CN113249464B - 环状rna作为骨关节炎标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及环状RNA作为骨关节炎标志物的应用。所述环状RNA为has_circ_0000423，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明研究发现与正常软骨组织相比，hsa_circ_0000423在骨关节炎患者软骨组织中呈现高表达，因此，通过检测hsa_circ_0000423的含量，有助于判断受试者是否存在患骨关节炎的高风险，这为临床辅助诊断及评估骨关节炎，意义显著。同时，本发明通过进一步研究软骨细胞生物学功能发现了hsa_circ_0000423在OA发生发展的诊断及治疗价值，从而为该病的诊治提供关键的理论依据及干预靶点，具有重要的潜在价值和良好的应用前景。

Description

环状RNA作为骨关节炎标志物的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及环状RNA has_circ_0000423作为骨关节炎标志物的应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是在机械性和生物性因素作用下，关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨的正常合成与降解失衡，导致关节软骨退变、纤维化、软骨下骨硬化、炎性变和骨赘形成，出现关节疼痛、活动受限、畸形等为临床表现的一种疾病。骨关节炎是骨科临床困扰已久且又亟待解决的难题，多发于老年人，常累及全身骨关节中的脊柱、髋关节和膝关节等负重较大的关节，导致受累关节僵硬、变形，从而使关节功能受到严重影响，影响患者的生活质量。因此，研究如何抑制关节软骨退变，预防OA发生与发展一直是骨科临床寻求的热点。目前主要预防及修复的措施有：间质干细胞的移植后的促软骨分化、自体软骨或生物材料移植等填补缺损软骨部位，虽取得了一定疗效，但仍存在再生软骨组织和缺损边缘软骨退变等问题。因此，寻找一种灵敏性高，特异性强的生物标志物和一种安全有效的靶点作用方法，对骨关节炎早发现、早诊断及早干预治疗至关重要。
circRNAs最早于1976年首次在类病毒中发现，并在随后的数十年中，在真核细胞和病毒中也同样检测到circRNAs的存在。起初，因为其表达水平低，人们对其很少关注，并且认为它的产生是选择性剪切失败的产物。然而，随着新一代测序技术的出现和生物信息学技术的不断发展，circRNAs在真核细胞中具有调节功能已经成为了共识。Jeck等人和Memcz等人通过RNA测序和生物信息分析，同样发现在不同物种、细胞中circRNAs存在表达。circRNA是闭合的环状结构，没有5’-3’极性和聚核苷酸的尾巴结构，其由特殊的末端反向互补的前体mRNA可变剪切，并首尾环化形成环状RNA。近几年的研究发现circRNA可能存在以下几种功能：①作为内源mRNA竞争者，拥有miRNA海绵结合位点，能吸附miRNA，抑制其功能；②调控可变剪切或转录过程；调控亲本基因的表达；③可直接翻译多肽。circRNA可调控多个miRNA，因而被称为miRNA“sponge”功能，而miRNA可调控多达上百个蛋白编码基因，这些蛋白分子与非编码信号构成了复杂而精确的RNA-RNA互作网络，从而可在OA中发挥着重要的调控作用，这些功能的发现为探索OA疾病的诊断治疗转归等方面提供了新的思路，并可将circRNAs可能作为临床诊断生物标记物和治疗靶点提供新思路。目前，与骨关节炎相关的环状RNA仍有很多未被发现，研究寻找这些环状RNA对骨关节炎的预防诊断和治疗都具有重要的研究价值和临床价值。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了环状RNA，has_circ_0000423，作为骨关节炎标志物的应用。
本发明所采用的技术方案如下文所述。
本发明一方面提供一种检测环状RNA has_circ_0000423的试剂在制备用于骨关节炎的诊断和/或预后的诊断剂中的应用，其中，所述环状RNA has_circ_0000423的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：荧光染料法、数字PCR、共振光散射法、实时荧光定量PCR、测序或生物质谱法。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂包括能够特异性结合环状RNA has_circ_0000423或环状RNA has_circ_0000423对应的cDNA的探针或引物；进一步地，所述引物序列如SEQ ID NO:2～3所示。
本发明人在研究骨关节炎时发现，骨关节炎软骨组织和正常软骨组织中存在显著差异的特异性circRNA的表达，该特异性环状RNA has_circ_0000423在骨关节炎软骨组织中的高表达使其具有了作为临床诊断生物标记物的潜在价值。
本发明的另一方面还提供一种骨关节炎诊断和/或预后试剂盒，包括能够检测环状RNA has_circ_0000423的表达的试剂，其中，所述环状RNA has_circ_0000423的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示的引物。进一步地，还包括RNA提取试剂、PCR反应缓冲液、dNTPs以及DNA聚合酶中的至少一种。
本发明另一方面还提供一种上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)获取待测样品；
(2)检测待测样品中所述环状RNA has_circ_0000423的表达水平，与参考水平进行比较。
根据本发明的一些实施方式，当待测样品中所述环状RNA has_circ_0000423的表达水平高于参考水平表明患有骨关节炎的几率高。
根据本发明的一些实施方式，所述待测样品可以为关节液样品或活检软骨组织样品。
根据本发明的一些实施方式，所述参考水平为非骨关节炎患者关节液样品或活检软骨组织样品中所述环状RNA has_circ_0000423的表达水平。
本发明的试剂盒可以用来检测环状RNA has_circ_0000423的表达水平。通过检测hsa_circ_0000423的表达，有助于判断受试者是否存在患骨关节炎的高风险，这为临床辅助诊断及评估骨关节炎，意义显著。
本发明的另一方面还提供环状RNA has_circ_0000423在制备用于预防和/或治疗骨关节炎的药物中的应用，其中，所述环状RNA has_circ_0000423的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
根据本发明的一些实施方式，所述药物包括特异性抑制环状RNA has_circ_0000423表达的小分子物质，环状RNA has_circ_0000423的特异性抗体，或靶向环状RNAhas_circ_0000423的siRNA或反义RNA中的至少一种。
本发明的另一方面还提供环状RNA has_circ_0000423在筛选用于预防和/或治疗骨关节炎的药物中的应用，其中，所述环状RNA has_circ_0000423的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
根据本发明的一些实施方式，所述药物包括特异性抑制环状RNA has_circ_0000423表达的小分子物质，环状RNA has_circ_0000423的特异性抗体，或靶向环状RNAhas_circ_0000423的siRNA或反义RNA中的至少一种。
本发明人为了进一步验证环状RNA has_circ_0000423的生物学功能，将过表达has_circ_0000423的质粒转染入软骨细胞，并检测软骨细胞相关代谢水平产物(MMP13和COL-2)的mRNA水平情况，结果提示其可升高基质金属蛋白酶13(MMP13)以及降低Ⅱ型胶原酶(COL-2)的mRNA水平表达；也就是说，环状RNA has_circ_0000423有望作为治疗骨关节炎的药物。
本发明的有益效果：
1、本发明建立了正常与骨关节炎软骨组织相关环状RNA生物标志物的表达谱，发现软骨组织中存在具有显著差异的特异性circRNA的表达，这结果揭示了circRNA具有作为临床诊断生物标记物的潜在价值。同时，本发明所述的hsa_circ_0000423在骨关节炎患者高表达，因此，通过检测hsa_circ_0000423的含量，有助于判断受试者是否存在患骨关节炎的高风险，这为临床辅助诊断及评估骨关节炎，意义显著。
2、本发明还揭示了hsa_circ_0000423在OA发生发展的诊断及治疗价值，从而为该病的诊治提供关键的理论依据及干预靶点，具有重要的潜在价值和良好的应用前景。
3、本发明首次发现环状RNA hsa_circ_0000423参与骨关节炎生物学行为的调控作用，起到防治OA的效果，因此进一步将环状RNA hsa_circ_0000423应用于骨关节炎的诊治及预后，为circRNAs作为临床诊断生物标记物和治疗靶点提供新思路。
附图说明
图1为正常软骨组织和骨关节炎患者软骨组织中circRNAs的表达谱。
图2为hsa_circ_0000423成环验证图。
图3为正常软骨组织和骨关节炎患者软骨组织中hsa_circ_0000423的表达水平。
图4为过表达hsa_circ_0000423的软骨细胞中基质金属蛋白酶13(MMP13)和Ⅱ型胶原酶(COL-2)的蛋白的表达情况。
图5为过表达hsa_circ_0000423的软骨细胞中基质金属蛋白酶13(MMP13)和Ⅱ型胶原酶(COL-2)的mRNA表达情况。
以上图示中，*表示与对照相比，P<0.05，有显著差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试验中，不同组别的纳入标准为：
正常组：包括肿瘤截肢术后、股骨颈骨折术后等患者的正常软骨组织。
OA组：为临床确诊为OA患者并行全膝关节置换术后患者的OA软骨，排除标准正常组包括软骨周围肿瘤侵蚀、既往关节创伤等，OA组包括膝关节痛风、肿瘤、结核、感染等。
试验中所有受试者均签署知情同意书，患者一般资料差异无统计学意义。
本发明的具体实施方式主要采用如下三个步骤。
第一步：发现阶段，收集正常与OA软骨组织标本各4例，利用Array HumanCircular RNA基因芯片测序手段检测标本中存在差异的circRNAs的表达谱，并从中筛选出目标circRNAs，即hsa_circ_0000423。
第二步，验证阶段：采用RT-PCR方法，分别收集各组10例临床标本，对目标circRNAhsa_circ_0000423进行验证，同时探究并评价hsa_circ_0000423与OA的特异性关系。
第三步，验证生物学功能：通过体外软骨细胞水平验证hsa_circ_0000423调控OA的相关生物学功能。
实施例1
本实施例研究环状RNAhsa_circ_0000423在正常志愿者和骨关节炎患者中的表达情况。
利用Array Human Circular RNA基因芯片测序手段检测正常(Normal)与骨关节炎(OA)患者软骨组织标本各4例，并进行生物信息学分析，发现了标本中存在差异的circRNAs的表达谱，结果如图1所示。其中，图1中A图为circRNAs表达谱的聚类图，其显示两组之间的circRNAs表达谱存在显著差异，且各自组内的表达谱相对一致；图1中B图为circRNAs散点图，其中线条以外为表达差异倍数＞2的circRNAs；图1中C图为差异性表达的circRNAs的火山图，深色点显示表达差异倍数在2倍以上且P<0.05的circRNA。经分析后发现共存在统计学意义的9个下调及69个上调的环状RNA，最后从中筛选出具有明显统计学意义的目标circRNAs，即hsa_circ_0000423。
实施例2
1、环状RNAhsa_circ_0000423的生物学特征
环状RNA hsa_circ_0000423作为OA标志物，包含1138bp，其核酸全序列如SEQ INNO.1所示。
2、环状RNAhsa_circ_0000423的成环验证
基于环状RNAhsa_circ_0000423的OA标志物的特异性引物：包括了hsa_circ_0000423的正向引物以及hsa_circ_0000423的反向引物，hsa_circ_0000423的正向引物的核苷酸序列如SEQ IN NO：2所示，hsa_circ_0000423的反向引物的核苷酸序列如SEQ INNO：3所示。
RNase R酶消化：采用GENESEED(吉赛生物)的RNase R消化酶，按照2μg总RNA+0.5μL RNase R+1μL Reaction Buffer配置反应体系10μL，不足的体积用RNase free H2O补足，37℃，孵育20分钟后可于70℃，10分钟使酶失活后予以逆转录，随后进行RT-PCR检测，PCR的反应体系如表1所示，扩增程序如表2所示。
表1 mRNA逆转录的cDNA进行PCR反应液的配制配方
Figure BDA0003018103930000061
表2 mRNA逆转录的cDNA进行PCR扩增程序
Figure BDA0003018103930000062
结果如图2所示，图2中A图为正常和OA软骨组织中总RNA经RNase R酶消化后的相对mRNA表达，提示经RNase R酶消化后，样品中线性RNA表达降低，环状RNA表达未见变化；图2中B图为RT-PCR的产物Sanger测序验证图；图2中C图为RT-PCR的产物的琼脂糖凝胶电泳图，结果说明hsa_circ_0000423来源于总RNA而不是gRNA。
3、环状RNAhsa_circ_0000423在正常志愿者和OA患者中的表达情况
通过收集正常志愿者和OA患者的临床标本各10例，随后利用RT-PCR技术(方法同前)对hsa_circ_0000423进行进一步临床验证，统计学方法采用独立样本t检验或单因素方差分析，p<0.05认为两组间具有统计学差异。
正常软骨组织和OA患者软骨组织中的hsa_circ_0000423相对表达情况如图3所示，可以看出，在OA患者软骨组织中，hsa_circ_0000423的明显高表达，且相对于正常软骨组织有统计学差异。
实施例3
采用转染过表达hsa_circ_0000423质粒验证hsa_circ_0000423对OA的生物学功能的影响，其中过表达hsa_circ_0000423质粒由上海和元生物技术有限公司提供。
通过将过表达hsa_circ_0000423质粒转染入人软骨细胞，利用Western Blot技术检测人软骨细胞的相关代谢水平产物(MMP13与COL-2)的蛋白水平情况，具体操作步骤如下：
1、转染
1.转染前1小时，吸去6孔板内培养基，换为每孔2mL opti-MEM培养基或细胞对应的无血清培养基，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中。
2.根据转染的质粒数目，准备足够的EP管，并在管盖上标记清楚质粒名称，其中有一个EP管子是opti-MEM培养基总管，一个EP管子是PEI转染试剂(或者Trans-EZ转染试剂)总管。
3.质粒稀释：取opti-MEM培养基稀释4μg表达质粒至每管125μL，提前要计算出5μg各质粒原液的体积VP，吸取相应体积(每个质粒浓度不同，相应吸取5μg质粒的体积VP也不同)，接着要在每个标有质粒名称EP管中加入125μL opti-MEM培养基。
4.每个质粒EP管吸去VP体积的opti-MEM培养基，然后补加相同体积的质粒原液，使每个EP管最终体积为125μL。
5.配制PEI转染试剂(或者Trans-EZ转染试剂)总管，移液器轻轻混匀后静置5分钟：
5.1.计算公式：VPEI＝N×4μL Vomem＝N×25-VPEI(N为要检测质粒的个数)；
5.2.计算出总管所加opti-MEM培养基体积Vomem和所加PEI转染试剂体积VPEI；
5.3.总管先加Vomem再加入VPEI；
5.4.加完后用1mL移液器轻轻混匀，混匀后静置5分钟。
6.从PEI转染试剂(或者Trans-EZ转染试剂)总管中取125μL加到各配制好的质粒管中混匀室温静置20分钟。
7.20分钟内及时在6孔板上标记好质粒名称合同号等信息，20分钟到后把每管加到各自标记好的孔内，轻轻摇匀后置于培养箱中，转染6～8小时后每孔更换2mL新鲜的细胞完全培养基，培养24h后蛋白收样品。
2、蛋白提取及浓度测定
转染完成后弃上清，用4℃预冷的PBS冲洗各孔2次，去除残留的细胞培养基，然后加入0.75mL预冷的PBS，用细胞铲刮下培养板中的细胞，收集于1.5mL预冷的EP管中，重复PBS细胞铲一次，尽量收集孔内所有细胞，低温离心机以4℃，13000rpm为参数离心1分钟。
离心完成后，彻底弃去上清液，每孔加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液100μL(裂解液比蛋白酶抑制剂为1mL：40μL)，移液枪反复吹打使裂解液与细胞重复混合，注意细胞收集及裂解过程需在冰上操作以保护蛋白质的稳定性。
待细胞充分裂解后，将EP管放入低温离心机，以4℃，13000rpm为参数离心20分钟。离心完成后收集上清液，即为样品总蛋白。
样品总蛋白浓度的测定(碧云天BCA蛋白浓度试剂盒检测)：
取0.1％BSA标准品依次向96孔酶标板中加入相应浓度的标准品(1、2、4、6、8、10μL)及样品蛋白(1μL)，设置3个复孔。
按BCA试剂盒说明书方法，A液：B液以50：1的比例配制成BCA工作液，并吹打充分混匀。向96孔酶标板各孔中加入相应体积的BCA工作液使每孔总体积补足至100μL，放入37℃、含有5％CO2细胞培养箱孵育30分钟。
酶标仪测量。将酶标板放入预先预热的酶标仪中，以595nm波长测量样品中的吸光OD值，并根据梯度BCA数据绘制蛋白质标准曲线，从而计算出各个样品的浓度。
3、Western Blot技术检测
根据实验设计蛋白上样总量(如50μg)，加入5倍浓缩的Loading Buffer，以4:1的比例稀释后加入EP管中，各组上样总体积均加入无蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，使各组上样总体积保持相同。
蛋白质变性：将已制成的蛋白质上样品放置于100℃的热变形机中，变性5分钟后取出放置室温后冷却，随后放入离心机离心30秒，使管壁上的液体离心至底部。
灌制SDS-PAGE电泳胶：
(1)根据目标蛋白分子量制备下层分离胶，配置浓度为10％，按照已经计算好的配方量依次将30％丙烯酰胺-亚丙烯酰胺混合物，双蒸水，1.5M Tris溶液(pH＝8.8)，10％SDS溶液，10％APS溶液和TEMED液混合并于磁性搅拌机上搅拌。
(2)将搅拌后的下层胶溶液转移至玻璃板之间，加入1mL异丙醇封住下层胶面，等待1小时后凝固，弃去异丙醇，并用去离子水冲洗胶面2～3次，用滤纸将剩余在玻璃板内的去离子水轻轻拭去。
(3)配制上层压缩胶，按照已经计算好的配方量依次将30％丙烯酰胺-亚丙烯酰胺混合物，双蒸水，1.0M Tris溶液(pH＝6.8)，10％SDS溶液，10％APS溶液和TEMED液混合并于磁性搅拌机上搅拌1分钟。
(4)快速将搅拌后的上层胶灌入玻璃板间，并插入相应规格的制胶梳，待20分钟后上层胶凝固，用保鲜膜包装好放置4℃冰箱中过夜。
(5)电泳跑胶：依据已计算好的配方量将甘氨酸、Tris、SDS加入锥形瓶中，加入适量的双蒸水在磁性搅拌器上充分混匀制成跑胶液。随后将跑胶液倒入已安放好玻璃板的电泳架上，轻柔拔出玻璃板内的梳子，并将已变性的上样品依次加入梳孔内，两侧未加样的孔用1倍浓度的Loading Buffer封边配平并加入Marker指示。电泳机条件参数：35mA恒流，约1小时，最终以Marker显示的蛋白质跑胶线为准。
(6)转膜：依据已计算好的配方量将甘氨酸、Tris、SDS和甲醇溶液加入锥形瓶中，加入适量的双蒸水在磁性搅拌器上充分混匀制成转膜液。裁减合适大小的硝酸纤维素膜(NC膜)浸泡于转膜液内，将孰料三明治转膜板放入转膜液中，黑色面放在最下层，然后按照顺序依次将黑海棉、白海绵、滤纸、胶、NC膜、滤纸、黑海棉层叠放入夹板内，合上并紧扣白板，注意过程中尽量清除海绵内的气泡，随后将转膜板置入转膜架中，加入转膜液。转膜机条件参数为395mA恒流，3小时。
(7)洗膜：待转膜完成时将硝酸纤维素膜取出，用刀片裁去多余的部分,用TBS液在摇床上快洗5分钟(110～120rpm)。
(8)封闭：用TBS溶液制成含5％脱脂奶粉的封闭液，并用镊子将NC膜浸润其中，摇床(30～40rpm)室温下孵育30分钟。
(9)一抗孵育过夜：用TBS溶液将封闭完成的NC膜快洗5分钟后弃去溶液。加入已经用5％BSA/TBS溶液制成MMP13一抗工作液，抗体浓度为1:1000，然后放入4℃冰箱内摇床上，慢摇，孵育过夜。
(10)常温二抗孵育：第二天回收一抗工作液,并放入-20℃冰箱保存重复使用(约5～8次)，向孵育盒内加入TBS溶液10ml左右快洗5分钟，加入对应种属的HRP标记二抗工作液(5％脱脂奶粉/TBS溶液)，摇床慢摇，室温孵育2小时，二抗抗体浓度为1:1000。
(11)快速洗膜程序：先用TBS溶液洗膜5分钟1次，然后TBST溶液(0.1％Tween-20/TBS)洗膜5分钟3次，最后用TBS液再次洗膜5分钟1次，摇床转速为110～120rpm，洗膜完成后进行化学发光试验。
(12)将ECL化学显色混合液(发光液A液和B液按1:1混和)与NC膜表面充分混匀，作用1分钟后放入玻璃板上，并将玻璃板放入ECL化学发光检测仪上予以曝光、显影，调整合适的参数后拍摄并保存结果图片。
(13)印迹洗脱：待显影结束后，用TBS液快洗(110～120rpm)5分钟后弃去液体，按照Millipore洗脱液说明书配制洗脱工作液，并将其灌进含有NC膜的孵育盒中，并使膜完全浸泡其中，室温摇床上慢摇(30～40rpm)15～30分钟。
(14)再次封闭：回收洗脱液(可重复利用5次)，重复第(8)－(13)步，更换不同类型(COL-2及GAPDH)一抗及二抗，曝光显影后保存实验结果图片。
(15)数据测量：用ImageJ软件对Western blot结果进行定量分析。
结果如图4所示，为人软骨细胞的相关代谢水平产物MMP13与COL-2的蛋白水平情况，可以看出，相对于正常软骨细胞(NC组)，转染过表达hsa_circ_0000423质粒的软骨细胞(P-circ组)中，COL-2蛋白表达下调，MMP-13蛋白表达上调。
实施例4
在实施例3的基础上，通过将过表达hsa_circ_0000423质粒转染入人软骨细胞，利用RT-PCR技术检测人软骨细胞的相关代谢水平产物(MMP13与COL-2)的mRNA水平情况，具体实验步骤如下：
1、转染
具体步骤同实施例3。
2、总RNA提取及逆转入
(1)转染完成后，弃上清，用4℃预冷的PBS冲洗各孔2次，每孔中加入Trizol液约1mL，用移液枪洗吹液体至贴壁细胞完全脱落装入灭酶EP管中，室温放置5～10分钟后可将灭酶EP管放入-80℃长期保存或者继续下一步实验。
(2)向每1mL的灭酶EP管内加入0.2mL氯仿，盖紧EP管，手动或者用漩涡振荡器剧烈震荡15秒后置室温5分钟。
(3)随后将灭酶EP管放入低温高速离心机中，以12000g，4℃为参数离心15分钟，离心结束后可见液体分三层：最上层是无色的水相，RNA主要分布其中，约占总体积的50％左右，底层为黄色为有机相。
(4)倾斜EP管45度，用200μL移液枪小心收集上层水相约0.5mL，避免吸取其他各相的液体，并将吸取的液体盛放在另一灭酶EP管中。
(5)向收集的RNA液体中加入相应体积的异丙醇，反复摇晃使液体混合均匀后室温放置10分钟。
(6)将灭酶EP管放入低温高速离心机中，以12000g，4℃为参数离心15分钟，离心结束后可见管底少量白色沉淀物析出，此为RNA，完全吸掉上清液后，用滤纸洗干管壁机管口周围液体。
(7)向每管中加入1mL 75％乙醇，用指轻弹沉淀物，使沉淀物飘起洗涤，并轻柔颠倒EP管洗涤管壁。
(8)将灭酶EP管再次放入低温高速离心机中，以7500g，4℃为参数离心5分钟。
(9)重复步骤(7)和(8)2次后去上清，室温敞口干燥RNA10分钟，注意避免过度干燥样品，随后加入相应的无RNA酶的纯水，55℃～60℃水浴15分钟后充分混匀。
(10)测定总RNA浓度及纯度。
(11)cDNA合成：根据TaKaRa逆转录反应体系进行cDNA的合成，其中反应体系见表3。
表3 mRNA逆转录反应混合液的配制配方
试剂组分 体积
5×Primescrip Master Mix 4μL
总RNA 1μg/RNA浓度
ddH<sub>2</sub>O(RNase/DNase free) 与RNA体积补足16μL
总体积 20μL
3、RT-PCR反应
RTPCR反应检测根据SYBR Premix Ex TaqTM II说明书和CFX96软件。参考融解曲线为依据进行质控，测量样品中MMP-13及COL-2的mRNA的表达量，并以GAPDH作为内参。使用2-△△Ct法分析结果，所有引物均由上海生物工程技术有限公司设计，其中，mRNA逆转录反应混合液的体系如表3所示，进行扩增的相关引物序列如表4所示，qPCR反应体系参数及扩增程序详见表1及表2。
表4 qRT-PCR检测引物合成序列
Figure BDA0003018103930000121
结果如图5所示，其中图5中A图为正常软骨细胞(NC组)和转染过表达hsa_circ_0000423质粒的软骨细胞(P-circ组)中COL-2的mRNA表达水平，图5中B图为正常软骨细胞(NC组)和转染过表达hsa_circ_0000423质粒的软骨细胞(P-circ组)中MMP-13的mRNA表达水平。可以看出，相对于正常软骨细胞(NC组)，转染过表达hsa_circ_0000423质粒的软骨细胞(P-circ组)中，COL-2的mRNA表达下调，MMP-13的mRNA表达上调；提示，过表达hsa_circ_0000423可升高基质金属蛋白酶13(MMP13)以及降低Ⅱ型胶原酶(COL-2)的mRNA水平表达。
本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省中医院（广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院）
<120> 环状RNA作为骨关节炎标志物的应用
<130> 111
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1138
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ccctgtaaga ccagtaataa atttctgtct actgatgatt ctattgaatt gaaatgcaga 60
gccaatggca tctttcagaa aaggtaacct gaatttcaga accagataat aagagaattc 120
tcctttacca gtaagatatg tttttcctgc ttaggacaaa cccattactt gtcactttgg 180
atatacttta tttcatcaaa tctaagacat tactcatttt aaaacaccat tgtgttacct 240
actactgaaa aaaaggaaag gtgctaccaa ttaaactata atgcatcatc aattgtaagc 300
cattttctgg ttttggaaat attaaaatgt gggaggaagt gtacaattta aaatattaat 360
cattatatga aaccagtttt ggcttttaaa catggaaatt ttgactctct tcctcaatta 420
atggaaatta gtagtattaa aaaaataggc tgggtgcagt ggctcattcc tgtagtctcc 480
cagcactttg ggaggctgag gcatgtgaat tgcttgagcc caggagttca agaccagcct 540
gggcaacatg gtgaaacccc atccctacca aaagtacaga attaggcatg gtggcatatg 600
cctgtagtcc cagcaaccca ggaggctgag gtagaagaat cacttgagcc cgagaagtcg 660
agtctgcagt gacctgagat catgccactg cactccaagc tgggcagcag agtgagaccc 720
tatctaaaaa aataaaataa cttcccactt attatatatc acaaaaatta atcagataac 780
agagggagac tgtgacctac tcttttgaac tgtcaagtta tatgtgtact aggatgtatg 840
ttgttataat tgtaaaagcc tataacaagg ttttttattt aaattaatct tttgaagata 900
tgaaaccagt tctacatcag ctggtgatcg atatgattcc ttgctgggtc gctctggatc 960
atacagttac ttagaagaaa gaaaacctta cagcagcagg ctagaaaagg atgactcaac 1020
tgactttaaa aagctttatg aacaaattct agctgaaaat gaaaagctga aggcacagct 1080
acatgataca aatatggaac taacagatct taaattacag ttggaaaagg ccacccag 1138
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
ggcatgtgaa ttgcttgagc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
tctcgggctc aagtgattct tc 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
gcacctgcag agacctgaaa c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
gcaagtctcg ccagtctcca 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
aaggaccctg gagcactcat gttt 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
tggcatcaag ggataaggaa gggt 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
acccagaaga ctgtggatgg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
gaggcaggga tgatgttctg 20

Claims (4)

1.一种定量检测环状RNA has_circ_0000423的试剂在制备用于骨关节炎的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述环状RNA has_circ_0000423的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：荧光染料法、数字PCR、共振光散射法、实时荧光定量PCR、测序或生物质谱法。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括能够特异性结合环状RNAhas_circ_0000423或环状RNA has_circ_0000423对应的cDNA的探针或引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示。
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