JP2004516815A - ダウン症候群重要領域1−様1タンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、核酸分子及びその断片を提供する。本発明はまた、この核酸分子を用いた遺伝子発現に関連する症状、疾患、及び障害の特徴付け・診断・評価・治療方法、並びにモデル系の作製方法を提供する。更に本発明は、この核酸分子によってコードされるタンパク質を産生するための発現ベクター及び宿主細胞を提供する。
Description
【0001】
(発明の技術分野)
本発明は、新規の哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子に関し、また、これらの分子を用いたアルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態などの症状の特徴付け・診断・治療に関する。
【0002】
(発明の背景)
アルツハイマー病は、アミロイドβペプチドを含む老人斑及び神経原線維濃縮体の形成によって特徴付けられる進行性の神経変性疾患である。このような老人斑は、海馬、前頭皮質、帯状皮質、小脳、基底核、及び青斑核を含む脳の連合皮質及び辺縁に見られる。初期のアルツハイマー病では、帯状皮質の物理的変化が視認できる(Minoshima et al. (1997) Annals of Neurology 42: 85−94)。後期のアルツハイマー病患者では、蓄積された老人斑により辺縁領域の神経構造が破壊され、最終的に記憶過程に障害が起こる。
【0003】
全世界には、約2000万人ものアルツハイマー病による痴呆患者がいる。この疾患は、早期発症型(30歳の若者も発病する)、家族性、または散発性の場合がある。家族性アルツハイマー病はかつて、完全に常染色体優性な特性であると考えられていたが、この考えは多くの遺伝的決定因子が排除されていくにつれて変化してきた。例えば、老人斑に見られるアポリポタンパク質E(ApoE)の或る正常なアレル変異体は、アルツハイマー病を発症するリスクを増大し得るか、或いはアルツハイマー病の発症を防止し得るかの何れかである(Strittmatter et al. (1993) Proc Natl Acad Sci 90: 1977−1981)。
【0004】
ApoE、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、プレセニリン−1、及びプレセニリン−2の4種の遺伝子における突然変異により、アルツハイマー病に罹患し易くなることが知られている(Selkoe (1999) Nature 399: A23−A31)。ApoE遺伝子のe4アレルが、晩年発症型アルツハイマー病のリスクを増大させる。βアミロイドタンパク質(Aβ)が老人斑の主成分であり、このAβは通常、βセレクターゼ及びγセレクターゼによりAPPが切断されて形成される。アルツハイマー病患者では、多量のAβがこのような神経病理学的な斑で生成され細胞外に蓄積される。
【0005】
アルツハイマー病と多くの他の遺伝子やタンパク質との関連が報告されている。胎児アルツハイマー抗原及びsynucleinαが、脳の斑及び神経原線維濃縮体で見られる。或る種の遺伝子多形の遺伝もまた、アルツハイマー病のリスク増大に関連する。例えば、プロテアーゼインヒビターとして機能し得るβ2−マクログロブリンをコードする或る種の遺伝子多形が、晩年発症型アルツハイマー病のリスク増大に関係する。
【0006】
マイクロアレイ技術を用いた実験により、アルツハイマー病患者の組織において、特定の遺伝子の発現が変化することが分かった。このような遺伝子の1つであるDSCR1L1(gl435040)とも呼ばれるダウン症候群重要領域1−様1(Mazowiecki et al. (1996) J Biol Chem 271: 14567−14571)が、アルツハイマー病の組織において2分の1以下にダウンレギュレートされることが分かった。DSCR1L1は、甲状腺ホルモン応答性タンパク質をコードし、DSCR1(g7657042)及びDSCR1L2(g6017918)を含む遺伝子ファミリーのメンバーである。このファミリーの第1のメンバーDSCR1がクローニングされ、第21染色体のダウン症候群領域に近接していることから命名されたが、そのコードされたタンパク質の機能及びダウン症候群におけるその役割は不明である。このファミリーのタンパク質であることを決定するモチーフには、多くのRNA結合タンパク質及び或る種の一本鎖DNA結合タンパク質に見られるドメインに類似したN末端RNA結合ドメインと、リン酸化の標的と思われるISPPXSPPボックスを含む中心に存在する短いユニークなセリン−プロリンモチーフとが含まれる(Fuentes et al. (1995) Hum Mol Genet 4: 1935−1944)。
【0007】
アミノ酸配列の一般的な特性から判断すると、DSCR1遺伝子が転写調節及びシグナル伝達に関与するタンパク質をコードする可能性が高い(Strippoli et al. (2000) Genomics 64: 252−263)。3種類の遺伝子、即ちDSCR1、DSCR1L1、及びDSCR1L2が発現変動するのが明らかある。DSCR1は胎児の脳及び心臓において多量に発現し、DSCR1L1は心臓、脳、肝臓、及び筋骨格で見られ、DSCR1L2は血液を含む殆んどの組織で発現する。
【0008】
アルツハイマー病とダウン症候群との間には、中年のダウン症候群患者に見られるβアミロイドの重度の蓄積などの幾つかの関連性が存在する。DSCR1L1の甲状腺ホルモン応答特性が、アルツハイマー病及び/またはダウン症候群におけるこの遺伝子の役割に関連し得る。すなわち、アルツハイマー病及びダウン症候群患者の双方において、アルツハイマー病患者の脳脊髄液における抗チログロブリ抗体の上昇及びプレアルブミンのレベルの低下、並びにアルツハイマー病の臨床症状のあるダウン症候群患者における明白な無症状の甲状腺機能低下を含む甲状腺ホルモンの代謝障害が見られる(Sutherland et aL (1992) Neurobiol Aging 13: 301−312)。これとは逆に、甲状腺機能が低下した患者には、アルツハイマー病に見られるのと同様の或る種の神経性症状が見られ、甲状腺機能不全の病歴が、アルツハイマー病を発症するリスク因子であると考えられる。考えられる得る1つの関連性は、甲状腺ホルモンがAPP遺伝子の転写活性を負に調節するという発見である(Belandia et al. (1998) J Biol Chem 273: 30366−30371)。APPの過剰な発現により、βアミロイドタンパク質の産生増大を伴うメカニズムによって神経変性が引き起こされるとの仮説がある。アルツハイマー病患者における甲状腺応答DSCR1L1遺伝子のダウンレギュレーションと他のDSCR1遺伝子のダウンレギュレーションの可能性とから、アルツハイマー病と甲状腺機能との間に関連があることが分かる。
【0009】
DSCR1タンパク質ファミリーのメンバーをコードする更なる核酸分子の発見を、アルツハイマー病、ダウン症候群、及び他の痴呆の形態の診断・予後・治療に利用することができる。
【0010】
(発明の概要)
本発明は、アルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態などの症状の特徴付け・診断・予防・治療に有用な組成物を提供することで当分野の要望を満たすDSCR1L1αタンパク質をコードする精製された核酸分子の発見に基づている。
【0011】
本発明は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有する変異体、及びSEQ ID NO:2の抗原性エピトープを含む群から選択されるタンパク質またはその一部をコードする単離された核酸分子またはその断片を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1の核酸配列、SEQ ID NO:1の核酸配列と少なくとも85%の同一性を有する変異体cDNA、及びSEQ ID NO:1の断片を含む群から選択される単離された哺乳動物核酸分子またはそのその相補体を提供する。更に本発明は、DSCR1L1αをコードする核酸分子またはその相補体を含む組成物、基板、及びプローブを提供する。更に本発明は、このような核酸分子を含むベクター、このようなベクターを含む宿主細胞、及びこのような核酸分子を用いてDSCR1L1を作製する方法を提供する。更に本発明は、DSCR1L1αをコードする核酸分子を含むベクターを有する遺伝子組換え細胞系または遺伝子組換え生物を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:3−9から成る群から選択される哺乳動物断片またはその相補体を提供する。或る実施態様では、本発明は核酸分子を含む基板を提供する。第2の実施様態では、この基板を、検出法、スクリーニング法、及び精製法に用いる。更なる実施様態では、核酸分子は一本鎖相補RNAまたはDNA分子である。
【0012】
本発明はまた、核酸分子を用いて、サンプルの核酸の発現変動を検出する方法であって、前記核酸分子と前記核酸とをハイブリダイズさせてハイブリダイゼーション複合体を形成し、そのハイブリダイゼーション複合体を標準と比較し、その比較によりサンプルにおける前記核酸の発現変動が分かる方法を提供する。或る実施態様では、この検出方法は、ハイブリダイゼーションの前に前記核酸を増幅するステップを含む。別の実施態様では、前記核酸分子の発現変動を標準と比較して、アルツハイマー病、ダウン症候群、及び痴呆の他の形態の診断をする。更なる実施態様では、前記核酸分子、その断片やその相補体はアレイ上のエレメントを含み得る。
【0013】
本発明はまた、核酸配分子、その断片またはその相補体を用いて、ライブラリ即ち複数の分子または化合物をスクリーニングしてその核酸分子と特異的に結合する少なくとも1つのリガンドを同定する方法であって、特異的な結合が許容される条件下で、その核酸分子を前記分子または化合物と結合させるステップと、前記核酸分子に対する特異的な結合を検出して、前記核酸分子と特異的に結合するリガンドを特定するステップとを含む方法を提供する。一実施態様では、このような分子または化合物として、DNA分子、RNA分子、ペプチド核酸、人工染色体作製物、ペプチド、転写因子、リプレッサー、及び調節分子が選択される。
【0014】
本発明はまた、本核酸分子の少なくともある断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、この発現ベクターは宿主細胞内に含まれている。本発明は更に、タンパク質が発現する条件下で宿主細胞を培養するステップと、そのタンパク質をその宿主細胞から回収するステップとを含むタンパク質生産方法を提供する。
【0015】
本発明はまた、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と95%の同一性を有する変異体と、SEQ ID NO:2の抗原エピトープと、SEQ ID NO:2のオリゴペプチドと、SEQ ID NO:2の生物学的に活性ナ部分とからなる群から選択される精製されたタンパク質あたはその一部を提供する。本発明はまた、前記精製されたタンパク質及び医薬用担体を含む医薬組成物を提供する。本発明は更に、タンパク質を用いてライブラリ即ち複数の分子または化合物をスクリーニングして少なくとも1つのリガンドを特定する方法であって、特異的な結合が許容される条件下で、そのタンパク質を前記分子または化合物と結合させるステップと、特異的な結合を検出して、前記タンパク質と特異的に結合するリガンドを特定するステップとを含む方法を提供する。ある実施様態においては、分子または化合物はDNA分子、RNA分子、ペプチド核酸、ペプチド、タンパク質、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、及び薬剤から選択される。別の実施様態では、アルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態の患者を治療するために前記リガンドを使用する。
【0016】
本発明は、哺乳動物タンパク質を用いて、被検サンプルをそのタンパク質に特異的に結合する抗体に対してスクリーニングする方法であって、前記被検サンプルから抗体を単離するステップと、特異的な結合が許容される条件下で、この単離した抗体を前記タンパク質とを結合させるステップと、結合した前記タンパク質から抗体を解離するステップと、抗体の存在或いは存在量からアルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態の患者を診断できる抗体の量を既知の標準値と比較するステップとを含むスクリーニング法を提供する。本発明はまた、哺乳動物タンパク質を用いて抗体を作製及び精製する方法であって、抗体反応が起こる条件下でこのタンパク質によって動物を免疫するステップと、動物抗体を単離するステップと、基板にこのタンパク質を付着させるステップと、このタンパク質への特異的な結合が許容される条件下で、この基板を単離した抗体と接触させること、このタンパク質から抗体を分離して精製した抗体を得ることを含む方法を提供する。
【0017】
本発明は、DSCR1L1αに特異的に結合する精製された抗体を提供する。本発明はまた、抗体を用いてアルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態を診断する方法であって、結合が許容される条件下で、サンプルと前記抗体とを結合させるステップと、結合した抗体の量を既知の標準値と比較して前記疾患の有無を診断するステップとを含む診断方法を提供する。本発明は更に、抗体を用いてアルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態を治療する方法であって、精製された抗体を含む医薬組成物をそのような治療が必要な患者に投与することを含む治療方法を提供する。
【0018】
本発明はまた、哺乳動物のゲノムDNAの中にマーカー遺伝子を挿入して、内在性ポリヌクレオチドの発現を阻害する方法を提供する。本発明はまた、核酸分子を用いて哺乳動物モデル系を作製する方法であって、SEQ ID NO:3−9から選択される核酸分子を含むベクターを作製するステップと、そのベクターで胚性幹細胞を形質転換するステップと、形質転換された胚性幹細胞を選択するステップと、この形質転換された肺性幹細胞を哺乳動物胚盤胞の中に微量注入して、キメラ胚盤胞を形成するステップと、偽妊娠メスにキメラ胚盤胞を導入し、このメスが、生殖細胞系の中に核酸分子を含むキメラ子孫を出産し、そのキメラ哺乳動物を交配して同型接合哺乳動物モデル系を作製するステップとを含む哺乳動物モデル系作製方法を提供する。
【0019】
(本発明の実施方法について)
本発明は、ここに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更できることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いるものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい。本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その(この等)」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は当業者には周知の複数の宿主細胞を含む。
【0020】
本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用した。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるものではない。
【0021】
(定義)
「ダウン症候群重要領域1−様1(DSCR1L1α)タンパク質」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など任意の哺乳動物種(ウシ、イヌ、マウス、ヒツジ、ブタ、げっ歯類、サルそして好ましくはヒトを含む)から得られる実質的に精製されたタンパク質を指す。
【0022】
「アレイ」は、基板上の少なくとも2つの核酸分子の規則正しい配列を指す。核酸分子の少なくとも1つが調節または標準を表す。そして他方が目的の診断の核酸分子体を表す。基質上の2から約4万の核酸分子の構成により、核酸分子とサンプル核酸の間で形成される各標識ハイブリダイゼーション複合体の大きさ及びシグナル強度を確実に個別に区別できる。
【0023】
配列表の核酸分子の「相補配列」は、完全長配列に完全に相補的な核酸分子を指す。また高いストリンジェンシー条件下で核酸分子或いはmRNAにハイブリダイズする。
【0024】
「核酸分子」とは、単離したポリヌクレオチド、cDNA或いはその任意の断片または相補配列を指す。それは組換えまたは合成された二本鎖または一本鎖であり、コード配列及び/または非移動配列(nonmoving sequence)、ゲノムDNA分子由来のイントロンを有するまたは有しないエキソンを有する。
【0025】
「タンパク質をコードする核酸分子」という語は、当分野で周知の分析により同定された保存された領域、モチーフ或いはドメインをコードする配列と密接にアラインメントする核酸配列を指す。これらの分析には、保存された領域内における同一性を特定するBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)が含まれる(Altschul (1993) J Mol Evol 36: 290−300、Altschul ら(1990) J Mol Biol 215:403−410)。Brenner et al. (1998 ; Proc Natl Acad Sci 95: 6073−6078)が配列同一性による構造的相同性を特定するべくBLASTの信頼性を分析し、30%の同一性が少なくとも150残基の配列アラインメントに対する信頼できる閾値であり、40%の同一性が少なくとも70残基のアラインメントに対する適切な閾値であることを示した(Brenner et al., page 6076, column 2)。
【0026】
「誘導体」とは化学修飾された核酸分子或いはタンパク質を指す。核酸分子の誘導体化にはクエオシン(queosine)或いはヒポキサンチンなどの類似体等非従来型塩基の置換が含まれ得る。これらの置換は当分野で周知である。タンパク質の誘導体化にはアセチル基、アシル基、アルキル基、アミノ基、ホルミル基またはモルホリン基による水素の置換が含まれる。分子誘導体は天然分子の生物学的活性を保持するが、長い寿命或いは強化された活性などの長所を付与し得る。
【0027】
「発現変動」とは、サンプル中の転写されたメッセンジャーRNA或いは翻訳されたタンパク質の存在の有無、その量の少なくとも二倍の変更により検出される増加、即ちアップレギュレーション、或いは減少、即ちダウンレギュレーションを指す。
【0028】
「障害」とは、核酸分子及びDSCR1タンパク質が異なって発現されている場合の症状、疾患、または症候群を指す。
【0029】
「断片」とは長さが約200から約700塩基の連続したヌクレオチド鎖を指す。断片は、関連する核酸分子を同定するためにPCRまたはハイブリダイゼーション技術に、或いはリガンドをスクリーニングするための結合アッセイで使用され得る。核酸とそれらのリガンドはこのような方法で同定され、複製、転写、または翻訳を調節する治療として有用である。
【0030】
「ハイブリタイゼーション複合体」とは、例えば5’−A−G−T−C−3’と3’−T−C−A−G−5’との塩基対などのように1つの分子のプリンが相補的な分子ピリミジンと水素結合して、核酸分子とサンプルの核酸との間で形成される。相補性の度合およびヌクレオチド類似体の使用が、ハイブリダイゼーション反応の効率とストリンジェンシーに影響を与える。
【0031】
「リガンド」とは、ポリヌクレオチド或いはタンパク質のエピトープ上の相補部位に特異結合するあらゆる物質、分子、または化合物を指す。そのようなリガンドは、ポリヌクレオチドまたタンパク質の活性を安定化或いは調節し、核酸、タンパク質、炭水化物、脂肪、及び脂質を含む無機および/または有機物質から構成され得る。
【0032】
「オリゴヌクレオチド」とは、長さが約18から約60ヌクレオチドの一本鎖分子を指す。そしてハイブリダイゼーションや増幅技術において、または複製、転写、翻訳の調節において使用され得る。同義語として、アンプライマー、プライマー、及びオリゴマーが挙げられる。
【0033】
「部分」とは、あらゆる目的に使用されるタンパク質の任意の部分を指すが、特にリガンドのスクリーニングまたは抗体の生産に用いられるエピトープを指す。
【0034】
タンパク質の「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、及び蛋白分解性切断等が含まれ得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、細胞の位置、細胞型、pH、及び酵素環境などによって異なる。
【0035】
「プローブ」とは、サンプル中の少なくとも1つの核酸にハイブリダイズする核酸分子を指す。標的が一本鎖である場合、プローブは相補的一本鎖である。プローブは、サザン法、ノーザン法、in situ法、ドットブロット法、及びアレイなどを含むハイブリダイゼーション反応またはスクリーニングアッセイで使用するためにレポーター分子で標識化することができる。
【0036】
「タンパク質」とは、ポリペプチド或いはその任意の部分を指す。タンパク質の「部分」とは、少なくとも1つの生物学的活性を保持し得るアミノ酸配列の長さ、PFAMまたはPRINTS分析によって同定されるドメイン、或いはPROTEAN プログラム(DNASTAR, Madison WI)のKyte−Doolittle アルゴリズムを使用して同定されたタンパク質の抗原エピトープを指す。「オリゴペプチド」は、抗体を産生させるために融合タンパク質の一部として使用される約5残基から約15残基までのアミノ酸配列である。
【0037】
「精製された」とは、自然環境から分離され、自然環境で会合していた他の化合物が約60%から約90%まで分離したあらゆる分子や化合物を指す。
【0038】
「サンプル」は、核酸、タンパク質、及び抗体等を含むとして、その最も広い意味で用いられる。サンプルは体液、細胞調製の可溶性分画、細胞が成長する培地のアリコット、染色体、細胞小器官、或いは細胞から単離または抽出された膜、溶液中のまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、または核酸分子と、細胞、組織、組織プリント、フィンガープリント、口内細胞、皮膚、または髪等を含み得る。
【0039】
「特異的な結合」とは、構造、特に分子側鎖に依存する2つの分子間での特殊つ正確な相互作用を指す。例えば、調節タンパク質のDNA分子の主溝への挿入、2つの一本鎖核酸間の骨格に沿った水素結合、またはタンパク質のエピトープとアゴニスト、アンタゴニストまたは抗体との間の結合がある。
【0040】
配列に適用される「類似性」とは、Smith−Waterman アルゴリズム(Smith及びWaterman (1981) J Mol Biol 147:195−197)或いはBLAST2 (Altschul ら (1997) Nucleic Acids Res 25:3389−3402)などの標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも2つの配列間で一致する分子或いは残基の定量化(通常は%)を指す。BLAST2は、アラインメントを最適化するために配列の1つでギャップを挿入するまた2つの配列をより有意に比較できる標準化された再現性のある方法で使用され得る。
【0041】
「基板」とは、核酸分子またはタンパク質が結合する任意の固体または半固体の支持体を指すものであって、膜、フィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁性または非磁性ビーズ、ゲル、毛管、またはその他のチューブ、プレート、ポリマー、微小粒子が含まれ、穴、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有する。
【0042】
「変異体」とは、核酸分子またはその核酸分子がコードするタンパク質の認識できる変異した分子を指す。スプライス変異体は、スコアが少なくとも100、最も好ましいのは少なくとも400であるBLASTスコアにより決定し得る。対立遺伝子変異体は、核酸分子に対して高い同一性のパーセントを有し、100塩基に付き約3塩基が異なり得る。「一塩基多型」(SNP)とは、欠失、挿入、または置換による単一塩基による変異を指す。この変異は、保存的(プリンからプリン)或いは非保存的(プリンからピリミジン)であり得、コードされたアミノ酸に変異が起こる可能性がある。
【0043】
(発明)
本発明は、DSCR1L1αをコードする新規の哺乳動物核酸分子の発見に基づき、アルツハイマー病、ダウン症候群、及び他の形態の痴呆などの病態の特徴付け・診断・治療・予防においてその核酸分子やその断片、またはそのタンパク質やその一部を用いることに関連する。
【0044】
一実施形態では、本発明は図1A−図1Cに示されているSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。DSCR1L1αは、既知のRNA認識モチーフに類似した残基129〜199のプラスに荷電した芳香族アミノ酸によって特徴付けられる一本鎖核酸結合ドメインを有する。加えて、DSCR1L1αは、DSCR1タンパク質の特徴であるISPPXSPPボックス(残基169〜176)を含む。図2A及び図2Bに示されているように、DSCR1L1αは、ヒトDSCR1L1(g1435040;SEQ ID NO:10)及びヒトDSCR1L2(g6017919;SEQ ID NO:11)と化学的及び構造的相同性を有する。具体的には、DSCR1L1αはDSCR1L1との同一性が90.3%であり、DSCR1L2とは57.3%の同一性を有する。これら3種類全てのタンパク質が、一本鎖核酸分子結合ドメイン及びISPPXSPPボックスを共に有する。SEQ ID NO:1は、5’非翻訳領域がDSCR1L1(g1435040;SEQ ID NO:10)をコードする遺伝子及びDSCR1L2(g6017919;SEQ ID NO:11)をコードする遺伝子とは異なり、また、SEQ ID NO:1の読み枠によってコードされた残基M1からS70までの初めの70個のアミノ酸により、DSCR1L1αファミリータンパク質をコードするこれら及び他の遺伝子と区別される。SEQ ID NO:1のヌクレオチド1から400までのプローブは、DSCR1L1αをコードする自然発生の核酸分子、アレル変異体、または関連分子を特定するのに有用であろう。DSCR1L1αのアミノ酸残基M1からS70までの抗原エピトープは、DSCR1L1αと類似タンパク質とを区別し得るDSCR1L1αの抗体の生産に有用であろう。
【0045】
電子ノーザン分析により、様々なライブラリにおいてこの配列の発現が示され、精神分裂病、ハンチントン病、癲癇、及び筋萎縮性側索硬化症に関連する組織を含む神経系の組織に最も多量に存在することが分かった。アルツハイマー病と診断された患者のサンプルとのマイクロアレイにおけるハイブリダイズが2分の1にダウンレギュレートされたのに一致して、アルツハイマー病の患者からのライブライ8の内7のライブラリでDSCR1L1αが発現していない。
【0046】
表1は、ラット及びサルからの核酸断片、その配列の範囲、及びSEQ ID NO:1との同一性を示す。列1及び列2にはそれぞれ、各核酸配列に対する配列番号(SEQ ID NO)及びインサイト配列識別子が列記されている。列3には各断片のヌクレオチド長、列4には各断片がSEQ ID NO:1と同一性を有するSEQ ID NO:1におけるヌクレオチド残基の範囲、列5には由来する生物名、列6には列4のヌクレオチド範囲に対する各断片とSEQ ID NO:1との同一性(%)が列記されている。
【0047】
これらの核酸分子は、ヒトの疾患モデルとなる遺伝子組換え生物または遺伝子組換え細胞系を作製するのに特に有用である。また、このような遺伝子組換え生物において治療の可能性を検査することができる。初期のアルツハイマー病の機能欠損を示す領域である帯状皮質におけるSEQ ID NO:9の発現に注目されたい。このサル核酸分子は、アルツハイマー病のモデル系に有用であろう。また、サル核酸分子をプローブとして用いて、同様に発現が帯状皮質に制限される相同なヒトDSCR1遺伝子ファミリー配列を検索することができる。
【0048】
(本発明の特徴及び使用)
cDNA ライブラリ
ここに開示する特定の実施例では、当分野で周知の方法を用いて哺乳動物の細胞及び組織からmRNAを単離し、これを用いてcDNAライブラリを作製する。上記したインサイト社クローンは、哺乳動物cDNAライブラリから単離された。本発明の代表的な少なくとも1つのライブラリの作製方法を以降に記載する実施例に示す。コンセンサス哺乳動物配列は、Phrap (P. Green, 前出)及びGELVIEW 断片構築システム(Genetics Computer Group, Madison WI)、AUTOASSEMBLERアプリケーション(Applied Biosystems, Foster City CA)などのコンピュータプログラムを用いて、インサイト社クローンを含む断片、伸長、及び/またはショットガン配列から化学的かつ/または電子的に構築した。
【0049】
シークエンシング
核酸をシークエンシングする方法は当分野で周知であり、そのような方法を用いて本発明の任意の実施例を実施することができる。これらの方法は、DNAポリメラーゼIであるクレノウフラグメント、SEQUENASE、Taq DNAポリメラーゼおよび熱耐性T7 DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech (APB), Picataway NJ)、或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Rockville MD)に用いられるような校正エクソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせを用いることができる。配列の準備は、HYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific, Sunnyvale CA)、MICROLAB 2200(Hamilton, Reno NV)、及びDNA ENGINEサーマルサイクラー(PTC200; MJ Research, Watertown MA)などの装置を用いて自動的に行うのが望ましい。シークエンシングに用いる装置には、ABI 3700、377または373DNAシークエンシングシステム(Applied Biosystems)、及びMEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(APB)等がある。当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて、シークエンシングした配列を解析することができる。これらのアルゴリズムは、Ausubel(1997; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7) 及びMeyers(1995; Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, pp. 856−853)に記載されている。
【0050】
ショットガンシークエンシングを用いて、様々に由来するクローニングしたインサートから更に配列を作り出す。ショットガンシークエンシング方法は当分野で周知であり、熱耐性DNAポリメラーゼや非熱耐性DNAポリメラーゼ、及び目的の核酸分子に隣接する代表的な領域から選択されたプライマーを用いる。当分野で周知のCONSED(Gordon (1998) Genome Res. 8:195−202)などの様々なアルゴリズムやプログラムを用いて、組み立てが未終了の配列(組立てが不完全な配列)を調べる。ベクターやキメラ配列、または欠失配列を含む汚染配列を除去して、組み立てが未終了の配列を完全な配列に組み立てる。
【0051】
核酸配列の伸長
本発明の配列は、当分野で周知の様々なPCR法を用いた方法で伸長することができる。例えば、XL−PCRキット(Applied Biosystems)及び入れ子プライマー(nested primer)、市販のcDNAまたはゲノムDNAライブラリ(Life Technologies; Clontech, Palo Alto CA, respectively)用いてヌクレオチド配列を伸長することが可能である。全てのPCR系の方法に用いることができるように、プライマーは、OLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア(Molecular Biology Insights, Cascade CO)等の市販のソフトウェアを用いて、ヌクレオチドの長さが約22〜30個、GC含量が約50%以上、約55〜68℃の温度で標的配列とアニールするように設計することが可能である。調節エレメントを復活させるために配列を伸長する場合は、cDNAライブラリよりゲノムライブラリを用いる方が良い。
【0052】
(本哺乳動物核酸分子の使用)
ハイブリダイゼーション
本哺乳動物核酸分子及びその断片は、様々な目的のための様々なハイブリダイゼーション技術に用いることができる。プローブは、5’調節領域やDSCR1タンパク質ファミリーに見られるN末端RNA結合ドメインなどのユニークな領域から作製可能であり、これらのプローブを、この哺乳動物タンパク質やアレル変位配列、または関連分子をコードする天然の分子を同定するためのプロトコルに用いることができる。通常は一本鎖であるDNA若しくはRNAからなるこのプローブは、任意のこの核酸配列と少なくとも50%の配列同一性を有することが望ましい。ハイブリダイゼーションプローブは、標識されたヌクレオチドの存在下でのPCR増幅、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、または末端標識化を利用して作製することができる。この核酸分子またはその断片を含むベクターを用いて、RNAポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを加えてin vitroでmRNAプローブを作製することができる。これらの方法はAPBが販売するキットを用いて行うことができる。
【0053】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー(厳密性)は、プローブのGC含量、塩濃度、及び温度によって決まる。特に、塩濃度を下げる、またはハイブリダイゼーションの温度を上げて、ストリンジェンシーを高めることができる。ある膜系のハイブリダイゼーション用の溶液にホルムアミドなどの有機溶媒を加えて、反応が低い温度で起こるようにすることができる。ハイブリダイゼーションは、低いストリンジェンシーの緩衝液(5×SSC、1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS))で、60℃で行うことができるが、核酸配列間に不適正塩基対を含む複合体の形成を許容し得る。続く洗浄は、45℃(中程度のストリンジェンシー)或いは68℃(高いストリンジェンシー)の何れかの温度、0.2×SSC、0.1%SDSなどの高いストリンジェンシーで行う。高いストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーション複合体は、完全に相補的な核酸分子部分のみが安定して保持される。ある膜系のハイブリダイゼーションにおいて、好ましくは35%、最も好ましくは50%のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に加えて、ハイブリダイゼーションを行う温度を下げたり、または、SarkosylやTriton X−100などの界面活性剤及び変性したサケ精子DNAなどのブロッキング試薬を用いてバックグラウンドシグナルを低減することが可能である。ハイブリダイゼーションの条件や要素の選択については当分野で周知であり、Ausubel(前出) 及びSambrook他(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY.に記載されている。
【0054】
当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して分析することができる。オリゴヌクレオチドをマイクロアレイのプローブや標的として用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多数の遺伝子の発現レベルをモニタリングし、遺伝子変異体、突然変異及びSNP(一塩基多型)を同定することができる。このようなデータを用いて、遺伝子機能の解明や、症状及び疾患、または障害における遺伝子原理の解明や、症状及び疾患、障害の診断または治療、治療薬の開発、並びにこれらの治療薬の活性のモニタリングが可能である(例えば、Brennan他(1995) USPN 5,474,796; Schena他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614−10619; Baldeschweiler他(1995) PCT出願 WO95/251116; Shalon他(1995) PCT出願WO95/35505; Heller他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150−2155; and Heller他(1997) USPN 5,605,662を参照)。
【0055】
ハイブリダイゼーションプローブはまた、天然のゲノム配列のマッピングに有用である。このプローブは、(1)特定の染色体、(2)染色体の特定の領域、(3)ヒト人工染色体(HACs)や酵母人工染色体(YACs)、細菌人工染色体(BACs)、細菌P1作製物、または単一の染色体、または(5)これらから作製されたcDNAライブラリなどの人工染色体作製物、にハイブリダイズすること可能である。
【0056】
発現
哺乳動物DSCR1L1αタンパク質をコードする多数の核酸分子をベクターにクローニングして、このタンパク質若しくはその一部を宿主細胞で発現させることができる。この核酸配列を、DNAシャフリング(Stemmer and Crameri (1996) USPN5,830,721)や部位特異的変異誘発などの方法によって、新規の制限部位を作り出したり、グリコシル化パターンを変えたり、優先コドンを変えて特定の宿主における発現を増大させたり、スプライスバリアントを作り出したり、半減期を延長する等の操作が可能である。この発現ベクターは、特定の宿主における各要素の効率に基づいて選択された様々なサンプルに由来する転写及び翻訳調節エレメント(プロモーター及びエンハンサー、特定の開始シグナル、ポリアデニル化3’配列)を含み得る。in vitro組み換えDNA技術、合成技術及び/またはin vivo遺伝子組み換え技術を組み合わせて、このベクターに核酸配列と調節エレメントをつなぐことができる。このような技術は、当分野で周知であり、Sambrook(前出、ch. 4, 8, 16 and 17)に記載されている。
【0057】
様々な宿主系を発現ベクターで形質転換することができる。以下に限定するものではないが、これらの中には組み換えバクテリオファージやプラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌と、酵母発現ベクターで形質転換された酵母と、バキュロウイルス発現ベクターで形質転換された昆虫細胞系と、ウイルスエレメント及び/または細菌エレメントを含む発現ベクターで形質転換された植物細胞系や動物細胞系が含まれる(Ausubel前出、unit 16)。例えば、アデノウイルス転写/翻訳複合体を哺乳動物細胞に用いることができる。配列をウイルスのゲノムのE1若しくはE3領域に結合させた後、この感染ウイルスを用いて形質転換させ、宿主細胞でタンパク質を発現させることができる。また、ラウス肉腫ウイルスエンハンサーやSV40、またはEBV系のベクターを用いてタンパク質を高発現させることができる。
【0058】
核酸配列のルーチンのクローニング及びサブクローニング、増殖は、多機能PBLUESCRIPTベクター(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT1プラスミド(Life Technologies)を用いて行うことができる。核酸配列をこれらのベクターの多数のクローニング部位に導入すると、lacZ遺伝子が破壊され、形質転換された細菌を確認するための比色法によるスクリーニングが可能となる。更に、これらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitroでの転写及びジデオキシ法によるシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖の調整、入れ子状欠失の作製において有用である。
【0059】
長期に渡って組み換えタンパク質を産生させるために、同一或いは別のベクター上の選択マーカー遺伝子或いは可視マーカー遺伝子と共にこのベクターを持続的に細胞株に形質転換することができる。形質転換後、細胞を強化培地で約1〜2日間増殖させてから選択培地に移す。選択マーカー、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性遺伝子は、関連する選択薬に対する抵抗性を与え、導入配列を確実に発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。アントシアニン、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどの可視マーカーの発現によって同定された、或いは選択培地に生存することによって同定された耐性クローンを、培養技術を用いて増殖することができる。また、可視マーカーを用いて、導入された遺伝子によって発現するタンパク質を定量することができる。宿主細胞が目的の哺乳動物核酸分子を含むか否かの決定は、DNA−DNAまたはDNA−RNAハイブリダイゼーション、或いはPCR増幅技術に基づいて行うことができる。
【0060】
宿主細胞は、組み換えタンパク質を目的の形に修飾する能力に基づいて選択することができる。このような修飾には、アセチル化及びカルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化等が含まれる。「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングを利用して、タンパク質のターゲッティング、折り畳み及び/または活性を特定することができる。翻訳後活性のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有するATCC(Manassas, MD)から得られる異なった宿主細胞が、組み換えタンパク質の適当な修飾及びプロセシングが確実に行われるようにするために選択され得る。
【0061】
細胞培地からのタンパク質の回収
精製を容易にするために、ベクターに導入する異種部分は、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、6−His、FLAG、MYC等を含む。GST及びCBP、6−Hisはそれぞれ、グルタチオン及びカルモジュリン、金属キレート樹脂が結合した市販のアフィニティーマトリックスを用いて精製される。FLAG及びMYCは、市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて精製される。目的のタンパク質配列と異種部分との間にタンパク分解切断部位を設けて、生成の後の分離が容易にすることができる。組み換えタンパク質の発現及び精製の方法はAusubel(前出、unit 16)に記載され市販されている。
【0062】
ペプチドの化学合成
タンパク質若しくはその一部は、組み換え方法以外の当分野で周知の化学的方法によって合成することもできる。固相技術を用いるペプチド合成は、バッチ式或いは連続的なフロープロセスによって行うことができる。連続的なフロープロセスでは、αアミノ保護及び側鎖保護アミノ酸残基をリンカーを介して不溶性の高分子支持物に連続的に追加する。メチルアミン誘導体化ポリエチレングリコールなどのリンカーを、ポリ(スチレン−co−ジビニルベンゼン)に結合させて支持レジンを形成する。このアミノ酸残基は、酸不安定Boc(t−butyloxycarbonyl)法若しくは塩基不安定Fmoc(9−fluorenylmethoxycarbonyl)法によって保護されたN−α−である。保護されたアミノ酸のカルボキシル基をリンカーのアミンに結合して、この残基を固相支持レジンに結合させる。Boc若しくはFmocを用いた場合、トリフルオロ酢酸若しくはピペリジンを用いて保護基を除去する。カップリング試薬若しくは予め活性化されたアミノ酸誘導体を用いて、追加する各アミノ酸を結合された残基に付加してから、レジンを洗浄する。完全長のペプチドは、連続的な保護の停止、即ち誘導体化アミノ酸を結合させて合成し、ジクロロメタン及び/またはN、N−ジメチルホルムアミドで洗浄する。このペプチドは、ペプチドカルボキシル末端とリンカーとの間で切断され、ペプチド酸またはペプチドアミドが作られる(Novabiochem 1997/98 Catalog and Peptide Synthesis Handbook, San Diego CA pp. S1−S20)。ABI 431 A ペプチドシンセサイザー(Applied Biosystems)などの装置を用いて、ペプチドを自動合成することができる。タンパク質またはその一部は調整用の高性能液体クロマトグラフィーによって精製し、その組成をアミノ酸解析またはシークエンシングによって確認することができる(Creighton (1984) Proteins. Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY)。
【0063】
抗体の準備及びスクリーニング
ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、及びヒト等を含む様々な宿主は、哺乳動物DSCR1L1αタンパク質若しくはその任意の一部を注入して免疫することができる。フロイントなどのアジュバント及びミネラルゲルと、リゾレシチン及びpluronic polyol、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)、ジニトロフェノールなどの表面活性物質とを用いて免疫反応を高めることができる。オリゴペプチドやペプチド、またはタンパク質の一部を用いて、少なくとも約5個のアミノ酸、より好ましくは10個の天然のタンパク質の一部と同一のアミノ酸を含む抗体を誘発させる。キメラ分子に対する抗体を産生させるために、オリゴヌクレオチドをKLHなどのタンパク質と融合させることができる。
【0064】
モノクローナル抗体は、培地の連続細胞株によって抗体を産生させる任意の技術を用いて準備する。以下に限定するものではないが、このような技術には、ハイブリドーマ技術及びヒトB細胞ハイブリドーマ技術、EBV−ハイブリドーマ技術が含まれる(例えば、Kohler他(1975) Nature 256:495−497; Kozbor他(1985) J. Immunol. Methods 81:31−42: Cote他(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026−2030; and Cole他(1984) Mol. Cell Biol. 62:109−120.を参照)。
【0065】
別法では、当分野で周知の方法を用いる上記した一本鎖抗体を生産する技術で、エピトープ特異的一本鎖抗体を生産する。本哺乳動物タンパク質のエピトープに対して特異的に結合する部位を含む抗体断片を生産することが可能である。限定するものではないが、このような断片には、例えば、抗体分子のペプシン消化によって作製されたF(ab’)2断片及びこのF(ab’)2断片のジスルフィド架橋を減少させて作製したFab断片が含まれる。別法では、Fab発現ライブラリを作製して、目的の特異性を有するモノクローナルFab断片の高速かつ容易に同定できるようにする(例えば、Huse他(1989) Science 246:1275−1281を参照)。
【0066】
本哺乳動物DSCR1αタンパク質若しくはその一部を用いて、ファージミドまたはBリンパ球免疫グロブリン・ライブラリをスクリーニングして、目的の特異性を有する抗体を同定する。確立された特異性を有するモノクローナル抗体或いはポリクローナル抗体のいずれか一方を用いる、競合的結合またはイムノアッセイの様々なプロトコルが当分野で周知である。このようなイムノアッセイは通常、このタンパク質とその特異的な抗体との複合体形成の測定を行う。2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合によるアッセイを用いることもできる(Pound (1998) Immunochemical Protocols. Humana Press, Totowa NJ)。
【0067】
アッセイのための分子の標識化
多様な標識化及び接合技術が当分野で周知であり、様々な核酸やアミノ酸、及び抗体のアッセイに用いることができる。標識した分子の合成は、32P−dCTPまたはCy3−dCTP、Cy5−dCTPなどの標識したヌクレオチドや35Sメチオニン(APB)などのアミノ酸を組み込むためのAPBキットまたはPromega (Madison WI)を用いて行うことができる。ヌクレオチド及びアミノ酸は、BIODIPYまたはFITC(Molecular Probes, Eugene OR)などの試薬を用いて分子中に存在するアミン及びチオール基または他の基に化学的に結合させることで、様々な物質(蛍光剤または化学発光剤、色素産生剤など)で直接標識することができる。
【0068】
(診断)
本核酸分子、断片、オリゴヌクレオチド、相補的なRNA及びDNA分子、PNAを用いて、遺伝子発現の変化やmRNAの過剰な発現の不在/存在を検出及び定量、または治療期間中のmRNAレベルのモニタリングを行うことができる。発現変動に関連する症状や疾患には、アルツハイマー病、ダウン症候群、ハンチントン病、及びピック病が含まれる。診断アッセイにハイブリダイゼーションまたは増幅技術を用いて、遺伝子発現の変化を検出するべく、患者からの生体サンプルの遺伝子発現レベルを標準的なサンプルの値と比較する。質的または量的なこのような比較法は当分野で周知である。
【0069】
例えば、本核酸分子またはプローブを標準的な方法で標識して、これをハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者からの生体サンプルに加える。インキュベーションの後、このサンプルを洗浄し、ハイブリダイゼーション複合体に関連する標識(シグナル)の量を定量して標準値と比較する。患者のサンプルにおける標識の量が標準値と著しく異なっている(高いまたは低い)場合は、関連する症状や疾患、または異常症の存在が示唆される。
【0070】
遺伝子発現に関連する症状や疾患、または異常症の診断のための基準を設けるために、正常或いは標準的な発現プロフィールを確立する。この発現プロフィールは、動物かヒトの正常な被験体から採取した生体サンプルを、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、プローブと結合させることによって確立することができる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験体から得た値と、実質的に精製された標的配列を所定量用いた実験値とを比較することによって定量することができる。このように求めた標準値を、特定の症状や疾患、または異常症を示す患者のサンプルから得た値と比較することができる。標準値と特定の症状に関連する値との偏差からその症状を診断する。
【0071】
またこのようなアッセイを用いて、動物実験や臨床検査における特定の治療計画の効果を評価したり、患者個人の治療をモニタリングすることができる。病態が確認されると治療プロトコルを開始し、通常ベースで診断アッセイを繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患者に示される値に近づき始めたか否かを調べることが可能である。連続して行ったアッセイの結果から、数日から数ヶ月に渡る期間の治療効果を調べることができる。
【0072】
免疫学的方法
特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体の何れかを用いるタンパク質の検出及び定量は当分野で周知である。このような技術には、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)及びラジオイムノアッセイ(RIA)、蛍光活性化セルソーター法(FACS)が含まれる。2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを用いることもできる(例えば、Coligan 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Wiley−Interscience, New York NY; および Pound 前出)。
【0073】
(治療)
例えばRNA結合ドメインと保存されたセリン/プロリン・モチーフの文字列における化学的および構造的な類似性が、SEQ ID NO:2の或る領域と、ヒトDSCR1、ヒト(g1435040)、及びヒトDSCR1L2(g6017919)などの他のDSCR1ファミリータンパク質の或る領域との間に存在する。発現または活性の上昇に関連する症状の治療においては、タンパク質の発現または活性を低下させることが望ましい。また、発現または活性の低下に関連する症状の治療においては、タンパク質の発現または活性を増大させることが望ましい。
【0074】
一実施例において、本哺乳動物タンパク質の発現または活性の変化に関連する症状の治療または予防のために、本哺乳動物タンパク質、その一部、またはその誘導体を患者に投与することが可能である。このような疾患の例には、限定するものではないがアルツハイマー病、ダウン症候群、ハンチントン病、及びピック病が含まれる。
【0075】
別の実施例では、医薬用担体と共に精製された哺乳動物タンパク質を含む医薬組成物を患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこの内在性タンパク質の活性、または発現の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【0076】
更なる実施例では、この哺乳動物タンパク質の活性を調節するリガンドを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこのタンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。一実施態様では、この哺乳動物タンパク質に特異的に結合する抗体を、この哺乳動物タンパク質を発現する組織や細胞に薬剤を送達するためのターゲッティング或いは送達機構として用いることもできる。
【0077】
更なる実施例では、この哺乳動物タンパク質またはその一部や誘導体を発現可能なベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこのタンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【0078】
更なる実施例では、この核酸分子やその断片の相補配列を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこのタンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【0079】
本核酸分子、またはそれに相補的な分子やその一部、そのタンパク質やその一部の内の任意のもの、これらの核酸分子やタンパク質を運ぶベクター、及びそれらのリガンドをその他の薬剤と共に投与することが可能である。併用療法に用いる薬剤の選択は、当業者が従来の薬学原理に従って行うことができる。薬剤を併用することによって、少量の各薬剤で特定の症状の予防または治療において相乗的な効果をあげることが可能である。
【0080】
核酸を用いる遺伝子発現の調節
遺伝子の発現は、哺乳動物遺伝子の5’または3’調節領域、或いは他の調節領域に対して相補的或いはアンチセンス分子を設計することで調節することが可能である。転写開始部位に対して設計されたオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合を阻止する三重螺旋塩基対合で遺伝子発現を阻止することができる(Gee 他 In: Huber and Carr (1994) Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, pp. 163−177)。また、リボソームとmRNAとの結合を阻止して翻訳が行われないように、相補的な分子を設計することも可能である。或るいは、核酸分子またはその断片のライブラリをスクリーニングして、翻訳されない調節配列に特異的に結合する核酸分子または断片を同定することも可能である。
【0081】
また、酵素活性をもつRNA分子であるリボザイムを用いて、RNAの特異的な切断を触媒してもよい。リボザイム作用のメカニズムは、まずリボザイム分子と相補的な標的RNAとの配列特異的なハイブリダイゼーションが起こり、次にGUAおよびGUU、GUCなどの部位においてヌクレオチド鎖が切断される。このような部位が一旦同定されたら、オリゴヌクレオチドを機能不全にしうる二次構造特性について、同じ配列を有するオリゴヌクレオチドを評価することができる。また、候補標的としての適合性は、RNA分解酵素保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検査して評価することができる。
【0082】
本発明の相補的な核酸およびリボザイムは、固相ホスホラミダイト化学合成法を用いて、in vitroまたはin vivoでの組換え発現によって調製することが可能である。更に、RNA分子は、その5’および/または3’末端に隣接配列を付加して、或いは分子のバックボーン内のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオネートまたは2’O−メチルを用いて、細胞内の安定性および半減期が増大するように改変することができる。この改変はPNAの作製に固有であるが、他の核酸分子にも適用することができる。例えばイノシン、queosine、wybutosineなどの伝統的でない塩基を含めて、またはアセチル基、メチル基、チオ基でウリジン、アデニン、シチジン、グアニン、およびチミンを修飾して、内在性エンドヌクレアーゼに対する分子の有効性を低くする。
【0083】
スクリーニングアッセイ
本哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子を用いて、分子のライブラリをスクリーニングして特異的な結合親和性を調べることが可能である。このライブラリは、生物系において核酸分子の活性、複製、転写、または翻訳を調節するDNA分子、RNA分子、PNA、ペプチド、転写因子などのタンパク質、エンハンサー、リプレッサー、およびその他のリガンドを含み得る。このアッセイは、特異的な結合が許容される条件下で、哺乳動物核酸分子またはその断片を分子のライブラリと結合させるステップと、特異的な結合を検出して、その核酸分子と特異的に結合する少なくとも1つの分子を同定するステップとを含む。
【0084】
同様に、本哺乳動物タンパク質またはその一部を用いて、任意の様々なスクリーニングアッセイで分子または化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングに用いるタンパク質の一部は、溶液中に遊離している、非生物的若しくは生物的な基板に固定されている、または細胞内に位置していてもよい。そのタンパク質と分子との特異的な結合を測定することが可能である。スクリーニングするライブラリの種類によって、アッセイでそのタンパク質に特異的に結合するDNA、RNA、PNA分子、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、ペプチド、タンパク質、薬剤、または他の任意のリガンドを同定することが可能である。極めて少ないアッセイ容量および極少量の試験化合物を用いるハイスループットのスクリーニング方法が、米国特許第5,876,946号に記載されている。この方法は、酵素阻害または受容体結合を調べるために多数の分子をスクリーニングする。
【0085】
リガンドの精製
本核酸分子またはその断片を用いてサンプルからリガンドを精製することが可能である。哺乳動物核酸分子またはその断片を用いてリガンドを精製する方法は、特異的な結合が許容される条件下でその核酸分子またはその断片とサンプルとを結合させるステップと、特異的結合を検出するステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、好適な試薬を用いて精製されたリガンドから核酸分子を分離するステップとを含む。
【0086】
同様に、本タンパク質またはその一部を用いてサンプルからリガンドを精製することが可能である。哺乳動物タンパク質またはその一部を用いてリガンドを精製する方法は、特異的な結合が許容される条件下でそのタンパク質またはその一部とサンプルとを結合させるステップと、そのタンパク質をリガンドとの間の特異的な結合を検出するステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、好適なカオトロピック剤を用いて精製されたリガンドからタンパク質を分離するステップとを含む。
【0087】
薬理学
医薬組成物とは、所望の目的を達成するのに効果的な量の活性成分を含んでいる物質である。効果的な薬用量の決定は、当分野の技術者の能力による部分が大きい。どんな化合物であっても、初めは細胞培養アッセイ或いは動物モデルの何れかによって治療効果のある薬用量を推定する。また、動物モデルを使って、好適な濃度範囲および投与経路を決定する。次に、このような情報を用いて、ヒトへの効果的な投与経路および薬用量を決定する。
【0088】
治療効果のある薬用量とは、症状または病態を改善するタンパク質またはインヒビターの量である。このような薬剤の薬用効果および毒性は、例えば、ED50(集団の50%に医薬的効果がある投与量)およびLD50(集団の50%に致命的である投与量)などの細胞培養または実験動物における標準的な製薬方法によって決定することができる。或る投与量における毒性効果と治療効果との比率が治療指数となり、LD50/ED50と示すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて、ヒトへ適用する薬用量の範囲を決定する。
【0089】
モデル系
動物モデルを用いて、ヒトに相当する暴露条件で動物モデルがヒトに類似の毒物反応を示すバイオアッセイを行うことができる。哺乳動物が最も一般的なモデルである。大抵の毒物研究は、低コストで入手が容易であり、かつ参照できる中毒学が豊富であることから、ラットやマウスなどの齧歯類を用いて行われる。齧歯類近交系は、目的の遺伝子の過剰或いは過少な発現の生理学的な原因を調査するのに有用なモデルであり、疾患の診断および治療方法の開発にも有用である。特定の遺伝子を大量に発現する(例えば、乳汁中に分泌される)同系哺乳動物は、その遺伝子によって発現されるタンパク質の便利な供給源となり得る。
【0090】
中毒学
中毒学とは、生物系における物質の影響を研究する学問である。殆どの毒物研究はラットまたはマウスを用いて、物質がヒトの健康に与える影響を推定する。生理機能及び行動、恒常性プロセス、致死率における質的及び量的変化を観察して、毒性プロフィールを作成し、その物質に曝露された後のヒトの健康状態を評価する。
【0091】
遺伝子毒物学は、物質が遺伝子の突然変異を引き起こす能力を同定し分析する。遺伝毒性物質は通常、核酸との相互作用を促進する共通の化学的或いは物理的特性を有し、突然変異した染色体が子孫に受け継がれるのが最大の害である。毒物研究によって、受胎前の両親のどちらか一方、または妊娠中の母、発生段階の生物に投与された場合の、子孫における構造的或いは機能的な異常の頻度を増加させる物質を同定することが可能である。マウス及びラットは生殖周期が短く、統計的必要性を満たす多数の子を出産する能力から、これらの試験にはマウス及びラットが用いられる場合が最も多い。
【0092】
急性毒物の検査は、被験体への物質の一回の投与に基づき、その物質による症状または致死率を決定する。この検査では、(1)初めの投与量の範囲を決定する実験と、(2)有効な投与量の範囲を狭める実験と、(3)用量応答曲線を確立する実験の3つの実験が行われる。
【0093】
長期に渡る毒性検査では繰り返し物質を投与する。このような検査には、ラットやイヌが一般的に用いられ、分類学上異なった種からデータを収集する。物質を高い投与濃度で3〜4ヶ月間、毎日投与することで、発癌を除く、成体動物における殆どの毒性の種類が明らかになるという研究結果が多数報告されている。
【0094】
一年或いはそれ以上の長期に渡る慢性毒性検査は、物質に毒性がないこと、或いは物質の発癌の可能性の何れかを実証するために行われる。ラットで検査が行われる場合、少なくとも3つの検査グループと1つの対照グループが用いられ、最初から最後まである間隔で検査及びモニタリングが行われる。
【0095】
遺伝子組換え動物モデル
目的の遺伝子を過剰或いは過小に発現する遺伝子組換え齧歯類を同系交配し、それを用いてヒト疾患モデルを作製したり、治療薬検査や毒物検査を行う(例えば、米国特許第4,736,866号、同第5,175,383号、および同第5,767,337号を参照)。場合によっては、導入遺伝子が、胚発生中若しくは出生後の特定の時期に特定の種類の組織で活性化され得る。導入遺伝子の発現は、実験的薬剤治療を施す前、その最中、またはその後の、遺伝子組換え動物における表現型や組織特異的なmRNAの発現の分析からモニタリングすることができる。
【0096】
胚性幹細胞
齧歯類胚から単離された胚性幹細胞(ES細胞)は、胚を形成する可能性を維持している。ES細胞がキャリアとなる胚の中に導入されると、正常な発生が再開され、生まれる動物の全ての組織の一部を担うことになる。ES細胞は、実験用のノックアウトおよびノックイン齧歯類系を作製するのに好適な細胞である。マウス129/SvJ細胞株などのマウスES細胞は、マウスの初期胚から採取されてから当分野で周知の培養条件下で増殖されたものである。ノックアウト系に用いるベクターには、マーカー遺伝子配列を含むように破壊された疾患候補遺伝子が含まれる。このマーカー遺伝子配列は、in vivoでその転写および/または翻訳を阻害する。このベクターを、当分野で周知の電気穿孔法、アデノウイルス運搬法、及びマイクロインジェクション等の形質転換方法によってES細胞に導入する。齧歯類の内在性遺伝子が、細胞分裂の際の相同組換えや組み込みによって、破壊された疾患遺伝子に置換される。形質転換されたES細胞を或る条件で選択して特定し、C57BL/6マウス系などからのマウス細胞胚盤胞に微量注入するのが好ましい。この胚盤胞を複数の偽妊娠メスに外科的に導入し、その遺伝子型を有するキメラ子孫を産ませ、それらのキメラ子孫を交配してヘテロ接合系またはホモ接合系を作製する。
【0097】
また、in vitroでの神経細胞および造血系、心筋細胞などの様々な細胞型や組織の分化の研究に、ES細胞が用いられている(Bain 他 (1995) Dev. Biol. 168:342−357; Wiles and Keller (1991) Development 111:259−267; and Klug 他 (1996) J. Clin. Invest. 98:216−224)。近年の研究により、ヒト胚盤胞由来ES細胞をin vitroで操作して、内胚葉および中胚葉、外胚葉性の細胞型を含む8つの別の細胞系譜に分化可能であることが実証された(Thomsonら (1998) Science 282:1145−1147)。
【0098】
ノックアウト分析
遺伝子ノックアウト分析では、ヒト疾患遺伝子候補のある領域が、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの非哺乳動物遺伝子を含むように酵素によって改変される(neo ; Capecchi (1989) Science 244:1288−1292)。挿入されたコード配列は、標的遺伝子の転写および翻訳を阻害して疾患候補タンパク質の生化学的な合成を阻止する。この改変した遺伝子を培養胚性幹細胞(上記)に形質転換し、この形質転換細胞を齧歯類胞胚に注入し、この胞胚を偽妊娠メスに移植する。この遺伝子組換え子孫をクロス交配して、ホモ接合近交系を作り出す。
【0099】
ノックイン分析
胚発達の初期段階に現われる分化全能性ES細胞を用いてノックインヒト化動物(ブタ)または遺伝子組換えヒト疾患動物モデル(マウスまたはラット)を作り出すことができる。ノックイン技術を用いて、ヒト遺伝子のある領域を動物ES細胞に注入し、そのヒト配列が組換えによって動物細胞ゲノムの中に組み込まれるようにする。ヒト遺伝子が組み込まれた全能性ES細胞を上記したように操作する。ヒトの症状に類似の情報を収集するべく、この近交系動物の研究および処置を行う。これらの方法を用いて、幾つかのヒト疾患モデルを作り出す(例えば、Lee 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95:11371−11376;Baudoin 他 (1998) Genes Dev. 12:1202−1216; and Zhuang 他 (1998) Mol. Cell Biol. 18:3340−3349)。
【0100】
非ヒト霊長類モデル
動物実験の分野は、生理学および遺伝学、化学、薬理学、統計学等の基本科学から得たデータおよび方法論を利用する。このようなデータは、非ヒト霊長類がヒトの健康に関連し得るため、非ヒト霊長類における治療薬の効果の評価に重要である。ヒトの代わりにサルをワクチンおよび薬剤の評価に用いる。サルの反応は、類似の条件下でのヒトへの暴露に相当する。カニクイザル(Macaca fascicularis、Macaca mulatta)、および一般的なマーモセット(Callithrix jacchus)は、このような実験に用いられる最も一般的な非ヒト霊長類(NHP)である。NHPの群体作りおよび維持には多大な費用が掛かるため、初期の研究および毒物学的検査は、通常は齧歯類モデルで行われる。薬物嗜癖などの行動を調べる研究では、NHPは最良の実験動物である。更に、個々のNHPおよびヒトは、多くの薬剤および毒物に対して異なった感受性を示すため、これらの物質を「高代謝型」および「低代謝型」に分類することができる。
【0101】
更なる実施例では、限定するものではないが、トリプレット遺伝子コードおよび特異的な塩基対相互作用などの特性を含む、現在知られている核酸配列の特性に新しい技術が依存する場合は、本哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子を、開発中のあらゆる分子生物学技術に用いることが可能である。
【0102】
(実施例)
本発明は、記載した特定の装置及び物質、方法に限定されるものではないことを理解されたい。特定の実施例について説明するが、同等の実施例を用いて本発明を具現することも可能である。本発明の範囲は、前記請求の範囲によってのみ限定されるものであって、記載した実施例によって限定されるものではない。また、以下に記載の実施例は、本発明を例示するためのものであって本発明を限定するものではない。例示目的で、ヒト海馬cDNAライブラリHIPONON02の作製方法を記載する。
【0103】
1 cDNA の作製
ヒト海馬cDNAライブラリHIPONON02は、頭蓋内出血で死亡した72歳の白人女性の海馬から採取した組織を用いて作製した。凍結組織を、POLYTRONホモジナイザー(PT−3000;Brinkmann Instruments, Westbury, NY)を用いて、TRIZOL試薬(1gの組織にTRIZOL 10ml;Life Technologies)においてホモジナイズし溶解した。ホモジナイズした後、クロロホルム(1:5 v/v クロロホルム:ホモジネート)を加え、溶解物を遠心分離した。水層を取り除いて、イソプロパノールでRNAを沈殿させた。RNAをDEPC処理水で再懸濁し、27℃で35分間、DNアーゼI(Life Technologies)で処理した。このRNAを酸性フェノールクロロホルム(pH4.7)で一回再抽出して、0.3M酢酸ナトリウムおよび2.5倍量のエタノールで沈殿させた。
【0104】
メッセンジャーRNA(mRNA)をOLIGOTEXキット(QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA)を用いて単離した。これをcDNAライブラリの作製に用いた。このmRNAを、mRNAのポリ(A)尾部で一本鎖cDNAの合成を開始するように設計されたNotIプライマー−アダプターを含むSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)の推奨プロトコルに従って処理した。二本鎖cDNAを平滑化し、EcoRIアダプターに結合し、NotI(New England Biolabs, Beverly MA)で消化した。このcDNAを、SEPHAROSE CL−2Bカラム(APB)上で分画化し、800bpを越える大きさのcDNAを、PSPORT1プラスミド(Life Technologies)のNotI及びEcoRI部位に結合させた。この組換えプラスミドを、DH5α、DH12s、DH10Bコンピテント細胞(全てLife Technologies)に形質転換した。
【0105】
2 cDNA ライブラリの標準化
例を示すために、ヒト脳ライブラリの標準化について説明する。大腸菌株DH12Sコンピテント細胞(Life Technologies)におけるHIPONOT01プラスミドライブラリの約1.13×106の独立したクローンを、カルベニシリン(25mg/l)及びメチシリン(1mg/ml)選択下で、培地で成長させ、その後に電気穿孔法により形質転換を行った。ライブラリの存在レベルに従って余剰のcDNA複製物の数を減らすために、cDNAライブラリを以下の変更点を除きSoares他(1994, Proc Natl Acad Sci 91: 9228−9232)の方法に従って1回標準化した。変更点は次の通りである。プライマー伸長反応における鋳型に対するプライマーの比率を2:1から10:1に高めた。反応液のddNTP濃度を、より長いプライマー伸長物(400〜1000塩基)が形成できるように各ddNTPを150μMまで低下させた。アニーリングハイブリダイゼーションを13時間から48時間に延長した。標準化したライブラリの一本鎖DNAサークルを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーで精製し、ランダムプライミングにより部分的な2本鎖に変換し、大腸菌株DH10Bコンピテント細胞(Life Technologies)の中に電気穿孔法により導入した。
【0106】
3 pINCY プラスミドの作製
このプラスミドは、pSPORT1プラスミド(Life Technologies)をEcoRI制限酵素(New England Biolabs, Beverly MA)で消化し、オーバーハングした端部を、クレノウ酵素(New England Biolabs)及び2’−デオキシヌクレオチド5’−三リン酸(dNTPs)を用いて二本鎖に合成した。このプラスミドが自己連結した後、このプラスミドで細菌宿主となる大腸菌株JM109を形質転換した。
【0107】
細菌(pSPORT 1−△RI)によって生成された中間プラスミドは、EcoRIでは消化されず、Hind III (New England Biolabs)で消化し、オーバーハングした端部をクレノウ酵素及びdNTPsで二本鎖にした。リンカー配列をリン酸化し、5’平滑末端に繋ぎ、EcoRIで消化し、自己連結させた。JM109宿主細胞を形質転換した後、プラスミドを単離し、Hind IIIではなくEcoRIで選択的な消化の検査を行った。この基準を満たす1つのコロニーをpINCYプラスミドとを呼ぶ。
【0108】
NotI及びEcoRI制限酵素を用いて作製したライブラリからcDNAを取り込むプラスミドの能力を検査した後、いくつかのクローンをシークエンシングし、約0.8kbのインサートを含む1つのクローンを選択し、そのクローンから大量のプラスミドを生成した。NotI及びEcoRIで消化した後、ライブラリの作製に用いるためにこのプラスミドをアガロースゲル上で分画し、QIAQUICKカラム(Qiagen)を用いて精製した。
【0109】
4 cDNA クローンの単離及びシークエンシング
プラスミドDNAを細胞から遊離し、MINIPREPキット(Edge Biosystems, Gaithersburg MD)またはREAL Prep 96プラスミドキット(Qiagen)のいずれかを用いて精製した。このキットには、96ウェルブロック、及び960回の精製を行うための試薬が含まれている。以下の変更点を除き、推奨プロトコルに従った。(1)細菌を、25mg/lのカルベニシリン及び2.4%のグリセロールと共に1mlの滅菌TERRIFIC BROTH(BD Biosciences, San Jose CA)において培養した。(2)19時間インキュベートしてから、0.3mlの溶解バッファで溶解した。(3)イソプロパノール沈殿の後、プラスミドDNAのペレットを0.1mlの蒸留水で再懸濁した。プロトコルの最終ステップの後、サンプルを96ウェルブロックに移し、4℃で保管した。
【0110】
MICROLAB 2200システム(Hamilton, Reno NV)及びDNA ENGINEサーマルサイクラー(MJ Research)を用いて、シークエンシングするためにcDNAを調整した。このcDNAを、ABI PRISM377シークエンシングシステム(Applied Biosystems)またはMEGABASE 1000 DNAシークエンシングシステム(APB)を用いてSanger and Coulson (1975; J Mol Biol 94: 441−448)の方法でシークエンシングした。単離したもののほとんどを、標準的なABIプロトコル及びキット(Applied Biosystems)に従って、0.25×〜1.0×の濃度の溶液容量でシークエンシングした。別法では、APBから入手した溶液及び色素を用いてcDNAをシークエンシングした。
【0111】
5 cDNA 配列の伸長
本cDNAは、cDNAクローン及びオリゴヌクレオチドプライマーを用いて伸長した。一方のプライマーは既知の断片の5’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の3’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、OLIGプライマー分析ソフトウエア(National Biosciences Insights)を用いて、約22〜約30個のヌクレオチドの長さ、約50%以上のGC含量で、685〜72℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を形成するヌクレオチドのストレッチは排除した。
【0112】
選択されたcDNAライブラリを鋳型として用いてこの配列を伸長した。2段階以上の伸長が必要な場合は、追加の或いは入れ子状のプライマー(nested primer)を設計した。好適なライブラリは、大きなcDNAを含むように大きさが選択されたライブラリである。ゲノムライブラリは、調節エレメントを得るためにプロモーター結合領域の5’を伸長する際に有用である。
【0113】
米国特許第5,932,451号に開示されているような方法を用いてPCR法で高い忠実度の増幅を達成した。PCRは、DNA ENGINE サーマルサイクラー(MJ Research)を用いて96ウェルプレートで行った。反応混合液には、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、反応緩衝液(Mg2 +、(NH4)2SO4、β−メルカプトエタノールを含む)、Taq DNAポリメラーゼ(APB)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含まれている。プライマーの組、PCI A及びPCI B(Incyte Pharmaceuticals)に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 60℃で1分間
ステップ4 68℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す
ステップ6 68℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
別法では、プライマーの組、T7とSK+(Stratagene)に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 57℃で1分間
ステップ4 68℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す
ステップ6 68℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
【0114】
各ウェルのDNA濃度は、100μlのPICOGREEN定量試薬(1×TEにおける試薬0.25% (v/v); Molecular Probes)及び0.5μlの希釈していないPCR産物を不透明な蛍光光度計プレート(Corning, Acton MA)の各ウェルに分注して、DNAがその試薬と結合できるようにして測定した。このプレートをFluoroskan II (Labsystems Oy)でスキャンして、サンプルの蛍光を測定してDNAの濃度を定量化した。反応混合物の5〜10μlのアリコットを1%のアガロースミニゲル上で電気泳動して解析し、何れの反応がより長い配列の伸長に成功したかを決定した。
【0115】
伸長したクローンを脱塩及び濃縮してから384ウェルプレートに移し、CviJIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison WI)で消化し、pUC 18ベクター(APB)に再連結する前に音波処理または切断した。ショットガンシークエンシングのために、消化したヌクレオチド配列を低濃度(0.6%〜0.8%)のアガロースゲル上に分離させ、断片を切断し、ゲルをAGARACE酵素(Promega)で消化した。T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を用いて伸長したクローンをpUC 18ベクター(APB)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部位の延び出しを処理してから、大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。形質転換細胞が抗生物質を含む培地で選択され、それぞれのコロニーを切りとって、LB/2Xカルベニシリン培養液の入った384ウェルプレートの中で、37℃で一晩培養した。
【0116】
この細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(APB)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAを増幅した。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 60℃で1分間
ステップ4 72℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を29回繰り返す
ステップ6 72℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量した。DNA回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを20%のジメチルサルホサイド(dimethysulphoxide)(1:2, v/v)で希釈し、DYENAMICエネルギー移動シークエンシングプライマー及びDYENAMIC DIRECTサイクルシークエンシングキット(APB)またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reactionキット(Applied Biosystems)を用いてシークエンシングした。
【0117】
6 cDNA 及びそれらから導き出されたタンパク質の相同性検索
配列表のcDNA及びそれらから導き出されたアミノ酸配列を、GenBank、SwissProt、BLOCKSなどのデータベースにおいて検索する。すでに同定されアノテーションの付けられた配列またはドメインを含むこれらのデータベースを、BLASTまたはBLAST 2 (Altschulら、前出; Altschul、前出)を用いて検索し、アラインメントを作成し、完全に一致する或いは相同な配列を決定する。このアラインメントは、原核生物(細菌)または真核生物(動物、真菌、または植物)を起源とする配列に対するものである。或いは、Smith and Smith(1992, Protein. Engineering 5: 35−51)に記載されているようなアルゴリズムを用いて、一次配列パターン及び二次構造ギャップペナルティを処理することが可能である。本明細書に記載した全ての配列は、その長さが少なくとも49ヌクレオチドであり、不要な塩基(A、C、G、或いはTではなくNと記載)は12%以下である。
【0118】
Karlin (前出) に詳述されているように、問い合わせ配列とデータベース配列との間のBLASTによる一致を統計学的に評価し、ヌクレオチドに対しては10−25、ペプチドに対しては10−14の閾値を満たす一致のみを記録した。相同性はまた、以下のように計算した積スコアによって評価した。まず、BLASTにおける核酸またはアミノ酸同一性(問い合わせ配列と参照配列との間の)のパーセントに、最大可能BLASTスコアのパーセント(問い合わせ配列及び参照配列の長さに基づく)を乗じてから、100で除した。実験室で用いられるハイブリダイゼーション法と比べ、完全一致に対する電子的なストリンジェンシーを70と設定し、完全一致に対する保守的な下限を約40に設定した(不要な塩基対による1〜2%のエラーを有する)。
【0119】
無料で利用可能な配列比較アルゴリズムであるBLASTソフトウエア一式(NCBI, Bethesda MD; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html)は、既知の核酸分子を整列するために用いる“blastn”、及び核酸分子或いはアミノ酸分子のいずれかの直接ペアワイズ比較に用いられるBLAST2を含む様々な配列分析プログラムを含む。BLASTプログラムは、一般に、例えば以下のようにデフォルト設定されたギャップ及びその他のパラメーターで実行される。
【0120】
同一性を、配列の全長或いは配列の一部に対して測定することができる。Brennerらが(1998; Proc Natl Acad Sci 95: 6073−6078、言及することをもって本明細書の一部とする)、配列同一性により構造の相同性を同定するBLASTの能力を分析した。この分析により、少なくとも150残基の配列アラインメントに対して30%の同一性が信頼できる閾値であり、少なくとも70残基の配列アラインメントに対して40%の同一性が信頼できる閾値である。
【0121】
本明細書の哺乳動物核酸分子を、LIFESEQ GOLDデータベースで見出した構築されたコンセンサス配列または鋳型と比較した。cDNA、伸長、完全長、及びショットガンシークエンシングプロジェクトに由来するコンポーネント配列をPHREDで分析し、質のスコアを割り当てた。許容できる質スコアを有する全ての配列に対して様々なプリプロセシング及び編集を行い、質の低い3’末端、ベクター及びリンカー配列、ポリA尾部、Aluリピート、ミトコンドリア及びリボソーム配列、及び細菌汚染配列を除去した。編集した配列は少なくともその長さが50bpでなければならない。情報の少ない配列、並びにジヌクレオチドリピート、Aluリピートなどの繰り返しエレメントはNで置換するかマスクした。
【0122】
編集した配列を、配列が遺伝子ビンに割り当てられる構築処理を行った。それぞれの配列は1つのビンにのみ属し、鋳型を形成するべく各ビンにおける配列を構築した。新規にシークエンシングしたコンポーネントをBLAST及びCROSSMATCHを用いて存在するビンに加えた。ビンに加えるためにはこのコンポーネント配列は、BLAST質スコアが150以上であって、少なくとも82%の局所的な同一性のアラインメントでなければならない。それぞれのビンにおける配列を、PHRAPを用いて構築した。いくつかの重複するコンポーネント配列を有するビンはDEEP PHRAPを用いて構築した。それぞれの鋳型の向きは、そのコンポーネント配列の数及び向きに基づいて決定した。
【0123】
それぞれのビンを互いに比較して、局所類似性が82%以上のビンを1つにまとめて再構築した。局所同一性が95%未満の鋳型を有するビンは分けた。鋳型は、STITCHER/EXON MAPPERアルゴリズムで分析した。このSTITCHER/EXON MAPPERアルゴリズムは、スプライスバリアント、択一的スプライシングエキソン、スプライスジャンクション、並びに組織の種類或いは疾患の状態により発現が異なる択一的にスプライシングされた遺伝子などの存在の確率を分析することができる。構築処理を繰り返し行い、GBpriなどのGenBankデータベースに対してBLASTを用いて鋳型にアノテーションを付けた。完全一致は、200塩基対に対する95%以上の局所同一性から100塩基対に対する100%の局所同一性を有すると定義し、相同一致は、≦1×10−8のE値(確率スコア)を有すると定義した。また鋳型を、GENPEPTに対してフレームシフトFASTx分析を行い、相同一致を≦1×10−8のE値を有すると定義した。鋳型の分析及び構築については、1999年3月25日に出願された米国特許出願第09/276,534号に開示されている。
【0124】
構築の後に、鋳型をBLAST、モチーフ、及びその他の機能分析法で分析し、1997年3月6日に出願の米国特許出願第08/812,290号及び同第08/811,758号、1997年10月9日に出願の米国特許出願第08/947,845号、及び1998年3月4日に出願の米国特許出願第09/034,807号に記載されている方法を用いてタンパク質を階層に分類した。次に鋳型を、3つ全ての前方読み枠にそれぞれの鋳型を翻訳して、それぞれの翻訳を、HMMERソフトウエアパッケージ(Washington University School of Medicine, St. Louis MO; http://pfam.wustl.edu/)を用いて隠れマルコフモデルをベースにしたタンパク質ファミリー及びドメインのPFAMデータベースにおいて検索した。
【0125】
本核酸分子を、MACDNASIS PROソフトウエア(Hitachi Software Engineering)及びLASERGENEソフトウエア(DNASTAR)を用いて更に分析し、GenBankの齧歯類、哺乳類、脊椎動物、原核生物、及び真核生物のデータベース、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、PFAM、及びPrositeなどの公共のデータベースに対して問い合わせた。
【0126】
7 染色体マッピング
Stanford Human Genome Center (SHGC)、Whitehead Institute for Genome Research (WIGR)、及びGenethonなどの公共の情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝子マッピングデータを用いて、マッピングできる配列表のcDNAが存在するかを調べた。DSCR1αをコードする核酸分子のマッピングされた全ての断片が、同じ位置にマッピングされた全ての関連する調節及びコード配列に割り当てられた。遺伝子マップ位置は、ヒト染色体の範囲すなわち区間として表される。センチモルガン(cM)(ヒトDNAの100万塩基対に概ね相当する)で表されるマップ位置の範囲は、染色体p腕の末端から測定する。
【0127】
7 ハイブリダイゼーション技術及び分析
核酸分子の基板への固定
本cDNAを以下に示す方法で基板に固定する。cDNAの混合液をジェル電気泳動により分画後、毛細管輸送によってナイロン膜に移す。別法では、cDNAを個別にベクターに結合して、それを細菌宿主細胞に挿入してライブラリを形成する。次にcDNAを以下の方法で基板に配列する。第1の方法では、個別のクローンを含む細菌細胞を機械的に摘み上げてナイロン膜に整列させる。このナイロン膜を、選択薬(用いるベクターによって異なるが、カルベンシリン、カナマイシン、アンピシリン、またはクロラムフェニコールなど)を含むLB寒天培地に載置し、37℃で16時間インキュベートする。この膜を寒天培地から取り除き、次にこの膜をコロニー側を上にして10%SDS、変性溶液(1. 5 M NaCl、0. 5 M NaOH)、中和液(1. 5 M NaCl、1 M Tris、pH 8. 0)に入れ、2×SSCにおいて10分間づつ2回インキュベートする。次にこの膜を、STRATALINKER UVクロスリンカー(Stratagene)でUV照射する。
【0128】
第2の方法では、インサートに隣接したベクター配列に相補的なプライマーを用いて、PCRを30サイクル行い細菌ベクターからcDNAを増幅する。PCR増幅により、拡散の濃度を開始時の1〜2 ngから最終的に5μgまで増大させる。約400 bp〜約5000 bpの増幅した拡散をSEPHACRYL−400ビーズ(APB)を用いて精製する。精製した拡散を、手動で或いはドット/スロットブロッティングマニフォールド及び吸入装置でナイロン膜に配列し、上記した変性、中和、及びUV照射によって固定する。精製した拡散を、米国特許第5,807,522号に開示された方法でポリマーコートスライドガラスに機械的に配列して固定する。ポリマーコートスライドガラスは、顕微鏡スライドガラス(Corning)を0.1%SDS及びアセトンで超音波洗浄した後、4%フッ化水素酸(VWR Scientific Products, West Chester PA)においてエッチングし、次に95%エタノールにおいて0.05%アミノプロピルシラン(Sigma−Aldrich, St Louis MO)でコーティングし、オーブンで110℃で硬化させて準備する。処理中及び処理後にこのスライドガラスを蒸留水で十分に洗浄する。次に、核酸分子をスライド上に配列し、STRATALINKER UVクロスリンカー(Stratagene)を用いてこの核酸分子のアレイをUV照射してスライド上に固定する。次にこのアレイを、室温で0.2%SDSで洗浄し、蒸留水で3回すすぐ。非特異的な接合部位を、アレイをリン酸バッファー(Tropix, Bedford MA)に於ける0.2%カゼインにおいて60℃で30分間インキュベートしてブロックし、次にこのアレイを0.2%SDSで洗浄し、前記したように蒸留水で洗い流す。
【0129】
メンブレンを用いるハイブリダイゼーションのためのプローブの準備
本配列表のcDNAに由来するハイブリダイゼーションプローブは、メンブレンハイブリダイゼーションにおいてcDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングするために用いられる。プローブを準備するために、cDNAを45μl TEバッファにおいて40〜50 ngの濃度に希釈し、100℃で5分間加熱して変性し、短時間遠心分離する。次に、変性したcDNAをREDIPRIMEチューブ(APB)に加え、青色が十分に拡散するまで軽く混合し、短時間遠心分離する。5μlの[32P] dCTPをチューブに加え、その内容物を37℃で10分間インキュベートする。この標識化反応を5μlの0. 2M EDTAを加えてストップし、PROBEQUANT G−50マイクロカラム(APB)を用いてプローブを組み込まれなかったヌクレオチドから精製する。精製したプローブを100℃で5分間加熱してから氷上で2分間冷却し、以下に記載するようにメンブレンハイブリダイゼーションに用いる。
【0130】
ポリマーコートスライドを用いるハイブリダイゼーションのためのプローブの準備
サンプルから単離したmRNAに由来するハイブリダイゼーションプローブを用いて、アレイハイブリダイゼーションにおいて本配列表のcDNAをスクリーニングする。プローブは、GEMbrightキット(Incyte Genomics)を用いて、mRNAを9μl TEバッファにおいて200 ngの濃度に希釈し、5μlの5×バッファ、1μlの0.1 M DTT、3μlのCy3またはCy5標識混合物、1μlのRNアーゼインヒビター、1μlの逆転写酵素、及び5μlの1×酵母コントロールmRNAを加えて準備する。酵母コントロールmRNAは、非コード酵母ゲノムDNA(W. Lei, unpublished)からin vitro転写によって合成する。量的コントロールとして、0.002 ng、0.02 ng、0.2 ng、及び2 ngのコントロールmRNAからなるセットを、サンプルmRNAに対してそれぞれ1:100,000、1:10,000、1:1000、及び1:100 (w/w)の比率で逆転写反応液に希釈する。mRNAの異なった発現パターンを検査するために、第2のセットのコントロールmRNAを、1:3、3:1、1:10、10:1、1:25、及び25:1 (w/w)の比率で逆転写反応液に希釈する。反応液を混合し、37℃で2時間インキュベートする。次に反応液を85℃で20分間インキュベートし、2つの連続したCHROMA SPIN+TE 30カラム(Clontech)を用いてプローブを精製する。精製したプローブを、DEPC処理水で90μlに希釈して、2μlの1mg/mlグリコーゲン、60μlの5M酢酸ナトリウム、300μlの100%エタノールを加えてエタノール沈殿させる。このプローブを20,800×gにおいて20分間遠心分離し、ペレットを12μlの再懸濁バッファに再懸濁させ、65℃で5分間加熱し、完全に混合する。上記したようにプローブを加熱及び混合してから氷上で保管する。プローブを以下に記載するように高密度のアレイハイブリダイゼーションに用いる。
【0131】
メンブレンを用いるハイブリダイゼーション
メンブレンを、1%Sarkosyl及び1×高リン酸バッファ(0. 5M NaCl、0.1 M Na2HPO4、5 mM EDTA、pH 7)を含むハイブリダイゼーション溶液において55℃で2時間プレハイブリダイゼーションする。15mlの新しいハイブリダイゼーション溶液に希釈したプローブをメンブレンに加える。55℃で16時間、メンブレンにプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを1mM Tris(pH 8. 0)、1%Sarkosylにおいて25℃で15分間洗浄し、1mM Tris(pH 8. 0)において25℃で15分間づつ4回洗浄する。ハイブリダイゼーション複合体を検出するために、XOMAT−ARフィルム(Eastman Kodak, Rochester NY)をメンブレンに一晩−70℃で露出し、現像して目で確認する。
【0132】
ポリマーコートスライドを用いるハイブリダイゼーション
プローブを65℃で5分間加熱し、5415Cマイクロ遠心分離器(Eppendorf Scientific, Westbury NY)を用いて毎分9400回転で5分間遠心分離し、アレイの表面に18μlのアリコットを載せカバースリップで覆う。このアレイを、顕微鏡スライドより僅かに大きいキャビティを有する防水容器に移す。この容器の角から140μlの5×SSCを加えてその内部を100%の湿度に保つ。アレイを含む容器を60℃で約6時間半インキュベートする。このアレイを、1×SSC、0.1%SDSにおいて45℃で10分間洗浄し、0.1×SSCにおいて45℃で10分間づつ3回洗浄した後、乾燥させる。
【0133】
ハイブリダイゼーション反応を、絶対ハイブリダイゼーション(absolute hybridization)方式またはディファレンシャルハイブリダイゼーション方式で行う。絶対ハイブリダイゼーション方式の場合、1つのサンプルからのプローブをアレイの要素にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体が形成された後にシグナルを検出する。シグナルの強度がサンプルにおけるプローブmRNAのレベルに相関する。ディファレンシャルハイブリダイゼーション方式の場合、2つの生体サンプルにおける遺伝子のセットの異なった発現を分析する。2つのサンプルからのプローブを準備し、異なった標識成分で標識する。2つの標識したプローブの混合物をアレイ要素にハイブリダイズさせ、2つの異なった標識からの蛍光シグナルをそれぞれ別に検出できる条件下でシグナルを検査する。アレイ上の要素に、2つの生体サンプルに由来するプローブのそれぞれが同数ハイブリダイズする場合、明瞭な複合蛍光が得られる(Shalon W095/35505)。
【0134】
ハイブリダイゼーション複合体をInnova 70混合ガス10Wレーザーを備えた顕微鏡(Coherent, Santa Clara CA)で検出する。この顕微鏡は、Cy3を励起するために488nmのスペクトル線を発生し、Cy5を励起するために632nmのスペクトル線を発生することができる。励起レーザー光を20倍の顕微鏡対物レンズ(Nikon, Melville NY)を用いてアレイに集束させる。アレイを含むスライドを顕微鏡上のコンピュータ制御されたXYステージ上に載せ、20μmの解像度で対物レンズを通してラスタースキャンする。ディファレンシャルハイブリダイゼーション方式の場合、2つの蛍光物質を順番にレーザーで励起する。波長に応じて放出された光を2つの蛍光物質に対応する2つの光電子増倍管検出器(PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ)に分割する。アレイと光電子増倍管との間に配置された好適なフィルターを用いてシグナルをフィルタリングする。用いられる蛍光物質の最大発光波長は、Cy3が565nmであり、Cy5が650nmである。スキャンの感度は、プローブ混合物に加えられた酵母コントロールmRNAによって生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイのある位置に相補的なDNA配列が含まれていると、その位置におけるシグナルの強度が、ハイブリダイズ種(hybridizing species)の重量比で1:100,000の関係となり得る。
【0135】
光電子増倍管の出力をIBM互換性パーソナルコンピュータにインストールした12ビットRTI−835H アナログ/デジタル変換ボードを用いてデジタル化する(Analog Devices, Norwood MA)。このデジタル化したデータを、イメージとして表示する。この場合、シグナル強度を、20色線形変換を用いて、青(弱いシグナル)から赤(強いシグナル)の疑似色スケールにマッピングする。データはまた量的にも分析する。2つの異なった蛍光物質が同時に励起されて測定された場合、データを、各蛍光物質に対する発光スペクトルを用いて蛍光物質間の光学クロストーク(発光スペクトルの重複による)をまず補正する。各スポットからのシグナルがグリッドの各要素の中心に来るように、蛍光物質シグナル強度の上にグリッドを重ね合わせる。各要素内の蛍光シグナルを統合して、シグナルの平均強度に対応する数値を求める。シグナル分析に用いるソフトウエアはGEMTOOLSプログラム(Incyte Pharmaceuticals)である。
【0136】
8 電子分析
BLASTを用いて、GenBankやLifeSeqデータベース(Incyte Genomics)において同一または関連分子を検索した。ヒトおよびラット配列の積スコアを下記のようにして計算した。BLASTスコアにヌクレオチド一致率(%)を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さ×5で除し、短い配列の長さに対する100%のアラインメントが積スコア100とする。積スコアは2つの配列間の類似性の程度と配列一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア40では一致はエラーが1%〜2%以内の厳密さであり、積スコア70以上では一致は完全となる。類似分子または関連分子は通常、8〜40の間の積スコアを示す分子を選択することで特定できる。
【0137】
電子ノーザン分析を積スコア70で実施した。LIFESEQデータベースのすべての配列とcDNAライブラリを系、器官/組織、細胞のタイプにより分類した。分類には、心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液及び免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性/混合性または尿路が含まれる。各カテゴリーでは、配列が発現したライブラリの数を数えて、そのカテゴリー内のライブラリの総数に対して示した。非標準化ライブラリでは、2以上の発現レベルが有意である。
【0138】
9 相補的な分子
約5 (PNA)から5000 bp (cDNAインサートの相補配列)の本核酸分子に相補的な分子を用いて、遺伝子発現の検出或いは阻害を行う。これらの分子をOLIGOプライマー分析ソフトウエア(Molecular Biology Insights)で選択した。検出については、実施例7に記載されている。プロモーターが結合するのを妨げて転写を阻害するために、相補的な分子を最もユニークな5’ 配列に結合すると共に読み枠の開始コドンの5’ UTR上流のヌクレオチドを含むよう設計する。相補的な分子は、エンハンサーやイントロン等のゲノム配列を含み、この相補的な分子を用いて「三重らせん」塩基対を形成して、二重らせんが十分に開かないようにし、これによりポリメラーゼ、転写因子、または調節分子が結合できないようにする。翻訳を阻害するためには、リボソームが本哺乳動物タンパク質をコードするmRNAに結合するのを阻害するように相補的な分子を設計する。
【0139】
相補的な分子を発現ベクターに導入して、これを用いて細胞系を形質転換して効果を検査する。例えば、器官、腫瘍、滑腔、また脈管系を形質転換して一過性或いは短期治療の効果、また幹細胞、接合体、または他の再生系統を形質転換して長期或いは安定した遺伝子治療の効果を検査することが可能である。一過性発現は、非複製ベクターを用いると1ヶ月以上続き、ベクター複製を誘導する適切なエレメントを形質転換/発現系に用いると3ヶ月以上続く。
【0140】
相補的な分子をコードするベクターで好適な分裂細胞を安定的に形質転換することにより、遺伝子組換え細胞系、組織、または生物を作製することができる(USPN 4,736,866)。同化して十分な量のベクターを複製する細胞を安定的に組込むことが可能であるため、十分な相補的分子が産生され、本哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子の活性を低下或いは完全を消失させることができる。
【0141】
10 DSCR1K1 αの発現
本哺乳動物タンパク質の発現及び精製は、哺乳動物細胞発現系若しくは昆虫細胞発現系を用いて行うことができる。pUB6/V5−His ベクター系(Invitrogen, Carlsbad CA)を用いて、CHO細胞でDSCR1K1αを発現させる。ベクターは選択可能なbsd遺伝子、複数のクローニング部位、ヒトユビキチンC遺伝子のプロモーター/エンハンサー配列、抗−V5抗体での抗体検出のためのC−末端V5エピトープ、PROBOND 樹脂(Invitrogen)上での急速な精製のためのC−末端ポリヒスジン(6xHis)配列を含む。形質転換された細胞を、ブラストサイジンを含む培地で選択する。
【0142】
Spodoptera frugiperda(Sf9)昆虫細胞を組換えAutographica californica核多角体病ウイルス(バキュロウイルス)で感染させる。この多角体遺伝子を、相同組換えにより哺乳動物核酸分で置換し、多角体プロモーターにより転写が促進されるようにする。このタンパク質を、上述したように精製を可能にする6xhisで合成して融合タンパク質にする。精製されたタンパク質を次のように用いて、抗体を作製する。
【0143】
11 抗体の生産
DSCR1K1αをポリアクリルアミドゲル電気泳動法で精製して、マウスやウサギの免疫に用いる。抗体の生産は下記のプロトコルに従う。別法では、DSCR1K1αのアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)で解析して免疫原性の高い領域を決定する。通常はC−末端近傍或いは親水性領域内で見られる抗原性エピトープを選択して、合成し、抗体を産生させるために用いる。通常は、長さ約15残基のエピトープを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ(Applied Biosystems)で作製し、N−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させてKLH(Sigma−Aldrich)に結合させ、免疫原性を高める。
【0144】
完全フロイントアジュバントでエピトープ−KLH複合体を用いてウサギを免疫する。次に、不完全フロイントアジュバントで間隔を置いて免疫化を繰り返す。マウスの場合は最低7週間、ウサギの場合は最低12週間が経過した後、抗血清を抽出して抗ペプチド活性を検査した。この検査では、ペプチドをプラスチックに結合させ、1%のウシ血清アルブミンでブロックし、ウサギ抗血清で反応させ、洗浄し、放射性ヨウ素化標識ヤギ抗ウサギIgGで反応させる。当分野で公知の方法を用いて、抗体価と形成された複合体の量を決定する。
【0145】
12 特異的抗体を用いる天然タンパク質の精製
天然或いは組換えタンパク質を、そのタンパク質と特異的に結合する抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr−活性化SEPHAROSE樹脂(APB)に抗体を共有結合させて作製される。タンパク質を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのタンパク質の優先的な吸着を可能にする界面活性剤の存在下で、高イオン強度バッファーでカラムを洗浄する。そのタンパク質が結合した後に、pH2〜3或いはそれ以上のバッファー、高濃度の尿素、またはチオシネートイオンを用いて抗体とタンパク質との結合を切断してカラムから溶出させ、そのタンパク質を回収する。
【0146】
13 核酸分子またはタンパク質と特異的に結合する分子のスクリーニング
本核酸分子またはそのタンパク質をそれぞれ、32P−dCTP、Cy3−dCTP、またはCy5−dCTP (APB)と、BIODIPYまたはFITC (Molecular Probes, Eugene OR)とで標識する。前もって基質上に配列した候補分子または複合体のライブラリを、標識した核酸分子またはタンパク質の存在下でインキュベートする。核酸配列或いはアミノ酸配列に適した条件下でインキュベートした後、基板を洗浄し、特異的な結合即ち複合体成形を示す標識を保持した基板上の全ての位置をアッセイしてリガンドを同定する。様々な濃度の核酸またはタンパク質から得たデータを使用して、標識した核酸或いはタンパク質と結合した分子との間の親和性を計算する。
【0147】
14 2−ハイブリッドスクリーン
酵母2−ハイブリッド法、即ちMATCHMAKER LexA Two−Hybridシステム(Clontech Laboratories, Palo Alto CA)を用いて、本発明の哺乳動物タンパク質と結合するペプチドをスクリーニングする。本タンパク質をコードするcDNAをpLexAベクターの複数のクローニング部位に挿入し、連結して大腸菌に形質転換する。mRNAから調整したcDNAを、pB42ADベクターの複数のクローニング部位に挿入して、結合させ、大腸菌に形質転換させてcDNAライブラリを作製した。pLexAプラスミド及びpB42AD−cDNAライブラリ作製物を大腸菌から単離し、これらを2:1の比率で用いて、polyethylene glycol/lithium acetateプロトコルに従ってコンピテント酵母EGY48 [p8op−lacZ]細胞を同時形質転換した。形質転換した酵母細胞をヒスチジン、トリプトファン、及びウラシルを含まない合成ドロップアウト(SD:synthetic dropout)培地(‐His、‐Trp、‐Ura)に移し、コロニーが成長してカウント出来るまで30℃でインキュベートした。このコロニーを1×TE(pH 7.5)の最小容量にプールし、2%アガロース(Gal)、1%ラフィノース(Raf)、及び80 mg/ml のX−Gal (5−bromo−4−chloro−3−indoryl−b−D−galactoside)を加えたSD培地(‐His、‐Leu、‐Trp、‐Ura)に移し、青いコロニーの成長を調べた。発現したタンパク質とcDNA融合タンパク質との間の相互作用により、EGY48におけるLEU2レポーター遺伝子の発現が活性化され、ロイシンを含まない培地(‐Leu)でコロニーが成長した。また、相互作用により、p8op−lacZ レポーター作製物からのβ−ガラクトシダーゼの発現が活性化され、X−Gal上で成長したコロニーにおいて青色コロニーが生成される。
【0148】
発現タンパク質とcDNA融合タンパク質との間のポジテブな相互作用は、個々のポジティブコロニーを分離して、これらのコロニーをSD液体培地(‐Trp、‐Ura)で30℃で2日間成長させるて確認することができる。培養物のサンプルをSD培地(‐Trp、‐Ura)に移して、コロニーが現れるまで30℃でインキュベートする。このサンプルを、SDプレート(‐Trp、‐Ura)及びSDプレート(‐His、‐Trp、‐Ura)上でレプリカ培養する。ヒスチジン含有SD培地で成長するがヒスチジンを含まない培地では成長しないコロニーは、pLexAプラスミドが欠損している。ヒスチジンを必要とするコロニーをSD(Gal、Raf、X−Gal、‐Trp、‐Ura)上で成長させ、白いコロニーを単離して成長させた。本哺乳動物タンパク質と物理的に相互作用するタンパク質をコードするcDNAを含むpB42AD−cDNAプラスミドを、酵母細胞から単離して特徴付けることが可能である。
【0149】
15 タンパク質活性の実証
DSCR1K1αまたはその生物学的に活性な断片を、125I−Bolton−Hunter試薬(Bolton A.E. (1973) Biochem. J. 133:529−539)で標識する。マルチウェルプレートのウェルに予め配列しておいた候補リガンド分子を、標識したDSCR1K1αと共にインキュベートし、洗浄して、標識したDSCR1K1α複合体をアッセイする。様々な濃度のDSCR1K1αから得たデータを用いて、DSCR1K1αに結合した候補リガンド分子の数、親和性、会合についての値を計算する。
【0150】
本明細書に記載した全ての特許及び刊行物は、言及することを以って本明細書の一部とする。本発明の範囲及び概念から逸脱することなく本発明の方法及び装置の種々の改変が可能であることは当業者には明らかであろう。特定の好適な実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には、本明細書に記載の本発明の実施例の様々な改変は、特許請求の範囲に含まれることが容易に理解できよう。
【0151】
(表の簡単な説明)
表1は、SEQ ID NO:1に相同なラット及びサルの核酸配列を示し、それらのヌクレオチド長、生物起源、SEQ ID NO:1と重複する領域、及びSEQ ID NO:1との同一性のパーセントを含む。
【図面の簡単な説明】
【図1A】
ヒトアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)をコードするヒト核酸分子(SEQ ID NO:1)の領域を示す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA)を用いて作成した。
【図1B】
ヒトアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)をコードするヒト核酸分子(SEQ ID NO:1)の領域を示す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA)を用いて作成した。
【図1C】
ヒトアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)をコードするヒト核酸分子(SEQ ID NO:1)の領域を示す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA)を用いて作成した。
【図2A】
ヒトDSCR1K1α(SEQ ID NO:1)、ヒトDSCR1L1(g1435040;SEQ ID NO:10)、及びヒトDSCR1L2(g6017919;SEQ ID NO:11)の間の化学的及び構造的類似性を実証する。このアラインメントは、MEGALIGNプログラム(DNASTAR, Madison WI)を用いて作成した。
【図2B】
ヒトDSCR1K1α(SEQ ID NO:1)、ヒトDSCR1L1(g1435040;SEQ ID NO:10)、及びヒトDSCR1L2(g6017919;SEQ ID NO:11)の間の化学的及び構造的類似性を実証する。このアラインメントは、MEGALIGNプログラム(DNASTAR, Madison WI)を用いて作成した。
【表1】
(発明の技術分野)
本発明は、新規の哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子に関し、また、これらの分子を用いたアルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態などの症状の特徴付け・診断・治療に関する。
【0002】
(発明の背景)
アルツハイマー病は、アミロイドβペプチドを含む老人斑及び神経原線維濃縮体の形成によって特徴付けられる進行性の神経変性疾患である。このような老人斑は、海馬、前頭皮質、帯状皮質、小脳、基底核、及び青斑核を含む脳の連合皮質及び辺縁に見られる。初期のアルツハイマー病では、帯状皮質の物理的変化が視認できる(Minoshima et al. (1997) Annals of Neurology 42: 85−94)。後期のアルツハイマー病患者では、蓄積された老人斑により辺縁領域の神経構造が破壊され、最終的に記憶過程に障害が起こる。
【0003】
全世界には、約2000万人ものアルツハイマー病による痴呆患者がいる。この疾患は、早期発症型(30歳の若者も発病する)、家族性、または散発性の場合がある。家族性アルツハイマー病はかつて、完全に常染色体優性な特性であると考えられていたが、この考えは多くの遺伝的決定因子が排除されていくにつれて変化してきた。例えば、老人斑に見られるアポリポタンパク質E(ApoE)の或る正常なアレル変異体は、アルツハイマー病を発症するリスクを増大し得るか、或いはアルツハイマー病の発症を防止し得るかの何れかである(Strittmatter et al. (1993) Proc Natl Acad Sci 90: 1977−1981)。
【0004】
ApoE、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、プレセニリン−1、及びプレセニリン−2の4種の遺伝子における突然変異により、アルツハイマー病に罹患し易くなることが知られている(Selkoe (1999) Nature 399: A23−A31)。ApoE遺伝子のe4アレルが、晩年発症型アルツハイマー病のリスクを増大させる。βアミロイドタンパク質(Aβ)が老人斑の主成分であり、このAβは通常、βセレクターゼ及びγセレクターゼによりAPPが切断されて形成される。アルツハイマー病患者では、多量のAβがこのような神経病理学的な斑で生成され細胞外に蓄積される。
【0005】
アルツハイマー病と多くの他の遺伝子やタンパク質との関連が報告されている。胎児アルツハイマー抗原及びsynucleinαが、脳の斑及び神経原線維濃縮体で見られる。或る種の遺伝子多形の遺伝もまた、アルツハイマー病のリスク増大に関連する。例えば、プロテアーゼインヒビターとして機能し得るβ2−マクログロブリンをコードする或る種の遺伝子多形が、晩年発症型アルツハイマー病のリスク増大に関係する。
【0006】
マイクロアレイ技術を用いた実験により、アルツハイマー病患者の組織において、特定の遺伝子の発現が変化することが分かった。このような遺伝子の1つであるDSCR1L1(gl435040)とも呼ばれるダウン症候群重要領域1−様1(Mazowiecki et al. (1996) J Biol Chem 271: 14567−14571)が、アルツハイマー病の組織において2分の1以下にダウンレギュレートされることが分かった。DSCR1L1は、甲状腺ホルモン応答性タンパク質をコードし、DSCR1(g7657042)及びDSCR1L2(g6017918)を含む遺伝子ファミリーのメンバーである。このファミリーの第1のメンバーDSCR1がクローニングされ、第21染色体のダウン症候群領域に近接していることから命名されたが、そのコードされたタンパク質の機能及びダウン症候群におけるその役割は不明である。このファミリーのタンパク質であることを決定するモチーフには、多くのRNA結合タンパク質及び或る種の一本鎖DNA結合タンパク質に見られるドメインに類似したN末端RNA結合ドメインと、リン酸化の標的と思われるISPPXSPPボックスを含む中心に存在する短いユニークなセリン−プロリンモチーフとが含まれる(Fuentes et al. (1995) Hum Mol Genet 4: 1935−1944)。
【0007】
アミノ酸配列の一般的な特性から判断すると、DSCR1遺伝子が転写調節及びシグナル伝達に関与するタンパク質をコードする可能性が高い(Strippoli et al. (2000) Genomics 64: 252−263)。3種類の遺伝子、即ちDSCR1、DSCR1L1、及びDSCR1L2が発現変動するのが明らかある。DSCR1は胎児の脳及び心臓において多量に発現し、DSCR1L1は心臓、脳、肝臓、及び筋骨格で見られ、DSCR1L2は血液を含む殆んどの組織で発現する。
【0008】
アルツハイマー病とダウン症候群との間には、中年のダウン症候群患者に見られるβアミロイドの重度の蓄積などの幾つかの関連性が存在する。DSCR1L1の甲状腺ホルモン応答特性が、アルツハイマー病及び/またはダウン症候群におけるこの遺伝子の役割に関連し得る。すなわち、アルツハイマー病及びダウン症候群患者の双方において、アルツハイマー病患者の脳脊髄液における抗チログロブリ抗体の上昇及びプレアルブミンのレベルの低下、並びにアルツハイマー病の臨床症状のあるダウン症候群患者における明白な無症状の甲状腺機能低下を含む甲状腺ホルモンの代謝障害が見られる(Sutherland et aL (1992) Neurobiol Aging 13: 301−312)。これとは逆に、甲状腺機能が低下した患者には、アルツハイマー病に見られるのと同様の或る種の神経性症状が見られ、甲状腺機能不全の病歴が、アルツハイマー病を発症するリスク因子であると考えられる。考えられる得る1つの関連性は、甲状腺ホルモンがAPP遺伝子の転写活性を負に調節するという発見である(Belandia et al. (1998) J Biol Chem 273: 30366−30371)。APPの過剰な発現により、βアミロイドタンパク質の産生増大を伴うメカニズムによって神経変性が引き起こされるとの仮説がある。アルツハイマー病患者における甲状腺応答DSCR1L1遺伝子のダウンレギュレーションと他のDSCR1遺伝子のダウンレギュレーションの可能性とから、アルツハイマー病と甲状腺機能との間に関連があることが分かる。
【0009】
DSCR1タンパク質ファミリーのメンバーをコードする更なる核酸分子の発見を、アルツハイマー病、ダウン症候群、及び他の痴呆の形態の診断・予後・治療に利用することができる。
【0010】
(発明の概要)
本発明は、アルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態などの症状の特徴付け・診断・予防・治療に有用な組成物を提供することで当分野の要望を満たすDSCR1L1αタンパク質をコードする精製された核酸分子の発見に基づている。
【0011】
本発明は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有する変異体、及びSEQ ID NO:2の抗原性エピトープを含む群から選択されるタンパク質またはその一部をコードする単離された核酸分子またはその断片を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1の核酸配列、SEQ ID NO:1の核酸配列と少なくとも85%の同一性を有する変異体cDNA、及びSEQ ID NO:1の断片を含む群から選択される単離された哺乳動物核酸分子またはそのその相補体を提供する。更に本発明は、DSCR1L1αをコードする核酸分子またはその相補体を含む組成物、基板、及びプローブを提供する。更に本発明は、このような核酸分子を含むベクター、このようなベクターを含む宿主細胞、及びこのような核酸分子を用いてDSCR1L1を作製する方法を提供する。更に本発明は、DSCR1L1αをコードする核酸分子を含むベクターを有する遺伝子組換え細胞系または遺伝子組換え生物を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:3−9から成る群から選択される哺乳動物断片またはその相補体を提供する。或る実施態様では、本発明は核酸分子を含む基板を提供する。第2の実施様態では、この基板を、検出法、スクリーニング法、及び精製法に用いる。更なる実施様態では、核酸分子は一本鎖相補RNAまたはDNA分子である。
【0012】
本発明はまた、核酸分子を用いて、サンプルの核酸の発現変動を検出する方法であって、前記核酸分子と前記核酸とをハイブリダイズさせてハイブリダイゼーション複合体を形成し、そのハイブリダイゼーション複合体を標準と比較し、その比較によりサンプルにおける前記核酸の発現変動が分かる方法を提供する。或る実施態様では、この検出方法は、ハイブリダイゼーションの前に前記核酸を増幅するステップを含む。別の実施態様では、前記核酸分子の発現変動を標準と比較して、アルツハイマー病、ダウン症候群、及び痴呆の他の形態の診断をする。更なる実施態様では、前記核酸分子、その断片やその相補体はアレイ上のエレメントを含み得る。
【0013】
本発明はまた、核酸配分子、その断片またはその相補体を用いて、ライブラリ即ち複数の分子または化合物をスクリーニングしてその核酸分子と特異的に結合する少なくとも1つのリガンドを同定する方法であって、特異的な結合が許容される条件下で、その核酸分子を前記分子または化合物と結合させるステップと、前記核酸分子に対する特異的な結合を検出して、前記核酸分子と特異的に結合するリガンドを特定するステップとを含む方法を提供する。一実施態様では、このような分子または化合物として、DNA分子、RNA分子、ペプチド核酸、人工染色体作製物、ペプチド、転写因子、リプレッサー、及び調節分子が選択される。
【0014】
本発明はまた、本核酸分子の少なくともある断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、この発現ベクターは宿主細胞内に含まれている。本発明は更に、タンパク質が発現する条件下で宿主細胞を培養するステップと、そのタンパク質をその宿主細胞から回収するステップとを含むタンパク質生産方法を提供する。
【0015】
本発明はまた、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と95%の同一性を有する変異体と、SEQ ID NO:2の抗原エピトープと、SEQ ID NO:2のオリゴペプチドと、SEQ ID NO:2の生物学的に活性ナ部分とからなる群から選択される精製されたタンパク質あたはその一部を提供する。本発明はまた、前記精製されたタンパク質及び医薬用担体を含む医薬組成物を提供する。本発明は更に、タンパク質を用いてライブラリ即ち複数の分子または化合物をスクリーニングして少なくとも1つのリガンドを特定する方法であって、特異的な結合が許容される条件下で、そのタンパク質を前記分子または化合物と結合させるステップと、特異的な結合を検出して、前記タンパク質と特異的に結合するリガンドを特定するステップとを含む方法を提供する。ある実施様態においては、分子または化合物はDNA分子、RNA分子、ペプチド核酸、ペプチド、タンパク質、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、及び薬剤から選択される。別の実施様態では、アルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態の患者を治療するために前記リガンドを使用する。
【0016】
本発明は、哺乳動物タンパク質を用いて、被検サンプルをそのタンパク質に特異的に結合する抗体に対してスクリーニングする方法であって、前記被検サンプルから抗体を単離するステップと、特異的な結合が許容される条件下で、この単離した抗体を前記タンパク質とを結合させるステップと、結合した前記タンパク質から抗体を解離するステップと、抗体の存在或いは存在量からアルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態の患者を診断できる抗体の量を既知の標準値と比較するステップとを含むスクリーニング法を提供する。本発明はまた、哺乳動物タンパク質を用いて抗体を作製及び精製する方法であって、抗体反応が起こる条件下でこのタンパク質によって動物を免疫するステップと、動物抗体を単離するステップと、基板にこのタンパク質を付着させるステップと、このタンパク質への特異的な結合が許容される条件下で、この基板を単離した抗体と接触させること、このタンパク質から抗体を分離して精製した抗体を得ることを含む方法を提供する。
【0017】
本発明は、DSCR1L1αに特異的に結合する精製された抗体を提供する。本発明はまた、抗体を用いてアルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態を診断する方法であって、結合が許容される条件下で、サンプルと前記抗体とを結合させるステップと、結合した抗体の量を既知の標準値と比較して前記疾患の有無を診断するステップとを含む診断方法を提供する。本発明は更に、抗体を用いてアルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態を治療する方法であって、精製された抗体を含む医薬組成物をそのような治療が必要な患者に投与することを含む治療方法を提供する。
【0018】
本発明はまた、哺乳動物のゲノムDNAの中にマーカー遺伝子を挿入して、内在性ポリヌクレオチドの発現を阻害する方法を提供する。本発明はまた、核酸分子を用いて哺乳動物モデル系を作製する方法であって、SEQ ID NO:3−9から選択される核酸分子を含むベクターを作製するステップと、そのベクターで胚性幹細胞を形質転換するステップと、形質転換された胚性幹細胞を選択するステップと、この形質転換された肺性幹細胞を哺乳動物胚盤胞の中に微量注入して、キメラ胚盤胞を形成するステップと、偽妊娠メスにキメラ胚盤胞を導入し、このメスが、生殖細胞系の中に核酸分子を含むキメラ子孫を出産し、そのキメラ哺乳動物を交配して同型接合哺乳動物モデル系を作製するステップとを含む哺乳動物モデル系作製方法を提供する。
【0019】
(本発明の実施方法について)
本発明は、ここに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更できることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いるものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい。本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その(この等)」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は当業者には周知の複数の宿主細胞を含む。
【0020】
本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用した。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるものではない。
【0021】
(定義)
「ダウン症候群重要領域1−様1(DSCR1L1α)タンパク質」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など任意の哺乳動物種(ウシ、イヌ、マウス、ヒツジ、ブタ、げっ歯類、サルそして好ましくはヒトを含む)から得られる実質的に精製されたタンパク質を指す。
【0022】
「アレイ」は、基板上の少なくとも2つの核酸分子の規則正しい配列を指す。核酸分子の少なくとも1つが調節または標準を表す。そして他方が目的の診断の核酸分子体を表す。基質上の2から約4万の核酸分子の構成により、核酸分子とサンプル核酸の間で形成される各標識ハイブリダイゼーション複合体の大きさ及びシグナル強度を確実に個別に区別できる。
【0023】
配列表の核酸分子の「相補配列」は、完全長配列に完全に相補的な核酸分子を指す。また高いストリンジェンシー条件下で核酸分子或いはmRNAにハイブリダイズする。
【0024】
「核酸分子」とは、単離したポリヌクレオチド、cDNA或いはその任意の断片または相補配列を指す。それは組換えまたは合成された二本鎖または一本鎖であり、コード配列及び/または非移動配列(nonmoving sequence)、ゲノムDNA分子由来のイントロンを有するまたは有しないエキソンを有する。
【0025】
「タンパク質をコードする核酸分子」という語は、当分野で周知の分析により同定された保存された領域、モチーフ或いはドメインをコードする配列と密接にアラインメントする核酸配列を指す。これらの分析には、保存された領域内における同一性を特定するBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)が含まれる(Altschul (1993) J Mol Evol 36: 290−300、Altschul ら(1990) J Mol Biol 215:403−410)。Brenner et al. (1998 ; Proc Natl Acad Sci 95: 6073−6078)が配列同一性による構造的相同性を特定するべくBLASTの信頼性を分析し、30%の同一性が少なくとも150残基の配列アラインメントに対する信頼できる閾値であり、40%の同一性が少なくとも70残基のアラインメントに対する適切な閾値であることを示した(Brenner et al., page 6076, column 2)。
【0026】
「誘導体」とは化学修飾された核酸分子或いはタンパク質を指す。核酸分子の誘導体化にはクエオシン(queosine)或いはヒポキサンチンなどの類似体等非従来型塩基の置換が含まれ得る。これらの置換は当分野で周知である。タンパク質の誘導体化にはアセチル基、アシル基、アルキル基、アミノ基、ホルミル基またはモルホリン基による水素の置換が含まれる。分子誘導体は天然分子の生物学的活性を保持するが、長い寿命或いは強化された活性などの長所を付与し得る。
【0027】
「発現変動」とは、サンプル中の転写されたメッセンジャーRNA或いは翻訳されたタンパク質の存在の有無、その量の少なくとも二倍の変更により検出される増加、即ちアップレギュレーション、或いは減少、即ちダウンレギュレーションを指す。
【0028】
「障害」とは、核酸分子及びDSCR1タンパク質が異なって発現されている場合の症状、疾患、または症候群を指す。
【0029】
「断片」とは長さが約200から約700塩基の連続したヌクレオチド鎖を指す。断片は、関連する核酸分子を同定するためにPCRまたはハイブリダイゼーション技術に、或いはリガンドをスクリーニングするための結合アッセイで使用され得る。核酸とそれらのリガンドはこのような方法で同定され、複製、転写、または翻訳を調節する治療として有用である。
【0030】
「ハイブリタイゼーション複合体」とは、例えば5’−A−G−T−C−3’と3’−T−C−A−G−5’との塩基対などのように1つの分子のプリンが相補的な分子ピリミジンと水素結合して、核酸分子とサンプルの核酸との間で形成される。相補性の度合およびヌクレオチド類似体の使用が、ハイブリダイゼーション反応の効率とストリンジェンシーに影響を与える。
【0031】
「リガンド」とは、ポリヌクレオチド或いはタンパク質のエピトープ上の相補部位に特異結合するあらゆる物質、分子、または化合物を指す。そのようなリガンドは、ポリヌクレオチドまたタンパク質の活性を安定化或いは調節し、核酸、タンパク質、炭水化物、脂肪、及び脂質を含む無機および/または有機物質から構成され得る。
【0032】
「オリゴヌクレオチド」とは、長さが約18から約60ヌクレオチドの一本鎖分子を指す。そしてハイブリダイゼーションや増幅技術において、または複製、転写、翻訳の調節において使用され得る。同義語として、アンプライマー、プライマー、及びオリゴマーが挙げられる。
【0033】
「部分」とは、あらゆる目的に使用されるタンパク質の任意の部分を指すが、特にリガンドのスクリーニングまたは抗体の生産に用いられるエピトープを指す。
【0034】
タンパク質の「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、及び蛋白分解性切断等が含まれ得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、細胞の位置、細胞型、pH、及び酵素環境などによって異なる。
【0035】
「プローブ」とは、サンプル中の少なくとも1つの核酸にハイブリダイズする核酸分子を指す。標的が一本鎖である場合、プローブは相補的一本鎖である。プローブは、サザン法、ノーザン法、in situ法、ドットブロット法、及びアレイなどを含むハイブリダイゼーション反応またはスクリーニングアッセイで使用するためにレポーター分子で標識化することができる。
【0036】
「タンパク質」とは、ポリペプチド或いはその任意の部分を指す。タンパク質の「部分」とは、少なくとも1つの生物学的活性を保持し得るアミノ酸配列の長さ、PFAMまたはPRINTS分析によって同定されるドメイン、或いはPROTEAN プログラム(DNASTAR, Madison WI)のKyte−Doolittle アルゴリズムを使用して同定されたタンパク質の抗原エピトープを指す。「オリゴペプチド」は、抗体を産生させるために融合タンパク質の一部として使用される約5残基から約15残基までのアミノ酸配列である。
【0037】
「精製された」とは、自然環境から分離され、自然環境で会合していた他の化合物が約60%から約90%まで分離したあらゆる分子や化合物を指す。
【0038】
「サンプル」は、核酸、タンパク質、及び抗体等を含むとして、その最も広い意味で用いられる。サンプルは体液、細胞調製の可溶性分画、細胞が成長する培地のアリコット、染色体、細胞小器官、或いは細胞から単離または抽出された膜、溶液中のまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、または核酸分子と、細胞、組織、組織プリント、フィンガープリント、口内細胞、皮膚、または髪等を含み得る。
【0039】
「特異的な結合」とは、構造、特に分子側鎖に依存する2つの分子間での特殊つ正確な相互作用を指す。例えば、調節タンパク質のDNA分子の主溝への挿入、2つの一本鎖核酸間の骨格に沿った水素結合、またはタンパク質のエピトープとアゴニスト、アンタゴニストまたは抗体との間の結合がある。
【0040】
配列に適用される「類似性」とは、Smith−Waterman アルゴリズム(Smith及びWaterman (1981) J Mol Biol 147:195−197)或いはBLAST2 (Altschul ら (1997) Nucleic Acids Res 25:3389−3402)などの標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも2つの配列間で一致する分子或いは残基の定量化(通常は%)を指す。BLAST2は、アラインメントを最適化するために配列の1つでギャップを挿入するまた2つの配列をより有意に比較できる標準化された再現性のある方法で使用され得る。
【0041】
「基板」とは、核酸分子またはタンパク質が結合する任意の固体または半固体の支持体を指すものであって、膜、フィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁性または非磁性ビーズ、ゲル、毛管、またはその他のチューブ、プレート、ポリマー、微小粒子が含まれ、穴、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有する。
【0042】
「変異体」とは、核酸分子またはその核酸分子がコードするタンパク質の認識できる変異した分子を指す。スプライス変異体は、スコアが少なくとも100、最も好ましいのは少なくとも400であるBLASTスコアにより決定し得る。対立遺伝子変異体は、核酸分子に対して高い同一性のパーセントを有し、100塩基に付き約3塩基が異なり得る。「一塩基多型」(SNP)とは、欠失、挿入、または置換による単一塩基による変異を指す。この変異は、保存的(プリンからプリン)或いは非保存的(プリンからピリミジン)であり得、コードされたアミノ酸に変異が起こる可能性がある。
【0043】
(発明)
本発明は、DSCR1L1αをコードする新規の哺乳動物核酸分子の発見に基づき、アルツハイマー病、ダウン症候群、及び他の形態の痴呆などの病態の特徴付け・診断・治療・予防においてその核酸分子やその断片、またはそのタンパク質やその一部を用いることに関連する。
【0044】
一実施形態では、本発明は図1A−図1Cに示されているSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。DSCR1L1αは、既知のRNA認識モチーフに類似した残基129〜199のプラスに荷電した芳香族アミノ酸によって特徴付けられる一本鎖核酸結合ドメインを有する。加えて、DSCR1L1αは、DSCR1タンパク質の特徴であるISPPXSPPボックス(残基169〜176)を含む。図2A及び図2Bに示されているように、DSCR1L1αは、ヒトDSCR1L1(g1435040;SEQ ID NO:10)及びヒトDSCR1L2(g6017919;SEQ ID NO:11)と化学的及び構造的相同性を有する。具体的には、DSCR1L1αはDSCR1L1との同一性が90.3%であり、DSCR1L2とは57.3%の同一性を有する。これら3種類全てのタンパク質が、一本鎖核酸分子結合ドメイン及びISPPXSPPボックスを共に有する。SEQ ID NO:1は、5’非翻訳領域がDSCR1L1(g1435040;SEQ ID NO:10)をコードする遺伝子及びDSCR1L2(g6017919;SEQ ID NO:11)をコードする遺伝子とは異なり、また、SEQ ID NO:1の読み枠によってコードされた残基M1からS70までの初めの70個のアミノ酸により、DSCR1L1αファミリータンパク質をコードするこれら及び他の遺伝子と区別される。SEQ ID NO:1のヌクレオチド1から400までのプローブは、DSCR1L1αをコードする自然発生の核酸分子、アレル変異体、または関連分子を特定するのに有用であろう。DSCR1L1αのアミノ酸残基M1からS70までの抗原エピトープは、DSCR1L1αと類似タンパク質とを区別し得るDSCR1L1αの抗体の生産に有用であろう。
【0045】
電子ノーザン分析により、様々なライブラリにおいてこの配列の発現が示され、精神分裂病、ハンチントン病、癲癇、及び筋萎縮性側索硬化症に関連する組織を含む神経系の組織に最も多量に存在することが分かった。アルツハイマー病と診断された患者のサンプルとのマイクロアレイにおけるハイブリダイズが2分の1にダウンレギュレートされたのに一致して、アルツハイマー病の患者からのライブライ8の内7のライブラリでDSCR1L1αが発現していない。
【0046】
表1は、ラット及びサルからの核酸断片、その配列の範囲、及びSEQ ID NO:1との同一性を示す。列1及び列2にはそれぞれ、各核酸配列に対する配列番号(SEQ ID NO)及びインサイト配列識別子が列記されている。列3には各断片のヌクレオチド長、列4には各断片がSEQ ID NO:1と同一性を有するSEQ ID NO:1におけるヌクレオチド残基の範囲、列5には由来する生物名、列6には列4のヌクレオチド範囲に対する各断片とSEQ ID NO:1との同一性(%)が列記されている。
【0047】
これらの核酸分子は、ヒトの疾患モデルとなる遺伝子組換え生物または遺伝子組換え細胞系を作製するのに特に有用である。また、このような遺伝子組換え生物において治療の可能性を検査することができる。初期のアルツハイマー病の機能欠損を示す領域である帯状皮質におけるSEQ ID NO:9の発現に注目されたい。このサル核酸分子は、アルツハイマー病のモデル系に有用であろう。また、サル核酸分子をプローブとして用いて、同様に発現が帯状皮質に制限される相同なヒトDSCR1遺伝子ファミリー配列を検索することができる。
【0048】
(本発明の特徴及び使用)
cDNA ライブラリ
ここに開示する特定の実施例では、当分野で周知の方法を用いて哺乳動物の細胞及び組織からmRNAを単離し、これを用いてcDNAライブラリを作製する。上記したインサイト社クローンは、哺乳動物cDNAライブラリから単離された。本発明の代表的な少なくとも1つのライブラリの作製方法を以降に記載する実施例に示す。コンセンサス哺乳動物配列は、Phrap (P. Green, 前出)及びGELVIEW 断片構築システム(Genetics Computer Group, Madison WI)、AUTOASSEMBLERアプリケーション(Applied Biosystems, Foster City CA)などのコンピュータプログラムを用いて、インサイト社クローンを含む断片、伸長、及び/またはショットガン配列から化学的かつ/または電子的に構築した。
【0049】
シークエンシング
核酸をシークエンシングする方法は当分野で周知であり、そのような方法を用いて本発明の任意の実施例を実施することができる。これらの方法は、DNAポリメラーゼIであるクレノウフラグメント、SEQUENASE、Taq DNAポリメラーゼおよび熱耐性T7 DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech (APB), Picataway NJ)、或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Rockville MD)に用いられるような校正エクソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせを用いることができる。配列の準備は、HYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific, Sunnyvale CA)、MICROLAB 2200(Hamilton, Reno NV)、及びDNA ENGINEサーマルサイクラー(PTC200; MJ Research, Watertown MA)などの装置を用いて自動的に行うのが望ましい。シークエンシングに用いる装置には、ABI 3700、377または373DNAシークエンシングシステム(Applied Biosystems)、及びMEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(APB)等がある。当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて、シークエンシングした配列を解析することができる。これらのアルゴリズムは、Ausubel(1997; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7) 及びMeyers(1995; Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, pp. 856−853)に記載されている。
【0050】
ショットガンシークエンシングを用いて、様々に由来するクローニングしたインサートから更に配列を作り出す。ショットガンシークエンシング方法は当分野で周知であり、熱耐性DNAポリメラーゼや非熱耐性DNAポリメラーゼ、及び目的の核酸分子に隣接する代表的な領域から選択されたプライマーを用いる。当分野で周知のCONSED(Gordon (1998) Genome Res. 8:195−202)などの様々なアルゴリズムやプログラムを用いて、組み立てが未終了の配列(組立てが不完全な配列)を調べる。ベクターやキメラ配列、または欠失配列を含む汚染配列を除去して、組み立てが未終了の配列を完全な配列に組み立てる。
【0051】
核酸配列の伸長
本発明の配列は、当分野で周知の様々なPCR法を用いた方法で伸長することができる。例えば、XL−PCRキット(Applied Biosystems)及び入れ子プライマー(nested primer)、市販のcDNAまたはゲノムDNAライブラリ(Life Technologies; Clontech, Palo Alto CA, respectively)用いてヌクレオチド配列を伸長することが可能である。全てのPCR系の方法に用いることができるように、プライマーは、OLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア(Molecular Biology Insights, Cascade CO)等の市販のソフトウェアを用いて、ヌクレオチドの長さが約22〜30個、GC含量が約50%以上、約55〜68℃の温度で標的配列とアニールするように設計することが可能である。調節エレメントを復活させるために配列を伸長する場合は、cDNAライブラリよりゲノムライブラリを用いる方が良い。
【0052】
(本哺乳動物核酸分子の使用)
ハイブリダイゼーション
本哺乳動物核酸分子及びその断片は、様々な目的のための様々なハイブリダイゼーション技術に用いることができる。プローブは、5’調節領域やDSCR1タンパク質ファミリーに見られるN末端RNA結合ドメインなどのユニークな領域から作製可能であり、これらのプローブを、この哺乳動物タンパク質やアレル変位配列、または関連分子をコードする天然の分子を同定するためのプロトコルに用いることができる。通常は一本鎖であるDNA若しくはRNAからなるこのプローブは、任意のこの核酸配列と少なくとも50%の配列同一性を有することが望ましい。ハイブリダイゼーションプローブは、標識されたヌクレオチドの存在下でのPCR増幅、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、または末端標識化を利用して作製することができる。この核酸分子またはその断片を含むベクターを用いて、RNAポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを加えてin vitroでmRNAプローブを作製することができる。これらの方法はAPBが販売するキットを用いて行うことができる。
【0053】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー(厳密性)は、プローブのGC含量、塩濃度、及び温度によって決まる。特に、塩濃度を下げる、またはハイブリダイゼーションの温度を上げて、ストリンジェンシーを高めることができる。ある膜系のハイブリダイゼーション用の溶液にホルムアミドなどの有機溶媒を加えて、反応が低い温度で起こるようにすることができる。ハイブリダイゼーションは、低いストリンジェンシーの緩衝液(5×SSC、1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS))で、60℃で行うことができるが、核酸配列間に不適正塩基対を含む複合体の形成を許容し得る。続く洗浄は、45℃(中程度のストリンジェンシー)或いは68℃(高いストリンジェンシー)の何れかの温度、0.2×SSC、0.1%SDSなどの高いストリンジェンシーで行う。高いストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーション複合体は、完全に相補的な核酸分子部分のみが安定して保持される。ある膜系のハイブリダイゼーションにおいて、好ましくは35%、最も好ましくは50%のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に加えて、ハイブリダイゼーションを行う温度を下げたり、または、SarkosylやTriton X−100などの界面活性剤及び変性したサケ精子DNAなどのブロッキング試薬を用いてバックグラウンドシグナルを低減することが可能である。ハイブリダイゼーションの条件や要素の選択については当分野で周知であり、Ausubel(前出) 及びSambrook他(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY.に記載されている。
【0054】
当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して分析することができる。オリゴヌクレオチドをマイクロアレイのプローブや標的として用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多数の遺伝子の発現レベルをモニタリングし、遺伝子変異体、突然変異及びSNP(一塩基多型)を同定することができる。このようなデータを用いて、遺伝子機能の解明や、症状及び疾患、または障害における遺伝子原理の解明や、症状及び疾患、障害の診断または治療、治療薬の開発、並びにこれらの治療薬の活性のモニタリングが可能である(例えば、Brennan他(1995) USPN 5,474,796; Schena他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614−10619; Baldeschweiler他(1995) PCT出願 WO95/251116; Shalon他(1995) PCT出願WO95/35505; Heller他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150−2155; and Heller他(1997) USPN 5,605,662を参照)。
【0055】
ハイブリダイゼーションプローブはまた、天然のゲノム配列のマッピングに有用である。このプローブは、(1)特定の染色体、(2)染色体の特定の領域、(3)ヒト人工染色体(HACs)や酵母人工染色体(YACs)、細菌人工染色体(BACs)、細菌P1作製物、または単一の染色体、または(5)これらから作製されたcDNAライブラリなどの人工染色体作製物、にハイブリダイズすること可能である。
【0056】
発現
哺乳動物DSCR1L1αタンパク質をコードする多数の核酸分子をベクターにクローニングして、このタンパク質若しくはその一部を宿主細胞で発現させることができる。この核酸配列を、DNAシャフリング(Stemmer and Crameri (1996) USPN5,830,721)や部位特異的変異誘発などの方法によって、新規の制限部位を作り出したり、グリコシル化パターンを変えたり、優先コドンを変えて特定の宿主における発現を増大させたり、スプライスバリアントを作り出したり、半減期を延長する等の操作が可能である。この発現ベクターは、特定の宿主における各要素の効率に基づいて選択された様々なサンプルに由来する転写及び翻訳調節エレメント(プロモーター及びエンハンサー、特定の開始シグナル、ポリアデニル化3’配列)を含み得る。in vitro組み換えDNA技術、合成技術及び/またはin vivo遺伝子組み換え技術を組み合わせて、このベクターに核酸配列と調節エレメントをつなぐことができる。このような技術は、当分野で周知であり、Sambrook(前出、ch. 4, 8, 16 and 17)に記載されている。
【0057】
様々な宿主系を発現ベクターで形質転換することができる。以下に限定するものではないが、これらの中には組み換えバクテリオファージやプラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌と、酵母発現ベクターで形質転換された酵母と、バキュロウイルス発現ベクターで形質転換された昆虫細胞系と、ウイルスエレメント及び/または細菌エレメントを含む発現ベクターで形質転換された植物細胞系や動物細胞系が含まれる(Ausubel前出、unit 16)。例えば、アデノウイルス転写/翻訳複合体を哺乳動物細胞に用いることができる。配列をウイルスのゲノムのE1若しくはE3領域に結合させた後、この感染ウイルスを用いて形質転換させ、宿主細胞でタンパク質を発現させることができる。また、ラウス肉腫ウイルスエンハンサーやSV40、またはEBV系のベクターを用いてタンパク質を高発現させることができる。
【0058】
核酸配列のルーチンのクローニング及びサブクローニング、増殖は、多機能PBLUESCRIPTベクター(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT1プラスミド(Life Technologies)を用いて行うことができる。核酸配列をこれらのベクターの多数のクローニング部位に導入すると、lacZ遺伝子が破壊され、形質転換された細菌を確認するための比色法によるスクリーニングが可能となる。更に、これらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitroでの転写及びジデオキシ法によるシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖の調整、入れ子状欠失の作製において有用である。
【0059】
長期に渡って組み換えタンパク質を産生させるために、同一或いは別のベクター上の選択マーカー遺伝子或いは可視マーカー遺伝子と共にこのベクターを持続的に細胞株に形質転換することができる。形質転換後、細胞を強化培地で約1〜2日間増殖させてから選択培地に移す。選択マーカー、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性遺伝子は、関連する選択薬に対する抵抗性を与え、導入配列を確実に発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。アントシアニン、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどの可視マーカーの発現によって同定された、或いは選択培地に生存することによって同定された耐性クローンを、培養技術を用いて増殖することができる。また、可視マーカーを用いて、導入された遺伝子によって発現するタンパク質を定量することができる。宿主細胞が目的の哺乳動物核酸分子を含むか否かの決定は、DNA−DNAまたはDNA−RNAハイブリダイゼーション、或いはPCR増幅技術に基づいて行うことができる。
【0060】
宿主細胞は、組み換えタンパク質を目的の形に修飾する能力に基づいて選択することができる。このような修飾には、アセチル化及びカルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化等が含まれる。「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングを利用して、タンパク質のターゲッティング、折り畳み及び/または活性を特定することができる。翻訳後活性のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有するATCC(Manassas, MD)から得られる異なった宿主細胞が、組み換えタンパク質の適当な修飾及びプロセシングが確実に行われるようにするために選択され得る。
【0061】
細胞培地からのタンパク質の回収
精製を容易にするために、ベクターに導入する異種部分は、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、6−His、FLAG、MYC等を含む。GST及びCBP、6−Hisはそれぞれ、グルタチオン及びカルモジュリン、金属キレート樹脂が結合した市販のアフィニティーマトリックスを用いて精製される。FLAG及びMYCは、市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて精製される。目的のタンパク質配列と異種部分との間にタンパク分解切断部位を設けて、生成の後の分離が容易にすることができる。組み換えタンパク質の発現及び精製の方法はAusubel(前出、unit 16)に記載され市販されている。
【0062】
ペプチドの化学合成
タンパク質若しくはその一部は、組み換え方法以外の当分野で周知の化学的方法によって合成することもできる。固相技術を用いるペプチド合成は、バッチ式或いは連続的なフロープロセスによって行うことができる。連続的なフロープロセスでは、αアミノ保護及び側鎖保護アミノ酸残基をリンカーを介して不溶性の高分子支持物に連続的に追加する。メチルアミン誘導体化ポリエチレングリコールなどのリンカーを、ポリ(スチレン−co−ジビニルベンゼン)に結合させて支持レジンを形成する。このアミノ酸残基は、酸不安定Boc(t−butyloxycarbonyl)法若しくは塩基不安定Fmoc(9−fluorenylmethoxycarbonyl)法によって保護されたN−α−である。保護されたアミノ酸のカルボキシル基をリンカーのアミンに結合して、この残基を固相支持レジンに結合させる。Boc若しくはFmocを用いた場合、トリフルオロ酢酸若しくはピペリジンを用いて保護基を除去する。カップリング試薬若しくは予め活性化されたアミノ酸誘導体を用いて、追加する各アミノ酸を結合された残基に付加してから、レジンを洗浄する。完全長のペプチドは、連続的な保護の停止、即ち誘導体化アミノ酸を結合させて合成し、ジクロロメタン及び/またはN、N−ジメチルホルムアミドで洗浄する。このペプチドは、ペプチドカルボキシル末端とリンカーとの間で切断され、ペプチド酸またはペプチドアミドが作られる(Novabiochem 1997/98 Catalog and Peptide Synthesis Handbook, San Diego CA pp. S1−S20)。ABI 431 A ペプチドシンセサイザー(Applied Biosystems)などの装置を用いて、ペプチドを自動合成することができる。タンパク質またはその一部は調整用の高性能液体クロマトグラフィーによって精製し、その組成をアミノ酸解析またはシークエンシングによって確認することができる(Creighton (1984) Proteins. Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY)。
【0063】
抗体の準備及びスクリーニング
ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、及びヒト等を含む様々な宿主は、哺乳動物DSCR1L1αタンパク質若しくはその任意の一部を注入して免疫することができる。フロイントなどのアジュバント及びミネラルゲルと、リゾレシチン及びpluronic polyol、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)、ジニトロフェノールなどの表面活性物質とを用いて免疫反応を高めることができる。オリゴペプチドやペプチド、またはタンパク質の一部を用いて、少なくとも約5個のアミノ酸、より好ましくは10個の天然のタンパク質の一部と同一のアミノ酸を含む抗体を誘発させる。キメラ分子に対する抗体を産生させるために、オリゴヌクレオチドをKLHなどのタンパク質と融合させることができる。
【0064】
モノクローナル抗体は、培地の連続細胞株によって抗体を産生させる任意の技術を用いて準備する。以下に限定するものではないが、このような技術には、ハイブリドーマ技術及びヒトB細胞ハイブリドーマ技術、EBV−ハイブリドーマ技術が含まれる(例えば、Kohler他(1975) Nature 256:495−497; Kozbor他(1985) J. Immunol. Methods 81:31−42: Cote他(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026−2030; and Cole他(1984) Mol. Cell Biol. 62:109−120.を参照)。
【0065】
別法では、当分野で周知の方法を用いる上記した一本鎖抗体を生産する技術で、エピトープ特異的一本鎖抗体を生産する。本哺乳動物タンパク質のエピトープに対して特異的に結合する部位を含む抗体断片を生産することが可能である。限定するものではないが、このような断片には、例えば、抗体分子のペプシン消化によって作製されたF(ab’)2断片及びこのF(ab’)2断片のジスルフィド架橋を減少させて作製したFab断片が含まれる。別法では、Fab発現ライブラリを作製して、目的の特異性を有するモノクローナルFab断片の高速かつ容易に同定できるようにする(例えば、Huse他(1989) Science 246:1275−1281を参照)。
【0066】
本哺乳動物DSCR1αタンパク質若しくはその一部を用いて、ファージミドまたはBリンパ球免疫グロブリン・ライブラリをスクリーニングして、目的の特異性を有する抗体を同定する。確立された特異性を有するモノクローナル抗体或いはポリクローナル抗体のいずれか一方を用いる、競合的結合またはイムノアッセイの様々なプロトコルが当分野で周知である。このようなイムノアッセイは通常、このタンパク質とその特異的な抗体との複合体形成の測定を行う。2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合によるアッセイを用いることもできる(Pound (1998) Immunochemical Protocols. Humana Press, Totowa NJ)。
【0067】
アッセイのための分子の標識化
多様な標識化及び接合技術が当分野で周知であり、様々な核酸やアミノ酸、及び抗体のアッセイに用いることができる。標識した分子の合成は、32P−dCTPまたはCy3−dCTP、Cy5−dCTPなどの標識したヌクレオチドや35Sメチオニン(APB)などのアミノ酸を組み込むためのAPBキットまたはPromega (Madison WI)を用いて行うことができる。ヌクレオチド及びアミノ酸は、BIODIPYまたはFITC(Molecular Probes, Eugene OR)などの試薬を用いて分子中に存在するアミン及びチオール基または他の基に化学的に結合させることで、様々な物質(蛍光剤または化学発光剤、色素産生剤など)で直接標識することができる。
【0068】
(診断)
本核酸分子、断片、オリゴヌクレオチド、相補的なRNA及びDNA分子、PNAを用いて、遺伝子発現の変化やmRNAの過剰な発現の不在/存在を検出及び定量、または治療期間中のmRNAレベルのモニタリングを行うことができる。発現変動に関連する症状や疾患には、アルツハイマー病、ダウン症候群、ハンチントン病、及びピック病が含まれる。診断アッセイにハイブリダイゼーションまたは増幅技術を用いて、遺伝子発現の変化を検出するべく、患者からの生体サンプルの遺伝子発現レベルを標準的なサンプルの値と比較する。質的または量的なこのような比較法は当分野で周知である。
【0069】
例えば、本核酸分子またはプローブを標準的な方法で標識して、これをハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者からの生体サンプルに加える。インキュベーションの後、このサンプルを洗浄し、ハイブリダイゼーション複合体に関連する標識(シグナル)の量を定量して標準値と比較する。患者のサンプルにおける標識の量が標準値と著しく異なっている(高いまたは低い)場合は、関連する症状や疾患、または異常症の存在が示唆される。
【0070】
遺伝子発現に関連する症状や疾患、または異常症の診断のための基準を設けるために、正常或いは標準的な発現プロフィールを確立する。この発現プロフィールは、動物かヒトの正常な被験体から採取した生体サンプルを、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、プローブと結合させることによって確立することができる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験体から得た値と、実質的に精製された標的配列を所定量用いた実験値とを比較することによって定量することができる。このように求めた標準値を、特定の症状や疾患、または異常症を示す患者のサンプルから得た値と比較することができる。標準値と特定の症状に関連する値との偏差からその症状を診断する。
【0071】
またこのようなアッセイを用いて、動物実験や臨床検査における特定の治療計画の効果を評価したり、患者個人の治療をモニタリングすることができる。病態が確認されると治療プロトコルを開始し、通常ベースで診断アッセイを繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患者に示される値に近づき始めたか否かを調べることが可能である。連続して行ったアッセイの結果から、数日から数ヶ月に渡る期間の治療効果を調べることができる。
【0072】
免疫学的方法
特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体の何れかを用いるタンパク質の検出及び定量は当分野で周知である。このような技術には、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)及びラジオイムノアッセイ(RIA)、蛍光活性化セルソーター法(FACS)が含まれる。2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを用いることもできる(例えば、Coligan 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Wiley−Interscience, New York NY; および Pound 前出)。
【0073】
(治療)
例えばRNA結合ドメインと保存されたセリン/プロリン・モチーフの文字列における化学的および構造的な類似性が、SEQ ID NO:2の或る領域と、ヒトDSCR1、ヒト(g1435040)、及びヒトDSCR1L2(g6017919)などの他のDSCR1ファミリータンパク質の或る領域との間に存在する。発現または活性の上昇に関連する症状の治療においては、タンパク質の発現または活性を低下させることが望ましい。また、発現または活性の低下に関連する症状の治療においては、タンパク質の発現または活性を増大させることが望ましい。
【0074】
一実施例において、本哺乳動物タンパク質の発現または活性の変化に関連する症状の治療または予防のために、本哺乳動物タンパク質、その一部、またはその誘導体を患者に投与することが可能である。このような疾患の例には、限定するものではないがアルツハイマー病、ダウン症候群、ハンチントン病、及びピック病が含まれる。
【0075】
別の実施例では、医薬用担体と共に精製された哺乳動物タンパク質を含む医薬組成物を患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこの内在性タンパク質の活性、または発現の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【0076】
更なる実施例では、この哺乳動物タンパク質の活性を調節するリガンドを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこのタンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。一実施態様では、この哺乳動物タンパク質に特異的に結合する抗体を、この哺乳動物タンパク質を発現する組織や細胞に薬剤を送達するためのターゲッティング或いは送達機構として用いることもできる。
【0077】
更なる実施例では、この哺乳動物タンパク質またはその一部や誘導体を発現可能なベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこのタンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【0078】
更なる実施例では、この核酸分子やその断片の相補配列を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこのタンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【0079】
本核酸分子、またはそれに相補的な分子やその一部、そのタンパク質やその一部の内の任意のもの、これらの核酸分子やタンパク質を運ぶベクター、及びそれらのリガンドをその他の薬剤と共に投与することが可能である。併用療法に用いる薬剤の選択は、当業者が従来の薬学原理に従って行うことができる。薬剤を併用することによって、少量の各薬剤で特定の症状の予防または治療において相乗的な効果をあげることが可能である。
【0080】
核酸を用いる遺伝子発現の調節
遺伝子の発現は、哺乳動物遺伝子の5’または3’調節領域、或いは他の調節領域に対して相補的或いはアンチセンス分子を設計することで調節することが可能である。転写開始部位に対して設計されたオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合を阻止する三重螺旋塩基対合で遺伝子発現を阻止することができる(Gee 他 In: Huber and Carr (1994) Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, pp. 163−177)。また、リボソームとmRNAとの結合を阻止して翻訳が行われないように、相補的な分子を設計することも可能である。或るいは、核酸分子またはその断片のライブラリをスクリーニングして、翻訳されない調節配列に特異的に結合する核酸分子または断片を同定することも可能である。
【0081】
また、酵素活性をもつRNA分子であるリボザイムを用いて、RNAの特異的な切断を触媒してもよい。リボザイム作用のメカニズムは、まずリボザイム分子と相補的な標的RNAとの配列特異的なハイブリダイゼーションが起こり、次にGUAおよびGUU、GUCなどの部位においてヌクレオチド鎖が切断される。このような部位が一旦同定されたら、オリゴヌクレオチドを機能不全にしうる二次構造特性について、同じ配列を有するオリゴヌクレオチドを評価することができる。また、候補標的としての適合性は、RNA分解酵素保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検査して評価することができる。
【0082】
本発明の相補的な核酸およびリボザイムは、固相ホスホラミダイト化学合成法を用いて、in vitroまたはin vivoでの組換え発現によって調製することが可能である。更に、RNA分子は、その5’および/または3’末端に隣接配列を付加して、或いは分子のバックボーン内のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオネートまたは2’O−メチルを用いて、細胞内の安定性および半減期が増大するように改変することができる。この改変はPNAの作製に固有であるが、他の核酸分子にも適用することができる。例えばイノシン、queosine、wybutosineなどの伝統的でない塩基を含めて、またはアセチル基、メチル基、チオ基でウリジン、アデニン、シチジン、グアニン、およびチミンを修飾して、内在性エンドヌクレアーゼに対する分子の有効性を低くする。
【0083】
スクリーニングアッセイ
本哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子を用いて、分子のライブラリをスクリーニングして特異的な結合親和性を調べることが可能である。このライブラリは、生物系において核酸分子の活性、複製、転写、または翻訳を調節するDNA分子、RNA分子、PNA、ペプチド、転写因子などのタンパク質、エンハンサー、リプレッサー、およびその他のリガンドを含み得る。このアッセイは、特異的な結合が許容される条件下で、哺乳動物核酸分子またはその断片を分子のライブラリと結合させるステップと、特異的な結合を検出して、その核酸分子と特異的に結合する少なくとも1つの分子を同定するステップとを含む。
【0084】
同様に、本哺乳動物タンパク質またはその一部を用いて、任意の様々なスクリーニングアッセイで分子または化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングに用いるタンパク質の一部は、溶液中に遊離している、非生物的若しくは生物的な基板に固定されている、または細胞内に位置していてもよい。そのタンパク質と分子との特異的な結合を測定することが可能である。スクリーニングするライブラリの種類によって、アッセイでそのタンパク質に特異的に結合するDNA、RNA、PNA分子、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、ペプチド、タンパク質、薬剤、または他の任意のリガンドを同定することが可能である。極めて少ないアッセイ容量および極少量の試験化合物を用いるハイスループットのスクリーニング方法が、米国特許第5,876,946号に記載されている。この方法は、酵素阻害または受容体結合を調べるために多数の分子をスクリーニングする。
【0085】
リガンドの精製
本核酸分子またはその断片を用いてサンプルからリガンドを精製することが可能である。哺乳動物核酸分子またはその断片を用いてリガンドを精製する方法は、特異的な結合が許容される条件下でその核酸分子またはその断片とサンプルとを結合させるステップと、特異的結合を検出するステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、好適な試薬を用いて精製されたリガンドから核酸分子を分離するステップとを含む。
【0086】
同様に、本タンパク質またはその一部を用いてサンプルからリガンドを精製することが可能である。哺乳動物タンパク質またはその一部を用いてリガンドを精製する方法は、特異的な結合が許容される条件下でそのタンパク質またはその一部とサンプルとを結合させるステップと、そのタンパク質をリガンドとの間の特異的な結合を検出するステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、好適なカオトロピック剤を用いて精製されたリガンドからタンパク質を分離するステップとを含む。
【0087】
薬理学
医薬組成物とは、所望の目的を達成するのに効果的な量の活性成分を含んでいる物質である。効果的な薬用量の決定は、当分野の技術者の能力による部分が大きい。どんな化合物であっても、初めは細胞培養アッセイ或いは動物モデルの何れかによって治療効果のある薬用量を推定する。また、動物モデルを使って、好適な濃度範囲および投与経路を決定する。次に、このような情報を用いて、ヒトへの効果的な投与経路および薬用量を決定する。
【0088】
治療効果のある薬用量とは、症状または病態を改善するタンパク質またはインヒビターの量である。このような薬剤の薬用効果および毒性は、例えば、ED50(集団の50%に医薬的効果がある投与量)およびLD50(集団の50%に致命的である投与量)などの細胞培養または実験動物における標準的な製薬方法によって決定することができる。或る投与量における毒性効果と治療効果との比率が治療指数となり、LD50/ED50と示すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて、ヒトへ適用する薬用量の範囲を決定する。
【0089】
モデル系
動物モデルを用いて、ヒトに相当する暴露条件で動物モデルがヒトに類似の毒物反応を示すバイオアッセイを行うことができる。哺乳動物が最も一般的なモデルである。大抵の毒物研究は、低コストで入手が容易であり、かつ参照できる中毒学が豊富であることから、ラットやマウスなどの齧歯類を用いて行われる。齧歯類近交系は、目的の遺伝子の過剰或いは過少な発現の生理学的な原因を調査するのに有用なモデルであり、疾患の診断および治療方法の開発にも有用である。特定の遺伝子を大量に発現する(例えば、乳汁中に分泌される)同系哺乳動物は、その遺伝子によって発現されるタンパク質の便利な供給源となり得る。
【0090】
中毒学
中毒学とは、生物系における物質の影響を研究する学問である。殆どの毒物研究はラットまたはマウスを用いて、物質がヒトの健康に与える影響を推定する。生理機能及び行動、恒常性プロセス、致死率における質的及び量的変化を観察して、毒性プロフィールを作成し、その物質に曝露された後のヒトの健康状態を評価する。
【0091】
遺伝子毒物学は、物質が遺伝子の突然変異を引き起こす能力を同定し分析する。遺伝毒性物質は通常、核酸との相互作用を促進する共通の化学的或いは物理的特性を有し、突然変異した染色体が子孫に受け継がれるのが最大の害である。毒物研究によって、受胎前の両親のどちらか一方、または妊娠中の母、発生段階の生物に投与された場合の、子孫における構造的或いは機能的な異常の頻度を増加させる物質を同定することが可能である。マウス及びラットは生殖周期が短く、統計的必要性を満たす多数の子を出産する能力から、これらの試験にはマウス及びラットが用いられる場合が最も多い。
【0092】
急性毒物の検査は、被験体への物質の一回の投与に基づき、その物質による症状または致死率を決定する。この検査では、(1)初めの投与量の範囲を決定する実験と、(2)有効な投与量の範囲を狭める実験と、(3)用量応答曲線を確立する実験の3つの実験が行われる。
【0093】
長期に渡る毒性検査では繰り返し物質を投与する。このような検査には、ラットやイヌが一般的に用いられ、分類学上異なった種からデータを収集する。物質を高い投与濃度で3〜4ヶ月間、毎日投与することで、発癌を除く、成体動物における殆どの毒性の種類が明らかになるという研究結果が多数報告されている。
【0094】
一年或いはそれ以上の長期に渡る慢性毒性検査は、物質に毒性がないこと、或いは物質の発癌の可能性の何れかを実証するために行われる。ラットで検査が行われる場合、少なくとも3つの検査グループと1つの対照グループが用いられ、最初から最後まである間隔で検査及びモニタリングが行われる。
【0095】
遺伝子組換え動物モデル
目的の遺伝子を過剰或いは過小に発現する遺伝子組換え齧歯類を同系交配し、それを用いてヒト疾患モデルを作製したり、治療薬検査や毒物検査を行う(例えば、米国特許第4,736,866号、同第5,175,383号、および同第5,767,337号を参照)。場合によっては、導入遺伝子が、胚発生中若しくは出生後の特定の時期に特定の種類の組織で活性化され得る。導入遺伝子の発現は、実験的薬剤治療を施す前、その最中、またはその後の、遺伝子組換え動物における表現型や組織特異的なmRNAの発現の分析からモニタリングすることができる。
【0096】
胚性幹細胞
齧歯類胚から単離された胚性幹細胞(ES細胞)は、胚を形成する可能性を維持している。ES細胞がキャリアとなる胚の中に導入されると、正常な発生が再開され、生まれる動物の全ての組織の一部を担うことになる。ES細胞は、実験用のノックアウトおよびノックイン齧歯類系を作製するのに好適な細胞である。マウス129/SvJ細胞株などのマウスES細胞は、マウスの初期胚から採取されてから当分野で周知の培養条件下で増殖されたものである。ノックアウト系に用いるベクターには、マーカー遺伝子配列を含むように破壊された疾患候補遺伝子が含まれる。このマーカー遺伝子配列は、in vivoでその転写および/または翻訳を阻害する。このベクターを、当分野で周知の電気穿孔法、アデノウイルス運搬法、及びマイクロインジェクション等の形質転換方法によってES細胞に導入する。齧歯類の内在性遺伝子が、細胞分裂の際の相同組換えや組み込みによって、破壊された疾患遺伝子に置換される。形質転換されたES細胞を或る条件で選択して特定し、C57BL/6マウス系などからのマウス細胞胚盤胞に微量注入するのが好ましい。この胚盤胞を複数の偽妊娠メスに外科的に導入し、その遺伝子型を有するキメラ子孫を産ませ、それらのキメラ子孫を交配してヘテロ接合系またはホモ接合系を作製する。
【0097】
また、in vitroでの神経細胞および造血系、心筋細胞などの様々な細胞型や組織の分化の研究に、ES細胞が用いられている(Bain 他 (1995) Dev. Biol. 168:342−357; Wiles and Keller (1991) Development 111:259−267; and Klug 他 (1996) J. Clin. Invest. 98:216−224)。近年の研究により、ヒト胚盤胞由来ES細胞をin vitroで操作して、内胚葉および中胚葉、外胚葉性の細胞型を含む8つの別の細胞系譜に分化可能であることが実証された(Thomsonら (1998) Science 282:1145−1147)。
【0098】
ノックアウト分析
遺伝子ノックアウト分析では、ヒト疾患遺伝子候補のある領域が、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの非哺乳動物遺伝子を含むように酵素によって改変される(neo ; Capecchi (1989) Science 244:1288−1292)。挿入されたコード配列は、標的遺伝子の転写および翻訳を阻害して疾患候補タンパク質の生化学的な合成を阻止する。この改変した遺伝子を培養胚性幹細胞(上記)に形質転換し、この形質転換細胞を齧歯類胞胚に注入し、この胞胚を偽妊娠メスに移植する。この遺伝子組換え子孫をクロス交配して、ホモ接合近交系を作り出す。
【0099】
ノックイン分析
胚発達の初期段階に現われる分化全能性ES細胞を用いてノックインヒト化動物(ブタ)または遺伝子組換えヒト疾患動物モデル(マウスまたはラット)を作り出すことができる。ノックイン技術を用いて、ヒト遺伝子のある領域を動物ES細胞に注入し、そのヒト配列が組換えによって動物細胞ゲノムの中に組み込まれるようにする。ヒト遺伝子が組み込まれた全能性ES細胞を上記したように操作する。ヒトの症状に類似の情報を収集するべく、この近交系動物の研究および処置を行う。これらの方法を用いて、幾つかのヒト疾患モデルを作り出す(例えば、Lee 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95:11371−11376;Baudoin 他 (1998) Genes Dev. 12:1202−1216; and Zhuang 他 (1998) Mol. Cell Biol. 18:3340−3349)。
【0100】
非ヒト霊長類モデル
動物実験の分野は、生理学および遺伝学、化学、薬理学、統計学等の基本科学から得たデータおよび方法論を利用する。このようなデータは、非ヒト霊長類がヒトの健康に関連し得るため、非ヒト霊長類における治療薬の効果の評価に重要である。ヒトの代わりにサルをワクチンおよび薬剤の評価に用いる。サルの反応は、類似の条件下でのヒトへの暴露に相当する。カニクイザル(Macaca fascicularis、Macaca mulatta)、および一般的なマーモセット(Callithrix jacchus)は、このような実験に用いられる最も一般的な非ヒト霊長類(NHP)である。NHPの群体作りおよび維持には多大な費用が掛かるため、初期の研究および毒物学的検査は、通常は齧歯類モデルで行われる。薬物嗜癖などの行動を調べる研究では、NHPは最良の実験動物である。更に、個々のNHPおよびヒトは、多くの薬剤および毒物に対して異なった感受性を示すため、これらの物質を「高代謝型」および「低代謝型」に分類することができる。
【0101】
更なる実施例では、限定するものではないが、トリプレット遺伝子コードおよび特異的な塩基対相互作用などの特性を含む、現在知られている核酸配列の特性に新しい技術が依存する場合は、本哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子を、開発中のあらゆる分子生物学技術に用いることが可能である。
【0102】
(実施例)
本発明は、記載した特定の装置及び物質、方法に限定されるものではないことを理解されたい。特定の実施例について説明するが、同等の実施例を用いて本発明を具現することも可能である。本発明の範囲は、前記請求の範囲によってのみ限定されるものであって、記載した実施例によって限定されるものではない。また、以下に記載の実施例は、本発明を例示するためのものであって本発明を限定するものではない。例示目的で、ヒト海馬cDNAライブラリHIPONON02の作製方法を記載する。
【0103】
1 cDNA の作製
ヒト海馬cDNAライブラリHIPONON02は、頭蓋内出血で死亡した72歳の白人女性の海馬から採取した組織を用いて作製した。凍結組織を、POLYTRONホモジナイザー(PT−3000;Brinkmann Instruments, Westbury, NY)を用いて、TRIZOL試薬(1gの組織にTRIZOL 10ml;Life Technologies)においてホモジナイズし溶解した。ホモジナイズした後、クロロホルム(1:5 v/v クロロホルム:ホモジネート)を加え、溶解物を遠心分離した。水層を取り除いて、イソプロパノールでRNAを沈殿させた。RNAをDEPC処理水で再懸濁し、27℃で35分間、DNアーゼI(Life Technologies)で処理した。このRNAを酸性フェノールクロロホルム(pH4.7)で一回再抽出して、0.3M酢酸ナトリウムおよび2.5倍量のエタノールで沈殿させた。
【0104】
メッセンジャーRNA(mRNA)をOLIGOTEXキット(QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA)を用いて単離した。これをcDNAライブラリの作製に用いた。このmRNAを、mRNAのポリ(A)尾部で一本鎖cDNAの合成を開始するように設計されたNotIプライマー−アダプターを含むSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)の推奨プロトコルに従って処理した。二本鎖cDNAを平滑化し、EcoRIアダプターに結合し、NotI(New England Biolabs, Beverly MA)で消化した。このcDNAを、SEPHAROSE CL−2Bカラム(APB)上で分画化し、800bpを越える大きさのcDNAを、PSPORT1プラスミド(Life Technologies)のNotI及びEcoRI部位に結合させた。この組換えプラスミドを、DH5α、DH12s、DH10Bコンピテント細胞(全てLife Technologies)に形質転換した。
【0105】
2 cDNA ライブラリの標準化
例を示すために、ヒト脳ライブラリの標準化について説明する。大腸菌株DH12Sコンピテント細胞(Life Technologies)におけるHIPONOT01プラスミドライブラリの約1.13×106の独立したクローンを、カルベニシリン(25mg/l)及びメチシリン(1mg/ml)選択下で、培地で成長させ、その後に電気穿孔法により形質転換を行った。ライブラリの存在レベルに従って余剰のcDNA複製物の数を減らすために、cDNAライブラリを以下の変更点を除きSoares他(1994, Proc Natl Acad Sci 91: 9228−9232)の方法に従って1回標準化した。変更点は次の通りである。プライマー伸長反応における鋳型に対するプライマーの比率を2:1から10:1に高めた。反応液のddNTP濃度を、より長いプライマー伸長物(400〜1000塩基)が形成できるように各ddNTPを150μMまで低下させた。アニーリングハイブリダイゼーションを13時間から48時間に延長した。標準化したライブラリの一本鎖DNAサークルを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーで精製し、ランダムプライミングにより部分的な2本鎖に変換し、大腸菌株DH10Bコンピテント細胞(Life Technologies)の中に電気穿孔法により導入した。
【0106】
3 pINCY プラスミドの作製
このプラスミドは、pSPORT1プラスミド(Life Technologies)をEcoRI制限酵素(New England Biolabs, Beverly MA)で消化し、オーバーハングした端部を、クレノウ酵素(New England Biolabs)及び2’−デオキシヌクレオチド5’−三リン酸(dNTPs)を用いて二本鎖に合成した。このプラスミドが自己連結した後、このプラスミドで細菌宿主となる大腸菌株JM109を形質転換した。
【0107】
細菌(pSPORT 1−△RI)によって生成された中間プラスミドは、EcoRIでは消化されず、Hind III (New England Biolabs)で消化し、オーバーハングした端部をクレノウ酵素及びdNTPsで二本鎖にした。リンカー配列をリン酸化し、5’平滑末端に繋ぎ、EcoRIで消化し、自己連結させた。JM109宿主細胞を形質転換した後、プラスミドを単離し、Hind IIIではなくEcoRIで選択的な消化の検査を行った。この基準を満たす1つのコロニーをpINCYプラスミドとを呼ぶ。
【0108】
NotI及びEcoRI制限酵素を用いて作製したライブラリからcDNAを取り込むプラスミドの能力を検査した後、いくつかのクローンをシークエンシングし、約0.8kbのインサートを含む1つのクローンを選択し、そのクローンから大量のプラスミドを生成した。NotI及びEcoRIで消化した後、ライブラリの作製に用いるためにこのプラスミドをアガロースゲル上で分画し、QIAQUICKカラム(Qiagen)を用いて精製した。
【0109】
4 cDNA クローンの単離及びシークエンシング
プラスミドDNAを細胞から遊離し、MINIPREPキット(Edge Biosystems, Gaithersburg MD)またはREAL Prep 96プラスミドキット(Qiagen)のいずれかを用いて精製した。このキットには、96ウェルブロック、及び960回の精製を行うための試薬が含まれている。以下の変更点を除き、推奨プロトコルに従った。(1)細菌を、25mg/lのカルベニシリン及び2.4%のグリセロールと共に1mlの滅菌TERRIFIC BROTH(BD Biosciences, San Jose CA)において培養した。(2)19時間インキュベートしてから、0.3mlの溶解バッファで溶解した。(3)イソプロパノール沈殿の後、プラスミドDNAのペレットを0.1mlの蒸留水で再懸濁した。プロトコルの最終ステップの後、サンプルを96ウェルブロックに移し、4℃で保管した。
【0110】
MICROLAB 2200システム(Hamilton, Reno NV)及びDNA ENGINEサーマルサイクラー(MJ Research)を用いて、シークエンシングするためにcDNAを調整した。このcDNAを、ABI PRISM377シークエンシングシステム(Applied Biosystems)またはMEGABASE 1000 DNAシークエンシングシステム(APB)を用いてSanger and Coulson (1975; J Mol Biol 94: 441−448)の方法でシークエンシングした。単離したもののほとんどを、標準的なABIプロトコル及びキット(Applied Biosystems)に従って、0.25×〜1.0×の濃度の溶液容量でシークエンシングした。別法では、APBから入手した溶液及び色素を用いてcDNAをシークエンシングした。
【0111】
5 cDNA 配列の伸長
本cDNAは、cDNAクローン及びオリゴヌクレオチドプライマーを用いて伸長した。一方のプライマーは既知の断片の5’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の3’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、OLIGプライマー分析ソフトウエア(National Biosciences Insights)を用いて、約22〜約30個のヌクレオチドの長さ、約50%以上のGC含量で、685〜72℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を形成するヌクレオチドのストレッチは排除した。
【0112】
選択されたcDNAライブラリを鋳型として用いてこの配列を伸長した。2段階以上の伸長が必要な場合は、追加の或いは入れ子状のプライマー(nested primer)を設計した。好適なライブラリは、大きなcDNAを含むように大きさが選択されたライブラリである。ゲノムライブラリは、調節エレメントを得るためにプロモーター結合領域の5’を伸長する際に有用である。
【0113】
米国特許第5,932,451号に開示されているような方法を用いてPCR法で高い忠実度の増幅を達成した。PCRは、DNA ENGINE サーマルサイクラー(MJ Research)を用いて96ウェルプレートで行った。反応混合液には、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、反応緩衝液(Mg2 +、(NH4)2SO4、β−メルカプトエタノールを含む)、Taq DNAポリメラーゼ(APB)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含まれている。プライマーの組、PCI A及びPCI B(Incyte Pharmaceuticals)に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 60℃で1分間
ステップ4 68℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す
ステップ6 68℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
別法では、プライマーの組、T7とSK+(Stratagene)に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 57℃で1分間
ステップ4 68℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す
ステップ6 68℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
【0114】
各ウェルのDNA濃度は、100μlのPICOGREEN定量試薬(1×TEにおける試薬0.25% (v/v); Molecular Probes)及び0.5μlの希釈していないPCR産物を不透明な蛍光光度計プレート(Corning, Acton MA)の各ウェルに分注して、DNAがその試薬と結合できるようにして測定した。このプレートをFluoroskan II (Labsystems Oy)でスキャンして、サンプルの蛍光を測定してDNAの濃度を定量化した。反応混合物の5〜10μlのアリコットを1%のアガロースミニゲル上で電気泳動して解析し、何れの反応がより長い配列の伸長に成功したかを決定した。
【0115】
伸長したクローンを脱塩及び濃縮してから384ウェルプレートに移し、CviJIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison WI)で消化し、pUC 18ベクター(APB)に再連結する前に音波処理または切断した。ショットガンシークエンシングのために、消化したヌクレオチド配列を低濃度(0.6%〜0.8%)のアガロースゲル上に分離させ、断片を切断し、ゲルをAGARACE酵素(Promega)で消化した。T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を用いて伸長したクローンをpUC 18ベクター(APB)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部位の延び出しを処理してから、大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。形質転換細胞が抗生物質を含む培地で選択され、それぞれのコロニーを切りとって、LB/2Xカルベニシリン培養液の入った384ウェルプレートの中で、37℃で一晩培養した。
【0116】
この細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(APB)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAを増幅した。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 60℃で1分間
ステップ4 72℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を29回繰り返す
ステップ6 72℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量した。DNA回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを20%のジメチルサルホサイド(dimethysulphoxide)(1:2, v/v)で希釈し、DYENAMICエネルギー移動シークエンシングプライマー及びDYENAMIC DIRECTサイクルシークエンシングキット(APB)またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reactionキット(Applied Biosystems)を用いてシークエンシングした。
【0117】
6 cDNA 及びそれらから導き出されたタンパク質の相同性検索
配列表のcDNA及びそれらから導き出されたアミノ酸配列を、GenBank、SwissProt、BLOCKSなどのデータベースにおいて検索する。すでに同定されアノテーションの付けられた配列またはドメインを含むこれらのデータベースを、BLASTまたはBLAST 2 (Altschulら、前出; Altschul、前出)を用いて検索し、アラインメントを作成し、完全に一致する或いは相同な配列を決定する。このアラインメントは、原核生物(細菌)または真核生物(動物、真菌、または植物)を起源とする配列に対するものである。或いは、Smith and Smith(1992, Protein. Engineering 5: 35−51)に記載されているようなアルゴリズムを用いて、一次配列パターン及び二次構造ギャップペナルティを処理することが可能である。本明細書に記載した全ての配列は、その長さが少なくとも49ヌクレオチドであり、不要な塩基(A、C、G、或いはTではなくNと記載)は12%以下である。
【0118】
Karlin (前出) に詳述されているように、問い合わせ配列とデータベース配列との間のBLASTによる一致を統計学的に評価し、ヌクレオチドに対しては10−25、ペプチドに対しては10−14の閾値を満たす一致のみを記録した。相同性はまた、以下のように計算した積スコアによって評価した。まず、BLASTにおける核酸またはアミノ酸同一性(問い合わせ配列と参照配列との間の)のパーセントに、最大可能BLASTスコアのパーセント(問い合わせ配列及び参照配列の長さに基づく)を乗じてから、100で除した。実験室で用いられるハイブリダイゼーション法と比べ、完全一致に対する電子的なストリンジェンシーを70と設定し、完全一致に対する保守的な下限を約40に設定した(不要な塩基対による1〜2%のエラーを有する)。
【0119】
無料で利用可能な配列比較アルゴリズムであるBLASTソフトウエア一式(NCBI, Bethesda MD; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html)は、既知の核酸分子を整列するために用いる“blastn”、及び核酸分子或いはアミノ酸分子のいずれかの直接ペアワイズ比較に用いられるBLAST2を含む様々な配列分析プログラムを含む。BLASTプログラムは、一般に、例えば以下のようにデフォルト設定されたギャップ及びその他のパラメーターで実行される。
【0120】
同一性を、配列の全長或いは配列の一部に対して測定することができる。Brennerらが(1998; Proc Natl Acad Sci 95: 6073−6078、言及することをもって本明細書の一部とする)、配列同一性により構造の相同性を同定するBLASTの能力を分析した。この分析により、少なくとも150残基の配列アラインメントに対して30%の同一性が信頼できる閾値であり、少なくとも70残基の配列アラインメントに対して40%の同一性が信頼できる閾値である。
【0121】
本明細書の哺乳動物核酸分子を、LIFESEQ GOLDデータベースで見出した構築されたコンセンサス配列または鋳型と比較した。cDNA、伸長、完全長、及びショットガンシークエンシングプロジェクトに由来するコンポーネント配列をPHREDで分析し、質のスコアを割り当てた。許容できる質スコアを有する全ての配列に対して様々なプリプロセシング及び編集を行い、質の低い3’末端、ベクター及びリンカー配列、ポリA尾部、Aluリピート、ミトコンドリア及びリボソーム配列、及び細菌汚染配列を除去した。編集した配列は少なくともその長さが50bpでなければならない。情報の少ない配列、並びにジヌクレオチドリピート、Aluリピートなどの繰り返しエレメントはNで置換するかマスクした。
【0122】
編集した配列を、配列が遺伝子ビンに割り当てられる構築処理を行った。それぞれの配列は1つのビンにのみ属し、鋳型を形成するべく各ビンにおける配列を構築した。新規にシークエンシングしたコンポーネントをBLAST及びCROSSMATCHを用いて存在するビンに加えた。ビンに加えるためにはこのコンポーネント配列は、BLAST質スコアが150以上であって、少なくとも82%の局所的な同一性のアラインメントでなければならない。それぞれのビンにおける配列を、PHRAPを用いて構築した。いくつかの重複するコンポーネント配列を有するビンはDEEP PHRAPを用いて構築した。それぞれの鋳型の向きは、そのコンポーネント配列の数及び向きに基づいて決定した。
【0123】
それぞれのビンを互いに比較して、局所類似性が82%以上のビンを1つにまとめて再構築した。局所同一性が95%未満の鋳型を有するビンは分けた。鋳型は、STITCHER/EXON MAPPERアルゴリズムで分析した。このSTITCHER/EXON MAPPERアルゴリズムは、スプライスバリアント、択一的スプライシングエキソン、スプライスジャンクション、並びに組織の種類或いは疾患の状態により発現が異なる択一的にスプライシングされた遺伝子などの存在の確率を分析することができる。構築処理を繰り返し行い、GBpriなどのGenBankデータベースに対してBLASTを用いて鋳型にアノテーションを付けた。完全一致は、200塩基対に対する95%以上の局所同一性から100塩基対に対する100%の局所同一性を有すると定義し、相同一致は、≦1×10−8のE値(確率スコア)を有すると定義した。また鋳型を、GENPEPTに対してフレームシフトFASTx分析を行い、相同一致を≦1×10−8のE値を有すると定義した。鋳型の分析及び構築については、1999年3月25日に出願された米国特許出願第09/276,534号に開示されている。
【0124】
構築の後に、鋳型をBLAST、モチーフ、及びその他の機能分析法で分析し、1997年3月6日に出願の米国特許出願第08/812,290号及び同第08/811,758号、1997年10月9日に出願の米国特許出願第08/947,845号、及び1998年3月4日に出願の米国特許出願第09/034,807号に記載されている方法を用いてタンパク質を階層に分類した。次に鋳型を、3つ全ての前方読み枠にそれぞれの鋳型を翻訳して、それぞれの翻訳を、HMMERソフトウエアパッケージ(Washington University School of Medicine, St. Louis MO; http://pfam.wustl.edu/)を用いて隠れマルコフモデルをベースにしたタンパク質ファミリー及びドメインのPFAMデータベースにおいて検索した。
【0125】
本核酸分子を、MACDNASIS PROソフトウエア(Hitachi Software Engineering)及びLASERGENEソフトウエア(DNASTAR)を用いて更に分析し、GenBankの齧歯類、哺乳類、脊椎動物、原核生物、及び真核生物のデータベース、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、PFAM、及びPrositeなどの公共のデータベースに対して問い合わせた。
【0126】
7 染色体マッピング
Stanford Human Genome Center (SHGC)、Whitehead Institute for Genome Research (WIGR)、及びGenethonなどの公共の情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝子マッピングデータを用いて、マッピングできる配列表のcDNAが存在するかを調べた。DSCR1αをコードする核酸分子のマッピングされた全ての断片が、同じ位置にマッピングされた全ての関連する調節及びコード配列に割り当てられた。遺伝子マップ位置は、ヒト染色体の範囲すなわち区間として表される。センチモルガン(cM)(ヒトDNAの100万塩基対に概ね相当する)で表されるマップ位置の範囲は、染色体p腕の末端から測定する。
【0127】
7 ハイブリダイゼーション技術及び分析
核酸分子の基板への固定
本cDNAを以下に示す方法で基板に固定する。cDNAの混合液をジェル電気泳動により分画後、毛細管輸送によってナイロン膜に移す。別法では、cDNAを個別にベクターに結合して、それを細菌宿主細胞に挿入してライブラリを形成する。次にcDNAを以下の方法で基板に配列する。第1の方法では、個別のクローンを含む細菌細胞を機械的に摘み上げてナイロン膜に整列させる。このナイロン膜を、選択薬(用いるベクターによって異なるが、カルベンシリン、カナマイシン、アンピシリン、またはクロラムフェニコールなど)を含むLB寒天培地に載置し、37℃で16時間インキュベートする。この膜を寒天培地から取り除き、次にこの膜をコロニー側を上にして10%SDS、変性溶液(1. 5 M NaCl、0. 5 M NaOH)、中和液(1. 5 M NaCl、1 M Tris、pH 8. 0)に入れ、2×SSCにおいて10分間づつ2回インキュベートする。次にこの膜を、STRATALINKER UVクロスリンカー(Stratagene)でUV照射する。
【0128】
第2の方法では、インサートに隣接したベクター配列に相補的なプライマーを用いて、PCRを30サイクル行い細菌ベクターからcDNAを増幅する。PCR増幅により、拡散の濃度を開始時の1〜2 ngから最終的に5μgまで増大させる。約400 bp〜約5000 bpの増幅した拡散をSEPHACRYL−400ビーズ(APB)を用いて精製する。精製した拡散を、手動で或いはドット/スロットブロッティングマニフォールド及び吸入装置でナイロン膜に配列し、上記した変性、中和、及びUV照射によって固定する。精製した拡散を、米国特許第5,807,522号に開示された方法でポリマーコートスライドガラスに機械的に配列して固定する。ポリマーコートスライドガラスは、顕微鏡スライドガラス(Corning)を0.1%SDS及びアセトンで超音波洗浄した後、4%フッ化水素酸(VWR Scientific Products, West Chester PA)においてエッチングし、次に95%エタノールにおいて0.05%アミノプロピルシラン(Sigma−Aldrich, St Louis MO)でコーティングし、オーブンで110℃で硬化させて準備する。処理中及び処理後にこのスライドガラスを蒸留水で十分に洗浄する。次に、核酸分子をスライド上に配列し、STRATALINKER UVクロスリンカー(Stratagene)を用いてこの核酸分子のアレイをUV照射してスライド上に固定する。次にこのアレイを、室温で0.2%SDSで洗浄し、蒸留水で3回すすぐ。非特異的な接合部位を、アレイをリン酸バッファー(Tropix, Bedford MA)に於ける0.2%カゼインにおいて60℃で30分間インキュベートしてブロックし、次にこのアレイを0.2%SDSで洗浄し、前記したように蒸留水で洗い流す。
【0129】
メンブレンを用いるハイブリダイゼーションのためのプローブの準備
本配列表のcDNAに由来するハイブリダイゼーションプローブは、メンブレンハイブリダイゼーションにおいてcDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングするために用いられる。プローブを準備するために、cDNAを45μl TEバッファにおいて40〜50 ngの濃度に希釈し、100℃で5分間加熱して変性し、短時間遠心分離する。次に、変性したcDNAをREDIPRIMEチューブ(APB)に加え、青色が十分に拡散するまで軽く混合し、短時間遠心分離する。5μlの[32P] dCTPをチューブに加え、その内容物を37℃で10分間インキュベートする。この標識化反応を5μlの0. 2M EDTAを加えてストップし、PROBEQUANT G−50マイクロカラム(APB)を用いてプローブを組み込まれなかったヌクレオチドから精製する。精製したプローブを100℃で5分間加熱してから氷上で2分間冷却し、以下に記載するようにメンブレンハイブリダイゼーションに用いる。
【0130】
ポリマーコートスライドを用いるハイブリダイゼーションのためのプローブの準備
サンプルから単離したmRNAに由来するハイブリダイゼーションプローブを用いて、アレイハイブリダイゼーションにおいて本配列表のcDNAをスクリーニングする。プローブは、GEMbrightキット(Incyte Genomics)を用いて、mRNAを9μl TEバッファにおいて200 ngの濃度に希釈し、5μlの5×バッファ、1μlの0.1 M DTT、3μlのCy3またはCy5標識混合物、1μlのRNアーゼインヒビター、1μlの逆転写酵素、及び5μlの1×酵母コントロールmRNAを加えて準備する。酵母コントロールmRNAは、非コード酵母ゲノムDNA(W. Lei, unpublished)からin vitro転写によって合成する。量的コントロールとして、0.002 ng、0.02 ng、0.2 ng、及び2 ngのコントロールmRNAからなるセットを、サンプルmRNAに対してそれぞれ1:100,000、1:10,000、1:1000、及び1:100 (w/w)の比率で逆転写反応液に希釈する。mRNAの異なった発現パターンを検査するために、第2のセットのコントロールmRNAを、1:3、3:1、1:10、10:1、1:25、及び25:1 (w/w)の比率で逆転写反応液に希釈する。反応液を混合し、37℃で2時間インキュベートする。次に反応液を85℃で20分間インキュベートし、2つの連続したCHROMA SPIN+TE 30カラム(Clontech)を用いてプローブを精製する。精製したプローブを、DEPC処理水で90μlに希釈して、2μlの1mg/mlグリコーゲン、60μlの5M酢酸ナトリウム、300μlの100%エタノールを加えてエタノール沈殿させる。このプローブを20,800×gにおいて20分間遠心分離し、ペレットを12μlの再懸濁バッファに再懸濁させ、65℃で5分間加熱し、完全に混合する。上記したようにプローブを加熱及び混合してから氷上で保管する。プローブを以下に記載するように高密度のアレイハイブリダイゼーションに用いる。
【0131】
メンブレンを用いるハイブリダイゼーション
メンブレンを、1%Sarkosyl及び1×高リン酸バッファ(0. 5M NaCl、0.1 M Na2HPO4、5 mM EDTA、pH 7)を含むハイブリダイゼーション溶液において55℃で2時間プレハイブリダイゼーションする。15mlの新しいハイブリダイゼーション溶液に希釈したプローブをメンブレンに加える。55℃で16時間、メンブレンにプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを1mM Tris(pH 8. 0)、1%Sarkosylにおいて25℃で15分間洗浄し、1mM Tris(pH 8. 0)において25℃で15分間づつ4回洗浄する。ハイブリダイゼーション複合体を検出するために、XOMAT−ARフィルム(Eastman Kodak, Rochester NY)をメンブレンに一晩−70℃で露出し、現像して目で確認する。
【0132】
ポリマーコートスライドを用いるハイブリダイゼーション
プローブを65℃で5分間加熱し、5415Cマイクロ遠心分離器(Eppendorf Scientific, Westbury NY)を用いて毎分9400回転で5分間遠心分離し、アレイの表面に18μlのアリコットを載せカバースリップで覆う。このアレイを、顕微鏡スライドより僅かに大きいキャビティを有する防水容器に移す。この容器の角から140μlの5×SSCを加えてその内部を100%の湿度に保つ。アレイを含む容器を60℃で約6時間半インキュベートする。このアレイを、1×SSC、0.1%SDSにおいて45℃で10分間洗浄し、0.1×SSCにおいて45℃で10分間づつ3回洗浄した後、乾燥させる。
【0133】
ハイブリダイゼーション反応を、絶対ハイブリダイゼーション(absolute hybridization)方式またはディファレンシャルハイブリダイゼーション方式で行う。絶対ハイブリダイゼーション方式の場合、1つのサンプルからのプローブをアレイの要素にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体が形成された後にシグナルを検出する。シグナルの強度がサンプルにおけるプローブmRNAのレベルに相関する。ディファレンシャルハイブリダイゼーション方式の場合、2つの生体サンプルにおける遺伝子のセットの異なった発現を分析する。2つのサンプルからのプローブを準備し、異なった標識成分で標識する。2つの標識したプローブの混合物をアレイ要素にハイブリダイズさせ、2つの異なった標識からの蛍光シグナルをそれぞれ別に検出できる条件下でシグナルを検査する。アレイ上の要素に、2つの生体サンプルに由来するプローブのそれぞれが同数ハイブリダイズする場合、明瞭な複合蛍光が得られる(Shalon W095/35505)。
【0134】
ハイブリダイゼーション複合体をInnova 70混合ガス10Wレーザーを備えた顕微鏡(Coherent, Santa Clara CA)で検出する。この顕微鏡は、Cy3を励起するために488nmのスペクトル線を発生し、Cy5を励起するために632nmのスペクトル線を発生することができる。励起レーザー光を20倍の顕微鏡対物レンズ(Nikon, Melville NY)を用いてアレイに集束させる。アレイを含むスライドを顕微鏡上のコンピュータ制御されたXYステージ上に載せ、20μmの解像度で対物レンズを通してラスタースキャンする。ディファレンシャルハイブリダイゼーション方式の場合、2つの蛍光物質を順番にレーザーで励起する。波長に応じて放出された光を2つの蛍光物質に対応する2つの光電子増倍管検出器(PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ)に分割する。アレイと光電子増倍管との間に配置された好適なフィルターを用いてシグナルをフィルタリングする。用いられる蛍光物質の最大発光波長は、Cy3が565nmであり、Cy5が650nmである。スキャンの感度は、プローブ混合物に加えられた酵母コントロールmRNAによって生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイのある位置に相補的なDNA配列が含まれていると、その位置におけるシグナルの強度が、ハイブリダイズ種(hybridizing species)の重量比で1:100,000の関係となり得る。
【0135】
光電子増倍管の出力をIBM互換性パーソナルコンピュータにインストールした12ビットRTI−835H アナログ/デジタル変換ボードを用いてデジタル化する(Analog Devices, Norwood MA)。このデジタル化したデータを、イメージとして表示する。この場合、シグナル強度を、20色線形変換を用いて、青(弱いシグナル)から赤(強いシグナル)の疑似色スケールにマッピングする。データはまた量的にも分析する。2つの異なった蛍光物質が同時に励起されて測定された場合、データを、各蛍光物質に対する発光スペクトルを用いて蛍光物質間の光学クロストーク(発光スペクトルの重複による)をまず補正する。各スポットからのシグナルがグリッドの各要素の中心に来るように、蛍光物質シグナル強度の上にグリッドを重ね合わせる。各要素内の蛍光シグナルを統合して、シグナルの平均強度に対応する数値を求める。シグナル分析に用いるソフトウエアはGEMTOOLSプログラム(Incyte Pharmaceuticals)である。
【0136】
8 電子分析
BLASTを用いて、GenBankやLifeSeqデータベース(Incyte Genomics)において同一または関連分子を検索した。ヒトおよびラット配列の積スコアを下記のようにして計算した。BLASTスコアにヌクレオチド一致率(%)を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さ×5で除し、短い配列の長さに対する100%のアラインメントが積スコア100とする。積スコアは2つの配列間の類似性の程度と配列一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア40では一致はエラーが1%〜2%以内の厳密さであり、積スコア70以上では一致は完全となる。類似分子または関連分子は通常、8〜40の間の積スコアを示す分子を選択することで特定できる。
【0137】
電子ノーザン分析を積スコア70で実施した。LIFESEQデータベースのすべての配列とcDNAライブラリを系、器官/組織、細胞のタイプにより分類した。分類には、心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液及び免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性/混合性または尿路が含まれる。各カテゴリーでは、配列が発現したライブラリの数を数えて、そのカテゴリー内のライブラリの総数に対して示した。非標準化ライブラリでは、2以上の発現レベルが有意である。
【0138】
9 相補的な分子
約5 (PNA)から5000 bp (cDNAインサートの相補配列)の本核酸分子に相補的な分子を用いて、遺伝子発現の検出或いは阻害を行う。これらの分子をOLIGOプライマー分析ソフトウエア(Molecular Biology Insights)で選択した。検出については、実施例7に記載されている。プロモーターが結合するのを妨げて転写を阻害するために、相補的な分子を最もユニークな5’ 配列に結合すると共に読み枠の開始コドンの5’ UTR上流のヌクレオチドを含むよう設計する。相補的な分子は、エンハンサーやイントロン等のゲノム配列を含み、この相補的な分子を用いて「三重らせん」塩基対を形成して、二重らせんが十分に開かないようにし、これによりポリメラーゼ、転写因子、または調節分子が結合できないようにする。翻訳を阻害するためには、リボソームが本哺乳動物タンパク質をコードするmRNAに結合するのを阻害するように相補的な分子を設計する。
【0139】
相補的な分子を発現ベクターに導入して、これを用いて細胞系を形質転換して効果を検査する。例えば、器官、腫瘍、滑腔、また脈管系を形質転換して一過性或いは短期治療の効果、また幹細胞、接合体、または他の再生系統を形質転換して長期或いは安定した遺伝子治療の効果を検査することが可能である。一過性発現は、非複製ベクターを用いると1ヶ月以上続き、ベクター複製を誘導する適切なエレメントを形質転換/発現系に用いると3ヶ月以上続く。
【0140】
相補的な分子をコードするベクターで好適な分裂細胞を安定的に形質転換することにより、遺伝子組換え細胞系、組織、または生物を作製することができる(USPN 4,736,866)。同化して十分な量のベクターを複製する細胞を安定的に組込むことが可能であるため、十分な相補的分子が産生され、本哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子の活性を低下或いは完全を消失させることができる。
【0141】
10 DSCR1K1 αの発現
本哺乳動物タンパク質の発現及び精製は、哺乳動物細胞発現系若しくは昆虫細胞発現系を用いて行うことができる。pUB6/V5−His ベクター系(Invitrogen, Carlsbad CA)を用いて、CHO細胞でDSCR1K1αを発現させる。ベクターは選択可能なbsd遺伝子、複数のクローニング部位、ヒトユビキチンC遺伝子のプロモーター/エンハンサー配列、抗−V5抗体での抗体検出のためのC−末端V5エピトープ、PROBOND 樹脂(Invitrogen)上での急速な精製のためのC−末端ポリヒスジン(6xHis)配列を含む。形質転換された細胞を、ブラストサイジンを含む培地で選択する。
【0142】
Spodoptera frugiperda(Sf9)昆虫細胞を組換えAutographica californica核多角体病ウイルス(バキュロウイルス)で感染させる。この多角体遺伝子を、相同組換えにより哺乳動物核酸分で置換し、多角体プロモーターにより転写が促進されるようにする。このタンパク質を、上述したように精製を可能にする6xhisで合成して融合タンパク質にする。精製されたタンパク質を次のように用いて、抗体を作製する。
【0143】
11 抗体の生産
DSCR1K1αをポリアクリルアミドゲル電気泳動法で精製して、マウスやウサギの免疫に用いる。抗体の生産は下記のプロトコルに従う。別法では、DSCR1K1αのアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)で解析して免疫原性の高い領域を決定する。通常はC−末端近傍或いは親水性領域内で見られる抗原性エピトープを選択して、合成し、抗体を産生させるために用いる。通常は、長さ約15残基のエピトープを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ(Applied Biosystems)で作製し、N−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させてKLH(Sigma−Aldrich)に結合させ、免疫原性を高める。
【0144】
完全フロイントアジュバントでエピトープ−KLH複合体を用いてウサギを免疫する。次に、不完全フロイントアジュバントで間隔を置いて免疫化を繰り返す。マウスの場合は最低7週間、ウサギの場合は最低12週間が経過した後、抗血清を抽出して抗ペプチド活性を検査した。この検査では、ペプチドをプラスチックに結合させ、1%のウシ血清アルブミンでブロックし、ウサギ抗血清で反応させ、洗浄し、放射性ヨウ素化標識ヤギ抗ウサギIgGで反応させる。当分野で公知の方法を用いて、抗体価と形成された複合体の量を決定する。
【0145】
12 特異的抗体を用いる天然タンパク質の精製
天然或いは組換えタンパク質を、そのタンパク質と特異的に結合する抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr−活性化SEPHAROSE樹脂(APB)に抗体を共有結合させて作製される。タンパク質を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのタンパク質の優先的な吸着を可能にする界面活性剤の存在下で、高イオン強度バッファーでカラムを洗浄する。そのタンパク質が結合した後に、pH2〜3或いはそれ以上のバッファー、高濃度の尿素、またはチオシネートイオンを用いて抗体とタンパク質との結合を切断してカラムから溶出させ、そのタンパク質を回収する。
【0146】
13 核酸分子またはタンパク質と特異的に結合する分子のスクリーニング
本核酸分子またはそのタンパク質をそれぞれ、32P−dCTP、Cy3−dCTP、またはCy5−dCTP (APB)と、BIODIPYまたはFITC (Molecular Probes, Eugene OR)とで標識する。前もって基質上に配列した候補分子または複合体のライブラリを、標識した核酸分子またはタンパク質の存在下でインキュベートする。核酸配列或いはアミノ酸配列に適した条件下でインキュベートした後、基板を洗浄し、特異的な結合即ち複合体成形を示す標識を保持した基板上の全ての位置をアッセイしてリガンドを同定する。様々な濃度の核酸またはタンパク質から得たデータを使用して、標識した核酸或いはタンパク質と結合した分子との間の親和性を計算する。
【0147】
14 2−ハイブリッドスクリーン
酵母2−ハイブリッド法、即ちMATCHMAKER LexA Two−Hybridシステム(Clontech Laboratories, Palo Alto CA)を用いて、本発明の哺乳動物タンパク質と結合するペプチドをスクリーニングする。本タンパク質をコードするcDNAをpLexAベクターの複数のクローニング部位に挿入し、連結して大腸菌に形質転換する。mRNAから調整したcDNAを、pB42ADベクターの複数のクローニング部位に挿入して、結合させ、大腸菌に形質転換させてcDNAライブラリを作製した。pLexAプラスミド及びpB42AD−cDNAライブラリ作製物を大腸菌から単離し、これらを2:1の比率で用いて、polyethylene glycol/lithium acetateプロトコルに従ってコンピテント酵母EGY48 [p8op−lacZ]細胞を同時形質転換した。形質転換した酵母細胞をヒスチジン、トリプトファン、及びウラシルを含まない合成ドロップアウト(SD:synthetic dropout)培地(‐His、‐Trp、‐Ura)に移し、コロニーが成長してカウント出来るまで30℃でインキュベートした。このコロニーを1×TE(pH 7.5)の最小容量にプールし、2%アガロース(Gal)、1%ラフィノース(Raf)、及び80 mg/ml のX−Gal (5−bromo−4−chloro−3−indoryl−b−D−galactoside)を加えたSD培地(‐His、‐Leu、‐Trp、‐Ura)に移し、青いコロニーの成長を調べた。発現したタンパク質とcDNA融合タンパク質との間の相互作用により、EGY48におけるLEU2レポーター遺伝子の発現が活性化され、ロイシンを含まない培地(‐Leu)でコロニーが成長した。また、相互作用により、p8op−lacZ レポーター作製物からのβ−ガラクトシダーゼの発現が活性化され、X−Gal上で成長したコロニーにおいて青色コロニーが生成される。
【0148】
発現タンパク質とcDNA融合タンパク質との間のポジテブな相互作用は、個々のポジティブコロニーを分離して、これらのコロニーをSD液体培地(‐Trp、‐Ura)で30℃で2日間成長させるて確認することができる。培養物のサンプルをSD培地(‐Trp、‐Ura)に移して、コロニーが現れるまで30℃でインキュベートする。このサンプルを、SDプレート(‐Trp、‐Ura)及びSDプレート(‐His、‐Trp、‐Ura)上でレプリカ培養する。ヒスチジン含有SD培地で成長するがヒスチジンを含まない培地では成長しないコロニーは、pLexAプラスミドが欠損している。ヒスチジンを必要とするコロニーをSD(Gal、Raf、X−Gal、‐Trp、‐Ura)上で成長させ、白いコロニーを単離して成長させた。本哺乳動物タンパク質と物理的に相互作用するタンパク質をコードするcDNAを含むpB42AD−cDNAプラスミドを、酵母細胞から単離して特徴付けることが可能である。
【0149】
15 タンパク質活性の実証
DSCR1K1αまたはその生物学的に活性な断片を、125I−Bolton−Hunter試薬(Bolton A.E. (1973) Biochem. J. 133:529−539)で標識する。マルチウェルプレートのウェルに予め配列しておいた候補リガンド分子を、標識したDSCR1K1αと共にインキュベートし、洗浄して、標識したDSCR1K1α複合体をアッセイする。様々な濃度のDSCR1K1αから得たデータを用いて、DSCR1K1αに結合した候補リガンド分子の数、親和性、会合についての値を計算する。
【0150】
本明細書に記載した全ての特許及び刊行物は、言及することを以って本明細書の一部とする。本発明の範囲及び概念から逸脱することなく本発明の方法及び装置の種々の改変が可能であることは当業者には明らかであろう。特定の好適な実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には、本明細書に記載の本発明の実施例の様々な改変は、特許請求の範囲に含まれることが容易に理解できよう。
【0151】
(表の簡単な説明)
表1は、SEQ ID NO:1に相同なラット及びサルの核酸配列を示し、それらのヌクレオチド長、生物起源、SEQ ID NO:1と重複する領域、及びSEQ ID NO:1との同一性のパーセントを含む。
【図面の簡単な説明】
【図1A】
ヒトアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)をコードするヒト核酸分子(SEQ ID NO:1)の領域を示す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA)を用いて作成した。
【図1B】
ヒトアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)をコードするヒト核酸分子(SEQ ID NO:1)の領域を示す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA)を用いて作成した。
【図1C】
ヒトアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)をコードするヒト核酸分子(SEQ ID NO:1)の領域を示す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA)を用いて作成した。
【図2A】
ヒトDSCR1K1α(SEQ ID NO:1)、ヒトDSCR1L1(g1435040;SEQ ID NO:10)、及びヒトDSCR1L2(g6017919;SEQ ID NO:11)の間の化学的及び構造的類似性を実証する。このアラインメントは、MEGALIGNプログラム(DNASTAR, Madison WI)を用いて作成した。
【図2B】
ヒトDSCR1K1α(SEQ ID NO:1)、ヒトDSCR1L1(g1435040;SEQ ID NO:10)、及びヒトDSCR1L2(g6017919;SEQ ID NO:11)の間の化学的及び構造的類似性を実証する。このアラインメントは、MEGALIGNプログラム(DNASTAR, Madison WI)を用いて作成した。
【表1】
Claims (20)
- (a)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、
(b)SEQ ID NO:2の抗原エピトープ、及び
(c)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有する変異体から選択されるタンパク質またはその一部をコードする単離された核酸分子またはその断片。 - (a)SEQ ID NO:1の核酸配列、
(b)SEQ ID NO:1の核酸配列と少なくとも85%の同一性を有するcDNA、及び
(c)SEQ ID NO:1の約1〜400ヌクレオチドのSEQ ID NO:1の断片から選択される単離された核酸分子またはその相補体。 - SEQ ID NO:3−9から選択される請求項2のcDNA。
- 請求項1の核酸分子またはその相補体とレポーター分子を含む組成物。
- 請求項1の核酸分子またはその相補体を含む基板。
- 請求項1の核酸分子またはその相補体を含むアレイ。
- 請求項1の核酸分子を含むベクター。
- 請求項7のベクターを含む宿主細胞。
- タンパク質を生産するための方法であって、
(a)前記タンパク質が発現する条件下で、請求項8の宿主細胞を培養するステップと、
(b)前記宿主細胞から前記タンパク質を回収するステップとを含むことを特徴とする方法。 - 請求項7のベクターを含む遺伝子組換え細胞系または生物。
- 核酸を含むサンプルの核酸分子の発現変動(differential expression)を検出する方法であって、
(a)請求項1の核酸分子と前記サンプルの核酸とをハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、
(b)前記サンプルにおける前記核酸分子の存在を表す前記ハイブリダイゼーション複合体を定量するステップとを含むことを特徴とする検出方法。 - 更に、前記ハイブリダイゼーションの前に前記サンプルの核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 発現変動の検出によりアルツハイマー病、ダウン症候群、または痴呆の他の形態の診断ができることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 核酸分子を用いて複数の分子または化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)結合が許容される条件下で、請求項1の核酸分子を複数の分子または化合物と結合させるステップと、
(b)その結合を検出して、前記核酸分子に結合する分子または化合物を特定するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング法。 - 前記分子または化合物が、DNA分子、RNA分子、ペプチド核酸、人工染色体作製物、ペプチド、転写因子、リプレッサー、及び調節分子から選択されることを特徴とする請求項14に記載の方法。
- (a)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、
(b)SEQ ID NO:2の抗原エピトープ、及び
(c)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有する変異体から選択されることを特徴とする精製されたタンパク質またはその一部。 - 請求項16のタンパク質及びレポーター分子を含む組成物。
- タンパク質を用いて、複数の分子または化合物をスクリーニングして少なくとも1つのリガンドを特定する方法であって、
(a)特異的な結合が許容される条件下で、請求項16のタンパク質を複数の分子または化合物と結合させるステップと、
(b)特異的結合を検出して、前記タンパク質に特異的に結合するリガンドを特定するステップとを含むことを特徴とする方法。 - タンパク質を用いて抗体を生産及び精製する方法であって、
(a)動物を請求項16のタンパク質で免疫して、抗体反応を生じさせるステップと、
(b)動物抗体を単離するステップと、
(c)前記タンパク質を基板に付着させるステップと、
(d)前記タンパク質に対する特異的な結合が許容される条件下で、単離した前記抗体に前記基板を接触させるステップと、
(e)前記タンパク質から抗体を解離させて、前記タンパク質と特異的に結合する精製された抗体を得るステップとを含むことを特徴とする方法。 - 請求項16のタンパク質と結合する抗体。
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