CN101501215A

CN101501215A - 用于诊断内毒素血症的多核苷酸标记基因及它们的表达

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Publication number: CN101501215A
Application number: CNA2006800321398A
Authority: CN
Inventors: R·B·布兰登; M·R·托马斯
Original assignee: Immunexpress Pty Ltd
Current assignee: Immunexpress Pty Ltd
Priority date: 2005-07-07
Filing date: 2006-07-07
Publication date: 2009-08-05
Also published as: US20090264305A1; AU2006269820A1; US20130210658A1; EP1910565A4; EP2476761A2; EP2476761A3; US9816128B2; CA2614202A1; EP1910565A1; NZ564923A; WO2007006091A1; AU2006269820B2

Abstract

本发明公开了疾病相关的分子与试验，这些分子和试验可用于诊断和评估患有内毒素血症的动物，测定有发生内毒素血症或其后发病风险的动物。本发明可实际应用于该疾病的早期诊断、监测动物对该疾病的免疫反应并能为临床和亚临床上受影响的动物作出更好的治疗和控制决定。

Description

用于诊断内毒素血症的多核苷酸标记基因及它们的表达

发明领域

本发明总体上涉及诊断、检测宿主应答，监测、治疗与控制哺乳动物中内毒素血症和内毒素血症诱导的病症的方法与装置。本发明还涉及用该方法监测、质粒和控制可导致内毒素血症的病症。本发明可实际应用于早期诊断、诊断轻度或亚临床内毒素血症，检测作为活动性疾病或进行性疾病一部分的特异性细胞免疫应答，临床上监测受影响的动物和能对临床和亚临床上受影响的动物作出更好的治疗和控制决定。此外，本发明还可实际应用于监测危症监护病房或重病监护病房的内毒素血症患者并预测临床结果。

发明背景

通常认为宿主防御机制不能抵御外来生物，包括革兰阳性和阴性细菌、病毒、真菌和寄生虫而导致内毒素血症(也称为败血症性休克和败血综合征)。大多数内毒素血症病例由革兰阴性细菌导致(Glauser等，1991，Lancet 338(9月)732-736)，特别是由称为内毒素或脂多糖(LPS)的革兰阴性细菌产物，即细菌细胞外壁的成分所致。

由于内毒素血症的主要引发物质是内毒素，已开发了许多试验来检测液体中的这些分子，包括鲎阿米巴细胞裂解物(LAL)试验(Cohen J.，2000，Intensive CareMed.26：S51-S56)、家兔热原试验及小鼠和鸡胚胎致死率(试验)(Hurley JC.ClinMicrobiol Reviews 8(2)：268-292)。然而，检测液体，特别是血液中的内毒素预测内毒素血症的临床结果不佳，这有许多原因：

·激发导致内毒素血症的生物学事件级联反应所需的内毒素水平在患者与患者之间极为不同。

·根据身体解毒或中和内毒素的能力，内毒素在患者与患者之间的生物利用度不同。

·一些患者对内毒素敏感或对内毒素耐受。

·各种生物学液体(甚至液体容器)含有能结合内毒素的物质，它们能提高或限制内毒素的生物学效应，或能干扰内毒素的检测。

·一些内毒素比其它内毒素更强。

·当用于化验血液或血清内毒素时，LAL试验的特异性和灵敏度有限。

出于这些原因，人们已努力开发了可测定内毒素生物学效应的试验，作为测定临床结果的手段，包括检测诸如肿瘤坏死因子(TNF)、C3a、C5a、因子XII(哈格曼因子)、白介素-1(IL-1)、γ-干扰素和各种其它细胞因子等分子，以及检测白细胞的活化水平。Casey等(1993，Ann Intern Med.119：771-778)利用这些检测发展了“脓毒症评分”概念。

然而，这些试验无一具有足够的灵敏度、特异性或实用性，因而不能应用于常规临床实践。此外，现有治疗的效力也限制了这种预后和检测试验的实际应用。

尽管如此此，但内毒素血症的许多特征能对受影响的临床上和经济上重要的动物作出早期检测、监测、测定临床结果、测定预后、早期干预和提供治疗信息，即：

·许多和各种不同疾病可导致内毒素血症。

·内毒素血症可导致许多其它病症。

·如果不正确治疗，内毒素血症常是致死的极急性病症。

·据估计，在美国重病监护病房中有20-30％的人类患者受此影响，单在美国每年就有超过100,000人死亡(Young L和Glauser M(编)，《革兰阴性败血症和败血症性休克》(Gram negative septicemia and septic shock)，WB桑得斯公司)WBSaunders)费城(1991)；Parrillo JE.1990，Ann Intern Med.113：227-242)。

·在不发达国家，因为卫生和医疗设施不好，该病症的严重程度可能更高。

·多达50％的病例未确定病原。

·在医院中，该病症在患有其它潜在疾病的患者中最常见。

·亚临床疾病的严重程度及其对人类健康、畜牧业、运动能力和处方药管理(ethical management)的影响尚未知。

除直接检测内毒素以外，人们已作出了许多努力用败血症的第二指示剂来诊断和检测该病症，包括检测心率、体温、呼吸率、心输出量、全身血管阻力、血浆IL-6水平、巨噬细胞炎性蛋白-2、趋化因子KC、蛋白C和C反应性蛋白(Panacek等，2004，Crit Care Med.32：2173-2182；Ulloa和Tracey，2005，Trends MolMed.1：56-63)。

目前没有一组生物学标记可用于确定人败血症(Buras等，2006，Nature ReviewsDrug Discovery，4：854-865)。然而，有人提议可用细胞因子分布(Ulloa等，2005，Trends Mol Biol.11：56-63)。其原因在于该疾病复杂，难以确定疾病的阶段以及明显存在两种不同但不相互排斥的炎性和抗炎性应答阶段(Bone RC.，1996，Crit CareMed.24：1125-1128)。

由于目前内毒素血症的诊断、监测和预后方法有局限性，特别是在亚临床或早期阶段，需要更有效的方法来早期检测、诊断、监测、预后和治疗败血症的各阶段，包括急性、极急性、早期阶段、晚期和亚临床的内毒素血症。

内毒素血症所致并发症的一个例子是导致有蹄动物严重跛行的蹄叶炎。该病症发生于奇蹄和偶蹄动物，包括马、牛、山羊、绵羊和其它有蹄动物(有蹄类)。据信，内毒素对蹄内壁的组织和薄层的作用导致该病症。薄层衰竭导致蹄内囊(innerhoof capsule)与蹄骨分离，随后(承重的)使得蹄骨穿过蹄膜并压碎真皮、足底和蹄冠(Sloet van Oldruitenborgh-Oosterbaan MM.，1999，Vet Quarterly 21(4)121-127)。

蹄叶炎的许多特征能对受影响的临床上和经济上重要的动物作出早期检测、监测、早期干预和提供治疗信息，即：

·蹄叶炎的确切原因尚未知。

·亚临床疾病(常称为发展阶段；Hood DM.，1999，Vet Clin Nth Amer Eq Pract15(2)：287-294)的严重程度及其对畜牧业、运动能力和处方药管理的影响尚未知。

·疾病的最初72小时(发展和急性阶段)是监测的最关键时期。在此阶段没有严重机械性或结构性衰竭的动物可能会康复。

·该疾病的发病机理不大了解。

·蹄叶炎是全球最大的马类杀手，常因为进行性疾病导致严重的残疾和疼痛而施以安乐死。

·该疾病发生后，目前的诊断方法只部分有效，此时预防性治疗或改善治疗作用不大。

·实际可用的干预方法很少。

·因此，需要更有效的方法来作出轻度或亚临床蹄叶炎的早期诊断、诊断，检测作为活动性疾病或进行性疾病一部分的特异性免疫应答，监测临床上受蹄叶炎影响的动物。这些方法应能在不可逆性组织破坏前对临床和亚临床上受影响的动物作出更好的治疗和控制决定。

诊断内毒素血症或监测导致内毒素血症的病症或评估内毒素血症后发病的现有技术受限于对体液中细菌内毒素的检测与临床体征无良好相关性，并且这些技术的灵敏度和特异性不足以临床应用。此外，由于这些病症往往是极急性的，能检测到内毒素时可能已发展到晚期和不可逆的组织损伤(并且可能死亡)。

此外，诊断或评估蹄叶炎的现有技术有限，几乎完全依赖于蹄叶炎的临床评估和检测。在许多情况中，跛行是非常细微的或亚临床的。此外，许多这些临床变化只在疾病的晚期观察到，此时已发展成不可逆组织损伤，只能采用人道安乐死。

发明概述

与目前治疗受影响动物的技术相比，本发明代表了显著进步。在某些优选实施方式中，依赖于检测宿主的细胞，特别是循环白细胞中某些标记的水平，而不是检测内毒素。因此，这些方法适用于广泛筛选有症状和无症状的动物。在循环白细胞是分析对象的某些实施方式中，有人提出在广泛的组织损伤发生前，即在内毒素血症发展的非常早期检测宿主对该病症的反应及其后发病(sequelae)(在本文中也称为“内毒素血症相关病症”)是可行的。

因此，本发明通过检测可以在宿主细胞中检测的宿主反应解决了诊断内毒素血症相关病症的问题。优选的实施方式包括监测免疫系统外周白细胞中某些基因的表达，这可反映为与存在活动性疾病或对疾病反应相关的RNA水平或蛋白质产生模式的改变。

因此，在一方面，本发明提供诊断测试对象，特别是马匹测试对象中存在的内毒素血症相关病症的方法。这些方法一般包括检测该测试对象中至少一种选自以下的基因(本文也称为“内毒素血症标记基因”)的异常表达：(a)一种基因，其多核苷酸表达产物含有与以下任一序列有至少50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325，或其互补序列；(b)一种基因，其多核苷酸表达产物含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；(c)一种基因，其多核苷酸表达产物含有编码与以下任一序列的至少一部分有至少50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列：SEQID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)一种基因，其多核苷酸表达产物含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。本发明的这些内毒素血症标记基因在患内毒素血症相关病症(例如但不限于内毒素血症诱导的病症)的动物中表达异常，所述病症的示范性例子包括休克、抑郁、腹部不适、疼痛阈值降低、蹄叶炎和特发性病症。

本文所用的内毒素血症标记基因的多核苷酸表达产物称为“内毒素血症标记多核苷酸”。本文将内毒素血症标记基因的多肽表达产物称为“内毒素血症标记多肽”。

因此，在一些实施方式中，所述方法包括检测选自以下的内毒素血症标记多核苷酸的异常表达：(a)含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少可在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在其它实施方式中，所述方法包括检测选自以下的内毒素血症标记多肽的异常表达：(i)含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；(ii)含有以下任一序列一部分的多肽：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分含有该序列的至少5个毗连氨基酸残基；(iii)所含氨基酸序列与以下任一序列的至少15个毗连氨基酸残基至少有30％相似性的多肽：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；和(iv)含有以下任一序列的一部分的多肽：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分含有该序列的至少5个毗连氨基酸残基，并且与能和(i)、(ii)或(iii)所述某序列发生免疫相互作用的抗原结合分子发生免疫相互作用。

这种异常表达一般通过以下步骤检测：(1)检测得自测试对象的生物学样品中至少一种内毒素血症标记基因表达产物的水平或功能活性，和(2)将所检测到的各表达产物的水平或功能活性与得自一位或多位正常对象或一位或多位无此疾病的对象的参比样品中相应表达产物的水平或功能活性作比较，其中与参比样品中相应表达产物的水平或功能活性相比，该生物学样品中此表达产物的水平或功能活性有差异表明该测试对象存在内毒素血症相关病症。在一些实施方式中，当该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性与相应的该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性不同时，所述方法还包括诊断该测试对象内毒素血症相关病症的存在、阶段或程度。在这些实施方式中，与各相应表达产物的水平或功能活性相比，所述差异通常表示为各表达产物的水平或功能活性至少升高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或者甚至至少升高约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％；或者至少降低约10％、20％、30％40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％，或者甚至至少降低约99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％，即下文所称的“异常表达”。在此类型的示范性例子中，通过检测至少一种选自以下的内毒素血症标记多核苷酸的水平或功能活性降低来测定内毒素血症相关病症的存在：(a)含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：5、6、7、11、13、15、16、17、18、19、21、25、26、35、37、38、41、42、43、44、50、52、54、58、60、63、64、69、70、71、73、77、79、80、81、82、83、86、92、93、96、98、100、101、102、103、104、106、115、117、128、134、137、141、143、153、155、158、162、164、166、174、182、186、188、190、195、197、199、201、205、206、207、209、210、211、214、215、216、222、223、240、244、246、248、259、260、269、272、280、282、284、286、290、298、300、302、305、306、307、309、312、314、315、316、318、320、321、323，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：8、12、14、20、22、36、51、53、55、59、65、72、74、78、87、97、99、105、116、118、129、135、138、142、144、154、156、159、163、165、167、175、183、187、189、191、196、198、200、202、208、217、241、247、249、261、273、281、283、285、287、291、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324；(c)含有编码与以下序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：8、12、14、20、22、36、51、53、55、59、65、72、74、78、87、97、99、105、116、118、129、135、138、142、144、154、156、159、163、165、167、175、183、187、189、191、196、198、200、202、208、217、241、247、249、261、273、281、283、285、287、291、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在其它示范性例子中，通过检测至少一种选自以下内毒素血症标记多核苷酸的水平或功能活性的升高来确定内毒素血症相关病症的存在：(a)含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：1、3、4、9、10、23、27、29、31、33、39、45、47、49、56、61、66、67、68、75、76、84、88、90、94、107、109、110、111、113、114、119、121、122、123、124、125、126、130、132、136、139、145、147、149、151、157、160、168、169、170、172、173、176、178、180、184、192、193、194、203、212、218、220、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、242、245、250、252、254、255、257、262、264、266、268、270、271、274、276、278、279、288、292、294、296、304、311、325，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、24、28、30、32、34、40、46、48、57、62、85、89、91、95、108、112、120、127、131、133、140、146、148、150、152、161、171、177、179、181、185、204、213、219、221、226、228、230、232、234、238、243、251、253、256、258、263、265、267、275、277、289、293、295、297、326；(c)含有编码与以下任一序列至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：8、12、14、20、22、36、51、53、55、59、65、72、74、78、87、97、99、105、116、118、129、135、138、142、144、154、156、159、163、165、167、175、183、187、189、191、196、198、200、202、208、217、241、247、249、261、273、281、283、285、287、291、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在一些实施方式中，当该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性与相应的该表达产物或各表达产物所检测水平或功能活性相同或相似时，所述方法还包括诊断不存在内毒素血症相关病症。在这些实施方式中，各表达产物检测到的水平或功能活性与各相应表达产物检测到的水平或功能活性的差异不超过约20％、18％、16％、14％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.1％时，即下文称为“正常表达”。

在一些实施方式中，所述方法包括检测至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50种内毒素血症标记多核苷酸各表达产物的水平或功能活性。例如，所述方法可包括单独检测一种内毒素血症标记多核苷酸或联合检测多达49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种其它内毒素血症标记多核苷酸的水平或功能活性。在另一实施例中，所述方法可包括单独检测一种内毒素血症标记多肽或联合检测多达49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种其它内毒素血症标记多肽的水平或功能活性。在此类型的示范性例子中，所述方法包括检测与存在内毒素血症病症或患病风险极高度相关(p<0.001)的至少1、2、3、4、5或6种内毒素血症标记基因(下文称为“一级内毒素血症相关标记基因”)各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于：(a)含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：11、23、29、35、43、44、68、81、82、84、104、105、107、119、130、136、147、155、174、192、193、245、254、255、262、264、270、271、279、296、325，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：12、24、30、36、85、108、120、131、148、156、175、256、263、265、297、326；(c)含有编码与以下序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：12、24、30、36、85、108、120、131、148、156、175、256、263、265、297、326，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在其它示范性例子中，所述方法包括检测与存在内毒素血症相关病症或患病风险高度相关(p<0.005)的至少1、2、3、4、5、6、7或8种内毒素血症标记基因(下文称为“二级内毒素血症相关标记基因”)各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于：(a)含有与以下任一序列具有至少50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：1、7、9、10、17、18、21、25、26、33、54、61、64、79、80、90、94、115、117、121、122、125、126、143、160、162、164、172、173、178、184、186、194、199、205、206、225、229、242、244、252、257、259、274、276、282、284、288、294、306、316、318，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、8、22、34、55、62、65、91、95、116、118、127、144、161、163、165、179、185、187、200、226、230、243、253、258、275、277、283、285、289、295、317、319；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、8、22、34、55、62、65、91、95、116、118、127、144、161、163、165、179、185、187、200、226、230、243、253、258、275、277、283、285、289、295、317、319，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在还有其它示范性例子中，所述方法包括检测与存在内毒素血症相关病症或患病风险中等相关(p<0.05)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种内毒素血症标记基因(下文称为“三级内毒素血症相关标记基因”)各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于：(a)含有与以下任一序列具有至少50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：3、4、5、6、13、15、16、27、31、37、38、39、41、42、45、47、49、52、56、58、63、66、67、69、70、71、77、83、86、88、96、98、100、101、106、109、110、111、113、114、128、132、134、137、139、141、145、149、151、153、157、158、166、168、169、176、180、188、190、197、203、207、209、210、211、214、215、218、220、222、223、224、231、233、236、237、239、240、241、246、250、260、266、268、269、272、278、280、286、290、292、300、304、309、312、314、315、321、323，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：14、28、32、40、46、48、53、57、59、72、78、87、89、97、99、112、129、133、135、138、140、142、146、150、152、154、159、167、177、181、189、191、198、204、208、219、221、232、234、238、247、251、261、267、273、281、287、291、293、301、310、313、322、324；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ IDNO：14、28、32、40、46、48、53、57、59、72、78、87、89、97、99、112、129、133、135、138、140、142、146、150、152、154、159、167、177、181、189、191、198、204、208、219、221、232、234、238、247、251、261、267、273、281、287、291、293、301、310、313、322、324，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在其它示范性例子中，所述方法包括检测与存在内毒素血症相关病症或患病风险适度相关(p<0.05)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种内毒素血症标记基因(下文称为“四级内毒素血症相关标记基因”)各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于：(a)含有与以下任一序列具有至少50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ IDNO：19、50、60、73、75、92、93、102、103、123、124、170、182、195、201、212、216、227、235、248、298、302、305、307、311、320，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：20、51、74、76、171、183、196、202、213、217、228、249、299、303、308；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：20、51、74、76、171、183、196、202、213、217、228、249、299、303、308，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在一些实施方式中，所述方法包括检测至少1种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方式中，所述方法包括检测至少2种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少2种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方式中，所述方法包括检测至少1种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方式中，所述方法包括检测至少2种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，这些方法包括检测至少1种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方式中，所述方法包括检测至少1种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方式中，所述方法包括检测至少2种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种一级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方式中，所述方法包括检测至少2种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方式中，所述方法包括检测至少2种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方式中，所述方法包括检测至少2种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少5种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方式中，所述方法包括检测至少2种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种五级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方式中，所述方法包括检测至少2种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种五级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种五级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种五级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种五级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种二级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少5种五级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方式中，所述方法包括检测至少1种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方式中，所述方法包括检测至少2种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方式中，所述方法包括检测至少2种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少1种三级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性和至少5种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方式中，所述方法包括检测至少1种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方式中，所述方法包括检测至少2种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方式中，所述方法包括检测至少3种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少3种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少4种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少5种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方式中，所述方法包括检测至少6种四级内毒素血症相关标记基因表达产物的水平或功能活性。

生物学样品优选包括含有白细胞的血液，特别是外周血。所述表达产物宜选自RNA分子或多肽。在一些实施方式中，所述表达产物与相应的表达产物相同。在其它实施方式中，所述表达产物是相应表达产物的变体(例如，等位基因变体)。

在某些实施方式中，所述表达产物或相应的表达产物是靶RNA(例如，mRNA)或该靶RNA的DNA拷贝，其水平可用能在至少低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与该靶RNA或该DNA拷贝杂交的至少一种核酸探针来检测，其中该核酸探针至少含有某内毒素血症标记多核苷酸的15个毗连核苷酸。在这些实施方式中，将该靶RNA或其DNA拷贝所检测到的水平或丰度按同一样品中存在的参比RNA或该参比RNA的DNA拷贝的水平或丰度标准化。核酸探针宜固定在固体或半固体支持物上。在此类型的示范性例子中，该核酸探针形成核酸探针空间阵列的一部分。在一些实施方式中，通过杂交(例如利用核酸阵列)检测与靶RNA或DNA拷贝结合的核酸探针水平。在其它实施方式中，通过核酸扩增(例如，采用聚合酶链式反应(PCR))检测与靶RNA或DNA拷贝结合的核酸探针水平。在还有其它实施方式中，通过核酸酶保护试验检测与靶RNA或DNA拷贝结合的核酸探针水平。

在其它实施方式中，所述表达产物或相应的表达产物是靶多肽，其水平可用能与该靶多肽发生免疫相互作用的至少一种抗原结合分子来检测。在这些实施方式中，将靶多肽检测到的水平按同一样品中存在的参比多肽水平标准化。抗原结合分子宜固定于固体或半固体支持物上。在此类型的示范性例子中，该抗原结合分子形成抗原结合分子空间阵列的一部分。在一些实施方式中，用免疫测定(例如采用ELISA)检测与靶多肽结合的抗原结合分子水平。

在还有其它实施方式中，所述表达产物或相应的表达产物是靶多肽，其水平可用能与该靶多肽反应形成反应产物的至少一种底物来检测。在这些实施方式中，将靶多肽检测到的功能活性按同一样品中存在的参比多肽的功能活性标准化。

在一些实施方式中，可用适当包括至少一个与基站(base station)相耦联的终端站(end station)的一种系统来执行以上广泛描述的诊断方法。该基站宜(a)通过通信网络从终端站接受对象数据，其中所述对象数据代表的参数值对应于生物学样品中至少一种表达产物所检测到的或标准化的水平或功能活性，和(b)将所述对象数据与代表参比样品中至少一种相应表达产物的所检测到的或标准化的水平或功能活性的预定数据作比较，从而测定与参比样品中相应表达产物的水平或功能活性相比，该生物学样品中此表达产物的水平或功能活性中的任何差异。基站最好还能诊断是否存在内毒素血症相关病症或其程度。在这些实施方式中，基站还可通过通信网络将诊断指征传递给终端站。

在另一方面，本发明考虑采用上文广泛描述的方法来监测、治疗与控制可能导致内毒素血症的病症，所述病症的示范性例子包括：胎盘滞留、脑膜炎、子宫内膜异位、休克、中毒性休克(即，使用止血塞的后发病)、胃肠炎、阑尾炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、炎性肠病、酸性肠综合征(acid gut syndrome)、肝衰竭和硬化、新生儿的初乳递送障碍(failure of colostrum transfer in neonates)、局部缺血(任何器官中)、菌血症、诸如腹膜腔、心包腔、鞘膜腔和胸膜腔等体腔感染、烧伤、严重的伤口、锻炼过度或应激、血液透析、涉及无法忍受的疼痛(例如，胰腺炎、肾结石)、外科手术和不愈合性病损等病症。在这些实施方式中，频繁应用本发明诊断方法常能有效监测内毒素血症相关病症的早期发生，从而能早期治疗性干预和治疗该病症。在示范性例子中，诊断方法至少间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时使用。

在另一方面，本发明提供治疗、预防或抑制对象发生内毒素血症相关病症的方法。这些方法一般包括检测对象中至少一种内毒素血症标记基因的异常表达，给予该对象有效量的药物以治疗或缓解症状，或者逆转或抑制对象发生内毒素血症相关病症。这种治疗或药物的代表性例子包括但不限于：抗生素、类固醇、静脉内输液、血管活性(药物)、损伤或损坏器官的治标性支持疗法(例如，对呼吸窘迫供氧，对血容量不足输液)与密切监测生命器官。

在还有另一方面，本发明提供本文称为“内毒素血症标记多核苷酸”的分离的多核苷酸，所述多核苷酸通常选自：(a)含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：3、4、9、15、16、17、18、25、26、37、38、41、42、43、44、49、63、66、67、68、69、70、75、76、79、80、81、82、83、92、93、100、101、102、103、106、109、110、113、114、121、122、123、124、125、136、157、168、169、172、173、192、193、194、205、206、209、210、211、214、215、222、223、224、235、236、239、244、245、254、259、268、269、270、271、278、279、304、305、306、311、314、315或320，或其互补序列；(b)包含以下任一序列一部分的多核苷酸：SEQ ID NO：3、4、9、15、16、17、18、25、26、37、38、41、42、43、44、49、63、66、67、68、69、70、75、76、79、80、81、82、83、92、93、100、101、102、103、106、109、110、113、114、121、122、123、124、125、136、157、168、169、172、173、192、193、194、205、206、209、210、211、214、215、222、223、224、235、236、239、244、245、254、259、268、269、270、271、278、279、304、305、306、311、314、315或320，或其互补序列，其中所述部分至少含有该序列或互补序列的15个毗连核苷酸；(c)至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)或(b)所述序列或其互补序列杂交的多核苷酸；和(d)含有以下任一序列的一部分的多核苷酸：SEQ ID NO：3、4、9、15、16、17、18、25、26、37、38、41、42、43、44、49、63、66、67、68、69、70、75、76、79、80、81、82、83、92、93、100、101、102、103、106、109、110、113、114、121、122、123、124、125、136、157、168、169、172、173、192、193、194、205、206、209、210、211、214、215、222、223、224、235、236、239、244、245、254、259、268、269、270、271、278、279、304、305、306、311、314、315或320，或其互补序列，其中所述部分至少含有该序列或互补序列的15个毗连核苷酸并至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)或(c)所述序列或其互补序列杂交。

在还有另一方面，本发明提供含有操作性连接于调节元件的上文广泛描述的多核苷酸的核酸构建物，该构建物可在宿主细胞中操作。在某些实施方式中，所述构建物是载体形式，特别是表达载体。

在还有另一方面，本发明提供含有上文广泛描述的核酸构建物或载体的分离的宿主细胞。在某些优选实施方式中，所述宿主细胞选自细菌细胞、酵母菌细胞和昆虫细胞。

在还有另一方面，本发明提供用于探查核酸中是否存在上文广泛描述的多核苷酸的探针。这些探针一般包含至少能在低严谨性条件下与上文广泛描述的多核苷酸杂交的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述探针基本上由对应于编码以下任一氨基酸序列的核苷酸序列的至少一部分或与其互补的核酸序列构成：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分至少长15个核苷酸。在其它实施方式中，所述探针含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与编码以下任一氨基酸序列的核苷酸序列的至少一部分杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分至少长15个核苷酸。在还有其它实施方式中，所述探针含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与以下序列的至少一部分杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320321、323或325，其中所述部分至少长15个核苷酸。用于检测本发明内毒素血症标记多核苷酸的代表性探针如SEQ ID NO：326-2315(见表2)所示。

在一相关方面，本发明提供在其上固定了至少一种上文广泛描述的核酸探针的固体或半固体支持物。在一些实施方式中，该固体或半固体支持物包含固定于其上的核酸探针空间阵列。

在其它方面，本发明提供本文称为“内毒素血症标记多肽”的分离的多肽，所述多肽一般选自：(i)含有与上文广泛描述的内毒素血症标记基因的多肽表达产物至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的氨基酸序列的多肽，例如，特别是含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的内毒素血症标记基因：SEQ ID NO：3、4、9、15、16、17、18、25、26、37、38、41、42、43、44、49、63、66、67、68、69、70、75、76、79、80、81、82、83、92、93、100、101、102、103、106、109、110、113、114、121、122、123、124、125、136、157、168、169、172、173、192、193、194、205、206、209、210、211、214、215、222、223、224、235、236、239、244、245、254、259、268、269、270、271、278、279、304、305、306、311、314、315或320；(ii)如(i)所述多肽的一部分，其中该部分至少含有该多肽的5个毗连氨基酸残基；(iii)含有与(i)所述多肽的至少15个毗连氨基酸残基至少有30％相似性(和至少31％-至少99％及其之间所有整数百分比)的氨基酸序列的多肽；和(iv)含有能与(i)、(ii)或(iii)所述序列发生免疫相互作用的抗原结合分子发生免疫相互作用的氨基酸序列的多肽。

本发明还有一方面提供能与上文广泛描述的内毒素血症标记多肽发生免疫相互作用的抗原结合分子。

在一相关方面，本发明提供其上固定了至少一种上文广泛描述的抗原结合分子的固体或半固体支持物。在一些实施方式中，该固体或半固体支持物包含固定于其上的抗原结合分子空间阵列。

本发明还有另一方面提供一种或多种上文广泛描述的内毒素血症标记多核苷酸、一种或多种上文广泛描述的探针、一种或多种上文广泛描述的内毒素血症标记多肽或一种或多种上文广泛描述的抗原结合分子在制备诊断对象的内毒素血症相关病症存在的试剂盒中的应用。

本发明的其它方面涉及上文广泛描述的诊断方法、一种或多种上文广泛描述的内毒素血症标记多核苷酸、一种或多种上文广泛描述的探针、一种或多种上文广泛描述的内毒素血症标记多肽或一种或多种上文广泛描述的抗原结合分子在诊断动物(脊椎动物)、哺乳动物、非人哺乳动物，例如涉及负重或运动(例如竞技)的马与宠物(例如，狗与猫)的内毒素血症相关病症中的应用。

本发明的各方面涉及动物(脊椎动物)、哺乳动物、非人哺乳动物，例如涉及负重或运动(例如竞技)的马与宠物(例如，狗与猫)。

附图简述

图1是图示比较诱导后24小时的因表达的接收器操作曲线(Receiver OperatorCurve)(ROC)。从这些数据获得的ROC曲线显示诱导后24小时与0小时区分良好。利用两种主要组分(principal component)的灵敏度和选择性分别是1.00和1.00。

图2是图示比较诱导后72小时基因表达的ROC。从这些数据获得的ROC曲线显示诱导后72小时与0小时区分良好。利用两种主要组分的灵敏度和选择性分别是0.667和1.00。利用四种主要组分可将灵敏度和选择性分别提高至0.883和1(未显示)。

发明详述

1.定义

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。为本发明的目的定义了以下术语。

本文所用的冠词“一种”和“一个”指一个或多个(即至少一个)语法上该冠词的宾语。例如，“一种元件”指一个元件或多个元件。

本文用于描述内毒素血症标记基因表达的术语“异常表达”，指与取自健康对象或无内毒素血症对象的细胞中某内毒素血症标记基因或其变体的表达水平，和/或与取自健康对象或无内毒素血症对象的组织样品或体液中某内毒素血症标记基因产物(例如，转录物或多肽)的较高或较低水平相比，该内毒素血症标记基因过度表达或表达不足。具体地说，如果与取自健康对象或无内毒素血症对象的细胞中某内毒素血症标记基因的表达水平，和/或与取自健康对象或无内毒素血症对象的组织样品或体液中某内毒素血症标记基因的表达水平相比，该内毒素血症标记基因至少高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或甚至至少高约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％，或者至少低约10％、20％、30％40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少低约99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％，则该内毒素血症标记基因异常表达。

“约”指与参比品的量、水平、数值、数字、频率、百分比、维度、大小、用量、重量或长度相比，多达30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％不同的量、水平、数值、数字、频率、百分比、维度、大小、用量、重量或长度变化。

术语“扩增子”指扩增的靶序列和/或扩增靶序列的扩增产物。在某些其它实施方式中，“扩增子”可包含用于扩增的探针或引物序列。

“抗原结合分子”指对靶抗原具有结合亲和力的分子。应该知道该术语可扩展至显示具有抗原结合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白衍生的蛋白质框架。

当本文所用的术语“特异性结合”、“特异性免疫相互作用”等指某抗原结合分子时，此术语指能确定在蛋白质和其它生物物质的异质群体中存在该抗原的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，所述抗原结合分子能与其特定抗原相结合而不以明显量与样品中存在的其它蛋白质或抗原相结合。在这种条件下与某抗原的特异性结合可能需要选择对特定抗原具有特异性的抗原结合分子。例如，可产生针对所选蛋白质抗原的抗原结合分子，该分子能结合该抗原而不结合样品中的其它蛋白质抗原。可采用各种形式的免疫测定来选择能与某特定蛋白质发生特异性免疫相互作用的抗原结合分子。例如，常规采用固相ELISA免疫测定来选择能与某蛋白质发生特异性免疫相互作用的单克隆抗体。可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定方法和条件可参见Harlow和Lane，(1988)，《抗体，实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版物，纽约。

“生物学活性部分”指保留了亲代分子活性的全长亲代肽或多肽的一部分。本文所用的术语“生物学活性部分”包括，例如具有至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900、1000个连续氨基酸的缺失突变体和肽，这些缺失突变体和肽具有亲代分子的活性。可用标准的重组核酸技术获得或采用常规液相或固相合成技术合成此类部分。例如，可参考如布莱克威尔科学出版公司(Blackwell Scientific Publications)出版，Nicholson所编的名为《合成疫苗》(Synthetic Vaccines)的出版物中，Atherton和Shephard所著名为“肽合成”(Peptide Synthesis)的第9章中所述的液相合成或固相合成。或者，可用蛋白酶，例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化本发明的肽或多肽来制备这类肽。可通过例如高效液相色谱(HPLC)技术纯化所消化的片段。也可采用重组核酸技术来制备这种部分。

本文所用的术语“生物学样品”指从动物提取的、未处理、处理、稀释或浓缩的样品。生物学样品可包括生物学液体，例如全血、血清、血浆、唾液、尿、汗液、腹水、腹膜液、滑膜液、羊水、脑脊液、组织活检(样品)等。在某些实施方式中，生物学样品是血液、特别是外周血。

本文所用的术语“顺式作用序列”、“顺式作用元件”、“顺式调节区”或“调节区”或类似的术语应表示当安置在相对于某可表达遗传序列的适当位置时能调节，至少部分调节该遗传序列表达的任何核苷酸序列。本领域技术人员知道顺式调节区能在转录或翻译后水平上活化、沉默、增强、抑制或者改变基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。在本发明的某些实施方式中，顺式作用序列是能增强或刺激某可表达遗传序列表达的激活序列。

除非文中另有需要，本说明书中的词语“包含”、“含有”和“含有的”应理解为指包括某所述步骤或元件或者一组步骤或元件，但不排除任何其它步骤或元件或者一组步骤或元件。

“对应”或“对应于”表示以下多核苷酸：(a)其含有的核苷酸序列与某参比多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补，或(b)其编码的氨基酸序列与某肽或蛋白质的氨基酸序列相同。该短语的范围还包括含有的氨基酸序列与参比肽或蛋白质的氨基酸序列基本上相同的肽或多肽。

在本文治疗或预防某病症的章节中，“有效量”表示将该用量的活性(化合物)以单剂量或连续剂量的一部分给予需要这种治疗或预防的个体，该用量可有效防止该病症的症状发生、抑制这种症状和/或治疗已有症状。有效量依待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类学组别、组合物的剂型、医学状况的评估和其它相关因素而不同。希望该用量处于可用常规试验确定的较宽范围。

术语“表达”或“基因表达”指产生RNA信息或将RNA信息翻译为蛋白质或多肽。采用本文所述方法检测各类型基因表达是本发明的一部分。

“表达载体”表示能指导该载体所含的多核苷酸转录和适当地合成该多核苷酸所编码的肽或多肽的任何自主遗传元件。本领域技术人员知道这种表达载体。

本文所用的术语“功能活性”通常指某分子(例如，转录物或多肽)执行其所指定功能的能力，包括生物学、酶学或治疗性功能。在某些实施方式中，通过本领域已知的任何合适试验检测某分子的功能活性对应于其具体活性。

本文所用的术语“基因”指细胞基因组的任何与所有的不连续编码区及其相关的非编码和调节区。基因还表示编码具体多肽的开放读框、内含子、参与表达调节的毗邻5’和3’非编码核苷酸序列。在这点上，基因还可含有与某给定基因天然相关的调控信号，例如启动子、增强子、终止和/或聚腺苷酸化信号，或异源调控信号。DNA序列可以是cDNA或基因组DNA或其片段。可将基因引入合适的载体中而维持于染色体外或整合入宿主。

“高密度多核苷酸阵列”等表示每cm2至少含有400个不同元件(feature)的那些阵列。

短语“高度鉴别性杂交条件”指可测定出一个碱基错配的杂交条件。

“持家基因”表示实际上在所有细胞中均表达的基因，因为其对任何细胞功能都重要(例如，必需的蛋白质和RNA分子)。

本文用“杂交”表示互补核苷酸序列配对而产生DNA-DNA杂交体或DNA-RNA杂交体。互补碱基序列是通过碱基配对原则而相互关联的那些序列。在DNA中，A与T配对，C与G配对。在RNA中，U与A配对，C与G配对。在这点上，本文所用术语“匹配”和“错配”指互补核酸链中配对核苷酸的杂交可能性。匹配的核苷酸能有效杂交，例如上述典型的A-T和C-G碱基配对。错配是不能有效杂交核苷酸的其它组合。

短语“特异性杂交”等指在严谨性条件下，当某特定核苷酸序列存在于复杂的DNA或RNA混合物(例如，总细胞的)中时，某分子只与该序列结合、形成双螺旋或杂交。

本文述及“免疫相互作用”包括述及分子之间，特别是所述分子之一是免疫系统组分或模拟物时的任何相互作用、反应或其它结合形式。

“分离的”表示所述物质实质上或基本上不含其在天然状态下正常相伴的组分。例如，本文所用的“分离的多核苷酸”指去除了天然状态下其侧接的序列而纯化的多核苷酸，例如去除了与其正常毗连序列的DNA片段。或者，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等指在体外将肽或多肽分子与其天然细胞环境和与之结合的其它细胞组分相分离和/或纯化，即不与体内物质结合。

“标记基因”表示能赋予表达该标记基因的细胞独特表型的基因，因而这种转化细胞可与不含有该标记的细胞相区分。可选择标记基因赋予的特性能根据对选择性因子(例如，除草剂、抗生素、辐射、热或破坏未转化细胞的其它处理方法)的抗性进行选择。可筛选标记基因(或报道基因)赋予的性状可通过观察或检验，即通过“筛选”来鉴定(例如，非转化细胞中不存在的β-葡糖醛酸酶、萤光素酶或其它酶活性)。

本文所用的“天然产生的”核酸分子指具有天然产生的核苷酸序列的RNA或DNA分子。例如，天然产生的核酸分子能编码天然产生的蛋白质。

“获自”表示某样品，例如核酸提取物或多肽提取物是分离自或衍生自特定来源。例如，可从对象的生物学液体或组织中直接分离这种提取物。

本文所用的术语“寡核苷酸”指经磷酸二酯键相连的多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关的结构变体或合成类似物，包括含有修饰或取代糖基团等的核苷酸)构成的聚合物(或其相关的结构变体或合成类似物)。因此，尽管术语“寡核苷酸”通常指其中的核苷酸残基与残基间的连接键是天然存在的核苷酸聚合物，但应知道该术语的范围还包括各种类似物，包括但不限于：肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、亚磷酰胺、膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核酸等。该分子的确切大小视具体应用而不同。寡核苷酸是长200个或以下碱基的多核苷酸亚组。寡核苷酸优选长10-60个碱基，最优选长12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基。虽然寡核苷酸可以是双链，例如用于构建变体核酸序列，但寡核苷酸通常是单链的，例如探针。本发明寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。

术语“寡核苷酸阵列”指含有寡核苷酸探针的基板，在该基板表面的已知不连续位置沉积了不同的已知序列。例如，该基板可以是如美国专利5,424,186所述的两维基板形式。这种基板可用于合成两维空间寻址的寡核苷酸(矩阵)阵列。或者，该基板的特征在于通过将两维平面的薄片卷成三维管状构型而形成管状阵列。该基板还可采取与光纤表面相连的微球或珠形式，例如Chee等在WO 00/39587中所述的那样。寡核苷酸阵列至少具有两种不同的元件，其密度为每cm²至少400个元件。在某些实施方式中，这些阵列的密度可以是每cm²约500、至少一千、至少一万、至少十万、至少一百万或至少一千万个元件。例如，该基板可以是硅或玻璃，具有玻璃显微镜载玻片或玻璃盖玻片的厚度，或者可由其它合成聚合物构成。当在该基板上进行试验的方法包括光检测时，可用透光的基板。该术语还指探针阵列和与其相连形成晶片一部分的基板。

本文所用的术语“操作性连接”或“操作性相连”表示将结构基因置于启动子的调控下，从而可控制该基因的转录和任选的翻译。在构建异源启动子/结构基因组合时，通常优选将遗传序列或启动子安置在与基因转录起始位点的距离与其天然设置，即衍生该遗传序列或启动子的基因中该遗传序列或启动子与其所调控的基因的距离大致相同。本领域已知可允许对此距离作一些变动而不丧失功能。类似地，调控序列元件与置于其控制下的异源基因的优选定位可利用该元件在其天然设置，即衍生其的基因中的定位来确定。

术语“病原体”在本文以其最广泛含义使用，指可感染动物活组织的细胞从而引发疾病反应的生物或感染因子。

本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常指至少长10个碱基的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二类核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链或双链形式。

术语“多核苷酸变体”和“变体”指显示与参比多核苷酸序列具有基本序列相同性的多核苷酸，或能在下述严谨性条件下与参比序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括其中含有一个或多个核苷酸添加或删除，或用不同的核苷酸取代的多核苷酸。在这点上，本领域熟知可按照参比多核苷酸对所述多核苷酸作出某些改变，包括突变、添加、缺失和取代，但改变的多核苷酸仍保留该参比多核苷酸的生物学功能或活性。术语“多核苷酸变体”和“变体”也包括天然产生的等位基因变体。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，指氨基酸残基的聚合物及其变体与合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然产生氨基酸(例如，相应的天然产生氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物以及天然产生的氨基酸聚合物。

术语“多肽变体”指因至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代而与参比多肽相区别的多肽。在某些实施方式中，参比多肽的一个或多个氨基酸残基可用不同的氨基酸所取代。如下所述，本领域熟知一些氨基酸可以更换成具有大致相似性质的其它氨基酸而不会改变多肽的性质(保守取代)。

“引物”表示当与DNA的一条链配对时在合适的聚合试剂存在下能启动引物延伸产物合成的寡核苷酸。为使扩增效率最大，引物优选单链，但或者可以是双链。引物应足够长从而能在聚合试剂存在时引发合成延伸产物。引物的长度取决于许多因素，包括：应用、所采用的温度、模板反应条件、其它试剂和引物来源。例如，取决于靶序列的复杂性，引物的3’末端可比模板序列长度短至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500到1个碱基而能延伸核酸链，虽然引物5’末端长度可延伸超出模板序列的3’末端。在某些实施方式中，引物可以是大的多核苷酸，例如约35个核苷酸到数千碱基以上。可选出与模板序列“基本上互补”的引物，所设计的这些引物能与模板杂交并用作合成的起点。“基本上互补”表示引物的互补性足够与靶多核苷酸杂交。引物和设计与之杂交的模板最好不含错配，但这不是必需的。例如，可将非互补核苷酸残基连接在引物的5’末端，而该引物序列的其余部分与模板互补。或者，可将非互补核苷酸残基或非互补核苷酸残基的延伸段间插入引物中，前提是引物序列与和其杂交的模板序列足够互补从而能形成合成该引物的延伸产物所需的模板。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有说明，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(常称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。依据杂交条件的严谨性，探针能结合与该探针不完全序列互补的靶多核苷酸。探针可直接或间接标记，其范围包括引物。

本文所用的术语“重组多核苷酸”指通过操作核酸而在体外形成自然界中正常没有的多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以采取表达载体形式。这种表达载体一般包括操作性连接于核苷酸序列的转录和翻译调节核酸。

“重组多肽”表示采用重组技术，即通过重组或合成多核苷酸的表达而制备的多肽。

“调节元件”或“调节序列”表示在具体宿主细胞中表达操作性相连编码序列所需的核酸序列(例如，DNA)。例如，适用于原核细胞的调节序列包括启动子和任选的顺式作用序列，如操纵子序列与核糖体结合位点。适用于真核细胞的调控序列包括启动子、聚腺苷酸化信号、转录增强子、翻译增强子、调节mRNA稳定性的前导和尾随序列，以及使转录的多核苷酸所编码产物靶向细胞内区室或靶向胞外环境的定向序列。

本文所用的术语“序列相同性”指在比较窗口上序列依据核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的相同性程度。因此，可通过以下步骤计算“序列相同性百分比”：在比较窗口上比较两条最佳比对的序列，测定两条序列中相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数目从而获得匹配的位置数目，将匹配位置数目除以比较窗口的位置总数(即，窗口大小)，再将结果乘以100得到序列相同性百分比。为本发明的目的，应知道“序列相同性”可用DNASIS计算机程序(已有windows的2.5版；购自美国加利福尼亚州南圣弗朗西斯科市的日立软件工程有限公司(Hitachi Software engineering Co.，Ltd.，South San Francisco，California，USA))，使用该软件随附参考手册中所用的标准默认(参数)计算“匹配百分比”。

如下表A所述，“相似性”指相同或构成保守取代的氨基酸百分数。可利用序列比较程序，例如GAP(Deveraux等，1984，Nucleic Acids Research，12，387-395)测定相似性。以此方式，可通过在排列中插入空位来比较长度与本文所述序列相似或基本上不同的序列，这种空位可通过例如GAP所用的比较算法确定。

用于描述两条或更多条多核苷酸或多肽之间序列相关性的术语包括“参比序列”、“比较窗口”、“序列相同性”、“序列相同性百分比”和“基本上相同”。“参比序列”的长度至少12个，但更常见15-18个，往往至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。由于两条多核苷酸各含有(1)两条多核苷酸之间相似的序列(即，只是整个多核苷酸序列的一部分)，和(2)两条多核苷酸序列之间有差别的序列，则一般通过在“比较窗口”上比较这两条多核苷酸的序列来鉴定和比较局部区域的序列相似性从而在两条(或更多条)多核苷酸之间进行序列比较。“比较窗口”指含有至少6个，通常约50-约100个，更常见约100-约150个毗连位置的概念性片段，其中某序列与参比序列最佳比对后，该序列与相同数目的毗连位置的参比序列作比较。为(进行)两条序列的最佳比对，与参比序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗口可包含约20％或更少的添加或缺失(即，空位)。为比对比较窗口，可通过计算机执行算法(美国威斯康星州麦迪逊575 Science Drive的遗传学计算机组的威斯康星遗传学软件包7.0版(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA算法)，或通过目测和所选择的各种方法之一产生的最佳比对(即在比较窗口上获得最高同源性百分比)来对诸序列进行最佳比对。也可如Altschul等，1997，Nucl.Acids Res.，25：3389所述，参考BLAST家族程序进行比对。序列分析详述可见Ausubel等，《最新分子生物学方法》(Current Protocolsin Molecular Biology)，约翰威利父子公司(John Wiley & Sons Inc)，1994-1998，第15章，第19.3单元。

在本文可互换使用的术语“对象”、“个体”或“患者”指需要治疗或预防的任何对象，特别是脊椎动物对象，甚至更特别指哺乳动物对象。本发明范围内合适脊椎动物包括但不限于：灵长类动物、鸟类、家畜(例如，绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室检验动物(例如，家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如，猫、狗)和捕获的野生动物(例如，狐、鹿、澳洲野狗(dingoes))。优选的对象是需要治疗或预防内毒素血症的马类动物。然而，应该知道以上术语并未暗示存在症状。

本文的短语“基本上相似的亲和力”指在所选择的一组严谨性条件下，靶序列与它们的互补或基本上互补的寡核苷酸探针杂交强度相似并可检测。

本文所用的术语“模板”指用于产生该“模板”链的互补核酸链的核酸。模板可以是RNA和/或DNA，其互补链也可以是RNA和/或DNA。在某些实施方式中，互补链可包括该“模板”的全部或部分互补序列，和/或可包含突变，因而其不是该“模板”的精确互补链。在本文所述的检测试验以及本领域已知的其它试验中，与模板链不精确互补的链也可以与模板链特异性杂交，这种可用于检测试验的互补链是本发明的一部分。

术语“转化”表示通过引入外源或内源性核酸而改变某生物体，例如细菌、酵母菌、哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼或植物的基因型。

术语“治疗”表示治疗性与预防性治疗。

“载体”表示可在其中插入或克隆入某多核苷酸的多核苷酸分子，最好是衍生自，例如质粒、细菌噬菌体、酵母菌、病毒、哺乳动物、鸟类、爬行动物或鱼的DNA分子。载体优选含有一个或多个独特的限制性位点并能在确定的宿主细胞，包括靶细胞或组织或其子代细胞或组织中自主复制，或能与确定的宿主基因组整合从而可复制所克隆的序列。因此，载体可以是自主复制性载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如线形或闭环质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可含有确保自身复制的元件。或者，当将载体引入宿主细胞后它能整合入基因组中与整合其的染色体一起复制。载体系统可包含一种载体或质粒，一起含有引入宿主细胞基因组的总DNA的两种或多种载体或质粒，或转座子。选择载体一般取决于该载体与待引入该载体的宿主细胞的相容性。载体也可包含选择标记，例如可用于选择合适转化子的抗生素抗性基因。本领域技术人员已知这种抗性基因的例子。

术语“野生型”和“正常的”可互换使用，指大多数天然产生的物种的特征性表型，其相反的例子是突变体表型。

2.缩写

说明书中使用以下缩写：

nt＝核苷酸

nts＝多个核苷酸

aa＝氨基酸

kb＝千碱基或千碱基对

kDa＝千道尔顿

d＝日

h＝小时

s＝秒

3.内毒素血症标记及其应用

本发明涉及内毒素血症或其后发病(在本文中也称为“内毒素血症相关病症”)的早期检测、诊断或预后。本发明公开了患有或怀疑患有内毒素血症的对象的细胞，特别是血细胞，更具体说是外周血细胞中的内毒素血症标记，其形式为特定序列的RNA分子或这些RNA分子表达的多肽。这些标记是内毒素血症相关病症的指标，与正常对象或无内毒素血症相关病症的对象的表达相比，当它们差异性表达时可诊断该测试对象中存在那些病症。与此领域的现有技术相比，这些标记有许多优点。在某些利用白细胞(例如，外周血细胞)进行分析的优选实施方式中，可能在检测到内毒素的血清抗体，或内毒素血症致病因子之前即诊断活性内毒素血症相关病症。

看来本文所述的核酸序列可用于内毒素血症相关病症的检测、诊断、预后与治疗等各种应用领本文范围内这些应用的例子包括利用特异性引物扩增内毒素血症标记，通过与寡核苷酸探针杂交、将分离的核酸掺入载体、使掺入载体的核酸表达为RNA和蛋白质与使对应于该标记所编码产物的免疫学试剂显色来检测内毒素血症标记。

所鉴定的内毒素血症标记进而可用于设计特异性寡核苷酸探针和引物。这种探针和引物可以是能与所鉴定的标记基因序列特异性杂交的任何长度，其至少长约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500个核苷酸，以探针为例，最长可以是本文所鉴定标记基因序列的全长。探针也可在其5’和/或3’末端包含额外序列从而能延伸超出与其杂交的靶序列。

当联用核酸扩增方法时，这些探针和引物能快速分析生物学样品(例如，外周血样品)来检测标记基因或检测或定量测定标记基因的转录物。这种方法包括本领域已知或本文所述用于复制或增加靶核酸或其互补序列的拷贝数或数量的任何方法或技术。

所鉴定的标记还可用于鉴定和分离基因组DNA文库中宜为(但不限于)马来源的全长基因序列，包括基因表达的调节元件。本文鉴定的cDNA序列可用作杂交探针以常规技术来筛检基因组DNA文库。一旦鉴定到部分基因组克隆，可通过“染色体行走”(也称为“重叠杂交”)，采用，例如Chinault和Carbon(1979，Gene，5：111-126)所述的方法来分离全长基因。一旦利用cDNA杂交探针分离得到部分基因组克隆，位于该部分基因组克隆两末端或其附近的非复制型区段可用作杂交探针进一步筛选基因组文库，最终分离感兴趣的内毒素血症标记的整个基因序列。应知道可用本文所述的全长或部分cDNA序列或短的表达序列标签(ETS)，采用例如Sambrook等，(《分子克隆.实验室手册》(MOLECULAR CLONING.ALABORATORY MANUAL)，(冷泉港出版社，1989)和Ausubel等，(《最新分子生物学方法》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，约翰威利父子公司，1994)所述的标准技术获得全长基因。此外，可采用公开的，例如以上参考教材中所述的标准技术，利用所述序列来鉴定和分离全长cDNA序列。可利用这些手段鉴定和分离的序列，采用本文所述检测方法来检测内毒素血症标记基因，这些序列是本发明的一部分。

本领域普通技术人员能从所鉴定的标记基因中选择区段用于不同检测、诊断或预后方法，载体构建物，制备抗原结合分子，试剂盒和/或本文所述任何实施方式，这些方法或物质是本发明的一部分。本发明优选使用的标记基因序列是SEQ IDNO：1、3、5、7、8、10、12、14、16、17、18、20、22、24、26、27、28、30、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、54、55、56或57所示的序列(见表1)。

4.本发明的核酸分子

如实施例和表1所述，本文提供了179种内毒素血症标记，这些标记是通过对正常马匹和具有内毒素血症相关病症临床证据的马匹血液进行基因芯片(

)分析鉴定到的。在所鉴定的179种标记中，121种包含编码区序列(参见与以下序列相关的标记：SEQ ID NO：1、5、6、7、11、13、19、21、23、27、29、31、33、35、39、45、47、50、52、54、56、58、60、61、64、71、73、77、78、84、86、88、90、94、96、98、102、103、104、107、111、115、117、119、126、128、130、132、134、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、158、160、162、164、166、170、174、176、178、180、182、184、186、188、190、195、197、199、201、203、207、212、216、218、220、225、227、229、231、233、237、240、242、246、248、250、252、255、257、260、262、264、266、272、274、276、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、307、309、312、316、318、321、323或325)，58种只包含5′和/或3′非翻译序列(参见与以下序列相关的标记：SEQ ID NO：3、4、9、15、16、17、18、25、26、37、38、41、42、43、44、49、63、66、67、68、69、70、75、76、79、80、81、82、83、92、93、100、101、102、103、106、109、110、113、114、121、122、123、124、125、136、157、168、169、172、173、192、193、194、205、206、209、210、211、214、215、222、223、224、235、236、239、244、245、254、259、268、269、270、271、278、279、304、305、306、311、314、315或320)。表1所示的这些序列能诊断内毒素血症相关病症的存在、阶段或程度(在本文也称为“内毒素血症标记多核苷酸”)。序列分析显示这些内毒素血症标记基因可以分成亚组。例如，几种内毒素血症标记基因编码参与免疫应答的膜结合多肽(例如，SEQ ID NO.59、219、230、253、285和295)，而其它标记基因编码细胞质结合多肽(例如，SEQ ID NO：217、241、247、265、267、287和291)，还有其它标记基因编码胞外多肽(例如，SEQID NO：30、85、108、127、140和226)，而还有其它标记基因编码核多肽(例如，8、12、20、28、40、55、281、283和313)，还有其它标记基因编码细胞骨架分子(例如，SEQ ID NO：105和213)。

根据本发明，发现本文所述分离的核酸序列特别可用作杂交探针或扩增引物。这些核酸可用于，例如诊断性评估生物学样品或用于克隆全长cDNA或其相应的基因组克隆。在某些实施方式中，这些探针和引物提供了长度足以与生物学样品提取的RNA或DNA样品特异性杂交的寡核苷酸。这些序列通常长约10-20个核苷酸，但可以更长。某些实施方式需要较长的序列，例如约30、40、50、100、500个核苷酸和甚至最多达全长。

本发明考虑了含有以下所示任一序列的约10、15、17、20、30、40、50、60、75或100或500个核苷酸的毗连延伸段的核酸分子：SEQ ID NO：1、3、5、7、8、10、12、14、16、17、18、20、22、24、26、27、28、30、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、54、55、56或57。本发明还考虑了与上述序列互补，能在高严谨性条件下与这些序列结合的分子。这些探针可用于各种杂交实施方式，例如Southern和Northern印迹。在一些例子中，本发明考虑可使用能与多种靶序列杂交而不损伤它们有效诊断内毒素血症相关病症能力的探针。总之，本发明认为本文所述杂交探针既可用作溶液杂交(如PCR中)也可用于固相实施方式中的试剂来检测相应基因的表达。

设计了围绕所述核苷酸序列的各种探针和引物。例如，在某些实施方式中，用于设计探针和引物的序列可包含通常连接于所鉴定标记基因的RNA两末端的腺嘌呤核苷酸的重复延伸段(poly-A尾)。在其它实施方式中，本领域普通技术人员可能认为某些区段更适用于所述检测方法，故可将探针和引物专门设计为不包含所鉴定标记基因的这些或其它区段。在任何情况中，普通技术人员均能为所选择的应用领域选择引物或探针序列。用于检测内毒素血症标记基因的示范性探针序列见表2。

引物可以是双链或单链形式，虽然单链形式更可取。可将探针设计为能与靶DNA或RNA结合(尽管可能致敏)而无需用于扩增方法中。在某些实施方式中，可用放射性物质(³²P、¹⁴C、³⁵S、³H或其它标记物)、荧光团(例如罗丹明、荧光素)或化学发光标记物(例如，萤光素酶)来标记这些探针或引物。

本发明提供可用作内毒素血症相关病症标记的基本上全长的cDNA序列以及EST或部分cDNA序列。然而，应该知道本文内容不限于这些公开的序列，特别是至少要包括能与含有所公开序列的核酸或这些核酸的变体杂交的分离核酸。例如，可用核酸的部分序列来鉴定结构相关的基因或衍生其的全长基因组或cDNA克隆。本领域已知可用作上述探针的靶标的cDNA和基因组文库的制备方法(参见，例如Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1994，同上)。所有这种核酸以及本文所述的特异性核酸分子统称为“内毒素血症标记多核苷酸”。此外，本发明的范围包括内毒素血症标记多核苷酸的分离或纯化的表达产物(即，RNA转录物和多肽)。

因此，本发明包括分离的或基本上纯化的核酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白质或其生物学活性部分是基本上或在本质上不含有该核酸分子或蛋白质所在的天然环境中发现的与其正常相伴或相互作用的组分。因此，当通过重组技术产生分离或纯化的多核苷酸或多肽时其基本上不含其它细胞物质或培养基成分，或者当化学合成时其基本上不含化学前体或其它化学物质。“分离的”多核苷酸宜不含产生该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然侧接该多核苷酸的序列(即，位于该多核苷酸5’和3’末端的序列)，特别是蛋白质的编码序列。例如，在各种实施方案中，分离的内毒素血症标记多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的产生该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然侧接该多核苷酸的核苷酸序列。基本上不含细胞物质的多肽包括含有少于约30％、20％、10％、5％(以干重计)污染蛋白质的蛋白质制品。当本发明的蛋白质或其生物学活性部分是重组产生时，培养基宜含有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的化学前体或非感兴趣蛋白质化学物质。

本发明还包括内毒素血症标记基因的全长或基本上全长核苷酸序列的各部分，或者它们的转录物或这些转录物的DNA拷贝。内毒素血症标记核苷酸序列的各部分可编码多肽部分或保留该天然多肽生物学活性的区段。或者，可用作杂交探针的内毒素血症标记核苷酸序列的各部分通常不编码保留这种生物学活性的氨基酸序列。因此，内毒素血症标记核苷酸序列的各部分至少含有编码本发明内毒素血症标记多肽的核苷酸序列的约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、80、90、100个核苷酸，或者几乎多达其全长。

编码本发明内毒素血症标记多肽的生物学活性部分的内毒素血症标记核苷酸序列部分至少可编码全长内毒素血症标记多肽中的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900或1000、或者甚至至少约2000、3000、4000或5000个连续氨基酸残基，或者几乎最多达其氨基酸总数。可用作杂交探针或PCR引物的内毒素血症标记核苷酸序列的各部分一般无需编码内毒素血症标记多肽的生物学活性部分。

因此，内毒素血症标记核苷酸序列的一部分可编码内毒素血症标记多肽的生物学活性部分，或者它可以是在本领域已知标准方法中用作杂交探针或PCR引物的片段。可通过分离一条本发明内毒素血症标记核苷酸序列的一部分，表达其所编码的内毒素血症标记多肽部分(例如通过体外重组表达)并评估所编码的该内毒素血症标记多肽部分(的活性)来制备该内毒素血症标记多肽的生物学活性部分。作为内毒素血症标记核苷酸序列各部分的核酸分子至少含有全长内毒素血症标记核苷酸序列中的约15、16、17、18、19、20、25、30、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或650个核苷酸，或者几乎最多达其核苷酸总数。

本发明还考虑了内毒素血症标记核苷酸序列的变体。核酸变体可以是天然产生的，例如等位基因变体(同一基因座)、同源物(不同基因座)和直向同源物(不同生物体)或者可以是非天然产生的。可采用熟知的分子生物学技术，例如本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术鉴定天然产生的变体，例如所述的这些变体。可通过诱变技术，包括适用于多核苷酸、细胞或生物体的技术来制备非天然产生的变体。这些变体可含有核苷酸取代、缺失、倒位和插入。编码与非编码区可发生变异。这些变异既可导致保守性也可导致非保守性氨基酸取代(与编码产物相比)。对于核苷酸序列，保守性变体包括因遗传密码子简并性而产生但仍能编码本发明内毒素血症标记多肽之一的氨基酸序列的那些(核酸)序列。变体核苷酸序列还包括合成产生但仍能编码本发明内毒素血症标记多肽的核苷酸序列，例如通过定点诱变产生的那些序列。总体上，通过本文它处所述的序列比对程序利用默认参数测定到本发明某特定核苷酸序列的变体与该特定核苷酸序列至少具有约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％，一般至少约75％、80％、85％，优选约90％-95％或更高，更优选约98％或更高的序列相同性。

本发明的内毒素血症标记核苷酸序列可用于分离其它生物体，特别是其它哺乳动物，尤其是其它品种马匹的相应序列与等位变体序列。本领域不难获得核酸序列的杂交方法。可通过熟知技术根据与本文所述编码序列的序列相同性分离其它生物体的编码序列。在这些技术中，可将所有或部分已知的编码序列用作探针，与所选生物体的克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即，基因组或cDNA文库)中存在的其它内毒素血症标记编码序列选择性杂交。因此，本发明还考虑在下述严谨性条件下能与所述内毒素血症标记基因核苷酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸。本文所用的术语“在低严谨性、中严谨性、高严谨性或极高严谨性条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可见Ausubel等(1998，同上)，第6.3.1-6.3.6部分。该参考文献中描述了水性和非水性方法，二者均可用。本文述及的低严谨性条件包括采用至少约1％-至少约15％v/v的甲酰胺和至少约1-至少约2M的盐42℃杂交，与采用至少约1-至少约2M的盐42℃洗涤。低严谨性条件也可包括采用1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH7.2)、7％ SDS，65℃杂交，与(i)用2×SSC、0.1％ SDS；或(ii)用0.5％ BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH7.2)、5％SDS，室温洗涤。低严谨性条件的一个实施方式包括约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后至少在50℃(低严谨性条件的洗涤温度可升高至55℃)用0.2×SSC，0.1％ SDS洗涤两次。中严谨性条件包括采用至少约16-至少约30％v/v的甲酰胺和至少约0.5-至少约0.9M的盐42℃杂交，与采用至少约0.1-至少约0.2M的盐55℃洗涤。中严谨性条件也可包括采用1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5MNaHPO₄(pH7.2)、7％SDS，65℃杂交，与(i)用2×SSC、0.1％ SDS；或(ii)用0.5％ BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH7.2)、5％SDS，60-65℃洗涤。中严谨性条件的一个实施方式包括约45℃在6×SSC中杂交，然后60℃用0.2×SSC，0.1％ SDS洗涤一次或多次。高严谨性条件包括采用至少约31-至少约50％v/v的甲酰胺和约0.01-约0.15M的盐42℃杂交，与采用约0.01-约0.02M的盐55℃洗涤。高严谨性条件还可包括采用1％BSA、1mMEDTA、0.5M NaHPO₄(pH7.2)、7％SDS，65℃杂交，与(i)用0.2×SSC、0.1％SDS；或(ii)用0.5％ BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH7.2)、1％ SDS，65℃以上温度洗涤。高严谨性条件的一个实施方式包括约45℃在6×SSC中杂交，然后65℃用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤一次或多次。

在某些实施方式中，本发明的抗原结合分子由能在极高严谨性条件下与所述核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。极高严谨性条件的一个实施方式包括65℃在0.5M磷酸钠、7％ SDS中杂交，然后65℃用0.2×SSC，1％ SDS洗涤一次或多次。

本领域熟知其它严谨性条件，技术人员知道可操控各种因素来优化杂交的特异性。优化最终洗涤步骤的严谨性可确保高度杂交。详细例子可参见Ausubel等，同上，第2.10.1-2.10.16页和Sambrook等，(1989，同上)，第1.101-1.104部分。

虽然一般在约42℃-68℃温度下进行严谨性洗涤，但本领域技术人员知道其它温度也适合于严谨性条件。为形成DNA-DNA杂交体，最大杂交率一般发生在比T_m低约20℃-25℃的温度。本领域熟知T_m是解链温度，或者是两条互补多核苷酸序列解离的温度。本领域熟知估计T_m的方法(参见Ausubel等，同上，第2.10.8页)。总体上，可利用以下公式预测DNA形成最佳匹配双螺旋体的T_m近似值：

T_m＝81.5+16.6(log₁₀M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)

其中：M是Na⁺的浓度，优选0.01-0.4摩尔；％G+C是鸟苷和胞苷碱基之和占碱基总数的百分比，其范围在30％和75％G+C之间；％甲酰胺是以体积计的甲酰胺浓度百分比；长度是DNA双螺旋体中碱基对的数目。随机错配的碱基对数目每上升1％，双螺旋DNA的T_m降低约1℃。高严谨性洗涤通常在T_m-15℃进行，或者中等严谨性在T_m-30℃进行。

在杂交方法的一个例子中，42℃将含有固定DNA的膜(例如，硝酸纤维素膜或尼龙膜)在含有标记探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt溶液(0.1％菲科尔(ficoll)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)、0.1％ SDS和200mg/mL变性鲑鱼精子DNA)中杂交过夜。然后以中严谨性连续洗涤该膜两次(即，45℃用2×SSC、0.1％ SDS洗涤15分钟，然后50℃用2×SSC、0.1％ SDS洗涤15分钟)，再以较高严谨性连续洗涤两次(即，55℃用0.2×SSC、0.1％ SDS洗涤12分钟，然后65-68℃用0.2×SSC、0.1％ SDS溶液洗涤12分钟)。

5.本发明多肽

本发明还考虑了本发明内毒素血症标记基因编码的全长多肽以及那些多肽的生物学活性部分，在本文统称为“内毒素血症标记多肽”。全长内毒素血症标记多肽的生物学活性部分包含至少长约6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、60个氨基酸残基的具有免疫相互作用活性的部分。例如，本发明所考虑的免疫相互作用片段至少长6个，优选至少8个氨基酸残基，它们能在动物中引发免疫反应从而产生能与本发明内毒素血症标记多肽发生免疫相互作用的抗原结合分子。可用这种抗原结合分子筛检其它哺乳动物，特别是马类哺乳动物中结构和/或功能相关的内毒素血症标记多肽。全长内毒素血症标记多肽的各部分一般可能参与某种相互作用，例如分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可以是特异性结合相互作用或酶促相互作用(例如所述相互作用可以是瞬时性，可形成或打断某共价键)。全长内毒素血症标记多肽的生物学活性部分包括含有与某(假定的)全长内毒素血症标记多肽的氨基酸序列，例如以下所示的氨基酸序列足够相似或衍生自该氨基酸序列的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO：2、4、6、9、11、13、15、19、21、23、25、29、31、33、51、53或58，这些序列含有少于全长内毒素血症标记多肽的氨基酸并至少显示该多肽的一种活性。生物学活性部分通常包含至少具有全长内毒素血症标记多肽一种活性的结构域或基序。全长内毒素血症标记多肽的生物学活性部分可以是长，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900或1000个，或者甚至至少约2000或3000个，或更多个氨基酸残基的多肽。所述部分宜是含有不低于衍生其的全长多肽的约1％、10％、25％、50％活性的“生物学活性部分”。

本发明还考虑了变体内毒素血症标记多肽。“变体”多肽包括通过以下方式从天然蛋白质衍生的蛋白质：在该天然蛋白质的N-末端和/或C-末端删除(称为截短)或添加一个或多个氨基酸；在该天然蛋白质的一个或多个位点处删除或添加一个或多个氨基酸；或者在该天然蛋白质的一个或多个位点处取代一个或多个氨基酸。本发明的变体蛋白质具有生物学活性，即它们仍具有该天然蛋白质的所需生物学活性。例如，遗传多态性或人为操作可形成这种变体。通过本文所述的序列比对程序利用默认参数测定到本发明的天然内毒素血症标记多肽的生物学活性变体与天然蛋白质的氨基酸序列可具有至少40％、50％、60％、70％，一般至少75％、80％、85％，优选约90％-95％或更高，更优选约98％或更高的序列相似性。本发明蛋白质的生物学活性变体与该蛋白质一般可有多达1000、500、400、300、200、100、50或20个氨基酸残基，或者宜少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个(例如6-10个)、少至5个、少至4、3、2或者甚至1个氨基酸残基不同。

可以各种方式改变本发明的内毒素血症标记多肽，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。本领域公知这种操作方法。例如，可通过DNA突变制备内毒素血症标记蛋白质的氨基酸序列变体。本领域熟知诱变与改变核苷酸序列的方法。参见，例如Kunkel(1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488-492)，Kunkel等，(1987，Methods in Enzymol.，154：367-382)，美国专利4,873,192；Watson，J.D.等，(《基因的分子生物学》(Molecular Biology of the Gene)，第四版，本杰明/卡明斯公司(Benjamin/Cummings)，门洛帕克，加利福尼亚州，1987)和它们所引用的参考文献。适当进行氨基酸取代而不影响感兴趣蛋白质生物学活性的指导见Dayhoff等，(1978)，《蛋白质序列和结构图》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，(国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.)，华盛顿，哥伦比亚特区)的模型。本领域已知筛选通过点突变或截短(方法)制备的组合文库基因产物和筛选cDNA文库中具有所选特性的基因产物的方法。这些方法适用于快速筛选通过组合诱变产生的内毒素血症标记多肽的基因文库。可联用能提高这些文库中功能性突变频率的技术—递推集团诱变(REM)与筛选试验来鉴定内毒素血症标记多肽变体(Arkin和Yourvan，(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：7811-7815；Delgrave等，(1993)，Protein Engineering，6：327-331)。下文详述了理想的保守性取代，例如用另一个具有相似特性的氨基酸替换某一氨基酸。

与亲代内毒素血症标记氨基酸序列相比，变体内毒素血症标记多肽在沿其序列的不同位置可含有保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是用含有相似侧链的氨基酸残基取代某氨基酸残基。本领域定义了含有相似侧链的氨基酸残基家族，它们一般可再分为：

酸性：该残基因在生理pH下失去H离子而带负电荷，该残基受水溶液吸引，因此当包含它的肽处于生理pH水性介质中时，此残基处于该肽构型的表面位置。含有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。

碱性：该残基因在生理pH下或在生理pH的一两个pH单位内结合H离子而带正电荷(例如，组氨酸)，该残基受水溶液吸引，因此当包含它的肽处于生理pH水性介质中时，此残基处于该肽构型的表面位置。含有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。

带电荷的：这些残基在生理pH时带电荷，因此包括含有酸性或碱性侧链的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。

疏水性：这些残基在生理pH下不带电荷并被水溶液排斥，因此当包含它的肽处于水性介质中时，此残基处于该肽构型的内部位置。含有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

中性/极性：这些残基在生理pH下不带电荷，但水溶液不能充分排斥它们，因此当包含该残基的肽处于水性介质中时，此类残基处于该肽构型的内部位置。含有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。

本说明书也将某些氨基酸特征鉴定为“小的”氨基酸，因为它们的侧链不够大(甚至缺乏极性基团)因而不能赋予疏水性。除脯氨酸以外，“小的”氨基酸是当侧链上有至少一个极性基团时含有4个或更少的碳，和当侧链上没有极性基团时含有3个或更少的碳的那些氨基酸。含有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的二级氨基酸--脯氨酸因已知其对肽链的二级构型有影响而成为特例。脯氨酸的结构因其侧链与α-氨基的氮原子以及α-碳原子结合而不同于所有其它天然产生的氨基酸。例如Dayhoff等((1978)，“蛋白质进化改变的模型”(Amodel of evolutionary change in proteins))公开了几种氨基酸相似性矩阵(例如，PAM120矩阵和PAM250矩阵)。然而，刊于M.O.Dayhoff编的《蛋白质序列和结构图》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，第5卷，第345-358页，国家生物医学研究基金会(National Biomedical Research Foundation)，华盛顿，哥伦比亚特区；和Gonnet等，1992，Science，256(5062)：144301445中用于测定远程相关性矩阵将脯氨酸包括在甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的同一组中。因此，为本发明的目的将脯氨酸归类为“小”氨基酸。

将(氨基酸)分为极性或非极性类别所需的吸引或排斥程度是随意决定的，因此本发明专门考虑的氨基酸可分为一类或另一类。可根据已知的性能对大多数未专门命名的氨基酸进行分类。

氨基酸残基还可再分为环状或非环状，芳香族或非芳香族，根据残基的侧链取代基可自圆其说分类，和分成小的或大的。如果某残基总共含有4个或更少的碳原子(包括羧基碳)，认为其是小氨基酸，前提是存在其它极性取代基；如果不存在其它极性取代基，总共含3个或更少碳原子的残基可认为是小氨基酸。小残基当然总是非芳香族残基。可根据氨基酸残基的结构性能将其分入两种或更多种类。对于天然产生的蛋白质氨基酸，根据此方案的亚分类见表3。

保守性氨基酸取代还包括根据侧链分类。例如，含有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；含有脂族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；含有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；含有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理地预计用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺、丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构相关的氨基酸相似地取代某种氨基酸时不会严重影响所产生的变体多肽的性能。氨基酸改变是否能产生功能性内毒素血症标记多肽不难通过检验其活性来测定。保守性取代见下表4中示范性取代的标题。更优选的取代见优选取代标题。本发明范围内的氨基酸取代一般通过选择取代基来实现，所述选择的取代基应对维持：(a)取代区域肽骨架结构，(b)该分子靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积没有明显不同作用。引入取代基后，筛选具有生物学活性的变体。

或者，可根据侧链的相同性将制备保守性取代的相似氨基酸分为三类。如Zubay，G.，《生物化学》(Biochemistry)，第三版，Wm.C布朗出版社(Wm.C.BrownPublishers)，(1993)所述，第一组包括均含有带电荷侧链的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸。

因此，通常用同一侧链家族中的另一氨基酸残基取代内毒素血症标记多肽中预定的非必需氨基酸残基。或者，可沿着内毒素血症标记基因编码序列的全部或部分随机引入突变，例如通过饱和诱变，然后筛选得到的突变体有无亲代多肽的活性来鉴定保留了该活性的突变体。诱变编码序列后，可重组表达所编码的肽，测定该肽的活性。

因此，本发明还考虑天然产生的内毒素血症标记多肽序列的变体或它们的生物学活性片段，其中所述变体因添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基而与天然产生的序列相区别。总体上，变体可显示与亲代内毒素血症标记多肽序列，例如以下SEQ ID NO：2、4、6、9、11、13、15、19、21、23、25、29、31、33、51、53或58所示任一序列具有至少约30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的相似性。变体优选与亲代内毒素血症标记多肽序列，例如以下SEQ ID NO：2、4、6、9、11、13、15、19、21、23、25、29、31、33、51、53或58所示任一序列具有至少约30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的序列相同性。此外，本发明考虑因添加、缺失或取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、500或更多个氨基酸而与天然或亲代序列不同但仍保留该亲代内毒素血症标记多肽特性的序列。内毒素血症标记多肽也包括能在本文所述严谨条件下，特别是高严谨条件下与上述本发明内毒素血症标记多核苷酸序列或其非编码链杂交的多核苷酸编码的多肽。

在一个实施方式中，变体多肽与内毒素血症标记序列有至少一个但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基不同。在另一实施方式中，变体多肽与以下SEQ ID NO：2、4、6、9、11、13、15、19、21、23、25、29、31、33、51、53或58任一所示的相应序列有至少1％但低于20％、15％、10％或5％的残基不同。(如果此比较(方法)需要比对，则应比对这些序列的最大相似性。因缺失或插入或错配所产生的“环”外序列可认为有差别)。这些差别优选非必需残基的差别或改变，或保守性取代。

“非必需”氨基酸残基是某具体多肽的野生型序列中可改变但不破坏或基本上不改变其一种或多种活性的残基。所述改变优选基本上不改变这些活性之一，例如野生型活性的20％、40％、60％、70％或80％。“必需”氨基酸残基是当本发明内毒素血症标记多肽的野生型序列中该残基改变时会破坏亲代分子的活性，从而低于野生型多肽活性的20％。

在其它实施方式中，变体多肽包括与内毒素血症标记多肽的相应序列，例如以下SEQ ID NO：2、4、6、9、11、13、15、19、21、23、25、29、31、33、51、53或58所示任一序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％或更高相似性并具有该内毒素血症标记多肽活性的氨基酸序列。

可通过本领域技术人员已知的任何合适方法制备本发明的内毒素血症标记多肽。例如，可通过包括以下步骤的方法制备这些多肽：(a)制备含有编码某内毒素血症标记多核苷酸至少一部分和与调节元件操作性相连的核苷酸序列的嵌合型构建物；(b)将该嵌合型构建物引入宿主细胞中；(c)培养该宿主细胞表达该内毒素血症标记多肽；和(d)从宿主细胞中分离该内毒素血症标记多肽。在示范性的例子中，所述核苷酸序列编码以下SEQ ID NO：2、4、6、9、11、13、15、19、21、23、25、29、31、33、51、53或58任一所示的序列，或其变体的至少一部分。

嵌合型构建物通常采取表达载体的形式，宜选自自身复制的染色体外载体(例如质粒)和能整合入宿主基因组中的载体。

调节元件一般应适合于表达该内毒素血症标记多核苷酸所用的宿主细胞。本领域已知用于各种宿主细胞的许多类型的表达载体和调节元件。此类型的示范性元件包括但不限于：启动子序列(例如可以是天然产生的组成型或可诱导启动子或含有多个启动子的组合元件)、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列及增强子或激活序列。

在一些实施方式中，表达载体包含可选择的标记基因以选择转化的宿主细胞。可选择标记基因是本领域熟知的，随所用的宿主细胞而不同。

所述表达载体还可包含融合伴侣(通常由表达载体提供)从而可将内毒素血症标记多肽制备成含有融合伴侣的融合多肽。融合伴侣的主要优点是它们有助于鉴定和/或纯化融合多肽。为制备融合多肽，需要将内毒素血症标记多核苷酸连接入表达载体，从而使融合伴侣与内毒素血症标记多核苷酸的翻译读框重合。融合伴侣的熟知例子包括但不限于：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麦芽糖结合蛋白(MBP)和六个组氨酸(hexahistidine)(HIS₆)，这些伴侣特别可用于通过亲和层析分离融合多肽。在一些实施方式中，可利用与融合伴侣结合的基质(例如但不限于：谷胱甘肽-、直链淀粉-和镍-或钴-偶联树脂)通过亲和层析来纯化这些融合多肽。许多这种基质可以“试剂盒”形式购得，例如利用(HIS₆)融合伴侣的QIA快速(QIAexpress^TM)系统(恰根公司(Qiagen))和法玛西亚公司(Pharmacia)GST纯化系统。本领域已知的其它融合伴侣是发光蛋白质，例如可作为荧光“标签”通过荧光显微术或流式细胞术来鉴定和/或分离融合多肽的绿色荧光蛋白(GFP)和萤光素酶。流式细胞术方法，例如荧光激活细胞分选(FACS)法在该后一应用中特别有用。

融合伴侣也优选含有蛋白酶切割位点，例如因子X_a或凝血酶的切割位点，从而可用相关蛋白酶部分消化该融合多肽而从融合构建物中释放内毒素血症标记多肽。随后可通过层析分离方法分离所释放的多肽与融合伴侣。

融合伴侣的范围也包括“表位标签”，这些标签通常是可获得其特异性抗体的短肽序列。易于获得其特异性单克隆抗体的表位标签的熟知例子包括c-Myc、流感病毒血凝素和FLAG标签。

可通过包括“转导”和“转染”等适当方法将本发明的嵌合型构建物引入宿主中，这在技术上意味着通过核酸介导的基因转移将核酸，例如表达载体引入受者细胞中。然而，“转化”指宿主的基因型因细胞摄入外源性DNA或RNA而改变的过程，例如转化细胞含有本发明的表达系统。将嵌合型构建物引入细胞有许多方法。所用的方法一般取决于宿主细胞的选择。本领域技术人员熟知将嵌合型构建物引入宿主细胞的技术。四类将核酸分子递送入细胞的方法已见描述：(1)化学方法，例如磷酸钙沉淀、聚乙二醇(PEG)-介导的沉淀和脂质转染；(2)物理方法，例如显微注射、电穿孔、加速方法和真空渗透；(3)载体方法，例如细菌和病毒载体介导的转化；和(4)受体介导的转化。本领域技术人员熟知这些和其它类型的转化技术，而新的技术也不断涌现。具体选择转化技术取决于该技术转化特定宿主细胞的效率以及采用具体选择的方法实施本发明之人的经验和偏好。技术人员明白将嵌合型构建物引入细胞中的转化系统的具体选择不是实质性的或对本发明的限制，只要该系统能实现可接受的核酸转移水平。

可通过培养用嵌合型构建物转化的宿主细胞来制备重组内毒素血症标记多肽。适合表达内毒素血症标记多核苷酸的条件随所选表达载体和宿主细胞而不同，技术人员通过常规实验不难确定这些条件。适合表达的宿主细胞可以是原核或真核细胞。表达本发明多肽的示范性宿主细胞是细菌。所用的细菌可以是大肠杆菌(Escherichia coli)。或者，宿主细胞可以是酵母菌细胞或昆虫细胞，例如利用杆状病毒表达系统的SF9细胞。

可采用如Sambrook等，(1989，同上)，特别是第16和17部分；Ausubel等，(1994，同上)，特别是第10和16章；和Coligan等，《蛋白质科学的最新方法》(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)，(约翰威利父子公司，1995-1997)，特别是第1、5和6章中所述的标准方法不难制备重组内毒素血症标记多肽。或者，可通过化学合成，例如采用如Atherton和Shephard，(同上)第9章和Roberge等，(1995，Science，269：202)中所述的液相合成或固相合成法来合成内毒素血症标记多肽。

6.抗原结合分子

本发明还提供可与本发明内毒素血症标记多肽发生特异性免疫相互作用的抗原结合分子。在一个实施方式中，该抗原结合分子包括多克隆全抗体。可通过，例如将本发明的内毒素血症标记多肽注射入产(抗体)的动物(包括小鼠或家兔)以获得多克隆抗血清来制备这种抗体。本领域技术人员熟知制备多克隆抗体的方法。可采用的示范性方法见，例如Coligan等，《免疫学最新方法》(CURRENT PROTOCOLSIN IMMUNOLOGY)，(约翰威利父子公司，1991)和Ausubel等，(1994-1998，同上)，特别是第11章的第III部分。

可采用，例如

和Milstein(1975，Nature，256，495-497)所述的标准方法或采用，例如Coligan等，(1991，同上)所述更新的改进方法，用源自接种了一种或多种本发明内毒素血症标记多肽的产(抗体)动物的无限增殖脾细胞或其它产抗体细胞来制备单克隆抗体，替代从产(抗体)动物的多克隆抗血清。

本发明也考虑用Fv、Fab、Fab′和F(ab′)₂免疫球蛋白片段作为抗原结合分子。或者，抗原结合分子可包括合成的稳定Fv片段。此类型的示范性片段包括用肽接头分别桥连V_H结构域的N末端或C末端与V_L结构域的C末端或N-末端的单链Fv片段(sFv，通常称为scFv)。ScFv缺乏全抗体的所有恒定区，因而不能激活补体。可根据，例如Kreber等(Kreber等，1997，J.Immunol.Methods，201(1)：35-55)所概述的方法制备ScFv。或者，可通过美国专利5,091,513；欧洲专利239,400或Winter和Milstein的文章(1991，Nature，349：293)和Plückthun等(1996，刊于《抗体工程改造：一种实用方法》(Antibody engineering：A practical approach)，203-252)所述的方法制备它们。在另一实施方案中，合成的稳定Fv片段包括二硫键稳定的Fv(dsFv)，在该片段中有两个半胱氨酸残基引入V_H和V_L结构域从而在完全折叠的Fv分子中此二残基之间形成二硫键。产生dsFv的合适方法描述于，例如(Glockscuther等，Biochem.，29：1363-1367；Reiter等，1994，J.Biol.Chem.，269：18327-18331；Reiter等，1994，Biochem.，33：5451-5459；Reiter等，1994，CancerRes.，54：2714-2718；Webber等，1995，Mol.Immunol.，32：249-258)。

本领域已知制备抗-内毒素血症标记多肽的抗原结合分子的噬菌体展示与组合方法(例如，以下文献中所述的：Ladner等，美国专利5,223,409；Kang等，国际公布号WO 92/18619；Dower等，国际公布号WO 91/17271；Winter等，国际公布WO 92/20791；Markland等，国际公布号WO 92/15679；Breitling等，国际公布WO 93/01288；McCafferty等，国际公布号WO 92/01047；Garrard等，国际公布号WO 92/09690；Ladner等，国际公布号WO 90/02809；Fuchs等，(1991)，Bio/Technology，9：1370-1372；Hay等，(1992)，Hum Antibod Hybridomas，3：81-85；Huse等，(1989)，Science，246：1275-1281；Griffths等，(1993)，EMBOJ，12：725-734；Hawkins等，(1992)，JMol Biol，226：889-896；Clackson等，(1991)，Nature，352：624-628；Gram等，(1992)，PNAS，89：3576-3580；Garrad等，(1991)，Bio/Technology，9：1373-1377；Hoogenboom等，(1991)，Nuc Acid Res，19：4133-4137；和Barbas等，(1991)，PNAS，88：7978-7982)。这些抗原结合分子可用于筛选表达文库中的变体内毒素血症标记多肽。它们也可用于检测和/或分离本发明的内毒素血症标记多肽。因此，本发明也考虑利用这些抗原结合分子，采用例如任何合适的免疫亲和方法(包括但不限于免疫层析和免疫沉淀)来分离内毒素血症标记多肽。合适的方法利用固相吸附，其中将抗-内毒素血症标记多肽的抗原结合分子与合适的树脂相连，使该树脂与怀疑含有内毒素血症标记多肽的样品接触，然后从树脂上洗脱内毒素血症标记多肽(如果存在的话)。示范性树脂包括：琼脂糖(

)(法玛西亚公司)、多孔(

)树脂(罗氏分子生物化学公司(Roche Molecular Biochemicals)，印第安纳波利斯)、阿卡特吉尔超流(Actigel Superflow^TM)树脂(斯特罗基因生物分离公司(Sterogene Bioseparations Inc.)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)和戴娜珠(Dynabeads^TM)(戴娜公司(Dynal Inc.)，成功湖，纽约州)。

可将抗原结合分子与化合物，例如标记物，如放射性核素，或成像试剂，如放射性、酶活性(试剂)或其它成像试剂，如NMR对比试剂相偶联。优选能产生可检测的放射性射线或荧光的标记物。为评估蛋白质表达的丰度和模式，可利用抗-内毒素血症标记多肽的抗原结合分子(例如，单克隆抗体)来检测内毒素血症标记多肽(例如，细胞裂解物或细胞上清液中的)。在本发明的某些优选应用中，可用这种抗原结合分子来监测生物学样品(含有完整的细胞和液体)中的内毒素血症标记多肽水平而诊断是否存在内毒素血症及其程度或发展阶段。将抗体与可检测物质(即，标记抗体)相偶联(即，物理连接)有助于检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素与亲和素/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三吖嗪胺荧光素(dichlorotriazinylaminefluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、荧光素和水母蛋白；合适的放射性材料的例子包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。标记物可选自：色原、催化剂、酶、荧光基团、化学发光分子、镧系离子，如铕(Eu³⁴)、放射性同位素和可直接观察的标记物。就可直接观察标记物而言，可用胶体金属颗粒或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物、乳胶颗粒、脂质体或含有信号产生物质的其它载体等制备这种标记。

美国专利说明书U.S.4,366,241；U.S.4,843,000和U.S.4,849,338公开了大量可用作标记物的酶。本发明可用的酶标记物包括：碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等。酶标记物可在溶液中单独使用或与第二种酶联用。

7.检测内毒素血症标记基因表达异常或存在内毒素血症标记多核苷酸的方法

本发明部分基于以下发现：与正常的马匹或无内毒素血症相关病症的马匹相比，具有内毒素血症相关病症临床证据的马匹的某些基因(本文称为内毒素血症标记基因)表达异常，这些基因的转录物包括但不限于：SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325。

因此，在某些实施方式中，本发明的特征在于通过检测获自某对象的生物学样品中内毒素血症标记基因的异常表达来诊断该对象是否存在内毒素血症、其程度或阶段的方法，所述对象通常是马源的。因此，为作出这种诊断，需要定性或定量测定内毒素血症标记基因转录物的水平、或内毒素血症标记多肽的水平或功能活性。在一些实施方式中，当检测到生物学样品中内毒素血症标记基因产物表达水平低于取自正常对象或无该病症对象的参比样品中该基因的水平时，可诊断存在内毒素血症相关病症、其程度或发展阶段。在其它实施方式中，当检测到生物学样品中内毒素血症标记基因产物表达水平高于取自正常对象或无内毒素血症相关病症对象的参比样品中该基因的水平时，则可诊断存在内毒素血症相关病症、其程度或发展阶段。总之，当生物学样品中的内毒素血症标记基因产物的水平或功能活性与参比样品中相应的内毒素血症标记基因产物的水平或功能活性相比至少有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少约99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％，或甚至至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的差异时，可作出这种诊断。相应的基因产物通常选自生物学样品中存在的同一基因产物，变体基因(例如，同源或直向同源基因)，包括等位基因变体或剪接变体所表达的基因产物或它们的蛋白质产物。在一些实施方式中，该方法包括检测至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种内毒素血症标记基因各表达产物的水平或功能活性。

生物学样品一般包括血液，特别是外周血，或其组分或提取物。生物学样品通常含有血细胞，例如成熟、不成熟和发育的白细胞，包括淋巴细胞、多形核白细胞、嗜中性白细胞、单核细胞、网织红细胞、嗜碱性粒细胞、腔胞、血细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、天然杀伤细胞，或这些细胞的组分(例如，核酸或蛋白质组分)。在特定的实施方式中，生物学样品含有白细胞，包括外周血单核的细胞(PBMC)。

7.1核酸诊断

可按照标准方法(Sambrook等，1989，同上；Ausubel等，1994，同上)从生物学样品所含细胞中分离核酸用于多核苷酸试验。所述核酸一般是经分级的(例如，poly A⁺RNA)或全细胞RNA。当将RNA用作检测对象时，需要将RNA转变为其互补DNA。在一些实施方式中，采用模板依赖性核酸扩增技术扩增该核酸。已有许多模板依赖性方法可用来扩增某给定模板样品中存在的内毒素血症标记序列。示范性核酸扩增技术详述于美国专利号4,683,195；4,683,202和4,800,159；Ausubel等(同上)和Innis等，(《PCR方法》(PCR Protocols)，学术出版社公司(AcademicPress，Inc.)，圣迭戈，加利福尼亚州，1990)中的聚合酶链式反应(称为PCR)。简言之，在PCR中，制备与该标记序列的相对互补链上区域互补的两条引物序列。向反应混合物中加入过量的脱氧核苷三磷酸和DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。如果某样品中存在同源内毒素血症标记序列，这些引物将与该标记(序列)结合，聚合酶可通过添加核苷酸使该引物沿此标记序列延伸。通过升高和降低反应混合物的温度，延伸的引物可与标记(序列)解离形成反应产物，过量的引物可与标记(序列)和反应产物结合，和反复进行该过程。为定量测定所扩增的mRNA量，可采用逆转录酶PCR扩增方法。将RNA逆转录为cDNA的方法是熟知的，描述于Sambrook等，1989，同上。其它逆转录方法利用热稳定的RNA依赖性DNA聚合酶。WO90/07641描述了这些方法。本领域熟知聚合酶链式反应方法。

在某些优选实施方式中，模板依赖性扩增包括实时定量测定转录物。例如，可采用实时PCR技术(Higuchi等，1992，Biotechnology，10：413-417)定量测定RNA或DNA。通过测定PCR反应中完成相同扩增轮次并处于线性范围内的靶DNA扩增产物的浓度，可以确定原始DNA混合物中特异性靶序列的相对浓度。如果DNA混合物是从分离自不同组织或细胞的RNA合成的cDNA，则可测定各组织或细胞中产生该靶序列的特异性mRNA的相对丰度。PCR产物的浓度与mRNA相对丰度之间的这种直接正比例关系只在PCR反应的线性范围内才正确。可通过反应混合物中试剂的利用率测定该曲线平台部分靶DNA的终浓度，该终浓度不依赖于靶DNA的初始浓度。

另一扩增方法是EPO 320 308所公开的连接酶链式反应(“LCR”)。在LCR中，制备两对互补探针，在靶序列存在下每对探针与靶序列的相反互补链结合从而使它们毗邻。在连接酶存在下，此两对探针可相连形成一个单位。与PCR中一样，通过温度循环，使结合的连接单位与靶序列解离，然后用作连接过量探针对的“靶序列”。美国专利4,883,750描述了与LCR相似，使探针对和靶序列结合的方法。

也可使用PCT申请号PCT/US87/00880所述的Qβ复制酶。在此方法中，在RNA聚合酶存在下将含有与靶序列互补区域的RNA复制序列加入样品中。聚合酶可拷贝该复制序列，然后检测。

还可用恒温扩增方法扩增本发明的核酸，该方法利用限制性核酸内切酶和连接酶扩增在一条链的限制性位点含有核苷酸5′α-硫代-三磷酸的靶分子，Walker等，(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，89：392-396)。

链置换扩增(SDA)是进行核酸恒温扩增的另一种方法，该方法包括多轮链置换与合成，即切口平移。称为修复链式反应(RCR)的相似方法包括使几种探针在要扩增的靶区域上退火，然后只在四种碱基中的两种处进行修复反应。为便于检测，将另两种碱基以生物素化衍生物加入。SDA中采用了类似的方法。也可采用循环探针反应(cyclic probe reaction)(CPR)检测特异性靶序列。在CPR中，含有非特异性DNA的3’和5’序列与特异性RNA中段序列的探针与样品中存在的DNA杂交。杂交后，用RNA酶H处理反应(混合物)，探针的产物鉴定为消化后释放的不同产物。使原始模板与另一循环探针退火，重复进行此反应。

还可采用英国申请号2 202 328和PCT申请号PCT/US89/01025所述的另一种扩增方法。在前一申请中，将“修饰的”引物用于PCR-样的模板和酶依赖性合成中。可用捕获部分(例如，生物素)和/或检测部分(例如，酶)标记来修饰这些引物。在后一申请中，将过量的标记探针加入样品。在靶序列存在下，探针结合并被催化切割。切割后，靶序列完整释放进而与过量探针结合。切割标记的探针放出靶序列存在的信号。

其它核酸扩增方法包括转录扩增系统(TAS)，包括核酸序列扩增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：1173；Gingeras等，PCT申请WO 88/10315)。在NASBA中，可通过临床样品的标准苯酚/氯仿提取、热变性、裂解缓冲液处理和微量离心(minispin)柱分离DNA和RNA或通过盐酸胍提取RNA来制备用于扩增的核酸。这些扩增技术包括使含有靶特异性序列的引物退火。聚合后，用RNA酶H消化DNA/RNA杂交体，同时加热双链DNA分子使之再次变性。在两种情况中，通过加入第二条靶特异性引物然后聚合将单链DNA制成完全双链。然后用RNA聚合酶，例如T7或SP6多次转录该双链DNA分子。在恒温循环反应中，将RNA逆转录为单链DNA，然后转变为双链DNA，接着用RNA聚合酶，例如T7或SP6再一次转录。得到的产物无论是截短的还是完整的均显示为靶特异性序列。

Vincent和Kong披露了称为解旋酶依赖性恒温DNA扩增(HAD)的方法(Vincent和Kong，EMBO Reports，5(8)：795-800，2004)。该方法利用DNA解旋酶分离DNA链，因而无需热循环。整个反应可以在一种温度下进行，该方法应能广泛适用于实时DNA诊断(point-of-care DNA diagnostics)。

Davey等，EPO 329 822公开了一种核酸扩增方法，包括可用于本发明的循环合成的单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)。ssRNA是逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)延伸的第一引物寡核苷酸的模板。然后利用核糖核酸酶H(RNA酶H，对含DNA或RNA的双螺旋中RNA具有特异性的RNA酶)的作用除去所产生的DNA:RNA双螺旋体中的RNA。产生的ssDNA是第二引物的模板，该引物在5’(端)也含有与该模板同源的RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)的启动子序列。然后用DNA聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶I的大“Klenow”片段)延伸此引物，得到双链DNA(“dsDNA”)分子，其序列与引物之间的原始RNA相同，在一末端还含有启动子序列。合适的RNA聚合酶可利用此启动子序列制备该DNA的多份RNA拷贝。然后这些拷贝可再进入循环导致快速扩增。利用适当选择的酶可恒温进行此扩增(方法)而无需在每轮加入酶。由于此方法的循环性质，可选择DNA或RNA形式的起始序列。

Miller等在PCT申请WO 89/06700中公开的核酸序列扩增方案根据启动子/引物序列与单链靶DNA(“ssDNA”)杂交，然后转录该序列的多份RNA拷贝。此方案不是循环性的，即得到的RNA转录物不产生新模板。其它扩增方法包括“RACE”和“单边(one-sided)PCR”(Frohman，M.A.，刊于《PCR方法：方法与应用指南》(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)，学术出版社，纽约州，1990；Ohara等，1989，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，86：5673-567)。

也可采用能在含有所产生的“二-寡核苷酸”序列的核酸存在下能连接两条(或多条)寡核苷酸从而扩增该“二-寡核苷酸”的方法来扩增靶核酸序列。Wu等，(1989，Genomics，4：560)。

取决于所用的方式，可采用例如上述模板依赖性扩增或在扩增后用第二种已知的核酸直接鉴定样品中感兴趣的内毒素血症标记核酸。然后检测所鉴定的产物。在某些应用中，可通过目测方法进行检测(例如，凝胶的溴化乙锭染色)。或者，检测可涉及通过化学发光、放射性标记的放射性闪烁照相术或荧光标记物或甚至通过利用电或热脉冲信号的系统来间接鉴定产物(艾飞麦克斯技术公司(AffymaxTechnology)；Bellus，1994，J Macromol.Sci.Pure，Appl.Chem.，A31(1)：1355-1376)。

在一些实施方式中，可观察扩增产物或“扩增子”以证实内毒素血症标记序列的扩增。一种典型的目测方法包括用溴化乙锭染色凝胶后在UV光下观察。或者，如果扩增产物整合标记了放射性或荧光标记的核苷酸，可在分离后使这些扩增产物接触x-射线胶片或在合适的激发光谱下观察。在一些实施方式中，可间接进行观察。扩增产物分离后，使标记的核酸探针与扩增的内毒素血症标记序列接触。探针宜与生色团偶联，但也可放射性标记。或者，将探针与结合伴侣，例如抗原结合分子或生物素偶联，而结合对的另一成员携带可检测部分或报道分子。所涉及的技术是本领域技术人员熟知的，可在许多分子方法的标准教科书(例如，参见Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1994，同上)中找到。例如，可在扩增期间或其后用生色团或放射性标记的探针或引物鉴定靶(序列)。

在某些实施方案中，采用本领域技术人员熟知的印迹技术定量测定靶核酸。Sourthern印迹将DNA用作靶标，而Northern印迹将RNA用作靶标。各方法可提供不同类型的信息，虽然cDNA印迹在许多方面与RNA印迹相似。简言之，用探针靶向已固定于合适基质上，通常是硝酸纤维素滤膜上的DNA或RNA。不同种类核酸在空间上应分置以便分析。这常通过核酸凝胶电泳，然后“印迹”到滤膜上来实现。随后，在促进变性和再杂交(rehybridisation)的条件下共同温育印迹的靶(序列)与探针(通常作了标记)。因为探针设计为与靶(序列)碱基配对，探针可在复性条件下与靶序列的一部分结合。然后除去未结合的探针，如上所述进行检测。

检测/定量测定后，可将某给定对象的所见结果与对照反应或正常对象或无内毒素血症相关病症的对象的有统计学意义的参比组作比较。以此方式可使所检测到的内毒素血症标记核酸含量与疾病的进程或严重程度相关联。

本发明也考虑如Kristensen等，(Biotechniques，30(2)：318-322)所述的基因分型方法和等位基因鉴别方法和技术，这些方法和技术包括采用单个核苷酸多态性分析、高效液相层析、泰克曼()、液相层析和质谱。

本发明还考虑了生物芯片技术，例如Hacia等(1996，Nature Genetics，14：441-447)和Shoemaker等(1996，Nature Genetics，14：450-456)所述的技术。简言之，这些技术包括快速精确地分析许多基因的定量测定方法。通过用寡核苷酸给基因加标签或者利用固定的探针阵列，可用生物芯片技术将靶分子分隔成高密度阵列并根据杂交筛选这些分子。也参见Pease等(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：5022-5026)；Fodor等(1991，Science，251：767-773)。简言之，如本文所概述，制备内毒素血症标记多核苷酸的核酸探针，将其与用于筛选和诊断方法的生物芯片相连。可将连接于生物芯片的核酸探针设计为基本上与特异性表达的内毒素血症标记核酸，即靶序列(无论是样品的靶序列还是其它探针序列，例如夹心测定中的序列)互补，从而使靶序列与本发明的探针杂交。此互补性无需完美；靶序列与本发明的核酸探针之间可存在一定数量的会干扰杂交的碱基对错配。然而，如果错配的数目太大以致于即使在最低严谨性杂交条件下也不发生杂交，则该序列不是互补靶序列。在某些实施方式中，每条序列可利用多种探针，可利用重叠的探针或针对靶序列不同区段的探针。即，可用两种、三种、四种或更多种探针(优选三种)构成具体靶(序列)的冗余度。这些探针可以是重叠的(即有一些序列相同)或不同的。

本领域普通技术人员应该知道，可以各种方式将核酸连接于或固定于固体支持物。本文的“固定的”或其语法等价词表示核酸探针与固体支持物之间的连接或结合在下述结合、洗涤、分析和去除条件下足够稳定。结合可以是共价或非共价的。本文的“非共价结合”与其语法等价词表示静电、亲水性和疏水性相互作用的一种或多种。非共价结合包括分子，例如链霉亲和素与支持物的共价连接以及生物素化探针与链霉亲和素的非共价结合。本文的“共价结合”及其语法等价词表示两部分，即固体支持物与探针至少通过一根键，包括σ键、π键和配位键相连。探针与固体支持物之间可直接形成共价键，或者可通过交联接头或通过固体支持物或探针二者或此两种分子所含的特异性反应活性基团来形成共价键。固定化也可包括共价和非共价相互作用的组合。

总之，本领域技术人员知道可以各种方式连接探针与生物芯片。如本文所述，可先合成核酸，然后与生物芯片相连，或者可直接在生物芯片上合成核酸。

生物芯片包含合适的固体或半固体基板或固体支持物。“基板”或“固体支持物”表示经修饰而含有适合与核酸探针相连或结合的不连续多个位点并适用于至少一种检测方法的任何材料。本领域技术人员知道可用的基板很多，包括但不限于：玻璃和修饰或功能化的玻璃，塑料(丙烯酸、聚苯乙烯与苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟龙(Teflon^TM)等)，多糖，尼龙或硝酸纤维素，树脂，二氧化硅或硅材料(包括硅和修饰的硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料等。总之，这些基板可用光学方法检测并且没有可见的荧光。

所述基板一般是平的，虽然本领域技术人员知道也可利用其它构型的基板。例如，为分析流过的样品而尽可能降低样品体积，可将探针置于试管的内表面。类似地，所述基板可以是可弯曲的，例如可弯曲的泡沫塑料，包括特殊塑料制成的闭孔泡沫塑料(closed cell foam)。

在某些实施方式中，本领域已知可在基板上合成寡核苷酸探针。例如，可采用利用光聚合化合物和技术的光活化技术。在一示范性例子中，采用熟知的光版印刷技术，例如WO 95/25116；WO 95/35505；美国专利号5,700,637和5,445,934及其引用的参考文献中所述的技术原位合成核酸；这些连接方法构成(艾飞麦特里克斯基因芯片)(Affymetrix GeneChip^TM)技术的基础。

在一示范性生物芯片分析的例子中，使生物芯片上的寡核苷酸探针在促进特异性杂交的条件下与怀疑含有一种或多种内毒素血症多核苷酸的核酸样品接触。可用生物材料的悬液制备DNA或RNA样品提取物(无论单链或双链)，或者研碎生物材料，或者在细胞裂解步骤后制备，所述步骤包括但不限于：用SDS(或其它洗涤剂)、渗透压冲击、异硫氰酸胍和溶菌酶处理进行裂解。可用于本发明方法的合适DNA包括cDNA。可采用多种常用方法之一制备这种DNA，例如见Ausubel等，1994，同上；和Sambrook等，1989，同上所述。

可用于本发明方法的合适RNA包括信使RNA、DNA转录的互补RNA(cRNA)或基因组RNA或亚基因组RNA。可采用标准方法制备这种RNA，例如Ausubel等，1994，同上；和Sambrook等，1989，同上的相关章节所述。

可通过，例如超声波处理或用限制性核酸内切酶处理使cDNA片段化。优选片段化cDNA从而使产生的DNA片段长于固定的寡核苷酸探针，但足够小而可在合适的杂交条件下快速接触固定的探针。或者，可采用例如上述合适的核苷酸扩增技术来选择和扩增cDNA片段，这涉及利用合适的随机或特异性引物。

通常可检测地标记靶内毒素血症标记多核苷酸从而可测定它们与各探针的杂交。通常用报道分子可检测地标记靶多核苷酸，所述报道分子的示范性例子包括色原、催化剂、酶、荧光染料、化学发光分子、生物发光分子、镧系离子(例如，Eu34)、放射性同位素和可直接观察的标记物。对于可直接观察的标记物，可利用胶体金属颗粒或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物、乳胶颗粒、脂质体或含有产信号物质的其它载体等。此类示范性标记物包括大的胶体，例如金属胶体，如金、硒、银、锡和钛氧化物。在一些将酶用作直接观察标记物的实施方式中，将生物素化碱基掺入靶多核苷酸中。通过与链霉亲和素-报道分子温育来检测杂交。

合适的荧光染料包括但不限于：异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、R-藻红蛋白(RPE)和得克萨斯红(Texas Red)。其它示范性荧光染料包括Dower等(国际公布WO 93/06121)中所述的。荧光染料也可参考美国专利5,573,909(Singer等)；5,326,692(Brinkley等)所述的。或者，荧光染料可参考美国专利号5,227,487；5,274,113；5,405,975；5,433,896；5,442,045；5,451,663；5,453,517；5,459,276；5,516,864；5,648,270和5,723,218中所述。可购得的荧光标记物包括，例如荧光素亚磷酰胺，如弗鲁尔普莱姆(Fluoreprime^TM)(法玛西亚)、弗鲁尔戴特(Fluoredite^TM)(米利波尔公司(Millipore))和FAM(应用生物系统国际公司(AppliedBiosystems International))。

放射性报道分子包括，例如可通过X-射线或磷酸成像(phosphoimager)技术检测的³²P。

可在适合于寡核苷酸探针与测试核酸(包括DNA或RNA)杂交的条件下进行杂交体形成步骤。就此而言，可参考例如《核酸杂交，一种实用方法》(NUCLEIC ACIDHYBRIDIZATION，A PRACTICAL APPROACH)，(Homes和Higgins编)，(IRL出版社(IRL press)，华盛顿，哥伦比亚特区，1985)。总之，杂交是否发生受寡核苷酸探针和所测试多核苷酸序列的长度、pH、温度、一价和二价阳离子的浓度、杂交体形成区中G和C核苷酸的比例、介质粘度和可能存在的变性剂的影响。这些可变因素也影响杂交所需时间。因此，优选的条件取决于具体应用。然而，可常规确定这些经验性条件而无需过多实验。

某些优选实施方式采用高度鉴别性杂交条件。例如，可参考Wallace等(1979，Nucl.Acids Res.，6：3543)，他描述了与含有一对内部碱基错配的相似寡核苷酸探针相比，能区别与靶序列完美匹配和完全同源的11-17个碱基长的寡核苷酸探针的杂交条件。也可参考Wood等(1985，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，82：1585)，他描述了利用3M氯化四甲铵使11-20个碱基长的寡核苷酸杂交的条件，其中杂交体的解链温度只取决于该寡核苷酸探针的长度，而无论其GC含量。此外，Drmanac等(同上)描述了6-10个核苷酸长的寡聚物的严谨杂交条件，利用核苷酸类似物，例如“锁定核酸”不难获得相似的条件(Christensen等，2001，Biochem J，354：481-4)。

杂交反应一般可在杂交缓冲液存在下进行，所述缓冲液任选含有杂交优化试剂，例如稳定剂(isostabilising agent)、变性剂和/或复性加速剂。稳定剂的例子包括但不限于：甜菜碱和低级四烷基铵盐。变性剂是通过干扰双链核酸碱基之间的氢键或核酸分子的水合作用来降低双链核酸分子解链温度的组合物。变性剂包括但不限于：甲酰胺、甲醛、二甲基亚砜、四乙基乙酸酯(tetraethyl acetate)、脲、异硫氰酸胍、甘油和离液盐。杂交加速剂包括核内不均一核糖蛋白(hnRP)A1和阳离子洗涤剂，如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)、聚赖氨酸、精胺、亚精胺、单链结合蛋白(SSB)、噬菌体T4基因32蛋白及乙酸铵和乙醇的混合物。杂交缓冲液可含有浓度为约0.005-约50nM、优选约0.5-5nM、更优选约1-2nM的靶多核苷酸。

室温下使含有靶内毒素血症标记多核苷酸的杂交混合物与探针阵列接触并温育适当时间以使靶多核苷酸中的靶序列与任何互补探针杂交。可在任何合适的容器中进行接触，例如设计用于盛放其上连接有探针的固体支持物的碟或小室。温育温度通常为核酸杂交所用温度，例如约20℃-约75℃、如约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃，或约65℃。长度超过14个核苷酸的探针优选20-50℃。对于较短的探针，优选较低温度。将靶多核苷酸样品与探针培育足够时间使靶多核苷酸中的靶序列与任何互补探针之间达到所需杂交水平。例如，可在约45℃+/-10℃在甲酰胺中杂交1-2天。

杂交体形成步骤后，用杂交缓冲液洗涤探针以除去任何未结合的核酸，该杂交缓冲液含有与杂交步骤所用浓度相同的杂交优化剂。此洗涤步骤只留下结合的靶多核苷酸。然后检测探针以鉴定哪些探针与靶多核苷酸杂交。

然后检测杂交反应以确定哪种探针与相应的靶序列杂交。依据与靶多核苷酸连接的报道分子的性质，可通过以下方式用仪器检测信号：用光照射荧光标记物，用荧光计检测荧光；提供酶系统以产生可用分光光度计检测的颜色；或者用光反射仪检测染料颗粒或有色的胶体金属颗粒或非金属颗粒；用放射性标记物或化学发光分子时采用辐射计数器或放射自显影术。因此，检测装置应适用于检测或扫描标记物相关的光，所述光可包括荧光、冷光、聚焦光束或激光。此时，可用电荷耦合器件(CCD)或光电池来扫描微阵列中各位置探针：靶多核苷酸杂交体发射的光并用数字计算机直接记录数据。在一些情况中，无需电子检测信号。例如，采用酶产生与核酸阵列模式相关的颜色斑点，目测该阵列就可解读阵列上的模式。在核酸阵列情况中，检测装置优选与模式识别软件相联系从而能将阵列的信号模式转化为明语遗传分布模式(plain language genetic profile)。在某些实施方式中，不同内毒素血症应激标记基因产物的特异性寡核苷酸探针采取核酸阵列形式，用“芯片阅读器”检测阵列上报道分子所产生的信号。“芯片阅读器”可利用的检测系统如Pirrung等(美国专利5,143,854)所述。芯片阅读器通常也整合了一些信号加工(元件)来确定某具体阵列位置或元件处的信号是真阳性或者可能是假信号。示范性芯片阅读器例如Fodor等(美国专利5,925,525)所述。或者，当阵列是由各种可寻址型标记的微珠混合物制成时，可采用流式细胞术检测该反应。

7.2蛋白质诊断

与本发明一致的是，存在异常浓度的内毒素血症标记蛋白质表明内毒素血症相关病症的存在、程度或发展阶段。可采用本领域已知的任何合适方法检测生物学样品中内毒素血症标记蛋白质的水平。例如，当内毒素血症标记蛋白质是酶时，可根据其催化活性或根据样品中该蛋白质分子含量来定量测定该蛋白质。可采用抗体技术，例如免疫组织学和免疫组织化学方法来检测组织样品中感兴趣蛋白质的水平。例如，用一抗(多克隆或单克隆)提供特异性识别，用第二检测系统检测一抗的存在(或结合)。可将可检测标记物，例如荧光标记物、放射性标记物或能产生可定量测定(如有色的)产物的酶(如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)与二抗相偶联。在另一合适方法中，可检测性地标记一抗本身。因此可对组织切片作免疫组织学标记。在一些实施方式中，从生物学样品(例如，组织、细胞)中制备蛋白提取物用于分析。可采用常规免疫印迹方法(Jalkanen等，1985，J.Cell.Biol.，101：976-985；Jalkanen等，1987，J.Cell.Biol.，105：3087-3096)以蛋白质印迹或斑点/狭线试验(分析)这种提取物(例如，洗涤剂提取物)中感兴趣蛋白质的水平。

其它有用的抗体方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。例如，蛋白质特异性单克隆抗体可用作免疫吸附剂与酶标记探针来检测和定量测定感兴趣的内毒素血症标记蛋白质。可采用计算机线性回归算法(参见，Lacobilli等，1988，Breast Cancer Research and Treatment，11：19-30)，参考标准制品中的含量来计算样品中这种蛋白质的含量。其它实施方式可用感兴趣蛋白质的两种不同单克隆抗体，一种作为免疫吸附剂，另一种作为酶标记探针。

此外，蛋白质捕获阵列领域的最新进展使得能同时检测和/或定量测定大量蛋白质。例如，滤膜上的低密度蛋白质阵列，如通用蛋白质阵列系统(Ge，2000，NucleicAcids Res.，28(2)：e3)采用标准ELISA技术和扫描电荷耦联器件(CCD)检测器可拍摄组成阵列的抗原图像。也开发了能同时检测多种临床分析物的免疫传感器阵列。目前已能用蛋白质阵列来分析体液中，例如健康或患病对象以及药物治疗前后对象血清中的蛋白质表达分布模式。

蛋白质捕获阵列一般包含多种蛋白质捕获剂，它们各自组成了该阵列的空间位置不同的元件。蛋白质捕获剂可以是能结合蛋白质并将其固定在阵列上的蛋白质捕获剂位点的任何分子或分子复合物。蛋白质捕获剂可以是一种蛋白质，其在细胞中的天然功能是特异性结合另一种蛋白质，例如抗体或受体。或者，蛋白质捕获剂可以是能特异性结合某蛋白质的部分合成或全合成或重组的蛋白质。或者，蛋白质捕获剂可以是根据其对特定靶蛋白质或肽的结合亲和力而在体外从诱变、随机或完全随机化与合成文库中选出的蛋白质。所用的选择方法可以任选本领域已知的展示方法，例如核糖体展示或噬菌体展示方法。或者，经体外选择得到的蛋白质捕获剂可以是能特异性结合靶蛋白质的DNA或RNA适体(参见，例如Potyrailo等，1998，Anal.Chem.，70：3419-3425；Cohen等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：14272-14277；Fukuda等，1997，Nucleic Acids Symp.Ser.，37：237-238；购自索玛洛吉克公司(SomaLogic))。例如，用塞莱克斯(Selex^TM)方法从寡核苷酸文库中选择适体，可通过共价连接，通过掺入溴化脱氧尿苷和紫外光活化交联(光适体)来增强它们与蛋白质的相互作用。适体的优点在于易通过自动寡核苷酸合成来制备，和DNA稳定而可靠；可采用通用荧光蛋白质染色来检测结合情况。或者，体外选择的蛋白质捕获剂可以是多肽(例如，抗原)(参见，例如Roberts和Szostak，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：12297-12302)。

捕获分子的另一种阵列是通过“分子印刷”技术制成的阵列，其中的肽(例如蛋白质的C-末端区域)用作模板在可聚合基质中产生结构互补的序列特异性空隙；然后这些空隙能特异性捕获具有相应一级氨基酸序列的(变性)蛋白质(例如，购自蛋白质印刷(ProteinPrint^TM)和阿斯普里拉生物系统公司(Aspira Biosystems))。

示范性蛋白质捕获阵列包括通常称为抗体阵列的含有空间寻址的抗原结合分子的阵列，该阵列有助于大规模地平行分析众多蛋白质来确定蛋白质组或蛋白质亚组。抗体阵列显示具有所需的特异性性质和可接受的背景，一些阵列可购得(例如，BD生物科学公司(BD Biosciences)，克隆技术公司(Clontech)，拜尔雷得公司(BioRad)和西格玛公司(Sigma))。制备抗体阵列的各种方法已有报道(参见，例如Lopez等，2003，J.Chromatogr.B，787：19-27；Cahill，2000，Trends in Biotechnology，7：47-51；美国专利申请公布2002/0055186；美国专利申请公布2003/0003599；PCT公布WO03/062444；PCT公布WO 03/077851；PCT公布WO 02/59601；PCT公布WO 02/39120；PCT公布WO 01/79849；PCT公布WO 99/39210)。这些阵列的抗原结合分子至少可识别细胞或细胞群所表达蛋白质亚组，其示范性例子包括：生长因子受体、激素受体、神经递质受体、儿茶酚胺受体、氨基酸衍生物受体、细胞因子受体、胞外基质受体、抗体、凝集素、细胞因子、丝抑蛋白、蛋白酶、激酶、磷酸酶、ras-样GTP酶、水解酶、类固醇激素受体、转录因子、热激转录因子、DNA-结合蛋白、锌指蛋白、亮氨酸拉链蛋白、同源域蛋白、胞内信号转导调节剂和效应物、凋亡相关因子、DNA合成因子、DNA修复因子、DNA重组因子、细胞表面抗原、丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶和HIV蛋白酶。

经噬菌体展示或核糖体展示文库(例如，购自剑桥抗体技术公司(CambridgeAntibody Technology)，生物发明公司(BioInvent)，艾飞技术公司(Affitech)和生物位点公司(Biosite))选择后可通过常规免疫方法(例如，多克隆血清和杂交瘤)，或作为通常用大肠杆菌表达的重组片段制备抗体阵列的抗原结合分子。或者，可制备矩阵形式的含非共价结合的VH和VL结构域的“组合抗体(combibody)”，所述居住形式由产生双抗体的细菌克隆(例如，购自多门蒂斯公司(Domantis))组合形成。用作蛋白质捕获剂的示范性抗原结合分子包括单克隆抗体、多克隆抗体、Fv、Fab、Fab′和F(ab′)₂免疫球蛋白片段、合成的稳定Fv片段(如单链Fv片段(scFv)、通过二硫键稳定的Fv片段(dsFv))、单可变区结构域(dAbs)小抗体(minibody)、组合抗体和多价抗体(如双抗体和多-scFv)、骆驼(camelids)的单结构域或工程改造的人等价抗体。

空间位置不同的各蛋白质捕获剂通常连接于一般是平的或有起伏的支持物表面。常用的物理支持物包括载玻片、硅、微孔、硝酸纤维素或PVDF膜和磁性微珠及其它微珠。

虽然广泛采用将蛋白质微滴递送到平面上，但也可采用有关的其它构造，包括根据微流体学进展开发的CD离心装置(例如，购自盖罗斯公司(Gyros))和专门化的芯片设计，例如平面中工程改造的微通道(例如，活芯片(The Living Chip^TM)，购自生物宝藏公司(Biotrove))和硅表面的微小3D柱(例如，购自扎米克斯公司(Zyomyx))。

也可将悬浮液中的颗粒用作阵列的基础，只要为了辨识而给它们编号；这些系统包括用颜色编号的微珠(例如，购自鲁米奈克斯公司(Luminex)、拜尔雷得公司和纳诺米克斯生物系统公司(Nanomics Biosystems))、半导体纳米晶体(例如，Q点(Qdots^TM)，购自量子点公司(Quantum Dots))、棒形编号珠(超丛(UltraPlex^TM)，购自慧珠公司(Smartbeads))和多金属微杆(纳诺巴考得(Nanobarcodes^TM)颗粒，购自萨罗医药公司(Surromed))。也可将这些珠在半导体芯片上组装成平面阵列(例如，购自LEAPS技术公司(LEAPS technology)和生物阵列解决公司(BioArraySolutions))。当用颗粒时，各蛋白质捕获剂通常连接于各颗粒以提供空间位置确定或分开的阵列。然后分别(但平行)以隔离方式，例如在微量滴定板的孔中或不同试管中检测这些颗粒。

在操作中，任选片段化蛋白质样品以形成肽片段(参见，例如美国专利申请公布2002/0055186)，在适合于蛋白质或肽结合的条件下递送到蛋白质捕获阵列；洗涤该阵列将样品中未结合或非特异性结合的组分从阵列上除去。然后，利用合适的检测系统检测与阵列上各元件结合的蛋白质或肽的存在或含量。与该阵列第二元件结合的第二蛋白质的含量作比较来测定与阵列上某元件结合的蛋白质含量。在某些实施方式中，样品中第二蛋白质的含量是已知或已知不变的。

为分析两种细胞或细胞群之间蛋白质表达的差异，将第一种细胞或细胞群的蛋白质样品在适合于蛋白质结合的条件下递送到该阵列。将第二种细胞或细胞群的蛋白质样品以类似方式递送到与第一阵列相同的第二阵列。然后洗涤两阵列将样品中未结合或非特异性结合的组分从阵列上除去。最后，将保持与第一阵列元件结合的蛋白质含量和保持与第二阵列的相应元件结合的蛋白质含量作比较。为测定两种细胞或细胞群之间蛋白质表达模式的差异，将与第一阵列各元件结合的蛋白质含量从与第二阵列的相应元件结合的蛋白质含量中扣除。

在一示范性例子中，可利用荧光标记检测与阵列结合的蛋白质。将与解读DNA微阵列所用相同的仪器应用于蛋白质捕获阵列。为展示差别，可用两种不同细胞状态的荧光标记蛋白质检测捕获阵列(例如，抗体阵列)，两种状态的细胞裂解物用不同荧光团(例如，Cy-3和Cy-5)标记并混合，从而可将颜色作为靶标丰度变化的读数。通过酪酰胺信号扩增(TSA)(例如，获自帕金埃尔默生命科学公司(PerkinElmerLifesciences))可将荧光读数灵敏度提高10-100倍。平面波导技术(例如，获自扎普托森公司(Zeptosens))能进行超灵敏的荧光检测，其另一优点是无需洗涤。利用藻红蛋白作标记物(例如，购自鲁米奈克斯公司)或利用半导体纳米晶体(例如，购自量子点公司)性能的悬浮珠和颗粒也能实现高灵敏度。已采纳荧光共振能量转移来检测可用于阵列的未标记配体的结合(例如，购自艾飞体公司(Affibody))。已开发了几种其它读数装置，包括以下方法的改进装置：表面等离振子共振(例如，获自HTS生物系统公司(HTS Biosystems)和固有生物探针公司(Intrinsic Bioprobes))、滚动循环DNA扩增(例如，获自分子分级公司(Molecular Staging))、质谱(例如，获自有义蛋白质组公司(Sense Proteomic)，赛弗金公司(Ciphergen)，英逊西克公司(Intrinsic)和生物探针公司(Bioprobes))、共振光散射(例如，获自詹宁康科学公司(GeniconSciences))和原子力显微镜(例如，购自生物力实验室公司(BioForce Laboratories))。新生代公司(NextGen)和帕金埃尔默生命科学公司共同开发了用载玻片阵列自动培育样品并洗涤的微流体系统。

在某些实施方案中，用于检测内毒素血症标记表达产物的技术包括用内部或外部标准品来定量或半定量测定那些产物，从而能有效地比较生物学样品中这些表达产物与参比样品中相应表达产物的水平或功能活性。技术人员采用标准方法可以确定这种标准品。具体实施例中测定了各表达产物的水平或功能活性的绝对值。

在具体实施方式中，如国际公布号WO 02/090579和2003年11月14日提交的待批PCT申请号PCT/AU03/01517中所述，可用包括与基站相耦联的至少一个终端站的系统来执行此诊断方法。基站通常与一个或多个数据库相耦联，这些数据库含有大量个体的内毒素血症标记表达产物水平或功能活性的代表性预定数据，以及收集这些预定数据时这些个体实际状态的指征(例如，内毒素血症相关病症的存在、不存在、程度或发展阶段)。在操作中，基站一般通过通信网络接受终端站的数据，所述数据代表获自测试对象生物学样品中至少一种表达产物所检测到的或标准化的水平或功能活性，并与存储在数据库中的预定数据作比较。将对象数据与预定数据作比较使基站能根据比较结果确定该对象的状态。因此，基站试图鉴定与测试对象具有相似参数值的个体，一旦根据该鉴定确定了状态，基站会将诊断指示送至终端站。

7.3试剂盒

可将检测与定量测定内毒素血症标记基因表达产物所需的所有必需材料和试剂一起组装在试剂盒中。这些试剂盒也任选装有检测标记物的合适试剂、阳性和阴性对照、洗涤溶液、印迹膜、微量滴定板稀释缓冲液等。例如，核酸检测试剂盒可装有(i)内毒素血症标记多核苷酸(可用作阳性对照)，(ii)能与某种内毒素血症标记多核苷酸特异性杂交的引物或探针。还可装有适用于扩增核酸的酶，包括各种聚合酶(逆转录酶，Taq，序列酶(Sequenase^TM)DNA连接酶等，根据所采用的核酸扩增技术)，脱氧核苷酸和缓冲液以提供扩增所需的反应混合物。这种试剂盒一般以合适方式装有各种试剂和酶以及各种引物或探针的不同容器。或者，蛋白质检测试剂盒可装有：(i)内毒素血症标记多肽(可用作阳性对照)，(ii)能与某内毒素血症标记多核苷酸发生免疫相互作用的抗原结合分子。该试剂盒的特征也在于装有进行本文所述试验之一的各种装置和试剂；和/或用该试剂盒定量测定内毒素血症标记基因表达的印制的使用说明书。

8.治疗或预防方法

本发明还拓展至阳性诊断对象中存在内毒素血症相关病症或其阶段后治疗内毒素血症相关病症，或预防内毒素血症相关病症的进一步发展，或评估对象的治疗效果。治疗内毒素血症相关病症通常是非常密集的，包括鉴定和改善潜在的病因及积极使用治疗性化合物，例如血管活性化合物、抗生素、类固醇、内毒素的抗体和抗肿瘤坏死因子制剂。此外，可采用目的在于恢复和保护器官功能治标性治疗¹，例如静脉内输液和供氧。

治疗剂一般与药学上可接受的载体组成药物(或兽医学)组合物，以有效量给予来实现它们所需的目的。给予对象的活性化合物剂量应能在一段时间内足以在对象中引发有益反应，例如降低或减轻内毒素血症的症状。给予的药学活性化合物的用量取决于待治疗的对象，包括其年龄、性别、体重和总体健康状况。在这点上，所给予的活性化合物的精确用量取决于从业医师的判断。在确定治疗或预防内毒素血症的活性化合物的给予有效量时，医师或兽医应评估与内毒素血症存在相关症状的严重程度，包括心动过速、发热、寒颤、呕吐、腹泻、皮疹、头痛、精神错乱、肌痛、癫痫发作。在任何情况中，本领域技术人员不难确定治疗剂的合适剂量与合适的治疗方案而无需过多实验。

可联合辅助(治标性)治疗给予这些治疗剂以提高主要器官的供氧，增加主要器官的血流和/或降低阳性反应。这些辅助治疗的示范性例子包括非类固醇抗炎药(NSAID)、静脉内输注盐水和供氧。

为便于理解和实施本发明，通过以下非限制性实施例描述特别优选的实施方式。

实施例

实施例1

¹Cohen J和Glauser MP.Lancert338：736-739(1991)。

鉴定内毒素血症相关病症的特异性诊断基因

实验性疾病试验设计

对三组(每组4匹马)进行临床试验。第一组由4匹马组成，口服给予12.5mg/kg的寡聚果糖²，这与Pollitt³所述试验方法部分相同，该试验专门设计用于诱导内毒素血症和随后的急性蹄叶炎。第二组由4匹马组成，进行相同的试验方法，除了给予普通盐水(0.9％)溶液(对照)外。然后对第二组中相同的4匹马实施第二次试验方法(在恢复期后)，但给予寡聚果糖(第三组)。在该试验期间(120小时)，所有马匹关在相同条件下的马厩中。

可实验性诱导马匹中的内毒素血症相关病症(包括蹄叶炎)，一种更可靠的诱导方法是通过口服给予寡聚果糖造成碳水化合物过载。

在4个时间点收集血液样品--给予前的第0小时和给予后的第24、48和72小时。第0时的样品作为各马匹的对照。

在上述所有时间点进行以下检验与观察：

(i)体检、直肠温度、脉脉数(digital pulse)、蹄温、心率和呼吸率、粪便pH、蹄移位(hoof shifting)；和

(ii)血液学和生物化学(检验)。

在试验的第0、24、48和72小时，利用含有马白细胞所表达的数千种基因的基因芯片(GeneChips^TM)(使用方法详述于下文“产生基因表达数据”)分析各马匹的血液样品。分析这些数据(参见下文“鉴定诊断性标记基因”)揭示实验性诱导内毒素血症和蹄叶炎之前和给予24小时后动物之间许多特定基因的表达有差异。可以设计一种试验来检测样品中至少一种，优选至少两种内毒素血症标记基因表达的RNA水平，所述基因的代表性转录序列如下所示：SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、

Orafti Active Food Ingredients，Aanndorenstraat，B-3300Tienen，Belgium.

³van Eps A & Pollitt CC.Equine Vet J.36(3)：255-60(2004).

160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259、260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325。

材料与方法

血液采集

从马匹(非兴奋状态)采血提取高质量的RNA或蛋白质。收集、保藏、转运和分离RNA所用的合适采血试管包括美国加利福尼亚州巴伦西亚市预分析公司的PAX基因(PAXgene^TM)试管(PreAnalytix Inc.，Valencia，CA，USA)。或者，可将血液收集入含有设计用于保藏核酸的溶液(购自罗氏公司(Roche)，安比昂公司(Ambion)，英杰公司(Invitrogen)和ABI公司(ABI))的试管中。为测定蛋白质水平，将50ml血液收集入含有4ml4％柠檬酸钠的试管中以防凝结。分离白细胞和血浆，冷冻保藏用于随后分析与检测特异性蛋白质。将PAX基因试管保持于室温，然后提取RNA。以标准格式记录临床体征。

提取总RNA

购自美国加利福尼亚州巴伦西亚市的恰根公司(Valencia，CA，USA)的试剂盒装有分离收集于PAX基因血液RNA试管(PAXgene Blood RNA Tube)中2.5ml血液的总RNA所用的试剂和使用说明书。分离开始时是离心步骤以沉淀PAX基因血液RNA试管中的核酸。洗涤沉淀物、重悬，与蛋白酶K一起在优化缓冲液中温育以消化蛋白质。再离心一次以除去残留的细胞碎片，将上清液转移至新的微量离心管。加入乙醇调节结合条件，将裂解液施加到PAX基因RNA自旋柱(PAXgeneRNA spin column)。简单离心期间，RNA与硅胶膜选择性结合，而污染物流出。进行三次有效的洗涤以除去其余的污染物，然后用缓冲液BR5洗脱RNA。

测试前要用安捷伦生物分析仪(Agilent Bioanalyzer)和分光光度计以吸光度260/280比值定量和定性测定RNA。

产生基因表达数据

选择方法

可采用各种技术检测组织样品中的特异性RNA水平。本领域熟知的两种常规且易于使用的技术是：

·采用艾飞麦特里克斯(Affymetrix)技术作基因芯片

分析；

·实时聚合酶链式反应(例如，应用生物系统公司的泰克曼(TaqMan^TM))。

基因芯片

通过检测与构建在硅基板上的短寡核苷酸杂交的标记cRNA来定量测定RNA。该技术和方法详见www.affymetrix.com。

实时聚合酶链式反应(RT-PCR)利用两种PCR引物、标记的探针和热稳定DNA聚合酶来定量测定RNA。PCR产物产生的色素释放入溶液并检测。常用内部对照，例如18S RNA探针测定样品中总RNA的起始水平。分别测定各基因与内部对照。该技术和方法详见www.appliedbiosytems.com或www.qiagen.com或www.biorad..com。应用生物系统公司提供以下服务：即由客户提供DNA序列信息并付费，作为回馈该公司提供对各基因进行RT-PCR分析所需的全部试剂。

基因芯片

分析的优点在于一次能分析数千个基因。然而，该分析花费大且进行一次试验要3天以上。RT-PCR一般一次只能分析一种基因，但廉价并且能在一天内完成。

如果待分析的具体基因数目少于20，则选择RT-PCR作为基因表达分析方法。当需要同时分析许多基因时，

或其它基因表达分析技术(例如伊鲁米娜珠阵列(Illumina Bead Arrays))是可选的方法。

用于产生和分析基因芯片

数据与实时PCR的方法概述于下文。

产生基因芯片

数据

制备cDNA和cRNA

从总RNA制备cDNA和cRNA的以下方法采用艾飞麦特里克斯公司(www.affymetrix.com)提供和推荐的方法。

步骤是：

·总共3μg的总RNA用作模板来制备双链cDNA。

·制备cRNA并用生物素化尿嘧啶(dUTP)作标记。

·纯化(clean)生物素标记的cRNA，利用分光光度计和MOPS凝胶分析定量测定。

·将标记的cRNA片段化为约300bp大小。

·利用安捷伦“芯片实验室(Lab-on-a-Chip)”系统(安捷伦技术公司(AgilentTechnologies))测定RNA含量。

杂交、洗涤和染色

步骤是：

·制备含有0.05μg/μL标记的和片段化的cRNA、掺杂(spike-in)阳性杂交对照和艾飞麦特里克斯(Affymetrix)寡核苷酸B2、bioB、bioC、bioD和cre的杂交混合物。

·将终体积(80μL)的杂交混合物加入基因芯片

柱盒中。

·将该柱盒置于恒定转速的杂交炉中，16小时。

·去除基因芯片中的液体并保存。

·将基因芯片

置于流体站中。

·将各基因芯片

的实验条件记录为.EXP文件。

·助理人员提供合适溶液后，艾飞麦特里克斯流体站执行所有的洗涤和染色过程。

·洗涤基因芯片

用链霉亲和素-藻红蛋白染料染色，然后用低盐溶液再次洗涤。

·洗涤完成后，用激光“激发”探针阵列上的染料，用艾飞麦特里克斯扫描仪(安捷伦公司制造)通过CCD照相机拍摄图像。

扫描和产生数据文件

扫描仪和MAS5软件可产生单个基因芯片

的图像文件，称为.DAT文件(参见后页的图)。

预处理.DAT文件后进行统计学分析。

数据的预处理步骤(在任何统计学分析之前)包括：

·.DAT文件的质量控制(QC)。

·产生.CEL文件。

·测量和标准化。

.DAT文件的质量控制

.DAT文件是一种图像。手工检查这些图像的人为因素(artifact)(例如，斑点强度的高/低，划痕，局部高背景或总背景)。(通过改变产生边界的强度模式和阵列名称不难鉴定B2寡核苷酸阵列的杂交性能)。MAS5软件利用B2寡核苷酸边界来比对图像上的栅格，从而可集中和鉴定各寡核苷酸方格。

利用其它掺杂(spiked)杂交对照(bioB、bioC、bioD和cre)，通过读取反映它们相对浓度的信号值增加的“本”基因检测呼叫来评估样品的杂交效率。(如果.DAT文件质量合适，用艾飞麦特里克斯MAS5软件将其转变为强度数据文件(.CEL文件))。

产生.CEL文件

用MAS5软件从.DAT文件产生的.CEL文件包含计算的该探针组原始强度。从各细胞(测定)值中扣除计算的背景值得到基因表达数据。为除去阴性强度值，应用依据最低2％的背景值标准偏差的局部噪声值的噪声校正分数(noise correctionfraction)。

将基因芯片

产生的所有.CEL文件应用于特定的质量度量标准参数(quality metrics parameter)。

一些度量标准由艾飞麦特里克斯公司常规推荐，可利用作为基因芯片

的一部分而提供的艾飞麦特里克斯内部对照测定。其它度量标准依据经验和许多基因芯片

的处理。

分析基因芯片

数据

可用于数据标准化的三种示范性方法是：

·艾飞麦特里克斯MAS5算法。

·Irizarry的可靠多芯片分析(Robust Multi-chip Analysis)(RMA)算法(Irizarray等，2002，Biostatistics(印刷中))。

本领域技术人员应知道可采用许多其它方法而不会实质性影响本发明。

艾飞麦特里克斯MAS5算法

艾飞麦特里克斯MAS5软件利用.CEL文件来标准化或标定数据。将一块芯片的标定数据与另一芯片的相似标定数据作比较。

对.CEL文件应用MAS5算法的默认“整体定标(Global Scaling)”选项来实现艾飞麦特里克斯MAS5标准化。此法扣除了探针值分布中心的可靠估计值，再除以探针可变性的可靠估计值。这产生了在探针水平具有共同位置和标定的一组芯片。

通过对某给定基因的所有探针对实施可靠的平均化方法得到基因表达指数。将结果强制定为非阴性。

由于是在探针水平而不是在基因水平进行标定，故即使标准化后基因表达总水平在芯片之间也可能存在差异。标准MAS5标准化后，根据芯片强度中值使各基因值去趋势(de-trend)。即，各基因值根据芯片强度中值回归，计算残差。取这些残差作为各基因表达的去趋势估计值。

用艾飞麦特里克斯MAS5算法计算芯片中值强度，但标定因子固定是1。

RMA算法

该算法可定量测定一组芯片，而不是一块芯片的表达。其将可靠的统计学模型应用于完美匹配的探针数据来估计背景强度。其未利用错配的探针数据。隐含背景校正(implicit background correction)后，采用分位数标准化方法(Quantile Quantilenormalization)(Rizarray等，2002，Biostatistics(印刷中))处理芯片。

DNA提取

购自美国加利福尼亚州巴伦西亚市的恰根公司(Qiagen Inc，Valencia，CA，USA)的试剂盒装有分离收集于PAX基因血液DNA试管(PAXgene Blood DNATube)中8.5ml血液的总DNA的试剂和使用说明书。分离开始加入额外的裂解溶液然后离心。洗涤沉淀物、重悬，与蛋白酶K在优化缓冲液中一起温育以消化蛋白质。乙醇沉淀DNA，再离心一次以沉淀核酸。洗涤除去残留污染物，然后将DNA重悬于缓冲液BG4中。

测试前需要用分光光度计或琼脂糖凝胶电泳定量和定性测定DNA。

基因分型分析

可采用许多方法对DNA进行基因分型(genotype)。等位基因区分方法的综述见Kristensen等，(Biotechniques 30(2)：318-322(2001))。本文描述了采用等位基因特异性PCR进行基因分型的示范性方法。

引物设计

可利用能自由购得的计算机程序，例如引物(Primer)3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/primer3_code.html)设计特定等位基因的特异性上游和下游PCR引物。或者，可利用诸如ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)的程序和针对存在DNA序列差异但保留了足够特异性以确保能扩增正确扩增子的区域所设计的特异性引物比对各种等位基因的DNA序列。PCR扩增子优选设计成在一个等位基因中含有限制性酶切位点，而在另一个中不含有。引物通常长18-25个碱基对，解链温度相似。

PCR扩增

在(《PCR的临床应用》(Clinical Applications of PCR)，Dennis Lo(编)，布莱克威尔出版公司(Blackwell Publishing)，1998)已描述了PCR反应的组合物。简言之，反应包括引物、DNA、缓冲液和热稳定的聚合酶。反应利用热循环仪，例如MJ研究热循环仪PTC-96V型(MJ Research Thermocycler model PTC-96V)通过变性、杂交和DNA延伸的温度步骤循环(最多50次)。

DNA分析

可采用各种方法分析PCR产物，包括采用质谱法、毛细管凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳区分大小。如果将PCR扩增子设计为含有不同限制性酶切位点，则利用DNA-结合柱或沉淀和用水重悬，然后用合适的限制性内切酶限制性切割来纯化PCR反应中的DNA。然后对限制性切割的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用电流按照大小将DNA分开。依据是否含有限制性位点，某基因的各种等位基因的大小不同。因此，可以测定纯合子和杂合子。

产生实时PCR数据

在例如http://dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.html和Bustin SA的综述(2000，J Mol Endocrinol，25：169-193)中可获得执行实时PCR的背景信息。

泰克曼(TaqMan ^TM)引物和探针设计指南：

1.引物速递(Primer Express^TM)(ABI公司(ABI))软件设计了解链温度(Tm)为58-60℃的引物和Tm值为10℃以上的探针。两种引物的Tm应该相同；

2.引物应长15-30个碱基；

3.G+C含量优选30-80％。如果G+C含量较高无法避免，则需要采用高退火和解链温度，用共溶剂，例如甘油、DMSO或7-脱氮杂-dGTP；

4.应避免成串的相同核苷酸。这对于G尤其重要，不允许有4个或更多个G串；

5.引物3’末端的最后5个核苷酸中G和C的总数应不超过2个(较新版本的该软件具有自动执行此功能的选项)。这有助于在引物的3’末端引入相对不稳定性从而减少非特异性致敏。引物条件与SYBR绿(SYBR Green)试验相同；

6.最大扩增子的长度不应超过400bp(优选50-150个碱基)。较小的扩增子能得到更一致的结果，因为PCR更有效且对反应条件更耐受(要求长度短与5′核酸酶活性的效率无关)；

7.该探针不应含有成串的相同核苷酸(特别是4个或更多个连续的G)，G+C含量应为30-80％，C应比G多，5′末端不应是G。C的数量越多，产生的ΔRn越高。应先选择探针；

8.为避免因扩增了cDNA制品中的污染性基因组DNA所致的假阳性，引物宜跨越外显子-外显子连接区。这样不会扩增基因组DNA(用于人GAPDH扩增的PDAR试剂盒装有这种引物)；

9.如果设计泰克曼(TaqMan^TM)探针来区别等位基因，错配的核苷酸(多态性位点)应在探针中间而不是两端；

10.可利用3’末端附近含有dA核苷酸的引物通过AmpErase^TM UNG有效降解所产生的任何引物二聚体(见EZ RT-PCR试剂盒手册的第9页；P/N 402877)。如果不能选择在二末端附近含有dA核苷酸的引物，则应考虑利用具有3′末端dU-核苷酸的引物。

(也可参见英杰公司的《PCR引物设计》(PCR Primer Design)的通用原理)。

通用方法

1.用随机六聚体(不含有寡聚-dT)将总RNA逆转录为cDNA。如果不得不用寡聚-dT，则应避免上游有两千碱基以上的长mRNA转录物或扩增子，18S RNA不能用作标准品；

2.多重PCR只在对照引物有限时可正确进行(ABI对照试剂不限制它们的引物)；

3.靶cDNA用量范围是10ng-1μg。如果用DNA(主要用于等位基因鉴别研究)，最佳用量是100ng-1μg；

4.最好用不含RNA酶的DNA酶处理各RNA制品以避免基因组DNA污染。即使是最佳的RNA提取方法也会产生一些基因组DNA。当然最好有根本不扩增基因组DNA的引物，但有时做不到；

5.为得到最佳结果，试剂(在制备PCR混合物之前)和PCR混合物本身(加样之前)应充分旋振(vortex)与混合。否则在PCR的早期轮次(0-5)中Rn值可能会有漂移。先将探针加入缓冲液组分使其在室温下平衡再配制试剂混合物也很重要。

泰克曼(TaqMan^TM)引物和探针

定购自ABI公司的中等规模(midi-scale)TaqMan^TM探针收到时是100μM的混悬液。如果制备1/20稀释液，则得到5μM溶液。应将此储备溶液分为等份、冷冻、避光保存。在50μL反应体积中用1μL该储备溶液得到推荐的100nM终浓度。

引物收到时是冻干的，含量以pmol标在试管上(例如150.000pmol等于150nmol)。如果将X nmol的引物重悬在XμL水中，得到的溶液是1mM。最好将此储备液分成等份冷冻。当将1mM储备液稀释100倍时，得到的工作溶液是10μM。为使50μL反应体积中的最终引物浓度为推荐的50-900nM，每次反应使用0.25-4.50μL(500nM终浓度用2.5μL)。

试管中的PDAR引物和探针以混合物提供。它们在50μL反应体积中使用2.5μL。

设置一步泰克曼(TaqMan^TM)反应：

一步实时PCR将RNA(与cDNA相反)用作模板。如果RNA溶液浓度低则优选此方法，但只在进行单重反应(singleplex reaction)时。缺点是RNA遗留物使得酶AmpErase不能用于一步反应。在此方法中，逆转录和实时PCR发生在同一试管中。下游PCR引物还用作逆转录酶的引物(随机六聚体或寡聚-dT不能用于一步RT-PCR中的逆转录)。一步反应需要较高的dNTP浓度(大于或等于300mM与200mM)，因为该反应组合了需要dNTP的两种反应的一种。Gold RT-PCR试剂盒的一步PCR所用的典型反应混合物如下：

^*如果用PDAR，则用2.5μL的引物+探针混合物。

此反应优选用10pg-100ng RNA。注意将模板用量从100ng降低至50ng将使C_T值增加1。为使C_T值降低3，起始模板用量应增加8倍。ABI公司宣称此系统可检测到2皮克的RNA，RNA的最大用量可以是1微克。为进行常规分析，可用10pg-100ng的RNA和100pg-1μg基因组DNA。

一步PCR的循环参数：

逆转录(MuLV)，48℃ 30分钟。

扩增泰克(AmpliTaq)活化，95℃ 10分钟。

PCR：95℃变性15秒，60℃退火/延伸1分钟(重复40次)(用ABI 7700，最低维持时间是15秒)。

最新引入的EZ一步(one-step^TM)RT-PCR试剂盒可利用UNG，因为利用了热稳定性逆转录酶使得逆转录的温育时的温度是60℃。此温度也是避免在48℃形成引物二聚体和非特异性结合的较好选择。

操作ABI7700：

开始运行前应确认以下事项：

1.运行的循环参数正确；

2.光谱补偿的选择正确(单重反应选off(关闭)，多重反应选on(开启))；

3.Analysis Options box(分析选项框)(Analysis(分析)/Options(选项))中的“Number of PCR Stages(PCR阶段编号)”选择正确。如果扩增图中没有数据，但在平面图中可见，并且扩增(图)的X-轴显示范围0-1轮，则在运行一次后必须手动设定此(参数)。

4.模板对照(Template Control)不如此标记(为精确计算ΔRn)；

5.数据分析前应正确选择染料组分；

6.你必须在运行开始前给予名称(不能维持未命名)并保存；运行结束时，先保存数据再开始分析；

7.(使用)ABI软件需要极其谨慎。揿下Run(运行)按钮后不要试图停止运行。你有问题并如果需要开关机器时，必须等至少1小时才能重新启动运行。

分析数据时，记住默认的基线设置是3-15。如果任何C_T值<15，应随之改变基线(基线停止值应比最小的C_T值小1-2)。此问题的有用讨论见《ABI基线与阈值设置指南》(ABI Tutorial on Setting Baselines and Thresholds)。(令人感兴趣的是，此问题的最佳讨论见泰克曼(TaqMan^TM)人内源性对照板(Human EndogenousControl Plate)手册)。

如果结果没有意义，检查原始光谱看运行期间CDC照相机(是否)可能饱和。利用光学盖(optical cap)而不是光学粘性罩(optical adhesive cover)可防止CDC照相机饱和。当利用SYBR绿I、多重(反应)和高浓度探针时，更可能发生(CDC照相机饱和)。

结果解析：

每次反应结束时，所记录的荧光强度用于以下计算：

Rn⁺是含所有组分时反应的Rn值；Rn^-是未反应样品的Rn值(基线值或NTC中检测的值)。ΔRn是Rn⁺与Rn^-之间的差异。它是PCR产生的信号数量级指标。

定量测定模板含量有三种示范性方法：

1.绝对标准方法：在此方法中，用含量已知的标准品，例如体外翻译的RNA(cRNA)。

2.相对标准方法：每次运行的试验设计中包括已知量的靶核酸；

3.比较性C_T方法：此方法不用含量已知的标准品，而是将靶序列的相对量与选择的任何参比值作比较，给出的结果为与参比值(例如静息淋巴细胞或标准细胞系的表达水平)相比的量。

基因表达相对定量测定的比较性CT方法(ΔΔCT)：

此方法在观察相对于活性参比对照物(标准品)的表达水平时无需制作标准曲线，从而能相对定量测定模板并提高样品处理量。为成功实施此方法，应使靶标和参比物的动态范围相似。控制此(动态范围)的灵敏方法是观察ΔCT(相同的起始模板量作两次PCR所得两个CT值之间的差异)如何随模板的稀释度而变化。如果两种扩增的效率大致相等，将输入量的对数与ΔC_T作图得到接近水平的线(斜率<0.10)。这表示在起始模板用量范围内进行的两次PCR效率相同。如果该图显示效率不相等，应采用标准曲线方法来定量测定基因表达。应测定以下二者的动态范围：(1)结果精确的靶标最低和最高浓度和(2)结果精确的两种基因含量最低和最高比例。在常规竞争性RT-PCR中，该动态范围限制在靶标-竞争物比例约为10:1-1:10(1:1的比例可获得最佳精确度)。实时PCR能达到更广泛的动态范围。

在不同试管中扩增靶标和内源对照物，采用标准曲线方法需要的优化和验证量最少。采用比较性C_T方法的优点在于无需制作标准曲线(样品可利用更多的孔)。该方法也消除了制作标准曲线样品时可能产生的任何稀释误差的负面影响。

只要靶标和标准品具有相似的动态范围，比较性C_T方法(ΔΔC_T方法)是最实用的方法。预计标准品比靶标的表达水平高(因此，C_T值较低)。从得到的靶标和标准品C_T值之间的差异(ΔC_T)开始定量计算：

ΔC_T＝C_T(靶标)-C_T(标准品)

计算待定量各样品的此值(除非靶标的表达水平高于标准品，此值应为正值。如果是负值也无妨)。每次比较应选择这些样品之一作为参比品(基线)。比较性ΔΔC_T计算包括找到各样品ΔC_T与基线ΔC_T之间的差异。如果基线值表示最低表达水平，则预计ΔΔC_T值是负值(因为基线样品的ΔC_T具有最大C_T值而最大)。如果一些样品中表达增加，而另一些减少，ΔΔC_T值将是负值和正值的混合。定量测定的最后一步是将这些数值转化为绝对值。此计算公式是：

比较性表达水平＝2^-ΔΔCT

与基线水平相比，对于表达升高，增加约2³＝8倍，而对于表达降低，约为参比品水平的2^-3＝1/8。通过简单地输入C_T值用微软Excel进行这些计算(ABI公司在http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/7700amp/有关于利用扩展层程序(spread sheetprogram)以获得扩增图的在线指南；泰克曼(TaqMan^TM)人内源性对照板(Human Endogenous Control Plate)方法也包括用MS Excel进行实时PCR数据分析的详细说明)。

其它(绝对)定量方法概述于ABI公司用户公告(http://docs.appliedbiosystems.com/search.taf？_UserReference＝A8658327189850A13A0C598E)。公告#2和#5对全面理解实时PCR和定量测定最有用。

推荐方法：

1.利用正位移移液管(positive-displacement pipette)以避免移液不精确；

2.实时PCR的灵敏度可检测出2pg总RNA中的靶标。反应所用总RNA的拷贝数最好应通过25-30轮即足以产生信号(优选低于100ng)。为实现此目的应减少或增加用量；

3.各试剂的最佳浓度如下；

i.氯化镁的浓度应是4-7mM。对用引物表达软件(Primer Express software)设计的引物/探针而言最佳是5.5mM；

ii.除dUTP外(如果使用的话)，各dNTP的浓度应平衡。用dUTP取代dTTP来控制PCR产物残留需要dUTP浓度是其它dNTP的两倍。虽然dNTP浓度的最佳范围是500μM-1 mM(一步RT-PCR)，但典型的泰克曼反应(只是PCR)利用200μM的各种dNTP(400μM dUTP)；

iii.通常向每50μL反应物中加入0.25μL(1.25U)扩增泰克DNA聚合酶(AmpliTaq DNA Polymerase)(5.0U/μL)。这是最低要求。如果需要，可将此量增加0.25U以实现优化；

iv.最佳探针浓度是50-200nM，引物浓度是100-900nM，应对三种不同温度(泰克曼引物为58、60和62℃)和三种浓度(50、300、900nM)的各种组合优化各对引物。这意味着设置了不同的三组(三种温度)，每组利用固定量的靶模板，共有九种反应(50/50mM、50/300mM、50/900、300/50、300/300、300/900、900/50、900/300、900/900mM)。如果需要，可(进行)第二轮优化来改善结果。选择能提供最低C_T和最高ΔRn的引物浓度来实现最佳性能。类似地，应将探针浓度优化为25-225nM；

4.如果用扩增泰克金DNA聚合酶(AmpliTaq Gold DNA Polymerase)，为实现此目的需要在PCR前于92-95℃加热9-12分钟。如果用扩增泰克金DNA聚合酶，不需要在冰上反应。典型的泰克曼反应包括50℃温育UNG(参见下文)2分钟；95℃活化聚合酶10分钟；和40轮的95℃15秒(变性)与60℃1分钟(退火与延伸)。如果起始材料是总RNA，在泰克曼反应之前通常应进行逆转录循环，该循环(cDNA合成)包括25℃10分钟(引物温育)，48℃30分钟(用常规逆转录酶进行逆转录)和95℃5分钟(灭活逆转录酶)；

5.向该反应中加入AmpErase尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)来除去掺入扩增子中的任何尿嘧啶以防残留PCR产物再扩增。这是PCR反应中为何用dUTP而不是dTTP的原因。UNG在55℃以上不起作用，不切割含末端dU核苷酸的单链DNA。除非逆转录和PCR采用rTth DNA聚合酶，一步RT-PCR不应使用含UNG的主混合物(泰克曼EZ RT-PCR试剂盒)；

6.每块反应平板中必需包含至少三份非扩增对照(NAC)以及三份非模板对照(NTC)(为在确定靶标扩增的+/-阈值中达到99.7％可信度水平，必须进行一式六份NTC)。NAC模板含有样品，不含酶。需要排除样品中或热循环仪的加热块(heatingblock)中存在的荧光污染物(这些污染物可导致假阳性)。如果PCR后NAC的绝对荧光大于NTC，样品中或热循环仪的加热块中可能存在荧光污染物。

7.如果要将ΔΔC_T方法用于相对定量测定，应核查引物/探针系统及其标准品的动态范围。通过以5种RNA浓度(例如，0.80pg/μL、400pg/μL、2ng/μL和50ng/μL)进行(一式三份)反应来进行此核查。对于相同的总RNA浓度范围，靶标和标准品的实时RT-PCR得到的起始含量对数与CT值作图(标准曲线)应该是(接近)直线；

8.被动参比物是加入反应中的染料(ROX)(存在于泰克曼通用PCR主混合物中)。它不参与5’核酸酶反应。它提供了背景荧光发射的内部参比物。可用其来标准化受体-染料信号。对孔与孔之间(浓度或体积差异)或随时间变化发生的非PCR相关荧光波动进行此标准化，该标准化不同于对cDNA用量或PCR效率进行的标准化。将报道染料的发射光强度除以被动参比物的发射光强度以实现标准化。得到的比值定义为Rn；

9.如果进行多重(反应)，更丰富的靶标将在其它靶标得以扩增之前耗尽所有的反应成分。为避免此种情况，应限制更丰富的靶物质的引物浓度；

10.泰克曼通用PCR主混合物应保存于2-8℃(不是-20℃)；

11.用JOE报导染料标记泰克曼金RT-PCR试剂盒提供的GAPDH探针，用VIC标记预显影泰克曼试验试剂(Pre-Developed TaqMan^TM Assay Reagents)(PDAR)试剂盒提供的同一探针。所设计的这些人GAPDH试验的引物不会扩增基因组DNA；

12.为防止酶残留，需要在48℃温育的一步RT-PCR法不能利用AmpEraseUNG，但EZ RT-PCR试剂盒中可用；

13.单重反应只能用一步RT-PCR法，逆转录法只能选择下游引物(不是随机六聚体或寡聚-dT)；

14.优选进行一式两份(反应)来控制移液误差，但这不可避免会增加成本；

15.如果进行多重(反应)，在运行前应核查光谱补偿选项(在Advanced Options(高级选项)中)；

16.利用反应中的被动参比物(ROX)标准化荧光波动(值)，和用内源性对照物(例如GAPDH，活性参比物(active reference))标准化cDNA/PCR用量的效率是不同的方法；

17.ABI7700不仅可用于定量RT-PCR也可用于终点PCR。后者包括存在/不存在试验或等位基因鉴别试验(例如SNP分型)；

18.PCR的前几轮(0-5轮)中Rn值漂移表示反应诸组分最初不平衡，但不影响最终结果，只要重新设置基线范围的下限值；

19.如果注意到扩增图异常(C_T值<15，在前几轮中检测到有扩增信号的轮次)，应降低基线范围的上限值，应稀释样品以提高C_T值(污染也可能造成C_T值升高)；

20.ΔRn值低(或高于预计的C_T值)表明PCR效率不佳或者靶标的拷贝数低；

21.C_T值的标准偏差>0.16表明移液不精确；

22.纯色彩设置(Pure Dye Setup)中的SYBR绿色条目(SYBR Green entry)以大写字母缩写为“SYBR”。任何其它缩写或小写字母会产生问题；

23.ABI 7700的SDS软件与8.1版的Macintosh操作系统有冲突。不应在这种计算机上分析数据。

24.ABI 7700不应长期停用。如果将其关闭，在运行前应至少预热1小时。推荐将仪器随时开着，这对激光有益。如果运行前刚开机，可能会出现显示操作系统版本冲突的出错框。如果发生此情况，选择“Auto Download(自动下载)”选项。

25.ABI 7700只是可购得的实时PCR系统中的一种，其它包括拜尔雷得公司、赛飞得公司(Cepheid)、考伯特研究公司(CorbettResearch)、罗氏公司和斯特拉特基因公司(Stratagene)的系统。

实施例2

鉴定诊断性标记基因与这些基因的优先排序

对于实验组，采用Lonnstedt和Speed的经验Bayes方法(Lonnstedt和Speed，2002，Statistica Sinica 12：31-46)分析实验性诱导内毒素血症前后动物的基因表达差异。

检测内毒素血症的目的是：(a)鉴定疾病的急性内毒素血症期间基因表达的差异，和(b)评估这些改变的诊断潜力。

给药和对照马匹之间的比较包括马匹内部的一些信息(即，纵向比较用作对照和经治疗的马匹获得的一些信息)和马匹之间的一些信息(即，包括给药和未给药马匹之间的截面比较(cross-sectional comparison))。此外，一些计划样品(planed sample)未获得。结果是不平衡、非正交的混合效应研究(effects study)。

产生基因表达数据，产生各芯片的质量度量(quality metrics)。随后的分析使用只提供高质量数据并符合所有质量度量的芯片。然后如R生物导体项目(RBioconductor project)所执行的那样，采用RAM(可靠的多芯片分析(Robust MultichipAnalysis))算法处理芯片。计算表达测量值后，采用箱须图(Box and Whisker plot)、核密度估算(kernel density estimates)和MA图比较各芯片的分布。溢出值不作进一步分析。

采用微阵列分析软件5.0(艾飞麦特里克斯公司提供)和一组“持家”基因确证获得的结果来按比例测定数据。通过鉴定品种、年龄、性别和地理位置不同的健康马匹和患有各种疾病的马匹中基因表达变化最少的那些基因来推测持家基因。

将各时间点的阳性马匹与0时的所有马匹和有关时间点的阴性马匹作比较。例如，将24小时时呈阳性的马匹与第0天的所有马匹和24小时时为阴性的马匹作比较。各比较采用两种方法：单变量比较一次用一个基因，多变量比较用整组基因。对于单变量比较，用线性混合模型分析各基因，其中马匹是随机效应和时间(0时与当前时间)，状态(对照或诱导的)是混合效应。采用Holm渐降方法(Holm，S.1979，Scandinavian Journal of Statistics 6：65-70)调节各p值以提供族差错率(Family-WiseError Rate)(FWER)的强对照。对于多变量分析，所采用的组合方法包括：简约空间线性判别分析(reduced space linear discriminate analysis)、支持向量机器(supportvector machine)和分类树技术(classification tree technique)。在给药后每天将显示实验性诱导内毒素血症前后有统计学显著性差异的基因制成表格。

表5显示了根据第0小时和给药后第24、48及72小时之间作比较的p值进行排序的基因清单。该分析依据两组比较(第0时与第24、48及72小时)，其中采用Holm和FDR方法调整p值。结果是依据经验Bayes方法的全部结果。

采用线性混合模型，24小时时，159种基因在应用Holm校验时有统计学显著性，995种基因作了FDR调整。利用分类和回归树，基因芯片(GeneChip^TM)上3105种基因中的829种完美地区分各组，其中p值为0.002。

采用线性混合模型，72小时时，无基因在应用Holm校验时有统计学显著性，62种基因作了FDR调整。利用分类和回归树，基因芯片(GeneChip^TM)上3105种基因中的125种完美地区分各组，其中p值为0.001。

采用线性混合模型，120小时时，无基因在应用Holm校验或FDR调整时有统计学显著性。利用分类和回归树，基因芯片(GeneChip^TM)上3105种基因中的7种完美地区分各组，其中p值为0.019。

表5所列基因按它们的统计学t值排序，其可解释为信噪比。该表格也显示了log2倍变化(M值)与调整的p值。具有负t值(因此M也是负值)的基因表达下调。具有正t和M值的基因上调。根据第一时间点(24小时)的t值升高进行显著基因的优先级排序(p<0.05)，然后根据72小时的t值升高排序。注意，一些基因在24和72小时均显著，其它基因在24或72小时显著。

实施例3

证明对测定内毒素血症具有诊断潜力

此外，根据基因表达计算的主要组分评分(Jolliffe，I.T.，《主要组分分析》(Principal components analysis)，斯普林格-维拉格公司(Springer-Verlag)，1986)采用辨别分析(Venables和Ripley，2002，《统计学在S中的现代应用》(Modern AppliedStatistics in S)，斯普林格公司(Springer))评估了整组基因的诊断潜力。整体方法经交叉验证。灵敏度和特异性经计算均为优先级(uniform prior)。这可解释为一种形式的收缩调节，其中将这些估算值缩小到简约空间(reduced space)内。

利用交叉验证的判别函数评分(discriminant function scores)来估计接收器操作曲线。将关键阈值沿着判别函数评分的轴移动来计算接收器操作曲线。计算两种原始经验性ROC，采用Lloyd的方法校平ROC(Lloyd C.J.，1998，Journal of theAmerican Statistical Association，93：1356-1364)。计算曲线来比较临床上正常的和临床上受影响的动物。利用接种后每天的基因表达计算不同曲线。采用梯形规则计算接收器操作曲线下面积，将其应用于经验性ROC与校平的ROC。

ROC曲线可提供某试验诊断潜力的有用总结。完美诊断试验的ROC曲线是一条水平线，其通过灵敏度与特异性均等于1的点。这种完美诊断的ROC曲线下面积是1。无用的诊断试验的ROC曲线是一条通过原点的45度线。这种无诊断信息的面积是0.5。

图1-2分别给出了根据时间0点和时间点24小时及72小时之间的比较对ROC曲线的分析。诊断能力非常高。

实施例4

预测性的各组基因

虽然鉴定到约180种基因具有诊断潜力，但对于可接受的诊断性能通常只需要很少数目的基因。

表6显示根据选自具有诊断潜力基因的组中两种基因的线性判别分析获得的经交叉验证的分类结果、灵敏度和特异性。提出的诸对基因是能产生最好预测结果的基因，许多其它基因对也可产生可接受的分类结果。本领域技术人员明白不难鉴定其它基因对。鉴定基因对的技术包括(但不限于)正向可变性选择(Venables W.N.和Ripley B.D.，《统计学在S中的现代应用》(Modern Applied Statistics in S)，第四版，2002.，斯普林格公司)、最佳亚组选择、反向(backward)消除(Venables W.N.和Ripley B.D.，2002，同上)、逐步(stepwise)选择(Venables W.N.和Ripley B.D.，2002，同上)和随机可变消除(Figuerado M.A.，《监督学习的适应性稀疏》(AdaptiveSparseness for Supervised Learning))。

表7显示根据选自诊断组三种基因的线性判别分析得到的经交叉验证分类结果。只提供了20组三种基因。本领域技术人员不难明白可根据三种内毒素血症标记基因作出其它合适的诊断选择。

表8显示根据选自诊断组四种基因的线性判别分析得到的经交叉验证分类结果。只提供了20组四种基因。本领域技术人员不难明白可根据四种内毒素血症标记基因作出其它合适的诊断选择。

表9显示根据选自诊断组五种基因的线性判别分析得到的经交叉验证分类结果。只提供了20组五种基因。本领域技术人员不难明白可根据五种内毒素血症标记基因作出其它合适的诊断选择。

表10显示根据选自诊断组六种基因的线性判别分析得到的经交叉验证分类结果。只提供了20组六种基因。本领域技术人员不难明白可根据六种内毒素血症标记基因作出其它合适的诊断选择。

表11显示根据选自诊断组七种基因的线性判别分析得到的经交叉验证分类结果。只提供了20组七种基因。本领域技术人员不难明白可根据七种内毒素血症标记基因作出其它合适的诊断选择。

表12显示根据选自诊断组八种基因的线性判别分析得到的经交叉验证分类结果。只提供了20组八种基因。本领域技术人员不难明白可根据八种内毒素血症标记基因作出其它合适的诊断选择。

表13显示根据选自诊断组九种基因的线性判别分析得到的经交叉验证分类结果。只提供了20组九种基因。本领域技术人员不难明白可根据九种内毒素血症标记基因作出其它合适的诊断选择。

表14显示根据选自诊断组十种基因的线性判别分析得到的经交叉验证分类结果。只提供了20组十种基因。本领域技术人员不难明白可根据十种内毒素血症标记基因作出其它合适的诊断选择。

表15显示根据选自诊断组12种基因的线性判别分析得到的经交叉验证分类结果。只提供了20组二十种基因。本领域技术人员不难明白可根据二十种内毒素血症标记基因作出其它合适的诊断选择。

表16显示根据选自诊断组十三种基因的线性判别分析得到的经交叉验证分类结果。只提供了20组二十种基因。本领域技术人员不难明白可根据二十种内毒素血症标记基因作出其它合适的诊断选择。

与变量的数目相比，其它数目的基因会通过观察到的过载而引入噪声(因而降低灵敏度与特异性)。

表5所列基因按它们的统计学t值排序，其可解释为信噪比。该表格也显示了log2倍变化(M值)与调整的p值。具有负t值(因此M也是负值)的基因下调。

实施例5

特异性的证明

通过只在试验数据上训练分类符(classifier)和对超过850个基因芯片

的大基因表达数据集运行此分类符，检验了这些内毒素血症标记(signature)的特异性。该数据库中的基因表达结果得自患各种疾病与病症的马匹样品，所述疾病与病症包括：临床上诱导的急性与慢性EPM、疱疹病毒感染、退变性骨关节炎、应激、红球菌(Rhodococcus)感染、内毒素血症、蹄叶炎、胃溃疡综合征、运动训练的动物与临床正常的动物。

产生了三种分类符。所有这些分类符依据24小时的阳性马匹与0时的所有马匹和24小时的阴性马匹的比较。第一种利用了基因芯片(GeneChip^TM)上的所有基因。第二种只利用统计学显著(Holm调整后p值<0.05)的那些基因。第三种依据所有基因，除了已鉴定为涉及至少一种其它疾病基因标记的45种基因。后者最具有特异性。其能鉴定数据库中所有8匹内毒素血症马。还鉴定了其它5匹马，其中1匹患有严重的胃炎，1匹患有肉毒杆菌中毒，1匹患有颤抖综合征(Wobblersyndrome)，其余两匹诊断不明。

利用此方法与159种基因的基因标记，从850个以上的一群样品中获得的内毒素血症特异性为为99％。

实施例7

基因本体

采用BLAST算法(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D.J.，(1990)，“局部序列比对基本检索工具”(Basic local alignment searchtool)，J.Mol.Biol.，215：403-410)将基因序列与GeneBank数据库作比较，进行了基因同源性和基因本体检索，从而根据功能、代谢过程或细胞组分对基因分组。根据这些标准，表17列出了这些基因的分组。也参见含有各基因的序列信息的表1。

本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的内容全文纳入本文作为参考。

本文所引用的任何参考文献不应理解为承认该参考文献是本申请可用的“现有技术”。

整篇说明书的目的是描述本发明的优选实施方式而不是将本发明限制于任一实施方式或特征的特定组合。因此，本领域技术人员应知道借鉴本文内容可对示范的具体实施方式作出各种改进与改变而不脱离本发明的范围。所有这种改进与改变要包括在随附的权利要求书的范围内。

表2

表3

氨基酸亚类

表4

示范性与优选的氨基酸取代

表5

根据T值的基因优先排序

表6

选择的两种基因

表7

选择的三种基因

表8

选择的四种基因

Claims

1.一种诊断测试对象存在内毒素血症相关病症的方法，所述方法包括检测测试对象中在免疫系统细胞内表达的至少一种内毒素血症标记基因的异常表达，所述内毒素血症标记基因选自：(a)一种基因，其多核苷酸表达产物含有与以下任一序列有至少50％序列相同性的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259、260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325，或其互补序列；(b)一种基因，其多核苷酸表达产物含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；(c)一种基因，其多核苷酸表达产物含有编码与以下任一序列的至少一部分有至少50％序列相似性的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分含有该序列的至少15个毗连的氨基酸残基；和(d)一种基因，其多核苷酸表达产物含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括检测选自以下的内毒素血症标记多核苷酸的异常表达：(a)含有与以下任一序列有至少50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259、260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分有至少50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分含有该序列的至少15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括检测选自以下的内毒素血症标记多肽的异常表达：(i)含有与以下任一序列至少有50％序列相似性的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；(ii)含有以下任一序列的一部分的多肽：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分含有该序列的至少5个毗连氨基酸残基；(iii)所含氨基酸序列与以下任一序列的至少15个毗连氨基酸残基至少有30％相似性的多肽：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；和(iv)含有以下任一序列的一部分的多肽：SEQ ID：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分含有该序列的至少5个毗连氨基酸残基，并与和(i)、(ii)或(iii)所述序列发生免疫相互作用的抗原结合分子发生免疫相互作用。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法通过以下步骤检测所述异常表达：(1)检测获自测试对象的生物学样品中至少一种内毒素血症标记基因表达产物的水平或功能活性，和(2)将所检测到的各表达产物的水平或功能活性与一位或多位正常对象或一位或多位无内毒素血症相关病症的对象的参比样品中相应表达产物的水平或功能活性作比较，其中与参比样品中相应表达产物的水平或功能活性相比，该生物学样品中表达产物的水平或功能活性有差异表明测试对象中存在内毒素血症相关病症。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括当所述表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性比其相应表达产物或各相应表达产物检测到的水平或功能活性高10％时，诊断该测试对象中内毒素血症相关病症的存在、阶段或程度。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法通过检测至少一种选自以下的内毒素血症标记多核苷酸的水平或功能活性的升高来确定内毒素血症相关病症的存在：(a)含有与以下任一序列至少有50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NQ：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259、260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；(c)含有编码与以下任一序列至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分含有该序列的至少15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括当所述表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性比其相应表达产物或各相应表达产物检测到的水平或功能活性低10％时，诊断该测试对象中内毒素血症相关病症的存在、阶段或程度。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法通过检测至少一种选自以下的内毒素血症标记多核苷酸的水平或功能活性的降低来确定内毒素血症相关病症的存在：(a)含有与以下任一序列至少有50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：5、6、7、11、13、15、16、17、18、19、21、25、26、35、37、38、41、42、43、44、50、52、54、58、60、63、64、69、70、71、73、77、79、80、81、82、83、86、92、93、96、98、100、101、102、103、104、106、115、117、128、134、137、141、143、153、155、158、162、164、166、174、182、186、188、190、195、197、199、201、205、206、207、209、210、211、214、215、216、222、223、240、244、246、248、259、260、269、272、280、282、284、286、290、298、300、302、305、306、307、309、312、314、315、316、318、320、321、323，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：8、12、14、20、22、36、51、53、55、59、65、72、74、78、87、97、99、105、116、118、129、135、138、142、144、154、156、159、163、165、167、175、183、187、189、191、196、198、200、202、208、217、241、247、249、261、273、281、283、285、287、291、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324；(c)含有编码与以下任一序列至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：8、12、14、20、22、36、51、53、55、59、65、72、74、78、87、97、99、105、116、118、129、135、138、142、144、154、156、159、163、165、167、175、183、187、189、191、196、198、200、202、208、217、241、247、249、261、273、281、283、285、287、291、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324，其中所述部分含有该序列的至少15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括当所述表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性与其相应表达产物或各相应表达产物检测到的水平或功能活性相同或相似时，诊断该测试对象中不存在内毒素血症相关病症。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，各表达产物检测到的水平或功能活性与各相应表达产物检测到的水平或功能活性的差异不超过约5％。

11.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括检测至少约两种内毒素血症标记基因的各表达产物的水平或功能活性。

12.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括检测选自以下的至少一种一级内毒素血症相关标记基因的各表达产物的水平或功能活性：(a)含有与以下任一序列至少有50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：11、23、29、35、43、44、68、81、82、84、104、105、107、119、130、136、147、155、174、192、193、245、254、255、262、264、270、271、279、296或325，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：12、24、30、36、85、108、120、131、148、156、175、256、263、265、297或326；(c)含有编码与以下序列的至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：12、24、30、36、85、108、120、131、148、156、175、256、263、265、297或326，其中所述部分含有该序列的至少15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

13.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括检测选自以下的至少一种二级内毒素血症相关标记基因的各表达产物的水平或功能活性：(a)含有与以下任一序列具有至少50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：1、7、9、10、17、18、21、25、26、33、54、61、64、79、80、90、94、115、117、121、122、125、126、143、160、162、164、172、173、178、184、186、194、199、205、206、225、229、242、244、252、257、259、274、276、282、284、288、294、306、316或318，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、8、22、34、55、62、65、91、95、116、118、127、144、161、163、165、179、185、187、200、226、230、243、253、258、275、277、283、285、289、295、317或319；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、8、22、34、55、62、65、91、95、116、118、127、144、161、163、165、179、185、187、200、226、230、243、253、258、275、277、283、285、289、295、317或319，其中所述部分含有该序列的至少15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

14.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括检测选自以下的至少一种三级内毒素血症相关标记基因的各表达产物的水平或功能活性：(a)含有与以下任一序列具有至少50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：3、4、5、6、13、15、16、27、31、37、38、39、41、42、45、47、49、52、56、58、63、66、67、69、70、71、77、83、86、88、96、98、100、101、106、109、110、111、113、114、128、132、134、137、139、141、145、149、151、153、157、158、166、168、169、176、180、188、190、197、203、207、209、210、211、214、215、218、220、222、223、224、231、233、236、237、239、240、241、246、250、260、266、268、269、272、278、280、286、290、292、300、304、309、312、314、315、321或323，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：14、28、32、40、46、48、53、57、59、72、78、87、89、97、99、112、129、133、135、138、140、142、146、150、152、154、159、167、177、181、189、191、198、204、208、219、221、232、234、238、247、251、261、267、273、281、287、291、293、301、310、313、322或324；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：14、28、32、40、46、48、53、57、59、72、78、87、89、97、99、112、129、133、135、138、140、142、146、150、152、154、159、167、177、181、189、191、198、204、208、219、221、232、234、238、247、251、261、267、273、281、287、291、293、301、310、313、322或324，其中所述部分含有该序列的至少15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

15.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括检测选自以下的至少一种四级内毒素血症相关标记基因的各表达产物的水平或功能活性：(a)含有与以下任一序列具有至少50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：19、50、60、73、75、92、93、102、103、123、124、170、182、195、201、212、216、227、235、248、298、302、305、307、311或320，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：20、51、74、76、171、183、196、202、213、217、228、249、299、303或308；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：20、51、74、76、171、183、196、202、213、217、228、249、299、303或308，其中所述部分含有该序列的至少15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

16.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物学样品包括血液。

17.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物学样品包括外周血。

18.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物学样品包含白细胞。

19.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达产物是RNA分子。

20.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达产物是多肽。

21.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达产物与所述相应的表达产物相同。

22.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达产物是所述相应表达产物的变体。

23.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达产物或相应表达产物是靶RNA或该靶RNA的DNA拷贝，其水平可用至少在低严谨性条件下与该靶RNA或其DNA拷贝杂交的至少一种核酸探针来检测，该核酸探针至少含有某内毒素血症标记基因的15个毗连核苷酸。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，将所述靶RNA或其DNA拷贝所检测到的水平或丰度按同一样品中存在的参比RNA或该参比RNA的DNA拷贝的水平或丰度标准化。

25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述核酸探针固定在固体或半固体支持物上。

26.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述核酸探针构成诸核酸探针空间阵列的一部分。

27.如权利要求23所述的方法，其特征在于，通过杂交检测与所述靶RNA或其DNA拷贝结合的核酸探针的水平。

28.如权利要求23所述的方法，其特征在于，通过核酸扩增检测与所述靶RNA或其DNA拷贝结合的核酸探针的水平。

29.如权利要求23所述的方法，其特征在于，通过核酸酶保护试验检测与所述靶RNA或其DNA拷贝结合的核酸探针的水平。

30.如权利要求23所述的方法，其特征在于，用于检测内毒素血症标记多核苷酸的探针含有如SEQ ID NO：327-2317中任何一种所示的序列。

31.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述表达产物或相应表达产物是靶多肽，其水平可用与所述靶多肽免疫相互作用的至少一种抗原结合分子检测。

32.如权利要求23所述的方法，其特征在于，将所述靶多肽检测到的水平按同一样品中存在的参比多肽的水平标准化。

33.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述抗原结合分子固定在固体或半固体支持物上。

34.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述抗原结合分子形成抗原结合分子空间阵列的一部分。

35.如权利要求23所述的方法，其特征在于，通过免疫测定检测与所述靶多肽结合的抗原结合分子的水平。

36.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达产物或相应表达产物是靶多肽，其水平可用与所述靶多肽反应产生反应产物的至少一种底物来检测。

37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，将所述靶多肽检测到的功能活性按同一样品中存在的参比多肽的功能活性标准化。

38.如权利要求4所述的方法，其特征在于，利用包括至少一个与基站相连接的终端站的系统来执行所述方法，其中所述基站(a)通过通信网络从所述终端站接受对象数据，其中所述对象数据代表对应于生物学样品中至少一种表达产物检测到的或标准化的水平或功能活性的参数值，和(b)将所述对象数据与代表参比样品中至少一种相应表达产物检测到的或标准化的水平或功能活性的预定数据作比较，从而测定与参比样品中相应表达产物的水平或功能活性相比，此生物学样品中表达产物的水平或功能活性的任何差异。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述基站可诊断内毒素血症相关病症的存在、不存在或程度。

40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述基站还可通过通信网络将诊断指征传递至所述终端站。

41.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测到所述异常表达表明有内毒素血症相关病症的存在或风险。

42.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测试对象是马。

43.一种治疗、预防或抑制对象发生内毒素血症相关病症的方法，该方法包括检测对象中至少一种内毒素血症标记基因的异常表达，并给予所述对象有效量的治疗或缓解症状或逆转或抑制所述对象发生内毒素血症相关病症的药物，其中，内毒素血症标记基因在免疫系统的细胞中表达并选自下组：(a)一种基因，其多核苷酸表达产物含有与以下任一序列有至少50％序列相同性的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259、260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325，或其互补序列；(b)一种基因，其多核苷酸表达产物含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；(c)一种基因，其多核苷酸表达产物含有编码与以下任一序列的至少一部分有至少50％序列相似性的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分含有该序列的至少15个毗连的氨基酸残基；和(d)一种基因，其多核苷酸表达产物含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。

44.一种分离的内毒素血症标记多核苷酸，其选自：(a)含有与以下任一序列至少有50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325，或其互补序列；(b)含有包含以下任一序列的一部分的多核苷酸：SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259、260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325，或其互补序列，其中所述部分含有该序列或互补序列的至少15个毗连核苷酸；(c)至少在低严谨性条件下与(a)或(b)所述序列或其互补序列杂交的多核苷酸；和(d)含有以下任一序列的一部分的多核苷酸：SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259、260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325，或其互补序列，其中所述部分含有该序列或互补序列的至少15个毗连核苷酸并至少在低严谨性条件下与(a)、(b)或(c)所述序列或其互补序列杂交。

45.一种核酸构建物，其含有操作性连接于调节元件的如权利要求44所述的内毒素血症标记多核苷酸，所述调节元件在宿主细胞中可操作。

46.一种分离的宿主细胞，其含有如权利要求45所述的核酸构建物。

47.一种探针，其含有至少在低严谨性条件下与如权利要求44所述多核苷酸杂交的核苷酸序列。

48.如权利要求47所述的探针，其特征在于，所述探针基本上由对应于编码以下任一氨基酸序列的核苷酸序列的至少一部分或与其互补的核酸序列构成：SEQID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分至少长15个核苷酸。

49.如权利要求47所述的探针，其特征在于，所述探针包含至少能在低严谨性条件下与编码以下任一氨基酸序列的核苷酸序列的至少一部分杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分至少长15个核苷酸。

50.如权利要求47所述的探针，其特征在于，所述探针含有至少能在低严谨性条件下与以下序列的至少一部分杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259、260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325，其中所述部分至少长15个核苷酸。

51.如权利要求47所述的探针，其特征在于，所述探针包含SEQ ID NO：145-2150中任一所示的序列。

52.一种固体或半固体支持物，其包含至少一种固定于其上的如权利要求47所述的探针。

53.如权利要求44所述的一种或多种内毒素血症标记多核苷酸，或如权利要求47所述的一种或多种探针，或选自以下的一种或多种内毒素血症标记多肽，或者与这些内毒素血症标记多肽免疫相互作用的一种或多种抗原结合分子在制备诊断对象中存在内毒素血症相关病症的试剂盒中的应用：(i)含有与以下任一序列至少有50％序列相似性的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；(ii)含有与内毒素血症标记基因的多肽表达产物至少有50％序列相似性的氨基酸序列的多肽，所述多肽表达产物含有以下任一序列：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；(iii)以上(i)或(ii)所述多肽的一部分，其中所述部分包含该多肽的至少5个毗连氨基酸残基；(iv)含有与(i)或(ii)所述多肽的至少15个毗连氨基酸残基至少具有30％相似性的氨基酸序列的多肽；与(iv)含有(i)或(ii)所述多肽的一部分的多肽，其中所述部分含有(i)或(ii)所述多肽的至少5个毗连氨基酸残基并与和(i)、(ii)或(iii)所述序列免疫相互作用的抗原结合分子发生免疫相互作用。

54.一种诊断测试对象存在内毒素血症相关病症的方法，所述方法包括检测测试对象的免疫系统细胞中选自以下的至少一种内毒素血症标记多核苷酸的异常表达：(a)含有与以下任一序列有至少50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQID NO：1、3、4、5、6、7、9、10、11、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26、27、29、31、33、35、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、61、63、64、66、67、68、69、70、71、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、88、90、92、93、94、96、98、100、101、102、103、104、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、121、122、123、124、125、126、128、130、132、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、158、160、162、164、166、168、169、170、172、173、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、193、194、195、197、199、201、203、205、206、207、209、210、211、212、214、215、216、218、220、222、223、224、225、227、229、231、233、235、236、237、239、240、242、244、245、246、248、250、252、254、255、257、259、260、262、264、266、268、269、270、271、272、274、276、278、279、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、305、306、307、309、311、312、314、315、316、318、320、321、323或325，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分有至少50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：2、8、12、14、20、22、24、28、30、32、34、36、40、46、48、51、53、55、57、59、62、65、72、74、78、85、87、89、91、95、97、99、105、108、112、116、118、120、127、129、131、133、135，138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、159、161、163、165、167、171、175、177、179、181、183、185、187、189、191、196、198、200、202、204、208、213、217、219、221、226、228、230、232、234、236、238、241、243、247、249、251、253、256、258、261、263、265、267、273、275、277、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、308、310、313、317、319、322、324或326，其中所述部分含有该序列的至少15个毗连的氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。