CN108611420A - circ-0000423在制备或筛选结肠癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了circ‑0000423在制备或筛选结肠癌的药物中的应用。circ‑0000423高表达与肠癌分期、分化程度以及预后密切相关，发现表达程度越高，病期越晚、分化及预后越差，提示circ‑0000423与结直肠癌的恶性行为密切相关。circ‑0000423可吸附抑癌基因miR‑519以ceRNA机制促进结直肠癌的侵袭转移。circ‑0000423可作为治疗靶点在制备或筛选治疗结肠癌或抑制结肠癌侵袭迁移的药物中应用。circ‑0000423可作为检测靶点在制备结直肠癌诊断试剂中应用。circ‑0000423可作为检测靶点在制备预测结直肠癌分期、分化程度或预后的试剂中应用。

Description

circ-0000423在制备或筛选结肠癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及circ-0000423在制备或筛选结肠癌的药物中的应用。

背景技术

结直肠癌是全球男性的第三大好发肿瘤，在女性中位列第二，也是第四大致死性肿瘤；在2012年新增肠癌病例140万，死亡病例69.4万；原先发病率较低的东亚地区发病率正迅速上升^[1-3]。目前，结直肠癌的治疗仍以手术、放化疗及靶向药物为主，但5年生存率并没有得到显著改善；导致治疗失败的主要原因就是癌侵袭转移^[4,5]。积极探索结直肠癌侵袭转移的分子机制、寻找诊疗新靶标，对于提高疗效、改善预后极为迫切。

随着高通量测序等技术的发展，大量的基因组平台数据表明人类基因组中占至少98％的转录序列是无蛋白质编码功能的RNA分子，即非编码RNA(ncRNA)，但它们却是转录和表达过程中的关键性调控者^[6,7]。而环状RNA(circRNA)，是近年确认的一类特殊的ncRNA分子，一般通过外显子的套索驱动环化(lariat-driven circularization)和内含子配对驱动环化(intron-pairing-driven circularization)两种方式形成无5’、3’端的封闭结构，且不受核酸酶影响，比线性RNA具有更好的组织特异性和稳定性^[8-11]，因此具备理想肿瘤标志物潜能^[12,13]。

据报道，circRNA可充当“海绵”吸附microRNA，即作为竞争性内源RNA(ceRNA)：例如CDR1as作为miR-7的吸附“海绵”，改变miR-7靶基因的水平；从而影响miR-7的致癌或抑癌能力^[14,15]。在消化道肿瘤方面Li等^[16]发现circ-002059在胃癌组织中表达水平下调，且手术前后血浆中circ-002059水平也有显著变化；还证实了circRNA表达水平与患者的胃癌分期和侵袭转移等恶性进展有关。而结直肠癌相关circRNA的探索刚刚处于起步阶段，尚无机制方面的涉及；因此，从circRNA角度探索调控肠癌侵袭转移的分子机制十分必要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供circ-0000423作为治疗靶点在制备或筛选治疗结肠癌或抑制结肠癌侵袭迁移的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供circ-0000423作为检测靶点在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

circ-0000423作为治疗靶点在制备或筛选治疗结肠癌或抑制结肠癌侵袭迁移的药物中的应用；所述的circ-0000423基因序列如SEQ ID NO.1所示,所述的circ-0000423基因转录本序列如SEQ ID NO.2所示。

人circ-0000423用于制备或筛选治疗结肠癌或抑制结肠癌侵袭迁移的药物包括两方面的内容：其一，将人circ-0000423作为药物或制剂针对结直肠癌细胞的作用靶标应用于制备结直肠癌治疗药物；其二，将人circ-0000423作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选结直肠癌治疗药物。

circ-0000423作为检测靶点在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。

circ-0000423作为检测靶点在制备预测结直肠癌分期、分化程度或预后的试剂中的应用。

检测人circ-0000423表达量的引物、探针或基因芯片在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。

检测人circ-0000423表达量的引物、探针或基因芯片在制备预测结直肠癌分期、分化程度或预后的试剂中的应用。

一种治疗结直肠癌的药物组合物，包括抑制或沉默人circ-0000423表达的核酸分子。

一种结直肠癌诊断试剂，其特征在于包含检测人circ-0000423表达量的引物、探针或基因芯片。

有益效果：

发明人前期应用circRNA表达谱芯片技术，从5对结直肠癌新鲜组织中筛选到41条差异表达的circRNA(设肿瘤组与正常组对照)。在41条circRNA中进一步筛选出4条表达差异5倍以上，表达丰度高，均一性好的转录本，其中3条上调，1条下调(表1)(图3A-D)。随后，我们在200例结直肠癌中对上述4条差异表达circRNA进行组织验证，其中circ-0000423在结直肠癌组织中均一性最好，表达丰度最高。结合临床病理特征分析发现circ-0000423高表达与肠癌分期、分化程度以及预后密切相关，发现表达程度越高，病期越晚、分化及预后越差。提示circ-0000423与结直肠癌的恶性行为密切相关(图3E-G)。

为明确circ-0000423在结直肠癌中的作用：①首先我们发现在细胞系中，circ-0000423在各种结直肠癌细胞株中表达上调，而在人正常肠上皮细胞株FHC中表达丰度相对较低(图3H)；②结果还显示circ-0000423能促进HT29细胞的侵袭迁移。沉默circ-0000423后，HT29的侵袭迁移能力显著降低(图6A、B)；③此外circ-0000423还影响细胞周期进程(图6C)，沉默circ-0000423后，细胞周期被阻止在G0/G1及S期。circ-0000423可吸附抑癌基因miR-519以ceRNA机制促进结直肠癌的侵袭转移。上述结果提示circ-0000423是一个在肠癌中普遍高表达，且其能促进肠癌侵袭迁移、调控细胞周期，是与预后相关的潜在“促癌基因”。因此，基于上述研究工作，本发明提出了circ-0000423可作为治疗靶点在制备或筛选治疗结肠癌或抑制结肠癌侵袭迁移的药物中应用。circ-0000423可作为检测靶点在制备结直肠癌诊断试剂中应用。circ-0000423可作为检测靶点在制备预测结直肠癌分期、分化程度或预后的试剂中应用。

附图说明

图1.差异表达的功能circRNA筛选分析：(A)circRNA组织芯片结果的聚类分析；(B)circRNA组织芯片结果提示肿瘤组织对比正常组织表达水平的火山图(C)circRNA组织芯片的GO分析结果；(D)circRNA组织芯片的KEGG pathway分析结果。

图2.组织芯片对信号转导通路的分析：(A)参与细胞周期进程的信号通路；(B)参与P53信号通路。

图3.目标circ-0000423的选择与检测：(A-D)circ-0000423、circ-0007503、circ-0007364及circ-0050486在20对结直肠癌组织中表达特征；(E)circ-0000423表达水平与分化程度的关系；(F)circ-0000423表达水平与TNM分期的关系；(G)circ-0000423表达水平与结直肠癌预后的关系。(H)各细胞系中circ-0000423的表达丰度。

图4.circ-0000423在结直肠癌细胞株HT29及HCT116中表达：经RNase R处理后，线性的PPP1R12A以及circ-0000423表达水平变化情况(*：p<0.05，**：p<0.01)

图5.circ-0000423的基本信息。

图6.circ-0000423的生物学功能(在HT29细胞株中)：(A)Transwell细胞迁移实验；(B)Matrigel细胞侵袭实验。(C)细胞周期流式检测；(D)凋亡流式检测。(*：p<0.05，**：p<0.01)

图7.circ-0000423与PPP1R12A关系及亚细胞定位：(A)PPP1R12A在肠癌组织及正常组织中表达情况的对比；(B)circ-0000423表达水平与PPP1R12A相关性；(C、D、E)干扰circ-0000423后PPP1R12A mRNA、蛋白水平的变化情况；(F)核质分离后circ-0000423的主要空间位置分布；(G)FISH检测circ-0000423主要空间位置分布(HT29细胞株)

图8.circ-0000423“海绵”作用吸附microRNAs：(A)生物信息学预测CRA3吸附的microRNAs；(B)双荧光素酶报告基因提示circ-0000423所能吸附的microRNA；(C)qPCR组织验证，肠癌组织与正常组织中miR-519的表达丰度对比；(D)在肠癌组织中，circ-00004233与miR-519的表达丰度对比(*：p<0.05，**：p<0.01)

图9.circ-0000423-miR-519下游靶基因筛选：(A)沉默circ-0000423后差异表达基因聚类分析；(B)circ-0000423-miR-519下游靶基因初筛结果；(C、D)在细胞株HT29及HCT116中下调circ-0000423表达后，ABCG2、ELAVL1、HF1A及CDKN1A mRNA水平的表达变化；(E)ELAVL1及CDKN1A在结直肠癌组织中验证；(F、G)CDKN1A及ELAVL1mRNA表达水平分别与circ-0000423表达水平的相关性分析；(H)组织中ELAVL1mRNA水平与miR-519表达水平的相关性分析(*：p<0.05，**：p<0.01)

图10.circ-0000423可竞争性吸附miR-519上调ELAVL1的表达，从而促进结直肠癌侵袭转移”的机制图

具体实施方式

实施例1

(1)基因芯片由北京康成公司完成；使用美国Agilent定制的human circRNAs/mRNA 4×180K Microarray共表达芯片V.2.0平台，覆盖4425条circRNAs、32197条mRNA；对原始数据先用Lowess(locally weighted scatterplot smoothing)等方法对信号值进行归一化处理后，进行差异基因筛选。用SAM(Significance Analysis of Microarrays)软件进行差异基因的分析，FDR控制在5％以内。应用倍数法、多重假设检验等手段，对两条件或多条件下的表达差异的circRNAs和mRNA分别进行计算和筛选。

(2)GO功能注释基因本体论(Gene ontology，GO)功能注释是目前基因功能注释最广泛使用的方法之一。GO数据库(www.geneontology.org/)是由基因本体论联合会(Geneontology consortium)创建，GO数据库包括了对基因和蛋白功能的描述和注释，而且随着研究进展不断更新。GO注释包括了三个层面的标准语言，它依据基因产物的相关分子功能、生物学通路和细胞组件进行注释。

本发明中，使用DAVID在线网站进行基因GO功能富集分析(http://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp)；

(3)KEGG Pathway分析京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes，KEGG)是日本东京大学和日本京都大学共同研制的数据库。KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库。本课题中，使用DAVID在线网站进行基因KEGG Pathway分析；(http://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp)

应用circRNA表达谱芯片技术,从5对结直肠癌新鲜组织中通过聚类分析筛选差异表达的circRNA(设肿瘤组与正常组对照)，以3倍差异(p<0.05)为标准，共得到41条circRNA：上调的30条，下调的共11条。GO功能分析及KEGG信号通路分析显示差异表达的基因功能上与细胞周期进程、有丝分裂周期、核糖体合成、DNA复制转运、侵袭转移等相关，参与细胞周期调控及P53等信号通路，提示这些circRNA在结直肠癌发生发展中意义非凡(图1，2)。

实施例2

根据组织芯片在41条circRNA中进一步筛选出4条表达差异5倍以上，表达丰度高，均一性好的转录本，其中3条上调，1条下调(表1)(图3A-D)。

表1.根据芯片结果反复筛选出3条上调及1条下调的circRNA信息

随后，我们在20对结直肠癌中对上述4条差异表达circRNA进行组织PCR验证:

提取结肠癌组织总RNA，按照TAKARA036A试剂盒说明书合成cDNA，进行荧光定量PCR反应(引物见表2)：按照实验的重复和对照原则，每次每组标本设置三个复孔，并设置阴性对照和空白对照。按照说明书以10μL体系为例：在ABI的7300PCR仪或者Quantstudio6Flex仪器上运行，GAPDH、β-actin和U6作为内参。反应条件：酶预热变性—95℃10min，后进行40个循环的变性—95℃15s、退火延伸—60℃60s。

表2

其中circ-0000423在结直肠癌组织中均一性最好，表达丰度最高。结合临床病理特征进行临床相关性分析发现circ-0000423高表达与肠癌分期、分化程度以及预后密切相关，发现表达程度越高，病期越晚、分化及预后越差。提示circ-0000423与结直肠癌的恶性行为密切相关，引起发明人高度关注(图3E-G)。

分别提取FHC、SW620、SW480、LoVo、HCT116、HT29细胞总RNA，按照TAKARA036A试剂盒说明书合成cDNA，进行荧光定量PCR反应(引物见表2circ-000423引物)，circ-0000423在各种结直肠癌细胞株中表达上调，而在永生化人正常肠上皮细胞株FHC中表达丰度相对较低(图3H)

实施例3

设计针对circ-0000423接头处特异性背靠背引物行RT-PCR(引物见表2circ-000423引物)验证了circ-0000423在肠癌细胞株HT29及HCT116中的表达情况。同时，鉴于circRNA特殊的构造及对RNase不敏感的特征，采用RNase R处理后RT-PCR在结直肠癌细胞株中成功鉴定出circ-0000423的存在(图4)；同时，检索UCSC显示:circ-0000423位于第12号染色体长臂的PPP1R12A基因上，由PPP1R12A的1、2号外显子环化形成，长度为1138bp,序列如SEQ ID NO.1所示(图5)。

实施例4

1.特异性抑制circ-0000423的siRNA

特异性siRNA：根据circ-0000423序列及ThermoFisher公司提供的在线siRNA设计软件(BLOCK-iT RNAi Designer,网址http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)设计siRNA。需注意circ设计siRNA应针对接头处，保证特异性。同时设计线性的siRNA。

2.过表达circ-0000423质粒的构建

由上海捷瑞公司合成circ-0000423的全长序列(SEQ ID NO.1)，并插入真核表达载体pCDNA3.1中，构建circ-0000423过表达载体pCDNA-circ，将上述质粒转化大肠杆菌，摇菌、培养、挑选单克隆菌培养，使用去除内毒素的质粒提取试剂盒(DNA Midiprep试剂盒，Qiagen)提取获得扩增质粒。并将质粒送上海Invitrogen公司测序，检测序列是否发生突变。

3.si-circ和pcDNA3.1-circ转染HT-29细胞系

circ-0000423特异性的siRNA序列和阴性对照(negative control，NC)均购自Invitrogen公司(CA，USA)。siRNA和质粒转染均使用3000(lipo3000)转染试剂。将细胞以合适密度接种于6孔培养板，使过夜后细胞密度达到60％-70％；取6μLlipo3000稀释于125μL的OPTI-MEM中，温和吹打混匀；取100pmol siRNA/NC，或2.5μg质粒+10μl P3000稀释于125μL OPTI-MEM中，吹打混匀；将孵育好的lipo3000与siRNA或质粒稀释液混合，轻柔吹打混匀。于室温下孵育5min；将上述混合物均匀加入已经加好1.75mL完全培养基的6孔培养板中，轻轻混匀。37℃,5％CO2培养箱中继续培养。转染后48h，收集细胞提取RNA或蛋白进行实时定量RT-PCR或免疫印迹分析。

4.Transwell小室实验(使用millipore公司8μm膜的小室)

(1)细胞转染后24h，收集对数期细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整细胞悬液浓度为2×105/ml；

(2)在下室(即24孔板底部)加入800μl含10％血清的培养基，上室加入200μl细胞悬液(可添加FBS至浓度为0.5—1％，保持一定的渗透压)，继续在孵箱培养24小时(24-48h，根据细胞侵袭能力调整)；

(3)培养24h后，用镊子小心取出小室，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醛的孔中，室温固定30分钟；

(4)取出小室，吸干上室固定液，移到预先加入约800μl结晶紫染液的孔中，室温染色15－30分钟；

(5)轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出小室，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；

(6)晾干，倒置显微镜下取5个随机视野计数，统计结果。

5.Matrigel实验(使用BD BioCoat^TMMatrigel^TMInvasion Chamber)

(1)水化预铺胶：Matrigel侵袭小室加入500ml无血清培养基，移到预先加入约750μl基础培养基的孔中，置37℃5％CO₂的细胞培养箱中培养2h；

(2)细胞转染后24h，收集对数期细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整细胞悬液浓度为1×105/ml；

(3)在下室(即24孔板底部)加入750μl含10％血清的培养基，上室加入500μl细胞悬液(可添加FBS至浓度为0.5—1％，保持一定的渗透压)，继续在孵箱培养24小时(24-48h，根据细胞侵袭能力调整)；

(3)培养24h后，用镊子小心取出小室，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醛的孔中，室温固定30分钟；

(4)取出小室，吸干上室固定液，移到预先加入约800μl结晶紫染液的孔中，室温染色15－30分钟；

(5)轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出小室，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；

(6)晾干，倒置显微镜下取5个随机视野计数，统计结果。

通过Transwell细胞迁移实验和Matrigel细胞侵袭实验发现沉默circ-0000423后，HT29的侵袭迁移能力显著降低(图6A、B)；流式细胞术发现circ-0000423还影响细胞周期进程(图6C)，沉默circ-0000423后，细胞周期被阻止在G0/G1及S期(图6D)。体外细胞功能试验验证circ-0000423能促进HT29细胞的侵袭迁移。

实施例5

对实施例2中的20对结直肠癌组织qPCR验证表明肠癌组织中宿主基因PPP1R12A的表达与癌旁组织无显著差异，且与circ-0000423表达无关(图7A、B)；此外，沉默circ-0000423(方法同实施例4)后，RT-PCR及Western BlotPPP1R12A的mRNA及蛋白水平均无显著差异，提示circ-0000423的作用机制与宿主基因PPP1R12A无关。(工作基础图7C-E)。

实施例6

通过核质分离后RT-PCR验证细胞核、细胞质中的表达水平以及HT29细胞系的荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测后发现circ-0000423主要分布于细胞质内(工作基础图7F、G)，所处空间位置提示其可能具有转录后调控的功能。外显子来源的circ-0000423富含miRNA反应元件(MREs)，常以ceRNA机制充当吸附microRNA的“海绵”，调控microRNA下游靶基因的表达^[18,19]。提示circ-0000423是以ceRNA机制在转录后水平发挥调控作用。

实施例7

我们首先采用在线分析工具miRanda及PITA(表2)以“结合评分高、自由能低、“种子序列”≥8个及结合个数≥5”等条件筛选，得到3个circ-0000423可潜在吸附的microRNA：miR-526、miR-519、miR-665。

表2.本专利所采用的在线分析工具及生物信息学数据库

再行双荧光素酶报告基因实验验证上述3个microRNAs，结果显示circ-0000423仅可吸附miR-519(8A、B)。方法如下：

1)E2F7-3UTR区报告基因质粒构建，通过NCBI查询E2F7-3UTR序列全长构建质粒，合成野生型序列(WT)和点突变缺失型序列(MUT)，分别将WT和MUT序列插入到报告基因质粒，构建Pzex-H1619G(WT)，Pzex-H1620G(MUT)质粒。

2)细胞培养与转染：用含10％胎牛血清的DMEM培养HT29细胞系，在转染前一天将HT29细胞按每孔2×104个细胞的密度接种至96孔板，每孔设5个复孔，待细胞单层长至70％-80％融合时进行质粒转染。按照FuGENE 6Transfection Regent转染系统说明，每孔分别定量加入载体质粒Pzex-FR01，Pzex-H1619G(WT)，Pzex-H1620G(MUT)各0.5ug,转染步骤如下:

a.每个1.5ml的EP管中加入15ul的optiMEM；

b.加入1.5ul的FuGENE 6Transfection Regent混匀，室温放5min；

c.按照上述DNA量加入EP管中，轻轻混匀，室温放置15min；

3)转染24h后收集细胞。

4)荧光素酶活性测定a.弃去96孔细胞培养中的培养液，用PBS轻轻漂洗细胞洗2次；b.每孔加20uL细胞裂解液(1XPLB)，置于37℃摇床孵育15min；

c.取20uL细胞裂解液至检测管中，加入100u1LAR II涡旋混匀后放入仪器中读数；

d.取出检测管，加100u1Stop/Glo试剂，涡旋混匀后放入仪器中读数；e.记录Firefly-Luc和Renilla Luc的数值和比值，分析荧光活性。

进一步行肠癌组织qPCR验证(引物见表2circ-000423引物)，发现肠癌组织中miR-519显著下调(图8C)，同时circ-0000423表达丰度高于miR-519(图8D)，满足circ-0000423作为ceRNA发挥作用的必须条件^[22]。”综上可见，circ-0000423能吸附有抑癌作用的microRNA miR-519。

实施例8

为进一步寻找circ-0000423吸附miR-519以ceRNA机制调控的下游靶基因，我们进行下列验证分析：

①在HT29肠癌细胞株中沉默circ-0000423后行RNA-seq：沉默circ-0000423后对比阴性组，得到393条显著下调2.5倍以上的基因，为“靶基因集1”。再借助Targetscan、miRBase、miranda、PITA、RNAhybrid、microTar、miRecords及PICTA等8个数据库(表2)综合预测miR-519的靶基因，取全部获得数据的交集共得到79条基因，为“靶基因集2”。最后取集合1、2的交集，最终筛得候选靶基因4条ABCG2、CDKN1A、HIF1A及ELAVL1(工作基础图9A、B)。

②circ-0000423可能的下游靶基因可能是“促转移基因”ELAVL1：沉默circ-0000423后仅ELAVL1和CDKN1A在HT29及HCT116两个细胞株中均下调(工作基础图9C、D)；再行组织验证和相关性分析提示仅ELAVL1在结直肠癌组织中显著上调，且与circ-0000423表达成正相关，与miR-519表达呈负相关(工作基础图9E、G、H)。据此得出circ-0000423以ceRNA机制调控的靶标ELAVL1。

③进一步检索文献可知ELAVL1作为microRNA的靶点在结直肠癌等多种恶性肿瘤的侵袭转移中发挥着重要作用^[23-26]。

综上申请人绘制了“CRA3可竞争性吸附miR-519上调ELAVL1的表达，从而促进结直肠癌侵袭转移”的机制图(图10)

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序列表

<110> 江苏省肿瘤医院

<120> circ-0000423在制备或筛选结肠癌的药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1138

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

ccctgtaaga ccagtaataa atttctgtct actgatgatt ctattgaatt gaaatgcaga 60

gccaatggca tctttcagaa aaggtaacct gaatttcaga accagataat aagagaattc 120

tcctttacca gtaagatatg tttttcctgc ttaggacaaa cccattactt gtcactttgg 180

atatacttta tttcatcaaa tctaagacat tactcatttt aaaacaccat tgtgttacct 240

actactgaaa aaaaggaaag gtgctaccaa ttaaactata atgcatcatc aattgtaagc 300

cattttctgg ttttggaaat attaaaatgt gggaggaagt gtacaattta aaatattaat 360

cattatatga aaccagtttt ggcttttaaa catggaaatt ttgactctct tcctcaatta 420

atggaaatta gtagtattaa aaaaataggc tgggtgcagt ggctcattcc tgtagtctcc 480

cagcactttg ggaggctgag gcatgtgaat tgcttgagcc caggagttca agaccagcct 540

gggcaacatg gtgaaacccc atccctacca aaagtacaga attaggcatg gtggcatatg 600

cctgtagtcc cagcaaccca ggaggctgag gtagaagaat cacttgagcc cgagaagtcg 660

agtctgcagt gacctgagat catgccactg cactccaagc tgggcagcag agtgagaccc 720

tatctaaaaa aataaaataa cttcccactt attatatatc acaaaaatta atcagataac 780

agagggagac tgtgacctac tcttttgaac tgtcaagtta tatgtgtact aggatgtatg 840

ttgttataat tgtaaaagcc tataacaagg ttttttattt aaattaatct tttgaagata 900

tgaaaccagt tctacatcag ctggtgatcg atatgattcc ttgctgggtc gctctggatc 960

atacagttac ttagaagaaa gaaaacctta cagcagcagg ctagaaaagg atgactcaac 1020

tgactttaaa aagctttatg aacaaattct agctgaaaat gaaaagctga aggcacagct 1080

acatgataca aatatggaac taacagatct taaattacag ttggaaaagg ccacccag 1138

<210> 2

<211> 3307

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 2

ctgggtggcc ttttccaact gtaatttaag atctgttagt tccatatttg tatcatgtag 60

ctgtgccttc agcttttcat tttcagctag aatttgttca taaagctata aaaattaggg 120

taaaagaaca aattactttt ctgctctcct attactttaa aatttctcat tgattacttt 180

gcaatattaa aacagcttaa tgtagcatat gagctataaa ggatacattt aaaaaatcct 240

tcatggttgc aaagcagaga ctgttcgtta tgcaagtgtg tttgtcccat ataaagtctt 300

aaaattagtt ccagtattca aaaatcaaga cttcacagaa aaattggact tttcaggtta 360

tcttaaaaaa gattcagtta tctgataaag agggaccaca tacctgcaca gcaactgcag 420

ctagggctaa ggagtcactg tgatctttat ttggagtccg tgagattttc tgcccatcac 480

tctctcttgc attcccaaaa atgagacgga gtaccagctg tatttatcat tatacttcta 540

cattgcttat agtaaagtta aaaggcaaat gacgtatttc ctgaaatatt tcaaatccag 600

gataaaatcc aagaccttcc ccttttctaa tgcttttcgt ctttcttaac actccttctt 660

ccttatccct gctttactac ttccaccata attctggcta tgatcatctc ttatctaaac 720

tattctaatt ccctgatcac cctctaatct gttttatata taggagctaa aattaacttt 780

tcaaaatgaa aatctcataa ttttcatagg ccaaccattc catttccacc cacaaattaa 840

aaactcttga atggcttccc agtgttctta gcatacgaaa aatcttacaa tggcctataa 900

ggcactgcat gatctggtct cagcctatac aactgctgcc tcaaatgaat atttcttcca 960

ctctactagc tataattaaa atttatttat tccaatgcat catgtattct ccccccacca 1020

ggtctatgtg cttgtaattc cactctattt ggaataattt tctcacccat ttttgcccgt 1080

taactattag taatccttcc gtttttggct gaaaccacac ttcctttgga aatcaatcca 1140

ctttcttttt ttttgagata acagttttcc tcttgttgcc caggctggag tgcaatggcg 1200

tgttctcagc tcactgcaac ctctgcctcc tgggttcatg tgattctcct gcctcagcct 1260

cccgagtagc tgggattata ggcatgcgcc accacacctg gggtaatttt gtatttttgg 1320

tagagacgag gtttcttcat gttggtcagg ctggtctcga actcccgacc tcaggtgatg 1380

gcctgccaca gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcgtg agccactgca cccagccaag 1440

gaaatcaatc tactttcttt tgttatatac ttttataaaa ttgcttttct acttcaagtt 1500

aactgtctcc attatttatt atacagtcat tagtatgact gtgtaataag gtctctctcc 1560

actacatgga aaatgcccac aagagcaaga tagtatcttc atctccattt acccatgagt 1620

agaatctctc tacttagcat agttcagttc tttattgaat aaatgatgaa tcttactcat 1680

aatgtaaaat gattctctcc ctcacccgtt cccctaactt ggcttttaaa aaagtatgta 1740

attcaaatag ctgccagata actggggaca tgtacaaatg ccataagctt tctccttctc 1800

caacagactt tatgtttact ataagcacaa aataagaaga tatagtttct gcgatttatt 1860

cattaattac ttcaatcctt aatagcactt gagctgcccc aagtttttca gttacctatg 1920

aaaaactacc aatatattat cttaggaaaa gccatcttct ctgtttggct gcttcctagt 1980

aacaagaaac aaagtgtgta tacatttgtg tgcacccatt tattgaacgc tcctttccag 2040

ctcaatcata gcaatgactt gagatactta aatgtaaaat catcttggat gactttctct 2100

tccctttaat aaacaaacag ctatttacat tctacttaac catcacttgc cgaaaactga 2160

aaataagtta tttcaaaata ctcatttcat tatgagtttt taaaataata tttgaatgag 2220

tatctcaaca taaaagataa ctttttatta aatataacta aataacccaa gtaccttttt 2280

aaagtcagtt gagtcatcct tttctagcct gctgctgtaa ggttttcttt cttctaagta 2340

actgtatgat ccagagcgac ccagcaagga atcatatcga tcaccagctg atgtagaact 2400

ggtttcatat cttcaaaaga ttaatttaaa taaaaaacct tgttataggc ttttacaatt 2460

ataacaacat acatcctagt acacatataa cttgacagtt caaaagagta ggtcacagtc 2520

tccctctgtt atctgattaa tttttgtgat atataataag tgggaagtta ttttattttt 2580

ttagataggg tctcactctg ctgcccagct tggagtgcag tggcatgatc tcaggtcact 2640

gcagactcga cttctcgggc tcaagtgatt cttctacctc agcctcctgg gttgctggga 2700

ctacaggcat atgccaccat gcctaattct gtacttttgg tagggatggg gtttcaccat 2760

gttgcccagg ctggtcttga actcctgggc tcaagcaatt cacatgcctc agcctcccaa 2820

agtgctggga gactacagga atgagccact gcacccagcc tattttttta atactactaa 2880

tttccattaa ttgaggaaga gagtcaaaat ttccatgttt aaaagccaaa actggtttca 2940

tataatgatt aatattttaa attgtacact tcctcccaca ttttaatatt tccaaaacca 3000

gaaaatggct tacaattgat gatgcattat agtttaattg gtagcacctt tccttttttt 3060

cagtagtagg taacacaatg gtgttttaaa atgagtaatg tcttagattt gatgaaataa 3120

agtatatcca aagtgacaag taatgggttt gtcctaagca ggaaaaacat atcttactgg 3180

taaaggagaa ttctcttatt atctggttct gaaattcagg ttaccttttc tgaaagatgc 3240

cattggctct gcatttcaat tcaatagaat catcagtaga cagaaattta ttactggtct 3300

tacaggg 3307

Claims (8)

1.circ-0000423作为治疗靶点在制备或筛选治疗结肠癌或抑制结肠癌侵袭迁移的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于人circ-0000423用于制备或筛选治疗结肠癌或抑制结肠癌侵袭迁移的药物包括两方面的内容：其一，将人circ-0000423作为药物或制剂针对结直肠癌细胞的作用靶标应用于制备结直肠癌治疗药物；其二，将人circ-0000423作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选结直肠癌治疗药物。

3.circ-0000423作为检测靶点在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。

4.circ-0000423作为检测靶点在制备预测结直肠癌分期、分化程度或预后的试剂中的应用。

5.检测人circ-0000423表达量的引物、探针或基因芯片在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。

6.检测人circ-0000423表达量的引物、探针或基因芯片在制备预测结直肠癌分期、分化程度或预后的试剂中的应用。

7.一种治疗结直肠癌的药物组合物，其特征在于包括抑制或沉默人circ-0000423表达的核酸分子。

8.一种结直肠癌诊断试剂，其特征在于包含检测人circ-0000423表达量的引物、探针或基因芯片。