ES2096655T5

ES2096655T5 - Procedimiento para la produccion de fragmentos funcionales de anticuerpos fv de cadena simple en la superficie de particulas de bacteriofagos.

Info

Publication number: ES2096655T5
Application number: ES91913039T
Authority: ES
Inventors: John Mccafferty; Anthony Richard Pope; Kevin Stuart Johnson; Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom; Andrew David Griffiths; Ronald Henry Jackson; Kaspar Philipp Holliger; James David Marks; Timothy Piers Clackson; David John Chiswell; Gregory Paul Winter; Timothy Peter Bonnert
Original assignee: Medical Research Council; Cambridge Antibody Technology Ltd
Current assignee: Medical Research Council; MedImmune Ltd
Priority date: 1990-07-10
Filing date: 1991-07-10
Publication date: 2006-04-16
Anticipated expiration: 2011-07-10
Also published as: EP0844306A1; EP1433846B1; KR100222326B1; EP1847605A2; AU664155B2; US7635666B1; US20090155810A1; DK1433846T3; EP1754787A2; LU91623I2; DK2055777T3; ATE339497T1; CA2086936C; WO1992001047A1; JP3176917B2; DE69132920D1; DK0589877T3; US20120129710A1; HK1131637A1; ES2096655T3

Abstract

UN MIEMBRO DE UN PAR DE UNION ESPECIFICO (SBP) SE IDENTIFICA EXPRESANDO DNA QUE CODIFICA UNA POBLACION GENETICAMENTE DIVERSA DE DICHOS MIEMBROS SBP EN CELULAS ANFITRIONAS RECOMBINANTES EN LAS CUALES LOS MIEMBROS SBP SE MUESTRAN DE FORMA FUNCIONAL EN LA SUPERFICIE DE UN PAQUETE DE REPRESENTACION GENETICA RECOMBINANTE SEGREGADO (RGDP) QUE CONTIENE DNA QUE CODIFICA EL MIEMBRO SBP O UN COMPONENTE POLIPEPTIDO DEL MISMO, EN VIRTUD DEL MIEMBRO SBP O DE UN COMPONENTE POLIPEPTIDO DEL MISMO QUE SE EXPRESA COMO UNA FUSION CON UN COMPONENTE DEL RGDP. LOS SBPS REPRESENTADOS PUEDEN SELECCIONARSE POR AFINIDAD POR UN MIEMBRO SBP COMPLEMENTARIO, Y EL DNA RECUPERADO DE LOS RGDPS SELECCIONADOS PARA LA EXPRESION DE LOS MIEMBROS SBP SELECCIONADOS. DE ESTA FORMA PUEDEN OBTENERSE MIEMBROS SBP DEL ANTICUERPO, CON LAS CADENAS DIFERENTES DE LOS MISMOS EXPRESADAS, UNA FUNDIDA AL COMPONENTE CAPSIDO Y LA OTRA EN FORMA LIBRE PARA SU ASOCIACION CON EL COMPONENTE COMPAÑERO PARA LA FUSION. PUEDE USARSE UN FAGEMIDO COMO UNVECTOR DE EXPRESION, AYUDANDO DICHA FUSION DEL CAPSIDO PARA EMPAQUETAR EL DNA DEL FAGEMIDO. USANDO ESTE METODO PUEDEN COMBINARSE LIBRERIAS DE DNA QUE CODIFICAN CADENAS RESPECTIVAS DE TALES MIEMBROS SBP MULTIMERICOS, OBTENIENDO DE ESTA FORMA UNA DIVERSIDAD GENETICA MUCHO MAYOR EN LOS MIEMBROS SBP DE LA QUE PODRIA OBTENERSE FACILMENTE MEDIANTE METODOS CONVENCIONALES.

Description

Procedimiento para la producción de fragmentos funcionales de anticuerpos Fv de cadena simple en la superficie de partículas de bacteriófagos.

La presente invención está relacionada con los procedimientos de producción de miembros de parejas de unión específicos. La presente invención también está relacionada con las moléculas de unión biológica producidas mediante estos procedimientos.

A causa de su elevada especificidad para un antígeno dado, la aparición de los anticuerpos monoclonales (Kohler, G. y Milstein, C., 1975, Nature, 256: 495) representaron un gran descubrimiento técnico con importantes consecuencias tanto científicas como comerciales.

Tradicionalmente, los anticuerpos monoclonales se generan mediante el establecimiento de una línea celular inmortal de mamífero que deriva de una única célula productora de inmunoglobulina que secreta una forma de una molécula de anticuerpo biológicamente funcional con una especificidad concreta. Debido a que la línea celular de mamífero secretora de anticuerpo es inmortal, las características del anticuerpo son reproducibles entre distintos lotes. Las propiedades clave de los anticuerpos monoclonales son su especificidad para un antígeno en particular y la reproducibilidad con la que pueden fabricarse.

Estructuralmente, el anticuerpo más sencillo (IgG) comprende cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante puentes disulfuro (ver Figura 1). Las cadenas ligeras existen en dos formas distintas denominadas kappa (K) y lambda (l). Cada cadena tiene una región constante (C) y una región variable (V). Cada cadena se organiza en una serie de dominios. Las cadenas ligeras tienen dos dominios, correspondientes a la región C y la otra a la región V. Las cadenas pesadas tienen cuatro dominios, uno correspondiente a la región V y tres dominios (1, 2 y 3) en la región C. El anticuerpo tiene dos brazos (cada brazo es una región Fab), cada uno de los cuales tiene una región VL y una VH asociada entre sí. Este par de regiones V (VL y VH) son las que difieren de un anticuerpo a otro (a causa de las variaciones en la secuencia aminoacídica), y las cuales juntas son responsables del reconocimiento del antígeno, proporcionando además un sitio de unión al antígeno (ABS). De forma más detallada, cada región V está formada por tres regiones que determinan su complementariedad (CDR) separadas por cuatro regiones estructurales (FR). Las CDR son las partes más variables de las regiones variables y realizan la función crítica de la unión al antígeno. Las regiones CDR derivan de muchas secuencias de líneas germinales potenciales mediante un proceso complejo que incluye recombinación, mutación y selección.

Se ha observado que la función de unión a los antígenos puede realizarse con fragmentos de un anticuerpo completo. Ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab formado por los dominios VL, VH, CL y CHl; (ii) el fragmento Fd formado por los dominios VH y CHl; (iii) el fragmento Fv formado por los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S., y col, (1989), Nature, 341: 544-546) formado por un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; y fragmentos F(ab')_{2}, un fragmento bivalente formado por dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región frontisa ("hinge").

Aunque los dos dominios del fragmento Fv están codificados por genes separados, se ha demostrado que es posible generar un engarzador sintético que permite hacerlos como una única cadena proteica (conocida como cadena única Fv (scFv); Bird, R.E., y col, (1988), Science, 242: 423-426, Huston, J.S., y col, (1988), Proc Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883) mediante técnicas de DNA recombinante. Estos fragmentos scFv se ensamblaron a partir de genes de monoclonales que se habían aislado previamente. En esta solicitud, los solicitantes describen un procedimiento para ensamblar fragmentos scFv a partir de los dominios VH y VL que no forman parte de un anticuerpo previamente aislado.

Aunque los anticuerpos monoclonales, sus fragmentos y derivados han sido enormemente ventajosos, existen, sin embargo, una serie de limitaciones asociadas a ellos.

En primer lugar, las aplicaciones terapéuticas de los anticuerpos monoclonales producidos por líneas celulares inmortales humanas tienen grandes perspectivas para el tratamiento de un rango amplio de enfermedades (Clinical Applications of Monoclonal Antibodies. Editado por E. S. Lennox, British Medical Bulletin, 1984. Publishers Churchill Livingstone). Desafortunadamente, son muy difíciles de establecer las líneas celulares humanas inmortales productoras de anticuerpo y dan bajos rendimientos de anticuerpos (aproximadamente 1 mg/ml). Sin embargo, líneas celulares de roedores equivalentes tienen un rendimiento elevado de anticuerpo (aproximadamente 100 mg/ml). No obstante, la administración continuada de estas proteínas extrañas de roedores a humanos puede provocar reacciones perjudiciales de hipersensibilidad. Por lo tanto, estos anticuerpos monoclonales derivados de roedores tienen un uso terapéutico limitado.

En segundo lugar, un aspecto clave en el aislamiento de los anticuerpos monoclonales es, en la práctica, cuantos clones distintos de células productoras de anticuerpos con distintas especificidades pueden establecerse y muestrearse comparado con los que teóricamente son necesarios para aislar una célula productora de anticuerpos con las características deseadas de especificidad (Milstein, C. (1990), Royal Soc. Croonian Lecture, Proc. R. Soc. London B., 239: 1-16). Por ejemplo, se cree que el número de distintas especificidades expresadas en cualquier momento por los linfocitos del sistema inmunitario murino es de 10^{7} aproximadamente y esto es sólo una proporción pequeña del repertorio potencial de especificidades. Sin embargo, durante el aislamiento de una célula productora de anticuerpos típica con una especificidad deseada, el investigador sólo es capaz de muestrear de 10^{3} a 10^{4} especificidades individuales. El problema es peor en los humanos, en los que se tienen 10^{12} especificidades linfocíticas aproximadamente, con la limitación de poder muestrear unas 10^{3} o 10^{4}.

Este problema se ha solucionado parcialmente en laboratorios de animales mediante la utilización de regímenes de inmunización. Por lo tanto, cuando se quieren producir anticuerpos monoclonales provistos de una especificidad en contra de un epítope en particular, se inmuniza a un animal con un inmunógeno que exprese dicho epítope. El animal generará una respuesta inmune contra el inmunógeno y habrá una proliferación de linfocitos que tendrán especificidad frente al epítope. Debido a esta proliferación de linfocitos con la especificidad deseada, es mucho más fácil detectarlos en el procedimiento de muestreo. Sin embargo, esta aproximación no funciona siempre cuando no está disponible un inmunógeno adecuado. Además, cuando se quieren producir anticuerpos monoclonales humanos (como por ejemplo, para su administración terapéutica, tal como se ha descrito anteriormente), dicha aproximación no es práctica o éticamente factible.

En los últimos años, estos problemas se han tratado, en parte, mediante la aplicación de los procedimientos del DNA recombinante para aislar y producir en bacterias como E. coli, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con capacidad de unión al antígeno.

Esta sustitución simple de las células inmortalizadas por células bacterianas como "fábricas" simplifica considerablemente los procedimientos para la preparación de grandes cantidades de moléculas de unión. Además, un sistema de producción recombinante permite la producción en este campo de anticuerpos y fragmentos de los mismos a la medida. Por ejemplo, es posible producir moléculas quiméricas con nuevas combinaciones de funciones de unión y efector, humanización de anticuerpos (como por ejemplo, regiones variables murinas combinadas con dominios conservados humanos o anticuerpos CDR murinos injertados en un FR humana) y nuevas moléculas de unión al antígeno. Además, la utilización de la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki, R.K., y col., (1988), Science, 239: 487-491) para aislar secuencias productoras de anticuerpo a partir de células (como por ejemplo, hibridomas y células B) tiene un gran potencial para disminuir el tiempo en que se pueden aislar especificidades. Los genes VH y VL amplificados se clonan directamente en vectores de expresión en células bacterianas o de mamíferos (Orlandi, R., y col, (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3833-3837; Ward, E.S., y col, (1989), supra; Larrick, J.W., y col (1989), Biochem. Biophys. Res. Commun., 160: 1250-1255; Sastry, L., y col (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5728-5732). A continuación se rastrean los fragmentos de anticuerpos solubles secretados por las bacterias para sus actividades de unión.

Sin embargo, como en el caso del sistema de producción basado en las células inmortalizadas, el sistema de producción recombinante aún tiene problemas de selección discutidos anteriormente y, por lo tanto, se apoya en la inmunización de animales para incrementar la proporción de células con la especificidad deseada. Además, algunas de estas técnicas pueden agravar los problemas de rastreo. Por ejemplo, se han construido grandes genotecas de las cadenas L y H separadas a partir de ratones inmunizados y se han combinado aleatoriamente antes de su rastreo (Huse, W.D., y col., (1989), Science, 246: 1275-1281; W090/14443; W090/14424 y W090/14430). Sin embargo, es crucial la pérdida de la información que lleva cada célula, es decir, denominada apareamiento inicial de una cadena L con una cadena H. Esto representa una pérdida de la ventajas que se tenían con el empleo de protocolos de inmunización en animales. Actualmente, sólo las genotecas derivadas de dominios VH individuales (dAbs: Ward, E.S., y col (1989), supra) no tienen este inconveniente. Sin embargo, debe hacerse un rastreo más amplio porque no todos los dominios VH de los anticuerpos son capaces de unirse al antígeno. Además, el problema en el rastreo directo de varias especificidades distintas aún tiene que solucionarse en procariotas.

Por lo tanto, es necesario un sistema de rastreo que mejore o supere uno o más u otros problemas de los mencionados anteriormente. El sistema ideal permitiría el muestreo de grandes cantidades de especificidades (por ejemplo, 10^{6} o mayores), una clasificación en cada ronda de clonaje, y una transferencia rápida del material genético que codifica para la molécula de unión desde un estadio del procedimiento de producción al siguiente estadio.

Los candidatos más atractivos para este tipo de rastreo serían los organismos procarióticos (porque crecen rápidamente, son relativamente fáciles de manipular y porque pueden crearse gran número de clones) que expresen y manifiesten en su superficie un dominio de unión funcional, como por ejemplo, un anticuerpo, receptor, enzima, etc. En la patente GB 2137631B se manifiestan los procedimientos para la coexpresión en una célula huésped individual de los genes para la cadena variable H y L de las inmunoglobulinas. Sin embargo, la proteína se expresó intracelularmente y era insoluble. Además, era necesario un procesamiento extenso de la proteína para generar los fragmentos de anticuerpos con actividad de unión y este material generado con sólo una fracción de la actividad de unión esperada para los fragmentos de anticuerpo a esta concentración. Se ha observado que los fragmentos de anticuerpos pueden secretarse a través de membranas bacterianas con el péptido señal apropiado (Skerra, A. y Pluckthun, A. (1988), Science, 240: 1038-1040; Better, M., y col., (1988), Science, 240: 1041-1043) con un consiguiente incremento en la actividad de unión de los fragmentos del anticuerpo. Estos procedimientos requieren el rastreo de clones individuales para la actividad de unión de la misma forma que se hace con los anticuerpos monoclonales de ratón.

Sin embargo, no se ha mostrado como un dominio de unión funcional, como por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, receptor, enzima, etc., puede mantenerse en la superficie de la bacteria en una configuración que permita el muestreo de las propiedades de unión al antígeno y la selección de los clones con las propiedades deseadas. En gran medida es porque la superficie bacteriana es una estructura compleja, y en los organismos gram negativos existe una pared externa que complica aún más la posición. Además, no se ha mostrado que, por ejemplo, un dominio de anticuerpo se plegará adecuadamente cuando se exprese como fusión con una proteína de superficie bacteriana o de bacteriófago.

Los bacteriófagos son unos organismos atractivos, relacionados con los procariotas, para este tipo de rastreo. En general, su superficie es una estructura relativamente simple, pueden crecer fácilmente en gran número, son manejables desde un punto de vista práctico en muchos programas de rastreo en masa y llevan información genética para su propia síntesis con un empaquetamiento pequeño y sencillo. La dificultad ha estribado en la resolución práctica del problema de cómo utilizar bacteriófagos para este propósito. En una solicitud de patente número W088/06630 de Genex Corporation se ha propuesto que el bacteriófago lambda sería un vehículo adecuado para la expresión de moléculas de anticuerpo, pero no proporcionan una manera que muestre como llevar a cabo dicha idea general. Por ejemplo, en la W088/06630 no se demuestra que ninguna secuencia: (a) se haya expresado como una fusión con el gen V; (b) se haya expresado en la superficie de lambda; y (c) se haya expresado de tal forma que la proteína retenga actividad biológica. Además, no se muestra cómo rastrear las fusiones adecuadas. También, ya que los viriones de lambda se ensamblan dentro de la célula, la proteína de fusión se expresaría intracelularmente y se podría predecir su inactividad. En Diciembre de 1990, Bass y col. (después de la primera fecha de priorización para la presente solicitud) describen la deleción de parte del gen III del bacteriófago filamentoso M13 y la inserción en la secuencia codificante para la hormona del crecimiento humana (hGH) en el extremo N-terminal del gen. Se demostró que la hormona del crecimiento manifestada en M13 era funcional (Bass, S., y col (1990), Proteins, Structure, Function and Genetics, 8: 309-314). Además, una copia funcional del gen III siempre estaba presente cuando se expresaba dicha fusión. En una solicitud de patente W090/02809 de Protein Engineering Corporation se propone la inserción de la secuencia codificante para el inhibidor de la tripsina pancreática bovina (BPTI) en el gen VIII de M13. Sin embargo, no se mostró que la propuesta fuera operativa. Por ejemplo, no existe demostración alguna de que la expresión de las secuencias BPTI como fusiones con la proteína VIII y su expresión en la superficie de M13. Asimismo, este documento enseña que cuando se hace una fusión con el gen III, es necesario utilizar una segunda copia sintética del gen III, de tal forma que esté presente la forma inalterada de la proteína del gen III. En las realizaciones de la presente solicitud no se hace esto. En las realizaciones en las que se recupera al fagemido con el fago con deleción del gen III M13K07, no está presente el gen III inalterado.

La W090/02809 también enseña que los fagemidos que no contienen todo el genoma del M13 y necesitan su recuperación por coinfección con el fago auxiliar no son adecuados para estos propósitos ya que la coinfección puede dar lugar a recombinación.

En todas las realizaciones en que los solicitantes actuales utilizaron fagemidos, han utilizado un fago auxiliar y las únicas secuencias derivadas del bacteriófago filamentoso en los fagemidos tienen las secuencias del origen de replicación y del gen III.

La W090/02809 también enseña que su procedimiento requiere información como la secuencia nucleotídica de la molécula de partida y su estructura tridimensional. No se manifiesta la utilización de un repertorio preexistente de moléculas de unión para seleccionar un miembro de unión, como el que se describe en la presente invención, como por ejemplo la utilización de un repertorio de genes de inmunoglobulina de animales. Además, no discuten el favorecimiento de la variegación en sus moléculas de unión en bloques de variación natural como las CDRs de las inmunoglobulinas, para favorecer la generación de moléculas mejoradas y evitar variaciones no favorables. En la W090/02809 también se excluye específicamente la solicitud de su procedimiento para la producción de moléculas scFv.

En cada una de las patentes anteriores comentadas (W088/06330 y W090/02809, la proteína propuesta para expresarse es una cadena polipeptídica única. No se describe un procedimiento para la manifestación de una molécula dimérica mediante la expresión de un monómero como fusión con una proteína de la cápside y la otra proteína en forma libre. En la W091//17271, citada en el artículo 54 (3) EPC y sólo con derecho por su previa fecha de priorización se describe la inserción de una proteína en una proteína de la cubierta de un bacteriófago y la utilización de técnicas de purificación por afinidad para seleccionar partículas fago.

En otra descripción publicada en Mayo de 1991 (después de la primera fecha de priorización de la presente solicitud) se describe la inserción en el gen VIII de M13 de las secuencias codificantes para una de las dos cadenas de la porción Fab de un anticuerpo con la coexpresión del otro a partir de un plásmido. Se demostró que las dos cadenas se expresaban como un fragmento Fab funcional en la superficie del fago (Kang, A.S., y col (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4363-4366). No se hacía una descripción sobre el sitio de inserción en el gen VIII y en el ensayo para la actividad de unión del pAb mediante ELISA se utilizaba un reactivo específico para la cadena L del anticuerpo en lugar de para el fago. En otra descripción publicada en Marzo de 1991 (después de la primera fecha de priorización de la presente solicitud) describe la inserción de un fragmento de la proteína gag del virus del SIDA en la porción N-terminal del gen III del bacteriófago fd. La expresión del fragmento de la proteína gag se detectó mediante procedimientos inmunológicos, pero no se mostró si la proteína se expresaba o no en una forma funcional (Tsunetsugu-Yokota, T., y col (1991), Gene, 99: 261-265).

El problema de cómo utilizar los bacteriófagos de esta forma es, de hecho, difícil de solucionar. La proteína debe insertarse en el fago de tal forma que la integridad de la cubierta del fago no esté afectada, y la misma proteína debe ser funcional reteniendo su actividad biológica respecto a la unión con el antígeno. Por lo tanto, en los casos en los que la proteína que se escoja sea un anticuerpo, debería plegarse eficiente y correctamente y estar preparada para su unión al antígeno. La solución del problema para moléculas y fragmentos de anticuerpos también proporcionaría un procedimiento general para cualquier biomolécula que sea miembro de una pareja de unión específico, como por ejemplo, moléculas receptoras y enzimas.

De forma sorprendente, los solicitantes han sido capaces de construir un bacteriófago que expresa y expone en su superficie una gran molécula de unión biológicamente funcional (como por ejemplo fragmentos de anticuerpos, y enzimas y receptores), y que permanece intacto y mantienen su infectividad. Los solicitantes han denominado la estructura que comprende una partícula vírica y una molécula de unión expresada en la superficie viral un empaquetamiento. En los casos en los que la molécula de unión sea un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o un fragmento, o un dominio que sea homólogo a un dominio de inmunoglobulina, los solicitantes denominan al empaquetamiento un anticuerpo fágico (pAb). Sin embargo, excepto en los casos que se requiera, en los que el término anticuerpo fágico se usa de forma general, también debe interpretarse como cualquier empaquetamiento que incluya una partícula vírica y una molécula de unión funcional expuesta en la superficie vírica.

Los pAbs tienen un rango de aplicaciones para la selección de genes de anticuerpos que codifican para actividades de unión a los antígenos. Por ejemplo, los pAbs se pueden utilizar para el clonaje y recuperación de hibridomas (Orlandi, R., y col (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3833-3837), y en el rastreo de grandes genotecas combinatoriales (como describen Huse, W.D., y col. (1989), Science, 246: 1275-1281). En particular, varios ciclos de selección mediante el empleo de pAbs pueden ayudar en la recuperación de anticuerpos de alta afinidad de las últimas genotecas. Puede ser preferible rastrear genotecas pequeñas derivadas de células seleccionadas de antígenos (Casali, P., y col. (1986), Science, 234: 476-479) para recuperar las parejas VH/VL originales que comprenden la región Fv de un anticuerpo. La utilización de los pAbs puede permitir también la construcción de anticuerpos completamente sintéticos. Además, los anticuerpos pueden hacerse con algunas secuencias sintéticas, como por ejemplo CDRs, y algunas secuencias derivadas de las naturales. Por ejemplo, repertorios de los genes V podrían hacerse in vitro mediante la combinación de genes V no reordenados, con segmentos D y J. Las genotecas de pAbs podrían seleccionarse a continuación por su unión al antígeno, hipermutarse in vitro en los bucles de unión al antígeno o en las regiones del dominio estructural V, y someterse a ciclos sucesivos de selección y mutagénesis.

Tal como se ha discutido anteriormente, las genotecas separadas de cadenas L y H pierden su apareamiento original entre las cadenas. Es difícil hacer y rastrear una genoteca suficientemente grande para una combinación particularmente ventajosa de cadenas H y L.

Por ejemplo, en un ratón hay aproximadamente 10^{7} cadenas H posibles y 10^{7} cadenas L posibles. Por los tanto, existen 10^{14} combinaciones posibles de cadenas L y H, y para probar algo parecido a este número de combinaciones se necesitaría crear y rastrear una genoteca de 10^{14} clones aproximadamente. Hasta el momento esto no es posible desde un punto de vista práctico.

La presente invención proporciona varias aproximaciones que permiten mejorar este problema.

En una primera aproximación (una aproximación de combinaciones aleatorias, que se muestran en los ejemplos 15 y 16), se crea una genoteca lo más grande posible para que exprese el número máximo posible de las 10^{14} combinaciones potenciales. Sin embargo, debido a la expresión de las cadenas H y L en la superficie del fago, es razonablemente posible seleccionar la combinación deseada a partir de todas las combinaciones generadas mediante técnicas de afinidad (ver posteriormente para la descripción de los formatos de selección).

En una segunda aproximación (denominada aproximación combinatoria dual por los presentes solicitantes), se crea una gran genoteca a partir de dos genotecas más pequeñas para la selección de la combinación deseada. Esto representa aún una mejora más. La aproximación implica la creación de: (i) una primera genoteca de, por ejemplo, unas 10^{7} cadenas H que se expresan en un bacteriófago (como fusión con la proteína codificada por el gen III) que es resistente, por ejemplo, a la tetraciclina; y (ii) una segunda genoteca de, por ejemplo, unas 10^{7} cadenas L en las que las secuencias codificantes para dichas secuencias ligeras están dentro de un vector plasmídico que contiene un origen de replicación para un bacteriófago (un fagemido) que es resistente, por ejemplo, a la ampicilina (es decir, un antibiótico distinto) y se expresan en el espacio periplásmico de una bacteria huésped. A continuación, la primera genoteca se utiliza para infectar la bacteria que contiene la segunda genoteca para proporcionar 10^{14} combinaciones de las cadenas H y L en la superficie del fago resultante que se encuentra en el sobrenadante del cultivo bacteriano.

La ventaja de esta aproximación es que se crean dos genotecas separadas de, por ejemplo, 10^{7}, para producir 10^{14} combinaciones. La creación de una genoteca de 10^{7} es posible desde un punto de vista práctico.

A continuación, las 10^{14} combinaciones se someten a selección (ver más adelante para la descripción de los formatos de selección) tal como se describe en la presente invención. Esta selección producirá una población de fagos que expresan una combinación en particular de cadenas H y L provistas de la especificidad deseada. Sin embargo, los fagos seleccionados sólo incluirán DNA que codifique para uno de los miembros de las cadenas H y L apareadas (derivadas bien del fago o del fagemido). La muestra eluida que contiene la población se divide entonces en dos porciones. Una primera porción se crece en, por ejemplo, placas con tetraciclina para seleccionar aquellos bacteriófagos que contienen DNA que codifica para las cadenas H que están implicadas en la unión al antígeno deseado. Una segunda porción se crece en, por ejemplo, placas con ampicilina para seleccionar aquellos bacteriófagos que contienen el DNA del fagemido que codifica para las cadenas L que están implicadas en la unión al antígeno deseado. Un grupo de colonias de clones aislados individualmente, por ejemplo, de las placas con tetraciclina, se utilizan para infectar colonias específicas, por ejemplo, de las placas con ampicilina. El resultado es un bacteriófago que expresa combinaciones específicas de cadenas H y L que pueden ensayarse para la unión al antígeno.

En una tercera aproximación (denominada por los presentes solicitantes aproximación combinatoria dual jerárquica), una colonia individual tanto de un clon de la cadena H o de la L seleccionado por su crecimiento en placas con antibiótico, se utiliza para infectar una genoteca completa de clones que codifican para la otra cadena (H o L). La selección se realiza tal como se ha descrito anteriormente. Esto favorece el aislamiento de las combinaciones más favorables.

En una cuarta aproximación (denominada por los presentes solicitantes aproximación jerárquica; ver ejemplos 17 y 31) ambas cadenas se clonan en el mismo vector. Sin embargo, se mantiene fija una de las cadenas que se sabe ya que tiene las propiedades deseadas. Una genoteca de la cadena complementaria se inserta en el mismo vector. Se seleccionan parejas adecuadas para la cadena fijada tras su manifestación en la superficie del bacteriófago.

En una quinta aproximación (ver ejemplo 33), para mejorar las posibilidades de recuperación de las parejas originales, puede reducirse la complejidad de las genotecas combinatorias mediante la utilización de poblaciones pequeñas de linfocitos B seleccionados para la unión a un antígeno deseado. Las células proporcionan, por ejemplo mRNA o DNA, para la preparación de genotecas de genes para anticuerpos para su expresión en el fago. Esta técnica puede emplearse en combinación con las anteriores cuatro aproximaciones mencionadas para seleccionar especificidades de anticuerpos.

Se han mencionado anteriormente a los fagemidos. Los solicitantes se han dado cuenta y han demostrado que en muchos casos se prefieren los fagemidos a los fagos para el clonaje de anticuerpos ya que son más fáciles de utilizar para generar genotecas más extensas del repertorio inmune. Esto se debe a que el DNA del fagemido es aproximadamente 100 veces más eficiente que el DNA del bacteriófago para la transformación de bacterias (ver ejemplo 14). Así mismo, la utilización de fagemidos da la capacidad para variar el número de proteínas de fusión de las moléculas de unión del gen III expresado en la superficie del bacteriófago (ver ejemplo 12). Por ejemplo, en un sistema que comprende una célula bacteriana con un fagemido que codifica para una proteína de fusión con el gen III y se infecta con un fago auxiliar, la inducción de la expresión de la proteína de fusión con el gen III a distintos niveles determinará el número de proteínas de fusión con el gen III presentes en el espacio definido entre las membranas bacterianas internas y externas tras una superinfección. Esto determinará la proporción entre la proteína de fusión con el gen III y la proteína del gen III nativa expresada por el fago ensamblado.

La expresión de una única proteína de fusión por virión puede ayudar a la selección de las especificidades de anticuerpo en base a la afinidad mediante la evitación del efecto de "avidez" por el que un fago que exprese dos copias de un anticuerpo de baja afinidad tendría la misma afinidad aparente que un fago que expresase una copia de un anticuerpo con elevada afinidad. Sin embargo, en algunos casos será importante expresar todas las moléculas del gen III derivadas de la superinfección de las células que contienen fagemidos que tienen fusiones (por ejemplo, para seleccionar moléculas de unión de baja afinidad o mejorar la sensibilidad en ensayos ELISA). Una manera para realizar esto es superinfectar con un bacteriófago que contiene un gen III defectuoso. Por lo tanto, los solicitantes han desarrollado y utilizado un fago que está delecionado en el gen III. Esto es completamente nuevo.

La demostración de que un dominio de unión a antígeno funcional puede expresarse en la superficie del fago tiene implicaciones más allá de la construcción de nuevos anticuerpos. Por ejemplo, si otros dominios de proteínas pueden expresarse en la superficie de un fago, los vectores fago pueden emplearse para clonar y seleccionar genes mediante las propiedades de unión de la proteína expresada. Además, pueden hacerse variantes de las proteínas, incluyendo genotecas de epítopes construidas en la superficie de la proteína y seleccionarse eficientemente por sus actividades de unión. En efecto, otras arquitecturas proteicas puede ser útiles como anticuerpos "novedosos".

La técnica proporciona la posibilidad de construir anticuerpos a partir de los primeros principios, aprovechando el armazón estructural en el cual se pliegan los bucles de unión al antígeno. En general, estos bucles tienen un número limitado de conformaciones que generan una variedad de sitios de unión mediante combinaciones de bucles alternativos y por distintas cadenas laterales. Los avances recientes en el diseño de los sitios de unión al antígeno son un buen presagio para el diseño de novo. En cualquier caso, se necesita una estructura de alta resolución del antígeno. Sin embargo, esta aproximación es atractiva para fabricar, por ejemplo, anticuerpos catalíticos, y en particular para sustratos pequeños. Pueden introducirse aquí cadenas laterales o sitios de unión para grupos prostéticos, no sólo para unir selectivamente al estado de transición del sustrato, sino también para participar directamente en la formación y rotura del enlace. La única cuestión es si la arquitectura del anticuerpo, especializada para unirse, es el mejor punto de partida para construir catalizadores. Pueden ser más adecuadas arquitecturas enzimáticas genuinas, como el cilindro de triosa fosfato isomerasa (TIM). Las enzimas TIM presentan también, como los anticuerpos, un armazón estructural (un cilindro de cadenas b y hélices a) y bucles de unión al sustrato. Muchas enzimas con varias propiedades catalíticas se basan en esta arquitectura y los bucles pueden manipularse independientemente en los armazones para diseñar nuevas propiedades catalíticas y de unión. El sistema de selección de fagos tal como se presenta en la presente invención puede emplearse para seleccionar las actividades de unión al antígeno y los bucles CDR así seleccionados, utilizarlos tanto en un armazón de anticuerpo o en un armazón cilíndrico de la TIM. Los bucles situados, por ejemplo, en el armazón cilíndrico de la TIM pueden modificarse posteriormente por mutagénesis y someterse a una posterior selección. Por lo tanto, no es necesario seleccionar para actividades de unión de alta afinidad en un único paso. La estrategia del sistema inmunitario, en el que la baja afinidad evoluciona hacia una alta afinidad parece más realista y puede mimetizarse mediante la utilización de la presente invención.

Aunque a través de la presente solicitud, los solicitantes discuten la posibilidad de rastrear para variantes de alta afinidad de los pAbs, reconocen que para algunas aplicaciones, como por ejemplo la cromatografía de baja afinidad (Ohlson, S. y col., (1988), Anal. Biochem., 169: 204-208) sería deseable aislar variantes de menor afinidad.

Los ejemplos 16 y 17 muestran que la presente invención proporciona una manera de producir anticuerpos con bajas afinidades (como se ve en la respuesta inmunológica primaria o en animales no inmunizados). Esto es posible por la expresión de múltiples copias del anticuerpo en la superficie del fago en asociación con la proteína del gen III. Por lo tanto, los pAbs permiten el aislamiento de genes para estos anticuerpos y si es necesario, mutados para proporcionar anticuerpos mejorados.

Los pABs también permiten la selección de anticuerpos para mejorar la estabilidad. Se ha observado para muchos anticuerpos que mejora el rendimiento y la estabilidad cuando los anticuerpos se expresan a 30ºC en lugar de 37ºC. Si se expresan los pAbs a 37ºC, sólo aquellos que sean estables estarán disponibles para la selección por afinidad. Cuando los anticuerpos se utilizan in vivo para objetivos terapéuticos o de diagnóstico, el incremento en la estabilidad alargaría la vida media de los anticuerpos en circulación.

A menudo será necesario incrementar la diversidad de una población de genes clonados para la expresión de sus proteínas en el fago o mutar una secuencia nucleotídica individual. Aunque las técnicas de mutagénesis in vivo o in vitro pueden emplearse para los dos objetivos, un procedimiento particularmente adecuado sería la utilización de cepas mutadoras. Una cepa mutadora es una cepa que contiene un defecto genético que causa que el DNA replicado en ella mute respecto su DNA parental. Por lo tanto, si una población de genes como las fusiones con el gen III se introduce en estas cepas podrán diversificarse más y, si se desea, podrán transferirse a una cepa no mutadora para su expresión y selección. El ejemplo 26 cubre la utilización de cepas mutadoras con anticuerpos de fagos (el ejemplo 30 muestra un ejemplo de la mutagénesis in vitro y la selección de anticuerpos de fagos).

Terminología

La mayor parte de la terminología discutida en esta sección se ha mencionado en el texto de forma adecuada.

Pareja de unión específica

Describe una pareja de moléculas (cada una es un miembro de una pareja de unión específico) que derivan de forma natural o se producen de forma sintética. Una de las parejas de moléculas tiene una área en su superficie o una cavidad que se une específicamente a, y por lo tanto, se la define como complementaria a otra molécula con una organización espacial y polar particular, de tal forma que el par tiene la propiedad de unirse específicamente entre sí. Ejemplos de parejas de unión específicos son el antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando, enzima-sustrato, IgG-proteína A.

Empaquetamiento

Describe una partícula bacteriófago secretada en que la partícula expresa un miembro de una pareja de unión específica en su superficie. El empaquetamiento puede ser un bacteriófago que expresa un dominio de unión al antígeno en su superficie. Este tipo de empaquetamiento se ha denominado anticuerpo fágico (pAb).

Anticuerpo

Describe una inmunoglobulina natural o de producción parcial o totalmente sintética. El término incluye también cualquier proteína provista de un dominio de unión que es homólogo a un dominio de unión a una inmunoglobulina. Estas proteínas pueden derivar de fuentes naturales, o producirse total o parcialmente de forma sintética.

Ejemplos de anticuerpos son los isotipos de inmunoglobulinas y los fragmentos Fab, F(ab1)2, scFv, Fv, dAb, Fd.

Superfamilia de las inmunoglobulinas

Describe una familia polipeptídica cuyos miembros tienen al menos un dominio con una estructura relacionada con el dominio variable o constante de las moléculas de inmunoglobulinas. El dominio contiene dos hojas plegadas b y generalmente un puente disulfuro conservado (ver Williams, A.F., y Barclay, A.N., (1988), Ann. Rev. Inmunol., 6: 381-405).

Ejemplos de miembros de una superfamilia de inmunoglobulinas son el CD4, el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), y la molécula de adhesión intercelular (ICAM). Excepto en los casos que se expresen de forma concreta, la referencia a inmunoglobulinas y homólogos de inmunoglobulinas en esta solicitud incluye los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas y los homólogos de las mismas.

Homólogos

Este término incluye a los polipéptidos que tienen el mismo o residuos conservados en una posición correspondiente a su estructura primaria, secundaria o terciaria. El término también incluye a dos o más secuencias nucleotídicas que codifican para los polipéptidos homólogos.

Ejemplos de polipéptidos homólogos son los isotipos de las inmunoglobulinas.

Funcional

En relación a un miembro sbp expresado en la superficie de un bacteriófago, significa que el miembro sbp se presenta en una forma de plegamiento en la que su dominio de unión específico para su miembro sbp complementario es el mismo o básicamente análogo a su configuración nativa, por medio del cual exhibe una especificidad similar respecto al miembro sbp complementario. Respecto a esto, difiere de los péptidos de Smith y col., supra, que no tienen una configuración de plegamiento definida y puede presentar una variedad de configuraciones determinadas por los miembros complementarios con los que debe contactar.

Población genéticamente diversa

En conexión con los miembros sbp o componentes polipeptídicos de los mismos, se refiere no sólo a la diversidad que puede existir en las poblaciones naturales de las células u organismos, sino también la diversidad creada mediante mutaciones artificiales in vitro o in vivo.

Por ejemplo, las mutaciones in vitro pueden implicar mutagénesis al azar mediante la utilización de oligonucleótidos provistos de mutaciones al azar de la secuencia que se desea variar. Por ejemplo, en la mutagénesis in vivo se pueden utilizar cepas mutadoras de microorganismos huésped portadoras del DNA (ver el ejemplo 38 poste-
rior).

Dominio

Un dominio es una parte de una proteína que se pliega en si misma e independientemente de otras partes de la misma proteína e independientemente de un miembro de unión complementario.

Unidad de plegamiento

Es una combinación específica de una hélice a y/o una hoja plegada b y/o una estructura de vuelta b. Los dominios y unidades de plegamiento contienen estructuras que unen a aminoácidos que en la estructura primaria no son adyacentes.

Forma libre

Describe el estado de un polipéptido que no se expresa mediante un empaquetamiento de expresión genéticamente replicable.

Condicionalmente defectivo

Describe un gen que no expresa un polipéptido en particular bajo unas determinadas condiciones, pero que se expresa en otro tipo de condiciones. Un ejemplo es un gen que contiene una mutación ámbar que se expresa en huéspedes no supresores o supresores, respectivamente.

Alternativamente, un gen puede expresar una proteína que es defectiva bajo unas condiciones determinadas, pero no en otras. Un ejemplo es un gen con una mutación sensible a la temperatura.

Codón de paro traduccional suprimible

Describe un codón que permite la traducción de secuencias nucleotídicas cadena abajo del codón en unas condiciones, pero en otras condiciones, finaliza la traducción en ese codón. Ejemplos de codones de paro traduccionales suprimibles son los codones ámbar, ochre y opal.

Cepa mutadora

Es una célula huésped que tiene un defecto genético que provoca que el DNA replicado en ella mute respecto a su DNA parental. Ejemplos de cepas mutadoras son la NR906mutD5 y la NR9046 mut Tl (ver Ejemplo 26).

Fago auxiliar

Es un fago que se emplea para infectar células que contienen un genoma de fago defectivo y que actúa para complementar el defecto. El genoma del fago defectivo puede ser un fagemido o un fago con algunas funciones que codifiquen para secuencias génicas eliminadas. Ejemplos de fagos auxiliares son el M13K07, el M13K07 gen III nº 3; y el fago que expresa o codifica para una molécula de unión fusionada a una proteína de la cápside.

Vector

Es una molécula de DNA, capaz de replicarse en un organismo huésped, en el que se inserta un gen para construir una molécula de DNA recombinante.

Vector fago

Es un vector derivado de la modificación de un genoma de fago, que contiene un origen de replicación para un bacteriófago, pero no para un plásmido.

Vector fagemido

Es un vector derivado de la modificación de un genoma plasmídico, que contienen un origen de replicación para un bacteriófago así como un origen de replicación plasmídico.

Secretado

Describe un bacteriófago o molécula asociada con un miembro de un sbp expresado en el bacteriófago, en el que el miembro sbp y/o la molécula se han plegado y el empaquetamiento se ha ensamblado externamente al citosol celular.

Repertorio de genes de inmunoglobulina reordenados

Una colección de nucleótidos presentes en la naturaleza, como por ejemplo, secuencias de DNA que codifican para inmunoglobulinas expresadas en un animal. Las secuencias se generan mediante reordenación in vivo por ejemplo de los segmentos V, D y J para las cadenas H y por ejemplo de los segmentos V y J para las cadenas L. Alternativamente, las secuencias pueden generarse a partir de una línea celular inmunizada in vitro en la cual la reordenación en respuesta a la inmunización es intracelular.

Genoteca

Una colección de nucleótidos, por ejemplo secuencias de DNA dentro de clones.

Repertorio de genes de inmunoglobulinas reordenados artificialmente

Una colección de secuencias nucleotídicas, como por ejemplo DNA, derivadas total o parcialmente de una fuente distinta a las secuencias de inmunoglobulinas reordenadas de un animal. Pueden incluirse, por ejemplo, secuencias de DNA que codifiquen para dominios VH mediante la combinación de segmentos V no reordenados con segmentos D y J y secuencias de DNA que codifiquen para dominios VL mediante la combinación de segmentos V y J.

Las secuencias de DNA pueden derivar total o parcialmente de una síntesis de oligonucleótidos.

Péptido líder de secreción

Es una secuencia de aminoácidos unida al extremo N-terminal de un polipéptido y que dirige el movimiento del polipéptido fuera del citosol.

Eluyente

Es una solución que se emplea para romper la unión entre dos moléculas. La unión puede ser mediante enlace(s) covalente(s) o no covalente(s). Las dos moléculas pueden ser miembros de un sbp (pareja de unión específica).

Derivado

Es una sustancia que deriva de un polipéptido codificado por DNA dentro de una partícula seleccionada. El derivativo polipeptídico puede diferir del polipéptido codificado por la adición, deleción, sustitución o inserción de aminoácidos, o por la unión de otras moléculas al polipéptido codificado. Estos cambios pueden realizarse a nivel nucleotídico o proteico. Por ejemplo, el polipéptido codificado puede ser un fragmento Fab que a continuación se le une una cola Fc de otro origen. Alternativamente, pueden unirse marcadores como enzimas, fluoresceínas, etc., a los fragmentos Fab, scFv.

Lo que se reivindica aquí es un procedimiento de la invención, definido como:

Un procedimiento para la producción de un miembro de una pareja de unión específica (sbp), procedimiento que comprende:

expresión en células hospedadoras recombinantes de un ácido nucleico que codifica una población genéticamente diversa de ese tipo de miembro sbp, en el cual cada uno de dicho miembro sbp se expresa como una fusión con un componente de superficie de un bacteriófago secretado que expresa en la superficie de la partícula bacteriófago dicho miembro sbp, teniendo dicha partícula la capacidad de replicarse, proporcionada por la información genética empaquetada dentro, mediante la utilización de dicho componente de superficie, el ácido nucleico que codifica dicho miembro sbp expresado que está incluido dentro de la célula hospedadora en una forma que es capaz de ser empaquetado en dicha partícula mediante la utilización de dicho componente de superficie, por medio del cual el material genético de la partícula que expresa un miembro sbp codifica para el miembro sbp expresado mencionado, estando caracterizado el procedimiento por el hecho de que dichos miembros sbp son moléculas de anticuerpo Fv de cadena sencilla derivadas de:

(i) el repertorio de genes de inmunoglobulinas reorganizadas de un animal inmunizado con el miembro sbp complementario,

(ii) el repertorio de genes de inmunoglobulinas reordenados de un animal no inmunizado con el miembro sbp complementario,

(iii) un repertorio de un gen o genes de inmunoglobulinas reordenados artificialmente, o

(iv) una mezcla de cualquiera de (i), (ii) y (iii);

y cada miembro sbp mencionado se expresa en una forma funcional que comprende un dominio de unión para el miembro sbp complementario.

También se reivindican realizaciones del procedimiento de la invención como sigue:

Una realización en donde cada miembro sbp expresado se expresa en un vector fago.

Una realización en donde cada miembro sbp expresado se expresa en un vector fagémido, incluyendo el procedimiento la utilización de un fago auxiliar, o un plásmido que exprese genes que complementen al fago, para ayudar al empaquetamiento del genoma del fagémido mencionado, y dicho componente de superficie mencionado es una proteína de la cápside del mismo.

Una realización en donde la fusión mencionada es con una proteína de la cápside de un bacteriófago y la partícula se forma con la mencionada fusión en ausencia de dicha proteína de la cápside expresada en la forma salvaje.

Una realización en donde dicha fusión es con una proteína de la cápside de un bacteriófago y está presente una proteína de dicha cápside nativa en la partícula mencionada que expresa dicha fusión.

Una realización en donde el hospedador es una bacteria y dicho componente de superficie es una proteína de la cápside del bacteriófago.

Una realización en la cual el bacteriófago es un fago filamentoso.

Una realización en la cual el fago se selecciona de la clase de fagos I fd, M13 y f1.

Una realización en la cual cada miembro sbp expresado se expresa como una fusión con la proteína de la cápside del gen III del fago fd o su correspondiente en otro fago filamentoso.

Una realización en la cual el miembro sbp expresado mencionado se inserta en la región N-terminal de la proteína de la cápside madura secuencia abajo de un péptido líder secretor.

Una realización en la cual el hospedador es E. coli.

Una realización en la cual las partículas que se forman por la expresión mencionada se seleccionan o rastrean para proporcionar un miembro sbp expresado único o una población mezcla de dichos miembros sbp expresados asociados en sus partículas respectivas con ácido nucleico que codifica para dicho miembro sbp expresado.

Una realización en la cual las partículas se seleccionan por afinidad con un miembro complementario a dicho miembro sbp expresado.

Una realización en la que el procedimiento comprende la recuperación de cualquier partícula unida al miembro complementario mencionado mediante lavado con un eluyente.

Una realización en la cual el eluyente contiene una molécula que compite con las partículas mencionadas para la unión al miembro sbp complementario.

\newpage

Una realización en la cual el eluyente contiene una molécula que compite con dichas partículas para la unión a dicho miembro sbp complementario.

Una realización en la cual el ácido nucleico derivado de una partícula seleccionada o rastreada se utiliza para expresar dicho miembro sbp que se había expresado o un fragmento o derivado del mismo en un organismo hospedador recombinante.

Una realización en la cual el ácido nucleico de una o más partículas se coge y se utiliza para proporcionar un ácido nucleico codificante en un procedimiento adicional para obtener un miembro sbp individual o una población mezclada de miembros sbp, o el ácido nucleico codificante para los mismos.

También se reivindican en el presente documento células hospedadoras recombinantes de la invención, definidas como:

Células hospedadoras recombinantes portadoras de una genoteca de fragmentos de ácidos nucléicos que comprenden fragmentos que codifican para un población genéticamente diversa de miembros de parejas de unión específicos (sbp), cada miembro sbp se expresa como una fusión con un componente de superficie de un bacteriófago secretable, de tal manera que los miembros sbp mencionados se expresen en la superficie de las partículas bacteriófago y el material genético de las partículas, empaquetado mediante la utilización del componente de superficie mencionado, codifique para el miembro sbp expresado asociado, caracterizado en que los miembros sbp mencionados son moléculas de anticuerpos Fv de cadena sencilla derivados de

(ii) el repertorio de genes de inmunoglobulina reordenados de un animal no inmunizado con el miembro sbp complementario,

(iv) una mezcla de cualquiera de (i), (ii) y (iii);

y cada miembro sbp se expresa en una forma funcional que comprende un dominio de unión para el miembro sbp complementario.

El fago puede ser fd o un derivado de fd. El derivado puede ser resistente a tetraciclina.

El miembro sbp o cadena polipeptídica del mismo se puede insertar en la región N-terminal de la proteína de la cápside madura dirección cadena debajo de un péptido secretor líder. La secuencia se puede insertar después del aminoácido +1 de la proteína madura. El sitio para la inserción puede estar flanqueado por secuencias cortas correspondientes a las secuencias que se encuentran en cada extremo del ácido nucleico a ser insertado. Por ejemplo, donde el dominio proteico es un dominio de inmunoglobulina, el sitio de inserción en el fago puede estar flanqueado por secuencias nucleotídicas que codifican para los primeros cinco aminoácidos y los cinco últimos aminoácidos del dominio Ig. Dichas secuencias nucleotídicas flanqueantes se muestran en la Figura 4(2) B y C, en donde las secuencias nucleotídicas que flanquean el sitio codifican las secuencias de aminoácidos QVQLQ y VTVSS que se encuentran en cualquier extremo del dominio VH, o QVQLQ y LEIKR que se encuentran en cualquier extremo del dominio Fv (VH+VL combinado). Cada una de estas secuencias que flanquean el sitio de inserción pueden incluir un sitio de escisión adecuado, como se muestra en la Fig. 4.

Alternativamente, las secuencias nucleotídicas flanqueantes mostradas en la Figura 4 (2) B y C según se han descrito más arriba, se pueden utilizar para flanquear el sitio de inserción para cualquier ácido nucleico a ser insertado, ya sea o no que el ácido nucleico codifique una inmunoglobulina.

Como se ha mencionado previamente, la presente invención también proporciona nuevos sistemas de selección y formatos de ensayo. En estos sistemas y formatos, la secuencia genética codificante de la molécula de anticuerpo scFv de especificidad deseada se separa de una población general de partículas de bacteriófago secretadas que tienen un rango de especificidad, por el hecho de su unión a un objetivo específico (p.e. antígeno o epítopo).

Las partículas se pueden recuperar mediante lavado con un eluyente. Las condiciones de lavado se pueden variar con el fin de obtener partículas con diferentes afinidades de unión para dicho epítopo. Alternativamente, para obtener, p.e., partículas de elevada afinidad, el miembro complementario (pe un epítopo) se puede presentar a la población de partículas (pe. pAbs) ya unidos colocados alrededor del miembro de unión unido.

Los cebadores para la PCR y los reactivos asociados para su utilización cuando los miembros sbp son anticuerpos pueden tener las siguientes características:

(i) cebadores homólogos en el extremo 5' de la cadena con sentido o sin sentido de las secuencias que codifican para los dominios de anticuerpos; y

(ii) cebadores que incluyen secuencias diana a 5' de estas secuencias homólogas en las que se incorporan dianas de restricción para permitir su inserción en vectores; junto con secuencias que permiten la unión de las regiones VH y VL amplificadas para permitir su expresión como fragmentos Fv, scFv o Fab.

Los tampones y las enzimas se emplean generalmente para permitir la preparación de secuencias nucleotídicas que codifican para los fragmentos Fv, scFv o Fab derivados de los genes de inmunoglobulinas reordenados o no reordenados según las estrategias descritas en la presente invención.

Los solicitantes han escogido los bacteriófagos específicos F filamentosos como un ejemplo del tipo de fago que puede proporcionar un vehículo para la expresión de las moléculas de unión, como por ejemplo los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos y derivados de los mismos, en sus superficies y facilitar su posterior selección y manipulación.

Los fagos específicos F (como por ejemplo el fl, el fd o el M13) han desarrollado un procedimiento de propagación que no mata a la célula huésped y se utilizan generalmente como vehículos para el DNA recombinante (Kornberg, A. (1980), DNA Replication, W.H. Freeman y Co., San Francisco). El genoma de DNA de cadena sencilla (aproximadamente de 6,4 kb) del fd sale a través de la membrana bacteriana, lugar en donde secuestra subunidades de la cápside para producir viriones maduros. Estos viriones son de unos 6 nm de diámetro, 1 mm de largo y cada uno contiene 2800 moléculas aproximadamente de la proteína de cubierta más grande codificada por el gen vírico VIII y cuatro moléculas de la proteína del gen de la molécula de adsorción III (g3p), esta última situada en un extremo del virión. La estructura ha sido descrita en una revisión de Webster y col., (1978), en The Single Stranded DNA Phages, 557-569, Cold Spring Harbor Laboratory Press. El producto del gen III está implicado en la unión del fago al pilo F de la bacteria.

Aunque estos fagos no matan a sus huéspedes durante la replicación normal, la interrupción de algunos de sus genes puede dar lugar a la muerte de la célula (Kornberg, A. (1980), supra). Esto lleva implícito alguna limitación para su utilización. Los solicitantes han identificado que el gen III del fago fd es un posible lugar atractivo para la inserción de secuencias externas biológicamente activas. Sin embargo, hay otros sitios candidatos entre los que se incluyen, por ejemplo, el gen VIII y el gen VI.

La proteína por sí misma solo es un componente minoritario de la cubierta del fago y la interrupción del gen no provoca la muerte celular (Smith, G. (1988), Virology, 167:156-165). Además, es posible insertar algunas secuencias externas (sin función biológica) en varias posiciones dentro de este gen (Smith, G. (1985), Science, 228:1315-1317; Parmley, S.F., G.P Smith (1988), Gene, 73:305-318 y de la Cruz, V.F. y col. (1988), J. Biol Chem., 263:4318-4322). Smith y col. describieron la expresión de péptidos en la superficie externa del fago, pero no describieron la expresión de dominios proteicos. Los péptidos pueden adoptar un rango de estructuras que pueden ser distintas cuando están libres en solución respecto a cuando están unidas, por ejemplo, a un anticuerpo, o cuando forman parte de una proteína (Stanfield, R.I. y col. (1980), Science, 248:712-719). En general, las proteínas tienen una estructura terciaria bien definida y realizan su función biológica sólo cuando adoptan esta estructura. Por ejemplo, la estructura del anticuerpo D1.3 se ha resuelto en su forma libre y cuando está unida al antígeno (Bhat, T.N. y col. (1990), Nature, 347:483-485). El grueso de la estructura de la proteína es idéntica en cada circunstancia, con sólo pequeñas variaciones alrededor del sitio de unión al antígeno. Otras proteínas tienen cambios conformacionales más sustanciales al unirse al ligando, como por ejemplo las enzimas hexoquinasa y piruvato deshidrogenasa durante su ciclo catalítico, pero aún retienen su patrón general de plegamiento. Esta integridad estructural no incluye a toda la proteína, sino que se presenta en los dominios proteicos. Esto conduce al concepto de una unidad de plegamiento que forma parte de una proteína, generalmente un dominio, que tiene una estructura primaria, secundaria y terciaria bien definidas y que mantiene el mismo patrón de plegamiento general tanto si está unida a una pareja de unión o no. La única secuencia génica que Smith y col. describieron que era de un tamaño suficiente para codificar un dominio (posiblemente un mínimo de 50 aminoácidos) era un fragmento de 335 pb de la b-galactosidasa correspondiente a los nucleótidos 861-1195 de la secuencia del gen b-galactosidasa (Parmley, S., G.P. Smith (1988), supra) Este codificaría para 112 aminoácidos de un dominio mucho más largo de 380 aminoácidos. Por lo tanto, con anterioridad a la presente solicitud, no se ha expresado en fagos un dominio básicamente completo o una unidad de plegamiento. En estos casos, aunque se rompe la infectividad del virión, las secuencias insertadas pueden detectarse en la superficie del fago mediante la utilización, por ejemplo, de anticuerpos.

La proteína codificada por el gen III tiene varios dominios (Pratt, D. y col. (1969), Virology, 39:42-53; Grant, R.A. y col. (1981), J. Biol. Chem., 256: 539-546; y Armstrong, J. y col. (1981), FEBS Lett., 135:161-172) que son: (i) una secuencia señal que dirige a la proteína a la membrana celular y que después se elimina; (ii) un dominio que ancla la proteína madura en la membrana de la célula bacteriana (y también la cubierta del fago); y (iii) un dominio que la une específicamente al fago receptor, el pilo F de la bacteria huésped. Las secuencias cortas derivadas de moléculas proteicas se han insertado en dos lugares dentro de la proteína madura (Smith, G. (1985), supra, y Parmley, S.F. y G.P. Smith (1988), supra). Es decir, en una región entre dominios y también entre los aminoácidos 2 y 3 del extremo N terminal. Los sitios de inserción en el extremo N terminal son más eficaces en el mantenimiento de la integridad estructural del gen de la proteína III y en la expresión de los péptidos en la superficie del fago. Mediante la utilización de antisueros específicos para los péptidos, se ha observado que los péptidos insertados en esta posición están en la superficie del fago. Estos autores también fueron capaces de purificar el fago mediante la utilización de esta propiedad. Sin embargo, los péptidos expresados por el fago no poseen por si mismas funciones biológicas medi-
bles.

Es difícil retener la función biológica de una molécula cuando se expresa en un contexto radicalmente distinto a su estado natural. Los requerimientos estructurales de la molécula son fuertes. Sin embargo, la retención de la capacidad de unirse a un antisuero específico es un proceso pasivo que impone demandas mucho menos rigurosas sobre la estructura de la molécula. Por ejemplo, el hecho de que el antisuero policlonal reconozca claramente proteínas completamente desnaturalizadas y biológicamente inactivas en transferencias de Western es un regla más que una excepción (ver, por ejemplo, Harlow, E. y D. Lane (1988), Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Por lo tanto, la inserción de péptidos en una región que permite que su estructura sea sondeada con un antisuero sólo muestra que la región permite que estén expuestas las secuencias insertadas y no muestra que la región sea adecuada para la inserción de secuencias largas que tienen requerimientos estructurales restrictivos para la expresión de una molécula con una función biológica o de unión. En concreto, no muestra que los dominios o las unidades de plegamiento de las proteínas puedan expresarse en secuencias insertadas en esta región.

Esta experiencia con las transferencias de Western es una demostración práctica gráfica que muestra que la retención de la capacidad a unirse a un antisuero específico impone muchas menos demandas sobre la estructura de un polipéptido que la que impone el plegamiento para la retención de una función biológica.

Se han realizado estudios en los que se ha manipulado E. coli para expresar la proteína del receptor b-adrenérgico como una fusión con la proteína lamB de la membrana externa. El receptor b-adrenérgico se expresó en una forma funcional tal como se determinó por la presencia de actividad de unión. Sin embargo, cuando se hizo una fusión equivalente de un anticuerpo con lamB, el anticuerpo fusionado era tóxico para la célula huésped.

Los solicitantes han investigado la posibilidad de insertar el gen con una secuencia que codifica para fragmentos de anticuerpos biológicamente activos en la región del gen III del fd para expresar una proteína de fusión grande. Como puede deducirse de la discusión anterior, esta aproximación lleva consigo complicadas demandas sobre la funcionalidad de la proteína de fusión. La inserción es grande, con fragmentos que codifican para fragmentos de anticuerpos de al menos 100-200 aminoácidos; el anticuerpo derivado del dominio debe plegarse eficiente y correctamente para expresar la unión al antígeno; y deben retenerse la mayoría de las funciones del gen III. La aproximación de los solicitantes consistente en la construcción de una molécula de fusión se diseñó para minimizar el riesgo de interrumpir dichas funciones. En una realización de la presente invención, el vector inicial que se utilizó era el fd-tet (Zacher, A.N. y col. (1980), Gene, 9:127-140), una versión resistente a la tetraciclina del bacteriófago fd que puede propagarse como un plásmido que confiere resistencia a la tetraciclina al huésped E. coli infectado. Los solicitantes decidieron insertar justo después de la secuencia líder del gen de la proteína III del fd por diversas razones. En concreto, los solicitantes decidieron insertar tras el aminoácido 1 de la proteína madura para retener el contexto de rotura por la peptidasa de la secuencia líder. Para retener la estructura y la función del gen III por él mismo, la mayoría de los aminoácidos originales se sintetizan tras las secuencias de inmunoglobulinas insertadas. Las secuencias de inmunoglobulinas insertadas se diseñaron para incluir residuos de la región de cambio que une VH-VL a CH1-CL (Lesk, A., y C. Chothia (1988), Nature, 335:188-190).

De forma sorprendente, mediante la manipulación del gen III del bacteriófago fd, los actuales solicitantes han sido capaces de construir un bacteriófago que expresa en su superficie un anticuerpo biológicamente funcional, una enzima, y moléculas de receptores mientras permanece intacto e infeccioso. Además, los fagos portadores de anticuerpos con una especificidad deseada pueden seleccionarse de un fondo de bacteriófagos que no muestran dicha especificidad.

La secuencias que codifican para una población de moléculas de anticuerpos y para la inserción en un vector para expresar la funciones de unión del anticuerpo en la superficie del fago pueden derivar de varias fuentes. Por ejemplo, de humanos o roedores inmunizados o no inmunizados, y de órganos como el bazo y los linfocitos del sistema circulatorio periférico. Las secuencias codificantes derivadas de estas fuentes se obtienen mediante técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia (Orlandi, R. y col. (1989), supra; Larrick, J.W. y col. (1989), supra; Chiang, Y.L. y col. (1989), BioTechniques, 7:360-366; Ward, E.S. y col. (1989), supra; Sastry, L. y col. (1989), supra) o por nuevas estrategias de ligamiento descritas en el Ejemplo II. Cada pAb individual en la genoteca resultante de pAbs expresara anticuerpos o fragmentos derivados de anticuerpos que son monoclonales respecto a sus característica de unión al antígeno.

El desarrollo realizado por los presentes solicitantes es importante y proporciona una ruptura significativa en la tecnología relativa a la producción de moléculas de unión biológicas, sus fragmentos y derivados mediante la utilización de procedimientos recombinantes.

En las técnicas recombinantes estándar para la producción de anticuerpos, se utiliza un vector de expresión que contiene secuencias que codifican para las cadenas polipeptídicas de anticuerpos para transformar, por ejemplo, E. coli. Los polipéptidos de anticuerpos se expresan y detectan mediante la utilización de sistemas de rastreo estándar. Cuando en el rastreo se detecta un polipéptido de un anticuerpo con una especificidad deseada, hay que volver a la E. coli transformada en particular que expresa el polipéptido del anticuerpo deseado. Además, el vector que contiene la secuencia codificante para el polipéptido del anticuerpo deseado tienen que aislarse de E. coli para su utilización posterior en los pasos de procesamiento.

Sin embargo, en la presente invención el polipéptido del anticuerpo deseado cuando se expresa ya está empaquetado con su secuencia génica codificante. Esto significa que cuando se selecciona el polipéptido de un anticuerpo con una especificidad deseada, no hay necesidad de volver al cultivo original para el aislamiento de dicha secuencia. Además, en procedimientos anteriores de técnicas recombinantes estándar, cada clon que exprese el anticuerpo debe rastrearse individualmente. La presente solicitud proporciona la selección de clones que expresan anticuerpos con las propiedades deseadas y sólo requiere el rastreo de clones a partir de un grupo enriquecido.

Debido a que la partícula bacteriófago secretada expresa un miembro de una pareja de unión específico en la superficie de una estructura replicable relativamente simple, también contienen la información genética que codifica para el miembro, pueden recuperarse las partículas que se unen al miembro complementario del par de unión específico (por ejemplo, el antígeno) de forma muy eficiente tanto por elución del miembro complementario utilizando, por ejemplo, dietilamina, concentración salina elevada, etc., e infectando una bacteria adecuada, o mediante desnaturalización de la estructura y amplificando específicamente mediante la PCR las secuencias que codifican para el miembro. Es decir, no hay necesidad de volver al clon bacteriano original que ha originado al pAb.

En algunos casos, como por ejemplo la inmunoprecipitación y algunas pruebas diagnósticas, es una ventaja la utilización de anticuerpos policlonales o fragmentos de anticuerpos. La presente invención permite que esto se realice tanto por selección de un grupo enriquecido de pAbs con las propiedades deseadas o mediante la mezcla de clones aislados individualmente con las propiedades deseadas. Si se desea, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden expresarse en su forma soluble. Una población de pAb policlonal de este tipo seleccionada puede hacerse crecer a partir de reservas del fago, de bacteria con fagemidos o de bacterias que expresen fragmentos solubles derivados de la población policlonal seleccionada. Por lo tanto, se crea un reactivo equivalente a un antisuero policlonal que puede replicarse y fabricarse rutinariamente en cultivo sin la utilización de animales.

Selección de formatos y maduración de afinidad

Las partículas bacteriófagos secretadas individuales que expresen la especificidad deseada, por ejemplo hacia un antígeno, puede aislarse de la genoteca compleja mediante la utilización de técnicas de rastreo convencionales (como por ejemplo las descritas por Harlow, E. y D. Lane (1988), supra; Gheradi, E. y col. (1990), J. Immunol. Meth., 126:61-68).

Los solicitantes también han planeado una serie de nuevas técnicas de selección que son practicables sólo por las propiedades específicas de las partículas. La líneas generales de algunos procedimientos de rastreo se ilustran en la Figura 2.

La genoteca/población de pAbs que deben rastrearse pueden generarse a partir de inmunizados u otros animales; o pueden crearse in vitro mediante la mutagénesis de anticuerpos fágicos preexistentes (mediante la utilización de técnicas perfectamente conocidas por los especialistas en la materia como la mutagénesis oligonucleotídica dirigida (Sambrook, J. y col. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Esta población puede rastrearse con uno o más de los formatos descritos posteriormente en relación a lo esquematizado en la Figura 2, para obtener pAbs individuales cuyas propiedades de unión al antígeno son distintas de la muestra c.

Elución de la unión

La Figura 2(i) muestra el antígeno (ag) unido a una superficie sólida (s). La superficie sólida (s) puede proporcionarse por medio de una placa de Petri, esferas de cromatografía, esferas magnéticas y similares. La genoteca/población de pAbs se pasa entonces a través del ag, y aquellos p individuales que se unen quedan retenidos tras el lavado, y pueden detectarse opcionalmente con el sistema de detección d. Un sistema de detección está basado en el antisuero anti-fd, tal como se ilustra con mayor detalle después en en Ejemplo 4. Si las muestras de la población p unidas se eliminan en condiciones con una estrictez cada vez mayor, la afinidad de unión representada en cada muestra se incrementará. Las condiciones para incrementar la estrictez pueden obtenerse, por ejemplo, incrementando el tiempo de inmersión o cambiando el pH de la solución de inmersión, etc.

Competición

Respecto a la Figura 2(ii), el antígeno ag puede unirse a un soporte sólido s y unirse hasta la saturación a la molécula de unión original c. Si una población de mutante pAb (o un grupo de pAbs no relacionados) se pone en contacto con el complejo, sólo se unirán aquellos que tengan una afinidad más elevada para el antígeno ag que c. En la mayoría de ejemplos, sólo una parte pequeña de la población c será desplazada por individuos de la población p. Si c es una molécula de anticuerpo tradicional, todo el material que se una puede recuperarse y el p unido se recuperará por infección de una bacteria adecuada y/o mediante la utilización de técnicas estándar como la PCR.

Una aplicación ventajosa es cuando ag es un anticuerpo y c su antígeno. Entonces, la población p unida recuperada es un anticuerpo anti-idiotipo que tiene numerosas aplicaciones en la investigación y en el diagnóstico e industrias farmacéuticas.

Actualmente es difícil seleccionar directamente anticuerpos anti-idiotipos. Los pAbs darían la capacidad para realizarlo directamente mediante la unión de genotecas pAb (como por ejemplo una genoteca sencilla) a células B (que expresan anticuerpos en su superficie) y aislamiento de aquellos fagos que se unen bien.

En algunos casos puede ser ventajosos preseleccionar la población p. Por ejemplo, en el ejemplo anterior del anti-idiotipo, p puede absorberse en contra de un anticuerpo relacionado que no se une al antígeno.

Sin embargo, si c es un pAb, entonces tanto c como p o ambos pueden marcarse ventajosamente de tal forma que puedan distinguirse y seleccionarse para la unión a p frente a la unión a c. Este marcaje puede ser físico, como por ejemplo marcando previamente p con biotina; o de forma más ventajosa, genética. Por ejemplo, puede marcarse c con una diana de restricción EcoB, mientras que p puede marcarse con una diana de restricción EcoK (ver Carter, P. y col (1985), Nucleic Acid Res., 13:4431-4443). Cuando p+c unidos se eluyen del antígeno y se utilizan para infectar una bacteria adecuada, hay una restricción (y, por lo tanto, no hay crecimiento) de la población c (es decir, en este ejemplo una bacteria que restringe EcoB). Cualquier fago que crezca estará enriquecido por aquellos individuos de p con elevada afinidad de unión. Alternativamente, el marcaje genético puede realizarse marcando p con secuencias nuevas que pueden utilizarse para amplificar específicamente p de la mezcla utilizando la PCR.

Debido a que los pAbs unidos pueden amplificarse utilizando, por ejemplo, la PCR o la infección bacteriana, también es posible recuperación la especificidad deseada incluso cuando insuficientes individuos están unidos para permitir la detección mediante técnicas convencionales.

El procedimiento preferido de selección de un fago que exprese una molécula proteica con una especificidad o afinidad deseada será generalmente la elución en una matriz de afinidad con un ligando (por ejemplo, Ejemplo 16). La elución con cada vez mayor concentración de ligando deberá eluir el fago que expresa las moléculas de unión con un incremento en su afinidad. Sin embargo, cuando, por ejemplo, un pAb se une a su antígeno con una elevada afinidad o avidez (u otra proteína a su pareja de unión) puede que no sea posible eluir el pAb de una matriz de afinidad con la molécula relacionada con el antígeno. Alternativamente, puede que no haya ninguna molécula eluida específica adecuada que pueda prepararse en una concentración suficientemente elevada. En estos casos es necesario utilizar un procedimiento de elución que no sea específico, por ejemplo, del complejo antígeno-anticuerpo. Algunos de los procedimientos de elución no específica utilizan generalmente una reducida viabilidad del fago, como por ejemplo, mediante la reducción con el tiempo de la viabilidad del fago a pH 12 (Rossomando, E.F. y N.D.J. Zinder (1968), J. Mol. Biol., 36:387-399). Por ejemplo, pueden haber interacciones entre anticuerpos y matrices de afinidad que no puedan interrumpirse sin la completa eliminación de la infectividad del fago. En estos casos se requiere un procedimiento para eluir el fago que, por ejemplo, no se base en la interrupción de la interacción antígeno-anticuerpo. En consecuencia, se diseñó un procedimiento que permitía la elución de pAbs unidos en condiciones suaves (reducción de un grupo ditiol con ditiotreitol), procedimiento que no destruye la estructura del fago (Ejemplo 32).

Este procedimiento de elución es sólo un ejemplo de un procedimiento de elución en condiciones suaves. Un procedimiento particularmente ventajoso sería la introducción de una secuencia nucleotídica que codifique para aminoácidos que constituyan una diana de rotura para proteasas altamente específicas entre el gen foráneo insertado, en este caso un gen para un fragmento de anticuerpo, y la secuencia del resto del gen III. Ejemplos de estas proteasas altamente específicas son el Factor X y la trombina. Después de la unión del fago a una matriz de afinidad y la elución para eliminar las uniones de fagos no específicos y uniones débiles de fagos, el fago fuertemente unido se eliminará mediante lavado de la columna con proteasas en condiciones adecuadas para la digestión en la diana de reconocimiento. Esto dará lugar a la rotura del fragmento de anticuerpo de la partícula fago por elución del fago. Se esperaría que este fago fuera infectivo, ya que la única diana de proteasa debe ser la que se ha introducido específicamente. El fago fuertemente unido puede recuperarse, por ejemplo, mediante la infección de células TG1 de E. coli.

Un procedimiento alternativo al anterior es coger la matriz de afinidad que ha retenido el pAb fuertemente unido y extraer el DNA, por ejemplo, mediante ebullición en una solución con SDS. A continuación, el DNA extraído puede utilizarse directamente para transformar células huésped de E. coli o, alternativamente, pueden amplificarse las secuencias que codifican para el anticuerpo mediante, por ejemplo, la utilización de la PCR con cebadores adecuados como los descritos en la presente invención, y, a continuación, insertarlas en un vector para su expresión como un anticuerpo soluble para posteriores estudios o un pAb para posteriores tandas de selección.

Otro procedimiento preferido de selección por afinidad sería la unión a una matriz de afinidad que contenga cantidades pequeñas de ligando.

Si se desea seleccionar a partir de una población de fagos que expresan una molécula proteica con una elevada afinidad por su ligando, una estrategia preferida es unir una población de fagos a una matriz de afinidad que contiene una cantidad pequeña de ligando. Existe una competición entre fagos, que expresan proteínas con elevada afinidad y baja afinidad para su unión con el ligando de la matriz. Los fagos que expresen proteína con elevada afinidad se unirán preferencialmente y la proteína con baja afinidad se eliminará por lavado. A continuación, la proteína de alta afinidad se recupera por elución con el ligando o por otros procedimientos que eluyan al fago de la matriz de afinidad (el Ejemplo 25 demuestra este procedimiento).

En resumen, para la recuperación de DNA empaquetado del paso de afinidad, el empaquetado simplemente debe eluirse, puede eluirse en presencia de un miembro sbp homólogo que compita con el empaquetado mencionado por su unión a un miembro sbp complementario; puede recuperarse mediante ebullición, puede recuperarse por rotura proteolítica de la proteína; y otros procedimientos que serán evidentes para aquellos expertos en la materia, como por ejemplo, la destrucción de la unión entre el sustrato y el miembro sbp complementario para liberar al DNA empaquetado mencionado y el miembro sbp. En cualquier caso, el objetivo es obtener el DNA del empaquetado de tal forma que pueda emplearse directa o indirectamente para expresar el miembro sbp codificado por el mismo.

La eficiencia de este procedimiento de selección para los pAbs y la capacidad para crear genotecas muy grandes significa que las técnicas de inmunización desarrolladas para incrementar la proporción de células rastreadas para la producción de anticuerpos de interés no será necesariamente un requerimiento obligatorio. La técnica permite el aislamiento rápido de especificidades de unión, como por ejemplo, especificidades antígeno-anticuerpo, incluidas aquellas que serían difíciles o incluso imposibles mediante técnicas convencionales, como por ejemplo, anticuerpos catalíticos o anti-idiotípicos. Ahora es posible extraerlos todos del animal una vez que se haya construido una genoteca completa del repertorio inmunológico.

La nueva estructura de la molécula de pAb puede emplearse en otras varias aplicaciones, siendo algunos ejemplos:

Amplificación de señales

Mediante la actuación como una nueva entidad molecular en sí mismo, los pAbs combinan la capacidad de unirse a una molécula específica, como por ejemplo, antígeno, con la amplificación sí la proteína principal de la cubierta se utiliza para unir otra porción. Esta porción puede unirse vía procedimientos inmunológicos, químicos o de cualquier otro tipo y, por ejemplo, puede utilizarse para marcar el complejo con reactivos de detección o moléculas citotóxicas para su utilización in vivo o in vitro.

Detección física

El tamaño de los pAbs puede utilizarse como un marcador en relación particularmente a los procedimientos físicos de detección como la microscopía electrónica y/o algunos biosensores, como por ejemplo la resonancia plasmón de superficie.

Ensayos para diagnósticos

Los pAbs también tienen usos ventajosos en los ensayos para diagnósticos, particularmente en aquellos en los que la separación puede efectuarse utilizando sus propiedades físicas, como por ejemplo la centrifugación, la filtración etc.

Para que se comprenda mejor la presente invención, se describirán realizaciones con mucho mayor detalle a modo de ejemplos y no como una limitación en relación a las figuras descritas más adelante. La expresión de los fragmentos Fab no forma parte de la invención. La mención a dichos fragmentos en este documento sólo se realiza a modo de ilustración.

La Figura 1 muestra la estructura básica de la molécula de anticuerpo IgG más simple.

La Figura 2 muestra de forma esquemática las técnicas de selección que utilizan las propiedades únicas de los pAbs; 2i) muestra un sistema de unión/elución; y (2ii) muestra un sistema de competición (p=pAb; ag=antígeno al que se requiere su unión al pAb; c=competidor de la población, como por ejemplo anticuerpo, pAb, ligando; s=sustrato (por ejemplo, esferas de plástico, etc); d=sistema de detección.

La Figura 3 muestra el vector fd-tet y un esquema para la construcción de vectores, fdTPs/Bs (para la inserción de secuencias codificantes para VH) y fdTPs/Xh para la inserción de secuencias codificantes para scFv.

La Figura 4 muestra las secuencias nucletídicas para los oligonucleótidos y los vectores. Todas las secuencias se dibujan de 5' a 3' y se numeran según Beck y col (1978), Nucleic Acid Res., 5:4495-4503. 4.1 muestra las secuencias de los oligonucleótidos utilizados para la mutagénesis (oligos 1 y 2) o secuenciación (oligo 3). Las secuencias ilustradas se sintetizaron en un Applied Biosystems, sintetizador de oligonucleótidos y son complementarios a la forma de cadena sencilla del fd-tet (son sin sentido respecto al gen III). 4.2 muestra las secuencias de varias construcciones alrededor del sitio de inserción del gen III. Estas secuencias están ilustradas en la orientación con sentido en relación al gen III; (A) fd-tet (y fdTdBst) (B) fdTPs/Bs y (C) fdTPs/Xh. Las dianas de restricción claves se muestran junto con los aminoácidos de la inmunoglobulina a los que contribuye el vector, (se utiliza el código de una letra para los aminoácidos, ver Harlow, E. y D. Lane (1988), supra).

La Figura 5 muestra las secuencias nucletídica y aminoacídica para el scFv en el vector scFvD1.3 myc. Esta proporciona la secuencia del Fv de cadena sencilla anti-lisozima y las secuencias que la rodean en el scFvD1.3 myc, en la que se muestra la secuencia del péptido señal pe1 B en el extremo N-terminal y la secuencia etiqueta myc en el extremo C-terminal (Ward, E.S. y col. (1989), supra). También se muestra la secuencia peptídica que une a las regiones VH y VL. La secuencia aminoacídica se representa encima de la secuencia nucleotídica mediante el código de una letra, ver Harlow, E. y D. Lane (1988), supra.

La Figura 6 muestra la unión de pAbs a la lisozima y el efecto de la variación de la cantidad de sobrenadante. Cada punto es media de las muestras duplicadas. La lisozima se utilizó para tapizar a 1 mg/ml en NaHCO_{3} 50 mM.

La Figura 7 muestra en una gráfica el efecto de la variación de la concentración del tapizado con lisozima o albúmina de suero bovino en la unión de pAbs a la lisozima. Cada punto es la media de muestras duplicadas.

La Figura 8 muestra la secuencia alrededor del sitio de clonaje en el gen III del fd-CAT2. Se muestran las dianas para las enzimas de restricción así como los aminoácidos codificados por las secuencias derivadas de anticuerpos. Estas están flanqueadas en el extremo 5' por el péptido señal del gen III y en el extremo 3' por 3 residuos alanina (codificado por la diana de restricción NotI) y el resto del gen de la proteína III madura. La flecha muestra el sitio de corte para el corte del péptido señal.

La Figura 9 muestra la unión del pAb (1.3) a las lisozimas. La unión del fago se detecta mediante ELISA a la (a) lisozima de claras de huevos de gallina (HEL) (b) lisozima de claras de huevos de pavo (TEL), (c) lisozima humana (HUL); (d) albúmina de suero bovino (BSA). Un control adicional de (e) fdTPs/Bs a HEL.

La Figura 10 muestra un mapa del FabD1.3 en pUC19.

La Figura 11 muestra los resultados del ELISA que proporciona una comparación entre la unión a la lisozima por el fago Fab y por el fago scFv. Vector=fdCATT2 (Ejemplo 5); fdscFv(OX)=pAbQll (Ejemplo 9); fdVHCHI (D1.3)=cultivadas en células normales (por ejemplo, no con la cadena L, ver Ejemplo 7); FdFAb (D1.3) por ejemplo, FdVHCH1 (D1.3) que se han cultivado en células que contenían la cadena D1.3 L; fdscFv (D1.3)=pAbD1.3.

La Figura 12 muestra la prueba con oligonucleótidos para la afinidad al fago purificado. 10^{12} fagos con la proporción de 1 pAb (D1.3) en 4 x 10^{4} fdTPS/Bs fagos se purificaron por afinidad y se probaron frente a un oligonucleótido específico para el pAb (D1.3). A es una membrana después de una ronda de purificación por afinidad (un total de 900 colonias) y B es una membrana después de dos rondas (un total de 372 colonias).

La Figura 13 muestra la secuencia del fragmento del anticuerpo anti-oxazolona NQ11 scFv. La secuencia aportada por el engarzador se muestra en minúsculas. La secuencia del VH está antes de la secuencia del engarzador y la secuencia del VL está detrás del engarzador.

La Figura 14 muestra los resultados del ELISA para la unión del pAb NQ11 y del pAb D1.3 y del vector fdTPs/xh a antígenos especificados.

La Figura 15 muestra la secuencia que rodea la inserción de la phoA en el fd-phoAla166. Se muestran las dianas de restricción utilizadas para clonar, así como los aminoácidos codificados por phoA alrededor del sitio de inserción. Los primeros cinco aminoácidos de la fusión madura tienen su origen en el gen III.

La Figura 16(1) muestra la estructura del gen III y de la diana nativa BamHI en la cual se insertó una secuencia codificante scFv del Ejemplo 10 y la Figura 16(2) muestra los sitios A y B de engarzado del péptido natural para posibles inserciones de secuencias codificantes scFv.

La Figura 17 muestra de forma esquemática el protocolo para la PCR de ensamblaje de los repertorios VH y VLK de ratón para la expresión de fagos descrita en el Ejemplo 11.

La Figura 18 muestra ejemplos de los productos finales obtenidos con el procedimiento del Ejemplo 11. Los carriles a y b muestran los productos de la PCR inicial con la utilización de los cebadores para la cadena pesada y ligera, respectivamente; el carril c muestra el producto de 700 pb completamente ensamblados antes de la digestión final con NotI y ApaLI; M1, M2 son los marcadores F174 digerido con HaeIII y el marcador en escalera de 123 pares de bases (BRL Limited, P.O. Box 35, Washington Road, Paisley, Escocia), respectivamente.

La Figura 19 muestra los resultados de un ELISA de la unión a la lisozima por el fagemido pCAT-3 scFv D1.3 en comparación con el vector pCAT-3 (ambos recuperados en M13K07) y fdCATT2 scFv D1.3, tal como se describe en el Ejemplo 12. El ELISA se realizó tal como se describe en el Ejemplo 6 con las modificaciones detalladas en el Ejemplo 13.

La Figura 20 muestra el patrón de digestión observado en clones individuales, seleccionados aleatoriamente de una genoteca de genes de anticuerpos Fv de cadena sencilla derivados de un ratón inmunizado; están digeridos con BstNI.

La Figura 21 muestra las secuencias de los genes VH y VK derivadas de la genoteca combinatorial del Ejemplo 16 y de la genoteca jerárquica del Ejemplo 17.

La Figura 22 muestra una matriz de señales ELISA para los clones derivados de la genoteca combinatorial aleatoria. La denominación de los clones es la correspondiente a la Figura 21. El número de clones que se encontraron para cada combinación se muestra en numerales.

La Figura 23 muestra a) el fagemido pHEN1 como derivado del pUC119 descrito en el Ejemplo 19; y b) los sitios de clonación en el fagemido pHEN.

Figura 24. Las construcciones de anticuerpo clonadas en el fd-CAT2 y pHEN1 para su expresión en la superficie del fago. Las construcciones I, II, III y IV se clonaron tanto en el fd-CAT2 (como fragmentos ApaLI-NotI) y en el pHEN1 (como fragmentos SfiI-NotI), y en el pHEN1 (como fragmentos SfiI-NotI). Todas las construcciones contenían las regiones variables de la cadena pesada (VH) y la cadena ligera (VK) del anticuerpo anti-phOx de ratón NQ10.12.5. Los dominios conservados eran el CK y CH1 humanos (isotipo s1).

Figura 25. Tres vías de expresión de los fragmentos de anticuerpo en la superficie del fago mediante la fusión al gen de la proteína III.

Figura 26. Transferencia de Western del sobrenadante obtenido de los cultivos pHEN1-II(+) o pHEN1(-) en E. coli HB2151, en la que se muestra la secreción del fragmento Fab sólo de pHEN1-II. El Fab anti-humano detecta tanto la cadena H como la L. A causa de la etiqueta c-myc adherida, la cadena L, detectada tanto por la etiqueta anti-c-myc como por el antisuero anti-CK humana, es ligeramente más grande (Mr calculado de 24625) que la cadena H (Mr calculado de 23145).

La Figura 27 es una gráfica que muestra los efectos de la dilución de la lisozima en relación a las señales ELISA obtenidas con la utilización del pAbD1.3 o del scFv D1.3 soluble.

La Figura 28 es una gráfica que muestra los efectos de la dilución de la lisozima en relación a las señales ELISA obtenidas con la utilización del fdTscFvD1.3 y del scFv D1.3 soluble.

La Figura 29 es una gráfica de barras que muestra los resultados positivos de un rastreo por ELISA del fago que expresa los fragmentos scFv derivados de la línea celular 013 que expresa un anticuerpo monoclonal dirigido contra el estriol.

La Figura 30 es una gráfica de barras que muestra los resultados positivos de un rastreo por ELISA del fago que expresa los fragmentos scFv derivados de la línea celular 014 que expresa un anticuerpo monoclonal dirigido contra el estriol.

Figura 31. Comparación de las señales ELISA con scFv D1.3 clonado en fd-CAT2 (fd) o pCAT-3. pCAT-3 scFv1.3 se recuperó con M13K07 (K07). M13k07DgIII No 3 (gIII No 3) o M13K07 gIIIDNo 2 (gIIINo2). Los anticuerpos fágicos se comparan a concentraciones de 10 veces (10x), 1 vez (1x) o 0,1 veces (0,1x) relativas a la concentración en el sobrenadante después del crecimiento durante toda la noche. Las señales de los vectores no recombinantes fdCAT2 y pCAT-3 eran <0,01 a una concentración de 10x. M13K07 gIIIDNo 1 no recuperó nada, tal como se puede ver por la no presencia de señal por encima del fondo en este ELISA.

Figura 32. Transferencia de Western del fago precipitado con PEG utilizado en el ELISA sondeado con el anti-g3p. Las flechas muestran las bandas correspondientes al g3p libre y la fusión g3p-scFvD1.3

Muestra 1: - fd scFvD1.3

Muestra 2: - vector pCAT3

Muestra 3: - pCAT3 scFvD1.3 recuperado con M13K07, sin IPTG

Muestra 4: - pCAT3 scFvD1.3 recuperado con M13K07, IPTG 50 mM

Muestra 5: - pCAT3 scFvD1.3 recuperado con M13K07, IPTG 100 mM

Muestra 6: - pCAT3 scFvD1.3 recuperado con M13K07 gIIIDNo3 (sin IPTG)

Muestra 7: - pCAT3 scFvD1.3 recuperado con M13K07 gIIIDNo2 (sin IPTG)

Panel A: muestras que contienen el equivalente a 8 ml del sobrenadante del cultivo de fagemido por carril, y 80 ml del sobrenadante fd (rendimiento 10 veces inferior del fago comparado con el fagemido). Panel B: las muestras de los fagemidos son las utilizadas en el panel A en una cantidad 5 veces mayor de muestra de carga (equivalente a 40 ml de sobrenadante de cultivo por carril) para permitir la visualización de la banda de fusión en las muestras recuperadas con el parental M13K07.

La Figura 33 es una gráfica que muestra el enriquecimiento de fdCAT2scFvD1.3 producido por una mezcla de fdCAT2scFvD1.3 y fvCAT2TPB4 en un ciclo de mejora del rendimiento.

La Figura 34 es una gráfica que muestra el enriquecimiento de fdCAT2scFvD1.3 producido por una mezcla de fdCAT2scFvD1.3 y fvCAT2TPB1 en un ciclo de mejora del rendimiento.

Figura 35. Transferencia de Western de las proteínas de los fagos fdCAT2(1) y fd-tet-SNasa(2) con antisuero anti-g3p. Se indican los pesos moleculares de las bandas del marcador (kD).

Figura 36. Ensayo de nucleasa de SNasa soluble (3 ng) (A-1), fd-tet-SNasa (4 x 10^{9} TU, (B-1), fd-CAT2 (2 x 10^{10} TU) (C-1) y de una mezcla precipitada con PEG de fdCAT2 y SNasa (2 x 10^{10} TU y 0,7 mg)(D-1) en diluciones de 10 en serie (1 a 3 o 4). El marcador (M) es una digestión de DNA de l con HindIII (New England Biolabs).

La Figura 37 muestra la secuencia de DNA del scFv B18 (anti-NP).

La Figura 38 muestra una representación esquemática de los pasos implicados en el ensamblaje por PCR de las secuencias nucleotídicas que codifican para los fragmentos scFv humanos. Los detalles están en el Ejemplo 27.

Figura 39. Ensayo ELISA de anticuerpos fágicos en placas tapizadas con lisozima de huevo de pavo. Se muestran los dos clones B1 y A4 obtenidas por mutagénesis y selección a partir de pAbD1.3 (Ejemplo 30). La Concentración (ejes x) se refiere a la concentración del fago para cada muestra relativa a la concentración del sobrenadante del cultivo. B1 muestra unión con la lisozima de huevo de pavo comparado con D1.3. A4 muestra una unión reducida a la lisozima de huevo de gallina comparado con D1.3.

Figura 40. ELISA de los anticuerpos fágicos unidos a HEL y TEL. El clon 1 es el fdCAT2scFvD1.3. Los clones 2 a 10 se obtuvieron de la genoteca (Ejemplo 31) después de una selección. Los valores de fondo obtenidos por la unión a BSA se restaron de los valores de unión definidos.

La Figura 41 muestra la secuencia de DNA de las cadenas ligeras D1.3 M1F y M21 obtenidas por selección de una genoteca jerárquica del Ejemplo 31.

La Figura 42 muestra un vector de expresión lambda Fv (Ejemplo 33) derivado de pUC119. Contiene el gen de la línea germinal lambda1 reordenado. Los cassettes de la cadena pesada y ligera contienen un sitio de unión al ribosoma cadena arriba del líder pel B (las dianas de restricción mostradas son: H=HindIII; Sp=SphI; B=BamHI; E=EcoRI).

Materiales y procedimientos

Los siguientes procedimientos que han utilizado los presentes solicitantes están descritos por Sambrook, J. y col. (1989), supra: digestiones con enzimas de restricción, ligación, preparación de células competentes (procedimiento de Hanahan), transformación, análisis de los productos de digestión con enzimas de restricción en geles de agarosa, purificación de DNA con fenol/cloroformo, marcaje en el extremo 5' de oligonucleótidos, rastreo de colonias bacterianas en membranas, preparación de medio 2x YT y placas, preparación de la solución base de tetraciclina, PAGE de proteínas, preparación del tampón fosfato salino.

Todas las enzimas fueron suministradas por New England BioLabs (CP Laboratories, PO Box 22, Bishop's Stortford, Herts., Inglaterra) y se utilizaron según las instrucciones del fabricante en los casos en los que no se hace mención explícita.

La American Type Culture Collection suministró el vector fd-tet (Zacher, A.N. y col. (1980), supra) (ATCC nº 37000) y se transformó en células TG1 competentes (genotipo: K12d (lac-pro), sup E, thi, hsdD5/F traD36, pro A+B+, Lac 1^{q}, lac dM15).

Las partículas víricas se prepararon creciendo las células TG1 que tenían la construcción deseada en 10 a 100 ml de medio 2x YT con 15 mg/ml de tetraciclina durante 16-24 horas. Se recogió el sobrenadante del cultivo mediante centrifugación durante 10 minutos a 10.000 rpm en un rotor de 8 x 50 ml en un centrifuga Sorvall RC-5B. Las partículas de fago se precipitaron mediante la adición de 1/5 del volumen de polietilenglicol al 20% (PEG)/NaCl 2,5 M y dejándolo a 4ºC durante 1 hora. El precipitado se centrifugó durante 15 minutos tal como se ha descrito anteriormente y los precipitados se resuspendieron en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM a 1/100 del volumen original. Las bacterias residuales y el material no disuelto se eliminaron mediante centrifugación durante 2 minutos en una microcentrifuga. El DNA de cadena sencilla para mutagénesis o secuenciación se preparó a partir del fago concentrado según Sambrook, J. y col. (1989), supra.

Índice de Ejemplos Ejemplo 1 Diseño de los engarzadores puntuales de inserción y construcción de los vectores

Este ejemplo abarca la construcción de dos derivados del vector fago fd-tet: a) fdtPs/Bs para la inserción de las secuencias codificantes para VH; y b) fdTPs/Xh para la inserción de las secuencias codificantes scFv. Los vectores derivados tienen una nueva diana BstEII para la inserción de secuencias.

Ejemplo 2 Inserción en el fago del dominio Fv de la inmunoglobulina

Este ejemplo abarca la inserción de las secuencias codificantes para scFv derivadas de un anticuerpo anti-lisozima D1.3 en el fdTPs/Xh para obtener la construcción fdTscFvD1.3.

Ejemplo 3 Inserción en el anticuerpo fágico del dominio VH de la inmunoglobulina

Este ejemplo abarca la inserción de las secuencias codificantes para VH derivadas de un anticuerpo anti-lisozima D1.3 en el fdTPs/Bs para obtener la construcción fdTVHD1.3.

Ejemplo 4 Análisis de la especificidad de unión de los anticuerpos fágicos

Este ejemplo investiga las especificidades de unión de las construcciones fdTscFvD1.3 y fdTVHD1.3.

Ejemplo 5 Construcción del fdCAT2

Este ejemplo abarca la construcción del derivado fdCAT2 del vector fago fdTPs/Xh. El derivado tiene las dianas de restricción para las enzimas que cortan el DNA con baja frecuencia.

Ejemplo 6 Unión específica del anticuerpo fágico (pAb) al antígeno

Este ejemplo muestra mediante ELISA la unión de pAb fdTscFvD1.3 a la lisozima.

Ejemplo 7 Aislamiento de fagos específicos deseados a partir de una mezcla de vectores fagos

Este ejemplo muestra que un fago (por ejemplo el fdTscFvD1.3) que expresa una molécula de unión puede aislarse del vector fago mediante técnicas de afinidad.

Ejemplo 8 Construcción de un pAb que exprese una actividad anti-hapteno

Este ejemplo está relacionado con la inserción de las secuencias codificantes para el scFv derivadas del anticuerpo anti-oxazolona NQ11 en fdTPs/Xh para obtener la construcción pAbNQ11. El ejemplo muestra mediante ELISA la unión de pAbNQ11 a la oxazolona.

Ejemplo 9 Enriquecimiento del pAbD1.3 a partir de mezclas de otros pAbs mediante purificación por afinidad

Este ejemplo muestra como un fago (por ejemplo, el pAbD1.3) que expresa un grupo de moléculas de unión puede aislarse del fago (por ejemplo, el pAbNQ11) que expresa otro grupo de moléculas de unión mediante técnicas de afinidad.

Ejemplo 10 Inserción de moléculas de unión en sitios alternativos del fago

Este ejemplo abarca la inserción de las secuencia codificantes para el scFv derivadas de a) el anticuerpo anti-lisozima D1.3; y b) el anticuerpo anti-oxazalona NQ11 en una diana BamHI del fdTPs/Xh para obtener las construcciones fdTBamI provistas del inserto NQ11.

Ejemplo 11 Ensamblaje mediante PCR de los repertorios VH y VL(VLK) para su expresión en fagos

Este ejemplo está relacionado con un sistema para la expresión en fagos de todos los repertorios VH y VLK codificados por los ratones. El sistema incluye los siguientes pasos. 1) Preparación del RNA de timo. 2) Preparación del cDNA a partir del RNA. 3) Utilización de cebadores específicos para secuencias de anticuerpos para amplificar por PCR todas las secuencias de cDNA codificantes para todos los VH y VLK. 4) Utilización de la PCR para crear una molécula engarzadora de parejas de unión de secuencias VH y VLK. 5) Utilización de la PCR para unir moléculas continuas de DNA cada una con una secuencia VH, un engarzador y una secuencia VLK. La combinación de VH/VLK específica se genera aleatoriamente. 6) Utilización de la PCR para introducir dianas de restricción.

Ejemplo 12 Construcción de un fagemido que contiene el gen III fusionado con la secuencia codificante para una molécula de unión

Este ejemplo está relacionado con la construcción de dos fagemidos basados en pUC119 que contienen, por separado, el gen III del fdCAT2 y la fusión fdCAT2scFvD1.3 del gen III scFv para generar el pCAT2 y el pCAT3ScFvD1.3, respectivamente.

Ejemplo 13 Recuperación de la especificidad del anticuerpo anti-lisozima a partir del pCAT3scFvD1.3 por M13K07

Este ejemplo describe la recuperación de la secuencia codificante para la fusión del gen IIIscFv de pCAT3scFvD1.3 mediante el crecimiento del fago auxiliar M13M07, en los fagos se observó la expresión de la actividad anti-lisozima scFv mediante ELISA.

Ejemplo 14 Eficiencia en la transformación de los fagemidos pCAT-3 y pCAT-3 scFvD1.3

Este ejemplo comparó la eficiencia de los fagemidos pUC119, pCAT-3 y pCAT3scFvD1.3 y el fago fdCAT2 en la transformación de E. coli.

Ejemplo 15 Ensamblaje por PCR de una genoteca de cadenas sencillas Fv de un ratón inmunizado

Este ejemplo hace referencia a un sistema para la expresión en fagos de scFv (que comprende el VH y VL) a partir de un ratón inmunizado mediante la utilización de la técnica básica descrita en el Ejemplo 11 (la preparación del cDNA y la unión mediante la PCR de los repertorios del VH y VLK de ratón) y la ligación de las secuencias de la PCR unidas en fdCAT2 para crear una genoteca de fagos de 10^{5} clones. El análisis de 500 clones mostró que ninguno de ellos presentaba especificidad en contra de phOx.

Ejemplo 16 Selección de anticuerpos específicos para la 2-fenil-oxazolona a partir de un repertorio de ratón no inmunizado

Este ejemplo muestra que el fago que ha crecido a partir de la genoteca generada en el Ejemplo 15 puede someterse a una selección por afinidad mediante la utilización de phOx para seleccionar aquellos fagos que expresen scFv con la especificidad deseada.

Ejemplo 17 Generación de más especificidades de anticuerpos con el ensamblaje de genotecas jerárquicas

Este ejemplo hace referencia a la construcción de genotecas jerárquicas en las que una secuencia VH dada se combina con el repertorio completo de VLK y una secuencia VLK se combina con el repertorio completo de VH y se seleccionan a partir de estas genotecas nuevos parejas de VH y VLK.

Ejemplo 18 Selección de anticuerpos expresados en bacteriófagos con distintas afinidades para la 2-fenil-5-oxazolona utilizando cromatografía de afinidad

Este ejemplo hace referencia a la separación mediante técnicas de afinidad de fagos que expresan fragmentos scFv con distintas afinidades de unión para un antígeno dado.

Ejemplo 19 Construcción de un fagemido pHEN1 para la expresión de fragmentos de anticuerpos expresados en la superficie de bacteriófagos después de una superinfección

Este ejemplo hace referencia a la construcción del fagemido pHEN1 derivado de pUC119. El pHEN1 tiene las características que se muestran en la Figura 23.

Ejemplo 20 Expresión de fragmentos Fv y Fab de cadena sencilla derivados del anticuerpo anti-oxazolona NQ 10.12.5 en el bacteriófago fd con la utilización del pHEN1 y del fdCAT2

Este ejemplo describe la expresión del fragmento scFv con una especificidad frente a phOx en la superficie de un bacteriófago. Para la expresión del scFv, el fagemido pHEN1 comprende las secuencias codificantes para scFv (VH y VL) para recuperar tanto los fagos VSM13 o fdCAT2.

Ejemplo 21 Inducción de fragmentos ScFv y Fab solubles con la utilización del fagemido pHEN1

Este ejemplo abarca la generación de fragmentos scFv y Fab solubles de las fusiones del gen III con secuencias que codifican para estos fragmentos mediante la expresión de clones en pHEN1 en una cepa de E. coli que no suprime las mutaciones ámbar.

Ejemplo 22 Sensibilidad incrementable en los ensayos ELISA de la lisozima al utilizar fdTscFvD1.3 como anticuerpo primario comparado con el scFvD1.3 soluble

Este ejemplo abarca la utilización del fdTscFvD1.3 en un ELISA en el que pueden detectarse cantidades menores de lisozima con el anticuerpo del fago fdTscFvD1.3 que con el scFvD1.3 soluble.

Ejemplo 23 Recuperación directa y expresión de anticuerpos monoclonales de ratón como fragmentos Fv de cadena sencilla en la superficie del bacteriófago fd

Este ejemplo abarca la expresión como fragmentos scFv funcionales en fagos de dos clones directamente derivados de células que expresan anticuerpos monoclonales dirigidos en contra de estriol. Ambos clones se establecieron para que fueran funcionales para el ELISA.

Ejemplo 24 Construcción de un fago auxiliar deficiente en un gen III

Este ejemplo describe la construcción de un fago auxiliar derivado del M13K07, en el que se han delecionado secuencias del gen III. Se describe la recuperación de pCAT3-scFvD1.3. El scFvD1.3 se expresa a un alto nivel como fusión mediante el empleo del fago delecionado, equivalente a la expresión con el empleo del fdCAT2-
scFvD1.3.

Ejemplo 25 Selección de bacteriófagos que expresan fragmentos scFv dirigidos contra la lisozima a partir de mezclas en función de su afinidad utilizando un procedimiento de mejora del rendimiento

Este ejemplo hace referencia a la selección del bacteriófago según la afinidad del fragmento scFv dirigido en contra de la lisozima que se expresa en su superficie. Los fagos de distintas afinidades se unieron a cápsulas de Petri tapizadas con lisozima y, tras el lavado, el fago unido se eluyó con trietilamina. Se determinaron las condiciones en las que se podía obtener un enriquecimiento sustancial para un fago con una afinidad 5 veces mayor que el fago con el que se mezcló.

Ejemplo 26 Generación y selección de mutantes de un anticuerpo anti-ácido 4-hidroxi-3-nitrofenilacético (NP) expresado en fagos mediante la utilización de cepas mutadoras

Este ejemplo abarca la introducción de mutaciones en un gen para un anticuerpo clonado en fagos mediante crecimiento del fago en cepas que mutan el DNA aleatoriamente como consecuencia de defectos en la replicación del DNA. Se introducen varias mutaciones en fagos que pueden seleccionarse del fago parental.

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Ejemplo 27 Una técnica basada en la PCR para el clonaje de construcciones de scFv humanas en un solo paso

Este ejemplo describe la generación de genotecas de fragmentos scFv derivados de un humano inmunizado. Se dan los ejemplos para la preparación de fagos de expresión de genotecas en fagemidos de fragmentos scFv derivados de secuencias IgG e IgM.

Ejemplo 28 Aislamiento de actividades de unión a partir de una genoteca de scFvs de un humano no inmunizado

Este ejemplos describe el aislamiento, en la genoteca de fragmentos scFv derivados de genes IgM de un humano inmunizado, de clones para anticuerpos fágicos dirigidos contra BSA, lisozima y oxazolona. La selección se realizó mediante mejora del rendimiento o cromatografía de afinidad y análisis de especificidad de unión por ELISA. La secuenciación de los clones mostró que tenían un origen humano.

Ejemplo 29 Recuperación de una genoteca de IgM humana mediante la utilización de un fago auxiliar deficiente en el gen 3 (Dg3)

Este ejemplo abarca el aislamiento, en la genoteca de fragmentos scFv derivados de genes IgM de un humano inmunizado, de clones de anticuerpos fágicos por anticuerpos fágicos específicos para la tiroglobulina y la oxazolona. En este ejemplo la recuperación se realizó con M13K07gIII No3 (NCTC12478), un fago auxiliar deficiente para el gen III. Se necesitan aparentemente menos rondas de selección para una genoteca de fagemidos recuperada con este fago comparada con una recuperada con M13K07.

Ejemplo 30 Alteración de la especificidad fina del scFvD1.3 expresado en fagos mediante mutagénesis y selección en lisozima de pavo inmovilizada

Este ejemplo abarca la mutagénesis in vitro del pCATscFvD1.3 mediante reemplazamiento, con aminoácidos al azar, de residuos que se sabe que son importantes en el reconocimiento preferencial de la lisozima de huevo de gallina frente a la lisozima de huevo de pavo por scFvD1.3. Después de la selección para los anticuerpos fágicos que reconocen la lisozima de huevo de pavo mediante cromatografía de afinidad, los clones se analizaron mediante ELISA para su especificidad. Se observó que dos grupos de clones mostraban un reconocimiento más equivalente de las lisozimas de pavo y de gallina, uno con una señal ELISA incrementada respecto a la enzima del pavo y el otro con una señal reducida respecto a la enzima de gallina.

Ejemplo 31 Modificación de la especificidad de un anticuerpo por reemplazamiento del dominio VLK por una genoteca VLK derivada de un ratón no inmunizado

Este ejemplo muestra que el reemplazamiento del dominio VL de scFvD1.3 específico para la lisozima de clara de huevo de gallina (HEL) con una genoteca de dominios VL permite la selección de fragmentos scFv que se unen también a la lisozima de clara de huevo de pavo (TEL). Los fragmentos scFv se expresaron en el fago y la selección por mejora del rendimiento en tubos tapizados con TEL. Los análisis ELISA mostraron clones con un incremento de la unión a TEL comparada a la de HEL. Se secuenciaron aquellos que mostraron una unión más elevada a TEL.

Ejemplo 32 Selección de una especificidad de anticuerpo fágico por unión a un antígeno acoplado a esferas magnéticas. Utilización de un reactivo que se puede cortar en condiciones suaves para permitir la elución del fago unido

Estos ejemplos abarcan la utilización de un enlace que puede romperse en el procedimiento de selección por afinidad que permite la liberación en condiciones suaves del fago unido. El pAbNQ11 se enriqueció aproximadamente 600 veces a partir de una mezcla con pAbD1.3 mediante selección con Ox-BSA biotinilada unida a esferas magnéticas. El corte del enlace entre el BSA y la biotina permite la elución del fago.

Ejemplo 33 Utilización de la selección celular para proporcionar una fuente enriquecida de genes de anticuerpos específicos para un antígeno. Es una aplicación para reducir la complejidad de los repertorios de fragmentos de anticuerpos expresados en la superficie de los bacteriófagos

Este ejemplo abarca la utilización de la selección celular para producir un grupo enriquecido de genes que codifican para anticuerpos dirigidos contra el ácido 4-hidroxi-3-nitrofenilacético y describe como puede utilizarse dicha técnica para reducir la complejidad de los repertorios de anticuerpos expresados en la superficie del bacteriófa-
go.

Ejemplo 1 Diseño de los engarzadores puntuales de inserción y construcción de los vectores

El vector fd-tet tiene dos dianas de restricción BstEII a ambos lados del gen de resistencia a la tetraciclina (Fig. 3). Debido a que la estrategia para la inserción de fragmentos VH era ligarlos en la nueva diana BstEII insertada en el gen III, era ventajoso delecionar las dianas BstEII originales del fd-tet. Esto se realizó mediante la digestión del fd-tet con la enzima de restricción BstEII, el llenado de los extremos protuberantes 5' y la ligación para generar el vector fdTdBst. La digestión del fd-tet con BstEII (0,5 unidades/ml) se llevó a cabo en tampón KGB 1x (glutamato potásico 100 mM, Tris-acetato 23 mM (pH 7,5), acetato magnésico 10 mM, 50 mg/ml de albúmina de suero bovino, ditiotreitol 0,5 mM) (Sambrook, J. y col., 1989, supra) con DNA a una concentración de 25 ng/ml. Los extremos protuberantes 5' se llenaron en tampón KGB 2x, 250 mM de cada dNTP (Pharmacia Ltd., Pharmacia House, Midsumer Boulevard, Milton Keynes, Bucks, GB) y el fragmento Klenow (Amersham International, Lincoln Place, Green End, Aylesbury, Bucks, GB) a 0,04 unidades/ml. Tras incubar 1 hora a temperatura ambiente, el DNA se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol.

Las ligaciones se realizaron a una concentración de DNA de 50 ng/ml. Los productos de las ligaciones se transformaron en células TG1 competentes y se sembraron en placas con YT complementadas con 15 mg/ml de tetraciclina. Esto selecciona aquellos vectores en donde el gen para la proteína de resistencia a la tetraciclina se ha reinsertado en el vector durante el paso de ligación. Se escogieron colonias, se sembraron en 25 ml de medio 2x YT complementado con 15 mg/ml de tetraciclina y se dejaron crecer durante toda la noche a 37ºC.

A partir de los clones resultantes se purificó el DNA de doble cadena con el kit "gene-clean II" (Bio101 Inc., PO Box 2284, La Jolla, California, 92038-2284, USA) y según el procedimiento rápido de aislamiento de DNA plasmídico en pequeña escala descrito allí. La orientación de 5 de los clones resultantes se confirmó mediante la enzima de restricción ClaI. Se escogió un clon que diera el mismo patrón de restricción frente a ClaI que fd-tet, pero que no tuviera dianas BstEII.

Se utilizó la mutagénesis in vitro de fdTdBst para generar vectores que tuvieran dianas de restricción adecuadas que facilitaran el clonaje de fragmentos de anticuerpos cadena abajo del péptido señal del gen III y que estuvieran en fase con la secuencia codificante del gen III. Se utilizó la versión 2 del sistema de mutagénesis dirigida por oligonucleótidos (Amersham International) con el oligo 1 (Figura 4) para crear el fdTPs/Bs (para facilitar el clonaje de los fragmentos VH). La secuencia del fdTPs/Bs (Figura 4) se confirmó utilizando la versión 2.0 del kit de "Sequenase" (USB Corp., PO Box 22400, Cleveland, Ohio, 44122, USA) con el oligo 3 (Figura 4) como cebador.

Se generó un segundo vector fdTPs/Xh (para facilitar el clonaje de los fragmentos Fv de cadena sencilla) mediante la mutación del fdTPs/Bs con el oligo 2 según el procedimiento de Venkitaraman, A.R., Nucleic Acid Res., 17:3314. La secuencia del fdTPs/Xh (Figura 4) se confirmó mediante la utilización de la versión 2.0 del kit de la "Sequenase" (USB Corp.) con el oligo 3 como cebador.

Evidentemente, las construcciones alternativas serán lógicas para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, el M13 y/o su bacteria huésped pueden modificarse de tal forma que su gen III puede interceptarse sin que afecte excesivamente la muerte celular; el gen III de fd modificado, u otra proteína modificada, puede incorporarse en un plásmido que incluya un origen de replicación de fago de cadena sencilla, como el pUC119, y la superinfección, por ejemplo de K07, con el fago modificado daría lugar a la encapsulación del genoma del anticuerpo fágico en una cubierta derivada del fago auxiliar y parcialmente de la construcción del gen III anticuerpo fági-
co.

La construcción detallada de un vector como el fdTPs/Bs es sólo una manera para generar un anticuerpo fágico. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas como la el clonaje/mutagénesis sticky feet (Clakson, T. y G. Winter (1989), Nucleic Acid Res., 17:10163-10170) para evitar la utilización de los pasos de digestión con enzimas de restricción y/o de ligación.

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Ejemplo 2 Inserción en el fago del dominio Fv de la inmunoglobulina

El plásmido scFv D1.3 myc (cedido por G. Winter y A. Griffiths) contiene las secuencias VH y VL del anticuerpo D1.3 fusionadas vía una secuencia peptídica engarzadora para formar una versión Fv de cadena sencilla del anticuerpo D1.3. La secuencia del scFv y las secuencias a ambos lados en el scFvD1.3 myc se muestran en la Figura 5.

El anticuerpo D1.3 está dirigido contra la lisozima de huevo de gallina (Harper, M. y col. (1987), Molec. Inmunol., 24:97-108) y la forma expresada de scFv en E. coli tiene la misma especificidad (A. Griffiths y G. Winter, comunicación personal).

La digestión de scFv D1.3 myc con PstI y XhoI (estas dianas de restricción se muestran en la Figura 5), libera un fragmento de 693 pb que codifica la mayor parte del scFv. La ligación de este fragmento en fdTPs/Xh cortado con PstI y XhoI da lugar a la construcción fdTscFvD1.3 que codifica para el péptido señal del gen III y el primer aminoácido fusionado al scFv D1.3 completo, seguido de la proteína madura del gen III a partir del aminoácido 2.

El vector fdTPs/Xh se preparó para su ligación mediante digestión con PstI y XhoI durante 2 horas seguida de una digestión con fosfatasa alcalina intestinal de ternera (Boehringer Mannheim UK Ltd., Bell Lane, Lewes, East Sussex, BN7 1LG) a una unidad/ml durante 30 minutos a 37ºC. Se añadió la fosfatasa alcalina intestinal de ternera a una concentración total final de 2 unidades/ml y se incubó durante unos 30 minutos más a 37ºC. La reacción se extrajo tres veces con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol y se disolvió en agua. El inserto de scFvD1.3 myc se escindió con las enzimas de restricción adecuadas (PstI y XhoI), se extrajo dos veces con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol y se disolvió en agua. Las ligaciones se realizaron tal como se describió en el Ejemplo 1, excepto que ambas muestras de vector e inserto estaban a una concentración final de 5 ng/ml cada una. La generación de la construcción correcta se confirmó por secuenciación, tal como se describió para el Ejemplo 1.

Para demostrar que se producían las proteínas del tamaño esperado, los viriones se concentraron mediante precipitación con PEG, tal como se describió anteriormente. Las muestras se prepararon para electroforesis tal como describen Sambrook, J. y col. (1989), supra. Se cargó el equivalente a 2 ml de sobrenadante en un gel de poliacrilamida SDS al 18%. Una vez finalizada la electroforesis, el gel se sumergió en el tampón de electroforesis (Tris 50 mM, glicina 380 mM, SDS al 0,1%) con metanol al 20% durante 15 minutos. La transferencia a una membrana de nitrocelulosa se realizó en tampón de electroforesis 1x/metanol al 20% recién preparado, utilizando una cubeta de transferencia en semi-seco Semi Phor TE70 (Hoeffer, 654 Minnesota Street, Box 77387, San Francisco, California 94107, USA).

Después de la transferencia, la membrana se saturó por incubación durante 1 hora con una solución de leche en polvo (Marvel) al 2% en tampón fosfato salino (PBS). La detección de las secuencias de las proteínas scFv y VH en las proteínas de fusión del anticuerpo fágico se realizó con la inmersión de la membrana durante 1 hora en una dilución 1:1000 (con leche en polvo al 2%) de un antisuero policlonal de conejo generado en contra del fragmento scFv expresado en bacteria y purificado por afinidad (cedido por G. Winter). Tras el lavado con PBS (3 lavados de 5 minutos), el anticuerpo primario unido se detectó con un anticuerpo anti-conejo conjugado con la peroxidasa de rábano (Sigma, Fancy Road, Poole, Dorset, BH17 7NH, GB) durante 1 hora. La membrana se lavó en PBS/tritón X-100 al 0,1% y se reveló con 0,5 mg/ml de tertradihidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB), cloruro de cobalto al 0,02% y peróxido de hidrógeno al 0,03% en PBS.

Los resultados mostraron que con los clones fdTVHD1.3 (del Ejemplo 3, que incorporaban las secuencias codificante para VH) y fdTscFvD1.3 (que incorporaban las secuencias codificantes para scFv) se detectaba una proteína entre 69.000 y 92500 daltons con el suero anti-Fv. Este es el tamaño esperado para las proteínas de fusión generadas. Este producto no se observa en los sobrenadantes derivados del fd-tet, fdTdBst o fdTPs/Xh.

El fragmento VH de D1.3 se generó a partir del plásmido pSW1-VHD1.3-TAG1 (Ward, E.S. y col. (1989), supra). La digestión de este plásmido con PstI y BstEII genera el fragmento que se muestra en la Figura 5 entre las posiciones 113 y 432. El clonaje de este fragmento en los sitios de restricción PstI y BstEII del fdTPs/Bs da lugar a la construcción fdTVHD1.3 que codifica para una proteína de fusión con un domino VH completo insertado entre el primer y tercer aminoácido de la proteína del gen III madura (se ha delecionado el aminoácido 2).

Los procedimientos empleados eran exactamente los mismos que en el Ejemplo 2 excepto que el vector utilizado era el fdTPs/Bs digerido con PstI y BstEII.

Ejemplo 4 Análisis de la especificidad de unión de los anticuerpos fágicos

Se analizó la unión de varios anticuerpos fágicos al antígeno específico, lisozima, mediante técnicas ELISA. Los anticuerpos fágicos (por ejemplo, fdTVHD1.3 y fdTsc/FvD1.3) se hicieron crecer en E. coli y las partículas de los anticuerpos fágicos se precipitaron con PEG tal como se describió en Materiales y Procedimientos. Las partículas de anticuerpo fágico unidas se detectaron con la utilización de suero de oveja policlonal generado contra el fago estrechamente relacionado M13.

Las placas de ELISA se prepararon tapizando placas de 96 pocillos (placas flexibles Falcon Microtest III. Falcon: Becton Dickinson Labware, 1950 Williams Drive, Oxnard, California, 93030, USA) con 200 ml de una solución de lisozima (1 mg/ml en caso de que no se diga lo contrario) en NaHCO_{3} 50 mM durante 16-24 horas. Antes de su utilización, se eliminó esta solución, se lavó la placa varias veces con PBS y se incubó con 200 ml de leche en polvo al 2%/PBS durante 1 hora. Después de lavarla varias veces con PBS, se añadieron 100 ml de las muestras de análisis y se incubaron durante 1 hora. Se lavaron las placas (3 lavados en Tween 20 al 0,05%/PBS, seguido de 3 lavados sólo con PBS). Se detectaron los anticuerpos fágicos unidos con la adición de 200 ml/pocillo de una dilución 1:1000 de antisuero policlonal anti-M13 de oveja (cedido por G. Winter, aunque un anticuerpo equivalente puede ser fabricado fácilmente por un experto en la materia mediante la tecnología estándar) en leche en polvo al 2%/PBS e incubando durante 1 hora. Tras un lavado como el descrito anteriormente, las placas se incubaron con anticuerpo anti-oveja marcado con biotina (Amersham International) durante 30 minutos. Las placas se lavaron como se describió anteriormente, y se incubaron con el complejo de peroxidasa de rábano-estreptavidina (Amersham International). Tras un lavado final como el anterior, se añadieron 0,5 mg/ml del sustrato ABTS en tampón citrato (ABTS = ácido sulfónico 2'2'-azinobis (3-etilbenzotiazolina); tampón citrato = ácido cítrico 50 mM, citrato sódico-Tris 50 mM en una relación 54:46. Se añadió peróxido de hidrógeno a una concentración final del 0,003% y las placas se incubaron durante 1 hora. La densidad óptica a 405 nm se determinó en un lector de placas Titertek multiskan.

La Figura 6 muestra el efecto de variar la cantidad de anticuerpo fágico. Se aplicaron varias diluciones de 100 ml de fago precipitado con PEG y la cantidad se expresó en términos del volumen del cultivo original del que derivaba. Las señales derivadas tanto del anticuerpo fágico que contenía scFv (fdTscFvD1.3) como del anticuerpo fágico que contenía VH (fdtVHD1.3) y el anticuerpo fágico que contenía VH eran mayores que las derivadas del vector del anticuerpo fágico (fdTPs/Xh). La señal más elevada en relación al ruido de fondo se produce con la utilización del equivalente a 1,3 ml de cultivo.

La Figura 7 muestra los resultados obtenidos al tapizar las placas con cantidades variables de lisozima o albúmina de suero bovino (BSA). Se utilizó el equivalente a 1 ml de sobrenadante del cultivo de anticuerpo fágico original. Las señales de los sobrenadantes derivados del fdTscFvD1.3 fueron una vez más mayores que aquellos que derivaban del fdTPs/Xh cuando se utilizaban pocillos tapizados con lisozima. No existían diferencias significativas entre estos dos tipos de sobrenadantes cuando las placas se tapizaban con BSA. Hablando en un sentido amplio, el nivel de señal en las placas es proporcional a la cantidad de lisozima utilizada para tapizar. Estos resultados demuestran que la unión detectada es específica para la lisozima como antígeno.

Ejemplo 5 Construcción del fdCAT2

Sería útil diseñar vectores que permitieran la utilización de enzimas de restricción que corten de forma poco frecuente el DNA, evitándose de esta manera la digestión no deseada de los insertos de genes de anticuerpos dentro de su secuencia codificante. Las enzimas con secuencias de reconocimiento de ocho pares de bases son particularmente útiles para este propósito, como por ejemplo NotI y SfiI. Chaudhary y col. (PNAS, 87:1066-1070, 1990) han identificado un número de dianas de restricción que son raras en los genes variables de anticuerpos. Como un ejemplo de la posibilidad de utilizar este tipo de enzimas, el solicitante ha diseñado y construido un vector que utiliza dos de estas dianas. Básicamente, se han fabricado las dianas para las enzimas ApaLI y NotI en fdTPs/Xh para crear el fdCAT2.

El oligonucleótido:

5' ACT TTC AAC AGT TTC TGC GGC CGC CCG TTT GAT CTC GAG CTC CTG CAG TTG GAC CTG TGC ACT GTG AGA ATA GAA 3'

se sintetizó (supra texto de la Figura 4) y se utilizó para mutar fdTPs/Xh con el kit de mutagénesis in vitro de Amersham International tal como se describió en el Ejemplo 1, para crear fd-CAT2. La secuencia del fd-CAT2 se comprobó alrededor del sitio de manipulación mediante secuenciación del DNA. La Figura 8 muestra la secuencia final alrededor del punto de inserción dentro del gen III.

N.B. fdCAT2 también se denomina en la presente invención con las terminologías alternativas fd-tet-DOG1 y fdDOG1.

Ejemplo 6 Unión específica del anticuerpo fágico (pAb) al antígeno

La unión del pAb D1.3 (fdTscFvD1.3 del Ejemplo 2) a la lisozima se analizó con ELISA.

Procedimientos 1. Crecimiento del fago

Los cultivos de las bacterias transducidas con fago se prepararon en 10-100 ml de medio 2x TY con 15 mg/ml de tetraciclina y se hicieron crecer en agitación a 37ºC durante 16-24 horas. Se preparó el sobrenadante enriquecido con fago por centrifugación del cultivo (10 min a 10.000 rpm, rotor de 8 x 50 ml, centrifuga Sorvall RC-5B). En esta fase, el título del fago era de 1-5 x 10^{10}/ml de unidades transducidas. Los fagos se precipitaron al añadir 1/5 del volumen de PEG al 20%, NaCl 2,5 M, y dejar durante 1 hora a 4ºC, y posterior centrifugación (supra). Los fagos precipitados se resuspendieron en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0 a 1/100 del volumen original, y las bacterias residuales y fagos agregados se eliminaron mediante centrifugación durante 2 min en una microcentrifuga de
mesa.

ELISA

Las placas se tapizaron con antígeno (1 mg/ml de antígeno) y se saturaron tal como se describió en el Ejemplo 4. Se añadieron 2 x 10^{10} unidades de fagos transducidos a las placas tapizadas con antígeno en tampón fosfato salino (PBS) que contenía leche desnatada en polvo al 2% (MPBS). Las placas se lavaron entre cada paso con tres lavados de Tween-20 al 0,5% en PBS seguidos de tres lavados con PBS. El fago unido se reveló mediante la incubación con antisuero anti-M13 de oveja y se detectó con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con suero anti-cabra (Sigma, Poole, Dorset, GB), que también detecta las inmunoglobulinas de oveja y el ABTS (ácido sulfónico 2'2'-azinobis (3-etilbenzotiazolina)). Las lecturas se realizaron a 405 nm después de dejar transcurrir un tiempo adecuado. Los resultados (Figura 9) muestran que el fago portador del anticuerpo tiene el mismo patrón de reactividad que el anticuerpo D1.3 original (Harper, M., F. Lema, G. Boulot y F.J. Poljak (1987), Molec. Immunol., 24:97-108), y unido a la lisozima de clara de huevo de gallina pero no a la lisozima de clara de huevo de pavo, lisozima humana o albúmina de suero bovino. La especificidad del fago se ilustra claramente por la no existencia de unión a la lisozima de clara de huevo de pavo que difiere de la lisozima de clara de huevo de gallina sólo en siete aminoácidos.

Ejemplo 7 Aislamiento de fagos específicos deseados de una mezcla de vectores fagos

El solicitante purificó pAb (D1.3) (denominado originalmente fdTscFvD1.3 en el ejemplo 2) a partir de mezclas mediante la utilización de columnas de afinidad al antígeno. El pAb (D1.3) se mezcló con el vector fago fd (ver tabla 1) y aproximadamente 10^{12} fagos se pasaron por una columna de sefarosa-lisozima (preparada a partir de sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno (Pharmacia, Milton Keynes, Bucks, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes). Células TG1 se infectaron con diluciones apropiadas de los eluidos y se analizaron las colonias derivadas mediante hibridación con un oligonucleótido que detecta sólo el pAb (D1.3) ver tabla 1 y Fig. 12. Se observó un enriquecimiento de pAb (D1.3) de mil veces con un sólo pase a través de la columna. Al crecer el fago enriquecido y pasarlo otra vez a través de la columna, se observaron enriquecimientos de hasta un millón de veces.

Se demostró también enriquecimiento al utilizar solamente criterios inmunológicos. Por ejemplo, 10^{12} fagos (a una relación de 1 pAb (D1.3) por 4 x 10^{6} fdTPs/Bs) se sometieron a dos rondas de selección por afinidad, y después se seleccionaron 26 colonias y se crecieron toda la noche. Entonces se ensayó el fago por su unión a la lisozima mediante un ELISA (como en ejemplo 6). Cinco de las colonias produjeron fagos con actividades de unión a la lisozima, ver tabla 1, y estas mostraron que codificaban para scFv (D1.3) con un rastreo por PCR (Ejemplo 13, se utilizaron 30 ciclos de 1 minuto a 92ºC, 1 minuto a 60ºC, 1 minuto a 72ºC utilizando como cebadores CDR3PCR1 y el oligo 3
(Fig. 4)).

Por tanto pAbs muy raros pueden seleccionarse de poblaciones muy grandes, al utilizar el antígeno para seleccionar y después rastrear el fago.

En este ejemplo, la cromatografía de afinidad de los pAbs y la hibridación con el oligonucleótido se llevaron a cabo tal como se describe a continuación.

Aproximadamente 10^{12} partículas fago en 1 ml de MPBS se cargaron en una columna de afinidad de sefarosa-lisozima de 1 ml que había sido previamente lavada con MPBS. Se lavó la columna con 10 ml de PBS; después con 10 ml de Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM a pH 7,5; después con 10 ml de Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM a pH 8,5; después con 5 ml de Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM a pH 9,5 (ajustado con trietilamina) y después se eluyó con 5 ml de trietilamina 100 mM. El eluido se neutralizó con tampón fosfato sódico 0,5 M pH 6,8 y el fago se sembró en placa para su análisis. Para una segunda ronda de cromatografía de afinidad, el eluido de la primera columna se sembró a aproximadamente 30.000 colonias por placa de Petri. Después del crecimiento durante toda la noche, las colonias se obtuvieron por raspado en 5 ml de medio 2x TY, y se diluyó una alícuota de 20 ml en 10 ml de medio fresco y se creció durante toda la noche. El fago se precipitó con PEG como se ha descrito anteriormente, se resuspendió en 1 ml de MPBS y se cargó en una columna, lavándola y eluyéndolo como se ha descrito con anterioridad.

Oligonucleótidos sintetizados:

CDR3PCR1

\hskip0,5cm

5' TGA GGA C(A o T) C(A o T) GC CGT CTA CTA CTG TGC 3'

40 pmoles del oligonucleótido VH1FOR (Ward, E.S. y col. (1989) Nature 341: 544-546), específico a pAB (D1.3) se fosforilaron con 100 mCi de a-^{32}P ATP, se hibridaron (1 pmol/ml) a membranas de nitrocelulosa a 67ºC en un tampón salino 6x de citrato sódico (SSC) Sambrook y col., supra. durante 30 minutos y se dejaron enfriar hasta llegar a temperatura ambiente durante 30 min, se lavaron 3x 1 min a 60ºC en 0,1X SSC.

Ejemplo 8 Construcción de un pAB que exprese una actividad anti-hapteno

La oxazolona es un hapteno que se utiliza comúnmente para estudiar los detalles de la respuesta inmune. El anticuerpo anti-oxazolona, NQ11 se ha descrito con anterioridad (Gherardi, E., R. Pannell, C. Milstein, J. Immunol. Method. 126: 61-68). Un plásmido que contenía los genes VH y VL de NQ11 se convirtió en una forma scFv al insertar el fragmento BstEII/SacI de scFvD1.3 myc (nucleótidos 432-499 de la Fig. 5) entre los genes VH y VL para crear pscFvNQ11, la secuencia del cual se muestra en la fig. 13. Este scFv se clonó en el sitio de restricción PstI/XhoI de FdTPs/Xh (como se ha descrito con anterioridad) para crear pAb NQ11, y como tiene un sitio de restricción interno para PstI fue necesario realizar una digestión completa de pscFvNQ11 con XhoI seguida de una digestión parcial con PstI.

La especificidad de unión del pAb NQ11 se confirmó mediante un ELISA. Placas de ELISA se tapizaron con una capa de NaHCO_{3} 50 mM a 37ºC a una concentración proteica de 200 mg/ml. Las placas se tapizaron con una capa bien de lisozima de huevo de gallina (HEL), albúmina sérica bovina (BSA), o BSA conjugada con oxazolona (OX-BSA) (el procedimiento de conjugación se encuentra en Makela O., M. Kartinen, J.L.T. Pelkonen, K. Karjalainen (1978) J. Exp. Med. 148: 1644). La preparación del fago, la unión a las placas ELISA, el lavado y la detección fueron como se describen en el ejemplo 6. Se analizaron muestras duplicadas y la absorbancia media después de 10 minutos se presenta en la Figura 14.

Este resultado demuestra que el pAb NQ11 se une al antígeno correcto. La Figura 14 también muestra que el pAb D1.3 y el pAb NQ11 sólo se unen a aquel antígeno contra el cual se generaron los anticuerpos originales.

Ejemplo 9 Enriquecimiento del pAb D1.3 a partir de mezclas de otros pAb mediante purificación por afinidad

Fagos a 3 x 10^{10} en 10 ml de PBSM con una proporción entre pAb D1.3 y pAb NQ11 como se muestra en la tabla 2 se pasaron por una columna de sefarosa-lisozima de 1 ml. El lavado, la elución y otros procedimientos fueron como en el ejemplo 8 a menos que se especifique de otra manera. Los eluidos de las columnas se utilizaron para infectar células TG1 que a continuación se recolectaron en placa. Las colonias se hibridaron con una sonda que distingue entre pAb D1.3 y pAb NQ11. La secuencia de este oligonucleótido (D1.3CDR3A) es:

5' GTA GTC AAG CCT ATA ATC TCT CTC 3'

La tabla 2 muestra los resultados de este experimento. Se consiguió un enriquecimiento de casi 1000 veces en una sola ronda y un enriquecimiento de más de un millón de veces en dos rondas de purificación. Esto es análogo al resultado descrito en el ejemplo 7.

Ejemplo 10 Inserción de moléculas de unión en sitios alternativos del fago

La disponibilidad de un sitio alternativo en el fago para la inserción de moléculas de unión crearía la posibilidad de expresar más fácilmente más de una molécula de unión por ejemplo, un fragmento de un anticuerpo en un único pAb. Esto se podría utilizar para generar especificidades de unión individuales o múltiples. La presencia de dos actividades de unión distintas en un misma molécula incrementaría mucho su utilidad y su especificidad. Podría ser útil en la unión a virus con frecuencias de mutación muy altas como el virus de la inmunodeficiencia en humanos. Además, se podría utilizar para producir una proximidad estrecha de antígenos (por ejemplo, para direccionamiento de drogas o fusión celular) o también podría actuar como una "abrazadera molecular" en procedimientos químicos, inmunológicos o enzimáticos.

El vector fd-tet y sus derivados descritos en la presente invención, tienen un único sitio de restricción para BamHI en el gen 3. Esto se ha utilizado con anterioridad para la expresión de fragmentos del péptido en la superficie de bacteriófagos filamentosos (Smith GP. (1985) Science 228: 1315-13117 y de la Cruz y col. (1988) J Biol. Chem. 263: 4318-4322). Esto proporciona un sitio alternativo potencial para la inserción de fragmentos de anticuerpos.

Los fragmentos de DNA que codifican para scFv provenientes de D1.3 o NQ11 se generaron por PCR con la utilización de los cebadores que se muestran posteriormente. Estos cebadores se diseñaron para generar un fragmento con sitios de restricción para BamHI cerca de los dos extremos, lo que permitiría clonar en el sitio de restricción para BamHI del gen 3 (ver Figura 16(1)). Los oligonucleótidos que se utilizaron, también aseguran que el producto que resulta de la amplificación por PCR carece de los sitios de restricción para PstI y XhoI que son los que se utilizan normalmente para la manipulación de scFv (ver Figura 16(1)). Esto facilitaría la subsecuente manipulación de un segundo fragmento de anticuerpo en el modo usual en el N-terminal del gen 3. Los oligonucleótidos que se utilizaron son:

1

Preparación del vector y del inserto generado por PCR

La reacción de PCR se llevó a cabo en una reacción de 80 ml tal como se describió en el ejemplo 11, con la utilización de 1 ng/ml del molde y 0,25 u/ml de Taq polimerasa y un régimen de ciclos de 94ºC por 1 minuto, 60ºC por 1 minuto y 70ºC por dos minutos durante 30 ciclos. El molde era bien pscFvNQ11 (Ejemplo 8) o scFvD1.3 myc (Ejemplo 2). Los productos de la reacción se extrajeron con fenol:cloroformo, se precipitaron y se disolvieron en agua y se digirieron con BamHI según las instrucciones de los fabricantes. La digestión se extrajo de nuevo con fenol:cloroformo, se precipitó y se disolvió en agua.

El vector fdTPs/Xh se digirió con BamHI, se trató con fosfatasa intestinal de ternera y se purificó como se describió en el ejemplo 2. Las ligaciones se prepararon a una concentración del vector de 6 ng/ml y una concentración del inserto amplificado por PCR de aproximadamente 3 ng/ml. Estas se ligaron durante 2,5 horas a temperatura ambiente antes de transformarse en células competentes TG1 y sembrarse en placas TY tet. Las colonias resultantes se hibridaron con una sonda tal como se describió en el ejemplo 7. Se preparó DNA de diversas colonias y se confirmó la correcta orientación y el tamaño del inserto mediante la digestión con HindIII en solitario o en combinación con BamHI. (Uno de los sitios de restricción para BamHI se encuentra en el cebador y el otro en el vector).

Se hicieron crecer dos clones que contenían un inserto D1.3 (fdTBam1 y fdTBam2) y uno que contenía un inserto NQ11 (NQ11Bam1) y se prepararon fagos como se ha descrito con anterioridad. Se llevaron a cabo ensayos ELISA como se ha descrito en el ejemplo 6. No se encontró ninguna señal específica para ninguno de estos clones lo que sugería que el sitio de restricción natural para BamHI no es apropiado como sitio para la inserción de un anticuerpo funcional (no se muestran estos resultados).

Sería posible clonar en sitios alternativos para mantener la actividad de unión. Las repeticiones peptídicas presentes en el gen III podrían proporcionar este tipo de sitio (Figura 16 bloques A y B). Esto se puede hacer con la inserción de un sitio de restricción para BamHI y la utilización del producto de PCR que se ha descrito con anterioridad. Para facilitar esto, el sitio de restricción natural para BamHI se eliminó por mutagénesis con el oligonucleótido G3mutdBam que se muestra a continuación (con la utilización de un equipo de mutagénesis in vitro (Amersham International)):

G3mutdBam

\hskip0,5cm

5' CA AAC GAA TGG GTC CTC CTC ATT A 3'

El residuo subrayado reemplaza a un residuo A, eliminando de este modo el sitio de restricción para BamHI. El DNA se preparó a partir de varios clones y se identificaron mediante digestión con enzimas de restricción diversos mutantes carentes del sitio de restricción para BamHI.

El oligonucleótido G3 Bamlink se diseñó para introducir un sitio de restricción para BamHI en distintos lugares posibles en los sitios del engarzador peptídico A y B, ver Figura 16 (2). La secuencia del engarce es:

Bamlink

\hskip0,5cm

5' CC (G o A) CC ACC CTC GGA TCC (G o A) CC ACC CTC 3'

Su relación con las repeticiones peptídicas en el gen III se muestra en la Figura 16.

Ejemplo 11 Ensamblaje mediante PCR de los repertorios VH y kappa VL (VLK) de ratón para su expresión en fagos

El principio se ilustra en la Figura 17. Las secciones de la A a la F proporcionan detalles de la técnica pero se discutirá primero un esquema más amplio.

1. Se prepara cDNA a partir de RNA de bazo de un ratón apropiado y se amplifican individualmente los repertorios VH y VLK. Por otra parte, los cebadores inverso y complementario a VH1FOR-2 (dominio 1) y a VLK2BACK (dominio 2) se utilizan separadamente para amplificar por PCR un DNA que contenga scFv. (El término 5' se refiere por ejemplo a un cebador para la amplificación de secuencias en la cadena con sentido que da lugar a secuencias codificantes antisentido. El término cebador en 3' se refiere por ejemplo a un cebador para la amplificación de secuencias en la cadena antisentido que da lugar a secuencias codificantes con sentido). Esto proporciona una molécula "engarce" que codifica para el engarce con la secuencia aminoacídica (código de 1 letra) (GGGGS)_{3} la cual se solapa con los dos productos primarios de la PCR (VH y VLK).

2. Las secuencias amplificadas separadamente VH, VLK y engarce tienen que ensamblarse ahora en una molécula de DNA continua mediante la utilización de una PCR de "ensamblaje". En la PCR secundaria de "ensamblaje", las bandas del VH, VLK y engarce se combinan y se ensamblan en virtud de las zonas de solapamiento a las que se ha hecho referencia con anterioridad. Esto genera un fragmento de DNA ensamblado que dirigirá la expresión de VH y de un dominio VLK. La combinación específica de VH/VLK se consigue aleatoria a partir de los repertorios VH y VLK por separado a los que se ha hecho referencia con anterioridad.

La PCR de ensamblaje se lleva a cabo en dos etapas. Primero, se realizan 7 ciclos con sólo las tres bandas presentes en la PCR, seguidos por 20 ciclos más en presencia de los cebadores flanqueantes VH1BACK (que se refiere al dominio 1 de VH) y VLKFOR. Las secuencias nucleotídicas para estos cebadores oligonucleotídicos se encuentran en la sección posterior que lleva por título "Secuencias de los Cebadores". Este procedimiento con dos etapas evita el problema potencial de la amplificación preferencial de las combinaciones que se ensamblan primero.

Para el clonaje en el sistema de fagos, los repertorios ensamblados deben ser "marcados" con los sitios de restricción apropiados. En el siguiente ejemplo, esto se ilustra con la inserción de un sitio de restricción para ApaLI en el extremo VH de la molécula continua de DNA y de un sitio de restricción para NotI en el extremo VLK de la molécula. Esto se lleva a cabo mediante una tercera etapa de PCR con cebadores marcados. Las secuencias nucleotídicas de estos cebadores también se encuentran en la sección posterior que lleva por título "Secuencias de los Cebadores". Hay sin embargo, 4 posibles secuencias de las cadenas ligeras kappa (mientras que se puede utilizar una única secuencia consenso de cadena pesada). Por lo tanto se proporcionan 4 secuencias de cebadores oligonucleotídicos para VLK.

Para esta tercera etapa de PCR, se utilizan juegos de cebadores que originan el nuevo sitio de restricción y que tienen 10 nucleótidos más en el extremo 5' del sitio de restricción utilizado. Sin embargo, secuencias marcadoras más largas podrían dar lugar a una mejor digestión, en cuyo caso se podrían utilizar colas de 15-20 nucleótidos protuberantes.

Deben utilizarse procedimientos escrupulosamente limpios en todo momento para evitar contaminaciones durante la PCR. Para monitorizar contaminaciones siempre se deben incluir controles negativos que carecen de DNA. Las cajas de los geles se deben despurinizar. Para extraer el DNA de un gel de agarosa se puede utilizar el equipo Geneclean (B10 101, Geneclean, La Jolla, San Diego, California, EE.UU.) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Deben hacerse alícuotas de las esferas, del NaI y de la solución de lavado NEW.

Todas las enzimas se obtuvieron de los Laboratorios CP, P.O. Box 22, Bishop's Stortford, Herts CM20 3DH y se utilizaron los tampones recomendados y suministrados con las enzimas por los fabricantes a menos que se especifique lo contrario.

A. Preparación del RNA

El RNA se puede preparar utilizando diversos procedimientos bien conocidos por aquellos expertos en la materia. Como un ejemplo, el siguiente protocolo (lisis con Tritón X-100, inactivación de la RNAsa con fenol/SDS) da excelentes resultados con células de bazo y de hibridomas (la adición de VRC (complejo veronal ribosil) como un inhibidor de la RNasa es necesaria para las células de bazo). También dan buenos resultados los procedimientos con de isotiocianato de guanidinio/CsCl (que producen RNA celular total) pero son más largos.

1. Precipitar de 1 a 5 x 10^{7} células mediante centrifugación en una centrífuga de sobremesa a 800xg durante 10 minutos a 4ºC. Resuspender con suavidad en 50 ml de tampón PBS frío. Centrifugar las células de nuevo a 800xg durante 10 minutos a 4ºC, y descartar el sobrenadante.

2. En hielo, añadir al precipitado 1 ml de tampón de lisis que ha sido enfriado en hielo y resuspenderlo con una pipeta Gilson de 1 ml pipeteando arriba y abajo con suavidad. Incubar en hielo durante 5 minutos.

3. Después de la lisis, eliminar los restos celulares por centrifugación a 1300 rpm durante 5 minutos en una microcentrífuga a 4ºC, en tubos enfriados con anterioridad.

4. Transferir 0,5 ml del sobrenadante a cada uno de dos tubos eppendorfs que contienen 60 ml de SDS al 10% (p/v) y 250 Ml de fenol (previamente equilibrado con Tris-HCl 100 mM, pH 8,0). Mezclar en un vórtex con fuerza durante 2 minutos y después microcentrifugar (13.000 rpm) durante cinco minutos a temperatura ambiente. Transferir la fase superior, acuosa, a un tubo nuevo.

5. Extraer de nuevo la fase superior acuosa cinco veces más con 0,5 ml de fenol.

6. Precipitar con 1/10 del volumen de acetato sódico 3 M y 2,5 volúmenes de etanol a 20ºC durante toda la noche o con isopropanol en hielo seco durante 30 minutos.

7. Lavar el precipitado de RNA y resuspenderlo en 50 ml para cuantificar la concentración mediante la OD260 y examinar 2 mg en un gel de agarosa al 1%. Se obtuvieron 40 mg de RNA a partir de células de bazo de ratón.

El tampón de lisis es [Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 1 mM, NaCl 150 mM, VCR 10 mM (New England Biolabs), Triton X-100 al 0,5% (p/v)], y se prepara al momento.

B. Preparación del cDNA

El cDNA se puede preparar utilizando diversos procedimientos bien conocidos por aquellos expertos en la materia. Como un ejemplo, se puede utilizar el siguiente protocolo:

1. Preparar la siguiente mezcla de transcripción inversa:

	\mul

H_{2}O (tratada con DEPC)	20
dNTP 5 mM	10
tampón de la primera cadena 10 x	10
DTT 0,1 M	10
cebador(es) 5' (10 pmoles/\mul)	2 (cada uno) (ver más abajo)
RNasin (Promega; 40 U/\mul)	4

NB

i) El DEPC es dietilpirocarbonato, su función es inactivar cualquier enzima que pudiera degradar el DNA o el RNA.

ii) El dNTP es desoxinucleótido trifosfato.

iii) El DTT es ditiotreitol y funciona como antioxidante para crear el ambiente reductor necesario para el funcionamiento de la enzima.

iv) El RNasin es un inhibidor de ribonucleasas obtenido de Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wisconsin, EE.UU..

2. Diluir 10 mg de RNA con agua tratada con DEPC a un volumen final de 40 ml. Calentar a 65ºC durante 3 minutos y mantener en hielo durante un minuto (para eliminar la estructura secundaria).

3. Añadir al RNA la mezcla de transcripción inversa (58 ml) y 4 ml de la transcriptasa inversa clonada "Super RT" (Anglian Biotech Ltd., Whitehall House, Whitehall Road, Colchester, Essex) e incubar a 42ºC durante una hora.

4. Hervir la mezcla de reacción durante tres minutos, enfriar en hielo durante un minuto y después centrifugar en una microcentrífuga para precipitar las impurezas. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.

El tampón de la primera cadena 10 x es [KCl 1,4 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 8,1 a 42ºC, MgCl_{2} 80 mM].

Los cebadores se aparean al extremo 3'. Ejemplos de cebadores para la cadena ligera kappa son MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX y MJK5FONX (proporcionados posteriormente bajo "Secuencias de Cebadores") y ejemplos de cebadores para la cadena pesada son MIGG1, 2 (CTG GAC AGG GAT CCA GAG TTC CA) y MIGG3 (CTG GAC AGG GCT CCA TAG TTC CA) los cuales se aparean con CH1.

Alternativamente, puede utilizarse cualquier cebador que se una al extremo 3' de las regiones variables VH, VLK, VL, o a las regiones constantes CH1, CK o CL.

C. PCRs Primarias

Para cada PCR y control negativo, se preparan las siguientes reacciones (por ejemplo una reacción de PCR para cada una de las cuatro VLKs y de las cuatro VH). En la siguiente reacción se utilizó la DNA polimerasa Vent vendida por (C.P. Laboratories Ltd (New England Biolabs) la dirección se ha dado con anterioridad). Los tampones son de C.P. Laboratoires.

\newpage

	\mul

H_{2}O	32,5
tampón Vent 10 x	5
BSA Vent 20 x	2,5
dNTPs 5 mM	1,5
cebador 5' (10 pmoles/\mul)	2,5
cebador 3' (10 pmoles/\mul)	2,5

Los cebadores 5' y 3' se especifican en la posterior sección titulada "Secuencias de los Cebadores". Para VH, el cebador 5' es VH1FOR-2 y el cebador 3' es VH1BACK. Para VLK los cebadores 5' son MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX y MJK5FONX (para las cuatro respectivas cadenas ligeras kappa) y el cebador 3' es VK2BACK. Sólo es necesario un cebador 3' para la cadena ligera kappa porque la unión del cebador tiene lugar en una secuencia común a las cuatro cadenas ligeras kappa.

Tratar la mezcla con UV durante 5 minutos. Añadir 2,5 ml de la preparación del cDNA (del B anterior) y 2 gotas de aceite de parafina (Sigma Chemicals, Poole, Dorset, GB). Colocar en un bloque de un termociclador, por ejemplo, el PHC-2 fabricado por Techne LTd. Duxford GB, calentado previamente a 94ºC. Añadir 1 ml de DNA polimerasa Vent por debajo de la parafina. Amplificar utilizando 25 ciclos de 1 min a 94ºC, 2 min a 72ºC. Hacer un tratamiento final de 5 min a 60ºC.

Purificar en un gel de agarosa lmp (agarosa de bajo punto de fusión) al 2%/TAE (tris-acetato EDTA) y extraer el DNA hasta 20 ml de agua por cada reacción de PCR original utilizando un equipo Geneclean (ver con anterioridad) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

D. Preparación del engarce

Preparar en cantidad (por ejemplo 10 veces)

	\mul

H_{2}O	34,3
tampón Vent 10 x	5
BSA Vent 20 x	2,5
dNTPs 5 mM	2
cebador LINKFOR (10 pmoles/\mul)	2,5
cebador LINKBACK (10 pmoles/\mul)	2,5
DNA de scFv D1.3 (Ejemplo 2)	1
Enzima Vent	0,2

Los cebadores 5' y 3' se especifican en la sección posterior titulada "Secuencias de los Cebadores". El cebador 5' es LINKFOR y el 3' es LINKBACK. Cubrir con parafina y colocar en un bloque de un termociclador (ver ejemplo anterior) a 94ºC. Amplificar utilizando 25 ciclos de 1 min a 94ºC, 1 min a 65ºC, 2 min a 72ºC. Hacer un tratamiento final de 5 min a 60ºC.

Purificar en un gel de agarosa lmp al 2%/TAE (utilizar un colorante de carga sin azul de bromofenol ya que se desea un fragmento de 93 pb) y eluir con una columna SPIN-X (Costar Limited, 205 Broadway, Cambridge, Ma. EE.UU.) y precipitar. Disolver en 5 ml de H_{2}O por reacción de PCR.

E. PCRs de ensamblaje

Un cuarto del volumen de cada uno de los productos de reacción de la PCR (5 ml) se utiliza para cada ensamblaje. El volumen total es de 25 ml.

Para cada uno de los cuatro cebadores VLK se prepara la siguiente reacción:

H_{2}O	4,95
tampón Vent 10 x	2,5
BSA Vent 20 x	1,25
dNTPs 5 mM	0,3

Irradiar la mezcla con UV durante 5 min Añadir 5 ml de cada banda Vh y VK de la PCR primaria y 1,5 ml del engarce, aislado de los geles preparativos y extraído utilizando el equipo Geneclean tal como se ha descrito en los anteriores apartados C y D. Cubrir con parafina. Colocar en un bloque de un termociclador calentado a 94ºC. Añadir debajo de la parafina 1 ml de DNA polimerasa Vent. Amplificar utilizando 7 ciclos de 2 min a 94ºC, 4 min a 72ºC. Después restituir la temperatura a 94ºC.

Añadir 1,5 ml de cada cebador VH1BACK y del apropiado VKFOR: MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX o MJK5FONX (10 pmoles/ml) a 94ºC. Los cebadores tienen que haberse irradiado con UV tal como se ha descrito con anterioridad. Amplificar utilizando 20 ciclos de 1,5 min a 94ºC, 2,5 min a 72ºC. Hacer un tratamiento final de 5 min a 60ºC. Purificar en un gel de agarosa lmp al 2%/TAE y extraer el DNA en 20 ml de H_{2}O para cada PCR de ensamblaje utilizando un equipo Geneclean (ver anteriormente) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

F. Adición de los sitios de restricción

Preparar para cada ensamblaje y control:

	\mul

H_{2}O	36,5
tampón Taq 10 x	5
dNTPs 5 mM	2
cebador 5' (10 pmoles/ml)	2.5
cebador 3' (10 pmoles/ml)	2.5
producto del ensamblaje	1

Los cebadores 5' y 3' se especifican en la sección posterior titulada "Secuencias de los Cebadores". El cebador 5' para insertar un sitio de restricción para NotI en el extremo VLK es cualquiera de los JK1NOT10, JK2NOT10, JK4NOT10 o JK5NOT10 (para las cuatro respectivas cadenas ligeras kappa). El cebador 3' para insertar un sitio de restricción para ApaLI en el extremo VH es HBKAPA10.

Cubrir con parafina y colocar en un bloque de un termociclador calentado a 94ºC. Añadir 0,5 ml de Taq DNA polimerasa Cetus (Cetus/Perkin-Elmer, Beaconsfield, Bucks, GB) por debajo de la parafina. La amplificación se lleva a cabo utilizando de 11 a 15 ciclos (dependiendo de la eficacia) de 1 min a 94ºC, 1 min a 55ºC, 2 min a 72ºC. Hacer un tratamiento final de 5 min a 60ºC.

El tampón Taq 10 x es [Tris-HCl 0,1 M, pH 8,3 a 25ºC, KCl 0,5 M, MgCl_{2} 15 mM, gelatina a 1 mg/ml].

G. Digestión clave del DNA (Work-up)

Purificar una vez con CHCl_{3}/IAA (alcohol isoamílico), una vez con fenol, una vez con CHCl_{3}/IAA y volver a extraer cada una de las purificaciones para asegurar pérdidas mínimas. Precipitar y lavar dos veces con 70% EtOH. Disolver en 70 ml de H_{2}O.

Digerir durante toda la noche a 37ºC con NotI:

	\mul

DNA (secuencia ensamblada)	70
tampón NotI NEB 10 x	10
BSA NEB 10 x	10
NotI (10 u/ml)	10

El DNA (secuencia ensamblada) anterior se refiere a la secuencia de DNA ensamblada que comprende en la dirección 5' a 3' de:

Sitio de restricción para ApaLI

Secuencia VH

Secuencia de engarce

Secuencia VLK

Sitio de restricción para NotI

La secuencia VLK puede ser cualquiera de las cuatro posibles secuencias de las cadenas kappa.

Las enzimas NotI (anterior digestión), ApaLI (siguiente digestión) y los tampones NotI NEB, BSA NEB (anterior digestión) y el tampón NEB 4 (siguiente digestión) se obtienen de CP Laboratories, New England Biolabs mencionados anteriormente.

Volver a precipitar y disolver en 80 ml de H_{2}O. Añadir a estos 10 ml de tampón NEB 4 y 10 ml de ApaLI.

Añadir la enzima ApaLI en alícuotas durante todo el día ya que tiene una vida media muy corta a 37ºC.

Purificar en un gel de agarosa lmp al 2%/TAE y extraer el DNA con un equipo de Geneclean de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Si se desea se puede volver a digerir.

H. Producto Final del DNA

El producto de DNA final es un fragmento de aproximadamente 700 pb con extremos compatibles ApaLI y NotI que consiste en asociaciones aleatorias de secuencias de las cadenas ligeras y pesadas unidas por un engarce. Una molécula típica de este tipo es la molécula scFvD1.3 incorporada dentro de fdscFvD1.3 tal y como se ha descrito en el ejemplo 3. Mediante el uso de técnicas estándar estas moléculas pueden ligarse después en vectores derivados de fd adecuados, como por ejemplo fdCAT2 (Ejemplo 5).

Secuencias de los Cebadores

Oligos para PCR primarias (sitios de restricción subrayados):

2

Códigos de ambigüedad M=A o C, R=A o G, S=G o C, W=A o T

Oligos para la PCR para producir el engarce:

3

Para añadir sitios de restricción:

4

Sería útil mejorar la eficiencia de la transfección del sistema fago-molécula de unión y también el tener la posibilidad de expresar diferentes números y especificidades de las moléculas de unión en la superficie del mismo bacteriófago. Los solicitantes han ideado un procedimiento que consigue ambos objetivos.

La aproximación deriva del sistema del fagemido basado en pUC119 [Vieira, J y J. Messing (1987) Methods Enzymol. 153: 3]. Brevemente, el gen III del fd-CAT2 (Ejemplo 5) y la fusión gen III scFv del fd-CAT2 scFv D1.3 (Ejemplo 2) se clonaron cadena abajo del promotor lac en muestras separadas del pUC119, de manera que el gen III insertado y el gen III fusionado pudieran ser "recuperados" mediante el fago auxiliar M13MO7 [Vieira, J and Messing J y col., supra] preparado de acuerdo con Sambrook y col. (1989), supra. La mayoría del fago recuperado se esperaría que tuviera un genoma derivado del plásmido pUC119 que incluyera la fusión gen III-molécula de unión y debería expresar un número variable de las moléculas de unión en la superficie hasta el máximo normal de 3-5 moléculas del gen III en la superficie del fago de tipo salvaje. A continuación se muestra un ejemplo del sistema con la utilización de un anticuerpo como la molécula de unión.

Se obtuvo un fdCAT2 que contenía la forma Sv de cadena sencilla del anticuerpo D1.3 antilisozima mediante la digestión de fdTscFvD1.3 (Ejemplo 2) con PstI y XhoI, la purificación del fragmento que contenía el fragmento scFv y la ligación de este en fdCAT2 previamente digerido con PstI y XhoI. El clon apropiado, llamado fd-CAT2 scFvD1.3, se seleccionó después de sembrar en placas de 2x TY con tetraciclina (15 mg/ml) y se confirmó por digestión con enzimas de restricción y análisis de la secuencia.

El gen III del fd-CAT2 (Ejemplo 5) y la fusión del gen III scFv a partir del fd-CAT2 scFvD1.3 se amplificaron por PCR con la utilización de los cebadores A y B que se muestran a continuación:

100

El cebador A se aparea al extremo 5' del gen III que incluye el punto donde se localiza el sitio de unión al ribosoma e incorpora un sitio de restricción para HindIII. El cebador B se une al extremo 3' del gen III en el C terminal e incorpora dos codones de parada UAA y un sitio de restricción para EcoRI. Se utilizaron 100 ng de DNA del fd-CAT2 y del fd-CAT2 scFv D1.3 como molde para la amplificación por PCR en un volumen total de reacción de 50 ml como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 7, excepto que se realizaron 20 ciclos de amplificación: 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC, 3 minutos a 72ºC. Esto dio lugar a la amplificación del fragmento esperado de 1,2 Kb del fd-CAT2 y de un fragmento de 1,8 Kb del fd-CAt2 scFv D1.3.

Los fragmentos de PCR se digirieron con EcoRI y HindIII, se purificaron de un gel, se ligaron con DNA de pUC119 digerido con EcoRI y HindIII y desfosforilado, y se transformaron en E. coli TG1 con la utilización de técnicas estándar (Sambrook y col., supra). Las células transformadas se sembraron en placas con agar SOB (Sambrook y col., (1989), supra) que contenían 100 mg/ml de ampicilina y 2% de glucosa. Los clones resultantes se denominaron pCAT-3 (derivados del fd-CAT2) y pCAT-3 scFv D1.3 (derivados del fd-CAT2 scFv D1.3).

Ejemplo 13 Recuperación de la especificidad del anticuerpo anti-lisozima a partir del pCAT-3 scFv D1.3 mediante M13KO7

Se aislaron colonias únicas pCAT-3 y pCAT-3 scFv D1.3 en 1,5 ml de 2x TY que contenía ampicilina a 100 mg/ml y glucosa al 2%, y se hicieron crecer durante 6 horas a 30ºC. 30 ml de estas células en crecimiento estacionario se añadieron a 6 ml de 2x TY que contenía ampicilina a 100 mg/ml y glucosa al 2% en tubos de 50 ml de polipropileno (Falcon, Becton Dickinson Labware, 1950 Williams Drive, Oxnard, CA, EE.UU.) y se hicieron crecer durante 1,5 horas a 30ºC y 380 rpm en un agitador orbital New Brunswick (Scientific Ltd., Edison House 163 Dixons Hill road, North Mimms, Hatfield, GB). Las células se precipitaron por centrifugación a 5.000 g durante 25 minutos y los tubos se escurrieron sobre papel. Los precipitados celulares se resuspendieron entonces en 6 ml de 2x TY que contenía 1,25 x 10^{9} p.f.u. ml^{-1} del bacteriófago M13KO7. La mezcla se incubó en hielo durante 5 minutos y se dejó crecer a 35ºC durante 45 minutos a 450 rpm. Se añadió entonces un cóctel que contenía 4 ml de ampicilina a 100 mg/ml, 0,5 ml de IPTG
0,1 M y 50 ml de canamicina a 10 mg/ml y se dejaron crecer los cultivos durante toda la noche a 35ºC y 450 rpm.

Al día siguiente los cultivos se centrifugaron y se precipitaron las partículas fagos con PEG como se ha descrito con anterioridad en el ejemplo 6. Los precipitados de fagos se resuspendieron en 100 ml de TE (tris-EDTA ver ejemplo 6) y se titularon los fagos en células de E. coli TG1. Se sembraron alicuotas de las células infectadas en placas 2x TY que contenían bien ampicilina a 100 mg/ml para seleccionar partículas fago con pUC119 o canamicina a 50 mg/ml para seleccionar para el fago auxiliar M13KO7. Las placas se incubaron durante toda la noche a 37ºC y se cuantificaron las colonias resistentes a antibióticos:

DNA	amp^{R}	kan^{R}
pCAT-3	1,8 x 10^{11} colonias	1,2 x 10^{9} colonias
pCAT-3 scFv D1.3	2,4 x 10^{11} colonias	2,0 x 10^{9} colonias

Estos resultados muestran que las partículas fagemidos amp^{R} son infectivas y están presentes en la población de fagos recuperados a una concentración 100 veces en exceso respecto el fago auxiliar M13KO7 kan^{R}.

Se ensayó en los fagos la actividad anti-lisozima con un ELISA tal como se ha descrito en el ejemplo 6, con las siguientes modificaciones:

1) Las placas ELISA se saturaron durante 3 horas con Marvel al 2%/PBS.

2) Se mezclaron muy bien durante 20 minutos 50 ml de fago, 400 ml de 1 x PBS y 50 ml de Marvel al 20% a temperatura ambiente antes de añadir 150 ml en cada pocillo.

3) Se dejó que se unieran los fagos durante 2 horas a temperatura ambiente.

4) Los lavados posteriores a la unión del fago fueron:

: 2 aclarados rápidos en PBS/0, Tween 20 al 5%

: 3 lavados de 2 minutos en PBS/0, Tween 20 al 5%

: 2 aclarados rápidos en PBS sin detergente

: 3 lavados de 2 minutos en PBS sin detergente

El resultado de este ELISA se muestra en la Figura 22, la cual muestra que la especificidad del anticuerpo se puede recuperar eficientemente.

Se considera un tópico en genética bacteriana que cuando se expresan conjuntamente una proteína mutante y su forma salvaje en la misma célula, la proteína salvaje se utiliza preferentemente. Esta situación es análoga a la situación anterior donde las proteínas mutantes (por ejemplo la fusión de anticuerpos) y las proteínas del gen III salvaje (de M13KO7) compiten en el ensamblaje como parte de la partícula del fagemido pUC119. Por tanto es de prever que la mayoría de las partículas fago pUC119 resultantes tendrán menos moléculas de la fusión gen III-anticuerpo en su superficie que en un sistema de fagos puramente como el descrito en el ejemplo 2. Por tanto, dichos anticuerpos fagemidos se unirán probablemente al antígeno con una avidez menor que los anticuerpos fágicos fd que presentan tres o más copias de la fusión de anticuerpo en sus superficies (no hay gen III de tipo salvaje en el sistema descrito, por ejemplo, en el ejemplo 2) y que proporcionan una vía para la producción de partículas fago con diferentes cantidades de la misma molécula de unión (y por tanto diferentes niveles de avidez para el ligando/antígeno) o múltiples especificidades de unión diferentes en su superficie, con la utilización de un fago auxiliar como M13KO7 para recuperar células que expresen dos o más fusiones del gen III-anticuerpo.

También es posible obtener fagos auxiliares derivados que no codifican para un gen III funcional en sus genomas (por ejemplo delecionando las secuencias del gen III o una parte de él o incorporando una mutación ambar dentro del gen). Estos fagos defectivos crecerán sólo en células apropiadas (por ejemplo células provistas del gen III funcional en trans, o que contengan un gen supresor de la mutación ámbar), pero cuando se utilicen para recuperar anticuerpos fágicos, sólo incorporarán la fusión gen III-anticuerpo codificada por el fagemido dentro de la partícula de fago liberada.

Ejemplo 14 Eficiencia en la Transformación de los fagemidos pCAT-3 y pCAT-3 scFv D1.3

Se preparó DNA de los plásmidos pUC 19, pCAT-3 y pCAT-3 scFv D1.3 y DNA del fago fdCAT-2 y se utilizó para transformar E. coli TG1. Las transformaciones con pCAT-3 y pCAT-3 scFv D1.3 se sembraron en placas de agar SOB que contenían ampicilina a 100 mg/ml y glucosa al 2% y se incubaron durante toda la noche a 30ºC. Las transformaciones con fdCAT-2 se sembraron en placas de agar TY que contenían tetraciclina a 15 mg/ml y se incubaron toda la noche a 37ºC. Las eficiencias de transformación se expresan como número de colonias por mg de DNA.

DNA	Eficiencia de Transformación
pUC 19	1 x 10^{9}
pCAT-3	1 x 10^{8}
pCAT-3 scFv D1.3	1 x 10^{8}
fd CAT-2	8 x 10^{5}

Como era de esperar, la transformación del vector fagemido es aproximadamente 100 veces más eficiente que la del vector parental fdCAT-2. Además, la presencia de un fragmento de anticuerpo scFv no compromete esta eficiencia. Esta mejora en la eficiencia de transformación es útil de una manera práctica en la generación de genotecas de anticuerpos fágicos que tengan grandes repertorios de especificidades de unión diferentes.

Ejemplo 15 Ensamblaje por PCR de una genoteca de cadenas sencillas Fv a partir de un ratón inmunizado

Para demostrar la utilidad de los fagos para la selección de anticuerpos a partir de repertorios, el primer requerimiento es el ser capaz de preparar una genoteca que sea diversa y representativa del repertorio de anticuerpos de un animal y que exprese este repertorio en la superficie del bacteriófago fd.

El RNA citoplasmático se aisló de acuerdo con el ejemplo 11 a partir de los bazos agrupados de cinco ratones macho Balb/c inyectados 8 semanas después de una inmunización primaria con 2-fenil-5-oxazolona (pH OX) acoplada a albúmina sérica de pollo. La preparación del cDNA y el ensamblaje por PCR de los repertorios VH y VL kappa de ratón para la expresión del fago se realizó como se describe en el ejemplo 11. Las moléculas que se obtuvieron se ligaron en fdCAT2.

El vector fdCat2 se digirió extensivamente con NotI y ApaLI, se purificó por electroelución (Sambrook y col., 1989 supra) y se utilizó 1 mg para ligarlo con 0,5 mg (5 mg para la genotecas jerárquicas: ver ejemplo 17) de los genes scFv ensamblados en 1 ml con 8000 unidades de T4 DNA ligasa (New England Biolabs). La ligación se llevó a cabo durante toda la noche a 16ºC. La mezcla de ligación una vez purificada se electroporó en seis alícuotas en células MC1061 (Dower, W.J., J.F. Miller y C.W. Ragsdale (1988) Nuclic Acid Res. 16: 6127-6145) y se sembraron las células en placas de medio NZY (Sambrook y col., (1989) supra) con tetraciclina a 15 mg/ml, en placas de 243 x 243 mm (Nunc): el 90-95% de los clones contenían genes scFv por rastreo con PCR.

Las colonias recombinantes se rastrearon por PCR utilizando los cebadores VH1BACK y MJK1FONX,
MJK2FONX, MJK4FONX y MJK5FONX (ver ejemplo 11) seguido por digestión con la enzima de restricción frecuente BstNI (New England Biolabs, utilizado según las recomendaciones de los fabricantes). La genoteca de 2 x 10^{5} clones parecía ser diversa si se juzgaba por la variedad de patrones de restricción que se observan en la Figura 23, y la secuenciación reveló la presencia de una mayoría de grupos VH (Dildrop, R. (1984) Inmunol. Today 5: 85-86) y subgrupos VK (Kabat, E.A. y col., (1987) supra) (no se muestran estos resultados). Ninguno de los 568 clones que se analizaron se unió a phOx como se detecta por ELISA en el ejemplo 8.

Por tanto la habilidad para seleccionar anticuerpos proporcionada por la utilización de anticuerpos fágicos (como en el ejemplo 16) es esencial para aislar rápidamente anticuerpos con actividades de unión al antígeno a partir de combinaciones aleatorias de dominios VH y VL. Se requeriría un rastreo muy extensivo para aislar fragmentos de unión al antígeno si se utilizara la aproximación combinatorial aleatoria de Huse y col., (1989) supra.

Ejemplo 16 Selección de anticuerpos específicos para la 2-fenil-5-oxazolona a partir de un repertorio derivado de un ratón inmunizado

La genoteca preparada en el ejemplo 15 se utilizó para demostrar la habilidad del sistema de fagos para seleccionar anticuerpos basándose en la especificidad del anticuerpo.

Ninguno de los 568 clones que se analizaron por ELISA de la genoteca sin seleccionar se unió a phOx.

El rastreo de unión del fago al hapteno se llevo a cabo por ELISA: placas de 96 pocillos se tapizaron con phOx-BSA a 10 mg/ml o BSA a 10 mg/ml en un tampón fosfato salino (PBS) durante toda la noche a temperatura ambiente. Se inocularon colonias de bacterias transducidas con fagos en placas de 96 pocillos ("cell wells", Nuclon) en 200 ml de 2x TY con 12,5 mg/ml de tetraciclina, y se dejaron crecer con agitación (300 rpm) durante 24 horas a 37ºC. En este estadio los cultivos estaban saturados y las titulaciones del fago eran reproducibles (10^{10} TU/ml). Se añadió a las placas tapizadas 50 ml del sobrenadante con el fago mezclado con 50 ml de PBS que contenía 4% de leche desnatada en polvo. Para más detalles ver ejemplo 8.

La genoteca de fagos se pasó a través de una columna de afinidad para phOx (Tabla 3A), y se eluyó con hapteno. Las colonias de la genoteca preparada en el ejemplo 17 se obtuvieron por raspado en 50 ml de medio 2x TY y se agitaron a 37ºC durante 30 min El fago liberado se precipitó dos veces con polietilenglicol y se resuspendió en agua a una concentración de 10^{12} TU (unidades de transducción)/ml (titulado como en el ejemplo 8). Para la selección por afinidad se lavó una columna de 1 ml de sefarosa-BSA-phOx (Makela, O., M. Kaartinen, J.L.T. Pelonen, y K. Karjalainen (1978) J. Exp. Med. 148: 1644-1660) con 300 ml de tampón fosfato salino (PBS), y 20 ml de PBS que contenía 2% de leche desnatada en polvo (MPBS). Se cargaron en la columna 10^{12} TU del fago en 10 ml de PBS, se lavó la columna con 10 ml de MPBS y finalmente 200 ml de PBS. El fago unido a la columna se eluyó con 5 ml de 4-e-amino-ácido capróico metileno 2-fenil-oxazol-5-ona 1 mM (phOx-CAP; O. Makela y col., (1978), supra). Aproximadamente 10^{6} TU del fago eluido se amplificó infectando 1 ml de cultivo celular de E. coli TG1 en fase logarítmica y se sembró en placa como se ha explicado con anterioridad. Para una ronda más de selección, las colonias se obtuvieron por raspado en 10 ml de medio 2x TY y luego se procesaron como se ha explicado con anterioridad. De los clones eluidos, se encontró que un 13% se unían a phOx después de la primera ronda de selección, y oscilaban de unión escasa a fuerte en ensayos ELISA.

Para secuenciar los clones, se preparó DNA molde a partir de los sobrenadantes de 10 ml de cultivos que se dejaron crecer durante 24 horas y se secuenció siguiendo el procedimiento del didesoxi y se utilizó el equipo de la sequenase (USB), con el cebador LINKFOR (ver ejemplo 11) para los genes VH y con el cebador fdSEQ1 (5'-GAA TTT TCT GTA TGA GG) para los genes Vk. Se secuenciaron veintitrés de los clones de unión al hapteno y se encontraron ocho genes VH diferentes (de la A a la H) en una variedad de combinaciones con siete genes Vk diferentes (de la a a la g) (Fig. 21). La mayoría de los dominios, como VH-B y Vk-d eran "promiscuos", capaces de unir hapteno con cualquiera de las distintas parejas.

Las secuencias de los genes V estaban relacionadas con aquellas vistas en la respuesta secundaria a phOx, pero con algunas diferencias (Fig. 21). Por tanto, los hibridomas phOx de la respuesta secundaria emplean derivados mutados somáticamente de tres tipos de genes Vk - los genes Vkox1, "similar a Vkox" y Vk45,1 (Berek, C., G.M. Griffiths y C. Milstein (1985) Nature 316: 412-418). Estos se pueden aparear con genes VH de distintos grupos, Vkox1 se aparea más comúnmente con el gen VHox1 (VH grupo 2. R. Dildrop supra). Los genes Vkox1 se encuentran siempre, y los genes similares a Vkox con frecuencia, en asociación con cadenas pesadas (incluyendo VHox1) y contienen un pequeño CDR3 de cinco residuos, con la secuencia motivo Asp-X-Gly-X-X en la cual la glicina central es necesaria para generar una cavidad para phOx. Sin embargo en la genoteca combinatorial aleatoria, casi todos los genes VH pertenecían al grupo 1, y la mayoría de los genes Vk eran similares a ox y se asociaban a dominios VH con un CDR3 de cinco residuos, motivo Asp/Asn-X-Gly-X-X (Fig. 21). Los Vkox1 y VHox1 se encontraron una sola vez (Vk-f y VH-E) y no se combinaban entre ellos. Además, el Vk-f carece del Trp91 implicado en la unión a phOx y estaba apareado con un VH (VH-C) con un CDR3 de seis residuos.

Se identificó una matriz de combinaciones de genes VH y VK en clones de unión a phOX seleccionados a partir de la genoteca combinatorial aleatoria. El número de clones que se encontraron para cada combinación se muestra en la Figura 22. La unión a phOx-BSA, según se juzga por la señal del ELISA, parecía variar (marcado con sombreado en la Fig. 22). No se encontró unión a BSA en solitario.

Una segunda ronda de selección de la genoteca original combinatorial aleatoria de ratón inmune resultó en un 93% de clones eluidos que se unían a phOx (Tabla 3). La mayoría de estos clones eran combinaciones Vk-d, y se unían fuertemente a phOx en ensayos ELISA (no se muestran estos resultados). Se observaron pocos clones que se unían débilmente. Esto sugería que la cromatografía de afinidad no sólo había enriquecido la muestra para clones que se unían sino que se habían seleccionado los mejores.

Las titulaciones de la extinción de la fluorescencia ("quench") determinaron que el valor de Kd de VH-B/Vk-d para phOx-GABA era de 10^{-8} M (Ejemplo 18), lo que indicaba que los anticuerpos con afinidades representativas de la respuesta secundaria pueden seleccionarse a partir de la respuesta secundaria, sólo dos (de once que se caracterizaron) secretaron anticuerpos con una afinidad mayor que VH-B/Vk-b (C. Berek y col., (1985) supra). La Kd de VH-B/Vk-b para phOx-GABA fue de 10^{-5} M (Ejemplo 18). Por tanto, los fagos portadores de fragmentos scFv con bajas afinidades pueden seleccionarse con el antígeno, probablemente debido a la avidez de las múltiples cabezas de anticuerpos en el fago.

Este ejemplo muestra que se pueden aislar especificidades antigénicas a partir de genotecas derivadas de ratones inmunizados. En numerosas ocasiones se deseará expresar estos anticuerpos en una forma soluble para estudios posteriores o para su utilización en aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico. El ejemplo 18 demuestra la determinación de la afinidad de fragmentos scFv solubles seleccionados mediante la utilización de anticuerpos fágicos. El ejemplo 21 demuestra que los fragmentos solubles presentan propiedades similares a aquellas expresadas por el fago. En muchos casos, es deseable construir y expresar una molécula de anticuerpo que contenga las porciones Fc de la cadena pesada, y quizás varíe el isotipo de la inmunoglobulina. Para conseguir esto, es necesario subclonar los sitios de unión al antígeno identificados con la utilización del sistema de selección de fagos en un vector para la expresión en células de mamífero, utilizando procedimientos similares a los descritos por Orlandi, R. y col., (1989) supra. Por ejemplo, los genes VH y VL podrían amplificarse separadamente por PCR con cebadores que tuvieran sitios de restricción apropiados e insertarse en vectores como pSV-gpt HuIgG1 (Riechmann, L. y col., (1988) Nature 332: 323-327) el cual permite la expresión del dominio VH como parte de un isotipo IgG1 de la cadena pesada y pSV-hyg HuCK el cual permite la expresión del dominio VL acoplado a la región constante de la cadena ligera K. Además, las fusiones de los dominios
VH y VL pueden realizarse con genes que codifican para proteínas no inmunoglobulinas, por ejemplo, enzimas.

A partir de la genoteca preparada y rastreada en los ejemplos 15 y 16 se derivaron más especificidades de anticuerpos mediante la utilización de una aproximación jerárquica.

La promiscuidad de los dominios VH-B y Vk-d incitó a los solicitantes a forzar más apareamientos, mediante el ensamblaje de estos genes con los repertorios completos si cualquiera de los genes Vk o VH provenían del mismo ratón inmunizado. Las genotecas "jerárquicas" resultantes, (VH-B x Vk-rep y VH-rep x Vk-d), cada una con 4 x 10^{7} miembros, se sometieron a una ronda de selección y se aislaron clones de unión al hapteno (Tabla 3). Tal como se mostró en un ensayo ELISA, la mayoría de estos clones se unía fuertemente. Mediante la secuenciación de veinticuatro clones de cada una de las genotecas, los solicitantes identificaron catorce nuevas parejas para VH-B y trece para
Vk-d (Fig. 21). Aparte de VH-B y Vk-c, ninguna de las parejas previas (o por ejemplo otros clones) de la genoteca combinatorial aleatoria se aisló de nuevo. De nuevo, los genes Vk fueron principalmente similares a ox y los genes VH principalmente del grupo 1 (tal como se define en Dildrop, R., (1984) supra), pero los únicos ejemplos de Vkox1 (Vk-h, -p, -q y -r) tenían Trp91, y predominaba ahora el motivo VH-CDR3 Asp-X-Gly-X-X. Por tanto, parece ser que ciertas características de los hibridomas phOx emergían con más fuerza en la genoteca jerárquica. Las nuevas parejas diferían entre ellas principalmente por pequeñas alteraciones en los CDRs, lo que indicaba que mucha de la diversidad más sutil no se había explotado por la aproximación combinatorial aleatoria. Generalmente se ha mostrado que se puede conseguir un espectro de anticuerpos relacionados manteniendo uno de los miembros de la pareja fijo y variando
el otro, y esta técnica puede demostrar ser valiosa en un ajuste más fino de la afinidad y especificidad del anticuerpo.

Por tanto, de nuevo los anticuerpos fágicos permiten analizar para propiedades deseadas un mayor rango de moléculas de anticuerpos.

Este ejemplo, y el ejemplo 16, demuestran el aislamiento de especificidades de anticuerpos individuales a través de la expresión en la superficie del fago. Sin embargo, para alguno de los propósitos sería más conveniente tener una mezcla de anticuerpos, equivalentes a un antisuero policlonal (por ejemplo, para inmunoprecipitación). Para preparar una mezcla de anticuerpos, uno puede mezclar clones y expresar anticuerpos solubles o fragmentos de anticuerpos o alternativamente seleccionar clones de una genoteca para conseguir un grupo altamente enriquecido de genes que codifican para anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos contra un ligando de interés y expresar los anticuerpos a partir de estos clones.

Ejemplo 18 Selección de anticuerpos expresados en bacteriófagos con diferentes afinidades para la 2-fenil-5-oxazolona utilizando cromatografia de afinidad

Los resultados de los ensayos ELISA mostrados en el ejemplo 16 sugerían que la cromatografía de afinidad no sólo habían enriquecido la muestra para clones que se unían sino que se había seleccionado los mejores. Para confirmar esto, se determinaron las afinidades de unión de un clon que se unía fuertemente y uno que se unía débilmente al fago y después se demostró que estos dos clones podían separarse entre ellos utilizando cromatografía de afinidad.

Los clones VH-B/Vk-b y VH-B/Vk-d se reamplificaron con MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX y
MJK5FONX (ver ejemplo 11) y VH1BACK-Sfi1 (5' TCG CGG CCC AGC CGG CCA TGG CC(G/C) AGG T(C/G) (A/C) A(A/G)C TGC AG (C/G) AGT C(A/T)G G), un cebador que introduce un sitio de restricción para SfiI (subrayado) en el extremo 5' del gen VH. VH-B/Vk-d se clonó en un fagemido, por ejemplo pJM1 (cedido por A. Griffiths y J. Marks), como un cassette SfiI-NotI, cadena abajo del líder pelB para secreción periplásmica (M. Better y col., supra), con un péptido etiqueta ("tag") C-terminal para su detección (ver ejemplo 19 y figura), y bajo el control de un promotor lP_{L} (Shimatake, H. y M. Rosenberg (1981) Nature 292: 128-132). El fagemido debe tener las siguientes características: a) sitios de restricción para SfiI y NotI únicos cadena abajo de un líder pelB; b) una secuencia codificadora de un péptido etiqueta C-terminal para su detección; c) un promotor lP_{L} que controle la expresión. Se indujeron cultivos de 10 litros de E. coli N4830-1 (Gottesman, M.E., S. Adhya y A. Das (1980) J. Mol. Biol. 140: 57-75) portadoras de cada uno de los fagemidos tal como en Nagai, K. y H.C. Thogerson (1987) Methods Enzymol. 153: 461-481 y se precipitaron los sobrenadantes con sulfato amónico al 50%. El precipitado resuspendido se dializó en PBS + EDTA 0,2 mM (PBSE), se cargó en una columna de 1,5 ml de sefarosa:phOx y se lavó la columna secuencialmente con 100 ml PBS, 100 ml Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,0: 10 ml de citrato 50 mM, pH 5,0: 10 ml de citrato 50 mM, pH 4,0, y 20 ml de glicina 50 mM, pH 3,0. Los fragmentos scFv se eluyeron con glicina 50 mM, pH 2,0, se neutralizaron con Tris base y se dializaron frente PBSE. VH-B/Vk-b se clonó en un vector fagemido basado en pUC119 que codificaba para secuencias señales y secuencias etiquetas idénticas a pJM1, y se indujo su expresión a 30ºC en un cultivo de 10 litros de E. coli TG1 portador del fagemido como en de Bellis, D. y I. Schwartz (1980) Nucleic Acid Res. 18: 1311. La baja afinidad del clon VH-B/Vk-b hizo imposible su purificación en sefarosa-phOx. Por lo tanto después de su concentración por ultrafiltración (Filtron, Flowgen), el sobrenadante (100 ml de 600 ml) se cargó en una columna de 1 ml de sefarosa-proteína A (E. Harlow y D. Lane (1988) supra) acoplada al anticuerpo monoclonal 9E10 (Evan, G.I. y col., (1985) Mol. Cell Biol. 5: 3610-3616) que reconoce el péptido etiqueta. La columna se lavó con 200 ml de PBS y 50 ml de PBS en NaCl 0,5 M. Los fragmentos scFv se eluyeron con 100 ml de glicina 0,2 M, pH 3,0, y se neutralizó y dializó como se ha explicado con anterioridad.

La Kd (1,0 \pm 0,2 x 10^{-8} M) para el clon VH-B/Vk-d se determinó por titulación de la extinción de la fluorescencia con 4-E-ácido amino-butírico 2-fenil-oxazol-5-ona (phOx-GABA Co. Makela y col., (1978) supra). Se excitó a 280 nm, y la emisión se monitorizó a 340 nm y se calculó la Kd. La Kd del clon de baja afinidad VH-B/Vk-b se determinó que era de 1,8 \pm 0,3 x 10^{-5}M (no se muestra este resultado). Para minimizar la adsorción de la luz por las altas concentraciones de phOx-GABA que se requieren, la excitación se realizó a 260 nm y la emisión se monitorizó a 304 nm. Además los valores de fluorescencia se dividieron por aquellos valores de una titulación paralela del fragmento Fv D1.3 de unión a lisozima. El valor se calculó como en Eisen, H.N. (1964) Meth. Med. Res. 10: 115-121. Una mezcla de clones VH-B/Vk-b y VH-B/Vk-d, 7 x 10^{10} TU de fagos en una proporción de 20 VH-B/Vk-b : 1 VH-B/Vk-d se cargaron en una columna de sefarosa-BSA-phOx en 10 ml de MPBS y se eluyeron como se ha explicado con anterioridad. Los fagos eluidos se utilizaron para reinfectar E. coli TG1, y los fagos producidos se recolectaron tal como se ha descrito anteriormente. Aproximadamente 10^{11} TU de fagos se cargaron en una segunda columna de afinidad y el proceso se repitió hasta un total de tres pases por columna. Se sembraron placas por duplicado de diluciones de los fagos eluidos en cada uno de los estadios y se hibridaron separadamente con oligonucleótidos específicos para Vk-b (5'-GAG CGG GTA ACC ACT GTA CT) o Vk-d (5'-GAA TGG TAT AGT ACT ACC CT). Después de estos dos pases, esencialmente todos los fagos eluidos eran VH-B/Vk-d (Tabla 3). Por tanto, los anticuerpos fágicos pueden seleccionarse en base a la afinidad antigénica del anticuerpo que expresan.

El fagemido pHEN1 (Figura 23) deriva de pUC119 (Vieira, J. y J. Messing (1987) Methods Enzymol. 153: 3-11). La región codificante de g3p del fdCAT2, que incluye el péptido señal y los sitios de clonaje, se amplificó por PCR utilizando los cebadores G3FUFO y G3FUBA (que se detallan posteriormente) (que contienen los sitios de restricción para EcoRI y HindIII, respectivamente), y se clonó como un fragmento HindIII-EcoRI en pUC119. El fragmento HindIII-NotI que codifica para el péptido señal de g3p se reemplazó por un péptido señal pelB (Better, M. y col., (1988) Science 240: 1041-1043) con un sitio de restricción interno para SfiI, lo que permite clonar genes de anticuerpos como fragmentos SfiI-NotI. Un péptido diana, c-myc (Munro, S. y H. Pelham (1986) Cell 46: 291-300) se introdujo directamente después del sitio de restricción para NotI con el clonaje de un cassette oligonucleotídico, seguido de un codón ámbar que se introdujo por mutagénesis dirigida con la utilización de un equipo de mutagénesis in vitro (Amersham International) (Figura 23 b).

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Ejemplo 20 Expresión de fragmentos Fv y Fab de cadena sencilla derivados del anticuerpo anti-oxazolona NQ10.12.5 en el bacteriófago fd con la utilización del pHEN1 y del fdCAT2

Se realizaron un rango de construcciones (ver Figura 24) a partir de un clon (esencialmente construcción II en pUC19) diseñado para su expresión en bacterias, de un fragmento soluble Fab (Better y col., (1988) ver anteriormente) del anticuerpo de ratón anti-phOx (2-fenil-5-oxazolona) NQ10.12.5 (Griffiths, G.M. y col., (1984) Nature 312: 271-275). En la construcción II, las regiones V derivan de NQ10.12.5 y están unidas a los dominios constantes Ck y CH1 (isotipo g1) humano. Los residuos cisteína C-terminales, los cuales forman normalmente un enlace covalente entre las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo, se han delecionado de los dos dominios constantes. Para clonar juntos los genes de las cadenas ligeras y pesadas como fragmentos Fab (construcción II) o como cadenas separadas (construcciones III y IV) para su expresión en el fago, el DNA de la construcción II se amplificó por PCR para introducir un sitio de restricción para NotI en el extremo 3', y en el extremo 5' introducir bien un sitio de restricción para ApaLI (para el clonaje en el fd-CAT2) o un sitio para SfiI (para el clonaje en el pHEN1). Los cebadores FABNOTFOK con VH1BACKAPA (o VH1BACKSFI15) se utilizaron para amplificar por PCR los genes que codifican para fragmentos Fab (construcción II), los cebadores FABNOTFOH con VH1BACKAPA (o VH1BACKSFI15) para las cadenas pesadas (construcción III), y los cebadores FABNOTFOK y MVKBAAPA (o MVKBASFI) para las cadenas ligeras (construcción IV).

La versión Fv de cadena sencilla NQ10.12.5 (construcción I) tiene los dominios variables de la cadena pesada (VH) y la cadena ligera (Vk) unidos por un engarce flexible (Gly_{4}Ser)_{3} (Huston, J.S. y col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883) y se construyó a partir de la construcción II mediante "ajuste por extensión de la zona solapada" ("splicing by overlap extensión") como en el ejemplo 14. Los genes ensamblados se reamplificaron con los cebadores VK3F2NOT y VH1BACKAPA (o VH1BACKSFI15) para añadir sitios de restricción para el clonaje en el fd-CAT2 ( ApaLI-NotI) o pHEN1 ( SfiI-NotI).

VH1BACKAPA: 5'-CAT GAC CAC AGT GCA CAG GT(C/G) (A/C)A(A/G) CTG CAG (C/G)AG TC(A/T) GG;

VH1BACKSFI15: 5'-CAT GCC ATG ACT CGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC C(C/G)A GGT (C/G)(A/C)A (A/G)CT GCA G(C/G)A GTC (A/T)GG;

FABNOTFOH: 5'-CCA CGA TTC TGC GGC CGC TGA AGA TTT GGG CTC AAC TTT CTT GTC GAC;

FABNOTFOK: 5'-CCA CGA TTC TGC GGC CGC TGA CTC TCC GCG GTT GAA GCT CTT TGT GAC;

MVKBAAPA: 5'-CAC AGT GCA CTC GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA;

MVKBASFI: 5'-CAT GAC CAC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA;

VK3F2NOT: 5'-TTC TGC GGC CGC CCG TTT CAG CTC GAG CTT GGT CCC.

Los sitios de restricción están subrayados.

Recuperación de las partículas fago y fagemido

Las construcciones I-IV (Figura 27) se introdujeron en ambos fd-CAT2 y pHEN1. El fago fd-CAT2 (y fd-CAT2-I, II, III o IV) se aisló del sobrenadante de células E. coli TG1 infectadas después de incubaras con agitación a 37ºC durante toda la noche en medio 2x TY con tetraciclina 12,5 mg/ml y se utilizó directamente para un ensayo ELISA. Se hizo crecer fagemido pHEN1 (y pHEN1-I y II) en E. coli TG1 (su Pe) durante toda la noche en 2 ml de medio 2x TY, ampicilina a 100 mg/ml y glucosa al 1% (sin la glucosa, la expresión del g3p impide la posterior superinfección por el fago auxiliar). Se utilizaron 10 ml del cultivo hecho crecer durante toda la noche para inocular 2 ml de medio 2x TY, ampicilina 100 mg/ml, glucosa al 1% y se agitaron a 37ºC durante 1 hora. Las células se lavaron y se resuspendieron en 2x TY, ampicilina 100 mg/ml y las partículas fagemido se recuperaron añadiendo 2 ml (10^{8} puf) del fago auxiliar VCSM13 (Estratagema). Después de dejarlas crecer por una hora, se añadió 4 ml de canamicina (25 mg/ml) y se dejo crecer el cultivo durante toda la noche. Las partículas fagemido se concentraron diez veces para un ensayo ELISA por precipitación con polietilenglicol.

ELISA

La detección de la unión del fago a 2-fenil-5-oxazolona (phOx) se realizó como en el ejemplo 9. Se tapizaron placas de 96 pocillos con 10 mg/ml de phOx-BSA o 10 mg/ml de BSA en PBS, durante toda la noche a temperatura ambiente y se saturaron con PBSS que contenía 2% de leche desnatada en polvo. Se añadió a los pocillos sobrenadante de los fagos (fagemido) (50 ml) mezclado con 50 ml de PBS que contenía 4% de leche desnatada en polvo y se realizó el ensayo. Para detectar la unión del scFv soluble o de los fragmentos Fab secretados por pHEN1, se detectó el péptido diana c-myc descrito por Munro y Pelham (1986) supra, con la utilización del anticuerpo monoclonal anti-myc 9E10 (Evan, G.I. y col., (1985) Mol. Cell Biol. 5: 3610-3616) seguido por la detección con peroxidasa conjugada a inmunoglobulina de cabra anti-ratón. Para más detalles ver el Ejemplo 8.

Las construcciones en el fdCAT2 y el pHEN1 expresan fragmentos de anticuerpos de la superficie del fago filamentoso. El vector fago, fd-CAT2 (Figura 8) se basa en el vector fd-tet (Zacher, A.N. y col., (1980) Gene 9: 127-140) y tiene los sitios de restricción (ApaLI y NotI) para el clonaje de genes de anticuerpos (o genes de otras proteínas) para su expresión como fusiones al N-terminal de la proteína de la cubierta del fago g3p. La transcripción de las fusiones anticuerpo-g3p en el fd-CAT2 es dirigida por el promotor del gen III y la proteína de fusión se dirige al periplasma mediante el líder g3p. Los fragmentos Fab y scFv de NQ10.12.5 clonados en el fd-CAT2 para su expresión se mostró que se unían a phOX-BSA (pero no a BSA) en un ensayo ELISA (Tabla 4). Se consideraba que los fagos se unían si la A_{405} de la muestra era al menos 10 veces mayor que el ruido de fondo en el ELISA.

El vector fagemido, pHEN1 (Fig. 23), se basa en pUC119 y contiene sitios de restricción (SfiI y NotI) para el clonaje de proteínas de fusión. Aquí la transcripción de las fusiones anticuerpo-g3p son dirigidas por el promotor inducible lacZ y la proteína de fusión se dirige al periplasma mediante el líder pelB. Se rescató el fagemido con el fago auxiliar VCSM13 en medio 2x TY que no contenía glucosa o IPTG: bajo estas condiciones hay suficiente expresión del anticuerpo-g3p. Se mostró que los fragmentos Fab y scFv de NQ10.12.5 clonados en pHEN1 para su presentación se unían a phOx-BSA (pero no a BSA) en un ensayo ELISA (Tabla 4) utilizando el mismo criterio que anteriormente.

Ejemplo 21 Inducción de fragmentos solubles scFv y Fab con la utilización del fagemido pHEN1

El estudio más a fondo de los anticuerpos que han sido expresados en la superficie de los fagos se facilitaría mucho si fuera sencillo cambiar a una expresión en solución.

E. coli HB2151 se infectó con el fagemido pHEN (pHEN1-I o II), y se sembró en placas de YTE, ampicilina a 100 mg/ml. Las colonias estuvieron con agitación a 37ºC en medio 2x TY, ampicilina a 100 mg/ml, glucosa al 1% hasta una OD_{550}=0,5 a 1,0. Las células se sedimentaron, se lavaron una vez con medio 2x TY, se resuspendieron en medio con 100 mg/ml de ampicilina, isopropil b-D-tiogalactosido (IPTG) 1 mM y se dejaron crecer 16 horas más. Las células se sedimentaron y el sobrenadante que contenía las cadenas secretadas se utilizó directamente en un ensayo ELISA.

El fagemido pHEN1 tiene la ventaja sobre el fago fd-CAT2, de que el anticuerpo puede producirse bien por la expresión del fago (mediante el crecimiento en cepas supE de E. coli) o como un fragmento soluble etiqueta (mediante el crecimiento en cepas no supresoras) como un péptido etiqueta (Ejemplo 19) y un codón ámbar introducido entre el anticuerpo y g3p. La secreción de los fragmentos solubles Fab de pHEN1-II o los fragmentos scFv de pHEN1-I se demostró después del crecimiento en E. coli HB2151y la inducción con IPTG con la utilización de transferencias Western (Figura 26). Para la detección de las proteínas secretadas se analizaron 10 ml del sobrenadante de los cultivos inducidos por SDS-PAGE y se transfirieron las proteínas por electrotransferencia a Immobilon-P (Millipore). Las cadenas pesadas y ligeras solubles se detectaron con antisuero policlonal de cabra anti-Fab humano (Sigma) y peroxidasa conjugada a inmunoglobulina de conejo anti-cabra (Sigma), cada una a una dilución de 1:1000. El dominio Vk etiquetado se detectó con el anticuerpo 9E10 (1:1000) y con peroxidasa conjugada a inmunoglobulinas de cabra anti-ratón (específica de Fc) (1:1000) (Sigma) o con un antisuero anti-CK humano marcado con peroxidasa (Dako). El 3,3'-diaminobenzidina (DAB; Sigma) se utilizó como substrato de la peroxidasa (Harlow, E. y col., (1988) supra). Con el scFv, los fragmentos se detectaron utilizando el anticuerpo etiqueta anti-myc 9E10 (no se muestran estos resultados). Con el Fab, sólo se detectó la cadena ligera con 9E10 (o anti-CK humano), como era de esperar, mientras que el antisuero anti-Fab humano detectó tanto la cadena pesada como la ligera. La unión de los fragmentos solubles scFv y Fab a phOx-BSA (pero no a BSA) también se demostró por ELISA (Tabla 4B). Por tanto, los fragmentos scFv y Fab se pueden expresar en fagos o ser secretados como fragmentos solubles a partir del mismo vector fagemido.

Ejemplo 22 Sensibilidad incrementada en ensayos ELISA de la lisozima al utilizar FDTscFvD1.3 como anticuerpo primario comparado con el scFvD1.3 soluble

En principio la utilización de anticuerpos fágicos debería permitir la realización de inmunoensayos más sensibles que con anticuerpos solubles. Los anticuerpos fágicos combinan la habilidad de unión a antígenos específicos con el potencial de amplificación a través de la presencia de copias múltiples (ca. 2800) de la proteína más importante de la cubierta (g8p) en cada virión. Esto permitiría la unión de diversas moléculas de anticuerpos dirigidas contra M13 a cada virión seguido por la unión de diversas moléculas IgG de anticuerpos anti-especies (anti-oveja en el caso posterior) conjugados a peroxidasa. Por tanto, por cada anticuerpo fágico unido al antígeno existe el potencial de unirse a diversas moléculas de peroxidasa mientras que cuando se utiliza un anticuerpo soluble como anticuerpo primario este tipo de amplificación no ocurre.

Se tapizaron placas ELISA con 200 ml de diluciones seriadas de factor 10 de lisozima de huevo de gallina (1000, 100, 10, 1, 0,1 y 0,01 mg/ml) en NaHCO_{3} 50 mM, pH 9,6 durante toda la noche, a temperatura ambiente. El ensayo ELISA se realizó como se ha descrito en el ejemplo 4 con la excepción de que (i) la incubación con el anticuerpo anti-lisozima fue bien con FDTscFvD1.3 (pAb; 10^{11} fagos por pocillo; 1,6 moles) o con scDvD1.3 soluble purificado por afinidad (18 mg por pocillo; 0,7 nmoles) (ii) la incubación con el segundo anticuerpo fue con suero anti-M13 de oveja diluido a 1/100 para las muestras FDTscFvD1.3 o con suero anti-scFvD1.3 de conejo diluido a 1/100 (de S. Ward) para las muestras del scFvD1.3 soluble. (iii) la inmunoglobulina de conejo anti-cabra conjugada con peroxidasa (Sigma; 1/5.000) se utilizó para las muestras de FDTscFvD1.3 y la inmunoglobulina de cabra anti-conejo conjugada con peroxidasa (Sigma; 1/5.000) se utilizó para las muestras de scFvD1.3 solubles. La absorbancia a 405 nm se cuantificó después de 15 h. Los resultados se muestran en las Figuras 30 y 31. En estas figuras las concentraciones de lisozima para el tapizado de las placas se muestran en una escala logarítmica de diluciones respecto de 1 mg/ml (por ejemplo log = -3 = 1 mg/ml; log = 2 = 0,01 mg/ml).

Se obtuvieron señales mayores con FDTscFvD1.3 para todas las concentraciones de lisozima (Fig. 28) pero la diferencia era muy marcada en las diluciones mayores, donde las cantidades de antígeno son más limitantes (Fig. 27 y 28). Esto sugiere que los anticuerpos fágicos podrían ser de particular importancia para ensayos tipo "sandwich" en los que la captura de pequeñas cantidades de antígeno por el anticuerpo primario genera una señal amplificada cuando se utilizan anticuerpos fágicos dirigidos contra un epítope diferente como el segundo anticuerpo de unión al
antígeno.

El principio es muy similar al descrito en el ejemplo 11. Consiste en el ensamblaje por PCR de anticuerpos de cadena sencilla a partir del cDNA preparado a partir de monoclonales de ratón. Como un ejemplo, la recuperación y expresión de dos anticuerpos de este tipo a partir de monoclonales que expresan anticuerpos en contra de la hormona esteroidea estriol se describe a continuación.

A. Preparación del RNA

El RNA se puede preparar con la utilización de diversos procedimientos bien conocidos para aquellos expertos en la materia. En este ejemplo, la utilización de Triton X-100 para la lisis y la inactivación de las RNasas con fenol/SDS dio resultados excelentes.

1. Las células monoclonales de ratón utilizadas en la presente invención se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en medio sin suero. A continuación, se centrifugaron y resuspendieron en tampón fosfato salino y después de una centrifugación final, se resuspendieron en agua estéril a 1 x 10^{7} células por ml. (Normalmente las células se lavarían en tampón PBS y se resuspendrían finalmente en tampón PBS, pero estas células en particular se nos suministraron congeladas en agua de la manera que se ha descrito).

2. Se añadieron a 750 ml de células 250 ml de tampón de lisis 2x enfriado en hielo (Tris-HCl 40 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 4 mM, NaCl 600 mM, VCR 40 mM (complejo veronil ribosil), triton X-100 al 2%). La suspensión se mezcló bien y se incubó en hielo durante 5 minutos.

3. Se centrifugó a 4ºC en unas microcentrífuga a 13000 rpm durante 5 minutos.

El sobrenadante se extrajo tres veces con fenol, tres veces más con fenol cloroformo y, finalmente, se precipitó con etanol del modo descrito en los materiales y procedimientos. El precipitado se resuspendió en 50 ml de agua.

4. La densidad óptica del RNA se cuantificó a 260 nm de una muestra de 2,5 ml en 1 ml de agua. El RNA se examinó por electroforesis de una muestra de 2 mg en un gel de agarosa al 1%. Con este procedimiento se obtuvieron concentraciones de RNA en el rango de 32 mg a 42 mg.

B. Preparación del cDNA

El procedimiento utilizado es el mismo que el descrito en el ejemplo 11. Se realizaron dos preparaciones de cDNA. Estas eran de RNA extraído de los monoclonales conocidos como líneas celulares 013 y 014 que ambas expresan anticuerpos contra una hormona esteroidea, el estriol.

C. PCRs primarias

El procedimiento utilizado es esencialmente el mismo que el descrito en el ejemplo 11. La región VH se amplificó con los cebadores VH1BACK y VH1FOR-2. Para la región Vkappa, se llevaron a cabo cuatro reacciones separadas utilizando el cebador VK2BACK con MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX o MJK5FONX. Las muestras (5 ml) se examinaron en un gel de agarosa al 1,5%. A partir de este gel se observó que para el cDNA preparado a partir de los dos monoclonales de estriol los cebadores VK2BACK y MJK1FONX daban la mejor amplificación de la región Vkappa. Las bandas VH y las bandas Vkappa amplificadas con VK2BACK/MJK1FONX para cada monoclonal se purificaron en geles de agarosa de bajo punto de fusión al 2%. Las bandas de DNA se cortaron del gel y se purificaron utilizando el equipo de Geneclean del modo descrito en el ejemplo 11.

D. Preparación del engarce

El procedimiento utilizado es esencialmente el mismo que el descrito en el ejemplo 11. En este caso, el DNA del engarce amplificado se purificó en un gel de agarosa al 2% y se recuperó del gel con el equipo "Mermaid" (BIO 101, Geneclean, La Jolla, San Diego, California, EE.UU.) utilizando las instrucciones de los fabricantes.

E. PCRs de ensamblaje

El procedimiento utilizado es esencialmente el mismo que el descrito en el ejemplo 11. En este caso, el producto ensamblado por PCR se purificó en un gel de agarosa al 2% y se recuperó del gel con un equipo "Mermaid".

F. Inserción de sitios de restricción y de digestión clave

El producto ensamblado se etiquetó con los sitios de restricción para ApaLI y NotI. Después, el DNA se digirió con ApaLI y NotI para conseguir los extremos cohesivos adecuados para el clonaje, y se purificó en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 2% y se extrajo utilizando un equipo Geneclean. El procedimiento utilizado es esencialmente el mismo que el descrito en el ejemplo 11.

G. Clonaje en el vector fd-CAT2

Un total de 15 mg de DNA del fd-CAT2 purificado por CsCl se digirió con 100 unidades de la enzima de restricción NotI (New England Biolabs) en un volumen total de 200 ml de tampón NotI NEB 1x con BSA acetilada NEB 1x durante 3 horas a 37ºC. Después, el vector se trató dos veces con 15 ml de Strataclean (una resina disponible comercialmente para eliminar proteínas), siguiendo las recomendaciones de los fabricantes (Stratagene, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, California, EE.UU.). El DNA se precipitó entonces con etanol y se redisolvió en tampón TE (Sambrook y col., (1989) supra). A continuación, se digirió el DNA con 100 unidades de la enzima de restricción ApaLI (New England Biolabs) en un volumen total de 200 ml de tampón NEB 4 1x durante toda la noche a 37ºC. El vector se purificó después con una columna Chroma Spin 1000 siguiendo las recomendaciones de los fabricantes (Clontech Laboratoires Inc, 4030 Fabian way, Palo Alto, California, EE.UU.). Este paso elimina el fragmento ApaLI/NotI para dar máxima eficiencia de ligación al vector digerido.

Las reacciones de ligación se llevaron acabo con 2,5-10 ng del inserto de DNA y 10 ng del vector en un volumen total de 10 ml de tampón ligasa NEB 1x con 1 ml de ligasa NEB (New England Biolabs) a 16ºC durante toda la noche (aproximadamente 16 horas).

H. Transformación y crecimiento

Se hicieron células competentes de E. coli de la cepa TG1 y se transformaron con el DNA recombinante del fdCAT2 tal como se describe en Sambrook y col., (1989) supra. Las células se sembraron en placas LBtet (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl, 15 g de bacto-agar por litro con tetraciclina a 15 mg/\mul que se añadió justo antes de verter el medio en las placas) y se dejaron crecer durante toda la noche.

Colonias únicas bien aisladas se inocularon en 10 ml de medio líquido LBtet (medio LB con tetraciclina a 15 mg/\mul) en tubos de 50 ml. Después de dejarlas crecer durante toda la noche a 35ºC/350 rpm. Las células se centrifugaron en una centrífuga de sobremesa y los sobrenadantes se transfirieron a tubos de centrífuga de 15 ml y se les añadió a cada uno 2 ml de PEG 8000 al 20%/NaCl 2,5 M. Después de incubarlos a temperatura ambiente durante 20-30 minutos, se precipitó el fago recombinante por centrifugación a 9000 rpm en un rotor Sorval SM24 durante 30 minutos. El sobrenadante con PEG se descartó. Cualquier resto de PEG se eliminó con una pipeta Pasteur después de una centrifugación breve (2 minutos). Este último paso se repitió para asegurar que no quedase nada de PEG. El precipitado del fago se resuspendió en 500 ml de tampón PBS. Se transfirió a un tubo de microcentrífuga y se centrifugó a 13000 rpm para eliminar las células que quedaran. El sobrenadante con los fagos se transfirió a un nuevo tubo.

I. Ensayo para la expresión del anticuerpo

Los bacteriofagos recombinantes fd se rastrearon por ensayo ELISA para la expresión del anticuerpo frente a estriol. Este procedimiento se ha descrito en el ejemplo 6. En este caso las siguientes alteraciones son relevantes.

1. Las placas de microtitulación se tapizaron durante toda la noche con estriol-6 carboximetiloxime-BSA a 40 mg/ml (Steraloids, 31 Radcliffe Road, Croydon, CRO 5QJ, England).

2. El primer anticuerpo era el anticuerpo fágico anti-estriol putativo. Se añadió a cada pocillo 50 ml de fagos en un volumen final de 200 ml de PBS estéril combinado con gelatina al 0,25%.

3. El segundo anticuerpo era de oveja anti-M13 a una dilución de 1:1000.

4. El tercer anticuerpo era una inmunoglobulina de conejo anti-cabra conjugada con peroxidasa.

Los recombinantes que expresan anticuerpos funcionales se detectaron por incubación con el substrato cromogénico 2'2' rinobis (ácido 3-etil benzotiazolina sulfónico). Los resultados se muestran en las Figuras 32 y 33.

Ejemplo 24 Construcción de un fago auxiliar deficiente en un gen III

Para comprender en su totalidad el potencial del sistema de clonaje en fagemidos, es conveniente el tener un fago auxiliar que carezca del gen III. La recuperación de las fusiones del gen III con dicho fago auxiliar resultaría en toda una progenie de fagemidos provistos de una fusión del gen III en su cápside, ya que no habría competición con la molécula de tipo salvaje.

Sería particularmente útil el tener un control sobre el número de moléculas de fusión contenidas en cada fago. Por ejemplo, un fago auxiliar deficiente en un gen III podría utilizarse para recuperar anticuerpos de baja afinidad a partir de un repertorio sencillo, en el cual seria necesaria una gran avidez para aislar aquellos fagos portadores de la especificidad del anticuerpo correcta. El fago auxiliar sin mutar puede utilizarse entonces cuando se construyen versiones de mayor afinidad, reduciendo por tanto componente de avidez, y permitiendo la selección sólo en base a la afinidad. Esta estrategia tendría un éxito sorprendente en el aislamiento y maduración por afinidad de los anticuerpos de genotecas sencillas.

Para construir el fago auxiliar se escogió la estrategia de delecionar parcialmente el gen III de M13KO7 con la utilización de exonucleasa Bal 31. Sin embargo, los fagos que no presentan la proteína del gen III no son infectivos por lo que se construyó una cepa de E. coli que expresase el gen III. El gen III de M13 tipo salvaje se amplificó por PCR con los cebadores gIIIFUFO y gIIIFUBA, exactamente como se describe en el ejemplo 19. El producto de PCR se digirió con EcoRI y HindIII y se insertó en el vector pUC19 digerido con EcoRI y HindIII (no es un fagemido ya que carece del origen de replicación del DNA de cadena sencilla del fago filamentoso) bajo el control del promotor lac. El plásmido se transformó en E. coli TG1, y a la cepa resultante se denominó TG1/pUC19gIII. Esta cepa proporciona la proteína gIII en trans al fago auxiliar.

Existe un único sitio de restricción para BamHI en M13KO7, que está aproximadamente en el centro de gIII. Se preparó DNA de doble cadena de M13KO7 por lisis alcalina y centrifugación en Cloruro de Cesio (Sambrook y col., (1989) supra); se digirieron 20 mg de DNA con BamHI, se extrajo el DNA con fenol y se precipitó con etanol, se resuspendió entonces en 50 ml de tampón Bal 31 (NaCl 600 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, CaCl_{2} 12 mM, MgCl_{2} 12 mM y EDTA 1 mM) y se digirió durante 4 minutos con una unidad de Bal 31 (New England Biolabs). Este tratamiento eliminó aproximadamente 1Kb de DNA. Se añadió EGTA a una concentración de 20 mM y la reacción se extrajo con fenol y se precipitó con etanol antes de purificar el genoma truncado en un gel de agarosa. El DNA se reparó con la enzima Klenow y se ligó consigo mismo con T4 DNA ligasa (New England Biolabs).

Se transformaron alicuotas de la ligación en células competentes TG1/pUC19gIII y se sembraron en placas con medio SOB que contenía ampicilina a 100 mg/ml y canamicina a 50 mg/ml. Las colonias se rastrearon por PCR para la presencia de la deleción con los cebadores gIIIFUBA y KSJ12 (CGGAATACCCAAAAGAACTGG).

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El cebador KSJ12 se aparea al gen VI que se encuentra inmediatamente cadena abajo del gIII en el genoma del fago, por lo tanto distinguiendo el gIII del fago auxiliar del residente en el plásmido. Tres clones dieron productos de PCR truncados que correspondían a las deleciones de aproximadamente 200, 400 y 800 pb. Estos clones se denominaron M13KO7gIII D números 1, 2 y 3, respectivamente. No se aisló ningún clon de los anteriores estudios a diferentes tiempos con Bal 31, lo que sugiere que estos son de alguna manera letales para la célula huésped. Se aislaron diversos clones de estudios a tiempos posteriores, pero ninguno dio lugar a un producto de PCR, lo que indicaría que la reacción de deleción se había prolongado demasiado.

Se cultivaron M13KO7gIII D n^{os} 1, 2 y 3 y el fago auxiliar resultante se analizó mediante ELISA por su habilidad para recuperar una fusión anticuerpo gIII (scFv D1.3), exactamente tal como se ha descrito en el ejemplo 13. Como se muestra en la Figura 31, sólo un clon, M13KO7gIII D nº 3 se encontró que recuperaba el anticuerpo correctamente; de hecho, la señal cuando se utilizaba este fago auxiliar era mayor que la observada con el M13KO7 original. Los fagemidos recuperados por M13KO7gIII D nº 3 deberían tener una mayor densidad de fusiones de anticuerpos en sus superficies. Que este era el caso se demostró cuando los fagos utilizados en este ELISA se analizaron por transferencia de Western con antisuero anti-proteína gIII (Fig. 32). Este análisis permite la estimación de la cantidad de proteína de fusión gIII frente a la proteína gIII libre presente en las partículas fago (fagemidos).

Sólo una pequeña fracción de la proteína gIII en el material recuperado por M13KO7 está presente como una fusión intacta (Fig. 32). La banda de la proteína de fusión se induce por IPTG, por tanto es indiscutiblemente la que sintetiza el fagemido. Como es de esperar, incluso cuando el promotor lac que dirige la síntesis de la proteína de fusión gIII está totalmente inducido (IPTG 100 mM), la proteína gIII de tipo salvaje, que se encuentra en bajo número de copias y su síntesis está dirigida por un promotor más débil, predomina. Esto contrasta con el patrón generado por el mismo clon recuperado con M13KO7gIII D nº 3 y el patrón generado por el fd CAT2-scFv D1.3. En estos dos últimos casos, no hay competición con la proteína gIII de tipo salvaje y la banda de la proteína de fusión es correspondientemente más fuerte.

Vale la pena destacar que la construcción M13KO7gIII D nº 3 fue muy ineficiente: un clon de 20 mg de DNA en el inicio. Además, el rendimiento del fago auxiliar gIII de cultivos realizados durante toda la noche es extremadamente bajo de aproximadamente. 10^{6} cfu/ml comparado con aproximadamente 10^{11} cfu/ml del fago original. A pesar de esto, el M13KO7 gIII D nº 3 recupera el fagemido tan bien como el fago original, si se juzga por el número de partículas fagemidos producidas después de dejar crecer durante toda la noche. Esto indica que la replicación en trans y las funciones de empaquetamiento del fago auxiliar están intactas y sugiere que su propia replicación es defectiva. Podría ser que la inactivación de gIII sea normalmente tóxica para la célula huésped, y que M13KO7gIII D nº 3 se aislara debido a una mutación compensadora que afectaría, por ejemplo, a la replicación. El fago fd-tet es inusual en el hecho que tolera mutaciones en genes estructurales que son normalmente letales para la célula huésped, ya que tiene un defecto en la replicación que retarda la acumulación de productos tóxicos del fago; M13KO7gIII D nº 3 podría tener el mismo defecto.

El M13KO7gIII D nº 3 se depositó en la National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London, NW9 6HT, GB (nº de acceso NCTC 12478), el 28 de Junio de 1991, de acuerdo con las regulaciones del Tratado de Budapest. Contiene una deleción del genoma de M13 de las bases 1979 a la 2768 ambas incluidas (ver Van Wezenbeek, P.G.M.F. y col., (1980) Gene II p129-148 para la secuencia del genoma de M13).

Ejemplo 25 Selección de bacteriófagos que expresan fragmentos scFv dirigidos contra la lisozima a partir de mezclas en función de su afinidad utilizando un procedimiento para mejorar el rendimiento (panning)

Para el aislamiento de un anticuerpo con una afinidad deseada alta, es necesario ser capaz de seleccionar un anticuerpo con una afinidad sólo unas pocas veces más elevada que el resto de la población. Esto será de particular importancia cuando se haya aislado un anticuerpo con afinidad insuficiente, por ejemplo, a partir de un repertorio derivado de un animal inmunizado, y se utilice mutagénesis aleatoria para preparar derivados con una afinidad potencialmente incrementada. En este ejemplo, las mezclas de fagos que expresaban anticuerpos con afinidades diferentes en contra de la lisozima de huevo de gallina se sometieron a un procedimiento para mejorar el rendimiento. Se demostró que los anticuerpos fágicos ofrecían la habilidad de seleccionar para un anticuerpo con una K_{d} de 2 nM en contra de uno con una K_{d} de 13 nM.

Los oligonucleótidos que se utilizaron en este ejemplo se muestran en la siguiente lista:

Oligonucleótidos

5

Los fagos que expresaban fragmentos scFv dirigidos contra la lisozima derivaban de fragmentos Fab clonados en plásmidos.

Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras se amplificaron por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de plásmidos que contenían insertos VH-CH1 o VK-CK humanos idóneos para la producción de fragmentos Fab (cedidos por J. Foote). La constante de disociación, Kd para las diferentes combinaciones de los dos plásmidos combinados como Fabs, se muestran a continuación:

Plásmido de la Cadena Pesada	Plásmido de la Cadena Ligera	Kd
HuH-1	HuK-3	52 nM
HuH-1	HuK-4	180 nM
HuH-2	HuK-3	13 nM
HuH-2	HuK-4	(no se determinó)

PCR Primaria

La PCR primaria de las regiones variables se realizó combinando los siguientes reactivos:

: 36,5 \mul de H_{2}O

: 5 \mul de tampón PCR (10 x)

: 2 \mul de dNTPs 5 mM

: 2,5 \mul del cebador 3' (10 pmoles/ml) (VHBHD13APA o VKBHD13)

: 2,5 \mul del cebador 5' (10 pmoles/ml) (VHFHD13 o VKFHD13NOT)

La reacción se descontaminó por radiación UV durante 5 minutos para destruir el DNA foráneo y se añadió 1 ml de DNA plasmídico (0,1 mg/ml). La mezcla de PCR se cubrió con dos gotas de aceite de parafina, y se colocó en el bloque del PCR durante 5 minutos a 94ºC antes de añadirle 0,5 ml de Taq DNA polimerasa bajo la parafina. Las condiciones de amplificación utilizadas fueron 1 min a 94ºC, 1 min a 40ºC, 1,5 min a 72ºC, 17 ciclos.

El engarce (Gly_{4}-Ser)_{3} se amplificó a partir del anti-pHOx (2-feniloxazol-5-ona) clon fd-CAT2-scFv NQ11, con la utilización de los oligos HD13BLIN y HD13FLIN3, con 0,1 mg de DNA plasmídico. El programa de amplificación de la PCR utilizado fue 94ºC 1 min, 25ºC 1,5 min, durante 17 ciclos.

El DNA amplificado se purificó por electroforesis de las muestras en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 2% a 90 mA, se cortaron las bandas apropiadas y se extrajo el DNA con un equipo Geneclean II (BIO 101 Inc.) para VH y VK, o mediante la utilización de unidades de filtro Spin-X (Costar) para el engarce. Se utilizó un volumen final de 10 ml para resuspender el DNA extraído.

PCR de ensamblaje

El ensamblaje de las construcciones de las cuatro cadenas sencillas Fv de humano D1.3 (scFv HuD1.3) se realizó por el proceso de "ensamblaje por extensión de la zona solapada" del Ejemplo 11.

Se combinaron los siguientes reactivos:

: 34,5 \mul de H_{2}O

: 5 \mul de tampón PCR (10 x)

: 2 \mul dNTPs 5 mM

: 2,5 \mul del cebador 3' (10 pmoles/ml) (VHBHD13APA)

: 2,5 \mul del cebador 5' (10 pmoles/ml) (VKFHD13NOT)

Una vez más la reacción se descontaminó con un tratamiento de UV durante 5 minutos justo antes de la adición de 1 ml de los productos de la PCR primaria; VH-1 o VH-2, VK-3 o VK-4, más el DNA de engarce. La reacción se cubrió con dos gotas de parafina, y se calentó a 94ºC5 minutos antes de añadir 0,5 ml de Taq polimerasa. Las condiciones de amplificación de la PCR que se utilizaron fueron 1 min a 94ºC, 1,5 min a 60ºC, 2,5 min a 72ºC, durante 20
ciclos.

La fase acuosa debajo de la parafina se extrajo una vez con fenol, una vez con fenol:cloroformo, y una vez con éter, se precipitó con etanol, y se resuspendió en 36 ml de agua. A estos se le añadió, 5 ml de tampón 10 x para NotI, 5 ml de BSA a 1 mg/ml, y 4 ml (40u) de NotI (New England Biolabs). La digestión se incubó a 37ºC durante toda la noche.

El DNA se precipitó con etanol y se resuspendió en 36 ml de agua, y se le añadió 5 ml de tampón 4 NEB 10 x, 5 ml de BSA a 1 mg/ml, y 2 ml (40 u) de ApaLI (New England Biolabs). Esto se incubó a 37ºC durante 5 horas; se le añadieron 2 ml más de ApaLI y se incubó la reacción a 37ºC durante toda la noche.

El DNA digerido se extrajo por purificación en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,3% seguido de un tratamiento con Geneclean, para producir el inserto de DNA para su clonaje.

El vector fd CAT2 (preparado y digerido con ApaLI y NotI como en el ejemplo 15) y el DNA scFv se ligaron como en el ejemplo 15.

Análisis de los clones

Primero se rastrearon las colonias procedentes de la ligaciones para determinar la presencia de insertos por rastreo con PCR. La mezcla de PCR se preparó en cantidad suficiente mediante la combinación por colonia rastreada de 14,8 ml de tampón PCR 1x, 1 ml dNTP (5 mM), 1 ml del cebador 3' (FDPCRBAK), 1 ml del cebador 5' (FDPCRFOR), y 0,2 ml Taq polimerasa. Se colocaron alícuotas de 20 ml de esta mezcla de PCR en una placa Techne de 96 pocillos. Con un palillo se tocó la parte superior de una colonia y se agitó rápidamente en la mezcla de PCR y se recuperó la colonia al colocar el mismo palillo en una placa Cellwell (Nunc) que contenía 250 ml de medio 2x TY. La mezcla de PCR se cubrió con una gota de parafina y la placa se colocó en un bloque durante 10 minutos a 94ºC antes de empezar la amplificación de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC, 2,5 minutos a 72ºC.

Los clones que se obtuvieron de esta manera se nombraron como se indica a continuación. La afinidad de los fragmentos scFv derivados de los fragmentos Fab no se determinó pero resultados anteriores sugieren que las afinidades son muy parecidas aunque no son necesariamente idénticas (Bird, R.E. y Walker, B.W. (1991) TIBTECH 9: 132-137).

Nombre de la Construcción	Composición	Afinidad del Fab (Kd)
TPB1	VH-HuH2-(Gly_{4}-Ser)_{3}-VK-HuK3	13 nM
TPB2	VH-HuH1-(Gly_{4}-Ser)_{3}-VK-HuK4	180 nM
TPB3	VH-HuH2-(Gly_{4}-Ser)_{3}-VK-HuK4	(desconocida)
TPB4	VH-HuH1-(Gly_{4}-Ser)_{3}-VK-HuK3	52 nM

La preparación de fagos y el ensayo ELISA se ha descrito en el ejemplo 6. Tal como se esperaba, se mostró que los clones generados en fd CAT2 se unían a lisozima.

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Selección de la afinidad Selección de fagos con la mayor afinidad de unión

Se realizaron experimentos de mezcla en los que fagos fd-CAT2 scFvD1.3 (Ejemplo 14) se mezclaron bien con fd-CAT2 TPB1, con fd-CAT2 TPB2, o con fd-CAT2 TKPB4 y se sometieron a una ronda de mejora del rendimiento.

El procedimiento general utilizado para la selección de la afinidad por la mejora del rendimiento se detalla a continuación. Cualquier modificación de este protocolo se describe en el momento apropiado. Las placas donde se realizaba la mejora del rendimiento se colocaron en una plataforma de agitación por balanceo entre manipulaciones.

Las placas de cultivo de tejidos Falcon de 35 mm se tapizaron durante toda la noche con 1 ml de lisozima (a diversas concentraciones) disuelta en sodio hidrógeno carbonato 50 mM, pH 9,6 y se saturaron con 2 ml de MPBS al 2% a temperatura ambiente durante 2 horas. Los fagos se prepararon en 1 ml de MPBS al 2% y se agitaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavaron durante 5 minutos con 2 ml de las siguientes soluciones; 5 veces con PBS, PBS-Tween, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; cloruro sódico 500 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,5; cloruro sódico 500 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 9,5; cloruro sódico 500 mM, sodio hidrógeno carbonato 50 mM, pH 9,6; cloruro sódico 500 mM. Los fagos se eluyeron mediante la adición de 1 ml de trietilamina 100 mM y agitación durante 5 minutos antes de retirar el eluido que se neutralizó con 100 ml de Tris-HCl 1,0 M, pH 7,4.

Las placas se tapizaron con lisozima durante toda la noche a las concentraciones que se indican posteriormente.

Las colonias procedentes de la única ronda de mejora del rendimiento se hibridaron bien con MURDSEQ (para el fdCAT2 scFvD1.3) o bien con HUMD12SEQ (para las construcciones fdCAT2 TPB).

Se marcaron círculos de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell, BA 85, 0,45 mm) con un lápiz y se colocaron con cuidado sobre las colonias derivadas de los experimentos de mejora del rendimiento y se dejaron durante un minuto. Se retiraron las membranas con rapidez estirando de uno de los extremos y se situaron con el lado de las colonias hacia arriba sobre un papel 3 MM (Whatman) empapado en solución desnaturalizante (Hidróxido sódico 500 mM; Cloruro sódico 1,5 M) durante 5 minutos. Después se transfirieron a un papel 3 MM empapado en solución neutralizante (Cloruro sódico 3,0 M; Tris-HCl 500 mM, pH 7,5) durante 1 minuto, y después a un papel 3 MM empapado en SSC 5x; Acetato amónico 250 mM durante 1 minuto. Las membranas se secaron al aire antes de colocarlos en un horno con vacío a 80ºC durante 30 minutos.

La sonda oligonucleotídica se preparó combinando los siguientes reactivos:

: 2 \mul del oligonucleótido (1 pmol/ml)

: 2 \mul de g-^{32}P ATP (300 Ci/mmol) (Amersham International plc)

: 2 \mul de tampón quinasa 10 x (Tris-HCl 0,5 M, ph 7,5; Cloruro magnésico 100 mM; DTT 10 mM)

: 12 \mul de agua

: 2 \mul de polinucleótido quinasa (20 unidades)

Esta mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora.

La hibridación se realizó en un horno de hibridación Techne HB-1. Las membranas después de su tratamiento en el horno se hibridaron previamente a 37ºC en 40 ml de tampón de hibridación (10 ml de Pirofosfato sódico 100 mM; 180 ml de Cloruro sódico 5,0 M; 20 ml de Solución Denhart 50x; 90 ml de Tris-HCl 1,0 M, pH 7,5; 24 ml de EDTA 250 mM; 50 ml de NP40 al 10%; ajustado a 1 litro con agua; 60,3 mg de rATP; 200 mg de RNA de levadura (Sigma)) durante 15 minutos antes de añadir 20 ml del oligonucleótido tratado con la quinasa. Se incubaron las membranas a 37ºC durante al menos una hora, y se lavaron entonces 3 veces con 50 ml de SSC 6x a 37ºC durante 10 minutos (lavado de baja estrictez). Las membranas se secaron al aire, se cubrieron con film de plástico y se expusieron durante toda la noche con película Kodak X-AR.

Selección del fd-CAT2 scFv D1.3 a partir del fd-CAT2 TPB4

La Figura 33 resume los resultados de los experimentos de mejora del rendimiento cuando se utiliza una mezcla de fagos de alta afinidad fd-CAT2 scFv D1.3 (Kd-2 nM) y la construcción del fd-CAT2 TPB4 (Kd 52 nM).

Con un tapizado de lisozima a una concentración de 3000 mg/ml, no se obtuvo enriquecimiento o muy poco. Sin embargo, fue posible conseguir enriquecimiento para el fago scFv D1.3 cuando se utilizó una concentración más baja de lisozima para tapizar las placas. El mejor valor de enriquecimiento obtenido fue del 1,5% del fd-CAT2 scFV D1.3 en la mezcla de inicio, al 33% del fdCAT2 scFv D1.3 en la fracción eluida, en una placa tapizada durante toda la noche con 30 mg/ml de lisozima.

Selección del fd-CAT2 scFv D1.3 a partir del fd-CAT2 TPB1

Sólo se mostró enriquecimiento para fagos de alta afinidad scFv D1.3 a partir del fago fd-CAT2 TPB1 (Kd-13 nM) en experimentos en los que las placas se habían tapizado durante toda la noche con concentraciones bajas de lisozima, tal como se muestra en la Figura 34.

En resumen, se construyeron en el fago fd-CAT2 versiones Fv de cadena sencilla de una serie de anticuerpos D1.3 humanos. Mediante la selección de la afinidad de mezclas de fagos fd-CAT2, mediante el procedimiento de mejora del rendimiento en placas de Petri pequeñas, se ha demostrado que el fago scFv D1.3 de alta afinidad se puede seleccionar preferencialmente de un grupo de fagos scFv HuD1.3 de menor afinidad.

Ejemplo 26 Generación y selección de mutantes de un anticuerpo anti-ácido 4-hidroxi-3-ácido nitrofenilacético (NP) expresado en fagos mediante la utilización de cepas mutadoras

En algunos casos sería deseable incrementar la diversidad de un grupo de genes clonados en un fago, por ejemplo un grupo de genes de anticuerpos, o producir un gran número de variantes de un sólo gen clonado. Hay muchos procedimientos apropiados de mutagénesis in vitro. Sin embargo, un procedimiento atractivo, particularmente para conseguir una población más diversa de una genoteca de genes de anticuerpos, es utilizar cepas mutadoras. Este procedimiento tiene la ventaja de generar un número muy grande de mutantes, esencialmente sólo limitado por el número de fagos que se pueden manejar. El sistema de expresión en fagos permite aprovechar completamente la ventaja de este número muy grande de mutantes para poder aislar clones mejorados o alterados.

Las secuencias nucleotídicas que codificaban para un fragmento de anticuerpo scFv dirigido contra el 4-hidroxi-3-ácido nitrofenilacético (NP), scFvB18, derivado como en el ejemplo 11 a partir de un anticuerpo monoclonal contra NP en el fdCAT2 se clonaron con la utilización de los sitios de restricción ApaLI y NotI como en el ejemplo 11 para crear el fdCAT2scFvB18 o en el fdDOGKan (fdCAT2 con su gen de resistencia a la tetraciclina eliminado y reemplazado por un gen de resistencia a la canamicina), con la utilización de los sitios de restricción PstI y NotI para crear el fdDOGKanscFvB18, o en el vector fagemido pHEN1 con la utilización de los sitios de restricción SfiI y NotI como una proteína de fusión con el gen III para crear pHEN1scFvB18.

Se utilizaron las siguientes cepas mutadoras (Schaaper, R.M. y R.L. Dunn (1987) J. Mol. Biol. 262: 1627-16270; Schaaper, R.M. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8126-8130):

NR9232: ara, thi, mutD5-zaf13::Tn10, prolac, F' prolac

NR9670: ara, thi, azi, mutT1, leu::Tn10, prolac

NR9292: ara, thi, mutH101, prolac, F' prolac

NR9084: ara, thi, mutT1, azi, prolac, F' prolac I^{-}Z^{-}DM15 M15

NR9046: ara, thi, supE, rif, na1A, metB, argE(am), prolac, F' prolac

que fueron cedidas amablemente por el Dr. R.M. Schaaper (Department of Health and Human Services, N1H, P.O. Box 12233, Research Triangle Park, N.C. 27709)

NR9046mutD5: NR9046 mutD5::Tn10

NR9046mutT1: NR9046 mutT1::Tn10

que se construyeron por transducción de P1 siguiendo los procedimientos estándar. Las cepas mutadoras se transfectaron con el fdCAT2scFvB18 del fdDOGKanscFvB18 y los transfectantes se seleccionaron por la resistencia a antibióticos. Los transfectantes se dejaron crecer durante 24 horas a 37ºC antes de recolectar los fagos mutantes por precipitación con PEG. Los fagos mutantes se seleccionaron en una columna de afinidad de 1 ml de sefarosa-BSA-NIP (4-hidroxi-3-yodo-5-ácido nitrofenilacético) (preparada según las recomendaciones de los fabricantes), lavada previamente con 200 ml de PBS y saturada con 20 ml de MPBS. Los fagos se cargaron en la columna en 10 ml de MPBS y el material que no se había unido se volvió a cargar para asegurar una unión completa. La columna se lavó consecutivamente con 10 ml de MPBS y 500 ml de PBS. Los fagos unidos a la columna de afinidad se eluyeron con 5 volúmenes de columna de NIP-Cap 0,33 mM (Ejemplo 33).

El eluido de fagos se incubó entre 30 min y 1 hora con cepas E. coli en fase logarítmica (2 x 10^{8} células/ml) sin seleccionar para el antibiótico. Las células infectadas se diluyeron después a 1:100 con 2x TY y se dejaron crecer durante 24 horas con selección para antibiótico (15 mg/ml de tetraciclina o 30 mg/ml de canamicina para el fdCAT2scFvB18 o el fdDOGKanscFvB18, respectivamente). Los fagos de este cultivo se utilizaron para otra ronda de selección por afinidad y mutación.

La unión de los anticuerpos fágicos se ensayó por ELISA como en el ejemplo 8 con la excepción de que las placas de ELISA se tapizaron con NIP-BSA (4-hidroxi-3-yodo-5 nitrofenilacetil-BSA; 0,4 mg/ml). Los sobrenadantes de los cultivos se prepararon tras dejarlas crecer en los pocillos de la placa (cell wells) tal como se describió en el ejemplo 16 y 20 ml del sobrenadante del cultivo se añadieron a cada pocillo diluidos a 200 ml con MPBS.

Las muestras de fagos que daban señales en el ensayo ELISA de más de dos veces el ruido de fondo se analizaron con un ensayo ELISA para determinar la unión inespecífica frente a la lisozima, BSA o Ox-BSA como ha sido explicado anteriormente (Ejemplo 9). La especificidad para el NIP se volvió a confirmar con un ensayo ELISA en el cual se añadieron diluciones seriadas de NIP-CAP juntamente con anticuerpos fágicos. La adición de concentraciones en incremento de NIP-CAP reducía la señal del ensayo ELISA al nivel del ruido de fondo.

Los fagos que daban señales positivas en el ensayo ELISA se secuenciaron y dos mutantes diferentes se subclonaron en el fagemido pHEN1 y se transformaron en HB2151 para su expresión en medio soluble y en TG1 para su expresión en fagos (Ejemplo 21).

Para la expresión de fragmentos scFv solubles, se hicieron crecer transformantes en E. coli HB2151 a 37ºC en 1 litro de 2x TY, glucosa al 0,2% y ampicilina al 0,1 mg/ml hasta una OD600 de 1 y la expresión de los fragmentos scFv solubles se indujo al añadir IPTG a 1 mM. Los cultivos se agitaron a 30ºC durante 16 horas.

El scFvB18 soluble se concentró a partir del sobrenadante de las bacterias sin procesar en una unidad de ultrafiltración FLOWGEN a un volumen de 200 ml.

El concentrado se pasó dos veces por una columna de sefarosa-BSA-NIP de 2 ml lavada previamente con 200 ml de PBS. La columna se lavó con 500 ml de PBS y 200 ml de Tris 0,1 M, pH 5,7, NaCl 0,5 M y los anticuerpos fágicos se eluyeron con tampón citrato 50 mM, pH 2,3. El eluido se neutralizó inmediatamente con Tris 1 M, pH 8. El eluido se dializó frente dos cambios de 1 litro de PBS, EDTA 0,2 mM. La proteína precipitada se eliminó por centrifugación a 10.000 g y el rendimiento de proteína se determinó al medir la absorbancia del sobrenadante a 280 nm.

Después de 4 rondas de mutación y selección, los clones aislados se rastrearon y en uno o dos ejemplos raros se obtuvieron señales positivas muy fuertes en el ensayo ELISA de anticuerpos fágicos derivados de la mutación de cada fdCAT2scFvB18 y fdDOGKanscFvB18 en el ELISA. Las condiciones del ensayo ELISA eran tales que el fago parental fdCAT2scFvB18 sólo generaba señales débiles. Estos anticuerpos fágicos que daban señales positivas muy fuertes en el ensayo ELISA se enriquecieron en sucesivas rondas en un factor de aproximadamente 2,5 por ronda. Cuarenta anticuerpos fágicos que daban señales positivas muy fuertes se secuenciaron y cada uno de ellos expresaba mutaciones únicas en seis posiciones diferentes de la secuencia nucleotídica del scFvB18, cinco de las cuales residían en la cadena ligera. Más del 70% de las mutaciones ocurrieron en las posiciones 724 y 725 cambiándose la primera glicina del segmento J de la cadena ligera (armazón 4) a serina (en 21 de los casos) o a aspartato (en 3 casos). Las mutaciones que se encontraron se muestran en la Tabla 5. La secuencia del scFvB18 se muestra en la Figura 37.

Las secuencias nucleotídicas que codificaban para los fragmentos scFv de un armazón mutante con la mutación de glicina a serina de la que se ha hablado con anterioridad, así como de un mutante donde la Tyr en el CDR3 de la cadena ligera había mutado a aspartato, se amplificaron por PCR a partir de los clones de anticuerpos fágicos y se subclonaron en el fagemido pHEN1 (esencialmente como en el ejemplo 20). Esto evita posibles problemas con mutaciones del gen III causadas por las cepas mutadoras. El mismo patrón de señales de ELISA se observó cuando los mutantes se expresaban en fagos después de la recuperación del fagemido con el fago auxiliar (tal como se ha descrito en el ejemplo 20) o cuando se ensayaban los mutantes cuando eran expresados a partir del genoma del fago como se ha explicado con anterioridad.

Los fragmentos scFv del scFvB18 y los fragmentos scFv que contenían las mutaciones de glicina a serina y de tirosina a aspartato, respectivamente, se expresaron en solución (después de su transformación en E. coli HB2151 tal como en el ejemplo 21) a 30ºC. Estos no mostraron diferencias en las señales del ensayo ELISA entre el tipo salvaje B18 y el armazón mutante. La señal que se obtuvo del anticuerpo fágico con la Tyr mutada a aspartato en el CDR3 del scFvB18 era aproximadamente 10 veces más fuerte. Se encontró que los rendimientos de expresión eran comparables si se juzgaba por los resultados obtenidos en transferencia de Western al utilizarse un antisuero producido en contra de g3p (tal como se ha descrito con anterioridad). Las medidas de la afinidad por la extinción de la fluorescencia (quenching) se realizaron tal como se ha descrito en el ejemplo 18. Sin embargo las medidas de la afinidad de los fragmentos scFv purificados por afinidad mostraron que todos los mutantes scFvB18 y el scFvB18 (Gly®Ser) y el scFvB18 (Tyr®Asp) tienen afinidades comparables por NIP-CAP de 20 nM.

Una transferencia de Western utilizando un anticuerpo anti-gen III mostró que el armazón mutante había sufrido significativamente menos digestión proteolítica que scFvB18.

Por lo tanto, la utilización de cepas mutadoras genera un rango diverso de mutantes de anticuerpos fágicos cuando se utilizan como huéspedes para clones de fusiones del gen III. En este caso algunos de los clones exhiben señales de ensayo ELISA más elevadas probablemente debidas a una estabilidad incrementada contra el ataque proteolítico. Las cepas mutadoras se pueden utilizar por tanto para introducir diversidad en un clon o en una población de clones. Esta diversidad debería generar clones con características deseadas como una mayor afinidad o especificidad. Dichos clones podrían seleccionarse después de la expresión de las proteínas en el fago.

Ejemplo 27 Una técnica basada en la PCR para el clonaje de construcciones scFv humanas en un solo paso

El ensamblaje del scFv humano es similar a los ensamblajes de los scFvs de ratón descritos en el ejemplo 11. Para desarrollar el clonaje de genes V humanos por PCR fue necesario diseñar un nuevo grupo de cebadores oligonucleotídicos específicos para humanos (Tabla 6). El ensamblaje de los scFv humanos es esencialmente el mismo que la extracción de los Fab humanos pero requiere un grupo de cebadores 5' complementarios a los segmentos J de los genes lambda VH, VK y V. (Se utilizaron cebadores 5' para los Fabs complementarios a la región constante). Los cebadores específicos del segmento J se diseñaron basándose en las secuencias de lambda JH, JK y J publicadas (Kabat, E.A. y col., (1987) Sequences of Proteins of Inmunological Interest. 4ª Edición. U.S Department of Health and Human Services).

Además, se necesita un engarce diferente para los scFvs que para los Fabs por lo que para los scFvs humanos se necesitó un nuevo grupo de cebadores para preparar el engarce. Se sintetizaron cebadores complementarios a los cebadores 5' JH y a los cebadores 3' lambda VK y V para permitir la generación de un engarce de DNA por amplificación por PCR de un plásmido molde que contenía el engarce scFv (Tabla 6, Fig. 38). Los cebadores se extendieron dentro de la secuencia actual del engarce para asegurar una amplificación adecuada. Utilizando estos cebadores para preparar el engarce de DNA del scFv, se realizaron 52 reacciones separadas de la PCR utilizando de cada uno de los 4 cebadores JH inversos en combinación con cada uno de los 13 oligonucleótidos inversos lambda VK y V. Como molde se utilizó aproximadamente 1 ng del pSW2scD1.3 (Ward, E.S. (1989) supra) que contenía el péptido corto (Gly_{4}Ser)_{3} (Huston, J.S. y col., (1989) Gene 77: 61).

Un ejemplo específico de ensamblaje por PCR de una genoteca de scFv humano

Este ejemplo describe la generación de una genoteca de scFv humano construida a partir de un humano no inmunizado:

Se obtuvieron 500 ml de sangre que contenían aproximadamente 10^{8} células B, de un donante de sangre voluntario en buen estado de salud. Los glóbulos blancos se prepararon en Ficoll y se preparó el RNA tal como se ha descrito en el ejemplo 11.

Se utilizó para la preparación del cDNA un veinte por ciento del RNA, que contenía el material genético de aproximadamente 2 x 10^{7} células B. Las cadenas pesadas que se originaron a partir de los anticuerpos IgG e IgM se mantuvieron separadas mediante la iniciación de la síntesis del cDNA bien con un cebador específico de IgG (HuIgG1-4CH1FOR) o bien con un cebador específico de IgM (HuIgMFOR). Se utilizaron alícuotas del cDNA para generar cuatro genotecas de scFv separadas (IgG-K, IgG-lambda, IgM-K y IgM-lambda). Las genotecas resultantes se purificaron en agarosa al 1,5%, se electroeluyeron y se precipitaron con etanol. Las genotecas K y lambda se combinaron para el clonaje posterior, dando lugar a genotecas de IgG y de IgM separadas.

Clonaje de la genoteca

Los fragmentos scFv purificados (1-4 mg) se digirieron con las enzimas de restricción NotI y bien SfiI o NcoI. Después de la digestión, los fragmentos se extrajeron con fenol/cloroformo, y se precipitaron con etanol. Los fragmentos digeridos se ligaron al DNA de pHEN1 (6 mg) purificado por electroforesis en gel de agarosa (ver ejemplo 19) digerido bien con SfiI-NotI o con NcoI-NotI en 100 ml de una mezcla de ligación con 2.000 U de T4 DNA ligasa (New England Biolabs) durante toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla de ligación se purificó por extracción con fenol y se precipitó con etanol. El DNA ligado se resuspendió en 10 ml de agua, y muestras de 2,5 ml se electroporaron en E. coli TG1 (50 ml). Las células se dejaron crecer en 1 ml de SOC durante 1 hora y se sembraron en placas de 243 x 243 mm (Nunc.) de medio 2x TY con ampicilina a 100 mg/ml y glucosa al 1% (AMP-GLU). Después de dejarlas crecer durante toda la noche las colonias se obtuvieron por raspado en 10 ml de medio 2x TY que contenía AMP-GLU y 15% de glicerol para su almacenamiento a -70ºC como un reserva de la genoteca.

El clonaje en pHEN1 digerido con SfiI-NotI y NcoI-NotI dió lugar a genotecas de 10^{7} y 2 x 10^{7} clones respectivamente para las genotecas de IgM y de aproximadamente 5 x 10^{7} clones para cada una de las dos genotecas de IgG.

Ejemplo 28 Aislamiento de actividades de unión a partir de una genoteca de scFv de un humano no inmunizado

La habilidad de seleccionar actividades de unión de genotecas de anticuerpos humanos expresados en la superficie de fagos debería demostrarse como más importante que el aislamiento de actividades de unión de genotecas murinas. La razón de esto es que el modo estándar de generar anticuerpos a través de la tecnología de los hibridomas no ha tenido el mismo éxito en anticuerpos humanos que el que se ha conseguido en ratón. Aunque en algunos casos sería posible la generación de genotecas de humanos inmunizados, en muchos casos, no sería posible debido a la toxicidad, la ausencia de la disponibilidad de un inmunogen o por consideraciones éticas. Alternativamente, las actividades de unión podrían aislarse de genotecas construidas de individuos con enfermedades en las que se generan anticuerpos terapéuticos mediante la respuesta inmune. Sin embargo, en muchos casos, las células productoras de anticuerpos se encuentran en el bazo y no están disponibles en el conjunto de linfocitos circulantes en la sangre del sistema circulatorio periférico (el material más accesible para generar la genoteca). Además, en enfermedades asociadas con la inmunodepresión, los anticuerpos terapéuticos podrían no producirse.

Una aproximación alternativa sería el aislamiento de actividades de unión de una genoteca generada de un individuo no inmunizado. Esta aproximación se basa en estimaciones de que un repertorio primario de 10^{7} anticuerpos diferentes probablemente puede reconocer más del 99% de los epítopes con una constante de afinidad de 10^{5} M^{-1} o mejor. (Perelson, A.S. (1989) Immunol. Rev. 110: 5). Mientras que este procedimiento podría no producir anticuerpos con alta afinidad, la afinidad se podría estimular mediante la mutación de los genes V y/o mediante la utilización del dominio VH aislado en una aproximación jerárquica con una genoteca de cadenas ligeras (o viceversa). En esta sección, demostramos la viabilidad de esta aproximación mediante el aislamiento de actividades de unión antígeno específicas contra tres diferentes antígenos a partir de una genoteca de scFvs de un humano no inmunizado.

Materiales y Procedimientos

La generación de la genoteca de scFv humana utilizada para el aislamiento de las actividades de unión descritas en este ejemplo se detalla en el ejemplo 27.

Estimación de la diversidad de genotecas originales y seleccionadas

Los clones recombinantes se rastrearon antes y después de la selección por PCR (Ejemplo 15) con los cebadores LMB3 (que se encuentra 5' de la secuencia líder pelB y es idéntico al cebador de secuenciación inverso (-40 n) de pUC19) y fd-SEQ1, seguido por la digestión con la enzima de corte frecuente BstNI. El análisis de 48 clones de cada una de las genotecas sin seleccionar indicó que el 90% de los clones tenia inserto, y las genotecas parecían ser extremadamente diversas si se juzgaba por el patrón de digestión con BstNI.

Recuperación de genotecas de fagemidos para experimentos de enriquecimiento

Para recuperar partículas fagemidos de una genoteca, se inocularon 100 ml de 2x TY que contenía AMP-GLU (ver ejemplo 27) con 10^{9} bacterias procedentes de la genoteca (preparada en el ejemplo 27) (aproximadamente 10 ml) y se dejaron crecer durante 1,5 horas con agitación a 37ºC. Las células se centrifugaron (centrifuga IEC, 4K, 15 min) y se resuspendieron en 100 ml de medio 2x TY precalentado (37ºC), se añadieron 2 x 10^{10} pfu de partículas VCS-M13 (Stratagene) y se incubaron durante 30 min a 37ºC sin agitación. Después se transfirieron la células a 900 ml de 2x TY que contenía ampicilina (100 mg/ml) y canamicina (25 mg/ml) (AMP-KAN), y se dejaron crecer durante toda la noche, con agitación a 37ºC. Las partículas fago se purificaron y se concentraron con tres precipitaciones con PEG (ver materiales y procedimientos) y se resuspendieron en PBS a 10^{13} TU/ml (clones resistentes a ampicilina).

Enriquecimiento para fagemidos que se unen a phOx:BSA mediante selección en tubos

Para el enriquecimiento, un inmunotubo Nunc (Maxisorp; nº de catálogo 4-44202) de 75 x 12 mm se tapizó con 4 ml de phOx:BSA (1 mg/ml; 14 phOx por BSA en tampón NaHCO_{3}, 50 mM, pH 9,6) durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavarlo tres veces con PBS, el tubo se incubó durante 2 horas a 37ºC con PBS que contenía Marvel al 2% (MPBS al 2%) para saturar. Después de tres lavados con PBS, se añadieron las partículas fagemidos (10^{13} TU) en 4 ml de MPBS al 2%, se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente en una mesa rotatoria donde se dejaron durante 1,5 horas más. Los tubos se lavaron entonces con 20 lavados de PBS, Tween 20 al 0,1% y 20 lavados de PBS (cada paso de lavado se realizó vertiendo el tampón dentro del tubo y sacándolo inmediatamente). Las partículas fago unidas se eluyeron del tubo con la adición de 1 ml de trietilamina 100 mM, pH 11,5, y se dejaron en agitación por rotación durante 15 min El material eluido se neutralizó inmediatamente con la adición de 0,5 ml de Tris-HCl 1 M, pH 7,4 y se mezcló con el agitador de tubos. El fago se almacenó a 4ºC.

El fago eluido (en 1,5 ml) se utilizó para infectar 8 ml de células E. coli TG1 en crecimiento logarítmico en 15 ml de medio 2x TY, y se sembraron en placas AMP-GLU tal como se ha explicado previamente produciendo como media 10^{7} colonias infectadas por fagos.

Para la selección de los fagos que se unen a phOx:BSA, el ciclo de recuperación-enriquecimiento en tubo-siembra en placa se repitió 4 veces, después de los cuales los clones de fagemidos se analizaron para la unión con un ensayo ELISA.

Enriquecimiento de fagos que se unen a lisozima mediante un procedimiento de mejora del rendimiento y en columnas

Se utilizó una placa de Petri (placas de cultivo celular de 35 x 10 mm Falcon 3001) para el enriquecimiento por un procedimiento de mejora del rendimiento. Durante todos los pasos, las placas se agitaron por balanceo en una placa de agitación por balanceo A600 (Raven Scientific). Las placas se tapizaron durante toda la noche con 1 ml de lisozima de clara de huevo de pavo (3 mg/ml) sodio hidrógeno carbonato 50 mM (pH 9,6), se lavaron tres veces con 2 ml de PBS, y se saturaron con 2 ml de MPBS al 2% a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de tres lavados con PBS se añadieron aproximadamente 10^{12} TU partículas fago en 1 ml de MPBS al 2% por placa, y se dejó balanceando durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron durante 5 min con 2 ml de las siguientes soluciones: 5 veces con PBS, PBS-Tween (Tween-20 al 0,02%), Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 500 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) + NaCl 500 mM, Tris-HCl 500 mM (pH 9,5) + NaCl 500 mM y sodio hidrógeno carbonato 50 mM, pH 9,6. Las partículas fago unidas se eluyeron mediante la adición de 1 ml de trietilamina 100 mM, pH 11,5 y se balanceó durante 5 min antes de neutralizarlas con Tris-HCl 1 M (pH 7,4) (tal como se ha explicado con anterioridad). Alternativamente, se utilizaron columnas de sefarosa-lisozima de clara de huevo de pavo de 1 ml para la purificación por afinidad (McCafferty, J. y col., (1990) Nature 348: 552). Las columnas se lavaron extensivamente con PBS, se saturaron con 15 ml de MPBS al 2%, y se cargó el fago (10^{12} TU) en 1 ml de MPBS al 2%. Después se lavó la columna con 50 ml de PBS, 10 ml de PBS-Tween (PBS-Tween-20al 0,02%), 5 ml de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) + NaCl 500 mM, Tris-HCl 5 mM (pH 8,5) + NaCl 500 mM, 5 ml de Tris-HCl 50 mM (pH 9,5) + NaCl 500 mM y finalmente 5 ml de Carbonato hidrógeno sódico 50 mM, pH 9,6. El fago unido se eluyó con 1,5 ml de trietilamina 100 mM y se neutralizó con Tris-HCl
1 M(pH 7,4).

Para la selección de fagos que se unían a la lisozima de clara de huevo de pavo, los ciclos de recuperación-enriquecimiento en tubo-siembra o recuperación-columna-siembra se repitieron 4 veces, después de los cuales los clones de fagemidos se analizaron para unión con un ensayo ELISA.

Recuperación de clones individuales de fagemidos por ensayo ELISA

Los clones resultantes de partículas fagos que se habían reinfectado y sembrado y se habían eluido después de 4 rondas de enriquecimiento, se inocularon en 150 ml de 2x TY-AMP-GLU en placas de 96 pocillos (cell wells, Nunclon), se dejaron crecer con agitación (250 rpm) durante toda la noche a 37ºC. Se utilizó un replicador de placas de 96 pocillos ("émbolo") para inocular aproximadamente 4 ml de cultivos de toda la noche en la placa original en 200 ml de 2x TY-AMP-GLU recién preparado. Después de 1 hora, se añadió a cada pocillo 50 ml de 2x TY-AMP-GLU que contenía 10^{8} pfu de VCS-M13, y se incubó la placa a 37ºC durante 45 min, seguido de la agitación de la placa a 37ºC durante 1 hora. La glucosa se eliminó por centrifugación de las células (4K, 15 min), y se aspiró el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio que se había alargado. Las células se resuspendieron en 200 ml de 2x TY-AMP-KAN (canamicina 50 mg/ml) y se dejaron crecer durante 20 horas con agitación a 37ºC. El sobrenadante sin concentrar que contenía el fago se analizó por ELISA.

ELISA

El análisis para unión a phOx:BSA, BSA o lisozima se realizó por un ensayo ELISA (ver ejemplo 9), con phOx:BSA 100 mg/ml o BSA, o con lisozima de clara de huevo de pavo a 3 mg/ml para el tapizado. La determinación de la reactividad cruzada de los clones seleccionados con antígenos no relacionados también se determinó con un ensayo ELISA en placas tapizadas con 100 mg/ml de un antígeno irrelevante (keyhole limpet hemocianina (KLH), ovoalbúmina, quimotripsinógeno, citocromo C, tiroglobulina, GAP-DH (gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa), o inhibidor de tripsina).

Caracterización de los clones positivos por ensayo ELISA

Todos los clones aislados específicos de un antígeno se analizaron para reacción cruzada contra un panel de antígenos irrelevantes tal como se ha descrito con anterioridad. La diversidad de los clones se determinó por rastreo por PCR tal como se ha descrito anteriormente y se secuenciaron al menos dos clones para cada uno de los patrones de restricción por el procedimiento de terminación de cadenas con didesoxinucleótidos.

Resultados Aislamiento y caracterización de fagos que se unen a phOx:BSA

Después de 4 rondas de selección, los clones positivos por ELISA se aislaron por phOx:BSA. Todos los clones se originaron a partir de la genoteca de IgM. De los 96 clones analizados, 43 clones se unían tanto a phOx:BSA como a BSA, con ODs que variaban de 0,4 a 1,3 (ruido de fondo 0,125). Estos clones se designaron como de unión a BSA. La unión a BSA parecía ser específica, ya que ninguno de los 11 clones analizados dió una señal por encima del ruido de fondo cuando se analizaron en un ensayo ELISA con KLH, ovoalbúmina, quimotripsinógeno, citrocromo C, lisozima, tiroglobulina, GAP-DH o inhibidor de la tripsina. Todos los clones de unión a BSA tenían el mismo patrón de restricción para BstNI, y se secuenciaron completamente 14 clones. Trece de los catorce clones tenían la misma secuencia, el VH derivaba de una familia de genes VH3 humanos y el VL de una familia de genes V lambda 3 humanos (Tabla 1). El otro clon de unión a BSA derivaba de una familia de genes VH4 humanos y de una familia de genes Vk1 humanos (no se muestran estos datos).

Se aisló un clon que se unía solamente a phOx:BSA (OD 0,3) y el fago unido se podía desplazar completamente al añadir 4-e-amino-ácido caproico metileno 2-fenil-oxazol-5-ona (phOx-CAP) 0,02 mM como competidor. Tampoco se pudo detectar unión por encima del ruido de fondo con el panel de antígenos irrelevantes que se han descrito con anterioridad. La secuencia reveló un VH derivado de una familia de genes VH1 humanos y un VL derivado de una familia de genes V lambda 1 humanos (Tabla 7).

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Aislamiento y caracterización de clones de unión a lisozima

Después de cuatro rondas de selección, se aislaron 50 clones positivos por ELISA para la lisozima de pavo. La mayoría de los clones, más del 95%, procedían de la genoteca de IgM. La unión a lisozima parecía ser específica, ya que ninguno de los clones analizados dio una señal por encima del ruido de fondo cuando se analizaron en un ensayo ELISA con KLH, ovoalbúmina, quimotripsinógeno, citrocromo C, tiroglobulina, GAP-DH o inhibidor de la tripsina. Los clones de unión a la lisozima dieron lugar a tres patrones de restricción con BstNI, y al menos se secuenciaron completamente dos clones de cada patrón de restricción. Las secuencias indicaron la presencia de 4 combinaciones únicas de VH-VL humanas (Tabla 7).

Conclusión

Los resultados indican que las actividades de unión al antígeno pueden aislarse de repertorios de scFvs preparados a partir del cDNA de las IgM de voluntarios humanos que no han sido inmunizados de forma específica.

Este ejemplo describe la recuperación de fusiones del gen 3 de una genoteca humana con la utilización de un fago auxiliar con una deleción para el gen 3.

100 ml del stock de bacterias de la genoteca de fagemidos de IgM preparada tal como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 27), que contenía 5 x 10^{8} bacterias, se utilizaron para inocular 100 ml de medio 2x TY que contenía ampicilina 100 mg/ml, glucosa al 2% (TY/Amp/Glu). Este cultivo se dejo crecer a 37ºC durante 2,5 horas. Se añadieron 10 ml de este cultivo a 90 ml de TY/Amp/Glu previamente calentado y la infección se llevó a cabo mediante la adición de 10 ml de una solución 200 veces concentrada del fago auxiliar KO7 que carecía del gen 3 (M13KO7gIIIDNº3) (Ejemplo 24) e incubación durante 1 hora a 37ºC sin agitación. La preparación del M13KO7gIIIDNº3 se realizó tal como se describe en el ejemplo 24. Después de una centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos se resuspendieron las bacterias en 100 ml de medio 2x TY que contenía ampicilina 100 mg/ml (sin glucosa). La titulación del cultivo en este punto reveló que habían 1,9 x 10^{8} bacterias infectadas si se juzgaba por su habilidad de crecer en placas que contenían ampicilina (100 mg/ml) y canamicina (50 mg/ml). Se continuó la incubación durante 1 hora con agitación antes de transferirlo a 2,5 litros de medio 2x TY que contenía ampicilina 100 mg/ml, canamicina 50 mg/ml, distribuido en cinco frascos de 2,5 litros. Este cultivo se incubó durante 16 horas y se preparó el sobrenadante por centrifugación (10-15 minutos a 10,000 rpm en una centrífuga Sorvall RC5B a 4ºC). Las partículas fago se recolectaron con la adición de 1/5 del volumen de polietilen glicol al 20%, NaCl 2,5 M, se incubaron a 4ºC durante 30 minutos y se centrifugaron tal como se ha descrito con anterioridad. El precipitado resultante se resuspendió en 40 ml de Tris 10 mM, 0,1 mM EDTA 0,1 M, pH 7,4 y los restos celulares se eliminaron por centrifugación como se ha descrito con anterioridad. La preparación de fagemidos empaquetados se volvió a precipitar y se recuperó como se ha descrito con anterioridad y se resuspendió en 10 ml de Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,4. El litro de esta preparación presentaba 4,1 x 10^{13} unidades de transducción/ml (resistentes a ampicilina).

Se prepararon tubos tapizados con OX-BSA tal como se ha descrito en el ejemplo 30 para hacer un procedimiento de mejora del rendimiento de la genoteca de fagemidos del ejemplo 27. La recuperación de la genoteca también se mejoró en rendimiento frente tubos tapizados con tiroglobulina bovina (Sigma). Estos tubos se tapizaron a una concentración de 1 mg/ml de tiroglobulina en NaHCO_{3} 50 mM, pH 9,6 a 37ºC durante toda la noche. Los tubos se saturaron con PBS que contenía leche en polvo al 2% (PBS/M) y se incubaron con 1 ml de la genoteca de fagemidos recuperados (el equivalente a 250 ml de sobrenadante del cultivo) mezclado con 3 ml de PBS/M durante 3 horas. El lavado, elución, neutralización e infección se realizaron tal como se describe en el ejemplo 30.

Resultados: Mejora del rendimiento frente a oxazolona-BSA

La primera ronda de mejora del rendimiento frente a OX-BSA suministró 2,8 x 10^{6} fagos. Una placa de bacterias grande con 1,4 x 10^{6} colonias derivadas de este eluido se obtuvo por raspado en 10 ml de 2x TY, glicerol al 20%, se agitó durante 10 minutos, se alicuotó y se almacenó. Este se utilizó también para inocular un cultivo recién preparado para la recuperación con M13KO7gIIIDNº3. (Las bacterias y los fagos recuperados derivados de la primera ronda de mejora del rendimiento frente a OX-BSA se denominaron OXPAN1. Las bacterias y los fagos recuperados derivados de la segunda y tercera ronda de mejora del rendimiento se denominaron OXPAN2 y OXPAN3 respectivamente). La recuperación del fagemido con M13KO7gIIIDNº3 después de cada ronda de mejora del rendimiento fue esencialmente como se ha descrito con anterioridad pero se utilizaron volúmenes de 5 ml para los cultivos iniciales en TY/Amp/Glu, se utilizó 1 ml del fago auxiliar y se transfirió a 100-500 ml de medio 2x TY que contenía 100 mg/ml de ampicilina y 50 mg/ml de canamicina. Los pasos de la segunda y tercera ronda de mejora del rendimiento fueron igual a como se ha descrito para la primera ronda, pero se utilizaron 0,8-1,0 ml de fago 100 veces concentrado (el equivalente de 80-100 ml de sobrenadante del cultivo). El eluido de la segunda ronda de mejora del rendimiento contenía 8 x 10^{8} partículas infecciosas y el eluido de la tercera ronda de mejora del rendimiento contenía 3,3 x 10^{9} partículas infecciosas.

Mejora del rendimiento frente a tiroglobulina

La primera ronda de mejora del rendimiento frente a tiroglobulina produjo 2,52 x 10^{5} partículas infecciosas. La mitad del eluido se utilizó para generar 1,26 x 10^{5} colonias de bacterias en una placa grande. Estas colonias se obtuvieron por raspado en 10 ml de 2x TY, glicerol al 20%, se agitaron durante 10 minutos, se alicuotaron y se almacenaron. Estas bacterias y el fago recuperado derivado de ellas se denominaron THYPAN1, y se utilizaron para inocular un cultivo recién preparado para la recuperación con M13KO7gIIIDNº3 para originar una preparación de fagos recuperados policlonales. El material que se derivó similarmente de la segunda y tercera rondas de mejora del rendimiento se denominó THYPAN2 y THYPAN3 respectivamente. La segunda y tercera rondas de mejora del rendimiento con tiroglobulina se realizaron tal como se ha descrito para la segunda y tercera rondas de mejora del rendimiento de OX-BSA. El eluido de la segunda ronda de mejora del rendimiento contenía 8 x 10^{7} unidades de transducción y el eluido de la tercera ronda de mejora del rendimiento contenía 6 x 10^{7} partículas infecciosas.

Rastreo por ELISA de clones derivados de la mejora del rendimiento

Cuarenta colonias derivadas de la tercera ronda de mejora del rendimiento frente a tiroglobulina (THYPAN3) se inocularon en una placa de 96 pocillos y se dejaron crecer durante toda la noche a 37ºC en 200 ml de TY/Amp/Glu. De la misma manera se hicieron crecer 48 colonias de las dos rondas y 48 colonias de las tres rondas de mejora del rendimiento frente a OX-BSA (OX-PAN2 y OX-PAN3). Los fagos policlonales se prepararon al mismo tiempo. Al siguiente día se transfirieron 5 \mul de cada cultivo a 100 ml de medio TY/Amp/Glu recién preparado y calentado previamente, se dejaron crecer durante 1,5 horas y se añadió M13KO7gIIIDNº3 (2 x 10^{5} fagos infecciosos por pocillo en 100 ml de TY/Amp/Glu). Estos se incubaron durante 1 hora a 37ºC sin agitación, se centrifugaron a 4.000 rpm durante 10 minutos, se resuspendieron en 150 ml de medio 2x TY que contenía 100 mg/ml de ampicilina y se incubaron durante 1 hora más con agitación antes de añadir 2 ml de medio que contenía 100 mg/ml de ampicilina y 50 mg/ml de canamicina. Después de dejarlas crecer durante toda la noche los cultivos se centrifugaron a 4.000 rpm durante 10 minutos y se recogieron los sobrenadantes. Las placas ELISA que se utilizaron para rastrear clones THYPAN3 se tapizaron a 37ºC durante toda la noche con 200 mg/ml de tiroglobulina en NaHCO_{3} 50 mM, pH 9,6. Las placas que se utilizaron para OXPAN2 y OXPAN3 se tapizaron con 100 mg/ml de OX-BSA en PBS a 37ºC durante toda la noche.

Se mezclaron 120 \mul del sobrenadante de cultivos con 30 ml de PBS 5x, leche en polvo al 10% y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Los ensayos ELISA se llevaron a cabo tal como se describió en el ejemplo 13.

Para la tiroglobulina, 18 de los 40 clones fueron positivos (O.D. de 0,3-2,0 después de 30 minutos). (Un fago utilizado como control (vector pCAT3) dio una lectura de O.D. de 0,07). Además, se observaron también clones positivos en las preparaciones de fagos policlonales THYPAN1 (O.D. 0,314) y THYPAN2 (O.D. 0,189) comparados con los fagos derivados de la genoteca original de fagemidos no mejorados para su rendimiento ("no panned") (O.D. 0,069). Todos los fagos policlonales se precipitaron con PEG y se utilizaron 10 veces concentrados.

Las reacciones de PCR y digestiones con BstNI se llevaron a cabo en los clones positivos tal como se ha descrito con anterioridad y se obtuvieron seis patrones diferentes de fragmentos de DNA lo que mostraba que se habían aislado al menos seis clones diferentes.

Para OX-BSA después de dos rondas de mejora del rendimiento, 30 de los 48 clones eran positivos por ELISA y después de tres rondas, 42 de 48 eran positivos. En un experimento separado, se obtuvo una señal positiva a partir de preparaciones del fago policlonal OXPAN1 (O.D. 0,988) y OXPAN2 (O.D. 1,717) comparado con el fago derivado a partir de la genoteca original de fagemidos no mejorados para su rendimiento (O.D. 0,186) después de 30 minutos.

Especificidad de los clones para tiroglobulina o OX-BSA

Los clones seleccionados (11 anti-tiroglobulina, 5 anti-OX-BSA) que representaban cada uno de los diferentes patrones de restricción para BstNI se ensayaron para la unión a un panel de antígenos irrelevantes. Las placas ELISA se tapizaron con antígeno (100 ml/ml en NaHCO_{3} 50 mM, pH 9,6) durante toda la noche a 37ºC. El panel de antígenos consistía en keyhole limpet hemocianina, lisozima de huevo de gallina, albúmina sérica bovina, ovoalbúmina, citocromo c, quimotripsinógeno, inhibidor de tripsina, GAP-DH (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa), tiroglobulina bovina y oxazolona-BSA. Se añadieron muestras duplicadas del sobrenadante de fagos (80 ml + 20 ml de PBS 5x, leche en polvo al 10%) a cada antígeno y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El ensayo ELISA se llevó a cabo tal como se ha descrito en el ejemplo 13.

Cada uno de los clones específicos de tiroglobulina (11 de 11) fue positivo para tiroglobulina (O.D. de 0,12-0,76) pero después de 60 minutos no mostraron unión (O.D. <0,03) para ninguno de los 9 antígenos irrelevantes. De la misma manera, de los 5 clones específicos de OX-BSA, 3 tenían una O.D. de 0,07-0,52 comparada con O.D. <0,02 para los antígenos irrelevantes. Ninguno de los 5 clones presentaba unión a BSA en solitario.

Por lo tanto, se pueden aislar clones positivos después de sólo dos rondas de mejora del rendimiento mediante la recuperación con M13KO7gIIIDNº3. Además, hay una mayor probabilidad con este fago auxiliar de generar partículas fago con más de una molécula de anticuerpo intacta. Esto incrementaría potencialmente la avidez de los anticuerpos fago y podría permitir el aislamiento de clones con afinidades más débiles.

Ejemplo 30 Alteración de la especificidad fina del scFv D1.3 expresado en fagos mediante mutagénesis y selección en lisozima de pavo inmovilizado

El anticuerpo D1.3 se une a la lisozima de huevo de gallina (HEL) con una constante de afinidad de 4,5 x 10^{7} M^{-1} mientras que se une a la lisozima de huevo de pavo (TEL) con una afinidad de <1 x 10^{5} M^{-1} (Harper y col. (1987) Molecular Immunology 24: 97-108; Amit y col. (1986) Science 233: 747-753).

Se ha sugerido que esto es debido a que el residuo glutamina presente en la posición 121 de HEL (gln121) está representado por un residuo histidina en la misma posición en TEL. Por tanto, la mutación de los residuos del anticuerpo D1.3 que interaccionan con gln121 de HEL podría facilitar la unión aTEL.

De acuerdo con Amit y col. supra, la tirosina en la posición aminoacídica 32, la fenilalanina en la posición 91 y el triptófano en la posición 92 de la cadena ligera interaccionan con la gln121 de HEL. Además, la tirosina en la posición 101 de la cadena pesada también interacciona. Ninguno de estos residuos se ha predicho que esté involucrado en determinar la conformación de la cadena principal de las regiones variables del anticuerpo (Chothia y Lesk (1987) Journal of Molecular Biology 196: 901-917).

Mutagénesis del pCAT3scFvD1.3

Los oligonucleótidos mutL91, 92 se prepararon para colocar aleatoriamente fenilalanina en la posición 91 (L91) y tritófano en la posición 92 (L92) de la cadena ligera. El oligonucleótido mutL32 se preparó para colocar aleatoriamente tirosina en la posición 32 de la cadena ligera (L32) y el oligonucleótido mutH101 se preparó para colocar aleatoriamente tirosina en la posición 101 de la cadena pesada (H101).

102

(la N representa una inserción aleatoria de cantidades iguales de A, C, G o T). La mutagénesis in vitro del vector fagemido, pCAT3scFvD1.3 (Ejemplo 12) con el oligonucleótido mutL91, 92 se llevó a cabo con la utilización de un equipo de mutagénesis in vitro (Amersham). El DNA resultante se transformó por electroporación en células TG1 con la utilización de un electroporador de Bio-Rad. Se obtuvieron 78.000 clones por raspado en 15 ml de 2x TY/glicerol al 20%. Este grupo de clones se denominó D1.3L91L92. Se preparó DNA de cadena sencilla mediante la recuperación con M13KO7 tal como se describe en Sambrook y col. (1989) supra, y se secuenció con el cebador FDTSEQ1 con la utilización del equipo de secuenciación Sequenase (United States Biochemical Corporation).

Esto reveló que el DNA se había mutagenizado con éxito como se juzgaba por la presencia de bandas en los cuatro carriles de secuenciación en las posiciones nucleotídicas que codifican para L91 y L92. Este DNA de cadena sencilla mutagenizado se sometió a una ronda más de mutagénesis como se ha descrito anteriormente utilizando bien los oligonucleótidos mutL32 o mutH101.

La mutagénesis con mutL32 dio lugar a 71.000 clones (grupo denominado D1.3L32) mientras que el mutH101 dio lugar a 102.000 clones (grupo denominado D1.3H101). Estos clones se obtuvieron por raspado en 15 ml de 2x TY/glicerina al 20%. El DNA de cadena sencilla de cada uno de los grupos se secuenció con los oligonucleótidos D1.3L40 y LINKSEQ1, respectivamente, tal como describió anteriormente, y se vio que estaban correctamente generados aleatoria.

D1.3L40:

: 5' CAG GAG CTG AGG AGA TTT TCC 3'

LINKSEQ1:

: 5' TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC 3'

Preparación del fago recuperado mediante purificación por afinidad

Se utilizaron 10-20 ml de bacterias derivadas de cada grupo mutado (obtenidos por raspado en las placas) para inocular 5 ml de TY/Glu/Amp. Todo el crecimiento bacteriano se realizó a 37ºC. Tras 2-3 horas de crecimiento, se diluyó 1 ml en 5 ml de TY/Glu/Amp y se infectaron mediante la adición de 0,5 ml de una preparación de un concentrado de 200x del M13K07gIIID No.3 descrito en el Ejemplo 24. Después de 1 hora de infección, los cultivos se centrifugaron a 4.000 rpm durante 10 minutos, se resuspendieron en 2x TY, 100 mg/ml de ampicilina, se incubaron una hora más, se transfirieron a 500 ml de medio 2x TY que contenía 100 mg/ml de ampicilina, 50 mg/ml de canamicina y se dejaron crecer durante 16 horas. Los restantes pasos de la preparación de los fagos se realizaron tal como se describió en el Ejemplo 29. Los fagos se disolvieron finalmente en Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 a 1/100 del volumen de cultivo original.

Purificación por afinidad

Se mezclaron 10 ml de lisozima de huevo de pavo a una concentración de 10 mg/ml en NaHCO_{3} 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3 con un mismo volumen de una suspensión de Sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno (Pharmacia), unida covalentemente y lavada según las instrucciones del fabricante. Antes de utilizar esta matriz (Sefarosa-TEL), se lavó con 100 volúmenes de PBS seguidos de 10 volúmenes de PBSM. La Sefarosa-TEL se resuspendió en un volumen igual de PBSM y se añadió 1 ml a 1 ml de fagos concentrados 50 veces en PBSM y se incubó en una plataforma rotatoria durante 30 minutos a temperatura ambiente. El fago que se utilizó para este paso se preparó mezclando volúmenes iguales de preparaciones independientes de los tres grupos generados aleatoriamente (D1.3L9192, D1.3H101 y D1.3L32). Tras este paso de unión, las suspensiones se cargaron en una columna de polipropileno desechable (columnas Poly-Prep, Bio-Rad) y se lavaron con 200 volúmenes de PBS que contenía Tween 20 al 0,1%. El fago unido se eluyó con 1 ml de trietilamina y se neutralizó con 0,5 ml de Tris 1 M (pH 7,4). Se prepararon del eluido unas diluciones en serie y se utilizaron para infectar células TG1 y se sembraron en placas TY que contenían 100 mg/ml de ampicilina, glucosa al 2%. Las placas que contenían 10^{8} colonias se obtuvieron por raspado en 3 ml de 2xTY, glicerol al 20% y se almacenaron a -70ºC. De estos, se utilizaron 10 ml para iniciar una segunda ronda de cultivo que se recuperó con M13K07gIIID No. 3, tal como se describió anteriormente (con la utilización de un volumen final de cultivo de 100 ml). Se realizaron una segunda y tercera ronda de purificaciones por columna de afinidad tal como se describió anteriormente para la primera ronda.

Análisis por ELISA

Se seleccionaron 40 colonias derivadas de la tercera ronda de purificación con Sefarosa-TEL en una placa de 96 pocillos y se dejaron crecer durante toda la noche a 37ºC en 200 ml de Ty/Amp/Glu. Se recuperaron y prepararon para ELISA las partículas fagemido tal como se describió en el Ejemplo 13. Las placas de ELISA se tapizaron durante toda la noche a 37ºC con lisozima de huevo de gallina (HEL) o lisozima de huevo de pavo (TEL) a una concentración de 200 mg/ml en NaHCO_{3} 50 mM, pH 9,6. Los ELISA se realizaron tal como se describió en el Ejemplo 13.

Tras 15 minutos de incubación en el sustrato, se vio que 13 clones eran negativos (OD<0,05 en HEL y TEL). En todos los positivos, se observaron valores de 0,1-0,78 en HEL, con la excepción de uno en que la señal en HEL era de 0,078 pero la señal en TEL (OD 0,169) lo desplazó al grupo de los positivos. La preparación de los fagemidos control tenía una relación porcentual de la señal TEL:HEL del 22%. Se estimó que los clones tenían una unión inalterada si la relación TEL:HEL era menor al 40%. Nueve clones estaban incluidos en esta categoría. Se vio que 18 muestras tenían una unión alterada con una relación en la señal en TEL:HEL del 40 al 200%.

Se realizaron una diluciones en serie de 10 clones que se habían analizado con ELISA, y en 6 de estos clones el perfil de unión a HEL era el mismo que el del clon original (pCAT3SCFvD1.3), mientras que se observó un incremento en la señal con TEL (ver Figura 50, clon B1). En los 4 clones restantes, el incremento de la señal con TEL estaba acompañado con un decrecimiento de la señal en HEL (ver Figura 39, clon A4).

Competición con el antígeno soluble

Todos los clones aislados conservaban con diferentes niveles la unión a HEL. Para determinar si un antígeno soluble podía competir con el antígeno inmovilizado, se llevó a cabo un experimento paralelo como el anterior pero con la adición de lisozima de huevo de gallina (1 mg/ml) a Sefarosa-TEL antes de incubar con la preparación de fagos. Este experimentó se realizó con 3 rondas de purificación por columna y se seleccionaron 40 colonias. Ninguno de estos clones se unió a HEL o TEL, demostrándose así que el antígeno soluble era positivo para competir por la unión con el antígeno inmovilizado.

Cuando se aísla una especificidad de anticuerpo generalmente es deseable alterar alguna de sus propiedades, particularmente su afinidad o especificidad. Este ejemplo demuestra que la especificidad de un anticuerpo puede alterarse mediante la utilización de un dominio VL diferente derivado del repertorio para dichos dominios. Este procedimiento con la utilización de la expresión en fagos sería aplicable para mejorar los anticuerpos monoclonales existentes así como las especificidades de los anticuerpos derivadas de la utilización de anticuerpos fagos. Este ejemplo muestra que el reemplazamiento del dominio VL del scFvD1.3 específico para la lisozima de huevo blanco de gallina (HEL) con una genoteca de dominios VL permite la selección de fragmentos scFv que se unen también a la lisozima de huevo blanco de pavo (TEL). De forma más general, esta aproximación experimental muestra que las especificidades de los anticuerpos pueden modificarse por reemplazamiento de un dominio variable y da un ejemplo más de la aproximación jerárquica para aislar especificidades de anticuerpos.

La cadena pesada de D1.3 se amplificó a partir de una construcción existente (pSW1-VHD1.3, Ward y col. (1989), supra) mediante PCR con la utilización de los cebadores VH1BACK y VH1FOR, la genoteca de cadenas ligeras se amplificó a partir de una genoteca de cDNA derivada del bazo de un ratón no inmunizado, que se sintetizó mediante el empleo de los cebadores 1, 2, 4 5 de MJKFONX para la primera cadena, tal como se describió en el Ejemplo 11. La amplificación posterior se realizó con los mismos cebadores 5' ("forward") y el cebador VK2BACK. El ensamblaje por PCR de la cadena pesada D1.3 con la genoteca de cadenas ligeras se realizó a través del engarzador de la cadena señal Fv, tal como se describió en el Ejemplo 11.

El clonaje de los productos de PCR ensamblados (secuencias scFv) se realizó después de un paso de PCR adicional (pull-trough) con el empleo de un cebador BACK que proporcionaba una diana ApaLI y los cebadores 5' que contenían una diana NotI, tal como se describió en el Ejemplo 11. Los fragmentos de PCR digeridos con ApaLI/NotI se clonaron en el vector fdCAT2 digerido de forma similar. Se obtuvieron 5 x 10^{5} transformaciones tras la electroporación de la reacción de ligación en las células MC1061.

El rastreo de la genoteca de fagos para los que se unían a TEL se llevó a cabo mediante mejora del rendimiento. Los tubos de poliestireno Falcon 2058 se tapizaron (16 horas) con 2 ml de TEL-PBS (3 mg/ml) y se saturaron durante 2 hr con 4 ml de MPBS (PBS con leche desnatada en polvo al 2%). Se incubaron los fagos derivados de la genoteca (5 x 10^{5} unidades de transducción) en 2 ml de MPBS (2%) en estos tubos durante 2 hr a temperatura ambiente. Los tubos se lavaron 3x con PBS, 1x con Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M; 1x con Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, pH 9,5, NaCl M. Al final se eluyeron los fagos con trietilamina 100 mM. Los fagos eluidos se utilizaron para infectar células TG1, las células se sembraron en placas 2xTY que contenían 15 mg/ml de tetraciclina, y se dejaron crecer durante 16 h. Las colonias se rasparon en 25 ml de medio 2xTY y los fagos se recuperaron mediante precipitación con PEG. Tras una segunda ronda de selección para los que se unían a TEL, se realizaron ensayos ELISA tal como se describió anteriormente (Ejemplo 2).

El análisis de 100 clones de la genoteca antes de la selección por afinidad con placas ELISA tapizadas con TEL mostró que no había uniones. Sin embargo, tras dos rondas de selección de fagos que se unen a TEL aproximadamente un 10% de los clones de fagos mostraban señales ELISA positivas. Se consideraron señales positivas de ELISA los que tenían valores al menos dos veces mayores que el vector fdCAT2 sin inserto. En la Figura 40 se muestra un análisis más detallado de las propiedades de unión de los fagos que se unen a TEL.

Tal como se muestra en la Figura 40, se determinó que varios clones se unían igualmente a TEL que a HEL en contraste con el scFv D1.3 original, que se une casi exclusivamente a HEL. Ninguno de estos clones se unía a BSA. Estos resultados indican que la especificidad de estos scFv era más amplia en comparación a D1.3, ya que reconocen ambas lisozimas (HEL y TEL), pero conservan la especificidad para la lisozima ya que no reconocen a otras BSA. Las secuencias aminoacídicas deducidas (derivadas de la secuenciación del DNA) de las dos cadenas ligeras de los clones MF1 y MF2, que corresponden a los clones 3 y 9 de la Figura 40, se muestran en la Figura 41.

En el caso de los anticuerpos aislados, la aproximación experimental tal como se describió en este estudio puede se particularmente útil si se desea el reconocimiento de un amplio rango de antígenos diferentes, pero íntimamente relacionados, antígenos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales contra antígenos virales como el bucle V3 del gp120 HIV-1 son en la mayoría de los casos bastante específicos para un virus concreto aislado a causa de la variabilidad en esta parte del gen env del HIV-1. La modificación de dichos anticuerpos de la manera descrita en este ejemplo puede dar lugar a anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con un rango más amplio de HIV-1 aislados, y, por lo tanto, sería más alto su valor terapéutico o de diagnóstico.

Puede escogerse una aproximación semejante en la que un dominio variable de la cadena ligera con propiedades deseadas se mantiene fija y se combina con una genoteca de dominios variables de las cadenas pesadas. Algunas cadenas pesadas, como por ejemplo la VHD1.3, mantienen la actividad de unión como dominios individuales. Esto puede permitir una estrategia en donde los dominios VH se rastrean por su actividad de unión cuando se expresan en fagos y, a continuación, se combinan los dominios de unión con una genoteca de dominios VL para la selección de parejas de cadena ligera adecuadas.

Cuando un anticuerpo fágico se une a su antígeno con una elevada afinidad o avidez puede que no sea posible eluir el anticuerpo fágico de una matriz de afinidad con una molécula relacionado con el antígeno. Alternativamente, puede que no exista una molécula para la elución que sea adecuada y que pueda prepararse en una concentración elevada para que sea suficiente. En estos casos es necesario utilizar un procedimiento de elución que no sea específico del complejo antígeno-anticuerpo. Desafortunadamente, algunos de los procedimientos de elución no específicos destruyen la estructura del fago, por ejemplo, se reduce la viabilidad del fago con el tiempo a valores de pH 12 (Rossomando, E.F. y N.D. Zinder (1968), J. Mol. Biol., 36:387-399). En consecuencia, se ha diseñado un procedimiento que permite la elución de los anticuerpos fágicos unidos en condiciones suaves (reducción de un grupo ditiol con ditiotreitol) que no destruye la estructura del fago.

El antígeno diana se marcó con biotina con la utilización de un reactivo de biotinilación que podía romperse. Se modificó el BSA conjugado con 2-fenil-oxazolona (Makela, O. y col., supra) con un reactivo de biotinilación con un grupo ditiol que podía romperse (sulfosuccinimidil 2-(biotinamido) etil-1,3-ditiopropionato, de Pierce) según las instrucciones de los fabricantes. Este antígeno marcado con biotina se unió a esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina y el complejo se utilizó para unirse al fago. Las esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynal) se recubrieron previamente con antígeno mediante la mezcla de 650 mg de OX-BSA marcada con biotina en 1 ml de PBS, con 200 ml de esferas durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. El antígeno libre se eliminó mediante lavado con PBS. Una cuarta parte del complejo (equivalente a 5 ml de esferas y una entrada de 17,5 mg de OX-BSA) se añadió a 0,5 ml de fagos en PBSM (PBS que contenía leche desnatada en polvo al 2%) con 1,9 x 10^{10} partículas fago mezcladas en las proporciones de pAbD1.3 dirigido contra lisozima (Ejemplo 2) y pAbNQ11 dirigido contra 2-fenil-5-oxazolona, tal como se muestra en la Tabla 8.

Tras 1 hora de incubación con agitación a temperatura ambiente, las esferas magnéticas se recuperaron con un aparato de separación magnético MPC-E de Dynal. Se lavaron entonces en PBS que contenía 0,5% de Tween 20 (3 x 10 minutos, 2 x 1 hora, 2 x 10 minutos) y se eluyeron los fagos con una incubación de 5 minutos en 50 ml de PBS que contenía ditiotreitol 10 mM. El eluido se empleó para infectar células TG1 y las colonias resultantes se sondearon con el oligo NQ11CDR3 (5' AAACCAGGCCCCGTAATCATAGCC 3') derivado del CDR3 del anticuerpo NQ11 (hibrida con pAbNQ11 pero no con el pAb D1.3).

Se consiguió en enriquecimiento de pAbNQ11 de 670 veces (Tabla 8) en relación al ruido de fondo del pAbD1.3 en una sola ronda de purificación mediante la utilización de 17,5 mg de OX-BSA marcado con biotina.

Este procedimiento de elución es sólo un ejemplo de un procedimiento de elución en condiciones suaves. Un procedimiento particularmente ventajoso sería la introducción de una secuencia nucleotídica que codifique para los aminoácidos que representan un sitio de reconocimiento para el corte con una proteasa altamente específica entre el gen externo insertado, en este caso un gen para un fragmento de anticuerpo, y la secuencia del resto del gen III. Algunos ejemplos de proteasas altamente específicas son el Factor X y la trombina. Después de la unión del fago a una matriz de afinidad y la elución para eliminar la unión no específica del fago y los fagos que se unen débilmente, los fagos fuertemente unidos se eliminarían mediante lavado de la columna con proteasa en condiciones adecuadas para la digestión del sitio de corte. Esto liberaría el fragmento del anticuerpo de la partícula fago eluyendo el fago. Se esperaría que estos fagos fueran infectivos, ya que el único sitio de corte de la proteasa debe ser el que se ha introducido específicamente. En consecuencia, los fagos que se han unido fuertemente pueden recuperarse mediante la infección, por ejemplo, de células TG1 de E. coli.

Hay aproximadamente 10^{14} combinaciones distintas de cadenas ligeras y pesadas derivadas del bazo de un ratón inmunizado. Si se emplea la aproximación combinatorial aleatoria para clonar fragmentos de las cadenas ligeras y de las cadenas pesadas en un único vector para expresar fragmentos scFv, Fv o Fab en fagos, no es práctico expresar las 10^{14} combinaciones. Una aproximación para reducir la complejidad, descrita en este ejemplo, es clonar los genes sólo de células seleccionadas por antígeno.

El sistema inmunitario emplea la unión al antígeno por la superficie de la inmunoglobulina para seleccionar la población de células que responden al anticuerpo específico. Esta aproximación de selección de células que unen el antígeno se ha investigado para reducir el número de posibilidades combinatorias e incrementar la posibilidad de recuperar la combinación original de cadenas pesadas y ligeras.

La respuesta inmunológica al hapteno 4-hidroxi-3-nitrofenilacético (NP) se ha estudiado extensamente. Debido a que la respuesta inmune primaria al NP utiliza sólo una única cadena ligera, los solicitantes fueron capaces de examinar la utilización del procedimiento combinatorial mediante el empleo de una cadena ligera fija y una genoteca de cadenas pesadas para examinar las frecuencias de los genes que codifican para los anticuerpos que se unen al NIP (ácido 4-hidroxi-3-yodo-5-nitrofenilacético). Por lo tanto, los solicitantes han utilizado este sistema para investigar las ventajas de seleccionar poblaciones celulares antes de hacer las genotecas combinatoriales para su expresión en fagos.

Procedimientos 2.1 Conjugados de haptenos

La globulina gamma de pollo (CGG, Sigma, Poole, GB) y la albúmina de suero bovino (BSA, Boehringer Mannheim, Alemania) se conjugaron con NP-O-succinimida o NIP-caproato-O-succinimida (Cambridge Research Biochemicals, Northwich, GB) según el procedimiento descrito por Brownstone (Brownstone, A., N.A. Mitchison y R. Pitt-Rivers (1966), Immunology, 10:465-492). Los compuestos activados se disolvieron en dimetilformamida y se añadieron a proteínas en sodio hidrógeno carbonato 0,2 M. Se mezclaron con agitación constante durante 16 horas a 4ºC y se dializó frente a varios cambios de sodio hidrógeno carbonato 0,2 M. Finalmente, se dializaron frente a tampón fosfato salino (PBS). Los conjugados que se hicieron fueron el NP_{12}CGG y el NIP_{10}BSA. El derivado NIP_{10}BSA se marcó a continuación con biotina con un equipo de biotinilación suministrado por Amersham (Amersham International, Amersham, GB).

2.2 Animales e inmunización

Se inmunizaron ratones de 10 semanas de edad de la cepa C57BL/6 mediante inyección intraperitoneal de 100 mg de NP-CGG en Adyuvante Completo de Freund.

2.3 Preparación del bazo

Siete días después de la inmunización, las células del bazo se prepararon tal como describen Galfre y Milstein (Galfre, G. y C. Milstein (1981), Methods Enzymol., 73:3-46). Los glóbulos rojos se lisaron con cloruro amónico (Boyle, W (1968), Transplantation, 6:71) y cuando se realizó la selección celular, las células muertas se eliminaron mediante el procedimiento descrito por von Boehmer y Shortman (von Boehmer, H. y K. Shortman (1973), J. Immunol. Methods, 1:273). Las células se resuspendieron en tampón fosfato salino (PBS), albúmina de suero bovino al 1%, azida sódica al 0,01%; todos los procedimientos de selección celular se realizaron a 4ºC en este medio.

2.4 Selección celular

El NIP-BSA marcado con biotina se acopló a las esferas magnéticas acopladas con estreptavidina (Dynabeads M280 Streptavidin, Dynal, Oslo, Noruega) mediante la incubación de 10^{8} esferas con 100 mg de proteína marcada con biotina durante 1 hora, con agitación ocasional, y el lavado posterior por cinco veces para eliminar el antígeno no unido. Las esferas acopladas se almacenaron a 4ºC en el medio hasta su utilización. Para la selección de las células de unión al antígeno, las células (2-4 x 10^{7}/ml) se incubaron primero durante 30 minutos con esferas no acopladas, en una relación esferas:células de 1:1, para examinar el grado de unión no específica. A continuación, las esferas se separaron colocando el tubo en el aparato magnético (MPC-E Dynal) durante 3-5 minutos. Se eliminaron las células no unidas y a continuación se incubaron con esferas magnéticas acopladas con NIP-BSA, en una relación esferas:células de 0,1:1, durante 60 minutos, con agitación ocasional. Las esferas y las células en roseta se separaron tal como se describió anteriormente. A continuación, las esferas se resuspendieron en 1 ml de medio y se repitió la separación; este proceso se repitió de 5 a 7 veces hasta que no se detectaron células no unidas cuando se hacía el contaje en un hemocitómetro.

Para la separación de las células positivas con inmunoglobulinas en su superficie, las células se incubaron con 200 mg de inmunoglobulina polivalente anti-ratón de cabra marcada con biotina (Sigma, Polle, GB). A continuación, las células se lavaron dos veces con el medio y se añadieron esferas magnéticas acopladas a estreptavidina, en una relación esferas respecto células de 30:1. Después de 30 minutos de incubación, las esferas y las células roseta se separaron con el aparato magnético tres veces, cogiéndose el sobrenadante en cada ronda.

2.4 Preparación del DNA/cDNA, amplificación por PCR y clonaje

El DNA se preparó simplemente por el procedimiento de digestión con proteinasa-K, que es particularmente útil para pequeñas cantidades de células (PCR protocols: A Guide to Methods and Applications. Ed. M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky y T.J. White. Academic Press). La preparación del RNA y la síntesis posterior del cDNA se realizó tal como lo describen Gherardi y col. (Gherardi, E., R. Pannell y C. Milstein (1990), J. Immunol. Methods, 126:61-68). La PCR y el clonaje de las genotecas de cadenas pesadas se realizaron mediante el empleo de los cebadores y condiciones descritas por Ward y col. (Ward, E.S., D. Güssow, A.D. Griffiths, P.T. Jones y G. Winter (1989), Nature, 341:544-546). Se realizaron 40 ciclos de amplificación por PCR. Los vectores de expresión VH y VF utilizados se adaptaron a partir de aquellos descritos previamente por Ward y col. Los dos se subclonaron en pUC119 (Veira y Messing, ver más adelante) y se modificó el vector de expresión Fv para incluir la cadena ligera lambda-1 de la línea germinal (cedida por T. Simon (originalmente clonada por Siegfried Weiss, Instituto de Inmunología de Basilea). El vector se muestra en la Figura 53.

2.5 Expresión y ELISA

Para el rastreo se seleccionaron colonias individuales y se incubaron en pocillos individuales de placas de microtitulación (Bibby) en 200 ml de 2xTY/ampicilina 100 mg/ml/glucosa al 0,1% y, a continuación, se incubaron a 37ºC durante 5-6 horas con agitación, y posteriormente se añadió isopropil-b-D-tiogalactopiranósido (IPTG, Sigma, Poole, GB) a una concentración final de 1 mM y la incubación se dejó proseguir durante 16 horas más a 30ºC antes de recuperar los sobrenadantes. Los pocillos de las placas Falcon para ELISA (Becton Dickenson, N.J., E.E.U.U.) se tapizaron durante toda la noche a temperatura ambiente con NIP_{10}-BSA (40 mg/ml en PBS) y se saturaron con leche desnatada en polvo al 2% en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Los sobrenadantes bacterianos se añadieron y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y, a continuación, las placas se lavaron tres veces con PBS. Se añadió peroxidasa conjugada con la cadena lambda anti-ratón de cabra (Southern Biotechnology, Birmingham, E.E.U.U.) y se incubó otra vez durante 1 hora a temperatura ambiente antes de realizar seis lavados con PBS y del posterior revelado con 2,2'-Azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (Sigma, Poole, GB) como sustrato para la peroxidasa. A los 30 minutos se midió la densidad óptica a 405 nm con un lector de placas Thermomax (Molecular Devices, Menlo Park, E.E.U.U.). Se realizó una transferencia de Western con el etiquetado del extremo carboxi de myc como se describió en el Ejemplo 21.

3.1 Comparación del RNA/DNA y de las células seleccionadas para el antígeno

Los resultados de la selección para los antígenos se muestran en la Tabla 13. Menos de un 1% de las células se unen a las esferas recubiertas con NIP-BSA y la unión no específica es muy baja. La evaluación de la proporción de genes expresados de cada genoteca VH mediante transferencia de Western mostró que los dominios VH completos se expresaban en un 95% (19/20) de los clones cuando se utilizaba el RNA como material de partida, pero sólo en un 60% (12/20) de los clones cuando se utilizaba el DNA (tanto de células seleccionadas como a partir del bazo total) como material de partida. Probablemente, esta diferencia es resultado de la amplificación con nuestros cebadores de algunos pseudogenes reordenados y parece que debe existir algún grado de selección, a nivel de transcripción, para genes funcionales.

Se rastreó un número variable de clones de cada tipo de genoteca para la producción de fragmentos Fv que se unían a NIP. Se realizaron rastreos iniciales por ELISA y se seleccionaron los positivos para incluir aquellos con una densidad óptica de, al menos, dos veces el ruido de fondo. Los positivos iniciales se volvieron a transformar y se comprobó su unión en replicas; se confirmó que la unión era específica al NIP y no al BSA. La frecuencia de clones de unión a NIP confirmados como positivos para cada material de partida se muestran en la Tabla 10. Con el empleo de DNA como material de partida para la amplificación por PCR, el valor es aproximadamente equivalente al muestreo de células presentes como si hubiera sólo un gen de cadena pesada reordenado funcional y como máximo un pseudogen reordenado por célula B. Naturalmente, la amplificación del RNA de un animal sesga el repertorio de células B que reaccionan y en un animal inmunizado recientemente daría un sesgo hacia el inmunógeno. Los datos de la Tabla 10 muestran claramente la potencialidad de esta selección por la que el número de genes específicos para antígenos se enriquece al menos 96 veces cuando se utiliza como material de partida el RNA de una semana después de la inmunización primaria. Los datos también muestran que la selección para las células de unión al antígeno proporciona también un procedimiento alternativo potente para la selección del material de partida genético que se requiere.

3.2 Comparación del bazo total/bazo sin las inmunoglobulinas de superficie

Para examinar las bases celulares de la selección conseguida mediante la utilización de RNA como material de partida, eliminamos las células positivas para inmunoglobulinas de superficie del bazo con la utilización de inmunoglobulinas anti-polivalentes marcadas con biotina y esferas magnéticas conjugadas con estreptavidina. El análisis previo por FACS demostró que este procedimiento eliminaba aproximadamente un 96% de las células positivas para inmunoglobulinas. El RNA de ambas superficies se preparó a partir de fracciones de inmunoglobulinas eliminadas y no eliminadas de superficie de un bazo, y se hicieron genotecas de VH de cada una de ellas. Los resultados por ELISA (tabla 10) muestran que el número de positivos realmente no decrece por esta eliminación, aspecto que sugiere que la mayor proporción del efecto selectivo de utilizar RNA probablemente tenga su origen en que provenga de células G negativas para inmunoglobulinas de superficie (probablemente células plasmáticas).

Conclusiones

Los solicitantes han demostrado la importancia de la amplificación del RNA específico producido tras la inmunización para permitir que se obtenga la actividad de unión con una frecuencia razonable a partir de una genoteca combinatorial. Los solicitantes también han demostrado una estrategia alternativa que mimetiza al mismo sistema inmune. Mediante la utilización de un procedimiento sencillo para la selección de células de unión a antígenos se ha obtenido un enriquecimiento comparable y ha añadido la ventaja de utilizar un rango más amplio de genes. A primera vista, la aproximación combinatorial aleatoria sería inviable para producir la combinación original de cadenas pesadas y ligeras por la gran diversidad de genes de inmunoglobulinas. Sin embargo, los solicitantes muestran en la presente invención que, tras la inmunización, con un buen antígeno, el 10% de los genes VH del RNA total del bazo provienen de las células específicas para el antígeno, reduciéndose de esta manera y en gran medida el tamaño del repertorio. Esto, junto con el hecho de la promiscuidad de las cadenas ligeras y pesadas (Ejemplos 16 y 17), es responsable de que el sistema combinatorial produzca clones de unión al antígeno con una frecuencia razonable. Los datos también sugieren que el grueso del RNA específico para el antígeno proviene de las células negativas para inmunoglobulinas de superficie que más probablemente se tratan de células plasmáticas.

Los datos también muestran que este simple procedimiento de selección de antígenos puede ser útil para la reducción de la complejidad de la genoteca combinatorial. En este caso, se ha conseguido un enriquecimiento de genes específicos para antígenos de al menos 56 veces, los cuales en casos normales en donde se desconocen las cadenas ligeras y pesadas resultaría en una reducción de la complejidad de la genoteca combinatorial por un factor de más de 3000. Otra ventaja de la utilización de células seleccionadas para antígenos (y amplificación del DNA para reducir cualquier sesgo resultante del estado de la célula) es que da como resultado un rango amplio de genes de anticuerpos amplificados. Sería ideal una selección celular sencilla como la que han descrito los solicitantes en la presente invención en combinación con la selección de fagos. Con este ejemplo puede verse que de la combinación de procedimientos de selección celular y de fagos podría esperarse rastrear todas las combinaciones de cadenas ligeras y pesadas (aproximadamente 4 x 10^{10}) y posiblemente podrían rastrearse todas las combinaciones de unión aunque, de momento, no sería posible a partir de todo el bazo (aproximadamente 4 x 10^{14} combinaciones, asumiendo un 50% de células B).

TABLA 1 Enriquecimiento del pAb (D1.3) a partir de la población del vector

Proporción de partida	Proporción final	Enriquecimiento^{d}
	oligo^{b}	ELISA^{c}
pAB:fd-CAT1	pAB:fagos totales	pAB:fagos totales
Ronda única
1:4 x 10^{3}	43/124		1,3 x 10^{3}
1:4 x 10^{4}	2/82		1,0 x 10^{3}
Doble ronda
1:4 x 10^{4}	197/372		2,1 x 10^{4}
1:4 x 10^{5}	90/356	3/24	1,0 x 10^{5}
1:4 x 10^{6}	27/183	5/26	5,9 x 10^{5}
1:4 x 10^{7}	13/278		1,8 x 10^{6}
\begin{minipage}[t]{160mm} Nota a pie de página: ^{a}Aproximadamente 10^{12} fagos con la relación establecida de pAb (d1,3): FDTPs/Bs se aplicaron a columnas de 1 ml de sefarosa-lisozima, lavaron y eluyeron. ^{b}Se infectaron las células TG1 con el fago de unión específico eluido y se sembraron en placas TY-tet. tras una incubación durante toda la noche a 30-37^{o}C, las placas se analizaron mediante hibridación con el oligonucleótido VH1FOR marcado con ^{32}p (Ward y col., referencia citada), específico para el pAb D1,3. ^{c}Se hicieron crecer colonias individuales a partir de placas cultivadas toda la noche se purificaron los fagos y se analizaron por la unión a lisozima. ^{d}El enriquecimiento se calculó a partir de los datos obtenidos con la sonda oligonucleotídica.\end{minipage}

TABLA 2 Enriquecimiento del pAb (D1.3) a partir de la población de pAb

Proporción de partida ^{1}	Proporción final ^{2}	Enriquecimiento
(pAbD1.3:pAbNQ11)	(pAb D1.3: fagos totales)
Ronda única
1 : 2,5 x 10^{4}	18/460	0,98 x 10^{3}
1 : 2,5 x 10^{5}	3/770	1,97 x 10^{3}
1 : 2,4 x 10^{6}	0/112	-
Sólo pAb NQ11	0/460	-
Doble ronda
1 : 2,5 x 10^{4}	119/170	1,75 x 10^{4}
1 : 2,5 x 10^{5}	101/130	1,95 x 10^{5}
1 : 2,5 x 10^{6}	102/204	1,26 x 10^{6}
1 : 2,5 x 10^{7}	0/274	-
1 : 2,5 x 10^{8}	0/209	-
Sólo pAb NQ11	0/170	-
Notas:
1. Se aplicaron 10^{10} fagos a una columna de lisozima como en la Tabla 1.
2. \begin{minipage}[t]{155mm} Las células se sembraron en placa y se analizaron con sondas oligonucleotídicas tal como se muestra en la Tabla 1, excepto que el oligonucleótido era D1.3CDR3A. \end{minipage}

6

7

TABLA 5

Mutaciones en el scFvB18 seleccionadas mediante la expresión en fagos después de hacerlos crecer en
cepas mutadoras
Nucleótido mutado	Aminoácido mutado	Número
(posición de la base)
308	Ala->Val (VH-FR3)	3

703	Tyr->Asp (VL CDR3)	1

706	Ser->Gly (VL CDR3)	1

724	Gly->Ser (VL FR4)	21

725	Gly->Asp (VL FR4)	3

734	Thr->Ile (VL FR4)	1

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8

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9

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10

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11

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12

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13

Claims

1. Procedimiento para la producción de un miembro de una pareja de unión específica (sbp), procedimiento que comprende:

expresión en células hospedadoras recombinantes de un ácido nucleico que codifica una población genéticamente diversa de ese tipo de miembro sbp, en el cual cada uno de dicho miembro sbp se expresa como una fusión con un componente de superficie de un bacteriófago secretado que expresa en la superficie de la partícula bacteriófago dicho miembro sbp, teniendo dicha partícula la capacidad de replicarse, proporcionada por la información genética empaquetada dentro, mediante la utilización de dicho componente de superficie, el ácido nucleico que codifica dicho miembro sbp expresado que está incluido dentro de la célula hospedadora en una forma que es capaz de ser empaquetado en dicha partícula mediante la utilización de dicho componente de superficie, por medio del cual el material genético de la partícula que expresa un miembro sbp codifica para el miembro sbp expresado mencionado, estando caracterizado el procedimiento por el hecho de que dichos miembros sbp son moléculas de anticuerpo Fv de cadena sencilla derivadas de:

(iv) una mezcla de cualquiera de (i), (ii) y (iii);

2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el cual cada miembro sbp expresado se expresa en un vector fago.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 en el cual cada miembro sbp expresado se expresa en un vector fagémido, incluyendo el procedimiento la utilización de un fago auxiliar, o un plásmido que exprese genes que complementen al fago, para ayudar al empaquetamiento del genoma del fagémido mencionado, y dicho componente de superficie mencionado es una proteína de la cápside del mismo.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 en el cual la fusión mencionada es con una proteína de la cápside de un bacteriófago y la partícula se forma con la mencionada fusión en ausencia de dicha proteína de la cápside expresada en la forma salvaje.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 en el cual dicha fusión es con una proteína de la cápside de un bacteriófago y está presente una proteína de dicha cápside nativa en la partícula mencionada que expresa dicha fusión.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el cual el hospedador es una bacteria y dicho componente de superficie es una proteína de la cápside del bacteriófago.

7. Procedimiento según la reivindicación 6 en el cual el bacteriófago es una fago filamentoso.

8. Procedimiento según la reivindicación 7 en el cual el fago se selecciona de la clase de fagos I fd, M13 y f1.

9. Procedimiento según la reivindicación 7 o reivindicación 8 en el cual cada miembro sbp expresado se expresa como una fusión con la proteína de la cápside del gen III del fago fd o su correspondiente en otro fago filamentoso.

10. Procedimiento según la reivindicación 9 en el cual el miembro sbp expresado mencionado se inserta en la región N-terminal de la proteína de la cápside madura secuencia abajo de un péptido líder secretor.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 en el cual el hospedador es E. coli.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el cual las partículas que se forman por dicha expresión se seleccionan o rastrean para proporcionar un único miembro sbp expresado o una población mezcla de dichos miembros sbp expresados asociados en sus partículas respectivas con ácido nucleico que codifica para dicho miembro sbp expresado.

13. Procedimiento según la reivindicación 12 en el cual las partículas se seleccionan por afinidad con un miembro complementario a dicho miembro sbp expresado.

\newpage

14. Procedimiento según la reivindicación 13 que comprende la recuperación de cualquier partícula unida al miembro complementario mencionado mediante lavado con un eluyente.

15. Procedimiento según la reivindicación 14 en el cual el eluyente contiene una molécula que compite con las partículas mencionadas para la unión al miembro sbp complementario.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 en el cual las partículas se aplican al miembro sbp complementario mencionado en presencia de una molécula que compite con las partículas mencionadas para la unión a dicho miembro sbp complementario.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el cual el ácido nucleico derivado de una partícula seleccionada o rastreada se utiliza para expresar dicho miembro sbp que se había expresado o un fragmento o derivado del mismo en un organismo hospedador recombinante.

18. Procedimiento según la reivindicación 17 en el cual el ácido nucleico de una o más partículas se coge y se utiliza para proporcionar un ácido nucleico codificante en un procedimiento adicional para obtener un miembro sbp individual o una población mezclada de miembros sbp, o el ácido nucleico codificante para los mismos.

19. Células hospedadoras recombinantes portadoras de una genoteca de fragmentos de ácidos nucléicos que comprenden fragmentos que codifican para un población genéticamente diversa de miembros de parejas de unión específicos (sbp), cada miembro sbp se expresa como una fusión con un componente de superficie de un bacteriófago secretable, de tal manera que los miembros sbp mencionados se expresen en la superficie de las partículas bacteriófago y el material genético de las partículas, empaquetado mediante la utilización del componente de superficie mencionado, codifique para el miembro sbp expresado asociado, caracterizado en que los miembros sbp mencionados son moléculas de anticuerpos Fv de cadena sencilla derivados de

(iv) una mezcla de cualquiera de (i), (ii) y (iii);