１０Ｇ５は、ヒト急性骨髄性白血病のマウス異種移植モデルにおいて腫瘍成長を阻害する）
血液癌モデルにおける抗Ａｘｌキメラ抗体の抗腫瘍活性を評価するために、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のマウス異種移植モデルを使用した。ヒトＡＭＬ Ｍｖ４－１１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－９５９１）細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを追加したＩＭＤＭ培地中、懸濁物で繁殖させた。無血清ＩＭＤＭ培地およびマトリゲル（１：１）の混合物に再懸濁させた５×１０６個のＭｖ４－１１細胞を用い、ヌードマウスの脇腹にｓ．ｃ．移植した。腫瘍の大きさが２００ｍｍ３に達したら（図１５では０日目）、動物を無作為に分け、ビヒクル（滅菌ＰＢＳ）または３０ｍｇ／ｋｇの抗Ａｘｌキメラ抗体１０Ｇ５のいずれで、ｉ．ｐ．注射を週に２回、４週間行うことによって治療した。
図１５に示されるように、キメラ抗体１０Ｇ５は、コントロールと比較して、Ｍｖ４－１１腫瘍の成長をきわめて有意に弱めた（二元配置ＡＮＯＶＡによって決定される場合、Ｐ＜０．０００１）。３週間の治療の後に、ほぼ７５％の阻害が観察された。
（実施例１６：脱フコシル化され、糖操作されたＣ１０Ｇ５（Ｇｌｙｍａｘ）は、ヒト非小細胞肺癌のマウスモデルにおいて、Ｃ１０Ｇ５と比較して、向上した抗腫瘍効果を示す）
裸の抗Ａｘｌ抗体は、標的受容体の特異的なシグナル伝達経路を阻害することによって、および／またはそのエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を介する腫瘍細胞殺滅によって、腫瘍成長を防ぐことができる。コアのフコシル化を欠く抗体は、顕著に向上した抗体依存性の細胞が介在する細胞毒性（ＡＤＣＣ）および抗腫瘍活性の増加した有効性を示した。
キメラ抗体ｃ１０Ｇ５の２種類のバリアント（野生型および脱フコシル化したもの）の抗腫瘍効果を比較するために、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のマウス異種移植モデルを使用した。ヒトＮＳＣＬＣＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－１８５）Ａ５４９細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１ＭのＨＥＰＥＳバッファー、０．４５％のＤ－（＋）－グルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを追加したＤＭＥＭ培地中、単層培養物として繁殖させた。無血清培地／マトリゲル（１：１）に再懸濁させた５×１０６個のＡ５４９細胞を用い、ＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍の大きさが１３０ｍｍ３に達したら（図１５では０日目）、動物を無作為に分け、抗Ａｘｌ ｃ１０Ｇ５またはＧｌｙｍａｘ－ｃ１０Ｇ５のいずれかで３０ｍｇ／ｋｇで、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を週に２回、４週間行うことによって治療した。
図１６に示されるように、抗体Ｇｌｙｍａｘ－ｃ１０Ｇ５は、ｃ１０Ｇ５と比較して、Ａ５４９腫瘍の成長を有意に弱めた（二元配置ＡＮＯＶＡによって決定される場合、Ｐ＜０．０００１）。キメラ１０Ｇ５の野生型および脱フコシル化態様の活性における有意差は、腫瘍成長の阻害における抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の重要性を示している。
（実施例１７：ｈｕ１０Ｇ５ Ｈ２Ｌ１は、ヒト非小細胞肺癌のマウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害する）
ｈｕ１０Ｇ５ Ｈ２Ｌ１は、１０Ｇ５のヒト化バリアントである。抗体は、マウス１０Ｇ５のＣＤＲおよび結合特異性を有するが、Ｖ－ドメインフレームワーク領域に複数の置換を有する。ｈｕ１０Ｇ５ Ｈ２Ｌ１の抗腫瘍活性をｉｎ ｖｉｖｏで評価するために、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のマウス異種移植モデルを使用した。ヒトＮＳＣＬＣＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－１８５）Ａ５４９細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１ＭのＨＥＰＥＳバッファー、０．４５％のＤ－（＋）－グルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを追加したＤＭＥＭ培地中、単層培養物として繁殖させた。無血清培地／マトリゲル（１：１）に再懸濁させた５×１０６個のＡ５４９細胞を用い、ＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ３に達したら（図１６では１８日目）、動物を無作為に分け、ビヒクル（ＳＹＮＡＧＩＳ）または３０ｍｇ／ｋｇの抗Ａｘｌ ｈｕ１０Ｇ５ Ｈ２Ｌ１のいずれで、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を週に２回、２週間行うことによって治療した。
図１７に示されるように、抗体ｈｕ１０Ｇ５ Ｈ２Ｌ１は、コントロールと比較して、Ａ５４９腫瘍の成長を有意に弱めた（二元配置ＡＮＯＶＡによって決定される場合、Ｐ＜０．０５１）。２週間の治療の後に、ほぼ２５％の阻害が観察された。
（実施例１８：糖操作されたｈｕ１０Ｇ５（Ｈ１Ｌ１－ＧＬＹＭＡＸＸ）は、ヒト非小細胞肺癌のマウスモデルにおける腫瘍成長に対する抗ＥＧＦＲ治療の効果を強める）
ｈｕ１０Ｇ５（Ｈ１Ｌ１－ＧＬＹＭＡＸＸ）は、ヒト化され、脱フコシル化された抗体であり、１０Ｇ５のＣＤＲおよび結合特異性を有している。ｈｕ１０Ｇ５（Ｈ１Ｌ１－ＧＬＹＭＡＸＸ）の抗腫瘍活性をｉｎ ｖｉｖｏで評価するために、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のマウス異種移植モデルを使用した。ヒトＮＳＣＬＣＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－１８５）Ａ５４９細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１ＭのＨＥＰＥＳバッファー、０．４５％のＤ－（＋）－グルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを追加したＤＭＥＭ培地中、単層培養物として繁殖させた。無血清培地／マトリゲル（１：１）に再懸濁させた５×１０６個のＡ５４９細胞を用い、ヌードマウスの脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ３に達したら（図１８では０日目）、動物を無作為に分け、ビヒクル（ＳＹＮＡＧＩＳ）、エルビタックス（２０ｍｇ／ｋｇ）またはｈｕ１０Ｇ５（Ｈ１Ｌ１－ＧＬＹＭＡＸＸ）（１５ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇ）を単独で、または組み合わせて治療した。抗体を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を週に２回、３週間行うことによって投与した。
図１８に示されるように、ｈｕ１０Ｇ５（Ｈ１Ｌ１－ＧＬＹＭＡＸＸ）は、抗ＥＧＦＲ治療抗体セツキシマブ（エルビタックス）の抗腫瘍効果と非常によく似た中程度の抗腫瘍活性を示した。しかし、単一薬剤として使用した両方の抗体について、観察された効果は、アイソタイプコントロール抗体（Ｓｙｎａｇｉｓ）を用いて治療したマウスコホートと比較すると、統計学的には有意なものではなかった。両抗体を組み合わせると、アイソタイプコントロールで治療した動物と比較したときに、有意な腫瘍成長の遅れが生じた（二元配置ＡＮＯＶＡによって決定される場合、Ｐ＜０．０００１）。この効果は、ｈｕ１０Ｇ５（Ｈ１Ｌ１－ＧＬＹＭＡＸＸ）抗体またはエルビタックス単独のいずれかで治療した群と比較しても有意であった（二元配置ＡＮＯＶＡによって決定される場合、Ｐ＜０．０５）。
（実施例１９：ヒト化Ｈ２Ｌ１およびＨ１Ｌ１ １０Ｇ５抗体の親和性決定）
フローサイトメトリーで、ｃ１０Ｇ５と、ヒト化１０Ｇ５バリアントの結合分析。ＡＸＬ＋細胞およびＡＸＬ－細胞に対するＩｇＧの滴定。
フローサイトメトリーのために、培養物中の付着性細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン（０．２５％）で１分間処理することによって脱着させた。２００ｇで５分間の遠心分離処理によって細胞を集めた。０．０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中の合計濃度について、抗体を希釈した。２０００００個の細胞を含む２００μＬの細胞懸濁物を用い、室温で３０分間、細胞染色を行った。ＡＰＣが接合したロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ番号７０９－１３６－１４９、１：４００希釈）を用い、細胞に結合した抗体を検出した。ＰＢＳ／０．０２％ＢＳＡを用いた２回の洗浄工程の後、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させ、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析するまで、氷上で保存した。
以下の表３、また図１９Ａおよび１９Ｂに示されるように、ヒト化１０Ｇ５抗体は、ナノモル濃度未満の範囲で高い親和性を示した。
Figure 0007071935000008
（実施例２０：ヒト化Ｈ２Ｌ１およびＨ１Ｌ１ １０Ｇ５抗体の細胞殺滅活性）
抗体－サポリン接合体を用いた腫瘍細胞殺滅。キメラ１０Ｇ５と、２種類のヒト化１０Ｇ５バリアントの比較。
免疫毒素の作成のために、ＦａｂＦｃ－ＺＡＰヒト接合体（最終濃度４．５ｎＭ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＴ－６５）を用い、キメラＭＡｂを、植物毒素サポリンに非共有結合によってカップリングさせた。Ａｘｌ陽性腫瘍細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒトトリプルネガティブ乳癌腫）を用い、ｃｈＡｂ－サポリンインターナリゼーションが腫瘍細胞の生存率に与える影響を試験した。１０％ＦＢＳ、Ｌ－グルタミン（４ｍＭ）、ストレプトマイシン（５μｇ／ｍｌ）およびペニシリン（５Ｕ／ｍｌ）を追加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地中、９６ウェルプレートに、ウェルあたり８００個の細胞を播種し、１６時間かけて付着させた。この細胞を、異なる希釈度の免疫毒素ｃｈＡｂ－サポリンと共に７２時間インキュベートした。ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を用いたＸＴＴ／ＰＭＳアッセイを行うことによって、この細胞の生存率を決定した。
図２０に示される結果は、１０Ｇ５に基づく免疫毒素の良好なインターナリゼーションと、ピコモル範囲のＥＣ５０値（５０％の細胞を死滅させるのに有効な濃度）で、非常に強い細胞殺滅の効能を示した。
接合していないサポリンと、サポリンに接続したアイソタイプコントロール抗体（ヒトＩｇＧ１）（コントロールＳＡＰ）をネガティブコントロールとして使用した。５０％の細胞を殺滅させるのに有効な濃度（ＥＣ５０、ｐＭ）を以下の表４に示す。
Figure 0007071935000009
（実施例２１：１０Ｇ５と従来技術の抗Ａｘｌ抗体の比較）
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ抗体ＹＷ３２７．６Ｓ２：結合したエピトープ
直接的なＢｉａＣｏｒｅ競合結合分析は、１０Ｇ５が、Ａｘｌに対する結合について、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ抗体ＹＷ３２７．６Ｓ２と競合しないことを示す。このことは、この２つの抗体が異なるエピトープに結合することを示す。
（材料／装置）
１．抗Ａｘｌモノクローナル抗体（全てＰＢＳ中）
（１）ｃ１０Ｇ５（１２６、ＭＡＢ－Ｇ、Ｅｖｉｔｒｉａ、ロット番号３４３９） ４．６ｍｇ／ｍＬ
（２）ＹＷ３２７．６Ｓ２－ｖａｒ（１５３、ＣＯＮＴＲ－１、Ｅｖｉｔｒｉａ、ロット番号＃３５３７） ４．５ｍｇ／ｍＬ
２．固定されたＨｕ－Ａｘｌ－Ｆｃ（６６１．９ＲＵ）、ｈｕ－ＥＧＦＲ－Ｆｃ（５４８．５ＲＵ）、モノ－Ａｘｌ（７７６．６ＲＵ）を含む、センサチップＣＭ５ ５番
３．試行バッファー（ＨＢＳ－ＥＰ） Ｂｉａｃｏｒｅ；カタログ番号ＢＲ－１００１－８８；ロット番号１０２１３１７６
４．プラスチックバイアル７ｍｍ（０．８ｍＬ） Ｂｉａｃｏｒｅ；カタログ番号ＢＲ－１００２－１２
５．再生溶液： １０ｍＭ ＨＣＬ、１ＭＮａＣＬ
６．Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ
（方法）
１．ＨＢＳ－ＥＰ中、全ての抗体を１００μｇ／ｍＬ（６６６．７ｎＭ）になるまで希釈する。
（１）ｃ１０Ｇ５ ２５μＬ＋１ｍＬ
（２）ＹＷ３２７．６Ｓ２－ｖａｒ ３７．５μＬ＋１．５ｍＬ
２．装置の制御ソフトウェアにおいて、以下のテンプレートを使用する。
アッセイ原理：直接的な結合
注射：
・使用フローセル：２、リファレンスとして１
・流速：３０（μＬ／分）
・注射回数：２
・第１のサンプル：
○注射時間：３（分）
○注射後の待ち時間：２．５（分）
・第２のサンプル：
○注射時間：３（分）
○注射後の待ち時間：２．５（分）
サイクル：
試行順序：入れた順
Figure 0007071935000010
再生：
・１回の注射
・再生流速：５０（μＬ／分）
・溶液：１０ｍＭ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ
・注射時間：３０（秒）
・注射針を前もって浸漬するか：いいえ
・再生後の安定化時間：２（分）
３．その日の終わりに、脱着させる（３ｍＬのＢＩＡｄｅｓｏｒｂ溶液１、３ｍＬのＢＩＡｄｅｓｏｒｂ溶液２）。
４．その週の終わりに、消毒する（０．５２５ｍＬのＢＩＡｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔ溶液＋６．４７５ｍＬのｄｄＨ２０、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）。
５．曲線をテキストファイルとしてエクスポートする。ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、ＣＡ）を用い、センサーグラムを開き、分析する。
（結果）
第１のサンプル（ＭＡｂ ｃ１０Ｇ５またはＹＷ３２７．６Ｓ２－ｖａｒ）を、１～２分以内に水平状態に達するのに十分な濃度で注射し、その後、ＭＡｂ ＹＷ３２７．６Ｓ２－ｖａｒを第２のサンプルとして注射することによって、競合結合分析を行った（図２１Ａ）。
実験の第２部において、抗体ＹＷ３２７．６Ｓ２－ｖａｒを第１のサンプルとして注射し、その後、抗体ＹＷ３２７．６Ｓ２－ｖａｒまたはｃ１０Ｇ５を第２のサンプルとして注射した（図２１Ｂ）。
（結論）
この結果は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの抗体ＹＷ３２７．６Ｓ２が、ｃ１０Ｇ５抗体存在下で、ヒトＡｘｌに結合することができることを示した。したがって、ＹＷ３２７．６Ｓ２と１０Ｇ５抗体は、異なるエピトープを認識する。
これらが異なるエピトープに結合することと一致して、１０Ｇ５とＹＷ３２７．６Ｓ２は、種によって異なる交差反応性を示す。ＹＷ３２７．６Ｓ２は、ヒトＡｘｌおよびマウスＡｘｌの両方と交差反応し（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０１０）２９、５２５４－５２６４、ページ５２５５、左側の欄を参照）、一方、１０Ｇ５は、マウスＡｘｌに対し、顕著な結合を示さない（実施例３を参照）。
（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ抗体ＹＷ３２７．６Ｓ２：細胞殺滅）
抗体－サポリン接合体を用いた腫瘍細胞殺滅を実施例２０に記載したように行った。ヒト化１０Ｇ５の２種類のバリアントとＹＷ３２７．６Ｓ２の比較を行った。結果を以下の表５に示す。
Figure 0007071935000011
（ＩＮＳＥＲＭ抗体Ｄ９およびＥ８）
１０Ｇ５とは異なり、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３３、５４０５－５４１４（２０１４年１１月２０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｏｎｃ．２０１３．４８７）に記載の「Ｄ９」抗体および「Ｅ８」抗体は、Ａｘｌに対するＧＡＳ６の結合を阻害しない。このことは、Ｄ９抗体およびＥ８抗体が、１０Ｇ５と同じエピトープに結合しないことを示す。
（Ｕ３ Ｐｈａｒｍａ １１Ｂ７抗体）
ＷＯ ２００９０６２６９０ Ａ１号に記載される１１Ｂ７抗体は、受容体Ａｘｌに対するＧＡＳ６リガンドの結合を阻害しないことが示されている。このことは、１１Ｂ７抗体が、１０Ｇ５と同じエピトープに結合しないことを示す。
（実施例２２：１０Ｇ５と従来技術の抗Ａｘｌ抗体のさらなる比較）
（比較される抗体）
実施例２１に記載した抗Ａｘｌ抗体のいくつかについて、さらなる試験を行った。試験した抗体は、以下であった。
Ｈｕ１０Ｇ５（Ｈ２Ｌ１）＊＋
Ｈｕ１０Ｇ５（Ｈ２Ｌ１－ｐｒｅｐ２）＊＋
キメラ１０Ｇ５＋、ＷＯ２０１６／０９７３７０号
ＹＷ３２７．６Ｓ２［Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］
Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ「Ｈ９－Ｌ０」抗Ａｘｌ、ＵＳ２０１２／０１２１５８７号（配列番号３および６５）
ＩＮＳＥＲＭ 抗Ａｘｌ Ｄ４、ＷＯ２０１６／０９１８９１号（ＶＨ＝配列番号１、ＶＬ＝配列番号２）
Ｕ３ Ｐｈａｒｍａ「１１Ｄ５」抗Ａｘｌ、ＷＯ２００９／０６２６９０Ａ１号
キメラ１Ｈ１２、ＷＯ２０１５／１９３４２８号
＊同じ抗体配列、異なる調製物
＋同じＣＤＲ配列
（結合競合アッセイ）
（目標）
上の抗体が、
（１）同じエピトープまたは重なり合うエピトープに結合する
（２）Ａｘｌに対する結合について、Ｇａｓ６と競合する
かどうかを決定すること。
（材料）
上述の抗体
ｒｈＧａｓ６リガンド
固定されたＡｘｌ：Ｈｓ－Ａｘｌ－Ｆｃ（６３８．２ＲＵ）、Ｍｍ－Ａｘｌ－Ｆｃ（３３４．５ＲＵ）、Ｒｈｅ－Ａｘｌ－Ｆｃ（３５０．２ＲＵ）を含むセンサチップ
実施例２１と同じバッファー、溶液およびＢｉａｃｏｒｅ装置。
（方法）
（概要）
この実験では、第１の抗体を飽和するまで結合させた。次いで、第２の抗体を適用し、その結合する能力をモニタリングした。
第２の抗体が第１の抗体と同じ（または重なり合う）エピトープを認識する場合、結合はブロックされるだろう。第２の抗体が、異なるエピトープを認識する場合、結合は、第１の抗体が存在しない場合と同じレベルで検出されるだろう。
Ｇａｓ６をＨＢＳ－ＥＰ中、１０μｇ／ｍＬで用い、Ｇａｓ６が抗体の結合をブロックする能力も試験した。
Ｈｓ－Ａｘｌ－Ｆｃ表面、Ｍｍ－Ａｘｌ－Ｆｃ表面およびＲｈｅ－Ａｘｌ－Ｆｃ表面に対して、並行して全ての試験を行った。
試験した対のリストについては、図１を参照（このリストにおいて、Ｃｏｎｔｒ－１は、ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒではなく、誤って標識されたＹＷ３６７である）。全ての抗体は、ＨＢＳ－ＥＰ中、２５μｇ／ｍＬであった。
（工程）
１．溶液の調製。
Figure 0007071935000012
 ２．Ｂｉａｃｏｒｅ実験を２５℃で行う。
３．装置の制御ソフトウェアにおいて、直接的な結合（Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ）を選択し、以下に示すように２種類の注射について設定を選択する。
４．上述の溶液を適切な試薬ラックの位置に置き、サンプル含有量および推奨容量と、Ｂｉｏｃｏｒｅソフトウェアによって示唆される示されたラック位置とを合わせる。
５．テンプレートと結果のファイルを保存し、分析を開始する。
（アッセイ原理）
アッセイ原理：直接的な結合
（注射）
使用フローセル：２、３、４、リファレンスとして１
流速：２０（μＬ／分）
注射回数：２
第１のサンプル：
注射時間：３（分）
注射後の待ち時間：２．５（分）
第２のサンプル：
注射時間：４（分）
注射後の待ち時間：２．５（分）
（サイクル）
試行順序：入れた順
繰り返し数 第１のサンプル 第２のサンプル
必要な場合、各Ａｂ対を用い、両方の構成で試験した。すなわち、第１のサンプルがＡ、第２のサンプルがＢと、第１のサンプルがＢ、第２のサンプルがＡ。
（結果）
典型的なＢｉａｃｏｒｅ応答グラフを図２１に示す。各注射の開始が、それぞれの対応する応答と共に示されている。各注射で使用したタンパク質も示されている。再生段階は各試験の後に首尾良く行われたが、明確さのために図２１から痕跡量は削除している。
以前の結果と一致して、ＹＷ３２７．６Ｓ２のみがマウスＡｘｌ－Ｆｃに結合した。ヒトＡｘｌ－ＦｃおよびカニクイザルＡｘｌ－Ｆｃに対する全ての抗体の結合は、定性的に同様の結果を与えた。
ＣｈｕｇａｉおよびＩＮＳＥＲＭは、全ての条件でこれより弱い結合を示し、ＩＮＳＥＲＭは、検出可能な結合を示していない（Ａｂの不完全なバッチであることを示唆している）。Ｃｈｕｇａｉの結合は、結合したエピトープを評価するのに十分に強いものであった。以下の表には、固定されたＡｘｌ－Ｆｃに既に別のタンパク質が結合している場合に、第２のタンパク質が結合する能力をまとめている。第２のタンパク質の結合が、第１のタンパク質の存在によって影響を受けない場合、これらは独立したエピトープを有し、一方、第１のタンパク質が、第２のタンパク質の結合をブロックする場合、そのエピトープは、重なり合っているか、または近い位置にあるにちがいない。
Figure 0007071935000013
予想される通り、Ｈ２Ｌ１およびＨ２Ｌ１－ｐｒｅｐ２は、同じ抗体配列を有する異なる調製物であるため、重なり合うエピトープを有する。
Ｈ２Ｌ１と、ＹＷ３２７．６Ｓ２またはＵ３の結合間に競合は観察されず、このことは、これらが別個のエピトープを有することを示している。Ｃｈｕｇａｉの結合は弱かったが、このデータは、これもＨ２Ｌ１と同じエピトープを共有していないことを示唆している。
第１のタンパク質がＧａｓ６であった場合、データは、Ｇａｓ６が、Ｈ２Ｌ１、Ｈ２Ｌ１ ｐｒｅｐ２およびＹＷ３２７．６Ｓ２の結合をブロックすることを示す。Ｇａｓ６は、ＣｈｕｇａｉまたはＵ３の結合をブロックしない。
１Ｈ１２と、ＹＷ３２７．６Ｓ２または１０Ｇ５のいずれかの結合間に競合は観察されず、このことは、これらが別個のエピトープに結合することを示している。
（結論）
固定されたＡｘｌ－Ｆｃに対するＨ２Ｌ１の結合は、ＹＷ３２７．６Ｓ２、Ｕ３またはＣｈｕｇａｉの結合に影響を与えない。
いずれの条件でもＩＮＳＥＲＭの結合は観察されず、このことは、Ａｂの不完全なバッチであることを示唆している。
固定されたＡｘｌＦｃに対するＧａｓ６の結合は、Ｈ２Ｌ１、Ｈ２Ｌ１ ｐｒｅｐ２およびＹＷ３２７．６Ｓ２に対するその後の結合を阻害した。Ｇａｓ６の結合は、ＣｈｕｇａｉまたはＵ３の結合を阻害しなかった。
したがって、Ｈ２Ｌ１が結合するエピトープは、ＹＷ３２７．６Ｓ２、ＣｈｕｇａｉおよびＵ３が結合するエピトープとは異なっている。
このアッセイでは、ＩＮＳＥＲＭ抗体についての結果は得られなかった。しかし、上述のように、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３３、５４０５－５４１４（２０１４年１１月２０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｏｎｃ．２０１３．４８７）に記載されるＩＮＳＥＲＭの「Ｄ９」抗体および「Ｅ８」抗体は、Ａｘｌに対するＧＡＳ６の結合を阻害しない。このことは、Ｄ９抗体およびＥ８抗体が、Ｈ２Ｌ１またはＹＷ３２７．６Ｓ２と同じエピトープに結合しないことを示している。
したがって、このアッセイを、公開されている結合データと組み合わせると、Ｈ２Ｌ１抗体が、試験した中で新規のエピトープに結合し、さらに、Ａｘｌに対するＡｘｌ－リガンドＧａｓ６の結合を阻害するわずか２種類の抗体（ＹＷ３２７．６Ｓ２を含む）の１つであることを示している。
（Ａｘｌ活性化の阻害）
（目標）
種々のＡｘｌ阻害剤が、Ａｘｌの既知の自己リン酸化部位の１つであるチロシン８６６（Ｙ８６６）の阻害によって評価されるような、Ａｘｌの活性化を減少させるレベルを評価すること（その他にＹ７７９およびＹ８２１が含まれる。Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１４年１０月；５（２０）：９５４６－９５６３；ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２５４２およびこれに引用される参考文献を参照）。
（溶解物の調製）
１．１４個の１０ｃｍ皿にＨｅＬａ細胞を播種する。
ａ．皿あたり３００万個の細胞
２．接着するまで細胞をインキュベートする。
３．培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄する。
４．０．５％ＦＢＳ培地中、細胞を血清飢餓状態にする。
ａ．Ｈｅｌａについて０．５％ＭＥＭ
ｂ．Ｏ／Ｎ、少なくとも２４時間の飢餓状態
５．６ｍｌの新鮮な０．５％ＭＥＭ培地中、抗Ａｘｌ抗体と共に細胞を１時間インキュベートする。
ａ．ＢＧＢ３２４（ＣＡＳ＝１０３７６２４－７５－１、ＵＮＩＩ＝０ＩＣＷ２ＬＸ８ＡＳ）：０．２ｕＭ
ｂ．Ｈ２Ｌ１－Ｅｖｉｔｒａ＊：５０ｕｇ／ｍｌ
ｃ．Ｈ２Ｌ１－Ｃａｔａｌｅｎｔ＊：５０ｕｇ／ｍｌ
ｄ．ＹＷ３２７．６Ｓ２：５０ｕｇ／ｍｌ
＊同じ配列、異なる調製物。
６．１０ｃｍ皿あたり、全培地６ｍｌ中、指定のプレートを０．０１ｕｇ／ｍｌのｒｈＧａｓ６で刺激する。
ａ．ｒｈＧａｓ６刺激 ０．０１ｕｇ／ｍｌ
７．設定：０．５％ＭＥＭ２６ｍｌにおいて、それぞれ以下を作成する。
１番：飢餓状態
２番：ｒｈＧａｓ６刺激（０．０１ｕｇ／ｍｌ）
３番：ｒｈＧａｓ６刺激＋ＢＧＢ３２４ ０．２ｕＭを用いた前インキュベート
４番：ｒｈＧａｓ６刺激＋Ｈ２Ｌ１－Ｅｖｉｔｒａ：５０ｕｇ／ｍｌを用いた前インキュベート
５番：ｒｈＧａｓ６刺激＋Ｈ２Ｌ１－Ｃａｔａｌｅｎｔ：５０ｕｇ／ｍｌを用いた前インキュベート
６番：ｒｈＧａｓ６刺激＋ＹＷ３２７．６Ｓ２ ５０ｕｇ／ｍｌを用いた前インキュベート
７番：ＢＧＢ３２４ ０．２ｕＭ単独
８番：Ｈ２Ｌ１－Ｅｖｉｔｒａ：５０ｕｇ／ｍｌ単独
９番：Ｈ２Ｌ１－Ｃａｔａｌｅｎｔ：５０ｕｇ／ｍｌ単独
１０番：ＹＷ３２７．６Ｓ２ ５０ｕｇ／ｍｌ単独。
８．氷上で細胞を溶解させることによって反応を止める。
９．冷たいＰＢＳで洗浄する。
１０．ＲＩＰＡバッファー（とホスファターゼ阻害剤）を添加する。
ａ．１００ｕｌ／皿
１１．皿から細胞をこすり取る。
１２．氷上で５～１０分間インキュベートする。
１３．１３，０００ｒｐｍで５～１０分間遠沈させる（冷）。
１４．上清を新鮮なチューブに移す。
１５．ＥＬＩＳＡによってリンタンパク質を測定する。
（ＥＬＩＳＡ測定）
Ａｘｌタンパク質に、ＢｅｒＧｅｎＢｉｏのモノクローナルマウス抗ＨｓＡｘｌ抗体５Ｆ１１を捕捉抗体として用い、その親和性を、ポリクローナルウサギ抗リンＡｘｌ抗体（ｐＡｘｌ Ｙ８６６ １６）を検出抗体として選択した。
（材料）
・Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６Ｃプレート
・Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７．６
・Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）
・洗浄バッファー（ＴＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）
・ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）
・モノクローナルマウス抗ＨｓＡｘｌ抗体５Ｆ１１、３．６ｍｇ／ｍｌストック（ＢｅｒＧｅｎＢｉｏ）
・ポリクローナルウサギ抗Ｈｓ－リン－Ｙ８６６ Ａｘｌ抗体ｐＡｘｌ－Ｙ８６６－１６、１．０ｍｇ／ｍｌ（ＢｅｒＧｅｎＢｉｏ）。ＴＢＳ＋１０％ＦＢＳで１：１０００に希釈して使用する。
・ＨＲＰが接合したヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ １１１－０３５－１４４）。ＴＢＳ＋１０％ＦＢＳ中、１：２０００で使用する。
・組換えヒトＡｘｌＦｃキメラ（ＡｘｌＦｃ標準）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１５４－ＡＬ－１００）
・リンＡｘｌペプチドに接合した組換えヒトＡｘｌＦｃキメラ（ｐＡｘｌＦｃ標準）（ＢｅｒＧｅｎＢｉｏ）
・０．２Ｍ炭酸ナトリウムバッファー ｐＨ９．４
・ＴＭＢストック溶液（１０ｍｇ／ｍｌ ３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＤＭＳＯ中、Ｓｉｇｍａ Ｔ２８８５）
・１００ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ６
・１Ｍ Ｈ２ＳＯ４
・３０％過酸化水素溶液
・溶解物：上述の通りに調製する。ＨｅＬａ細胞について、全タンパク質濃度１．５ｍｇ／ｍｌだと、強いシグナルを与える。
・吸光度４５０ｎｍでのマイクロプレートリーダー。５９５ｎｍでの吸光度（利用可能な場合）を引き算してバックグラウンドを減らすべきであるが、その影響はわずかである。
任意：９６ウェルプレートを洗浄溶液で迅速に満たすために、Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ。
（プロトコル）
（プレートを調製する）
・０．２Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）で希釈した３．６μｇ／ｍｌの捕捉抗体５Ｆ１１をウェルあたり１００μｌ、９６ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐ Ｃプレートに加え、４℃で一晩インキュベートする。
・Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水中の１０％胎児ウシ血清を用いてウェルを完全に満たし、箔でプレートを密封し、３７℃で４～５時間かけてブロックする。
（サンプルを調製し、加える）
・一連のＡｘｌＦｃ標準およびｐＡｘｌＦｃ標準（約６０ｎｇ／ｍｌ～２ｐｇ／ｍｌの範囲、３倍希釈を用いる）を調製し、あなたの溶解物として、同じバッファー中で調製する。
・プレートからブロッキング溶液を捨て、洗浄バッファーで２回洗浄する（ウェルを完全に満たし、次いで、プレートを軽く叩くことによって捨てる）。
・適切な場合、上述の標準と溶解物をウェルに加える（最小で５０μｌ／ウェル、１００μｌ／ウェルが好ましい）。
・プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートする。
・検出抗体を加える。
・プレートを洗浄バッファーで２回洗浄する。
・１００μｌ／ウェルの検出抗体（ｐＡｘｌ－Ｙ８６６－１６）を加える。
・加湿チャンバー中、室温で２～３時間インキュベートする。
・二次抗体を加える。
・プレートを洗浄バッファーで２回洗浄する。
・１００μｌ／ウェルのＨＲＰ接合したヤギ抗ウサギ抗体を加える。
・加湿チャンバー中、室温で２時間インキュベートする。
（現像する）
・新しい基質溶液を調製する。
１００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ ＴＭＢストック溶液
１０μｌの３０％過酸化水素溶液
９．９ｍｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６
任意：１μｌの残ったＨＲＰ接合した検出抗体混合物を加えることによって、少ない体積の基質溶液を試験する（工程１２）。色は、非常に迅速に暗青色に変化するはずである。
１．プレートを洗浄バッファーで３回洗浄する。
２．各ウェルに１００μｌの基質溶液を加える。
３．３０分間現像し、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を止める。
４．吸光度４５０ｎｍを用い、マイクロプレートリーダーでプレートを読み取る。利用可能な場合には、５９５ｎｍでの吸光度を引き算する。
（結果）
Figure 0007071935000014
（考察）
Ｈ２Ｌ１調製物またはＢＧＢ３２４のいずれかが存在する状態で、Ｇａｓ６で刺激を受けた細胞からの溶解物から、ｐＡＸＬの読みを得て（０．０４０、０．０５５、０．０４５）、これらの値は、Ｇａｓ６によって刺激を受けたコントロール細胞の値（０．０７７）より顕著に低かった。Ｈ２Ｌ１－ＥｖｉｔｒｉａおよびＢＧＢ３２４は特に低く、この読みは、飢餓状態のコントロール（０．４４）に匹敵するものであった。
対照的に、ｐＡｘｌの結果は、ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ抗体が、Ａｘｌ自己リン酸化を強く活性化することを示しており、ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ単独だと、ｐＡｘｌの読みは０．０９２であり、この値は、Ｇａｓ６によって刺激を受けたコントロール細胞（０．０７７）より高い。
これらの抗体単独を用いたとき、またはＧａｓ６と共に用いたときに同様の読みが観察されるのは、Ａｘｌ結合について、Ｈ２Ｌ１およびＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒが両方ともＧａｓ６と競合することを示す競合試験と一致している。
（線維症アッセイでの活性）
（目標）
種々のＡｘｌ阻害剤が、線維症モデルにおいて、線維化促進マーカーの活性を下げるレベルを評価すること。このモデルは、ＬＸ２細胞（ヒト由来の肝星細胞株）を利用し、細胞外マトリックスタンパク質α－ＳＭＡおよびＣｏｌ１Ａ１（例えば、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ ３４、２０１４年２月、ページ１７０－１７８；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍａｔｂｉｏ．２０１３．１１．００２）、炎症促進ＭＣＰ１（Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．２００９ Ｊｕｎ；２９（６）：３１３－３２６；ｄｏｉ：１０．１０８９／ｊｉｒ．２００８．００２７）およびサイトカインＴＧＦ－β（炎症の背景において過剰な組織損傷を暗示する。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９ Ａｕｇ；９（４）：４４７－５３；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｏｐｈ．２００９．０４．００８を参照）の発現をモニタリングする。
（材料および方法）
細胞株および治療：
ＬＸ２細胞を使用した。この細胞は、最初にＧｕｔ（２００５）５４（１）：１４２－５１．ｄｏｉ：１０．１１３６／ｇｕｔ．２００４．０４２１２７に記載されているように、ヒト由来の肝星細胞株である。ＬＸ２細胞は、通常通り、ＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳで培養した。
生存率アッセイ：
テトラゾリウム系ＭＴＴアッセイを使用し、細胞死を決定した。簡単に言うと、約２×１０４個の細胞／ウェルを９６ウェル組織培養プレートに播種し、一晩かけた適切な処理の後、ＢＧＢ３２４、キメラ１Ｈ１２ Ａｂ（ＷＯ２０１５／１９３４２８号を参照）、Ｈ２Ｌ１－ｐｒｅｐ２およびＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ Ａｂをさまざまな濃度で用いた処理を一晩かけて行い、１０μｌのＭＴＴ試薬（ＰＢＳ中、５ｍｇ／ｍｌ）を加え、プレートを約２時間インキュベートした。その後に培地を取り出し、ホルマザンを１００ｕｌの１－プロパノールを用いて溶解させ、分光光度計を用い、５７０ｎｍおよび６３０ｎｍの波長で定量した。
ＬＸ２細胞におけるＡｘｌ依存性ＡＫＴ活性化をブロックする際のＡｘｌブロッキング抗体の効果：
ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中、細胞を１２ウェル／プレートに播種し（２×１０５個の細胞／ウェル）、付着させ、２４時間より長い間成長させた。実験前に、細胞をＤＭＥＭ（ｗ／ｏ）ＦＢＳ中に一晩放置し、ＢＧＢ３２４、Ｈ２Ｌ１－ｐｒｅｐ２、または様々な濃度（１０～５０μｇ／ｍｌ）のＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒブロッキング抗体で１時間前処理し、次いで、あらかじめクラスター化しておいた抗Ａｘｌ活性化抗体（１Ｈ１２ Ａｂ、１μｇ／ｍＬ）を用い、１５分間刺激した。セリン４７３でのＡｋｔのリン酸化によって、Ａｘｌ活性化を読み出した（ウエスタンブロット）。
タンパク質の分析：
細胞を、抗プロテアーゼおよび抗ホスファターゼ（ＰＭＳＦ、オルトバナジン酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびフッ化ナトリウム）を追加したＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）に溶解し、１×Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファーに対して調整し、音波処理し、遠心分離処理した。２０～３０μｌのサンプルを、８％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、次いで、ニトロセルロース膜に移した。膜を５％ＢＳＡ－ＦＡＦ中でブロックし、ＴＢＳ Ｔｗｅｅｎバッファーで洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅ－ＥＣＬウエスタンブロット基質を用いて現像した。
使用した抗体は、ｐ－ＡＫＴ（ｐ－Ａｋｔ１／２／３（Ｃ－１１））、５％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ中で１：２００、４℃で一晩；ＡＫＴ（１：２００）、その後、抗マウスｍ－ＩｇＧκ ＢＰ－ＨＲＰ（１：２０００、１ｈ、ＲＴ）；抗ＡＫＴ（Ａｋｔ１／２／３（Ｈ－１３６））、１：４００、１ｈ、ＲＴ、次いで、抗ウサギ－ＩｇＧ－ＨＲＰ（１：２００００、１ｈ、ＲＴ）であった。
ＬＸ２細胞活性化特徴におけるＡｘｌブロッキング抗体の効果：
ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中、細胞を１２ウェル／プレートに播種し（２×１０５個の細胞／ウェル）、付着させ、２４時間より長い間成長させた。
実験前に、細胞をＤＭＥＭ（ｗ／ｏ）ＦＢＳ中に一晩放置し、ＢＧＢ３２４、Ｈ２Ｌ１－ｐｒｅｐ２またはＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒブロッキング抗体（５０μｇ／ｍｌ）で１時間前処理し、次いで、あらかじめクラスター化しておいた抗Ａｘｌ活性化抗体（キメラ１Ｈ１２ Ａｂ、１μｇ／ｍＬ）を用い、刺激した。
ＴＲＩｚｏｌ試薬を用い、全ＲＮＡを単離した。ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用い、製造業者の指示にしたがって、全ＲＮＡを補体ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した。正規化のためにハウスキーピング遺伝子１８ＳおよびＲＰＩＩをリファレンス遺伝子として使用し、Ｈ２Ｏをネガティブコントロールとして使用した。
ＬＸ２活性化特徴を分析するために、α－ＳＭＡ；ＴＧＦ－β、ＣＯＬ１Ａ１およびＭＣＰ１のｍＲＮＡ発現を分析した。
（１Ｈ１２クラスタリング抗体を用いたＡｘｌの活性化）
Ａｘｌの活性化は、多くは、ＡｘｌをそのリガンドＧａｓ６で処理することによって達成される。しかし、Ｇａｓ６に代わるものとして、Ａｘｌは、１Ｈ１２クラスタリング抗体を用いた処理によって強く一貫して活性化され得る。
Ｇａｓ６と１Ｈ１２を比較すると、Ａｋｔリン酸化の刺激は、１Ｈ１２を用いた場合よりも、Ｇａｓ６を用いた場合の方が弱かった（図２２Ａを参照）。１Ｈ１２を用いた刺激は、ウエスタンブロット分析について、ｐＡｋｔ活性に対して良好な性能を示し、ＢＧＢ３２４に対する明確な応答を伴っていた（図２２Ｂ）。
実施例２１に記載するように、１Ｈ１２抗体は、ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ抗体またはＨ２Ｌ１－ｐｒｅｐ２抗体のどちらとも異なるエピトープに結合する。したがって、Ａｘｌは、ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒまたはＨ２Ｌ１－ｐｒｅｐ２のＡｘｌ結合を妨害することなく、１Ｈ１２を用いて活性化され得る。
（結果）
得られた結果を図２３に示す。
（考察）
活性化１Ｈ１２抗体にさらす前にＨ２Ｌ１－ｐｒｅｐ２で処理された細胞は、一貫して、４種類全てのアッセイしたマーカーについて、刺激を受けていないコントロール細胞と同様の発現レベルを示した。
対照的に、ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ抗体を用いた前処理の後、４種類全てのアッセイしたマーカーについて、発現レベルの上昇が観察された。
（ＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおける活性）
（目標）
ヌードマウスのＡ５４９ヒト非小細胞肺癌種（ＮＳＣＬＣ）異種移植モデルにおいて、抗Ａｘｌ機能をブロックする抗体である脱フコシル化キメラ１０Ｇ５（ＧｌｙｍａｘＸ－ｃ１０Ｇ５）およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ製の抗Ａｘｌヒト抗体のバリアント（ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ）の抗腫瘍活性を比較すること。
（実験手順）
（材料）
実験動物
種／株：Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ／Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ
供給源：Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
性別：雌
体重：移植日に２０～３０グラム
年齢：無作為化の日に少なくとも６週齢
動物の識別：ケージ番号および耳のノッチング
（細胞および細胞培養物）
ＡＴＣＣ（ＣＣＬ－１８５）からのＡ５４９細胞。
１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１ＭのＨＥＰＥＳバッファー、０．４５％のＤ－（＋）－グルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを追加したＤＭＥＭ培地。
０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＬＢＤ８０４９。
ＢＤ ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号３５４２３０、ロット番号２２２９９７５。
（薬物）
アイソタイプコントロール：ＸｏｌａｉｒＴＭオマリズマブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｅｕｒｏｐｈａｒｍ Ｌｔｄ、ＵＫ；ロット番号Ｓ２０８５）、１５０ｍｇ／ｍＬ。
抗Ａｘｌ抗体：
１．キメラ（マウス可変／ヒト定常）脱フコシル化ＩｇＧ１ ｃ１０Ｇ５（ＭＡｂ－ＧＧｌｙｍａｘＸ；Ｅｖｉｔｒｉａ、ロット番号３５５６）、６．４ｍｇ／ｍＬ。
２．ヒトＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ（ＣＯＮＴＲ－１；Ｅｖｉｔｒｉａ、ロット番号３５３７）、４．５ｍｇ／ｍＬ。
薬物調製物：
１群あたり合計で９匹のマウスに薬物が必要。１群あたり１０匹のマウスのための薬物を作成。
マウスあたり２５０μＬ×１０＝合計で２．５ｍＬを作成した。
・ＧｌｙｍａｘＸ－ｃ１０Ｇ５：６．４ｍｇ／ｍＬのＧｌｙｍａｘＸストック溶液１１７２μＬを１３２８μＬの滅菌ＰＢＳと混合することによって希釈し、２．５ｍＬの３ｍｇ／ｍｌ投薬溶液を得る。抗体ストックを－８０℃で保存する。取り出したときに、抗体を室温で解凍させ、すぐに氷上に置く。抗体の入った溶液は、投与するまで氷上で保存する。抗体の入った溶液の残りは、４℃で保存する。
・ヒトＭＡｂ ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ：１６６７μＬの４．５ｍｇ／ｍｌ ＣＯＮＴＲ－１ストック溶液と、８３３μＬの滅菌ＰＢＳとを混合し、２．５ｍＬの３ｍｇ／ｍＬ投薬溶液を得る。抗体ストックを－８０℃で保存する。取り出したときに、抗体を室温で解凍させ、すぐに氷上に置く。抗体の入った溶液は、投与するまで氷上で保存する。抗体の入った溶液の残りは、４℃で保存する。
・ＸｏｌａｉｒＴＭオマリズマブ：３ｍｇ／ｍＬの薬物の入った溶液２．５ｍＬを得るために、５０μＬの抗体ストックを２４９０μＬの滅菌ＰＢＳで希釈する。抗体ストック溶液は、製造業者の助言通り、４℃で保存する。
（方法）
細胞培養
Ａ５４９細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１ＭのＨＥＰＥＳバッファー、０．４５％のＤ－（＋）－グルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを追加したＤＭＥＭ培地中、単層培養物として維持した。
指数成長期の間に、細胞を収穫し、腫瘍播種の前に計測した。簡単に言うと、コンフルエントになる前の培養したＡ５４９細胞を滅菌ＰＢＳで洗浄し、０．２５％（ｗ／ｖ）のトリプシン溶液を用い、フラスコから脱着させた。脱着した細胞を１回洗浄し、４×１０７個の細胞／ｍｌで、無血清ＤＭＥＭ培地に再懸濁させ、ＢＤ ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭで１：１に希釈した。
Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ。腫瘍あたり、合計４×１０６個の細胞を注射した。トリパンブルー排除を用い、細胞生存率を決定した。
（皮下腫瘍の播種）
それぞれのマウスに、５０％マトリゲルを含む無血清ＤＭＥＭ培地中、約４×１０７個の細胞／ｍｌのＡ５４９細胞０．１ｍｌを右の脇腹に皮下で播種した（Ａｎｎｅｘ １）。Ａ５４９細胞を播種されたマウスの治療を、腫瘍の平均体積が１２５ｍｍ３に達したとき、腫瘍細胞播種から２４時間後に開始した。各治療群は、９匹の腫瘍を有するマウスを含んでいた。
（実験群の割り当て）
治療を実施する前に、動物を計量し、腫瘍の体積を週に２回測定した。腫瘍の体積は、任意の所与の治療の有効性に影響を与え得るため、マウスを、ラテン方格法を用いて群に割り当てた。無作為化は、腫瘍の体積に基づいており、各動物について、所与の治療に割り当てられる確率が確実に同じになるようにし、したがって、系統的誤差を減らし、治療群は、ベースラインでは同程度であった。４５匹の動物を無作為に５治療群に分けた。
（投薬）
適切な日に、各動物に、特定の量のアイソタイプコントロール（ＸｏｌａｉｒＴＭ）または以下の用量の抗Ａｘｌ抗体を摂取させた。３０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｍｌを週に２回、５週間投与し、３８日目に安楽死させた。投薬量の投与は、ＩＰで行われ、投薬体積は、３０ゲージ針によって１０ｍｌ／ｋｇであった。
（臨床的観察）
通常のモニタリング時に、通常の挙動に対する腫瘍成長または治療の効果、例えば、可動性、脱水、体重増加／減少、眼の艶がないこと、および任意の他の異常な効果について、動物を調べた。死亡および観察される臨床的徴候を記録した。絶食していない状態での体重を毎日記録した。
（腫瘍の測定およびエンドポイント）
腫瘍測定：腫瘍の大きさを、週に２回、キャリパーを用いて二次元で測定し、腫瘍の体積を、式Ｖ＝０．５ａ×ｂ２［ｍｍ３］（式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長い方の直径と短い方の直径である）を用いて計算した。
エンドポイント：
深い麻酔をかけつつ、マウスを頸椎脱臼によって屠殺した。それぞれの動物について、それぞれの腫瘍を２等分し、１つを液体窒素で急速冷凍し、－８０℃の冷凍庫に保存し、その他の部分を４％ホルムアルデヒドで固定し、２４時間後に７０％エタノールに移し、さらなる評価のために４℃で保存した。
（統計分析）
腫瘍成長曲線を、ソフトウェアＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、ＣＡ）を用い、反復手段を比較するためのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉポストテストを用い、二元配置（時間および治療）ＡＮＯＶＡによって比較した。群差は、Ｐ＜０．０５のときに有意であるとした。外れ値は、オンラインの外れ値計算器（Ｏｕｔｉｅｒ ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）（ＱｕｉｃｋＣａｌｃｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ； ｈｔｔｐ：／／ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／ｑｕｉｃｋｃａｌｃｓ／Ｇｒｕｂｂｓ１．ｃｆｍ）を用いたＧｒｕｂｂｓ検定を用い、個々の腫瘍体積の比較によって検出された。ソフトウェアＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用い、図を作成した。
（結果）
体重変化
ビヒクルまたは抗Ａｘｌ抗体による治療に起因する体重変化を３８日間にわたってモニタリングした。０日目に治療を開始し、週に２回、５週間にわたって行った。一般的に、体重が２０％を超えて低下するのは、治療毒性を示すものであり、動物を安楽死させるべきである。どの群も、毒性の指標となる体重減少を示さなかった。
（腫瘍体積の変化）
いずれかのＧｌｙｍａｘＸ－ｃ１０Ｇ５およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ製の抗Ａｘｌヒト抗体のバリアント（ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ）で治療したマウスにおける個々の腫瘍の腫瘍成長を示すプロットを図２４に示す。
脱フコシル化キメラ抗体ｃ１０Ｇ５（ＧｌｙｍａｘＸ－ｃ１０Ｇ５）およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈの抗体ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒで治療した両動物群において、腫瘍成長の遅れが観察された。
ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ群およびＧｌｙｍａｘＸ－ｃ１０Ｇ５群の両方においても、１つの外れ値が存在し、さらなる分析からは除外した（図２４にアスタリスクを付けて示している）。
治療３１日目までの異なる群の腫瘍成長曲線の比較から、ＹＷ３２７．６Ｓ２ｖａｒ群およびＧｌｙｍａｘＸ－ｃ１０Ｇ５群は、アイソタイプコントロールで治療した群とは有意な差を示した（以下の表を参照）。
Figure 0007071935000015
（考察）
このマウス異種移植ＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおいて、脱フコシル化キメラ抗体ｃ１０Ｇ５は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの完全ヒトＭＡｂ ＹＷ３２７．６Ｓ２と同様の抗腫瘍活性を有している。
上の観察結果は、１０Ｇ５の結合特異性を有するヒト化抗体であるＨ２Ｌ１は、ヒト被験体において、ＹＷ３２７．６Ｓ２よりも有効なものとなり得ることを示唆している。この理由は、実施例２１および２２に報告したように、ＹＷ３２７．６Ｓ２がマウスＡｘｌに結合し、一方、１０Ｇ５は結合しないからである。したがって、ＹＷ３２７．６Ｓ２について報告された効果は、ヒト異種移植細胞および宿主マウス組織の両方に対する抗体作用の結果である。対照的に、１０Ｇ５について報告された結果は、単に、ヒト異種移植細胞に対する抗体作用からくるものである。
配列番号１［ｈｕ１０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ１）］
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＧＬＶＱＰＧＧＳＶＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＦＴＤＦＹＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＲＩＦＰＧＧＤＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧＲＦＴＬＳＡＤＴＳＳＳＴＡＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＬＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２［ｈｕ１０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ２）］
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＦＴＤＦＹＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＦＰＧＧＤＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧＲＦＴＬＳＡＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＬＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３［ｈｕ１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ１）］
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＩＰＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＳＱＧＴＨＶＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号４［ｈｕ１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ２）］
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＩＰＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＳＱＧＴＨＶＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号５［重鎖定常領域の例］
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配列番号６［１０Ｇ５ ＧＨ１重鎖］
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配列番号７［１０Ｇ５ ＧＨ２重鎖］
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＦＴＤＦＹＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＦＰＧＧＤＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧＲＦＴＬＳＡＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＬＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号８［軽鎖定常領域の例］
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配列番号９［１０Ｇ５ ＧＬ１軽鎖］
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＩＰＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＳＱＧＴＨＶＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１０［１０Ｇ５ ＧＬ２軽鎖］
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＩＰＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＳＱＧＴＨＶＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１１［ｈｕ１０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ１）の核酸］
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配列番号１２［ｈｕ１０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ２）の核酸］
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配列番号１３［ｈｕ１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ１）の核酸］
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配列番号１４［ｈｕ１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ２）の核酸］
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配列番号１５［重鎖定常領域の例の核酸］
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配列番号１６［１０Ｇ５ ＧＨ１重鎖の核酸］
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配列番号１７［１０Ｇ５ ＧＨ２重鎖の核酸］
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配列番号１８［軽鎖定常領域の核酸］
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配列番号１９［１０Ｇ５ ＧＬ１軽鎖の核酸］
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配列番号２０［１０Ｇ５ ＧＬ２軽鎖の核酸］
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配列番号２１［ヒトＡｘｌ］
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配列番号２２［マウスＡｘｌ］
ＭＧＲＶＰＬＡＷＷＬＡＬＣＣＷＧＣＡＡＨＫＤＴＱＴＥＡＧＳＰＦＶＧＮＰＧＮＩＴＧＡＲＧＬＴＧＴＬＲＣＥＬＱＶＱＧＥＰＰＥＶＶＷＬＲＤＧＱＩＬＥＬＡＤＮＴＱＴＱＶＰＬＧＥＤＷＱＤＥＷＫＶＶＳＱＬＲＩＳＡＬＱＬＳＤＡＧＥＹＱＣＭＶＨＬＥＧＲＴＦＶＳＱＰＧＦＶＧＬＥＧＬＰＹＦＬＥＥＰＥＤＫＡＶＰＡＮＴＰＦＮＬＳＣＱＡＱＧＰＰＥＰＶＴＬＬＷＬＱＤＡＶＰＬＡＰＶＴＧＨＳＳＱＨＳＬＱＴＰＧＬＮＫＴＳＳＦＳＣＥＡＨＮＡＫＧＶＴＴＳＲＴＡＴＩＴＶＬＰＱＲＰＨＨＬＨＶＶＳＲＱＰＴＥＬＥＶＡＷＴＰＧＬＳＧＩＹＰＬＴＨＣＮＬＱＡＶＬＳＤＤＧＶＧＩＷＬＧＫＳＤＰＰＥＤＰＬＴＬＱＶＳＶＰＰＨＱＬＲＬＥＫＬＬＰＨＴＰＹＨＩＲＩＳＣＳＳＳＱＧＰＳＰＷＴＨＷＬＰＶＥＴＴＥＧＶＰＬＧＰＰＥＮＶＳＡＭＲＮＧＳＱＶＬＶＲＷＱＥＰＲＶＰＬＱＧＴＬＬＧＹＲＬＡＹＲＧＱＤＴＰＥＶＬＭＤＩＧＬＴＲＥＶＴＬＥＬＲＧＤＲＰＶＡＮＬＴＶＳＶＴＡＹＴＳＡＧＤＧＰＷＳＬＰＶＰＬＥＰＷＲＰＧＱＧＱＰＬＨＨＬＶＳＥＰＰＰＲＡＦＳＷＰＷＷＹＶＬＬＧＡＬＶＡＡＡＣＶＬＩＬＡＬＦＬＶＨＲＲＫＫＥＴＲＹＧＥＶＦＥＰＴＶＥＲＧＥＬＶＶＲＹＲＶＲＫＳＹＳＲＲＴＴＥＡＴＬＮＳＬＧＩＳＥＥＬＫＥＫＬＲＤＶＭＶＤＲＨＫＶＡＬＧＫＴＬＧＥＧＥＦＧＡＶＭＥＧＱＬＮＱＤＤＳＩＬＫＶＡＶＫＴＭＫＩＡＩＣＴＲＳＥＬＥＤＦＬＳＥＡＶＣＭＫＥＦＤＨＰＮＶＭＲＬＩＧＶＣＦＱＧＳＤＲＥＧＦＰＥＰＶＶＩＬＰＦＭＫＨＧＤＬＨＳＦＬＬＹＳＲＬＧＤＱＰＶＦＬＰＴＱＭＬＶＫＦＭＡＤＩＡＳＧＭＥＹＬＳＴＫＲＦＩＨＲＤＬＡＡＲＮＣＭＬＮＥＮＭＳＶＣＶＡＤＦＧＬＳＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲＱＧＲＩＡＫＭＰＶＫＷＩＡＩＥＳＬＡＤＲＶＹＴＳＫＳＤＶＷＳＦＧＶＴＭＷＥＩＡＴＲＧＱＴＰＹＰＧＶＥＮＳＥＩＹＤＹＬＲＱＧＮＲＬＫＱＰＶＤＣＬＤＧＬＹＡＬＭＳＲＣＷＥＬＮＰＲＤＲＰＳＦＡＥＬＲＥＤＬＥＮＴＬＫＡＬＰＰＡＱＥＰＤＥＩＬＹＶＮＭＤＥＧＧＳＨＬＥＰＲＧＡＡＧＧＡＤＰＰＴＱＰＤＰＫＤＳＣＳＣＬＴＡＡＤＶＨＳＡＧＲＹＶＬＣＰＳＴＡＰＧＰＴＬＳＡＤＲＧＣＰＡＰＰＧＱＥＤＧＡ
配列番号２３［ヒトＴｙｒｏ３］
ｍａｌｒｒｓｍｇｒｐｇｌｐｐｌｐｌｐｐｐｐｒｌｇｌｌｌａａｌａｓｌｌｌｐｅｓａａａｇｌｋｌｍｇａｐｖｋｌｔｖｓｑｇｑｐｖｋｌｎｃｓｖｅｇｍｅｅｐｄｉｑｗｖｋｄｇａｖｖｑｎｌｄｑｌｙｉｐｖｓｅｑｈｗｉｇｆｌｓｌｋｓｖｅｒｓｄａｇｒｙｗｃｑｖｅｄｇｇｅｔｅｉｓｑｐｖｗｌｔｖｅｇｖｐｆｆｔｖｅｐｋｄｌａｖｐｐｎａｐｆｑｌｓｃｅａｖｇｐｐｅｐｖｔｉｖｗｗｒｇｔｔｋｉｇｇｐａｐｓｐｓｖｌｎｖｔｇｖｔｑｓｔｍｆｓｃｅａｈｎｌｋｇｌａｓｓｒｔａｔｖｈｌｑａｌｐａａｐｆｎｉｔｖｔｋｌｓｓｓｎａｓｖａｗｍｐｇａｄｇｒａｌｌｑｓｃｔｖｑｖｔｑａｐｇｇｗｅｖｌａｖｖｖｐｖｐｐｆｔｃｌｌｒｄｌｖｐａｔｎｙｓｌｒｖｒｃａｎａｌｇｐｓｐｙａｄｗｖｐｆｑｔｋｇｌａｐａｓａｐｑｎｌｈａｉｒｔｄｓｇｌｉｌｅｗｅｅｖｉｐｅａｐｌｅｇｐｌｇｐｙｋｌｓｗｖｑｄｎｇｔｑｄｅｌｔｖｅｇｔｒａｎｌｔｇｗｄｐｑｋｄｌｉｖｒｖｃｖｓｎａｖｇｃｇｐｗｓｑｐｌｖｖｓｓｈｄｒａｇｑｑｇｐｐｈｓｒｔｓｗｖｐｖｖｌｇｖｌｔａｌｖｔａａａｌａｌｉｌｌｒｋｒｒｋｅｔｒｆｇｑａｆｄｓｖｍａｒｇｅｐａｖｈｆｒａａｒｓｆｎｒｅｒｐｅｒｉｅａｔｌｄｓｌｇｉｓｄｅｌｋｅｋｌｅｄｖｌｉｐｅｑｑｆｔｌｇｒｍｌｇｋｇｅｆｇｓｖｒｅａｑｌｋｑｅｄｇｓｆｖｋｖａｖｋｍｌｋａｄｉｉａｓｓｄｉｅｅｆｌｒｅａａｃｍｋｅｆｄｈｐｈｖａｋｌｖｇｖｓｌｒｓｒａｋｇｒｌｐｉｐｍｖｉｌｐｆｍｋｈｇｄｌｈａｆｌｌａｓｒｉｇｅｎｐｆｎｌｐｌｑｔｌｉｒｆｍｖｄｉａｃｇｍｅｙｌｓｓｒｎｆｉｈｒｄｌａａｒｎｃｍｌａｅｄｍｔｖｃｖａｄｆｇｌｓｒｋｉｙｓｇｄｙｙｒｑｇｃａｓｋｌｐｖｋｗｌａｌｅｓｌａｄｎｌｙｔｖｑｓｄｖｗａｆｇｖｔｍｗｅｉｍｔｒｇｑｔｐｙａｇｉｅｎａｅｉｙｎｙｌｉｇｇｎｒｌｋｑｐｐｅｃｍｅｄｖｙｄｌｍｙｑｃｗｓａｄｐｋｑｒｐｓｆｔｃｌｒｍｅｌｅｎｉｌｇｑｌｓｖｌｓａｓｑｄｐｌｙｉｎｉｅｒａｅｅｐｔａｇｇｓｌｅｌｐｇｒｄｑｐｙｓｇａｇｄｇｓｇｍｇａｖｇｇｔｐｓｄｃｒｙｉｌｔｐｇｇｌａｅｑｐｇｑａｅｈｑｐｅｓｐｌｎｅｔｑｒｌｌｌｌｑｑｇｌｌｐｈｓｓｃ
配列番号２４［ヒトＭｅｒ］
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配列番号２５［ヒトＡｋｔ３］
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配列番号２６［ヒトＧａｓ６］
ｍａｐｓｌｓｐｇｐａａｌｒｒａｐｑｌｌｌｌｌｌａａｅｃａｌａａｌｌｐａｒｅａｔｑｆｌｒｐｒｑｒｒａｆｑｖｆｅｅａｋｑｇｈｌｅｒｅｃｖｅｅｌｃｓｒｅｅａｒｅｖｆｅｎｄｐｅｔｄｙｆｙｐｒｙｌｄｃｉｎｋｙｇｓｐｙｔｋｎｓｇｆａｔｃｖｑｎｌｐｄｑｃｔｐｎｐｃｄｒｋｇｔｑａｃｑｄｌｍｇｎｆｆｃｌｃｋａｇｗｇｇｒｌｃｄｋｄｖｎｅｃｓｑｅｎｇｇｃｌｑｉｃｈｎｋｐｇｓｆｈｃｓｃｈｓｇｆｅｌｓｓｄｇｒｔｃｑｄｉｄｅｃａｄｓｅａｃｇｅａｒｃｋｎｌｐｇｓｙｓｃｌｃｄｅｇｆａｙｓｓｑｅｋａｃｒｄｖｄｅｃｌｑｇｒｃｅｑｖｃｖｎｓｐｇｓｙｔｃｈｃｄｇｒｇｇｌｋｌｓｑｄｍｄｔｃｅｄｉｌｐｃｖｐｆｓｖａｋｓｖｋｓｌｙｌｇｒｍｆｓｇｔｐｖｉｒｌｒｆｋｒｌｑｐｔｒｌｖａｅｆｄｆｒｔｆｄｐｅｇｉｌｌｆａｇｇｈｑｄｓｔｗｉｖｌａｌｒａｇｒｌｅｌｑｌｒｙｎｇｖｇｒｖｔｓｓｇｐｖｉｎｈｇｍｗｑｔｉｓｖｅｅｌａｒｎｌｖｉｋｖｎｒｄａｖｍｋｉａｖａｇｄｌｆｑｐｅｒｇｌｙｈｌｎｌｔｖｇｇｉｐｆｈｅｋｄｌｖｑｐｉｎｐｒｌｄｇｃｍｒｓｗｎｗｌｎｇｅｄｔｔｉｑｅｔｖｋｖｎｔｒｍｑｃｆｓｖｔｅｒｇｓｆｙｐｇｓｇｆａｆｙｓｌｄｙｍｒｔｐｌｄｖｇｔｅｓｔｗｅｖｅｖｖａｈｉｒｐａａｄｔｇｖｌｆａｌｗａｐｄｌｒａｖｐｌｓｖａｌｖｄｙｈｓｔｋｋｌｋｋｑｌｖｖｌａｖｅｈｔａｌａｌｍｅｉｋｖｃｄｇｑｅｈｖｖｔｖｓｌｒｄｇｅａｔｌｅｖｄｇｔｒｇｑｓｅｖｓａａｑｌｑｅｒｌａｖｌｅｒｈｌｒｓｐｖｌｔｆａｇｇｌｐｄｖｐｖｔｓａｐｖｔａｆｙｒｇｃｍｔｌｅｖｎｒｒｌｌｄｌｄｅａａｙｋｈｓｄｉｔａｈｓｃｐｐｖｅｐａａａ
配列番号２７［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ由来のＡｘｌ。本明細書では「Ｃｙｎｏ Ａｘｌ」とも呼ばれる］
ＭＡＷＲＣＰＲＭＧＲＶＰＬＡＷＣＬＡＬＣＧＷＶＣＭＡＰＲＧＴＱＡＥＥＳＰＦＶＧＮＰＧＮＩＴＧＡＲＧＬＴＧＴＬＲＣＱＬＱＶＱＧＥＰＰＥＶＨＷＬＲＤＧＱＩＬＥＬＡＤＳＴＱＴＱＶＰＬＧＥＤＥＱＤＤＷＩＶＶＳＱＬＲＩＡＳＬＱＬＳＤＡＧＱＹＱＣＬＶＦＬＧＨＱＮＦＶＳＱＰＧＹＶＧＬＥＧＬＰＹＦＬＥＥＰＥＤＲＴＶＡＡＮＴＰＦＮＬＳＣＱＡＱＧＰＰＥＰＶＤＬＬＷＬＱＤＡＶＰＬＡＴＡＰＧＨＧＰＱＲＮＬＨＶＰＧＬＮＫＴＳＳＦＳＣＥＡＨＮＡＫＧＶＴＴＳＲＴＡＴＩＴＶＬＰＱＱＰＲＮＬＨＬＶＳＲＱＰＴＥＬＥＶＡＷＴＰＧＬＳＧＩＹＰＬＴＨＣＴＬＱＡＶＬＳＤＤＧＭＧＩＱＡＧＥＰＤＰＰＥＥＰＬＴＬＱＡＳＶＰＰＨＱＬＲＬＧＳＬＨＰＨＴＰＹＨＩＲＶＡＣＴＳＳＱＧＰＳＳＷＴＨＷＬＰＶＥＴＰＥＧＶＰＬＧＰＰＥＮＩＳＡＴＲＮＧＳＱＡＦＶＨＷＱＥＰＲＡＰＬＱＧＴＬＬＧＹＲＬＡＹＱＧＱＤＴＰＥＶＬＭＤＩＧＬＲＱＥＶＴＬＥＬＱＧＤＧＳＶＳＮＬＴＶＣＶＡＡＹＴＡＡＧＤＧＰＷＳＬＰＶＰＬＥＡＷＲＰＧＱＡＱＰＶＨＱＬＶＫＥＴＳＡＰＡＦＳＷＰＷＷＹＩＬＬＧＡＶＶＡＡＡＣＶＬＩＬＡＬＦＬＶＨＲＲＫＫＥＴＲＹＧＥＶＦＥＰＴＶＥＲＧＥＬＶＶＲＹＲＶＲＫＳＹＳＲＲＴＴＥＡＴＬＮＳＬＧＩＳＥＥＬＫＥＫＬＲＤＶＭＶＤＲＨＫＶＡＬＧＫＴＬＧＥＧＥＦＧＡＶＭＥＧＱＬＮＱＤＤＳＩＬＫＶＡＶＫＴＭＫＩＡＩＣＴＲＳＥＬＥＤＦＬＳＥＡＶＣＭＫＥＦＤＨＰＮＶＭＲＬＩＧＶＣＦＱＧＳＥＲＥＳＦＰＡＰＶＶＩＬＰＦＭＫＨＧＤＬＨＳＦＬＬＹＳＲＬＧＤＱＰＶＹＬＰＴＱＭＬＶＫＦＭＡＤＩＡＳＧＭＥＹＬＳＴＫＲＦＩＨＲＤＬＡＡＲＮＣＭＬＮＥＮＭＳＶＣＶＡＤＦＧＬＳＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲＱＧＲＩＡＫＭＰＶＫＷＩＡＩＥＳＬＡＤＲＶＹＴＳＫＳＤＶＷＳＦＧＶＴＭＷＥＩＡＴＲＧＱＴＰＹＰＧＶＥＮＳＥＩＹＤＹＬＲＱＧＮＲＬＫＱＰＡＤＣＬＤＧＬＹＡＬＭＳＲＣＷＥＬＮＰＱＤＲＰＳＦＴＥＬＲＥＤＬＥＮＴＬＫＡＬＰＰＡＱＥＰＤＥＩＬＹＶＮＭＤＥＧＧＧＹＰＥＰＰＧＡＡＧＧＡＤＰＰＴＱＬＤＰＫＤＳＣＳＣＬＴＳＡＥＶＨＰＡＧＲＹＶＬＣＰＳＴＡＰＳＰＡＱＰＡＤＲＧＳＰＡＡＰＧＱＥＤＧＡ
配列番号２８［マウス１０Ｇ５ ＶＨドメイン］
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＦＹＩＮＷＶＲＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＡＲＩＦＰＧＧＤＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＥＥＳＳＳＴＡＹＩＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＲＧＬＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＩＳＶＴＶＳＳ
配列番号２９［マウス１０Ｇ５ ＶＬドメイン］
ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＩＰＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＲＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＧＴＨＶＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３０［１０Ｇ５ ＶＨ ＣＤＲ１］
ＧＹＳＦＴＤＦＹＩＮ
配列番号３１［１０Ｇ５ ＶＨ ＣＤＲ２］
ＲＩＦＰＧＧＤＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ
配列番号３２［１０Ｇ５ ＶＨ ＣＤＲ３］
ＲＧＬＹＹＡＭＤＹ
配列番号３３［１０Ｇ５ ＶＬ ＣＤＲ１］
ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＩＰＹＬＨ
配列番号３４［１０Ｇ５ ＶＬ ＣＤＲ２］
ＲＶＳＮＲＦＳ
配列番号３５［１０Ｇ５ ＶＬ ＣＤＲ３］
ＳＱＧＴＨＶＰＰＴ
（生物の寄託）
本開示は、２種類のハイブリドーマ細胞株ＷＲ－１０Ｇ５－Ｅ５を指す。この細胞株は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」にしたがって寄託された。ＷＲ－１０Ｇ５－Ｅ５寄託のさらなる詳細を以下に提示し、ＷＯ２０１６／０９７３７０号にも開示している。
ＷＲ－１０Ｇ５－Ｅ５
寄託機関 → Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）
Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ
ポートンダウン
ソールズベリー
ウィルトシャー
ＳＰ４ ０ＪＧ
英国
寄託日 → ２０１５年１２月１６日
アクセッション番号 → １５１２１６０２
特徴 → ハイブリドーマ－Ｂ－リンパ球；種－Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）；
形態－リンパ芽球；免疫原－ヒトＡｘｌ細胞外ドメイン；免疫細胞ドナー－ＮＭＲＩマウス；不死パートナーＸ６３．Ａｇ８．６５３；産物のＩｇクラス／サブクラスクラス－ＩｇＧ１。

Claims (15)

  1. Ａｘｌに結合し、
    １０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ２）ドメイン（配列番号２）および１０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ１）ドメイン（配列番号１）からなる群から選択される抗体ＶＨドメイン；および
    １０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ１）ドメイン（配列番号３）および１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ２）ドメイン（配列番号４）からなる群から選択される抗体ＶＬドメインを含む、抗体。
  2. １０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ２）ドメイン（配列番号２）と、１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ１） ドメイン（配列番号３）とを含む、請求項１に記載の抗体。
  3. １０Ｇ５ ＶＨ（ＧＨ１）ドメイン（配列番号１）と、１０Ｇ５ ＶＬ（ＧＬ２）ドメイン（配列番号４）とを含む、請求項１に記載の抗体。
  4. 前記抗体が、
    （ｉ）抗体重鎖定常領域および／または抗体軽鎖定常領域の全てまたは一部；
    （ｉｉ）全抗体；または
    （ｉｉｉ）抗原結合性抗体フラグメントを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 前記全抗体が、ＩｇＧ抗体であるか、または前記抗原結合性抗体フラグメントが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ミニボディ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ、ＴａｎｄＡｂ、トリボディ、ＢｉＴＥまたはＤＶＤ－Ｉｇである、請求項４に記載の抗体。
  6. Ｇａｓ６に対するＡｘｌの結合を阻害する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の、抗体、または、抗体ＶＨドメインおよび抗体ＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  8. 請求項７に記載の核酸を用いて形質転換された宿主細胞。
  9. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはその免疫接合体を、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、組成物。
  10. 免疫チェックポイントモジュレーターおよび／またはＡｘｌ以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
  11. ある治療方法で使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体、または請求項９～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 線維化障害を治療する方法で使用するための請求項１１に記載の抗体または組成物。
  13. 増殖性疾患を治療する方法で使用するための請求項１１に記載の抗体または組成物。
  14. 前記増殖性疾患が癌である、請求項１３に記載の抗体または組成物。
  15. 前記癌が転移性癌である、請求項１４に記載の抗体または組成物。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102453227B1 (ko) * 2014-12-18 2022-10-11 베르젠 테크놀로지오버포링 에이에스 항-axl 길항성 항체
GB201610902D0 (en) * 2016-06-22 2016-08-03 Bergen Teknologioverforing As And Bergenbio As Anti-Axl Antagonistic Antibodies
CN110483639A (zh) 2018-05-15 2019-11-22 复旦大学 靶向axl的抗体及抗体-药物偶联物及其制备方法和用途
GB201912059D0 (en) 2019-08-22 2019-10-09 Bergenbio As Combaination therapy of a patient subgroup
NL2024108B1 (en) * 2019-10-26 2021-07-19 Vitroscan B V Methods and apparatus for measuring immune-cell mediated anti-tumoroid responses
BR112022015977A2 (pt) * 2020-02-28 2022-10-11 Symphogen As Anticorpos anti-axl e composições
GB202004189D0 (en) 2020-03-23 2020-05-06 Bergenbio As Combination therapy
EP4132652A1 (en) 2020-04-08 2023-02-15 BerGenBio ASA Axl inhibitors for antiviral therapy
GB202006072D0 (en) 2020-04-24 2020-06-10 Bergenbio Asa Method of selecting patients for treatment with cmbination therapy
GB202104037D0 (en) 2021-03-23 2021-05-05 Bergenbio Asa Combination therapy
EP4359439A1 (en) * 2021-06-24 2024-05-01 Yeda Research and Development Co. Ltd Combination therapy for the treatment of cancer comprising an anti-egfr antibody and an axl-inhibitor
WO2024040114A2 (en) * 2022-08-18 2024-02-22 BioLegend, Inc. Anti-axl antibodies, antigen-binding fragments thereof and methods for making and using the same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011505120A (ja) 2007-11-12 2011-02-24 ユー３・ファーマ・ゲーエムベーハー Ａｘｌ抗体
JP2014532687A (ja) 2011-11-03 2014-12-08 ピエール、ファーブル、メディカマン 抗原結合タンパク質および癌の治療のためのアドレッシング産物としてのその使用

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1382969A1 (en) 2002-07-17 2004-01-21 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Diagnosis and prevention of cancer cell invasion
EP2853544A1 (en) * 2007-11-15 2015-04-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody capable of binding to anexelekto, and use thereof
US8841424B2 (en) 2009-05-11 2014-09-23 U3 Pharma Gmbh Humanized AXL antibodies
CA2761891A1 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-axl antibody
WO2011014457A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Genentech, Inc. Combination treatments
KR101885388B1 (ko) * 2010-06-18 2018-08-03 제넨테크, 인크. 항-Ａｘｌ 항체 및 사용 방법
WO2012175692A1 (en) 2011-06-22 2012-12-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-axl antibodies and uses thereof
WO2012175691A1 (en) 2011-06-22 2012-12-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-axl antibodies and uses thereof
CN104955842B (zh) * 2012-11-05 2018-04-10 皮埃尔法布雷医药公司 抗原结合蛋白及其作为定位产品用于治疗癌症的用途
WO2014144553A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Secreted frizzle-related protein 5 (sfrp5) binding proteins and methods of treatment
US20160106861A1 (en) * 2013-04-26 2016-04-21 Spirogen Sarl Axl antibody-drug conjugate and its use for the treatment of cancer
US10059775B2 (en) * 2014-01-29 2018-08-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against the MUC1-C/extracellular domain (MUC1-C/ECD)
GB201410826D0 (en) 2014-06-18 2014-07-30 Bergenbio As Anti-axl antibodies
GB201410825D0 (en) 2014-06-18 2014-07-30 Bergenbio As Anti-axl antibodies
US9986723B2 (en) 2014-10-22 2018-06-05 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Screen and use of therapeutics for pancreatic ductal adenocarcinoma
US10398774B2 (en) 2014-12-09 2019-09-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Human monoclonal antibodies against AXL
KR102453227B1 (ko) 2014-12-18 2022-10-11 베르젠 테크놀로지오버포링 에이에스 항-axl 길항성 항체
GB201610902D0 (en) * 2016-06-22 2016-08-03 Bergen Teknologioverforing As And Bergenbio As Anti-Axl Antagonistic Antibodies
US11159088B2 (en) * 2019-06-19 2021-10-26 Appulse Power Inc. Dual path and mode start-up circuit
GB202004189D0 (en) * 2020-03-23 2020-05-06 Bergenbio As Combination therapy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011505120A (ja) 2007-11-12 2011-02-24 ユー３・ファーマ・ゲーエムベーハー Ａｘｌ抗体
JP2014532687A (ja) 2011-11-03 2014-12-08 ピエール、ファーブル、メディカマン 抗原結合タンパク質および癌の治療のためのアドレッシング産物としてのその使用

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