CN1914336B - 犬骨关节炎相关基因及相关的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文描述了包含在骨关节炎中差异表达的多核苷酸分子的组合物。还描述了可用于诊断和预后骨关节炎的方法，以及可用于筛选在犬骨关节炎治疗模式中有效的测试物质的方法。还描述了可用于所述方法的设备和试剂盒。

Description

犬骨关节炎相关基因及相关的方法和组合物

相关申请交叉参考 

该申请要求在2004年二月2日递交的U.S.申请No.60/541,346的利益，其公开内容在本文整体引用为参考。 

技术领域

本发明涉及退行性关节病(例如骨关节炎)领域。更具体而言，本发明涉及基于骨关节炎相关的基因特征性表达谱的新组合物、设备和方法。 

背景技术

骨关节炎(OA)(通常也称为退行性关节病)已在人和所有兽类中识别(Richardson等，(1997)Vet.Clin.North Am.27：883-911)。在犬中OA是流行并导致虚弱的疾病，且经常伴随髋发育异常(Martinez，S.(1997)Osteoarthritis，Vet.Clinics of N.Am.：Small Animal Practice 27(4)：  735-758.)。犬和人骨关节炎之间有高度相似性，因此使得犬成为研究人骨关节炎的良好动物模型。尽管诱发因素仍然大部分未知，该疾病表征为软骨基质降解胜于软骨基质合成的失调。软骨细胞调亡和发炎也与该疾病相关(Pelletier，J.等，(2001)Arthritis&Rheumatism 44(6)：1237-1247；Lotz，M.(1999)Osteoarthritis and Cartilage 7：389-391)。 

该疾病通常发展缓慢并表征为丧失蛋白聚糖和胶原的关节软骨的退化以及新骨的增生。另外，滑膜上可发生炎症反应。犬骨关节炎可作为继发症状被引起，特别是被髋发育不良或分离性骨软骨炎引起(Martinez，上文)。包括外伤事件的后天疾病也可导致犬骨关节炎(Martinez等，Vet.Clin.North Am.27：759-775，1997)。骨关节炎治疗模式可包括施用消炎药以及饮食脂肪酸的控制(Richardson等，上文)。 

犬骨关节炎的诊断通常以症候学为基础。患有骨关节炎的犬显示可逐渐发生但在运动后会急剧加重的跛足。跛足可被休息加重但几分钟活动后可减轻。湿冷的条件、肥胖症和长时间的运动经常使跛足体征恶化(Pederson等，《Textbook of Veterinary Internal Medicine》第5版，Ettinger等编，W.B.Saunders and Co.，Philadelphia，2000，1862-1886页)。 

随着基因组科学的出现，人们了解到不仅基因表达调节与正常的内环境稳定密切相关，基因差异表达的变化也是疾病发生的一个方面。因此，评估疾病中的基因表达模式日益被认为对在分子水平上了解疾病过程至关重要(Going等，European J.Cancer 35：1895-1904，1999；Wang等，Cardiovasc.Res.35：414-421)。出现了大量用于研究比较基因表达的方法，且当前的重点为高通量分析方法(综述见Carulli等，J.Cell.Biochem.Suppl.30/32：286-296，1998；Kozian等，Trends Biotechnol 17：73-78，1999)。近期发展的差异基因表达高通量分析方法包括例如EST测序(Adams等，Science 252：1651-1656，1991；Adams等，Nature 377：3-16，1995)、微点阵杂交(Schena等，Science 270：467-470，1995)以及差异显示(Liang等，Science 257：967-970，1992；Welsh等，Nucleic Acids Res.20：4965-4970，1992)。 

骨关节炎中特别是犬骨关节炎中的基因表达尚未被广泛研究。因此，存在鉴定在骨关节炎中差异表达的核酸序列及其编码的蛋白质的需要。该信息在诊断受试者骨关节炎疾病状态或预处理该疾病以及鉴定对治疗或预防骨关节炎有效的物质时是有用的。 

发明概述 

根据本发明的一个方面，大量至少含有基因片段的多核苷酸被鉴定为与非骨关节炎或前骨关节炎受试者中的表达相比，在骨关节炎或前骨关节炎受试者中差异表达。 

根据本发明的一个方面，差异表达的基因、基因片段和编码的基因产物，以及与该组基因相关的表达模式被有利地用于检测与骨关节炎(特别 是犬骨关节炎)相关的基因表达改变的大量方法中。本发明的其它方面涉及用于鉴定可用于治疗和/或预防骨关节炎的试剂的方法。 

根据本发明的其他方面，提供便于实施本发明具体实施方案提供的方法的组合物、设备和测试试剂盒。 

将参考下面的详述和实施例将理解本发明的其他特点和优点。 

图表概述 

图1展示犬骨关节炎差异显示分析中使用的代表性凝胶。A.条带切除前，以双份上样的的骨关节炎对正常转录物差异显示(D＝骨关节炎(疾病)，N＝正常)。B.条带切除后的同一凝胶 

图2展示犬软骨中选定的OA相关转录物的定量PCR分析(qPCR)。RNA表达以任意单位显示(OA AVG＝骨关节炎软骨平均表达；CAVG＝正常对照平均表达)。 

表1：基因ID编号与序列ID编号对应关系 

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说明性实施方案详述 

定义： 

提供下列定义以促进对本发明的理解： 

本文使用的“核酸”或“核酸分子”指双链或单链的任何DNA或RNA分子，且如果是单链，还包括其线性或环状形式的互补序列分子。讨论核酸分子时，具体核酸分子的序列或结构在本文根据常规惯例以5’到3’方向提供序列来描述。参照本发明的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。该术语用于DNA时，是指从其来源的生物天然基因组中与之紧邻的序列中分离出来的DNA分子。例如，“分离的核酸”可包括插入载体(例如质粒或病毒载体)或整合进原核或真核细胞或宿主生物基因组DNA的DNA分子。 

用于RNA时，术语“分离的核酸分子”主要是指由上文定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。另外，该术语可以指与其在天然环境(即细胞或组织中)中可能结合的其他核酸充分分离的RNA分子。分离的核酸(DNA或RNA)还可代表直接通过生物学的或合成的途径产生并从其产生时存在的其他组分中分离的分子。 

涉及具体序列时，根据威斯康辛大学GCG软件程序中的解释使用术语“百分比相似度”、“百分比同一性”和“百分比同源性”。 

“多核苷酸”、“多核苷酸分子”或“多核苷酸序列”指核苷酸链。其可指双链或单链的DNA或RNA分子，如果是单链，还包括其线性或环状形式的互补序列分子。链优选大约有50到10000个核苷酸，更优选大约 有150到3500个核苷酸。一些情况下，当比对时序列是完全互补的(没有错配)。在其他情况下，序列中可有上至约30％的错配。 

本文使用术语“寡核苷酸”是指本发明的序列、引物和探针，并定义为由两个或多个(优选多于三个)核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成的核酸分子。寡核苷酸的确切大小依赖于多种因素和寡核苷酸的具体应用和用途。 

“片段”是指核酸序列，其优选至少约10个核苷酸长度的，更优选约40个核苷酸，最优选约100个核苷酸长度，包括例如由SEQ ID NO：1-1558的1-100、300-400、500-600、800-900个核苷酸组成的片段，或SEQ ID NO：1-15583’端类似长度的片段。“片段”还可指包含一个或多个缺失、插入或替换的一段至少约100个连续的核苷酸。“片段”还可指基因的整个编码序列并可包括5’和3’非翻译区。“片段”还可指多肽序列，其优选至少约5到约15个氨基酸长度，更优选至少约10个氨基酸长度，并保留序列的一些生物活性或免疫活性。 

术语“基因”是指基因的部分或全部编码序列。该术语还指转录物的5’或3’非翻译区。短语“骨关节炎中差异表达的基因”是指与非骨关节炎或前骨关节炎的正常受试者细胞中mRNA或翻译的基因产物数量相比，在骨关节炎和前骨关节炎受试者细胞中，由该基因表达的mRNA数量或由该mRNA翻译的基因产物数量有可检测差异(即更多或更少)的基因。本文使用“前骨关节炎”或“前骨关节炎的”旨在表示受试者日后容易发生骨关节炎，但是可没有任何骨关节炎的明显体征和症状。优选的，来自骨关节炎或前骨关节炎样品的差异表达基因的转录或翻译产物丰度与正常样品中相比差异至少约1.15倍，更优选至少约1.2倍，更优选至少约1.3倍，更优选至少约1.4倍，更优选至少约1.5倍，更优选至少约1.6倍，更优选至少约1.75倍，更优选至少约2倍，更优选至少约3倍，更优选至少约10倍，更优选至少约20倍。短语“骨关节炎中差异表达的基因”还指在正常转录物谱中不可检测但在骨关节炎或前骨关节炎组织转录物谱中优选至少约每细胞2拷贝，更优选至少约每细胞3拷贝水平的基因。 

术语“骨关节炎(OA)相关的”和“骨关节炎(OA)相关基因”是指如本文定义在骨关节炎中差异表达的基因。 

本文使用术语“报告子”、“报告体系”、“报告基因”或“报告基因产物”是指有效的遗传系统，其中核酸包含编码表达时产生易于测量(如通过生物学鉴定法、免疫测定、放射免疫测定或通过比色法、荧光测定、化学发光法或其他方法)报告子信号的基因。该核酸可为线性或环形、单链或双链、反义或正义极性的RNA或DNA，并有效连接在该报告基因产物表达必须的控制元件上。所需的控制元件可根据报告体系的性质和该报告基因为DNA或RNA形式而变化，但可以包括但不仅限于如启动子、增强子、翻译控制序列、加多聚A信号、转录终止信号等这样的元件。 

术语“转化”、“转染”、“转导”是指将核酸引入细胞或宿主生物的任何方法或手段，并可互换使用以表达相同的含义。这类方法包括但不仅限于转染、电穿孔、微注射、PEG融合等。 

本文使用术语“功能的”是指核酸或氨基酸序列对所述测定或目的是有功能的。 

当涉及具体的核苷酸或氨基酸时，短语“基本上由......组成”是指具有给定SEQ ID NO性质的序列。例如，当用于氨基酸序列时，该短语包括序列本身以及不影响该序列基本特征和新特征的分子修饰。 

“载体”是例如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体、人工染色体(BAC、YAC)或病毒的复制子，另一遗传序列或元件(DNA或RNA)可插入其中以引起插入序列或元件的复制。“复制子”是例如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体、人工染色体(BAC、YAC)或病毒的任何遗传元件，其能够主要依赖自身的控制进行复制。复制子可为DNA或RNA并可是单链或双链的。 

本文使用术语“探针”是指核酸探针或蛋白质探针。当与核酸一起使用时，“探针”是指能够与具有探针互补序列的核酸退火或特异杂交的寡核苷酸、多核苷酸或核酸，它们可以是天然存在(作为纯化的限制酶消化物)或合成产生的DNA或RNA。探针可为单链或双链。探针的确切长度要依赖于包括温度、探针来源和使用方法的多种因素。例如，用于诊断应 用时，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸探针一般包含约10-100，优选约15-50，更优选约15-25个核苷酸。在某些诊断应用中，多核苷酸探针优选包含约90-1150个核苷酸，更优选约300-600个核苷酸，更优选约300个核苷酸。此处选择的探针与具体的靶核酸序列不同链“基本上”互补。这意味着探针必须足够互补从而能够与它们各自的靶链在一系列预先决定的条件下“特异杂交”或退火。因此，探针序列不必反映靶序列的精确互补序列。例如，探针序列剩余部分与靶链互补时，可在探针5’或3’末端附加非互补核苷酸片段。另外，非互补碱基或更长的序列可散布在探针内，只要探针序列与待特异退火的靶核酸序列有足够的互补性。与蛋白质一起使用时，“探针”是能够特异结合特定蛋白质或蛋白质片段以基本排除其他蛋白质或蛋白质片段的蛋白质结合物质。这些结合物质可是蛋白质或肽特异结合的任何分子，包括DNA(对DNA结合蛋白质)、抗体(如本文更详细描述的)、细胞膜受体、肽、辅因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜、细胞器和细胞器膜。 

“阵列”是指至少两个探针在基质上的有序排列。至少一个探针代表对照或标准，且另一个为诊断目的的探针。约两个到40000个探针在基质上的排列保证探针和样品核酸或蛋白质结合物质间形成的各个标记复合物的大小和信号强度能更各自区别。 

当一个分子的嘌呤与互补分子的嘧啶以氢键结合时(例如5′-A-G-T-C-3′碱基对与3′-T-C-A-G-5′)，在样品核酸分子间形成了“杂交复合物”。互补性程度和核苷酸类似物的使用影响杂交反应的效率和严格度。 

术语“特异杂交”是指两个单链核酸分子间的联合，两个分子具有足够互补的序列允许以在本领域通常使用的预先确定的条件下发生这类杂交(有时称为“基本互补”)。例如，该术语可指核酸探针与根据本发明某一发面的单链DNA或RNA分子所含的基本互补序列杂交，基本排除核酸探针与非互补序列的单链核酸的杂交。 

“样品”以其最广义的含义使用，包含核酸、蛋白质、抗体等。样品可包括，例如体液；细胞制品的可溶部分，或生长细胞的培养基的等分试样；染色体、细胞器，或从细胞分离或抽提的膜；溶液中的或结合在基质上的基因组DNA、RNA或cDNA；细胞；组织或活检组织；组织印痕(tissueprint)；指纹、口腔细胞、皮肤或毛发等。 

“标准”是指包含来自正常(与OA相关相对的)生物学状态来源材料的对照样品。OA相关生物学状态可包括例如在该状态下来源具有OA、容易发展OA或显示OA某些生物学特征。例如，标准样品可包括来自非骨关节炎或非前骨关节炎的正常受试者的核酸或蛋白质。标准样品还可包括来自正常细胞或组织的未经处理的样品，所述处理用于引发可模仿OA某些方面的免疫应答。 

“特异结合”是指两个分子间特异并精确的相互作用，其依赖于它们的结构，特别是它们的分子侧基。例如，调节蛋白嵌入DNA分子大沟，两个单链核酸间沿主链的氢键结合或蛋白质表位与激动剂、拮抗剂或抗体之间的结合。 

本文使用术语“引物”是指通过限制性酶消化产生的来自生物体系的或合成产生的单链或双链RNA或DNA核酸分子，其置于适当的环境中时，能够作为模板依赖的核酸合成的起始物发挥作用。当与适当的核酸模板、核酸的适当核苷三磷酸前体、聚合酶、合适的辅助因子和条件(例如适当的温度和pH)一起存在时，引物可通过聚合酶作用或类似的活性在其3，末端添加核苷酸而延伸，以产生引物延伸产物。引物长度可根据应用的具体条件和要求变化。例如，在根据本发明具体实施方案的诊断应用中，引物可为寡核苷酸引物，优选约15-25或更多核苷酸长度。引物与目的模板必须有足够的互补性以引起目的延伸产物的合成，即能够与目的模板链以足够提供恰当并列引物的3’羟基部分以用于起始由聚合酶或类似酶的合成的方式退火。不要求引物序列表现与目的模板精确互补。例如，非互补核苷酸序列可结合在另一互补引物的5’末端。另外，非互补碱基可散布在寡 核苷酸引物序列内，只要引物序列与目的模板链序列有足够的互补性以功能性产生用于延伸产物合成的模板引物复合物。 

本文描述的氨基酸残基优选“L”异构体形式。然而，“D”异构体形式的残基可替代任何L氨基酸残基，只要保留多肽的目的性质。本文描述的所有氨基酸残基序列遵从常规的左至右氨基端至羧基端的方向。 

多肽的“片段”或“部分”是指一段氨基酸残基，其为至少五到七个连接的氨基酸，经常为至少约七到九个连接的氨基酸，通常为至少约九到十三个连接的氨基酸，且最优选至少约二十到三十或更多个连接的氨基酸。多肽序列、抗原决定簇或表位的片段可用于引起对部分蛋白质氨基酸序列的免疫应答。 

天然存在差异表达基因的不同“变体”。这些变体可以是由编码蛋白质的基因的核苷酸序列差异表征的等位基因，或可以涉及不同的RNA加工或翻译后修饰。技术人员可产生具有单个或多个氨基酸替代、删除、添加或置换的变体。这些变体可以包括(但不仅限于)：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守氨基酸替代的变体；(b)其中一个或多个氨基酸被添加至多肽的变体；(c)其中一个或多个氨基酸包含取代基的变体，以及(d)其中多肽与另一肽或多肽融合的变体，融合部分如融合配偶体、蛋白质标签或能够给予多肽有用特性的其他化学部分，例如抗体表位、多组氨酸序列、生物素部分等。本发明的其他多肽可以包括其中来自一物种的氨基酸残基被另一物种中相应的残基在保守或非保守位置替代的变体。在另一实施方案中，非保守位置的氨基酸残基被保守的或非保守的残基替代。获得这些变体的技术为本领域普通技术人员公知，包括遗传(阻抑、缺失、突变等)、化学和酶技术。等位基因变体、类似物、片段、衍生物、突变体和修饰物，包括产生保留差异表达多肽任何生物学特性的差异表达多肽衍生物的备选核酸加工形式和备选翻译后修饰形式，都包括在本发明范围内。 

术语“分离的蛋白质”或“分离并纯化的蛋白质”主要指通过表达本发明的分离的核酸分子产生的蛋白质。另外，该术语可以指从其可能天然 结合的其他蛋白质中充分分离出来从而以“基本纯净”形式存在的蛋白质。“分离的”并不意味着排除与其他化合物或材料混合的人工或合成的混合物，或不影响基本活性的杂质的存在，以及可能由于例如不完全纯化、稳定剂的添加或混合进例如免疫原制品或可药用制品而存在的杂质。 

术语“基本纯净”是指以重量计包含至少约50-60％给定材料(例如核酸、蛋白质等)的制品。更优选的，该制品包含以重量计至少约75％，且最优选以重量计约90-95％量的给定化合物。纯度通过适合于给定材料的方法(例如层析法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)测量。 

术语“标签”、“标签序列”或“蛋白质标签”是指可以为核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或氨基酸、肽或蛋白质或其他化学品的化学部分，其添加至另一序列时产生附加效用或给予有用特性(特别是在该序列的检测或分离时)。因此，例如同聚物核酸序列或与捕获寡核苷酸互补的核酸序列可添加至引物或探针序列上，以便于随后分离延伸产物或杂交产物。对于蛋白质标签，组氨酸残基(例如4到8个连续的组氨酸残基)可被添加至蛋白质的氨基或羧基端以便于通过螯合金属层析法的蛋白质分离。另外，与特异抗体分子或其他分子反应的表位或结合决定子(例如标签表位、cmyc表位、甲型流感病毒血凝素蛋白质的跨膜表位、A蛋白、纤维素结合结构域、钙调素结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、几丁质结合结构域、谷胱甘肽S转移酶等)的氨基酸序列、肽、蛋白质或融合配偶体可添加至蛋白质上以便于通过例如亲和或免疫亲和层析方法分离蛋白质。化学标签部分包括例如生物素这样的分子，其可被添加至核酸或蛋白质上并通过与抗生物素蛋白试剂等反应促进分离或检测。大量的其他标签部分公知，并可被本领域熟练的技术人员设计，且计划包含在该定义的范围内。 

“抗体”或“抗体分子”为与特异抗原结合的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语包括多克隆、单克隆、嵌合体和双特异性抗体。如本文使用，抗体或抗体分子考虑为完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如本领域公知的Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)部分。 

如本文使用，术语“受试者”或“患者”是指人和动物，除非特别说明“受试者”或“患者”是指人或动物。动物受试者优选脊椎动物，更优选哺乳动物。 

“治疗方案”是指任何治疗和/或预防疾病、病症或紊乱的手段。 

在本发明的一个方面，鉴定了与非骨关节炎受试者相比在骨关节炎受试者中差异表达的大量基因。这些基因和基因片段，以及它们编码的蛋白质和片段，可用于例如各种诊断和预后测定中，以及用于筛选在骨关节炎治疗方案中有效的测试物质的测定中。 

在本发明的某些实施方案中，可测量至少一个差异表达基因的表达。在优选的实施方案中，可测量两个或更多的差异表达基因的表达，提供基因表达模式或基因表达谱。更优选的，可进行多个差异表达基因的测量，产生基因表达模式或谱的额外信息。 

在本发明的多个实施方案中，基因表达的变化可以一种或两种途径测量：(1)通过检测特定基因产生的mRNA测量转录；和(2)通过检测特定转录物产生的蛋白质测量翻译。 

可使用本领域熟知的任何多核苷酸定量方法在RNA水平上测量降低或提高的表达，例如PCR(包括但不仅限于RT-PCR和qPCR)、RNA酶保护、Northern印迹及其他杂交方法。根据本发明测定或检测的基因通常以mRNA或反转录mRNA的形式。基因可被克隆和/或扩增。克隆本身未显示改变基因在总体中的表现。然而，优选使用多聚腺苷酸+RNA作为来源，因为其可以以更少的加工步骤使用。 

根据本发明的诸方面，鉴定了1558个功能与骨关节炎(OA)密切相关的基因。通过比较这些基因在正常组织和来自诊断为OA的受试者组织中的表达确定该关联。如此鉴定的基因落入两个广义类别。第一类别包含已知基因，其中许多与OA的关联之前未被认识。这些基因随同它们相应的基因ID号和SEQ ID NO一起列在表6中。 

根据本发明的另一方面，另一类别包括与先前鉴定的序列未显示同源性的核酸片段。因此，相信该类别包含一个或多个新基因。本发明的一个 优选的实施方案涉及包含新OA相关基因、由该OA相关基因产生的mRNA或cDNA的分离的核酸分子。 

本发明的一个方面涉及与非骨关节炎或非前骨关节炎受试者中的表达相比，在骨关节炎受试者或前骨关节炎受试者中差异表达的1558个多核苷酸分子的组合。在本文描述的本发明的一个实施方案中，通过使用差异显示从犬软骨中获得1558个OA相关基因的片段。这些多核苷酸的核苷酸序列在本文公开为SEQ ID NO：1-1558(表1显示SEQ ID NO.和Gene ID序号之间的关系)。这些序列的BLAST分析鉴定了其与先前鉴定的(表2)大量核酸序列的同源性。这些序列包括大量与已知基因无鉴定的同源性的先前鉴定的核酸序列。BLAST分析还鉴定了与先前鉴定的基因显示同源性的序列；表2A和2B提供了包括这些序列各自的同源物的基因名称以及数据库登录号的信息。 

表2A 

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表2B 

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本发明的一个实施方案涉及包含两个或更多选自SEQ ID NO：1-1558的多核苷酸分子或其片段的组合。优选的，该组合包含约10个或更多多核苷酸分子，更优选约50个或更多多核苷酸分子，更优选约200个或更多多核苷酸分子，更优选约400个或更多多核苷酸分子，更优选约1000个或更多多核苷酸分子。 

在优选的实施方案中，本发明涉及396个差异表达的多核苷酸分子的组合，其序列由SEQ ID NO：1-396表示。表3鉴定了一系列从临床样品中鉴定为在OA对正常受试者中差异表达至统计学显著程度(p＜0.05)的基因序列。表3包含基因ID、表达值、标准差和表达倍数差异(OA对正常)。优选的，该组合包含两个或更多选自SEQ ID NO：1-396的多核苷酸分子或其片段。 

在特别优选的实施方案中，本发明涉及217个差异表达的多核苷酸分子的组合，其序列由SEQ ID NO：1-217表示。表4鉴定了一系列从临床样品中鉴定为在OA对正常受试者中差异表达至高度显著程度(p＜0.01)的基因序列。表4包含基因ID、表达值、标准差和差异表达倍数差异(OA对正常)。优选的，该组合包含两个或更多选自SEQ ID NO：1-217的多核苷酸分子或其片段。 

根据本发明的一个方面，用于检测样品的一个或多个寡核苷酸或多核苷酸探针可使用本文公开的1558个分离的基因片段(SEQ ID NO：1-1558)任一的序列信息制备。根据本发明的另一方面，探针可使用可得自本文鉴定的任何基因或基因片段的序列信息制备。探针必须有足够的长度以基本上专一地与适当互补基因或转录物特异杂交。优选的，寡核苷酸探针长度会至少为约10、12、14、16、18、20或25个核苷酸。在一些实施方案中，需要至少约30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸的更长的探针，且长于约100个核苷酸的探针在一些实施方案中可以是合适的。优选的， 提供用于检测在OA中差异表达的基因产物表达的两个或更多核酸探针的集合，更优选约10个或更多探针的集合，更优选约50个或更多探针的集合，更优选约200个或更多探针的集合，更优选约400个或更多探针的集合，更优选约1000个或更多探针的集合。 

在本发明的一个优选的实施方案中，一个或多个寡核苷酸或多核苷酸探针可使用本文SEQ ID NO：1-396中任一公开的序列信息制备。优选的，一个或多个寡核苷酸或多核苷酸探针可使用本文SEQ ID NO：1-217中任一公开的序列信息制备。 

在本发明某些优选的实施方案中，固定的核酸探针可用于核酸分子及其表达模式的快速和特异检测。通常，核酸探针连接在固体支持物上，且靶核酸(例如基因组核酸、扩增子，或最通常的扩增混合物)与探针杂交。探针或靶或两者都可被标记，通常使用荧光团或其他标签，例如链霉抗生物素。当标记靶时，通过检测结合荧光检测杂交。当标记探针时，通常通过标签的猝灭检测杂交。探针和靶都被标记时，通常通过监测两个结合标签的接近导致的色彩改变进行杂交检测。多种标记策略、标签等，特别是基于荧光的应用，为本领域公知。 

本发明的另一方面涉及包含多肽结合剂的一个或多个探针，所述结合剂与包含选自SEQ ID NO：1-1558序列或其片段的一个或多个核酸分子表达产生的多肽特异结合。根据本发明的另一方面，蛋白质结合探针可使用表2中鉴定的任何基因或基因片段的可获得的序列信息制备。优选的，提供用于检测在OA中差异表达的基因产物表达的两个或更多多肽探针的集合，更优选约10个或更多探针的集合，更优选约50个或更多探针的集合，更优选约200个或更多探针的集合，更优选约400个或更多探针的集合，更优选约1000个或更多探针的集合。 

在本发明优选的实施方案中，包含多肽结合剂的探针与包含选自SEQID NO：1-396的序列的核酸分子产生的多肽特异结合。在特别优选的实施方案中，包含多肽结合剂的探针与包含选自SEQ ID NO：1-217的序列的核酸分子产生的多肽特异结合。 

可用于确定蛋白质在样品中水平的测定验技术也是本领域技术人员熟知的。这样的测定方法包括放射免疫测定、竞争性结合测定、Western印迹分析和ELISA测定。在利用抗体的实验方法中，多克隆和单克隆抗体都适用于本发明。如本领域技术人员会深入理解的，这样的抗体对特定的蛋白质、或蛋白质表位、或蛋白质片段可以是免疫特异的。产生对蛋白质或肽免疫特异的多克隆和单克隆抗体的方法也是本领域熟知的。 

本发明优选的实施方案可利用抗体用于检测并定量通过表达本文描述的多核苷酸产生的蛋白质。尽管可以通过免疫沉淀、亲和分离、Western印迹分析等检测蛋白质，优选的方法使用ELISA型方法，其中抗体固定在固体支持物上且靶蛋白质或肽暴露于固定的抗体。探针或靶或两者都可以被标记。多种标记策略、标签等为本领域公知。 

在本发明特别优选的实施方案中，使用用于检测靶核酸或蛋白质的探针阵列观察在骨关节炎中差异表达的多数基因的表达模式或谱。在一个实施方案中，可使用寡核苷酸或多核苷酸探针阵列，而另一实施方案可使用抗体或其他与差异表达基因产物特异结合的蛋白质阵列。这样的阵列可是市售的(例如通过Affymetrix，Inc.、Applied Biosystems，Inc.、Agilent，Inc.获得)，或它们可根据已知方法定制，例如在固体支持物上原位合成或通过微印制技术将预先合成的探针附着在固体支持物上。在优选的实施方案中，定制核酸或蛋白质结合探针阵列以特异检测本文描述的1558个差异表达基因或基因片段中的两个或更多所产生的转录物或蛋白质。在本发明的一个实施方案中，定制核酸或蛋白质结合探针阵列以特异检测两个或更多表2中鉴定的基因或基因片段产生的转录物或蛋白质。在优选的实施方案中，定制核酸或蛋白质结合探针阵列以特异检测两个或更多表3中鉴定的396个差异表达的基因或基因片段产生的转录物或蛋白质。在优选的实施方案中，定制核酸或蛋白质结合探针阵列以特异检测两个或更多表4中鉴定的217个差异表达的基因或基因片段产生的转录物或蛋白质。 

优选的，用于检测在OA中差异表达基因产物表达的两个或更多核酸或多肽探针的集合固定在支持物上分散的位置，更优选约10个或更多探针 的集合，更优选约50个或更多探针的集合，更优选约200个或更多探针的集合，更优选约400个或更多探针的集合，更优选约1000个或更多探针的集合。 

由于软骨细胞代表了软骨(OA影响的组织)的细胞组分，构建软骨细胞阵列可代表研究骨关节炎软骨细胞的有力工具。本发明人利用差异显示在转录物选择中的用途来富集阵列上代表OA相关转录物的克隆。 

本发明的一个方面，提供用于测定样品中OA相关核酸的方法。优选的，使用包含一个或多个选自SEQ ID NO：1-1558，更优选选自EQ ID NOs：1-396，更优选选自SEQ ID NO：1-217的多核苷酸分子的组合来制备与测试样品核酸杂交的探针，检测形成的杂交复合物并与标准的复合物比较，以便样品和标准杂交复合物间的差异能指示样品中核酸的差异表达。在优选的实施方案中，制备核酸探针以特异检测一个或多个表2中鉴定的基因或基因片段产生的转录物或其片段。在某些优选的实施方案中，可在杂交前扩增样品核酸。 

在本发明的另一方面，提供用于测定样品中OA相关多肽的方法。优选的，使用选自SEQ ID NO：1-1558，更优选选自SEQ ID NO：1-396，更优选选自SEQ ID NO：1-217的多核苷酸序列制备与这些多肽或其片段的翻译产物特异结合的蛋白质结合探针。这些探针与测试样品反应，形成结合复合物，检测这些复合物并将其与标准的结合复合物比较，从而使样品和标准结合复合物间的差异能够指示样品中多肽的差异表达。在优选的实施方案中，制备蛋白质结合探针以特异检测一个或多个表2中鉴定的基因或基因片段产生的多肽或其片段。 

根据本发明某些优选的实施方案，本文描述的用于检测OA相关转录和翻译产物的测定可用在用于诊断和/或预后患者骨关节炎的方法中。根据本发明的实施方案，通常的诊断测试将包括从患者中获得预期会发生OA相关基因表达的细胞或组织样品。这样的细胞或组织包括(但不仅限于)软骨组织和软骨细胞。然后如分析样品中1)一个或多个选定基因的提高或降低的表达(通过mRNA或蛋白质检测)；或2)特定的基因表达谱(例 如通过本文所述的基因或蛋白质阵列技术)。这样的诊断方法可确定患者中是否存在骨关节炎症状。 

在本发明的另一实施方案中，本文描述的诊断方法可扩展至提供关于患者OA恢复的预后信息，或监测患者对治疗方案的反应进展。在这些情况下，诊断测定在患者恢复或疗程的间隔中进行，并且靶基因表达的变化或基因表达模式的具体变化指示患者的恢复或改善水平。 

在本发明的一个方面，提供用于鉴定在骨关节炎治疗药征中有效的物质的测定。在本发明的一个实施方案中，提供用于测量测试物质对骨关节炎差异表达基因表达谱的作用的方法，包含步骤：a)通过在无测试物质的情况下测量对应于表1和/或表2中鉴定的两个或更多基因或基因片段的两个或更多基因转录或翻译产物，从一个样品中获得标准表达谱；b)通过在有测试物质的情况下测量表1和/或表2中鉴定的两个或更多基因转录或翻译产物，从另一样品中获得测试表达谱；c)比较标准表达谱和测试表达谱，其中测试表达谱与标准表达谱相比的变化指示测试物质对与非骨关节炎疾病相比在骨关节炎中差异表达的基因表达谱的影响。优选的，两个或更多基因或基因片段与表3(SEQ ID NO：1-396)中鉴定的两个或更多基因或基因片段相对应。更优选的，两个或更多基因或基因片段与表4(SEQID NO：1-217)中鉴定的两个或更多基因或基因片段相对应。在某些优选的实施方案中，从培养的细胞中获得样品。这种情况下，标准表达谱从未曾接触测试物质的细胞中获得，而测试表达谱从接触过测试物质的细胞中获得。 

测试化合物可包括蛋白质、多肽、核酸、小分子药物、维生素、矿物质、脂肪酸、多糖、提取物、营养药等。在优选的实施方案中，测试化合物为可以添加进食品或其他食品物质中或可以作为食品添加剂使用的营养品。如本文例证的，这样的营养品包括(但不仅限于)脂肪酸例如ω-3脂肪酸(例如二十碳五烯酸)和ω-6脂肪酸(例如花生四烯酸)、葡糖胺、硫酸软骨素和维生素D衍生物，如1α，25-二羟维生素D3和24R，25-羟维生素D3。 

根据本发明实施方案的一种类型的测定涉及在存在或不存在候选物质时测量上述OA相关基因之一编码的蛋白质的活性。这样的活性测定为本领域熟知。如果对于选定的蛋白质可使用无细胞活性测定，则在存在或不存在测试物质时在纯化的蛋白质上简单进行这样的测定。根据它们正或负调节纯化蛋白质活性的能力选择候选物质。应注意这种类型的测定可在例如如下所述的重组细胞体系中进行。在一些情况下，它们还可在例如无细胞体系中进行。关于这样的体外活性实验，需要纯化的目的蛋白质来源。一个或多个上述基因的蛋白质产物可市售获得，或可从来自适当生物来源(例如培养的细胞)大量纯化。另外，亦如本领域已知的，该蛋白质可从分离的基因或cDNA通过在适当的原核或真核表达体系中表达并随后纯化而重组产生。 

本发明的另一实施方案包含用于测定OA相关基因表达或其编码的蛋白质活性的体外细胞测定。关于这些实施方案，包含根据本发明一方面的OA相关基因的核酸构建体被引入宿主细胞。在优选的实施方案中，使用哺乳动物细胞系。考虑使用的宿主细胞包括但不仅限于NIH3T3、CHO、HELA和COS，以及非哺乳动物细胞例如酵母、细菌和昆虫细胞。编码序列与适用于具体使用的宿主细胞的适当调节表达元件有效连接。将核酸构建体引入宿主细胞的方法为本领域公知。这样的方法包括(但不仅限于)转染、转化、磷酸钙沉淀、电穿孔和脂质转染。可使用重组细胞鉴定调节OA相关基因表达或它们编码的蛋白质活性的化合物。 

对基因表达测定，优选制备包含与报告基因有效连接的所选的OA相关基因启动子的人工构建体。报告基因构建体可引入培养的细胞，包括但不仅限于上述的标准宿主细胞系，或其他合适的细胞如软骨相关细胞，例如软骨细胞。该测定通过监测报告基因在存在或不存在测试化合物时的表达而实施。根据它们正或负影响基因表达的能力选择候选物质。 

在本发明的另一实施方案中，本文描述的OA相关基因和基因片段可用于操作非人动物受试者的基因组。操作多种动物基因组的方法为本领域技术人员公知。这样的方法可包括但不仅限于转基因和基因敲除动物的产 生。在本发明优选的实施方案中，表2鉴定的基因或基因片段用于制备构建体，该构建体用于破坏或“敲除”动物中相应内源基因，从而产生在该基因座上具有无效突变的动物。在一些实施方案中，动物显示具有选自SEQ ID NO：1-1558核酸序列的一个或多个基因表达的降低或完全消失。在一些实施方案中，动物显示具有选自SEQ ID NO：1-396核酸序列的一个或多个基因表达的降低或完全消失。在一些实施方案中，动物显示具有选自SEQ ID NO：1-217核酸序列的一个或多个基因表达的降低或完全消失。在其他实施方案中，动物显示表6中所示一个或多个基因表达的降低或完全消失。转基因动物优选哺乳动物。在一些实施方案中，转基因动物为啮齿动物(例如小鼠或大鼠)。在其他实施方案中，动物为例如山羊、猫、狗、牛、猪、绵羊、马、非人灵长类、兔和豚鼠。在一些实施方案中，使用小干扰RNA功能性破坏这些基因。一般的，基因表达被短干扰RNA(siRNA)通过RNA干扰(RNAi)或转录后基因沉默(PTGS)抑制(见例如Ketting等(2001)Genes Develop.15：2654-2659页)。siRNA分子可靶向同源的mRNA分子以通过在siRNA分子跨越的区域内切开mRNA分子来进行破坏。因此，能够靶向并切开表6中所示基因产物的mRNA的siRNA可用于降低或消除一个或多个这些基因的表达。在其他实施方案中，能够靶向并切开表1(SEQ ID NO：1-1558)中所示一个或多个基因的mRNA的siRNA可用于降低或消除一个或多个这些基因的表达。 

在本发明的另一实施方案中，本文描述的OA相关基因和基因片段用于设计可被用于干扰一个或多个OA相关基因表达的分子；这样的分子可包括(但不仅限于)RNA干扰探针和反义分子。 

本发明的另一方面表征了促进实现上述实定的物质的组合物。这些组合物可包含用于检测差异表达的OA相关基因、基因片段和根据本发明某些方面的编码蛋白质的两个或更多探针或引物的集合。在一个实施方案中，组合物可包含与选自SEQ ID NO：1-1558的核酸分子特异杂交的两个或更多寡核苷酸或多核苷酸的集合。优选的，组合物可包含与选自SEQ ID NO：1-396的核酸分子特异杂交的两个或更多寡核苷酸或多核苷酸的集合。更 优选的，组合物可包含与选自SEQ ID NO：1-217的核酸分子特异杂交的两个或更多寡核苷酸或多核苷酸的集合。更优选的，组合物可包含与选自表2中鉴定的基因和基因片段特异杂交的两个或更多寡核苷酸或多核苷酸的集合。该集合可包含用于扩增序列的引物对。在某些优选的实施方案中，可使用聚合酶链式反应(PCR)更优选定量PCR(qPCR)进行扩增。在优选的实施方案中，该集合包含更大量的探针(例如约10、50、200、400、1000或更多探针)，其中每个与SEQ ID NO：1-1558的一个序列的部分或全部特异杂交。在优选的实施方案中，核酸探针固定在固体支持物上。在特别优选的实施方案中，它们以阵列形式固定，最优选小型阵列或微阵列。这样的微阵列为本领域公知，且有时称为“DNA芯片”、“微芯片”、“生物芯片”和其他类似术语，并可包含除表1和表2中出现的之外被OA改变的基因或基因片段的整个阵列。 

在另一实施方案中，这些组合物包含两个或更多能够特异结合表1和表2中基因和基因片段编码的蛋白质或蛋白质片段的蛋白质结合物质。在优选的实施方案中，结合物质为抗体，且集合包含两个或更多分别检测两个或更多SEQ ID NO：1-1558编码的蛋白质或肽。优选的，这些组合物包含两个或更多能够特异结合SEQ ID NO：1-396的基因和基因片段编码的蛋白质或蛋白质片段的蛋白质结合物质。更优选的，这些组合物包含两个或更多能够特异结合SEQ ID NO：1-217的基因和基因片段编码的蛋白质或蛋白质片段的蛋白质结合物质。这样的结合物质可为蛋白质或肽特异结合的任何分子，包括DNA(对DNA结合蛋白质而言)、抗体、细胞膜受体、肽、辅因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜、细胞器和细胞器膜。在优选的实施方案中，集合包含更大量的抗体(约10、50、200、400、1000或更多)，其中每个与表1和/或2中鉴定的基因或基因片段编码的蛋白质或肽的部分或全部免疫特异性结合。在优选的实施方案中，抗体固定在固体支持物上。在特别优选的实施方案中，它们(如上文对寡核苷酸探针的描述)以阵列形式固定，最优选小型阵列或微阵列，并可包含除表1和表2中鉴定的基因或基因片段之外被OA改变的蛋白质的整个阵列。 

本发明的另一实施方案涉及用本文描述的任何方法鉴定对在OA中差异表达的基因表达谱具有影响的物质或化合物。优选的，这样的物质在治疗和/或预防OA中会有效。 

本发明的另一方面还表征了用于本文所述一个或多个测定的测试试剂盒。一种试剂盒包含一对或多对用于扩增对应本文所述OA相关基因和基因片段的核酸的引物。该试剂盒还可包含来自不同生理状态组织、用于作为对照的总mRNA样品。该试剂盒还可包含缓冲液、核苷酸碱基和将用于杂交和/或扩增反应的其他组合物。每种溶液或组合物可装在管或瓶中，且所有的管和瓶紧紧限制在盒中用于商业销售。 

另一种类型的试剂盒包含一个或多个核酸或蛋白质结合探针，其中核酸探针与根据本发明某些方面的OA相关基因或基因片段特异杂交，或蛋白质结合探针与OA相关基因或基因片段编码的蛋白质特异结合。优选的，蛋白质结合探针为对OA相关基因或基因片段编码蛋白质免疫特异的抗体。在优选的实施方案中，核酸或蛋白质结合探针固定在固体支持物上。在特别优选的实施方案中，该试剂盒包含固定的核酸或蛋白质结合探针阵列，该阵列包含对本文描述的大量OA相关基因或基因片段或其编码的蛋白质特异的探针。这些试剂盒还可包含来自已知生理状态组织的mRNA或蛋白质适当对照样品，在测定中将用作对照。它们可还包含用于进行测定的缓冲液和试剂。试剂盒中的每种溶液、试剂或组合物可装在管或瓶中，且所有的管和瓶紧紧限制在盒中用于商业销售。优选的，试剂盒还可包含指导进行基因表达测定的说明书。 

另一方面，本发明提供用于通过向细胞中引入关于OA相关基因的基因表达谱变化来改变细胞生物学模式的方法。该方法涉及向细胞施用有效量的化合物，该化合物改变具有选自SEQ ID NO：1-1558核酸序列的一个或多个基因的表达。在一些实施方案中，该化合物影响具有选自SEQ IDNO：1-396核酸序列的一个或多个基因的表达。在一些实施方案中，该化合物影响具有选自SEQ ID NO：1-217核酸序列的一个或多个基因的表达。在其他实施方案中，该化合物影响具有表6所示基因产物的一个或多个基 因的表达。本发明还提供影响OA相关基因表达的方法，包括将细胞暴露于有效数量的调节具有选自SEQ ID NO：1-1558核酸序列的一个或多个基因的表达的化合物中。在一些实施方案中，该化合物影响具有选自SEQ IDNO：1-396核酸序列的一个或多个基因的表达。在一些实施方案中，该化合物影响具有选自SEQ ID NO：1-217核酸序列的一个或多个基因的表达。在其他实施方案中，该化合物影响具有表6所示基因产物的一个或多个基因的表达。 

在一些实施方案中，细胞为与骨关节炎症状相关的细胞。在一些实施方案中，细胞为软骨细胞。在一些实施方案中，化合物体外施用于细胞。在其它实施方案中，化合物体内施用于细胞。该化合物可通过任何给药途径施用于受试者。优选的，受试者为脊椎动物。更优选的，受试者为哺乳动物，包括狗、猫和人。 

基因表达变化优选至少1.01倍差异。更优选其为至少1.05、1.10、1.25、1.50、1.75、2.0、2.25、2.50、2.75、3.0、3.25、3.50、3.75、4.0倍差异或更多。 

硫酸软骨素显示对如表7-12中详细展示的大量OA相关基因有影响。葡糖胺也发现对如表13-18中详细展示的大量OA相关基因具有影响。1α，25-二羟维生素D3和24R，25-二羟维生素D3也影响如表19-20中所示的OA相关基因的表达。二十碳五烯酸(EPA)和花生四烯酸(AA)也显示影响如表21-23所示的OA相关基因。 

提供下述实施例用于更详细描述本发明。它们旨在说明而非限制本发明。 

实施例1 

从软骨细胞中提取RNA 

获得正常和骨关节炎犬软骨软骨细胞(N₂-快速冷冻)并保存在-80℃。骨关节炎软骨细胞来自临床诊断遭受全髋关节置换骨关节炎的犬。300到500mg置于N₂(研钵和研杵)中并转移至干净的预冷50mL管中。加入Trizol(2ml/100mg)并使用Polytron2x30秒和1分钟(高速)将混合物均一化。然后将匀浆在10000xg4℃离心10分钟。取出上清液并向上清液 中添加0.2体积的氯仿，振荡，并在10000xg4℃离心15分钟。取出上层水相并向上层水相中添加5倍体积的4M硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠、0.5％肌氨酰、0.1Mβ-巯基乙醇和.475体积100％乙醇。然后将溶液置于Qiagen RNAqueous微型柱(cat#74104)中，使用多头抽真空装置(依照制造商说明)进一步纯化RNA。然后用乙醇沉淀纯化的RNA以浓缩，在DEPC水中重悬并用DNA酶I处理以去除残余的DNA。使用来自Ambion(cat#1906)的DNA-free^TM DNAse Treatment试剂盒根据制造商说明进行DNA酶I处理。 

在Beckman DU640B分光光度计中于260nm处定量RNA(BeckmanCoulter，Inc.，4300N.Harbor Boulevard，P.O.Box3100，Fullerton.CA92834-3100)。260nm处吸光度1等于40μgRNA/ml。一般的产量为0.65到0.8μg/μl。RNA质量用260nm/280nm吸光度确定，通常比值为1.7-2.0。还通过在1％琼脂糖凝胶/甲醛/Tris-硼酸-EDTA(TBE)，pH7.8缓冲液(90mM Tris、90mM硼酸、2mM EDTA)中电泳评估质量。与15μl凝胶上样溶液(10mM Tris pH7.5，1mM EDTA，0.02％溴酚蓝，10％甘油)混合后，上样约1到3.5μgRNA(2到5μl)。凝胶在50伏电泳3-4小时，用1∶10000稀释的SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.，PO Box22010，Eugene，OR97402-0469，4849 Pitchford Ave.，Eugene，OR97402-9165)在黑暗中染色30分钟，并用Hitachi FMBIO II Fluorescent扫描仪(HitachiGenetic Systems，1201Harbor Bay Parkway Ste.150，Alameda，CA 94502)在505nm处扫描。 

实施例2 

差异显示 

使用三个锚定引物之一和80个随机引物(GenHunter)之一的组合进行荧光差异显示。总计进行240个PCR反应。反应用PAGE分离并使用荧光扫描仪(EMBIOII，Hitachi)成像。代表差异表达基因的条带被切下、再扩增并在琼脂糖凝胶上电泳以验证大小。随后将其亚克隆(PCR-TRAP，GenHunter)并测序。 

使用GenHunter’s RNAimage试剂盒或RNAspectra^TM绿色荧光mRNA差异显示体系(GenHunter Corporation，624Grassmere Park Drive，Suite17，Nashville，TN37211)进行差异显示。在如下反应中反转录约200ng RNA(终浓度)：RT缓冲液(25mM Tris-Cl，pH8.3，37.6mM KCl，1.5mM MgCl₂，5mM DTT)、625μMea.dNTP、50pmol H-T₁₁G引物(GenHunter)(5’AAGCTTTTTTTTTTTG3′)(SEQ NO：1559)或H-T₁₁C引物(GenHunter)(5′AAGCTTTTTTTTTTTC3′)(SEQ NO：1560)或H-T₁₁A引物(GenHunter)(5′AAGCTTTTTTTTTTTA3′)(SEQ ID NO：1561)，总体积19μl。热循环仪(GeneAmp PCR System9700，PE Applied Biosystems，850Lincoln Center Dr.，Foster CA 94404)中37℃十分钟步骤中添加1μl(100单位/μl)MMLV反转录酶，然后进行如下反应：65℃5分钟，37℃60分钟，75℃5分钟随后保持在4℃。2μl反转录反应用于下面的聚合酶链式反应中：PCR缓冲液(10mM Tris-Cl，pH8.4，50mM KCl，1.5mMMgCl₂，0.001％明胶)，50μM各种dNTP，5pmol荧光素标记的H-T₁₁G引物(GenHunter)(荧光素标记引物，5’AAGCTTTTTTTTTTTG3′)(SEQNO：1562)，或荧光素标记的H-T₁₁C引物(GenHunter)(荧光素标记引物，5′AAGCTTTTTTTTTTTC3′)(SEQ NO：1563)，或荧光素标记的H-T₁₁A引物(GenHunter)(荧光素标记引物，5′AAGCTTTTTTTTTTTA3′)(SEQ IDNO：1564)，试剂盒中以200pM提供H-AP引物之一，1单位Amplitaq DNA聚合酶(PE Applied Biosystems，850 Lincoln Center Dr.，Foster CA 94404)，总体积20μl。 

使用下面的热循环仪反应：40个循环的94℃15秒、40℃2分钟、72℃30秒，然后是72℃5分钟和4℃保持。 

5μl各PCR样品与5μl葡聚糖蓝上样缓冲液和10μl去离子甲酰胺混和并在6％聚丙烯酰胺凝胶上在TBE缓冲液中于55瓦特电泳3小时。使用Hitachi FMBIO II在505 nm处扫描凝胶。用剃刀切下差异表达的cDNA条带，置于1.5ml管中，在100μl无菌水中浸泡10分钟然后煮沸15分钟。将管在10000xg离心2分钟并将上清液移至新管。向上清液中加入10μl 3M乙酸钠、5μl糖原(10mg/ml)和450μl 100％乙醇并将管置于-80℃过夜。样品在10000xg4℃离心10分钟并取出上清液。cDNA沉淀用冷的(-20℃)85％乙醇洗涤，如上离心1分钟并取出上清液。cDNA沉淀重悬在10μl无菌水中。 

4μlcDNA提取物样品用与上文PCR相同的反应扩增，不同的是：40μl总反应体积；20μMea.dNTP；200pM未标记引物H-T₁₁G、H-Y₁₁C或H-T₁₁A(GenHunter)或2单位Amplitaq DNA聚合酶(PE AppliedBiosystems)。PCR条件与上文相同。15μl扩增的cDNA提取物与3μl6x上样染料(0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯苯胺FF，30％甘油)混和并在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。凝胶在TBE缓冲液中以100伏特电泳2到3小时，如上染色/成像。用剃刀切取条带并根据Qiagen′sQIAEx

IIGel ExtractionKit(Qiagen，Inc.，28159Avenue Stanford，Valencia，CA91355)提取cDNA。向每个1.5ml管中的凝胶切片中加入300μlQX1缓冲液和10μlQIAEX

II重悬液并在50℃孵育10分钟。孵育过程中每2分钟振荡管。在10000xg将管离心30秒并弃去上清液。沉淀用500μlQX1缓冲液洗涤一次并用500μlPE缓冲液洗涤两次(每次洗涤如上振荡并离心)。沉淀在空气中干燥10分钟并加入20μl无菌水。管在室温孵育5分钟并如上离心30秒将cDNA洗脱。然后将上清液转移至新的1.5ml管中并保存在-20℃。 

扩增的凝胶纯化cDNA根据GenHunter′sPCR-TRAPCloningSystem Kit(GenHunter Corporation，624Grassmere Park Drive，Suite 17，Nashville，TN37211)亚克隆。5μl扩增的凝胶纯化cDNA加入300ngPCR-TRAP载体、连接酶缓冲液(50mM Tris-Cl，pH7.8，10mM MgCl₂，10mM DTT，10mM ATP，5μgBSA)和200单位T4 DNA连接酶中，混和，并在16℃孵育过夜。通过混和10μl连接产物与冰上1.5ml管中的100μlGH感受态细胞，用连接反应产物转化GH感受态细胞(大肠杆菌del(lac-pro)ara thi(80dlacZdelM15))。管在冰上孵育45分钟，42℃热激2分钟，然后在冰上孵育2分钟。向每管中加入400μlLB液体培养基(Luria-Bertani，Difco)并将管在37℃摇动(250rpm)孵育1小时。200μl转 化产物涂布在LB-琼脂-tet平板(LB-agar，Difco，20μg/ml四环素)上并在37℃孵育过夜。 

使用GenHunter′s菌落溶菌产物PCR方案检测菌落的插入。用干净的吸管端挑选菌落并置于microfuge管中的50μl菌落溶菌缓冲液(GenHunter，含0.1％Tween20的TE)中。将管煮沸10分钟，在10000xg离心2分钟并将相应的溶菌液(上清液)转移至新的microfuge管中。2.0μl溶菌液加入PCR缓冲液、20μM ea.dNTP、200pmol ea.Lgh(5′CGACAACACCGATAATC)(SEQ NO：1565)和Rgh(5′GACGCGAACGAAGCAAC)(SEQ ID NO：1566)引物和1单位AmplitaqDNA聚合酶(PE Applied Biosystems)，总体积20μl。使用下面的热循环仪反应：30个循环的94℃30秒、52℃40秒和72℃1分钟，然后72℃5分钟和4℃保持。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中与上文相同分析。 

用适当的菌落接种3-5mlLB液体培养基并在37℃250rpm下孵育过夜。根据Qiagen′s QIAprep Plasmid方案分离质粒。使用2×1.5ml接种的液体培养基沉淀(10000xg，30秒)细菌并去除上清液。沉淀的细菌重悬在250μlP1缓冲液中，然后加入250μlP2缓冲液并温和翻转以混和管。上清液加入QIAprep柱中并离心30秒。弃除离出液，向柱中加入0.5ml PB缓冲液并将管离心30秒。用0.75ml PE缓冲液洗涤柱并离心30秒。弃去离出液并将管再离心1分钟。通过向柱中加入50μl无菌水从柱上洗脱DNA。柱在室温孵育1分钟然后离心1分钟。如上定量得到的含有质粒DNA的上清液(260nm处吸光度1等于50μg/ml)，通常产量为350μg/ml且260nm/280nm为1.8。 

测序反应在ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit(PE Applied Biosystems，850 Lincoln Center Dr.，Foster CA94404)中使用200到500ng质粒DNA。向质粒DNA中加入0.8μl引物(Lgh或Rgh均为0.16um终浓度，GenHunter)以及0.4μl Terminator ReactionMix(含有AmpliTaq DNA Polymerase、FS、脱氧核苷三磷酸、MgCl₂、Tris-HCL缓冲液(pH 9.0)、二氯标记的A-Dye Terminator(R6G)、二氯标 记的C-Dye Terminator(ROX)、二氯标记的G-Dye Terminator(R110)和二氯标记的T-Dye Terminator(TAMRA))并用无菌水补至总体积10μl。使用下面的热循环仪反应：25个循环的96℃10秒、50℃5秒和60℃4分钟，然后4℃保持。 

未结合的染料终止子根据Qiagen’s DyeEx离心方案从测序反应中去除。制备好的DyeEx离心柱置于2.0mlmicrofuge管中并在750xg离心3分钟。柱置于新管中，向柱中加入测序反应物并如上离心3分钟。洗脱液置于74℃直至干燥。 

向每个干燥的测序沉淀中加入5μl甲酰胺/葡聚糖蓝(5∶1比例)。然后向Perkin Elmer ABI Prism 377自动DNA测序仪中的5％聚丙烯酰胺凝胶(TBE缓冲液中)中加入1.5到2.0μl。 

每个分离的质粒克隆测序2-6次(2-6个不同的测序反应，每个引物Lgh或Rgh1-3次)。来自ABI377测序仪的序列文件转移到GeneticComputer Group′s Wisconsin Package并确定相应的共有序列。 

使用差异显示分离出约1750个克隆。所有显示差异表达的基因都被选择。代表性的聚丙烯酰胺凝胶图像在图1中展示。A栏代表条带切除前的凝胶而B栏代表条带切除后的同一凝胶。克隆大小从90bp到1150bp，平均大小为300bp。滤去序列中的冗余序列、二聚体、大肠杆菌片段、小于100bp的片段等，留下1558个。获得的序列(SEQ ID NO：1-1558)在表1中展示，其附带在本文中并成为本说明书的一部分。 

获得的序列与人、小鼠和犬公开的结构域基因组BLAST，以获得初步hit。作为这一步的hit，匹配必须占据大于50％的序列且Expect值(E值)小于0.02。初步hit用于使用各自基因组扩展序列。序列在hit的5，或3’侧各扩展2kb。然后使用扩展的序列在公开的结构域蛋白质数据库中BLAST(Ensembl，swissprot/trembl)。将各自的hit(该情况下具有小于0.02Expect值的那些)合并并用于注解。在一些情况下，该策略不给出hit，且在这些情况下直接用原始序列与swissprot/trembl或Ensembl蛋白质BLAST。在这种情况下，当Expect值小于0.002时被认为是hit。 

通过差异显示分离的序列的BLAST分析结果(如1/28/04)在表2中展示，其附带在本文中并成为本说明书的一部分。序列按照本发明者本文使用的基因ID命名(克隆编号)列在最左侧列中。许多基因与先前鉴定基因的描述吻合；描述列也包括来源数据库和相应的数据库登录号。表2包括来自大量数据库的附加信息，包括Ensemble Gene IDs，EnsembleTranscript IDs，Swissprot/Ensemble，OMIM(Online MendelianInheritance in Man)，RefSeq，Pfam，InterPro和HUGO。还展示许多序列的关于染色体编号(#)和染色体定位的信息。另外，标记“信号肽”的列指出其中氨基酸序列中存在预测的信号肽序列；标记为“TMHMM”(Transmembrane Hidden Markov Model)的列指出其中蛋白质序列存在预测的跨膜区域序列。 

表6列出证明与先前鉴定的基因同源的克隆。 

表6 

[0194] 

[0195] 

[0196] 

[0197] 

[0198] 

[0199] 

[0200] 

[0201] 

[0202] 

[0203] 

[0204] 

[0205] 

[0206] 

[0207] 

[0208] 

[0209] 

[0210] 

实施例3 

微阵列的制备 

通过PCR扩增从差异显示中分离的克隆产生微阵列探针。探针使用GMS417(Affymetrix)阵列仪以两份重复点至聚L赖氨酸包被的载玻片上。从临床诊断遭受全髋关节置换的的犬股骨头获得骨关节炎软骨样品。使用HC ExpressArray(Digene)试剂盒将RNA杂交至载玻片上，并使用GMS418(Affymetrix)扫描仪成像。使用Imagene(Biodiscovery)程序寻点并使用GeneSight(Biodiscovery)进行随后的数据分析。表达水平在背景消除、log(底数为2)转化和总体载玻片信号标准化之后表述。 

微阵列克隆制备 

向含有1.5mL添加了四环素(50mg/mL)的Magnificent Broth的培养物块中接种来自甘油保存菌株的适当克隆并在37℃下摇动培养过夜。这些培养物用于接种另一在37℃下摇动培养约6小时的培养物块。这些6小时培养物用于接种两个在37℃摇动培养过夜的复制培养物块。将培养物离心以收集细胞并使用Qiagen96孔培养体系(Qiagen)分离质粒。使用分光光度计通过测量260nm处吸光度确定质粒浓度。所有的cDNA质粒克隆 使用如下的PCR反应(终浓度)扩增两份：10XPCR缓冲液(l0mM Tris-HClpH8.3，50mM KCl，2.5mM MgCl₂)、500ea.dNTP、600nM Rgh引物、600nM Lgh引物、1μL(5单位/μL)Eppendorf Taq聚合酶和1μL cDNA模板(～100ng/μL)，100μl总体积。反应在如下条件进行：94℃30秒、52℃40秒、72℃1分钟进行40个循环，随后72℃5分钟及4℃保持。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上确认并使用Minelute(Qiagen)方案纯化。将200μL PCR产物加至滤板并打开真空泵以吸走所有的PCR试剂和液体，只剩结合在滤器上的cDNA。向滤板上添加30μL分子等级的水并在室温轨道摇床上以900rpm孵育5分钟。从滤板上吸走含有纯化的cDNA的上清液。将cDNA干燥2小时或在45℃的真空离心蒸发浓缩器中完成。向所有cDNA中加入30μL Corning Universal Printing Buffer并在轨道摇床上室温下过夜重悬。转移2μL用于浓度分析并添加适量Corning UniversalPrinting Buffer使终浓度为200到500ng/μL。板保存在-20℃直到每次印制阵列和每次印制阵列后。 

克隆列阵 

显微镜载玻片(Goldseal cat#3010)泡在10％NaOH(Fishercat#S318-500)57％EtOH溶液中并在室温50rpm的轨道摇床上孵育2小时。在Milli-Q水中洗涤5次，每次30秒。当载玻片留在最后一次水洗涤中时，使用Milli-Q水在塑料容器中使10％聚L赖氨酸(Sigma cat#P8920)，10％1X PBS(GibcoBRL cat#70013-032)到达700mL。载玻片泡在包被溶液中并在室温下在50rpm轨道摇床上孵育1小时。载玻片在Milli-Q水中洗涤5次(每次30秒)并在500rpm离心1分钟。载玻片在55℃烘箱中孵育10分钟并在列阵前保持干燥至少14天但不超过3个月。使用GMS 417阵列仪(Affymetrix)将cDNA克隆列阵。所有的载玻片都放在室温干燥器中干燥过夜。载玻片在沸腾的Milli-Q水(蒸汽)中重新水合并使DNA面向上在80℃加热块上快速干燥。为了确保有效交联，载玻片在80℃烘箱中烘烤2小时然后用Stratalinker(120mJ，Stratagene)交联。所有载玻片保存在室温干燥器内直至用于cDNA杂交。 

cDNA微阵列杂交 

所有的RNA样品使用如下反应反转录：5X Superscript II First StrandBuffer(Invitrogen)、1μL(1pmole/μL)RT引物(Genisphere)、1μLSuperase-In^TM Rnase抑制剂，1μL 10mM ea.dNTP、2μL 0.1MDTT、1μL Superscript II和5μg总RNA。反应在42℃下进行2小时。通过添加3.5μL 0.5M NaOH/50mM EDTA并在65℃孵育10分钟终止反应。通过添加5μL 1M Tris-HCL(pH7.5)中和反应。添加101.5μL 10mM Tris(pH8)1mM EDTA，并通过Microcon YM-30(Millipore)方案纯化和浓缩cDNA。用不含核酸酶的水使浓缩的cDNA达到10μL的终体积，并添加如下试剂：20μL 2X杂交缓冲液(Genisphere)，2μL dT LNA封闭液和8uL不含核酸酶的水至总共40μL。杂交混合物在80℃加热10分钟并在lifterslip边缘装在微阵列载玻片上。然后将载玻片置于GeneMachines双重杂交炉中并置于60℃水浴过夜。第二天根据3DNA Array 350(Genisphere)方案加工载玻片。简言之，载玻片被洗涤(2XSSC-.2％ SDS，2X SSC，.2X SSC)、在1000rpm下旋转干燥1分钟并进行3DNA捕获杂交。载玻片被洗涤(2XSSC-.2％ SDS，2X SSC，.2X SSC)、在1000rpm下旋转干燥1分钟并使用GMS418阵列扫描仪(Affymetrix)扫描。 

微阵列分析 

描述与特异克隆结合的RNA转录物的扫描图片使用Imagene分析软件(BioDiscovery)定量并验证点质量控制。定量的图片使用Genesight分析软件(BioDiscovery)分析。该分析代表了点周围背景的去除、重复点的平均、删除描绘克隆杂交信号不大于所有样品背景之上200的克隆信息、log(以2为底)转化和每个载玻片的总体标准化(数值表示为平均点强度百分比)。 

实施例4 

使用微阵列的表达分析 

从如上所述软骨中提取RNA。对来自临床诊断遭受全髋关节置换的犬的8个骨关节炎软骨样品和8个正常软骨样品进行微阵列分析。为软骨样 品的骨关节炎特征对最终杂交信号进行标准T检验(两种策略，p＜0.05和p＜0.01，结果分别在表3和表4中显示)。 

表3 

[0227] 

[0228] 

[0229] 

[0230] 

[0231] 

[0232] 

[0233] 

[0234] 

表4

[0236] 

[0237] 

[0238] 

[0239] 

[0240] 

使用差异显示分离基因转录物使得本发明人能够开发富集了骨关节炎相关转录物的微阵列芯片。使用该芯片分析来自有骨关节炎的软骨样品(1)确定差异显示的结果并(2)使能够进一步在分子水平表征犬骨关节炎。通过qPCR(下文讨论的)分析转录物证明了来自微阵列的差异表达分析。 

实施例5 

定量聚合酶链式反应(qPCR) 

使用定量PCR证实RNA转录物的变化。反转录酶反应使用SuperScript^TM II Reverse Transcriptase for RT-PCR(Invitrogen)根据制造商说明进行。向1.5μL 10mM dNTP、1.5μL随机六聚体和0.6μL寡聚dT引物中添加1μg RNA并使得终体积为15μL。使用GeneAmp PCR System9700(Applied Biosystems)将样品在68℃孵育10分钟，然后降至4℃至少1分钟。取出上述反应的一部分(0.25X)作为阴性RT反应(Negative Controlcontaining No Super Script II Reverse Transcriptase)使用。使用相同的Super Script^TM II Reverse Transcriptase试剂盒制备含有3μL 10X RT缓冲液、6μL 25mM MgCl₂、3μL 0.1M DTT和1.5μL RNAse抑制剂的主要混合物。取出一部分(0.25X)并加入0.375μL H₂O作为阴性RT样品。向Master Mix中的剩余部分加入1.125μL Super Script^TM II ReverseTranscriptase用于阳性RT反应。然后使用GeneAmp PCR System 9700将所有反应在42℃孵育1小时，在95℃煮沸5分钟然后降至4℃。然后以1份RT反应物对29份H₂O稀释样品以产生用于实验的cDNA储液。 

引物和5’核酸酶测定探针根据来自使用Primer Express 5TM v1.5(Applied Biosystems Primer Tutorial for Real Time Quantitative PCRPrimer and Probe Design Tutorial)的差异显示选定序列设计。小沟结合探针(ABI Custom Oligo Synthesis Factory)从ABI定购。所有的寡聚物用TE缓冲液pH＝8.0(Ambion)重溶至100μM储备液浓度，然后用TE缓冲液稀释至5μM的工作储备液浓度。TaqManUniversal PCR Master Mix(Applied Biosystems)根据制造商说明用于定量PCR反应。引物浓度各为300μM且探针浓度为200μM(由前期实验确定为最佳)。4μL RT和阴性RT反应用于定量PCR反应。所有的阳性反应以三份进行，阴性对照单份进行。如TaqManUniversal Master Mix(Applied Biosystems，50℃2分钟，90℃10分钟，以及40-50个循环的95℃15秒然后60℃1分钟)中所述以0.5体积使用标准qPCR条件。样品使用ABI Sequence DetectorProgram vl.7a在ABI Prism 7700 Sequence Detector上分析样品。 

所有样品单独与各个引物/探针集一起使用以确定应使用何种标准曲线。使用连续稀释肝RNA或来自测定样品的RNA确定标准曲线。另外，如果样品未落入曲线范围内，有最低C_T(循环阈值)的样品应重新反转录且应使用1∶10的连续稀释作为该引物/探针组的标准曲线。数值标准化至定量PCR确定的G3PDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)水平。从各个最低样品标准化数值计算诱导。误差棒代表平均值的标准误差。 

表5显示用于分析的引物和探针。 

表5 

[0250] 

[0251] 实施例6 

犬OA软骨的qPCR分析 

如上文所述在6个来自临床诊断遭受全髋关节置换的骨关节炎软骨样品和8个正常软骨样品中进行qPCR。结果在图2(A-E)中显示。 

实施例7 

处理的OA样品微阵列分析 

A.体外软骨细胞培养 

在37℃水浴摇床中使用如下酶消化犬软骨过夜：胰蛋白酶(0.25％)25分钟，透明质酸酶(150U/ml)1小时和胶原酶(0.78％)过夜。过滤消化的软骨以获得软骨细胞。Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)+2.4％藻酸盐(低熔点)+细胞从10cc注射器滴入氯化钙中(102mM)以形成“珠”。软骨细胞珠在DMEM/F12+P/S(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)+10％胎牛血清(FBS)中培养。隔日更换培养基。在处理结束时(见下文)，软骨细胞溶解于柠檬酸钠(55mM)和EDTA(30mM)。悬液在1800rpm离心10分钟。用磷酸缓冲液洗涤细胞并在1800rpm再次离心5分钟。向分离的犬软骨细胞沉淀中加入1mL裂解结合溶液(Ambion

 RNAqueous^TM)，充分混匀并保存在-20℃直到可以进行RNA提取。 

B.从细胞培养物中分离RNA 

样品经振荡并用Quiashredder(Qiagen)柱根据制造商说明匀浆。收集匀浆的裂解液并向其中加入等体积的64％乙醇。然后将混合物用于RNAqueous^TM筒式滤器器中，每次700μL，然后在10000rpm离心1分钟。用700μL洗涤溶液#1和500μL洗涤溶液#2/3以每次洗涤10000rpm离心1分钟洗涤筒。离心(10000rpm)1分钟干燥筒式滤器。用30μL等分的95-100℃洗脱溶液通过离心(如上)洗脱RNA三次。得到的RNA用DNase处理并如上所述定量。RNA分离之后，如上所述处理RNA以用于微阵列杂交。 

C.细胞培养物微阵列数据统计学分析 

数据转化为以2为底的对数。使用分位数标准化法将数据标准化。标准化后，计算一致性相互作用。 

使用针对EPA对AA；EPAstim’对AAstim；硫酸软骨素和葡糖胺100μg对对照，100μg对10μg和10μg对对照的成对t检验(α＝0.05)确定差异表达基因。 

首先使用AAstim对AA和EPAstim对EPA的比值随后是针对AAstim/AA和EPAstim/EPA比值的成对t检验(α＝0.05)确定差异表达基因。 

检测对应答处理导致在所有三个样品中相同方向的提高或降低的每个处理对在所有葡糖胺和硫酸软骨素分析中沿着单项趋势的差异表达基因。 

对1，25D3对对照和24，25D3对对照(α＝0.05)使用Welch修饰的两样品t检验确定差异表达基因。 

1.硫酸软骨素处理 

基于硫酸软骨素作为关节营养物的认识，用硫酸软骨素处理软骨细胞。软骨细胞珠用100μg/mL、10μg/mL或0μg/mL(对照)硫酸软骨素(n＝3)在DMEM/F12+P/S+10％FBS中处理1周。隔日更换培养基。一周后，将软骨细胞珠溶解于柠檬酸钠(55mM)和EDTA(30mM)。悬液在1800rpm离心10分钟。用磷酸缓冲液洗涤细胞并在1800rpm再次离心5分钟。向分离的犬软骨细胞沉淀中加入1mL裂解结合溶液(Ambion

 RNAqueous^TM)，充分混匀并保存在-20℃直到可以进行RNA提取。由于与阵列数据其他部分的弱相关性，硫酸软骨素处理中一个样品被去除。这将该分析降低为n＝3。结果在表7-12中显示。 

[0270] 

[0272] 

[0274] 

[0275] 

[0276] 

[0278] 

[0279] 

[0280] 

[0282] 

[0283] 2.葡糖胺处理 

使用葡糖胺处理确定该关节健康营养物对OA相关基因差异表达的影响。软骨细胞珠在DMEM/F12+P/S+10％FBS中用100μg/mL、10μg/mL或0μg/mL(对照)葡糖胺(n＝3)处理1周。隔日更换培养基。一周后将软骨细胞珠溶解在柠檬酸钠(55mM)和EDTA(30mM)中。悬浮液在1800rpm离心10分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞并在1800rpm再离心5分钟。向分离的犬软骨细胞沉淀物中加入1mL裂解结合溶液(Ambion RNAqueous^TM)，充分混合并在可进行RNA分离前保存在-20℃。结果在表13-18中显示。 

[0287] 

[0290] 

[0292] 

[0294] 

3.1α，25-二羟维生素D3(1，25 D3)和24R，25-二羟维生素D3(24，25 D3)处理 

根据已知1，25 D3和24，25D3对前列腺素产生的影响和软骨细胞中对维生素D3代谢产物的差异应答，将其应用于软骨细胞以确定这些化合物对OA相关基因表达的影响。在DMEM/F12+P/S+10％FBS中用10^-7M1，25D3或10^-7M 24，25D3处理软骨细胞珠24小时或无维生素D(添加等量乙醇作为对照)(n＝3)。24小时后将软骨细胞珠溶解在柠檬酸钠(55mM)和EDTA(30mM)中。悬浮液在1800rpm离心10分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞并在1800rpm再离心5分钟。向分离的犬软骨细胞沉淀物中加入1mL裂解结合溶液(Ambion

RNAqueous^TM)，充分混合并在可进行RNA分离前保存在-20℃。结果在表19和20中显示。 

[0298] 

4.二十碳五烯酸(EPA)和花生四烯酸(AA)处理 

根据文献中EPA作为抗炎药的认识，用二十碳五烯酸(EPA)和花生四烯酸(AA)处理软骨细胞。使用AA作为对照以代表一般的西方食谱。在DMEM/HAMS+P/S+10％FBS中用50μM EPA或50μM AA(使用白蛋白作为载体)富集软骨细胞两周。隔日更换培养基。分开每组(n＝3)且一半用受激的单核细胞噬中性粒细胞条件培养基(SMNCM)处理一周，隔日更换培养基。使用NycoPrepTM依照制造商说明从犬全血中分离单核 细胞和噬中性粒细胞来制造SMNCM。单核细胞和噬中性粒细胞用脂多糖(20ng/mL)处理72小时。得到的上清液作为细胞培养实验中的SMNCM(SMNCM组成实验使用培养基的10％)使用。软骨细胞珠溶解在柠檬酸钠(55mM)和EDTA(30mM)中。悬浮液在1800rpm离心10分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞并在1800rpm再次离心5分钟。向分离的犬软骨细胞沉淀物中加入1mL裂解结合溶液(AmbionRNAqueous^TM)，充分混合并在可进行RNA分离前保存在-20℃。由于与数据其他部分的弱相关性，EPA/AA刺激处理中一个样品被去除。这使该分析的降至n＝3。结果在表21-23中显示。 

[0304] 

[0306] 

实验证明多种处理可影响OA相关基因的表达。在一些情况下，对基因表达的影响是统计学显著的(p＜0.05)。在其他情况下，尽管由于表达的变化性不能证明变化是统计学显著的，表达存在仅在一个方向变化的显著趋势(提高的表达或降低的表达)。这种单向变化被认为是生物学相关及显著的。在一些情况下，认为某些基因表达的下调将对OA具有有益的生物学效应。对其他基因，提高的表达将对OA具有有益的生物学效应。本发明允许鉴定与(通过调节已知与例如抗炎过程相关的化合物证明的)有益效应相关的基因。本发明还允许鉴定新的化合物，其基于对本发明所述OA相关基因的基因表达调节而应具有有益效应。 

结果证明可用多种处理影响细胞生物学并可直接影响OA相关基因的基因表达。本发明允许快速并有效地筛选化合物以鉴定动物(特别是人)中的OA候选治疗物和预防剂。 

本文件中引用或描述的每个专利、专利申请、出版物和数据库序列登录号的公开内容在本文整体引用作为参考。 

除本文所述之外，根据上述描述，本领域技术人员会明白本发明的多种修饰。这样的修饰亦旨在包含在附带的权利要求书范围内。 

Claims (18)

1.包含多个多核苷酸分子的组合，其中与非骨关节炎或非前骨关节炎受试者中的表达相比所述多核苷酸分子在骨关节炎受试者或前骨关节炎受试者中差异表达，其中该多个多核苷酸分子包括两个或两个以上选自SEQID NO：1-396的分子，其中该多个多核苷酸分子中的一个是分子SEQ IDNO：217。

2.权利要求1的组合，其中该多个多核苷酸分子包括两个或两个以上选自SEQ ID NO：1-217的分子。

3.用于在样品中检测核酸差异表达的方法，包括步骤：

(a)将至少一个选自SEQ ID NO：1-396的多核苷酸分子与样品核酸杂交，从而形成一个或多个杂交复合物，其中所述至少一个分子中的一个是SEQ ID NO：217；

(b)检测杂交复合物；并

(c)将杂交复合物与标准的复合物比较，其中标准和样品杂交复合物间的差异表明样品中核酸的差异表达。

4.检测样品中多肽差异表达的方法，包括步骤：

(a)将至少一个蛋白质结合分子与样品多肽反应，从而允许发生特异结合，其中被蛋白质结合分子结合的蛋白质在骨关节炎受试者或前骨关节炎受试者中与在非骨关节炎或非前骨关节炎受试者中相比差异表达，并且由包含任何SEQ ID NO：1-396的至少一个基因表达产生，其中所述至少一个基因中的一个包含SEQ ID NO：217；

(b)检测特异结合；并

(c)将样品中的特异结合与标准的结合比较，其中标准和样品特异结合间的差异表明样品中多肽的差异表达。

5.权利要求3或4的方法，还包括用测试化合物处理样品的步骤，其中与标准的比较表明以测试化合物处理是否改变样品中核酸或多肽的差异表达。

6.物质组合物，其包含用于检测与非骨关节炎或非前骨关节炎受试者相比在骨关节炎或前骨关节炎受试者中差异表达的基因的表达的两个或两个以上探针的集合，其中探针包括：

(a)与SEQ ID NO：1-396中的两个或两个以上基因特异杂交的两个或两个以上核酸分子；或

(b)与由包括选自SEQ ID NO：1-396中的两个或两个以上基因的两个或两个以上核酸分子表达产生的多肽特异结合的两个或两个以上多肽结合剂，

其中所述两个或两个以上基因中的一个为SEQ ID NO：217。

7.权利要求6的组合物，其中基因包括SEQ ID NO：1-396。

8.用于检测多个在骨关节炎中差异表达的基因的表达的设备，其中所述多个基因中的一个包括SEQ ID NO：217的序列，所述设备包括有多个探针被固定在已知位置的基质，其中探针包括：

(a)多个寡核苷酸或多核苷酸，其中每个各与选自SEQ ID NO：1-396的不同序列特异杂交；或

(b)多个多肽结合剂，其中每个各与下列核酸分子表达产生的不同多肽特异结合，所述核酸分子包括选自包含任何SEQ ID NO：1-396的基因的序列。

9.用于测量测试化合物对一个或多个在骨关节炎中差异表达的基因的表达的影响的方法，包括步骤：

a)通过测量含有任何SEQ ID NO：1-396的一个或多个基因在没有测试化合物的标准样品中的转录或翻译产物，测量标准表达；

b)通过测量含有任何SEQ ID NO：1-396的一个或多个基因在有测试化合物的测试样品中的转录或翻译产物，测量测试表达；

c)比较标准表达和测试表达，其中与标准表达相比测试表达中的变化指示测试化合物对与在非骨关节炎条件下相比在骨关节炎中差异表达的基因的表达的影响，

其中所述一个或多个基因中的一个含有SEQ ID NO：217。

10.权利要求9的方法，其中所述测量使用包含多个探针的物质组合物，其中探针包括包含任何SEQ ID NO：1-396的两个或两个以上基因。

11.权利要求9的方法，其中标准和测试样品获得自至少一个哺乳动物受试者。

12.用于测量测试化合物对OA相关基因表达的影响的方法，其中基因为SEQ ID NO：217，该方法包括测量存在或不存在测试化合物时基因表达产生的转录或翻译产物的产生，其中存在测试化合物时转录或翻译产物产生的变化指示测试化合物对该基因表达的影响。

13.权利要求12的方法，其中通过提供包含与OA相关基因的转录调节序列有效连接的报告基因编码序列的DNA构建体并测量存在或不存在测试化合物时报告基因产物的形成来测量基因表达。

14.试剂在制备诊断或预后显示骨关节炎体征的受试者的试剂盒中的用途，其中所述试剂能够测量样品中由包含任何SEQ ID NO：1-396的一个或多个OA相关基因表达产生的转录或翻译产物的产生，其中所述一个或多个基因中的一个包含SEQ ID NO：217；

其中，将样品中转录或翻译产物与标准中的转录或翻译产物比较，其中任何OA相关基因或基因片段表达的差异指示骨关节炎。

15.用于在受试者中检测骨关节炎存在或易患骨关节炎体质的试剂盒，其包含一个或多个具有如下序列中至少约10个连续核苷酸的寡核苷酸，其中所述序列选自与包含任何SEQ ID NO：1-396的一个或一个以上基因杂交的序列，其中所述一个或一个以上基因中的一个包含SEQ ID NO：217；其中寡核苷酸特异结合与在非骨关节炎或非易患骨关节炎的受试者中的表达相比在骨关节炎受试者或易患骨关节炎受试者中差异表达的核酸。

16.测定在骨关节炎中差异表达的基因的表达的试剂盒，其包含含有一个或多个探针的容器，其中探针包括：

(a)与包含任何SEQ ID NO：1-396的一个或多个基因特异杂交的一个或多个寡核苷酸或多核苷酸；或

(b)与包含任何SEQ ID NO：1-396的一个或多个基因表达产生的多肽特异结合的一个或多个多肽结合剂；

其中所述一个或多个基因中的一个包含SEQ ID NO：217，

以及进行基因表达测定的说明书。

17.用于通过在适当条件下施用有效数量化合物以影响具有选自SEQID NO：1-396的序列的至少一个骨关节炎相关基因的表达而调节细胞中骨关节炎相关基因表达的体外方法，其中所述至少一个骨关节炎相关基因中的一个具有SEQ ID NO：217的序列。

18.权利要求17的方法，其中该至少一个骨关节炎相关基因具有如下定义的基因产物：

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