JP4879756B2 - イヌの骨関節炎と関連する遺伝子並びに関連する方法及び組成物 - Google Patents

Description

本特許出願は、参照により本明細書に完全に組み込まれた２００４年２月２日に出願の米国特許出願６０／５４１３４６の権益を請求する。

本発明は、変性関節疾患、例えば骨関節炎の分野に関する。より詳しくは、本発明は骨関節炎と関連する遺伝子発現に特有のプロファイルに基づく新規組成物、装置及び方法に関する。

通常変性関節疾患とも称される骨関節炎（ＯＡ）は、ヒト及びすべての家畜動物で認められる（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、（１９９７年）Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．２７：８８３〜９１１頁）。ＯＡは、イヌにおいて一般的な消耗性疾患であり、しばしば股関節形成不全に伴う（Ｍａｒｔｉｎｅｚ、Ｓ．（１９９７年）骨関節炎（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎ．Ａｍ．：小動物の実際（Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）２７（４）：７３５〜７５８頁）。イヌとヒトの骨関節炎にはかなりの類似点があり、したがってヒト骨関節炎の研究の優れた動物モデルとなっている。原因因子は大部分未知であるが、この疾患は軟骨基質分解が軟骨基質合成を上回っている不均衡を特徴とする。軟骨細胞アポトーシス及び炎症もこの疾患と関係している可能性がある（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｊ．ら（２００１年）関節炎とリウマチ（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）４４（６）：１２３７〜１２４７頁；Ｌｏｔｚ、Ｍ．（１９９９年）骨関節炎及び軟骨（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ）７：３８９〜３９１頁）。

この疾患は一般的には進行が遅く、またプロテオグリカン及びコラーゲンの損失による関節軟骨の退化、及び新しい骨の増殖を特徴とする。更に、炎症反応が滑膜層内で起こる可能性がある。イヌの骨関節炎は、特に股関節形成不全又は離断性骨軟骨炎から生じる、二次性の病態として引き起こされる可能性がある（Ｍａｒｔｉｎｅｚ、上記）。外傷事象が関係する後天的な病態も、イヌの骨関節炎をもたらす可能性がある（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．２７：７５９〜７７５頁、１９９７年）。骨関節炎の治療法としては、抗炎症薬の投与並びに食事脂肪酸の操作を挙げることができる（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、上記）。

イヌの骨関節炎の診断は、一般的に症候学に基づいて行われる。骨関節炎のイヌは段階的に始まる跛行を示すが、運動後に急に発症することもある。跛行は安静によって悪化するが、２、３分の活動後に減少する。冷たく湿った条件、肥満及び長期にわたる運動は、しばしば跛行の徴候を悪化させる（Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、獣医内科教科書（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第５版、Ｅｔｔｉｎｇｅｒら編、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏ．、フィラデルフィア、２０００年、１８６２〜１８８６頁）。

ゲノム科学の出現で、遺伝子発現の調節が正常なホメオスタシスに緊密に関係するだけでなく、遺伝子の差次的発現の変化が疾患の発達における一側面であることが明瞭になった。その結果、疾患における遺伝子発現パターンの評価は、分子レベルでの疾患過程の理解にとって重要であるとますます認識されるようになった。（Ｇｏｉｎｇら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３５：１８９５〜１９０４頁、１９９９年；Ｗａｎｇら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：４１４〜４２１頁）。相対遺伝子発現を研究するためにいくつかの方法が出現したが、現在重視されているのはハイスループット分析法である（総説については、Ｃａｒｕｌｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．３０／３２：２８６〜２９６頁、１９９８年；Ｋｏｚｉａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：７３〜７８頁、１９９９年を参照）。差次的遺伝子発現のハイスループット分析のために開発された最近の方法としては、例えばＥＳＴシークエンシング（Ａｄａｍｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５１〜１６５６頁、１９９１年；Ａｄａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３７７：３〜１６頁、１９９５年）、マイクロアレイハイブリダイゼーション（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７〜４７０頁、１９９５年）及びディファレンシャルディスプレイ（Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７〜９７０頁、１９９２年；Ｗｅｌｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：４９６５〜４９７０頁、１９９２年）がある。

骨関節炎、特にイヌ骨関節炎における遺伝子発現は、包括的に研究されてきた訳ではない。したがって、骨関節炎で差次的に発現される核酸配列及びそれにコードされたタンパク質を同定する必要が存在する。この情報は、骨関節炎の治療又は予防に有用な物質を同定するだけでなく、対象で変形性関節炎の疾病状態又はその疾患の素因を診断するためにも有用であろう。

本発明の態様に従って、少なくとも遺伝子の断片を含むいくつかのポリヌクレオチドが、骨関節炎及び前骨関節炎ではない対象における発現と比較して、骨関節炎又は前骨関節炎の対象で差次的に発現されることが同定された。

本発明の態様に従って、差次的に発現された遺伝子、遺伝子断片及びコードされた遺伝子産物、並びに遺伝子群と関連する発現パターンは、骨関節炎、特にイヌ骨関節炎と関連する遺伝子発現変化の検出のためのいくつかの方法で利用される。本発明の別の態様は、骨関節炎の治療及び／又は予防に有用な作用物質の同定のための方法に関する。

本発明の他の態様に従って、本発明のある実施形態によって提供される方法の実施を容易にするために、組成物、装置及び試験キットが提供される。

本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び実施例を参考にして理解されよう。

定義：
本発明の理解を容易にするために、以下の定義が提供される。

本明細書で使用される用語「核酸」又は「核酸分子」とは、一本鎖又は二本鎖のいかなるＤＮＡ又はＲＮＡ分子も指し、一本鎖の場合は、その相補配列の分子は直鎖状又は環状である。核酸分子を議論する際に、特定の核酸分子の配列又は構造は、本明細書では５’から３’の方向の配列を提供する通常の慣行に従って記載することができる。本発明の態様に従う核酸に関して、用語「単離核酸」が使用されることもある。ＤＮＡに適用されるとき、この用語は、その起源生物の自然に存在するゲノム内で直接隣接している配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離核酸」は、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターに挿入されたＤＮＡ分子、或いは原核若しくは真核細胞又は宿主生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれたＤＮＡ分子を含むことができる。

ＲＮＡに適用される場合、用語「単離核酸」とは、上で定義された単離ＤＮＡ分子によってコードされたＲＮＡ分子を主に指す。或いは、この用語は、ＲＮＡ分子がその自然の状態で（即ち、細胞又は組織において）結合しているであろう他の核酸から十分に分離されたＲＮＡ分子を指すこともある。単離された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）は更に、生物学的又は合成の手段によって直接産生されて、その産生の間に存在する他の成分から分離された分子を表すこともある。

用語「類似性割合」、「同一性割合」及び「相同性割合」は、特定の配列に言及する場合、ウィスコンシン大学ＧＣＧソフトウェアプログラムで示されているように使用される。

「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド分子」又は「ポリヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチドの鎖を指す。それは一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指すことができ、一本鎖の場合は、その相補配列の分子は直鎖状又は環状である。好ましくは、この鎖は約５０から１０，０００のヌクレオチド、より好ましくは約１５０から３，５００のヌクレオチドを有す。ある場合には、整列させたときに配列は完全に相補性である（ミスマッチはない）。他の場合は、配列内に最大約３０％のミスマッチが存在してもよい。

本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」とは、本発明の配列、プライマー及びプローブを指し、２以上のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、好ましくは３より多くを含む核酸分子と定義される。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、様々な因子、並びにオリゴヌクレオチドの特定の用途及び使用によって決まる。

「断片」とは、長さが好ましくは少なくとも約１０の核酸、より好ましくは約４０の核酸、最も好ましくは約１００の核酸である核酸配列を指し、例としては配列番号１〜１５５８の核酸１〜１００、３００〜４００、５００〜６００、８００〜９００からなる断片、又は配列番号１〜１５５８の３’末端の類似した長さの断片が含まれる。「断片」は、１つ又は複数の欠失、挿入又は置換を含む、一続きの少なくとも約１００の連続するヌクレオチドを意味することもできる。「断片」は遺伝子のコード配列全体を意味することもでき、５’及び３’の非翻訳領域を含んでもよい。「断片」とは、長さが好ましくは少なくとも約５から約１５のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１０のアミノ酸であり、配列の一部の生物活性又は免疫活性を保持するポリペプチド配列を指すこともできる。

用語「遺伝子」又は「複数の遺伝子」とは、遺伝子の部分的又は完全なコード配列を指す。この用語は、転写産物の５’又は３’の非翻訳領域も指す。用語「骨関節炎で差次的に発現される遺伝子」とは、骨関節炎でも前骨関節炎でもない健常対象からの細胞におけるｍＲＮＡ又は翻訳された遺伝子産物の量と比較して、骨関節炎を有する対象からの細胞において又は前骨関節炎の対象において、その遺伝子から発現されるｍＲＮＡの量又はそのｍＲＮＡから翻訳される遺伝子産物の量が検出可能に異なる、即ちより大きいか小さい遺伝子を指す。本明細書で使用される「前骨関節炎」又は「前骨関節炎の」は、対象が後日骨関節炎を発症する素因があるが、骨関節炎のいかなる明らかな徴候及び症状も示していないことを意味するものとする。好ましくは、骨関節炎又は前骨関節炎の試料に由来する差次的に発現される遺伝子の転写産物又は翻訳産物の存在量は、正常試料のそれと比較して少なくとも約１．１５倍、より好ましくは少なくとも約１．２倍、より好ましくは少なくとも約１．３倍、より好ましくは少なくとも約１．４倍、より好ましくは少なくとも約１．５倍、より好ましくは少なくとも約１．６倍、より好ましくは少なくとも約１．７５倍、より好ましくは少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約３倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍異なる。用語「骨関節炎で差次的に発現された遺伝子」とは、正常な転写産物プロファイルでは検出不可能であるが、骨関節炎又は前骨関節炎組織の転写産物プロファイルでは好ましくは１細胞につき少なくとも約２コピー、より好ましくは１細胞につき少なくとも約３コピーのレベルである遺伝子も指す。

用語「骨関節炎（ＯＡ）に関係した」及び「骨関節炎（ＯＡ）関連の遺伝子」とは、本明細書で定義される骨関節炎で差次的に発現される遺伝子を指す。

本明細書で使用される用語「レポーター」、「レポーター系」、「レポーター遺伝子」又は「レポーター遺伝子産物」とは、発現されると生物検定、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は比色法、蛍光発生法、化学発光法又は他の方法などによって容易に測定可能なレポーターシグナルを生じる生成物をコードする遺伝子を核酸が含む、作動可能な遺伝系を指す。核酸は、ＲＮＡでもＤＮＡでもよく、直鎖状でも環状でもよく、一本鎖でも二本鎖でもよく、アンチセンス極性でもセンス極性でもよく、また、レポーター遺伝子産物の発現のために必要な調節エレメントに作動可能に結合されている。必要な調節エレメントはレポーター系の性質によって、またレポーター遺伝子がＤＮＡ又はＲＮＡの形であるかによって異なるが、その例としては、それには限定されないが、プロモーター、エンハンサー、翻訳調節配列、ポリＡ付加シグナル、転写終止シグナルなどがある。

用語「形質転換する」、「トランスフェクトする」、「形質導入する」とは、核酸を細胞又は宿主生物に導入するいかなる方法又は手段も指し、同じ意味を伝えるために同義的に使用することができる。そのような方法には、それには限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＰＥＧ融合などが含まれる。

本明細書で使用される用語「機能的」とは、核酸又はアミノ酸の配列が記載のアッセイ又は目的について機能的であることを意味する。

用語「から本質的に成る」は、特定のヌクレオチド又はアミノ酸に言及する場合、与えられた配列番号の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用する場合、この用語は、配列自体、及びその配列の基本的で新規な特性に影響を及ぼさないであろう分子修飾を含む。

「ベクター」とは、別の遺伝配列又はエレメント（ＤＮＡ又はＲＮＡ）をそれに挿入してその結合した配列又は要素が複製されるようにした、プラスミド、コスミド、バクミド（ｂａｃｍｉｄ）、ファージ、人工染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ）又はウイルスなどのレプリコンである。「レプリコン」とは、主にそれ自身の制御下で複製が可能なプラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、人工染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ）又はウイルスなどの任意の遺伝要素である。レプリコンはＲＮＡかＤＮＡのいずれかであり、一本鎖でも二本鎖でもよい。

本明細書で使用される用語「プローブ」とは、核酸のためのプローブ又はタンパク質のためのプローブを指す。「プローブ」とは、核酸と共に使用する場合、精製された制限酵素消化物のように自然に存在するものであれ合成されたものであれ、そのプローブに相補的な配列を有する核酸とアニーリングするか又は特異的にハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はＲＮＡ若しくはＤＮＡの核酸を指す。プローブは、一本鎖でも二本鎖でもよい。プローブの正確な長さは、温度、プローブの供給源及び使用方法を含めた多くの因子によって決まる。例えば、診断用途のためには、標的配列の複雑度に従い、オリゴヌクレオチドプローブは一般的に約１０〜１００、好ましくは約１５〜５０、より好ましくは約１５〜２５のヌクレオチドを含む。ある診断用途においては、ポリヌクレオチドプローブは、好ましくは約９０〜１１５０のヌクレオチド、より好ましくは約３００〜６００のヌクレオチド、より好ましくは約３００のヌクレオチドを含む。プローブは本明細書では、特定の標的核酸配列の異なる鎖に「実質的に」相補性であるように選択される。このことは、プローブは、１組の所定条件下でそのそれぞれの標的鎖と「特異的にハイブリッド形成する」か又はアニーリングすることができるように、十分に相補性でなければならないことを意味する。したがって、プローブ配列は、標的の正確な相補配列を反映する必要はない。例えば、非相補性のヌクレオチド断片がプローブの５’又は３’末端に結合し、プローブ配列の残りは標的鎖に相補性でよい。或いは、プローブ配列が標的核酸の配列と特異的にアニーリングするために十分な相補性を有するならば、非相補性の塩基又はより長い配列がプローブの中間にあってもよい。「プローブ」とは、タンパク質と共に使用する場合、他のタンパク質又はタンパク質断片を実質的に排除して特定のタンパク質又はタンパク質断片を特異的に結合することができるタンパク質結合物質である。このような結合物質は、タンパク質又はペプチドが特異的に結合するいかなる分子であってもよく、その例としてはＤＮＡ（ＤＮＡ結合タンパクの場合）、抗体（本明細書でより詳細に記載されている）、細胞膜受容体、ペプチド、コファクター、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、オルガネラ及びオルガネラ膜がある。

「アレイ」とは、基質上に整列した少なくとも２つのプローブの配列を指す。プローブの少なくとも１つは対照又は標準を表し、他は診断上の関心のあるプローブを表す。基質上の約２から約４０，０００のプローブの配列は、プローブ及び試料核酸又はタンパク質結合物質の間で形成される各標識複合体のサイズ及びシグナル強度は個々に区別できることを保障する。

「ハイブリダイゼーション複合体」は、例えば５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−３’が３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−５’と塩基対合した場合のように、１つの分子のプリンが相補性分子のピリミジンと水素結合を形成する場合に試料の核酸分子の間で形成される。相補性の程度及びヌクレオチド類似体の使用は、ハイブリダイゼーション反応の効率及びストリンジェンシーに影響を及ぼす。

用語「特異的にハイブリッド形成する」とは、当技術分野で一般的に使用される所定の条件下でそのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補性の（「実質的に相補性の」と言われることもある）配列の２本の一本鎖核酸分子の間の結合を指す。例えば、この用語は核酸プローブと本発明の一態様に従う一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補性の配列とのハイブリダイゼーションを指すことができ、核酸プローブと非相補配列の一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションは実質的に除外される。

「試料」とは、核酸、タンパク質、抗体などを含むその最も広い意味で使用される。試料は、例えば体液；細胞標品の可溶性画分又は細胞を増殖させた培地のアリコート；細胞から単離又は抽出した染色体、オルガネラ又は膜；溶液中の又は基質に結合したゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ；細胞；組織又は組織生検材料；組織プリント；指紋、口内細胞、皮膚又は毛などを含む。

「標準」とは、正常な（ＯＡ関係に対して）生物学的状態の供給源からの材料を含む対照試料を指す。ＯＡ関係の生物学的状態としては、例えば供給源がＯＡを有するもの、ＯＡを起こす素因を有するもの、又はＯＡのある生物学的特性を示すものがある。例えば、標準試料は骨関節炎でも前骨関節炎でもない健常対象からの核酸又はタンパク質を含むことができる。標準試料は、ＯＡのある側面をモデル化することができる免疫反応を導き出すために、治療されていない正常細胞又は組織からの試料を含むことができる。

「特異的結合」とは、２つの分子の間の、その構造、特にその分子側鎖基に依存する特別で厳密な相互作用、例えば、ＤＮＡ分子の主溝への調節タンパク質の挿入、２本の一本鎖核酸の間の骨格に沿った水素結合、又はタンパク質のエピトープと、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体との間の結合を指す。

本明細書で使用される用語「プライマー」とは、ＲＮＡ又はＤＮＡの、一本鎖又は二本鎖の、生物系に由来するか、制限酵素消化によって生成するか、或いは合成的に生成する核酸分子を指し、適当な環境に置かれると鋳型依存性の核酸合成のイニシエーターとして機能的に作用することができる。適当な核酸鋳型、適当なヌクレオシド三リン酸前駆体又は核酸、ポリメラーゼ酵素、適当なコファクター及び適当な温度及びｐＨなどの条件を与えると、プライマーは、ポリメラーゼ作用又は類似した活性によるヌクレオチドの添加によりその３’末端で伸長して、プライマー伸長産物を生成することができる。プライマーは、その用途の特定の条件及び要求事項に従い、長さが異なってもよい。例えば、本発明の特定の実施形態に従う診断用途において、プライマーは、長さが好ましくは約１５〜２５以上のヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドプライマーでよい。プライマーは、所望の伸長産物の合成を誘導するために、即ちポリメラーゼのような酵素による合成の開始で用いるための適当な近位にプライマーの３’ヒドロキシ部分を提供するのに十分な方法で所望の鋳型鎖とアニーリングすることが可能であるように、所望の鋳型と十分な相補性のあるものでなければならない。プライマー配列は所望の鋳型の正確な相補体である必要はない。例えば、非相補性のヌクレオチド配列を、そうではない相補性のプライマーの５’末端に結合させることができる。或いは、プライマー配列が所望の鋳型鎖の配列と、伸長生成物の合成のための鋳型プライマー複合体を機能的に提供するのに十分な相補性を有するならば、非相補性の塩基がオリゴヌクレオチドプライマー配列の中間にあってもよい。

本明細書で記載されるアミノ酸残基は、好ましくは「Ｌ」型の異性体である。しかし、ポリペプチドの所望の特性が保持されるならば、「Ｄ」型異性体の残基でＬアミノ酸残基を置換してもよい。本明細書で表されるすべてのアミノ酸残基配列は、従来の左から右へアミノ末端からカルボキシ末端の方向に従う。

ポリペプチドの「断片」又は「部分」は、少なくとも約５から７つの連続したアミノ酸、しばしば少なくとも約７から９の連続したアミノ酸、典型的には少なくとも約９から１３の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０から３０以上の連続したアミノ酸の一続きのアミノ酸残基を意味する。ポリペプチド配列の断片、抗原決定基群又はエピトープは、タンパク質アミノ酸配列の一部に対して免疫反応を導き出すために有用である。

差次的に発現されたポリペプチドの異なる「変異体」が、自然に存在する。これらの変異体は、タンパク質をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列の差によって特徴付けられる対立遺伝子であり、又は異なるＲＮＡプロセシング又は翻訳後修飾を含むことができる。当業者は、単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、付加又は置換を有する変異体を生産することができる。これらの変異体には、とりわけ以下が含まれる：（ａ）１つ又は複数のアミノ酸残基が保存的又は非保存的なアミノ酸で置換されている変異体、（ｂ）１つ又は複数のアミノ酸がポリペプチドに付加された変異体、（ｃ）１つ又は複数のアミノ酸が置換基を含む変異体、及び（ｄ）ポリペプチドが、そのポリペプチドに有用な特性を付与できる、融合パートナー、タンパク質タグ又は他の化学部分など別のペプチド又はポリペプチド、例えば抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分などと融合している変異体。本発明の他のポリペプチドには、保存的又は非保存的位置で１つの種からのアミノ酸残基が別種の対応する残基に代わって置換されている変異体が含まれてもよい。他の実施形態では、非保存的位置のアミノ酸残基は、保存的又は非保存的な残基で置換されている。これらの変異体を得るための技術は、遺伝子技術（抑制、欠失、変異など）、化学技術、及び酵素技術を含めて、当業者に公知である。そのような対立遺伝子の、変異、類似体、断片、誘導体、及び突然変異体、並びに核酸プロセシングの別の形及び翻訳後修飾の別の形を含めた修飾が、差次的に発現されたポリペプチドの任意の生物的性質を保持する差次的に発現されたポリペプチドの誘導体をもたらす限り、それらは本発明の範囲に含まれる。

用語「単離されたタンパク質」又は「単離され精製されたタンパク質」とは、主に本発明の態様に従う単離核酸分子の発現によって産生されたタンパク質を指す。或いは、この用語は、それが自然に結合しているであろう他のタンパク質から十分に分離されて、「実質的に純粋な」形で存在するタンパク質を指すこともある。「単離された」とは、他の化合物又は物質との人工又は合成の混合物を除外するものでも、或いは基本的な活性を妨げない不純物、及び、例えば不完全な精製、安定剤の添加、又は免疫原性製剤若しくは薬剤として許容される製剤などへの配合に起因して存在する可能性のある不純物の存在を除外するものでもない。

用語「実質的に純粋の」とは、所与の物質（例えば核酸、タンパク質、その他）を少なくとも約５０〜６０重量％含む製剤を指す。より好ましくは、この製剤は与えられた化合物を少なくとも約７５重量％、最も好ましくは約９０〜９５重量％含む。純度は、与えられた物質に適した方法で測定される（例えばクロマトグラフィー法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）。

用語「タグ」、「タグ配列」又は「タンパク質タグ」とは、他の配列に加えると更なる有用性を提供するかその配列の特に検出又は単離において有用な特性を付与する、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又はアミノ酸、ペプチド若しくはタンパク質、又は他の化学物質などの化学部分を指す。したがって、例えば、捕獲オリゴヌクレオチドと相補性のホモポリマー核酸配列又は核酸配列をプライマー又はプローブ配列に加えて、伸長産物又はハイブリダイゼーション生成物の続く単離を容易にすることができる。タンパク質タグの場合、ヒスチジン残基（例えば４から８の連続するヒスチジン残基）をタンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端に付加して、キレート金属クロマトグラフィーによるタンパク質の単離を容易にすることが可能である。或いは、特異的な抗体分子又は他の分子と反応するエピトープ又は結合決定因子（例えばフラグ（ｆｌａｇ）エピトープ、ｃ ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルス赤血球凝集素タンパク質の膜貫通エピトープ、プロテインＡ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、キチン質結合ドメイン、グルタチオンＳ転移酵素など）となるアミノ酸配列、ペプチド、タンパク質又は融合パートナーをタンパク質に付加して、例えばアフィニティー又は免疫アフィニティークロマトグラフィーなどの方法によるタンパク質単離を容易にすることが可能である。化学タグ部分としては、ビオチンなどの分子があり、それらは核酸又はタンパク質に付加することができ、アビジン試薬などとの相互作用による単離又は検出を容易にする。他の多数の標識部分は当分野の熟練者に公知で思いつくものであり、この定義の範囲内であることを企図するものである。

「抗体」又は「抗体分子」とは、特異抗原と結合する抗体及びその断片を含む任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び二重特異性の抗体を含む。本明細書で使用される抗体又は抗体分子は、手つかずの免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性のある部分、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）のような当技術分野で公知の部分を企図する。

本明細書で使用される用語「対象」又は「患者」とは、「対象」又は「患者」が動物又はヒトであると同定されていない限り、ヒト及び動物の両方を指す。動物対象は好ましくは脊椎動物であり、より好ましくは哺乳類である。

「治療法」とは、疾患、病態又は障害を治療及び／又は予防するいかなる手段も指す。

本発明の一態様では、骨関節炎ではない対象と比較して骨関節炎の対象において差次的に発現するいくつかの遺伝子が同定された。これらの遺伝子及び遺伝子断片、並びにそれらのコードされたタンパク質及び断片は、例えば様々な診断及び予防のアッセイ、並びに骨関節炎の治療法における効果について試験物質をスクリーニングする際に有用なアッセイで使用することができる。

本発明のある実施形態においては、少なくとも１つの差次的に発現される遺伝子の発現を測定してもよい。好ましい実施形態において、２つ以上の差次的に発現される遺伝子の発現を測定して、遺伝子発現パターン又は遺伝子発現プロファイルを提供することができる。より好ましくは、差次的に発現される複数の遺伝子の測定を実施して、遺伝子発現パターン又はプロファイルに関する追加情報を提供してもよい。

本発明の様々な実施形態において、遺伝子発現の変化は下記２つの方法の一方又は両方で測定することが可能である：（１）特定の遺伝子によって生じるｍＲＮＡの検出を通して転写を測定すること；（２）特定の転写産物によって生じるタンパク質の検出を通して翻訳を測定すること。

減少又は増加した発現は、当技術分野で公知のポリヌクレオチド定量のための任意の方法、例えばＰＣＲ（それには限定されないがＲＴ−ＰＣＲ及びｑＰＣＲを含む）、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティング及び他のハイブリダイゼーション法を使用して、ＲＮＡレベルで測定することができる。本発明によって分析されるか調べられる遺伝子の形態は、ｍＲＮＡ又は逆転写ｍＲＮＡである。これらの遺伝子は、クローニング及び／又は増幅することができる。クローニング自体は、集団内での遺伝子の表示を偏らせることはないようである。しかし、少ないプロセシング段階で使用することができるので、供与源としてｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを使用することが好ましい可能性がある。

本発明の態様に従い、機能が骨関節炎（ＯＡ）と緊密に関連している１５５８の遺伝子が同定された。この関連性は、正常組織及びＯＡと診断された対象からの組織における遺伝子の発現を比較することによって測定される。このように同定される遺伝子は、２つの広いカテゴリーに分類される。第１のカテゴリーは公知の遺伝子を含み、ＯＡとの関連性の多くはこれまで評価されてこなかった。これらの遺伝子は、その対応する遺伝子ＩＤ番号及び配列番号と一緒に表６にリストされている。

本発明の別の態様に従い、第２のカテゴリーは、以前に同定された配列と相同性を示さない核酸セグメントを含む。したがって、このカテゴリーは、１つ又は複数の新規遺伝子を含むと考えられる。本発明の好ましい一実施形態は、新規ＯＡ関連遺伝子、このＯＡ関連遺伝子から作り出されるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを含む、単離された核酸分子に関する。

本発明の一態様は、骨関節炎及び前骨関節炎ではない対象における発現と比較して、骨関節炎又は前骨関節炎の対象で差次的に発現される１５５８のポリヌクレオチド分子の組合せに関する。本明細書で記載される本発明の一実施形態では、イヌ軟骨からのＯＡ関係の１５５８遺伝子のセグメントが、ディファレンシャルディスプレイを使用することによって得られた。これらのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、本明細書では配列番号１〜１５５８で表されている（表１は、配列番号と遺伝子ＩＤ番号との間の関係を示す）。これらの配列のＢＬＡＳＴ分析からは、以前に同定されたいくつかの核酸配列との相同性が同定された（表２）。これらには、公知の遺伝子との相同性が同定されていない以前に同定されたいくつかの核酸配列が含まれる。ＢＬＡＳＴ分析からは、以前に同定された遺伝子との相同性を示している配列も同定された。これらのホモログそれぞれの遺伝子名並びにデータベースアクセッション番号を含む情報は、表２Ａ及び２Ｂで提供する。

本発明の一実施形態は、配列番号１〜１５５８から選択される２以上のポリヌクレオチド分子又はその断片を含む組合せに関する。好ましくは、この組合せは約１０以上のポリヌクレオチド分子、より好ましくは約５０以上のポリヌクレオチド分子、より好ましくは約２００以上のポリヌクレオチド分子、より好ましくは約４００以上のポリヌクレオチド分子、より好ましくは約１０００以上のポリヌクレオチド分子を含む。

好ましい一実施形態において、本発明は、その配列が配列番号１〜３９６によって表される３９６の差次的に発現されるポリヌクレオチド分子の組合せに関する。表３で、健常対象に対してＯＡ対象で統計学的に有意（ｐ＜０．０５）な程度で差次的に発現されると判定された、臨床試料からの遺伝子配列のリストを同定する。表３は、遺伝子ＩＤ番号、発現値、標準偏差及び発現差の倍率（ＯＡ対正常）を含む。好ましくは、この組合せは配列番号１〜３９６から選択される２つ以上のポリヌクレオチド分子又はその断片を含む。

特に好ましい一実施形態において、本発明は、その配列が配列番号１〜２１７によって表される２１７の差次的に発現されるポリヌクレオチド分子の組合せに関する。表４には、健常対象に対してＯＡ対象で非常に有意（ｐ＜０．０１）な程度で差次的に発現されると判定された、臨床試料からの遺伝子配列のリストを同定する。表４は、遺伝子ＩＤ番号、発現値、標準偏差及び発現差の倍率（ＯＡ対正常）を含む。好ましくは、この組合せは配列番号１〜２１７から選択される２つ以上のポリヌクレオチド分子又はその断片を含む。

本発明の一態様に従い、試料を調べるための１つ又は複数のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのプローブは、１５５８の単離された遺伝子断片（配列番号１〜１５５８）のいずれについても本明細書で記載されている配列情報を使用して調製することができる。本発明の他の態様に従い、プローブは、同定された遺伝子又は遺伝子断片のいずれについても利用できる配列情報を使用して調製することができる。プローブは、適当な相補的遺伝子又は転写産物と特異的に、実質的に排他的にハイブリッド形成するために十分な長さでなければならない。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは長さが少なくとも約１０、１２、１４、１６、１８、２０又は２５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチドのより長いプローブが望ましく、また約１００ヌクレオチドよりも長いプローブが一部の実施形態では適当である。好ましくは、ＯＡで差次的に発現される遺伝子産物の発現を検出するための２つ以上の核酸プローブの集合、より好ましくは約１０以上のプローブの集合、より好ましくは約５０以上のプローブの集合、より好ましくは約２００以上のプローブの集合、より好ましくは約４００以上のプローブの集合、より好ましくは約１０００以上のプローブの集合が提供される。

本発明の好ましい実施形態において、１つ又は複数のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのプローブは、配列番号１〜３９６のいずれについても記載されている配列情報を使用して調製することができる。好ましくは、１つ又は複数のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのプローブは、配列番号１〜２１７のいずれについても記載されている配列情報を使用して調製することができる。

本発明のある好ましい実施形態において、固定化核酸プローブは、核酸分子及びそれらの発現パターンの迅速で特異的な検出のために使用することができる。一般的に、核酸プローブは固体支持体に結合され、標的核酸（例えば、ゲノム核酸、アンプリコン、又は最も一般的には、増幅された混合物）はプローブにハイブリッド形成される。プローブ又は標的、或いはその両方は、一般的に蛍光団又はストレプトアビジンなど他のタグで標識することができる。標的を標識する場合、結合した蛍光を検出することによってハイブリダイゼーションを検出することができる。プローブを標識する場合、一般的に標識の失活によってハイブリダイゼーションを検出する。プローブ及び標的の両方を標識する場合、ハイブリダイゼーションの検出は一般的には、２つの結合した標識の近くから生じる色の変化をモニターすることによって実施する。特に蛍光ベースの応用のための様々な標識戦略、標識などは、当技術分野で公知である。

本発明の他の態様は、配列番号１〜１５５８から選択される配列又はその断片を含む１つ又は複数の核酸分子の発現から生じるポリペプチドと特異的に結合するポリペプチド結合剤を含む１つ又は複数のプローブに関する。本発明の他の態様に従い、タンパク質結合プローブは、表２で同定された遺伝子又は遺伝子断片のいずれについても利用できる配列情報を使用して調製することができる。好ましくは、ＯＡで差次的に発現される遺伝子産物の発現を検出するための２つ以上のポリペプチドプローブの集合、より好ましくは約１０以上のプローブの集合、より好ましくは約５０以上のプローブの集合、より好ましくは約２００以上のプローブの集合、より好ましくは約４００以上のプローブの集合、より好ましくは約１０００以上のプローブの集合が提供される。

本発明の好ましい実施形態において、ポリペプチド結合剤を含むプローブは、配列番号１〜３９６から選択される配列を含む核酸分子から生じるポリペプチドと特異的に結合する。特に好ましい実施形態では、ポリペプチド結合剤を含むプローブは、配列番号１〜２１７から選択される配列を含む核酸分子から生じるポリペプチドと特異的に結合する。

試料中のタンパク質レベルの測定で使用することができるアッセイ技術も、当業者に公知である。そのようなアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、競合結合検定法、ウェスタンブロット分析及びＥＬＩＳＡアッセイがある。抗体を利用するアッセイ方法では、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方が本発明での使用に適当である。当業者ならば理解するように、そのような抗体は特定のタンパク質又はタンパク質のエピトープ又はタンパク質断片に対して免疫学的に特異的であるものとすることができる。タンパク質又はペプチドに対して免疫学的に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作製する方法も、当技術分野で公知である。

本発明の好ましい実施形態では、本明細書で記載されているポリヌクレオチドの発現から生じるタンパク質の検出及び定量のために抗体を利用することができる。タンパク質は免疫沈降反応、アフィニティー分離、ウェスタンブロット分析などによって検出することができるが、好ましい方法では、抗体を体支持体上に固定化し、標的タンパク質又はペプチドを固定化抗体に曝露するＥＬＩＳＡ式の方法が利用される。プローブ又は標的、或いはその両方を標識することができる。様々な標識方法、標識などが当技術分野で公知である。

本発明の特に好ましい実施形態において、骨関節炎で差次的に発現される複数の遺伝子の発現パターン又はプロファイルは、標的核酸又はタンパク質を検出するためのプローブアレイを利用して観察される。一実施形態では、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドプローブのアレイを利用することができるが、他の実施形態では、差次的に発現される遺伝子産物と特異的に結合する抗体又は他のタンパク質のアレイを利用することができる。そのようなアレイは、市販されている（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｉｎｃ．を通して）か、又は公知の方法、例えば固体支持体上のｉｎ−ｓｉｔｕ合成若しくはマイクロプリンティング技術による固体支持体への前合成されたプローブの付着に従って、特別生産することができる。好ましい実施形態において、核酸又はタンパク質結合プローブのアレイは、本明細書で記載されている１５５８の差次的に発現される遺伝子又は遺伝子断片の２つ以上から生じる転写産物又はタンパク質を特異的に検出するように、特別に作製される。本発明の一実施形態において、核酸又はタンパク質結合プローブのアレイは、表２で同定されている遺伝子又は遺伝子断片の２つ以上から生じる転写産物又はタンパク質を特異的に検出するように、特別に作製される。好ましい実施形態において、核酸又はタンパク質結合プローブのアレイは、表３で同定されている３９６の差次的に発現される遺伝子又は遺伝子断片の２つ以上から生じる転写産物又はタンパク質を特異的に検出するように、特別に作製される。好ましい実施形態において、核酸又はタンパク質結合プローブのアレイは、表４で同定されている２１７の差次的に発現される遺伝子又は遺伝子断片の２つ以上から生じる転写産物又はタンパク質を特異的に検出するように、特別に作製される。

好ましくは、ＯＡで差次的に発現される遺伝子産物の発現を検出するための２つ以上の核酸又はポリペプチドのプローブの集合、より好ましくは約１０以上のプローブの集合、より好ましくは約５０以上のプローブの集合、より好ましくは約２００以上のプローブの集合、より好ましくは約４００以上のプローブの集合、より好ましくは約１０００以上のプローブの集合が支持体上の異なる位置に固定化される。

軟骨細胞は、ＯＡの影響を受ける組織である軟骨の細胞成分であるので、軟骨細胞アレイの構築は、骨関節炎の軟骨細胞の遺伝子発現プロファイルを研究するための強力な手段となることができる。ＯＡと関連する転写産物のためのアレイ上で表されるクローンを濃縮するために、転写産物選択のためのディファレンシャルディスプレイの使用が本発明者らによって使用された。

本発明の一態様では、試料中のＯＡ関連の核酸を分析する方法が提供される。好ましくは、配列番号１〜１５５８から選択された、より好ましくは配列番号１〜３９６から選択された、より好ましくは配列番号１〜２１７から選択された１つ又は複数のポリヌクレオチド分子を含む組合せを使用してプローブを調製し、プローブを検査試料の核酸とハイブリッド形成させてハイブリダイゼーション複合体を形成させ、これら複合体を検出して標準のそれらと比較し、試料ハイブリダイゼーション複合体と標準ハイブリダイゼーション複合体との間の差は試料中の核酸の差次的な発現を示す。好ましい一実施形態において、核酸プローブは表２で同定されている遺伝子又は遺伝子断片の１つ又は複数から生じる転写産物又はその断片を特異的に検出するように作製される。ある好ましい実施形態において、試料の核酸はハイブリダイゼーションの前に増幅してもよい。

本発明の他の態様では、試料中のＯＡ関連のポリペプチドを分析する方法が提供される。好ましくは、配列番号１〜１５５８から選択された、より好ましくは配列番号１〜３９６から選択された、より好ましくは配列番号１〜２１７から選択されたポリヌクレオチド配列を使用して、それらのポリペプチド又はその断片の翻訳産物と特異的に結合するタンパク質結合プローブを調製する。これらのプローブを検査試料と反応させて結合複合体を形成させ、これら複合体を検出して標準のそれらと比較し、試料結合複合体と標準結合複合体との間の差は試料中のポリペプチドの差次的な発現を示す。好ましい一実施形態において、タンパク質結合プローブは表２で同定されている遺伝子又は遺伝子断片の１つ又は複数から生じるポリペプチド又はその断片を特異的に検出するように作製される。

本発明のある好ましい実施形態に従い、本明細書で記載されているＯＡ関連の転写産物及び翻訳産物の検出のためのアッセイは、患者で骨関節炎の診断及び／又は予後診断を決定するために有用な方法で使用することができる。本発明の実施形態に従い、典型的診断検査は、ＯＡ関連の遺伝子発現が起こることが予想される患者から細胞又は組織の試料を得ることを含む。そのような細胞又は組織には、それには限定されないが、軟骨組織及び軟骨細胞が含まれる。次に、試料を１）ｍＲＮＡ又はタンパク質の検出による１つ又は複数の選択された遺伝子の発現の増減、又は２）例えば本明細書で記載されている遺伝子又はタンパク質アレイ技術による特定の遺伝子発現プロファイルについて分析する。そのような診断法は、骨関節炎の徴候が患者に存在するかどうかの判定に至るに違いない。

本発明の他の実施形態において、本明細書で記載されている診断法は、患者のＯＡからの回復に関して予後診断情報を提供するために、又は治療法に対する患者の進行度をモニターするために拡張することもできる。これらの状況では、診断検査は患者の回復又は治療経過の間に間隔をおいて実施され、標的遺伝子の発現の変化又は遺伝子発現パターンの特定の変化は、患者の回復又は改善の程度を示す。

本発明の一態様では、骨関節炎の治療様式で有効な物質を同定するためのアッセイが提供される。本発明の一実施形態では、骨関節炎で差次的に発現される遺伝子の発現プロファイルに及ぼす試験物質の影響を測定するための方法が提供され、この方法は、ａ）試験物質の非存在下で、表１及び／又は２で同定した２つ以上の遺伝子又は遺伝子断片に対応している２つ以上の遺伝子の転写産物又は翻訳産物を測定することによって第１の試料から標準発現プロファイルを得るステップと、ｂ）試験物質の存在下で発現される、表１及び／又は２で同定した２つ以上の遺伝子又は遺伝子断片の転写産物又は翻訳産物を測定することによって第２の試料から試験発現プロファイルを得るステップと、ｃ）標準発現プロファイルと試験発現プロファイルとを比較するステップとを含み、標準発現プロファイルと比較しての試験発現プロファイルにおける変化は骨関節炎ではない状態と比較して骨関節炎で差次的に発現される遺伝子の発現プロファイルに及ぼす試験物質の影響を示す。好ましくは、前記２つ以上の遺伝子又は遺伝子断片は表３（配列番号１〜３９６）で同定されている遺伝子又は遺伝子断片の２つ以上に対応する。より好ましくは、前記２つ以上の遺伝子又は遺伝子断片は表４（配列番号１〜２１７）で同定されている遺伝子又は遺伝子断片の２つ以上に対応する。ある好ましい実施形態において、試料は培養細胞から得られる。この場合、標準発現プロファイルは試験物質と接触しなかった細胞から得られるが、試験発現プロファイルは試験物質と接触した細胞から得られる。

試験化合物には、タンパク質、ポリペプチド、核酸、低分子薬剤、ビタミン類、ミネラル、脂肪酸、多糖類、抽出物、栄養補助食品などが含まれる。好ましい一実施形態において、試験化合物は、食品又は他の食事性物質に加えることができるか、又は栄養補助食品として摂取できる栄養素である。本明細書で例示されているように、そのような栄養素としては、それには限定されないが、ω３脂肪酸（例えばエイコサペンタエン酸）及びω６脂肪酸（例えばアラキドン酸）などの脂肪酸、グルコサミン、コンドロイチン硫酸並びにビタミンＤ誘導体、例えば１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及び２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３がある。

本発明の実施形態に従うアッセイの１種は、候補物質の存在下又は非存在下で前記ＯＡ関連の遺伝子の１つによってコードされるタンパク質の活性を測定することを含む。このような活性アッセイは当技術分野において公知である。無細胞系活性アッセイが選択されたタンパク質に利用できる場合は、そのようなアッセイは、試験物質の存在下又は非存在下で単に精製されたタンパク質で実施される。候補物質は、精製されたタンパク質の活性を正に又は負に調節することができるかどうかに基づいて選択される。この種のアッセイは、下記のように例えば組換え細胞系で実施することができる点に注目されたい。そのようなアッセイは、場合によっては例えば無細胞系でも実施することができる。

そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイについては、関心の精製タンパク質の供与源があることが望ましい。上述の遺伝子のタンパク質生成物の１つ又は複数は市販されているか、又は、適当な生物源、例えば培養細胞からかなりの量で精製することが可能である。或いは、このようなタンパク質は、適当な原核生物又は真核生物の発現系での発現により単離された遺伝子又はｃＤＮＡから組換えによって作製し、その後、当技術分野で公知なように精製することができる。

本発明の他の実施形態は、ＯＡ関連の遺伝子の発現又はそれにコードされたタンパク質の活性のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイを含む。これらの実施形態については、本発明の態様に従うＯＡ関連の遺伝子を含む核酸構築物を宿主細胞中に導入する。好ましい一実施形態において、哺乳動物細胞系が利用される。使用を企図する宿主細胞としては、それには限定されないが、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨＥＬＡ及びＣＯＳ、並びに非哺乳類細胞、例えば酵母、細菌及び昆虫細胞がある。コード配列は、利用される特定の宿主細胞に適する適当な調節発現要素と作動可能に連結される。核酸を宿主細胞中に導入する方法は、当技術分野で公知である。そのような方法としては、それには限定されないが、トランスフェクション、形質転換、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション及びリポフェクションがある。組換え細胞を使用して、ＯＡ関連の遺伝子の発現又はそれにコードされたタンパク質の活性を調整する化合物を同定することができる。

遺伝子発現アッセイについては、作動可能にレポーター遺伝子に結合されている選択されたＯＡ関連遺伝子のプロモーターを含む人工構築物を調製することが好ましい。レポーター構築物は、それには限定されないが上述の標準宿主細胞系又は他の適当な細胞、例えば軟骨細胞などの軟骨関係の細胞を含む培養細胞に導入することができる。アッセイは、試験化合物の存在下又は非存在下でレポーター遺伝子の発現をモニターすることによって実施される。候補物質は、遺伝子の発現に正に又は負に影響するそれらの能力に基づいて選択される。

本発明の他の実施形態において、本明細書で記載されているＯＡ関連の遺伝子及び遺伝子断片は、ヒト以外の動物対象のゲノムを操作するために使用することができる。様々な動物のゲノムを操作する方法は、当業者に公知である。そのような方法としては、トランスジェニック動物及び遺伝子ノックアウト動物の作製があるが、これに限定されるものではない。本発明の好ましい実施形態では、表２で同定されている遺伝子又は遺伝子断片を使用して、動物内の対応している内因性遺伝子を破壊又は「ノックアウト」することによりその遺伝子座に関して無発現変異を示す動物を生産するために使用される構築物を調製する。一部の実施形態において、動物は配列番号１〜１５５８から選択される核酸配列を有する１つ又は複数の遺伝子の発現の減少又は完全な消滅を示す。一部の実施形態において、動物は配列番号１〜３９６から選択される核酸配列を有する１つ又は複数の遺伝子の発現の減少又は完全な消滅を示す。一部の実施形態において、動物は配列番号１〜２１７から選択される核酸配列を有する１つ又は複数の遺伝子の発現の減少又は完全な消滅を示す。他の実施形態において、動物は表６で示す１つ又は複数の遺伝子の発現の減少又は完全な消滅を示す。トランスジェニック動物は、好ましくは哺乳類である。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は齧歯動物（例えばマウス及びラット）である。他の実施形態では、動物は、例えば、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、非ヒト霊長目動物、ウサギ及びモルモットである。一部の実施形態において、遺伝子を機能的に崩壊させるために低分子干渉ＲＮＡが使用される。つまり、遺伝子発現は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）又は転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を通して抑制される（例えば、Ｋｅｔｔｉｎｇら（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．１５：２６５４〜２６５９頁を参照）。ｓｉＲＮＡ分子は、相同性ｍＲＮＡ分子を、ｓｉＲＮＡ分子によってモニターされる領域内でｍＲＮＡ分子を切断することによる破壊の標的にすることができる。したがって、表６で示される遺伝子産物のｍＲＮＡのターゲッティング及び切断が可能なｓｉＲＮＡは、これらの遺伝子の１つ又は複数の発現を減少又は消滅させるために使用することができる。他の実施形態では、表１（配列番号１〜１５５８）で示される１つ又は複数の遺伝子のｍＲＮＡのターゲッティング及び切断が可能なｓｉＲＮＡは、これらの遺伝子の１つ又は複数の発現を減少又は消滅させるために使用することができる。

本発明の他の実施形態において、本明細書で記載されているＯＡ関連の遺伝子及び遺伝子断片は、１つ又は複数のＯＡ関連の遺伝子の発現を妨害するために使用することができる分子の設計のために使用される。そのような分子としては、ＲＮＡ干渉プローブ及びアンチセンス分子を挙げることができるが、これに限定されるものではない。

本発明の他の態様では、上記アッセイの実行を容易にする組成物が特徴である。これらの組成物は、本発明のある態様に従う差次的に発現されるＯＡ関係の遺伝子、遺伝子断片及びコードされたタンパク質を検出する際に使用するための、２つ以上のプローブ又はプライマーの集合を含むことができる。一実施形態では、このような組成物は、配列番号１〜１５５８から選択される核酸分子と特異的にハイブリッド形成する２つ以上のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの集合を含むことができる。好ましくは、このような組成物は、配列番号１〜３９６から選択される核酸分子と特異的にハイブリッド形成する２つ以上のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの集合を含むことができる。より好ましくは、このような組成物は、配列番号１〜２１７から選択される核酸分子と特異的にハイブリッド形成する２つ以上のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの集合を含むことができる。好ましくは、このような組成物は、表２で同定されている遺伝子及び遺伝子断片から選択される遺伝子及び／又は遺伝子断片と特異的にハイブリッド形成する２つ以上のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの集合を含むことができる。この集合は、配列を増幅するためのプライマー対を含むことができる。ある好ましい実施形態において、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、より好ましくは定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して実施することができる。好ましい一実施形態において、集合はより多くのプローブ、例えば約１０、５０、２００、４００、１０００以上のプローブを含み、それぞれは配列番号１〜１５５８の配列の１つの一部又は全体と特異的にハイブリッド形成する。好ましい一実施形態において、核酸プローブは固体支持体上で固定化される。特に好ましい実施形態では、それらはアレイフォーマットで、最も好ましくはミニチュア又はマイクロアレイ式に固定化される。そのようなマイクロアレイは当技術分野で公知であり、時には「ＤＮＡチップ」、「マイクロチップ」、「生物学的チップ」及び他の類似の用語で呼ばれ、表１及び２で表されているものに加えてＯＡによって変化した遺伝子又は遺伝子断片のすべてのアレイを含むことができる。

他の実施形態において、これらの組成物は、表１及び２で同定されている遺伝子及び遺伝子断片によってコードされるタンパク質又はタンパク質断片と特異的に結合することが可能な２つ以上のタンパク質結合物質を含む。好ましい一実施形態において、このような結合物質は抗体であり、集合は配列番号１〜１５５８によってコードされる２つ以上のタンパク質又はペプチドをそれぞれ検出するための２つ以上の抗体を含む。好ましくは、これらの組成物は、配列番号１〜３９６の遺伝子及び遺伝子断片によってコードされるタンパク質又はタンパク質断片と特異的に結合することが可能な２つ以上のタンパク質結合物質を含む。より好ましくは、これらの組成物は、配列番号１〜２１７の遺伝子及び遺伝子断片によってコードされるタンパク質又はタンパク質断片と特異的に結合することが可能な２つ以上のタンパク質結合物質を含む。そのような結合物質はタンパク質又はペプチドが特異的に結合するいかなる分子であってもよく、その例としてはＤＮＡ（ＤＮＡ結合タンパクの場合）、抗体、細胞膜受容体、ペプチド、コファクター、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、オルガネラ及びオルガネラ膜がある。好ましい一実施形態において、集合はより多くの抗体、例えば約１０、５０、２００、４００、１０００以上を含み、それぞれは表１及び／又は２で同定されている遺伝子又は遺伝子断片によってコードされるタンパク質又はペプチドの一部又は全体と免疫特異的に結合する。好ましい一実施形態において、抗体は固体支持体上で固定化される。特に好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブについて上述したようにそれらはアレイフォーマットで、最も好ましくはミニチュア又はマイクロアレイ式に固定化され、また、表１及び２で同定されている遺伝子又は遺伝子断片に加えてＯＡによって変化したタンパク質アレイの全体を含むことができる。

本発明の他の実施形態は、本明細書で記載されている方法のいずれかで、ＯＡで差次的に発現される遺伝子の発現プロファイルに影響を及ぼすと同定される物質又は化合物に関する。好ましくは、そのような物質はＯＡの治療及び／又は予防で有効となる。

本発明の他の態様の特徴は、本明細書で記載されるアッセイの１つ又は複数で用いられるテストキットである。キットの１種は、本明細書で記載されているＯＡ関連の遺伝子及び遺伝子断片に対応する核酸を増幅させるための１対又は複数対のプライマーを含む。キットは、様々な生理的状態の組織に由来するｍＲＮＡ全体の試料を、対照として使用するために更に含むことができる。キットは、ハイブリダイゼーション及び／又は増幅反応で使用する緩衝液、ヌクレオチド塩基及び他の組成物を含むこともできる。各溶液又は組成物はバイアル又は瓶に入れることができ、すべてのバイアルは市販用に箱詰めすることができる。

他の種類のキットは１つ又は複数の核酸又はタンパク質結合プローブを含み、核酸プローブは、本発明のある態様に従うＯＡ関連の遺伝子又は遺伝子断片と特異的にハイブリッド形成するか、或いはタンパク質結合プローブは、ＯＡ関連の遺伝子又は遺伝子断片によってコードされるタンパク質と特異的に結合する。好ましくは、タンパク質結合プローブは、ＯＡ関連の遺伝子又は遺伝子断片によってコードされるタンパク質に免疫特異的な抗体である。好ましい実施形態において、核酸又はタンパク質結合プローブは固体支持体上で固定化される。特に好ましい実施形態において、キットは、固定化された核酸又はタンパク質結合プローブのアレイを含み、アレイは、本明細書で記載されている複数のＯＡ関連の遺伝子若しくは遺伝子断片、又はそれらによってコードされるタンパク質に特異的なプローブを含む。これらのキットは、既知の生理状態の組織からのｍＲＮＡ又はタンパク質の適当な対照試料を、アッセイで対照として使用するために含むこともできる。それらは、アッセイを実施するための緩衝液及び試薬を更に含むことができる。キット内の各溶液、試薬又は組成物はバイアル又は瓶に入れることができ、すべてのバイアルは市販のために箱詰めされる。好ましくは、キットは遺伝子発現のアッセイを実施するための説明書を更に含むことができる。

他の態様において、本発明はＯＡに関係する遺伝子に関して細胞の遺伝子発現プロファイルの変化の誘発を通して細胞の生物学的プロファイルを変化させる方法を提供する。この方法は、配列番号１〜１５５８から選択される核酸配列を有する１つ又は複数の遺伝子の発現を変化させる化合物の有効量を細胞に投与することを含む。一部の実施形態において、この化合物は配列番号１〜３９６から選択される核酸配列を有する１つ又は複数の遺伝子の発現に影響を及ぼす。一部の実施形態において、この化合物は配列番号１〜２１７から選択される核酸配列を有する１つ又は複数の遺伝子の発現に影響を及ぼす。他の実施形態において、この化合物は表６で示す遺伝子産物を有する１つ又は複数の遺伝子の発現に影響を及ぼす。本発明は、ＯＡに関係する遺伝子の発現に影響を及ぼすための、配列番号１〜１５５８から選択される配列を有する１つ又は複数の遺伝子の発現を調整する化合物の有効量に細胞を曝露することを含む方法も提供する。一部の実施形態において、この化合物は配列番号１〜３９６から選択される核酸配列を有する１つ又は複数の遺伝子の発現に影響を及ぼす。一部の実施形態において、この化合物は配列番号１〜２１７から選択される核酸配列を有する１つ又は複数の遺伝子の発現に影響を及ぼす。他の実施形態において、この化合物は表６で示す遺伝子産物を有する１つ又は複数の遺伝子の発現に影響を及ぼす。

一部の実施形態において、細胞は、骨関節炎の症状と関連する細胞である。いくつかの実施形態では、これらの細胞は軟骨細胞である。一部の実施形態において、化合物はｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に投与される。一部の実施形態において、化合物はｉｎ ｖｉｖｏで細胞に投与される。化合物は、任意の投与経路を通して対象に投与することができる。好ましくは、対象は脊椎動物である。より好ましくは、対象はイヌ、ネコ及びヒトを含む哺乳動物である。

遺伝子発現における変化は、好ましくは少なくとも１．０１倍の差である。より好ましくは、それは少なくとも１．０５、１．１０、１．２５、１．５０、１．７５、２．０、２．２５、２．５０、２．７５、３．０、３．２５、３．５０、３．７５、４．０倍の差又はそれ以上である。

コンドロイチン硫酸は、表７〜１２で詳細に示すように、多種多様なＯＡ関連の遺伝子に影響を及ぼすことが示された。グルコサミンも、表１３〜１８で詳細に示すように、様々なＯＡ関連の遺伝子に影響を及ぼすことがわかった。表１９〜２０で示すように、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及び２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３も、ＯＡ関係の遺伝子の発現に影響を及ぼした。エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びアラキドン酸（ＡＡ）も、表２１〜２３で示すようにＯＡ関係の遺伝子に影響を及ぼすことが示された。

以下の実施例は、本発明を更に説明するために提供される。それらは本発明の例示が目的であり、それを限定するものではない。

軟骨細胞からのＲＮＡの抽出
正常及び骨関節炎のイヌ軟骨細胞（Ｎ_２瞬間冷凍）を取得して、−８０℃で保存した。骨関節炎の軟骨細胞は、人工股関節全置換術を行った、臨床的に骨関節炎と診断されたイヌに由来した。３００〜５００ｍｇをＮ_２下で磨砕（乳鉢及び乳棒）して、清潔な前冷却された５０ｍｌ管へ移した。トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（２ｍｌ／１００ｍｇ）を加え、混合物はポリトロンを使用して３０秒を２回、次に１分間（高速）均質化した。次にホモジネートを１０，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を取り出し、０．２溶のクロロホルムを上清に加えて攪拌し、１０，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。上の水相を取り出して、５溶の４Ｍチオシアン酸グアニジン、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）、０．１Ｍβ−メルカプトエタノール、及び０．４７５溶の１００％エタノールを上の水相に加えた。次に、ＲＮＡの更なる精製のために、減圧マニホルドを（製造元の使用説明書に従って）使用して溶液をＱｉａｇｅｎ ＲＮＡｑｕｅｏｕｓミニカラム（カタログ＃７４１０４）に加えた。次いで、精製されたＲＮＡをエタノール沈殿させて濃縮物とし、ＤＥＰＣ水で再懸濁させ、ＤＮアーゼＩで処理して残りのＤＮＡを取り出した。製造元の使用説明書に従ってＤＮアーゼＩ処理のためにＡｍｂｉｏｎ（カタログ＃１９０６）からのＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）ＤＮアーゼ処理キットを使用した。

ベックマンＤＵ６４０Ｂ分光光度計を使用して２６０ｎｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、４３００Ｎ．Ｈａｒｂｏｒ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｐ．Ｏ．３１００、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ ９２８３４−３１００）でＲＮＡを定量した。２６０ｎｍの吸光度１は、４０μｇＲＮＡ／ｍｌと等量である。典型的収率は、０．６５〜０．８μｇ／μｌであった。ＲＮＡの質は、２６０ｎｍ／２８０ｎｍでの吸光度で判定し、典型的比率は１．７〜２．０であった。質は、電気泳動法により１％アガロースゲル／ホルムアルデヒド／トリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）、ｐＨ７．８緩衝液（９０ｍＭトリス、９０ｍＭホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ）でも分析した。１５μｌのゲルローディング溶液（１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ブロムフェノールブルー、１０％グリセリン）と混合した後に、約１〜３．５μｇのＲＮＡをロードした（２〜５μｌ）。ゲルで、５０ボルトで３〜４時間泳動させ、１：１０，０００に希釈したＳＹＢＲグリーンＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、ＰＯ Ｂｏｘ ２２０１０、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ ９７４０２−０４６９、４８４９ Ｐｉｔｃｈｆｏｒｄ Ａｖｅ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ ９７４０２−９１６５）により３０分間暗条件下で染色し、日立ＦＭＢＩＯ ＩＩ蛍光スキャナー（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１２０１ Ｈａｒｂｏｒ Ｂａｙ Ｐａｒｋｗａｙ Ｓｔｅ．１５０、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ ９４５０２）を５０５ｎｍで使用してスキャンした。

ディファレンシャルディスプレイ
蛍光ディファレンシャルディスプレイは、３つの固定プライマーの１つを８０の任意のプライマー（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）の１つと組み合わせて使用して実施した。全部で、２４０のＰＣＲ反応を実行した。反応物はＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を使用して分離し、蛍光スキャナー（ＦＭＢＩＯＩＩ、Ｈｉｔａｃｈｉ）を使用して可視化した。差次的に発現された遺伝子を表しているバンドを切り取り、再増幅し、サイズを確認するためにアガロースゲルで泳動させた。これらを、その後サブクローニングして（ＰＣＲ ＴＲＡＰ、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）、配列決定をした。

ディファレンシャルディスプレイは、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒのＲＮＡｉｍａｇｅ（登録商標）キット又はＲＮＡｓｐｅｃｔｒａ（商標）緑蛍光ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイシステム（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、６２４ Ｇｒａｓｓｍｅｒｅ Ｐａｒｋ Ｄｒｉｖｅ、Ｓｕｉｔｅ １７、ナッシュビル、ＴＮ ３７２１１）を使用して実施した。約２００ｎｇのＲＮＡを以下の反応（最終濃度）で逆転写した：ＲＴ緩衝液（２５ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ８．３、３７．６ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭのＤＴＴ）、各６２５μｍのｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＨ−Ｔ_１１Ｇプライマー（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）（５’ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ ３’）（配列番号１５５９）、又はＨ−Ｔ_１１Ｃプライマー（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）（５’ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ ３’）（配列番号１５６０）、又はＨ−Ｔ_１１Ａプライマー（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）（５’ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ ３’）（配列番号１５６１）で総容積が１９μｌ。ＭＭＬＶ逆転写酵素の１μｌ（１００単位／μｌ）を、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．、Ｆｏｓｔｅｒ ＣＡ ９４４０４）の３７℃の段階へ加え１０分間放置し、以下の反応を実施した：６５℃で５分間、３７℃で６０分間、７５℃で５分間、その後４℃を維持。逆転写反応物の２μｌを、以下のポリメラーゼ連鎖反応で使用した：ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ８．４、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．００１％ゼラチン）、各５０μＭのｄＮＴＰ、５ｐｍｏｌのフルオレセイン標識Ｈ−Ｔ_１１Ｇプライマー（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）（フルオレセイン標識プライマー、５’ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ ３’）（配列番号１５６２）、又はフルオレセイン標識Ｈ−Ｔ_１１Ｃプライマー（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）（フルオレセイン標識プライマー、５’ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ ３’）（配列番号１５６３）又はフルオレセイン標識Ｈ−Ｔ_１１Ａプライマー（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）（フルオレセイン標識プライマー、５’ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ ３’）（配列番号１５６４）、キットで２００ｐＭで提供されるＨ−ＡＰプライマーの１つ、Ａｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．、Ｆｏｓｔｅｒ ＣＡ ９４４０４）の１単位、合計２０μｌ。

以下のサーモサイクラー反応を使用した：９４℃で１５秒、４０℃で２分、７２℃で３０秒を４０サイクル、その後７２℃で５分及び４℃を維持。

各ＰＣＲ試料５μｌを５μｌのブルーデキストランローディング緩衝液及び１０μｌの脱イオンホルムアミドと混合し、ＴＢＥ緩衝液中で３時間、６％ポリアクリルアミドゲル上で５５ワットの電気泳動にかけた。Ｈｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ ＩＩを使用してゲルを５０５ｎｍでスキャンした。差次的に発現されたｃＤＮＡバンドはカミソリで切り取り、１．５ｍｌの管に入れ、１００μｌ滅菌水に１０分間浸してから１５分間沸騰させた。管を２分間１０，０００×ｇで遠心分離し、上清を新しい管へ移した。１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、５μｌグリコーゲン（１０ｍｇ／ｍｌ）及び４５０μｌの１００％エタノールを上清に加え、管は−８０℃で一晩置いた。試料を１０，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を除去した。ｃＤＮＡペレットを冷たい（−２０℃）８５％エタノールで洗浄し、１分間上記のように回し、上清を取り出した。ｃＤＮＡペレットを１０μｌ滅菌水で再懸濁させた。

ｃＤＮＡ抽出物の４μｌ試料を、以下の例外を除いて上記のＰＣＲ反応と同じように増幅させた：４０μｌ総反応体積；各２０μＭｄＮＴＰ；２００ｐＭの非標識プライマーＨ−Ｔ_１１Ｇ、Ｈ−Ｔ_１１Ｃ、又はＨ−Ｔ_１１Ａ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）及び２ユニットのＡｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ Ａｌｌｐｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＰＣＲ条件は、上と同じであった。増幅されたｃＤＮＡ抽出物の１５μｌを３μｌの６×ローディング色素（０．２５％ブロムフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノールＦＦ、３０％グリセリン）と混合し、１．５％アガロースゲルで電気泳動にかけた。ゲルは１００ボルトで２〜３時間ＴＢＥ緩衝液で流し、上記と同じように染色／視覚化した。バンドをカミソリで切り取り、ｃＤＮＡをＱｉａｇｅｎのＱＩＡＥＸ（登録商標）ＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、２８１５９ Ａｖｅｎｕｅ Ｓｔａｎｆｏｒｄ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ９１３５５）により抽出した。３００μｌのＱＸ１緩衝液及び１０μｌのＱＩＡＥＸ（登録商標）ＩＩ懸濁液を１．５ｍｌ管内の各ゲル切片に加え、５０℃で１０分間インキュベートした。管を、インキュベートの間２分ごとに攪拌した。管を１０，０００×ｇで３０秒間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを５００μｌの緩衝液ＱＸ１で一度、緩衝液ＰＥで二度洗浄した（各洗浄について上述の攪拌及び遠心分離を行った）。ペレットを１０分間風乾させ、それに２０μｌの滅菌水を加えた。管を５分間室温でインキュベートし、ｃＤＮＡを上述のように遠心分離により３０秒間溶出させた。次いで、上清を新しい１．５ｍｌの管へ移して−２０℃で保存した。

増幅したゲル精製ｃＤＮＡは、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒのＰＣＲ−ＴＲＡＰ（登録商標）クローニングシステムキット（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、６２４ Ｇｒａｓｓｍｅｒｅ Ｐａｒｋ Ｄｒｉｖｅ、Ｓｕｉｔｅ １７、ナッシュビル、ＴＮ ３７２１１）によりサブクローニングした。５μｌの増幅したゲル精製ｃＤＮＡを３００ｎｇのＰＣＲ−ＴＲＡＰ（登録商標）ベクター、リガーゼ緩衝液（５０ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＡＴＰ、５μｇのＢＳＡ）及び２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼに加えて混合し、１６℃で一晩インキュベートした。１０μｌのライゲーション反応物を氷上の１．５ｍｌ管内の１００μｌのＧＨコンピテントセルと混合することによって、ＧＨコンピテントセル（大腸菌ｄｅｌ（ｌａｃ−ｐｒｏ）ａｒａ ｔｈｉ（φ８０ｄｌａｃＺｄｅｌＭ １５））をライゲーション反応で形質転換させた。管は氷上で４５分間インキュベートし、４２℃の熱ショックを２分間加え、次に氷上で２分間インキュベートした。４００μｌのＬＢブロス（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ、ディフコ）を各管に加え、管は振盪（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で１時間インキュベートした。これらの形質転換体の２００μｌをＬＢ−アガー−ｔｅｔプレート（ＬＢ−ａｇａｒ、ディフコ、テトラサイクリン２０μｇ／ｍｌ）上に蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。

コロニーは、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒのコロニー溶解物ＰＣＲプロトコルを使用して、挿入断片について検査した。コロニーを清潔なピペットチップで拾い、微量遠心管内の５０μｌのコロニー溶解物緩衝液（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ、０．１％トゥイーン２０を含むＴＥ）内に入れた。管を１０分間沸騰させ、１０，０００×ｇで２分間遠心分離し、該当する溶解物（上清）を新しい微量遠心管へ移した。溶解物の２．０μｌをＰＣＲ緩衝液、各２０μＭのｄＮＴＰ、各２００ｐｍｏｌのＬｇｈ（５’ＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＧＡＴＡＡＴＣ）（配列番号１５６５）及びＲｇｈ（５’ＧＡＣＧＣＧＡＡＣＧＡＡＧＣＡＡＣ）（配列番号１５６６）プライマー及び１単位のＡｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に加え、総容積は２０μｌであった。以下のサーモサイクラー反応を使用した：１サイクルが９４℃で３０秒間、５２℃で４０秒間及び７２℃で１分間を３０サイクル、その後７２℃で５分間及び４℃で維持。ＰＣＲ生成物を、上と同じように１．５％のアガロースゲルで分析した。

３〜５ｍｌのＬＢブロスに該当するコロニーを接種し、３７℃で一晩、２５０ｒｐｍでインキュベートした。プラスミドは、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｐｒｅｐプラスミドプロトコルに従って単離した。細菌を２×１．５ｍｌの接種ブロスを使用してペレット化し（１０，０００×ｇ、３０秒）、上清を除去した。ペレット化した細菌を２５０μｌの緩衝液Ｐ１内に再懸濁させ、次いで２５０μｌの緩衝液Ｐ２を加え、管を緩やかに転倒させることによって混合した。３５０μｌの緩衝液Ｎ３を加え、管を緩やかに転倒させることによって混合し、次に１０分間遠心分離した。上清をＱＩＡｐｒｅｐカラムに加え、３０秒間遠心分離した。フロースルーを捨て、０．５ｍｌの緩衝液ＰＢをカラムに加え、管を３０秒間遠心分離した。カラムを０．７５ｍｌの緩衝液ＰＥで洗浄して、３０秒間遠心分離した。フロースルーを捨て、管を更に１分間回した。５０μｌ滅菌水をカラムに加えることによって、ＤＮＡをカラムから溶出させた。カラムを室温で１分間インキュベートし、次いで１分間遠心分離した。プラスミドＤＮＡを含む生成上清を上のように定量し（２６０ｎｍでの吸光度１は５０μｇ／ｍｌに相当する）、典型的収率は３５０μｇ／ｍｌ及び２６０ｎｍ／２８０ｎｍの比は１．８であった。

シークエンシング反応では、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．、Ｆｏｓｔｅｒ ＣＡ ９４４０４）で２００〜５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを使用した。０．８μｌのプライマー（０．１６μｍ最終濃度のＬｇｈ又はＲｇｈ、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）を、４．０μｌのＴｅｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ、デオキシヌクレオシド三リン酸、ＭｇＣｌ_２、トリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０、ジクロロ（Ｒ６Ｇ）で標識したＡ−Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、ジクロロ（ＲＯＸ）で標識したＣ−Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、ジクロロ（Ｒ１１０）で標識したＧ−Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ及びジクロロ（ＴＡＭＲＡ）で標識したＴ−Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを含む）と共にプラスミドＤＮＡに加え、滅菌水で１０μｌの最終体積にした。以下のサーモサイクラー反応を使用した：１サイクルが９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間及び６０℃で４分間を２５サイクル、その後４℃で維持。

取り込まれなかったｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを、ＱｉａｇｅｎのＤｙｅＥｘスピンプロトコルに従ってシークエンシング反応から除去した。準備したＤｙｅＥｘスピンカラムを２．０ｍｌの微量遠心管に入れ、７５０×ｇで３分間遠心分離した。カラムを新しい管に入れ、シークエンシング反応体をカラムに加えて上のように３分間遠心分離した。溶出液は乾燥するまで７４℃に置いた。

５μｌのホルムアミド／ブルーデキストラン（５：１比率）を、各乾燥シークエンシングペレットに加えた。次いで１．５μｌから２．０μｌをパーキンエルマーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７自動ＤＮＡシークエンサーにおける５％ポリアクリルアミドゲル（ＴＢＥ緩衝液中）に加えた。

各単離されたプラスミドクローンを２〜６回シークエンシングした（２〜６の異なるシークエンシング反応、各プライマーにつき１〜３回、Ｌｇｈ又はＲｇｈ）。ＡＢＩ ３７７シークエンサーからの配列ファイルをＧｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＧｒｏｕｐのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅへ移し、対応するコンセンサス配列を決定した。

ディファレンシャルディスプレイを使用して約１７５０のクローンを単離した。差次的に発現されるように見えたすべての遺伝子を選択した。代表的なポリアクリルアミドゲル画像を図１で示す。図Ａはバンド切り出し前のゲルを表し、図Ｂはバンド切り出し後の同じゲルを表す。クローンのサイズは９０ｂｐから１１５０ｂｐの範囲であり、平均サイズは３００ｂｐであった。冗長な配列、二量体、大腸菌断片、１００ｂｐ未満の断片その他について配列をフィルターにかけた後に、１５５８が残された。得られた配列（配列番号１〜１５５８）を表１で示すが、それは本明細書に付属しており、本明細書の一部を形成する。

得られた配列を、第１のヒットを得るために、ヒト、マウス及びイヌのパブリックドメインゲノムに対してＢＬＡＳＴ分析した。現段階でヒットとみなされるためには、一致するのが配列の５０％以上でなければならなく、また予想値（Ｅ値）は０．００２未満でなければならない。第１のヒットは、それぞれのゲノムを使用して配列を伸長させるために使用した。配列を、ヒットの５’又は３’側に２ｋｂ伸長させた。伸長させた配列を次に使用して、パブリックドメインタンパク質データベース（Ｅｎｓｅｍｂｌ、ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ｔｒｅｍｂｌ）に対してＢＬＡＳＴ分析した。それぞれのヒット（この場合予想値が０．００２未満のもの）を統合し、注釈のために使用した。場合によってはこの手法でヒットが得られなく、このような状況においては元の配列をｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ｔｒｅｍｂｌ又はＥｎｓｅｍｂｌタンパク質に対して直接ＢＬＡＳＴ分析した。この場合、予想値が０．００２未満の場合ヒットを考慮した。

ディファレンシャルディスプレイによって単離された配列のＢＬＡＳＴ分析（２００４年１月２８日現在）の結果は表２で示すが、それは本明細書に付属しており、本明細書の一部を形成する。これらの配列は、本明細書で発明者らによって使用される遺伝子ＩＤ名（クローン番号）により、左端の欄にリストされている。多くの配列は、以前に同定された遺伝子の記載と一致した。記載の欄は、供与源データベース及び対応するデータベースアクセッション番号も含む。表２は、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ遺伝子ＩＤＤ、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ転写産物ＩＤ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／Ｅｎｓｅｍｂｌｅ、ＯＭＩＭ（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ）、ＲｅｆＳｅｑ、Ｐｆａｍ、ＩｎｔｅｒＰｒｏ及びＨＵＧＯを含むいくつかのデータベースからの追加情報を含む。染色体番号（＃）及び配列の多くの染色体位置に関しても情報が示されている。更に、「シグナルペプチド」と表示された欄は、予測されたシグナルペプチドがそのアミノ酸配列で見られる配列を示す。「ＴＭＨＭＭ」（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ）と表示された欄は、予測された膜貫通領域がタンパク質配列で見られる配列を示す。

表６は、以前同定された遺伝子に対する相同性を示しているクローンを記載する。

マイクロアレイの調製
マイクロアレイプローブは、ディファレンシャルディスプレイから単離されたクローンをＰＣＲ増幅することによって生成した。プローブは、ＧＭＳ４１７（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）アレイヤーを使用してポリ−Ｌ−リジンコーティングされたスライド上へ２連でスポットした。骨関節炎の軟骨試料は、人工股関節全置換術を行った臨床診断されたイヌの大腿骨頭部から得た。ＲＮＡは、ＨＣ ＥｘｐｒｅｓｓＡｒｒａｙ（Ｄｉｇｅｎｅ）キットを使用してスライドとハイブリッド形成させ、ＧＭＳ４１８（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）スキャナーを使用して視覚化した。スポットを発見するためにＩｍａｇｅｎｅ（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）プログラムを使用し、以降のデータ解析はＧｅｎｅＳｉｇｈｔ（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して実施した。発現量は、バックグラウンドの減算、対数（底２）変換及びグローバルスライドシグナル正規化の後に表される。

マイクロアレイクローン調製
１．５ｍＬのＭａｇｎｉｆｉｃｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ（ＭＢ）とテトラサイクリン（５０ｍｇ／ｍｌ）を含む培養ブロックに、グリセリンストックから適当なクローンを接種し、振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。これらの培養物を使用して第２の培養ブロックに接種し、それを振盪しながら３７℃で約６時間増殖させた。これらの６時間培養物を使用して２反復の培養ブロックに接種し、それを振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。培養物を遠心分離して細胞をペレットにし、Ｑｉａｇｅｎ ９６穴培養システム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドを単離した。プラスミド濃度は、分光光度計を使用して２６０ｎｍで吸光度を測定することによって測定した。すべてのｃＤＮＡプラスミドクローンを、以下のＰＣＲ反応（最終濃度）を使用して２反復で増幅させた：１０×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、各５００μＭのｄＮＴＰ、６００ｎＭのＲｇｈプライマー、６００ｎＭのＬｇｈプライマー、１μＬ（５単位／μｌ）のエッペンドルフＴａｑポリメラーゼ及び１μＬ（〜１００ｎｇ／μＬ）のｃＤＮＡ鋳型で、合計１００μＬ。反応は以下の条件で実施した：１サイクルが９４℃で３０秒間、５２℃で４０秒間及び７２℃で１分間を４０サイクル、その後７２℃で５分間及び４℃で維持。増幅生成物を１．５％のアガロースゲルで確認し、Ｍｉｎｅｌｕｔｅ（Ｑｉａｇｅｎ）プロトコルを使用して精製した。ＰＣＲの２００μｌを濾板に加え、フィルターに結合したｃＤＮＡだけを残してすべてのＰＣＲ試薬及び液体を引き抜くために減圧にした。３０μＬの分子グレードの水を濾板に加え、９００ｒｐｍのオービタル振盪機上で室温で５分間インキュベートした。精製されたｃＤＮＡを含む上清を濾板から吸引した。ｃＤＮＡを４５℃のｓｐｅｅｄ ｖａｃ内で２時間又は完了するまで乾燥させた。３０μＬのＣｏｒｎｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ緩衝液をすべてのｃＤＮＡに加え、オービタル振盪機上で室温で一晩再懸濁させた。２μＬを濃度解析のために移し、２００〜５００ｎｇ／μＬの最終濃度にするために適当な量のＣｏｒｎｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ緩衝液を加えた。プレートは、各アレイ印刷までとその後も、−２０℃で保存した。

クローン整列
顕微鏡スライド（Ｇｏｌｄｓｅａｌカタログ＃３０１０）を１０％ＮａＯＨ（Ｆｉｓｈｅｒカタログ＃Ｓ３１８−５００）、５７％ＥｔＯＨ溶液に浸漬して、５０ｒｐｍのオービタル振盪機内で２時間、室温でインキュベートした。スライドを、ミリＱ水５×でそれぞれ３０秒間洗浄した。スライドが最後の水洗液内にある間に、１０％のポリ−Ｌ−リジン（シグマカタログ＃Ｐ８９２０）、１０％の１×ＰＢＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬカタログ＃７００１３−０３２）をプラスチック容器内でミリＱ水を使用して７００ｍＬにした。スライドをコーティング溶液に浸漬し、５０ｒｐｍのオービタル振盪機内で１時間、室温でインキュベートした。スライドを、ミリＱ水５×でそれぞれ３０秒間洗浄し、５００ｒｐｍで１分間回転させた。スライドを５５℃のオーブン内で１０分間インキュベートし、整列前の少なくとも１４日間、また長くても３ヵ月間、デシケータ内に保管した。ｃＤＮＡクローンは、ＧＭＳ ４１７ ａｒｒａｙｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して整列させた。すべてのスライドを、乾燥させるために室温のデシケータ内に一晩置いた。スライドを、沸騰しているミリＱ水（蒸気）の上で再水和させ、８０℃熱ブロックの上でＤＮＡ側を上にして急速乾燥させた。効率的な架橋を確実にするために、スライドを８０℃オーブンで２時間焼き、その後Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（１２０ｍＪ、ストラタジーン）で架橋させた。すべてのスライドは、ｃＤＮＡハイブリダイゼーションのために使用するまで、室温のデシケータで保存した。

ｃＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション
すべてのＲＮＡ試料は、以下の反応を使用して逆転写した：５×Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ緩衝液（インビトロゲン）、１μＬ（１ｐｍｏｌｅ／μＬ）ＲＴプライマー（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ）、１μＬのＳｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（商標）Ｒｎａｓｅ阻害剤、１μＬの各１０ｍＭのＤＮＴＰ、２μＬの０．１Ｍ ＤＴＴ、１μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ及び５μｇの総ＲＮＡ。反応を４２℃で２時間実施した。３．５μＬの０．５Ｍ ＮａＯＨ／５０ｍＭ ＥＤＴＡを加え、６５℃で１０分間インキュベートすることによって反応を停止させた。反応を、５μＬの１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５を加えることによって中和させた。１０１．５μＬの１０ｍＭトリス、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡを加え、ｃＤＮＡはＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３０（ミリポア）プロトコルに従って精製及び濃縮した。濃縮したｃＤＮＡをヌクレアーゼ非含有水で１０μＬの最終体積にし、以下の試薬を加えた：合計４０μＬにつき、２０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ）、２μＬのｄＴ ＬＮＡ遮断薬及び８μＬのヌクレアーゼ非含有水。ハイブリダイゼーション混合物を８０℃で１０分間加熱し、ｌｉｆｔｅｒＳｌｉｐの端のマイクロアレイスライド上に載せた。次にスライドをＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ二重ハイブリダイゼーション槽に入れ、６０℃水槽に一晩置いた。翌日、３ＤＮＡ Ａｒｒａｙ ３５０（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ）プロトコルに従ってスライドを処理した。即ち、スライドを洗浄し（２×ＳＳＣ−０．２％ＳＤＳ、２×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ）、１０００ｒｐｍで１分回転乾燥させ、３ＤＮＡ捕獲ハイブリダイゼーションを実施した。スライドを洗浄し（２×ＳＳＣ−０．２％ＳＤＳ、２×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ）、１０００ｒｐｍで１分回転乾燥させ、ＧＭＳ ４１８アレイスキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用してスキャンした。

マイクロアレイ分析
特異クローンに結合したＲＮＡ転写物を表しているスキャン画像を定量化し、Ｉｍａｇｅｎｅ分析ソフトウェア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用してスポット品質管理について検査した。定量化された画像を、Ｇｅｎｅｓｉｇｈｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して分析した。分析は、スポット周囲のバックグラウンドの減算、スポット反復の平均算出、すべての試料でバックグラウンドより２００を超えて大きくないクローンハイブリダイゼーションシグナルを表しているクローン情報の削除、対数（底２）変換及び各スライドのグローバル正規化（値は平均スポット強度の割合で表される）を反映する。

マイクロアレイを使用した発現分析
ＲＮＡを上記のように軟骨から抽出した。マイクロアレイ分析（上記）を、臨床診断されて人工股関節全置換術を行ったイヌからの８つの骨関節炎の軟骨試料、及び８つの正常軟骨試料に対して実施した。標準のｔ検定（２カテゴリー）を、軟骨試料の骨関節炎についての評価のために最終ハイブリダイゼーションシグナルに対して実施した（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１、結果はそれぞれ表３及び４で示す）。

遺伝子転写物を単離するためのディファレンシャルディスプレイの使用で、本発明者らは骨関節炎に関係する転写産物で濃縮されるマイクロアレイチップを開発することができた。骨関節炎のイヌからの試料を分析するためのこのチップの使用により、（１）ディファレンシャルディスプレイからの結果が確認され、（２）分子レベルでのイヌ骨関節炎の更なる解明が可能になる。ｑＰＣＲ（上述）によって分析された転写産物は、マイクロアレイからの差次的発現の分析を検証するものであった。

定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
定量ＰＣＲを使用して、ＲＮＡ転写物における変化の確認を実施した。製造元の使用説明書通りにＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（インビトロゲン）を使用して逆転写酵素反応を実施した。１μｇのＲＮＡを１．５μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、１．５μＬのランダムヘキサマー及び０．６μＬのオリゴｄＴプライマーに加え、１５μＬの最終体積にした。試料を６８℃で１０分間インキュベートし、次いで、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して少なくとも１分間、４℃に下げた。上記反応物の一部（０．２５×）を取り出して、負のＲＴ反応物（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素を含まない陰性対照）として使用した。同じＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素キットを使用して、３μＬの１０×ＲＴ緩衝液、６μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３μＬの０．１Ｍ ＤＴＴ及び１．５μＬのＲＮアーゼ阻害剤を含むマスターミックスを作製した。負のＲＴ試料のために一部（０．２５×）を取り出して０．３７５μＬのＨ_２Ｏを加えた。正のＲＴ反応のために、マスターミックスの残りに１．１２５μＬのＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素を加えた。次にすべての反応物を４２℃で１時間インキュベートし、９５℃で５分間沸騰させ、次いで、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９７００を使用して４℃に下げた。次に試料をＲＴ反応１部に対しＨ_２Ｏの２９部で希釈して、実験のためのｃＤＮＡ原液を作製した。

プライマー及び５’ヌクレアーゼアッセイプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ｖ１．５（リアルタイム定量ＰＣＲプライマー及びプローブ設計チュートリアルのためのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）チュートリアル）を使用してディファレンシャルディスプレイからの選択された配列に基づいて設計された。副溝結合プローブ（ＡＢＩ Ｃｕｓｔｏｍ Ｏｌｉｇｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒｙ）をＡＢＩに注文した。すべてのオリゴを、ＴＥ緩衝液ｐＨ＝８．０（Ａｍｂｉｏｎ）で１００μＭ原液濃度に再構成し、その後、ＴＥ緩衝液で５μＭの実用原液濃度に希釈した。定量ＰＣＲ反応のために、製造元の使用説明書通りにＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。プライマー濃度はそれぞれ３００μＭであり、プローブ濃度は２００μＭであった（以前の実験から最適と判定された）。定量ＰＣＲ反応のために、４μＬのＲＴ反応及び負のＲＴ反応を使用した。すべての陽性反応は３連で実施し、陰性対照は単独で実施した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、５０．０℃で２分間、９５．０℃で１０分間、及び１サイクルが９５℃で１５秒間その後６０℃で１分間を４０〜５０サイクル）で記載されている標準のｑＰＣＲ条件を０．５溶で使用した。試料を、ＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒプログラムｖ１．７ａを使用してＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒで分析した。

どの標準曲線を使用しなければならないか判定するために、すべての試料は各プライマー／プローブセットに対して単独で流した。標準曲線は、実験試料からの肝臓ＲＮＡ又はＲＮＡの連続希釈を使用して作成した。或いは、試料が曲線範囲のいずれにも入らない場合は、最も低いＣ_Ｔ（サイクル閾値）の試料を再度逆転写し、１：１０の連続希釈をそのプライマー／プローブセットの標準曲線として使用する。値を、定量ＰＣＲで測定されたＧ３ＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素）レベルに正規化した。インダクションを、最も低い試料の正規化値のそれぞれから計算した。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。

表５は、ｑＰＣＲ分析で使用したプライマー及びプローブを示す。

イヌＯＡ軟骨のｑＰＣＲ分析
上述のように臨床診断されて人工股関節全置換術を行ったイヌからの６つの骨関節炎の軟骨試料、及び８つの正常軟骨試料に対してｑＰＣＲを実施した。結果を図２（Ａ〜Ｅ）に示す。

処理されたＯＡ試料のマイクロアレイ分析
Ａ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ軟骨細胞細胞培養
イヌ軟骨を、以下の酵素を使用して３７℃の振盪水浴上で消化した：トリプシン（０．２５％）２５分間、ヒアルロニダーゼ（１５０Ｕ／ｍｌ）１時間及びコラゲナーゼ（０．７８％）一晩。消化した軟骨を濾過して軟骨細胞を得た。ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋２．４％アルギン酸塩（低融点）＋細胞を１０ｃｃの注射器から塩化カルシウム（１０２ｍＭ）に滴下して、「ビーズ」を形成させた。軟骨細胞ビーズを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｐ／Ｓ（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢ）で培養した。培地を１日おきに交換した。処理の終わり（下記参照）に、軟骨細胞ビーズをクエン酸ナトリウム（５５ｍＭ）及びＥＤＴＡ（３０ｍＭ）に溶かした。懸濁液を１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、再び１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１ｍＬの溶解結合溶液（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標））を単離されたイヌ軟骨細胞ペレットに加え、完全に混合し、ＲＮＡ単離が実施できるまで−２０℃で保存した。

Ｂ．細胞培養からのＲＮＡ単離
製造元の使用説明書通りＱｕｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムを使用して、試料を攪拌してホモジナイズした。ホモジナイズした溶解物を収集し、１等容積の６４％エタノールをそれに加えた。次いで、この混合物をＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）フィルターカートリッジに一度に７００μＬ加え、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。７００μＬの洗浄溶液＃１及び５００μＬの洗浄溶液＃２／３を使用して、各洗浄につき１０，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によりカートリッジを洗浄した。フィルターカートリッジを１分間の遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）により乾燥させた。ＲＮＡを、９５〜１００℃の溶出溶液の３０μＬアリコートを使用して、遠心分離（上記）により３回溶出させた。得られたＲＮＡをＤＮアーゼ処理し、上で述べたように定量した。ＲＮＡ単離の後、以前に述べたようにＲＮＡをマイクロアレイハイブリダイゼーションのために準備した。

Ｃ．細胞培養マイクロアレイの統計解析
データを対数（底２）に変換した。データを、分位数正常化を使用して正規化した。正規化の後、一致相関関係を計算した。

差次的に発現された遺伝子は、ＥＰＡ対ＡＡ；ＥＰＡｓｔｉｍ対ＡＡｓｔｉｍ；コンドロイチン硫酸及びグルコサミン１００μｇ対対照、１００μｇ対１０μｇ、並びに１０μｇ対対照についてペアードｔ検定（α＝０．０５）を使用して判定した。

差次的に発現された遺伝子は、先ずＡＡｓｔｉｍ対ＡＡの比及びＥＰＡｓｔｉｍ対ＥＰＡの比を使用し、続いてＡＡｓｔｉｍ／ＡＡ及びＥＰＡｓｔｉｍ／ＥＰＡの比のペアードｔ検定（α＝０．０５）によって判定した。

すべてのグルコサミン及びコンドロイチン硫酸分析の一方向の傾向に従う差次的に発現された遺伝子は、３つすべての試料において処理への反応が同じ方向への増加又は減少をもたらした各処理ペアについて判定された。

差次的に発現された遺伝子は、１，２５ Ｄ３対対照及び２４，２５ Ｄ３対対照（α＝０．０５）の両方についてＷｅｌｃｈの修正２サンプルｔ検定を使用して判定した。

１．コンドロイチン硫酸処理
コンドロイチン硫酸は関節の栄養素と認識の上で、軟骨細胞をコンドロイチン硫酸で処理した。軟骨細胞ビーズを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｐ／Ｓ＋１０％ＦＢＳ内で１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ又は０μｇ／ｍＬ（対照）のコンドロイチン硫酸で１週間処理した（ｎ＝３）。培地を１日おきに交換した。１週間後に、軟骨細胞ビーズをクエン酸ナトリウム（５５ｍＭ）及びＥＤＴＡ（３０ｍＭ）に溶かした。懸濁液を１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、再び１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１ｍＬの溶解結合溶液（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標））を単離されたイヌ軟骨細胞ペレットに加え、完全に混合し、ＲＮＡ単離が実施できるまで−２０℃で保存した。コンドロイチン硫酸処理からの１試料を、残りのアレイデータとの低い相関関係のために除去した。これにより、この分析はｎ＝３に減少した。結果を表７〜１２に示す。

２．グルコサミン処理
グルコサミン処理を使用して、ＯＡ関連遺伝子の差次的発現に及ぼすこの関節健康栄養素の影響を判定した。軟骨細胞ビーズを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｐ／Ｓ＋１０％ＦＢＳ内で１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ又は０μｇ／ｍＬ（対照）のグルコサミンで１週間処理した（ｎ＝３）。培地を１日おきに交換した。１週間後、軟骨細胞ビーズをクエン酸ナトリウム（５５ｍＭ）及びＥＤＴＡ（３０ｍＭ）に溶解させた。懸濁液を１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、再び１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１ｍＬの溶解結合溶液（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標））を単離されたイヌ軟骨細胞ペレットに加え、完全に混合し、ＲＮＡ単離が実施できるまで−２０℃で保存した。結果を表１３〜１８に示す。

３．１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（１，２５ Ｄ３）及び２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（２４，２５ Ｄ３）処理
１，２５ Ｄ３及び２４Ｒ，２５Ｄ３を、軟骨細胞内でのプロスタグランジン産生及びビタミンＤ３代謝産物に対する差次的な反応に及ぼすそれらの既知の影響に基づき、軟骨細胞の処理に使用してＯＡ関連遺伝子の発現に及ぼすこれらの化合物の影響を判定した。軟骨細胞ビーズを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｐ／Ｓ＋１０％ＦＢＳ内で１０^−７Ｍの１，２５ Ｄ３又は１０^−７Ｍの２４，２５ Ｄ３で、或いはビタミンＤなしで（当量エタノールを対照に加えた）２４時間処理した（ｎ＝３）。２４時間後、軟骨細胞ビーズをクエン酸ナトリウム（５５ｍＭ）及びＥＤＴＡ（３０ｍＭ）に溶かした。懸濁液を１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、再び１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１ｍＬの溶解結合溶液（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標））を単離されたイヌ軟骨細胞ペレットに加え、完全に混合し、ＲＮＡ単離が実施できるまで−２０℃で保存した。結果を表１９及び表２０に示す。

４．エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びアラキドン酸（ＡＡ）処理
文献によるとＥＰＡは抗炎症剤として作用するとの認識の下、軟骨細胞をエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びアラキドン酸（ＡＡ）で処理した。ＡＡは、西洋の典型的食事を代表する対照として使用した。軟骨細胞を、ＤＭＥＭ／ＨＡＭＳ＋Ｐ／Ｓ＋１０％ＦＢＳ内で、５０μＭ ＥＰＡ又は５０μＭ ＡＡ（アルブミンを担体として使用）で２週間増殖させた。培地を１日おきに交換した。各組（ｎ＝３）を分割して、半分を刺激した単球好中球馴化培地（ＳＭＮＣＭ）で１週間処理し、培地を１日おきに交換した。ＳＭＮＣＭを、製造元の使用説明書通りにＮｙｃｏＰｒｅｐ（商標）を使用してイヌ全血から単球及び好中球を単離することによって作製した。単球及び好中球をリポ多糖（２０ｎｇ／ｍＬ）で７２時間刺激した。得られた上清を細胞培養実験でＳＭＮＣＭとして使用した（ＳＭＮＣＭは、実験中に使用された培地の１０％を占めた）。軟骨細胞ビーズをクエン酸ナトリウム（５５ｍＭ）及びＥＤＴＡ（３０ｍＭ）に溶かした。懸濁液を１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、再び１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１ｍＬの溶解結合溶液（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標））を単離されたイヌ軟骨細胞ペレットに加え、完全に混合し、ＲＮＡ単離が実施できるまで−２０℃で保存した。ＥＰＡ／ＡＡ ｓｔｉｍ処理からの１試料は、残りのアレイデータとの低い相関関係のために除去した。これにより、これらの分析はｎ＝３に減少した。結果を表２１〜２３に示す。

この実験は、様々な治療がＯＡ関連遺伝子の発現に影響を及ぼすことができることを証明した。ある場合には、遺伝子発現に対する影響は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。他の場合、発現の多様性のために変化は統計学的に有意であると証明することができなかったが、発現が１つの方向にのみ（発現の増加又は減少）変化する確かな傾向が見られた。この一方向の変化は、生物学的に関連し且つ重要であると思われる。場合によっては、ある遺伝子の発現のダウンレギュレーションはＯＡに有益な生物学的影響を及ぼすと思われている。他の遺伝子については、発現の増加が有益な生物学的影響を及ぼす。本発明は、例えば、抗炎症性過程に関係していることが知られている化合物の調節によって実証されている有益効果と相関する遺伝子の識別を可能にする。本発明は、本発明で記載されているＯＡ関連遺伝子の遺伝子発現の調節に基づく有益効果を有するはずである、新化合物の特定も可能にする。

これらの結果は、様々な処理で細胞の生物学に影響を及ぼすことができること、及びＯＡ関連遺伝子の遺伝子発現へ直接的影響を及ぼすことができることを証明している。本発明は、動物、特にヒトでＯＡの候補治療薬及び予防薬を同定するための、化合物の迅速で強力なスクリーニングを可能にする。

各特許、特許出願、刊行物及びこの文書で引用又は記載されているデータベース配列へのアクセッション番号の開示は、本明細書で参照により完全に組み込まれている。

本明細書で記載されているものに加えて、本発明の様々な修正形態が上の説明から当業者には明らかになろう。そのような修正形態も、添付の特許請求の範囲に入るものとする。

イヌ骨関節炎のディファレンシャルディスプレイ分析において使用される代表的なゲルを示す図である。Ａ．バンド切り出しの前に２反復でロードした骨関節炎対正常の転写産物のディファレンシャルディスプレイ（Ｄ＝骨関節炎（罹患）、Ｎ＝正常）。Ｂ．バンド切り出し後の同じゲル。 イヌ骨関節炎のディファレンシャルディスプレイ分析において使用される代表的なゲルを示す図である。Ａ．バンド切り出しの前に２反復でロードした骨関節炎対正常の転写産物のディファレンシャルディスプレイ（Ｄ＝骨関節炎（罹患）、Ｎ＝正常）。Ｂ．バンド切り出し後の同じゲル。 イヌ軟骨における選択されたＯＡ関連の転写産物の定量ＰＣＲ分析（ｑＰＣＲ）を示す図である。ＲＮＡ発現は、任意の単位で示される。（ＯＡ ＡＶＧ＝骨関節炎軟骨の平均発現；Ｃ ＡＶＧ＝正常対照の平均発現）。 イヌ軟骨における選択されたＯＡ関連の転写産物の定量ＰＣＲ分析（ｑＰＣＲ）を示す図である。ＲＮＡ発現は、任意の単位で示される。（ＯＡ ＡＶＧ＝骨関節炎軟骨の平均発現；Ｃ ＡＶＧ＝正常対照の平均発現）。 イヌ軟骨における選択されたＯＡ関連の転写産物の定量ＰＣＲ分析（ｑＰＣＲ）を示す図である。ＲＮＡ発現は、任意の単位で示される。（ＯＡ ＡＶＧ＝骨関節炎軟骨の平均発現；Ｃ ＡＶＧ＝正常対照の平均発現）。 イヌ軟骨における選択されたＯＡ関連の転写産物の定量ＰＣＲ分析（ｑＰＣＲ）を示す図である。ＲＮＡ発現は、任意の単位で示される。（ＯＡ ＡＶＧ＝骨関節炎軟骨の平均発現；Ｃ ＡＶＧ＝正常対照の平均発現）。 イヌ軟骨における選択されたＯＡ関連の転写産物の定量ＰＣＲ分析（ｑＰＣＲ）を示す図である。ＲＮＡ発現は、任意の単位で示される。（ＯＡ ＡＶＧ＝骨関節炎軟骨の平均発現；Ｃ ＡＶＧ＝正常対照の平均発現）。

Claims (2)

1. 配列番号２１７のポリヌクレオチド分子と、配列番号２１３〜２１６から選択される１つ以上のポリヌクレオチド分子とを含む複数のポリヌクレオチド分子を含み、前記ポリヌクレオチド分子が、骨関節炎及び前骨関節炎ではないイヌにおける発現と比較して骨関節炎又は前骨関節炎のイヌで差次的に発現される組合せ。
2. 試料中の核酸の差次的な発現の検出のための、
   ａ）配列番号２１７のポリヌクレオチド分子と、配列番号２１３〜２１６から選択される１つ以上のポリヌクレオチド分子とを含む複数のポリヌクレオチド分子を含み、前記ポリヌクレオチド分子が、骨関節炎及び前骨関節炎ではないイヌにおける発現と比較して骨関節炎又は前骨関節炎のイヌで差次的に発現される組合せを、試料の核酸とハイブリッド形成させることにより１つ又は複数のハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、
   ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出するステップと、
   ｃ）前記ハイブリダイゼーション複合体を標準のそれらと比較するステップとを含み、標準及び試料のハイブリダイゼーション複合体の差が試料中の核酸の差次的な発現を示す方法。