JP2004532602A - 泡沫細胞分化において発現される遺伝子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、泡沫細胞発生時に発現が変動するアテローム硬化性動脈硬化症に関連する複数のポリヌクレオチドを含む精製されたポリヌクレオチド及び組成物に関する。本発明は、基板上のエレメントとしてのこの組成物の使用法、並びにこの組成物及びポリヌクレオチドを用いた方法を提供する。
Description
【0001】
(技術分野)
本発明は、ヒト泡沫細胞において発現が調節される遺伝子を検出するために用いられ得る複数のポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、アテローム性動脈硬化症に関連する病態、障害、及び疾患の診断にこれらのポリヌクレオチドを使用することに関する。
【0002】
(本発明の背景)
アテローム性動脈硬化症、及び関連する冠状動脈疾患及び脳卒中は、先進国において最も一般的な死因である。ある種の重要な危険因子が同定されているが、この複雑な疾患を引き起こす完全な分子機構及びこの疾患に対する医療は確立されていない。アテローム硬化性血管の病巣の成長及び退行の分子機構の解明には、成長、安定、溶解、破裂、閉塞性血管の血栓の発生を含む病変の特徴に関係する遺伝子の同定が必要である。
【0003】
アテローム性動脈硬化症の発生の初期段階では、「脂肪条痕」が形成される。コレステロールリッチの低密度リポタンパク(LDL)などのリポタンパクが、血管内膜の細胞外空間に蓄積され、化学修飾を受ける。LDLの酸化は、循環抗酸化物の防御効率が低い内皮下空間において最も活発に起こる。LDLの酸化の程度が、標的細胞との相互作用に影響を与える。「最少酸化」LDL(MM−LDL)はLDL受容体に結合することができるが、スカベンジャー受容体A型及びB型、CD36、CD68/macrosialin、及びLOX−1を含む同定された酸化LDL(OX−LDL)受容体すなわちスカベンジャー受容体には結合できない(Navabら (1994) Arterioscler Thromb Vasc Biol 16:831−842; Kodamaら (1990) Nature 343:531−535; Actonら (1994) J Biol Chem 269:21003−21009; Endemannら (1993) J Biol Chem 268:11811−11816; Ramprasadら (1996) Proc Natl Acad Sci 92:14833−14838; Kataokaら(1999) Circulation 99:3110−3117)。MM−LDLは、単球の接着及び浸透を増大させ、内皮細胞による単球走化タンパク質1(MCP−1:monocyte chemotactic protein 1)の放出を刺激し、マクロファージにおけるスカベンジャー受容体A(SRA)及びCD36の発現を誘導し得る(Cushingら (1990) Proc Natl Acad Sci 87:5134−5138; Yoshidaら (1998) Arterioscler Thromb Vasc Biol 18:794−802; Steinberg (1997) J Biol Chem 272:20963−20966)。SRA及び他のスカベンジャー受容体は、OX−LDLに結合し、リポタンパク質粒子の取り込みを促進させ得る。
【0004】
単核食細胞は内膜に進入して、マクロファージに分化し、OX−LDLを含む化学修飾を受けた脂質を摂取する。ほとんどの細胞型では、コレステロールの量は、LDL受容体及び生合成酵素のフィードバック調節によって厳密に調節されている(Brown及びGoldstein (1986) Science 232:34−47)。しかしながら、マクロファージでは、追加のスカベンジャー受容体によりコレステロールが無制限に取り込まれ(Brown及びGoldstein (1983) Annu Rev Biochem 52:223−261)、泡沫細胞表現型を産生する多数の細胞内脂質滴が蓄積される。コレステロールを貪食して死亡したマクロファージが、初期の「脂肪条痕」プラークの塊及び病変動脈の典型的な進行した病巣のほとんどに関与する。様々な研究から、種々の泡沫細胞応答が、アテローム性動脈硬化症の血管壁プラークの成長及び破裂に関与することが分かった。これらの応答には、隣接する細胞の増殖及び接着を促進する多数の成長因子及びサイトカインの産生、循環単球を成長中のプラーク内に引き寄せるケモカイン、細胞外マトリックスを再構築するタンパク質、血栓症を引き起こし得る組織因子の産生が含まれる(Ross (1993) Nature 362:801−809; Quinら(1987) Proc Natl Acad Sci 84:2995−2998)。従って、アテローム硬化性プラーク形成のほとんどの段階で大量に生じるコレステロールを多く含んだマクロファージが、アテローム硬化プロセスの開始及び最終的なプラークの破裂及び閉塞血栓に関係する。
【0005】
OX−LDLの取り込み中に、マクロファージはサイトカイン及び成長因子を産生する。これらのサイトカイン及び成長因子が、平滑筋細胞増殖などのアテローム発生及び細胞マトリックスの形成を調節する更なる細胞現象を引き起こす。更にこれらのマクロファージは、誘導性酸化窒素シンターゼを含む炎症に関与する遺伝子を活性化し得る。従って、泡沫細胞形成時に発現が変動する遺伝子が、アテローム硬化プロセスのマーカーとなると推測できる。
【0006】
本発明は、診断において複数のプローブ及び精製されたポリヌクレオチドをアテローム性動脈硬化症及び他の心血管疾患のマーカーとして用いるハイスループットのスクリーニング法を提供する。
【0007】
(発明の要約)
本発明は、添付の配列表に示されているSEQ ID NO:1−276から選択された、泡沫細胞発生において発現が変動する複数のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。一実施例では、各ポリヌクレオチドは、泡沫細胞形成の初期マーカーであって、アップレギュレートされたSEQ ID NO:1−55或いはダウンレギュレートされたSEQ ID NO:171−196の何れかである。第2の実施例では、各ポリヌクレオチドは3倍を超えてまたは3分の1未満に発現が変動する、アップレギュレートされたSEQ ID NO:47−67またはダウンレギュレートされたSEQ ID NO:194−213の何れかである。更に本発明は、これらのポリヌクレオチドの相補配列、並びにこれらのポリヌクレオチドを基板に固定することを含む。
【0008】
本発明は、サンプルにおける1或いは複数のポリヌクレオチドの発現の変化を検出するハイスループット法を提供する。この方法は、このポリヌクレオチド組成物をサンプルとハイブリダイズさせて、1或いは複数のハイブリダイゼーション複合体を形成し、ハイブリダイゼーション複合体を検出し、このハイブリダイゼーション複合体を標準のハイブリダイゼーション複合体と比較することを含み、ハイブリダイゼーション複合体の大きさ及び強度におけるそれぞれの差が、サンプルにおけるポリヌクレオチドの発現の変化を示唆するものである。サンプルはアテローム性動脈硬化症の患者から得ることができ、標準と比べることにより疾患の程度が初期、中期、或いは後期であるかを決定することができる。
【0009】
本発明はまた、分子または化合物のライブラリをスクリーニングしてリガンドを同定するためのハイスループット法を提供する。この方法は、本ポリヌクレオチド組成物を、特異的な結合が許容される条件化で、分子または化合物のライブラリと結合させるステップと、特異的な結合を検出してリガンドを同定するステップとを含む。分子または化合物のライブラリは、DNA分子、RNA分子、ペプチド核酸(PNA)、擬態、ペプチド、及びタンパク質から選択される。本発明は更に、リガンドを生成する方法を提供する。この方法は、本発明のポリヌクレオチドを、特異的な結合が許容される条件下でサンプルと結合させるステップと、結合したポリヌクレオチドを回収するステップと、本ポリヌクレオチドからリガンドを分離して、精製したリガンドを得るステップとを含む。
【0010】
本発明はまた、発現核酸配列或いはゲノム核酸配列のライブラリから伸長した或いは完全長の遺伝子を得る方法を提供する。この方法は、基板上に個々のライブラリ配列を整列するステップと、添付の配列表から選択されたポリヌクレオチドを、特異的な結合が許容される条件下で前記ライブラリ配列とハイブリダイズするステップと、このポリヌクレオチドと配列との間のハイブリダイゼーションを検出するステップと、ライブラリ配列を単離して伸長した或いは完全長の遺伝子を得るステップとを含む。
【0011】
本発明は更に、添付の配列表に示されているSEQ ID NO:35‐48、68‐80、192、193、214−224から選択された実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、この発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、タンパク質が発現される条件下でこの宿主細胞を培養するステップと、この培養した宿主細胞からこのタンパク質を回収するステップとを含むタンパク質の生産方法を提供する。
【0012】
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を提供する。本発明はまた、分子または化合物のライブラリをスクリーニングしてこのタンパク質と特異的に結合する少なくとも1つのリガンドを同定するためのハイスループット法を提供する。この方法は、特異的な結合が許容される条件下で、このタンパク質またはその一部を分子または化合物のライブラリと結合させるステップと、特異的な結合を検出してこのタンパク質と特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含む。分子または化合物のライブラリは、DNA分子、RNA分子、PNA、擬態、ペプチド、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体またはそれらの断片、免疫グロブリン、インヒビター、薬剤化合物、及び医薬品から選択される。本発明は更に、タンパク質を用いたリガンドの精製を提供する。この方法は、このタンパク質またはその一部を、特異的な結合が許容される条件下でサンプルと結合させるステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、リガンドからタンパク質を分離して精製されたリガンドを得るステップとを含む。本発明はまた、このタンパク質及び医薬用担体を含む医薬組成物、並びにこのタンパク質と特異的に結合する精製された抗体を提供する。
【0013】
(発明の詳細な説明)
本発明の核酸配列及び方法について説明する前に、本発明がここに開示した特定の装置、物質、及び方法に限定されるものではないことを理解されたい。特定の実施例を用いて説明を行うが、これらの実施例に類似した或いは同等の装置、方法、及び物質を用いて本発明を具現可能である。後述の好適な装置、方法、及び物質は、本発明の範囲を制限することを意図したものではなく、本発明は請求の範囲によってのみ限定される。
【0014】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その(この等)」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含む。全ての専門用語及び科学技術用語は、当業者が一般に理解している意味をもつ。本発明に関連する或いは開示した細胞系、ベクター、及び方法を説明するまたは開示する目的で言及した全ての刊行物を本明細書の一部とする。本明細書の如何なる部分も、そのような刊行物が先行発明という理由で本発明が先行していないと解釈すべきではない。
【0015】
(定義)
「増幅」は、ヌクレオチド配列のコピーを生成することを指し、当分野で周知のPCR法を用いて行われる。
【0016】
「相補的な」は、塩基対形成(例えば、5’‐A‐G‐T‐3’が3’‐T‐C‐A‐5’と塩基対を形成する)によりアニーリングする2つの一本鎖ヌクレオチド配列間の関係を指す。
【0017】
「E値(E−value)」は、偶然により2つの配列が一致する実質的な確率を指す。
【0018】
「誘導体」は、化学修飾を受けたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。化学修飾の例には、分子や配列の生物学的活性または寿命を維持或いは増大する、例えば、アセチル基、アシル基、アルキル基、アミノ基、ホルミル基、またはmorpholino基による水素の置換が含まれる。誘導体ポリヌクレオチドは、自然のポリペプチドの必須の生物学的特性(触媒ドメインや調節ドメインなど)を保持したポリペプチドをコードし得る。
【0019】
「断片」は、添付の配列表のポリヌクレオチドまたはその相補配列の少なくとも18個の連続するヌクレオチドを指す。「ユニークな断片」は、添付の配列表のポリヌクレオチドに即位的な特定のポリヌクレオチドまたは相補配列またはその相補配列の少なくとも18個の連続するヌクレオチドであって、ハイブリダイゼーション条件下でユニークな断片を含まない関連配列を検出しない。
【0020】
「ハイブリダイゼーション複合体」は、プリン塩基とピリミジン塩基との間の水素結合の形成による2つの核酸分子の複合体を指す。
【0021】
「相同性」は、基準配列とのポリヌクレオチドの少なくとも断片またはポリペプチドの一部との間の配列類似性を指す。
【0022】
「ハイブリダイゼーション複合体」は、プリンとピリミジンとの水素結合による2つのポリヌクレオチド間の複合体を指す。
【0023】
「免疫学的に活性」は、動物において抗体を産生する特定の免疫反応を引き起こす天然、組換え、または合成のポリペプチド、またはその一部の能力を指す。
【0024】
「リガンド」は、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の相補的な部位に特異的に結合するあらゆる分子、物質、または化合物を指す。このようなリガンドは、本発明のポリヌクレオチドまたはタンパク質の活性を安定化或いは調節し、核酸、タンパク質、炭水化物、脂肪、及び脂質を含む無機物質及び有機物質の少なくとも1つを含む。
【0025】
「マイクロアレイ」は、基板上のハイブリダイズ可能なエレメントの規則正しい整列を指す。エレメントは、基板1cm2当たり好ましくは複数のエレメント、より好ましくは100エレメント、更に好ましくは1,000エレメント、最も好ましくは10,000エレメントの複数のエレメントが存在するように整列される。エレメントの最大数に制限はないが、少なくとも100,000エレメントである。更に、各エレメントからのハイブリダイゼーションシグナルは個別に識別可能である。本実施例及び好適な実施例では、エレメントはポリヌクレオチドプローブを含む。
【0026】
「調節する」は、分子と本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの間の特的な結合から生じる活性(増減、性靴学的、化学的、または免疫学的な)或いは寿命のあらゆる変化を指す。
【0027】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、PCR法の「プライマー」または「アンプライマー(amplimer)」として或いはアレイエレメントとして用いられる少なくとも約15から多くても約60のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を指し、好ましくは約18〜30のヌクレオチドであり、最も好ましくは約20〜25のヌクレオチドである。
【0028】
「ペプチド核酸(PNA)」は、安定性を高めるためにヌクレオチド塩基が偽ペプチド骨格に結合したDNA類似物を指す。
【0029】
「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド配列、核酸分子、DNA分子、またはそれらの任意の断片や相補配列を指す。「ポリヌクレオチド」はまた、ゲノムまたはは合成起源、二本鎖または一本鎖、コード及び/または非コードのDNA或いはRNA、ゲノムDNA分子のエキソンまたはイントロン、または炭水化物、脂質、タンパク質、無機エレメントや物質に結合したものが可能である。
【0030】
「一部」は、添付の配列表のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくとも6個の連続するアミノ酸を指す。一部は、関連するタンパク質内の保存されたアミノ酸配列(例えば、触媒ドメインやキナーゼドメイン)であり得る。
【0031】
ポリペプチドの「翻訳後修飾」は、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、及び蛋白分解による切断などが含まれる。これらのプロセスは、合成的に或いは生化学的に起こり得る。生化学的な修飾は、細胞の位置、細胞型、pH、及び酵素的環境などにより様々である。
【0032】
「プローブ」は、サンプルまたは基板上の核酸分子とハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその断片である。プローブを用いて、従来の分子生物学の技術によりcDNA、内在性遺伝子、または転写mRNAの検出、増幅、定量を行うことができる。ここで用いられるプローブは、サザーン、ノーザン、in situ、ドットブロット、及びアレイなどの技術を含むハイブリダイゼーション反応のレポーター分子である。
【0033】
「タンパク質」は、ポリペプチドやオリゴペプチドを含むタンパク質またはその一部を指す。ポリペプチドの一部は一般に、未処置のタンパク質の生物学的または免疫学的特性を保持している。「オリゴペプチド」は、少なくとも約5個の残基、好ましくは10個の残基、最も好ましくは約15個の残基からなる免疫原性を有するアミノ酸配列であって、抗体を産生する融合タンパク質の一部として用いられる。
【0034】
「精製された」は、天然の状態で結合していた少なくとも1つの成分から単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体などを指す。
【0035】
「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体などを含むサンプルには、体液や、細胞が成長する培地または細胞調製の可溶性画分や、細胞から単離或いは抽出された染色体、細胞小器官、または膜や、溶液中に存在する或いは基板に結合されたゲノムDNA、RNA、またはcDNAや、組織、細胞、組織プリント、またはフィンガープリント、皮膚、髪などが含れ得る。
【0036】
「特異的な結合」または「特異的に結合する」は、2つの分子間の相互作用を指す。ポリヌクレオチドの場合、特異的な結合には、センス鎖とアンチセンス鎖との間の水素結合、複製または転写に影響を与える一本鎖とタンパク質との間の水素結合、DNA分子の主溝または副溝への分子または化合物の挿入、転写因子、エンハンサー、及びリプレッサー等として機能する少なくとも1つの分子との相互作用が含まれる。ポリペプチドの場合、特異的な結合には、上記したようなポリヌクレオチドとの相互作用、或いはアゴニスト、抗体、またはアンタゴニストなどの分子や化合物との相互作用が含まれる。特異的な結合は、分子間の好適な化学的相互作用または分子相互作用を許容する構造的特性の存在に左右される。
【0037】
「基板」は、分子または化合物が結合する任意の固体或いは半固体の支持物を指し、膜またはフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、毛細管または他のチューブ、プレート、ポリマー、微小粒子が含まれる。この基板は、孔または溝、ピン、チャネル、細孔を含む様々な表面形態を有する。
【0038】
(発明)
本発明は、マクロファージが泡沫細胞に分化する時にそのマクロファージにおいてそれぞれが発現が変動して発現される複数のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。この複数のポリヌクレオチドは、添付の配列表に示されている同定された配列、SEQ ID NO:1−276の少なくとも断片を含む。更に本発明は、泡沫細胞形成の初期に発現がアップレギュレートされたSEQ ID NO:1−55またはダウンレギュレートされたSEQ ID NO:171−196のポリヌクレオチドのサブセットを提供する。本発明はまた、泡沫細胞形成時にその発現が3倍を超えてアップレギュレートされたSEQ ID NO:47−67または3分の1未満にダウンレギュレートされたSEQ ID NO:194−213のポリヌクレオチドのサブセットを提供する。本発明はまた、泡沫細胞発生時にその発現がアップレギュレートされたSEQ ID NO:35−48及び68−80、またはダウンレギュレートされたSEQ ID NO:192、193、及び214−222の新規のポリヌクレオチドを提供する。
【0039】
ポリヌクレオチドを選択する方法
ヒトTHP−1細胞(American Type Culture Collection, Manassas VA)を24時間の間、12−0−テトラデカノイルホルボール13−アセテート(Research Biochemical International, Natick MA)と共に血清を含む培地で成長させて分化させた。次に細胞を、30分から4日の一定期間Ox−LDLの存在下または非存在下の何れかで培養した。Ox−LDLに0、0.5、2.5、8、24、48、及び96時間暴露した後、発現プロフィールを作成するために培養した細胞からポリ(A)RNAを調製した。実験的なコントロール細胞からのポリ(A)RNAは別の蛍光色素で標識し、UNIGEM V 2.0アレイ(Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA)上で時間が一致する対にハイブリダイズさせた。
【0040】
集団クラスター分析(agglomerative cluster analysis)を用いて、応答パターンを同定し、異なった遺伝子発現プロフィール間の関係を確立した。それぞれの遺伝子測定値は、発現値を各時間において最大値で除して標準化した。クラスター化プロセスにより、ツリーの各ブランチレベルにおいて交差するそのレベルにおけるクラスターの数に等しい数のブランチを有する階層ツリーが形成される。ブランチレベル5におけるツリーの分割により、遺伝子が、発現が変動して発現された276の遺伝子及びスプライスバリアント、即ちSEQ ID NO:1−276を含む7つの遺伝子発現クラスターに分割される。
【0041】
表1は、クラスター分析により同定された泡沫細胞発生に関連して発現が変動して発現された遺伝子及びスプライスバリアントを示す。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示し、列3は遺伝子アノテーションを示す。列4から列10は、標準化された発現の変化を示し、各遺伝子は最大値1.0を有する。背景に3種類の陰影を付けて、Ox−LDLに応答し相対的な発現を色分けした。特定の遺伝子の発現の最大値に対して白い部分は0〜25%の発現を示し、薄いグレーの部分は26〜50%の発現を示し、濃いグレーの部分は51〜75%の発現を示し、黒い部分は76〜100%の発現を示す。列11は、その遺伝子が割り当てられたクラスターを示す。
【0042】
図1は、各クラスターにおける全ての遺伝子についての各時点における平均的な標準化された発現パターンのグラフを示す。クラスター1からクラスター4は、1日目、2日目、または4日目の時点でアップレギュレートされた遺伝子を含む。クラスター5及びクラスター6は、後半になってダウンレギュレートされた遺伝子を含む。クラスター7は、8時間目でアップレギュレートされた遺伝子を含む。
【0043】
表2は、各配列番号に対する様々なIDを示す。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示す。列3はUNIGEM V 2.0マイクロアレイ上のインサイトクローンのクローン番号を示す。列4及び列5は、列2に識別番号が示された遺伝子配列におけるクローンインサート配列の開始部位及び終了部位を示す。
【0044】
表3は、泡沫細胞分化の初期において発現が変化した遺伝子のリストである。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示し、列3は遺伝子アノテーションを示す。列4から列10は各時間において異なる発現の値を示す。この値は、処理したサンプルを同じ時間の未処理のサンプルで除して得られる。列11及び列12は、時間経過においてアップレギュレートされた発現またはダウンレギュレートされた発現の最大変化を示す。列12は、時間経過における最大の差を示す。
【0045】
表4は、泡沫細胞分化時に、発現の変動が3倍以上の遺伝子のリストである。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示し、列3は遺伝子アノテーションを示す。列4から列10は、各時間において異なる発現の値を示す。この値は、処理したサンプルを同じ時間の未処理のサンプルで除して求める。列11及び列12はそれぞれ、経過時間においてアップレギュレートされた発現またはダウンレギュレートされた発現における最大の変化を示す。列12は、経過時間における最大の差を示す。
【0046】
本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、またはペプチド核酸などの任意のRNA様またはDNA様物質、分枝DNAなどが可能である。ポリヌクレオチドプローブは、センス鎖またはアンチセンス鎖が可能である。標的が2本鎖である場合、プローブはセンス鎖或いはアンチセンス鎖のいずれであっても良い。標的が1本鎖の場合は、プローブは相補的な一本鎖である。一実施例では、ポリヌクレオチドはcDNAである。別の実施例では、ポリヌクレオチドはプラスミドである。プラスミドの場合は、目的の配列はcDNAインサートである。
【0047】
ポリヌクレオチドは、当分野で周知の様々な合成または酵素的な方法で調製することができる。ポリヌクレオチドは、当分野で周知の化学的な方法を用いて全体或いは一部を合成することができる(Caruthers他 (1980) Nucleic Acids Symp. Ser. (7) 215−233)。別法では、ポリヌクレオチドは、in vitro或いはin vivo転写により酵素を用いて或いは組換えにより作製することができる。
【0048】
ヌクレオチド類似体を、当分野で周知の方法によりポリヌクレオチドプローブ内に導入することができる。ただし、プローブに組み込まれるヌクレオチド類似体は標的ヌクレオチドと塩基対を形成しなければならない。例えば、特定のグアニンヌクレオチドを、シトシン残基と塩基対を形成するヒポキサンチンで置換することができる。しかしながら、これらの塩基対はグアニンとシトシンとの間の塩基対より安定性が低い。別法では、アデニンヌクレオチドを、アデニンとチミジンとの間の塩基対よりも強い塩基対をチミジンと形成し得る2, 6−ジアミノプリンと置換することができる。更に、ポリヌクレオチドは、化学的或いは酵素的に誘導されたヌクレオチドを含み得る。典型的な化学修飾には、アシル基、アルキル基、アリル基、またはアミノ基での誘導体化が含まれる。
【0049】
ポリヌクレオチドは、基板上で合成することができる。基板表面での合成は、化学結合法及びBaldeschweilerら(PCT公開WO95/251116)により開示されているピエゾプリント装置(piezoelectric printing apparatus)を用いて行うことができる。別法では、ポリヌクレオチドは、Hellerら(米国特許第5,605,662号)に記載されているように試薬が加えられた時に制御する自己アドレス式電子デバイスを用いて基板表面で合成することができる。
【0050】
相補的DNA(cDNA)を基板上に整列して固定することができる。ポリヌクレオチドは、化学結合法またはUV照射などの共有結合法により固定することができる。このような或る方法では、エポキシドまたはアルデヒド基を含むように化学修飾を受けたガラス表面に結合させる。別法では、cDNAプローブをポリリジンコーティングされた表面に載せ、次にShalonら(W095/35505)に記載されているようにUV架橋する。別の方法では、電気的な方法(Heller他、前出)によりDNAを溶液から基板上の所定の位置に輸送する。或いは、ポリヌクレオチド、クローン、プラスミド、または細胞を、フィルター上に整列することができる。細胞を用いる場合は、細胞を溶解し、タンパク質及び細胞成分を分解し、そのDNAをUV架橋によりフィルターに結合させる。
【0051】
更に、ポリヌクレオチドは、基板に直接結合させるのではなく、リンカーなどを介して基板に結合させることができる。このようなリンカーは、典型的には約6個から50個の原子長であり、付着したプローブを露出させる。好適なリンカーには、エチレングリコールオリゴマー、ジアミン、2酸等が含まれる。基板表面上の反応基がリンカーの末端基と反応して、リンカーが基板に固定される。次に、リンカーの他方の末端がポリヌクレオチドに結合する。
【0052】
ポリヌクレオチドは、プローブ合成用の試薬を基板表面に連続的に分注して、或いは既製DNA断片を基板表面上に分注して基板に固定することができる。典型的なディスペンサーには、基板に対してマイクロピペットの位置を制御する機械装置を備えた基板に溶液を供給するマイクロピペットが含まれる。複数のディスペンサーを配置して反応領域に効率的に試薬を分注することが可能である。
【0053】
(ポリヌクレオチドの使用)
本発明のポリヌクレオチドを様々な目的に用いることが可能である。例えば、本発明の組成物をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイは、サンプルにおける関連ポリヌクレオチドを検出するため、分子や化合物のライブラリをスクリーニングしてリガンドを同定するため、及びアテローム性動脈硬化症などの特定の心血管疾患、またはその状態や障害の診断のためなどのハイスループット法に用いることができる。別法では、添付の配列表の所定の配列に相補的なポリヌクレオチドを用いて、そのポリヌクレオチドに関連する治療に有効な遺伝子を阻害または不活性化することができる。
【0054】
本発明の組成物をマイクロアレイのエレメントとして用いる場合、本ポリヌクレオチドエレメントは、各エレメントが基板上の指定の位置に配置されるように規則正しく整列する。エレメントが基板上の指定の位置にあるため、ユニークな発現プロフィールを形成するハイブリダイゼーションパターン及びその強度を、特定の遺伝子の発現レベルと見なすことができる。また、ハイブリダイゼーションパターン及びその強度は、特定の代謝プロセス、病態、障害、疾患、疾患のステージ、または治療に関連性を有し得る。
【0055】
ハイブリダイゼーション
本発明のポリヌクレオチド、またはその断片や相補配列を、様々なハイブリダイゼーション技術に用いることができる。本ポリヌクレオチドは、天然、組換え、化学的に合成されたものが可能であり、ゲノムまたはcDNA配列に基づいており、PCR法或いは酵素的な技術の何れかにより様々なレポーター分子を用いて標識することができる。このようなポリヌクレオチド即ちプローブの標識及び精製に市販のキットを用いることができる。放射標識(Amersham Pharmacia Biotech)、蛍光標識(Operon Technologies, Alameda CA)、及び化学発光標識(Promega, Madison WI)は当分野で周知である。別法では、ポリヌクレオチドを市販のベクターにクローニングして、プローブを転写によって生成する。プローブをT7またはSP6ポリメラーゼなどの好適なポリメラーゼ及び少なくとも1つの標識したヌクレオチドを加えて合成及び標識化する。
【0056】
プローブは、本ポリヌクレオチドの3’非翻訳領域などのユニークな領域或いは保存されたモチーフから設計するか或いはこれらに由来する。このようなプローブをプロトコルに用いて、同一のポリペプチド、アレル変異体、または関連分子をコードする天然の分子を同定することが可能である。プローブはDNAまたはRNAが可能であって、通常は1本鎖であり、本核酸配列の何れかと少なくとも50%の配列同一性を有しなければならない。プローブは、ポリヌクレオチドの少なくとも18個の連続するヌクレオチドを含む。このようなプローブは、同一の配列のみとの結合が許容されるハイブリダイゼーション条件下、または少なくとも1つのヌクレオチド置換または欠失を有する関連配列に結合する条件下で用いることができる。また関連配列は、変性プローブのプールを用いた好適なハイブリダイゼーション条件により発見することが可能である。一般に、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーションに用いるためのプローブは、約400から約4,000ヌクレオチドの長さである。このようなプローブは一本鎖或いは二本鎖であって、溶液を用いるハイブリダイゼーションまたは基板を用いるハイブリダイゼーションにおいて高い結合特異性を有し得る。プローブはまた、PCR法によりサンプルにおける本発明のポリヌクレオチドの検出に用いられるオリゴヌクレオチドであってもよい。
【0057】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー(厳密性)は、プローブのGC含量、塩濃度、及び温度によって決まる。具体的には、塩濃度を下げたり、ハイブリダイゼーションの温度を上げたりしてストリンジェンシーを高めることができる。あるメンブレンを用いるハイブリダイゼーション用の溶液にホルムアミドなどの有機溶媒を加えて、反応が低い温度で起こるようにすることができる。ハイブリダイゼーションは、バッファー(5×SSC、1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS))で、60℃で行うことができるが、核酸配列間に不適正塩基対を含む複合体が形成され得る。続く洗浄は、45℃(中程度のストリンジェンシー)或いは65℃〜68℃(高いストリンジェンシー)の何れかの温度で、0.2×SSC、0.1%SDSなどのバッファーで行う。高いストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーション複合体は、完全に相補的なポリヌクレオチド部分のみが安定して保持される。あるメンブレンを用いるハイブリダイゼーションにおいて、好ましくは35%、最も好ましくは50%のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に加えて、ハイブリダイゼーションを行う温度を下げることができる。また、SarkosylやTriton X−100(Sigma Aldrich, St. Louis MO)などの界面活性剤及び変性サケ精子DNAなどのブロッキング試薬を用いてバックグラウンドシグナルを減少させることが可能である。ハイブリダイゼーションの成分や条件の選択は当分野で周知であり、Ausubel(前出、pp 6. 11−6. 19,14.11−14.36, 及びA1−43)に記載されている。
【0058】
ドットブロット、スロットブロット、低密度及び高密度のアレイを準備して当分野で周知の方法を用いて分析する。約18個から約5,000個の連続するヌクレオチドから成るプローブすなわちアレイエレメントは、本発明により作製でき、アレイ技術に用いることができる。プローブすなわちアレイエレメントの好適な数は、少なくとも約40,000であり、より好適には少なくとも約18,000であり、更に好適には少なくとも約10,000であり、最も好適には少なくとも約600から約800の間である。アレイを用いて多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタリングして、遺伝的変異、突然変異、及びSNPを同定することが可能である。このような情報を用いて、遺伝子機能の決定、障害の遺伝子レベルの解明、障害の診断、障害の制御或いは治癒に用いられる治療薬の開発及びその活性のモニタリングを行うことができる(例えば、米国特許出願第5,474,796号、PCT出願WO 95/11995、PCT出願WO 95/35505、米国特許出願第5,605,662号、及び米国特許出願第5,958,342号を参照)。
【0059】
スクリーニングアッセイ
ポリヌクレオチドを用いて、複数の分子または化合物即ちライブラリをスクリーニングして、特異的な結合親和性を有するリガンドを同定することができる。リガンドは、DNA分子、RNA分子、PNA、ペプチド、転写因子などのタンパク質、エンハンサー、リプレッサー、及び生態系においてそのポリヌクレオチドの活性、複製、転写、または翻訳を調節するその他のタンパク質を含み得る。このアッセイは、特異的な結合が許容される条件下で、このポリヌクレオチドまたはその断片を分子または化合物と結合させ、その結合したポリヌクレオチドを検出して、そのポリヌクレオチドと特異的に結合する少なくとも1つのリガンドを同定することを含む。
【0060】
一実施例では、本発明のポリヌクレオチドを、単離され精製された分子または化合物のライブラリと共にインキュベートし、当分野で周知の方法、例えばゲル遅延アッセイ(gel−retardation assay)(米国特許第6,010,849号)または網状赤血球溶解転写アッセイ(reticulocyte lysate transcriptional assay)により結合活性を決定することが可能である。別の実施例では、本ポリヌクレオチドを生検及び/または培養した細胞や組織に由来する核抽出物と共にインキュベートしてもよい。本ポリヌクレオチドと核抽出物における分子または化合物との間の特異的な結合を、まずゲルシフトアッセイを用いて決定し、次にその分子または化合物に対する抗体を上昇させて確認することが可能である。これらの抗体をアッセイに加えると、これによりゲル遅延アッセイによるスーパーシフトが起こる。
【0061】
別の実施例では、本ポリヌクレオチドを用いて、当分野で周知のアフィニティークロマトグラフィー法で分子または化合物を精製することが可能である。一実施例では、本ポリヌクレオチドを、ポリマー樹脂またはゲル上で臭化シアン基と化学的に反応させる。次に、サンプルを流して本ポリヌクレオチドと反応すなわち結合させる。本ポリヌクレオチドと結合した分子または化合物を、培地を流す塩濃度を上昇させて本ポリヌクレオチドから遊離させて回収する。
【0062】
リガンドの精製
本ポリヌクレオチドまたはその断片を用いてサンプルからリガンドを精製することができる。哺乳動物ポリヌクレオチドまたはその断片を用いてリガンドを精製する方法は、このポリヌクレオチドまたはその断片を、特異的な結合が許容される条件下でサンプルと結合させて、結合したポリヌクレオチドを回収し、好適な試薬を用いてこのポリヌクレオチドを精製されたリガンドから単離することを含む。
【0063】
(タンパク質の生産及びその使用)
本明細書のポリヌクレオチドまたはそれらの完全長cDNAを用いて、ここに開示しAusubel(前出; pp.16.1−16.62)に記載されている組換えDNA技術により精製されたポリペプチドを生産することができる。これらの方法によりポリペプチドを生産する1つの利点は、本ポリペプチドを多量に含んだ源を得る能力であり、これにより精製が容易になる。本発明はまた、関係する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び/または両親媒性特性における類似性に基づいたアミノ酸の置換、欠失、または挿入を包含する。置換された残基が、元の残基に類似した構造的または化学的特性を有する場合(例えば、ロイシンのイソロイシンやバリンでの置換)はこのような置換は自然において保存されるが、置換された残基が極端に異なっている場合(例えば、グリシンをトリプトファンで置換)はそのような置換は保存されないであろう。LASERGENEソフトウエア(DNASTAR, Madison WI)、MACVECTORソフトウエア(Genetics Computer Group, Madison WI)、及びRasMolソフトウエア(www. umass. edu/microbio/rasmol)に含まれているコンピュータプログラムを用いて、、本ポリペプチドの特定の部分におけるアミノ酸残基を、生物学的または免疫学的活性を損なうことなく、どのようにまたは幾つ、置換、挿入、または欠失できるかを調べることが可能である。
【0064】
コードされるタンパク質の発現
特定のcDNAを、そのcDNAを好適なベクターにクローニングして、このベクターを好適な宿主細胞に導入して形質転換し、発現させることが可能である。ヒト及びラットcDNAライブラリの作製に用いられるクローニングベクターは、発現のためにも用いることが可能である。このようなベクターは通常、クローニング、プライミング、及び転写に有用なポリリンカー及びプロモーターを含む。典型的なベクターは、β−ガラクトシダーゼのプロモーター、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端メチオニン及びそれに続く7つのアミノ酸残基を含み得る。このベクターを好適な大腸菌の宿主系に導入し形質転換することができる。標準的な方法によるイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)での単離された細菌株の誘導により、N末端メチオニン、β−ガラクトシダーゼの始めの7つの残基、約15残基のリンカー、及びこのcDNAによってコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質が産生される。
【0065】
このcDNAを、特定の宿主においてタンパク質の発現に有用であるとして知られる他のベクターに導入してもよい。このcDNAの両端のストレッチにハイブリダイズするのに十分なDNAの断片及びクローニング部位を含むオリゴヌクレオチドを、標準的な方法で化学的に合成することが可能である。次に、これらのプライマーを用いて、PCR法により目的の断片を増幅することができる。標準的な条件下で、この断片を好適な制限酵素で消化して、電気泳動法で単離することができる。別法では、類似の断片を、好適な制限酵素でこのcDNAを消化し、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを繋いで作製することができる。2つ以上の遺伝子に由来するコード配列の断片を繋いで発現させることもできる。
【0066】
可溶性タンパク質の分泌を指令するシグナル配列は、組換え配列の構成成分として特に有用である。例えば、1或いは複数の追加の精製促進ドメインを含むキメラタンパク質を発現さセルことが可能である。このようなドメインは、限定するものではないが、固定された金属上での精製を可能にする金属キレートドメイン、固定された免疫グロブリン上での精製を可能とするプロテインAドメイン、FLAGS伸長/アフィニティ精製システム(Immunex, Seattle WA)に用いられるドメインが含まれる。このポリペプチドと精製ドメインとの間にENTEROKINASEMAX(Invitrogen, San Diego CA)などの切断可能なリンカー配列を挿入して、本ポリペプチドを回収することができる。
【0067】
好適な発現宿主には、限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びヒト293細胞などの哺乳動物細胞、Sf9細胞などの昆虫細胞、サッカロミセス‐セレビジエなどの酵母細胞、及び大腸菌などの細菌が含まれる。これらの各細胞系の場合、有用な発現ベクターは、複製の起点、及び細菌や形質移入された真核宿主の選択を可能とする1或いは2の選択マーカーを含み得る。真核発現宿主に用いられるベクターは、ポリヌクレオチドがポリ(A)を含まない場合は、3’ポリ(A)尾部を付加する必要がある。
【0068】
更に、ベクターは、遺伝子発現を増大させるプロモーターまたはエンハンサーを含み得る。ほとんどのプロモーターは宿主特異的であって、CHO細胞にはMMTV、SV40またはメタロチオネインプロモーター、細菌宿主にはtrp、lac、tacまたはT7プロモーター、酵母にはα因子、アルコールオキシダーゼ、またはPGHプロモーターを用いることができる。ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどのエンハンサーを有するアデノウイルスベクター、または長い末端リピート(LTR: long terminal repeat)プロモーターなどのプロモーターを有するレロウイルスベクターを用いて、哺乳動物細胞系においてタンパク質を発現させることができる。組換え細胞の均一な培養物が得られたら、分泌された多量の可溶性ポリペプチドを条件培地から回収して、当分野で周知のクロマトグラフィー法を用いて分析することができる。多量の分泌タンパク質の別の生産方法は、哺乳動物胚を形質転換して、遺伝子組換え動物、例えばウシ、ヤギ、またはヒツジなどによって分泌される母乳から組換えタンパク質を回収することを含む。
【0069】
組換えによる生産に加えて、ポリペプチドまたはその一部を固相技術を用いて生産することができる(Stewartら (1969) Solid−Phase Peptide Synthesis, WH Freeman, San Francisco CA; Merrifield (1963) J Am Chem Soc 5:2149−2154)。この場合、ABI 431Aペプチドシンセサイザー(PE Biosystems, Norwalk CT)などの装置を用いるか或いは手動で行うことができる。上記した任意の方法で生産されたポリペプチドを、低発現に関連する障害を治療するために医薬組成物として用いることが可能である。
【0070】
スクリーニングアッセイ
本ポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質またはその一部を用いて、複数の分子または化合物すなわちライブラリをスクリーニングして特異的な結合親和性を有するリガンドを同定したり、サンプルから分子または化合物を精製することができる。このようなスクリーニングに用いられる本ポリペプチドまたはその一部は、溶液中に遊離、或いは有機または無機基板に固定されている、または細胞内に局在化していても良い。例えば、組換え核酸分子で安定的に形質転換され、ポリペプチドを発現してその表面上にポリペプチドが存在する生存可能すなわち安定した原核宿主細胞を、スクリーニングアッセイに用いることができる。この細胞を複数のリガンドすなわちライブラリに対してスクリーニングし、発現ポリペプチドとリガンドとの間の特異的な結合即ち複合体の形成を測定することができる。このリガンドは、本ポリペプチドと特異的に結合するDNA、RNA、またはPNA分子、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、ペプチド、医薬品、タンパク質、薬剤、またはその他の試験分子または化合物を含み得る。典型的なアッセイは、本哺乳動物ポリペプチドまたはその一部を、特異的な結合が許容される条件下で分子または化合物と結合させて、結合したポリペプチドを検出し、本ポリペプチドと特異的に結合する少なくとも1つのリガンドを同定することを含む。
【0071】
本発明はまた、競合的薬剤スクリーニングアッセイの方法を提供する。このアッセイでは、本ポリペプチドと結合可能な中和抗体が、本ポリペプチド、そのオリゴペプチド、或いはその一部と結合可能な試験化合物と特異的に競合する。極めて微量のアッセイ量及び極めて微量の試験化合物を用いるハイスループットのスクリーニング方法が、米国特許第5,876,946号に開示されている。スクリーニングによって同定された分子または化合物を用いて、哺乳動物モデル系を作製して、それらの毒性、診断または治療の可能性を評価することができる。
【0072】
リガンドの精製
本ポリペプチドまたはその一部を用いてサンプルからリガンドを精製することができる。哺乳動物ポリペプチドまたはその一部を用いてリガンドを精製する方法は、本ポリペプチドまたはその一部を、特異的な結合が許容される条件下でサンプルと結合させて、結合したポリペプチドを回収し、好適なカオトロピック剤を用いて精製されたリガンドから本ポリペプチドを単離することを含む。
【0073】
(抗体の作製)
本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを用いて特異的な抗体を作製する。抗体は、固有の免疫活性を有する本ポリペプチドのオリゴペプチドまたはその一部を用いて作製することができる。抗体を作製する方法は、(1)本ポリペプチド、またはその一部やオリゴペプチドを動物(通常はヤギ、ウサギ、マウス)に注入して、抗体反応を起こさせるステップと、(2)モノクローナル抗体を作製するべくハイブリドーマを作製するステップと、(3)リンパ球集団におけるin vivo産生を誘導するステップと、(4)組換え免疫グロブリンのライブラリをスクリーニングするステップとを含む。組換え免疫グロブリンは、米国特許第4,816,567号に開示されているように作製することができる。
【0074】
本発明のポリペプチドを用いて作製した抗体は、本ポリペプチドの発現、量、または分布における異常によって特徴付けられる急性或いは慢性の疾患の診断並びに病状が現れる前の診断に有用である。本ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイまたは免疫放射線測定法のための様々なプロトコルが当分野で知られている。イムノアッセイは通常、ポリペプチドとそのポリペプチドに特異的に結合する分子または化合物との間の複合体の形成、及びその複合体の測定を含む。特定のポリペプチドにおける2つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを用いることもできる。
【0075】
イムノアッセイ法を用いて、様々な条件下で、特定の疾患の患者またはモデル動物系の培養細胞における本ポリペプチドの発現を定量することができる。イムノアッセイによりモニタリングされるポリペプチドの産生の増減は、発生経路、作り出した症状や疾患、または治療効果に関連する細胞活性の知見に役立ち得る。所定の組織における所定のポリペプチドの量は、生体サンプルの凍結融解界面活性剤抽出物のイムノアッセイを行い、結合曲線の傾斜を精製されたポリペプチドから作成した結合曲線と比較して決定することができる。
【0076】
アッセイのための分子の標識化
様々な標識化及び結合技術は当分野で周知であり、種々のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体のアレイやアッセイに用いることができる。標識した分子の合成は、32P−dCTP、Cy3−dCTP、またはCy5−dCTPなどの標識したヌクレオチドや35S‐メチオニンなどのアミノ酸を組み込むためのAmersham Pharmacia BiotechキットまたはPromegaを用いて行うことができる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体を、BIODIPYまたはFITC(Molecular Probes, Eugene OR)などの試薬を用いて分子中に存在するアミン、チオール、または他の基に化学的に結合させることで、レポーター分子で直接標識することができる。
【0077】
アッセイのために本ポリペプチド及び抗体を、検出シグナルを提供するレポーター分子と共有結合または非共有結合により結合して標識化することが可能である。様々な標識及び結合技術が知られており、限定するものではないが米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437号、同第4,275,149号、及び同第4,366,241号を含む特許文献及び科学技術文献に記載されている。
【0078】
(診断)
本ポリヌクレオチドまたはその断片を用いて、遺伝子発現の変化、mRNAの存在、非存在、または過剰な発現を検出して測定したり、治療中のmRNAのレベルをモニタリングすることが可能である。発現の変化に関連する症状、疾患、または障害には、アテローム性動脈硬化症及びそれに関連する合併症が含まれる。これらのポリヌクレオチドを、上記した疾患及び他の心血管疾患、症状、及び障害に対する治療効果のマーカーとして、数日から数ヶ月の範囲に亘って用いることができる。診断アッセイにハイブリダイゼーションまたは増幅技術を用いて、患者からの生体サンプルの遺伝子発現レベルを標準的なサンプルの値と比較して、遺伝子発現の変化を検出する。質的または量的なこのような比較法は当分野で周知である。
【0079】
例えば、本ポリヌクレオチドを標準的な方法で標識して、これをハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者からの生体サンプルに加える。インキュベーションした後、このサンプルを洗浄し、ハイブリダイゼーション複合体に関連する標識(またはシグナル)の量を定量して標準値と比較する。患者のサンプルにおける標識の量が標準値と著しく異なっている場合は、関連する症状や疾患、または障害の存在が示唆される。
【0080】
遺伝子発現に関連する症状や疾患、または障害の診断基準を設けるために、正常即ち標準的な発現プロフィールを確立する。この発現プロフィールは、正常な動物或いはヒトから採取した生体サンプルを、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下でプローブと結合させることによって作成することができる。標準的なハイブリダイゼーションの量は、正常な患者から得た値と、実質的に精製された標的配列を所定量用いた実験値とを比較することによって求めることができる。このように求めた標準値を、特定の症状や疾患、または障害を示す患者のサンプルから得た値と比較することができる。標準値と特定の症状に関連する値との偏差からその症状を診断する。
【0081】
またこのようなアッセイを用いて、動物実験や臨床検査における特定の治療計画の効果を評価したり、個々の患者の治療をモニタリングすることができる。症状が確認されたら治療プロトコルを開始し、定期的に診断アッセイを繰り返して、患者の発現レベルが正常な被験者の値に近づき始めたかを調べることができる。連続して行ったアッセイの結果から、数日から数ヶ月に亘る期間の治療効果を推定することができる。
【0082】
遺伝子発現プロフィール
遺伝子発現プロフィールは、複数のポリヌクレオチド及び複数の検出可能なハイブリダイゼーション複合体を含む。それぞれの複合体は、1或いは複数のプローブとサンプルの1或いは複数の相補的な配列とのハイブリダイゼーションによって形成される。本発明のポリヌクレオチド組成物をマイクロアレイのエレメントとして用いて、遺伝子発現プロフィールを分析することができる。一実施例では、マイクロアレイを用いて疾患の進行をモニタリングすることができる。研究者は、正常な組織や細胞と病変した組織や細胞の遺伝子発現の差異を検査して記録することができる。遺伝子発現パターンの変化を分析することで、患者に症状が出る前の初期段階で疾患を診断することができる。本発明を用いて医学的な見通しをたて、治療計画を作成することができる。本発明はまた、治療の効果をモニタリングすることもできる。副作用が分かっている治療の場合には、マイクロアレイを用いて治療計画を改善することができる。治療の成功を示す遺伝子発現パターンの変化をもたらす服用量を確立する。望ましくない副作用の発生に関連する発現パターンを回避する。この方法は、患者の改善が不十分であることが分かるまで、或いは副作用が明らかになるまで治療計画を変えない従来の方法よりも高感度で迅速である。
【0083】
別の実施例では、ヒトの疾患を模した動物モデルを用いて、特定の症状、その症状の障害または疾患または治療、障害または疾患に関連する発現プロフィールを特徴づけることができる。新規の治療計画をこれらの動物モデルにおいて、一定期間における発現プロフィールを確立してそれに従うためにマイクロアレイを用いて検査することができる。更に、マイクロアレイを動物モデルから採取した培養細胞または組織に用いて、多数の候補薬剤分子を迅速にスクリーニングして、治療薬と類似の発現プロフィールを有する分子は類似の治療効果があるという期待の下で、既知の治療薬に類似した発現プロフィールを生成する分子を探した。従って、本発明は、分子レベルの薬剤の作用を迅速に決定する方法を提供する。
【0084】
抗体を用いるアッセイ
本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質のエピトープに対する抗体を、特定のヒト細胞に存在するタンパク質の量を定量するアッセイに用いることができる。このようなアッセイには、抗体及び標識を用いて、正常な状態または疾患状態における発現レベルを検出する方法が含まれる。抗体を、改変して或いは改変しないで、標識部分と共有結合または非共有結合による結合で標識して、用いることができる。
【0085】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いてタンパク質の発現を検出及び測定するためのプロトコルは当分野で周知である。例えば、ELISA、RIA、及びFACS(fluorescent activated cell sorting)が含まれる。このようなイムノアッセイは通常、タンパク質とそのタンパク質に特異的な抗体との間の複合体の形成、及びそのような複合体の測定を含む。これらのアッセイ及び他のアッセイがPound (supra)に記載されている。この方法は、2つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位モノクローナル系イムノアッセイ、または競合的結合アッセイを用い得る(例えば、Coliganら (1997) Current Protocols in Immunology. Wiley−Interscience, New York NY; Pound, 前出、を参照)
(治療)
本発明のポリヌクレオチド及びその断片を用いて遺伝子治療を行うことができる。本発明のポリヌクレオチドを単核食細胞などの標的組織に送達することができる。本ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現させて、内因性標的タンパク質の減少または喪失に関連する疾患状態を治療することができる。ポリヌクレオチドをin vitroの特定の細胞に送達し得る。形質転換細胞をin vivoの様々な組織に輸送する。或いは、ポリヌクレオチドをin vivoに輸送することもできる。ポリヌクレオチドを、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、及び細菌プラスミドなどのベクターを用いて細胞や組織に輸送する。ウイルスを用いない遺伝子輸送方法には、陽イオンリポソーム、ポリリジン結合、人工ウイルスエンベロープ、及びDNAの直接注入が含まれる(Anderson (1998) Nature 392: 25−30; Dachsら (1997) Oncol Res 9: 313−325; Chuら (1998) J Mol Med 76 (3−4): 184−192; Augustら (1997) Gene Therapy (Advances in Pharmacology, Vol. 40), Academic Press, San Diego CA)。
【0086】
更に、特定のタンパク質の発現は、そのタンパク質をコードする若しくはその発現を誘導する核酸配列にアンチセンスポリヌクレオチド配列を特異的に結合させて調節することができる。このアンチセンスポリヌクレオチドには、DNA、RNA、または核酸の擬態や類似体が可能である。核酸配列には、細胞mRNA及び/またはゲノムDNAが可能であり、アンチセンス配列の結合により、翻訳及び/または転写のそれぞれが影響を受け得る。アンチセンス配列を、上記したようなウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを用いて細胞内に送達することができる(Weissら (1999) Cell Mol Life Sci 55 (3): 334−358; Agrawal (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totowa NJ)。
【0087】
ポリヌクレオチド及びアンチセンス配列は何れも、ABI核酸シンセサイザーまたは当分野で周知の他の自動化装置の任意のものを用いてex vivoで作製することができる。ポリヌクレオチド及びアンチセンス配列はまた、好適な宿主細胞を目的の配列を含む発現ベクターで形質転換して生物学的に生産することもできる。
【0088】
本発明のポリヌクレオチドの発現またはコードされたタンパク質の活性を調節する分子は、免疫応答に関連する症状及び疾患の治療に有用である。このような分子には、本ポリヌクレオチドまたはコードされたタンパク質の活性または発現のそれぞれを増大させるアゴニスト、または本ポリヌクレオチドまたはコードされたタンパク質の活性または発現のそれぞれを低下させるアンタゴニストが含まれる。一実施態様では、このタンパク質に特異的に結合する抗体を、直接抗体として用いて或いはこのタンパク質を発現する細胞や組織に薬剤を送達するための標的すなわち送達機構として間接的に用いることができる。
【0089】
更に、このタンパク質、そのリガンド、または相補的な核酸配列を、他の好適な薬剤と共に投与することが可能である。組み合わせ治療に用いられる好適な薬剤の選択は、従来の製薬原理に従って当分野の通常の技術を有する者が行うことができる。治療薬を併用することにより、免疫応答に関連する症状や障害の治療または予防に相乗効果が生まれ得る。この方法を用いることにより、各薬剤の服用量を少なくしてなお治療効果を達成し、しかも潜在的な副作用を低下させることが可能である。更に、治療薬を、活性な化合物を医薬的に使用できる製剤にするプロセスを促進する賦形剤及び添加剤を含む医薬的に許容される担体と組み合わせることもできる。調剤及び投与についての詳細な技術については、最新版のRemington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co., Easton PA)に記載されている。
【0090】
(モデル系)
動物モデルを用いて、ヒトの暴露に相当する暴露条件にして、動物モデルがヒトに類似の表現型反応を示すバイオアッセイを行うことができる。哺乳動物が最も一般的な動物モデルである。大抵の感染症、癌、薬剤、及び毒物の研究には、ラットやマウスなどの齧歯類が用いられる。これは、低コスト、入手の容易性、寿命、生殖能、及び参考文献の豊富さからである。齧歯類近交系及び非近交系は、目的の遺伝子の過剰或いは過少な発現の生理学的な原因を調査するのに有用なモデルであり、疾患の診断及び治療方法の開発にも有用である。特定の遺伝子を大量に発現する(例えば、乳汁中に分泌される)同系哺乳動物は、その遺伝子によって発現されるタンパク質の便利な供給源となり得る。
【0091】
遺伝子組換え動物モデル
目的の遺伝子を過剰或いは過少に発現する遺伝子組換え齧歯類を同系交配し、それを用いてヒト疾患モデルを作製したり、治療薬検査や毒物検査を行う(例えば、米国特許第5,175,383号、及び同第5,767,337号を参照)。場合によっては、導入遺伝子が、胚発生中若しくは出生後の特定の時期に特定の種類の組織で活性化され得る。導入遺伝子の発現は、実験的薬剤治療を施す前、その最中、またはその後の、遺伝子組換え動物における表現型、組織特異的なmRNAの発現、または血清や組織のタンパク質レベルの分析からモニタリングすることができる。
【0092】
胚性幹細胞
齧歯類胚から単離された胚性幹細胞(ES細胞)は、胚組織を形成する可能性を維持している。ES細胞がキャリアとなる胚の中に導入されると、正常な発生が再開され、生まれる動物の組織の一部を担うことになる。ES細胞は、実験用のノックアウト及びノックイン齧歯類系を作製するのに好適な細胞である。マウス129/SvJ細胞株などのマウスES細胞は、マウスの初期胚から採取されてから当分野で周知の培養条件下で増殖されたものである。遺伝子組換え系の作製に用いるベクターは、疾患候補遺伝子及びマーカー遺伝子配列を含み、このマーカー遺伝子により導入された疾患遺伝子の存在を確認することができる。このベクターを、当分野で周知の方法でES細胞に形質転換し、この形質転換されたES細胞を特定し、C57BL/6マウス株などからのマウス細胞胚盤胞内に微量注入する。この胚盤胞を複数の偽妊娠メスに外科的に導入して、生まれてくるキメラ子孫のそれぞれがその遺伝子型を有するようにして、それらを交配してヘテロ接合系またはホモ接合系を作り出す。
【0093】
ヒト胚盤胞に由来するES細胞を、in vitroで操作して8個の異なった細胞系譜に分化することが可能である。これらの細胞系譜を用いて、in vitroで様々な細胞型及び組織の分化を研究する。細胞型には、神経細胞、造血系、及び心筋細胞に分化する内胚葉、中胚葉、及び外胚葉細胞型が含まれる。
【0094】
ノックアウト分析
遺伝子ノックアウト分析では、遺伝子のある領域を、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの非天然介在配列を含むように酵素によって改変する(neo ; Capecchi (1989) Science 244:1288−1292)。改変された遺伝子を培養ES細胞に形質転換し、相同組換えにより内在性のゲノムに組み込むる。挿入された配列が、内在性遺伝子の転写及び翻訳を阻害する。この形質転換細胞を齧歯類胞胚に注入し、この胞胚を偽妊娠メスに移植する。この遺伝子組換え子孫をクロス交配して、この哺乳動物遺伝子の機能的な複製物が存在しないホモ接合近交系を作り出す。
【0095】
ノックイン分析
ES細胞を用いてノックインヒト化動物(ブタ)または遺伝子組換えヒト疾患動物モデル(マウスまたはラット)を作り出すことができる。ノックイン技術を用いて、ヒト遺伝子のある領域を動物ES細胞に注入し、そのヒト配列が動物細胞のゲノムの中に組み込まれるようにする。形質転換細胞を胞胚に注入し、この胞胚を上記したように移植する。類似のヒトの症状の治療についての情報を収集するべく、遺伝子組換え子孫即ち近交系を有望な医薬品で処置して観察する。これらの方法を用いて、幾つかのヒト疾患モデルを作り出す。
【0096】
本明細書の配列表に示されているポリヌクレオチド及びそれらによりコードされるポリペプチドの前記したように用いたが、これは既知の技術の例であり、このように既知の技術に適用したからといって当業者に既知の任意の技術に限定されるものではない。更に、本明細書に示されているポリヌクレオチドを、開発途中の分子生物学技術に用いることが可能である。ただし、その新規の技術が、当業者には現在、例えばトリプレット遺伝子コード、及び特定の塩基対相互作用として知られるヌクレオチド配列の特性に依存する場合である。同様に、言及した方法は、当業者には周知の完全長のcDNA配列を得る或いは構築するための2つ以上の方法を組み合わせることを含み得る。
【0097】
記載した特定の方法、プロトコル、及び試薬等は変更することもあり得、本発明はこれらに限定されるものではないことを理解されたい。本明細書に用いた専門用語は、記載した特定の実施例を記載することのみが目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲は、前記した請求の範囲によってのみ限定されるものでる。また、以下に記載の実施例は、本発明を例示するためのものであって本発明を限定することを目的としたものではない。
【0098】
【実施例】
1 cDNA ライブラリの作製
RNAは、Clontech Laboratories社(Palo Alto CA)から購入したものと様々な組織から単離したものとがある。ある組織をグアニジニウムイソチオシアネート溶液においてホモジナイズして溶解する一方、別の組織を、フェノールにおいて、或いはTRIZOL試薬(Life Technologies)などの変性剤の好適な混合液においてホモジナイズして溶解した。この溶解物を塩化セシウムにおいて遠心分離するか、或いはクロロホルムで抽出した。RNAは、イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムとエタノールの何れかで、或いは別の一般的な方法で沈殿させた。
【0099】
RNAの純度を高めるためにRNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。殆どの場合、RNAはDNA分解酵素で処理した。殆どのライブラリの場合、ポリ(A)RNAは、オリゴd(T)結合常磁性粒子(oligo d (T)−coupled paramagnetic particles)(Promega)、OLIGOTEXラテックス粒子(QIAGEN. Valencia CA)、またはOLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いて単離した。別法では、POLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)などの別のRNA単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。
【0100】
ある場合には、Stratagene社(La Jolla, CA)にRNAを提供し、Stratagene社が対応するcDNAライブラリを作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)またはSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)を用いて、当分野で周知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成してcDNAライブラリを作製した。(Ausubel, 前出,ユニット5.1−6.6)。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始させた。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに結合させてから、好適な1或いは複数の制限酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリでは、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2B、SEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ)、またはアガロースゲル電気泳動法によってcDNAの大きさ(300〜1000bp)を選択した。PBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)、pSPORT1プラスミド(Life Technologies)、またはpINCYプラスミド(Incyte Pharmaceuticals)などのポリリンカーの適合性制限酵素部位にcDNAを結合させた。この組換えプラスミドを、Stratagene社のXL1−Blue, XL1−BIueMRF、SOLRコンピテント大腸菌細胞、またはLife Technologies社のDH5α、DH10B、またはELECTROMAX DH10Bコンピテント大腸菌細胞に導入し形質転換した。
【0101】
或る場合には、ライブラリを、Vieira ら (1987, Methods Enzymol. 153: 3−11)の方法に従って5×過剰のヘルパーファージM13K07で重感染させ、Soares (1994, Proc Natl Acad Sci 91:9228−9232)、Swaroop 他 (1991, Nucl Acids Res 19: 1954)、及びBonaldo 他 (1996, Genome Research 6: 791− 806)による方法を利用して、標準化即ちサブトラクトした。Soaresの標準化方法を変更して、高度に発現される豊富なcDNAの反復クローニングを減らす一方、ライブラリの全配列の複雑さは維持した。この変更の中には、遺伝子発見率を上げるためにハイブリダイゼーション時間を極めて長くすることによる、標準的な転写イメージでは現われにくい発現頻度が低く存在量が少ないcDNAに対して比重をおいたライブラリの標準化が含まれる(Soares 他, 前出)。
【0102】
2 cDNA クローンの単離及びシークエンシング
プラスミドは、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)或いは細胞溶解を利用したin vivo切除によって宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム(Promega)、AGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, Gaithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plus、QIAWELL 8 Plus Plasmid、またはQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、またはREAL Prep 96プラスミドキットの内の1つを用いた。沈殿させた後、0.1 mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで4℃で保管した。
【0103】
別法では、ハイスループットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1−14)。宿主細胞の溶解及び熱サイクリングステップは、1つの反応混合液で行った。サンプルを処理してから384−ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度を、PICOGREEN色素(Molecular Probes)及びFluoroskan II蛍光スキャナ(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した。
【0104】
cDNAシークエンシング反応は、HYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific, Sunnyvale CA)またはMICROLAB 2200システム(Hamilton, Reno NV)と共にABI CATALYST 800サーマルサイクラー(PE Biosystems)またはDNA ENGINEサーマルサイクラー(MJ Research, Watertown MA)などのハイスループットの装置または標準的な方法を用いて行った。cDNAシークエンシング反応液は、Amersham Pharmacia Biotechによる試薬またはABI PRISM BIGDYE サイクルシークエンシングキット(PE Biosystems)などのABIシークエンシングキットに含まれている試薬を用いて準備した。cDNAシークエンシング反応混合物の電気泳動による分離及び標識したポリヌクレオチドの検出は、MEGABACE 1000 DNA シークエンシングシステム(Amersham Pharmacia Biotech)、標準的なABIプロトコル及び塩基呼出しソフトウエア(base calling software)を用いるABI PRISM 373 or 377シークエンシングシステム(PE Biosystems)、または当分野で周知の他の配列分析システムを用いて行った。cDNA配列内の読み枠は、標準的な方法(Ausubel, 前出, Unit 7 を参照)を用いて特定した。
【0105】
3 cDNA 配列の伸長
核酸配列配列は、インサイトcDNAクローン及びオリゴヌクレオチドプライマーを用いて伸長した。一方のプライマーは既知の断片の5’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の3’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、OLIGO 4.06ソフトウエア(National Biosciences)或いは他の適切なプログラムを用いて、約22個から約30個のヌクレオチドの長さで約50%以上のGC含量を有し、かつ約68〜72℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じないようにヌクレオチドを伸長した。
【0106】
選択されたヒトcDNAライブラリを用いてこの配列を伸長した。2段階以上の伸長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組を設計する。大きなcDNAを含むようにサイズが選択されたライブラリが好ましい。遺伝子の5’及び上流領域を有する配列をより多く含むため、ランダムプライムされたライブラリが好ましい。ランダムプライムされたライブラリは、オリゴd(T)ライブラリから完全長cDNAを得られない場合に特に有用である。
【0107】
当分野で既知の方法を利用したPCR法で高い忠実度で増幅した。PCRはDNA ENGINEサーマルサイクラー(MJ Research)用いて96ウェルブロックプレートで行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg2 +と(NH4)2SO4とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI B(Incyte Pharmaceuticals)に対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 60℃で1分間
ステップ4 68℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す
ステップ6 68℃で5分間
ステップ7 4℃で保管
別法では、プライマーの組、T7とSK+(Stratagene)に対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 57℃で1分間
ステップ4 68℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す
ステップ6 68℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
【0108】
各ウェルのDNA濃度は、100μlのPICOGREEN試薬(1×TEにおける0.25%の試薬 (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes) 及び0.5μlの希釈していないPCR産物を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分注してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをFluoroskan II (Labsystems Oy)でスキャンして、サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量する。反応混合物の5〜10μlのアリコットを1%のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を伸長することに成功したかを決定する。
【0109】
伸長した核酸を脱塩及び濃縮してから384ウェルプレートに移し、CviJIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison WI)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する前に超音波処理即ちせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化した核酸を低濃度(0.6〜0.8%)のアガロースゲル上に分離して断片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs, Beverly MA)を用いて伸長したクローンをpUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部位のオーバーハングを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質転換細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートにおいて37℃で一晩培養した。
【0110】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 60℃で1分間
ステップ4 72℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を29回繰り返す
ステップ6 72℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNA回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを20%のジメチルサルホサイド(dimethysulphoxide)(1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC DIRECTサイクルシークエンシングキット(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator サイクルシークエンシングキット(PE Biosystems)を用いてシークエンシングした。
【0111】
4 配列の構築及び分析
クロマトグラムからの構成成分ヌクレオチドを、PHRED分析(Phil’s Revised Editing Program; Phil Green, University of Washington, Seattle WA)を用いて分析し、質のスコアを付与した。少なくとも必要な質スコアを有する配列を、様々なプリプロセシングアルゴリズムを用いて、質の低い3’末端、ベクター及びインカー配列、ポリA尾部、Aluリピート、ミトコンドリア及びリボソーム配列、細菌汚染配列、及び50塩基対よりも小さい配列を排除した。
【0112】
配列は、SWISS−PROT及びPROSITEデータベース(Bairochら (1997) Nucleic Acids Res. 25: 217−221; Attwoodら (1997) J. Chem. Inf. Comput. Sci. 37: 417−424)に含まれている配列情報に基づいたモチーフ分析プログラムであるBLOCK 2プログラム(Incyte Pharmaceuticals)を用いてスクリーニングした。
【0113】
1つの配列を1つのビンに割り当てるアセンブリ方法で、プロセシングした配列を分類した。各ビンにおける複数の配列を用いて、コンセンサス配列すなわちテンプレートをアセンブルした。その後の新しい配列は、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST; Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36:290−300; Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403−410; Karlinら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 841−845)、BLASTn (v. 1.4, WashU)、及びCROSSMATCH ソフトウエア (Phil Green, 前出)を用いて既存のビンに加えた。質スコアが150以上の候補の対を全てBLASTヒットとした。局所同一性が82%以上のアラインメントはビンに含めた。各ビンの構成成分配列は、PHRAP (Phil’s Revised Alignment Program; Phil Green, 前出)を用いてアセンブルした。いくつかの重複する構成成分配列を有するビンは、DEEP PHRAP(Phil Green, supra)を用いてアセンブルした。
【0114】
各ビンを互いに比較して、82%以上の局所類似性を有するビンを組み合わせて再アセンブルした。重複が不十分(局所同一性が95%未満)なテンプレートを有する再アセンブルしたビンを再び分割した。アセンブルしたテンプレートを、STITCHER/EXON MAPPERアルゴリズムにより分析した。この分析により、スプライスバリアント、選択的にスプライシングされたエキソン、及びスプライス部位の存在、並びに組織の種類及び疾患の状態などにおける選択的にスプライシングされた遺伝子の発現の変動の存在の可能性を調べることができる。これらの得られたビンを上記したアセンブリ方法で数回アセンブルし、LIFESEQ GOLDデータベース(Incyte Pharmaceuticals)に見られるテンプレート配列を作製した。
【0115】
アセンブリにより得られたテンプレートを次に示す方法でアノテーションを付けた。テンプレート配列は、GBpri (GenBank version 109)に対してBLASTn(v2.0, NCBI)で分析した。「ヒット」は、200塩基対に対して95%の局所同一性から100塩基対に対して100%までの局所同一性を有する正確な一致、またはE値が1×10− 8である相同一致と定義した。これらのヒットは、GENPEPT(GenBank version 109)に対してフレームシフトFASTxで分析した。この分析では、相同一致をE値が1×10− 8と定義した。上記したアセンブリ方法は、1999年3月25日に出願の米国特許出願第09/276,534号(名称「Database and System for Storing, Comparing and Displaying Related Biomolecular Sequence Information」)に記載されており、言及することをもって本明細書の一部とする。またLIFESEQ GOLDユーザーマニュアル(Incyte Pharmaceuticals)にも記載されている。
【0116】
続くアセンブリでは、テンプレート配列に対して、motif、BLAST、隠れマルコフモデル(HMM; Pearson及びLipman (1988) Proc Natl Acad Sci 85: 2444−2448 ; Smith及びWaterman (1981) J Mol Biol 147: 195−197)、及び機能の分析を行い、1997年3月6日に出願の米国特許出願第08/812,290号(名称、「Database System Employing Protein Function Hierarchies for Viewing Biomolecular Sequence Data」)、1997年10月9日に出願の米国特許出願第08/947,845号(名称、「Relational Database for Storing Biomolecule Information」)、米国特許出願第5,953,727号(名称、「Project−Based Full Length Biomolecular Sequence Database」)、及び1998年3月4日に出願の米国特許出願第09/034,807号(名称、「Relational Database and System for Storing Information Relating to Biomolecular Sequences」)に記載されている方法を用いてタンパク質の階層に分類した。なお、これらの特許出願に言及することを以って本明細書の一部とする。テンプレート配列を更に、GenBank齧歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物、原核生物、及びヒトESTデータベースなどの公共のデータベースに対して問い合わせすることもできる。
【0117】
5 マイクロアレイの準備
ヒトUNIGEM V 2.0(Incyte Pharmaceuticals)上のポリヌクレオチドは、gbESTデータベース(National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Bethesda, MD)から誘導したEST、及びIMAGE(ゲノム及びそれらの発現の統合的分子分析)cDNAライブラリクローンに由来する遺伝子指向クラスター(gene−oriented clusters)の重複しないセットに基づいたLIFESEQ GOLDアセンブルヒト配列データベース(Incyte Pharmaceuticals)に由来するテンプレート配列である。それぞれの特定のテンプレートを代表する1つのクローンをマイクロアレイに用いた。ポリヌクレオチドは、cDNAインサートに隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いて細菌細胞から増幅した。PCRを30サイクル行い、1〜2ngの開始ポリヌクレオチドから5μg以上の最終量に増加させた。次に増幅したポリヌクレオチドを、SEPHACRYL−400カラム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製した。
【0118】
精製したポリヌクレオチドをポリマーコートしたスライドガラス上に固定した。顕微鏡スライドガラス(Corning, Corning NY)は、0.1%SDS及びアセトン中で超音波洗浄した。この洗浄中及び洗浄後に大量の蒸留水で洗浄した。スライドガラスを4%フッ化水素酸(VWR Scientific Products Corporation, West Chester PA)中でエッチングし、蒸留水で丁寧に洗浄し、95%エタノールに溶解した0.05%アミノプロピルシラン(Sigma Aldrich, St. Louis MO)で被覆した。被覆したスライドガラスをオーブンで110℃で硬化させた。次にポリヌクレオチドを、米国特許第5,807,522号(言及することを以って本明細書の一部とする)に記載されている方法によりコーティングガラス基板に固定した。平均濃度が100ng/μlであるポリヌクレオチド1μlを高速ロボット装置によりオープンキャピラリープリンティング装置(open capillary printing element)に導入し、この装置によりスライド1枚に付き5nlのポリヌクレオチドを分柱した。
【0119】
マイクロアレイを、STRATALINKER UVクロスリンカー(Stratagene)を用いてUV架橋し、次に室温で0.2% SDSで洗浄し、更に蒸留水で3回洗浄した。非特異的な結合部位は、リン酸緩衝生理食塩水(Tropix, Bedford MA)における0.2%カゼインにおいてマイクロアレイを60℃で30分間インキュベートし、0.2% SDSで洗浄し、更に上記したように蒸留水で洗浄してブロッキングした。
【0120】
6 標的ポリヌクレオチドの調製
ヒトTHP−1細胞(American Type Culture Collection, Manassas VA)を、10% 胎児血清(v/v)、0.45% グルコース (w/v)、10 mM Hepes、1mMピルビン酸ナトリウム、1x10−5M β−メルカプトエタノール、ペニシリン(100 単位/ml)を含むRPMI1640培地で成長させた。酸化LDL負荷実験(loading experiments)のために、12−0−テトラデカノイルホルボール13−アセテート(Research Biochemical International, Natick MA)を含む培地に1x106細胞/mlの濃度で細胞を播種し、1x10−7Mで24時間培養した。次に、この培地を、Hammerらの方法(1995; Arterio Thromb Vasc Biol 15:704−713)に従って100μg/mlのCuSO4「完全」酸化型LDL(Intracel, Rockville MD)を含む或いは含まない培養培地に替えた。培養中は、2日毎に培地を取り替えた。細胞を、30分〜4日の範囲の各時点で、Ox−LDLで処理した。この期間中、細胞は接着したままであり、典型的な細点のあるナイルレッド染色パターンが形成された。RNAを、0時間、0.5時間、2.5時間、8時間、1日、2日、及び4日におけるOx−LDL暴露の発現プロフィールのために準備した。
【0121】
全RNAをRNA STAT−60キット(Tel−Test, Friendswood TX)を用いて抽出した。ポリ(A)RNAをPOLYATRACT mRNA単離システム(Promega)を用いて精製した。それぞれのポリ(A)RNAサンプルを、MMLV逆転写酵素、0.05 pg/μl オリゴ−dTプライマー(21mer)、1x 第1鎖バッファー、0.03 単位/μlのRNA分解酵素インヒビター、500 μM dATP、500 μM dGTP、500 μM dTTP、40 μM dCTP、及び40 μMの何れかdCTP−Cy3或いはdCTP−Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech)を用いて逆転写した。この逆転写反応は、GEMBRIGHTキット(Incyte Pharmaceuticals)を用いて200ngポリ(A)RNAを含む25mlの溶液において行った。特定のコントロールポリ(A)RNA(YCFR06、YCFR45、YCFR67、YCFR85、YCFR43、YCFR22、YCFR23、YCFR25、YCFR44、YCFR26)を、非コード酵母ゲノムDNA(W. Lei, unpublished)からin vitro転写により合成した。量的コントロールとして、0.002ng、0.02ng、0.2 ng、及び2ngのコントロールmRNA(YCFR06、YCFR45、YCFR67、及びYCFR85)を逆転写反応液に希釈して、サンプルmRNAに対する比率がそれぞれ1:100,000、1:10,000、1:1000、1:100 (w/w)となるようにした。異なった発現パターンをサンプリングするために、コントロールmRNA(YCFR43、YCFR22、YCFR23、YCFR25、YCFR44、及びYCFR26)を、サンプルmRNAに対して1:3、3:1、1:10、10:1、1:25、25:1 (w/w)の比率で逆転写反応液に希釈した。反応液を37℃で2時間インキュベートし、次に2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理し、85℃で20分間インキュベートして反応を停止させRNAを分解した。
【0122】
プローブを、2つの連続したCHROMA SPIN 30ゲルフィルトレーションスピンカラム(Clontech)を用いて精製した。Cy3及びCy5標識した反応サンプルを、後述するように結合させ、1mlのグリコーゲン(1mg/ml)、60mlの酢酸ナトリウム、及び300mlの100%エタノールを用いてエタノール沈殿させた。次にプローブをSpeedVACシステム(Savant Instruments, Holbrook NY)を用いて完全に乾燥させ、14μlの5X SSC/0.2% SDSにおいて再懸濁した。
【0123】
7 ハイブリダイゼーション及び検出
ハイブリダイゼーション反応液は、時点が一致する実験細胞とコントロール細胞の対からなるCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各0.2μg含む5×SSC、0.2%SDSハイブリダイゼーションバッファーからなる9μlのプローブ混合液を含む。この標的混合液を、65℃で5分間加熱し、マイクロアレイ表面上に一定量分注してから1.8cm2 のカバーガラスで覆った。このマイクロアレイを、顕微鏡スライドよりも僅かに大きいキャビティを有する防水チャンバーに移した。チャンバーの角から140μlの5×SSCを加えて、チャンバー内を湿度100%に保持した。このマイクロアレイを含むチャンバーを、60℃で約6.5時間インキュベートした。マイクロアレイは、ストリンジェンシーの低い洗浄バッファー(1×SSC, 0.1%SDS)において45℃で10分間、ストリンジェンシーの高い洗浄バッファー(0.1×SSC)において45℃で10分間それぞれ3回洗浄し、その後乾燥させた。
【0124】
レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体を、Cy3を励起するための488nm、及びCy3を励起するための632nmのスペクトル線を生成し得るInnova 70混合ガス10 Wレーザー(Coherent, Inc., Santa Clara CA)を備えた顕微鏡で検出した。20倍の顕微鏡対物レンズ(Nikon, Inc., Melville NY)を用いて、マイクロアレイ上に励起レーザー光を集中させた。このマイクロアレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御X−Yステージに置き、対物レンズを通してラスタスキャンした。本実施例で用いた1.8cm×1.8cmのアレイは、20μmの解像度でスキャンした。
【0125】
2つの異なるスキャンにおいて、混合ガスマルチラインレーザーは2つの蛍光体を連続的に励起した。放射された光は、波長に基づいて2つの蛍光体に対応する2つの光電子増倍管検出器(PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ)に分割された。マイクロアレイと光電子増倍管との間に配設された好適なフィルタを用いて信号をフィルタリングした。用いる蛍光体の最大発光は、Cy3では565nm、Cy5では650nmである。装置は両方の蛍光体からのスペクトルを同時に記録できるが、レーザー源に好適なフィルタを用いて、蛍光体1つにつき1回スキャンし、通常どおり各マイクロアレイを2回スキャンした。
【0126】
スキャンの感度は、cDNAコントロール種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。較正するcDNAのサンプルを、2つの蛍光体で別々に標識し、それぞれを等量、ハイブリダイゼーション混合液に添加した。マイクロアレイ上の特定の位置には相補的DNA配列を含め、その位置におけるシグナルの強度がハイブリダイズする種の重量比1:100,000に相関するようにした。
【0127】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI−835Hアナログ−ディジタル(AID)変換ボード(Analog Devices, Inc., Norwood MA)を用いてディジタル化した。ディジタル化したデータは、リニア20色変換を用いてシグナル強度が青色(低シグナル)から赤色(高シグナル)までの擬似カラー範囲にマッピングされるイメージとして表示した。データはまた、定量的に分析した。2つの異なる蛍光体を同時に励起して測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、先ずデータは蛍光体間の光学的漏話(重複発光スペクトルに起因する)に対して補正した。
【0128】
グリッドを蛍光シグナルイメージ上に重畳して、各スポットからのシグナルがグリッドの各エレメントに中央に位置するようにする。各エレメント内の蛍光シグナルを統合し、シグナルの平均強度に対応する数値を得る。シグナル分析に用いるソフトウエアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム(Incyte Pharmaceuticals)である。
【0129】
8 データ分析及び結果
アグロメラティブクラスター分析(agglomerative cluster analysis)を用いて、典型的な反応パターンを特定し、異なった遺伝子発現プロフィール間の関係を確立した。それぞれの遺伝子の測定は、まず発現の割合を各時点の最大値で除して標準化した。或る時点とその次の時点との変化を強調するために、連続する2つの時点の発現の差を取って発現ベクトルに傾斜を加えた。ユークリッド距離を、発現反応に対する類似性の基準として用いた。
【0130】
用いたアグロメラティブアルゴリズム(agglomerative algorithm)はデンドログラムを作成する。それぞれが1つの遺伝子を含むN個のクラスターで始まり、繰り返しの各ステップでは、最も近い2つのクラスターが1つの大きなクラスターにされた。クラスター間の距離は、それらの平均発現パターン間の距離と定義されている。N−1ステップの後を、全てのデータポイントがまとめられた。クラスター化プロセスにより階層ツリーが作成された。遺伝子は、一定距離によって分割された10行(ブランチレベル)のセットを有するそれぞれの遺伝子ブランチとルートとの間のツリーをカットして自動的にクラスターに割り当てられた。ブランチレベルのカットオフによりクラスターが形成された。ツリーは第1に標準化されるため、それぞれのブランチはルートから同じ距離である。最も近い遺伝子間の距離を保持するために、ツリーはリーフから最も遠いブランチで曲げられた。ツリーの各ブランチレベルで交差するブランチの数はそのレベルにおけるクラスターの数に等しい。
【0131】
ツリーをブランチレベル5で分割すると、遺伝子が、276の発現が変動した遺伝子及びスプライスバリアントを含む7つの遺伝子発現クラスターに分割される。表1における列4〜列10は、Ox−LDLに暴露しない遺伝子発現に対するOx−LDL暴露に反応した各時点の遺伝子発現のレベルを示す。差の調節は、それぞれの遺伝子に対して最大値を1として標準化した。白い部分は、特定の遺伝子における最大値に対して0〜25%の範囲でOx−LDLに反応した相対発現を示し、薄いグレーの部分は26〜50%の範囲であり、濃いグレーの部分は51〜75%の範囲であり、黒い部分は76〜100%の範囲である。
【0132】
9 相補的な核酸分子
本ポリヌクレオチドに相補的な分子またはその断片を用いて、遺伝子発現を検出したり、低下させたり、抑制することができる。約15〜約30個の塩基からなるオリゴヌクレオチドの使用について記載するが、それより小さい或いは大きい配列の断片、またはその誘導体(PNA)の場合でも同じ方法を用いることができる。オリゴヌクレオチドは、Oligo4.06ソフトウエア(National Biosciences)及びSEQ ID NO:1−278を用いて選択した。プロモーターの結合を阻害して転写を阻止するために、最も好ましくはオープンリーディングフレームの開始コドンの前の約10個のヌクレオチドである最もユニークな5’配列に結合するように相補的なヌクレオチドを設計する。翻訳を阻害するために、本哺乳動物ポリペプチドをコードするmRNAへのリボソームの結合を阻害するべく相補的なオリゴヌクレオチドを設計する。
【0133】
転写または翻訳を阻害するために作製したアンチセンス分子を用いるのに加えて、ゲノム配列(例えばエンハンサーやイントロン)或いはトランス作動性調節性遺伝子に対するアンチセンス分子を設計して遺伝子発現を変化させることができる。同様に、三重らせん塩基対形成として知られているHogeboom塩基対形成法を用いてアンチセンス阻害を行うことができる。三重らせんの塩基対形成に関与するアンチセンス分子は、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子と結合するために二本鎖の間を広げる二重らせんの能力を損なわせる。
【0134】
このようなアンチセンス分子を発現ベクターに導入して、好適な細胞または組織を形質転換する。これには、効果を検査するために細胞系への発現ベクターの導入、一過性或いは短期の治療のための器官、腫瘍、滑液キャビティ、または血管系への発現ベクターの導入、または長期或いは安定した遺伝子治療のための単細胞または他の生殖系への発現ベクターの導入が含まれる。一過性の発現は、ベクターの複製を伴わない場合には1ヶ月以上持続し、ベクターの複製を引き起こす好適なエレメントが形質転換/発現系に用いられている場合には3ヶ月以上持続する。
【0135】
アンチセンス分子をコードするベクターで好適な分裂細胞を安定的に形質転換することにより、遺伝子組換え細胞系、遺伝子組換え組織、または遺伝子組換え器官を作製することができる(米国特許第4,736,866号)。ベクターを取り込んで十分な量のベクターを複製するこれらの細胞により、安定した組み込みが可能となり、本ポリヌクレオチドの活性を弱める或いは完全に消失させる十分なアンチセンス分子を産生させることができる。
【0136】
10 ハイブリダイゼーション技術及び分析
火あぶり代ゼーション技術は、ポリマーコートしたスライドガラスやナイロン膜などの様々な基板を用いる。エレメントのポリマーコートスライドへの整列は、本実施例5に記載されており、ポリマーコートスライドを用いるプローブの調整、ハイブリダイゼーション、及び分析はそれぞれ、本実施例6及び7に示されている。
【0137】
ポリヌクレオチドを以下に示す方法で基板に固定する。ポリヌクレオチドの混合液をジェル電気泳動により分画後、毛細管輸送によってナイロン膜に移す。別法では、ポリヌクレオチドを個別にベクターに結合して、それを細菌宿主細胞に挿入してライブラリを形成する。次にポリヌクレオチドを以下の方法で基板に配列する。第1の方法では、個別のクローンを含む細菌細胞を機械的に摘み上げてナイロン膜に整列させる。このナイロン膜を、選択薬(用いるベクターによって異なるが、カルベンシリン、カナマイシン、アンピシリン、またはクロラムフェニコールなど)を含むLB寒天培地に載置し、37℃で16時間インキュベートする。この膜を寒天培地から取り除き、次にこの膜をコロニー側を上にして10%SDS、変性溶液(1. 5 M NaCl、0. 5 M NaOH)、中和液(1. 5 M NaCl、1 M Tris、pH 8. 0)に入れ、2×SSCにおいて10分間づつ2回インキュベートする。次にこの膜を、STRATALINKER UVクロスリンカー(Stratagene)でUV照射する。
【0138】
第2の方法では、インサートに隣接したベクター配列に相補的なプライマーを用いて、PCRを30サイクル行い細菌ベクターからポリヌクレオチドを増幅する。PCR増幅により、拡散の濃度を開始時の1〜2 ngから最終的に5μgまで増大させる。約400 bp〜約5000 bpの増幅した拡散をSEPHACRYL−400ビーズ(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製する。精製した拡散を、手動で或いはドット/スロットブロッティングマニフォールド及び吸入装置でナイロン膜に配列し、上記した変性、中和、及びUV照射によって固定する。
【0139】
本配列表のポリヌクレオチドに由来するハイブリダイゼーションプローブは、メンブレンハイブリダイゼーションにおいてcDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングするために用いられる。プローブを準備するために、ポリヌクレオチドを45μl TEバッファにおいて40〜50 ngの濃度に希釈し、100℃で5分間加熱して変性し、短時間遠心分離する。次に、変性したポリヌクレオチドをREDIPRIMEチューブ(Amersham Pharmacia Biotech)に加え、青色が十分に拡散するまで軽く混合し、短時間遠心分離する。5μlの[32P] dCTPをチューブに加え、その内容物を37℃で10分間インキュベートする。この標識化反応を5μlの0. 2M EDTAを加えてストップし、PROBEQUANT G−50マイクロカラム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いてプローブを組み込まれなかったヌクレオチドから精製する。精製したプローブを100℃で5分間加熱してから氷上で2分間冷却する。
【0140】
メンブレンを、1%Sarkosyl及び1×高リン酸バッファ(0. 5M NaCl、0.1 M Na2HPO4、5 mM EDTA、pH 7)を含むハイブリダイゼーション溶液において55℃で2時間プレハイブリダイゼーションする。15mlの新しいハイブリダイゼーション溶液に希釈したプローブをメンブレンに加える。55℃で16時間、メンブレンにプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを1mM Tris(pH 8. 0)、1%Sarkosylにおいて25℃で15分間洗浄し、1mM Tris(pH 8. 0)において25℃で15分間づつ4回洗浄する。ハイブリダイゼーション複合体を検出するために、XOMAT−ARフィルム(Eastman Kodak, Rochester NY)をメンブレンに−70℃で一晩暴露し、現像して目で確認する。
【0141】
11 コードされるタンパク質の発現
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現及び精製は、細菌若しくはウイルス系の発現系を用いて行うことができる。細菌で発現させるために、抗生物質耐性遺伝子とcDNAを高レベルで転写させる誘導性プロモーターとを含むベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターには、以下に限定するものではないが、lacオペレーター調節エレメントに関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp−lac(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれる。組み換えベクターを、例えばBL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導されると、抗生物質耐性細菌がこのタンパク質を発現する。真核細胞での発現は、Autographica californica核多面性ウイルス(AcMNPV)という組み換えバキュロウイスルスをSpodoptera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に感染させて行う。バキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子を、相同組み換え或いは転移プラスミド中間体が関係する細菌媒介遺伝子転移の何れかによって、本ポリヌクレオチドで置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモータによって高いレベルでポリヌクレオチドが転写される。
【0142】
精製を容易にするために、本タンパク質は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST; Amersham Pharmacia Biotech)またはFLAG等の別の代替物との融合タンパク質として合成する。融合タンパク質は、タンパク質活性及び抗原性が維持される条件下で、固定されたグルタチオン上で精製する。精製の後、GST部分がタンパク分解的にトロンビンで本タンパク質から切断される。8個のアミノ酸ペプチドであるFLAGとの融合タンパク質を、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体(Eastman Kodak, Rochester NY)を用いて精製する。
【0143】
12 特異的抗体の作製
逆相HPLC分離により75mgの変性ポリペプチドを得る。この変性タンパク質を用いて標準的なプロトコルに従ってマウスまたはウサギを免疫化する。マウスを免疫するには約100μg用い、ウサギを免疫するには1mg用いる。変性ポリペプチドを放射性ヨウ素標識し、マウスB細胞ハイブリドーマとインキュベートし、モノクローナル抗体をスクリーニングする。数千のクローンの標識及びスクリーニングには約20mgのポリペプチドで十分である。
【0144】
別の方法では、本発明のポリヌクレオチドから翻訳されたアミノ酸配列をPROTEANソフトウエア(DNASTAR)用いて分析し、免疫原性の高い領域を決定する。免疫化に最適な配列は、通常はC末端、N末端、本ポリペプチドが天然のコンフォメーションの場合に外部環境に曝され易い本ポリペプチドの親水性の介在領域である。一般に、約15残基の長さのオリゴペプチドを、Fmoc化学を用いてABI 431ペプチドシンセサイザー(PE Biosystems)で合成し、次にM−maleimidobenzoyl−N−hydroxysuccinimide esterとの反応によりキーホールリンペットヘモシアニン(KLH; Sigma Aldrich)に結合させる。必要であれば、ペプチドのN末端にシステインを導入してKLHとの結合を可能にすることもできる。ウサギを、このオリゴペプチド−KLH複合体を含む完全フロイントアジュバントで免疫化する。そのペプチドをプラスチックに結合させて、1% BSAでブロッキングし、得られたウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、放射線ヨウ素標識ヤギ抗ウサギIgGと反応させて、この抗血清の抗ペプチド活性を検査する。
【0145】
標準的な方法でハイブリドーマを作製してスクリーニングする。目的のハイブリドーマを放射線ヨウ素標識したポリペプチドでスクリーニングして検出し、本ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生する融合細胞を特定する。通常のプロトコルでは、96ウェルプレート(FAST, Becton−Dickinson, Palo Alto CA)のウェルを、アフィニティー精製した10mg/mlの特異的なウサギ−抗マウス(または好適な抗−種Ig)抗体でコーティングする。コーティングしたウェルを1% BSAでブロックし、洗浄し、ハイブリドーマの上清に暴露する。インキュベートした後、ウェルを1mg/mlの放射線ヨウ素標識したポリペプチドに暴露する。抗体を産生するクローンは、バックグラウンドを超えて検出可能な量の標識したポリペプチドに結合する。
【0146】
このようなクローンを、3ウェルに付き1細胞で2サイクルのクローニングを行って増殖させる。クローニングしたハイブリドーマをpristane処理したマウスに注入し、腹水を生じさせ、モノクローナル抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech)により腹水液から精製する。少なくとも108M−1、好ましくは109〜1010M−1、またはそれより強い親和性を有するモノクローナル抗体を当分野で周知の方法で作製する。
【0147】
13 特異的な抗体を用いる天然タンパク質の精製
天然或いは組換えのタンパク質を、このタンパク質に特異的な抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィーで実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、この抗体をCNBr−活性化SEPHAROSEレジン(Amersham Pharmacia Biotech)に共有結合させて作製する。このタンパク質を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、このタンパク質を優先的に吸着できるように、界面活性剤の存在下で高イオン強度バッファーでそのカラムを洗浄する。結合後、バッファー(pH 2〜3)或いは高濃度の尿素やチオシアネートイオンを用いてそのカラムからこのタンパク質を溶離させて抗体とこのタンパク質との結合を切断し、このタンパク質を回収する。
【0148】
14 特異的に結合する分子のスクリーニング
本ポリヌクレオチドやその断片を、32P−dCTP、Cy3−dCTP、Cy5−dCTP (Amersham Pharmacia Biotech)で標識したり、またはそのタンパク質やその一部をBIODIPYやFITC (Molecular Probes)でそれぞれ標識する。予め基板上に配列した複数の候補分子または化合物即ちライブラリを、標識したポリヌクレオチドまたはタンパク質の存在下でインキュベートする。ポリヌクレオチド或いはアミノ酸配列のための条件下でインキュベートした後、その基板を洗浄する。特異的な結合或いは複合体形成を示唆する標識が保持されている基板上の全ての部分によりリガンドを同定する。様々な濃度のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドで得られたデータを用いて、標識した核酸またはタンパク質と結合したリガンドとの間の親和性を求める。
【0149】
本明細書に記載した全ての特許及び刊行物に言及することを以って本明細書の一部とする。本発明の範囲及び概念から逸脱することなく本発明の方法及びシステムの種々の改変が可能であることは当業者には明らかであろう。特定の好適な実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には、本明細書に記載の本発明の実施例の様々な改変は、特許請求の範囲に含まれることが容易に理解できよう。
【0150】
(表の簡単な説明)
本明細書の開示の一部には、著作権が保護されるべき資料が含まれている。この著作権の所有権者は、特許庁のファイルや記録にある本発明の開示に関する明細書即ち発明の開示をファクシミリで複写することについての異議はないが、その他の場合は著作権を留保する。
【0151】
添付の配列表は、異なったcDNAのクローンインサート(単離物)をシークエンシングし、マイクロアレイ上のプローブとしてこれらのcDNAを用いてハイブリッド複合体を形成させ、それにより同定されたポリヌクレオチドを編集したものである。各配列は、配列識別番号(SEQ ID NO)及びインサイトID番号によって識別される。このインサイトID番号は、クローンインサートを含む遺伝子配列を表す。
【0152】
表1は、クラスター分析によって同定された泡沫細胞の発生に関連して発現が変動する遺伝子を示す。列1は、配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示し、列3は遺伝子アノテーションを示す。列4から列10は、標準化された遺伝子発現の変動を示し、列11は遺伝子が割り当てられたクラスターを示す。
【0153】
表2は、各配列の識別上方を示す。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示す。列3はUNIGEM V 2.0マイクロアレイ上のインサイトクローンのクローン番号を示す。列4及び列5は、列2に示された遺伝子配列に対するクローンインサート配列の開始及び終了部位を示し、添付の配列表に示されている。
【0154】
表3は、泡沫細胞発生の初期において発現が変動する遺伝子のリストである。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示し、列3は遺伝子アノテーションを示す。列4から列10は、各時点における発現値の変動を示す。列11及び列12はそれぞれ、時間経過による発現の上昇または低下の最大の変化を表す。列13は、時間経過における最大変化を示す。
【0155】
表4は、泡沫細胞分化時に発現が3倍以上変動した遺伝子のリストである。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示し、列3は遺伝子アノテーションを示す。列4から列10は各時点における発現値の変動を示す。列11及び列12はそれぞれ、時間経過による発現の上昇または低下の最大変化を表す。列13は、時間経過における最大の変化を示す。
【図面の簡単な説明】
【図1A】
各クラスターに含まれる遺伝子群の各時点における平均的な標準化された発現パターンのグラフを示す。クラスター1からクラスター4は、1日目、2日目、または4日目においてアップレギュレートされた遺伝子を含む。クラスター5及びクラスター6は、後半にダウンレギュレートされた遺伝子を含み、クラスター7は、8時間目にアップレギュレートされた遺伝子を含む。
【図1B】
各クラスターに含まれる遺伝子群の各時点における平均的な標準化された発現パターンのグラフを示す。クラスター1からクラスター4は、1日目、2日目、または4日目においてアップレギュレートされた遺伝子を含む。クラスター5及びクラスター6は、後半にダウンレギュレートされた遺伝子を含み、クラスター7は、8時間目にアップレギュレートされた遺伝子を含む。
【表1】 【表2】 【表3】 【表4】 【表5】 【表6】 【表7】 【表8】 【表9】 【表10】 【表11】 【表12】 【表13】 【表14】 【表15】 【表16】 【表17】 【表18】
(技術分野)
本発明は、ヒト泡沫細胞において発現が調節される遺伝子を検出するために用いられ得る複数のポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、アテローム性動脈硬化症に関連する病態、障害、及び疾患の診断にこれらのポリヌクレオチドを使用することに関する。
【0002】
(本発明の背景)
アテローム性動脈硬化症、及び関連する冠状動脈疾患及び脳卒中は、先進国において最も一般的な死因である。ある種の重要な危険因子が同定されているが、この複雑な疾患を引き起こす完全な分子機構及びこの疾患に対する医療は確立されていない。アテローム硬化性血管の病巣の成長及び退行の分子機構の解明には、成長、安定、溶解、破裂、閉塞性血管の血栓の発生を含む病変の特徴に関係する遺伝子の同定が必要である。
【0003】
アテローム性動脈硬化症の発生の初期段階では、「脂肪条痕」が形成される。コレステロールリッチの低密度リポタンパク(LDL)などのリポタンパクが、血管内膜の細胞外空間に蓄積され、化学修飾を受ける。LDLの酸化は、循環抗酸化物の防御効率が低い内皮下空間において最も活発に起こる。LDLの酸化の程度が、標的細胞との相互作用に影響を与える。「最少酸化」LDL(MM−LDL)はLDL受容体に結合することができるが、スカベンジャー受容体A型及びB型、CD36、CD68/macrosialin、及びLOX−1を含む同定された酸化LDL(OX−LDL)受容体すなわちスカベンジャー受容体には結合できない(Navabら (1994) Arterioscler Thromb Vasc Biol 16:831−842; Kodamaら (1990) Nature 343:531−535; Actonら (1994) J Biol Chem 269:21003−21009; Endemannら (1993) J Biol Chem 268:11811−11816; Ramprasadら (1996) Proc Natl Acad Sci 92:14833−14838; Kataokaら(1999) Circulation 99:3110−3117)。MM−LDLは、単球の接着及び浸透を増大させ、内皮細胞による単球走化タンパク質1(MCP−1:monocyte chemotactic protein 1)の放出を刺激し、マクロファージにおけるスカベンジャー受容体A(SRA)及びCD36の発現を誘導し得る(Cushingら (1990) Proc Natl Acad Sci 87:5134−5138; Yoshidaら (1998) Arterioscler Thromb Vasc Biol 18:794−802; Steinberg (1997) J Biol Chem 272:20963−20966)。SRA及び他のスカベンジャー受容体は、OX−LDLに結合し、リポタンパク質粒子の取り込みを促進させ得る。
【0004】
単核食細胞は内膜に進入して、マクロファージに分化し、OX−LDLを含む化学修飾を受けた脂質を摂取する。ほとんどの細胞型では、コレステロールの量は、LDL受容体及び生合成酵素のフィードバック調節によって厳密に調節されている(Brown及びGoldstein (1986) Science 232:34−47)。しかしながら、マクロファージでは、追加のスカベンジャー受容体によりコレステロールが無制限に取り込まれ(Brown及びGoldstein (1983) Annu Rev Biochem 52:223−261)、泡沫細胞表現型を産生する多数の細胞内脂質滴が蓄積される。コレステロールを貪食して死亡したマクロファージが、初期の「脂肪条痕」プラークの塊及び病変動脈の典型的な進行した病巣のほとんどに関与する。様々な研究から、種々の泡沫細胞応答が、アテローム性動脈硬化症の血管壁プラークの成長及び破裂に関与することが分かった。これらの応答には、隣接する細胞の増殖及び接着を促進する多数の成長因子及びサイトカインの産生、循環単球を成長中のプラーク内に引き寄せるケモカイン、細胞外マトリックスを再構築するタンパク質、血栓症を引き起こし得る組織因子の産生が含まれる(Ross (1993) Nature 362:801−809; Quinら(1987) Proc Natl Acad Sci 84:2995−2998)。従って、アテローム硬化性プラーク形成のほとんどの段階で大量に生じるコレステロールを多く含んだマクロファージが、アテローム硬化プロセスの開始及び最終的なプラークの破裂及び閉塞血栓に関係する。
【0005】
OX−LDLの取り込み中に、マクロファージはサイトカイン及び成長因子を産生する。これらのサイトカイン及び成長因子が、平滑筋細胞増殖などのアテローム発生及び細胞マトリックスの形成を調節する更なる細胞現象を引き起こす。更にこれらのマクロファージは、誘導性酸化窒素シンターゼを含む炎症に関与する遺伝子を活性化し得る。従って、泡沫細胞形成時に発現が変動する遺伝子が、アテローム硬化プロセスのマーカーとなると推測できる。
【0006】
本発明は、診断において複数のプローブ及び精製されたポリヌクレオチドをアテローム性動脈硬化症及び他の心血管疾患のマーカーとして用いるハイスループットのスクリーニング法を提供する。
【0007】
(発明の要約)
本発明は、添付の配列表に示されているSEQ ID NO:1−276から選択された、泡沫細胞発生において発現が変動する複数のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。一実施例では、各ポリヌクレオチドは、泡沫細胞形成の初期マーカーであって、アップレギュレートされたSEQ ID NO:1−55或いはダウンレギュレートされたSEQ ID NO:171−196の何れかである。第2の実施例では、各ポリヌクレオチドは3倍を超えてまたは3分の1未満に発現が変動する、アップレギュレートされたSEQ ID NO:47−67またはダウンレギュレートされたSEQ ID NO:194−213の何れかである。更に本発明は、これらのポリヌクレオチドの相補配列、並びにこれらのポリヌクレオチドを基板に固定することを含む。
【0008】
本発明は、サンプルにおける1或いは複数のポリヌクレオチドの発現の変化を検出するハイスループット法を提供する。この方法は、このポリヌクレオチド組成物をサンプルとハイブリダイズさせて、1或いは複数のハイブリダイゼーション複合体を形成し、ハイブリダイゼーション複合体を検出し、このハイブリダイゼーション複合体を標準のハイブリダイゼーション複合体と比較することを含み、ハイブリダイゼーション複合体の大きさ及び強度におけるそれぞれの差が、サンプルにおけるポリヌクレオチドの発現の変化を示唆するものである。サンプルはアテローム性動脈硬化症の患者から得ることができ、標準と比べることにより疾患の程度が初期、中期、或いは後期であるかを決定することができる。
【0009】
本発明はまた、分子または化合物のライブラリをスクリーニングしてリガンドを同定するためのハイスループット法を提供する。この方法は、本ポリヌクレオチド組成物を、特異的な結合が許容される条件化で、分子または化合物のライブラリと結合させるステップと、特異的な結合を検出してリガンドを同定するステップとを含む。分子または化合物のライブラリは、DNA分子、RNA分子、ペプチド核酸(PNA)、擬態、ペプチド、及びタンパク質から選択される。本発明は更に、リガンドを生成する方法を提供する。この方法は、本発明のポリヌクレオチドを、特異的な結合が許容される条件下でサンプルと結合させるステップと、結合したポリヌクレオチドを回収するステップと、本ポリヌクレオチドからリガンドを分離して、精製したリガンドを得るステップとを含む。
【0010】
本発明はまた、発現核酸配列或いはゲノム核酸配列のライブラリから伸長した或いは完全長の遺伝子を得る方法を提供する。この方法は、基板上に個々のライブラリ配列を整列するステップと、添付の配列表から選択されたポリヌクレオチドを、特異的な結合が許容される条件下で前記ライブラリ配列とハイブリダイズするステップと、このポリヌクレオチドと配列との間のハイブリダイゼーションを検出するステップと、ライブラリ配列を単離して伸長した或いは完全長の遺伝子を得るステップとを含む。
【0011】
本発明は更に、添付の配列表に示されているSEQ ID NO:35‐48、68‐80、192、193、214−224から選択された実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、この発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、タンパク質が発現される条件下でこの宿主細胞を培養するステップと、この培養した宿主細胞からこのタンパク質を回収するステップとを含むタンパク質の生産方法を提供する。
【0012】
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を提供する。本発明はまた、分子または化合物のライブラリをスクリーニングしてこのタンパク質と特異的に結合する少なくとも1つのリガンドを同定するためのハイスループット法を提供する。この方法は、特異的な結合が許容される条件下で、このタンパク質またはその一部を分子または化合物のライブラリと結合させるステップと、特異的な結合を検出してこのタンパク質と特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含む。分子または化合物のライブラリは、DNA分子、RNA分子、PNA、擬態、ペプチド、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体またはそれらの断片、免疫グロブリン、インヒビター、薬剤化合物、及び医薬品から選択される。本発明は更に、タンパク質を用いたリガンドの精製を提供する。この方法は、このタンパク質またはその一部を、特異的な結合が許容される条件下でサンプルと結合させるステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、リガンドからタンパク質を分離して精製されたリガンドを得るステップとを含む。本発明はまた、このタンパク質及び医薬用担体を含む医薬組成物、並びにこのタンパク質と特異的に結合する精製された抗体を提供する。
【0013】
(発明の詳細な説明)
本発明の核酸配列及び方法について説明する前に、本発明がここに開示した特定の装置、物質、及び方法に限定されるものではないことを理解されたい。特定の実施例を用いて説明を行うが、これらの実施例に類似した或いは同等の装置、方法、及び物質を用いて本発明を具現可能である。後述の好適な装置、方法、及び物質は、本発明の範囲を制限することを意図したものではなく、本発明は請求の範囲によってのみ限定される。
【0014】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その(この等)」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含む。全ての専門用語及び科学技術用語は、当業者が一般に理解している意味をもつ。本発明に関連する或いは開示した細胞系、ベクター、及び方法を説明するまたは開示する目的で言及した全ての刊行物を本明細書の一部とする。本明細書の如何なる部分も、そのような刊行物が先行発明という理由で本発明が先行していないと解釈すべきではない。
【0015】
(定義)
「増幅」は、ヌクレオチド配列のコピーを生成することを指し、当分野で周知のPCR法を用いて行われる。
【0016】
「相補的な」は、塩基対形成(例えば、5’‐A‐G‐T‐3’が3’‐T‐C‐A‐5’と塩基対を形成する)によりアニーリングする2つの一本鎖ヌクレオチド配列間の関係を指す。
【0017】
「E値(E−value)」は、偶然により2つの配列が一致する実質的な確率を指す。
【0018】
「誘導体」は、化学修飾を受けたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。化学修飾の例には、分子や配列の生物学的活性または寿命を維持或いは増大する、例えば、アセチル基、アシル基、アルキル基、アミノ基、ホルミル基、またはmorpholino基による水素の置換が含まれる。誘導体ポリヌクレオチドは、自然のポリペプチドの必須の生物学的特性(触媒ドメインや調節ドメインなど)を保持したポリペプチドをコードし得る。
【0019】
「断片」は、添付の配列表のポリヌクレオチドまたはその相補配列の少なくとも18個の連続するヌクレオチドを指す。「ユニークな断片」は、添付の配列表のポリヌクレオチドに即位的な特定のポリヌクレオチドまたは相補配列またはその相補配列の少なくとも18個の連続するヌクレオチドであって、ハイブリダイゼーション条件下でユニークな断片を含まない関連配列を検出しない。
【0020】
「ハイブリダイゼーション複合体」は、プリン塩基とピリミジン塩基との間の水素結合の形成による2つの核酸分子の複合体を指す。
【0021】
「相同性」は、基準配列とのポリヌクレオチドの少なくとも断片またはポリペプチドの一部との間の配列類似性を指す。
【0022】
「ハイブリダイゼーション複合体」は、プリンとピリミジンとの水素結合による2つのポリヌクレオチド間の複合体を指す。
【0023】
「免疫学的に活性」は、動物において抗体を産生する特定の免疫反応を引き起こす天然、組換え、または合成のポリペプチド、またはその一部の能力を指す。
【0024】
「リガンド」は、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の相補的な部位に特異的に結合するあらゆる分子、物質、または化合物を指す。このようなリガンドは、本発明のポリヌクレオチドまたはタンパク質の活性を安定化或いは調節し、核酸、タンパク質、炭水化物、脂肪、及び脂質を含む無機物質及び有機物質の少なくとも1つを含む。
【0025】
「マイクロアレイ」は、基板上のハイブリダイズ可能なエレメントの規則正しい整列を指す。エレメントは、基板1cm2当たり好ましくは複数のエレメント、より好ましくは100エレメント、更に好ましくは1,000エレメント、最も好ましくは10,000エレメントの複数のエレメントが存在するように整列される。エレメントの最大数に制限はないが、少なくとも100,000エレメントである。更に、各エレメントからのハイブリダイゼーションシグナルは個別に識別可能である。本実施例及び好適な実施例では、エレメントはポリヌクレオチドプローブを含む。
【0026】
「調節する」は、分子と本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの間の特的な結合から生じる活性(増減、性靴学的、化学的、または免疫学的な)或いは寿命のあらゆる変化を指す。
【0027】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、PCR法の「プライマー」または「アンプライマー(amplimer)」として或いはアレイエレメントとして用いられる少なくとも約15から多くても約60のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を指し、好ましくは約18〜30のヌクレオチドであり、最も好ましくは約20〜25のヌクレオチドである。
【0028】
「ペプチド核酸(PNA)」は、安定性を高めるためにヌクレオチド塩基が偽ペプチド骨格に結合したDNA類似物を指す。
【0029】
「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド配列、核酸分子、DNA分子、またはそれらの任意の断片や相補配列を指す。「ポリヌクレオチド」はまた、ゲノムまたはは合成起源、二本鎖または一本鎖、コード及び/または非コードのDNA或いはRNA、ゲノムDNA分子のエキソンまたはイントロン、または炭水化物、脂質、タンパク質、無機エレメントや物質に結合したものが可能である。
【0030】
「一部」は、添付の配列表のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくとも6個の連続するアミノ酸を指す。一部は、関連するタンパク質内の保存されたアミノ酸配列(例えば、触媒ドメインやキナーゼドメイン)であり得る。
【0031】
ポリペプチドの「翻訳後修飾」は、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、及び蛋白分解による切断などが含まれる。これらのプロセスは、合成的に或いは生化学的に起こり得る。生化学的な修飾は、細胞の位置、細胞型、pH、及び酵素的環境などにより様々である。
【0032】
「プローブ」は、サンプルまたは基板上の核酸分子とハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその断片である。プローブを用いて、従来の分子生物学の技術によりcDNA、内在性遺伝子、または転写mRNAの検出、増幅、定量を行うことができる。ここで用いられるプローブは、サザーン、ノーザン、in situ、ドットブロット、及びアレイなどの技術を含むハイブリダイゼーション反応のレポーター分子である。
【0033】
「タンパク質」は、ポリペプチドやオリゴペプチドを含むタンパク質またはその一部を指す。ポリペプチドの一部は一般に、未処置のタンパク質の生物学的または免疫学的特性を保持している。「オリゴペプチド」は、少なくとも約5個の残基、好ましくは10個の残基、最も好ましくは約15個の残基からなる免疫原性を有するアミノ酸配列であって、抗体を産生する融合タンパク質の一部として用いられる。
【0034】
「精製された」は、天然の状態で結合していた少なくとも1つの成分から単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体などを指す。
【0035】
「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体などを含むサンプルには、体液や、細胞が成長する培地または細胞調製の可溶性画分や、細胞から単離或いは抽出された染色体、細胞小器官、または膜や、溶液中に存在する或いは基板に結合されたゲノムDNA、RNA、またはcDNAや、組織、細胞、組織プリント、またはフィンガープリント、皮膚、髪などが含れ得る。
【0036】
「特異的な結合」または「特異的に結合する」は、2つの分子間の相互作用を指す。ポリヌクレオチドの場合、特異的な結合には、センス鎖とアンチセンス鎖との間の水素結合、複製または転写に影響を与える一本鎖とタンパク質との間の水素結合、DNA分子の主溝または副溝への分子または化合物の挿入、転写因子、エンハンサー、及びリプレッサー等として機能する少なくとも1つの分子との相互作用が含まれる。ポリペプチドの場合、特異的な結合には、上記したようなポリヌクレオチドとの相互作用、或いはアゴニスト、抗体、またはアンタゴニストなどの分子や化合物との相互作用が含まれる。特異的な結合は、分子間の好適な化学的相互作用または分子相互作用を許容する構造的特性の存在に左右される。
【0037】
「基板」は、分子または化合物が結合する任意の固体或いは半固体の支持物を指し、膜またはフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、毛細管または他のチューブ、プレート、ポリマー、微小粒子が含まれる。この基板は、孔または溝、ピン、チャネル、細孔を含む様々な表面形態を有する。
【0038】
(発明)
本発明は、マクロファージが泡沫細胞に分化する時にそのマクロファージにおいてそれぞれが発現が変動して発現される複数のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。この複数のポリヌクレオチドは、添付の配列表に示されている同定された配列、SEQ ID NO:1−276の少なくとも断片を含む。更に本発明は、泡沫細胞形成の初期に発現がアップレギュレートされたSEQ ID NO:1−55またはダウンレギュレートされたSEQ ID NO:171−196のポリヌクレオチドのサブセットを提供する。本発明はまた、泡沫細胞形成時にその発現が3倍を超えてアップレギュレートされたSEQ ID NO:47−67または3分の1未満にダウンレギュレートされたSEQ ID NO:194−213のポリヌクレオチドのサブセットを提供する。本発明はまた、泡沫細胞発生時にその発現がアップレギュレートされたSEQ ID NO:35−48及び68−80、またはダウンレギュレートされたSEQ ID NO:192、193、及び214−222の新規のポリヌクレオチドを提供する。
【0039】
ポリヌクレオチドを選択する方法
ヒトTHP−1細胞(American Type Culture Collection, Manassas VA)を24時間の間、12−0−テトラデカノイルホルボール13−アセテート(Research Biochemical International, Natick MA)と共に血清を含む培地で成長させて分化させた。次に細胞を、30分から4日の一定期間Ox−LDLの存在下または非存在下の何れかで培養した。Ox−LDLに0、0.5、2.5、8、24、48、及び96時間暴露した後、発現プロフィールを作成するために培養した細胞からポリ(A)RNAを調製した。実験的なコントロール細胞からのポリ(A)RNAは別の蛍光色素で標識し、UNIGEM V 2.0アレイ(Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA)上で時間が一致する対にハイブリダイズさせた。
【0040】
集団クラスター分析(agglomerative cluster analysis)を用いて、応答パターンを同定し、異なった遺伝子発現プロフィール間の関係を確立した。それぞれの遺伝子測定値は、発現値を各時間において最大値で除して標準化した。クラスター化プロセスにより、ツリーの各ブランチレベルにおいて交差するそのレベルにおけるクラスターの数に等しい数のブランチを有する階層ツリーが形成される。ブランチレベル5におけるツリーの分割により、遺伝子が、発現が変動して発現された276の遺伝子及びスプライスバリアント、即ちSEQ ID NO:1−276を含む7つの遺伝子発現クラスターに分割される。
【0041】
表1は、クラスター分析により同定された泡沫細胞発生に関連して発現が変動して発現された遺伝子及びスプライスバリアントを示す。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示し、列3は遺伝子アノテーションを示す。列4から列10は、標準化された発現の変化を示し、各遺伝子は最大値1.0を有する。背景に3種類の陰影を付けて、Ox−LDLに応答し相対的な発現を色分けした。特定の遺伝子の発現の最大値に対して白い部分は0〜25%の発現を示し、薄いグレーの部分は26〜50%の発現を示し、濃いグレーの部分は51〜75%の発現を示し、黒い部分は76〜100%の発現を示す。列11は、その遺伝子が割り当てられたクラスターを示す。
【0042】
図1は、各クラスターにおける全ての遺伝子についての各時点における平均的な標準化された発現パターンのグラフを示す。クラスター1からクラスター4は、1日目、2日目、または4日目の時点でアップレギュレートされた遺伝子を含む。クラスター5及びクラスター6は、後半になってダウンレギュレートされた遺伝子を含む。クラスター7は、8時間目でアップレギュレートされた遺伝子を含む。
【0043】
表2は、各配列番号に対する様々なIDを示す。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示す。列3はUNIGEM V 2.0マイクロアレイ上のインサイトクローンのクローン番号を示す。列4及び列5は、列2に識別番号が示された遺伝子配列におけるクローンインサート配列の開始部位及び終了部位を示す。
【0044】
表3は、泡沫細胞分化の初期において発現が変化した遺伝子のリストである。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示し、列3は遺伝子アノテーションを示す。列4から列10は各時間において異なる発現の値を示す。この値は、処理したサンプルを同じ時間の未処理のサンプルで除して得られる。列11及び列12は、時間経過においてアップレギュレートされた発現またはダウンレギュレートされた発現の最大変化を示す。列12は、時間経過における最大の差を示す。
【0045】
表4は、泡沫細胞分化時に、発現の変動が3倍以上の遺伝子のリストである。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示し、列3は遺伝子アノテーションを示す。列4から列10は、各時間において異なる発現の値を示す。この値は、処理したサンプルを同じ時間の未処理のサンプルで除して求める。列11及び列12はそれぞれ、経過時間においてアップレギュレートされた発現またはダウンレギュレートされた発現における最大の変化を示す。列12は、経過時間における最大の差を示す。
【0046】
本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、またはペプチド核酸などの任意のRNA様またはDNA様物質、分枝DNAなどが可能である。ポリヌクレオチドプローブは、センス鎖またはアンチセンス鎖が可能である。標的が2本鎖である場合、プローブはセンス鎖或いはアンチセンス鎖のいずれであっても良い。標的が1本鎖の場合は、プローブは相補的な一本鎖である。一実施例では、ポリヌクレオチドはcDNAである。別の実施例では、ポリヌクレオチドはプラスミドである。プラスミドの場合は、目的の配列はcDNAインサートである。
【0047】
ポリヌクレオチドは、当分野で周知の様々な合成または酵素的な方法で調製することができる。ポリヌクレオチドは、当分野で周知の化学的な方法を用いて全体或いは一部を合成することができる(Caruthers他 (1980) Nucleic Acids Symp. Ser. (7) 215−233)。別法では、ポリヌクレオチドは、in vitro或いはin vivo転写により酵素を用いて或いは組換えにより作製することができる。
【0048】
ヌクレオチド類似体を、当分野で周知の方法によりポリヌクレオチドプローブ内に導入することができる。ただし、プローブに組み込まれるヌクレオチド類似体は標的ヌクレオチドと塩基対を形成しなければならない。例えば、特定のグアニンヌクレオチドを、シトシン残基と塩基対を形成するヒポキサンチンで置換することができる。しかしながら、これらの塩基対はグアニンとシトシンとの間の塩基対より安定性が低い。別法では、アデニンヌクレオチドを、アデニンとチミジンとの間の塩基対よりも強い塩基対をチミジンと形成し得る2, 6−ジアミノプリンと置換することができる。更に、ポリヌクレオチドは、化学的或いは酵素的に誘導されたヌクレオチドを含み得る。典型的な化学修飾には、アシル基、アルキル基、アリル基、またはアミノ基での誘導体化が含まれる。
【0049】
ポリヌクレオチドは、基板上で合成することができる。基板表面での合成は、化学結合法及びBaldeschweilerら(PCT公開WO95/251116)により開示されているピエゾプリント装置(piezoelectric printing apparatus)を用いて行うことができる。別法では、ポリヌクレオチドは、Hellerら(米国特許第5,605,662号)に記載されているように試薬が加えられた時に制御する自己アドレス式電子デバイスを用いて基板表面で合成することができる。
【0050】
相補的DNA(cDNA)を基板上に整列して固定することができる。ポリヌクレオチドは、化学結合法またはUV照射などの共有結合法により固定することができる。このような或る方法では、エポキシドまたはアルデヒド基を含むように化学修飾を受けたガラス表面に結合させる。別法では、cDNAプローブをポリリジンコーティングされた表面に載せ、次にShalonら(W095/35505)に記載されているようにUV架橋する。別の方法では、電気的な方法(Heller他、前出)によりDNAを溶液から基板上の所定の位置に輸送する。或いは、ポリヌクレオチド、クローン、プラスミド、または細胞を、フィルター上に整列することができる。細胞を用いる場合は、細胞を溶解し、タンパク質及び細胞成分を分解し、そのDNAをUV架橋によりフィルターに結合させる。
【0051】
更に、ポリヌクレオチドは、基板に直接結合させるのではなく、リンカーなどを介して基板に結合させることができる。このようなリンカーは、典型的には約6個から50個の原子長であり、付着したプローブを露出させる。好適なリンカーには、エチレングリコールオリゴマー、ジアミン、2酸等が含まれる。基板表面上の反応基がリンカーの末端基と反応して、リンカーが基板に固定される。次に、リンカーの他方の末端がポリヌクレオチドに結合する。
【0052】
ポリヌクレオチドは、プローブ合成用の試薬を基板表面に連続的に分注して、或いは既製DNA断片を基板表面上に分注して基板に固定することができる。典型的なディスペンサーには、基板に対してマイクロピペットの位置を制御する機械装置を備えた基板に溶液を供給するマイクロピペットが含まれる。複数のディスペンサーを配置して反応領域に効率的に試薬を分注することが可能である。
【0053】
(ポリヌクレオチドの使用)
本発明のポリヌクレオチドを様々な目的に用いることが可能である。例えば、本発明の組成物をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイは、サンプルにおける関連ポリヌクレオチドを検出するため、分子や化合物のライブラリをスクリーニングしてリガンドを同定するため、及びアテローム性動脈硬化症などの特定の心血管疾患、またはその状態や障害の診断のためなどのハイスループット法に用いることができる。別法では、添付の配列表の所定の配列に相補的なポリヌクレオチドを用いて、そのポリヌクレオチドに関連する治療に有効な遺伝子を阻害または不活性化することができる。
【0054】
本発明の組成物をマイクロアレイのエレメントとして用いる場合、本ポリヌクレオチドエレメントは、各エレメントが基板上の指定の位置に配置されるように規則正しく整列する。エレメントが基板上の指定の位置にあるため、ユニークな発現プロフィールを形成するハイブリダイゼーションパターン及びその強度を、特定の遺伝子の発現レベルと見なすことができる。また、ハイブリダイゼーションパターン及びその強度は、特定の代謝プロセス、病態、障害、疾患、疾患のステージ、または治療に関連性を有し得る。
【0055】
ハイブリダイゼーション
本発明のポリヌクレオチド、またはその断片や相補配列を、様々なハイブリダイゼーション技術に用いることができる。本ポリヌクレオチドは、天然、組換え、化学的に合成されたものが可能であり、ゲノムまたはcDNA配列に基づいており、PCR法或いは酵素的な技術の何れかにより様々なレポーター分子を用いて標識することができる。このようなポリヌクレオチド即ちプローブの標識及び精製に市販のキットを用いることができる。放射標識(Amersham Pharmacia Biotech)、蛍光標識(Operon Technologies, Alameda CA)、及び化学発光標識(Promega, Madison WI)は当分野で周知である。別法では、ポリヌクレオチドを市販のベクターにクローニングして、プローブを転写によって生成する。プローブをT7またはSP6ポリメラーゼなどの好適なポリメラーゼ及び少なくとも1つの標識したヌクレオチドを加えて合成及び標識化する。
【0056】
プローブは、本ポリヌクレオチドの3’非翻訳領域などのユニークな領域或いは保存されたモチーフから設計するか或いはこれらに由来する。このようなプローブをプロトコルに用いて、同一のポリペプチド、アレル変異体、または関連分子をコードする天然の分子を同定することが可能である。プローブはDNAまたはRNAが可能であって、通常は1本鎖であり、本核酸配列の何れかと少なくとも50%の配列同一性を有しなければならない。プローブは、ポリヌクレオチドの少なくとも18個の連続するヌクレオチドを含む。このようなプローブは、同一の配列のみとの結合が許容されるハイブリダイゼーション条件下、または少なくとも1つのヌクレオチド置換または欠失を有する関連配列に結合する条件下で用いることができる。また関連配列は、変性プローブのプールを用いた好適なハイブリダイゼーション条件により発見することが可能である。一般に、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーションに用いるためのプローブは、約400から約4,000ヌクレオチドの長さである。このようなプローブは一本鎖或いは二本鎖であって、溶液を用いるハイブリダイゼーションまたは基板を用いるハイブリダイゼーションにおいて高い結合特異性を有し得る。プローブはまた、PCR法によりサンプルにおける本発明のポリヌクレオチドの検出に用いられるオリゴヌクレオチドであってもよい。
【0057】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー(厳密性)は、プローブのGC含量、塩濃度、及び温度によって決まる。具体的には、塩濃度を下げたり、ハイブリダイゼーションの温度を上げたりしてストリンジェンシーを高めることができる。あるメンブレンを用いるハイブリダイゼーション用の溶液にホルムアミドなどの有機溶媒を加えて、反応が低い温度で起こるようにすることができる。ハイブリダイゼーションは、バッファー(5×SSC、1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS))で、60℃で行うことができるが、核酸配列間に不適正塩基対を含む複合体が形成され得る。続く洗浄は、45℃(中程度のストリンジェンシー)或いは65℃〜68℃(高いストリンジェンシー)の何れかの温度で、0.2×SSC、0.1%SDSなどのバッファーで行う。高いストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーション複合体は、完全に相補的なポリヌクレオチド部分のみが安定して保持される。あるメンブレンを用いるハイブリダイゼーションにおいて、好ましくは35%、最も好ましくは50%のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に加えて、ハイブリダイゼーションを行う温度を下げることができる。また、SarkosylやTriton X−100(Sigma Aldrich, St. Louis MO)などの界面活性剤及び変性サケ精子DNAなどのブロッキング試薬を用いてバックグラウンドシグナルを減少させることが可能である。ハイブリダイゼーションの成分や条件の選択は当分野で周知であり、Ausubel(前出、pp 6. 11−6. 19,14.11−14.36, 及びA1−43)に記載されている。
【0058】
ドットブロット、スロットブロット、低密度及び高密度のアレイを準備して当分野で周知の方法を用いて分析する。約18個から約5,000個の連続するヌクレオチドから成るプローブすなわちアレイエレメントは、本発明により作製でき、アレイ技術に用いることができる。プローブすなわちアレイエレメントの好適な数は、少なくとも約40,000であり、より好適には少なくとも約18,000であり、更に好適には少なくとも約10,000であり、最も好適には少なくとも約600から約800の間である。アレイを用いて多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタリングして、遺伝的変異、突然変異、及びSNPを同定することが可能である。このような情報を用いて、遺伝子機能の決定、障害の遺伝子レベルの解明、障害の診断、障害の制御或いは治癒に用いられる治療薬の開発及びその活性のモニタリングを行うことができる(例えば、米国特許出願第5,474,796号、PCT出願WO 95/11995、PCT出願WO 95/35505、米国特許出願第5,605,662号、及び米国特許出願第5,958,342号を参照)。
【0059】
スクリーニングアッセイ
ポリヌクレオチドを用いて、複数の分子または化合物即ちライブラリをスクリーニングして、特異的な結合親和性を有するリガンドを同定することができる。リガンドは、DNA分子、RNA分子、PNA、ペプチド、転写因子などのタンパク質、エンハンサー、リプレッサー、及び生態系においてそのポリヌクレオチドの活性、複製、転写、または翻訳を調節するその他のタンパク質を含み得る。このアッセイは、特異的な結合が許容される条件下で、このポリヌクレオチドまたはその断片を分子または化合物と結合させ、その結合したポリヌクレオチドを検出して、そのポリヌクレオチドと特異的に結合する少なくとも1つのリガンドを同定することを含む。
【0060】
一実施例では、本発明のポリヌクレオチドを、単離され精製された分子または化合物のライブラリと共にインキュベートし、当分野で周知の方法、例えばゲル遅延アッセイ(gel−retardation assay)(米国特許第6,010,849号)または網状赤血球溶解転写アッセイ(reticulocyte lysate transcriptional assay)により結合活性を決定することが可能である。別の実施例では、本ポリヌクレオチドを生検及び/または培養した細胞や組織に由来する核抽出物と共にインキュベートしてもよい。本ポリヌクレオチドと核抽出物における分子または化合物との間の特異的な結合を、まずゲルシフトアッセイを用いて決定し、次にその分子または化合物に対する抗体を上昇させて確認することが可能である。これらの抗体をアッセイに加えると、これによりゲル遅延アッセイによるスーパーシフトが起こる。
【0061】
別の実施例では、本ポリヌクレオチドを用いて、当分野で周知のアフィニティークロマトグラフィー法で分子または化合物を精製することが可能である。一実施例では、本ポリヌクレオチドを、ポリマー樹脂またはゲル上で臭化シアン基と化学的に反応させる。次に、サンプルを流して本ポリヌクレオチドと反応すなわち結合させる。本ポリヌクレオチドと結合した分子または化合物を、培地を流す塩濃度を上昇させて本ポリヌクレオチドから遊離させて回収する。
【0062】
リガンドの精製
本ポリヌクレオチドまたはその断片を用いてサンプルからリガンドを精製することができる。哺乳動物ポリヌクレオチドまたはその断片を用いてリガンドを精製する方法は、このポリヌクレオチドまたはその断片を、特異的な結合が許容される条件下でサンプルと結合させて、結合したポリヌクレオチドを回収し、好適な試薬を用いてこのポリヌクレオチドを精製されたリガンドから単離することを含む。
【0063】
(タンパク質の生産及びその使用)
本明細書のポリヌクレオチドまたはそれらの完全長cDNAを用いて、ここに開示しAusubel(前出; pp.16.1−16.62)に記載されている組換えDNA技術により精製されたポリペプチドを生産することができる。これらの方法によりポリペプチドを生産する1つの利点は、本ポリペプチドを多量に含んだ源を得る能力であり、これにより精製が容易になる。本発明はまた、関係する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び/または両親媒性特性における類似性に基づいたアミノ酸の置換、欠失、または挿入を包含する。置換された残基が、元の残基に類似した構造的または化学的特性を有する場合(例えば、ロイシンのイソロイシンやバリンでの置換)はこのような置換は自然において保存されるが、置換された残基が極端に異なっている場合(例えば、グリシンをトリプトファンで置換)はそのような置換は保存されないであろう。LASERGENEソフトウエア(DNASTAR, Madison WI)、MACVECTORソフトウエア(Genetics Computer Group, Madison WI)、及びRasMolソフトウエア(www. umass. edu/microbio/rasmol)に含まれているコンピュータプログラムを用いて、、本ポリペプチドの特定の部分におけるアミノ酸残基を、生物学的または免疫学的活性を損なうことなく、どのようにまたは幾つ、置換、挿入、または欠失できるかを調べることが可能である。
【0064】
コードされるタンパク質の発現
特定のcDNAを、そのcDNAを好適なベクターにクローニングして、このベクターを好適な宿主細胞に導入して形質転換し、発現させることが可能である。ヒト及びラットcDNAライブラリの作製に用いられるクローニングベクターは、発現のためにも用いることが可能である。このようなベクターは通常、クローニング、プライミング、及び転写に有用なポリリンカー及びプロモーターを含む。典型的なベクターは、β−ガラクトシダーゼのプロモーター、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端メチオニン及びそれに続く7つのアミノ酸残基を含み得る。このベクターを好適な大腸菌の宿主系に導入し形質転換することができる。標準的な方法によるイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)での単離された細菌株の誘導により、N末端メチオニン、β−ガラクトシダーゼの始めの7つの残基、約15残基のリンカー、及びこのcDNAによってコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質が産生される。
【0065】
このcDNAを、特定の宿主においてタンパク質の発現に有用であるとして知られる他のベクターに導入してもよい。このcDNAの両端のストレッチにハイブリダイズするのに十分なDNAの断片及びクローニング部位を含むオリゴヌクレオチドを、標準的な方法で化学的に合成することが可能である。次に、これらのプライマーを用いて、PCR法により目的の断片を増幅することができる。標準的な条件下で、この断片を好適な制限酵素で消化して、電気泳動法で単離することができる。別法では、類似の断片を、好適な制限酵素でこのcDNAを消化し、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを繋いで作製することができる。2つ以上の遺伝子に由来するコード配列の断片を繋いで発現させることもできる。
【0066】
可溶性タンパク質の分泌を指令するシグナル配列は、組換え配列の構成成分として特に有用である。例えば、1或いは複数の追加の精製促進ドメインを含むキメラタンパク質を発現さセルことが可能である。このようなドメインは、限定するものではないが、固定された金属上での精製を可能にする金属キレートドメイン、固定された免疫グロブリン上での精製を可能とするプロテインAドメイン、FLAGS伸長/アフィニティ精製システム(Immunex, Seattle WA)に用いられるドメインが含まれる。このポリペプチドと精製ドメインとの間にENTEROKINASEMAX(Invitrogen, San Diego CA)などの切断可能なリンカー配列を挿入して、本ポリペプチドを回収することができる。
【0067】
好適な発現宿主には、限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びヒト293細胞などの哺乳動物細胞、Sf9細胞などの昆虫細胞、サッカロミセス‐セレビジエなどの酵母細胞、及び大腸菌などの細菌が含まれる。これらの各細胞系の場合、有用な発現ベクターは、複製の起点、及び細菌や形質移入された真核宿主の選択を可能とする1或いは2の選択マーカーを含み得る。真核発現宿主に用いられるベクターは、ポリヌクレオチドがポリ(A)を含まない場合は、3’ポリ(A)尾部を付加する必要がある。
【0068】
更に、ベクターは、遺伝子発現を増大させるプロモーターまたはエンハンサーを含み得る。ほとんどのプロモーターは宿主特異的であって、CHO細胞にはMMTV、SV40またはメタロチオネインプロモーター、細菌宿主にはtrp、lac、tacまたはT7プロモーター、酵母にはα因子、アルコールオキシダーゼ、またはPGHプロモーターを用いることができる。ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどのエンハンサーを有するアデノウイルスベクター、または長い末端リピート(LTR: long terminal repeat)プロモーターなどのプロモーターを有するレロウイルスベクターを用いて、哺乳動物細胞系においてタンパク質を発現させることができる。組換え細胞の均一な培養物が得られたら、分泌された多量の可溶性ポリペプチドを条件培地から回収して、当分野で周知のクロマトグラフィー法を用いて分析することができる。多量の分泌タンパク質の別の生産方法は、哺乳動物胚を形質転換して、遺伝子組換え動物、例えばウシ、ヤギ、またはヒツジなどによって分泌される母乳から組換えタンパク質を回収することを含む。
【0069】
組換えによる生産に加えて、ポリペプチドまたはその一部を固相技術を用いて生産することができる(Stewartら (1969) Solid−Phase Peptide Synthesis, WH Freeman, San Francisco CA; Merrifield (1963) J Am Chem Soc 5:2149−2154)。この場合、ABI 431Aペプチドシンセサイザー(PE Biosystems, Norwalk CT)などの装置を用いるか或いは手動で行うことができる。上記した任意の方法で生産されたポリペプチドを、低発現に関連する障害を治療するために医薬組成物として用いることが可能である。
【0070】
スクリーニングアッセイ
本ポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質またはその一部を用いて、複数の分子または化合物すなわちライブラリをスクリーニングして特異的な結合親和性を有するリガンドを同定したり、サンプルから分子または化合物を精製することができる。このようなスクリーニングに用いられる本ポリペプチドまたはその一部は、溶液中に遊離、或いは有機または無機基板に固定されている、または細胞内に局在化していても良い。例えば、組換え核酸分子で安定的に形質転換され、ポリペプチドを発現してその表面上にポリペプチドが存在する生存可能すなわち安定した原核宿主細胞を、スクリーニングアッセイに用いることができる。この細胞を複数のリガンドすなわちライブラリに対してスクリーニングし、発現ポリペプチドとリガンドとの間の特異的な結合即ち複合体の形成を測定することができる。このリガンドは、本ポリペプチドと特異的に結合するDNA、RNA、またはPNA分子、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、ペプチド、医薬品、タンパク質、薬剤、またはその他の試験分子または化合物を含み得る。典型的なアッセイは、本哺乳動物ポリペプチドまたはその一部を、特異的な結合が許容される条件下で分子または化合物と結合させて、結合したポリペプチドを検出し、本ポリペプチドと特異的に結合する少なくとも1つのリガンドを同定することを含む。
【0071】
本発明はまた、競合的薬剤スクリーニングアッセイの方法を提供する。このアッセイでは、本ポリペプチドと結合可能な中和抗体が、本ポリペプチド、そのオリゴペプチド、或いはその一部と結合可能な試験化合物と特異的に競合する。極めて微量のアッセイ量及び極めて微量の試験化合物を用いるハイスループットのスクリーニング方法が、米国特許第5,876,946号に開示されている。スクリーニングによって同定された分子または化合物を用いて、哺乳動物モデル系を作製して、それらの毒性、診断または治療の可能性を評価することができる。
【0072】
リガンドの精製
本ポリペプチドまたはその一部を用いてサンプルからリガンドを精製することができる。哺乳動物ポリペプチドまたはその一部を用いてリガンドを精製する方法は、本ポリペプチドまたはその一部を、特異的な結合が許容される条件下でサンプルと結合させて、結合したポリペプチドを回収し、好適なカオトロピック剤を用いて精製されたリガンドから本ポリペプチドを単離することを含む。
【0073】
(抗体の作製)
本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを用いて特異的な抗体を作製する。抗体は、固有の免疫活性を有する本ポリペプチドのオリゴペプチドまたはその一部を用いて作製することができる。抗体を作製する方法は、(1)本ポリペプチド、またはその一部やオリゴペプチドを動物(通常はヤギ、ウサギ、マウス)に注入して、抗体反応を起こさせるステップと、(2)モノクローナル抗体を作製するべくハイブリドーマを作製するステップと、(3)リンパ球集団におけるin vivo産生を誘導するステップと、(4)組換え免疫グロブリンのライブラリをスクリーニングするステップとを含む。組換え免疫グロブリンは、米国特許第4,816,567号に開示されているように作製することができる。
【0074】
本発明のポリペプチドを用いて作製した抗体は、本ポリペプチドの発現、量、または分布における異常によって特徴付けられる急性或いは慢性の疾患の診断並びに病状が現れる前の診断に有用である。本ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイまたは免疫放射線測定法のための様々なプロトコルが当分野で知られている。イムノアッセイは通常、ポリペプチドとそのポリペプチドに特異的に結合する分子または化合物との間の複合体の形成、及びその複合体の測定を含む。特定のポリペプチドにおける2つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを用いることもできる。
【0075】
イムノアッセイ法を用いて、様々な条件下で、特定の疾患の患者またはモデル動物系の培養細胞における本ポリペプチドの発現を定量することができる。イムノアッセイによりモニタリングされるポリペプチドの産生の増減は、発生経路、作り出した症状や疾患、または治療効果に関連する細胞活性の知見に役立ち得る。所定の組織における所定のポリペプチドの量は、生体サンプルの凍結融解界面活性剤抽出物のイムノアッセイを行い、結合曲線の傾斜を精製されたポリペプチドから作成した結合曲線と比較して決定することができる。
【0076】
アッセイのための分子の標識化
様々な標識化及び結合技術は当分野で周知であり、種々のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体のアレイやアッセイに用いることができる。標識した分子の合成は、32P−dCTP、Cy3−dCTP、またはCy5−dCTPなどの標識したヌクレオチドや35S‐メチオニンなどのアミノ酸を組み込むためのAmersham Pharmacia BiotechキットまたはPromegaを用いて行うことができる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体を、BIODIPYまたはFITC(Molecular Probes, Eugene OR)などの試薬を用いて分子中に存在するアミン、チオール、または他の基に化学的に結合させることで、レポーター分子で直接標識することができる。
【0077】
アッセイのために本ポリペプチド及び抗体を、検出シグナルを提供するレポーター分子と共有結合または非共有結合により結合して標識化することが可能である。様々な標識及び結合技術が知られており、限定するものではないが米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437号、同第4,275,149号、及び同第4,366,241号を含む特許文献及び科学技術文献に記載されている。
【0078】
(診断)
本ポリヌクレオチドまたはその断片を用いて、遺伝子発現の変化、mRNAの存在、非存在、または過剰な発現を検出して測定したり、治療中のmRNAのレベルをモニタリングすることが可能である。発現の変化に関連する症状、疾患、または障害には、アテローム性動脈硬化症及びそれに関連する合併症が含まれる。これらのポリヌクレオチドを、上記した疾患及び他の心血管疾患、症状、及び障害に対する治療効果のマーカーとして、数日から数ヶ月の範囲に亘って用いることができる。診断アッセイにハイブリダイゼーションまたは増幅技術を用いて、患者からの生体サンプルの遺伝子発現レベルを標準的なサンプルの値と比較して、遺伝子発現の変化を検出する。質的または量的なこのような比較法は当分野で周知である。
【0079】
例えば、本ポリヌクレオチドを標準的な方法で標識して、これをハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者からの生体サンプルに加える。インキュベーションした後、このサンプルを洗浄し、ハイブリダイゼーション複合体に関連する標識(またはシグナル)の量を定量して標準値と比較する。患者のサンプルにおける標識の量が標準値と著しく異なっている場合は、関連する症状や疾患、または障害の存在が示唆される。
【0080】
遺伝子発現に関連する症状や疾患、または障害の診断基準を設けるために、正常即ち標準的な発現プロフィールを確立する。この発現プロフィールは、正常な動物或いはヒトから採取した生体サンプルを、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下でプローブと結合させることによって作成することができる。標準的なハイブリダイゼーションの量は、正常な患者から得た値と、実質的に精製された標的配列を所定量用いた実験値とを比較することによって求めることができる。このように求めた標準値を、特定の症状や疾患、または障害を示す患者のサンプルから得た値と比較することができる。標準値と特定の症状に関連する値との偏差からその症状を診断する。
【0081】
またこのようなアッセイを用いて、動物実験や臨床検査における特定の治療計画の効果を評価したり、個々の患者の治療をモニタリングすることができる。症状が確認されたら治療プロトコルを開始し、定期的に診断アッセイを繰り返して、患者の発現レベルが正常な被験者の値に近づき始めたかを調べることができる。連続して行ったアッセイの結果から、数日から数ヶ月に亘る期間の治療効果を推定することができる。
【0082】
遺伝子発現プロフィール
遺伝子発現プロフィールは、複数のポリヌクレオチド及び複数の検出可能なハイブリダイゼーション複合体を含む。それぞれの複合体は、1或いは複数のプローブとサンプルの1或いは複数の相補的な配列とのハイブリダイゼーションによって形成される。本発明のポリヌクレオチド組成物をマイクロアレイのエレメントとして用いて、遺伝子発現プロフィールを分析することができる。一実施例では、マイクロアレイを用いて疾患の進行をモニタリングすることができる。研究者は、正常な組織や細胞と病変した組織や細胞の遺伝子発現の差異を検査して記録することができる。遺伝子発現パターンの変化を分析することで、患者に症状が出る前の初期段階で疾患を診断することができる。本発明を用いて医学的な見通しをたて、治療計画を作成することができる。本発明はまた、治療の効果をモニタリングすることもできる。副作用が分かっている治療の場合には、マイクロアレイを用いて治療計画を改善することができる。治療の成功を示す遺伝子発現パターンの変化をもたらす服用量を確立する。望ましくない副作用の発生に関連する発現パターンを回避する。この方法は、患者の改善が不十分であることが分かるまで、或いは副作用が明らかになるまで治療計画を変えない従来の方法よりも高感度で迅速である。
【0083】
別の実施例では、ヒトの疾患を模した動物モデルを用いて、特定の症状、その症状の障害または疾患または治療、障害または疾患に関連する発現プロフィールを特徴づけることができる。新規の治療計画をこれらの動物モデルにおいて、一定期間における発現プロフィールを確立してそれに従うためにマイクロアレイを用いて検査することができる。更に、マイクロアレイを動物モデルから採取した培養細胞または組織に用いて、多数の候補薬剤分子を迅速にスクリーニングして、治療薬と類似の発現プロフィールを有する分子は類似の治療効果があるという期待の下で、既知の治療薬に類似した発現プロフィールを生成する分子を探した。従って、本発明は、分子レベルの薬剤の作用を迅速に決定する方法を提供する。
【0084】
抗体を用いるアッセイ
本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質のエピトープに対する抗体を、特定のヒト細胞に存在するタンパク質の量を定量するアッセイに用いることができる。このようなアッセイには、抗体及び標識を用いて、正常な状態または疾患状態における発現レベルを検出する方法が含まれる。抗体を、改変して或いは改変しないで、標識部分と共有結合または非共有結合による結合で標識して、用いることができる。
【0085】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いてタンパク質の発現を検出及び測定するためのプロトコルは当分野で周知である。例えば、ELISA、RIA、及びFACS(fluorescent activated cell sorting)が含まれる。このようなイムノアッセイは通常、タンパク質とそのタンパク質に特異的な抗体との間の複合体の形成、及びそのような複合体の測定を含む。これらのアッセイ及び他のアッセイがPound (supra)に記載されている。この方法は、2つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位モノクローナル系イムノアッセイ、または競合的結合アッセイを用い得る(例えば、Coliganら (1997) Current Protocols in Immunology. Wiley−Interscience, New York NY; Pound, 前出、を参照)
(治療)
本発明のポリヌクレオチド及びその断片を用いて遺伝子治療を行うことができる。本発明のポリヌクレオチドを単核食細胞などの標的組織に送達することができる。本ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現させて、内因性標的タンパク質の減少または喪失に関連する疾患状態を治療することができる。ポリヌクレオチドをin vitroの特定の細胞に送達し得る。形質転換細胞をin vivoの様々な組織に輸送する。或いは、ポリヌクレオチドをin vivoに輸送することもできる。ポリヌクレオチドを、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、及び細菌プラスミドなどのベクターを用いて細胞や組織に輸送する。ウイルスを用いない遺伝子輸送方法には、陽イオンリポソーム、ポリリジン結合、人工ウイルスエンベロープ、及びDNAの直接注入が含まれる(Anderson (1998) Nature 392: 25−30; Dachsら (1997) Oncol Res 9: 313−325; Chuら (1998) J Mol Med 76 (3−4): 184−192; Augustら (1997) Gene Therapy (Advances in Pharmacology, Vol. 40), Academic Press, San Diego CA)。
【0086】
更に、特定のタンパク質の発現は、そのタンパク質をコードする若しくはその発現を誘導する核酸配列にアンチセンスポリヌクレオチド配列を特異的に結合させて調節することができる。このアンチセンスポリヌクレオチドには、DNA、RNA、または核酸の擬態や類似体が可能である。核酸配列には、細胞mRNA及び/またはゲノムDNAが可能であり、アンチセンス配列の結合により、翻訳及び/または転写のそれぞれが影響を受け得る。アンチセンス配列を、上記したようなウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを用いて細胞内に送達することができる(Weissら (1999) Cell Mol Life Sci 55 (3): 334−358; Agrawal (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totowa NJ)。
【0087】
ポリヌクレオチド及びアンチセンス配列は何れも、ABI核酸シンセサイザーまたは当分野で周知の他の自動化装置の任意のものを用いてex vivoで作製することができる。ポリヌクレオチド及びアンチセンス配列はまた、好適な宿主細胞を目的の配列を含む発現ベクターで形質転換して生物学的に生産することもできる。
【0088】
本発明のポリヌクレオチドの発現またはコードされたタンパク質の活性を調節する分子は、免疫応答に関連する症状及び疾患の治療に有用である。このような分子には、本ポリヌクレオチドまたはコードされたタンパク質の活性または発現のそれぞれを増大させるアゴニスト、または本ポリヌクレオチドまたはコードされたタンパク質の活性または発現のそれぞれを低下させるアンタゴニストが含まれる。一実施態様では、このタンパク質に特異的に結合する抗体を、直接抗体として用いて或いはこのタンパク質を発現する細胞や組織に薬剤を送達するための標的すなわち送達機構として間接的に用いることができる。
【0089】
更に、このタンパク質、そのリガンド、または相補的な核酸配列を、他の好適な薬剤と共に投与することが可能である。組み合わせ治療に用いられる好適な薬剤の選択は、従来の製薬原理に従って当分野の通常の技術を有する者が行うことができる。治療薬を併用することにより、免疫応答に関連する症状や障害の治療または予防に相乗効果が生まれ得る。この方法を用いることにより、各薬剤の服用量を少なくしてなお治療効果を達成し、しかも潜在的な副作用を低下させることが可能である。更に、治療薬を、活性な化合物を医薬的に使用できる製剤にするプロセスを促進する賦形剤及び添加剤を含む医薬的に許容される担体と組み合わせることもできる。調剤及び投与についての詳細な技術については、最新版のRemington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co., Easton PA)に記載されている。
【0090】
(モデル系)
動物モデルを用いて、ヒトの暴露に相当する暴露条件にして、動物モデルがヒトに類似の表現型反応を示すバイオアッセイを行うことができる。哺乳動物が最も一般的な動物モデルである。大抵の感染症、癌、薬剤、及び毒物の研究には、ラットやマウスなどの齧歯類が用いられる。これは、低コスト、入手の容易性、寿命、生殖能、及び参考文献の豊富さからである。齧歯類近交系及び非近交系は、目的の遺伝子の過剰或いは過少な発現の生理学的な原因を調査するのに有用なモデルであり、疾患の診断及び治療方法の開発にも有用である。特定の遺伝子を大量に発現する(例えば、乳汁中に分泌される)同系哺乳動物は、その遺伝子によって発現されるタンパク質の便利な供給源となり得る。
【0091】
遺伝子組換え動物モデル
目的の遺伝子を過剰或いは過少に発現する遺伝子組換え齧歯類を同系交配し、それを用いてヒト疾患モデルを作製したり、治療薬検査や毒物検査を行う(例えば、米国特許第5,175,383号、及び同第5,767,337号を参照)。場合によっては、導入遺伝子が、胚発生中若しくは出生後の特定の時期に特定の種類の組織で活性化され得る。導入遺伝子の発現は、実験的薬剤治療を施す前、その最中、またはその後の、遺伝子組換え動物における表現型、組織特異的なmRNAの発現、または血清や組織のタンパク質レベルの分析からモニタリングすることができる。
【0092】
胚性幹細胞
齧歯類胚から単離された胚性幹細胞(ES細胞)は、胚組織を形成する可能性を維持している。ES細胞がキャリアとなる胚の中に導入されると、正常な発生が再開され、生まれる動物の組織の一部を担うことになる。ES細胞は、実験用のノックアウト及びノックイン齧歯類系を作製するのに好適な細胞である。マウス129/SvJ細胞株などのマウスES細胞は、マウスの初期胚から採取されてから当分野で周知の培養条件下で増殖されたものである。遺伝子組換え系の作製に用いるベクターは、疾患候補遺伝子及びマーカー遺伝子配列を含み、このマーカー遺伝子により導入された疾患遺伝子の存在を確認することができる。このベクターを、当分野で周知の方法でES細胞に形質転換し、この形質転換されたES細胞を特定し、C57BL/6マウス株などからのマウス細胞胚盤胞内に微量注入する。この胚盤胞を複数の偽妊娠メスに外科的に導入して、生まれてくるキメラ子孫のそれぞれがその遺伝子型を有するようにして、それらを交配してヘテロ接合系またはホモ接合系を作り出す。
【0093】
ヒト胚盤胞に由来するES細胞を、in vitroで操作して8個の異なった細胞系譜に分化することが可能である。これらの細胞系譜を用いて、in vitroで様々な細胞型及び組織の分化を研究する。細胞型には、神経細胞、造血系、及び心筋細胞に分化する内胚葉、中胚葉、及び外胚葉細胞型が含まれる。
【0094】
ノックアウト分析
遺伝子ノックアウト分析では、遺伝子のある領域を、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの非天然介在配列を含むように酵素によって改変する(neo ; Capecchi (1989) Science 244:1288−1292)。改変された遺伝子を培養ES細胞に形質転換し、相同組換えにより内在性のゲノムに組み込むる。挿入された配列が、内在性遺伝子の転写及び翻訳を阻害する。この形質転換細胞を齧歯類胞胚に注入し、この胞胚を偽妊娠メスに移植する。この遺伝子組換え子孫をクロス交配して、この哺乳動物遺伝子の機能的な複製物が存在しないホモ接合近交系を作り出す。
【0095】
ノックイン分析
ES細胞を用いてノックインヒト化動物(ブタ)または遺伝子組換えヒト疾患動物モデル(マウスまたはラット)を作り出すことができる。ノックイン技術を用いて、ヒト遺伝子のある領域を動物ES細胞に注入し、そのヒト配列が動物細胞のゲノムの中に組み込まれるようにする。形質転換細胞を胞胚に注入し、この胞胚を上記したように移植する。類似のヒトの症状の治療についての情報を収集するべく、遺伝子組換え子孫即ち近交系を有望な医薬品で処置して観察する。これらの方法を用いて、幾つかのヒト疾患モデルを作り出す。
【0096】
本明細書の配列表に示されているポリヌクレオチド及びそれらによりコードされるポリペプチドの前記したように用いたが、これは既知の技術の例であり、このように既知の技術に適用したからといって当業者に既知の任意の技術に限定されるものではない。更に、本明細書に示されているポリヌクレオチドを、開発途中の分子生物学技術に用いることが可能である。ただし、その新規の技術が、当業者には現在、例えばトリプレット遺伝子コード、及び特定の塩基対相互作用として知られるヌクレオチド配列の特性に依存する場合である。同様に、言及した方法は、当業者には周知の完全長のcDNA配列を得る或いは構築するための2つ以上の方法を組み合わせることを含み得る。
【0097】
記載した特定の方法、プロトコル、及び試薬等は変更することもあり得、本発明はこれらに限定されるものではないことを理解されたい。本明細書に用いた専門用語は、記載した特定の実施例を記載することのみが目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲は、前記した請求の範囲によってのみ限定されるものでる。また、以下に記載の実施例は、本発明を例示するためのものであって本発明を限定することを目的としたものではない。
【0098】
【実施例】
1 cDNA ライブラリの作製
RNAは、Clontech Laboratories社(Palo Alto CA)から購入したものと様々な組織から単離したものとがある。ある組織をグアニジニウムイソチオシアネート溶液においてホモジナイズして溶解する一方、別の組織を、フェノールにおいて、或いはTRIZOL試薬(Life Technologies)などの変性剤の好適な混合液においてホモジナイズして溶解した。この溶解物を塩化セシウムにおいて遠心分離するか、或いはクロロホルムで抽出した。RNAは、イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムとエタノールの何れかで、或いは別の一般的な方法で沈殿させた。
【0099】
RNAの純度を高めるためにRNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。殆どの場合、RNAはDNA分解酵素で処理した。殆どのライブラリの場合、ポリ(A)RNAは、オリゴd(T)結合常磁性粒子(oligo d (T)−coupled paramagnetic particles)(Promega)、OLIGOTEXラテックス粒子(QIAGEN. Valencia CA)、またはOLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いて単離した。別法では、POLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)などの別のRNA単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。
【0100】
ある場合には、Stratagene社(La Jolla, CA)にRNAを提供し、Stratagene社が対応するcDNAライブラリを作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)またはSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)を用いて、当分野で周知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成してcDNAライブラリを作製した。(Ausubel, 前出,ユニット5.1−6.6)。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始させた。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに結合させてから、好適な1或いは複数の制限酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリでは、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2B、SEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ)、またはアガロースゲル電気泳動法によってcDNAの大きさ(300〜1000bp)を選択した。PBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)、pSPORT1プラスミド(Life Technologies)、またはpINCYプラスミド(Incyte Pharmaceuticals)などのポリリンカーの適合性制限酵素部位にcDNAを結合させた。この組換えプラスミドを、Stratagene社のXL1−Blue, XL1−BIueMRF、SOLRコンピテント大腸菌細胞、またはLife Technologies社のDH5α、DH10B、またはELECTROMAX DH10Bコンピテント大腸菌細胞に導入し形質転換した。
【0101】
或る場合には、ライブラリを、Vieira ら (1987, Methods Enzymol. 153: 3−11)の方法に従って5×過剰のヘルパーファージM13K07で重感染させ、Soares (1994, Proc Natl Acad Sci 91:9228−9232)、Swaroop 他 (1991, Nucl Acids Res 19: 1954)、及びBonaldo 他 (1996, Genome Research 6: 791− 806)による方法を利用して、標準化即ちサブトラクトした。Soaresの標準化方法を変更して、高度に発現される豊富なcDNAの反復クローニングを減らす一方、ライブラリの全配列の複雑さは維持した。この変更の中には、遺伝子発見率を上げるためにハイブリダイゼーション時間を極めて長くすることによる、標準的な転写イメージでは現われにくい発現頻度が低く存在量が少ないcDNAに対して比重をおいたライブラリの標準化が含まれる(Soares 他, 前出)。
【0102】
2 cDNA クローンの単離及びシークエンシング
プラスミドは、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)或いは細胞溶解を利用したin vivo切除によって宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム(Promega)、AGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, Gaithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plus、QIAWELL 8 Plus Plasmid、またはQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、またはREAL Prep 96プラスミドキットの内の1つを用いた。沈殿させた後、0.1 mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで4℃で保管した。
【0103】
別法では、ハイスループットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1−14)。宿主細胞の溶解及び熱サイクリングステップは、1つの反応混合液で行った。サンプルを処理してから384−ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度を、PICOGREEN色素(Molecular Probes)及びFluoroskan II蛍光スキャナ(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した。
【0104】
cDNAシークエンシング反応は、HYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific, Sunnyvale CA)またはMICROLAB 2200システム(Hamilton, Reno NV)と共にABI CATALYST 800サーマルサイクラー(PE Biosystems)またはDNA ENGINEサーマルサイクラー(MJ Research, Watertown MA)などのハイスループットの装置または標準的な方法を用いて行った。cDNAシークエンシング反応液は、Amersham Pharmacia Biotechによる試薬またはABI PRISM BIGDYE サイクルシークエンシングキット(PE Biosystems)などのABIシークエンシングキットに含まれている試薬を用いて準備した。cDNAシークエンシング反応混合物の電気泳動による分離及び標識したポリヌクレオチドの検出は、MEGABACE 1000 DNA シークエンシングシステム(Amersham Pharmacia Biotech)、標準的なABIプロトコル及び塩基呼出しソフトウエア(base calling software)を用いるABI PRISM 373 or 377シークエンシングシステム(PE Biosystems)、または当分野で周知の他の配列分析システムを用いて行った。cDNA配列内の読み枠は、標準的な方法(Ausubel, 前出, Unit 7 を参照)を用いて特定した。
【0105】
3 cDNA 配列の伸長
核酸配列配列は、インサイトcDNAクローン及びオリゴヌクレオチドプライマーを用いて伸長した。一方のプライマーは既知の断片の5’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の3’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、OLIGO 4.06ソフトウエア(National Biosciences)或いは他の適切なプログラムを用いて、約22個から約30個のヌクレオチドの長さで約50%以上のGC含量を有し、かつ約68〜72℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じないようにヌクレオチドを伸長した。
【0106】
選択されたヒトcDNAライブラリを用いてこの配列を伸長した。2段階以上の伸長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組を設計する。大きなcDNAを含むようにサイズが選択されたライブラリが好ましい。遺伝子の5’及び上流領域を有する配列をより多く含むため、ランダムプライムされたライブラリが好ましい。ランダムプライムされたライブラリは、オリゴd(T)ライブラリから完全長cDNAを得られない場合に特に有用である。
【0107】
当分野で既知の方法を利用したPCR法で高い忠実度で増幅した。PCRはDNA ENGINEサーマルサイクラー(MJ Research)用いて96ウェルブロックプレートで行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg2 +と(NH4)2SO4とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI B(Incyte Pharmaceuticals)に対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 60℃で1分間
ステップ4 68℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す
ステップ6 68℃で5分間
ステップ7 4℃で保管
別法では、プライマーの組、T7とSK+(Stratagene)に対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 57℃で1分間
ステップ4 68℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す
ステップ6 68℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
【0108】
各ウェルのDNA濃度は、100μlのPICOGREEN試薬(1×TEにおける0.25%の試薬 (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes) 及び0.5μlの希釈していないPCR産物を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分注してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをFluoroskan II (Labsystems Oy)でスキャンして、サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量する。反応混合物の5〜10μlのアリコットを1%のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を伸長することに成功したかを決定する。
【0109】
伸長した核酸を脱塩及び濃縮してから384ウェルプレートに移し、CviJIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison WI)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する前に超音波処理即ちせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化した核酸を低濃度(0.6〜0.8%)のアガロースゲル上に分離して断片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs, Beverly MA)を用いて伸長したクローンをpUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部位のオーバーハングを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質転換細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートにおいて37℃で一晩培養した。
【0110】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 60℃で1分間
ステップ4 72℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を29回繰り返す
ステップ6 72℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNA回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを20%のジメチルサルホサイド(dimethysulphoxide)(1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC DIRECTサイクルシークエンシングキット(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator サイクルシークエンシングキット(PE Biosystems)を用いてシークエンシングした。
【0111】
4 配列の構築及び分析
クロマトグラムからの構成成分ヌクレオチドを、PHRED分析(Phil’s Revised Editing Program; Phil Green, University of Washington, Seattle WA)を用いて分析し、質のスコアを付与した。少なくとも必要な質スコアを有する配列を、様々なプリプロセシングアルゴリズムを用いて、質の低い3’末端、ベクター及びインカー配列、ポリA尾部、Aluリピート、ミトコンドリア及びリボソーム配列、細菌汚染配列、及び50塩基対よりも小さい配列を排除した。
【0112】
配列は、SWISS−PROT及びPROSITEデータベース(Bairochら (1997) Nucleic Acids Res. 25: 217−221; Attwoodら (1997) J. Chem. Inf. Comput. Sci. 37: 417−424)に含まれている配列情報に基づいたモチーフ分析プログラムであるBLOCK 2プログラム(Incyte Pharmaceuticals)を用いてスクリーニングした。
【0113】
1つの配列を1つのビンに割り当てるアセンブリ方法で、プロセシングした配列を分類した。各ビンにおける複数の配列を用いて、コンセンサス配列すなわちテンプレートをアセンブルした。その後の新しい配列は、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST; Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36:290−300; Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403−410; Karlinら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 841−845)、BLASTn (v. 1.4, WashU)、及びCROSSMATCH ソフトウエア (Phil Green, 前出)を用いて既存のビンに加えた。質スコアが150以上の候補の対を全てBLASTヒットとした。局所同一性が82%以上のアラインメントはビンに含めた。各ビンの構成成分配列は、PHRAP (Phil’s Revised Alignment Program; Phil Green, 前出)を用いてアセンブルした。いくつかの重複する構成成分配列を有するビンは、DEEP PHRAP(Phil Green, supra)を用いてアセンブルした。
【0114】
各ビンを互いに比較して、82%以上の局所類似性を有するビンを組み合わせて再アセンブルした。重複が不十分(局所同一性が95%未満)なテンプレートを有する再アセンブルしたビンを再び分割した。アセンブルしたテンプレートを、STITCHER/EXON MAPPERアルゴリズムにより分析した。この分析により、スプライスバリアント、選択的にスプライシングされたエキソン、及びスプライス部位の存在、並びに組織の種類及び疾患の状態などにおける選択的にスプライシングされた遺伝子の発現の変動の存在の可能性を調べることができる。これらの得られたビンを上記したアセンブリ方法で数回アセンブルし、LIFESEQ GOLDデータベース(Incyte Pharmaceuticals)に見られるテンプレート配列を作製した。
【0115】
アセンブリにより得られたテンプレートを次に示す方法でアノテーションを付けた。テンプレート配列は、GBpri (GenBank version 109)に対してBLASTn(v2.0, NCBI)で分析した。「ヒット」は、200塩基対に対して95%の局所同一性から100塩基対に対して100%までの局所同一性を有する正確な一致、またはE値が1×10− 8である相同一致と定義した。これらのヒットは、GENPEPT(GenBank version 109)に対してフレームシフトFASTxで分析した。この分析では、相同一致をE値が1×10− 8と定義した。上記したアセンブリ方法は、1999年3月25日に出願の米国特許出願第09/276,534号(名称「Database and System for Storing, Comparing and Displaying Related Biomolecular Sequence Information」)に記載されており、言及することをもって本明細書の一部とする。またLIFESEQ GOLDユーザーマニュアル(Incyte Pharmaceuticals)にも記載されている。
【0116】
続くアセンブリでは、テンプレート配列に対して、motif、BLAST、隠れマルコフモデル(HMM; Pearson及びLipman (1988) Proc Natl Acad Sci 85: 2444−2448 ; Smith及びWaterman (1981) J Mol Biol 147: 195−197)、及び機能の分析を行い、1997年3月6日に出願の米国特許出願第08/812,290号(名称、「Database System Employing Protein Function Hierarchies for Viewing Biomolecular Sequence Data」)、1997年10月9日に出願の米国特許出願第08/947,845号(名称、「Relational Database for Storing Biomolecule Information」)、米国特許出願第5,953,727号(名称、「Project−Based Full Length Biomolecular Sequence Database」)、及び1998年3月4日に出願の米国特許出願第09/034,807号(名称、「Relational Database and System for Storing Information Relating to Biomolecular Sequences」)に記載されている方法を用いてタンパク質の階層に分類した。なお、これらの特許出願に言及することを以って本明細書の一部とする。テンプレート配列を更に、GenBank齧歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物、原核生物、及びヒトESTデータベースなどの公共のデータベースに対して問い合わせすることもできる。
【0117】
5 マイクロアレイの準備
ヒトUNIGEM V 2.0(Incyte Pharmaceuticals)上のポリヌクレオチドは、gbESTデータベース(National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Bethesda, MD)から誘導したEST、及びIMAGE(ゲノム及びそれらの発現の統合的分子分析)cDNAライブラリクローンに由来する遺伝子指向クラスター(gene−oriented clusters)の重複しないセットに基づいたLIFESEQ GOLDアセンブルヒト配列データベース(Incyte Pharmaceuticals)に由来するテンプレート配列である。それぞれの特定のテンプレートを代表する1つのクローンをマイクロアレイに用いた。ポリヌクレオチドは、cDNAインサートに隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いて細菌細胞から増幅した。PCRを30サイクル行い、1〜2ngの開始ポリヌクレオチドから5μg以上の最終量に増加させた。次に増幅したポリヌクレオチドを、SEPHACRYL−400カラム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製した。
【0118】
精製したポリヌクレオチドをポリマーコートしたスライドガラス上に固定した。顕微鏡スライドガラス(Corning, Corning NY)は、0.1%SDS及びアセトン中で超音波洗浄した。この洗浄中及び洗浄後に大量の蒸留水で洗浄した。スライドガラスを4%フッ化水素酸(VWR Scientific Products Corporation, West Chester PA)中でエッチングし、蒸留水で丁寧に洗浄し、95%エタノールに溶解した0.05%アミノプロピルシラン(Sigma Aldrich, St. Louis MO)で被覆した。被覆したスライドガラスをオーブンで110℃で硬化させた。次にポリヌクレオチドを、米国特許第5,807,522号(言及することを以って本明細書の一部とする)に記載されている方法によりコーティングガラス基板に固定した。平均濃度が100ng/μlであるポリヌクレオチド1μlを高速ロボット装置によりオープンキャピラリープリンティング装置(open capillary printing element)に導入し、この装置によりスライド1枚に付き5nlのポリヌクレオチドを分柱した。
【0119】
マイクロアレイを、STRATALINKER UVクロスリンカー(Stratagene)を用いてUV架橋し、次に室温で0.2% SDSで洗浄し、更に蒸留水で3回洗浄した。非特異的な結合部位は、リン酸緩衝生理食塩水(Tropix, Bedford MA)における0.2%カゼインにおいてマイクロアレイを60℃で30分間インキュベートし、0.2% SDSで洗浄し、更に上記したように蒸留水で洗浄してブロッキングした。
【0120】
6 標的ポリヌクレオチドの調製
ヒトTHP−1細胞(American Type Culture Collection, Manassas VA)を、10% 胎児血清(v/v)、0.45% グルコース (w/v)、10 mM Hepes、1mMピルビン酸ナトリウム、1x10−5M β−メルカプトエタノール、ペニシリン(100 単位/ml)を含むRPMI1640培地で成長させた。酸化LDL負荷実験(loading experiments)のために、12−0−テトラデカノイルホルボール13−アセテート(Research Biochemical International, Natick MA)を含む培地に1x106細胞/mlの濃度で細胞を播種し、1x10−7Mで24時間培養した。次に、この培地を、Hammerらの方法(1995; Arterio Thromb Vasc Biol 15:704−713)に従って100μg/mlのCuSO4「完全」酸化型LDL(Intracel, Rockville MD)を含む或いは含まない培養培地に替えた。培養中は、2日毎に培地を取り替えた。細胞を、30分〜4日の範囲の各時点で、Ox−LDLで処理した。この期間中、細胞は接着したままであり、典型的な細点のあるナイルレッド染色パターンが形成された。RNAを、0時間、0.5時間、2.5時間、8時間、1日、2日、及び4日におけるOx−LDL暴露の発現プロフィールのために準備した。
【0121】
全RNAをRNA STAT−60キット(Tel−Test, Friendswood TX)を用いて抽出した。ポリ(A)RNAをPOLYATRACT mRNA単離システム(Promega)を用いて精製した。それぞれのポリ(A)RNAサンプルを、MMLV逆転写酵素、0.05 pg/μl オリゴ−dTプライマー(21mer)、1x 第1鎖バッファー、0.03 単位/μlのRNA分解酵素インヒビター、500 μM dATP、500 μM dGTP、500 μM dTTP、40 μM dCTP、及び40 μMの何れかdCTP−Cy3或いはdCTP−Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech)を用いて逆転写した。この逆転写反応は、GEMBRIGHTキット(Incyte Pharmaceuticals)を用いて200ngポリ(A)RNAを含む25mlの溶液において行った。特定のコントロールポリ(A)RNA(YCFR06、YCFR45、YCFR67、YCFR85、YCFR43、YCFR22、YCFR23、YCFR25、YCFR44、YCFR26)を、非コード酵母ゲノムDNA(W. Lei, unpublished)からin vitro転写により合成した。量的コントロールとして、0.002ng、0.02ng、0.2 ng、及び2ngのコントロールmRNA(YCFR06、YCFR45、YCFR67、及びYCFR85)を逆転写反応液に希釈して、サンプルmRNAに対する比率がそれぞれ1:100,000、1:10,000、1:1000、1:100 (w/w)となるようにした。異なった発現パターンをサンプリングするために、コントロールmRNA(YCFR43、YCFR22、YCFR23、YCFR25、YCFR44、及びYCFR26)を、サンプルmRNAに対して1:3、3:1、1:10、10:1、1:25、25:1 (w/w)の比率で逆転写反応液に希釈した。反応液を37℃で2時間インキュベートし、次に2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理し、85℃で20分間インキュベートして反応を停止させRNAを分解した。
【0122】
プローブを、2つの連続したCHROMA SPIN 30ゲルフィルトレーションスピンカラム(Clontech)を用いて精製した。Cy3及びCy5標識した反応サンプルを、後述するように結合させ、1mlのグリコーゲン(1mg/ml)、60mlの酢酸ナトリウム、及び300mlの100%エタノールを用いてエタノール沈殿させた。次にプローブをSpeedVACシステム(Savant Instruments, Holbrook NY)を用いて完全に乾燥させ、14μlの5X SSC/0.2% SDSにおいて再懸濁した。
【0123】
7 ハイブリダイゼーション及び検出
ハイブリダイゼーション反応液は、時点が一致する実験細胞とコントロール細胞の対からなるCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各0.2μg含む5×SSC、0.2%SDSハイブリダイゼーションバッファーからなる9μlのプローブ混合液を含む。この標的混合液を、65℃で5分間加熱し、マイクロアレイ表面上に一定量分注してから1.8cm2 のカバーガラスで覆った。このマイクロアレイを、顕微鏡スライドよりも僅かに大きいキャビティを有する防水チャンバーに移した。チャンバーの角から140μlの5×SSCを加えて、チャンバー内を湿度100%に保持した。このマイクロアレイを含むチャンバーを、60℃で約6.5時間インキュベートした。マイクロアレイは、ストリンジェンシーの低い洗浄バッファー(1×SSC, 0.1%SDS)において45℃で10分間、ストリンジェンシーの高い洗浄バッファー(0.1×SSC)において45℃で10分間それぞれ3回洗浄し、その後乾燥させた。
【0124】
レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体を、Cy3を励起するための488nm、及びCy3を励起するための632nmのスペクトル線を生成し得るInnova 70混合ガス10 Wレーザー(Coherent, Inc., Santa Clara CA)を備えた顕微鏡で検出した。20倍の顕微鏡対物レンズ(Nikon, Inc., Melville NY)を用いて、マイクロアレイ上に励起レーザー光を集中させた。このマイクロアレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御X−Yステージに置き、対物レンズを通してラスタスキャンした。本実施例で用いた1.8cm×1.8cmのアレイは、20μmの解像度でスキャンした。
【0125】
2つの異なるスキャンにおいて、混合ガスマルチラインレーザーは2つの蛍光体を連続的に励起した。放射された光は、波長に基づいて2つの蛍光体に対応する2つの光電子増倍管検出器(PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ)に分割された。マイクロアレイと光電子増倍管との間に配設された好適なフィルタを用いて信号をフィルタリングした。用いる蛍光体の最大発光は、Cy3では565nm、Cy5では650nmである。装置は両方の蛍光体からのスペクトルを同時に記録できるが、レーザー源に好適なフィルタを用いて、蛍光体1つにつき1回スキャンし、通常どおり各マイクロアレイを2回スキャンした。
【0126】
スキャンの感度は、cDNAコントロール種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。較正するcDNAのサンプルを、2つの蛍光体で別々に標識し、それぞれを等量、ハイブリダイゼーション混合液に添加した。マイクロアレイ上の特定の位置には相補的DNA配列を含め、その位置におけるシグナルの強度がハイブリダイズする種の重量比1:100,000に相関するようにした。
【0127】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI−835Hアナログ−ディジタル(AID)変換ボード(Analog Devices, Inc., Norwood MA)を用いてディジタル化した。ディジタル化したデータは、リニア20色変換を用いてシグナル強度が青色(低シグナル)から赤色(高シグナル)までの擬似カラー範囲にマッピングされるイメージとして表示した。データはまた、定量的に分析した。2つの異なる蛍光体を同時に励起して測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、先ずデータは蛍光体間の光学的漏話(重複発光スペクトルに起因する)に対して補正した。
【0128】
グリッドを蛍光シグナルイメージ上に重畳して、各スポットからのシグナルがグリッドの各エレメントに中央に位置するようにする。各エレメント内の蛍光シグナルを統合し、シグナルの平均強度に対応する数値を得る。シグナル分析に用いるソフトウエアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム(Incyte Pharmaceuticals)である。
【0129】
8 データ分析及び結果
アグロメラティブクラスター分析(agglomerative cluster analysis)を用いて、典型的な反応パターンを特定し、異なった遺伝子発現プロフィール間の関係を確立した。それぞれの遺伝子の測定は、まず発現の割合を各時点の最大値で除して標準化した。或る時点とその次の時点との変化を強調するために、連続する2つの時点の発現の差を取って発現ベクトルに傾斜を加えた。ユークリッド距離を、発現反応に対する類似性の基準として用いた。
【0130】
用いたアグロメラティブアルゴリズム(agglomerative algorithm)はデンドログラムを作成する。それぞれが1つの遺伝子を含むN個のクラスターで始まり、繰り返しの各ステップでは、最も近い2つのクラスターが1つの大きなクラスターにされた。クラスター間の距離は、それらの平均発現パターン間の距離と定義されている。N−1ステップの後を、全てのデータポイントがまとめられた。クラスター化プロセスにより階層ツリーが作成された。遺伝子は、一定距離によって分割された10行(ブランチレベル)のセットを有するそれぞれの遺伝子ブランチとルートとの間のツリーをカットして自動的にクラスターに割り当てられた。ブランチレベルのカットオフによりクラスターが形成された。ツリーは第1に標準化されるため、それぞれのブランチはルートから同じ距離である。最も近い遺伝子間の距離を保持するために、ツリーはリーフから最も遠いブランチで曲げられた。ツリーの各ブランチレベルで交差するブランチの数はそのレベルにおけるクラスターの数に等しい。
【0131】
ツリーをブランチレベル5で分割すると、遺伝子が、276の発現が変動した遺伝子及びスプライスバリアントを含む7つの遺伝子発現クラスターに分割される。表1における列4〜列10は、Ox−LDLに暴露しない遺伝子発現に対するOx−LDL暴露に反応した各時点の遺伝子発現のレベルを示す。差の調節は、それぞれの遺伝子に対して最大値を1として標準化した。白い部分は、特定の遺伝子における最大値に対して0〜25%の範囲でOx−LDLに反応した相対発現を示し、薄いグレーの部分は26〜50%の範囲であり、濃いグレーの部分は51〜75%の範囲であり、黒い部分は76〜100%の範囲である。
【0132】
9 相補的な核酸分子
本ポリヌクレオチドに相補的な分子またはその断片を用いて、遺伝子発現を検出したり、低下させたり、抑制することができる。約15〜約30個の塩基からなるオリゴヌクレオチドの使用について記載するが、それより小さい或いは大きい配列の断片、またはその誘導体(PNA)の場合でも同じ方法を用いることができる。オリゴヌクレオチドは、Oligo4.06ソフトウエア(National Biosciences)及びSEQ ID NO:1−278を用いて選択した。プロモーターの結合を阻害して転写を阻止するために、最も好ましくはオープンリーディングフレームの開始コドンの前の約10個のヌクレオチドである最もユニークな5’配列に結合するように相補的なヌクレオチドを設計する。翻訳を阻害するために、本哺乳動物ポリペプチドをコードするmRNAへのリボソームの結合を阻害するべく相補的なオリゴヌクレオチドを設計する。
【0133】
転写または翻訳を阻害するために作製したアンチセンス分子を用いるのに加えて、ゲノム配列(例えばエンハンサーやイントロン)或いはトランス作動性調節性遺伝子に対するアンチセンス分子を設計して遺伝子発現を変化させることができる。同様に、三重らせん塩基対形成として知られているHogeboom塩基対形成法を用いてアンチセンス阻害を行うことができる。三重らせんの塩基対形成に関与するアンチセンス分子は、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子と結合するために二本鎖の間を広げる二重らせんの能力を損なわせる。
【0134】
このようなアンチセンス分子を発現ベクターに導入して、好適な細胞または組織を形質転換する。これには、効果を検査するために細胞系への発現ベクターの導入、一過性或いは短期の治療のための器官、腫瘍、滑液キャビティ、または血管系への発現ベクターの導入、または長期或いは安定した遺伝子治療のための単細胞または他の生殖系への発現ベクターの導入が含まれる。一過性の発現は、ベクターの複製を伴わない場合には1ヶ月以上持続し、ベクターの複製を引き起こす好適なエレメントが形質転換/発現系に用いられている場合には3ヶ月以上持続する。
【0135】
アンチセンス分子をコードするベクターで好適な分裂細胞を安定的に形質転換することにより、遺伝子組換え細胞系、遺伝子組換え組織、または遺伝子組換え器官を作製することができる(米国特許第4,736,866号)。ベクターを取り込んで十分な量のベクターを複製するこれらの細胞により、安定した組み込みが可能となり、本ポリヌクレオチドの活性を弱める或いは完全に消失させる十分なアンチセンス分子を産生させることができる。
【0136】
10 ハイブリダイゼーション技術及び分析
火あぶり代ゼーション技術は、ポリマーコートしたスライドガラスやナイロン膜などの様々な基板を用いる。エレメントのポリマーコートスライドへの整列は、本実施例5に記載されており、ポリマーコートスライドを用いるプローブの調整、ハイブリダイゼーション、及び分析はそれぞれ、本実施例6及び7に示されている。
【0137】
ポリヌクレオチドを以下に示す方法で基板に固定する。ポリヌクレオチドの混合液をジェル電気泳動により分画後、毛細管輸送によってナイロン膜に移す。別法では、ポリヌクレオチドを個別にベクターに結合して、それを細菌宿主細胞に挿入してライブラリを形成する。次にポリヌクレオチドを以下の方法で基板に配列する。第1の方法では、個別のクローンを含む細菌細胞を機械的に摘み上げてナイロン膜に整列させる。このナイロン膜を、選択薬(用いるベクターによって異なるが、カルベンシリン、カナマイシン、アンピシリン、またはクロラムフェニコールなど)を含むLB寒天培地に載置し、37℃で16時間インキュベートする。この膜を寒天培地から取り除き、次にこの膜をコロニー側を上にして10%SDS、変性溶液(1. 5 M NaCl、0. 5 M NaOH)、中和液(1. 5 M NaCl、1 M Tris、pH 8. 0)に入れ、2×SSCにおいて10分間づつ2回インキュベートする。次にこの膜を、STRATALINKER UVクロスリンカー(Stratagene)でUV照射する。
【0138】
第2の方法では、インサートに隣接したベクター配列に相補的なプライマーを用いて、PCRを30サイクル行い細菌ベクターからポリヌクレオチドを増幅する。PCR増幅により、拡散の濃度を開始時の1〜2 ngから最終的に5μgまで増大させる。約400 bp〜約5000 bpの増幅した拡散をSEPHACRYL−400ビーズ(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製する。精製した拡散を、手動で或いはドット/スロットブロッティングマニフォールド及び吸入装置でナイロン膜に配列し、上記した変性、中和、及びUV照射によって固定する。
【0139】
本配列表のポリヌクレオチドに由来するハイブリダイゼーションプローブは、メンブレンハイブリダイゼーションにおいてcDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングするために用いられる。プローブを準備するために、ポリヌクレオチドを45μl TEバッファにおいて40〜50 ngの濃度に希釈し、100℃で5分間加熱して変性し、短時間遠心分離する。次に、変性したポリヌクレオチドをREDIPRIMEチューブ(Amersham Pharmacia Biotech)に加え、青色が十分に拡散するまで軽く混合し、短時間遠心分離する。5μlの[32P] dCTPをチューブに加え、その内容物を37℃で10分間インキュベートする。この標識化反応を5μlの0. 2M EDTAを加えてストップし、PROBEQUANT G−50マイクロカラム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いてプローブを組み込まれなかったヌクレオチドから精製する。精製したプローブを100℃で5分間加熱してから氷上で2分間冷却する。
【0140】
メンブレンを、1%Sarkosyl及び1×高リン酸バッファ(0. 5M NaCl、0.1 M Na2HPO4、5 mM EDTA、pH 7)を含むハイブリダイゼーション溶液において55℃で2時間プレハイブリダイゼーションする。15mlの新しいハイブリダイゼーション溶液に希釈したプローブをメンブレンに加える。55℃で16時間、メンブレンにプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを1mM Tris(pH 8. 0)、1%Sarkosylにおいて25℃で15分間洗浄し、1mM Tris(pH 8. 0)において25℃で15分間づつ4回洗浄する。ハイブリダイゼーション複合体を検出するために、XOMAT−ARフィルム(Eastman Kodak, Rochester NY)をメンブレンに−70℃で一晩暴露し、現像して目で確認する。
【0141】
11 コードされるタンパク質の発現
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現及び精製は、細菌若しくはウイルス系の発現系を用いて行うことができる。細菌で発現させるために、抗生物質耐性遺伝子とcDNAを高レベルで転写させる誘導性プロモーターとを含むベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターには、以下に限定するものではないが、lacオペレーター調節エレメントに関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp−lac(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれる。組み換えベクターを、例えばBL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導されると、抗生物質耐性細菌がこのタンパク質を発現する。真核細胞での発現は、Autographica californica核多面性ウイルス(AcMNPV)という組み換えバキュロウイスルスをSpodoptera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に感染させて行う。バキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子を、相同組み換え或いは転移プラスミド中間体が関係する細菌媒介遺伝子転移の何れかによって、本ポリヌクレオチドで置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモータによって高いレベルでポリヌクレオチドが転写される。
【0142】
精製を容易にするために、本タンパク質は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST; Amersham Pharmacia Biotech)またはFLAG等の別の代替物との融合タンパク質として合成する。融合タンパク質は、タンパク質活性及び抗原性が維持される条件下で、固定されたグルタチオン上で精製する。精製の後、GST部分がタンパク分解的にトロンビンで本タンパク質から切断される。8個のアミノ酸ペプチドであるFLAGとの融合タンパク質を、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体(Eastman Kodak, Rochester NY)を用いて精製する。
【0143】
12 特異的抗体の作製
逆相HPLC分離により75mgの変性ポリペプチドを得る。この変性タンパク質を用いて標準的なプロトコルに従ってマウスまたはウサギを免疫化する。マウスを免疫するには約100μg用い、ウサギを免疫するには1mg用いる。変性ポリペプチドを放射性ヨウ素標識し、マウスB細胞ハイブリドーマとインキュベートし、モノクローナル抗体をスクリーニングする。数千のクローンの標識及びスクリーニングには約20mgのポリペプチドで十分である。
【0144】
別の方法では、本発明のポリヌクレオチドから翻訳されたアミノ酸配列をPROTEANソフトウエア(DNASTAR)用いて分析し、免疫原性の高い領域を決定する。免疫化に最適な配列は、通常はC末端、N末端、本ポリペプチドが天然のコンフォメーションの場合に外部環境に曝され易い本ポリペプチドの親水性の介在領域である。一般に、約15残基の長さのオリゴペプチドを、Fmoc化学を用いてABI 431ペプチドシンセサイザー(PE Biosystems)で合成し、次にM−maleimidobenzoyl−N−hydroxysuccinimide esterとの反応によりキーホールリンペットヘモシアニン(KLH; Sigma Aldrich)に結合させる。必要であれば、ペプチドのN末端にシステインを導入してKLHとの結合を可能にすることもできる。ウサギを、このオリゴペプチド−KLH複合体を含む完全フロイントアジュバントで免疫化する。そのペプチドをプラスチックに結合させて、1% BSAでブロッキングし、得られたウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、放射線ヨウ素標識ヤギ抗ウサギIgGと反応させて、この抗血清の抗ペプチド活性を検査する。
【0145】
標準的な方法でハイブリドーマを作製してスクリーニングする。目的のハイブリドーマを放射線ヨウ素標識したポリペプチドでスクリーニングして検出し、本ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生する融合細胞を特定する。通常のプロトコルでは、96ウェルプレート(FAST, Becton−Dickinson, Palo Alto CA)のウェルを、アフィニティー精製した10mg/mlの特異的なウサギ−抗マウス(または好適な抗−種Ig)抗体でコーティングする。コーティングしたウェルを1% BSAでブロックし、洗浄し、ハイブリドーマの上清に暴露する。インキュベートした後、ウェルを1mg/mlの放射線ヨウ素標識したポリペプチドに暴露する。抗体を産生するクローンは、バックグラウンドを超えて検出可能な量の標識したポリペプチドに結合する。
【0146】
このようなクローンを、3ウェルに付き1細胞で2サイクルのクローニングを行って増殖させる。クローニングしたハイブリドーマをpristane処理したマウスに注入し、腹水を生じさせ、モノクローナル抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech)により腹水液から精製する。少なくとも108M−1、好ましくは109〜1010M−1、またはそれより強い親和性を有するモノクローナル抗体を当分野で周知の方法で作製する。
【0147】
13 特異的な抗体を用いる天然タンパク質の精製
天然或いは組換えのタンパク質を、このタンパク質に特異的な抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィーで実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、この抗体をCNBr−活性化SEPHAROSEレジン(Amersham Pharmacia Biotech)に共有結合させて作製する。このタンパク質を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、このタンパク質を優先的に吸着できるように、界面活性剤の存在下で高イオン強度バッファーでそのカラムを洗浄する。結合後、バッファー(pH 2〜3)或いは高濃度の尿素やチオシアネートイオンを用いてそのカラムからこのタンパク質を溶離させて抗体とこのタンパク質との結合を切断し、このタンパク質を回収する。
【0148】
14 特異的に結合する分子のスクリーニング
本ポリヌクレオチドやその断片を、32P−dCTP、Cy3−dCTP、Cy5−dCTP (Amersham Pharmacia Biotech)で標識したり、またはそのタンパク質やその一部をBIODIPYやFITC (Molecular Probes)でそれぞれ標識する。予め基板上に配列した複数の候補分子または化合物即ちライブラリを、標識したポリヌクレオチドまたはタンパク質の存在下でインキュベートする。ポリヌクレオチド或いはアミノ酸配列のための条件下でインキュベートした後、その基板を洗浄する。特異的な結合或いは複合体形成を示唆する標識が保持されている基板上の全ての部分によりリガンドを同定する。様々な濃度のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドで得られたデータを用いて、標識した核酸またはタンパク質と結合したリガンドとの間の親和性を求める。
【0149】
本明細書に記載した全ての特許及び刊行物に言及することを以って本明細書の一部とする。本発明の範囲及び概念から逸脱することなく本発明の方法及びシステムの種々の改変が可能であることは当業者には明らかであろう。特定の好適な実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には、本明細書に記載の本発明の実施例の様々な改変は、特許請求の範囲に含まれることが容易に理解できよう。
【0150】
(表の簡単な説明)
本明細書の開示の一部には、著作権が保護されるべき資料が含まれている。この著作権の所有権者は、特許庁のファイルや記録にある本発明の開示に関する明細書即ち発明の開示をファクシミリで複写することについての異議はないが、その他の場合は著作権を留保する。
【0151】
添付の配列表は、異なったcDNAのクローンインサート(単離物)をシークエンシングし、マイクロアレイ上のプローブとしてこれらのcDNAを用いてハイブリッド複合体を形成させ、それにより同定されたポリヌクレオチドを編集したものである。各配列は、配列識別番号(SEQ ID NO)及びインサイトID番号によって識別される。このインサイトID番号は、クローンインサートを含む遺伝子配列を表す。
【0152】
表1は、クラスター分析によって同定された泡沫細胞の発生に関連して発現が変動する遺伝子を示す。列1は、配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示し、列3は遺伝子アノテーションを示す。列4から列10は、標準化された遺伝子発現の変動を示し、列11は遺伝子が割り当てられたクラスターを示す。
【0153】
表2は、各配列の識別上方を示す。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示す。列3はUNIGEM V 2.0マイクロアレイ上のインサイトクローンのクローン番号を示す。列4及び列5は、列2に示された遺伝子配列に対するクローンインサート配列の開始及び終了部位を示し、添付の配列表に示されている。
【0154】
表3は、泡沫細胞発生の初期において発現が変動する遺伝子のリストである。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示し、列3は遺伝子アノテーションを示す。列4から列10は、各時点における発現値の変動を示す。列11及び列12はそれぞれ、時間経過による発現の上昇または低下の最大の変化を表す。列13は、時間経過における最大変化を示す。
【0155】
表4は、泡沫細胞分化時に発現が3倍以上変動した遺伝子のリストである。列1は配列番号を示し、列2はインサイトID番号を示し、列3は遺伝子アノテーションを示す。列4から列10は各時点における発現値の変動を示す。列11及び列12はそれぞれ、時間経過による発現の上昇または低下の最大変化を表す。列13は、時間経過における最大の変化を示す。
【図面の簡単な説明】
【図1A】
各クラスターに含まれる遺伝子群の各時点における平均的な標準化された発現パターンのグラフを示す。クラスター1からクラスター4は、1日目、2日目、または4日目においてアップレギュレートされた遺伝子を含む。クラスター5及びクラスター6は、後半にダウンレギュレートされた遺伝子を含み、クラスター7は、8時間目にアップレギュレートされた遺伝子を含む。
【図1B】
各クラスターに含まれる遺伝子群の各時点における平均的な標準化された発現パターンのグラフを示す。クラスター1からクラスター4は、1日目、2日目、または4日目においてアップレギュレートされた遺伝子を含む。クラスター5及びクラスター6は、後半にダウンレギュレートされた遺伝子を含み、クラスター7は、8時間目にアップレギュレートされた遺伝子を含む。
【表1】 【表2】 【表3】 【表4】 【表5】 【表6】 【表7】 【表8】 【表9】 【表10】 【表11】 【表12】 【表13】 【表14】 【表15】 【表16】 【表17】 【表18】
Claims (19)
- 泡沫細胞の発生において発現が変動するSEQ ID NO:1−276またはその相補配列(complement)から選択された複数のポリヌクレオチドを含む組成物。
- 前記各ポリヌクレオチドのそれぞれが、泡沫細胞発生の初期に発現が変動し、
(a)SEQ ID NO:1−55、
(b)SEQ ID NO:171−196、または
(c)前記(a)または前記(b)の相補配列から選択されることを特徴とする請求項1に記載の組成物。 - 前記各ポリヌクレオチドが、3倍を超えて発現が変動し、
(a)SEQ ID NO:47−67、
(b)SEQ ID NO:194−213、または
(c)前記(a)または前記(b)の相補配列から選択されることを特徴とする請求項1に記載の組成物。 - 前記ポリヌクレオチドが基板に固定されていることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- サンプルにおける1或いは複数のポリヌクレオチドの発現の変動を検出するためのハイスループット法であって、
(a)請求項2の組成物を前記サンプルとハイブリダイズさせて、1或いは複数のハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、
(b)前記ハイブリダイゼーション複合体を検出するステップと、
(c)前記ハイブリダイゼーション複合体を標準のハイブリダイゼーション複合体と比較するステップとを含み、
ハイブリダイゼーション複合体の大きさ及び強度におけるそれぞれの差が、前記サンプルにおけるポリヌクレオチドの発現の変動を示唆することを特徴とする方法。 - 前記サンプルがアテローム性動脈硬化症の患者から得たものであり、標準との比較により、その疾患が初期、中期、後期であるかを決定できることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 分子または化合物のライブラリをスクリーニングして、ポリヌクレオチドと結合するリガンドを同定するためのハイスループット法であって、
(a)特異的な結合が許容される条件下で、請求項1の組成物を前記ライブラリと結合させるステップと、
(b)前記ポリヌクレオチドと分子または化合物との間の特異的な結合を検出して、前記ポリヌクレオチドに特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含むことを特徴とする方法。 - 前記ライブラリが、DNA分子、RNA分子、ペプチド核酸、擬態、ペプチド、及びタンパク質から選択されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 核酸分子のライブラリから伸長した或いは完全長の遺伝子を得る方法であって、
(a)基板上に個々の配列を整列するステップと、
(b)特異的な結合が許容される条件下で、請求項1から選択されたポリヌクレオチドを前記配列とハイブリダイズさせるステップと、
(c)前記ポリヌクレオチドと1或いは複数の配列との間のハイブリダイゼーションを検出するステップと、
(d)前記ライブラリから前記配列を単離して、伸長した或いは完全長の遺伝子を得るステップとを含むことを特徴とする方法。 - SEQ ID NO:35−48、68−80、192、193、及び214−222から選択された実質的に精製されたポリヌクレオチド。
- 請求項10のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項11の発現ベクターを含む宿主細胞。
- タンパク質を生産する方法であって、
(a)タンパク質の発現する条件下で、請求項12の宿主細胞を培養するステップと、
(b)培養した前記宿主細胞から前記タンパク質を回収するステップとを含むことを特徴とする方法。 - 請求項13の方法によって生産されたタンパク質。
- 分子または化合物のライブラリをスクリーニングして、タンパク質と特異的に結合する少なくとも1つのリガンドを同定するハイスループット法であって、
(a)請求項14のタンパク質またはその一部を、特異的な結合が許容される条件下で、前記ライブラリと結合させるステップと、
(b)前記タンパク質と分子または化合物との間の特異的な結合を検出して、前記タンパク質に特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含むことを特徴とする方法。 - 前記ライブラリが、DNA分子、RNA分子、PNA、擬態、ペプチド、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体またはそれらの断片、免疫グロブリン、インヒビター、薬剤化合物、及び医薬品から選択されることを特徴とする請求項15に記載の方法。
- サンプルからリガンドを精製する方法であって、
(a)特異的な結合が許容される条件下で、請求項15のタンパク質をサンプルと結合させるステップと、
(b)前記結合したタンパク質を回収するステップと、
(c)前記タンパク質を前記リガンドから分離して、精製されたリガンドを得るステップとを含むことを特徴とする方法。 - 請求項14のタンパク質及び医薬用担体を含む医薬組成物。
- 請求項14のタンパク質に特異的に結合する精製された抗体。
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