KR20060120652A - 난소암의 확인, 평가, 예방 및 치료를 위한 핵산 분자 및단백질 - Google Patents

난소암의 확인, 평가, 예방 및 치료를 위한 핵산 분자 및단백질 Download PDF

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도나 포드
만줄라 가나바라푸
카렌 글라트
세바스찬 회르스
슈브한기 카마트카르
존 이. 모나한
로버트 슈레겔
여그 야오 수
수메이 자오
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Abstract

본 발명은 난소암과 관련된 신규하게 발견된 핵산 분자 및 단백질에 관한 것이다. 인간 난소암을 검출, 특성화, 예방 및 치료하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다.
난소암, 핵산 분자, 단백질, 진단, 검출, 치료, 예방, 키트

Description

난소암의 확인, 평가, 예방 및 치료를 위한 핵산 분자 및 단백질{NUCLEIC ACID MOLECULES AND PROTEINS FOR THE IDENTIFICATION, ASSESSMENT, PREVENTION, AND THERAPY OF OVARIAN CANCER}
관련 출원:
본 출원은 전문을 본원에 참고로 포함한 2003년 10월 7일자 출원된 미국 가출원 60/509,171의 이익을 청구한다.
본 발명의 분야는 난소암의 진단, 특성화, 관리 및 치료를 포함하는, 난소암에 속한 것이다.
난소암은 전세계 인구에서 심각한 이환율과 사망률의 원인이다. 난소암은 임상 및 병리적 특징을 기초로 3가지 그룹, 즉, 상피성 난소암 (EOC; 서방 국가에서 난소암의 > 90%), 생식 세포 종양 (난소암의 약 2-3%) 및 기질 난소암 (난소암의 약 5%; Ozols et al., 1997, Cancer Principles and Practice of Oncology, 5th ed., DeVita et al., Eds. pp. 1502)으로 분류된다. EOC에 비해, 생식 세포 종양 및 기질 난소암은 초기 단계에서 보다 쉽게 검출되고 치료되며, 이는 이들 2가지 종류의 난소암에 걸린 환자에 대한 보다 높은/우수한 생존율로 해석된다.
수많은 종류의 난소 종양이 있으며, 이들 중 일부는 양성이고 다른 일부는 악성이다. 치료법 (비-치료법 포함) 선택 및 환자 치료의 예측은 난소암의 정확한 분류에 따른다. 난소암은 암이 유래되는 세포의 종류 및 난소암이 양성인지 악성인지에 따라 명명된다. 인정되는 조직학적 종양 종류는 예를 들어 장액성, 점액성, 자궁내막양 및 투명 세포 종양을 포함한다. 또한, 난소암은 인정되는 등급 및 단계 척도 (scale)에 따라 분류된다.
등급 I에서, 종양 조직은 잘 분화된다. 등급 II에서, 종양 조직은 중정도로 잘 분화된다. 등급 III에서, 종양 조직은 거의 분화되지 않는다. 이 등급은 등급 I 및 II보다 덜 양호한 예후와 관련된다. 단계 I은 일반적으로 하나의 난소 (단계 IA) 또는 두 난소 (단계 IB)를 둘러싸는 피막 내에 한정되지만, 일부 단계 I (즉, 단계 IC) 암에서는, 악성 세포는 복수, 복막 세정 유체에서 또는 난소 표면에서 검출될 수 있다. 단계 II는 하나 또는 두 난소에서 다른 골반 구조로 종양의 확장 또는 전이를 포함한다. 단계 IIA에서, 종양은 확장하거나 자궁, 난관 또는 둘 모두에 전이된다. 단계 IIB는 골반으로의 종양의 확장을 포함한다. 단계 IIC는 악성 세포가 복수, 복막 세정 유체에서 또는 난소 표면 상에서 검출될 수 있는 단계 IIA 또는 IIB이다. 단계 III에서, 종양은 소장 또는 그물막으로의 적어도 하나의 악성 확장을 포함하고, 현미경적 (단계 IIIA) 또는 육안적 (직경 < 2 cm, 단계 IIIB; 직경 > 2 cm, 단계 IIIC) 크기의 골반외 복막 착상물을 형성하거나, 후복막강 또는 서혜림프절로 전이된다 (단계 IIIC의 대안적인 지표). 단계 IV에서, 종양의 원격 (즉, 비-복막) 전이가 검출될 수 있다.
상이한 단계의 난소암의 지속기간은 현재 알려지지 않았으나, 각각 적어도 약 1년인 것으로 생각된다 (Richart et al., 1969, Am. J. Obstet. Gynecol. 105:386). 예후는 단계 지정이 증가함에 따라 감퇴한다. 예를 들어, 단계 I, II, III 및 IV 난소암으로 진단된 환자에 대한 5년 생존율은 각각 80%, 57%, 25% 및 8%이다.
세번째로 가장 우세한 부인과 암임에도 불구하고, 난소암은 부인과 암에 걸린 환자들의 주된 사망 원인이다. 난소암의 과잉 사망률은 초기-단계 난소암에 걸린 환자 사이의 실질적인 증상의 부재 및 초기 단계의 난소암을 진단하는 어려움에 기인한다. 난소암에 걸린 환자는 가장 종종 비특이적 병증, 예를 들어 이상 질출혈, 위장관 증상, 요로 증상, 하복부통 및 전신성 복부 팽만을 나타낸다. 이들 환자는 부신생물 증상 또는 고통의 원인을 명백하게 표시하는 증상을 거의 나타내지 않는다. 현재, 난소암에 걸린 환자의 약 40% 미만이 단계 I 또는 단계 II를 나타낸다. 난소암의 관리는 치료법이 훨씬 더 일반적으로 효능있을 때보다 질병이 초기 단계에 검출될 수 있다면 현저하게 향상될 것이다.
난소암은 부분적으로 환자로부터 일상적인 의료력을 수집함으로써 및 환자에 대해 신체 검사, x-선 검사 및 화학적 및 혈액학적 연구를 수행함으로써 진단될 수 있다. 환자에서 난소암의 표시일 수 있는 혈액학적 시험은 CA125 및 DF3으로 지정된 단백질의 혈청 수준 및 리소포스파티딘산 (LPA)의 혈장 수준의 분석을 포함한다. 난소 촉진 및 초음파 기술 (특히 질내 초음파 및 색 도플러 혈류 초음파 기술 포함)은 난소 종양의 검출 및 난소암의 양성 난소낭과의 구별을 도울 수 있다. 그러나, 난소암의 확진에는 전형적으로 환자의 진단개복술을 수행하는 것이 필요하 다.
난소암 검출을 위한 효능있는 시험 (예를 들어 스크리닝, 리플렉스 (reflex) 또는 모니터링)은 많은 요인에 의해 특성화될 수 있다. 분석의 "감도"는 시험이 난소암에 걸린 개인에서 양성 결과를 낼 가능성을 나타낸다. 분석의 "특이성"은 시험이 난소암에 걸리지 않은 개인에서 음성 결과를 낼 가능성을 나타낸다. 분석의 "양성 예측값" (PPV)은 모든 양성 결과 (즉, 난소암에 걸린 환자에 대한 양성 분석 결과 + 난소암에 걸리지 않은 환자에 대한 양성 분석 결과)에 대한 진정한 양성 결과 (즉, 난소암에 걸린 환자에 대한 양성 분석 결과)의 비율이다. 분석이 난소암에 대한 적절한 전체 인구 (population-wide) 스크리닝 툴 (tool)이 되기 위해서는, 분석의 PPV가 적어도 약 10%이어야 하는 것으로 추정된다 (Rosenthal et al., 1998, Sem. Oncol. 25:315-325). 따라서, 환자에서 난소암을 검출하기 위한 스크리닝 분석이 높은 감도와 높은 PPV를 갖는 것이 바람직할 것이다. 모니터링 및 리플렉스 시험은 또한 적절한 상세 내역을 필요로 할 것이다.
공지된 난소암 검출 방법의 비용, 제한된 감도 및 제한된 특이성 때문에, 스크리닝은 전체 인구에 대해 현재 시행되지 않는다. 또한, 난소암의 징후에 대한 양성 결과를 차단하는 환자에서 난소암을 진단하기 위해 개복술을 시행할 필요는 바람직한 전체 인구 스크리닝을 제한하여, 10%를 훨씬 더 초과하는 PPV가 바람직할 것이다.
선행 기술에서 난소암에 대한 진단 마커로서 혈청 CA125 수준을 사용한 것은 상기 방법이 일반적 스크리닝 방법으로서 사용하기에 불충분한 특이성을 보였음을 나타냈다. 환자로부터 얻은 연속 소급 샘플 내 CA125 수준을 해석하기 위해 정교한 알고리즘을 사용하는 것은 난소암의 검출을 보다 초기 단계로 바꾸지 않으면서 방법의 특이성을 개선시켰다 (Skakes, 1995, Cancer 76:2004). 난소암을 포함한 부인과 암을 검출하기 위해 LPA를 스크리닝하는 것은 약 96%의 감도 및 약 89%의 특이성을 보였다. 그러나, CA125-기초 스크리닝 방법 및 LPA-기초 스크리닝 방법은 각각 난소암 이외의 질병에 걸린 환자의 혈청 내 CA125 및 LPA의 존재에 의해 방해된다. 예를 들어, 혈청 CA125 수준은 월경, 임신, 위장관 및 간 질환, 예를 들어 대장염 및 경화증, 심장막염, 신장병 및 다양한 비-난소 악성종양과 관련된 것으로 알려져 있다. 혈청 LPA는 예를 들어 비-난소 부인과 악성종양의 존재에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. CA125 및 LPA에 대한 현재의 스크리닝 방법보다 난소암에 대해 더 큰 특이성을 갖는 스크리닝 방법이 초기 단계 난소암에 대한 전체 인구 스크리닝을 제공할 수 있을 것이다.
현재, 환자에서 진단된 약 60% 초과의 난소암이 단계 III 또는 단계 IV 암이다. 이들 단계에서 치료법은 세포감소 수술 (실행가능할 때) 및 화학요법으로 크게 제한되고, 이들 둘 모두는 전이된 종양의 확산 및 발달을 느리게 하는 것을 목적으로 한다. 실질적으로 모든 후기 단계 난소암 환자는 현재 일차 치료로서 조합 화학요법, 보통 백금 화합물 및 탁산의 조합물을 투여받고 있다. 반응하는 환자에 대한 중앙 생존율은 약 1년이다. 약제, 예를 들어 독소루비신, 시클로포스파미드, 시스플라틴, 헥사메틸멜라민, 파클리탁셀 및 메토트렉세이트를 포함하는 조합 화학요법은 단일 약제 치료법에 비해 이들 그룹에서 생존율을 개선시킬 수 있다. 최근 개발된 다양한 화학요법제 및 치료 요법은 또한 진행된 난소암의 치료에 유용한 것으로 증명되었다. 예를 들어, 토포이소머라제 I 억제제 토펙탄의 사용, 화학요법 부작용을 최소화하기 위한 아미포스틴의 사용, 및 복막에 착상된 종양의 환자에 대한 복막내 화학요법의 사용은 적어도 제한된 효용성을 증명하였다. 그러나, 현재, 단계 III 난소암에 걸린 환자에 대한 5년 생존율은 25%이고, 단계 IV 난소암에 걸린 환자에 대한 생존율은 8%이다.
요약하면, 보다 초기에 난소암이 검출될수록, 치료적 개입의 침습성 및 치료적 개입과 관련된 부작용이 최소화된다. 보다 중요하게는, 보다 초기에 암이 검출될수록, 난소암 환자의 생존율 및 삶의 질이 향상된다. 따라서, 가능한 한 초기에 난소암을 검출하는 방법이 절박하게 필요하다. 난소암의 재발을 검출하는 방법 및 치료 효능을 예측하고 모니터링하기 위한 방법이 또한 필요하다. 난소암을 치료하기 위한 신규한 치료 방법이 추가로 필요하다. 본 발명은 이러한 필요를 만족시킨다.
본 발명은 표 1에 나열한 암 마커 (이하 "마커" 또는 "본 발명의 마커")에 관한 것이다. 본 발명은 마커에 의해 코딩되거나 마커에 대응하는 핵산 및 단백질(이하 각각 "마커 핵산" 및 "마커 단백질")을 제공한다. 본 발명은 추가로 상기 단백질 및(또는) 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 유도체 및 항체 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 난소암 검출 및 치료에 관련된 다양한 진단, 모니터링, 시험 및 다른 방법에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 본 발명은 환자 샘플에서 본 발명의 마커의 발현 수준과 대조군, 예를 들어 난소암에 걸리지 않은 환자로부터의 샘플에서 정상 수준의 마커의 발현을 비교하는 단계를 포함하는, 환자가 난소암에 걸렸는지 또는 난소암 발생 위험이 정상보다 더 높은지 평가하는 진단 방법을 제공한다. 정상 수준에 비교할 때 환자 샘플 내의 상당히 더 큰 마커의 발현 수준은 환자가 난소암에 걸렸거나 난소암 발생 위험이 정상보다 더 높다는 표시이다.
진단 방법의 바람직한 실시태양에서, 마커는 단계 I 난소암 환자, 단계 II 난소암 환자, 단계 III 난소암 환자, 단계 IV 난소암 환자, 등급 I 난소암 환자, 등급 II 난소암 환자, 등급 III 난소암 환자, 상피성 난소암 환자, 기질 난소암 환자, 생식 세포 난소암 환자, 악성 난소암 환자, 양성 난소암 환자, 장액성 신생물 난소암 환자, 점액성 신생물 난소암 환자, 자궁내막양 신생물 난소암 환자 및(또는) 투명 세포 신생물 난소암 환자의 적어도 약 20%에서 적어도 2배 과다발현된다.
본 발명의 진단 방법은 확인된 골반 덩어리 또는 난소암과 관련된 증상이 있는 환자에 대해 특히 유용하다. 본 발명의 방법은 또한 난소암 발생 위험이 높은 환자에 (예를 들어, 난소암의 가족력이 있는 환자, 돌연변이 종양유전자를 갖는 것으로 확인된 환자 및 약 50세 이상의 환자) 특히 유용할 수 있다.
환자가 난소암에 걸렸는지 평가하는 바람직한 진단 방법 (예를 들어, 새로운 검출 ("스크리닝"), 재발의 검출, 리플렉스 시험)에서, 방법은 환자 샘플에서 본 발명의 마커의 발현 수준과 대조군 비-난소암 샘플에서 정상 수준의 마커의 발현을 비교하는 것을 포함한다. 정상 수준에 비교할 때 환자 샘플 내의 상당히 더 큰 마커의 발현 수준은 환자가 난소암에 걸렸다는 표시이다.
본 발명은 또한 환자에서 난소암을 억제하기 위한 치료의 효능을 평가하기 위한 진단 방법을 제공한다. 상기 방법은 적어도 일부의 치료를 환자에게 제공하기 전에 환자로부터 얻은 제1 샘플 내의 본 발명의 마커의 발현과 일부의 치료를 제공한 이후 환자로부터 얻은 제2 샘플 내의 마커의 발현을 비교하는 것을 포함한다. 제1 샘플 내의 수준에 비해 제2 샘플 내의 상당히 더 낮은 마커의 발현 수준은 치료가 환자에서 난소암을 억제하는데 효과적이라는 표시이다.
이들 방법에서 "요법"은 화학요법, 방사선 요법, 종양 조직의 수술적 제거, 유전자 요법 및 생물학적 요법, 예를 들어 항체 및 케모킨의 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는 난소암을 요법하기 위한 임의의 요법일 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 예를 들어 종양 부하량 (burden)의 감소를 평가하기 위해 요법 전, 요법 동안 및 요법 후 환자를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 진단 방법은 화학적 또는 생물학적 약제를 사용하는 요법에 관한 것이다. 이들 방법은 화학적 또는 생물학적 약제의 존재 하에 유지시킨 환자로부터 얻은 제1 샘플 내의 본 발명의 마커의 발현과 약제의 부재 하에 유지시킨 환자로부터 얻은 제2 샘플 내의 마커의 발현을 비교하는 것을 포함한다. 제2 샘플의 수준에 비해 제1 샘플 내의 상당히 더 낮은 마커의 발현 수준은 약제가 환자에서 난소암을 억제하는데 효과적이라는 표시이다. 한 실시태양에서, 제1 및 제2 샘플은 환자로부터 얻은 단일 샘플의 일부 또는 환자로부터 얻은 모아진 샘플의 일부일 수 있다.
본 발명은 추가로 환자에서 난소암의 진행을 평가하기 위한 모니터링 방법을 제공하고, 상기 방법은 제1 시점에서 환자 샘플에서의 본 발명의 마커의 발현을 검출하고; 후속 시점에 적시에 검출을 반복하고; 검출된 발현 수준을 비교하고, 그로부터 환자에서 난소암의 진행을 모니터링하는 것을 포함한다. 제1 시점에서의 샘플의 수준으로부터 후속 시점에서의 샘플 내의 상당히 더 큰 마커의 발현 수준은 난소암이 진행했다는 표시인 반면, 상당히 더 낮은 수준의 발현은 난소암이 퇴행했다는 표시이다.
본 발명은 난소암이 전이되었거나 미래에 전이할 가능성이 있는지 결정하기 위한 진단 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 환자 샘플 내의 본 발명의 마커의 발현 수준과 대조 샘플 내의 정상 수준 (또는 비전이 수준)의 마커의 발현을 비교하는 것을 포함한다. 정상 수준 (또는 비전이 수준)에 비교할 때 환자 샘플 내의 상당히 더 큰 수준의 발현은 난소암이 전이했거나 미래에 전이할 가능성이 있다는 표시이다.
본 발명은 또한 환자에서 난소암을 억제하기 위한 조성물을 선택하기 위한 시험 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자로부터 암 세포를 포함하는 샘플을 얻고; 샘플의 부분표본을 다수의 시험 조성물의 존재 하에 개별적으로 유지시키고; 각각의 부분표본 내의 본 발명의 마커의 발현을 비교하고; 이어서 다른 시험 조성물의 존재 하의 마커의 발현 수준에 비해 바로 그 시험 조성물을 함유하는 부분표본 내의 마커의 발현 수준을 상당히 감소시키는 하나의 시험 조성물을 선택하는 것을 포함한다.
본 발명은 추가로 화합물의 난소 발암 잠재력을 평가하는 시험 방법을 제공한다. 상기 방법은 난소 세포의 개별 부분표본을 화합물의 존재 및 부재 하에 유지시키고; 각각의 부분표본 내의 본 발명의 마커의 발현을 비교하는 것을 포함한다. 화합물의 부재 하에 유지된 부분표본의 수준에 비해 화합물의 존재 하에 유지된 부분표본 내의 상당히 더 큰 마커의 발현 수준은 화합물이 난소 발암 잠재력을 갖는다는 표시이다.
또한, 본 발명은 추가로 환자에서 난소암을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자로부터 암 세포를 포함하는 샘플을 얻고; 샘플의 부분표본을 다수의 조성물의 존재 하에 개별적으로 유지시킨 다음; 각각의 부분표본 내의 본 발명의 마커의 발현을 비교하고; 마지막으로 다른 조성물의 존재 하의 마커의 발현 수준에 비해 바로 그 조성물을 함유하는 부분표본 내의 마커의 발현 수준을 상당히 저하시키는 적어도 하나의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
상기 언급된 방법에서, 샘플 또는 환자 샘플은 환자로부터 얻은 세포를 포함한다. 세포는 예를 들어 난소 조직 생검 또는 조직학적 절개에 의해 모은 난소 조직 샘플에서 찾을 수 있다. 한 실시태양에서, 환자 샘플은 난소-관련 체액이다. 상기 체액은 예를 들어 혈액, 림프, 복수액, 부인과 유체, 낭액 (cystic fluid), 뇨 및 복막 세정에 의해 모은 유체를 포함한다. 다른 실시태양에서, 샘플은 환자로부터 얻은 세포를 포함한다. 상기 실시태양에서, 세포는 복막 세정에 의해 모은 유체, 자궁 세정에 의해 모은 유체, 자궁 유체, 자궁 삼출액, 흉수 및 난소 삼출액으로 이루어진 군 중에서 선택되는 유체에서 찾을 수 있다. 추가의 실시태양에서, 환자 샘플은 생체내의 것이다.
본 발명에 따르면, 샘플 내의 본 발명의 마커의 발현 수준은 예를 들어, 샘플에서
대응하는 마커 단백질 (예를 들어 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42 또는 서열 44 중의 하나의 서열을 갖는 단백질) 또는 단백질의 단편 (예를 들어 단백질 또는 단백질 단편과 특이적으로 결합하는 시약, 예를 들어 항체, 항체 유도체, 항체 단편 또는 단일쇄 항체를 사용함으로써);
대응하는 마커 핵산 (예를 들어 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41 또는 서열 43 중의 하나의 서열을 갖는 핵산) 또는 핵산의 단편 (예를 들어 샘플로부터 얻은 전사된 폴리뉴클레오티드를 전체 서열 또는 서열 세그먼트 또는 그의 보체를 갖는 하나 이상의 핵산이 고정된 기질과 접촉시킴으로써); 또는
대응하는 마커 단백질에 의해 직접적으로 (즉, 촉매된) 또는 간접적으로 생산되는 대사물의 존재를 검출함으로써 평가할 수 있다.
본 발명에 따르면, 임의의 상기 언급된 방법은 당업계에 공지된 난소암 마커를 포함하는 다수 (예를 들어 2, 3, 5 또는 10 이상)의 난소암 마커를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 방법에서, 각각의 다수의 마커 (이 중 적어도 하나는 본 발명의 마커임)의 샘플 내 발현 수준을 난소암에 걸리지 않은 대조군 인간으로부터 얻은 동일한 종류의 샘플 내의 각각의 다수의 마커의 정상 또는 대조 발현 수준과 비교한다. 마커의 대응하는 정상 수준에 비해 본 발명의 하나 이상의 마커 또는 그의 일부 조합물의 샘플 내의 상당히 변경된 (즉, 단일 마커를 사용하여 상기한 방법에 명시된 바와 같이 증가 또는 감소된) 발현 수준은 환자가 난소암에 걸렸다는 표시이다. 상기 모든 방법에 대해, 마커(들)은 바람직하게는 방법의 양성 예측값이 적어도 약 10%이도록 선택된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 마커 단백질 (예를 들어 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42 또는 서열 44 중의 임의의 서열을 갖는 단백질) 또는 단백질의 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항체, 항체 유도체 및 항체 단편을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유동물을 전체 마커 단백질 또는 마커 단백질의 10 이상의 아미노산 또는 그 이상의 세그먼트를 포함하는 단백질 또는 펩티드로 면역화시키는 것을 포함하고, 여기서 단백질 또는 펩티드는 세포로부터 또는 화학적 합성에 의해 얻을 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 모노클로날 및 단일쇄 항체를 생산하는 것을 포함하며, 이는 면역화시킨 포유동물로부터 비장세포를 단리하고, 단리된 비장세포를 무한증식세포주와 융합시켜 하이브리도마를 형성하고, 개별 하이브리도마를 마커 단백질 (예를 들어, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42 또는 서열 44 중의 임의의 서열을 갖는 단백질) 또는 단백질의 단편과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 것에 대해 스크리닝하는 것을 추가로 포함할 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 다양한 진단 및 시험 키트에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 본 발명은 환자가 난소암에 걸렸는지 평가하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 발명의 마커의 발현을 평가하기 위한 시약을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 환자에서 난소암을 억제하기 위한 화학적 또는 생물학적 물질의 적합성을 평가하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 발명의 마커의 발현을 평가하기 위한 시약을 포함하고, 또한 하나 이상의 상기 물질을 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 본 발명은 난소암 세포의 존재를 평가하거나 난소암을 치료하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 마커 단백질 또는 단백질의 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 포함한다. 상기 키트는 또한 다수의 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 포함할 수 있고, 여기서 다수의 상기 항체 물질은 마커 단백질 또는 단백질의 단편과 특이적으로 결합한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 또한 난소암 세포의 존재를 평가하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 마커 핵산 또는 핵산의 단편과 특이적으로 결합하는 핵산 프로브를 포함한다. 키트는 또한 다수의 프로브를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 프로브는 마커 핵산 또는 핵산의 단편과 특이적으로 결합한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 난소암에 걸렸거나 난소암 발생 위험이 있는 환자를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명의 마커의 발현의 감소 및(또는) 그의 생물학적 기능의 저해를 유도하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 환자에게 마커 핵산에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 세그먼트를 제공하는 것을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 환자에게 마커 핵산 또는 그의 단편의 안티센스 폴리뉴클레오티드를 발현하는 벡터의 전달을 통해 제공될 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 환자에게 마커 단백질 또는 마커 단백질의 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 제공하는 것을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편은 표 1에 나열된 임의의 마커의 서열을 갖는 단백질 또는 상기 단백질의 단편과 특이적으로 결합한다.
본 발명의 방법 및 키트가 또한 공지의 난소암 마커를 포함하는 공지의 암 마커를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 상기 방법 및 키트가 난소암 이외의 암을 확인하기 위해 사용될 수 있음도 이해될 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 마커 단백질 또는 마커 폴리펩티드, 예를 들어 마커 단백질의 생물학적 활성 부분을 코딩하는 핵산 분자를 특징으로 한다. 바람직한 실시태양에서, 단리된 핵산 분자는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42 또는 서열 44의 아미노산 서열을 갖는 마커 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41 또는 서열 43에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 마커 핵산 분자를 제공한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41 또는 서열 43에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 동일한 핵산 분자 (예를 들어, 천연 대립유전자 변이체)를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 엄격한 혼성화 조건 하에 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41 또는 서열 43의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 혼성화하는 핵산 분자를 제공하고, 여기서 상기 핵산은 전장 마커 단백질 또는 그의 활성 단편을 코딩한다.
관련 측면에서, 본 발명은 추가로 본원에 기재된 마커 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조체를 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 핵산 분자는 천연 또는 이종성 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 마커 핵산 분자를 함유하는 벡터 및 숙주 세포, 예를 들어 폴리펩티드를 생산하기에 적합한 벡터 및 숙주 세포가 또한 포함된다.
또다른 관련 측면에서, 본 발명은 마커 코딩 핵산의 검출을 위한 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 적합한 핵산 단편을 제공한다.
다른 관련 측면에서, 마커 코딩 핵산 분자에 안티센스인 단리된 핵산 분자를 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 마커 폴리펩티드, 예를 들어 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42 또는 서열 44에 나타낸 아미노산 서열; 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42 또는 서열 44에 나타낸 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열; 또는 본원에 기재된 바와 같은 엄격한 혼성화 조건 하에 뉴클레오티드 서열 번호 (nts)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되는 아미노산 서열 (여기서 핵산은 전장 마커 단백질 또는 그의 활성 단편을 코딩한다)을 갖는 마커 폴리펩티드를 제공한다.
관련 측면에서, 본 발명은 추가로 본원에 기재된 마커 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조체를 제공한다.
관련 측면에서, 본 발명은 비-마커 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되어 융합 단백질을 형성하는 마커 폴리펩티드 또는 단편을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 마커 폴리펩티드와 반응하거나, 보다 바람직하게는 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편을 특징으로 한다.
본 발명은 난소 세포의 암 상태와 관련되는 표 1에 확인된 신규하게 발견된 마커에 관한 것이다. 임의의 이들 마커 또는 이들 마커의 조합물의 정상보다 더 큰 발현 수준은 환자에서 난소암의 존재와 상호관련되는 것으로 밝혀졌다. 샘플 내의 난소암의 존재, 샘플 내의 난소암의 부재, 난소암의 단계를 검출하고, 유방암이 전이되었는지 평가하고, 환자에서 난소암의 예방, 진단, 특성화 및 요법에 관련된 난소암의 다른 특징과 함께 유방암 환자의 가능한 임상 결과를 예측하는 방법이 제공된다. 난소암의 치료 방법이 또한 제공된다.
표 1은 본 발명의 모든 마커를 나열하고, 이들 마커는 정상 (즉, 비암성) 난소 세포에 비해 난소암 세포에서 과다발현된다. 표 1에서, 마커는 명칭 ("마커") (유전자가 일반적으로 알려져 있는 명칭은 적절한 경우 ("유전자 명칭")에 의해), 마커에 의해 코딩되거나 마커에 대응하는 뉴클레오티드 전사체의 cDNA 서열의 서열 목록 식별자 ("서열 (nts)"), 뉴클레오티드 전사체에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열의 서열 목록 식별자 ("서열 (AAs)") 및 cDNA 서열 내의 단백질 코딩 서열의 위치 ("CDS")로 확인된다.
난소암 마커
마커 유전자 명칭 서열 (nts) 서열 (AAs) CDS
M138 CTHRC1: 1을 함유하는 콜라겐 삼중나선 반복체 1 2 27..863
M437 FLJ10546: 가설적 단백질 FLJ10546 3 4 28..1815
M445 FLJ23499: 가설적 단백질 FLJ23499 5 6 21..473
M452A IMP-2: IGF-II mRNA-결합 단백질 2, 변이체 1 7 8 65..1735
M712 IMP-2: IGF-II mRNA-결합 단백질 2, 변이체 2 9 10 65..1603
OV32A KLK10: 칼리크레인 10 11 12 220..1050
OV32A KLK6: 칼리크레인 6 (뉴로신, 자임) 13 14 246..980
M472 MAL2: T-세포 분화 단백질 2 15 16 88..618
M590 FLJ90687; 가정적 단백질 FLJ90687 17 18 21..404
OV52A MMP7: 매트릭스 메탈로프로테이나제 7 (마트리리신, 유테린) 19 20 48..851
OV51A PTGS1: 프로스타글란딘-엔도페록시드 신타제 1 (프로스타글란딘 G/H 신타제 및 시클로옥시게나제), 전사체 변이체 1 21 22 136..1935
M713 PTGS1: 프로스타글란딘-엔도페록시드 신타제 1 (프로스타글란딘 G/H 신타제 및 시클로옥시게나제), 전사체 변이체 2 23 24 136..1824
OV55 S100A1: S100 칼슘-결합 단백질 A1 25 26 114..398
M458 SCGB2A1: 세크레토글로빈, 패밀리 2A, 멤버 1 27 28 65..352
M714 SLC39A4: 용해질 캐리어 패밀리 39 (아연 트랜스포터), 멤버 4, 변이체 1 29 30 101..2044
M715 SLC39A4: 용해질 캐리어 패밀리 39 (아연 트랜스포터), 멤버 4, 변이체 2 31 32 101..1762
M185A SLPI: 분비성 류코사이트 프로테아제 억제제 (안티류코프로테이나제) 33 34 23..421
OV65 SPON1: VSGP/F-스폰딘 35 36 25..2448
M476 TACSTD2: 종양-관련 칼슘 시그날 변환기 2 37 38 616..1587
M716 WFDC2: WAP 4-디술피드 코어 도메인 2, 변이체 1 39 40 28..402
M717 WFDC2: WAP 4-디술피드 코어 도메인 2, 변이체 2 41 42 67..288
M724 MGC13057: 가정적 단백질 MGC13057 43 44 339..626
정의
본원에서 사용되는 각각의 하기 용어는 본 단락과 관련된 의미를 갖는다.
부정관사는 하나 또는 하나 이상 (즉, 적어도 하나)의 관사의 문법적 대상을 나타내도록 본원에서 사용된다. 예로서, "한 요소 (element)"는 하나의 요소 또는 2 이상의 요소를 의미한다.
"마커"는 정상 또는 건강한 조직 또는 세포 내의 그의 발현 수준으로부터 조직 또는 세포 내의 변경된 발현 수준이 질병 상태, 예를 들어 암과 관련되는 유전자이다. "마커 핵산"은 본 발명의 마커에 의해 코딩되거나 그에 대응하는 핵산 (예를 들어, mRNA, cDNA)이다. 상기 마커 핵산은 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41 또는 서열 43 중의 임의의 전체 서열 또는 부분 서열을 포함하는 DNA (예를 들어, cDNA)를 포함할 수 있다. 마커 핵산은 또한 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41 또는 서열 43의 임의의 서열에 대응하는 전체 서열 또는 부분 서열 또는 상기 서열의 보체를 포함하는 RNA를 포함할 수 있다 (여기서 모든 티미딘 잔기는 우리딘 잔기로 교체됨). "마커 단백질"은 본 발명의 마커에 의해 코딩되거나 그에 대응하는 단백질이다. 마커 단백질은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10. 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42 또는 서열 44 중의 임의의 전체 서열 또는 부분 서열을 포함한다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호 교환가능하게 사용된다.
"마커 세트"는 2 이상의 마커의 군이다.
용어 "프로브"는 특수하게 의도된 표적 분자, 예를 들어, 마커에 의해 코딩되거나 그에 대응하는 뉴클레오티드 전사체 또는 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 나타낸다. 프로브는 당업계의 숙련인에 의해 합성되거나 적절한 생물학적 제제로부터 유도될 수 있다. 표적 분자 검출을 위해, 프로브는 본원에 기재된 바와 같이 표지되도록 특수하게 디자인될 수 있다. 프로브로서 이용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "난소암"은 암종 (예를 들어, 계내 (in situ) 암종, 침습 암종, 전이 암종) 및 악성전 상태를 포함한다.
"난소-관련" 체액은 환자의 체내에 있을 때 난소 세포에 접촉하거나 통과하는 유체, 또는 난소 세포로부터 탈락된 세포 또는 단백질, 예를 들어 난소 상피가 그를 통해 통과할 수 있는 유체이다. 예시적인 난소-관련 체액은 혈액, 림프, 복수, 부인과 유체, 낭액, 뇨 및 복막 세정에 의해 모은 유체를 포함한다.
"샘플" 또는 "환자 샘플"은 환자로부터 얻은 세포, 예를 들어, 종괴 생검, 혈액, 림프 및 낭액을 포함하는 체액, 및 유두 흡인물을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 환자 샘플은 생체내에 있다.
"정상" 수준의 마커의 발현은 난소암에 걸리지 않은 인간 피험자 또는 환자의 난소 세포 내의 마커 발현 수준이다.
마커의 "과다 발현" 또는 "상당히 더 높은 수준의 발현"은 발현을 평가하기 위해 사용된 분석의 표준 오차보다 큰 시험 샘플 내의 발현 수준을 나타내고, 바람직하게는 대조 샘플 (예를 들어, 질병과 관련된 마커를 갖지 않는 건강한 피험자로부터의 샘플) 내의 마커 발현 수준, 및 바람직하게는 몇몇 대조 샘플 내의 마커의 평균 발현 수준의 적어도 2배, 보다 바람직하게는 3, 4, 5 또는 10배이다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 산물의 발현에 요구되는 핵산 서열을 의미한다. 몇몇 경우에 상기 서열은 코어 (core) 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우에 상기 서열은 또한 인핸서 서열 및 유전자 산물의 발현에 요구되는 다른 조절 성분을 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 유전자 산물을 조직 특이적 방식으로 발현하는 것일 수 있다.
"구성적" 프로모터는 유전자 산물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건 하에 살아있는 인간 세포에서 유전자 산물을 생성시키는 뉴클레오티드 서열이다.
"유도성" 프로모터는 유전자 산물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때 프로모터에 대응하는 유도인자가 세포에 존재할 때에만 살아있는 인간 세포에서 유전자 산물을 생성시키는 뉴클레오티드 서열이다.
"조직 특이적" 프로모터는 유전자 산물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때 세포가 프로모터에 대응하는 조직 유형의 세포일 경우에만 살아있는 인간 세포에서 실질적으로 유전자 산물을 생성시키는 뉴클레오티드 서열이다.
"전사된 폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드 전사체"는 본 발명의 마커의 전사 및 존재할 경우 RNA 전사체의 정상적인 전사후 프로세싱 (예를 들어 스플라이싱) 및 RNA 전사체의 역전사에 의해 제조된 성숙 mRNA의 전체 또는 일부에 상보적이거나 상동성인 폴리뉴클레오티드 (예를 들어 mRNA, hnRNA, cDNA, 또는 상기 RNA 또는 cDNA의 유사체)이다
"상보성"은 2개의 핵산 가닥의 영역들 사이 또는 동일한 핵산 가닥의 2개의 영역들 사이의 넓은 개념의 서열 상보성을 나타낸다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 제1 영역에 역평행인 제2 핵산 영역의 잔기 (잔기가 티민 또는 우라실인 경우)와 특이적 수소 결합을 형성할 ("염기 페어링할") 수 있음이 공지되어 있다. 유사하게, 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기는 제1 가닥에 역평행인 제2 핵산 가닥의 잔기 (잔기가 구아닌인 경우)와 염기 페어링할 수 있음이 공지되어 있다. 핵산의 제1 영역은 2개의 영역이 역평행 방식으로 배열될 때, 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기 짝짓기할 수 있는 경우 동일하거나 상이한 핵산의 제2 영역에 상보성이다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하여, 제1 및 제2 부분이 역평행 방식으로 배열될 때, 제1 부분의 뉴클레오티드 잔기의 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 제2 부분 내의 뉴클레오티드 잔기와 염기 페어링할 수 있다. 보다 바람직하게는, 제1 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기가 제2 부분 내의 뉴클레오티드 잔기와 염기 페어링할 수 있다.
본원에서 사용되는 "상동성"은 동일한 핵산 가닥의 2개의 영역들 사이 또는 2개의 상이한 핵산 가닥의 영역들 사이의 뉴클레오티드 서열 유사성을 나타낸다. 두 영역 내의 뉴클레오티드 잔기 위치를 동일한 뉴클레오티드 잔기가 차지하면, 상기 영역은 그 위치에서 상동성이다. 각 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기 위치를 동일한 잔기가 차지하면 제1 영역은 제2 영역에 상동성이다. 2개의 영역 사이의 상동성은 동일한 뉴클레오티드 잔기가 차지하는 2개의 영역의 뉴클레오티드 잔기 위치의 비율로 표시한다. 예로서, 뉴클레오티드 서열 5'-ATTGCC-3'을 갖는 영역 및 뉴클레오티드 서열 5'-TATGGC-3'을 갖는 영역은 50% 상동성을 공유한다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 가져서, 각각의 부분의 뉴클레오티드 잔기 위치의 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%를 동일한 뉴클레오티드 잔기가 차지한다. 보다 바람직하게는, 각각의 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기 위치를 동일한 뉴클레오티드 잔기가 차지한다.
분자는 상당한 분획의 분자를 기판으로부터 분리시키지 않으면서 기판을 유체 (예를 들어 표준 염수 시트레이트, pH 7.4)로 세정할 수 있을 정도로 기판과 공유 또는 비공유 결합하면 기판에 "고정되거나" "부착된다".
본원에서 사용되는 "천연" 핵산 분자는 자연에서 발견되는 유기체에서 나타나는 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 또는 DNA 분자를 나타낸다.
암은 암의 적어도 하나의 증상이 완화되거나, 끝나거나, 느려지거나 방지되는 경우 "억제된다". 본원에서 사용되는 난소암은 또한 암의 재발 또는 전이가 감소되거나, 느려지거나, 지연되거나 또는 방지되는 경우 "억제된다".
키트는 본 발명의 마커의 발현을 특이적으로 검출하기 위한 적어도 하나의 시약, 예를 들어 프로브를 포함하는 임의의 제조품 (예를 들어 패키지 (package) 또는 용기)이다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유닛 (unit)으로 판촉되거나, 배급되거나 시판될 수 있다.
"본 발명의 단백질"은 마커 단백질 및 이들의 단편; 변이체 마커 단백질 및 이들의 단편; 마커 또는 변이체 마커 단백질의 적어도 15 아미노산 세그먼트를 포함하는 펩티드 및 폴리펩티드; 및 마커 또는 변이체 마커 단백질, 또는 마커 또는 변이체 마커 단백질의 적어도 15 아미노산 세그먼트를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
본원에서 달리 명시하지 않으면, 용어 "항체" 및 "항체들"은 천연 형태의 항체 (예를 들어 IgG, IgA, IgM, IgE) 및 재조합 항체, 예를 들어 단일쇄 항체, 키메릭 및 인간화 항체 및 다중특이적 항체와 상기한 모든 것의 단편 및 유도체를 널리 포함하며, 상기 단편 및 유도체는 적어도 항원 결합 부위를 갖는다. 항체 유도체는 항체 잔기에 컨쥬게이팅된 단백질 또는 화학적 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명은 부분적으로는 정상 (즉, 비암성) 난소 세포에서의 발현에 비교할 때 난소암 세포에서 과다발현된 새로 확인된 마커에 기초한다. 난소 세포에서 하나 이상의 이들 마커의 증대된 발현은 본원에서 조직의 암 상태와 상호관련된다. 본 발명은 난소 세포 (예를 들어 인간으로부터 얻은 세포, 배양된 인간 세포, 보관되거나 보존된 인간 세포 및 생체내 세포)의 암 상태를 평가하고 난소암에 걸린 환자를 치료하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 특히 환자가 난소암에 걸렸는지 평가하고; 인간 환자에서 난소암의 단계를 평가하고; 환자에서 난소암의 등급을 평가하고; 환자에서 난소암의 양성 또는 악성 성질을 평가하고; 환자에서 난소암의 전이 가능성을 평가하고; 유방암이 전이되었는지 결정하고; 유방암 환자의 임상 결과를 예측하고; 환자에서 난소암과 관련된 신생물의 조직학적 종류 (예를 들어 장액성, 점액성, 자궁내막양 또는 투명 세포 신생물)를 평가하고; 난소암을 치료하고(하거나) 환자가 난소암에 걸렸는지 평가하기 위해 유용한 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체를 제조하고; 난소암 세포의 존재를 평가하고; 환자에서 난소암을 억제하기 위한 하나 이상의 시험 화합물의 효능을 평가하고; 환자에서 난소암을 억제하기 위한 요법의 효능을 평가하고; 환자에서 난소암의 진행을 모니터링하고; 환자에서 난소암을 억제하기 위한 조성물 또는 요법을 선택하고; 난소암에 걸린 환자를 치료하고; 환자에서 난소암을 억제하고; 시험 화합물의 난소 발암 잠재력을 평가하고; 난소암 발생 위험이 있는 환자에서 난소암의 발병 (onset)을 예방하는 용도를 갖는다.
따라서, 본 발명은 환자가 난소암에 걸렸는지 평가하는 방법을 포함하고, 이는 환자가 전이전 난소암에 걸렸는지 평가하는 것을 포함한다. 상기 방법은 환자 샘플 내의 본 발명의 마커 (표 1에 나열된)의 발현 수준을 대조군, 예를 들어 비-난소암 샘플 내의 마커의 정상 발현 수준과 비교하는 것을 포함한다. 정상 수준에 비해 환자 샘플 내의 상당히 더 큰 마커의 발현 수준은 환자가 난소암에 걸렸다는 표시이다.
본 발명에 의해 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41 또는 서열 43 중 임의의 서열의 전체 또는 15 이상의 뉴클레오티드의 세그먼트 또는 상기 서열의 보체를 포함하는 핵산 및 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42, 서열 44 중 임의의 서열의 전체 또는 10 이상 아미노산의 세그먼트를 포함하는 폴리펩티드를 함유하는 유전자 전달 비히클 (vehicle), 숙주 세포 및 조성물 (모두 본원에 기재된)을 또한 제공한다.
본원에 기재된 바와 같이, 환자에서 난소암은 본 발명의 하나 이상의 마커의 증가된 발현 수준과 관련된다. 상기 논의한 바와 같이, 발현 수준의 이러한 변화 중 일부는 난소암 발생에 의한 것이지만, 이러한 변화 중 다른 것은 난소암 세포의 암 상태를 유도하고, 유지하고, 촉진시킨다. 따라서, 본 발명의 하나 이상의 마커의 발현 수준의 증가를 특징으로 하는 난소암은 마커의 발현 및(또는) 이들 마커에 의해 코딩되는 단백질의 기능 감소 및(또는) 저해에 의해 억제될 수 있다.
본 발명의 마커의 발현은 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 많은 방식으로 억제할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 마커(들)의 전사, 번역 또는 둘 모두를 억제하도록 난소암 세포에 제공될 수 있다. 별법으로, 마커 단백질에 특이적으로 결합하고, 적절한 프로모터/조절자 영역과 작동가능하게 연결된 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 단백질의 기능 또는 활성을 억제시킬 세포내 항체를 생성시키도록 세포에 제공될 수 있다. 마커의 발현 및(또는) 기능은 또한 난소암 세포를 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 사용하여 치료함으로써 억제될 수 있다. 본원에 기재된 방법을 사용하여, 마커의 발현을 억제하거나 마커 단백질의 기능을 억제하는 분자를 확인하기 위해, 특히 세포막을 가로지를 수 있을 정도로 충분히 작은 분자를 포함하는 다양한 분자를 스크리닝할 수 있다. 이렇게 확인된 화합물은 환자의 난소암 세포를 억제하기 위해 환자에게 제공될 수 있다.
본 발명의 임의의 마커 또는 마커 조합물, 및 본 발명의 마커와 조합되는 임의의 공지된 마커가 본 발명의 조성물, 키트 및 방법에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 난소암 세포 내의 마커의 발현 수준과 정상 난소 세포 내의 동일한 마커의 발현 수준 사이의 차이가 가능한 한 큰 마커를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 차이가 마커 발현을 평가하기 위한 방법의 검출 한계만큼 작을 수 있지만, 차이는 적어도 평가 방법의 표준 오차보다 더 크고, 바람직하게는 정상 난소 조직 내의 동일한 마커의 발현 수준보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 25배, 100배, 500배, 1000배 이상의 차이가 바람직하다.
특정 마커 단백질은 난소 세포 (즉, 정상 및 암 세포 중 하나 또는 둘 모두)로부터 세포를 둘러싸는 세포외 공간으로 분비되는 것이 알려져 있다. 이들 마커 단백질이 조직 생검 샘플보다 인간 환자로부터 보다 쉽게 수집될 수 있는 난소-관련 체액 샘플 내에서 검출될 수 있다는 사실 때문에, 이들 마커는 바람직하게는 본 발명의 조성물, 키트 및 방법의 특정 실시태양에서 사용된다. 또한, 마커 단백질의 검출을 위한 바람직한 생체내 기술은 피험자에게 단백질에 대해 작용하는 표지된 항체를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는 피험자 내의 그의 존재 및 위치가 표준 영상 기술에 의해 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.
임의의 특정 마커 단백질이 분비된 단백질인지 결정하는 것은 당업계의 숙련인에게 간단한 문제이다. 상기 결정을 위해, 마커 단백질을 예를 들어, 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 난소 세포주에서 발현시키고, 세포외액을 수집하고, 세포외액 내의 단백질의 존재 또는 부재를 평가한다 (예를 들어 단백질과 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여).
단백질의 분비를 검출하기 위해 사용될 수 있는 방법의 예를 하기한다. 약 8 x 105개의 293T 세포를 37℃에서 성장 배지 (10% 태송아지 혈청을 보충한 둘베코 (Dulbecco's) 개질 이글 (Eagle's) 배지 {DMEM})를 함유하는 웰 중에서 5% (v/v) CO2, 95% 공기 분위기 하에 약 60-70% 컨플루언스 (confluence)로 인큐베이팅한다. 이어서 세포를 웰당 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 2 ㎍의 DNA 및 10 ㎕의 LipofectAMINE™ (GIBCO/BRL 카탈로그 번호 18342-012)을 포함하는 표준 형질감염 혼합물을 사용하여 형질감염시킨다. 형질감염 혼합물을 약 5시간 동안 유지시킨 다음, 신선한 성장 배지로 교체하고 공기 분위기 내에 유지시킨다. 각 웰을 메티오닌 또는 시스테인을 함유하지 않는 DMEM (DMEM-MC; ICN 카탈로그 번호 16-424-54)으로 천천히 2회 세정한다. 약 1 ml의 DMEM-MC 및 약 50 마이크로퀴리의 Trans-35S™ 시약 (ICN 카탈로그 번호 51006)을 각 웰에 첨가한다. 웰을 상기한 5% CO2 분위기 하에 유지시키고 37℃에서 선택된 기간 동안 인큐베이팅한다. 인큐베이팅한 후, 150 ㎕의 조건화된 배지를 제거하고, 원심분리하여 부유 세포 및 파편을 제거한다. 상등액 내의 단백질의 존재는 단백질이 분비되었다는 표시이다.
난소-관련 체액의 예는 혈액 (예를 들어 전혈, 혈청, 그로부터 혈소판을 제거한 혈액 등), 림프, 복수액, 부인과 유체 (예를 들어 난소, 난관 및 자궁 분비물, 생리혈, 질 세척액, 난소 세포 샘플을 세정하기 위해 사용된 유체 등), 낭액, 뇨 및 복막 세정에 의해 수집한 유체 (예를 들어, 복강경검사 동안 적용되고 수집된 유체 또는 인간 환자의 복막강 내로 점적 주입하고 회수된 유체)를 포함한다. 이들 실시태양에서, 마커의 발현 수준은 환자로부터 얻은 난소-관련 체액 내의 마커 단백질의 양 (예를 들어 절대량 또는 농도)를 평가함으로써 평가할 수 있다. 물론, 유체는 유체 내의 마커의 양을 평가하기 전에 다양한 잘 알려진 수집후 제조 및 저장 기술 (예를 들어 저장, 동결, 한외여과, 농축, 증발, 원심분리 등)에 적용될 수 있다.
많은 난소-관련 체액 (즉, 보통 뇨를 제외)은 특히 난소 세포가 암성일 때, 보다 특히 난소암이 전이할 때 내부에 난소 세포, 예를 들어 난소 상피를 가질 수 있다. 난소암 세포를 함유할 수 있는 세포 함유 유체는 복막 복수, 복막 세정에 의해 수집된 유체, 자궁 세정에 의해 수집된 유체, 자궁 유체, 예를 들어 자궁 삼출액 및 생리혈, 흉수 및 난소 삼출액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 그를 발현하는 세포의 표면 상에 표시되는 적어도 하나의 부분을 갖는 마커 단백질의 발현을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 마커 단백질 또는 그의 일부가 세포 표면 상에 발현되는지 결정하는 것은 당업계의 숙련인에게 간단한 문제이다. 예를 들어, 전체 세포 상의 상기 단백질을 검출하기 위해 면역학적 방법이 사용될 수 있거나, 적어도 하나의 세포외 도메인의 존재 (즉, 분비형 단백질 및 적어도 하나의 세포-표면 도메인을 갖는 단백질을 모두 포함)를 예측하기 위해 잘 알려진 컴퓨터 기초 서열 분석 방법 (예를 들어 SIGNALP 프로그램; Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10:1-6)이 사용될 수 있다. 그를 발현하는 세포의 표면 상에 표시되는 적어도 하나의 부분을 갖는 마커 단백질의 발현은 반드시 세포를 용해시키지는 않으면서 검출될 수 있다 (예를 들어 단백질의 세포-표면 도메인과 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여).
본 발명의 마커의 발현은 전사된 핵산 또는 단백질의 발현을 검출하기 위한 임의의 매우 다양한 잘 알려진 방법에 의해 평가할 수 있다. 상기 방법의 비제한적인 예는 분비형, 세포-표면, 세포질 또는 핵 단백질의 검출을 위한 면역학적 방법, 단백질 정제 방법, 단백질 기능 또는 활성 분석, 핵산 혼성화 방법, 핵산 역전사 방법 및 핵산 증폭 방법을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 마커의 발현은 항체 (예를 들어 방사성 표지된, 발색단 표지된, 형광단 표지된 또는 효소 표지된 항체), 항체 유도체 (예를 들어 기질과 또는 단백질 또는 단백질-리간드 쌍 {예를 들어 비오틴-스트렙타비딘}의 리간드와 컨쥬게이팅된 항체) 또는 항체 단편 (예를 들어 단일쇄 항체, 단리된 항체 초가변 도메인 등) 또는 정상 번역후 변형을 전부 또는 일부 겪은 마커 단백질을 포함하는 마커 단백질 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 유도체를 사용하여 평가한다.
다른 바람직한 실시태양에서, 마커의 발현은 환자 샘플 내의 세포로부터 mRNA/cDNA (즉, 전사된 폴리뉴클레오티드)를 제조함으로써 및 상기 mRNA/cDNA를 마커 핵산 또는 그의 단편의 보체인 대조 폴리뉴클레오티드와 혼성화시킴으로써 평가한다. cDNA는 임의로 대조 폴리뉴클레오티드와의 혼성화 이전에 임의의 다양한 중합효소 연쇄 반응 방법을 사용하여 증폭될 수 있고; 바람직하게는, 증폭되지 않는다. 하나 이상의 마커의 발현은 마찬가지로 마커(들)의 발현 수준을 평가하기 위해 정량적 PCR을 사용하여 검출할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 마커의 돌연변이 또는 변이체 (예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성 (polymorphism), 결실 등)를 검출하는 임의의 많은 공지 방법이 환자에서 마커의 발생을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
관련 실시태양에서, 샘플로부터 얻은 전사된 폴리뉴클레오티드의 혼합물을 마커 핵산의 적어도 일부 (예를 들어 적어도 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500 이상의 뉴클레오티드 잔기)에 상보성이거나 상동성인 폴리뉴클레오티드가 고정되어 있는 기판과 접촉시킨다. 몇몇 마커 핵산에 상보성이거나 상동성인 폴리뉴클레오티드가 기판 상에서 달리 검출가능하면 (예를 들어 상이한 발색단 또는 형광단을 사용하여 검출가능하거나, 상이한 선택된 위치에 고정된), 다수의 마커의 발현 수준은 단일 기판 (예를 들어 선택된 위치에서 고정된 폴리뉴클레오티드의 "유전자칩" 마이크로어레이)을 사용하여 동시에 평가할 수 있다. 하나의 핵산을 다른 핵산과 혼성화하는 것을 포함하는 마커 발현의 평가 방법이 사용될 때, 혼성화는 엄격한 혼성화 조건 하에 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 본 발명의 하나 이상의 마커의 발현 수준의 차이의 검출에 의존하기 때문에, 마커의 발현 수준은 적어도 하나의 정상 난소 세포 및 암성 난소 세포 내의 발현을 평가하기 위해 사용된 방법의 최소 검출 한계보다 상당히 더 큰 것이 바람직하다.
하나 이상의 본 발명의 마커를 사용하는 추가의 환자 샘플의 일상적 스크리닝에 의해, 특정 마커가 특이 난소암 및 다른 암, 예를 들어 유방암, 경부암 등을 포함한 상이한 종류의 암에서 과다발현되는 것을 인식할 것으로 이해된다. 예를 들어, 본 발명의 마커의 일부가 대부분 (즉, 50% 이상) 또는 실질적으로 모든 (즉, 80% 이상)의 난소암에서 과다발현되는 것이 확인될 것이다. 또한, 본 발명의 특정 마커가 상이한 단계 (즉, 단계 I, II, III 및 IV 난소암과 하위 분류 IA, IB, IC, IIA, IIB, IIC, IIIA, IIIB 및 IIIC, 난소의 원발 암종에 대한 FIGO 단계 분류 시스템 [1987, Am. J. Obstet. Gynecol. 156:236] 사용), 상이한 조직학적 하위종류 (예를 들어, 장액성, 점액성, 자궁내막양 및 투명 세포 하위종류) 및 하위분류 및 대안적 분류 선암종, 유두상 선암종, 유두상 낭선암종, 표면 유두상 암종, 악성 선섬유종, 낭선섬유종, 선암종, 낭선암종, 선극세포종, 자궁내막양 기질 육종, 중배엽 (뮐러 (Muellerian)) 혼합성 종양, 중신 종양, 악성 암종, 브레너 (Brenner) 종양, 혼합성 상피성 종양 및 미분화 암종, 악성 난소 종양의 분류를 위한 WHO/FIGO 시스템 [Scully, Atlas of Tumor Pathology, 3d series, Washington DC] 사용) 및 다양한 등급 (즉, 등급 I {잘 분화된}, 등급 II {중정도로 잘 분화된} 및 등급 III {주위의 정상 조직으로부터 거의 분화되지 않은})의 난소암과 연관되는 것이 확인될 것이다. 또한, 보다 많은 수의 환자 샘플이 본 발명의 마커의 변경된 발현에 대해 평가되고, 샘플을 얻은 개별 환자의 결과가 상호관련되므로, 본 발명의 특정 마커의 변경된 발현이 악성 암과 강하게 상호관련되고, 본 발명의 다른 마커의 변경된 발현이 양성 종양과 강하게 관련됨이 또한 확인될 것이다. 따라서, 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 환자에서 난소암의 단계, 등급, 조직학적 종류 및 양성/악성 성질 중 하나 이상을 특성화하기에 유용하다. 또한, 이들 조성물, 키트 및 방법은 상피, 기질 및 생식 세포 난소암을 검출하고 분화시키기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물, 키트 및 방법이 환자에서 난소암의 단계, 등급, 조직학적 종류 및 양성/악성 성질 중 하나 이상을 특성화하기 위해 사용될 때, 본 발명의 마커 또는 마커들의 패널 (panel)은 대응하는 단계, 등급, 조직학적 종류 또는 양성/악성 성질의 난소암에 걸린 환자의 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 약 40%, 60% 또는 80%에서, 보다 바람직하게는 실질적으로 모든 환자에서 양성 결과가 얻어지도록 선택되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 마커 또는 마커들의 패널은 전체 인구에 대해 약 10%를 초과하는 양성 예측값 (PPV)이 얻어지도록 (보다 바람직하게는 99.5%를 초과하는 분석 특이성과 결부되도록) 선택된다.
본 발명의 다수의 마커가 본 발명의 조성물, 키트 및 방법에서 사용될 때, 환자 샘플 내의 각각의 마커의 발현 수준은 단일 반응 혼합물 (즉, 각각의 마커에 대해 시약, 예를 들어 상이한 형광 프로브를 사용하여)로 또는 하나 이상의 마커에 대응하는 개별 반응 혼합물로 동일한 종류의 비암성 샘플 내의 각각의 다수의 마커의 정상 발현 수준과 비교될 수 있다. 한 실시태양에서, 대응하는 정상 수준에 비해 다수의 마커의 2 이상의 상당히 증가된 발현 수준은 환자가 난소암에 걸렸다는 표시이다. 다수의 마커가 사용되는 경우, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 15, 20, 30 또는 50 이상의 개별 마커가 사용되는 것이 바람직하고, 보다 적은 마커가 바람직하다.
본 발명의 조성물, 키트 및 방법의 감도를 최대화하기 위해 (즉, 환자 샘플 내의 비-난소 기원의 세포에 기인하는 간섭에 의한), 그에 사용된 본 발명의 마커가 제한된 조직 분포를 갖는, 예를 들어, 비-상피 조직에서는 정상적으로 발현되지 않는 마커, 보다 바람직하게는 비-난소 조직에서는 정상적으로 발현되지 않는 마커인 것이 바람직하다.
소수의 마커만이 난소암과 연관되는 것으로 알려져 있다 (예를 들어 AKT2 , Ki-RAS, ERBB2 , c- MYC , RB1 및 TP53; Lynch, 상기 문헌). 이들 마커는 물론 본 발명의 마커에 포함되지 않지만, 예를 들어 마커들의 패널에서 본 발명의 하나 이상의 마커와 함께 사용될 수 있다. 특정 종류의 유전자, 예를 들어 종양유전자, 종양 억제 유전자, 성장 인자 유사 유전자, 프로테아제 유사 유전자 및 단백질 키나제 유사 유전자가 상이한 종류의 암의 발생과 종종 관련되는 것이 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 마커 중에서, 공지의 종양유전자 및 종양 억제 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 닮은 단백질에 대응하는 것과 성장 인자, 프로테아제 및 단백질 키나제를 닮은 단백질에 대응하는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물, 키트 및 방법이 난소암 발생 위험이 증가된 환자 및 이들의 의료 조언자에게 특히 유용할 것임이 인식된다. 난소암 발생 위험이 증가된 것으로 인정되는 환자는 예를 들어, 난소암의 가족력이 있는 환자, 돌연변이 종양유전자 (즉, 적어도 하나의 대립유전자)를 갖는 것으로 확인된 환자 및 나이든 환자 (즉, 약 50 또는 60세 초과의 여성)를 포함한다.
정상 (즉, 비암성) 인간 난소 조직에서 마커의 발현 수준은 다양한 방식으로 평가할 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 정상 발현 수준은 비암성인 것으로 보이는 난소 세포의 일부에서의 마커의 발현 수준을 평가하고, 상기 정상 발현 수준을 암성인 것으로 의심되는 난소 세포의 일부에서의 발현 수준과 비교함으로써 평가한다. 예를 들어, 복강경검사 또는 다른 의료 시술에 의해 환자 난소의 한 부분에서 종괴의 존재를, 그러나 동일한 난소의 다른 부분 또는 다른 난소에서는 없는 것으로 밝혀진 경우, 정상 수준의 마커의 발현은 병에 걸리지 않은 난소 및 병에 걸린 난소의 병에 걸리지 않은 부분 중 하나 또는 둘 모두를 사용하여 평가할 수 있고, 상기 정상 발현 수준은 병에 걸린 난소의 병에 걸린 부분 (즉, 종괴)에서 동일한 마커의 발현 수준과 비교할 수 있다. 별법으로 및 특히, 본원에 기재된 방법의 일상적 수행의 결과로서 추가의 정보가 이용가능해짐에 따라, 본 발명의 마커의 정상 발현에 대한 인구-평균값이 이용될 수 있다. 다른 실시태양에서, '정상' 수준의 마커의 발현은 암에 걸리지 않은 환자로부터 얻은 환자 샘플, 환자에서 난소암의 의심되는 발병 이전에 환자로부터 얻은 환자 샘플, 보관된 환자 샘플 등에서 마커의 발현을 평가함으로써 측정할 수 있다.
본 발명은 샘플 (예를 들어 보관된 조직 샘플 또는 환자로부터 얻은 샘플) 내의 난소암 세포의 존재를 평가하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 포함한다. 이들 조성물, 키트 및 방법은 필요한 경우 조성물, 키트 및 방법이 환자 샘플 이외의 샘플에서 사용하도록 변경되는 것을 제외하고는 상기한 바와 실질적으로 동일하다. 예를 들어, 사용되는 샘플이 파라핀처리된 보관된 인간 조직 샘플인 경우, 본 발명의 조성물 내의, 본 발명의 키트 내의, 또는 샘플 내의 마커 발현 수준을 평가하기 위해 사용된 방법에서 화합물의 비를 조정하는 것이 필요할 수 있다. 상기 방법은 당업계에 공지되어 있고, 통상의 기술자의 기술 범위 내에 있다.
본 발명은 난소암 세포의 존재 (예를 들어 샘플, 예를 들어 환자 샘플 내의)를 평가하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 각각 마커 핵산 또는 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 시약을 포함한다. 마커 단백질과 결합하기에 적합한 시약은 항체, 항체 유도체, 항체 단편 등을 포함한다. 마커 핵산 (예를 들어 게놈 DNA, mRNA, 스플라이싱된 mRNA, cDNA 등)과 결합하기에 적합한 시약은 상보성 핵산을 포함한다. 예를 들어, 핵산 시약은 기판에 고정된 올리고뉴클레오티드 (표지되거나 표지되지 않은), 기판과 결합되지 않은 표지된 올리고뉴클레오티드, PCR 프라이머의 쌍, 분자 표지 (beacon) 프로브 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 임의로 본 발명의 방법을 수행하기 위해 유용한 추가의 성분을 포함할 수 있다. 예로서, 키트는 상보성 핵산을 어닐링(annealing)시키거나 또는 항체를 그가 특이적으로 결합하는 단백질과 결합시키기에 적합한 유체 (예를 들어 SSC 완충액), 하나 이상의 샘플 구획, 본 발명의 방법의 수행을 설명하는 지시물, 정상 난소 세포의 샘플, 난소암 세포의 샘플 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 환자가 난소암에 걸렸는지 평가하기에 유용한 항체를 생산하는 단리된 하이브리도마를 제조하는 방법을 포함한다. 상기 방법에서, 전체 마커 단백질 또는 마커 단백질의 세그먼트를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 합성하거나 단리한다 (예를 들어 그가 발현되는 세포로부터 정제에 의해, 또는 공지의 방법을 이용하여 생체 내 또는 시험관 내에서 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산의 전사 및 번역에 의해). 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어 마우스, 쥐, 토끼 또는 양을 단백질 또는 펩티드를 사용하여 면역화시킨다. 척추동물은 임의로 (및 바람직하게는) 단백질 또는 펩티드로 적어도 추가로 1회 면역화시켜, 척추동물이 단백질 또는 펩티드에 대해 강한 면역 반응을 보이도록 한다. 면역화시킨 척추동물로부터 비장세포를 단리하고 당업계에 공지되어 있는 임의의 다양한 방법을 이용하여 무한증식세포주와 융합시켜 하이브리도마를 형성한다. 이어서 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마를 마커 단백질 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하나 이상의 하이브리도마를 확인하기 위해 표준 방법을 이용하여 스크리닝한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 하이브리도마 및 상기 하이브리도마를 사용하여 제조된 항체를 포함한다.
또한, 본 발명은 난소암 세포를 억제하는 시험 화합물의 효능을 평가하는 방법을 포함한다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 마커의 발현 수준 차이는 난소 세포의 암 상태와 상호관련된다. 본 발명의 특정 마커의 발현 수준의 변화는 아마도 난소 세포의 암 상태로부터 기인하는 것이 인식되지만, 아마도 본 발명의 다른 마커의 발현 수준의 변화는 이들 세포의 암 상태를 유발하고, 유지시키고 촉진시키는 것으로 인식된다. 따라서, 환자에서 난소암을 억제하는 화합물은 본 발명의 하나 이상의 마커의 발현 수준을 그 마커에 대한 정상 발현 수준 (즉, 비암성 난소 세포 내의 마커에 대한 발현 수준)에 더 가까운 수준으로 변화시킬 것이다.
따라서 상기 방법은 시험 화합물의 존재 하에 유지시킨 제1 난소 세포 샘플 내의 마커의 발현과 시험 화합물의 부재 하에 유지시킨 제2 난소 세포 샘플 내의 마커의 발현을 비교하는 것을 포함한다. 시험 화합물의 존재 하에 본 발명의 마커의 상당히 감소된 발현은 시험 화합물이 난소암을 억제한다는 표시이다. 난소 세포 샘플은 예를 들어, 환자로부터 얻은 정상 난소 세포의 단일 샘플의 부분표본, 환자로부터 얻은 정상 난소 세포의 모아진 샘플, 정상 난소 세포주의 세포, 환자로부터 얻은 난소암 세포의 단일 샘플의 부분표본, 환자로부터 얻은 난소암 세포의 모아진 샘플, 난소암 세포주의 세포 등일 수 있다. 한 실시태양에서, 샘플은 환자로부터 얻은 난소암 세포이고, 환자에서 난소암을 가장 잘 억제할 것으로 보이는 화합물을 확인하기 위해 다양한 난소암을 억제하는데 효과적인 것으로 공지된 다수의 화합물을 시험한다.
상기 방법은 마찬가지로 환자에서 난소암을 억제하기 위한 요법의 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법에서, 샘플쌍 (하나를 요법을 받고, 다른 하나는 요법을 받지 않음) 내의 본 발명의 하나 이상의 마커의 발현 수준을 평가한다. 시험 화합물의 효능을 평가하는 방법에서와 같이, 요법이 본 발명의 마커의 상당히 더 낮은 수준의 발현을 유도하면, 요법은 난소암을 억제하는데 효능이 있다. 상기와 같이, 선택된 환자의 샘플이 상기 방법에 사용되면, 환자에서 난소암을 억제하는데 가장 효능이 있는 것으로 보이는 요법을 선택하기 위해 대안적 요법을 시험관 내에서 평가할 수 있다.
상기한 바와 같이, 인간 난소 세포의 암 상태는 본 발명의 마커의 발현 수준의 변화와 상호관련된다. 본 발명은 시험 화합물의 인간 난소 세포 발암 잠재력을 평가하기 위한 방법을 포함한다. 상기 방법은 인간 난소 세포의 별개의 부분표본을 시험 화합물의 존재 하에 및 부재 하에 유지시키는 것을 포함한다. 각각의 부분표본 내의 본 발명의 마커의 발현을 비교한다. 시험 화합물의 존재 하에 유지시킨 부분표본에서 본 발명의 마커의 상당히 더 큰 수준의 발현 (시험 화합물의 부재 하에 유지시킨 부분표본에 비해)은 시험 화합물이 인간 난소 세포 발암 잠재력을 갖는다는 표시이다. 다양한 시험 화합물의 상대적 발암 잠재력은 관련 마커의 발현 수준의 증진 또는 억제 정도를 비교함으로써, 발현 수준이 증진되거나 억제된 마커의 수를 비교함으로써, 또는 둘 모두를 비교함으로써 평가할 수 있다.
본 발명의 다양한 측면은 하기 세분된 단락에서 더욱 상세히 설명한다.
단리된 핵산 분자
본 발명의 한 측면은 마커 단백질 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 단리된 핵산은 또한 마커 핵산 분자를 확인하기 위해 혼성화 프로브로서 사용하기에 충분한 핵산 분자, 및 마커 핵산 분자의 단편, 예를 들어, 마커 핵산 분자의 증폭 또는 돌연변이를 위한 PCR 프라이머로서 사용하기에 적합한 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자 (예를 들어, mRNA) 및 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함하도록 의도된다. 핵산 분자는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중가닥 DNA이다.
"단리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 자연 공급원 내에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 바람직하게는, "단리된" 핵산 분자에는 핵산이 유도되는 유기체의 게놈 DNA에서 핵산에 자연히 인접하는 서열 (즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열) (바람직하게는 단백질-코딩 서열)이 없다. 예를 들어, 다양한 실시태양에서, 단리된 핵산 분자는 핵산이 유도되는 세포의 게놈 DNA에서 핵산 분자에 자연히 인접하는 약 5 kB, 4 kB, 3 kB, 2 kB, 1 kB, 0.5 kB 또는 0.1 kB 미만의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 또한, "단리된" 핵산 분자, 예를 들어 cDNA 분자에는 다른 세포성 물질 또는 재조합 기술에 의해 생산될 때 배양 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 표준 분자생물학 기술 및 본원에 기재된 데이타베이스 기록 내의 서열 정보를 이용하여 단리할 수 있다. 상기 핵산 서열 모두 또는 일부를 사용하여, 본 발명의 핵산 분자는 표준 혼성화 및 클로닝 기술 (예를 들어, Sambrook et al., ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989에 기재된 바와 같이)를 이용하여 단리할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 표준 PCR 증폭 기술에 따라 템플레이트 및 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머로서 cDNA, mRNA 또는 게놈 DNA를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 이렇게 증폭된 핵산은 적절한 벡터 내로 클로닝되고 DNA 서열 분석에 의해 특성화할 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 분자 모두 또는 일부에 대응하는 뉴클레오티드는 표준 합성기술에 의해, 예를 들어, 자동화 DNA 합성기를 사용하여 제조할 수 있다.
다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 마커 핵산의 뉴클레오티드 서열 또는 마커 단백질을 코딩하는 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 주어진 뉴클레오티드 서열에 상보적인 핵산 분자는 주어진 뉴클레오티드 서열에 혼성화하여, 안정한 듀플렉스 (duplex)를 형성할 수 있도록 주어진 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보적인 분자이다.
또한, 본 발명의 핵산 분자는 핵산 서열의 일부만 포함할 수 있고, 여기서 전장 핵산 서열은 마커 핵산을 포함하거나 또는 마커 단백질을 코딩하는 핵산 서열이다. 상기 핵산은 예를 들어 프로브 또는 프라이머로서 사용할 수 있다. 프로브/프라이머는 전형적으로 하나 이상의 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오티드로서 사용된다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 엄격한 조건 하에 본 발명의 핵산의 적어도 약 7, 바람직하게는 약 15, 보다 바람직하게는 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 또는 400 이상의 연속 뉴클레오티드에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열의 영역을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자의 서열에 기초한 프로브는 본 발명의 하나 이상의 마커에 대응하는 전사체 또는 게놈 서열을 검출하기 위해 사용할 수 있다. 프로브는 그에 부착된 표지기, 예를 들어, 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자를 포함한다. 상기 프로브는 예를 들어 피험자로부터의 세포 샘플 내의 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 수준을 측정함으로써, 예를 들어 mRNA 수준을 검출하거나 또는 단백질을 코딩하는 유전자가 돌연변이되거나 결실되었는지 결정함으로써, 단백질을 잘못 발현하는 세포 또는 조직을 확인하기 위한 진단 시험 키트의 일부로서 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 유전자 코드의 다의성 때문에 마커 단백질을 코딩하는 핵산의 뉴클레오티드 서열과 다르고, 이에 따라 동일한 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
당업계의 숙련인은 아미노산 서열의 변화를 일으키는 DNA 서열 다형성이 집단 (예를 들어, 인간 집단) 내에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 상기 유전적 다형성은 천연 대립유전자 변이로 인해 집단 내의 개인들 사이에 존재할 수 있다. 대립유전자는 주어진 유전자 로커스에서 택일적으로 발생하는 유전자의 군 중 하나이다. 또한, (예를 들어, 조절 또는 분해에 영향을 끼침으로써) 유전자의 총 발현 수준에 영향을 끼칠 수 있는 RNA 발현 수준에 영향을 끼치는 DNA 다형성이 또한 존재할 수 있음이 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "대립유전자 변이체"는 주어진 로커스에서 발생하는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 본 발명의 마커에 대응하는 폴리펩티드를 코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 나타낸다. 상기 천연 대립유전자 변이는 전형적으로 주어진 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 1-5% 변이를 일으킬 수 있다. 대체 대립유전자는 많은 상이한 개체에서 해당 유전자를 서열결정함으로써 확인할 수 있다. 이는 다양한 개체에서 동일한 유전자 로커스를 확인하기 위해 혼성화 프로브를 사용함으로써 쉽게 수행할 수 있다. 임의의 및 모든 상기 뉴클레오티드 변이와 생성되는 아미노산 다형성, 또는 천연 대립유전자 변이의 결과이며 기능적 활성을 변경시키지 않는 변이는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 적어도 7, 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 550, 650, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3500, 4000, 4500 이상의 뉴클레오티드 길이이고, 엄격한 조건 하에 마커 핵산 또는 마커 단백질을 코딩하는 핵산에 혼성화한다. 본원에서 사용되는 용어 "엄격한 조건 하에 혼성화하는"은 서로 적어도 60% (65%, 70%, 바람직하게는 75%) 동일한 뉴클레오티드 서열이 전형적으로 서로 혼성화되어 유지되는 혼성화 및 세척 조건을 설명하기 위한 것이다. 상기 엄격한 조건은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있고, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), sections 6.3.1-6.3.6]에 기재되어 있다. 엄격한 혼성화 조건의 바람직한 비제한적인 예는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 중의 혼성화에 이어, 50-65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS의 1회 이상의 세척이다.
집단 내에 존재할 수 있는 본 발명의 핵산 분자의 천연 대립유전자 변이체 외에, 당업계의 숙련인은 서열 변화가 그에 의해 코딩되는 단백질의 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키는 돌연변이에 의해 도입될 수 있음을 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, "비필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 일으키는 뉴클레오티드 치환을 만들 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성에 요구된다. 예를 들어, 상이한 종의 상동체 사이에 보존되지 않거나 단지 반보존되는 아미노산 잔기는 활성에 비필수적일 수 있고, 따라서 아마도 변경을 위한 표적이 될 것이다. 별법으로, 상이한 종 (예를 들어, 무린 (murine) 및 인간)의 상동체 사이에 보존되는 아미노산 잔기는 활성에 필수적일 수 있고, 따라서 아마도 변경을 위한 표적이 되지 않을 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기의 변화를 함유하는 변이체 마커 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 변이체 마커 단백질은 아미노산 서열이 천연 마커 단백질과 다르지만, 여전히 생물학적 활성을 보유한다. 한 실시태양에서, 상기 변이체 마커 단백질은 마커 단백질의 아미노산 서열에 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
변이체 마커 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 하나 이상의 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실이 코딩된 단백질 내로 도입될 수 있도록 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 마커 핵산의 뉴클레오티드 서열 내로 도입함으로써 생성될 수 있다. 돌연변이는 표준 기술, 예를 들어 부위 지정 돌연변이 및 PCR-매개 돌연변이에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 예상된 비필수 아미노산 잔기에서 이루어진다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 상기 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비대전 극성 측쇄 (예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 별법으로, 돌연변이는 예를 들어 포화 돌연변이에 의해 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 랜덤하게 도입될 수 있고, 생성되는 돌연변이는 활성을 보유하는 돌연변이를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 후에, 코딩되는 단백질은 재조합 방식으로 발현될 수 있고, 단백질의 활성을 결정할 수 있다.
본 발명은 안티센스 핵산 분자, 즉 본 발명의 센스 핵산에 상보성인, 예를 들어 이중가닥 마커 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보성이거나 마커 mRNA 서열에 상보성인 분자를 포함한다. 따라서, 본 발명의 안티센스 핵산은 본 발명의 센스 핵산에 수소 결합 (즉, 어닐링)될 수 있다. 안티센스 핵산은 전체 코딩 가닥에 또는 그의 일부, 예를 들어 단백질 코딩 영역 (또는 개방 해독 프레임)의 전부 또는 일부에만 상보성일 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 또한 마커 단백질 코딩 뉴클레오티드 서열의 코딩 가닥의 비코딩 영역의 전부 또는 일부에 대해 안티센스일 수 있다. 비코딩 영역 ("5' 및 3' 비번역 영역")은 코딩 영역에 인접하고 아미노산으로 번역되지 않는 5' 및 3' 서열이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 이상 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 당업계에 공지된 과정을 사용하는 화학적 합성 및 효소적 라이게이션 반응을 이용하여 제작할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)은 천연 뉴클레오티드, 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키도록 또는 안티센스 및 센스 핵산 사이에 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성할 수 있고, 예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 안티센스 핵산을 생성하기 위해 사용할 수 있는 변형 뉴클레오티드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노푸린을 포함한다. 별법으로, 안티센스 핵산은 핵산이 안티센스 배향으로 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생산할 수 있다 (즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 다음 세분 단락에서 추가로 설명된 해당 표적 핵산에 대해 안티센스 배향일 것이다).
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 대개 피험자에게 투여되거나 또는 이들이 마커 단백질을 코딩하는 세포 mRNA 및(또는) 게놈 DNA와 혼성화하거나 결합하여 예를 들어, 전사 및(또는) 번역을 억제함으로써 마커의 발현을 억제하도록 적소 생성된다. 혼성화는 안정한 듀플렉스를 형성하기 위해 통상의 뉴클레오티드 상보성에 의해, 또는 예를 들어, DNA 듀플렉스에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에 이중 나선의 큰 그루브 (groove)에서 특이적 상호작용을 통해 이루어질 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자의 투여 경로의 예는 조직 부위에 직접 주사 또는 난소-관련 체액 내로 안티센스 핵산의 주입을 포함한다. 별법으로, 안티센스 핵산 분자는 선택된 세포를 표적하도록 변형된 다음 전신 투여될 수 있다. 예를 들어, 전신 투여를 위해, 안티센스 분자는 예를 들어, 안티센스 핵산 분자를 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩티드 또는 항체에 연결시킴으로써 선택된 세포 표면 상에 발현된 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하도록 변형될 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 또한 본원에 기재된 벡터를 사용하여 세포로 전달될 수 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 달성하기 위해, 안티센스 핵산 분자가 강한 pol II 또는 pol III 프로모터의 제어 하에 놓인 벡터 구조체가 바람직하다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 (anomeric) 핵산 분자일 수 있다. α-아노머 핵산 분자는 상보적 RNA와 특이적 이중가닥 하이브리드를 형성하고, 여기서 보통의 α-유닛과 반대로, 가닥들은 서로 평행하다 (Gaultier et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-o-메틸리보뉴클레오티드 (Inoue et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) 또는 키메릭 RNA-DNA 유사체 (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 리보자임을 포함한다. 리보자임은 그들이 상보적 영역을 갖는 단일가닥 핵산, 예를 들어 mRNA을 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임 (예를 들어, 문헌 [Haselhoff and Gerlach, 1988, Nature 334:585-591]에 기재된 바와 같은 망치머리형 리보자임)이 mRNA 전사체를 촉매적으로 절단하여, mRNA에 의해 코딩되는 단백질의 번역을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 마커 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 특이성을 갖는 리보자임은 마커에 대응하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 디자인할 수 있다. 예를 들어, 활성 부위의 뉴클레오티드 서열이 절단할 뉴클레오티드 서열에 상보성인 Tetrahymena L-19 IVS RNA의 유도체가 제작될 수 있다 (세크 (Cech) 등의 미국 특허 4,987,071; 및 세크 등의 미국 특허 5,116,742 참고). 별법으로, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA는 RNA 분자의 풀 (pool)로부터 특이적 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA를 선택하기 위해 사용할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Bartel and Szostak, 1993, Science 261:1411-1418] 참조).
또한, 본 발명은 3중 나선 구조를 형성하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 마커의 발현은 표적 세포 내의 유전자의 전사를 방지하는 3중 나선 구조를 형성하기 위해 마커 핵산 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 조절 영역 (예를 들어, 프로모터 및(또는) 인핸서)에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 표적함으로써 억제될 수 있다 (일반적으로 문헌 [Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36; 및 Maher (1992) Bioassays 14(12):807-15] 참조).
다양한 실시태양에서, 본 발명의 핵산 분자는 예를 들어, 분자의 안정성, 혼성화 또는 가용성을 개선하기 위해 염기 잔기, 당 잔기 또는 포스페이트 주쇄에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 핵산의 데옥시리보스 포스페이트 주쇄가 펩티드 핵산을 생성하기 위해 변형될 수 있다 (Hyrup et al., 1996, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1):5-23 참조). 본원에서 사용되는 용어 "펩티드 핵산" 또는 "PNA"는 데옥시리보스 포스페이트 주쇄가 슈도펩티드 주쇄로 대체되고 단지 4개의 천연 핵염기만이 유지되는 핵산 모방체 (mimetic), 예를 들어 DNA 모방체를 의미한다. PNA의 중성 주쇄는 낮은 이온 강도 조건에서 DNA 및 RNA에 대한 특이적 혼성화를 허용하는 것으로 밝혀졌다. PNA 올리고머의 합성은 문헌 [Hyrup et al. (1996), 상기 문헌; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675]에 기재된 표준 고상 펩티드 합성 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있다.
PNA는 치료 및 진단 용도에 사용할 수 있다. 예를 들어, PNA는 예를 들어 전사 또는 번역 정지의 유도 또는 복제 억제에 의한 유전자 발현의 서열-특이적 조절을 위한 안티센스 또는 항원제로서 사용할 수 있다. PNA는 또한 예를 들어, PNA 지향 PCR 클램핑 (clamping)에 의한 유전자 내의 단일 염기쌍 돌연변이의 분석에, 다른 효소, 예를 들어 S1 뉴클레아제와 조합 사용시의 인공 제한 효소로서 (Hyrup (1996), 상기 문헌); 또는 DNA 서열 및 혼성화를 위한 프로브 또는 프라이머로서 (Hyrup, 1996, 상기 문헌; Perry-O'Keefe et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675) 사용될 수 있다.
다른 실시태양에서, PNA는 예를 들어 PNA에 친지질성 또는 다른 헬퍼기를 부착시키거나, PNA-DNA 키메라를 형성하거나, 리포좀 또는 당업계에 공지된 다른 약물 전달 기술을 사용하여 안정성 또는 세포 흡수를 증강시키기 위해 변형시킬 수 있다. 예를 들어, PNA 및 DNA의 유리한 특성을 조합할 수 있는 PNA-DNA 키메라를 생성시킬 수 있다. 상기 키메라는 인식 효소, 예를 들어 RNase H 및 DNA 중합효소가 DNA 부분과 상호작용하면서 PNA 부분이 높은 친화도 및 특이성을 제공하도록 할 수 있다. PNA-DNA 키메라는 염기 적층, 핵염기 사이의 결합수 및 배향의 측면에서 선택된 적절한 길이의 링커를 사용하여 연결시킬 수 있다 (Hyrup, 1996, 상기 문헌). PNA-DNA 키메라의 합성은 문헌 [Hyrup (1996), 상기 문헌, 및 Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 예를 들어, DNA 사슬을 표준 포스포라미다이트 커플링 화학 및 변형 뉴클레오시드 유사체를 사용하여 고상 지지체 상에 합성할 수 있다. 화합물, 예를 들어 5'-(4-메톡시트리틸)아미노-5'-데옥시-티미딘 포스포라미다이트는 PNA와 DNA의 5' 말단 사이의 링커로서 사용할 수 있다 (Mag et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:5973-88). PNA 모노머는 이어서 단계적인 방법으로 커플링되어 5' PNA 세그먼트 및 3' DNA 세그먼트를 갖는 키메릭 분자를 생성시킨다 (Finn et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63). 별법으로, 5' DNA 세그먼트 및 3' PNA 세그먼트를 갖는 키메릭 분자를 합성할 수 있다 (Peterser et al., 1975, Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124).
다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 다른 매달린 기, 예를 들어 펩티드 (예를 들어 생체내에서 숙주 세포 수용체를 표적화하기 위한), 또는 세포막을 가로지른 수송 (예를 들어 Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT 출원 공개 WO 88/09810 참조) 또는 혈액-뇌 장벽을 가로지른 수송을 촉진시키는 물질 (예를 들어 PCT 출원 공개 WO 89/10134 참조)을 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 혼성화-촉발 절단제 (예를 들어, Krol et al., 1988, Bio/Techniques 6:958-976 참조) 또는 중격제 (intercalating agent) (예를 들어 Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549 참조)로 변형시킬 수 있다. 이를 위해, 올리고뉴클레오티드는 또다른 분자, 예를 들어 펩티드, 혼성화 촉발 가교결합제, 수송제, 혼성화-촉발 절단제 등에 컨쥬게이팅될 수 있다.
또한, 본 발명은 분자 표지가 샘플 내의 본 발명의 핵산의 존재를 정량하기에 유용하도록, 본 발명의 핵산에 상보성인 적어도 하나의 영역을 갖는 분자 표지 핵산을 포함한다. "분자 표지" 핵산은 한쌍의 상보성 영역을 포함하고, 그와 결합된 형광단 및 형광 켄처 (quencher)를 갖는 핵산이다. 형광단 및 켄처는 상보성 영역이 서로 어닐링될 때, 형광단의 형광이 켄처에 의해 켄칭되도록 하는 배향으로 핵산의 상이한 부분과 결합된다. 핵산의 상보성 영역이 서로 어닐링되지 않을 때, 형광단의 형광은 더 적은 정도로 켄칭된다. 분자 표지 핵산은 예를 들어, 미국 특허 5,876,930에 기재되어 있다.
단리된 단백질 및 항체
본 발명의 한 측면은 단리된 마커 단백질과 그의 생물학적 활성 부분, 및 마커 단백질 또는 그의 단편에 대해 작용하는 항체를 생성시키는 면역원으로 사용하기에 적합한 폴리펩티드 단편에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 천연 마커 단백질은 표준 단백질 정제 기술을 이용하여 적절한 정제 계획에 의해 세포 또는 조직원으로부터 단리할 수 있다. 다른 실시태양에서, 전체 마커 단백질 또는 그의 세그먼트를 포함하는 단백질 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 재조합 발현에 대한 대안으로, 상기 단백질 또는 펩티드는 표준 펩티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
"단리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분에는 단백질이 유래되는 세포 또는 조직원으로부터 세포성 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 표현 "세포성 물질이 실질적으로 없는"은 단백질이 그가 단리되거나 재조합 방식으로 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 분리되는 단백질의 제제를 포함한다. 따라서, 세포성 물질이 실질적으로 없는 단백질은 약 30%, 20%, 10% 또는 5% (건조 중량) 미만의 이종성 단백질 (본원에서 "오염 단백질"로도 부름)을 갖는 단백질의 제제를 포함한다. 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분이 재조합 방식으로 생산될 때, 또한 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 없으며, 즉, 배양 배지는 단백질 제제 부피의 약 20%, 10% 또는 5% 미만을 나타낸다. 단백질이 화학적 합성에 의해 생산될 때, 바람직하게는 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없으며, 즉, 단백질의 합성에 관여하는 화학 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서 상기 단백질 제제는 해당 폴리펩티드 이외에 약 30%, 20%, 10%, 5% (건조 중량) 미만의 화학 전구체 또는 화합물을 갖는다.
마커 단백질의 생물학적 활성 부분은 마커 단백질의 아미노산 서열에 충분히 동일하거나 그로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 이는 전장 단백질보다 더 적은 아미노산을 포함하고 대응하는 전장 단백질의 적어도 하나의 활성을 갖는다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 대응하는 전장 단백질의 적어도 하나의 활성을 갖는 도메인 또는 모티프 (motif)를 포함한다. 본 발명의 마커 단백질의 생물학적 활성 부분은 예를 들어, 10, 25, 50, 100 이상 아미노산 길이인 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 다른 생물학적 활성 부분 (여기서 마커 단백질의 다른 영역은 삭제된다)은 재조합 기술에 의해 제조되고, 천연형의 마커 단백질의 하나 이상의 기능적 활성에 대해 평가될 수 있다.
바람직한 마커 단백질은 표 1에 나열된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 다른 유용한 단백질은 이들 서열 중 하나에 실질적으로 동일하고 (예를 들어, 적어도 약 40%, 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%) 대응하는 천연 마커 단백질의 기능적 활성을 보유하지만, 천연 대립유전자 변이 또는 돌연변이로 인해 아미노산 서열은 다르다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산의 동일성 비율을 결정하기 위해, 서열은 최적 비교를 위해 정렬된다 (예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열 내에 갭 (gap)이 도입될 수 있다). 이어서 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 내의 위치를 제2 서열 내의 대응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 차지하는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 동일성 비율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, %동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 (예, 겹치는 위치)x100). 한 실시태양에서, 2개의 서열은 길이가 동일하다.
2개의 서열 사이의 동일성 비율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적 예는 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서 수정된 문헌 [Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램 내로 포함된다. BLAST 뉴클레오티드 탐색은 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 BLASTN 프로그램, 스코어=100, 워드길이=12를 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 탐색은 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 BLASTP 프로그램, 스코어=50, 워드길이=3을 사용하여 수행할 수 있다. 비교 목적을 위해 갭이 도입된 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST로 불리는 보다 신규한 버전의 BLAST 알고리즘이 문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있으며, 이는 프로그램 BLASTN, BLASTP 및 BLASTX를 위한 갭 도입된 로컬 (local) 정렬을 수행할 수 있다. 별법으로, 분자들 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 탐색을 수행하기 위해 PSI-Blast가 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, BLASTX 및 BLASTN)의 디폴트 (default) 변수가 사용될 수 있다. 서열 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직한 비제한적인 예는 문헌 [Myers and Miller, (1988) CABIOS 4:11-17]의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 포함된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM120 웨이트 (weight) 잔기 표, 갭 길이 페널티 (penalty) 12 및 갭 페널티 4가 사용될 수 있다. 로컬 서열 유사성 및 정렬의 영역을 확인하기 위한 또다른 유용한 알고리즘은 문헌 [Pearson and Lipman(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448]에 기재된 바와 같은 FASTA 알고리즘이다. 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교하기 위해 FASTA 알고리즘을 사용할 때, 예를 들어 κ-튜플 (tuple) 값 2의 PAM120 웨이트 잔기 표가 사용될 수 있다.
2개의 서열 사이의 동일성 비율은 갭을 허용하거나 허용하지 않으면서 상기한 것과 유사한 기술을 이용하여 결정할 수 있다. 동일성 비율을 계산하는데 있어서, 정확한 일치만 계수한다.
또한, 본 발명은 마커 단백질 또는 그의 세그먼트를 포함하는 키메릭 또는 융합 단백질을 제공한다. 본원에서 사용되는 "키메릭 단백질" 또는 "융합 단백질"은 이종성 폴리펩티드 (즉, 마커 단백질 이외의 폴리펩티드)에 작동가능하게 연결된 마커 단백질의 전체 또는 일부 (바람직하게는 생물학적 활성 부분)를 포함한다. 융합 단백질에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 마커 단백질 또는 그의 세그먼트 및 이종성 폴리펩티드가 서로 인-프레임 (in-frame) 융합되는 것을 나타내는 것이다. 이종성 폴리펩티드는 마커 단백질 또는 세그먼트의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 융합될 수 있다.
하나의 유용한 융합 단백질은 GST 융합 단백질이고, 여기서 마커 단백질 또는 세그먼트는 GST 서열의 카르복실 말단에 융합된다. 상기 융합 단백질은 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 정제를 용이하게 할 수 있다.
다른 실시태양에서, 융합 단백질은 그의 아미노 말단에 이종성 시그날 서열을 함유한다. 예를 들어, 마커 단백질의 천연 시그날 서열이 제거되어, 다른 단백질로부터의 시그날 서열로 교체될 수 있다. 예를 들어, 바큘로바이러스 외피 단백질의 gp67 분비 서열이 이종성 시그날 서열로서 사용될 수 있다 (Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1992). 진핵세포 이종성 시그날 서열의 다른 예는 멜리틴 (melittin) 및 인간 태반 알칼리성 포스파타제 (스트라타젠 (Stratagene; 미국 캘리포니아주 라 졸라))의 분비 서열을 포함한다. 또다른 예에서, 유용한 원핵세포 이종성 시그날 서열은 phoA 분비 시그날 (Sambrook et al., 상기 문헌) 및 단백질 A 분비 시그날 (파마시아 바이오테크 (Pharmacia Biotech; 미국 뉴저지주 피스카타웨이))을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 융합 단백질은 면역글로불린 융합 단백질이고, 여기서 모든 마커 단백질 또는 그의 일부가 면역글로불린 단백질 패밀리의 멤버로부터 유래된 서열에 융합된다. 본 발명의 면역글로불린 융합 단백질은 제약 조성물에 포함되고, 세포의 표면 (수용체) 상에서 리간드 (가용성 또는 막 결합형)와 단백질 사이의 상호작용을 억제하여 생체내 시그날 전달을 억제하기 위해 피험자에게 투여될 수 있다. 면역글로불린 융합 단백질은 마커 단백질의 동족 (cognate) 리간드의 생체이용성에 영향을 끼치도록 사용될 수 있다. 리간드/수용체 상호작용의 억제는 증식성 및 분화성 질병을 치료하기 위해 및 세포 생존을 조정하기 위해 (예를 들어 촉진하거나 억제하기 위해) 치료적으로 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역글로불린 융합 단백질은 피험자에서 마커 단백질에 대해 작용하는 항체를 생산하기 위해 면역원으로서, 리간드를 정제하기 위해 및 마커 단백질의 리간드와의 상호작용을 억제하는 분자를 확인하기 위해 스크리닝 분석에서 사용될 수 있다.
본 발명의 키메릭 및 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생산할 수 있다. 다른 실시태양에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 포함하는 통상의 기술에 의해 합성할 수 있다. 별법으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 후속적으로 어닐링되고 재증폭되어 키메릭 유전자 서열을 생성할 수 있는 2개의 연속적인 유전자 단편 사이의 상보성 오버행 (overhang)을 발생시키는 앵커 (anchor) 프라이머를 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, Ausubel et al., 상기 문헌 참조). 또한, 이미 융합 잔기 (예, GST 폴리펩티드)를 코딩하는 많은 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 융합 잔기가 본 발명의 폴리펩티드에 인-프레임 연결되도록 상기 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
시그날 서열이 마커 단백질의 분비 및 단리를 용이하게 하도록 사용될 수 있다. 전형적으로 시그날 서열은 일반적으로 분비 동안 성숙 단백질로부터 하나 이상의 절단 사건으로 절단되는 소수성 아미노산의 코어를 특징으로 한다. 상기 시그날 펩티드는 분비 경로를 통과할 때 성숙 단백질로부터 시그날 서열의 절단을 허용하는 프로세싱 부위를 함유한다. 따라서, 본 발명은 시그날 서열을 갖는 마커 단백질, 융합 단백질 또는 그의 세그먼트, 및 그로부터 시그날 서열이 단백분해적으로 절단되는 상기 단백질 (즉, 절단 생성물)에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 시그날 서열을 코딩하는 핵산 서열은 발현 벡터 내에서 해당 단백질, 예를 들어 마커 단백질 또는 그의 세그먼트에 작동가능하게 연결될 수 있다. 시그날 서열은 발현 벡터가 형질전환되는 진핵 숙주로부터와 같이 단백질의 분비를 지시하고, 시그날 서열은 후속적으로 또는 동시에 절단된다. 이어서 단백질은 당업계에 인정되는 방법에 의해 세포외 배지로부터 쉽게 정제할 수 있다. 별법으로, 시그날 서열은 GST 도메인을 갖는 것과 같은 정제를 용이하게 하는 서열을 사용하여 해당 단백질에 연결될 수 있다.
또한, 본 발명은 마커 단백질의 변이체에 관한 것이다. 상기 변이체는 효능제 (모방체)로서 또는 길항제로서 기능할 수 있는 변경된 아미노산 서열을 갖는다. 변이체는 돌연변이, 예를 들어 불연속 점 돌연변이 또는 트렁케이션 (truncation)에 의해 생성될 수 있다. 효능제는 천연형 단백질의 실질적으로 동일하거나 서브세트의 생물학적 활성을 보유할 수 있다. 단백질의 길항제는 예를 들어 해당 단백질을 포함하는 세포성 세포전달 캐스케이드의 하류 또는 상류 멤버에 경쟁적으로 결합함으로써 천연형 단백질의 하나 이상의 활성을 억제할 수 있다. 따라서, 특이적 생물학적 효과는 제한된 기능의 변이체를 사용하는 처리에 의해 유도될 수 있다. 천연형 단백질의 생물학적 활성의 서브세트를 갖는 변이체로 피험자를 처리하면 천연형 단백질로 처리한 피험자에 비해 피험자의 부작용이 작을 수 있다.
효능제 (모방체) 또는 길항제로서 기능하는 마커 단백질의 변이체는 본 발명의 단백질의 돌연변이, 예를 들어, 트렁케이션 돌연변이의 조합 라이브러리를 효능제 또는 길항제 활성에 대해 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 한 실시태양에서, 변이체의 변이형 (variegated) 라이브러리는 핵산 수준에서 조합 돌연변이에 의해 생성되고, 변이형 유전자 라이브러리에 의해 코딩된다. 변이체의 변이형 라이브러리는 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 유전자 서열 내로 효소적으로 라이게이션하여, 잠재적인 단백질 서열의 다의성 세트가 개별 폴리펩티드로서 또는 별법으로 보다 큰 융합 단백질의 세트로서 (예를 들어, 파지 디스플레이에 대해) 발현가능하도록 함으로써 생산할 수 있다. 다의성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 마커 단백질의 잠재적인 변이체의 라이브러리를 생산하기 위해 사용할 수 있는 다양한 방법이 있다. 다의성 올리고뉴클레오티드 합성 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 Narang, 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura et al., 1984, Anru. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., 1984, Science 198:1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acids Res. 11:477 참고).
또한, 마커 단백질의 세그먼트의 라이브러리는 변이체 마커 단백질 또는 그의 세그먼트의 스크리닝 및 후속 선택을 위한 폴리펩티드의 변이형 집단을 생성하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 코딩 서열 단편의 라이브러리는 닉 형성 (nicking)이 분자당 약 1회만 발생하도록 하는 조건 하에 해당 코딩 서열의 이중가닥 PCR 단편을 뉴클레아제로 처리하고, 이중가닥 DNA를 변성시키고, DNA를 재생시켜 상이한 닉킹된 생성물로부터 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중가닥 DNA를 형성하고, S1 뉴클레아제로 처리하여 재형성된 듀플렉스로부터 단일 가닥 부분을 제거하고, 생성되는 단편 라이브러리를 발현 벡터 내로 라이게이션함으로써 생성할 수 있다. 상기 방법에 의해, 해당 단백질의 상이한 크기의 아미노 말단 및 내부 단편을 코딩하는 발현 라이브러리를 유도할 수 있다.
점 돌연변이 또는 트렁케이션에 의해 제조된 조합 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝하기 위한, 및 cDNA 라이브러리를 선택된 특성을 갖는 유전자 산물에 대해 스크리닝하기 위한 몇가지 기술이 당업계에 공지되어 있다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 가장 널리 사용되는 기술 (초고속 분석을 실시할 수 있는)은 전형적으로 유전자 라이브러리를 복제가능 발현 벡터 내로 클로닝하고, 적절한 세포를 벡터의 생성되는 라이브러리로 형질전환시키고, 목적하는 활성의 검출에 의해 그 생성물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 단리가 용이해지는 조건 하에 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 라이브러리 내의 기능적 돌연변이의 빈도를 증가시키는 기술인 재귀 앙상블 (recursive ensemble) 돌연변이 (REM)가 본 발명의 단백질의 변이체를 확인하기 위해 스크리닝 분석과 조합하여 사용될 수 있다 (Arkin and Yourvan, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993, Protein Engineering 6(3):327-331).
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 단백질에 대해 작용하는 항체에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 마커 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합한다. 본원에 상호교환가능하게 사용되는 용어 "항체" 및 "항체들"은 면역글로불린 분자, 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분을 포함하는 그의 단편 및 유도체를 나타낸다 (즉, 상기 부분은 항원, 예를 들어 마커 단백질, 예를 들어, 마커 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유한다). 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 단백질에 결합하지만 자연히 단백질을 함유하는 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플 내의 다른 분자에 실질적으로 결합하지 않는 항체이다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 예는 단일쇄 항체 (scAb), F(ab) 및 F(ab')2 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 단리된 단백질 또는 그의 단편은 항체를 생성하기 위해 면역원으로서 사용할 수 있다. 전장 단백질을 사용할 수 있거나, 또는 별법으로 본 발명은 면역원으로 사용하기 위해 항원성 펩티드 단편을 제공한다. 본 발명의 단백질의 항원성 펩티드는 본 발명의 단백질 중 하나의 아미노산 서열의 적어도 8 (바람직하게는 10, 15, 20 또는 30 이상)의 아미노산 잔기를 포함하고, 펩티드에 대해 발생된 항체가 단백질과 특이적 면역 복합체를 형성하도록 단백질의 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 항원성 펩티드에 포함된 바람직한 에피토프는 단백질의 표면에 위치하는 영역, 예를 들어, 친수성 영역이다. 소수성 서열 분석, 친수성 서열 분석 또는 유사한 분석이 친수성 영역을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 단리된 마커 단백질 또는 그의 단편이 면역원으로 사용된다.
면역원은 전형적으로 적합한 (즉, 면역적격) 피험자, 예를 들어 토끼, 염소, 마우스 또는 다른 포유동물 또는 척추동물을 면역화시킴으로써 항체를 제조하기 위해 사용된다. 적절한 면역원 제제는 예를 들어 재조합 방식으로 발현된 또는 화학적으로 합성된 단백질 또는 펩티드를 함유할 수 있다. 제제는 추가로 보강제 (adjuvant), 예를 들어 프로인트 (Freund's) 완전 또는 불완전 보강제 또는 유사한 면역자극제를 포함할 수 있다. 바람직한 면역원 조성물은 예를 들어, 본 발명의 단백질의 재조합 발현을 위해 비인간 숙주 세포를 사용하여 제조된 면역원 조성물과 같은, 다른 인간 단백질을 함유하지 않는 것이다. 상기 방식에서, 생성되는 항체 조성물은 본 발명의 단백질 이외의 인간 단백질의 결합을 감소시키거나 결합하지 않는다.
본 발명은 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"는 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 단지 하나의 종의 항원 결합 부위를 함유하는 항체 분자의 집단을 나타낸다. 바람직한 폴리클로날 및 모노클로날 항체 조성물은 본 발명의 단백질에 대해 작용하는 항체에 대해 선택된 것이다. 특히 바람직한 폴리클로날 및 모노클로날 항체 제제는 마커 단백질 또는 그의 단편에 대해 작용하는 항체만을 함유하는 것이다.
폴리클로날 항체는 면역원으로 본 발명의 단백질을 사용하여 적합한 피험자를 면역화시킴으로써 제조할 수 있다. 면역처리된 피험자에서 항체 역가는 표준 기술에 의해, 예를 들어 고정된 폴리펩티드를 사용하는 효소 결합 면역흡수 분석 (ELISA)으로 시간에 걸쳐 모니터링할 수 있다. 면역처리 후 적절한 시간에, 예를 들어 특이적 항체 역가가 최고일 때 항체-생산 세포를 피험자로부터 얻고, 표준 기술, 예를 들어 문헌 (Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497)에 최초로 설명된 하이브리도마 기술, 인간 B세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72 참조), EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al, pp. 77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,Inc., 1985 참조) 또는 트리오마 (trioma) 기술에 의해 모노클로날 항체 (mAb)를 제조하기 위해 사용할 수 있다. 하이브리도마 생산 기술은 잘 알려져 있다 (일반적으로 Current Protocols in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994 참조). 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 하이브리도마 배양 상등액을 예를 들어 표준 ELISA 분석을 이용하여 해당 폴리펩티드에 결합하는 항체에 대해 스크리닝함으로써 검출된다.
모노클로날 항체-분비 하이브리도마를 제조하는 대신, 본 발명의 단백질에 대해 작용하는 모노클로날 항체를 확인하고, 조합된 재조합 면역글로불린 라이브러리 (예를 들어, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 해당 폴리펩티드를 사용하여 스크리닝함으로써 단리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 키트는 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, 파마시아 Recombinant Pharge Antibody System, 카탈로그 넘버 27-9400-01 및 스트라타젠 SurfZAP Phage Display Kit, 카탈로그 넘버 240612). 추가로, 특히 스크리닝 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는데 사용하기에 알맞은 방법 및 시약의 예는 예를 들어, 미국 특허 5,223,409; PCT 출원 공개 WO 92/18619; PCT 출원 공개 WO 91/17271; PCT 출원 공개 WO 92/20791; PCT 출원 공개 WO 92/15679; PCT 출원 공개 WO 93/01288; PCT 출원 공개 WO 92/01047; PCT 출원 공개 WO 92/09690; PCT 출원 공개 WO 90/02809; 문헌 [Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734]에서 찾을 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 재조합 항체는 마커 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합한다. 재조합 항체는 인간 및 비인간 부분을 포함하는 키메릭 및 인간화 모노클로날 항체, 단일쇄 항체 및 다중특이적 항체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 키메릭 항체는 상이한 부분이 상이한 동물종에서 유래한 분자, 예를 들어 무린 mAb에서 유래한 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 분자이다 (예를 들어 본원에 그 전부가 참고로 포함된 카빌리 (Cabilly) 등의 미국 특허 4,816,567; 및 보스 (Boss) 등의 미국 특허 4,816,397 참고). 단일쇄 항체는 항원 결합 부위를 갖고, 단일 폴리펩티드로 구성된다. 이들은 당업계에 공지된 기술에 의해, 예를 들어 라드너 (Ladner) 등의 미국 특허 4,946,778 (그 전부가 본원에 참고로 포함됨); 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Whitlow et al., (1991), Enzymology 2:1-9; Whitlow et al., (1991), Enzymology 2:97-105; 및 Huston et al., (1991) Enzymology Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications 203:46-88]에 기재된 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 다중특이적 항체는 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 분자이다. 상기 분자는 당업계에 공지된 기술에 의해, 예를 들어 세갈 (Segal)의 미국 특허 4,676,980 (그 전부가 본원에 참고로 포함됨); 문헌 [Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Whitlow et al., (1994) Protein Eng. 7:1017-1026] 및 미국 특허 6,121,424에 기재된 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다.
인간화 항체는 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDRs) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 비인간 종으로부터의 항체 분자이다 (예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 퀸 (Queen)의 미국 특허 5,585,089 참조). 인간화 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해, 예를 들어 PCT 출원 공개 WO 87/02671; 유럽 특허 출원 184,187; 유럽 특허 출원 171,496; 유럽 특허 출원 173,494; PCT 출원 공개 WO 86/01533; 미국 특허 4,816,567; 유럽 특허 출원 125,023; 문헌 [Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521- 3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Technology 4:214]; 미국 특허 5,225,539; 문헌 [Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 및 Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060]에 기재된 방법을 이용하여 생산할 수 있다.
보다 특히, 인간화 항체는 예를 들어 내재성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없지만, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생산할 수 있다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들어, 본 발명의 마커에 대응하는 모든 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 일부를 사용하여 보통의 방식으로 면역화시킨다. 항원에 대해 작용하는 모노클로날 항체는 통상의 하이브리도마 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 함유되는 인간 면역글로불린 도입 유전자 (transgene)는 B세포 분화 동안 재배열된 후, 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 겪게 된다. 따라서, 상기 기술을 사용하여 치료적으로 유용한 IgG, IgA 및 IgE 항체를 제조하는 것이 가능하다. 인간 항체 제조를 위한 상기 기술에 대해서는 문헌 [Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93] 참조. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체 제조를 위한 상기 기술 및 상기 항체 제조를 위한 프로토콜에 대한 상세한 내용은 예를 들어 미국 특허 5,625,126; 미국 특허 5,633,425; 미국 특허 5,569,825; 미국 특허 5,661,016; 및 미국 특허 5,545,806을 참조한다. 또한, 압제닉스, 인크. (Abgenix, Inc.; 미국 캘리포니아주 프리몬트)와 같은 회사는 상기한 것과 유사한 기술을 이용하여 선택된 항원에 대해 작용하는 인간 항체를 제공하기 위한 연구를 수행하고 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 "유도 선택 (guided selection)"으로 언급되는 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다. 이 방법에서, 선택된 비인간 모노클로날 항체, 예를 들어 무린 항체가 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도하기 위해 사용된다 (Jespers et al., 1994, Bio/Technology 12:899-903).
본 발명의 항체는 생성 (예를 들어 피험자의 혈액 또는 혈청으로부터) 또는 합성 후에 단리되고, 잘 알려진 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다. 예를 들어, IgG 항체는 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 본 발명의 단백질에 특이적인 항체는 예를 들어 친화도 크로마토그래피에 의해 선택 또는 (예를 들어 부분 정제) 또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 재조합 방식으로 발현되고 정제된 (또는 부분적으로 정제된) 본 발명의 단백질은 본원에 기재된 바와 같이 생성되어 고상 지지체, 예를 들어 크로마토그래피 컬럼에 공유 또는 비공유 커플링된다. 이어서, 컬럼을 사용하여 매우 많은 상이한 에피토프에 대해 작용하는 항체를 함유하는 샘플로부터 본 발명의 단백질에 특이적인 항체를 친화도 정제하고, 실질적으로 정제된 항체 조성물, 즉 오염 항체가 실질적으로 존재하지 않는 조성물을 생성시킬 수 있다. 실질적으로 정제된 항체 조성물은 상기 문맥에서 항체 샘플이 본 발명의 목적하는 단백질과 다른 에피토프에 대해 작용하는 오염 항체를 단지 최대 30% (건조 중량), 바람직하게는 최대 20%, 보다 더 바람직하게는 최대 10%, 가장 바람직하게는 최대 5% (건조 중량) 함유함을 의미한다. 정제된 항체 조성물은 조성물 내의 적어도 99%의 항체가 본 발명의 목적하는 단백질에 대해 작용함을 의미한다.
바람직한 실시태양에서, 실질적으로 정제된 본 발명의 항체는 본 발명의 단백질의 시그날 펩티드, 분비된 서열, 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 또는 세포질 도메인 또는 세포질 멤브레인에 특이적으로 결합할 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 실질적으로 정제된 본 발명의 항체는 본 발명의 단백질의 아미노산 서열의 분비된 서열 또는 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 보다 바람직한 실시태양에서, 실질적으로 정제된 본 발명의 항체는 마커 단백질의 아미노산 서열의 분비된 서열 또는 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 단백질에 대해 작용하는 항체는 표준 기술, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 또는 면역침전에 의해 단백질을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체는 마커 발현의 수준 및 패턴을 평가하기 위해 마커 단백질 또는 그의 단편 (예를 들어, 세포 용해물 또는 세포 상등액 내의) 검출에 사용될 수 있다. 또한, 항체는 예를 들어 제시된 치료 요법의 효능을 결정하기 위해서 예를 들어 임상 시험 과정의 일부로서 조직 또는 체액 (예를 들어 난소-관련 체액) 내의 단백질 수준을 모니터링하기 위해 진단 과정에 사용할 수 있다. 검출은 검출가능 물질에 커플링된 본 발명의 항체를 포함하는 항체 유도체의 사용에 의해 용이해질 수 있다. 검출가능 물질의 예는 상이한 효소, 보조 분자군, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린스테라제를 포함하고, 적합한 보조 분자군 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고, 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고, 생체발광 물질의 예는 루시페라제, 루시페린 및 애쿠오린을 포함하고, 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
또한, 본 발명의 항체는 암 치료시에 치료제로서 사용될 수도 있다. 바람직한 실시태양에서, 완전히 본 발명의 인간 항체는 인간 암 환자, 특히 난소암 환자의 치료에 사용된다. 다른 바람직한 실시태양에서, 마커 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 치료용으로 사용된다. 또한, 상기 치료 항체는 치료 잔기, 예를 들어 사이토톡신, 치료제 또는 방사성 금속 이온에 컨쥬게이팅된 항체를 포함하는 항체 유도체 또는 면역독소일 수 있다. 사이토톡신 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 물질을 포함한다. 그 예는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올 및 푸로마이신 및 그의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 치료제는 항대사물질 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제 (예를 들어 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (예전 명칭: 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어 닥티노마이신 (예전 명칭: 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)) 및 항유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 컨쥬게이팅된 항체는, 약물 잔기는 전통적인 화학 치료제로 제한된 것으로 생각되지 않기 때문에 주어진 생물학적 반응을 변경하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 약물 잔기는 요구되는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들어 톡신, 예를 들어 리보좀-억제 단백질 (그 전부가 본원에 참고로 포함된 베터 (Better) 등의 미국 특허 6,146,631 참조), 아브린, 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신 또는 디프테리아 톡신; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제; 또는 생물학적 반응 조절제, 예를 들어 림포킨, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 마크로페이스 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF") 또는 다른 성장 인자를 포함할 수 있다.
상기 치료 잔기를 항체에 컨쥬게이팅시키는 기술은 잘 알려져 있다 (예를 들어 Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drut Delivery", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies' 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982) 참조).
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 그 모두가 본 발명의 단백질, 바람직하게는 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 실질적으로 정제된 항체, 항체 단편 및 유도체를 제공한다. 상이한 실시태양에서, 실질적으로 정제된 본 발명의 항체 또는 그의 단편 또는 유도체는 인간, 비인간, 키메릭 및(또는) 인간화 항체일 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명은 그 모두가 본 발명의 단백질, 바람직하게는 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 비인간 항체, 항체 단편 및 유도체를 제공한다. 상기 비인간 항체는 염소, 마우스, 양, 말, 닭, 토끼 또는 쥐 항체일 수 있다. 별법으로, 본 발명의 비인간 항체는 키메릭 및(또는) 인간화 항체일 수 있다. 또한, 본 발명의 비인간 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 다른 추가의 측면에서, 본 발명은 모노클로날 항체, 항체 단편 및 유도체를 제공하며, 이들 모두는 본 발명의 단백질, 바람직하게는, 마커 단백질에 특이적으로 결합한다. 모노클로날 항체는 인간, 인간화, 키메릭 및(또는) 비인간 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 검출가능 물질에 컨쥬게이팅된 본 발명의 항체, 및 사용 지시물을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 제약 조성물은 본 발명의 항체, 치료 잔기 및 제약상 허용되는 담체를 함유한다.
재조합 발현 벡터 및 숙주 세포
본 발명의 다른 측면은 마커 단백질 (또는 상기 단백질의 일부)을 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 그가 연결된 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 벡터의 한가지 종류는 "플라스미드"이고, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 원형 이중가닥 DNA 루프 (loop)를 나타낸다. 다른 종류의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포 내에서 자발적 복제를 할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터, 즉 발현 벡터는 이들이 작동가능하게 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 (벡터) 형태로 존재한다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 하는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 본 발명의 핵산을 숙주 세포 내에서의 핵산 발현에 적합한 형태로 포함한다. 이는 재조합 발현 벡터는 발현을 위해 사용할 숙주 세포에 기초하여 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 이는 발현시킬 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터에서, "작동가능하게 연결된"은 해당 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포에 도입된 경우 숙주 세포에서)을 허용하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결된 것을 의미한다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 성분 (예를 들어, 폴리아데닐화 시그날)을 포함하는 의미이다. 상기 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel, Methods in Enzymology: Gene Expression Technology vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1991)]에 기재되어 있다. 조절 서열은 많은 종류의 숙주 세포의 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 조절하는 것 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 것(예를 들어, 조직 특이적 조절 서열)을 포함한다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 요구되는 단백질의 발현 수준 등의 요인에 따라 결정될 수 있음을 당업계의 숙련인은 이해할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되어 본원에 기재된 바와 같이 핵산에 의해 코딩되는 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하여 단백질 또는 펩티드를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 (예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)) 또는 진핵 세포 (예를 들어, 곤충 세포 {바큘로바이러스 발현 벡터 사용}, 효모 세포 또는 포유동물 세포)에서 마커 단백질 또는 그의 세그먼트의 발현을 위해 디자인될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 추가로 문헌 [Goeddel, 상기 문헌]에 논의되어 있다. 별법으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 시험관 내에서 전사 및 번역될 수 있다.
원핵세포에서 단백질의 발현은 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 벡터를 갖는 이. 콜라이에서 가장 자주 수행된다. 융합 벡터는 그 내부에 코딩되는 단백질에, 보통 재조합 단백질의 아미노 말단에 많은 아미노산을 부가한다. 상기 융합 벡터는 일반적으로 3가지 목적, 즉 1) 재조합 단백질 발현의 증가, 2) 재조합 단백질의 가용성 증가 및 3) 친화도 정제에서 리간드로서 작용하여 재조합 단백질의 정제 보조를 위해 기능한다. 종종, 발현 벡터에서, 융합 단백질 정제 후에 융합 잔기로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 만들기 위해 단백분해 절단 부위가 융합 잔기와 재조합 단백질의 연결부에 도입된다. 상기 효소 및 이들의 동족 인식 서열은 팩터 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다. 전형적인 융합 발현 벡터는 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 각각 표적 재조합 단백질에 융합시키는 pGEX (파마시아 바이오테크 인크.; Smith and Johnson, 1988, Gene 67:31-40), pMAL (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 비벌리) 및 pRIT5 (파마시아, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)를 포함한다.
적합한 유도가능 비융합 이. 콜라이 발현 벡터의 예는 pTrc (Amann et al., 1988, Gene 69:301-315) 및 pET 11d (Studier et al., p. 60-89, In Gene Expression Technology: Methods in Enzymology vol. 185, Academic Press, San Diego, CA,1991)를 포함한다. pTrc 벡터로부터 표적 유전자의 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 중합효소 전사에 의존한다. pET 11d 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 동시발현되는 바이러스 RNA 중합효소 (T7 gn1)에 의해 매개되는 T7 gnlO-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존한다. 상기 바이러스 중합효소는 lacUV 5 프로모터의 전사 조절 하에 T7 gnl 유전자를 함유하는 내재하는 프로파지로부터 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 공급된다.
이. 콜라이에서 재조합 단백질 발현을 최대화하는 한 전략은 재조합 단백질을 단백분해에 의해 절단하는 능력이 손상된 숙주 세균에서 단백질을 발현하는 것이다 (Gottesman, p. 119-128, In Gene Expression Technology: Methods in Enzymology vol. 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990). 다른 전략은 각각의 아미노산에 대한 개별적인 코돈이 이. 콜라이에서 우선적으로 이용되도록 발현 벡터에 삽입되는 핵산의 서열을 변경시키는 것이다 (Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). 본 발명의 핵산 서열의 상기 변형은 표준 DNA 합성 기술에 의해 수행할 수 있다.
다른 실시태양에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)에서 발현하기 위한 벡터의 예는 pYepSec1 (Baldari et al., 1987, EMBO 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54: 113-123), pYES2 (인비트로겐 코포레이션 (Invitrogen Corporation), 미국 샌디에고) 및 pPicZ (인비트로겐 코포레이션)를 포함한다.
별법으로, 발현 벡터는 바큘로바이러스 발현 벡터이다. 배양된 곤충 세포 (예를 들어, Sf 9 세포)에서 단백질을 발현하기 위해 이용될 수 있는 바큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈 (Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈 (Lucklow and Summers, 1989, Virology 170:31-39)를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 핵산은 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 발현된다. 포유동물 발현 벡터의 예는 pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329:840) 및 pMT2PC (Kaufman et al., 1987, EMBO J 6:187-195)를 포함한다. 포유동물 세포에서 사용될 때, 발현 벡터의 조절 기능은 종종 바이러스 조절 성분에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 시미안 (Simian) 바이러스 40에서 유래한 것이다. 원핵 및 진핵 세포 모두에 적합한 다른 발현 시스템은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌의 chapters 16 및 17]을 참고할 수 있다.
다른 실시태양에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포 종류에서 우선적으로 핵산 발현을 지시할 수 있다 (예를 들어, 조직 특이적 조절 성분은 핵산 발현에 사용됨). 조직-특이적 조절 성분은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 조직 특이적 프로모터의 비제한적인 예는 알부민 프로모터 (간 특이적; Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1:268-277), 림프구-특이적 프로모터 (Calame and Eaton, 1988, Adv. Immunol. 43:235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터 (Winoto and Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733) 및 면역글로불린 (Banerji et al., 1983, Cell 33:729-740; Queen and Baltimore, 1983, Cell 33:741-748), 뉴런-특이적 프로모터 (예를 들어, 신경필라멘트 프로모터; Byrne and Ruddle, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), 췌장-특이적 프로모터 (Edlund et al., 1985, Science 230:912-916), 및 유선-특이적 프로모터(예를 들어, 유장 (milk whey) 프로모터; 미국 특허 4,873,316 및 유럽 특허 출원 공개 264,166)를 포함한다. 발생 조절 프로모터, 예를 들어 무린 hox 프로모터 (Kessel and Gruss, 1990, Science 249:374-379) 및 α-페토단백질 프로모터 (Camper and Tilghman, 1989, Genes Dev. 3:537-546)도 포함된다. .
본 발명은 추가로 안티센스 배향으로 발현 벡터에 클로닝된 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 즉, DNA 분자는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA에 안티센스인 RNA 분자의 발현 (DNA 분자의 전사에 의해)을 가능하게 하는 방식으로 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 다양한 세포 종류에서 안티센스 RNA 분자의 연속 발현을 지시하는, 안티센스 배향으로 클로닝된 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 선택할 수 있고, 예를 들어 안티센스 RNA의 직접적인 구성적, 조직-특이적 또는 세포 종류 특이적 발현을 지시하는 바이러스 프로모터 및(또는) 인핸서 또는 조절 서열이 선택될 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 안티센스 핵산이 고효율 조절 영역의 조절 하에 생성되고, 그의 활성이 벡터가 도입되는 세포 종류에 의해 결정될 수 있는 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약독화된 (attenuated) 바이러스의 형태일 수 있다. 안티센스 유전자를 이용한 유전자 발현의 조절에 대한 논의는 문헌 (Weintraub et al., 1986, Trends in Genetics, Vol.1(1))을 참조한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 특정 피험자 세포 뿐만 아니라 상기 세포의 자손체 또는 잠재적인 자손체를 나타내는 것으로 이해된다. 돌연변이 또는 환경의 영향으로 인해 다음 세대에 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 상기 자손체는 실제로 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에서 사용되는 용어의 범위 내에 포함된다.
숙주 세포는 임의의 원핵 (예, 이. 콜라이) 또는 진핵 세포 (예, 곤충 세포, 효모 또는 포유동물 세포)일 수 있다.
벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포에 도입시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션 (lipofection) 또는 전자천공을 포함하는, 외래 핵산을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 다양한 당업계에 인정된 기술을 나타내도록 의도된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키기 위해 적합한 방법은 문헌 [Sambrook, et al., 상기 문헌] 및 다른 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
포유동물 세포의 안정한 형질감염에 있어서, 사용된 발현 벡터 및 형질감염 기술에 따라, 적은 비율의 세포만이 외래 DNA를 그들의 게놈 내로 통합할 수 있음이 알려져 있다. 이들 통합체 (integrant)를 확인하고 선택하기 위해, 선택가능 마커를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 항생제에 대한 내성을 위한)가 일반적으로 해당 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 바람직한 선택가능 마커는 약물, 예를 들어 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 것이다. 도입된 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포는 약물 선별에 의해 확인할 수 있다 (예를 들어, 선택가능 마커 유전자를 포함한 세포는 생존할 것인 반면, 다른 세포는 죽는다).
본 발명의 숙주 세포, 예를 들어 배양액 중의 원핵 또는 진핵 숙주 세포는 마커 단백질 또는 그의 세그먼트를 제조하기 위해 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 마커 단백질 또는 그의 세그먼트를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 본 발명의 숙주 세포 (마커 단백질 또는 그의 세그먼트를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 도입시킨)를 단백질을 생산하도록 적합한 배지 내에서 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 추가로 마커 단백질 또는 그의 세그먼트를 배지 또는 숙주 세포로부터 단리하는 것을 포함한다.
본 발명의 숙주 세포는 또한 비인간 트랜스제닉 동물을 생산하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 발명의 숙주 세포는 마커 단백질 또는 그의 세그먼트를 코딩하는 서열이 도입된 수정된 난모세포 또는 배아 줄기 세포이다. 이어서 상기 숙주 세포는 본 발명의 마커 단백질을 코딩하는 외인성 서열이 그의 게놈 내로 도입된 비인간 트랜스제닉 동물 또는 마커 단백질을 코딩하는 내재성 유전자(들)이 변경된 상동성 재조합 동물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 상기 동물은 마커 단백질의 기능 및(또는) 활성을 연구하기 위해 및 마커 단백질의 조정자 (modulator)의 확인 및(또는) 평가를 위해 유용하다. 본원에서 사용되는 "트랜스제닉 동물"은 동물의 하나 이상의 세포가 도입 유전자를 포함하는 비인간 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 설치류, 예를 들어 쥐 또는 마우스이다. 트랜스제닉 동물의 다른 예는 비인간 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭, 양서류 등을 포함한다. 도입 유전자는 트랜스제닉 동물이 발생되는 세포의 게놈 내로 통합되고 성숙 동물의 게놈 내에 남아있어서, 트랜스제닉 동물의 하나 이상의 세포 종류 또는 조직 내에서 코딩된 유전자 산물의 발현을 지시하는 외인성 DNA이다. 본원에서 사용되는 "상동성 재조합 동물"은 내재성 유전자가 내재성 유전자와 동물의 발생 이전에 동물의 세포, 예를 들어, 동물의 배아 세포 내로 도입된 외인성 DNA 분자 사이의 상동성 재조합에 의해 변경된 비인간 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 마우스이다.
본 발명의 트랜스제닉 동물은 예를 들어 미세주입, 레트로바이러스 감염에 의해 마커 단백질을 코딩하는 핵산을 수정된 난모세포의 수컷 전핵 내로 도입하고 난모세포를 가임신 대리모 암컷에서 발생시킴으로써 생성시킬 수 있다. 도입 유전자의 발현 효능을 증가시키기 위해서 인트론 서열 및 폴리아데닐화 시그날도 도입 유전자에 포함될 수 있다. 조직 특이적 조절 서열(들)은 본 발명의 폴리펩티드의 특정 세포로의 발현을 지시하기 위해 도입 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특히 동물, 예를 들어 마우스의 배 조작 및 미세주입을 통해 트랜스제닉 동물을 생성시키는 방법은 당업계에 통상적인 기술로서, 예를 들어 미국 특허 4,736,866 및 4,870,009, 미국 특허 4,873,191 및 문헌 [Hogan, Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986]에 기재되어 있다. 다른 트랜스제닉 동물을 생성시키기 위해 유사한 방법을 사용한다. 시조 트랜스제닉 동물은 그의 게놈 내의 도입 유전자의 존재 및(또는) 동물의 조직 또는 세포에서 도입 유전자를 코딩하는 mRNA의 발현을 기초로 하여 확인할 수 있다. 시조 트랜스제닉 동물은 이어서 도입 유전자를 함유하는 추가의 동물을 번식시키기 위해 사용할 수 있다. 또한, 도입 유전자를 함유하는 트랜스제닉 동물은 추가로 다른 도입 유전자를 함유하는 다른 트랜스제닉 동물에 교배시킬 수 있다.
상동성 재조합 동물을 생성시키기 위해, 결실, 부가 또는 치환이 그 내부에 도입되어 예를 들어 유전자를 기능적으로 붕괴시킨 마커 단백질을 코딩하는 유전자의 적어도 일부를 함유하는 벡터를 제조한다. 바람직한 실시태양에서, 벡터는 상동성 재조합시에 내재성 유전자가 기능적으로 붕괴되도록 디자인된다 (즉, 더이상 기능적 단백질을 코딩하지 않음; "낙아웃" 벡터로도 언급됨). 별법으로, 벡터는 상동성 재조합시에 내재성 유전자가 돌연변이되거나 다른 방식으로 변경되지만 기능적 단백질을 계속 코딩하도록 디자인될 수 있다 (예를 들어, 상류 조절 영역은 내재성 단백질의 발현을 변경시키도록 변경될 수 있다). 상동성 재조합 벡터에서, 유전자의 변경된 부분은 벡터에 함유되는 외인성 유전자와 배아 줄기 세포의 내재성 유전자 사이에서 상동성 재조합이 발생하도록 유전자의 추가의 핵산에 의해 그의 5' 및 3' 말단에서 인접한다. 추가의 인접 핵산 서열은 내재성 유전자와 성공적인 상동성 재조합을 위한 충분한 길이이다. 일반적으로, 인접 DNA의 수 kB의 염기 (5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함된다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터에 대해서는 Thomas and Capecchi, 1987, Cell 51:503 참조). 벡터는 배아 줄기 세포주 내로 (예를 들어 전자천공에 의해) 도입되고, 도입된 유전자가 내재성 유전자와 상동 재조합된 세포가 선택된다 (예를 들어 Li et al., 1992, Cell 69:915 참조). 선택된 세포는 이어서 동물 (예를 들어, 마우스)의 배반포에 주입되어 결집 키메라를 형성한다 (예를 들어 Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell: A Practical Approach, Robertson, Ed., IRL, Oxford, 1987, pp. 113-152 참조). 키메릭 배는 이어서 적합한 가임신 암컷 대리모 동물에 착상되어 배를 분만시킬 수 있다. 그의 생식 세포에 상동 재조합 DNA를 보유하는 자손체는 동물의 모든 세포가 도입 유전자의 생식세포 유전에 의해 상동 재조합 DNA를 포함하는 동물을 번식시키기 위해 사용될 수 있다. 상동성 재조합 벡터 및 상동성 재조합 동물을 제조하는 방법은 추가로 문헌 [Bradley (1991) Current Opinion in Bio/Technology 2:823-829 및 PCT 출원 공개 WO 90/11354, WO 91/01140, WO 92/0968 및 WO 93/04169]에 기재되어 있다.
다른 실시태양에서, 도입 유전자의 조절된 발현을 허용하는 선택된 시스템을 함유하는 트랜스제닉 비인간 동물이 생산될 수 있다. 상기 시스템의 한 예는 박테리오파지 P1의 cre / loxP 리콤비나제 시스템이다. cre / loxP 리콤비나제 시스템의 설명에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236]을 참조한다. 리콤비나제 시스템의 다른 예는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 FLP 리콤비나제 시스템이다 (O'Gorman et al., 1991, Science 251:1351-1355). 도입 유전자의 발현을 조절하기 위해 cre / loxP 리콤비나제 시스템이 사용되면, Cre 리콤비나제 및 선택된 단백질을 모두 코딩하는 도입 유전자를 함유하는 동물이 필요하다. 상기 동물은 예를 들어, 하나는 선택된 단백질을 코딩하는 도입 유전자를 함유하고 다른 하나는 리콤비나제를 코딩하는 도입 유전자를 함유하는 2마리의 트랜스제닉 동물의 교배에 의한 "이중" 트랜스제닉 동물의 제작을 통해 제공할 수 있다.
문헌 [Wilmut et al. (1997) Nature 385:810-813] 및 PCT 출원 공개 WO 97/07668과 WO 97/07669에 기재된 방법에 따라 본원에 기재된 비인간 트랜스제닉 동물의 클론을 또한 생산할 수 있다.
제약 조성물
본 발명의 핵산 분자, 폴리펩티드 및 항체 (본원에서 "활성 화합물"로도 불림)는 투여에 적합한 제약 조성물 내에 포함될 수 있다. 상기 조성물은 전형적으로 핵산 분자, 단백질 또는 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 표현 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여에 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 흡수 지연제 등을 포함하도록 의도된다. 제약학적 활성 성분을 위한 상기 매질 및 물질의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 활성 화합물과 부적합성인 것을 제외하면, 임의의 통상적인 매질 또는 물질을 조성물 내에 사용하는 것이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물 내로 포함될 수 있다.
본 발명은 마커 핵산 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조정하기 위한 제약 조성물의 제조 방법을 포함한다. 상기 방법은 제약상 허용되는 담체를 마커 핵산 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조정하는 물질와 함께 제형화하는 것을 포함한다. 상기 조성물은 추가의 활성제를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 제약상 허용되는 담체를 마커 핵산 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조정하는 물질 및 하나 이상의 추가의 활성 화합물과 함께 제형화함으로써 제약 조성물을 제조하기 위한 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 (a) 마커에 결합하거나, (b) 마커의 활성에 조절 (예를 들어, 자극 또는 억제) 효과를 갖거나, 보다 구체적으로 (c) 마커와 하나 이상의 그의 천연 기질 (예를 들어, 펩티드, 단백질, 호르몬, 보조인자 또는 핵산)의 상호작용에 대한 조정 효과를 갖거나, 또는 (d) 마커의 발현에 대해 조정 효과를 갖는 조정자, 즉, 후보 또는 시험 화합물 또는 물질 (예를 들어, 펩티드, 펩티드 모방체, 펩토이드, 작은 분자 또는 다른 약물)을 확인하기 위한 방법 (본원에서 "스크리닝 분석"으로도 불림)을 제공한다. 상기 분석은 전형적으로 마커와 하나 이상의 분석 성분 사이의 반응을 포함한다. 다른 성분은 시험 화합물 자체, 또는 시험 화합물과 마커의 천연 결합 파트너의 조합물일 수 있다.
본 발명의 시험 화합물은 천연 및(또는) 합성 화합물의 계통 (systematic) 라이브러리를 포함하는 임의의 이용가능한 공급원으로부터 입수할 수 있다. 시험 화합물은 또한 생물학적 라이브러리; 펩토이드 라이브러리 (펩티드의 기능성을 갖지만, 효소 분해에 대해 내성임에도 불구하고 생활성 (bioactive)을 유지하는 신규한 비-펩티드 주쇄를 갖는 분자의 라이브러리; 예를 들어 Zuckermann et al., 1994, J Med. Chem. 37:2678-85 참고); 공간적으로 어드레스가능한 평행 고상 또는 용액상 라이브러리; 디컨벌루션 (deconvolution)을 요구하는 합성 라이브러리 방법; '일-비드 일-화합물 (one-bead one-compound)' 라이브러리 방법; 및 친화도 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법을 포함한, 당업계에 공지된 조합 라이브러리 방법 내의 임의의 수많은 방법에 의해 입수할 수 있다. 생물학적 라이브러리 및 펩토이드 라이브러리 방법은 펩티드 라이브러리에 제한되는 반면, 다른 4개의 방법은 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 화합물의 작은 분자 라이브러리에 적용가능하다 (Lam, 1997, Anticancer Agents Des. 12:145).
분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 당업계에서, 예를 들어 문헌 [DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 및 Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233]에서 찾을 수 있다.
화합물의 라이브러리는 용액으로 (예를 들어, Houghten, 1992, Biotechnology 13:412-421) 또는 비드 (Lam, 1991, Nature 354:82-84), 칩 (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), 박테리아 및(또는) 포자 (라드너 (Ladner), 미국 특허 5,223,409), 플라스미드 (Cull et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) 상에 또는 파지 상에 (Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, 상기 문헌) 제시될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은 마커 또는 그의 생물학적 활성 부분에 의해 코딩되거나 또는 그에 대응하는 단백질의 기질인 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 분석법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 마커 또는 그의 생물학적 활성 부분에 의해 코딩되거나 또는 그에 대응하는 단백질에 결합하는 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 분석법을 제공한다. 단백질에 직접 결합하는 시험 화합물의 능력의 결정은 예를 들어, 화합물의 마커에 대한 결합이 복합체 내의 표지된 마커 화합물을 검출함으로써 결정될 수 있도록 화합물을 방사성동위원소 또는 효소 표지와 결합시킴으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 화합물 (예를 들어, 마커 기질)은 125I, 35S, 14C 또는 3H로 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있고, 방사성동위원소는 방사선방출의 직접 계수에 의해 또는 섬광 계수에 의해 검출될 수 있다. 별법으로, 분석 성분은 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 루시페라제로 효소적으로 표지될 수 있고, 효소 표지는 적절한 기질의 생성물로의 전환율의 결정에 의해 검출할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 마커의 발현 또는 마커 또는 그의 생물학적 활성 부분에 의해 코딩되거나 또는 그에 대응하는 단백질의 활성을 조정하는 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 분석법을 제공한다. 아마도, 마커에 의해 코딩되거나 그에 대응하는 단백질은 생체내에서 하나 이상의 분자, 예를 들어 비제한적으로 펩티드, 단백질, 호르몬, 보조인자 및 핵산과 상호작용할 수 있다. 본원의 논의의 목적에서, 상기 세포성 및 세포외 분자는 본원에서 "결합 파트너" 또는 마커 "기질"로 부른다.
상기 스크리닝을 용이하게 하기 위한 본 발명의 하나의 필수적인 실시태양은 단백질의 천연 생체내 결합 파트너를 확인하기 위해 마커에 의해 코딩되거나 그에 대응하는 단백질을 사용하는 것이다. 이를 달성하기 위한 많은 방법이 있고, 이는 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 한 예는 마커와 결합하거나 상호작용하고 따라서 가능하게는 마커의 천연 기능에 관여하는 다른 단백질 (결합 파트너)을 확인하기 위해 2-하이브리드 분석 또는 3-하이브리드 분석에서 "베이트 (bait) 단백질"로서 마커 단백질을 사용하는 것이다 (예를 들어 미국 특허 5,283,317; Zervos et al, 1993, Cell 72:223-232; Madura et al, 1993, J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al, 1993, Bio/Technology 14:920-924; Iwabuchi et al, 1993 Oncogene 8:1693-1696; Brent W094/10300). 상기 마커 결합 파트너는 또한 마커 단백질 또는 마커 단백질-매개 신호전달 경로의 하류 성분에 의한 시그날의 전달에 관여할 가능성이 있다. 별법으로, 상기 마커 단백질 결합 파트너는 마커 단백질의 억제제인 것으로 밝혀질 수도 있다.
2-하이브리드 시스템은 분리가능한 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 이루어지는 대부분의 전사 인자의 조절 특성에 기초한 것이다. 간단히 설명하면, 분석은 2개의 상이한 DNA 구조체를 이용한다. 한 구조체에서, 마커 단백질을 코딩하는 유전자는 공지의 전사 인자 (예를 들어, GAL-4)의 DNA 결합 도메인을 코딩하는 유전자에 융합된다. 다른 구조체에서, 확인되지 않은 단백질 ("프레이 (prey)" 또는 "샘플")을 코딩하는 DNA 서열의 라이브러리로부터의 DNA 서열은 공지의 전사 인자의 활성화 도메인을 코딩하는 유전자에 융합된다. "베이트" 및 "프레이" 단백질이 생체내에서 상호작용하여 마커-의존성 복합체를 형성할 수 있다면, 전사 인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인은 매우 근접하게 된다. 이러한 근접에 의해, 전사 인자에 반응성인 전사 조절 부위에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 (예를 들어 LacZ)의 전사가 가능하게 된다. 리포터 유전자의 발현은 용이하게 검출할 수 있고, 기능적 전사 인자를 함유하는 세포 콜로니는 단리되어 마커 단백질과 상호작용하는 단백질을 코딩하는 클로닝된 유전자를 얻을 수 있다.
추가의 실시태양에서, 마커 단백질과 그의 기질 및(또는) 결합 파트너 사이의 상호 작용을 조절 (예를 들어, 양의 또는 부의 영향)하는 화합물을 확인하기 위한 분석을 본 발명을 사용하여 고안해낼 수 있다. 상기 화합물은 분자, 예를 들어 항체, 펩티드, 호르몬, 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 그의 유사체를 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 상기 화합물은 또한 천연 및(또는) 합성 화합물의 계통 라이브러리를 포함하여 임의의 가용한 공급원으로부터 얻을 수 있다. 상기 실시태양에서 사용하기 바람직한 분석 성분은 확인된 난소암 마커 단백질, 공지의 결합 파트너 및(또는) 기질 및 시험 화합물이다. 시험 화합물은 임의의 공급원으로부터 공급될 수 있다.
마커 단백질과 그의 결합 파트너 사이의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하기 위해 사용되는 분석 시스템의 기본 원리는 두 생성물이 상호작용하고 결합하여 복합체를 형성하기에 충분한 조건 및 시간에서 마커 단백질 및 그의 결합 파트너를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것을 수반한다. 억제 활성에 대해 물질을 시험하기 위해서, 반응 혼합물은 시험 화합물의 존재 및 부재 하에 제조한다. 시험 화합물은 반응 혼합물에 초기에 포함될 수 있거나, 마커 단백질 및 그의 결합 파트너의 첨가 후에 첨가될 수 있다. 대조 반응 혼합물은 시험 화합물 없이 또는 위약과 함께 인큐베이팅된다. 이어서, 마커 단백질과 그의 결합 파트너 사이의 임의의 복합체의 형성을 검출한다. 대조 반응에서 복합체가 형성되지만 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서 상기 형성이 작거나 전혀 없을 경우, 화합물이 마커 단백질과 그의 결합 파트너의 상호작용을 방해한 것을 나타낸다. 반대로, 대조 반응보다 화합물의 존재 시에 보다 많은 복합체가 형성되면, 마커 단백질과 그의 결합 파트너의 상호작용을 화합물이 증강시킬 수 있음을 나타낸다.
마커 단백질과 그의 결합 파트너의 상호작용을 방해하는 화합물에 대한 분석은 불균일 또는 균일 포맷으로 수행할 수 있다. 불균일 분석은 마커 단백질 또는 그의 결합 파트너를 고상에 앵커링하고 반응 종료시에 고상에 앵커링된 복합체를 검출하는 것을 수반한다. 균일 분석에서, 전체 반응은 액상으로 수행한다. 두 방법 모두에서, 반응물의 첨가 순서는 시험되는 화합물에 대한 상이한 정보를 얻기 위해 다를 수 있다. 예를 들어, 마커 단백질과 결합 파트너 사이의 상호작용을 방해하는 시험 화합물 (예를 들어 경쟁에 의해)은 시험 물질의 존재 하에, 즉 마커 및 그의 상호작용하는 결합 파트너 첨가 전에 또는 첨가와 동시에 시험 물질을 반응 혼합물에 첨가하여 반응을 수행함으로써 확인할 수 있다. 별법으로, 기형성된 복합체를 붕괴시키는 시험 화합물, 예를 들어 복합체로부터 성분 중의 하나를 치환하는 높은 결합 상수를 갖는 화합물은 복합체 형성 후에 시험 화합물을 반응 혼합물에 첨가함으로써 시험할 수 있다. 상이한 포맷을 아래에서 간단히 설명한다.
불균일 분석 시스템에서, 마커 단백질 또는 그의 결합 파트너는 고체 표면 또는 매트릭스에 앵커링되지만, 다른 대응하는 비앵커링된 성분은 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 실제로, 마이크로타이터 플레이트가 상기 방법에 종종 이용된다. 앵커링된 물질종은 당업자에게 일반적으로 잘 알려진 많은 방법에 의해 비공유 또는 공유 고정될 수 있다. 비공유 부착은 종종 고체 표면을 마커 단백질 또는 그의 결합 파트너의 용액으로 코팅하고 건조시켜 간단하게 달성할 수 있다. 별법으로, 앵커링된 분석 성분에 특이적인 고정된 항체를 상기 목적을 위해 사용할 수 있다. 상기 표면은 종종 미리 제조되어 보관할 수 있다.
관련 실시태양에서, 분석 성분의 하나 또는 둘 모두가 매트릭스에 앵커링되도록 하는 도메인을 부가하는 융합 단백질을 제공할 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제/마커 융합 단백질 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제/결합 파트너는 글루타티온 세파로즈 비드 (시그마 케미칼 (Sigma Chemical, 미국 미쥬리주 세인트루이스) 또는 글루타티온 유도체화 마이크로타이터 플레이트 상에 흡착한 후, 시험 화합물 또는 시험 화합물 및 비흡착된 마커 또는 그의 결합 파트너와 조합하고, 혼합물을 복합체 형성에 도움이 되는 조건 (예를 들어, 생리학적 조건) 하에서 인큐베이팅할 수 있다. 인큐베이팅한 후, 비드 또는 마이크로타이터 플레이트 웰을 세척하여, 예를 들어 상기한 바와 같이 임의의 미결합된 분석 성분을 제거하고, 고정된 복합체를 직접 또는 간접적으로 평가한다. 별법으로, 복합체는 매트릭스로부터 해리시키고, 마커 결합 수준 또는 활성을 표준 기술을 사용하여 결정한다.
매트릭스 상에 단백질을 고정하기 위한 다른 기술도 본 발명의 스크리닝 분석에서 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 마커 단백질 또는 마커 단백질 결합 파트너는 비오틴 및 스트렙타비딘의 컨쥬게이션을 사용하여 고정할 수 있다. 비오티닐화된 마커 단백질 또는 표적 분자는 당업계에 공지된 기술 (예를 들어, 비오티닐화 키트, 피어스 케미칼스 (Pierce Chemicals), 미국 일리노이주 록포드)을 사용하여 비오틴-NHS (N-히드록시-숙신이미드)로부터 제조하여 스트렙타비딘-코팅된 96웰 플레이트 (피어스 케미칼)의 웰에 고정될 수 있다. 특정 실시태양에서, 단백질-고정된 표면은 미리 제조하여 보관할 수 있다.
분석을 수행하기 위해서, 고정된 분석 성분의 대응하는 파트너를 시험 화합물이 존재하거나 존재하지 않는 코팅 표면에 노출한다. 반응이 종결된 후, 미반응 분석 성분은 제거하고 (예를 들어 세척에 의해), 형성된 임의의 복합체는 고상 표면 상에 고정되어 유지될 것이다. 고상 표면 상에 앵커링된 복합체의 검출은 많은 방식으로 수행될 수 있다. 비고정된 성분을 예비표지하는 경우, 표면 상에 고정된 표지의 검출은 복합체의 형성을 나타낸다. 비고정된 성분을 예비표지하지 않는 경우, 간접 표지를 사용하여, 예를 들어 처음에 비고정된 물질종에 특이적인 표지된 항체 (항체는 다시 직접 표지되거나 예를 들어 표지된 항-Ig 항체로 간접적으로 표지될 수 있음)를 사용하여 표면 상에 앵커링된 복합체를 검출할 수 있다. 반응 성분의 첨가 순서에 따라, 복합체 형성을 조절 (억제 또는 증강)하고 기형성된 복합체를 붕괴시키는 시험 화합물을 검출할 수 있다.
본 발명의 별도의 실시태양에서, 균일 분석을 사용할 수 있다. 이것은 일반적으로 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 액상으로 수행되는, 상기 언급한 반응과 유사한 반응이다. 형성된 복합체는 이어서 미반응 성분과 분리되고, 형성된 복합체의 양을 결정한다. 불균일 분석 시스템에서 언급한 바와 같이, 반응물을 액상에 첨가하는 순서는 복합체 형성을 조절 (억제 또는 증강)하고 기형성된 복합체를 붕괴시키는 시험 화합물에 대한 정보를 제시할 수 있다.
상기 균일 분석에서, 반응생성물은 분별 원심분리, 크로마토그래피, 전기영동 및 면역침전을 포함하여 이로 제한되지 않는 임의의 많은 표준 기술에 의해 미반응 분석 성분으로부터 분리할 수 있다. 분별 원심분리에서, 분자의 복합체는 그들의 상이한 크기 및 밀도를 기초로 한 복합체의 상이한 침강 평형에 의해 일련의 원심분리 단계를 통해 비복합체화된 분자로부터 분리될 수 있다 (예를 들어, Rivas, G., and Minton, A.P., Trends Biochem Sci 1993 Aug; 18(8):284-7 참조). 또한, 표준 크로마토그래피 기술을 이용하여 비복합체화된 분자로부터 복합체화된 분자를 분리할 수 있다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피는 크기를 기초로 하여 컬럼 포맷에 적절한 겔 여과 수지를 이용하여 분자를 분리한다. 예를 들어, 상대적으로 큰 복합체는 비교적 작은 비복합체화된 성분으로부터 분리할 수 있다. 유사하게, 비복합체화된 분자에 비해 복합체의 비교적 상이한 전하 특성은 예를 들어 이온교환 크로마토그래피 수지를 사용하여 잔류하는 개별 반응물로부터 복합체를 분별 분리하도록 이용될 수 있다. 상기 수지 및 크로마토그래피 기술은 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다 (예를 들어 Heegaard, 1998, J Mol. Recognit. 11:141-148; Hage and Tweed, 1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 699:499-525 참조). 또한, 겔 전기영동을 사용하여 비결합된 물질종으로부터 복합체화된 분자를 분리할 수 있다 (예를 들어 Ausubel et al (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York. 1999 참조). 상기 기술에서, 단백질 또는 핵산 복합체는 예를 들어 크기 또는 전하를 기초로 하여 분리된다. 전기영동 과정 동안 결합 상호작용을 유지하기 위해, 환원제의 부재 하의 비변성 겔이 일반적으로 바람직하지만, 특정 상호작용 물질에 적절한 조건이 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있을 것이다. 면역침전은 용액으로부터 단백질-단백질 복합체의 분리를 위해 사용되는 다른 통상적인 기술이다 (예를 들어 Ausubel et al (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York. 1999 참조). 상기 기술에서, 결합 분자의 하나에 특이적인 항체에 결합하는 모든 단백질은 원심분리에 의해 쉽게 수거할 수 있는 중합체 비드에 항체를 컨쥬게이팅시켜 용액으로부터 침전된다. 결합된 분석 성분은 비드로부터 방출되고 (특정 단백질 분해 또는 복합체의 단백질-단백질 상호작용을 붕괴시키지 않는 당업계에 공지되어 있는 다른 기술을 통해), 제2 면역침전 단계가 수행되고, 이때 대응하는 상이한 상호작용 분석 성분에 특이적인 항체를 이용한다. 이러한 방식에서, 단지 형성된 복합체만이 비드에 부착된 상태로 유지되어야 한다. 시험 화합물 존재 및 부재하 모두에서 복합체 형성의 변경을 비교하여 마커 단백질과 그의 결합 파트너 사이의 상호작용을 조절하는 화합물의 능력에 대한 정보를 제공할 수 있다.
또한, 추가의 샘플 조작없이 균일 또는 불균일 분석 시스템에서 마커 단백질과 그의 천연 결합 파트너 및(또는) 시험 화합물 사이의 상호작용을 직접 검출하는 방법도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 형광 에너지 전달 기술을 이용할 수 있다 (예를 들어, 라코빅츠 (Lakowicz) 등의 미국 특허 5,631,169; 스타브리아노파울로스 (Stavrianopoulos) 등의 미국 특허 4,868,103 참조). 일반적으로, 상기 기술은 그의 방출된 형광 에너지는 제2 '수여' 분자 (예를 들어, 마커 또는 시험 화합물) 상의 형광 표지에 의해 흡수될 것이고, 이는 다시 흡수된 에너지 때문에 형광을 낼 수 있도록, 제1 '공여' 분자 (예를 들어, 마커 또는 시험 화합물) 상에 형광단 표지의 첨가를 포함한다. 별법으로, '공여' 단백질 분자는 간단히 트립토판 잔기의 천연 형광 에너지를 이용할 수 있다. '수여' 분자 표지가 '공여' 분자 표지와 구별될 수 있도록 상이한 파장의 광을 방출하는 표지가 선택된다. 표지들 사이의 에너지 전달 효율은 분자를 분리하는 거리와 관련되므로, 분자 사이의 공간 관계를 평가할 수 있다. 분자 사이에 결합이 일어나는 상황에서, 분석에서 '수여' 분자 표지의 형광 방출은 최대가 될 것이다. FET 결합 사건은 당업계에 공지되어 있는 표준 형광 검출 수단을 통해 (예를 들어, 형광계를 사용하여) 편리하게 측정할 수 있다. 예비형성된 복합체에서 물질종들 중 하나의 참여를 강화하거나 방해하는 시험 물질은 배경에 대해 시그날 변이체를 생성시킬 것이다. 본 방식으로, 마커와 그의 결합 파트너 사이의 상호작용을 조정하는 시험 물질은 제어된 분석으로 확인할 수 있다.
다른 실시태양에서, 마커 발현의 조정자는 세포를 후보 화합물과 접촉시키고 세포 내의 마커 mRNA 또는 단백질의 발현을 결정하는 방법으로 확인한다. 후보 화합물의 존재 하의 마커 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 후보 화합물의 부재 하의 마커 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교한다. 이어서 후보 화합물은 상기 비교를 기준으로 마커 발현의 조정자로서 확인할 수 있다. 예를 들어, 마커 mRNA 또는 단백질의 발현이 그의 부재 하보다 후보 화합물의 존재 하에서 더 큰 (통계학적으로 유의하게 더 큰) 경우, 후보 화합물은 마커 mRNA 또는 단백질 발현의 자극제로서 확인된다. 반대로, 마커 mRNA 또는 단백질의 발현이 그의 부재 하보다 후보 화합물의 존재 하에서 더 적은 (통계학적으로 유의하게 더 적은) 경우, 후보 화합물은 마커 mRNA 또는 단백질 발현의 억제제로서 확인된다. 세포 내의 마커 mRNA 또는 단백질 발현의 수준은 마커 mRNA 또는 단백질을 검출하기 위해 본원에 기재된 방법에 의해 결정할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 분석의 2 이상의 조합에 관한 것이다. 예를 들어, 조정제는 세포 기반 또는 무세포 분석을 이용하여 확인할 수 있고, 마커 단백질의 활성을 조정하는 물질의 능력은 세포성 형질전환 및(또는) 종양발생에 대해 생체내, 예를 들어, 전체 동물 모델에서 추가로 확인할 수 있다.
본 발명은 추가로 상기한 스크리닝 분석에 의해 확인된 신규한 물질에 관한 것이다. 따라서, 적절한 동물 모델에서 본원에 기재된 바와 같이 확인된 물질을 사용하는 것이 추가로 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 확인된 물질 (예를 들어, 마커 조정제, 안티센스 마커 핵산 분자, 마커-특이적 항체 또는 마커-결합 파트너)이 상기 물질을 사용한 치료의 효능, 독성 또는 부작용을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다. 별법으로, 본원에 기재된 바와 같이 확인된 물질은 상기 물질의 작용 메카니즘을 결정하기 위해 동물 모델에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기한 스크리닝 분석에 의해 확인된 신규한 물질의 본원에 기재된 바와 같은 치료를 위한 용도에 관한 것이다.
작은 분자 물질 및 단백질 또는 폴리펩티드 물질의 적절한 투여량은 통상의 기술의 의사, 수의사 또는 연구자의 지식 내에 있는 많은 인자에 따르는 것이 이해된다. 이들 물질의 투여량(들)은 예를 들어 치료할 피험자 또는 샘플의 대상, 크기 및 조건에 따라, 추가로 적용가능할 경우 조성물이 투여되는 경로 및 의사가 원하는 물질의 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드에 대한 효과에 따라 변할 것이다. 작은 분자의 예시적인 투여량은 피험자 또는 샘플 무게의 kg당 mg 또는 ㎍의 양을 포함한다 (예, 약 1 ㎍/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 100 ㎍/kg 내지 약 5 mg/kg 또는 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 ㎍/kg). 단백질 또는 폴리펩티드의 예시적인 투여량은 피험자 또는 샘플 무게의 kg당 g, mg 또는 ㎍의 양을 포함한다 (예, 약 1 ㎍/kg 내지 약 5 g/kg, 약 100 ㎍/kg 내지 약 500 mg/kg 또는 약 1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg). 이들 물질 중 하나의 적절한 투여량은 조정하고자 하는 발현 또는 활성에 관한 물질의 효력에 의해 결정된다는 것이 또한 이해된다. 상기 적절한 투여량은 본원에 기재된 분석을 이용하여 결정할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 또는 활성을 조정하기 위해 하나 이상의 이들 물질이 동물 (예를 들어 인간)에게 투여되어야 하는 경우, 의사, 수의사 또는 연구자는 예를 들어 먼저 비교적 낮은 투여량을 처방하고, 적절한 반응이 얻어질 때까지 후속적으로 투여량을 증가시킬 수 있다. 또한, 임의의 특정 동물 피험자에 대한 구체적인 투여량 수준은 사용된 구체적 물질의 활성, 피험자의 연령, 체중, 전체 건강, 성별 및 섭생, 투여 시간, 투여 경로, 배설률, 임의의 약물 조합 및 조정해야 하는 발현 또는 활성의 정도를 포함하는 다양한 인자에 의해 결정될 것임이 이해된다.
본 발명의 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 투여에 사용되는 용액 또는 현탁액은 멸균 희석제, 예를 들어 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예를 들어 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅제, 예를 들어 에틸렌디아민-테트라아세트산; 완충제, 예를 들어 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 삼투성 조절제, 예를 들어 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함할 수 있다. pH는 산 또는 염기, 예를 들어 염산 또는 수산화나트륨으로 조정할 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 다용량 바이알 내에 봉입될 수 있다.
주사용으로 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 사용 제제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL (바스프 (BASF); 미국 뉴저지주 파르시파니) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사가 가능할 정도의 유체이어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건 하에 안정하여야 하고, 미생물, 예를 들어 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성할 수 있다. 많은 경우에, 조성물 내에 등장성 물질, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 일어날 수 있다.
멸균 주사가능 용액은 필요한 양의 활성 화합물 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 항체)을 적절한 용매 중에, 요구되는 경우 상기 나열된 성분 중 하나 또는 그의 조합물과 함께 포함시킨 후 멸균 여과함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질을 함유하는 멸균 비히클 중에 포함시킨 다음, 요구되는 상기 나열된 다른 성분들을 포함시켜 제조한다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균 여과된 그의 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조이다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐 내에 봉입될 수 있거나 정제로 압착될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 포함되고 정제, 트로키제 또는 캡슐제 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세척액으로 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조할 수 있고, 여기서 유체 담체 중의 화합물은 경구 적용하여 튀기거나 뱉거나 삼킨다.
제약학적으로 적합한 바인딩제 및(또는) 부형제 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 알약 (pill), 캡슐, 트로키제 등은 임의의 다음 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 바인더, 예를 들어 미세결정질 셀룰로스, 트라가간트검 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어 전분 또는 락토즈, 붕괴제, 예를 들어 알긴산, Primogel 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트 또는 Sterotes; 활택제, 예를 들어 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예를 들어 수크로즈 또는 사카린; 또는 향미제, 예를 들어 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지맛 향미제.
흡입 투여를 위해, 화합물은 적합한 분사제, 예를 들어, 이산화탄소와 같은 기체를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서 (dispenser), 또는 네뷸라이저 (nebulizer)로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과될 장벽에 적절한 침투제를 제형 내에 사용한다. 상기 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여를 위해, 세제, 담즙산염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 코 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성할 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화된다.
화합물은 또한 직장 전달을 위한 좌약 (예를 들어 통상적인 좌약 베이스, 예를 들어 코코아버터 및 다른 글리세라이드를 사용하여) 또는 정체 관장제 형태로 제조할 수 있다.
한 실시태양에서, 예를 들어, 임플란트 (implant) 및 마이크로캡슐화 (microencapsulated) 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형에서, 활성 화합물은 신체로부터의 신속한 제거에 대해 화합물을 보호할 담체를 사용하여 제조된다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 상기 제형의 제조 방법은 당업계의 숙련인에게 명백할 것이다. 물질은 또한 알자 코오퍼레이션 (Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스, 인크. (Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포좀 현탁액 (내부에 또는 그 위에 모노클로날 항체를 포함하는 리포좀 포함)을 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용할 수 있다. 이들은 당업계의 숙련인에게 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 미국 특허 4,522,811에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
경구 또는 비경구 조성물을 투여 용이함과 투여 균일성을 위해 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투약 단위 형태는 치료할 피험자를 위한 단일 투약에 맞추어진 물리적으로 구분된 단위를 나타내고; 각각의 단위는 목적하는 치료 효과를 갖도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 요구되는 제약학적 담체와 함께 함유한다. 본 발명의 투약량 단위 형태에 대한 상세 요건은 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 개인의 치료를 위해 상기 활성 화합물을 화합하는 분야에 고유한 제한에 의해 규정되고 그에 직접 의존한다.
항체에 있어서, 바람직한 투여량은 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg (체중) (일반적으로 10 mg/kg 내지 20 mg/kg)이다. 항체가 뇌에 작용하기 위한 것이면, 50 mg/kg 내지 100 mg/kg의 투약량이 보통 적절하다. 일반적으로, 부분 인간 항체 및 완전 인간 항체는 다른 항체보다 인체 내 반감기가 더 길다. 따라서, 보다 적은 투약량 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능하다. 항체를 안정화시키기 위해 및 흡수 및 조직 침투 (예를 들어, 난소 상피 내로)를 향상시키기 위해 변형, 예를 들어 지질화를 이용할 수 있다. 항체의 지질화 방법은 문헌 [Cruikshank et al. (1997) J Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193]에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 난소암의 예방 및(또는) 치료를 위한 백신 조성물을 제공한다. 본 발명은 표 1의 마커의 단백질 또는 표 1의 마커의 단백질의 조합물이 난소암에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 피험자에게 도입되는 난소암 백신 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 표 1의 마커에 의해 코딩되는 단백질 또는 단백질의 단편이 피험자 내의 형질감염된 세포에 의해 정상보다 더 높은 수준으로 생산되고 면역 반응을 유도하도록 표 1에 확인된 마커 또는 마커의 단편을 발현하는 유전자 발현 구조체가 피험자에게 도입되는 난소암 백신 조성물을 제공한다.
한 실시태양에서, 난소암 백신은 난소암의 예방을 위한 면역치료제로서 제공되고 사용된다. 다른 실시태양에서, 난소암 백신은 난소암의 치료를 위한 면역치료제로서 제공되고 사용된다.
예로서, 표 1의 마커의 단백질로 구성된 난소암 백신은 백신을 다양한 경로, 예를 들어, 피내, 피하 또는 근내로 투여함으로써 피험자에서 난소암의 예방 및(또는) 치료를 위해 사용할 수 있다. 또한, 난소암 백신은 백신의 활성 및 피험자의 반응을 부양하기 위해 보강제 및(또는) 면역조절제와 함께 투여할 수 있다. 한 실시태양에서, 지연 또는 간헐 방출에 적합한, 백신을 함유하는 장치 및(또는) 조성물이 상기 물질의 체내로의 비교적 느린 방출을 위해 체내에 이식되거나 국소적으로 적용될 수도 있다. 난소암 백신은 암을 제거하기에 보다 효과적일 반응을 생성하기 위해 생산되는 면역 반응의 유형을 변경시킬 수 있는 면역조절 화합물과 함께 도입될 수 있다.
다른 실시태양에서, 표 1의 마커의 발현 구조체로 구성된 난소암 백신은 주사에 의해 근육 내로 또는 마이크로분출제 (microprojectile) 상에 코팅하고 분출제를 고속으로 피부 내로 발사하기 위한 목적으로 디자인된 장치를 사용함으로써 도입할 수 있다. 이어서 피험자의 세포는 표 1의 마커의 단백질(들) 또는 단백질의 단편을 발현하고 면역 반응을 유도할 것이다. 또한, 난소암 백신은 면역 반응을 증가시키거나 암을 제거하는데 보다 효과적일 반응을 생성하기 위해 생산되는 면역 반응의 유형을 조절할 수 있는 면역조절 분자, 예를 들어 사이토카인을 위한 발현 구조체와 함께 도입할 수 있다.
본 발명의 마커 핵산 분자는 또한 벡터 내로 삽입되어 유전자 요법 벡터로서 사용할 수 있다. 유전자 요법 벡터는 예를 들어, 정맥내 주사; 국소 투여 (미국 특허 5,328,470)에 의해 또는 정위 주사 (예를 들어, Chen et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057 참고)에 의해 피험자에게 전달될 수 있다. 유전자 요법 벡터의 제약 제제는 허용되는 희석제 중에 유전자 요법 벡터를 포함할 수 있거나, 유전자 전달 비히클이 매립된 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다. 별법으로, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예를 들어 레트로바이러스 벡터로부터 무손상 상태로 생산될 수 있는 경우, 제약 제제는 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 제약 조성물은 용기, 팩 (pack) 또는 디스펜서 내에 투여 지시서와 함께 포함될 수 있다.
예측 의약
본 발명은 예측 의약의 분야에 속하며, 여기서 진단 분석, 예후 분석, 약물유전체학 및 임상 결과 모니터링은 그에 의해 개인을 예방적으로 치료하는 예후 (예측) 목적을 위해 사용된다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 난소암 발병 위험이 있는지 결정하기 위하여 하나 이상의 마커 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 결정하기 위한 진단 분석에 관한 것이다. 상기 분석은 그에 의해 개인을 암 발병 이전에 예방적으로 치료하기 위해 예후 또는 예측 목적을 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 임상 시험에서 본 발명의 마커의 발현 또는 활성에 대한 물질 (예를 들어, 난소암을 억제하거나 임의의 다른 질병을 치료 또는 예방하기 위해 투여되는 약물 또는 다른 화합물 {즉, 상기 치료가 가질 수 있는 임의의 난소 발암 효과를 이해하기 위해})의 영향을 모니터링하는 것에 관한 것이다. 이들 및 다른 물질은 아래 단락에서 추가로 상세히 설명한다.
A. 진단 분석
생물학적 샘플 내의 마커 단백질 또는 핵산의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 예시적인 방법은 시험 피험자로부터 생물학적 샘플 (예를 들어 난소-관련 체액)을 얻고, 생물학적 샘플을 폴리펩티드 또는 핵산 (예를 들어, mRNA, 게놈 DNA 또는 cDNA)을 검출할 수 있는 화합물 또는 물질와 접촉시키는 것을 포함한다. 따라서 본 발명의 검출 방법은 예를 들어, 생물학적 샘플 내의 mRNA, 단백질, cDNA 또는 게놈 DNA를 시험관내 및 생체내에서 검출하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, mRNA 검출을 위한 시험관내 기술은 노던 (Northern) 혼성화 및 계내 (in situ) 혼성화를 포함한다. 마커 단백질의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 결합 면역흡수 분석 (ELISA), 웨스턴 (Western) 블롯, 면역침전 및 면역형광을 포함한다. 게놈 DNA의 검출을 위한 시험관내 기술은 서던 (Southern) 혼성화를 포함한다. 또한, 마커 단백질의 검출을 위한 생체내 기술은 단백질 또는 그의 단편에 대해 작용하는 표지된 항체를 피험자 내로 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 피험자 내의 존재 및 위치를 표준 영상 기술에 의해 검출할 수 있는 방사성 마커로 표지할 수 있다.
상기 진단 및 예후 분석의 일반적 원칙은 적절한 조건 하에 및 마커 및 프로브가 상호작용하고 결합하여, 반응 혼합물 내에서 제거 및(또는) 검출할 수 있는 복합체를 형성하도록 허용하는 충분한 시간 동안 마커 및 프로브를 함유할 수 있는 샘플 또는 반응 혼합물을 제조하는 것을 포함한다. 이들 분석은 다양한 방식으로 수행할 수 있다.
예를 들어, 상기 분석을 수행하기 위한 한 방법은 마커 또는 프로브를 기질로도 불리는 고상 지지체 상에 앵커링하고, 반응 종료시에 고상에 앵커링된 표적 마커/프로브 복합체를 검출하는 것을 포함할 것이다. 상기 방법의 한 실시태양에서, 마커의 존재 및(또는) 농도에 대해 분석하고자 하는 피험자로부터의 샘플은 담체 또는 고상 지지체 상으로 앵커링될 수 있다. 다른 실시태양에서, 반대 상황이 가능하고, 여기서 프로브가 고상에 앵커링되고, 피험자로부터의 샘플은 비앵커링된 분석 성분으로서 반응하도록 허용될 수 있다.
분석 성분을 고상에 앵커링하는 많은 확립된 방법이 존재한다. 이들은 비오틴 및 스트렙타비딘의 컨쥬게이션을 통해 고정된 마커 또는 프로브 분자를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기 비오티닐화된 분석 성분은 당업계에 공지된 기술 (예를 들어, 비오티닐화 키트, 피어스 케미칼스), 미국 일리노이주 록포드)을 사용하여 비오틴-NHS (N-히드록시-숙신이미드)로부터 제조하여 스트렙타비딘-코팅된 96웰 플레이트 (피어스 케미칼)의 웰에 고정될 수 있다. 특정 실시태양에서, 고정된 분석 성분은 미리 제조하여 보관할 수 있다.
상기 분석을 위한 다른 적합한 담체 또는 고상 지지체는 마커 또는 프로브가 속하는 분자의 종류에 결합할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 잘 알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 나일론, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에틸렌, 덱스트란, 아밀라제, 천연 및 개질 셀룰로스, 폴리아미드, 반려암 및 자철석을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
상기 언급된 방법으로 분석을 수행하기 위해, 비고정 성분이 제2 성분이 앵커링되는 고상에 첨가된다. 반응이 완결된 후, 비복합체화된 성분은 형성된 임의의 복합체가 고상에 고정되어 유지되도록 하는 조건 하에 제거될 수 있다 (예를 들어, 세척에 의해). 고상에 앵커링된 마커/프로브 복합체의 검출은 본원에 개략된 많은 방법으로 달성할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 프로브는 비앵커링된 분석 성분인 경우 검출 및 분석의 판독의 목적을 위해 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 본원에 논의된 검출가능 표지로 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다.
예를 들어, 형광 에너지 전달 기술을 이용함으로써 양 성분 (마커 또는 프로브)의 추가의 샘플 조작 또는 표지 없이 마커/프로브 복합체 형성을 직접 검출하는 것도 또한 가능하다 (예를 들어, 라코빅츠 등의 미국 특허 5,631,169; 스타브리아노파울로스 등의 미국 특허 4,868,103 참조). 제1 '공여' 분자 상의 형광단 표지는 적절한 파장의 입사광으로 여기시, 그의 방출된 형광 에너지가 제2 '수여' 분자 상의 형광 표지에 의해 흡수될 것이고, 이는 다시 흡수된 에너지 때문에 형광을 낼 수 있도록 선택된다. 별법으로, '공여' 단백질 분자는 간단히 트립토판 잔기의 천연 형광 에너지를 이용할 수 있다. '수여' 분자 표지가 '공여' 분자 표지와 구별될 수 있도록 상이한 파장의 광을 방출하는 표지가 선택된다. 표지들 사이의 에너지 전달 효율은 분자를 분리하는 거리와 관련되므로, 분자 사이의 공간 관계를 평가할 수 있다. 분자 사이에 결합이 일어나는 상황에서, 분석에서 '수여' 분자 표지의 형광 방출은 최대가 될 것이다. FET 결합 사건은 당업계에 공지되어 있는 표준 형광 검출 수단을 통해 (예를 들어, 형광계를 사용하여) 편리하게 측정할 수 있다.
다른 실시태양에서, 마커를 인식하는 프로브의 능력의 결정은 실시간 생체분자 상호작용 (Biomolecular Interaction 분석 (BIA) (예를 들어, Sjolander, S. and Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 및 Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 참고)과 같은 기술을 이용함으로써 양 분석 성분 (프로브 또는 마커)을 표지하지 않으면서 달성할 수 있다. 본원에서 사용되는 "BIA" 또는 "표면 플라즈몬 공명"은 임의의 상호작용물을 표지하지 않으면서 생물특이적 상호작용을 실시간으로 연구하기 위한 기술이다 (예를 들어, BIAcore). 결합 표면에서 질량 변화 (결합 사건의 표시)는 표면에 가까운 빛의 굴절률을 변경시켜 (표면 플라즈몬 공명 (SPR)의 광학 현상), 생물학적 분자 사이의 실시간 반응의 표시로서 사용할 수 있는 검출가능 시그날을 생성시킨다.
별법으로, 다른 실시태양에서, 유사 진단 및 예후 분석은 액상 내의 용질로서 마커 및 프로브를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 분석에서, 복합체화된 마커 및 프로브는 비제한적으로 분별 원심분리, 크로마토그래피, 전기영동 및 면역침전을 포함하는 임의의 많은 표준 기술에 의해 비복합체화된 성분으로부터 분리된다. 분별 원심분리에서, 마커/프로브 복합체는 그들의 상이한 크기 및 밀도를 기준으로 복합체의 상이한 침강 평형으로 인해 일련의 원심분리 단계를 통해 비복합체화된 분석 성분으로부터 분리될 수 있다 (예를 들어, Rivas, G., and Minton, A. P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7 참고). 복합체화된 분자를 비복합체화된 것으로부터 분리하기 위해 표준 크로마토그래피 기술을 또한 이용할 수 있다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피는 컬럼 포맷에서 적절한 겔 여과 수지를 이용하여 크기를 기준으로 분자를 분리하며, 예를 들어, 비교적 더 큰 복합체는 비교적 더 작은 비복합체화된 성분으로부터 분리될 수 있다. 유사하게, 비복합체화된 성분에 비해 마커/프로브 복합체의 비교적 상이한 전하 특성은 예를 들어, 이온교환 크로마토그래피 수지를 이용하여 복합체를 비복합체화된 성분으로부터 구별하기 위해 활용될 수 있다. 상기 수지 및 크로마토그래피 기술은 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다 (예를 들어 Heegaard, N. H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8; Hage, D.S., and Tweed, S.A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(1-2):499-525 참조). 복합체화된 분석 성분을 비결합 성분으로부터 분리하기 위해 겔 전기영동을 또한 이용할 수 있다 (예를 들어 Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999 참조). 상기 기술에서, 단백질 또는 핵산 복합체는 예를 들어 크기 또는 전하를 기준으로 분리된다. 전기영동 과정 동안 결합 상호작용을 유지하기 위해, 환원제의 부재 하에 비변성 겔 매트릭스 물질 및 조건이 일반적으로 바람직하다. 특정 분석 및 그의 성분에 대한 적절한 조건은 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있을 것이다.
특정 실시태양에서, 마커 mRNA의 수준은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생물학적 샘플 내에서 계내 및 시험관내 포맷으로 모두 결정될 수 있다. 용어 "생물학적 샘플"은 피험자로부터 단리된 조직, 세포, 생물학적 유체 및 그의 단리물, 및 피험자 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하도록 의도된다. 많은 발현 검출 방법은 단리된 RNA를 사용한다. 시험관내 방법에 있어서, 난소 세포로부터 RNA를 정제하기 위해, mRNA의 단리에 대항하여 선택하지 않는 임의의 RNA 단리 기술을 이용할 수 있다 (예를 들어, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999 참조). 추가로, 많은 수의 조직 샘플은 예를 들어, 콤친스키 (Chomczynski, 1989, 미국 특허 4,843,155)의 단일 단계 RNA 단리 공정과 같은 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용하여 쉽게 처리할 수 있다.
단리된 mRNA는 비제한적으로 서던 또는 노던 분석, 중합효소 연쇄 반응 분석 및 프로브 어레이를 포함하는 혼성화 또는 증폭 분석에서 사용할 수 있다. mRNA 수준의 검출을 위한 한 바람직한 진단 방법은 검출되는 유전자에 의해 코딩되는 mRNA에 혼성화할 수 있는 핵산 분자 (프로브)와 단리된 mRNA를 접촉시키는 것을 포함한다. 핵산 프로브는 예를 들어, 전장 cDNA 또는 그의 일부, 예를 들어 엄격한 조건 하에 본 발명의 마커를 코딩하는 mRNA 또는 게놈 DNA에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 진단 분석에 사용하기 위한 다른 적합한 프로브는 본원에 기재되어 있다. mRNA의 프로브와의 혼성화는 해당 마커가 발현되는 것을 표시한다.
한 포맷에서, mRNA는 예를 들어, 단리된 mRNA를 아가로스 겔 상에서 진행시키고 겔로부터 mRNA를 멤브레인, 예를 들어 니트로셀룰로스로 전달함으로써 고체 표면 상에 고정되고 프로브와 접촉된다. 대체 포맷에서, 프로브(들)이 고체 표면 상에 고정되고, mRNA는 예를 들어, Affymetrix 유전자칩 어레이에서 프로브(들)과 접촉된다. 당업계의 숙련인은 공지의 mRNA 검출 방법을 본 발명의 마커에 의해 코딩되는 mRNA의 수준을 검출하는데 사용하기 위해 쉽게 변경할 수 있다.
샘플 내의 mRNA 마커의 수준을 결정하기 위한 대안적 방법은 예를 들어 rtPCR (뮬리스 (Mullis), 1987, 미국 특허 4,683,202에 설명된 실험적 실시태양), 리가제 연쇄 반응 (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), 자기 부양 서열 복제 (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템 (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), 롤링 (rolling) 원형 복제 (리자디 (Lizardi) 등, 미국 특허 5,854,033) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 의한 핵산 증폭 공정 이후, 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용하는 증폭된 분자의 검출을 포함한다. 이들 검출 계획은 핵산 분자가 매우 적은 수로 존재할 경우 핵산 분자의 검출을 위해 특히 유용하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 증폭 프라이머는 유전자의 5' 또는 3' 영역 (각각 플러스 및 마이너스 스트랜드 또는 그 반대)에 어닐링하고 그 사이에 짧은 영역을 포함할 수 있는 한쌍의 핵산 분자로서 정의된다. 일반적으로, 증폭 프라이머는 약 10 내지 30 뉴클레오티드 길이이고 인접 영역은 약 50 내지 200 뉴클레오티드 길이이다. 적절한 조건 하에 적절한 시약을 사용하여, 상기 프라이머는 프라이머가 인접하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 증폭을 허용한다.
계내 방법에 있어서, mRNA는 검출에 앞서 난소 세포로부터 단리될 필요가 없다. 상기 방법에서, 세포 또는 조직 샘플은 공지의 조직학적 방법을 이용하여 제조/처리된다. 이어서 샘플은 지지체, 일반적으로 유리 슬라이드 상에 고정된 후, 마커를 코딩하는 mRNA에 혼성화할 수 있는 프로브와 접촉된다.
마커의 절대적 발현 수준을 기초로 한 결정에 대한 대안으로서, 결정은 마커의 표준화된 발현 수준에 기초할 수 있다. 발현 수준은 그의 발현을 마커가 아닌 유전자, 예를 들어, 구성적으로 발현되는 하우스키핑 (housekeeping) 유전자의 발현과 비교하여 마커의 절대적 발현 수준을 보정함으로써 표준화된다. 표준화를 위해 적합한 유전자는 하우스키핑 유전자, 예를 들어 액틴 유전자 또는 상피 세포-특이적 유전자를 포함한다. 상기 표준화는 하나의 샘플, 예를 들어, 환자 샘플 내의 발현 수준을 다른 샘플, 예를 들어, 비-난소암 샘플과 또는 상이한 공급원으로부터의 샘플들의 비교를 가능하게 한다.
별법으로, 발현 수준은 상대적 발현 수준으로 제공될 수 있다. 마커의 상대적 발현 수준을 결정하기 위해, 마커의 발현 수준은 해당 샘플에 대한 발현 수준의 결정에 앞서, 10개 이상의 정상 대 암 세포 단리물의 샘플, 바람직하게는 50개 이상 샘플에 대해 결정된다. 다수의 샘플에서 분석된 각각의 유전자의 평균 발현 수준이 결정되고, 이는 마커에 대한 기준선 발현 수준으로 사용된다. 이어서 시험 샘플에 대해 결정된 마커의 발현 수준 (절대적 발현 수준)을 그 마커에 대해 얻은 평균 발현값으로 나눈다. 이는 상대적 발현 수준을 제공한다.
바람직하게는, 기준선 결정에 사용된 샘플은 난소암으로부터 또는 난소 조직의 비-난소암 세포로부터 얻은 것일 것이다. 세포 공급원의 선택은 상대적 발현 수준의 사용에 따른다. 평균 발현 스코어로서 정상 조직에서 발견된 발현을 사용하는 것은 분석된 마커가 난소 특이적인지 (정상 세포에 대비하여) 확인하는 것을 돕는다. 또한, 보다 많은 데이타가 축적됨에 따라, 평균 발현값은 수정될 수 있어서, 축적된 데이타를 기준으로 개선된 상대적 발현값을 제공한다. 난소 세포로부터의 발현 데이타는 난소암 상태의 중증도를 등급매기는 수단을 제공한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 마커 단백질이 검출된다. 본 발명의 마커 단백질을 검출하기 위한 바람직한 물질은 상기 단백질 또는 그의 단편에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 검출가능 표지를 갖는 항체이다. 항체는 폴리클로날 또는 보다 바람직하게는 모노클로날일 수 있다. 무손상 항체 또는 그의 단편 또는 유도체 (예를 들어 Fab 또는 F(ab')2)가 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체에 관하여 용어 "표지된"은 검출가능 물질을 프로브 또는 항체에 결합시키는 (즉, 물리적으로 연결시키는) 프로브 또는 항체의 직접 표지 및 직접 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접 표지를 포함하도록 의도된다. 간접 표지의 예는 형광 표지된 2차 항체를 사용하는 1차 항체의 검출 및 형광 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 검출될 수 있도록 비오틴을 사용하는 DNA 프로브의 말단-표지를 포함한다.
세포로부터의 단백질은 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 단리될 수 있다. 사용된 단백질 단리 방법은 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)]에 기재된 것일 수 있다.
샘플이 주어진 항체에 결합하는 단백질을 함유하는지 결정하기 위해 다양한 포맷이 사용될 수 있다. 상기 포맷의 예는 효소 면역 분석 (EIA), 방사성 면역 분석 (RIA), 웨스턴 블롯 분석 및 효소 결합 면역흡수 분석 (ELISA)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 당업계의 숙련인은 난소 세포가 본 발명의 마커를 발현하는지를 결정할 때 사용하기 위한 단백질/항체 검출 방법을 용이하게 채용할 수 있다.
한 포맷에서, 항체 또는 항체 단편 또는 유도체는 발현된 단백질을 검출하기 위해 웨스턴 블롯 또는 면역형광 기술과 같은 방법에서 사용할 수 있다. 상기 용도에서, 항체 또는 단백질을 고상 지지체 상에 고정시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 적합한 고상 지지체 또는 담체는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 임의의 지지체를 포함한다. 잘 알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 개질 셀룰로스, 폴리아미드, 반려암 및 자철석을 포함한다.
당업계의 숙련인은 항체 또는 항원에 결합하기 위한 다른 적합한 많은 담체를 알 것이고, 상기 지지체를 본 발명에 사용하기 위해 변경할 수 있을 것이다. 예를 들어, 난소 세포로부터 단리된 단백질을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 진행시키고 고상 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스 상으로 고정시킬 수 있다. 이어서 지지체를 적합한 완충제로 세척한 후 검출가능하게 표지된 항체로 처리할 수 있다. 이어서 비결합 항체를 제거하기 위해 고상 지지체를 완충제로 2회 세척할 수 있다. 이어서 고상 지지체 상의 결합 표지의 양은 통상적인 수단에 의해 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 생물학적 샘플 (예를 들어 난소-관련 체액, 예를 들어 뇨 샘플) 내의 마커 단백질 또는 핵산의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 상기 키트는 피험자가 난소암에 걸렸는지 또는 난소암 발병 위험이 증가하였는지 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 키트는 생물학적 샘플 내의 마커 단백질 또는 핵산을 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 물질 및 샘플 내의 단백질 또는 mRNA의 양을 결정하기 위한 수단 (예를 들어, 단백질 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 mRNA에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브)를 포함할 수 있다. 키트는 또한 키트를 사용하여 얻어지는 결과를 해석하기 위한 지시물을 포함할 수 있다.
항체 기반 키트에 대해, 키트는 예를 들어 (1) 마커 단백질에 결합하는 제1 항체 (예를 들어, 고상 지지체에 부착된); 및 임의로 (2) 단백질 또는 제1 항체에 결합하고 검출가능 표지에 컨쥬게이팅된 제2의 상이한 항체를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 기반 키트에 대해, 키트는 예를 들어 (1) 마커 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 검출가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 (2) 마커 핵산 분자를 증폭하기 위해 유용한 한쌍의 프라이머를 포함할 수 있다. 키트는 또한 예를 들어 완충제, 방부제 또는 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 추가로 검출가능 표지를 검출하기 위해 필요한 성분 (예를 들어, 효소 또는 기질)을 포함할 수 있다. 키트는 또한 분석되고 시험 샘플에 비교될 수 있는 대조 샘플 또는 일련의 대조 샘플을 함유할 수 있다. 키트의 각각의 성분은 개별 용기 내에 담길 수 있고, 모든 다양한 용기는 키트를 사용하여 수행된 분석 결과를 해석하기 위한 지시물과 함께 단일 패키지 내에 담길 수 있다.
B. 약물유전체학
환자에서 난소암을 (예방 또는 치료적으로) 치료하기 위해 본 발명의 마커의 발현에 대해 자극 또는 억제 효과를 갖는 물질 또는 조정자를 개인에게 투여할 수 있다. 상기 치료와 함께, 개인의 약물유전체학 (즉, 개인의 유전형과 외래 화합물 또는 약물에 대한 그 개인의 반응 사이의 관계의 연구)을 고려할 수 있다. 치료제의 대사 차이는 약리학적 활성 약물의 투여량 및 혈중 농도 사이의 관계를 변경시킴으로써 심각한 독성 또는 치료 실패를 야기할 수 있다. 따라서, 개인의 약물유전체학은 개인의 유전형을 기준으로 예방 또는 치료적 치료를 위한 유효제 (예를 들어, 약물)의 선택을 허용한다. 상기 약물유전체학은 적절한 투약량 및 치료 방법을 결정하기 위해 추가로 사용될 수 있다. 따라서, 개인 내의 본 발명의 마커의 발현 수준은 그에 의해 개인의 치료 또는 예방적 치료를 위한 적절한 물질(들)을 선택하기 위해 결정될 수 있다.
약물유전체학은 이환된 개인에서 변경된 약물 배치 및 비정상적 작용으로 인한 약물에 대한 반응에서 임상적으로 유의한 변동을 다룬다 (예를 들어 Linder (1997) Clin. Chem. 43(2):254-266 참조). 일반적으로, 2가지 종류의 약물유전체학적 상태가 분류될 수 있다. 약물이 신체에 대해 작용하는 방식을 변경시키는 단일 인자로서 유전되는 유전적 상태는 "변경된 약물 작용"으로 불린다. 신체가 약물에 대해 작용하는 방식을 변경시키는 단일 인자로서 유전되는 유전적 상태는 "변경된 약물 대사"로 불린다. 이들 약물유전체학적 상태는 희귀 결함 또는 다형성으로서 발생할 수 있다. 예를 들어, 글루코즈-6-포스페이트 데히드로게나제 (G6PD) 결핍은 주요 임상 증상이 산화제 약물 (항말라리아제, 술폰아미드, 진통제, 니트로푸란)의 섭취 및 파바 콩 (fava bean)의 소비 후 용혈인 일반적으로 유전되는 효소병증이다.
예시적인 실시태양으로서, 약물 대사 효소의 활성은 약물 작용의 강도 및 지속 시간 모두의 주요 결정자이다. 약물 대사 효소의 유전적 다형성의 발견 (예를 들어, N-아세틸트랜스퍼라제 2 (NAT 2) 및 사이토크롬 P450 효소 CYP2D6 및 CYP2C19)은 일부 환자가 약물의 표준 및 안전 투여량의 섭취 후 예상 약물 효과를 얻지 않거나 악화된 약물 반응 및 심각한 독성을 보이는 이유에 대한 설명을 제공하였다. 이들 다형성은 인구 내에서 2가지 표현형, 즉 과도 대사군 (EM) 및 불량 대사군 (PM)으로 표현된다. PM의 유병율은 다양한 집단 사이에 상이하다. 예를 들어, CYP2D6을 코딩하는 유전자는 고도 다형성이고, PM에서 몇몇 돌연변이가 확인되었고, 이는 모두 기능적 CYP2D6의 부재를 일으킨다. CYP2D6 및 CYP2C19의 불량 대사군은 표준 투여량을 투여받을 때 악화된 약물 반응 및 부작용을 매우 빈번하게 경험한다. 대사물질이 활성 치료 잔기이면, 그의 CYP2D6-형성된 대사물질 모르핀에 의해 매개된 코데인의 진통 효과에 대해 증명된 바와 같이 PM은 치료 반응을 보이지 않을 것이다. 다른 극단적인 예는 표준 투여량에 반응하지 않는 소위 초고속 대사군이다. 최근에, 초고속 대사의 분자적 기초는 CYP2D6 유전자 증폭으로 인한 것임이 확인되었다.
따라서, 개인 샘플에서 본 발명의 마커의 발현 수준을 결정하여 개인의 치료 또는 예방적 치료를 위한 적절한 물질(들)을 선택할 수 있다. 또한, 약물유전학 연구를 사용하여 개인의 약물 반응 표현형의 확인을 위해 약물 대사 효소를 코딩하는 다형성 대립 유전자의 유전자형을 적용할 수 있다. 이를 통해, 투여량 또는 약물 선택에 적용할 때 부반응 또는 치료 실패를 방지할 수 있고, 따라서 본 발명의 마커의 발현의 조정자로 피험자를 치료할 때 치료 또는 예방 효능을 개선시킬 수 있다.
C. 임상 시험의 모니터링
환자 샘플에서 본 발명의 마커의 발현 수준에 대한 물질 (예를 들어, 약물 화합물)의 영향의 모니터링은 기본적 약물 스크리닝 및 임상 시험 모두에 적용할 수 있다. 예를 들어, 마커 발현에 영향을 주는 물질의 효과는 난소암 치료를 받는 피험자의 임상 시험에서 모니터링할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 (i) 물질 투여 전에 피험자로부터 투여전 샘플을 획득하고, (ii) 투여전 샘플 내의 본 발명의 하나 이상의 선택된 마커의 발현 수준을 검출하고, (iii) 피험자로부터 하나 이상의 투여후 샘플을 획득하고, (iv) 투여후 샘플 내의 마커(들)의 발현 수준을 검출하고, (v) 투여전 샘플 내의 마커(들)의 발현 수준을 투여후 샘플 또는 샘플들 내의 마커(들)의 발현 수준을 비교하고, (vi) 이에 따라 물질의 피험자에 대한 투여를 변경하는 단계를 포함하는, 물질 (예를 들어, 효능제, 길항제, 펩티드 모방체, 단백질, 펩티드, 핵산, 작은 분자, 또는 다른 약물 후보)을 사용한 피험자의 치료 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 치료 과정 동안 증가된 마커 유전자(들)의 발현은 무효한 투약량을 표시할 수 있고, 투약량을 증가시키는 것이 바람직하다. 반대로, 감소된 마커 유전자(들)의 발현은 효과적인 치료를 표시할 수 있고 투약량을 변화시킬 필요가 없다.
D. 전자 장치 판독가능 매체 및 어레이 (array)
본 발명의 마커를 포함하는 전자 장치 판독가능 매체를 또한 제공한다. 본원에서 사용되는 "전자 장치 판독가능 매체"는 전자 장치에 의해 직접 판독되고 액세스될 수 있는 데이타 또는 정보를 저장하거나, 보유하거나 포함하는 임의의 적합한 매체를 나타낸다. 상기 매체는 비제한적으로 자기 저장 매체, 예를 들어 플로피 디스크, 하드 디스크 저장 매체 및 자기 테이프; 광학 저장 매체, 예를 들어 콤팩트 디스크; 전자 저장 매체, 예를 들어 RAM, ROM, EPROM, EEPROM 등; 일반적 하드 디스크 및 이들 카테고리의 하이브리드, 예를 들어 자기/광학 저장 매체를 포함할 수 있다. 매체는 본 발명의 마커를 그 위에 기록하도록 개조되거나 설정된다.
본원에서 사용되는 용어 "전자 장치"는 데이타 또는 정보를 저장하기 위해 설정되거나 개조된 임의의 적합한 컴퓨팅 또는 프로세싱 장치 또는 다른 장치를 포함하도록 의도된다. 본 발명에 사용하기 적합한 전자 장치의 예는 독립형 (stand-alone) 컴퓨팅 장치, 근거리 통신망 (LAN), 광역 통신망 (WAN) 인터넷, 인트라넷 (Intranet) 및 엑스트라넷 (Extranet)을 포함하는 네트워크, 전자 제품, 예를 들어 개인용 디지탈 단말기 (PDA), 휴대폰, 호출기 등 및 근거리 및 분산 처리 시스템을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "기록된"은 전자 장치 판독 매체 상에 정보를 저장 또는 엔코딩하기 위한 프로세스를 의미한다. 당업계의 숙련인은 본 발명의 마커를 포함하는 제조품을 생성시키기 위해서 공지의 매체 상에 정보를 기록하기 위해 현재 공지된 임의의 방법을 쉽게 채용할 수 있다.
다양한 소프트웨어 프로그램 및 포맷을 사용하여 본 발명의 마커 정보를 전자 장치 판독 매체에 저장할 수 있다. 예를 들어, 마커 핵산 서열은 워드 처리 텍스트 파일로 제시되어 상업적으로 이용가능한 소프트웨어, 예를 들어 WordPerfect 및 MicroSoft Word로 포맷되거나 또는 ASCII 파일 형태로 제시되어 데이타베이스 애플리케이션, 예를 들어 DB2, Sybase, Oracle 등과 다른 형태로 저장될 수 있다. 임의의 수의 데이타 프로세서 구성 포맷 (예를 들어, 텍스트 파일 또는 데이타베이스)을 사용하여 본 발명의 마커가 그 위에 기록된 매체를 얻거나 생성시킬 수 있다.
본 발명의 마커를 판독가능한 형태로 제공함으로써, 다양한 목적을 위해 마커 서열 정보를 일상적으로 접근할 수 있다. 예를 들어, 당업계의 숙련인은 표적 서열 또는 표적 구조 모티프를 데이타 저장 수단 내에 저장된 서열 정보와 비교하기 위해 본 발명의 판독가능한 형태의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열를 사용할 수 있다. 검색 수단을 이용하여 특정 표적 서열 또는 표적 모티프에 일치하는 본 발명의 서열의 단편 또는 영역을 확인한다.
따라서 본 발명은 피험자가 난소암에 걸렸거나 난소암에 대한 예비소인을 가졌는지 결정하는 방법을 수행하기 위한 지시를 갖는 매체를 제공하며, 여기서 상기 방법은 마커의 존재 또는 부재를 결정하고, 마커의 존재 또는 부재를 기준으로, 피험자가 난소암에 걸렸거나 난소암에 대한 예비소인을 가졌는지 결정하고(하거나) 난소암 또는 난소암전 상태에 대한 특정 치료를 추천하는 단계를 포함한다.
본 발명은 전자 시스템 및(또는) 네트워크에, 피험자가 마커와 관련된 난소암에 걸렸거나 난소암에 대한 예비소인을 가졌는지 결정하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 마커의 존재 또는 부재를 결정하고, 마커의 존재 또는 부재를 기준으로, 피험자가 난소암에 걸렸거나 난소암에 대한 소인을 가졌는지 결정하고(하거나) 난소암 또는 난소암전 상태에 대한 특정 치료를 추천하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 피험자와 연관된 표현형 정보를 수용하고(하거나) 네트워크로부터 피험자와 연관된 표현형 정보를 획득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 네트워크에, 피험자가 마커와 관련된 난소암에 걸렸거나 난소암에 대한 소인을 가졌는지 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 마커와 연관된 정보를 수용하고, 피험자와 연관된 표현형 정보를 수용하고, 마커 및(또는) 난소암에 대응하는 네트워크로부터 정보를 획득하고, 하나 이상의 표현형 정보, 마커 및 획득된 정보를 기준으로, 피험자가 난소암에 걸렸거나 난소암에 대한 소인을 가졌는지 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 난소암 또는 난소암전 상태에 대한 특정 치료를 추천하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 피험자가 난소암에 걸렸거나 난소암에 대한 소인을 가졌는지 결정하기 위한 비즈니스 (business) 방법을 제공하고, 상기 방법은 마커와 연관된 정보를 수용하고, 피험자와 연관된 표현형 정보를 수용하고, 마커 및(또는) 난소암에 대응하는 네트워크로부터 정보를 획득하고, 하나 이상의 표현형 정보, 마커 및 획득된 정보를 기준으로, 피험자가 난소암에 걸렸거나 난소암에 대한 소인을 가졌는지 결정하는 단계를 포함한다. 방법은 난소암 또는 난소암전 상태에 대한 특정 치료를 추천하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 마커를 포함하는 어레이를 포함한다. 어레이는 어레이 내의 하나 이상의 유전자의 발현을 분석하기 위해 사용할 수 있다. 한 실시태양에서, 어레이는 어레이 내의 유전자의 조직 특이성을 규명하기 위해 조직에서의 유전자 발현을 분석하기 위해 사용할 수 있다. 본 방식에서, 약 7600 이하의 유전자가 발현에 대해 동시에 분석될 수 있다. 이에 의해, 하나 이상의 조직에서 특이적으로 발현된 일련의 유전자를 보여주는 프로파일의 개발이 가능하다.
상기 정성적 결정 이외에, 본 발명은 유전자 발현의 정량을 허용한다. 따라서, 조직 특이성 뿐만 아니라 조직에서 일련의 유전자의 발현 수준도 또한 규명가능하다. 따라서, 유전자는 그들의 조직 발현 자체 및 그 조직 내 발현 수준을 기초로 분류될 수 있다. 이는 예를 들어 조직들 사이에 또는 조직 중에서 유전자 발현의 관계를 규명하는데 유용하다. 따라서, 하나의 조직이 교란될 수 있고, 제2 조직 내의 유전자 발현에 대한 영향을 결정할 수 있다. 이러한 측면에서, 생물학적 자극에 대한 반응에서 한 세포 종류의 다른 세포 종류에 대한 효과를 결정할 수 있다. 상기 결정은 예를 들어 유전자 발현의 수준에서 세포-세포 상호작용의 효과를 알기 위해 유용하다. 물질이 한 세포 종류를 치료하기 위해 투여되지만 다른 세포 종류에 바람직하지 않은 효과를 가질 경우, 본 발명은 바람직하지 않은 효과의 분자적 기준을 결정하기 위한 분석을 제공하고, 따라서 중화제를 동시투여하거나 바람직하지 않은 효과를 처리할 기회를 제공한다. 유사하게, 단일 세포 종류 내의 경우에도, 바람직하지 않은 생물학적 효과를 분자 수준에서 결정할 수 있다. 따라서, 표적 유전자 이외의 다른 유전자의 발현에 대한 물질의 효과를 확인하여 중화시킬 수 있다.
다른 실시태양에서, 어레이를 사용하여 어레이 내의 하나 이상의 유전자의 발현의 시간 추이를 모니터링할 수 있다. 이것은 본원에서 개시되는 바와 같은 상이한 생물학적 측면, 예를 들어 난소암 발생, 난소암의 진행 및 과정, 난소암에 연관된 상기 세포 변형에서 실행할 수 있다.
또한, 어레이는 동일한 세포 또는 상이한 세포에서 다른 유전자의 발현에 대한 한 유전자의 발현 효과를 확인하기에 유용하다. 이것은 예를 들어 최종 또는 하류의 표적을 조절할 수 없을 경우 치료적 개입을 위한 대안적 분자 표적의 선별을 제공한다.
또한, 어레이는 정상 및 비정상 세포에서 하나 이상의 유전자의 상이한 발현 패턴 확인에 유용하다. 이것은 진단 또는 치료적 개입을 위한 분자 표적으로서 기능할 수 있는 일련의 유전자를 제공한다.
E. 대용 (surrogate) 마커
본 발명의 마커는 하나 이상의 질환 또는 질병 상태 또는 질병, 특히 난소암에 이르는 상태에 대한 대용 마커로서 역할을 할 수 있다. 본원에서 사용되는 "대용 마커"는 질환 또는 질병의 부재 또는 존재, 또는 질환 또는 질병의 진행 (예를 들어, 종양의 존재 또는 부재)와 상호관련되는 객관적인 생화학적 마커이다. 상기 마커의 존재 또는 양은 질환에 무관하다. 따라서, 이들 마커는 치료의 특정 과정이 질병 상태 또는 질환을 감소시키는데 효과적인지 표시하는 역할을 할 수 있다. 대용 마커는 질병 상태 또는 질환의 존재 또는 정도가 표준 방법을 통해 평가하기 어려울 때 (예를 들어, 초기 단계 종양) 또는 잠재적으로 위험한 임상 종료점에 도달하기 전에 질병 진행의 평가가 요망될 때 특히 유용하다 (예를 들어, 심근 경색 또는 완전 발병된 AIDS의 바람직하지 않은 임상 결과 전에 심혈관 질병의 평가는 대용 마커로서 콜레스테롤 수준을 사용하여 이루어질 수 있고, HIV 감염의 분석은 대용 마커로서 HIV RNA 수준을 사용하여 이루어질 수 있다). 당업계에서 대용 마커의 사용예는 문헌 [Koomen et al. (2000) J. Mass. Spectrom. 35:258-264; 및 James (1994) AIDS Treatment News Archive 2090]에 기재되어 있다.
본 발명의 마커는 약역학 마커로서 또한 유용하다. 본원에서 사용되는 "약역학 마커"는 약물 효과와 특이적으로 상호관련되는 객관적인 생화학적 마커이다. 약역학 마커의 존재 또는 양은 약물이 투여되는 질환 상태 또는 질병에 관련되지 않고; 따라서, 마커의 존재 또는 양은 피험자 내의 약물의 존재 또는 활성의 표시이다. 예를 들어, 약역학 마커는 마커가 약물 수준과 관련하여 조직에서 발현 또는 전사되거나 또는 발현 또는 전사되지 않는다는 점에서 생물학적 조직 내 약물 농도의 표시가 될 수 있다. 이러한 방식에서, 약물의 분배 또는 흡수는 약역학 마커에 의해 모니터링할 수 있다. 유사하게, 약역학 마커의 존재 또는 양은 마커의 존재 또는 양이 생체 내에서 약물의 상대적 붕괴 비율을 나타내도록 약물의 대사 산물의 존재 또는 양에 관련될 수 있다. 약역학 마커는 특히 약물이 낮은 투여량으로 투여될 때 약물 효과의 검출 감도를 증가시킬 때 특히 유용하다. 소량의 약물도 마커 전사 또는 발현의 다수회 활성화에 충분할 수 있기 때문에, 증폭된 마커는 약물 자체보다 용이하게 검출가능한 양으로 존재할 수 있다. 또한, 마커는 마커 자체의 특성에 의해 용이하게 검출할 수 있고, 예를 들어 본원에 기재된 방법을 사용하여, 항체는 단백질 마커를 위한 면역 기반 검출 시스템에 사용될 수 있거나 또는 마커-특이적 방사선 표지된 프로브가 mRNA 마커 검출에 사용될 수 있다. 또한, 약역학 마커의 사용은 가능한 직접 관찰 범위를 넘어서는 약물 처리에 의한 위험에 대한 메카니즘 기반 예측을 제공할 수 있다. 당업계에서 약역학 마커의 사용예는 문헌 [마쓰다 (Matsuda) 등의 미국 특허 6,033,862; Hattis et al. (1991) Env. Health Perspect. 90:229-238; Schentag (1999) Am.J Health-Syst. Pharm. 56 Suppl. 3:S21-S24; 및 Nicolau (1999) Am, J. Health-Syst. Pharm. 56 Suppl. 3:S16-S20]에 기재되어 있다.
실시예 1: cDNA 및 조직 마이크로어레이에 의한 난소암 마커의 확인
재료 및 방법
샘플 수집 및 RNA 제조
난소 조직을 수집하고 액체 질소 중에서 급속 동결시켰다. RNA 추출을 수행하기 전에 조직의 조직학 및 세포 조성을 확인하였다. 전체 RNA는 Trizol 시약 (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies))을 사용하여 동결 조직으로부터 추출한 후, RNA 프로브 표지 효능을 증가시키기 위해 콰이간 (Qiagen) RNeasy 키트 (콰이간 (Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아))를 사용하여 2차 세정 단계를 수행하였다. 아가로스 겔 상의 전기영동 후 RNA의 에티듐 염색으로부터 계산된, 적어도 1.0의 28S/18S 리보좀 RNA 비율을 갖는 RNA만을 본 연구에서 사용하였다.
cDNA 마이크로어레이 혼성화
리서치 제네틱스 (Research Genetics, 미국 알리바마주 헌스트빌))의 30,732 Unigene 클론을 함유하는 cDNA 마이크로어레이를 나일론 필터 상에 생성시켰다. 총 4-6 ㎍의 전체 RNA를 템플레이트로서 사용하여, 33P-dCTP, 올리고dT-30 프라이머 및 Superscript II 역전사효소 (라이프 테크놀로지)를 사용하는 역전사에 의해 방사성 표지된 cDNA를 생성시켰다. 33P-표지된 제1 가닥 cDNA는 비-특이적 혼성화를 감소시키기 위해 cot-1 DNA 및 폴리-dA 40-60 (파마시아, 미국 뉴저지주 피팩)를 사용하여 예비어닐링시켰다. 각각의 필터를 65℃에서 16시간 동안 7% 소듐 도데실 술페이트 (SDS), 250mM Na3P04 (pH 7.2), 1 mM EDTA, 0.5% 카제인-해머스테인 및 O.1 mg/ml의 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 완충액 중에서 약 6x106 카운트의 표지된 프로브로 혼성화시켰다. 필터를 4% 및 1% SDS 세척 완충액 (20mM Na3P04 (pH 7.2), 1 mM EDTA 및 4% 또는 1% SDS)로 세척한 후, 후지 포스포이미저 (Fuji Phosphoimager) 스크린에 노출시키고 후지 (Fuji) 스캐너 BAS 2500을 사용하여 스캐닝하였다. 스폿 (spot)은 밀레니엄 파마슈티컬스, 인크. (Millennium Pharmaceuticals, Inc.)에서 개발된 자동화 어레이 분석 프로그램 Grid Guru v1.0을 사용하여 정량하였다.
마커 스코어링 알고리즘 및 데이타 분석
혼성화 효능의 차이를 교정하기 위해, 각각의 마이크로어레이 필터로부터의 디지탈화된 데이타를 필터 상의 모든 스폿의 중간 강도에 의해 정규화하였다. 어레이-기반 및 유전자 기반 계층 클러스터링을 모두 수행하고, 스탠포드 (Stanford)의 Gene Cluster and Tree View 소프트웨어를 사용하여 가시화하였다. 각각의 유전자에 대한 마커 스코어를 계산하여 상이하게 발현된 유전자의 등급을 평가하였다.
마커 스코어를 계산하기 위해, 샘플을 대조군 및 시험군으로 분류하였다. 마커 스코어의 출발점은 대조 샘플을 넘는 시험 샘플의 평균 배수 변경 (비)이다. 스코어는 매우 높은 값을 갖는 소수의 시험 샘플에 의해 좌우되지 않으면서 차별적 발현을 보이는 시험 샘플의 변경 정도 (발현비) 및 수를 모두 반영하도록 디자인하였다. 상기 "특이치 (outlier)" 효과를 감소시키기 위해, 10을 초과하는 발현비를 갖는 유전자를 10의 발현비를 갖는 것과 유의하게 다르지 않은 것으로 취급하였다. 마커 스코어로부터 상기 요망되는 작업은 시험 샘플 전체에 평균 배수 변경을 취하기 전에 비대칭 압축 함수를 사용하여 시험군:대조군 발현비를 전환시킴으로써 달성하였다. 마커 스코어는 시험군이 대조군보다 더 많이 발현되는 것으로 나타나지 않을 때 1의 값을 갖고 그렇지 않으면 1을 초과하는 값을 갖는다. 마커 스코어는 임의의 유전자에 대해 10의 값을 초과할 수 없다.
따라서 유전자 g에 대한 마커 스코어 Sg는 다음과 같이 개별 시험군 및 대조군 수준의 칭량된 강도의 비의 평균으로서 계산한다:
Sg = (∑ Sgs)/N시험군
Sgs = C(xgs/(k+xg Q))
상기 식에서, Sgs는 유전자 g 및 샘플 s에 대한 마커 스코어를 나타내고,
C(r)은 r≥ 1에 대해 압축 함수 C(r) = A(1-e-r/A), r < 1에 대해 C(r) = 1이고,
A는 배수 변경값에 대한 상부 점근선이고 (본원에서는 10을 사용함),
xgs는 샘플 s에서 유전자 g의 발현값이고,
xg Q는 대조 샘플 발현값의 Q번째 백분위수이고; 전형적으로 Q = 50이며,
k는 데이타에서 부가 노이즈를 반영하는 상수, 즉 반복 측정치에서 편차의 고정 성분이다. 0.25의 값은 마이크로어레이 기술을 사용하는 보정 실험으로부터 상기 변수에 대해 유도되었다.
N시험군은 시험 샘플의 수이다.
결과
마커 선별
표 1에 나열된 모든 마커는 재료 및 방법 단락에 규정된 바와 같이 전사 프로파일링에 의해 확인하였다. 마커 M138, M437, M445, M452A, M712, M472, M590A, M713, M458, M714, M715, M185A, M476, M716, M717 및 M724로부터의 mRNA는 다양한 조직형 및 단계의 67개 난소 종양, 및 정상 난소 상피, 양성 상태, 다른 정상 조직 및 다른 비정상 조직을 포함하는 96개 비-난소 종양 조직으로부터 얻었다. 비-난소 종양 조직에서의 발현에 비해, 적어도 10%의 난소 종양에서 적어도 3배 더 많이 발현하는 클론을 난소암 특이적 마커로서 지정하였다. 이들 cDNA 클론을 그들의 단백질-코딩 전사체 서열을 결정하기 위해 선별하였다.
마커 OV32A, OV33A, OV52A, OV51A, OV55 및 OV65로부터의 mRNA는 9개 정상 난소 상피, 11개의 단계 I/II 난소암 종양 및 25개의 단계 III/IV 난소암 종양으로부터 얻었다. 적어도 4개 종양 샘플에서 비-난소 종양 조직에서의 그들의 발현에 비해 난소 종양에서 적어도 2배 더 많이 발현하는 클론을 그들의 단백질-코딩 전사체 서열을 결정하기 위해 선별하였다.
선택된 cDNA 클론에 대해 전장 단백질-코딩 전사체를 결정하기 위해, 선택된 클론의 서열(들)을 사용하여 유의한 겹침을 갖는 다른 EST 서열 또는 클러스터를 확인하기 위해 공공 및 특허 서열 데이타베이스에서 조사하였다. 간략히, 각각의 클론과 관련된 것으로 알려진 EST 서열의 BLAST 분석 (공공 및 특허 서열 데이타베이스 모두에 대해)을 직접 수행하거나 또는 고엄격 조건 하에 자동적으로 조립된 인접 서열의 측면에서 수행하였다. 클론에 대응하는 단백질 서열의 확인은 다음 중 하나를 얻음으로써 달성하였다:
1) 단백질 서열과 그의 가능한 6개 번역 중 하나에서 적어도 하나의 EST 서열 사이의 직접 매치;
2) 단백질 서열에 대응하는 mRNA에 대한 뉴클레오티드 서열과 적어도 하나의 EST 서열 사이의 직접 매치;
3) 단백질 서열과 그의 가능한 6개 번역 중 하나에서 데이타베이스 내의 다른 이용가능한 EST 서열과의 EST 서열의 인접 어셈블리 (콘티그 (contig)) 사이의 매치; 또는
4) 단백질 서열에 대응하는 mRNA에 대한 뉴클레오티드 서열과 그의 가능한 6개 번역 중 하나에서 데이타베이스 내의 다른 이용가능한 EST 서열과의 EST 서열의 인접 어셈블리 사이의 매치. 따라서, 인접 EST 서열 및(또는) 클러스터를 단백질-코딩 전사체 내로 조립하였다. 모든 주장된 마커에 대한 대체 전사체 분석을 다음과 같이 시작하였다:
1) 임의의 제시된 마커 유전자에 대한 공지의 뉴클레오티드 서열의 인간 게놈 서열에 대한 기존 맵핑 (mapping)을 이용하고, 임의의 제시된 마커 유전자에 대한 신규 뉴클레오티드 서열을 인간 게놈 서열 상에 추가로 맵핑함으로써 (예를 들어 "UCSC 게놈 브라우저 (browser)"와 같은 리소스 (resource) 또는 유사한 기능성의 인-하우스 (in-house) 리소스를, 게놈 서열 상으로 탐색 서열의 신속하고 정확한 맵핑을 허용하는 BLAT와 같은 알고리즘과 함께 사용하여), 동일한 유전자에 매칭하는 EST 서열을 추가로 고려하면서 마커 유전자의 엑손-인트론을 확립하였다.
2) 해당 조직 및 대조 샘플으로부터 주어진 마커 유전자의 코딩 서열을 증폭하기 위해 PCR 프라이머를 디자인하였다. 코딩 서열을 변경하는 가능성을 갖는 본 분석으로부터 발생하는 마커 유전자의 임의의 대체 5' 또는 3' 말단을 고려하여 상기 대체 말단에 특이적인 추가의 프라이머를 디자인하였다.
3) 난소 종양 시료로부터 유도된 cDNA 템플레이트를 사용하여 얻은 PCR 산물을 플라스미드 벡터 내로 클로닝하고, DNA 서열 분석에 의해 특성화하였다. 전형적으로, 96 클론을 PCR 산물의 제한 효소 및 겔 전기영동에 의해 또는 DNA 서열 분석에 의해 분석하였다.
4) 2% 이상의 빈도로 발생하는 대체 유전자 전사체를 나타내는 클론을 서열분석하였다.
5) 확인된 대체 전사체의 차별적 유전자 발현을 환자 조직 시료로부터 제조된 cDNA에서 TAQMAN(등록상표) 정량적 PCR (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems))에 의해 확인하였다. 각 전사체에 대해 스플라이스 (splice)-형 특이적 TaqMan 프라이머 및 프로브 시약 세트를 개발하고, 각 유전자에 대해 모든 시약 세트를 사용하여 유사한 증폭 효능을 얻었다.
6) 이들 대체 전사체에 대응하는 단백질 서열의 확인은 모든 이용가능한 서열을 기준으로 수동 큐레이팅된 (curated) 어셈블리 (콘티그) 내에 함유된 개방 해독 프레임 (ORF)의 확인에 의해 달성하였다.
실시예 2: 엔드-포인트 (end-point) PCR에 의한 유전자 발현 분석
재료 및 방법
간략히, 제1 cDNA를 생성하기 위하여 템플레이트로서 사용하기 위해 상이한 샘플로부터의 총 RNA를 모았다. 난소 패널은 "난소 종양 풀" (장액성 및 투명 세포 난소 종양을 함유하는 4개 종양 샘플) 및 "난소 정상 풀" (3개 정상 난소 상피)의 환자 샘플로 이루어졌다.
제조자 (인비트로겐 코포레이션)의 지시에 따라 TRIZOL 시약을 사용하는 단일 단계 추출 방법에 의해 환자 샘플로부터 총 RNA를 제조하였다. 각각의 RNA 제제를 DNase I (앰비온 (Ambion))으로 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 각각의 환자 샘플로부터의 RNA를 2개의 풀, 예를 들어 난소 종양 풀 및 난소 정상 풀 중 하나에 모았다. ThermoScript RT-PCR 시스템 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 각각의 풀로부터 cDNA를 얻었다. 간략히, 제조자의 지시에 따라 10 ㎕ 부피 중에 1 ㎕의 50 μM 올리고(dT)20 프라이머를 사용하여 1 ㎕ RNA를 65℃에서 5분 동안 변성시켰다. 85℃에서 5분 동안 인큐베이팅하여 반응을 종결시켰다. 물로 최종 생성물을 100 ㎕의 최종 부피로 희석하였다.
개방 해독 프레임 바로 바깥쪽에 유전자 특이적 프라이머를 디자인하였다 (표 2의 카테고리 "엔드-포인트 PCR 프라이머 1" 및 "엔드-포인트 PCR 프라이머 2"에 나타낸 바와 같이). PCR 조건은 프라이머 및 예상되는 생성물 크기에 대해 최적화시켰다. 터치다운 (touchdown) 사이클링 조건으로 20 ㎕의 반응물 중 2 ㎕의 cDNA을 사용하였다. 생성물을 에티듐 브로마이드 함유 아가로스 겔 상에서 진행시켰다. 이어서 겔 사진을 반정량적으로 분석하고 스코어링하였다.
조직 패널에 대한 엔드-포인트 PCR의 에티듐 브로마이드 아가로스 겔 사진을 1-5의 스케일에서 스코어링하였다. 각각의 사진은 시각적 밴드 강도에 기준하여 3명의 사람이 독립적으로 스코어링하고, 결과를 수집하였다. 3명 모두 밴드의 상대적 강도에 동의한 것을 확인하기 위해 스코어를 비교하고, 필요한 경우 수정하였다. 이어서 3개 스코어의 중앙값을 최종 스코어로서 기록하였다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 엔드-포인트 PCR에서 시험된 본 발명의 모든 마커는 난소 정상 풀에 비해 난소 종양 풀에서 더 큰 수준으로 발현되었다.
결과
엔드-포인트 PCR 데이타
마커 엔드-포인트 PCR 프라이머 1 엔드-포인트 PCR 프라이머 2 난소 종양 풀 난소 정상 풀
M138 62-81 898-920 1 0
OV32A 87-108 1107-1128 3 0
OV33A 237-254 1082-1103 5 1
M472 62-80 458-480 2 0
M590A 751-772 1114-1135 5 1
OV52A 2-23 927-948 5 0
OV51A 91-108 1968-1989 4 0
M713 91-108 1857-1878 4 0
OV55 17-36 485-504 4 0
M458 1-22 373-394 5 0
M185A 13-33 519-538 3 1
OV65 106-123 2444-2465 5 0
M476 152-171 1742-1761 2 0
M716 20-39 414-432 1 0
M717 95-114 403-422 3 1
M724 275-296 638-659 5 1
다른 실시태양
당업계의 숙련인은 본원에서 설명되는 본 발명의 특정 실시태양에 대한 많은 균등물을 알 수 있거나 단지 통상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 상기 균등물은 하기 청구의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Millennium Pharmaceuticals, Inc., et al. <120> NUCLEIC ACID MOLECULES AND PROTEINS FOR THE IDENTIFICATION, ASSESSMENT, PREVENTION, AND THERAPY OF OVARIAN CANCER <130> MRI-065PC <150> 60/509,171 <151> 2003-10-07 <160> 44 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1257 <212> DNA <213> Homo sapien <220> <221> CDS <222> (27)...(863) <400> 1 gaggcgcgcg ggtgaaaggc gcattg atg cag cct gcg gcg gcc tcg gag cgc 53 Met Gln Pro Ala Ala Ala Ser Glu Arg 1 5 ggc gga gca gac gct gac cac gtt cct ctc ctc ggt ctc ctc cgc ctc 101 Gly Gly Ala Asp Ala Asp His Val Pro Leu Leu Gly Leu Leu Arg Leu 10 15 20 25 cag ctc cgc gct gcc cgg cag ccg gga gcc atg cga ccc cag ggc ccc 149 Gln Leu Arg Ala Ala Arg Gln Pro Gly Ala Met Arg Pro Gln Gly Pro 30 35 40 gcc gcc tcc ccg cag cgg ctc cgc ggc ctc ctg ctg ctc ctg ctg ctg 197 Ala Ala Ser Pro Gln Arg Leu Arg Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 45 50 55 cag ctg ccc gcg ccg tcg agc gcc tct gag atc ccc aag ggg aag caa 245 Gln Leu Pro Ala Pro Ser Ser Ala Ser Glu Ile Pro Lys Gly Lys Gln 60 65 70 aag gcg cag ctc cgg cag agg gag gtg gtg gac ctg tat aat gga atg 293 Lys Ala Gln Leu Arg Gln Arg Glu Val Val Asp Leu Tyr Asn Gly Met 75 80 85 tgc tta caa ggg cca gca gga gtg cct ggt cga gac ggg agc cct ggg 341 Cys Leu Gln Gly Pro Ala Gly Val Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly 90 95 100 105 gcc aat ggc att ccg ggt aca cct ggg atc cca ggt cgg gat gga ttc 389 Ala Asn Gly Ile Pro Gly Thr Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asp Gly Phe 110 115 120 aaa gga gaa aag ggg gaa tgt ctg agg gaa agc ttt gag gag tcc tgg 437 Lys Gly Glu Lys Gly Glu Cys Leu Arg Glu Ser Phe Glu Glu Ser Trp 125 130 135 aca ccc aac tac aag cag tgt tca tgg agt tca ttg aat tat ggc ata 485 Thr Pro Asn Tyr Lys Gln Cys Ser Trp Ser Ser Leu Asn Tyr Gly Ile 140 145 150 gat ctt ggg aaa att gcg gag tgt aca ttt aca aag atg cgt tca aat 533 Asp Leu Gly Lys Ile Ala Glu Cys Thr Phe Thr Lys Met Arg Ser Asn 155 160 165 agt gct cta aga gtt ttg ttc agt ggc tca ctt cgg cta aaa tgc aga 581 Ser Ala Leu Arg Val Leu Phe Ser Gly Ser Leu Arg Leu Lys Cys Arg 170 175 180 185 aat gca tgc tgt cag cgt tgg tat ttc aca ttc aat gga gct gaa tgt 629 Asn Ala Cys Cys Gln Arg Trp Tyr Phe Thr Phe Asn Gly Ala Glu Cys 190 195 200 tca gga cct ctt ccc att gaa gct ata att tat ttg gac caa gga agc 677 Ser Gly Pro Leu Pro Ile Glu Ala Ile Ile Tyr Leu Asp Gln Gly Ser 205 210 215 cct gaa atg aat tca aca att aat att cat cgc act tct tct gtg gaa 725 Pro Glu Met Asn Ser Thr Ile Asn Ile His Arg Thr Ser Ser Val Glu 220 225 230 gga ctt tgt gaa gga att ggt gct gga tta gtg gat gtt gct atc tgg 773 Gly Leu Cys Glu Gly Ile Gly Ala Gly Leu Val Asp Val Ala Ile Trp 235 240 245 gtt ggc act tgt tca gat tac cca aaa gga gat gct tct act gga tgg 821 Val Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Pro Lys Gly Asp Ala Ser Thr Gly Trp 250 255 260 265 aat tca gtt tct cgc atc att att gaa gaa cta cca aaa taa 863 Asn Ser Val Ser Arg Ile Ile Ile Glu Glu Leu Pro Lys * 270 275 atgctttaat tttcatttgc tacctctttt tttattatgc cttggaatgg ttcacttaaa 923 tgacatttta aataagttta tgtatacatc tgaatgaaaa gcaaagctaa atatgtttac 983 agaccaaagt gtgatttcac actgttttta aatctagcat tattcatttt gcttcaatca 1043 aaagtggttt caatattttt tttagttggt tagaatactt tcttcatagt cacattctct 1103 caacctataa tttggaatat tgttgtggtc ttttgttttt tctcttagta tagcattttt 1163 aaaaaaatat aaaagctacc aatctttgta caatttgtaa atgttaagaa ttttttttat 1223 atctgttaaa taaaaattat ttccaacaac ctta 1257 <210> 2 <211> 278 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 2 Met Gln Pro Ala Ala Ala Ser Glu Arg Gly Gly Ala Asp Ala Asp His 1 5 10 15 Val Pro Leu Leu Gly Leu Leu Arg Leu Gln Leu Arg Ala Ala Arg Gln 20 25 30 Pro Gly Ala Met Arg Pro Gln Gly Pro Ala Ala Ser Pro Gln Arg Leu 35 40 45 Arg Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Leu Pro Ala Pro Ser Ser 50 55 60 Ala Ser Glu Ile Pro Lys Gly Lys Gln Lys Ala Gln Leu Arg Gln Arg 65 70 75 80 Glu Val Val Asp Leu Tyr Asn Gly Met Cys Leu Gln Gly Pro Ala Gly 85 90 95 Val Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Asn Gly Ile Pro Gly Thr 100 105 110 Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asp Gly Phe Lys Gly Glu Lys Gly Glu Cys 115 120 125 Leu Arg Glu Ser Phe Glu Glu Ser Trp Thr Pro Asn Tyr Lys Gln Cys 130 135 140 Ser Trp Ser Ser Leu Asn Tyr Gly Ile Asp Leu Gly Lys Ile Ala Glu 145 150 155 160 Cys Thr Phe Thr Lys Met Arg Ser Asn Ser Ala Leu Arg Val Leu Phe 165 170 175 Ser Gly Ser Leu Arg Leu Lys Cys Arg Asn Ala Cys Cys Gln Arg Trp 180 185 190 Tyr Phe Thr Phe Asn Gly Ala Glu Cys Ser Gly Pro Leu Pro Ile Glu 195 200 205 Ala Ile Ile Tyr Leu Asp Gln Gly Ser Pro Glu Met Asn Ser Thr Ile 210 215 220 Asn Ile His Arg Thr Ser Ser Val Glu Gly Leu Cys Glu Gly Ile Gly 225 230 235 240 Ala Gly Leu Val Asp Val Ala Ile Trp Val Gly Thr Cys Ser Asp Tyr 245 250 255 Pro Lys Gly Asp Ala Ser Thr Gly Trp Asn Ser Val Ser Arg Ile Ile 260 265 270 Ile Glu Glu Leu Pro Lys 275 <210> 3 <211> 4039 <212> DNA <213> Homo sapien <220> <221> CDS <222> (28)...(1815) <400> 3 cgccatcgtt ccctggctgc ttactaa gtt gga tcc gga att tct ttt caa ccg 54 Val Gly Ser Gly Ile Ser Phe Gln Pro 1 5 gga gcc att ggt gtc gaa gtg tct gca atg aac ccc gtg aat gct act 102 Gly Ala Ile Gly Val Glu Val Ser Ala Met Asn Pro Val Asn Ala Thr 10 15 20 25 gct ctc tac att tcc gcg agc cgc cta gtg ctc aac tac gac ccc gga 150 Ala Leu Tyr Ile Ser Ala Ser Arg Leu Val Leu Asn Tyr Asp Pro Gly 30 35 40 gac ccc aag gcg ttt act gag att aac agg ctc ttg cct tac ttc cga 198 Asp Pro Lys Ala Phe Thr Glu Ile Asn Arg Leu Leu Pro Tyr Phe Arg 45 50 55 cag tcc ctt tcg tgc tgt gtt tgc gga cat ttg cta caa gat cct att 246 Gln Ser Leu Ser Cys Cys Val Cys Gly His Leu Leu Gln Asp Pro Ile 60 65 70 gca ccc acc aac tcc acc tgc caa cat tat gtc tgc aaa act tgt aaa 294 Ala Pro Thr Asn Ser Thr Cys Gln His Tyr Val Cys Lys Thr Cys Lys 75 80 85 ggc aag aaa atg atg atg aaa cct tcc tgt agc tgg tgc aaa gac tat 342 Gly Lys Lys Met Met Met Lys Pro Ser Cys Ser Trp Cys Lys Asp Tyr 90 95 100 105 gag cag ttt gag gaa aac aag cag tta agc atc cta gtg aac tgc tac 390 Glu Gln Phe Glu Glu Asn Lys Gln Leu Ser Ile Leu Val Asn Cys Tyr 110 115 120 aaa aaa cta tgc gag tat ata aca cag act aca ctg gca cgg gat ata 438 Lys Lys Leu Cys Glu Tyr Ile Thr Gln Thr Thr Leu Ala Arg Asp Ile 125 130 135 ata gaa gca gtt gac tgt tct tct gat att ttg gct ttg ctt aat gat 486 Ile Glu Ala Val Asp Cys Ser Ser Asp Ile Leu Ala Leu Leu Asn Asp 140 145 150 gga tca ttg ttt tgt gag gag aca gaa aaa ccc tca gat tca tcc ttt 534 Gly Ser Leu Phe Cys Glu Glu Thr Glu Lys Pro Ser Asp Ser Ser Phe 155 160 165 act ttg tgt ttg aca cat tcc cct tta cct tca acc tca gaa ccc aca 582 Thr Leu Cys Leu Thr His Ser Pro Leu Pro Ser Thr Ser Glu Pro Thr 170 175 180 185 act gat cct caa gct agt tta tct cca atg tct gaa agc acc ctc agc 630 Thr Asp Pro Gln Ala Ser Leu Ser Pro Met Ser Glu Ser Thr Leu Ser 190 195 200 att gct att ggc agt tct gtt atc aat ggt ttg cct act tat aat ggg 678 Ile Ala Ile Gly Ser Ser Val Ile Asn Gly Leu Pro Thr Tyr Asn Gly 205 210 215 ctt tca ata gat aga ttt ggt ata aat att cct tca cct gaa cat tca 726 Leu Ser Ile Asp Arg Phe Gly Ile Asn Ile Pro Ser Pro Glu His Ser 220 225 230 aat acg att gac gta tgt aat act gtt gac ata aaa act gag gat ctg 774 Asn Thr Ile Asp Val Cys Asn Thr Val Asp Ile Lys Thr Glu Asp Leu 235 240 245 tct gac agc ctg cca ccc gtt tgt gac aca gta gcc act gac tta tgt 822 Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Cys Asp Thr Val Ala Thr Asp Leu Cys 250 255 260 265 tcc aca ggc att gat atc tgc agt ttc agt gaa gat ata aaa cct gga 870 Ser Thr Gly Ile Asp Ile Cys Ser Phe Ser Glu Asp Ile Lys Pro Gly 270 275 280 gac tct ctg tta ctg agt gtt gag gaa gta ctc cgc agc tta gaa act 918 Asp Ser Leu Leu Leu Ser Val Glu Glu Val Leu Arg Ser Leu Glu Thr 285 290 295 gtt tca aat aca gag gtc tgt tgc cct aat ttg cag ccg aac ttg gaa 966 Val Ser Asn Thr Glu Val Cys Cys Pro Asn Leu Gln Pro Asn Leu Glu 300 305 310 gcc act gta tcc aat gga cct ttt ctg cag ctt tct tcc cag tct ctt 1014 Ala Thr Val Ser Asn Gly Pro Phe Leu Gln Leu Ser Ser Gln Ser Leu 315 320 325 agc cat aat gtt ttt atg tcc acc agt cct gca ctt cat ggg tta tca 1062 Ser His Asn Val Phe Met Ser Thr Ser Pro Ala Leu His Gly Leu Ser 330 335 340 345 tgt aca gca gca act ccg aag ata gca aaa ttg aat aga aaa cga tcc 1110 Cys Thr Ala Ala Thr Pro Lys Ile Ala Lys Leu Asn Arg Lys Arg Ser 350 355 360 aga tca gag agt gac agt gag aaa gtt cag cca ctt cca att tct acc 1158 Arg Ser Glu Ser Asp Ser Glu Lys Val Gln Pro Leu Pro Ile Ser Thr 365 370 375 att atc cga ggc cca aca ctg ggg gca tct gct cct gtg aca gtg aaa 1206 Ile Ile Arg Gly Pro Thr Leu Gly Ala Ser Ala Pro Val Thr Val Lys 380 385 390 cgg gag agc aaa att tct ctt caa cct ata gca act gtt ccc aat gga 1254 Arg Glu Ser Lys Ile Ser Leu Gln Pro Ile Ala Thr Val Pro Asn Gly 395 400 405 ggc aca aca cct aaa atc agc aaa act gta ctt tta tct act aaa agc 1302 Gly Thr Thr Pro Lys Ile Ser Lys Thr Val Leu Leu Ser Thr Lys Ser 410 415 420 425 atg aaa aag agt cat gaa cat gga tcc aag aaa tct cac tct aaa acc 1350 Met Lys Lys Ser His Glu His Gly Ser Lys Lys Ser His Ser Lys Thr 430 435 440 aag cca ggt att ctt aaa aaa gac aaa gca gta aag gaa aag att cct 1398 Lys Pro Gly Ile Leu Lys Lys Asp Lys Ala Val Lys Glu Lys Ile Pro 445 450 455 agt cat cat ttt atg cca gga agt cct acc aag act gtg tac aaa aaa 1446 Ser His His Phe Met Pro Gly Ser Pro Thr Lys Thr Val Tyr Lys Lys 460 465 470 ccc cag gaa aag aaa ggg tgt aaa tgt ggg cgt gct act caa aat cca 1494 Pro Gln Glu Lys Lys Gly Cys Lys Cys Gly Arg Ala Thr Gln Asn Pro 475 480 485 agt gtt ctt aca tgc cga ggc caa cgc tgc cct tgc tac tct aac cgc 1542 Ser Val Leu Thr Cys Arg Gly Gln Arg Cys Pro Cys Tyr Ser Asn Arg 490 495 500 505 aaa gcc tgc tta gat tgt ata tgt cgt ggc tgc caa aac tcc tat atg 1590 Lys Ala Cys Leu Asp Cys Ile Cys Arg Gly Cys Gln Asn Ser Tyr Met 510 515 520 gcc aat ggg gag aag aag ctg gag gca ttt gcc gtg cca gaa aag gcc 1638 Ala Asn Gly Glu Lys Lys Leu Glu Ala Phe Ala Val Pro Glu Lys Ala 525 530 535 ttg gag cag acc agg ctc act ttg ggc att aac gtg act agc att gct 1686 Leu Glu Gln Thr Arg Leu Thr Leu Gly Ile Asn Val Thr Ser Ile Ala 540 545 550 gtg cgt aac gct agt acc agc acc agt gta ata aat gtc aca ggg tcc 1734 Val Arg Asn Ala Ser Thr Ser Thr Ser Val Ile Asn Val Thr Gly Ser 555 560 565 cca gta acg acg ttt tta gct gcc agt aca cat gat gat aaa agt ttg 1782 Pro Val Thr Thr Phe Leu Ala Ala Ser Thr His Asp Asp Lys Ser Leu 570 575 580 585 gat gaa gct ata gac atg aga ttc gac tgt taa atcagtgggt cttttaaacc 1835 Asp Glu Ala Ile Asp Met Arg Phe Asp Cys * 590 595 tactcctggt agggaaatag ctacagtttt acggcagcta tggttctgtt ggtttaactt 1895 gccggagctc ctgcatatag atcacttgta tcaagtgttt tcattgctaa gttatatgtg 1955 ttagtgtcgg ggaaatagtt tgcagataat ggaggagtaa ccctacaact atatgtcctt 2015 agttcttaca gaacctcata gtttgagaac aaagctgatg caactgattt atacaaaatg 2075 aactttggca agaaaaataa cattaacctc attgtttatg gccatgcttt gtgcataatc 2135 aaagtttatg attaaatgta aggaagtggt atctagtcag tccataaaga ttgtgctaat 2195 ttttttgtgg aaaagtagcc attagttcag gaaactcagt gctgccttca gatgtcattg 2255 atgtttctcc tgttggaaag ctgatgtgtc cagctcaacc tttgtgctga catcatacca 2315 tttctgatca tgaaatattg gctactggtg tatgtagcag ttcttaaatc agcagtatta 2375 tgaaaaaaaa ttccccctca ttagaatgtt taagaaatct ttttaaaaag taaaattctg 2435 tcagactaca aatgtttagc tgttactcat ttctagggaa gaaattctaa atccctcctt 2495 cactttgagc agtgttctaa ttggataaat gaaggagagt agttttattc tgaaggtaat 2555 taaatttaga ctatgtagta tgtgacagaa tttttttaaa attataaaaa gattttattt 2615 agtaattggg atttacttaa aataattttg gaataatgct cccagacttg cccagatttg 2675 tgtattgtac ttattgccac tggccgccac tttgacttat tttctctaat agtttatttg 2735 ccacagtctt tattttgaat atgctcctag ttttttttta gggtgctgtt cattatgaag 2795 gcttctttat agaggcctaa taagaatgcc tttttataaa gcctgtgcat ttaggtaggt 2855 tgaagctagg aggattttct ttagaatgct cttttgcatg taaagcacaa agtatgtttc 2915 agtttaaatg cacttcttcc ggttaatttt tatggggaag acaagtgagt cacaaacatt 2975 ctgttgaagg gaaatctagt cagttgcttg aaagagcaca gcccaaataa aacaaggact 3035 gactaggtgt aatgaaataa cctgtgattt aaaagaagag ctgcagcttt gacagtgctt 3095 atttaaagaa aaatactgct ggaaaatttc caatttctac tacgttcacc atctctagta 3155 agatctgaca tatgctgaag ttatgttttg atttggcaca cagcatgttc aatgatggtt 3215 actcgcctag tacaagacat ggagaagaaa cctttggaca cagagcagat gacacctcct 3275 tctgttttgt agtgtatcct ggtgtcattt tctgtgaatg tggtcaggta gagttgtttt 3335 tgttgttgtt gttgggcttt tttttctttt tttttttttg gtctcttttg gtggggtggg 3395 ggtgggctaa agccatagga agaaaaatgt gatgtgtcca gtatgtacta ttttgttttt 3455 gttttgcaag aagagttgaa ctatttttga taacaagagt aaatggtgga aaatgcttct 3515 tagttgtctt gtctttattt gctttccaag atttggaatt ttatttaatt cctttaagtg 3575 ttagcagtgt cttatgaaac atgtatttac ctaacgtttg taacagtttt gtgttgaacc 3635 cagatgccct gctatataaa gttgtaaatc tgttctttat tcactaatga tcactgcaaa 3695 aatgattaga aatgagattg tacacatgga tgaggatata ttttgcaaat cgaccaaact 3755 ttcctaatat tatgatctta aaattcatag agtactttat tgcttcccaa gtttgataat 3815 cttgtgggtt tttttttttt ttgatgcatg ggaggttggc aatatagaca aagtggaaat 3875 cattagtatg tgagggcctt gattgttatg taatattgcc aatgatgaat tcaggttgtt 3935 tttagcacaa gtttctcttt tttatgctgg tattctcact gccacatttt tggaaacctg 3995 tattacacct taaatctatc aataaatgat agttttctaa ttct 4039 <210> 4 <211> 595 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 4 Val Gly Ser Gly Ile Ser Phe Gln Pro Gly Ala Ile Gly Val Glu Val 1 5 10 15 Ser Ala Met Asn Pro Val Asn Ala Thr Ala Leu Tyr Ile Ser Ala Ser 20 25 30 Arg Leu Val Leu Asn Tyr Asp Pro Gly Asp Pro Lys Ala Phe Thr Glu 35 40 45 Ile Asn Arg Leu Leu Pro Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Ser Cys Cys Val 50 55 60 Cys Gly His Leu Leu Gln Asp Pro Ile Ala Pro Thr Asn Ser Thr Cys 65 70 75 80 Gln His Tyr Val Cys Lys Thr Cys Lys Gly Lys Lys Met Met Met Lys 85 90 95 Pro Ser Cys Ser Trp Cys Lys Asp Tyr Glu Gln Phe Glu Glu Asn Lys 100 105 110 Gln Leu Ser Ile Leu Val Asn Cys Tyr Lys Lys Leu Cys Glu Tyr Ile 115 120 125 Thr Gln Thr Thr Leu Ala Arg Asp Ile Ile Glu Ala Val Asp Cys Ser 130 135 140 Ser Asp Ile Leu Ala Leu Leu Asn Asp Gly Ser Leu Phe Cys Glu Glu 145 150 155 160 Thr Glu Lys Pro Ser Asp Ser Ser Phe Thr Leu Cys Leu Thr His Ser 165 170 175 Pro Leu Pro Ser Thr Ser Glu Pro Thr Thr Asp Pro Gln Ala Ser Leu 180 185 190 Ser Pro Met Ser Glu Ser Thr Leu Ser Ile Ala Ile Gly Ser Ser Val 195 200 205 Ile Asn Gly Leu Pro Thr Tyr Asn Gly Leu Ser Ile Asp Arg Phe Gly 210 215 220 Ile Asn Ile Pro Ser Pro Glu His Ser Asn Thr Ile Asp Val Cys Asn 225 230 235 240 Thr Val Asp Ile Lys Thr Glu Asp Leu Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val 245 250 255 Cys Asp Thr Val Ala Thr Asp Leu Cys Ser Thr Gly Ile Asp Ile Cys 260 265 270 Ser Phe Ser Glu Asp Ile Lys Pro Gly Asp Ser Leu Leu Leu Ser Val 275 280 285 Glu Glu Val Leu Arg Ser Leu Glu Thr Val Ser Asn Thr Glu Val Cys 290 295 300 Cys Pro Asn Leu Gln Pro Asn Leu Glu Ala Thr Val Ser Asn Gly Pro 305 310 315 320 Phe Leu Gln Leu Ser Ser Gln Ser Leu Ser His Asn Val Phe Met Ser 325 330 335 Thr Ser Pro Ala Leu His Gly Leu Ser Cys Thr Ala Ala Thr Pro Lys 340 345 350 Ile Ala Lys Leu Asn Arg Lys Arg Ser Arg Ser Glu Ser Asp Ser Glu 355 360 365 Lys Val Gln Pro Leu Pro Ile Ser Thr Ile Ile Arg Gly Pro Thr Leu 370 375 380 Gly Ala Ser Ala Pro Val Thr Val Lys Arg Glu Ser Lys Ile Ser Leu 385 390 395 400 Gln Pro Ile Ala Thr Val Pro Asn Gly Gly Thr Thr Pro Lys Ile Ser 405 410 415 Lys Thr Val Leu Leu Ser Thr Lys Ser Met Lys Lys Ser His Glu His 420 425 430 Gly Ser Lys Lys Ser His Ser Lys Thr Lys Pro Gly Ile Leu Lys Lys 435 440 445 Asp Lys Ala Val Lys Glu Lys Ile Pro Ser His His Phe Met Pro Gly 450 455 460 Ser Pro Thr Lys Thr Val Tyr Lys Lys Pro Gln Glu Lys Lys Gly Cys 465 470 475 480 Lys Cys Gly Arg Ala Thr Gln Asn Pro Ser Val Leu Thr Cys Arg Gly 485 490 495 Gln Arg Cys Pro Cys Tyr Ser Asn Arg Lys Ala Cys Leu Asp Cys Ile 500 505 510 Cys Arg Gly Cys Gln Asn Ser Tyr Met Ala Asn Gly Glu Lys Lys Leu 515 520 525 Glu Ala Phe Ala Val Pro Glu Lys Ala Leu Glu Gln Thr Arg Leu Thr 530 535 540 Leu Gly Ile Asn Val Thr Ser Ile Ala Val Arg Asn Ala Ser Thr Ser 545 550 555 560 Thr Ser Val Ile Asn Val Thr Gly Ser Pro Val Thr Thr Phe Leu Ala 565 570 575 Ala Ser Thr His Asp Asp Lys Ser Leu Asp Glu Ala Ile Asp Met Arg 580 585 590 Phe Asp Cys 595 <210> 5 <211> 2611 <212> DNA <213> Homo sapien <220> <221> CDS <222> (21)...(473) <400> 5 cttttttcac ctcgtctgaa atg gct gcc tcc cag tgt ctc tgc tgc tca aaa 53 Met Ala Ala Ser Gln Cys Leu Cys Cys Ser Lys 1 5 10 ttt ctc ttc cag aga cag aac ctc gcc tgt ttc ctc aca aac cca cac 101 Phe Leu Phe Gln Arg Gln Asn Leu Ala Cys Phe Leu Thr Asn Pro His 15 20 25 tgt ggc agc ctt gtt aat gca gat ggc cat ggt gaa gtg tgg aca gac 149 Cys Gly Ser Leu Val Asn Ala Asp Gly His Gly Glu Val Trp Thr Asp 30 35 40 tgg aat aat atg tcc aag ttt ttc cag tat gga tgg cga tgc acc act 197 Trp Asn Asn Met Ser Lys Phe Phe Gln Tyr Gly Trp Arg Cys Thr Thr 45 50 55 aat gag aat acc tat tca aac cgt acc ctg atg ggc aac tgg aac cag 245 Asn Glu Asn Thr Tyr Ser Asn Arg Thr Leu Met Gly Asn Trp Asn Gln 60 65 70 75 gaa aga tat gac ctg agg aat atc gtg cag ccc aaa ccc ttg cct tcc 293 Glu Arg Tyr Asp Leu Arg Asn Ile Val Gln Pro Lys Pro Leu Pro Ser 80 85 90 cag ttt gga cac tac ttt gaa aca aca tat gat aca agc tac aac aac 341 Gln Phe Gly His Tyr Phe Glu Thr Thr Tyr Asp Thr Ser Tyr Asn Asn 95 100 105 aaa atg cca ctt tca aca cat aga ttt aag cga gag cct cac tgg ttc 389 Lys Met Pro Leu Ser Thr His Arg Phe Lys Arg Glu Pro His Trp Phe 110 115 120 cca gga cat caa cct gaa ctg gat cct ccc cga tac aaa tgc aca gaa 437 Pro Gly His Gln Pro Glu Leu Asp Pro Pro Arg Tyr Lys Cys Thr Glu 125 130 135 aag tca act tac atg aat agc tat tca aag cct taa attgggcatc 483 Lys Ser Thr Tyr Met Asn Ser Tyr Ser Lys Pro * 140 145 150 actcaggatg tgtataagat cttaatattg atagtttcac atccaggttt ctaagaaatg 543 ataagatact tcacttttcc agagtgaaat gtaggaggga gcacattcta agtacagcta 603 aaaatttagc tcactgtaac acagtttcac tctctgaata aataaagcaa aaaacacagt 663 aaatattctt tatccctttt tttgttgttg ttttaaccaa gatttaaatg tcaaatttaa 723 tacagcaact cagttctaca tttggggtgt tgtagaaggg ccttaaaaag aattatttta 783 ggccaggcac ggtggctcat gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccga ggcaggtgga 843 tcacgtgagg tcaggagttc gagaccagcc tgaccaacat ggtgaaacac tgtctctact 903 aaaaacacaa aaattagctg agcatggtgg ctcacgcctg taatcccagc tactcaggag 963 gctgaggcag gggaatcgct tgaacctgag aagtggaggt tgtggtgagc tgagatcatg 1023 ccactgcact ttagcctggg tgacagagcg agactctgtc tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1083 agaattattt ctctgaagtc tacaaccact gtggtcttcc cttccttctg tcgtagcaag 1143 acctcagaat ctagcataac ttaggctagg tttggctaga tgctttctgg gtataagcca 1203 gagtcgtata gtgcaacttt gctgtgacct tagtgaacat cccctcttga ggactacaaa 1263 aacaaacgta actttttaaa attattatgg agaattttac gtaaaacaaa agtagacagg 1323 ctagtctaat gaactcccat gtatcattac ccagcatcaa ctatttatga ctaatcttac 1383 ctacttctac tttgtcttat tgaattaatt ttggagcaga tcttagaaat agaatttaat 1443 ctataaaaat cttggtgggc tgggtacggt ggctcatgcc tgtaatccca gcactttggg 1503 aggctgaggt gggtggatca cctgaggtca ggagtccaag accagcctgg ccaatgtggt 1563 gaaactccat ctcttctaaa aatacaaaaa ttagctggtc ttggtggcgg gcgcctgtaa 1623 tcccagctac ttgggaggct gaggcaggag aattgcttga acccaggaag cagaggttgc 1683 agtgagctga gacggtgcca ttgctctcca gcctgggcga caagagcgaa actccgtctc 1743 aaaaaaaaaa aagaaaagaa aaagaaaaaa aaaatcttgg tatactggct gggcacagtg 1803 gctcacacct aatcccagca ctttgggagg ctgaggcagg aggatagctt gaggctggga 1863 gttcaaaacc agcctgggca acatagcaag accccatctc taccaaaaaa aattttttta 1923 aagatttcag gtatatttct 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Ala Asp Gly His Gly Glu Val Trp Thr Asp Trp Asn Asn Met Ser 35 40 45 Lys Phe Phe Gln Tyr Gly Trp Arg Cys Thr Thr Asn Glu Asn Thr Tyr 50 55 60 Ser Asn Arg Thr Leu Met Gly Asn Trp Asn Gln Glu Arg Tyr Asp Leu 65 70 75 80 Arg Asn Ile Val Gln Pro Lys Pro Leu Pro Ser Gln Phe Gly His Tyr 85 90 95 Phe Glu Thr Thr Tyr Asp Thr Ser Tyr Asn Asn Lys Met Pro Leu Ser 100 105 110 Thr His Arg Phe Lys Arg Glu Pro His Trp Phe Pro Gly His Gln Pro 115 120 125 Glu Leu Asp Pro Pro Arg Tyr Lys Cys Thr Glu Lys Ser Thr Tyr Met 130 135 140 Asn Ser Tyr Ser Lys Pro 145 150 <210> 7 <211> 3296 <212> DNA <213> Homo sapien <220> <221> CDS <222> (65)...(1735) <400> 7 cggaggaggc gaggagcgcc gggtaccggg ccgggggagc cgcgggctct cggggaagag 60 acgg atg atg aac aag ctt tac atc ggg aac ctg agc ccc gcc gtc acc 109 Met Met Asn Lys Leu Tyr Ile Gly Asn Leu Ser Pro Ala Val Thr 1 5 10 15 gcc gac gac ctc cgg cag ctc ttt ggg gac agg aag ctg ccc ctg gcg 157 Ala Asp Asp Leu Arg Gln Leu Phe Gly Asp Arg Lys Leu Pro Leu Ala 20 25 30 gga cag gtc ctg ctg aag tcc ggc tac gcc ttc gtg gac tac ccc gac 205 Gly Gln Val Leu Leu Lys Ser Gly Tyr Ala Phe Val Asp Tyr Pro Asp 35 40 45 cag aac tgg gcc atc cgc gcc atc gag acc ctc tcg ggt aaa gtg gaa 253 Gln Asn Trp Ala Ile Arg Ala Ile Glu Thr Leu Ser Gly Lys Val Glu 50 55 60 ttg cat ggg aaa atc atg gaa gtt gat tac tca gtc tct aaa aag cta 301 Leu His Gly Lys Ile Met Glu Val Asp Tyr Ser Val Ser Lys Lys Leu 65 70 75 agg agc agg aaa att cag att cga aac atc cct cct cac ctg cag tgg 349 Arg Ser Arg Lys Ile Gln Ile Arg Asn Ile Pro Pro His Leu Gln Trp 80 85 90 95 gag gtg ttg gat gga ctt ttg gct caa tat ggg aca gtg gag aat gtg 397 Glu Val Leu Asp Gly Leu Leu Ala Gln Tyr Gly Thr Val Glu Asn Val 100 105 110 gaa caa gtc aac aca gac aca gaa acc gcc gtt gtc aac gtc aca tat 445 Glu Gln Val Asn Thr Asp Thr Glu Thr Ala Val Val Asn Val Thr Tyr 115 120 125 gca aca aga gaa gaa gca aaa ata gcc atg gag aag cta agc ggg cat 493 Ala Thr Arg Glu Glu Ala Lys Ile Ala Met Glu Lys Leu Ser Gly His 130 135 140 cag ttt 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250 255 cgc atg att ctt gaa atc atg cag aaa gag gca gat gag acc aaa cta 877 Arg Met Ile Leu Glu Ile Met Gln Lys Glu Ala Asp Glu Thr Lys Leu 260 265 270 gcc gaa gag att cct ctg aaa atc ttg gca cac aat ggc ttg gtt gga 925 Ala Glu Glu Ile Pro Leu Lys Ile Leu Ala His Asn Gly Leu Val Gly 275 280 285 aga ctg att gga aaa gaa ggc aga aat ttg aag aaa att gaa cat gaa 973 Arg Leu Ile Gly Lys Glu Gly Arg Asn Leu Lys Lys Ile Glu His Glu 290 295 300 aca ggg acc aag ata aca atc tca tct ttg cag gat ttg agc ata tac 1021 Thr Gly Thr Lys Ile Thr Ile Ser Ser Leu Gln Asp Leu Ser Ile Tyr 305 310 315 aac ccg gaa aga acc atc act gtg aag ggc aca gtt gag gcc tgt gcc 1069 Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Val Lys Gly Thr Val Glu Ala Cys Ala 320 325 330 335 agt gct gag ata gag att atg aag aag ctg cgt gag gcc ttt gaa aat 1117 Ser Ala Glu Ile Glu Ile Met Lys Lys Leu Arg Glu Ala Phe Glu Asn 340 345 350 gat atg ctg gct gtt aac acc cac tcc gga tac ttc tcc agc ctg tac 1165 Asp Met Leu Ala Val Asn Thr His Ser Gly Tyr Phe Ser 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Arg Val Pro Ser Ser Thr Ala Gly 465 470 475 cgg gtg att ggc aaa ggt ggc aag acc gtg aac gaa ctg cag aac tta 1549 Arg Val Ile Gly Lys Gly Gly Lys Thr Val Asn Glu Leu Gln Asn Leu 480 485 490 495 acc agt gca gaa gtc atc gtg cct cgt gac caa acg cca gat gaa aat 1597 Thr Ser Ala Glu Val Ile Val Pro Arg Asp Gln Thr Pro Asp Glu Asn 500 505 510 gag gaa gtg atc gtc aga att atc ggg cac ttc ttt gct agc cag act 1645 Glu Glu Val Ile Val Arg Ile Ile Gly His Phe Phe Ala Ser Gln Thr 515 520 525 gca cag cgc aag atc agg gaa att gta caa cag gtg aag cag cag gag 1693 Ala Gln Arg Lys Ile Arg Glu Ile Val Gln Gln Val Lys Gln Gln Glu 530 535 540 cag aaa tac cct cag gga gtc gcc tca cag cgc agc aag tga 1735 Gln Lys Tyr Pro Gln Gly Val Ala Ser Gln Arg Ser Lys * 545 550 555 ggctcccaca ggcaccagca aaacaacgga tgaatgtagc ccttccaaca cctgacagaa 1795 tgagaccaaa cgcagccagc cagatcggga gcaaaccaaa gaccatctga ggaatgagaa 1855 gtctgcggag gcggccaggg actctgccga ggccctgaga accccagggg ccgaggaggg 1915 gcggggaagg tcagccaggt ttgccagaac caccgagccc cgcctcccgc cccccagggc 1975 ttctgcaggc ttcagccatc cacttcacca tccactcgga tctctcctga actcccacga 2035 cgctatccct tttagttgaa ctaacatagg tgaacgtgtt caaagccaag caaaatgcac 2095 accctttttc tgtggcaaat cgtctctgta catgtgtgta catattagaa agggaagatg 2155 ttaagatatg tggcctgtgg gttacacagg gtgcctgcag cggtaatata ttttagaaat 2215 aatatatcaa ataactcaac taactccaat ttttaatcaa ttattaattt ttttttcttt 2275 ttaaagagaa agcaggcttt tctagacttt aaagaataaa gtctttggga ggtctcacgg 2335 tgtagagagg agctttgagg ccacccgcac aaaattcacc cagagggaaa tctcgtcgga 2395 aggacactca cggcagttct ggatcacctg tgtatgtcaa cagaagggat accgtctcct 2455 tgaagaggaa actctgtcac tcctcatgcc tgtctagctc atacacccat ttctctttgc 2515 ttcacaggtt ttaaactggt tttttgcata ctgctatata attctctgtc tctctctgtt 2575 tatctctccc ctccctcccc tccccttctt ctccatctcc attcttttga atttcctcat 2635 ccctccatct caatcccgta tctacgcacc cccccccccc aggcaaagca gtgctctgag 2695 tatcacatca cacaaaagga acaaaagcga aacacacaaa ccagcctcaa cttacacttg 2755 gttactcaaa agaacaagag tcaatggtac 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1261 Val Ser Glu Arg Met Val Ile Ile Thr Gly Pro Pro Glu Ala Gln Phe 385 390 395 aag gcc cag gga cgg atc ttt ggg aaa ctg aaa gag gaa aac ttc ttt 1309 Lys Ala Gln Gly Arg Ile Phe Gly Lys Leu Lys Glu Glu Asn Phe Phe 400 405 410 415 aac ccc aaa gaa gaa gtg aag ctg gaa gcg cat atc aga gtg ccc tct 1357 Asn Pro Lys Glu Glu Val Lys Leu Glu Ala His Ile Arg Val Pro Ser 420 425 430 tcc aca gct ggc cgg gtg att ggc aaa ggt ggc aag acc gtg aac gaa 1405 Ser Thr Ala Gly Arg Val Ile Gly Lys Gly Gly Lys Thr Val Asn Glu 435 440 445 ctg cag aac tta acc agt gca gaa gtc atc gtg cct cgt gac caa acg 1453 Leu Gln Asn Leu Thr Ser Ala Glu Val Ile Val Pro Arg Asp Gln Thr 450 455 460 cca gat gaa aat gag gaa gtg atc gtc aga att atc ggg cac ttc ttt 1501 Pro Asp Glu Asn Glu Glu Val Ile Val Arg Ile Ile Gly His Phe Phe 465 470 475 gct agc cag act gca cag cgc aag atc agg gaa att gta caa cag gtg 1549 Ala Ser Gln Thr Ala Gln Arg Lys Ile Arg Glu Ile Val Gln Gln Val 480 485 490 495 aag cag cag gag cag aaa tac cct cag gga gtc gcc tca cag cgc agc 1597 Lys Gln Gln Glu Gln Lys Tyr Pro Gln Gly Val Ala Ser Gln Arg Ser 500 505 510 aag tga ggctcccaca ggcaccagca aaacaacgga tgaatgtagc ccttccaaca 1653 Lys * cctgacagaa tgagaccaaa cgcagccagc cagatcggga gcaaaccaaa gaccatctga 1713 ggaatgagaa gtctgcggag gcggccaggg actctgccga ggccctgaga accccagggg 1773 ccgaggaggg gcggggaagg tcagccaggt ttgccagaac caccgagccc cgcctcccgc 1833 cccccagggc ttctgcaggc ttcagccatc cacttcacca tccactcgga tctctcctga 1893 actcccacga cgctatccct tttagttgaa ctaacatagg tgaacgtgtt caaagccaag 1953 caaaatgcac accctttttc tgtggcaaat cgtctctgta catgtgtgta catattagaa 2013 agggaagatg ttaagatatg tggcctgtgg gttacacagg gtgcctgcag cggtaatata 2073 ttttagaaat aatatatcaa ataactcaac taactccaat ttttaatcaa ttattaattt 2133 ttttttcttt ttaaagagaa agcaggcttt tctagacttt aaagaataaa gtctttggga 2193 ggtctcacgg tgtagagagg agctttgagg ccacccgcac aaaattcacc cagagggaaa 2253 tctcgtcgga aggacactca cggcagttct ggatcacctg tgtatgtcaa cagaagggat 2313 accgtctcct tgaagaggaa actctgtcac tcctcatgcc tgtctagctc atacacccat 2373 ttctctttgc ttcacaggtt ttaaactggt tttttgcata ctgctatata attctctgtc 2433 tctctctgtt tatctctccc ctccctcccc tccccttctt ctccatctcc attcttttga 2493 atttcctcat ccctccatct caatcccgta tctacgcacc cccccccccc aggcaaagca 2553 gtgctctgag tatcacatca cacaaaagga acaaaagcga aacacacaaa ccagcctcaa 2613 cttacacttg gttactcaaa agaacaagag tcaatggtac ttgtcctagc gttttggaag 2673 aggaaaacag gaacccacca aaccaaccaa tcaaccaaac aaagaaaaaa ttccacaatg 2733 aaagaatgta ttttgtcttt ttgcattttg gtgtataagc catcaatatt cagcaaaatg 2793 attcctttct ttaaaaaaaa aaaatgtgga ggaaagtaga aatttaccaa ggttgttggc 2853 ccagggcgtt aaattcacag atttttttaa cgagaaaaac acacagaaga agctacctca 2913 ggtgttttta cctcagcacc ttgatcttgt gtttccctta gagattttgt aaagctgata 2973 gttggagcat ttttttattt ttttaataaa aatgagttgg aaaaaaaata agatatcaac 3033 tgccagcctg gagaaggtga cagtccaagt gtgcaacagc tgttctgaat tgtcttccgc 3093 tagccaagaa cctatatggc cttcttttgg acaaaccttg aaaatgttta tttaaaaaaa 3153 aaaaaaaaaa a 3164 <210> 10 <211> 512 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 10 Met Met Asn Lys Leu Tyr Ile Gly Asn Leu Ser Pro Ala Val Thr Ala 1 5 10 15 Asp Asp Leu Arg Gln Leu Phe Gly Asp Arg Lys Leu Pro Leu Ala Gly 20 25 30 Gln Val Leu Leu Lys Ser Gly Tyr Ala Phe Val Asp Tyr Pro Asp Gln 35 40 45 Asn Trp Ala Ile Arg Ala Ile Glu Thr Leu Ser Gly Lys Val Glu Leu 50 55 60 His Gly Lys Ile Met Glu Val Asp Tyr Ser Val Ser Lys Lys Leu Arg 65 70 75 80 Ser Arg Lys Ile Gln Ile Arg Asn Ile Pro Pro His Leu Gln Trp Glu 85 90 95 Val Leu Asp Gly Leu Leu Ala Gln Tyr Gly Thr Val Glu Asn Val Glu 100 105 110 Gln Val Asn Thr Asp Thr Glu Thr Ala Val Val Asn Val Thr Tyr Ala 115 120 125 Thr Arg Glu Glu Ala Lys Ile Ala Met Glu Lys Leu Ser Gly His Gln 130 135 140 Phe Glu Asn Tyr Ser Phe Lys Ile Ser Tyr Ile Pro Asp Glu Glu Phe 145 150 155 160 Val Gly Ala Ile Ile Gly Lys Glu Gly Leu Thr Ile Lys Asn Ile Thr 165 170 175 Lys Gln Thr Gln Ser Arg Val Asp Ile His Arg Lys Glu Asn Ser Gly 180 185 190 Ala Ala Glu Lys Pro Val Thr Ile His Ala Thr Pro Glu Gly Thr 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Met Arg Ala Pro His Leu His Leu Ser Ala Ala Ser Gly Ala Arg Ala 1 5 10 15 Leu Ala Lys Leu Leu Pro Leu Leu Met Ala Gln Leu Trp Ala Ala Glu 20 25 30 Ala Ala Leu Leu Pro Gln Asn Asp Thr Arg Leu Asp Pro Glu Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Pro Cys Ala Arg Gly Ser Gln Pro Trp Gln Val Ser Leu Phe 50 55 60 Asn Gly Leu Ser Phe His Cys Ala Gly Val Leu Val Asp Gln Ser Trp 65 70 75 80 Val Leu Thr Ala Ala His Cys Gly Asn Lys Pro Leu Trp Ala Arg Val 85 90 95 Gly Asp Asp His Leu Leu Leu Leu Gln Gly Glu Gln Leu Arg Arg Thr 100 105 110 Thr Arg Ser Val Val His Pro Lys Tyr His Gln Gly Ser Gly Pro Ile 115 120 125 Leu Pro Arg Arg Thr Asp Glu His Asp Leu Met Leu Leu Lys Leu Ala 130 135 140 Arg Pro Val Val Leu Gly Pro Arg Val Arg Ala Leu Gln Leu Pro Tyr 145 150 155 160 Arg Cys Ala Gln Pro Gly Asp Gln Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly Thr 165 170 175 Thr Ala Ala Arg Arg Val Lys Tyr Asn Lys Gly Leu Thr Cys Ser Ser 180 185 190 Ile Thr Ile Leu Ser Pro Lys Glu Cys Glu Val Phe Tyr Pro Gly Val 195 200 205 Val Thr Asn Asn Met 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tcg ggc cac ttg ctc tgt 386 Ser His Pro Tyr Gln Ala Ala Leu Tyr Thr Ser Gly His Leu Leu Cys 35 40 45 ggt ggg gtc ctt atc cat cca ctg tgg gtc ctc aca gct gcc cac tgc 434 Gly Gly Val Leu Ile His Pro Leu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys 50 55 60 aaa aaa ccg aat ctt cag gtc ttc ctg ggg aag cat aac ctt cgg caa 482 Lys Lys Pro Asn Leu Gln Val Phe Leu Gly Lys His Asn Leu Arg Gln 65 70 75 agg gag agt tcc cag gag cag agt tct gtt gtc cgg gct gtg atc cac 530 Arg Glu Ser Ser Gln Glu Gln Ser Ser Val Val Arg Ala Val Ile His 80 85 90 95 cct gac tat gat gcc gcc agc cat gac cag gac atc atg ctg ttg cgc 578 Pro Asp Tyr Asp Ala Ala Ser His Asp Gln Asp Ile Met Leu Leu Arg 100 105 110 ctg gca cgc cca gcc aaa ctc tct gaa ctc atc cag ccc ctt ccc ctg 626 Leu Ala Arg Pro Ala Lys Leu Ser Glu Leu Ile Gln Pro Leu Pro Leu 115 120 125 gag agg gac tgc tca gcc aac acc acc agc tgc cac atc ctg ggc tgg 674 Glu Arg Asp Cys Ser Ala Asn Thr Thr Ser Cys His Ile Leu Gly Trp 130 135 140 ggc aag aca gca gat ggt gat ttc cct gac acc atc cag tgt gca tac 722 Gly Lys Thr Ala Asp Gly Asp Phe Pro Asp Thr Ile Gln Cys Ala Tyr 145 150 155 atc cac ctg gtg tcc cgt gag gag tgt gag cat gcc tac cct ggc cag 770 Ile His Leu Val Ser Arg Glu Glu Cys Glu His Ala Tyr Pro Gly Gln 160 165 170 175 atc acc cag aac atg ttg tgt gct ggg gat gag aag tac ggg aag gat 818 Ile Thr Gln Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Glu Lys Tyr Gly Lys Asp 180 185 190 tcc tgc cag ggt gat tct ggg ggt ccg ctg gta tgt gga gac cac ctc 866 Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Gly Asp His Leu 195 200 205 cga ggc ctt gtg tca tgg ggt aac atc ccc tgt gga tca aag gag aag 914 Arg Gly Leu Val Ser Trp Gly Asn Ile Pro Cys Gly Ser Lys Glu Lys 210 215 220 cca gga gtc tac acc aac gtc tgc aga tac acg aac tgg atc caa aaa 962 Pro Gly Val Tyr Thr Asn Val Cys Arg Tyr Thr Asn Trp Ile Gln Lys 225 230 235 acc att cag gcc aag tga ccctgacatg tgacatctac ctcccgacct 1010 Thr Ile Gln Ala Lys * 240 accaccccac tggctggttc cagaacgtct ctcacctaga ccttgcctcc cctcctctcc 1070 tgcccagctc tgaccctgat gcttaataaa cgcagcgacg tgagggtcct gattctccct 1130 ggttttaccc cagctccatc cttgcatcac tggggaggac gtgatgagtg aggacttggg 1190 tcctcggtct tacccccacc actaagagaa tacaggaaaa tcccttctag gcatctcctc 1250 tccccaaccc ttccacacgt ttgatttctt cctgcagagg cccagccacg tgtctggaat 1310 cccagctccg ctgcttactg tcggtgtccc cttgggatgt acctttcttc actgcagatt 1370 tctcacctgt aagatgaaga taaggatgat acagtctcca taaggcagtg gctgttggaa 1430 agatttaagg tttcacacct atgacataca tggaatagca cctgggccac catgcactca 1490 ataaagaatg aattttatta tg 1512 <210> 14 <211> 244 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 14 Met Lys Lys Leu Met Val Val Leu Ser Leu Ile Ala Ala Ala Trp Ala 1 5 10 15 Glu Glu Gln Asn Lys Leu Val His Gly Gly Pro Cys Asp Lys Thr Ser 20 25 30 His Pro Tyr Gln Ala Ala Leu Tyr Thr Ser Gly His Leu Leu Cys Gly 35 40 45 Gly Val Leu Ile His Pro Leu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys 50 55 60 Lys Pro Asn Leu Gln Val Phe Leu Gly Lys His Asn Leu Arg Gln Arg 65 70 75 80 Glu Ser Ser Gln Glu Gln Ser Ser Val Val Arg Ala Val Ile His 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ccg aac ccc gcc gtg tcc ttc ccg ccg ccc cgg gtc acc ctg 162 Pro Pro Pro Asn Pro Ala Val Ser Phe Pro Pro Pro Arg Val Thr Leu 10 15 20 25 ccc gcc ggc ccc gac atc ctg cgg acc tac tcg ggc gcc ttc gtc tgc 210 Pro Ala Gly Pro Asp Ile Leu Arg Thr Tyr Ser Gly Ala Phe Val Cys 30 35 40 ctg gag att ctg ttc ggg ggt ctt gtc tgg att ttg gtt gcc tcc tcc 258 Leu Glu Ile Leu Phe Gly Gly Leu Val Trp Ile Leu Val Ala Ser Ser 45 50 55 aat gtt cct cta cct cta cta caa gga tgg gtc atg ttt gtg tcc gtg 306 Asn Val Pro Leu Pro Leu Leu Gln Gly Trp Val Met Phe Val Ser Val 60 65 70 aca gcg ttt ttc ttt tcg ctc ctc ttt ctg ggc atg ttc ctc tct ggc 354 Thr Ala Phe Phe Phe Ser Leu Leu Phe Leu Gly Met Phe Leu Ser Gly 75 80 85 atg gtg gct caa att gat gct aac tgg aac ttc ctg gat ttt gcc tac 402 Met Val Ala Gln Ile Asp Ala Asn Trp Asn Phe Leu Asp Phe Ala Tyr 90 95 100 105 cat ttt aca gta ttt gtc ttc tat ttt gga gcc ttt tta ttg gaa gca 450 His Phe Thr Val Phe Val Phe Tyr Phe Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ala 110 115 120 gca gcc aca tcc ctg cat gat ttg cat tgc aat aca acc ata acc ggg 498 Ala Ala Thr Ser Leu His Asp Leu His Cys Asn Thr Thr Ile Thr Gly 125 130 135 cag cca ctc ctg agt gat aac cag tat aac ata aac gta gca gcc tca 546 Gln Pro Leu Leu Ser Asp Asn Gln Tyr Asn Ile Asn Val Ala Ala Ser 140 145 150 att ttt gcc ttt atg acg aca gct tgt tat ggt tgc agt ttg ggt ctg 594 Ile Phe Ala Phe Met Thr Thr Ala Cys Tyr Gly Cys Ser Leu Gly Leu 155 160 165 gct tta cga aga tgg cga ccg taa cactccttag aaactggcag tcgtatgtta 648 Ala Leu Arg Arg Trp Arg Pro * 170 175 gtttcacttg tctactttat atgtctgatc aatttggata ccattttgtc cagatgcaaa 708 aacattccaa aagtaatgtg tttagtagag agagactcta agctcaagtt ctggtttatt 768 tcatggatgg aatgttaatt ttattatgat attaaagaaa tggcctttta ttttacatct 828 ctcccctttt tccctttccc cctttatttt cctccttttc tttctgaaag tttcctttta 888 tgtccataaa atacaaatat attgttcata aaaaattagt atcccttttg tttggttgct 948 gagtcacctg aaccttaatt ttaattggta attacagccc ctaaaaaaaa cacatttcaa 1008 ataggcttcc cactaaactc tatattttag tgtaaaccag 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agtatgggta 1824 ccttttacaa agagcaatcc aataaatctt aaaaataaca gaaacttagt ctgcaaggta 1884 gaaagtttca gttttaattc tgtattaagc tttactatct cagaggtaca gagggctgga 1944 atatgggcat ttatttccag ttttttcttg actagtaagg cggtcaccat taaaatagac 2004 cagatgataa tgcatgaaga tttacagttg tattgcaaaa cggaaaagat aaaactgtcc 2064 tttgaggaga gtactcgttt tctgggtttt tgttattttt tagtggtaac acaagcctat 2124 agggcattta tagccaccta ttatactgtt tccataagcc tggctacctt ttagggaagc 2184 tattttttct ctttcatttt tactgtcaca gcacatacac acacaccttt ttgttttaaa 2244 ggattaagta ctgtttgaag atcagtggta acagaaaatt tgggagggag aagaagaaat 2304 taagacatga cttgttagaa aattaagact tcagtttcta gaattatctt ttcatcaaga 2364 tttggtagac attgagttta aatggaaagg aaattattta agcctgtgta tgttagatcc 2424 acaatacacc attggtattg aaatataaag gttaaaaaaa aggcttatga cctctttaat 2484 gagataaata tgtatttgtc ttgtaagcag gcagaaaatc tacctctaat tttaacacta 2544 atactttgaa acccacaatc aaatagagtg aattctccaa gttacataag caaggaaaac 2604 attatttgaa atatgccatg ttttcgttgc ctttggacac ctcatcattc 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ctg ctg cct ggc agc ctg gcc ctg ccg 104 Thr Val Leu Cys Ala Val Cys Leu Leu Pro Gly Ser Leu Ala Leu Pro 5 10 15 ctg cct cag gag gcg gga ggc atg agt gag cta cag tgg gaa cag gct 152 Leu Pro Gln Glu Ala Gly Gly Met Ser Glu Leu Gln Trp Glu Gln Ala 20 25 30 35 cag gac tat ctc aag aga ttt tat ctc tat gac tca gaa aca aaa aat 200 Gln Asp Tyr Leu Lys Arg Phe Tyr Leu Tyr Asp Ser Glu Thr Lys Asn 40 45 50 gcc aac agt tta gaa gcc aaa ctc aag gag atg caa aaa ttc ttt ggc 248 Ala Asn Ser Leu Glu Ala Lys Leu Lys Glu Met Gln Lys Phe Phe Gly 55 60 65 cta cct ata act gga atg tta aac tcc cgc gtc ata gaa ata atg cag 296 Leu Pro Ile Thr Gly Met Leu Asn Ser Arg Val Ile Glu Ile Met Gln 70 75 80 aag ccc aga tgt gga gtg cca gat gtt gca gaa tac tca cta ttt cca 344 Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala Glu Tyr Ser Leu Phe Pro 85 90 95 aat agc cca aaa tgg act tcc aaa gtg gtc acc tac agg atc gta tca 392 Asn Ser Pro Lys Trp Thr Ser Lys Val Val Thr Tyr Arg Ile Val Ser 100 105 110 115 tat act cga gac tta ccg cat att 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tat cca acc tat gga aat gga gat ccc caa aat 776 Pro Asn Ala Val Met Tyr Pro Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Pro Gln Asn 230 235 240 ttt aaa ctt tcc cag gat gat att aaa ggc att cag aaa cta tat gga 824 Phe Lys Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Tyr Gly 245 250 255 aag aga agt aat tca aga aag aaa tag aaacttcagg cagaacatcc 871 Lys Arg Ser Asn Ser Arg Lys Lys * 260 265 attcattcat tcattggatt gtatatcatt gttgcacaat cagaattgat aagcactgtt 931 cctccactcc atttagcaat tatgtcaccc ttttttattg cagttggttt ttgaatgtct 991 ttcactcctt ttattggtta aactccttta tggtgtgact gtgtcttatt ccatctatga 1051 gctttgtcag tgcgcgtaga tgtcaataaa tgttacatac acaaataaat aaaatgttta 1111 ttccatggta aattta 1127 <210> 20 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 20 Met Arg Leu Thr Val Leu Cys Ala Val Cys Leu Leu Pro Gly Ser Leu 1 5 10 15 Ala Leu Pro Leu Pro Gln Glu Ala Gly Gly Met Ser Glu Leu Gln Trp 20 25 30 Glu Gln Ala Gln Asp Tyr Leu Lys Arg Phe Tyr Leu Tyr Asp Ser Glu 35 40 45 Thr Lys Asn Ala Asn Ser Leu Glu Ala Lys Leu Lys 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tcc ctc aag ggt ctc cta ggg aat ccc atc tgt tct 1755 Gly Ala Pro Phe Ser Leu Lys Gly Leu Leu Gly Asn Pro Ile Cys Ser 525 530 535 540 ccg gag tac tgg aag ccg agc aca ttt ggc ggc gag gtg ggc ttt aac 1803 Pro Glu Tyr Trp Lys Pro Ser Thr Phe Gly Gly Glu Val Gly Phe Asn 545 550 555 att gtc aag acg gcc aca ctg aag aag ctg gtc tgc ctc aac acc aag 1851 Ile Val Lys Thr Ala Thr Leu Lys Lys Leu Val Cys Leu Asn Thr Lys 560 565 570 acc tgt ccc tac gtt tcc ttc cgt gtg ccg gat gcc agt cag gat gat 1899 Thr Cys Pro Tyr Val Ser Phe Arg Val Pro Asp Ala Ser Gln Asp Asp 575 580 585 ggg cct gct gtg gag cga cca tcc aca gag ctc tga ggggcaggaa 1945 Gly Pro Ala Val Glu Arg Pro Ser Thr Glu Leu * 590 595 agcagcattc tggaggggag agctttgtgc ttgtcattcc agagtgctga ggccagggct 2005 gatggtctta aatgctcatt ttctggtttg gcatggtgag tgttggggtt gacatttaga 2065 actttaagtc tcacccatta tctggaatat tgtgattctg tttattcttc cagaatgctg 2125 aactccttgt tagcccttca gattgttagg agtggttctc atttggtctg ccagaatact 2185 gggttcttag ttgacaacct agaatgtcag atttctggtt gatttgtaac acagtcattc 2245 taggatgtgg agctactgat gaaatctgct agaaagttag ggggttctta ttttgcattc 2305 cagaatcttg actttctgat tggtgattca aagtgttgtg ttcctggctg atgatccaga 2365 acagtggctc gtatcccaaa tctgtcagca tctggctgtc tagaatgtgg atttgattca 2425 ttttcctgtt cagtgagata tcatagagac ggagatccta aggtccaaca agaatgcatt 2485 ccctgaatct gtgcctgcac tgagagggca aggaagtggg gtgttcttct tgggaccccc 2545 actaagaccc tggtctgagg atgtagagag aacaggtggg ctgtattcac gccattggtt 2605 ggaagctacc agagctctat ccccatccag gtcttgactc atggcagctg tttctcatga 2665 agctaataaa attcgctttc taaagttacc tgttatatat ctcttttggt cccatcctct 2725 aaagcagagg caacactgga acatggctag cctttcttgt agccatggct gggcgtgcta 2785 gaggttgcag catgagactt tctgctggga tccttgggcc catcactgta tagacatgct 2845 accactggta cttcctttct ccctgcgggc caggcactgc ccttttcagg aagctctctt 2905 aaaataccca ttgccccaga cctggaagat ataacattca gttcccacca tctgattaaa 2965 acaacttcct cccttacaga gcatacaaca gagggggcac ccggggagga gagcacatac 3025 tgtgttccaa tttcacgctt 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Ser Met Ile Glu Ile Gly Ala Pro Phe Ser 480 485 490 ctc aag ggt ctc cta ggg aat ccc atc tgt tct ccg gag tac tgg aag 1659 Leu Lys Gly Leu Leu Gly Asn Pro Ile Cys Ser Pro Glu Tyr Trp Lys 495 500 505 ccg agc aca ttt ggc ggc gag gtg ggc ttt aac att gtc aag acg gcc 1707 Pro Ser Thr Phe Gly Gly Glu Val Gly Phe Asn Ile Val Lys Thr Ala 510 515 520 aca ctg aag aag ctg gtc tgc ctc aac acc aag acc tgt ccc tac gtt 1755 Thr Leu Lys Lys Leu Val Cys Leu Asn Thr Lys Thr Cys Pro Tyr Val 525 530 535 540 tcc ttc cgt gtg ccg gat gcc agt cag gat gat ggg cct gct gtg gag 1803 Ser Phe Arg Val Pro Asp Ala Ser Gln Asp Asp Gly Pro Ala Val Glu 545 550 555 cga cca tcc aca gag ctc tga ggggcaggaa agcagcattc tggaggggag 1854 Arg Pro Ser Thr Glu Leu * 560 agctttgtgc ttgtcattcc agagtgctga ggccagggct gatggtctta aatgctcatt 1914 ttctggtttg gcatggtgag tgttggggtt gacatttaga actttaagtc tcacccatta 1974 tctggaatat tgtgattctg tttattcttc cagaatgctg aactccttgt tagcccttca 2034 gattgttagg agtggttctc atttggtctg ccagaatact gggttcttag 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acc tgc act ggc tgc agg ggg gtc gcc 1171 Val Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Cys Thr Gly Cys Arg Gly Val Ala 345 350 355 cac tac atc ctg cag acc ttc ctg agc ctg gca gtg ggt gca ctc act 1219 His Tyr Ile Leu Gln Thr Phe Leu Ser Leu Ala Val Gly Ala Leu Thr 360 365 370 ggg gac gct gtc ctg cat ctg acg ccc aag gtg ctg ggg ctg cat aca 1267 Gly Asp Ala Val Leu His Leu Thr Pro Lys Val Leu Gly Leu His Thr 375 380 385 cac agc gaa gag ggc ctc agc cca cag ccc acc tgg cgc ctc ctg gct 1315 His Ser Glu Glu Gly Leu Ser Pro Gln Pro Thr Trp Arg Leu Leu Ala 390 395 400 405 atg ctg gcc ggg ctc tac gcc ttc ttc ctg ttt gag aac ctc ttc aat 1363 Met Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Phe Phe Leu Phe Glu Asn Leu Phe Asn 410 415 420 ctc ctg ctg ccc agg gac ccg gag gac ctg gag gac ggg ccc tgc ggc 1411 Leu Leu Leu Pro Arg Asp Pro Glu Asp Leu Glu Asp Gly Pro Cys Gly 425 430 435 cac agc agc cat agc cac ggg ggc cac agc cac ggt gtg tcc ctg cag 1459 His Ser Ser His Ser His Gly Gly His Ser His Gly Val Ser Leu Gln 440 445 450 ctg gca 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tgg ctc ctc ttc ctg ctg cac aac gtg ggc 1699 Val Arg Asp Pro Arg Pro Trp Leu Leu Phe Leu Leu His Asn Val Gly 520 525 530 ctg ctg ggc ggc tgg acc gtc ctg ctg ctg ctg tcc ctg tac gag gat 1747 Leu Leu Gly Gly Trp Thr Val Leu Leu Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Asp 535 540 545 gac atc acc ttc tga taccctgccc tagtccccca cctttgactt aagatcccac 1802 Asp Ile Thr Phe * 550 acctcacaaa cctacagccc agaaaccaga agcccctata gaggccccag tcccaactcc 1862 agtaaagaca ctcttgtcct tggaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1910 <210> 32 <211> 553 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 32 Met Ala Ser Leu Val Ser Leu Glu Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu 1 5 10 15 Val Val Thr Ala Thr Ala Ser Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ser Leu Leu 20 25 30 Thr Ser Gly Gln Gly Ala Leu Asp Gln Glu Ala Leu Gly Gly Leu Leu 35 40 45 Asn Thr Leu Ala Asp Arg Val His Cys Ala Asn Gly Pro Cys Gly Lys 50 55 60 Ala Cys Val Asp Ile Pro Gln Leu Leu Glu Glu Ala Val Gly Ala Gly 65 70 75 80 Ala Pro Gly Ser Ala Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Leu Asp His Val 85 90 95 Arg Ser Gly Ser 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Val Arg Asp Pro Arg Pro Trp Leu Leu Phe Leu 515 520 525 Leu His Asn Val Gly Leu Leu Gly Gly Trp Thr Val Leu Leu Leu Leu 530 535 540 Ser Leu Tyr Glu Asp Asp Ile Thr Phe 545 550 <210> 33 <211> 598 <212> DNA <213> Homo sapien <220> <221> CDS <222> (23)...(421) <400> 33 cagagtcact cctgccttca cc atg aag tcc agc ggc ctc ttc ccc ttc ctg 52 Met Lys Ser Ser Gly Leu Phe Pro Phe Leu 1 5 10 gtg ctg ctt gcc ctg gga act ctg gca cct tgg gct gtg gaa ggc tct 100 Val Leu Leu Ala Leu Gly Thr Leu Ala Pro Trp Ala Val Glu Gly Ser 15 20 25 gga aag tcc ttc aaa gct gga gtc tgt cct cct aag aaa tct gcc cag 148 Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala Gln 30 35 40 tgc ctt aga tac aag aaa cct gag tgc cag agt gac tgg cag tgt cca 196 Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys Pro 45 50 55 ggg aag aag aga tgt tgt cct gac act tgt ggc atc aaa tgc ctg gat 244 Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu Asp 60 65 70 cct gtt gac acc cca aac cca aca agg agg aag cct ggg 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ctc cgc gtg gag ggc gac ccc gac ttc tac aag 243 Tyr Thr Glu Phe Ser Leu Arg Val Glu Gly Asp Pro Asp Phe Tyr Lys 60 65 70 ccg gga acc agc tac cgc gta aca ctt tca gct gct cct ccc tcc tac 291 Pro Gly Thr Ser Tyr Arg Val Thr Leu Ser Ala Ala Pro Pro Ser Tyr 75 80 85 ttc aga gga ttc aca tta att gcc ctc aga gag aac aga gag ggt gat 339 Phe Arg Gly Phe Thr Leu Ile Ala Leu Arg Glu Asn Arg Glu Gly Asp 90 95 100 105 aag gaa gaa gac cat gct ggg acc ttc cag atc ata gac gaa gaa gaa 387 Lys Glu Glu Asp His Ala Gly Thr Phe Gln Ile Ile Asp Glu Glu Glu 110 115 120 act cag ttt atg agc aat tgc cct gtt gca gtc act gaa agc act cca 435 Thr Gln Phe Met Ser Asn Cys Pro Val Ala Val Thr Glu Ser Thr Pro 125 130 135 cgg agg agg acc cgg atc cag gtg ttt tgg ata gca cca cca gcg gga 483 Arg Arg Arg Thr Arg Ile Gln Val Phe Trp Ile Ala Pro Pro Ala Gly 140 145 150 aca ggc tgc gtg att ctg aag gcc agc atc gta caa aaa cgc att att 531 Thr Gly Cys Val Ile Leu Lys Ala Ser Ile Val Gln Lys Arg Ile Ile 155 160 165 tat ttt caa gat gag ggc tct ctg acc aag aaa ctt tgt gaa caa gat 579 Tyr Phe Gln Asp Glu Gly Ser Leu Thr Lys Lys Leu Cys Glu Gln Asp 170 175 180 185 tcc aca ttt gat ggg gtg act gac aaa ccc atc tta gac tgc tgt gcc 627 Ser Thr Phe Asp Gly Val Thr Asp Lys Pro Ile Leu Asp Cys Cys Ala 190 195 200 tgc gga act gcc aag tac aga ctc aca ttt tat ggg aat tgg tcc gag 675 Cys Gly Thr Ala Lys Tyr Arg Leu Thr Phe Tyr Gly Asn Trp Ser Glu 205 210 215 aag aca cac cca aag gat tac cct cgt cgg gcc aac cac tgg tct gcg 723 Lys Thr His Pro Lys Asp Tyr Pro Arg Arg Ala Asn His Trp Ser Ala 220 225 230 atc atc gga gga tcc cac tcc aag aat tat gta ctg tgg gaa tat gga 771 Ile Ile Gly Gly Ser His Ser Lys Asn Tyr Val Leu Trp Glu Tyr Gly 235 240 245 gga tat gcc agc gaa ggc gtc aaa caa gtt gca gaa ttg ggc tca ccc 819 Gly Tyr Ala Ser Glu Gly Val Lys Gln Val Ala Glu Leu Gly Ser Pro 250 255 260 265 gtg aaa atg gag gaa gaa att cga caa cag agt gat gag gtc ctc acc 867 Val Lys Met Glu Glu Glu Ile Arg Gln Gln Ser Asp Glu Val Leu Thr 270 275 280 gtc atc aaa gcc aaa gcc caa tgg cca gcc tgg cag cct ctc aac gtg 915 Val Ile Lys Ala Lys Ala Gln Trp Pro Ala Trp Gln Pro Leu Asn Val 285 290 295 aga gca gca cct tca gct gaa ttt tcc gtg gac aga acg cgc cat tta 963 Arg Ala Ala Pro Ser Ala Glu Phe Ser Val Asp Arg Thr Arg His Leu 300 305 310 atg tcc ttc ctg acc atg atg ggc cct agt ccc gac tgg aac gta ggc 1011 Met Ser Phe Leu Thr Met Met Gly Pro Ser Pro Asp Trp Asn Val Gly 315 320 325 tta tct gca gaa gat ctg tgc acc aag gaa tgt ggc tgg gtc cag aag 1059 Leu Ser Ala Glu Asp Leu Cys Thr Lys Glu Cys Gly Trp Val Gln Lys 330 335 340 345 gtg gtg caa gac ctg att ccc tgg gac gct ggc acc gac agc ggg gtg 1107 Val Val Gln Asp Leu Ile Pro Trp Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Val 350 355 360 acc tat gag tca ccc aac aaa ccc acc att ccc cag gag aaa atc cgg 1155 Thr Tyr Glu Ser Pro Asn Lys Pro Thr Ile Pro Gln Glu Lys Ile Arg 365 370 375 ccc ctg acc agc ctg gac cat cct cag agt cct ttc tat gac cca gag 1203 Pro Leu Thr Ser Leu Asp His Pro Gln Ser Pro Phe Tyr Asp Pro 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Met Met Pro Glu Cys His Thr Ile Pro Cys Leu Leu 605 610 615 tcc cca tgg tcc gag tgg agt gac tgc agc gtg acc tgc ggg aag ggc 1923 Ser Pro Trp Ser Glu Trp Ser Asp Cys Ser Val Thr Cys Gly Lys Gly 620 625 630 atg cga acc cga cag cgg atg ctc aag tct ctg gca gaa ctt gga gac 1971 Met Arg Thr Arg Gln Arg Met Leu Lys Ser Leu Ala Glu Leu Gly Asp 635 640 645 tgc aat gag gat ctg gag cag gtg gag aag tgc atg ctc cct gaa tgc 2019 Cys Asn Glu Asp Leu Glu Gln Val Glu Lys Cys Met Leu Pro Glu Cys 650 655 660 665 ccc att gac tgt gag ctc acc gag tgg tcc cag tgg tcg gaa tgt aac 2067 Pro Ile Asp Cys Glu Leu Thr Glu Trp Ser Gln Trp Ser Glu Cys Asn 670 675 680 aag tca tgt ggg aaa ggc cac gtg att cga acc cgg atg atc caa atg 2115 Lys Ser Cys Gly Lys Gly His Val Ile Arg Thr Arg Met Ile Gln Met 685 690 695 gag cct cag ttt gga ggt gca ccc tgc cca gag act gtg cag cga aaa 2163 Glu Pro Gln Phe Gly Gly Ala Pro Cys Pro Glu Thr Val Gln Arg Lys 700 705 710 aag tgc cgc atc cga aaa tgc ctt cga aat cca tcc atc caa aag cca 2211 Lys Cys Arg Ile Arg Lys Cys Leu Arg Asn Pro Ser Ile Gln Lys Pro 715 720 725 cgc tgg agg gag gcc cga gag agc cgg cgg agt gag cag ctg aag gaa 2259 Arg Trp Arg Glu Ala Arg Glu Ser Arg Arg Ser Glu Gln Leu Lys Glu 730 735 740 745 gag tct gaa ggg gag cag ttc cca ggt tgt agg atg cgc cca tgg acg 2307 Glu Ser Glu Gly Glu Gln Phe Pro Gly Cys Arg Met Arg Pro Trp Thr 750 755 760 gcc tgg tca gaa tgc acc aaa ctg tgc gga ggt gga att cag gaa cgt 2355 Ala Trp Ser Glu Cys Thr Lys Leu Cys Gly Gly Gly Ile Gln Glu Arg 765 770 775 tac atg act gta aag aag aga ttc aaa agc tcc cag ttt acc agc tgc 2403 Tyr Met Thr Val Lys Lys Arg Phe Lys Ser Ser Gln Phe Thr Ser Cys 780 785 790 aaa gac aag aag gag atc aga gca tgc aat gtt cat cct tgt tag 2448 Lys Asp Lys Lys Glu Ile Arg Ala Cys Asn Val His Pro Cys * 795 800 805 caagggtacg agttccccag ggctgcactc tagattccag agtcaccaat ggctggatta 2508 tttgcttgtt taagacaatt taaattgtgt acgctagttt tcatttttgc agtgtggttc 2568 gcccagtagt cttgtggatg ccagagacat cctttctgaa tacttcttga tgggtacagg 2628 ctgagtgggg cgccctcacc tccagccagc ctcttcctgc agaggagtag tgtcagccac 2688 cttgtactaa gctgaaacat gtccctctgg agcttccacc tggccaggga ggacggagac 2748 tttgacctac tccacatgga gaggcaacca tgtctggaag tgactatgcc tgagtcccag 2808 ggtgcggcag gtaggaaaca ttcacagatg aagacagcag attccccaca ttctcatctt 2868 tggcctgttc aatgaaacca ttgtttgccc atctcttctt agtggaactt taggtctctt 2928 ttcaagtctc ctcagtcatc aatagttcct ggggaaaaac agagctggta gacttgaaga 2988 ggagcattga tgttgggtgg cttttgttct ttcactgaga aattcggaat acatttgtct 3048 cacccctgat attggttcct gatgccccag c 3079 <210> 36 <211> 807 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 36 Met Arg Leu Ser Pro Ala Pro Leu Lys Leu Ser Arg Thr Pro Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ala Leu Pro Leu Ala Ala Ala Leu Ala Phe Ser Asp Glu 20 25 30 Thr Leu Asp Lys Val Pro Lys Ser Glu Gly Tyr Cys Ser Arg Ile Leu 35 40 45 Arg Ala Gln Gly Thr Arg Arg Glu Gly Tyr Thr Glu Phe Ser Leu Arg 50 55 60 Val Glu Gly Asp Pro Asp Phe Tyr Lys Pro Gly Thr Ser Tyr Arg Val 65 70 75 80 Thr Leu Ser Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Phe Arg Gly Phe Thr Leu Ile 85 90 95 Ala Leu Arg Glu Asn Arg Glu Gly Asp Lys Glu Glu Asp His Ala Gly 100 105 110 Thr Phe Gln Ile Ile Asp Glu Glu Glu Thr Gln Phe Met Ser Asn Cys 115 120 125 Pro Val Ala Val Thr Glu Ser Thr Pro Arg Arg Arg Thr Arg Ile Gln 130 135 140 Val Phe Trp Ile Ala Pro Pro Ala Gly Thr Gly Cys Val Ile Leu Lys 145 150 155 160 Ala Ser Ile Val Gln Lys Arg Ile Ile Tyr Phe Gln Asp Glu Gly Ser 165 170 175 Leu Thr Lys Lys Leu Cys Glu Gln Asp Ser Thr Phe Asp Gly Val Thr 180 185 190 Asp Lys Pro Ile Leu Asp Cys Cys Ala Cys Gly Thr Ala Lys Tyr Arg 195 200 205 Leu Thr Phe Tyr Gly Asn Trp Ser Glu Lys Thr His Pro Lys Asp Tyr 210 215 220 Pro Arg Arg Ala Asn His Trp Ser Ala Ile Ile Gly Gly Ser His Ser 225 230 235 240 Lys Asn Tyr Val Leu Trp Glu Tyr Gly Gly Tyr Ala Ser Glu Gly Val 245 250 255 Lys Gln Val Ala Glu Leu Gly Ser Pro Val Lys Met Glu Glu Glu Ile 260 265 270 Arg Gln Gln Ser Asp Glu Val Leu Thr Val Ile Lys Ala Lys Ala Gln 275 280 285 Trp Pro Ala Trp Gln Pro Leu Asn Val Arg Ala Ala Pro Ser Ala Glu 290 295 300 Phe Ser Val Asp Arg Thr Arg His Leu Met Ser Phe Leu Thr Met Met 305 310 315 320 Gly Pro Ser Pro Asp Trp Asn Val Gly Leu Ser Ala Glu Asp Leu Cys 325 330 335 Thr Lys Glu Cys Gly Trp Val Gln Lys Val Val Gln Asp Leu Ile Pro 340 345 350 Trp Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Val Thr Tyr Glu Ser Pro Asn Lys 355 360 365 Pro Thr Ile Pro Gln Glu Lys Ile Arg Pro Leu Thr Ser Leu Asp His 370 375 380 Pro Gln Ser Pro Phe Tyr Asp Pro Glu Gly Gly Ser Ile Thr Gln Val 385 390 395 400 Ala Arg Val Val Ile Glu Arg Ile Ala Arg Lys Gly Glu Gln Cys Asn 405 410 415 Ile Val Pro Asp Asn Val Asp Asp Ile Val Ala Asp Leu Ala Pro Glu 420 425 430 Glu Lys Asp Glu Asp Asp Thr Pro Glu Thr Cys Ile Tyr Ser Asn Trp 435 440 445 Ser Pro Trp Ser Ala Cys Ser Ser Ser Thr Cys Asp Lys Gly Lys Arg 450 455 460 Met Arg Gln Arg Met Leu Lys Ala Gln Leu Asp Leu Ser Val Pro Cys 465 470 475 480 Pro Asp Thr Gln Asp Phe Gln Pro Cys Met Gly Pro Gly Cys Ser Asp 485 490 495 Glu Asp Gly Ser Thr Cys Thr Met Ser Glu Trp Ile Thr Trp Ser Pro 500 505 510 Cys Ser Ile Ser Cys Gly Met Gly Met Arg Ser Arg Glu Arg Tyr Val 515 520 525 Lys Gln Phe Pro Glu Asp Gly Ser Val Cys Thr Leu Pro Thr Glu Glu 530 535 540 Met Glu Lys Cys Thr Val Asn Glu Glu Cys Ser Pro Ser Ser Cys Leu 545 550 555 560 Met Thr Glu Trp Gly Glu Trp Asp Glu Cys Ser Ala Thr Cys Gly Met 565 570 575 Gly Met Lys Lys Arg His Arg Met Ile Lys Met Asn Pro Ala Asp Gly 580 585 590 Ser Met Cys Lys Ala Glu Thr Ser Gln Ala Glu Lys Cys Met Met Pro 595 600 605 Glu Cys His Thr Ile Pro Cys Leu Leu Ser Pro Trp Ser Glu Trp Ser 610 615 620 Asp Cys Ser Val Thr Cys Gly Lys Gly Met Arg Thr Arg Gln Arg Met 625 630 635 640 Leu Lys Ser Leu Ala Glu Leu Gly Asp Cys Asn Glu Asp Leu Glu Gln 645 650 655 Val Glu Lys Cys Met Leu Pro Glu Cys Pro Ile Asp Cys Glu Leu Thr 660 665 670 Glu Trp Ser Gln Trp Ser Glu Cys Asn Lys Ser Cys Gly Lys Gly His 675 680 685 Val Ile Arg Thr Arg Met Ile Gln Met Glu Pro Gln Phe Gly Gly Ala 690 695 700 Pro Cys Pro Glu Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Arg Ile Arg Lys Cys 705 710 715 720 Leu Arg Asn Pro Ser Ile Gln Lys Pro Arg Trp Arg Glu Ala Arg Glu 725 730 735 Ser Arg Arg Ser Glu Gln Leu Lys Glu Glu Ser Glu Gly Glu Gln Phe 740 745 750 Pro Gly Cys Arg Met Arg Pro Trp Thr Ala Trp Ser Glu Cys Thr Lys 755 760 765 Leu Cys Gly Gly Gly Ile Gln Glu Arg Tyr Met Thr Val Lys Lys Arg 770 775 780 Phe Lys Ser Ser Gln Phe Thr Ser Cys Lys Asp Lys Lys Glu Ile Arg 785 790 795 800 Ala Cys Asn Val His Pro Cys 805 <210> 37 <211> 2805 <212> DNA <213> Homo sapien <220> <221> CDS <222> (616)...(1587) <400> 37 cgggtctgat agtccctacc tgtcaggact ggtgttagga tgagataatg tttgtgaact 60 gtaaacatat ataaacgtgt gctactgtga gaactggaac aaagaagaga gggagtgaga 120 gaaatcaagg gagggctggg gctgggaaag aacgaaaagg gagtcgcgta tagaggagag 180 gcgacagtcg cgagccacac tttgcaatga aactctttag actttctgcc gggagagcgg 240 cccagacgcg ccaggtctgt agcaggaggc cgcgagggcg ggtccccaga agcctacagg 300 tgagtatcgg ttctcccctt cccggctttc ggtccggagg aggcgggagc agcttccctg 360 ttctgatcct atcgcgggcg gcgcagggcc ggcttggcct tccgtgggac ggggaggggg 420 gcgggatgtg tcacccaaat accagtgggg acggtcggtg gtggaaccag ccgggcaggt 480 cgggtagagt ataagagccg gagggagcgg ccggggcgca gacgcctgca gaccatccca 540 gacgccggag cccgagcccc gacgagtccc cgcgcctcat ccgcccgcgt ccggtccgcg 600 ttcctccgcc ccacc atg gct cgg ggc ccc ggc ctc gcg ccg cca ccg ctg 651 Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu 1 5 10 cgg ctg ccg ctg ctg ctg ctg gtg ctg gcg gcg gtg acc ggc cac acg 699 Arg Leu Pro Leu Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr 15 20 25 gcc gcg cag gac aac tgc acg tgt ccc acc aac aag atg acc gtg tgc 747 Ala Ala Gln Asp Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys 30 35 40 agc ccc gac ggc ccc ggc ggc cgc tgc cag tgc cgc gcg ctg ggc tcg 795 Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser 45 50 55 60 ggc atg gcg gtc gac tgc tcc acg ctg acc tcc aag tgt ctg ctg ctc 843 Gly Met Ala Val Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu 65 70 75 aag gcg cgc atg agc gcc ccc aag aac gcc cgc acg ctg gtg cgg ccg 891 Lys Ala Arg Met Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro 80 85 90 agt gag cac gcg ctc gtg gac aac gat ggc ctc tac gac ccc gac tgc 939 Ser Glu His Ala Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys 95 100 105 gac ccc gag ggc cgc ttc aag gcg cgc cag tgc aac cag acg tcg gtg 987 Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val 110 115 120 tgc tgg tgc gtg aac tcg gtg ggc gtg cgc cgc acg gac aag ggc gac 1035 Cys Trp Cys Val Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp 125 130 135 140 ctg agc cta cgc tgc gat gag ctg gtg cgc acc cac cac atc ctc att 1083 Leu Ser Leu Arg Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile 145 150 155 gac ctg cgc cac cgc ccc acc gcc ggc gcc ttc aac cac tca gac ctg 1131 Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu 160 165 170 gac gcc gag ctg agg cgg ctc ttc cgc gag cgc tat cgg ctg cac ccc 1179 Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro 175 180 185 aag ttc gtg gcg gcc gtg cac tac gag cag ccc acc atc cag atc gag 1227 Lys Phe Val Ala Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu 190 195 200 ctg cgg cag aac acg tct cag aag gcc gcc ggt gaa gtg gat atc ggc 1275 Leu Arg Gln Asn Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Glu Val Asp Ile Gly 205 210 215 220 gat gcc gcc tac tac ttc gag agg gac atc aag ggc gag tct cta ttc 1323 Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe 225 230 235 cag ggc cgc ggc ggc ctg gac ttg cgc gtg cgc gga gaa ccc ctg cag 1371 Gln Gly Arg Gly Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln 240 245 250 gtg gag cgc acg ctc atc tat tac ctg gac gag att ccc ccg aag ttc 1419 Val Glu Arg Thr Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe 255 260 265 tcc atg aag cgc ctc acc gcc ggc ctc atc gcc gtc atc gtg gtg gtc 1467 Ser Met Lys Arg Leu Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val 270 275 280 gtg gtg gcc ctc gtc gcc ggc atg gcc gtc ctg gtg atc acc aac cgg 1515 Val Val Ala Leu Val Ala Gly Met Ala Val Leu Val Ile Thr Asn Arg 285 290 295 300 aga aag tcg ggg aag tac aag aag gtg gag atc aag gaa ctg ggg gag 1563 Arg Lys Ser Gly Lys Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Glu 305 310 315 ttg aga aag gaa ccg agc ttg tag gtacccggcg gggcagggga tggggtgggg 1617 Leu Arg Lys Glu Pro Ser Leu * 320 taccggattt cggtatcgtc ccagacccaa gtgagtcacg cttcctgatt cctcggcgca 1677 aaggagacgt ttatcctttc aaattcctgc cttccccctc ccttttgcgc acacaccagg 1737 tttaatagat cctggcctca gggtctcctt tctttctcac ttctgtcttg agggaagcat 1797 ttctaaaatg tatccccttt cggtccaaca acaggaaacc tgactggggc agtgaaggaa 1857 gggatggcac agcgttatgt gtaaaaaaca agtatctgta tgacaacccg ggatcgtttg 1917 caagtaactg aatccattgc gacattgtga aggcttaaat gagtttagat gggaaatagc 1977 gttgttatcg ccttgggttt aaattatttg atgagttcca cttgtatcat ggcctacccg 2037 aggagaagag gagtttgtta actgggccta tgtagtagcc tcatttacca tcgtttgtat 2097 tactgaccac atatgcttgt cactgggaaa gaagcctgtt tcagctgcct gaacgcagtt 2157 tggatgtctt tgaggacaga cattgcccgg aaactcagtc tatttattct tcagcttgcc 2217 cttactgcca ctgatattgg taatgttctt ttttgtaaaa tgtttgtaca tatgttgtct 2277 ttgataatgt tgctgtaatt ttttaaaata aaacacgaat ttaataaaat atgggaaagg 2337 cacaaaccag aagtcggcat ttgtgaaaag tccctccaga tttctatcac tttggtctct 2397 aatttcccaa gacttgtatt ttttttttat ttcaaattat aacacttttt tttcccccag 2457 aagtgggtgt ttcatgttgc tactctggtg tgtcccaaga tatcctaact ggccagtgta 2517 aatgctattc tttctaaata agattatttg gaaacttcct tcaaactgca ggagggcgag 2577 ctctgagggc acgagaagct aaaactagct gcttttgatg aaaaagagtg ccagtctttg 2637 gtcatctcta aacaaggctt atcaccaatg gagacagaaa actctagttc aagagctgta 2697 cctcctttga atcccagccc tactcgaaat aagtggtact atttccattt agcctttgag 2757 caaatcactt aactcaaagg cgttgtggct ctaagattaa acgacttt 2805 <210> 38 <211> 323 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 38 Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp 20 25 30 Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly 35 40 45 Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val 50 55 60 Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met 65 70 75 80 Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala 85 90 95 Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly 100 105 110 Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val 115 120 125 Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg 130 135 140 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 145 150 155 160 Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu 165 170 175 Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala 180 185 190 Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 195 200 205 Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Glu Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr 210 215 220 Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly 225 230 235 240 Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr 245 250 255 Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg 260 265 270 Leu Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu 275 280 285 Val Ala Gly Met Ala Val Leu Val Ile Thr Asn Arg Arg Lys Ser Gly 290 295 300 Lys Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Glu Leu Arg Lys Glu 305 310 315 320 Pro Ser Leu <210> 39 <211> 590 <212> DNA <213> Homo sapien <220> <221> CDS <222> (28)...(402) <400> 39 acctgcaccc cgcccgggca tagcacc atg cct gct tgt cgc cta ggc ccg cta 54 Met Pro Ala Cys Arg Leu Gly Pro Leu 1 5 gcc gcc gcc ctc ctc ctc agc ctg ctg ctg ttc ggc ttc acc cta gtc 102 Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Leu Val 10 15 20 25 tca ggc aca gga gca gag aag act ggc gtg tgc ccc gag ctc cag gct 150 Ser Gly Thr Gly Ala Glu Lys Thr Gly Val Cys Pro Glu Leu Gln Ala 30 35 40 gac cag aac tgc acg caa gag tgc gtc tcg gac agc gaa tgc gcc gac 198 Asp Gln Asn Cys Thr Gln Glu Cys Val Ser Asp Ser Glu Cys Ala Asp 45 50 55 aac ctc aag tgc tgc agc gcg ggc tgt gcc acc ttc tgc tct ctg ccc 246 Asn Leu Lys Cys Cys Ser Ala Gly Cys Ala Thr Phe Cys Ser Leu Pro 60 65 70 aat gat aag gag ggt tcc tgc ccc cag gtg aac att aac ttt ccc cag 294 Asn Asp Lys Glu Gly Ser Cys Pro Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln 75 80 85 ctc ggc ctc tgt cgg gac cag tgc cag gtg gac agc cag tgt cct ggc 342 Leu Gly Leu Cys Arg Asp Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Cys Pro Gly 90 95 100 105 cag atg aaa tgc tgc cgc aat ggc tgt ggg aag gtg tcc tgt gtc act 390 Gln Met Lys Cys Cys Arg Asn Gly Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr 110 115 120 ccc aat ttc tga gctccagcca ccaccaggct gagcagtgag gagagaaagt 442 Pro Asn Phe * ttctgcctgg ccctgcatct ggttccagcc cacctgccct cccctttttc gggactctgt 502 attccctctt gggctgacca cagcttctcc ctttcccaac caataaagta accactttca 562 gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 590 <210> 40 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 40 Met Pro Ala Cys Arg Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Leu Val Ser Gly Thr Gly Ala Glu Lys 20 25 30 Thr Gly Val Cys Pro Glu Leu Gln Ala Asp Gln Asn Cys Thr Gln Glu 35 40 45 Cys Val Ser Asp Ser Glu Cys Ala Asp Asn Leu Lys Cys Cys Ser Ala 50 55 60 Gly Cys Ala Thr Phe Cys Ser Leu Pro Asn Asp Lys Glu Gly Ser Cys 65 70 75 80 Pro Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp Gln 85 90 95 Cys Gln Val Asp Ser Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg Asn 100 105 110 Gly Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe 115 120 <210> 41 <211> 450 <212> DNA <213> Homo sapien <220> <221> CDS <222> (67)...(288) <400> 41 cccaagatgg actcaggcag gcagctctgc tgtatgtgaa gcccagtgag gggcagtggg 60 ggggcc atg ctg cag gta caa gtt aat ctc cct gta tcg cct ctg ccc 108 Met Leu Gln Val Gln Val Asn Leu Pro Val Ser Pro Leu Pro 1 5 10 act tac cct tac tcc ttt ttc tac cca gat aag gag ggt tcc tgc ccc 156 Thr Tyr Pro Tyr Ser Phe Phe Tyr Pro Asp Lys Glu Gly Ser Cys Pro 15 20 25 30 cag gtg aac att aac ttt ccc cag ctc ggc ctc tgt cgg gac cag tgc 204 Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp Gln Cys 35 40 45 cag gtg gac agc cag tgt cct ggc cag atg aaa tgc tgc cgc aat ggc 252 Gln Val Asp Ser Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg Asn Gly 50 55 60 tgt ggg aag gtg tcc tgt gtc act ccc aat ttc tga ggtccagcca 298 Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe * 65 70 ccaccaggct gagcagtgag gagagaaagt ttctgcctgg ccctgcatct ggttccagcc 358 cacctgccct cccctttttc gggactctgt attccctctt gggctgacca cagcttctcc 418 ctttcccaac caataaagta accactttca gc 450 <210> 42 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 42 Met Leu Gln Val Gln Val Asn Leu Pro Val Ser Pro Leu Pro Thr Tyr 1 5 10 15 Pro Tyr Ser Phe Phe Tyr Pro Asp Lys Glu Gly Ser Cys Pro Gln Val 20 25 30 Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp Gln Cys Gln Val 35 40 45 Asp Ser Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg Asn Gly Cys Gly 50 55 60 Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe 65 70 <210> 43 <211> 705 <212> DNA <213> Homo sapien <220> <221> CDS <222> (339)...(626) <400> 43 ctgccgcccg cccagacgcc agcaagcccc cctcccacga cagggctgct ccgggagctt 60 cggagacccg ccccgggcct gagcgcaggc tgcctccggg accccacggc tgtccggacg 120 tgccatgggc gcgcagctgc cgggcaacgt gttgtgtaag tgaacatctg ggaggtaaac 180 actacacgtg aagagtggtg aaagggaaca ttgattactg aagtgccctg gagagggaaa 240 gcactggtca acatcacatg gacaaatttc attgttttct aaagatggcc tggaagtagt 300 ctttgccact gcttcctcca caaacagctc ttcataac atg ggc tgc atg aaa tca 356 Met Gly Cys Met Lys Ser 1 5 aag caa act ttc cca ttt cct acc ata tat gaa ggt gag aag cag cat 404 Lys Gln Thr Phe Pro Phe Pro Thr Ile Tyr Glu Gly Glu Lys Gln His 10 15 20 gag agt gaa gaa ccc ttt atg cca gaa gag aga tgt cta cct agg atg 452 Glu Ser Glu Glu Pro Phe Met Pro Glu Glu Arg Cys Leu Pro Arg Met 25 30 35 gct tct cca gtt aat gtc aaa gag gaa gtg aag gaa cct cca ggg acc 500 Ala Ser Pro Val Asn Val Lys Glu Glu Val Lys Glu Pro Pro Gly Thr 40 45 50 aat att gtg atc ttg gaa tat gca cac cgc ctg tct cag gat atc ttg 548 Asn Ile Val Ile Leu Glu Tyr Ala His Arg Leu Ser Gln Asp Ile Leu 55 60 65 70 tgt gat gcc ttg cag caa tgg gca tgc aat aac atc aag tac cat gac 596 Cys Asp Ala Leu Gln Gln Trp Ala Cys Asn Asn Ile Lys Tyr His Asp 75 80 85 att cca tac att gag agt gag ggg cct tga ggctgtagga tgacaacact 646 Ile Pro Tyr Ile Glu Ser Glu Gly Pro * 90 95 ttgactgtgg aggtgctagt ttgaataaat gtgacaaaag caaaaaaaaa aaaaaaaaa 705 <210> 44 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 44 Met Gly Cys Met Lys Ser Lys Gln Thr Phe Pro Phe Pro Thr Ile Tyr 1 5 10 15 Glu Gly Glu Lys Gln His Glu Ser Glu Glu Pro Phe Met Pro Glu Glu 20 25 30 Arg Cys Leu Pro Arg Met Ala Ser Pro Val Asn Val Lys Glu Glu Val 35 40 45 Lys Glu Pro Pro Gly Thr Asn Ile Val Ile Leu Glu Tyr Ala His Arg 50 55 60 Leu Ser Gln Asp Ile Leu Cys Asp Ala Leu Gln Gln Trp Ala Cys Asn 65 70 75 80 Asn Ile Lys Tyr His Asp Ile Pro Tyr Ile Glu Ser Glu Gly Pro 85 90 95

Claims (37)

  1. a) 환자 샘플에서 표 1에 나열된 마커로 이루어진 군 중에서 선택되는 마커의 발현 수준을 결정하고;
    b) 난소암 또는 난소 종양에 걸리지 않은 대조 피험자로부터의 샘플에서 마커의 발현 수준을 결정하고;
    c) 환자 샘플 및 대조 피험자로부터의 샘플 내의 마커의 발현 수준을 비교하는, 여기서 환자 샘플 및 대조 피험자로부터의 샘플 내의 마커의 발현 수준의 유의한 차이는 환자가 유방암에 걸렸음을 나타내는 단계를 포함하는, 환자가 난소암에 걸렸는지 평가하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 대조 피험자로부터의 발현 수준이 비암성인 것으로 보이는 상기 환자로부터의 난소 세포로부터 결정되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 대조 피험자로부터의 발현 수준이 난소암에 걸리지 않은 피험자 집단으로부터의 발현 수준의 평균을 이용하여 예비결정되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 마커가 분비된 단백질에 대응하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 마커가 전사된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 일부에 대응하 고, 상기 폴리뉴클레오티드는 마커를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 샘플이 환자로부터 얻은 세포를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 세포가 혈액, 림프, 복수, 부인과 유체, 낭액, 뇨 및 복막 세정에 의해 수집된 유체로 이루어진 군 중에서 선택된 유체 중에 존재하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 샘플 내의 마커의 발현 수준이 마커에 대응하는 단백질의 샘플 내 존재를 검출함으로써 평가되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 단백질의 존재가 단백질과 특이적으로 결합하는 시약을 사용하여 검출되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 시약이 항체, 항체 유도체 및 항체 단편으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 샘플 내의 마커의 발현 수준이 전사된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 일부의 샘플 내 존재를 검출함으로써 평가되고, 상기 전사된 폴리뉴클레오티드는 마커를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 전사된 폴리뉴클레오티드가 mRNA 또는 cDNA인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 검출 단계가 전사된 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 샘플 내의 마커의 발현 수준이 엄격한 혼성화 조건 하에 마커와 어닐링하는 또는 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 일부와 어닐링하는 전사된 폴리뉴클레오티드의 샘플 내 존재를 검출함으로써 평가되는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 샘플 내의 마커의 발현 수준이 난소암에 걸리지 않은 환자의 마커의 정상 발현 수준과 적어도 약 2 배로 상이한 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 샘플 내의 마커의 발현 수준이 난소암에 걸리지 않은 환자의 마커의 정상 발현 수준과 적어도 약 5 배로 상이한 것인 방법.
  17. a) 표 1에 나열된 마커로부터 독립적으로 선택된 다수의 마커 각각의 샘플 내 발현 수준을 결정하고;
    b) 난소암에 걸리지 않은 대조 피험자로부터의 샘플에서 다수의 마커 각각의 발현 수준을 결정하고;
    c) 환자 샘플 내 및 대조 피험자로부터의 샘플 내의 마커의 발현 수준을 비교하는, 여기서 하나 이상의 마커의 발현 수준이 마커 발현의 대응하는 대조 수준에 비해 상당히 변경된 것은 환자가 난소암에 걸렸음을 나타내는 단계를 포함하는, 환자가 난소암에 걸렸는지 평가하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 대조 피험자로부터의 발현 수준이 비암성인 것으로 보이는 상기 환자로부터의 난소 세포로부터 결정되는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 대조 피험자로부터의 발현 수준이 난소암에 걸리지 않은 피험자 집단으로부터의 발현 수준의 평균을 이용하여 예비결정되는 것인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 다수의 마커가 적어도 3개의 마커를 포함하는 것인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 다수의 마커가 적어도 5개의 마커를 포함하는 것인 방법.
  22. a) 환자로부터의 샘플 내의 표 1에 나열된 마커의 발현 수준과,
    b) 비전이성 난소암에 걸렸거나 난소암에 걸리지 않은 대조 피험자로부터의 샘플 내의 마커의 발현 수준을 비교하는 것을 포함하고,
    c) 여기서 대조 피험자로부터의 샘플 내의 수준에 비해 환자 샘플 내의 상당히 더 높은 수준의 발현은 난소암이 전이되었거나 전이할 가능성이 있음을 나타내 는 것인, 환자가 전이되었거나 전이할 가능성이 있는 난소암에 걸렸는지 결정하는 방법.
  23. a) 환자로부터 얻은, 시험 화합물에 노출된 제1 샘플 내의 표 1에 나열된 마커로 이루어진 군 중에서 선택되는 마커의 발현과,
    b) 환자로부터 얻은, 시험 화합물에 노출되지 않은 제2 샘플 내의 마커의 발현을 비교하는 것을 포함하고,
    c) 여기서 제2 샘플에 비해 제1 샘플 내의 상당히 더 낮은 마커의 발현 수준은 시험 화합물이 환자에서 난소암을 억제하는데 효과적임을 나타내는 것인, 환자에서 난소암을 억제하기 위한 시험 화합물의 효능을 평가하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 제1 및 제2 샘플이 환자로부터 얻은 단일 샘플의 일부인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 제1 및 제2 샘플이 환자로부터 얻은 수집된 샘플의 일부인 방법.
  26. a) 적어도 일부의 요법을 환자에게 적용하기 이전에 환자로부터 얻은 제1 샘플 내의 표 1에 나열된 마커로 이루어진 군 중에서 선택되는 마커의 발현과,
    b) 일부의 요법을 적용한 이후 환자로부터 얻은 제2 샘플 내의 마커의 발현 을 비교하는 것을 포함하고,
    c) 여기서 제1 샘플에 비해 제2 샘플 내의 상당히 더 낮은 마커의 발현 수준은 요법이 환자에서 난소암을 억제하는데 효과적임을 나타내는 것인, 환자에서 난소암을 억제하기 위한 요법의 효능을 평가하는 방법.
  27. a) 환자로부터 암 세포를 포함하는 샘플을 얻고;
    b) 다수의 시험 조성물의 존재 하에 샘플의 부분표본을 개별적으로 노출시키고;
    c) 각각의 부분표본 내의 표 1에 나열된 마커로 이루어진 군 중에서 선택되는 마커의 발현을 비교하고;
    d) 다른 시험 조성물에 비해 그 시험 조성물을 함유하는 부분표본 내에서 보다 낮은 마커의 발현 수준을 유도하는 적어도 하나의 시험 조성물을 선택하는 것을 포함하는, 환자에서 난소암을 억제하기 위한 조성물을 선택하는 방법.
  28. a) 환자로부터 암 세포를 포함하는 샘플을 얻고;
    b) 다수의 시험 조성물의 존재 하에 샘플의 부분표본을 개별적으로 유지시키고;
    c) 각각의 부분표본 내의 표 1에 나열된 마커로 이루어진 군 중에서 선택되는 마커의 발현을 비교하고, 다른 시험 조성물에 비해 그 시험 조성물을 함유하는 부분표본 내에서 보다 낮은 마커의 발현 수준을 유도하는 적어도 하나의 시험 조성 물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 난소암을 억제하는 방법.
  29. a) 난소암 세포의 개별 부분표본을 시험 조성물의 존재 및 부재 하에 유지시키고;
    b) 각각의 부분표본 내의 표 1에 나열된 마커로 이루어진 군 중에서 선택되는 마커의 발현을 비교하는 것을 포함하고,
    여기서 시험 조성물의 존재 하에 유지된 부분표본 내의 상당히 증가된 마커의 발현 수준은 시험 조성물이 인간 난소 세포 발암 잠재력을 갖는다는 것을 나타내는 것인, 시험 조성물의 난소 세포 발암 잠재력을 평가하기 위한 방법.
  30. 표 1에 나열된 마커로 이루어진 군 중에서 선택된 다수의 마커의 발현을 평가하기 위한 시약을 포함하는, 환자가 난소암에 걸렸는지 평가하기 위한 키트.
  31. 표 1에 나열된 마커로 이루어진 군 중에서 선택된 다수의 마커에 대응하는 전사된 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 다수의 핵산 프로브를 포함하는, 난소암 세포의 존재를 평가하기 위한 키트.
  32. 표 1에 나열된 마커로 이루어진 군 중에서 선택된 다수의 마커에 대응하는 단백질과 특이적으로 결합하는 다수의 항체를 포함하는, 난소암 세포의 존재를 평가하기 위한 키트.
  33. 다수의 화합물; 및 표 1에 나열된 마커로 이루어진 군 중에서 선택된 마커의 발현을 평가하기 위한 시약을 포함하는, 환자에서 난소암을 억제하기 위한 다수의 화합물의 각각의 적합성을 평가하기 위한 키트.
  34. 표 1에 나열된 마커로부터 선택된 마커에 대응하는 유전자의 발현을 억제하는 것을 포함하는, 난소암 발병 위험이 있는 환자에서 난소암을 억제하는 방법.
  35. 서열 7, 서열 9, 서열 17, 서열 31, 서열 39 또는 서열 41의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  36. 서열 10, 서열 32, 서열 40 또는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  37. 제36항의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 항체.
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