JP2003529315A - 病気の診断および治療のための成分および方法 - Google Patents

病気の診断および治療のための成分および方法

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ティモスィー ジェイ． アイトマン、
ジェイムズ スコット、
ローレンス ダブリュー． スタントン、
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ティモスィー ジェイ． アイトマン、
ジェイムズ スコット、
ローレンス ダブリュー． スタントン、
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ここに特定されている配列を含む単離された核酸分子、突然変異体ＣＤ３６遺伝子、およびこれらのコードされた遺伝子産物、ＣＤ３６遺伝子突然変異を検出することによる血液または血液産物のスクリーニング方法、ＣＤ３６遺伝子突然変異の存在または不存在に基づいて血液または血液産物を投与する方法、ＣＤ３６遺伝子における突然変異の検出に基づいて生物サンプルドナーと受容体とをマッチさせる方法、ＣＤ３６遺伝子突然変異を検出することによる、寄生体による感染への患者の抵抗性を測定する方法、ＣＤ３６遺伝子における突然変異の検出による、インシュリン作用、グルコース代謝、脂肪酸代謝、および／またはカテコールアミン作用における欠陥と関連した病気の診断方法、および突然変異を改変することによる病気の治療方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 （発明の分野） この発明は一般に、病気の基礎になるメカニズムの発見に関する。 【０００２】 （発明の背景） 冠状心臓病、高血圧、インシュリン非依存性糖尿病、インシュリン抵抗性また
はインシュリン感受性欠如、および肥満は、産業社会における不健康の主な原因
である。炭水化物および脂質代謝の障害は、これらの病気の共通の特徴である（
Ｅｖａｎｓら、１９８４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７４：１５１５−１
５２５；Ｆｅｒｒａｎｎｉｎｉら、１９８７、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３
１７：３５０−３５７；Ｒｅａｖｅｎ、１９８８ａ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３７：
１５９５−１６０７；Ｈｕｎｔら、１９８９、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉ ｓ ，９：３３５−３４４；Ｋａｐｌａｎ、１９８９、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． ，１４９：１５１４−１５２０；ＭｃＧａｒｒｙ、１９９２、Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ，２５８：７６６−７７０；Ｃｏｈｅｎら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２７４：１１８５−１１８８；Ｐｏｌｏｎｓｋｙら、１９９５、Ｎ．Ｅｎｇｌ． Ｊ．Ｍｅｄ． ，３３４：７７７−７８３；Ｒｅａｖｅｎら、１９９６、Ｎ．Ｅｎ ｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ，３３４：３７４−３８１）。特に、インシュリンおよびカ
テコールアミン作用の欠陥に関連した炭水化物および脂肪酸代謝における障害は
、インシュリン非依存性糖尿病、代謝症候群Ｘ、肥満、家族性脂質異常高血圧、
および家族性複合高脂血症に特徴的なものである（Ｒｅａｖｅｎ、１９８８ａ、
上記；Ｒｅａｖｅｎら、１９８８ｂ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３７：１０２０−１０
２４；ＭａｒｔｉｎおよびＪｅｎｓｅｎ、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ ｔ． ，８８：６０９−６１３；Ｈｕｎｔら、１９８９、上記；Ｃａｓｔｒｏ Ｃ
ａｂｅｚａｓら、１９９３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９２：１６０−１
６８；Ａｉｔｍａｎら、１９９７、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ． ，１７：７４８−７５４；Ｒｅｙｎｉｓｄｏｔｔｉｒら、
１９９４、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，３７：４２８−４３５；Ｒｅｙｎｉｓｄ
ｏｔｔｉｒら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９５：２１６３−２
１６９）。これらの状態は、患者のライフスタイル（例えば食餌および運動）の
修正によっておよび／または薬物療法によって治療可能である。このような状態
の発現の存在またはリスクが早期に発見されれば、患者のそこそこ満足できる生
活に対して全体的なまたはかなりの範囲の妥協が必要になる前に、治療的または
予防的療法を開始することができる。 【０００３】 心臓病、高血圧、インシュリン非依存性糖尿病、代謝症候群Ｘ、複合高脂血症
、および／または肥満のうちの１つまたはそれ以上のものへの傾向を有する個体
を診断する方法に対するニーズが当業者に存在する。 【０００４】 いくつかの寄生体は、宿主細胞の感染ためのリガンドとしてＣＤ３６タンパク
質を利用していることが、この技術において示唆されている（Ｏｑｕｅｎｄｏら
、１９８９、Ｃｅｌｌ ５８：９５）。これの一例は、熱帯マラリア原虫（Ｐｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、すなわちマラリアの病原因子であ
る。従ってＣＤ３６タンパク質の変異型を発現するかまたはＣＤ３６の発現に失
敗した宿主は、このような寄生体による感染に対してより大きい抵抗性を有し得
る。ＣＤ３６タンパク質を欠く個体のかなりな部分が、アジアおよびアフリカ起
源の集団において同定されている。これらの生成発達の歴史は、頻繁なマラリア
感染からの選択圧力によってこの表現型がありふれたものになったことを示唆し
ている。Ｃｕｒｔｉｓ，Ｂ．Ｒ．およびＡｓｔｅｒ，Ｒ．Ｈ．，１９９６、Ｔｒ ａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３６：３３１−３３４。 【０００５】 この技術の測定方法に対しては、熱帯マラリア原虫による感染への抵抗性また
は感受性へのニーズが存在する。 【０００６】 見掛けは正常な個体にＧＰＩＶが欠けており、従って輸血を受けた時にタンパ
ク質に対する抗体を生産するリスクがある者がいることが示唆されている。Ｃｕ
ｒｔｉｓら、１９９６、上記；Ｇｒｅｅｎｗａｌｔら．，１９９２、Ｂｌｏｏｄ ８０：１１０５；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９０、Ｂｌｏｏｄ ７６：１６９８
。 【０００７】 組織のスクリーニングおよび供与を目的として、ＣＤ３６欠失を生じるＣＤ３
６遺伝子突然変異を検出することへのニーズがこの技術に存在する。 【０００８】 （発明の要約） 本発明は、インシュリン作用および／またはグルコース代謝および／または脂
肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用における欠陥を調節する物質を同
定する方法を提供する。この方法は、インシュリン作用および／またはグルコー
ス代謝および／または脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用を調節す
る遺伝子の活性が、候補モジュレータの存在下に改変されるかどうかをアッセイ
系において決定するステップを含んでいる。ここにおいて、候補モジュレータの
存在下における遺伝子の活性の改変は、欠陥インシュリン作用および／またはグ
ルコース代謝および／または脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用を
調節することにおける候補モジュレータの効率の指標となるものである。 【０００９】 ここで用いられている「物質」という用語は、次のものを含む群から選ばれる
生化学物質のことを言い、これには、タンパク質、ペプチド、またはアミノ酸；
核酸例えばＤＮＡ、例えばゲノム・ｃＤＮＡ・または人工コーディング配列から
誘導されたこれらの全長遺伝子または断片、遺伝子調節要素、ｍＲＮＡ、ｒＲＮ
Ａ、リボゾームＲＮＡ、リボザイム、およびアンチセンスＲＮＡを含むＲＮＡ、
オリゴヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド
およびリボヌクレオチド；炭水化物；脂質；プロテオグリカンを含むがこれらに
限定されるわけではない。これらの物質は、単離された（精製された）化合物ま
たは粗混合物として、例えば組織、細胞、または細胞溶解産物中に存在している
ことがある。さらにはこのような物質は、自然発生であってもよく、あるいは合
成であってもよい。「物質」という用語はさらに、小さい分子、例えば有機およ
び無機化合物のことをも言う。 【００１０】 ここで用いられている「遺伝子」という用語は、エキソンを１つまたはそれ以
上を含んでいる核酸配列のことを言う。このエキソンは、タンパク質またはＲＮ
Ａ分子、イントロン、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、および調節配列を
コードすることができる。この調節配列は、転写配列あるいは非転写配列のどち
らかにおいて、このエキソンの５’または３’に位置していてもよい。 【００１１】 遺伝子またはタンパク質の発現または活性に関してここで用いられている「調
節する」という用語は、その基礎的発現レベルに対して少なくとも１０％だけ、
その遺伝子またはタンパク質の発現（発現が、ＲＮＡを通して検出されるか、あ
るいはタンパク質、または遺伝子産物の活性を通して検出されるかによって）を
刺激、強化、あるいはまた増加させるため、あるいは阻害、抑制、降下、あるい
はまた減少させるための、物質（例えば薬剤またはその他の薬理組成物）または
条件（例えば環境変化または遺伝子の突然変異）の作用のことを言う。遺伝子ま
たはタンパク質の発現または活性を調節する物質は、ここでは「モジュレータ」
と呼ばれる。基礎レベルに対する、または、モジュレータまたは候補モジュレー
タと接触させられなかった対照に対する、発現または活性におけるパーセント変
化は、１０％よりも大きく、例えば２０〜５０％、あるいは７５〜１００％であ
ってもよい。あるいはまたモジュレータは、１００％よりも大きい活性または発
現における変更を行うことができる。例えば発現または活性の基礎レベル、また
はこのモジュレータを受入れなかったか、あるいはこのモジュレータによって接
触されなかった対照（すなわち未処理対照）において観察されたレベルの２〜１
０倍、２０〜１００倍、１０００倍、あるいは１０，０００〜１００，０００倍
もでさえ、このレベル以上または以下の変更を行うことができる。 【００１２】 遺伝子またはタンパク質の発現または活性に関してここで用いられている「基
礎レベル」という用語は、候補調節剤で処理されなかったか、あるいは候補調節
剤またはこの状態に暴露されなかった、あるいはこれに付されなかった対照生物
、細胞、細胞溶解産物、またはその他の系におけるその発現レベル、またはこの
ような処理または暴露前の被験者生物におけるその発現レベルに対する、生物、
細胞溶解産物、またはその他の系におけるその遺伝子またはタンパク質の発現ま
たは活性のレベルのことを言う。 【００１３】 ここで用いられている「欠陥」および「欠損症」という用語は、遺伝子または
タンパク質の活性または発現における、または代謝プロセスの効率における増加
または減少であって、この増加または減少が、生物、例えば哺乳類において臨床
的な病気を生じることがあるもののことを言う。 【００１４】 欠陥または欠損症は、下記のようなインシュリン抵抗性遺伝子座と関連した遺
伝子、特にＣＤ３６遺伝子における突然変異から生じると考えられる。特にヒト
のＣＤ３６遺伝子における突然変異は、インシュリン作用、グルコース代謝また
は摂取、脂肪酸代謝または摂取、またはカテコールアミン作用のうちの１つまた
はそれ以上における欠陥と関連した病気の存在またはリスクについて、並びに薬
剤スクリーニングまたは病気治療のための標的について個体を試験するための診
断マーカーとして有用である。 【００１５】 ＣＤ３６遺伝子における突然変異もまた、ＣＤ３６タンパク質欠失を検出する
のに有用である。このような突然変異の多くは、ＣＤ３６機能が減少するかまた
はなくなっているタンパク質の発現を結果として生じるか、あるいはこれらは、
端が切り取られたＣＤ３６タンパク質の発現を結果として生じるかまたはＣＤ３
６タンパク質の発現をまったく生じない。ＣＤ３６タンパク質欠失は、少なくと
も３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくと
も８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、あるいは
少なくとも９９〜１００％、ＣＤ３６タンパク質の機能的または物理的減少を結
果として生じる状態である。突然変異は、この突然変異がＣＤ３６遺伝子の転写
の改変または阻害、あるいはＣＤ３６遺伝子産物のプロセシングまたは翻訳の改
変または阻害を結果として生じるならば、ＣＤ３６タンパク質の欠失を示すかま
たはこれを結果として生じる。 【００１６】 遺伝子またはタンパク質に関してここで用いられている「活性」または「発現
」という用語は、コードされた産物の、または構造的、酵素的、またはその他の
生物機能の、転写、ｍＲＮＡプロセシングまたは安定性、および翻訳のうちの１
つまたはそれ以上のことを言う。「活性」または「発現」という用語はさらに、
１つまたはそれ以上の遺伝子産物（例えばＲＮＡまたはタンパク質）の、細胞（
例えば構造的要素、酵素、および／または経路のメンバー、例えばシグナルまた
は代謝経路としてのもの）における、または基質または下流標的（例えば遺伝子
を調節するためのタンパク質あるいは核酸分子）に対する作用のことを言うこと
もある。経路の下流要素に対する作用は、直接的（例えば直接タンパク質：タン
パク質、タンパク質：核酸、または核酸：核酸相互作用を通じて）であってもよ
く、あるいは例えば中間分子との相互作用を通して間接的であってもよい。 【００１７】 ここで用いられている「改変」という用語は、基礎状態の野生型または対照に
対する、遺伝子またはタンパク質の活性または発現における、少なくとも１０％
、好ましくは２０％またはそれ以上、例えば３０〜５０％、７５％、１００％、
または数倍の変化のことを言う。 【００１８】 ここで用いられている「アッセイ系」という用語は、生物、細胞溶解産物、ま
たは細胞を含まない系のことを言う（すなわち、緩衝液またはその他の媒質、例
えば核酸またはペプチドマイクロアレイで、これはアッセイされる生物学的プロ
セスを進行させることができる。例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および／または翻
訳、酵素反応、またはタンパク質：タンパク質、タンパク質：核酸、または核酸
：核酸結合であり、例えば生理緩衝液またはその他の反応媒質、酵素、酵素基質
、および場合によっては指標化合物、例えば色素または標識を含むものである）
。アッセイ系は、最小限、試験生物、細胞、細胞溶解産物、または細胞を含まな
い系を含んでおり、好ましくはさらに、対照生物、細胞、細胞溶解産物、または
細胞を含まない系を含んでいる。アッセイ系は、自然発生のものであってもよく
、あるいは合成、あるいは研究者が組立てた、あるいは遺伝子工学で作り変えら
れた成分（例えばマイクロアレイ、生化学分子の混合物、これから生じた形質転
換動物または組織または細胞、またはこれから誘導された形質転換またはトラン
スフェクトされた細胞または溶解産物）であってもよい。 【００１９】 ここで用いられている「インシュリン作用」という用語は、細胞によるインシ
ュリン媒介グルコース摂取のことを言う。 【００２０】 ここで用いられている「グルコース代謝」という用語は、培養あるいは生物中
の細胞によるグルコースの摂取のことを言う。 【００２１】 本発明によるグルコース代謝の代謝プロセスにおける欠陥は、少なくとも１０
％、好ましくは少なくとも１５％の、細胞によって取込まれたグルコースの量の
減少、あるいは基礎的未刺激状態におけるかまたはインシュリンに応答した、細
胞のグルコースの取込みの失敗でさえあると考えられる。 【００２２】 ここで用いられている「脂肪酸代謝」という用語は、トリグリセリドのグリセ
ロールおよび脂肪酸への分解のことを言う。 【００２３】 本発明による脂肪酸代謝における欠陥は、脂肪細胞からの脂肪酸の分泌におけ
る少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％の減少であると考えられる。 【００２４】 ここで用いられている「カテコールアミン作用」という用語は、細胞からの脂
肪酸およびグリセロールの放出によって証明されるような、脂肪酸代謝を誘発す
る脂肪細胞に対するカテコールアミン分子の作用のことを言う。本発明のアッセ
イにおいて特に有用なカテコールアミンは、イソプロテレノールである。 【００２５】 本発明によるカテコールアミン作用における欠陥は、少なくとも１０％、好ま
しくは少なくとも１５％の、脂肪酸代謝へのカテコールアミンの作用への脂肪細
胞の減少した感受性であると考えられる。 【００２６】 好ましくはこの遺伝子は、ＣＤ３６とＣｄ３６とから成る群から選ばれる。 【００２７】 このアッセイ系において、インシュリン作用および／またはグルコース代謝お
よび／または脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用における欠失があ
るのが好ましい。 【００２８】 同様にさらには、本発明によるインシュリン作用における「欠失」または欠陥
は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％の、グルコース代謝に対す
るインシュリンの作用への脂肪細胞の減少した感受性であるとも考えられる。 【００２９】 ここで用いられている「インシュリン抵抗性」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏの単離された脂肪組織、骨格筋、または血管組織、またはｉｎ ｖｉｖｏでの
動物まるごとにおいて測定された、インシュリン作用における少なくとも１０％
、好ましくは１５％またはそれ以上の減少のことを言う。ｉｎ ｖｉｖｏ動物の
場合は、次のものを含むがこれに限定されるわけではない群から選ばれるアッセ
イを用いる。すなわち、正常血糖クランプ、インシュリン耐性試験、高血糖クラ
ンプ、静脈内耐糖能試験、およびこれが投与された動物における放射性グルコー
スの分布の測定である。 【００３０】 本発明の別の態様は、ＣＤ３６遺伝子の活性を調節する物質を同定する方法で
あって、候補モジュレータの存在下でのＣＤ３６活性における改変を検出するた
めの検出ステップを実施することを含む方法である。ここにおいて改変の検出は
、前記ＣＤ３６遺伝子の活性を調節することにおける前記候補モジュレータの効
率の指標となるものである。 【００３１】 好ましくは前記方法のアッセイ系において、ＣＤ３６活性の欠失がある。 【００３２】 本発明はさらに、インシュリン作用および／またはグルコース代謝および／ま
たは脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用と関連した病気の治療のた
めの物質を同定する方法であって、ＣＤ３６遺伝子を含むアッセイ系と候補物質
とを接触させるが、ここにおいてＣＤ３６遺伝子がアッセイ系において発現され
るステップ、およびＣＤ３６遺伝子を含む第一対照系（ここにおいて遺伝子が第
一対照系において発現され、この第一対照系は候補物質と接触させられていない
）に対して、および第二対照系（ここにおいてＣＤ３６遺伝子はこの第二系にお
いて発現されず、この第二系は候補物質と接触させられている）に対しての、ア
ッセイ系における変化を検出するための検出ステップであって、第一および第二
対照系に対するアッセイ系の変化は、この候補物質がこの病気の治療に対して効
果的であることを示しているステップを実施することを含む方法をも包含する。 【００３３】 ここで用いられている「病気」という用語は、インシュリン作用、グルコース
代謝または摂取、脂肪酸代謝または摂取、またはカテコールアミン作用の代謝プ
ロセスのうちの１つまたはそれ以上における欠陥から結果として生じる症状の明
白な提示（すなわち不健康）または異常な臨床的指標（例えば生化学的指標）の
発現のことを言う。あるいはまた「病気」という用語は、このような症状または
異常な臨床的指標を発生させる遺伝的または環境的リスクまたは傾向のことを言
う。 【００３４】 インシュリン作用および脂肪酸代謝または摂取における欠陥と関連した病気に
は、代謝症候群Ｘ含むがこれに限定されない通常のインシュリン抵抗性症候群、
および心筋症を含んでいるが、これらに限定されるわけではない。 【００３５】 インシュリン作用に関連する病気には、インシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤ
ＤＭ）、複合高脂血症（家族性複合高脂血症を含むがこれに限定されない）、お
よび本態性高血圧が含まれるがこれらに限定されない。 【００３６】 心筋症に関連した病気には、遺伝性の肥大性、拡張、圧力過負荷、および突発
性心筋症が含まれるがこれらに限定されるわけではない。 【００３７】 ここで用いられている「高血圧」という用語は、匹敵し得る年齢、身長、およ
び体重の正常な個体の血圧と比べて、少なくとも１０％の安静血圧における上昇
のことを言う。 【００３８】 ここで用いられている「インシュリン非依存性糖尿病」という用語は、インシ
ュリン抵抗性、耐糖能異常、および空腹時血糖障害を特徴とする２型糖尿病のこ
とを言う。 【００３９】 ここで用いられている「代謝症候群Ｘ」という用語は、自然発生高血圧、脂肪
異常血症、インシュリン抵抗性、高インシュリン血症、増加腹部脂肪、および冠
状心臓病のリスクの増加を特徴とする病気のことを言う。 【００４０】 ここで用いられている「肥満」という用語は、哺乳類の体重が、年齢および骨
格サイズに基づいて、医学的に推奨されている範囲を少なくとも２０％超える状
態のことを言う。 【００４１】 ここで用いられている「哺乳類」という用語は、ヒトを含む哺乳類綱の一員の
ことを言う。 【００４２】 この発明の別の態様は、インシュリン作用および／またはグルコース代謝およ
び／または脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用と関連した病気の治
療のための物質を同定する方法であって、ＣＤ３６遺伝子を含むアッセイ系と候
補物質とを接触させるが、ここにおいてＣＤ３６遺伝子がこのアッセイ系におい
て発現されるステップ、およびＣＤ３６遺伝子を含む第一対照系（ここにおいて
遺伝子がこの第一対照系において発現され、この第一対照系は候補物質と接触さ
せられていない）に対して、および第二対照系（ここにおいてＣＤ３６遺伝子は
この第二系において発現されず、この第二系は候補物質と接触させられている）
に対しての、アッセイ系における変化を検出するための検出ステップであって、
第一および第二対照系に対するアッセイ系の変化が観察されるステップを実施す
るステップ、およびこの病気の臨床的指標を示す動物に候補物質を投与するステ
ップであって、ここにおいて臨床的指標における改良は、この候補物質がこの病
気の治療に対して効果的であることを示しているステップを含む方法である。 【００４３】 本発明はさらに、インシュリン作用および／またはグルコース代謝および／ま
たは脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用と関連した病気の治療のた
めの物質を同定する方法であって、ＣＤ３６遺伝子を含むアッセイ系と候補物質
とを接触させるが、ここにおいてＣＤ３６遺伝子がアッセイ系において発現され
るステップ、およびＣＤ３６遺伝子を含む第一対照系（ここにおいて遺伝子が第
一対照系において発現され、この第一対照系は候補物質と接触させられていない
）に対して、および第二対照系（ここにおいてＣＤ３６遺伝子はこの第二系にお
いて発現されず、この第二系は候補物質と接触させられている）に対しての、ア
ッセイ系における変化を検出するための検出ステップであって、第一および第二
対照系に対するアッセイ系の変化が観察されるステップを実施するステップ、こ
の病気の臨床的指標を示す動物に候補物質を投与するステップ、臨床的指標にお
ける変化を検出し、臨床的指標における改良が観察される検出ステップを実施す
るステップ、およびこの候補物質と生理学的に適合性のあるキャリアとを含むキ
ットを製造し、これを包装するステップであって、臨床的指標における改良は、
この候補物質がこの病気の治療に対して効果的であることを示しているステップ
を含む方法を提供する。 【００４４】 本発明の別の態様は、インシュリン作用および／またはグルコース代謝および
／または脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用と関連した病気の治療
のための物質を同定する方法であって、ＣＤ３６タンパク質を含むアッセイ系と
候補物質とを接触させるステップ、および第一対照系（ここにおいて第一対照系
はＣＤ３６タンパク質を含んでおり、候補物質と接触させられていない）に対し
て、および第二対照系（ここにおいて第二対照系はＣＤ３６タンパク質を含んで
おらず、候補物質と接触させられている）に対しての、アッセイ系における変化
を検出するための検出ステップであって、第一および第二対照系に対するアッセ
イ系の変化は、この候補物質が、この病気の治療に対して効果的であることを示
しているステップを実施するステップを含む方法である。 【００４５】 本発明はさらに、インシュリン作用および／またはグルコース代謝および／ま
たは脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用と関連した病気の治療のた
めの物質を同定する方法であって、ＣＤ３６タンパク質を含むアッセイ系と候補
物質とを接触させるステップ、第一対照系（ここにおいて第一対照系はＣＤ３６
タンパク質を含んでおり、候補物質と接触させられていない）に対して、および
第二対照系（ここにおいて第二対照系はＣＤ３６タンパク質を含んでおらず、候
補物質と接触させられている）に対しての、アッセイ系における変化を検出する
ための検出ステップであって、第一および第二対照系に対するアッセイ系の変化
が検出されるステップを実施するステップ、およびこの病気の臨床的指標を示す
動物に候補物質を投与するステップであって、ここにおいて臨床的指標における
改良は、この候補物質がこの病気の治療に対して効果的であることを示している
ステップを含む方法を包含する。 【００４６】 本発明の別の態様は、インシュリン作用および／またはグルコース代謝および
／または脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用と関連した病気の治療
のための物質を同定する方法であって、ＣＤ３６タンパク質を含むアッセイ系と
候補物質とを接触させるステップ、第一対照系（ここにおいて第一対照系はＣＤ
３６タンパク質を含んでおり、候補物質と接触させられていない）に対して、お
よび第二対照系（ここにおいて第二対照系はＣＤ３６タンパク質を含んでおらず
、候補物質と接触させられている）に対しての、アッセイ系における変化を検出
するための検出ステップであって、第一および第二対照系に対するアッセイ系の
変化が検出されるステップを実施するステップ、この病気の臨床的指標を示す動
物に候補物質を投与するステップ、臨床的指標における変化を検出するための検
出ステップであって、臨床的指標における改良が検出されるステップを実施する
ステップ、および候補物質と生理学的に適合性のあるキャリアとを含むキットを
製造し、これを包装するステップであって、ここにおいて臨床的指標における改
良は、この候補物質がこの病気の治療に対して効果的であることを示しているス
テップを含む方法である。 【００４７】 好ましくは前記方法において、このアッセイ系および対照系は１匹の動物を含
んでいる。 【００４８】 この動物は哺乳類であることが好ましい。 【００４９】 好ましくはこのアッセイ系および対照系は培養細胞を含んでいる。 【００５０】 別の好ましい実施形態において、このアッセイ系および対照系は細胞溶解産物
を含んでいる。 【００５１】 好ましくは前記アッセイ系および対照系において、ＣＤ３６活性の欠失がある
。 【００５２】 前記方法はさらに、この病気の臨床的指標を示す動物に候補物質を投与するス
テップ後に、この動物の臨床的指標の改良を検出するための検出ステップを実施
するステップを含むことが好ましい。 【００５３】 哺乳類におけるインシュリン作用および／またはグルコース代謝および／また
は脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用の欠陥に関連した病気を診断
する本発明は、試験哺乳類および正常哺乳類からの生物サンプルにおけるＣＤ３
６の発現レベルを測定するステップ、および 試験哺乳類からの生物サンプルおよび正常哺乳類からの生物サンプルにおいて測
定されたＣＤ３６発現のレベルを比較するステップであって、これらのレベル間
の差が、試験哺乳類における病気の存在を示しているステップを含んでいる。 【００５４】 好ましくは発現を測定するステップが、ＣＤ３６ｍＲＮＡを検出するステップ
を実施することを含んでいる。 【００５５】 別の好ましい実施形態において、発現を測定するステップは、ＣＤ３６タンパ
ク質を検出するステップを実施することを含んでいる。 【００５６】 試験哺乳類および正常哺乳類がヒトであるのが好ましい。 【００５７】 試験被験者と正常被験者との間でＣＤ３６発現レベルにおいて少なくとも２倍
の差が観察されることがさらに好ましい。 【００５８】 本発明はさらに、インシュリン抵抗性と関連した病気の治療方法であって、Ｃ
Ｄ３６活性のモジュレータの有効量を、これを必要としている被験者に投与する
ことを含む方法をも提供する。 【００５９】 このモジュレータがＣＤ３６活性を減少させることが好ましい。 【００６０】 別の好ましい実施形態によれば、このモジュレータはＣＤ３６活性を増加させ
る。 【００６１】 モジュレータがポリペプチドであるのが好ましく、ポリペプチドが、ＣＤ３６
タンパク質とＣＤ３６ペプチドとから成る群から選ばれるのがより好ましく、ポ
リペプチドがヒトのものであるのが非常に好ましい。 【００６２】 好ましくはポリペプチドは、［配列ＩＤ番号１０１］、[配列ＩＤ番号：１０
２]、[配列ＩＤ番号：１０３]、[配列ＩＤ番号：１０４]、[配列ＩＤ番号：１０
５]、[配列ＩＤ番号：１０６]、[配列ＩＤ番号：１０７]、[配列ＩＤ番号：１０
８]、[配列ＩＤ番号：１０９]、[配列ＩＤ番号：１１０]、[配列ＩＤ番号：１１
１]、[配列ＩＤ番号：１１２]、[配列ＩＤ番号：１１３]、[配列ＩＤ番号：１１
４]、[配列ＩＤ番号：１１５]、[配列ＩＤ番号：１１６]、[配列ＩＤ番号：１１
７]、[配列ＩＤ番号：１１８]、[配列ＩＤ番号：１１９]、[配列ＩＤ番号：１２
０]、[配列ＩＤ番号：１２１]、[配列ＩＤ番号：１２２]、[配列ＩＤ番号：１２
３]、[配列ＩＤ番号：１２４]、[配列ＩＤ番号：１２５]、[配列ＩＤ番号：１２
６]、[配列ＩＤ番号：１２７]、[配列ＩＤ番号：１２８]および[配列ＩＤ番号：
１２９]から成る群から選ばれる核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を
含んでいる。 【００６３】 ポリペプチドは、組換え核酸分子によって発現されるのが好ましい。 【００６４】 さらには組換え核酸分子が、［配列ＩＤ番号１０１］、[配列ＩＤ番号：１０
２]、[配列ＩＤ番号：１０３]、[配列ＩＤ番号：１０４]、[配列ＩＤ番号：１０
５]、[配列ＩＤ番号：１０６]、[配列ＩＤ番号：１０７]、[配列ＩＤ番号：１０
８]、[配列ＩＤ番号：１０９]、[配列ＩＤ番号：１１０]、[配列ＩＤ番号：１１
１]、[配列ＩＤ番号：１１２]、[配列ＩＤ番号：１１３]、[配列ＩＤ番号：１１
４]、[配列ＩＤ番号：１１５]、[配列ＩＤ番号：１１６]、[配列ＩＤ番号：１１
７]、[配列ＩＤ番号：１１８]、[配列ＩＤ番号：１１９]、[配列ＩＤ番号：１２
０]、[配列ＩＤ番号：１２１]、[配列ＩＤ番号：１２２]、[配列ＩＤ番号：１２
３]、[配列ＩＤ番号：１２４]、[配列ＩＤ番号：１２５]、[配列ＩＤ番号：１２
６]、[配列ＩＤ番号：１２７]、[配列ＩＤ番号：１２８]、[配列ＩＤ番号：１２
９]、[配列ＩＤ番号：１３２]、[配列ＩＤ番号：１３３] 、[配列ＩＤ番号：１
３４]、[配列ＩＤ番号：１３５]、[配列ＩＤ番号：１３６]、[配列ＩＤ番号：１
３７]、[配列ＩＤ番号：１３９] 、[配列ＩＤ番号：１４０]、[配列ＩＤ番号：
１４２] 、[配列ＩＤ番号：１４３]、[配列ＩＤ番号：１４４]、[配列ＩＤ番号
：１４５] 、[配列ＩＤ番号：１４６]、[配列ＩＤ番号：１４７]、[配列ＩＤ番
号：１４８]および[配列ＩＤ番号：１４９]から成る群から選ばれる配列を含ん
でいるのが好ましい。 【００６５】 好ましくはこのモジュレータは核酸分子である。 【００６６】 核酸分子は、［配列ＩＤ番号１０１］、[配列ＩＤ番号：１０２]、[配列ＩＤ
番号：１０３]、[配列ＩＤ番号：１０４]、[配列ＩＤ番号：１０５]、[配列ＩＤ
番号：１０６]、[配列ＩＤ番号：１０７]、[配列ＩＤ番号：１０８]、[配列ＩＤ
番号：１０９]、[配列ＩＤ番号：１１０]、[配列ＩＤ番号：１１１]、[配列ＩＤ
番号：１１２]、[配列ＩＤ番号：１１３]、[配列ＩＤ番号：１１４]、[配列ＩＤ
番号：１１５]、[配列ＩＤ番号：１１６]、[配列ＩＤ番号：１１７]、[配列ＩＤ
番号：１１８]、[配列ＩＤ番号：１１９]、[配列ＩＤ番号：１２０]、[配列ＩＤ
番号：１２１]、[配列ＩＤ番号：１２２]、[配列ＩＤ番号：１２３]、[配列ＩＤ
番号：１２４]、[配列ＩＤ番号：１２５]、[配列ＩＤ番号：１２６]、[配列ＩＤ
番号：１２７]、[配列ＩＤ番号：１２８]、[配列ＩＤ番号：１２９]、[配列ＩＤ
番号：１３２]、[配列ＩＤ番号：１３３] 、[配列ＩＤ番号：１３４]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１３５]、[配列ＩＤ番号：１３６]、[配列ＩＤ番号：１３７]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１３９]、[配列ＩＤ番号：１４０]、[配列ＩＤ番号：１４２]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１４３]、[配列ＩＤ番号：１４４]、[配列ＩＤ番号：１４５]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１４６]、[配列ＩＤ番号：１４７]、[配列ＩＤ番号：１４８]および[配
列ＩＤ番号：１４９]から成る群から選ばれる配列を含んでいるのが好ましい。 【００６７】 好ましくは核酸分子は、ＣＤ３６タンパク質とこれらの断片とから成る群から
選ばれるポリペプチドを宿主細胞中に発現する。 【００６８】 より好ましくは核酸分子は、前記宿主細胞において自己複製する。 【００６９】 宿主細胞は、核酸分子で形質転換されるのが好ましい。 【００７０】 好ましくは宿主細胞は、ヒト細胞である。 【００７１】 本発明に有利に用いられる宿主細胞には、ヒト細胞心筋細胞、特に左心室細胞
、脂肪細胞、内皮細胞、血管平滑筋細胞、マクロファージ、マクロファージ細胞
系の細胞、末梢単核白血球、および単核白血球細胞系の細胞が含まれるが、これ
らに限定されるわけではない。本発明のスクリーニングアッセイにおいて特に好
ましいものは、マクロファージ、マクロファージ細胞系の細胞、末梢単核白血球
、および単核白血球細胞系の細胞である。 【００７２】 好ましくはモジュレータは、ペプチド、ホスホペプチド、小さい有機分子、小
さい無機分子、抗体、および抗体のエピトープ結合断片から成る群から選ばれる
。 【００７３】 別の好ましい実施形態において、モジュレータは、アンチセンス核酸分子、リ
ボザイム、および三重螺旋核酸分子から成る群から選ばれる。 【００７４】 好ましくはこのモジュレータは、抗―ＣＤ３６抗体である。 【００７５】 このモジュレータは、ＣＤ３６タンパク質を結合する有機分子であるのが好ま
しい。 【００７６】 さらには被験者がヒトであるのが好ましい。 【００７７】 本発明はさらに、[配列ＩＤ番号：１３２]、[配列ＩＤ番号：１３３]、[配列
ＩＤ番号：１３４]、[配列ＩＤ番号：１３５]、[配列ＩＤ番号：１３６]、[配列
ＩＤ番号：１３７]、[配列ＩＤ番号：１３９]、[配列ＩＤ番号：１４０]、[配列
ＩＤ番号：１４２]、[配列ＩＤ番号：１４３]、[配列ＩＤ番号：１４４]、[配列
ＩＤ番号：１４５]、[配列ＩＤ番号：１４６]、[配列ＩＤ番号：１４７]、[配列
ＩＤ番号：１４８]および[配列ＩＤ番号：１４９] から成る群から選ばれる核酸
配列を含む単離された核酸配列をも包含している。 【００７８】 本発明はさらに、[配列ＩＤ番号：５]、[配列ＩＤ番号：１１]、[配列ＩＤ番
号：１７]、[配列ＩＤ番号：２３]、[配列ＩＤ番号：２９]、[配列ＩＤ番号：３
５]、[配列ＩＤ番号：４１]、[配列ＩＤ番号：４７]、[配列ＩＤ番号：５３]、[
配列ＩＤ番号：５９]、[配列ＩＤ番号：６５]、[配列ＩＤ番号：７１]、[配列Ｉ
Ｄ番号：７７]、[配列ＩＤ番号：８３]、[配列ＩＤ番号：８７]、[配列ＩＤ番号
：１６７]、[配列ＩＤ番号：１７１]、[配列ＩＤ番号：１７４]および[配列ＩＤ
番号：１３８] から成る群から選ばれた核酸配列を含む、単離された核酸分子を
も提供する。 【００７９】 本発明はさらに、［配列ＩＤ番号６］、[配列ＩＤ番号：１２]、[配列ＩＤ番
号：１８]、[配列ＩＤ番号：２４]、[配列ＩＤ番号：２９]、[配列ＩＤ番号：３
６]、[配列ＩＤ番号：４２]、[配列ＩＤ番号：４８]、[配列ＩＤ番号：５４]、[
配列ＩＤ番号：６０]、[配列ＩＤ番号：６６]、[配列ＩＤ番号：７２]、[配列Ｉ
Ｄ番号：７８]、[配列ＩＤ番号：８４]、[配列ＩＤ番号：８８]、[配列ＩＤ番号
：１６８]および[配列ＩＤ番号：１４１] から成る群から選ばれるアミノ酸配列
を含むポリペプチドをも包含している。 【００８０】 この発明の別の態様は、ＣＤ３６ｍＲＮＡにハイブリッドするアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを含む単離された核酸配列である。 【００８１】 本発明は、ＣＤ３６ｍＲＮＡにハイブリッドするアンチセンスＲＮＡを発現す
る核酸ベクターを提供する。 【００８２】 本発明はさらに、核酸ベクターを含む宿主細胞であって、前記ベクターが、前
記細胞においてアンチセンスＲＮＡを発現し、このアンチセンスＲＮＡがＣＤ３
６ｍＲＮＡにハイブリッドする宿主細胞をも包含している。 【００８３】 好ましくは宿主細胞はヒト細胞である。 【００８４】 好ましい実施形態において、ヒト細胞は、心筋細胞、好ましくは左心室細胞、
脂肪細胞、内皮細胞、血管平滑筋細胞、マクロファージ、マクロファージ細胞系
の細胞、末梢単核白血球、または単核白血球細胞系の細胞である。 【００８５】 本発明の別の態様は、このような病気のリスクを有すると疑われている個体に
おいて、インシュリン作用および／またはグルコース代謝および／または脂肪酸
代謝および／またはカテコールアミン作用における欠陥と関連した病気の診断方
法であって、Ｃｄ３６遺伝子における突然変異を検出するための検出ステップを
実施するステップを含んでいる方法である。ここにおいて、この突然変異の検出
は、個体におけるインシュリン作用および／またはグルコース代謝および／また
は脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用の欠陥と関連した病気の存在
を示している。 【００８６】 本発明は、哺乳類におけるグルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作用、
およびカテコールアミン作用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上と関連した遺
伝子を同定する方法であって、候補遺伝子が自然発生高血圧ラットのインシュリ
ン抵抗性遺伝子座の染色体位置に位置づけされるかどうかを決定することを含む
方法を提供する。ここにおいて、この遺伝子座への候補遺伝子のマッピングは、
この遺伝子と、グルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作用、およびカテコ
ールアミン作用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上との間の関連を示している
。 【００８７】 本発明の別の態様は、哺乳類におけるグルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュ
リン作用、およびカテコールアミン作用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上と
関連した遺伝子を同定する方法であって、哺乳類ゲノムにおける候補遺伝子の位
置をマッピングして地図位置を与えるステップ、およびこのようにして得られた
地図位置と、自然発生高血圧ラットのインシュリン抵抗性遺伝子座の地図位置と
を比較するステップであって、ここにおいて地図位置の一致が、この遺伝子と、
グルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作用、またはカテコールアミン作用
の代謝プロセスの１つまたはそれ以上との間の関連を示しているステップを含む
方法である。 【００８８】 本発明はさらに、哺乳類におけるグルコース代謝、脂肪酸代謝、およびカテコ
ールアミン活性の代謝プロセスの１つまたはそれ以上と関連した遺伝子を同定す
る方法であって、候補遺伝子が、インシュリン抵抗性遺伝子座１、２、３、およ
び４のうちの１つの染色体位置に位置づけされるかどうかを決定することを含む
方法をも包含する。ここにおいてこれらの遺伝子座のうちの１つへの候補遺伝子
のマッピングは、この遺伝子と、グルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作
用、およびカテコールアミン作用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上との間の
関連を示している。 【００８９】 本発明はまた、哺乳類におけるグルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作
用、およびカテコールアミン作用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上と関連し
た遺伝子を同定する方法であって、哺乳類ゲノムにおける候補遺伝子の位置をマ
ッピングして地図位置を与えるステップ、およびこのようにして得られた地図位
置と、インシュリン抵抗性遺伝子座１、２、３、および４のうちの１つまたはそ
れ以上の地図位置とを比較するステップであって、ここにおいて地図位置の一致
が、この遺伝子と、グルコース代謝、脂肪酸代謝、またはカテコールアミン活性
の代謝プロセスの１つまたはそれ以上との間の関連を示しているステップを含む
方法を提供する。 【００９０】 ここで用いられている「自然発生高血圧ラットのインシュリン抵抗性遺伝子座
（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｌｏｃｕｓ ｏｆ ａ Ｓｐｏｎｔ
ａｎｅｏｕｓｌｙ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ Ｒａｔ）」という用語は、グル
コース代謝または脂肪酸代謝、インシュリン作用またはカテコールアミン作用の
１つまたはそれ以上における欠陥が位置する染色体セグメント、遺伝的連鎖群、
または遺伝子のことを言い、このセグメント、連鎖群、または遺伝子は、各々次
に定義されているインシュリン抵抗性遺伝子座１、２、３、および４を含むがこ
れに限定されない群から選ばれる。例えば自然発生高血圧ラット（ＳＨＲ）に特
徴的なグルコース代謝または脂肪酸代謝、インシュリン作用またはカテコールア
ミン作用の１つまたはそれ以上における欠陥は、ラットゲノムに見られる。 【００９１】 ここで用いられている「インシュリン抵抗性遺伝子座１、２、３、および４」
という用語は、前記のような自然発生高血圧ラットのインシュリン抵抗性遺伝子
座のことを言い、これには、自然発生高血圧ラットおよびヒトを含む哺乳類のイ
ンシュリン抵抗性遺伝子座１、インシュリン抵抗性遺伝子座２、インシュリン抵
抗性遺伝子座３、およびインシュリン抵抗性遺伝子座４、下記のようなこれらの
ラット遺伝子座の同族体が含まれる。 【００９２】 ここで用いられている「インシュリン抵抗性遺伝子座１」という用語は、Ｄ４
Ａｒｂ１３、Ｄ４Ａｅ２、およびＤ４Ｒｔ８マーカー（以後「Ｄ４」という名称
を伴わずに言及される）を含んでいるラットの染色体４のほぼ４センチモルガン
（ｃＭ）にわたっている連鎖ピークを有しており、かつこの連鎖ピークの両側に
約１０ｃＭを包含する、前記のような高血圧ラットのインシュリン抵抗性遺伝子
座であって、この遺伝子座には、グルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作
用、およびカテコールアミン作用における自然発生高血圧ラットの欠陥が位置し
ているもののことを言う。観察された表現型の原因となる遺伝子は、テロメアか
ら離れた方向において、染色体の末端（これは連鎖ピークから２〜３ｃＭである
）と連鎖ピークから約７ｃＭの部位との間に位置していてもよい。「インシュリ
ン抵抗性遺伝子座１」という用語はまた、この遺伝子座がラットゲノムのインシ
ュリン抵抗性遺伝子座１に（例えばシンテニー（ｓｙｎｔｅｎｙ）または核酸配
列の類似性によって）対応している、別の哺乳類における染色体遺伝子座のこと
をも言う。 【００９３】 センチモルガン（ｃＭ）におけるあらゆる測定値に関してここで用いられてい
る「約」および「ほぼ」という用語は、挙げられている数値の上下の１０％幅の
ことを言う。 【００９４】 ここで用いられている「インシュリン抵抗性遺伝子座２」という用語は、Ｄ１
２Ｍｉｔ８とＤ１２Ｍｇｈ１マーカーとの間の、またはこれらを含む染色体１２
のほぼ２０ｃＭにわたる連鎖ピークを有しており、最も強い連鎖が、Ｄ１２Ｍｉ
ｔ８マーカーに近位のこの部位の４ｃＭにあり、かつこの連鎖ピークの両側に１
０ｃＭを包含する前記のような自然発生高血圧ラットのインシュリン抵抗性遺伝
子座であって、この遺伝子座には、グルコース代謝における自然発生高血圧ラッ
トの欠陥が位置しているもののことを言う。この観察された表現型の原因となる
遺伝子は、連鎖ピークの両末端の５ｃＭ以内または２ｃＭ以内にさえ位置してい
てもよい。「インシュリン抵抗性遺伝子座２」という用語はまた、この遺伝子座
がラットゲノムのインシュリン抵抗性遺伝子座２に（例えばシンテニーまたは核
酸配列の類似性によって）対応している、別の哺乳類における染色体遺伝子座の
ことをも言う。 【００９５】 ここで用いられている「インシュリン抵抗性遺伝子座３」という用語は、Ｄ７
Ｃｅｂｒ１７９ｓ７マーカーにおいて連鎖ピークを有し、かつこの連鎖ピークの
両側に１５ｃＭを包含する、ラットの染色体７上の前記のような自然発生高血圧
ラットのインシュリン抵抗性遺伝子座であって、この遺伝子座には、グルコース
代謝における自然発生高血圧ラットの欠陥が位置しているもののことを言う。観
察された表現型の原因となる遺伝子は、この連鎖ピークの両端の１０ｃＭ以内ま
たは５ｃＭ以内にさえ位置していてもよい。「インシュリン抵抗性遺伝子座３」
という用語はまた、この遺伝子座が、ラットゲノムのインシュリン抵抗性遺伝子
座３に（例えばシンテニーまたは核酸配列の類似性によって）対応している、別
の哺乳類における染色体遺伝子座のことをも言う。 【００９６】 ここで用いられている「インシュリン抵抗性遺伝子座４」という用語は、Ｄ１
６Ｍｉｔ３マーカーにおいて連鎖ピークを有し、かつ、この連鎖ピークの両側に
１０ｃＭを包含しているラットの染色体１６上の前記のような自然発生高血圧ラ
ットのインシュリン抵抗性遺伝子座であって、この遺伝子座には、グルコース代
謝における自然発生高血圧ラットの欠陥が位置しているもののことを言う。観察
された表現型の原因となる遺伝子は、この連鎖ピークの両端の５ｃＭ以内または
２ｃＭ以内にさえ位置していてもよい。「インシュリン抵抗性遺伝子座４」とい
う用語はまた、この遺伝子座がラットゲノムのインシュリン抵抗性遺伝子座４に
（例えばシンテニーまたは核酸配列の類似性によって）対応している、別の哺乳
類における染色体遺伝子座のことをも言う。 【００９７】 ここで用いられている「シンテニー」という用語は、進化時間の間ずっと２つ
の集団または種の間に保持される遺伝子の染色体位置のことを言い、従って一方
の集団または種の遺伝子は、他方の集団または種における同族遺伝子のものに対
応する、確立されたマーカーに関連する位置において見られる。 【００９８】 インシュリン抵抗性遺伝子座１、２、３、および４に関してここで用いられて
いる「核酸の類似性」という用語は、少なくとも６０％、好ましくは７０％、よ
り好ましくは８０％の配列の同一性を示す配列のことを言う。 【００９９】 ここで用いられている「染色体位置に位置する」という語句は、候補遺伝子と
マーカーとの間の統計的に有意な連鎖のことを言い、このマーカーは、自然発生
高血圧ラットのインシュリン抵抗性遺伝子座の中にあってもよく、インシュリン
抵抗性遺伝子座１、２、３、または４のうちの１つの中にあってもよく、あるい
は別のマーカーであってもよく、従っておそらくは候補遺伝子およびマーカーは
、互いの１５、好ましくは１０、より好ましくは５、最も好ましくは２センチモ
ルガン（ｃＭ）の距離以内にある。このような結果は、下記のように遺伝的連鎖
解析または放射ハイブリッドマッピングによって得ることができる。「染色体位
置に位置する」という語句はまた、例えば原位置での核酸ハイブリッド形成のよ
うな技術に基づく染色体上の遺伝子の非蓋然論的位置推定であって、染色体上の
遺伝子の物理的位置を示すシグナルが観察されるもののことを言う。 【０１００】 候補遺伝子は、この候補遺伝子とインシュリン抵抗性遺伝子座との間の連鎖解
析が、ｌｏｄスコア３を結果として生じるなら、あるいは放射ハイブリッドパネ
ルを用いたマッピングがｌｏｄスコア４を結果として生じるなら、自然発生高血
圧ラットのインシュリン抵抗性遺伝子座またはインシュリン抵抗性遺伝子座１、
２、３、または４のうちの１つの染色体地図位置に位置すると言われている。マ
ーカーの染色体地図位置と、自然発生高血圧ラットのインシュリン抵抗性遺伝子
座および／または本発明によるインシュリン抵抗性遺伝子座１、２、３、または
４のうちの１つまたはそれ以上のその地図位置とを比較するために、表現型、例
えばグルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作用、またはカテコールアミン
作用における欠陥を、新しい遺伝子マーカー（すなわち候補遺伝子）に位置する
場合、この表現型と候補遺伝子との間の連鎖解析は、第一組の遺伝的交雑または
第一血統分析において、Ｐ値＜１０−４を結果として生じなければならず、第一
組の両方の結果を確認するために実施された第二組の交雑または第二血統分析に
おいて、Ｐ値＜５×１０−２を結果として生じなければならない。 【０１０１】 ここで用いられている「一致する」という用語は、第二遺伝子またはその他の
マーカーに対して候補遺伝子の１５センチモルガン（ｃＭ）の距離内へのマッピ
ングのことを言う。好ましくはこの候補遺伝子は、第二遺伝子または他のマーカ
ーの１０ｃＭ以内、より好ましくは５ｃＭ以内、または２ｃＭ以内にさえ位置決
定される。 【０１０２】 代謝プロセスの欠陥と病気状態との間の関係に関してここで用いられている「
関連」という用語は、この欠陥が病気の発現を引き起こすかまたはそれに寄与し
ているにせよ、病気の結果であるにせよ、あるいはこの病気の原因でもなく、こ
の病気によってもたらされたものでもなく、単にこれに伴っているのが観察され
ているだけであるにせよ（例えばこの欠陥と病気の両方が、共通のメカニズムに
よって互いから独立して生じるにしても）、この欠陥と病気との一致のことを言
う。 【０１０３】 前記方法はさらに、グルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作用、および
カテコールアミン作用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上への候補遺伝子の作
用を測定するステップをも含んでいるのが好ましい。 【０１０４】 さらには、この測定が、遺伝子を含む核酸分子を細胞または生物の中に導入す
るステップ、生物の生物サンプルまたは生物それ自体において、細胞または生物
における、および核酸分子を欠く対照細胞または生物における、グルコース摂取
、非エステル化脂肪酸分泌、インシュリン作用、またはカテコールアミン作用の
１つまたはそれ以上のレベルをアッセイするステップ、およびこれらのレベルを
比較するステップを含むことが好ましい。ここにおいてこれらのレベルにおける
差は、グルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作用、およびカテコールアミ
ン作用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上への遺伝子の作用を示している。 【０１０５】 遺伝子は正常であってもよく、あるいは欠陥があってもよいと考えられる。正
常および欠陥遺伝子のどちらも入手可能な場合、各々がもう一方とは別に細胞ま
たは生物に導入された時に、正常遺伝子と欠陥遺伝子との相対的作用が比較され
、アッセイされ得る。 【０１０６】 遺伝子が導入された細胞または生物および対照細胞または生物におけるグルコ
ース摂取、非エステル化脂肪酸分泌、インシュリン作用、またはカテコールアミ
ン作用の１つまたはそれ以上のレベルに関してここで用いられている「差」とい
う用語は、少なくとも２０％、好ましくは３０％、非常に好ましくは４５％、よ
り好ましくは５０〜７５％、最も好ましくは１００％、あるいはさらには１００
％以上、例えば２倍またはそれ以上、１００，０００倍までの変化のことを言う
。 【０１０７】 特に好ましい実施形態において、細胞または生物は、グルコース代謝、脂肪酸
代謝、インシュリン作用、およびカテコールアミン作用の前記代謝プロセスの１
つまたはそれ以上において欠陥を有する。 【０１０８】 本発明はさらに、グルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作用、またはカ
テコールアミン作用の１つまたはそれ以上と関連する遺伝子の同定方法において
、遺伝子の染色体地図位置と、自然発生高血圧ラットのインシュリン抵抗性遺伝
子座の１つまたはそれ以上の地図位置とを比較することを含む改良をも包含する
。ここにおいてこれらの地図位置間の一致は、この遺伝子と、グルコース代謝、
脂肪酸代謝、およびカテコールアミン活性の代謝プロセスの１つまたはそれ以上
との関連を示している。 【０１０９】 この発明はまた、グルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作用、またはカ
テコールアミン作用の１つまたはそれ以上と関連する遺伝子の同定方法において
、遺伝子の染色体地図位置と、インシュリン抵抗性遺伝子座１、２、３、および
４のうちの１つまたはそれ以上の地図位置とを比較することを含む改良をも包含
する。ここにおいてこれらの地図位置間の一致は、この遺伝子と、グルコース代
謝、脂肪酸代謝、およびカテコールアミン活性の代謝プロセスの１つまたはそれ
以上との間の関連を示している。 【０１１０】 本発明の別の態様は、哺乳類におけるグルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュ
リン作用、およびカテコールアミン作用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上に
おける欠陥と関連する病気の診断方法であって、哺乳類からの生物サンプルを、
自然発生高血圧ラットのインシュリン抵抗性遺伝子座にリンクする遺伝子におけ
る突然変異または多形性の存在についてアッセイすることを含む方法である。こ
こにおいて、遺伝子における突然変異の存在は、病気の存在を示している。 【０１１１】 本発明はまた、哺乳類におけるグルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作
用、およびカテコールアミン作用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上における
欠陥と関連する病気の診断方法であって、哺乳類からの生物サンプルを、インシ
ュリン抵抗性遺伝子座１、２、３、および４のうちの１つにリンクする遺伝子に
おける突然変異または多形性の存在についてアッセイすることを含む方法を提供
する。ここにおいて、遺伝子における突然変異の存在は、病気の存在を示してい
る。 【０１１２】 この突然変異は、Ｉｌ６、Ｎｏｓ３、Ｓｌｃ４α２、Ｐｓｍｃ２、Ｆｇｌ２、
ＰｇｙＩ、Ｃｄ３６、およびＣａｃｎａ２を含む群から選ばれるラット遺伝子、
ＧｎａｉＩ、Ｐｇｙ２、Ｐｇｙ３、Ｓｒｉ、Ｈｇｆ、Ｈｔｒ５ａ、Ｃｄｋ５、Ｄ
ｐｐ６、Ｐｌｋ、Ｔｙｍｓ、Ｆｇｆｒ３、Ａｄｒａ２ｃ、Ｐｐａｒｇ、ＥＲＴＤ
３６３、およびＣｄ３６を含む群から選ばれるマウス遺伝子、またはヒトＩＰＦ
−１およびＣＤ３６に対応する遺伝子、並びに本発明によるインシュリン抵抗性
遺伝子座の染色体地図位置に位置決定されるその他の哺乳類遺伝子の中にあり、
これらの遺伝子は最小でも数百の数になると考えられる。 【０１１３】 好ましくはこの病気は、インシュリン非依存性糖尿病、代謝症候群Ｘ、肥満、
家族性脂質異常高血圧、複合高脂血症（家族性複合高脂血症を含むがこれに限定
されない）、および本態性高血圧を含む群から選ばれる。 【０１１４】 本発明はまた、ＳＨＲラット（染色体４）におけるインシュリン抵抗性遺伝子
座―１に位置する突然変異体または多形性遺伝子、および遺伝子における突然変
異または多形性の発見をベースとしている。従って本発明は次の核酸配列を考察
している。 【０１１５】 ［配列ＩＤ番号５］、[配列ＩＤ番号：１１]、[配列ＩＤ番号：１７]、[配列
ＩＤ番号：２３]、[配列ＩＤ番号：２９]、[配列ＩＤ番号：３５]、[配列ＩＤ番
号：４１]、[配列ＩＤ番号：４７]、[配列ＩＤ番号：５３]、[配列ＩＤ番号：５
９]、[配列ＩＤ番号：６５]、[配列ＩＤ番号：７１]、[配列ＩＤ番号：７７]、[
配列ＩＤ番号：８３]および／または[配列ＩＤ番号：８７] のヌクレオチド配列
の１つまたはそれ以上に示されているヌクレオチド配列を含む単離された核酸で
ある。 【０１１６】 同様にこの発明には、前記核酸配列によってコードされたポリペプチド配列も
包含されている。 【０１１７】 これらの核酸は、本発明によればここに記載されている突然変異を検出するた
めの核酸プローブとして有用である。ここで有用なハイブリッド形成プローブは
、１０〜１１ヌクレオチド（例えば突然変異体ヌクレオチドが中心ヌクレオチド
である場合、突然変異体ヌクレオチドの両側に５ヌクレオチドを包含する配列）
、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０〜４０ヌクレ
オチド程度の小さいものであってもよく、あるいはそれ以上、例えば７５、８０
、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、または１０００ヌ
クレオチドであってもよい。ハイブリッド形成プローブは、突然変異体核酸にハ
イブリッドするが、緊縮条件下に野生型核酸にはハイブリッドされないならば（
下記参照）、あるいはもしこれが核酸のある一定のストレッチにおいて単一のヌ
クレオチド差を識別するならば、有用であろう。 【０１１８】 本発明はまた、哺乳類におけるグルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作
用、およびカテコールアミン作用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上における
欠陥と関連する病気の診断方法であって、哺乳類からの生物サンプルを、インシ
ュリン抵抗性遺伝子座１にリンクする遺伝子における突然変異または多形性の存
在についてアッセイすることを含む方法をも考察している。ここにおいて、遺伝
子における突然変異の存在は、病気の存在を示している。 【０１１９】 好ましくはこの病気は、哺乳類におけるグルコース代謝、脂肪酸代謝、インシ
ュリン作用、およびカテコールアミン作用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上
における欠陥と関連しており、哺乳類からの生物サンプルを、インシュリン抵抗
性遺伝子座１にリンクする遺伝子によってコードされたタンパク質のアミノ酸配
列における改変の存在についてアッセイすることを含んでいる。ここにおいて、
遺伝子によってコードされた改変アミノ酸配列の存在は、病気の存在を示してい
る。 【０１２０】 好ましくはこの病気は、インシュリン非依存性糖尿病、代謝症候群Ｘ、肥満、
家族性脂質異常高血圧、および複合高脂血症（家族性複合高脂血症を含むがこれ
に限定されない）を含む群から選ばれる。 【０１２１】 好ましくは突然変異は、［配列ＩＤ番号８７］のヌクレオチド位置３７８、３
９７、５０７、５２１、５２２、５３３、５５２、５５３、５５４、６０１、６
１９、６２０、６４１、７４２、７９１、および８７１から成る群から選ばれる
。 【０１２２】 好ましくはアミノ酸配列は、［配列ＩＤ番号８７］のヌクレオチド位置３７８
、３９７、５０７、５２１、５２２、５３３、５５２、５５３、５５４、６０１
、６１９、６２０、６４１、７４２、７９１、および８７１から成る群から選ば
れる突然変異によってコードされる。 【０１２３】 ここで用いられている「核酸」という用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡのことを言
い、これは二本鎖または一本鎖であってもよく、線状または円形であってもよい
。本発明において用いられる核酸分子は、線状ＲＮＡまたはＤＮＡ断片、細菌プ
ラスミド、エピソームベクター、人工染色体、およびウイルスまたはレトロウイ
ルス染色体を含む群から選ばれてもよい。 【０１２４】 ここで用いられている「生物」という用語は、細胞生物、例えば原核生物また
は真核生物のことを言う。本発明に用いられる生物は、多細胞生物、例えば前記
のような哺乳類であると考えられる。さらには本発明に用いられる細胞は、真核
細胞、好ましくは哺乳類細胞であると考えられる。 【０１２５】 ここで用いられている「生物サンプル」という用語は、１つの生物まるごと、
またはその組織、細胞、または成分の部分集合のことを言う（例えば体液、これ
には血液、血清、血漿、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜索
血、尿、膣液、および精液が含まれるがこれらに限定されるわけではない）。「
生物サンプル」とはさらに、１つの生物まるごと、またはその組織、細胞、また
は成分の部分集合、またはこれらの１画分または一部分から調製されたホモジネ
ート、溶解産物、または抽出物のことを言う。最後に「生物サンプル」とは、媒
質、例えば細胞成分例えば核酸分子を含む、生物がその中で繁殖された栄養肉汁
またはゲルのことをも言う。 【０１２６】 本発明の核酸分子に関してここで用いられている「導入する」という用語は、
その分子での細胞または生物の形質転換、トランスフェクション、または感染の
ことを言う。 【０１２７】 ここで用いられている「突然変異」という用語は、遺伝子産物の量またはコー
ドされた産物の生物活性の損失または減少、あるいはこれの増加された、あるい
は新規の、または改変された機能を生じる、前記のような遺伝子における欠陥の
ことを言う。このような突然変異は、単一または多塩基置換、挿入、または欠失
、あるいはまた、これが正常に存在する位置以外の染色体位置への遺伝子の転座
を含むこともある。 【０１２８】 ＣＤ３６遺伝子産物における「減少」とは、ここに開示されているいくつかの
アッセイの１つによって測定された場合、ＣＤ３６遺伝子産物（ＣＤ３６タンパ
ク質）の少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％、および
９８〜１００％もの減少のことを言う。 【０１２９】 ここで用いられている「多形性」という用語は、１つの集団の大多数のメンバ
ー、あるいはまた少数派のメンバーにおいて存在することがある遺伝子の核酸配
列の対立遺伝子変異型のことを言う。多形性はサイレント（すなわちアミノ酸置
換またはその他の既知の対立遺伝子変異型に対して遺伝子調節における変化を結
果として生じないもの）であってもよく、あるいは異なるアミノ酸をコードして
もよく、あるいはその他の対立遺伝子変異型に対して遺伝子調節の変化を結果と
して生じてもよい。 【０１３０】 前記方法に従って同定された遺伝子は、薬剤スクリーニングアッセイにおける
標的として用いることができると考えられる。ここにおいて、試験される薬剤は
、インシュリン抵抗性遺伝子座にリンクされている遺伝子の活性の調節を通して
、グルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作用、およびカテコールアミン作
用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上の候補モジュレータである。前記候補薬
剤の存在下におけるこのような遺伝子の活性の変化は、この薬剤が、グルコース
代謝、脂肪酸代謝、インシュリン作用、およびカテコールアミン作用の代謝プロ
セスの１つまたはそれ以上の効果的モジュレータであり、これらのプロセスの１
つまたはそれ以上の崩壊または機能異常に関連した病気の治療に用いることがで
きることを示していると予想される。特にこのような病気のモデルになる動物に
おけるこのような物質の試験、および病気関連の指標（例えばグルコース摂取、
非エステル化脂肪酸分泌、インシュリン作用、またはカテコールアミン作用）に
おける改良についての動物のモニターであり、ここにおいて、候補薬剤の不存在
に対しての候補薬剤の存在下におけるこのような指標の改良は、薬剤の効率の指
標となるものである。このようなアッセイにおいて特に有利であると考えられて
いる標的遺伝子は、次のものを含む群から選ばれてもよい。すなわち、ラットＩ
ｌ６、Ｎｏｓ３、Ｓｌｃ４α２、Ｐｓｍｃ２、Ｆｇｌ２、ＰｇｙＩ、Ｃａｃｎａ
２、およびＣｄ３６、マウスＧｎａｉＩ、Ｐｇｙ２、Ｐｇｙ３、Ｓｒｉ、Ｈｇｆ
、Ｈｔｒ５ａ、Ｃｄｋ５、Ｄｐｐ６、Ｐｌｋ、Ｔｙｍｓ、Ｆｇｆｒ３、Ａｄｒａ
２ｃ、Ｐｐａｒｇ、およびＥＲＴＤ３６３、およびヒトＩＰＦ−ｌおよびＣＤ３
６である。あるいはまた前記方法によって同定され得るその他の遺伝子も用いる
ことができる。 【０１３１】 本発明はさらに、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８１]、[配列
ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８７]、[配列
ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９２]、[配列
ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９５]、[配列
ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９８]、[配列
ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０１]、[配列
ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]、[配列ＩＤ番号：２０４]、[配列
ＩＤ番号：２０５]、[配列ＩＤ番号：２０７]および[配列ＩＤ番号：２０９] か
ら成る群から選ばれる配列を含む単離された核酸分子をも提供する。 【０１３２】 本発明はまた、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８１]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８７]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９２]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９５]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９８]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０１]、[配列Ｉ
Ｄ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]、[配列ＩＤ番号：２０４]、[配列Ｉ
Ｄ番号：２０５]、[配列ＩＤ番号：２０７]および[配列ＩＤ番号：２０９] に示
されている突然変異の１つまたはそれ以上を有する突然変異体ＣＤ３６遺伝子を
も包含する。 【０１３３】 本発明はさらに、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８１]、[配列
ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８７]、[配列
ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９２]、[配列
ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９５]、[配列
ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９８]、[配列
ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０１]、[配列
ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]、[配列ＩＤ番号：２０４]、[配列
ＩＤ番号：２０５]、[配列ＩＤ番号：２０７]および[配列ＩＤ番号：２０９] に
よってコードされた突然変異の１つまたはそれ以上を有する突然変異体ＣＤ３６
タンパク質をも包含する。 【０１３４】 本発明はさらに、生物サンプルにおけるＣＤ３６タンパク質欠失を検出する方
法であって、ＣＤ３６遺伝子における突然変異の検出ステップを含む方法をも提
供する。前記突然変異が、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８１]、
[配列ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８７]、
[配列ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９２]、
[配列ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９５]、
[配列ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９８]、
[配列ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０１]、
[配列ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]、[配列ＩＤ番号：２０４]、
[配列ＩＤ番号：２０５]、[配列ＩＤ番号：２０７]および[配列ＩＤ番号：２０
９] から成る群から選ばれる配列に対応すると考えられる。 【０１３５】 本発明は、個体のヒトＣＤ３６遺伝子における突然変異の存在または不存在を
決定する方法であって、個体の生物サンプルと、長さが少なくとも１０ヌクレオ
チドのプローブであって、このプローブが次のものから成る群から選ばれる配列
において提示されている突然変異に対応する突然変異を含むものとを接触させる
ステップと、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８１]、[配列ＩＤ番
号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８７]、[配列ＩＤ番
号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９２]、[配列ＩＤ番
号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９５]、[配列ＩＤ番
号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９８]、[配列ＩＤ番
号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０１]、[配列ＩＤ番
号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]、 [配列ＩＤ番号：２０５]、[配列ＩＤ
番号：２０７]および[配列ＩＤ番号：２０９] サンプル中における突然変異の存
在または不存在を検出するステップとを含む方法をも包含する。 【０１３６】 このような突然変異の存在または不存在は、ここに開示されている感染病に対
して保護を与える遺伝的状態を示し得る。 【０１３７】 本発明は、哺乳類への投与のための組織のスクリーニング方法であって、これ
によってこの組織のサンプルが、ＣＤ３６遺伝子における突然変異について試験
される方法を包含する。この組織サンプルは、前記突然変異の存在または不存在
に基づいて標識される。 【０１３８】 好ましくは標識された組織は保存される。 【０１３９】 より好ましくはこの組織は、血液、または血小板を含む血液産物である。 【０１４０】 前記突然変異は、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８１]、[配列
ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８７]、[配列
ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９２]、[配列
ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９５]、[配列
ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９８]、[配列
ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０１]、[配列
ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]および[配列ＩＤ番号：２０4] か
ら成る群から選ばれる配列に対応するのが好ましい。 【０１４１】 本発明はさらに、ドナーと受容体とをマッチさせる方法をも包含する。ドナー
または受容体からの生物サンプルは、ＣＤ３６遺伝子における突然変異であって
、前記突然変異がＣＤ３６遺伝子産物の欠失を結果として生じるものについて試
験される。ドナーと受容体とをマッチさせ、これによって、もしもこの受容体が
ＣＤ３６遺伝子産物の欠失を結果として生じる突然変異を有しているならば、同
様にＣＤ３６遺伝子産物の欠失を有するドナーが選ばれる。 【０１４２】 好ましくは生物サンプルは血液である。 【０１４３】 より好ましくは突然変異は、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８
１]、[配列ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８
７]、[配列ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９
２]、[配列ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９
５]、[配列ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９
８]、[配列ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０
１]、[配列ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]および[配列ＩＤ番号：
２０４] から成る群から選ばれる配列に対応する。 【０１４４】 本発明の別の態様は、ＣＤ３６遺伝子における突然変異について患者を試験す
ることによって寄生体による感染への患者の抵抗性を測定する方法であって、こ
の突然変異が寄生体による感染への抵抗性を示すものである方法である。 【０１４５】 好ましくはこの寄生体は、熱帯マラリア原虫である。 【０１４６】 より好ましくは突然変異は、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８
１]、[配列ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８
７]、[配列ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９
２]、[配列ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９
５]、[配列ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９
８]、[配列ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０
１]、[配列ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]、および[配列ＩＤ番号
：２０４] から成る群から選ばれる配列に対応する。 【０１４７】 本発明はさらに、寄生体感染の治療方法をも提供する。ＣＤ３６遺伝子発現の
阻害剤を含む製薬組成物は、これを必要としている患者に投与される。 【０１４８】 好ましくはこの阻害剤は、ＣＤ３６ｍＲＮＡにハイブリッドするアンチセンス
オリゴヌクレオチドである。 【０１４９】 感染を引き起こす寄生体は熱帯マラリア原虫であるのが好ましい。 【０１５０】 本発明はさらに、哺乳類におけるインシュリン作用および／またはグルコース
代謝および／または脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用における欠
陥に関連した病気を診断する方法をも包含する。ＣＤ３６遺伝子における突然変
異が検出され、これによって前記突然変異は、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列
ＩＤ番号：１８１]、[配列ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列
ＩＤ番号：１８７]、[配列ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列
ＩＤ番号：１９２]、[配列ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列
ＩＤ番号：１９５]、[配列ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列
ＩＤ番号：１９８]、[配列ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列
ＩＤ番号：２０１]、[配列ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]および[
配列ＩＤ番号：２０４] から成る群から選ばれる配列に対応する。 【０１５１】 好ましくはこの病気は、インシュリン抵抗性、耐糖能異常、２型真性糖尿病、
複合高脂血症、本態性高血圧、心筋症、および冠状心臓病から成る群から選ばれ
る。 【０１５２】 本発明はさらに、ＣＤ３６遺伝子における突然変異を有すると決定された被験
者におけるインシュリン作用および／またはグルコース代謝および／または脂肪
酸代謝および／またはカテコールアミン作用の欠陥に関連した病気の治療方法を
も提供する。この方法は、ＣＤ３６活性を増加させるモジュレータの投与を提供
する。この突然変異の結果として、ＣＤ３６遺伝子産物の欠失を生じ、これは［
配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８１]、[配列ＩＤ番号：１８３]、[
配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８７]、[配列ＩＤ番号：１９０]、[
配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９２]、[配列ＩＤ番号：１９３]、[
配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９５]、[配列ＩＤ番号：１９６]、[
配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９８]、[配列ＩＤ番号：１９９]、[
配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０１]、[配列ＩＤ番号：２０２]、[
配列ＩＤ番号：２０３]および[配列ＩＤ番号：２０４] から成る群から選ばれる
配列に対応する。 【０１５３】 好ましくはモジュレータはポリペプチドである。 【０１５４】 より好ましくはこのポリペプチドは、ＣＤ３６タンパク質とＣＤ３６ペプチド
とから成る群から選ばれる。 【０１５５】 さらにより好ましくは、このポリペプチドはヒトのものである。 【０１５６】 このポリペプチドは、［配列ＩＤ番号１０１］、[配列ＩＤ番号：１０２]、[
配列ＩＤ番号：１０３]、[配列ＩＤ番号：１０４]、[配列ＩＤ番号：１０５]、[
配列ＩＤ番号：１０６]、[配列ＩＤ番号：１０７]、[配列ＩＤ番号：１０８]、[
配列ＩＤ番号：１０９]、[配列ＩＤ番号：１１０]、[配列ＩＤ番号：１１１]、[
配列ＩＤ番号：１１２]、[配列ＩＤ番号：１１３]、[配列ＩＤ番号：１１４]、[
配列ＩＤ番号：１１５]、[配列ＩＤ番号：１１６]、[配列ＩＤ番号：１１７]、[
配列ＩＤ番号：１１８]、[配列ＩＤ番号：１１９]、[配列ＩＤ番号：１２０]、[
配列ＩＤ番号：１２１]、[配列ＩＤ番号：１２２]、[配列ＩＤ番号：１２３]、[
配列ＩＤ番号：１２４]、[配列ＩＤ番号：１２５]、[配列ＩＤ番号：１２６]、[
配列ＩＤ番号：１２７]、[配列ＩＤ番号：１２８]および[配列ＩＤ番号：１２９
] から成る群から選ばれる核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含むの
が好ましい。 【０１５７】 さらにはこのポリペプチドは、組換え核酸分子によって発現されるのが好まし
い。 【０１５８】 さらにより好ましくは、組換え核酸分子は[配列ＩＤ番号：１０１]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１０２]、[配列ＩＤ番号：１０３]、[配列ＩＤ番号：１０４]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１０５]、[配列ＩＤ番号：１０６]、[配列ＩＤ番号：１０７]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１０８]、[配列ＩＤ番号：１０９]、[配列ＩＤ番号：１１０]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１１１]、[配列ＩＤ番号：１１２]、[配列ＩＤ番号：１１３]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１１４]、[配列ＩＤ番号：１１５]、[配列ＩＤ番号：１１６]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１１７]、[配列ＩＤ番号：１１８]、[配列ＩＤ番号：１１９]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１２０]、[配列ＩＤ番号：１２１]、[配列ＩＤ番号：１２２]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１２３]、[配列ＩＤ番号：１２４]、[配列ＩＤ番号：１２５]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１２６]、[配列ＩＤ番号：１２７]、[配列ＩＤ番号：１２８]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１２９]、[配列ＩＤ番号：１３２]、[配列ＩＤ番号：１３３]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１３４]、[配列ＩＤ番号：１３５]、[配列ＩＤ番号：１３６]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１３７]、[配列ＩＤ番号：１３９]、[配列ＩＤ番号：１４０]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１４２]、[配列ＩＤ番号：１４３]、[配列ＩＤ番号：１４４]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１４５]、[配列ＩＤ番号：１４６]、[配列ＩＤ番号：１４７]、[配列Ｉ
Ｄ番号：１４８]および[配列ＩＤ番号：１４９] から成る群から選ばれる配列を
含んでいる。 【０１５９】 さらにこのモジュレータは、核酸分子であるのが好ましい。 【０１６０】 さらにより好ましくは、この核酸分子は［配列ＩＤ番号１０１］、[配列ＩＤ
番号：１０２]、[配列ＩＤ番号：１０３]、[配列ＩＤ番号：１０４]、[配列ＩＤ
番号：１０５]、[配列ＩＤ番号：１０６]、[配列ＩＤ番号：１０７]、[配列ＩＤ
番号：１０８]、[配列ＩＤ番号：１０９]、[配列ＩＤ番号：１１０]、[配列ＩＤ
番号：１１１]、[配列ＩＤ番号：１１２]、[配列ＩＤ番号：１１３]、[配列ＩＤ
番号：１１４]、[配列ＩＤ番号：１１５]、[配列ＩＤ番号：１１６]、[配列ＩＤ
番号：１１７]、[配列ＩＤ番号：１１８]、[配列ＩＤ番号：１１９]、[配列ＩＤ
番号：１２０]、[配列ＩＤ番号：１２１]、[配列ＩＤ番号：１２２]、[配列ＩＤ
番号：１２３]、[配列ＩＤ番号：１２４]、[配列ＩＤ番号：１２５]、[配列ＩＤ
番号：１２６]、[配列ＩＤ番号：１２７]、[配列ＩＤ番号：１２８]、[配列ＩＤ
番号：１２９]、[配列ＩＤ番号：１３２]、[配列ＩＤ番号：１３３]、[配列ＩＤ
番号：１３４]、[配列ＩＤ番号：１３５]、[配列ＩＤ番号：１３６]、[配列ＩＤ
番号：１３７]、[配列ＩＤ番号：１３９]、[配列ＩＤ番号：１４０]、[配列ＩＤ
番号：１４２]、[配列ＩＤ番号：１４３]、[配列ＩＤ番号：１４４]、[配列ＩＤ
番号：１４５]、[配列ＩＤ番号：１４６]、[配列ＩＤ番号：１４７]、[配列ＩＤ
番号：１４８]および[配列ＩＤ番号：１４９]から成る群から選ばれる配列を含
んでいる。 【０１６１】 さらにこの核酸分子は、ＣＤ３６タンパク質とこれの断片とから成る群から選
ばれるポリペプチドを宿主細胞中に発現するのが好ましい。 【０１６２】 この核酸分子は、前記宿主細胞中において自己複製されるのが好ましい。 【０１６３】 宿主細胞が、前記核酸分子で形質転換されるのがさらにより好ましい。 【０１６４】 好ましくはこのモジュレータは、ペプチド、ホスホペプチド、ポリペプチド、
多糖類、小さい有機分子、小さい無機分子、抗体、および抗体のエピトープ結合
断片から成る群から選ばれる。ここで用いられているようなペプチド、ポリペプ
チド、多糖類、小さい無機分子、および小さい有機分子は、２００ダルトンより
も大きく、約２，５００ダルトンよりも小さく、好ましくは５００〜１，０００
ダルトンの分子量を有していてもよい。ペプチドは、長さが２〜１００残基、よ
り有利には長さが４〜４０残基、長さが８〜２０残基であってさえよく、Ｄ−あ
るいはＬ−アミノ酸（または同等のもの）を含んでいてもよい。 【０１６５】 さらにはこのモジュレータは、アンチセンス核酸分子、リボザイム、および三
重螺旋核酸分子から成る群から選ばれるのが好ましい。 【０１６６】 本発明はまた、寄生体感染を治療するための薬剤をスクリーニングする方法で
あって、前記感染を引き起こす寄生体が、感染を発生させるためにはリガンドと
してＣＤ３６タンパク質を必要とする方法をも包含する。この方法は、ＣＤ３６
遺伝子発現の阻害のための候補薬剤を試験するステップを含んでいる。 【０１６７】 好ましくは寄生体は、熱帯マラリア原虫である。 【０１６８】 本発明はさらに、寄生体感染を治療するための薬剤をスクリーニングする方法
であって、前記感染を引き起こす寄生体が、感染を発生させるためにはリガンド
としてＣＤ３６タンパク質を必要とする方法をも包含する。この方法は、ＣＤ３
６遺伝子の正の調節遺伝子の阻害のための候補薬剤を試験するステップを含んで
いる。 【０１６９】 好ましくは正の調節遺伝子はｐｐｒ−γである。 【０１７０】 より好ましくはこの寄生体は、熱帯マラリア原虫である。 【０１７１】 本発明のその他の特徴および利点は、次の実施形態の説明およびこれらの図面
において、および特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。 【０１７２】 （発明の説明） 本発明は、１つまたは複数の遺伝子の突然変異または変異型対立遺伝子がイン
シュリン作用および脂肪酸代謝とリンクされている４つの遺伝的子座のラットモ
デルにおける発見に基づいている。これら４つのうちの１つまたはそれ以上は、
これらの病気に関わっている遺伝子の同定のためのマーカーとして有用である。
本発明はまた、ラットＣＤ３６遺伝子（ラット脂肪（ＦＡＴ）遺伝子）が、イン
シュリン抵抗性遺伝子座１（染色体４）に位置するという発見（この位置推定は
ここにおいて初めて記載される）、およびＳＨＲラットのＣｄ３６遺伝子が少な
くとも１８の突然変異であって、１１が対応位置において野生型アミノ酸以外の
アミノ酸をコードしており、これらの突然変異がＳＨＲ表現型にリンクされてい
るという発見に基づいている。Ｃｄ３６遺伝子の位置を示すインシュリン抵抗性
遺伝子座１の放射ハイブリッド地図が、図１に示されている。さらにはヒトＣＤ
３６遺伝子における突然変異は、インシュリン作用および脂肪酸代謝における欠
陥と相関関係があることが発見された。これらのヒトＣＤ３６配列変異型、野生
型核酸配列、およびこれらのそれぞれのコードされたポリペプチド配列は、薬剤
標的用の潜在的候補として、病気診断において、診断手順において、および究極
的には病気の作用を制御することを目指す治療的療法において有用である。本発
明はまた、ＳＨＲラットにおけるＣｄ３６遺伝子転写物が、対応する野生型ｍＲ
ＮＡ（野生型ラットＣｄ３６ｃＤＮＡ配列については、ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番
号Ｌ1９６５８または［配列ＩＤ番号８５］参照のこと；野生型ヒトＣＤ３６遺
伝子配列については、ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号Ｇ１８３２４、Ｚ３２７５３、
Ｚ３２７５９、Ｚ３２７５７、Ｚ３２７５６、Ｚ３２７５５、Ｚ３２７５４、Ｚ
３２７６４、Ｚ３２７６３、Ｚ３２７６２、Ｚ３２７６１、Ｚ３２７６０、Ｚ３
４７５２、Ｚ３２７５８、Ｚ３２７６５、ＡＡ３６０６７４、ＡＡ３４２３５３
、ＡＡ３０２８２３、Ｌ０６８４９、Ｓ６７５３２、Ｓ６７５３２、Ｓ６７０４
４、Ｚ３２７７０、Ｚ２２９２４、Ｚ２２５５５、Ｔ２８５８５、Ｍ９８３９９
、Ｍ９８３９８、Ｍ２４７９５、およびＬ０６８５０、またはそれぞれ配列ＩＤ
番号１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０
９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１
８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２
７、１２８、および１２９参照のこと）に対して配列のバリエーションおよびサ
イズの違いを示し、従って異常なサイズのｍＲＮＡまたはここに記載された配列
変異型を有するｍＲＮＡは、欠陥インシュリン作用または脂肪酸代謝を特徴とす
る表現型の診断マーカーであるという発見に基づいている。本発明はまた、ＣＤ
３６遺伝子突然変異といくつかのヒト集団に存在するＣＤ３６欠失との相関関係
に基づいており、従ってこのような突然変異の検出は、生物組織サンプル、例え
ば血液または血液産物をスクリーニングすることにおいて有用である。本発明は
また、あるいくつかの寄生体、例えばマラリアを引き起こす寄生体による感染に
対する抵抗性の指標としてＣＤ３６遺伝子突然変異を検出することに基づいてい
る。 【０１７３】 実施例１は、遺伝子のマッピングおよびその地図位置と、ＳＨＲにおけるイン
シュリン抵抗性遺伝子座のうちの１つの位置との比較について記載している。実
施例２は、遺伝子が、ラットにおけるインシュリン抵抗性遺伝子座の染色体位置
に位置するという決定について記載している。実施例３は、インシュリン抵抗性
遺伝子座リンクの遺伝子における突然変異についての患者のスクリーニングを示
している。実施例４は、ＣＤ３６遺伝子における突然変異についての患者のスク
リーニングを示している。実施例５は、ＣＤ３６配列を含む核酸プローブにハイ
ブリッドするｍＲＮＡ分子におけるサイズの多形性についての、患者からの生物
サンプルのスクリーニングを示している。実施例６は、ラットモデルにおける候
補治療薬の本発明によるｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを示している。 【０１７４】 Ａ．インシュリン抵抗性遺伝子座 グルコースおよび脂肪酸の代謝における欠陥は、自然発生高血圧ラット（ＳＨ
Ｒ）を用いて、ラットゲノムにおける４つの遺伝子座にリンクされた。これらの
４つの遺伝子座は、ここで初めて詳細に記載および定義されている。ＳＨＲラッ
トは、本態性高血圧の広く用いられている動物モデルであり（Ｙａｍｏｒｉ，１
９８４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，Ｖｏｌ．４．Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｈｙ ｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ，ｅｄ．ｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，ＮＹ，ｐｐ．２２４−２３９）、これは、グルコー
ス代謝に対するインシュリン作用における全体的な欠陥を有しており（Ｒａｏ，
１９９３，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４２：１３６４−１３７１；Ｒｅａｖｅｎら、１
９８９ｃ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３８：１１５５−１１６０；Ｐａｔｅｒｎｏｓｔ
ｒｏ，１９９５，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，３０：２０５−２１１；Ｃ
ｈｉａｐｐｅ ｄｅ Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ，１９８８，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，
３７：３１８−３２２）、非高血圧ラットとの遺伝的交雑において、脂肪細胞に
おける脂肪分解に対する低下したカテコールアミン作用を示す（Ｒｅａｖｅｎら
、１９８９ｃ、上記；Ｃｈｉａｐｐｅ ｄｅ Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ，１９８８、
上記）。自然発生高血圧、脂肪異常血症、インシュリン抵抗性、高インシュリン
血症、および増加腹部脂肪はすべて、ＳＨＲモデルによって示され、これらは代
謝症候群Ｘの決定的特徴である。従ってＳＨＲは、これのヒトの状態のモデルに
なり得るものであり、ＳＨＲにおける欠陥インシュリンおよびカテコールアミン
作用についての遺伝子の同定は、ヒト代謝症候群Ｘおよび関連状態、例えば２型
糖尿病および複合高脂血症（家族性高脂血症を含むがこれに限定されない）にお
ける遺伝子同定を容易にし得る。 【０１７５】 遺伝的および統計的分析 自然発生的高血圧ラットにおけるグルコース代謝、脂肪酸代謝、インシュリン
作用、およびカテコールアミン作用の代謝プロセスの１つまたはそれ以上におけ
る欠陥の基礎となる遺伝子の染色体位置を決定するために、これらの欠陥を発現
しているＳＨＲ株と、これらの欠陥を示していない対照株との間に実験交雑が行
われた。これらの実験において、本発明のインシュリン抵抗性遺伝子座が特徴決
定され、対照株は、ラットのＷｉｓｔａｒ ＫｙｏｔｏおよびＢｒｏｗｎ Ｎｏ
ｒｗａｙ株であった。但しその他の対照株も同様に効果的であったであろうと予
測される。実際に、その他の株も、特許請求されている方法によれば有用である
。これらの交配から生じた子孫を分離する際、グルコース代謝、脂肪酸代謝、イ
ンシュリン作用、およびカテコールアミン作用の代謝プロセスの測定が、下記の
ように実施された。子孫分離におけるこれらの測定は、連鎖研究の表現型の特徴
決定段階を構成していた。評点された子孫は、２種類の交雑のうちの１つから生
じたものである。すなわち、Ｆ１個体は、姉妹細胞（「Ｆ２交雑」）あるいは親
対照株（戻し交雑）の動物に交配された。 【０１７６】 これらの欠陥代謝プロセスの基礎となる遺伝子の染色体位置を決定するために
、ＤＮＡを、これらの分離子孫世代における動物の各々の肝臓または脾臓から抽
出した。ついでこれらの動物のＤＮＡについて、ゲノムにおける多遺伝マーカー
を用いて遺伝子型を決定した。マーカーの分布は、統計分析により、ラットゲノ
ムの染色体上のどの点でもこれらの欠陥代謝プロセスの基礎となる遺伝子への連
鎖を検出するのに十分な密度を有し、これによってすべての測定された表現型に
対するすべての遺伝マーカーについて連鎖の統計学的テストが実施され得るよう
なものである。この統計分析は、一般に遺伝的連鎖および本発明のマッピング方
法に適用し得るが、これは次のように簡単に記載される。 【０１７７】 連鎖についてテストするために、各遺伝子型綱における動物群間の代謝表現型
の差についてテストする分散の統計分析（ＡＮＯＶＡ）を最初に用いた。例えば
ＳＨＲ株からの特定の遺伝マーカーの２つの対立遺伝子を受け継いだＦ２動物は
、対照株から２つの対立遺伝子を受け継いだすべてのＦ２動物または両方の株の
１つを受け継いだ動物と、表現型が比較された。ＡＮＯＶＡテストは、この結果
の有意性を測定した。本発明により実施された統計テストに当てはまることであ
るが、有意な連鎖を示すために、１つの交雑において０．０００１未満の独立し
たＰ値が選ばれた。０．０５未満の確認的Ｐ値（すなわち第一交雑結果を確認す
るために実施された、第一交雑と同一の第二交雑から得られた値）は、以前の独
立した実験交雑に対して連鎖を示したある一定の遺伝マーカーへの連鎖を支持す
る証拠を与えた。ついでＡＮＯＶＡテストは、コンピュータプログラム、例えば
Ｍａｐｍａｋｅｒ／ＱＴＬを用いた多点分析まで拡大された。このソフトウエア
パッケージは一般に、次の点において連鎖解析および遺伝子マッピングにおいて
有用である。すなわちこれによって、マーカー間の間隔が、欠陥代謝プロセスへ
の連鎖について評価され、ｌｏｄスコアの計算が可能になる。これは、連鎖強度
の普通に用いられている測定値であり、遺伝的連鎖のためのオッズ比の可能性と
して表わされる。 【０１７８】 本発明によれば、標準的連鎖解析（下記参照）によってインシュリン抵抗性遺
伝子座に候補遺伝子をマッピングする上で、ｌｏｄスコア３は、この候補遺伝子
と既にインシュリン抵抗性遺伝子座に位置されているマーカーとが有意にリンク
されている証拠として考えられる。下記のおいておよび実施例１に記載されてい
るように、その代わりに放射ハイブリッドパネルによるマッピングが行われる場
合、ｌｏｄスコア４が得られたら、連鎖が推定される。 【０１７９】 前記のもののような遺伝的交雑および統計分析は、同じかまたは異なる設計の
どんな数の実験に対して繰替えされてもよい。これらには、同じかまたは異なる
株の組み合わせを用いることができる。種々の親株が用いられる時、種々の遺伝
子マーカーへの連鎖が証明されるであろうが、その理由は、種々の遺伝的多形性
が存在するか、および／または株特異的に特徴決定されており、ある一定のマー
カーへの連鎖解析を実施し得るということは、その遺伝子座における多形性の有
効性によるからである。しかしながら同じ染色体領域への連鎖は、用いるために
選ばれた親株に応じてこの領域内の異なるマーカーに位置する連鎖のピークを有
しているとしても、位置決定されるある一定の形質または遺伝子について証明さ
れるべきである。例えば種々の株の組み合わせを用いてインシュリン抵抗性遺伝
子座に位置決定されるＳＨＲ遺伝子は、たとえ種々の株の組み合わせまたは種々
の交雑における特定の染色体セグメント上に検出された基礎となる１つまたは複
数のＳＨＲ遺伝子が同じであっても、同じ染色体セグメント上の異なる遺伝マー
カーへのピーク連鎖を示していることがある。 【０１８０】 １つの形質が１つまたは１つ以上のマーカーにリンクされていることが発見さ
れたにせよ、前記のように実施され、分析された交雑は、基礎となっている１つ
または複数の遺伝子の可能性のある位置を示す。１つの遺伝子の位置推定につい
ての確信は、特定の表現型と特定の染色体セグメントとの間に連鎖が示されてい
る交雑の数と共に高まり、各々の実験交雑における連鎖強度と共に高くなる。 【０１８１】 インシュリン抵抗性遺伝子座１、２、３、および４ インシュリン抵抗性遺伝子座１は、インシュリン作用の調節が位置決定する染
色体４上の１つの部位である。これは、３つの染色体マーカーに連鎖されている
ことが非常に確実である（Ｄ４Ａｒｂｌ３、Ｄ４Ａｅ２、およびＤ４Ｒｔ８であ
り、これらすべては以後Ｄ４という名称を伴わずに言及される）。共に連鎖ピー
クを表わすこれらのマーカーは、互いに４センチモルガン（ｃＭ）以内にある。
図２Ａは、ＳＨＲおよびＷｉｓｔａｒ Ｋｙｏｔｏラットがそれぞれ突然変異体
および対照親（Ｆ０）株として用いられているＦ２交雑において、グルコース代
謝および脂肪酸代謝における欠陥のＡｒｂｌ３およびＡｅ２マーカーへの連鎖の
グラフ図を示している。このグラフでは、ｌｏｄスコアが染色体地図位置に対し
てプロットされており、このグラフは、ＭＡＰＭＡＫＥＲ−ＱＴＬプログラム（
Ｐａｔｅｒｓｏｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３５：７２１−７２６；ｃＭ
、センチモルガン）を用いて生成された。図２Ｂは、その代わりにＳＨＲおよび
Ｗｉｓｔａｒ Ｋｙｏｔｏ親株を再びＳ用いた戻し交雑実験において証明されて
いる、グルコース摂取における欠陥のこれらのマーカーへの連鎖のグラフ図であ
る。 【０１８２】 インシュリン抵抗性遺伝子座１と関連する遺伝子は、この領域の両末端の１０
ｃＭ以内に位置決定されると考えられる。しかしながらＡｅ２マーカーは、この
染色体の末端の２〜３ｃＭ以内に位置すると考えられるので、テロメアに隣接す
る配列は、インシュリン抵抗性遺伝子座１の遠位境界を表す。インシュリン抵抗
性遺伝子座１にリンクされる遺伝子は、動原体の方向において連鎖ピークの７ｃ
Ｍ内に位置し、５ｃＭ以内の可能性もあり、あるいは２ｃＭ以内にさえ位置して
いるようである。Ａｅ２は、劣性的に制御するように見える、インクリメンタル
なグルコース摂取に強力にリンクされている。染色体４のこの領域も。非エステ
ル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）のイソプレテレノール媒介分泌にリンクされており、実
際、ＳＨＲにおける脂肪細胞脂肪分解への欠陥カテコールアミン作用の主な決定
因子は、この遺伝子座に位置する。インシュリン抵抗性遺伝子座１は、インクリ
メンタルなグルコース摂取における総表現型分散の１１％〜１５％、インクリメ
ンタルなＮＥＦＡ分泌における総表現型分散の４７％を占めている。これらの形
質の遺伝率は、４８％〜７０％であると計算された。 【０１８３】 インシュリンとイソプロテレノール（すなわちベータ―アドレナリン生産アゴ
ニスト）との両方の作用における欠陥への染色体４上の一致した連鎖は、遺伝子
欠陥がグルコースと脂肪酸代謝との両方を制御する経路に作用する可能性を示唆
している。いくつかの興味深い候補が、直接あるいはシンテニーによって、染色
体４のこの領域に位置する。これには、内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ；
Ｈｕｂｎｅｒら、１９９５、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ，６：７５８−７５９）、
Ｌ型カルシウムチャンネルのサブユニット２Ａ（Ｂｅｃｋｅｒｓら、１９９４、 Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ，２３：６８５−６９０）、ａ２ｃ型アドレナリン生産受容体
（Ｒｉｅｓｓら、１９９４、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １９：２９８−３０２）、お
よび電圧ゲートカリウムチャンネルＫＣＮＤ２（Ｋｌｏｃｋｅら、１９９３、Ｇ ｅｎｏｍｉｃｓ ， １８：５６８−５７４）が含まれる。ｅＮＯＳは、この点に
関して特に興味深いが、それは、ｅＮＯＳ機能がＳＨＲにおいて乱されており（
Ｄｏｈｉら、１９９６、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２８：７３２−７３７）、
ＮＯは血管においてインシュリン作用を媒介し（Ｓｃｈｅｒｒｅｒ，１９９４， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ，９４：２５１１−２５１５）、ｅＮＯＳノック
アウトマウスは高血圧である（Ｈｕａｎｇら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ，３７７
：２３９−２４２）からである。 【０１８４】 インシュリン抵抗性遺伝子座２は、染色体１２上に見られる。この遺伝子座に
は、増加のグルコース摂取および最大／基礎グルコース摂取に対する作用が位置
しており、この遺伝子座は、Ｄ１２Ｍｉｔ８遺伝子座とＤ１２Ｍｇｈｌ遺伝子座
との間の２０ｃＭ領域内で連鎖ピークを示し、この連鎖は、動原体に関してＤ１
２Ｍｉｔ８に近位の４ｃＭと最も強力に相関している。図２Ｃは、突然変異体お
よび対照親株としてそれぞれＳＨＲおよびＷＫＹラットを用いてＦ２交雑によっ
て決定された時、グルコース代謝における欠陥のこれらのマーカーへの連鎖のグ
ラフ図を示している。インシュリン抵抗性遺伝子座２にリンクされた遺伝子は、
連鎖ピークの１０ｃＭ以内に見られ、５ｃＭ以内も可能性があり、さらには２ｃ
Ｍ以内にさえ見られるようである。 【０１８５】 インシュリン抵抗性遺伝子座３は、染色体７上に見られる。この遺伝子座には
、基礎グルコース摂取に対する作用が位置づけされており、これは、Ｄ７Ｃｅｂ
ｒ１７９ｓ７マーカーにおいて連鎖ピークを示す。インシュリン抵抗性遺伝子座
３と関連する遺伝子は、Ｄ７Ｃｅｂｒ１７９ｓ７マーカーの１０ｃＭ以内にあっ
てもよく、このような遺伝子は、このマーカーの５ｃＭ以内、あるいは２ｃＭ以
内にさえ位置するようである。 【０１８６】 インシュリン抵抗性遺伝子座４は、染色体１６上に見られる。この遺伝子座に
は、インクリメンタルなグルコース摂取および最大／基礎グルコース摂取に対す
る作用が位置しており、これは、Ｄｌ６Ｍｉｔ３マーカーにおいて連鎖ピークを
示す。インシュリン抵抗性遺伝子座４の位置と一致した地図位置を占める遺伝子
は、このマーカーの１５ｃＭ以内に見られ、１０ｃＭ以内も可能性があり、ある
いは５ｃＭ以内にさえ見られることがある。 【０１８７】 Ｂ．候補遺伝子が、本発明によるインシュリン抵抗性遺伝子座の染色体地図位 置に位置づけられることを決定する方法 連鎖解析 本発明によれば、地図位置が割当てられなかった遺伝子が、インシュリン抵抗
性遺伝子座の中に位置するかどうかを決定することができる。このような分析で
は、位置づけされていない遺伝子が、インシュリン抵抗性遺伝子座の中にあるこ
とが発見されることがあり、このような候補遺伝子が、より徹底的な研究に適切
であるかどうかを決定する強力な方法を提供する。この研究には、ＤＮＡ配列分
析、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現研究、および遺
伝子標的化（病気診断あるいは薬剤発見のためのもの）が含まれるがこれらに限
定されるわけではない。これは連鎖解析を通じて実施され得るが、この解析は、
ある一定の形質が特定の遺伝子座と関連している可能性の確率的決定である。連
鎖解析実験は次のようにして実施することができる。 【０１８８】 遺伝的交雑または一連の遺伝的交雑は、観察し得る突然変異体表現型を有する
個体と対照株の正常な個体との間で、インシュリンまたは脂肪酸代謝、インシュ
リン作用、またはカテコールアミン作用（下記参照）の１つまたはそれ以上にお
ける欠陥の動物モデル系において実施される。これらの交雑において１つのマー
カーとして、インシュリン抵抗性遺伝子座の少なくとも１つが用いられる。もし
もインシュリン抵抗性遺伝子座を含む突然変異体形質の非ランダムな取合せが見
られ、非ランダムな取合せが統計的に有意であるならば（例えば前記のようにス
チューデントのｔテストまたはＡＮＯＶＡがこれらの結果に適用されるならば）
、この形質は、マーカーインシュリン抵抗性遺伝子座にリンクされている。有意
性の限界は次に考察される。 【０１８９】 同様に現存のヒトまたはその他の哺乳類の血統を用いた連鎖解析を実施しても
よい。血統分析は、病気に罹っている多数の個体を含む家族における病的状態の
リスク、発病、または進行に対してどの変異型対立遺伝子が寄与しているかにつ
いて、これらの遺伝子を同定する上で広く用いられているツールである。この手
順は一般的には、罹患している家族構成員と罹患していない家族構成員との間に
おける多数の遺伝子座の比較を内包している。他の遺伝子座について観察された
分布に対して、罹患している家族構成員と罹患していない家族構成員との間のあ
る一定の遺伝マーカーの非ランダムな取合せは、このマーカー（例えば１つの遺
伝子の変異型イソ型）が、この病気に寄与しているか、あるいは寄与している別
のものに対して物理的な近位にあることを示している。本発明によれば、インシ
ュリンまたは脂肪酸代謝またはカテコールアミン活性における欠陥と関連した病
気に罹っている多数の個体を含んでいる血統は、ここに記載されている４つのイ
ンシュリン抵抗性遺伝子座の１つへの欠陥の連鎖について分析される。 【０１９０】 どちらのアプローチを選んでも、インシュリン抵抗性遺伝子座を有する病気関
連表現型の非ランダムな取合せは、この欠陥の基礎となる遺伝子とその遺伝子座
との関連を示している。連鎖解析から引出されたどの結論の強さも、統計に基づ
いているので、信頼度はアッセイされた交雑または家族構成員、および遺伝子座
の数に比例して高まる。病気関連遺伝子が、インシュリン抵抗性遺伝子座１また
は２のうちの１つにリンクしていることが発見されたら、この遺伝子は、その遺
伝子座についての連鎖ピークの１０ｃＭ以内、好ましくは５ｃＭ以内、あるいは
２ｃＭ以内にさえ見られそうである。病気関連遺伝子が、インシュリン抵抗性遺
伝子座３または４のうちの１つにリンクしていることが発見されたら、この遺伝
子は、その遺伝子座についての連鎖ピークの１５ｃＭ以内、好ましくは５ｃＭ以
内に見られそうである。 【０１９１】 連鎖が確認されたとき、連鎖ピークが位置する領域の分子分析が実施される。
この分析は、下記のような酵母人工染色体（ＹＡＣ）ライブラリーの幅広い有効
性によって大幅に容易にされる。インシュリン抵抗性遺伝子座の地図位置を占め
ていると決定された遺伝子を包含する領域の核酸配列が調べられ、観察された表
現型とこれらとの考えられる関係についてオープンリーディングフレームが評価
される。所望であれば、最初の評価は、バイオ情報工学データベース、例えば発
現配列タグの一般に入手し得る（例えばｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖで入手し得る）データベースの助けを借りて実施することができ
る。突然変異体動物または罹患した家族構成員から、およびこれらの健康な対照
物（対照動物あるいは罹患していない家族構成員）からの、この領域に存在する
オープンリーディングフレームのすべてまたは部分集合のクローニング（例えば
ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちＰＣＲを用いて）が実施され、これらのオープ
ンリーディングフレームの配列が比較される。（ここでもまた統計的に有意な非
ランダム的に）病気表現型を示す個体にリンクされているのが発見された突然変
異またはその他の対立遺伝子変異型は、本発明による病気表現型と関連している
と判定される。ついでこの遺伝子を有するサブクローンされた核酸断片が標識さ
れ、この遺伝子の精密な物理的位置を確立するために、ヒトまたはその他の動物
の固定染色体への原位置ハイブリッド形成におけるプローブとして用いられ得る
。さらにはこのように位置づけされ、かつ単離された遺伝子は、本発明による病
気の診断（下記参照）および薬剤標的のための候補標的として役立ち得る。 【０１９２】 Ｃ．候補遺伝子の位置づけ方法およびその地図位置と、本発明によるインシュ リン抵抗性遺伝子座の地図位置との比較方法 ｉ．マッピング 分子および細胞遺伝方法が、候補遺伝子のマッピングに用いられる。これらの
方法を、次に簡単に要約する。 【０１９３】 連鎖解析 前記のように、連鎖解析は、非マップ候補遺伝子と、インシュリン抵抗性遺伝
子座の中にある１つまたはそれ以上の染色体マーカーとの間で実施することがで
きる。これらのマーカーがインシュリン抵抗性遺伝子座の中に存在するかどうか
とは無関係に、候補遺伝子の地図位置を、これと染色体マーカーとの連鎖解析に
よって確立することができ、ついで候補遺伝子についてこのようにして確立され
た地図位置と、インシュリン抵抗性遺伝子座にリンクされているマーカーの位置
とを比較することができる。このような実験において、テスト生物のゲノム全体
におけるマーカーの最適なスペーシングは、完全なカバー範囲を確保するため、
および正確なマッピングを可能にするために、１０ｃＭごとにほぼ１つである。 【０１９４】 シンテニック類似性 ヒトおよびマウスゲノムは、従来の遺伝的研究の結果として、およびより最近
になって多数の研究所のゲノム配列協力、例えばヒトゲノムプロジェクトおよび
マウスゲノムプロジェクトの結果として広範囲に特徴づけられている。ヒト、マ
ウス、およびラットには、有意な共直線性が存在する。すなわち、多数の遺伝子
および遺伝子群の染色体地図位置が、これらのいくつかの種の間で互いに対して
保持されている。このことによって、４つのインシュリン抵抗性遺伝子座のうち
の１つまたはそれ以上にリンクされている遺伝子のマッピングおよび同定が容易
にされる。ラットにおいてこれらのいくつかの遺伝子座が位置する領域に匹敵し
得る領域におけるヒトおよび／またはマウス染色体地図を調べることによって、
インシュリンおよび脂肪酸代謝プロセスの観察された調節の原因になり得る候補
遺伝子を生じる。ヒトおよび／またはマウスのこれらの領域に存在する遺伝子が
ラットにおける関係する領域に存在するということは、放射ハイブリッドマッピ
ング（下記実施例１参照）を用いることによって、またはヒトまたはマウス遺伝
子から誘導された標識断片を用いた、ラット染色体への低緊縮における蛍光原位
置ハイブリッド形成によって確認することができる。 【０１９５】 放射ハイブリッド（ＲＨ）マッピングは、哺乳類染色体の高解像能連続地図を
構成するために開発された体細胞ハイブリッド技術である。この技術は、他のマ
ッピング方法によって容易には得られない解像能において、数百万のＤＮＡ塩基
対にわたるＤＮＡマーカーをオーダーする方法を提供する（Ｃｏｘら、１９９０
、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：２４５−２５０；Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、１９９
１、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、９：１９−３０；Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９２、 Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ，１３：８０３−８０８；Ａｂｅｌら、１９９３、Ｇｅｎｏｍ ｉｃｓ ，１７：６３２３−６４１）。放射ハイブリッドマッピングの利点は、減
数分裂マッピングには用いることができない非多形性ＤＮＡマーカーを位置づけ
することができることである。 【０１９６】 この方法において、ドナー細胞系の染色体を多数の断片に分解するために、Ｘ
放射の致死量が用いられる。ドナー細胞系からの染色体断片が、その後に受容体
細胞系での細胞融解に続いて非選択的に保持される。ついで結果として生じたハ
イブリッドクローンを、特異的ドナー染色体マーカーの保持または損失について
テストする。染色体上で遠くに離れているマーカーは、近くにまとまっているマ
ーカーよりも、放射線によってさらにばらばらに分解され、ＲＨ細胞において独
立して分離される可能性が高い。ハイブリッドクローンにおいて様々な遺伝子座
の共分離を統計的に分析することによって、マーカーの相対的順序および距離に
ついて情報を与える地図を構成することができる（Ｃｏｘら、１９９０、上記：
Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９１、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１１：７０１−７０８
；Ｃｅｃｃｈｅｒｉｎｉら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ，８９：１０４−１０８）。 【０１９７】 差引きスクリーニングおよび識別的遺伝子発現のその他の試験 前記のように、表現型の株特異差（すなわちＳＨＲラットと正常ＷＫＹ対照と
の間）に寄与する遺伝的背景における遺伝子数を最小限にするために、インシュ
リンおよびカテコールアミン活性の量を測る上で最も有用な生化学アッセイを、
単離された組織、一般的には脂肪組織において実施する。１つの生物の遺伝子の
部分集合だけがある一定の組織において発現されているとすれば、突然変異体と
対照動物における同じ組織の細胞間の発現における異なる転写が、観察された突
然変異体表現型の原因である確率が高い。識別的発現遺伝子を試験する１つの方
法は、差引きクローニングである。 【０１９８】 差引きクローニング手順において、ｍＲＮＡを、選ばれた組織から単離する。
この組織は、第一および第二生物から得られる。ここにおいて１つの生物が、あ
る特定の形質に関して突然変異体表現型を示すが、もう一方のものはその点に関
して正常である。ｃＤＮＡは、この生物から誘導されたｍＲＮＡから、この技術
でよく知られている方法によって調製される。次いでｍＲＮＡ鋳型を、アルカリ
条件下における加水分解によって、あるいはリボヌクレアーゼＨ媒介分割によっ
て分解する。その後ｃＤＮＡは、緩衝液に戻されるが、この緩衝液中でｍＲＮＡ
は安定であり、これは緊縮ハイブリッド形成条件下で第二生物から調製されたモ
ル過剰ｍＲＮＡと混合される。次いでこの混合物をヒドロキシアパタイトカラム
上に通過させる。これは二本鎖核酸に結合するが、一本鎖核酸分子を通過させる
。第二サンプルのｍＲＮＡ分子にハイブリッドしない第一サンプルの逆転写（換
言すれば第一組織サンプルに特異的なメッセージを表わすもの）は、フロースル
ー画分中に存在し、ベクターにクローンされ、差引きライブラリーを形成する。
２つの出発組織サンプルに特異的な完全転写セットを生じるために、相互実験（
ここにおいてｃＤＮＡは、第二ｍＲＮＡ調製物から誘導される）も実施する。 【０１９９】 この手順に由来する転写を標識し、固定化染色体への原位置ハイブリッド形成
におけるプローブとして用いることができる。あるいはこれらの染色体位置は、
遺伝的連鎖解析または放射ハイブリッドマッピングを含む他の手段によって決定
することができる。従って差引きスクリーニングは、クローンされた遺伝子と、
これらが本発明によるインシュリン抵抗性遺伝子座の１つと共局在化するかどう
かを決定する手段との両方を生じる。その場合、これらの遺伝子を機能的に（例
えば下記のような表現型レスキュー実験において）分析することができ、これら
は究極的には薬剤用標的として、または病気診断方法用標的として、あるいは治
療的核酸としてさえ用いることができる。 【０２００】 具象差分析（ＲＤＡ） ＲＤＡは、Ｌｉｓｉｔｓｙｎら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９；９４６
に詳細に記載され、選択的増殖とＲＤＡとを組み合わせた適用法も記載されてい
る（Ｌｉｓｉｔｓｙｎら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，６：５７）
。ＲＤＡは、差引きハイブリッド形成（前記参照）の進歩したアプローチである
。テスターとドライバーゲノムとを比較するために、最初に両方のサンプル（例
えばＰＣＲによって増幅されるのに十分なほど小さいＢｇｌＩＩ断片から成るも
の）からアンプリコンという簡略具象体が作られる。反復差引きステップは、テ
スターアンプリコンにおける断片の５’末端への特別な受容体の連結反応から開
始される。次いでテスターアンプリコンが融解され、大過剰の競合ドライバーア
ンプリコンの存在下に簡単にリアニールされる。リアニールするテスター断片（
好ましくはドライバーに存在しないもの）は、そのパートナーの３’末端への受
容体配列の付加のための鋳型として役立ち得る。これによってこれらの断片は、
ＰＣＲによって指数関数的に増幅される。次いでより高度な強化を得るためにこ
の手順を繰返す。 【０２０１】 マイクロアレイスクリーニング 識別的発現された遺伝子について試験する別の方法は、グリッドされたｃＤＮ
Ａライブラリーまたは発現された配列のマイクロアレイの使用である。これらの
実験において、ｍＲＮＡは、突然変異体および対照哺乳類から選択された組織か
ら抽出され、ｍＲＮＡサンプルは、逆転写によって、ｃＤＮＡ分子の突然変異体
および対照特異的異質プールに転換される。ｃＤＮＡの各々の株特異的プールは
、放射能、蛍光、色素原、発光、またはこの技術で知られているその他の標識を
用いて標識され、結果として生じた標識分子は、グリッドされたライブラリーま
たはマイクロアレイを探索するために用いられる。このライブラリーまたはアレ
イでのプローブのインキュベーションおよび非結合プローブを除去するための洗
浄後、このライブラリーまたはアレイの各クローンへの株特異的ｃＤＮＡプロー
ブのどちらかのハイブリッド形成から生じたシグナルの強度を、オートラジオグ
ラフィ、蛍光分析、共焦レーザースキャニング、および光度測定または密度測定
スキャニングによって測定する。識別的発現された遺伝子のプロフィールを生成
させるために、ライブラリーまたはアレイの各メンバー配列への突然変異体およ
び正常ｃＤＮＡのハイブリッド形成から生じるシグナルを定量的に比較する。次
いでこれの地図位置は、原位置ハイブリッド形成、遺伝的連鎖分析、または放射
ハイブリッドマッピングによって決定することができる。識別的発現され、かつ
インシュリン抵抗性遺伝子座に位置する遺伝子は、グルコース代謝、脂肪酸代謝
、インシュリン作用、またはカテコールアミン作用における欠陥の非常に重要な
候補遺伝子であろう。 【０２０２】 本発明者らは、マイクロアレイ技術（Ｓｃｉｏｓ．Ｉｎｃ．）を用いて、ＳＨ
Ｒと２つの対照ラット株とにおける遺伝子発現を脂肪組織において比較した。こ
の技術によって、組織サンプルは数千の遺伝子の発現レベルを同時に監視するこ
とができ、個々の組織サンプルを比較することができる。 【０２０３】 ＣＤ３６遺伝子は、ＳＨＲ脂肪組織において５〜１０倍も発現不足であること
が分かった。この遺伝子は、ラット染色体４上の主要ＳＨＲ ＱＴＬに緊密にリ
ンクされている。９アミノ酸改変に翻訳された１５ヌクレオチド配列突然変異は
、ＳＨＲＣＤ３６遺伝子において同定された。 【０２０４】 突然変異原性のトランスポゾンマッピング まず細菌において記載されている（ＣａｓａｄａｂａｎおよびＣｏｈｅｎ，１
９７９，Ｐｒｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７６：４５３０
；Ｃａｓａｄａｂａｎら、１９８０、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４３：９７
１）エントラップメントベクターによって、遺伝子の中（例えばそのコーディン
グまたは調節配列の中）にある挿入種目（ｅｖｅｎｔ）の選択が可能になる。動
物モデル（例えばマウスまたはラット）において、エントラップメントベクター
を、培養中の多能性ＥＳ細胞中に導入することができ（例えばエレクトロポレー
ションまたはレトロウイルスを用いて）、次いでキメラによって生殖系列の中に
通すことができる（Ｇｏｓｓｌｅｒら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：４
６３；Ｓｋａｒｎｅｓ，１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８２７）
；あるいはまたこのようなベクターを有する形質転換動物を、標準的卵母細胞注
入技術によって発生させることができる。 【０２０５】 これらのＤＮＡ統合は、高度に突然変異原性であるが、その理由は、これらが
内生コーディング配列を中断させるからである。プロモータまたは遺伝子トラッ
プを用いてゲノムにおけるどれかの何らかの遺伝子の突然変異を得る頻度は約４
５％であると推定される。レトロウイルス挿入突然変異誘発の詳細な説明が出版
されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．２２５，１９９０参
照）。この技術を用いて、インシュリンまたは脂肪酸代謝における表現型欠陥を
結果として生じる突然変異を有する動物を回収することができる。 【０２０６】 本発明による候補遺伝子は、ここに記載されているインシュリンおよび脂質代
謝の生化学アッセイを適用し得る組織、例えば脂肪組織において最も有利に発現
される。プロモータまたは遺伝子トラップベクターは多くの場合、レポータ遺伝
子、例えばｌａｃＺ、Ｃａｔ、またはグリーン蛍光タンパク質（Ｇｆｐ）を含ん
でいる。これは、それ自体のプロモータおよび／または上流スプライス受容体配
列を欠いている。これによって候補遺伝子の組織特異性をアッセイすることがで
きる。このベクターが１つの遺伝子の中に含まれており、遺伝子産物の中に挿入
されるならば、その場合にはレポータ遺伝子が発現される。エンハンサートラッ
プは、機能しかつレポータ遺伝子を含むためにエンハンサーの活性を必要とする
最小限のプロモータを有する。ベクターがエンハンサーの近くに挿入されるなら
（遺伝子の中であれ、そうでなくても）、その場合はレポータ遺伝子が発現され
る。関係する組織におけるレポータ遺伝子活性は、本発明のインシュリン抵抗性
遺伝子座の染色体地図位置に位置づけされ得るものについての指標を与える。形
質転換動物のトランスフェクトされた細胞または組織においてレポータ遺伝子活
性を検出する方法は、この技術においてよく知られており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、お
よびタンパク質検出の適用し得る方法は、次に記載されている（セクションＥお
よびＧ参照）。 【０２０７】 これが本発明によるインシュリン抵抗性遺伝子座の染色体地図位置に位置づけ
されるかどうか調べるためにこのような遺伝子を試験する際、標準的細胞遺伝技
術、例えば原位置ハイブリッド形成を用いて、突然変異原性ベクターを位置づけ
することができる。この場合、ベクター特異的配列の標識断片をプローブとして
用いる。インシュリン抵抗性遺伝子座とのプローブの共局在化は、この関連遺伝
子がさらなる研究に適した候補であることを示している。このようにして同定さ
れた遺伝子のクローニングは、下記のように実施することができる。 【０２０８】 インシュリン抵抗性遺伝子座への連鎖について試験され得る候補遺伝子 インシュリン抵抗性遺伝子座１への連鎖の候補であるいくつかの遺伝子は、多
様な前記方法によって既に同定されている。これらには、ラットＩｌ６、Ｎｏｓ
３、Ｓｌｃ４α２、Ｐｓｍｃ２、Ｆｇｌ２、ＰｇｙＩ、およびＣａｃｎａ２、お
よびマウスＧｎａｉＩ、Ｐｇｙ２、Ｐｇｙ３、Ｓｒｉ、Ｈｇｆ、Ｈｔｒ５ａ、Ｃ
ｄｋ５、Ｄｐｐ６、Ｐｌｋ、Ｔｙｍｓ、Ｆｇｆｒ３、Ａｄｒａ２ｃ、Ｐｐａｒｇ
、ＥＲＴＤ３６３、およびＣＤ３６が含まれる。インシュリンプロモーティング
因子１（ＩＰＦ−１）をコードするヒト遺伝子のタンパク質コーディング配列に
おける不活性化突然変異が記載されている（Ｓｔｏｆｆｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，１５：１０６−１１０）。この突然変異についての異型接
合性は、若年の成熟発病糖尿病（ＭＯＤＹ）にリンクされているが、一方、同型
接合性は、先天性すい臓無発育を結果として生じる。ＩＰＦ１遺伝子もまたこの
発明に有用な候補遺伝子である。 【０２０９】 ｉｉ．候補遺伝子の染色体地図位置とインシュリン抵抗性遺伝子座の地図位置 との比較 次いで前記のように確立された候補遺伝子の地図位置を、インシュリン抵抗性
遺伝子座のものと比較する。候補遺伝子が、インシュリン抵抗性遺伝子座の連鎖
ピーク（前記参照）の１０ｃＭ以内にある地図位置を占めるならば、この遺伝子
および遺伝子座の地図位置は、一致していると判定される。 【０２１０】 Ｄ．本発明により同定された遺伝子についての病気における役割の確認 ｉ．核酸の細胞または生物への投与 核酸は、ウイルスまたは非ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡベクターを用いてトラ
ンスフェクションされてもよい。ここにおいて非ウイルスベクターは、プラスミ
ド、線状核酸分子、人工染色体、およびエピソームベクターを含んでいるが、こ
れらに限定されるわけではない。異種遺伝子の発現は、プラスミドＤＮＡを筋肉
（Ｗｏｌｆｆら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７；１４６５−１４６８；Ｃ
ａｒｓｏｎら、米国特許第５，５８０，８５９号）、甲状腺（Ｓｙｋｅｓら、１
９９４、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５：８３７−８４４）、メラノー
マ（Ｖｉｌｅら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３：９６２−９６７）
、皮膚（Ｈｅｎｇｇｅら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，１０：１６
１−１６６）、肝臓（Ｈｉｃｋｍａｎら、１９９４、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔ ｈｅｒａｐｙ ，５：１４７７−１４８３）、および気道上皮の暴露後（Ｍｅｙｅ
ｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２：４５０−４６０）に注入した
後で観察された。インシュリン抵抗性遺伝子座関連遺伝子活性の候補モジュレー
タをアッセイするのに最も都合のよいものは、培養哺乳類細胞のトランスフェク
ション、および形質転換動物の創造である。細胞トランスフェクションのための
方法および形質転換動物の創造のための方法は、この技術においてよく知られて
いる。有用な細胞または動物（この後者のものは、形質転換個体の生産のため、
あるいは細胞源として有用）には、マウスおよびラット、特に下記のものが含ま
れる。このような動物は、遺伝子座における野生型であってもよいが、候補モジ
ュレータの影響下のこれの発現は研究されなければならない。あるいはまた、本
発明における遺伝子発現研究に有用な動物は、関係のある遺伝子における突然変
異を有していてもよい。 【０２１１】 ｉｉ．動物モデル 前記のように病気のＳＨＲ動物モデルは、グルコースおよび脂肪酸代謝、並び
にインシュリンおよびカテコールアミン作用における欠陥の研究において有用で
ある。その他の動物モデルもまた用いることができる。例えばＧｏｔｏ−Ｋａｋ
ｉｚａｋｉ（ＧＫ）ラットは、インシュリン抵抗性およびインシュリン非依存性
糖尿病を発現させるが、これらの欠陥の遺伝子は位置づけされている（Ｇａｕｇ
ｕｉｅｒら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：３８−４３；
Ｇａｌｌｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：３１−３７
）。ＧＫラットにおける遺伝子のいくつかは、ＳＨＲ株におけるＳＨＲ代謝欠陥
の基礎となる遺伝子への同族体を有することがある。従ってＧＫ遺伝子の細かい
位置推定、同定、および特徴決定は、ＳＨＲ代謝欠陥の基礎となる候補遺伝子の
スペクトルの解明に役立ち、これらの遺伝子または同じ機能的または構造的な族
における遺伝子の位置推定後に、ＳＨＲ遺伝子の同定を補助し得る。本発明にお
いて潜在的に有用な別の動物モデルは、リヨン高血圧ラットである（Ｄｕｂａｙ
ら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３：３５４−３５７）。この
ラットモデルもまた、インシュリン抵抗性を示す。肥満（ｏｂ）、糖尿病（ｄｂ
）、アグーチ（Ａｙ）株を含むマウスのいくつかの株も、単一遺伝子突然変異に
よるか、またはいくつかの遺伝子における作用によって、肥満および糖尿病を発
現させる。これらの単一遺伝子肥満症候群における原因遺伝子は、いくつかの症
例において同定されている（ＣｈａｇｎｏｎおよびＢｏｕｃｈａｒｄ，１９９６
，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．，１２：４４１−４４４において評論されている
）。Ｃｄ３６は、このような遺伝子の修飾因子として作用するか、あるいはまた
これらが関わっている経路のその他の要素に対して作用し、これによって、これ
に伴うｏｂ、ｄｂ、またはＡｙ表現型を調節し得る。 【０２１２】 多くの動物モデル、すなわち自然発生のものと実験によって誘発されたものと
のどちらも、多様な心臓血管病を示すことが知られている（Ｅｌｓｎｅｒらによ
る評論、１９９５、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃａｒｄ，１０：２５３−２５９；Ｈ
ｏｎｇｏら、１９９７、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ，７：１
６１−１６７）。このようなモデルは、細胞源としてまたはｉｎ ｖｉｖｏで（
例えば形質転換動物における組換え遺伝子の作用を試験することにおいて）、あ
るいは本発明によるＣＤ３６活性の候補モジュレータを試験することにおいて、
本発明により同定された遺伝子についての病気における役割を確認するために用
いることができる。一般的にはこれらのモデルは、心臓血管機能を改良する上で
、物質の効率の指標として役立ち得る心拍出量における測定可能な欠失を示して
いる。拡張心筋症のラットモデルは、冠状動脈の狭窄によって生産される（Ｐｆ
ｅｆｆｅｒら、１９７９、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，４４：５０３−５１２）。同様
にラットにおける肥大性心筋症は、慢性的圧力過負荷によって誘発させることが
できる（Ｆｅｌｄｍａｎら、１９９３、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，７３：１８４−１
９２）。アテローム性動脈硬化症は、イヌ、ヒツジ、および霊長類モデルにおい
て研究されている（評論誌については、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ、Ｅｘｐ ｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ，１９６５；ＶｅｓｅｌｉｎｏｖｉｔｃｈおよびＷｉｓｓｌｅｒ
，１９７７，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，８２：６１４−６２２参照
）。 【０２１３】 これらの動物モデル、またはこれらに由来する細胞は、本発明による機能的試
験を受ける遺伝子の発現のため、並びに本発明による薬剤標的／スクリーニング
に有用である。例えば高脂肪の食餌を与えられた時、前記動物モデルは、アテロ
ーム硬化プラークを発現させる。特に有利な薬剤スクリーニングアッセイは、試
験動物および対照動物にこのような食餌を与えること、脂肪酸代謝またはインシ
ュリン作用の候補モジュレータを、これらの試験動物に投与すること、次いでこ
れらの試験動物におけるプラーク蓄積または減少と、同様なえさが与えられてい
たが、候補モジュレータは与えられていなかった対照動物とを比較することが含
まれる。試験集団と対照集団との間のプラーク蓄積における少なくとも１０％、
好ましくは少なくとも２０％の差は、本発明による候補モジュレータの効力の指
標となるものである。野生型動物および細胞も、本発明による薬剤スクリーニン
グアッセイ、および病気診断、および治療において用いられる。さらに形質転換
動物は、遺伝子発現研究および薬剤標的／スクリーニング実験に用いられる。こ
のような動物は、考察されている遺伝子に対して野生型または突然変異遺伝的背
景を有する個体に由来してもよい。 【０２１４】 あるいはまた候補モジュレータは、前記のような病気のモデルになる動物に投
与されるが、これらの動物は正常に維持されていたものである（例えば高脂肪の
食餌が与えられたものではない）。同様にこの病気のモデルとなっている対照動
物には、薬剤キャリアのみが与えられており、候補モジュレータを含むキャリア
と同様に投与されている。試験動物への候補モジュレータの投薬計算および投与
は、下記のように実施される。処理済み動物は、これらの病態生理学的条件の改
良について監視される。対照に対して処理済み動物における少なくとも１０％、
好ましくは少なくとも２０％の臨床病的指標の改良は、本発明によるＣＤ３６媒
介活性の候補モジュレータの効力を示している。 【０２１５】 動物全体も細胞も含まないスクリーニング系は次に別に記載される。これらは
、細胞溶解産物、並びに完全に非細胞の（例えば媒質中に例えば生理学的に適合
性の緩衝液または酵素反応緩衝液のようなアッセイ成分を有するか、あるいは固
体または半固体支持体（例えばゲル、フィルター、およびシリカ支持体を含むが
これらに限定されない）上に固定化されたアッセイ成分を有する）ものを含むア
ッセイ系を含んでいる。 【０２１６】 ｉｉｉ．機能の酵素アッセイ 本発明により位置づけされた遺伝子が、インシュリンまたは脂肪酸代謝におい
てどの程度機能するかを、次の技術を含むがこれらに限定されない方法によって
生化学的にアッセイすることができる。すなわちこれらの技術は、下記のような
細胞または動物モデルにおいて実施されたスクリーニングアッセイにおける候補
薬剤の効力、あるいは本発明による病気治療の療法の成功の評価においても等し
く用いられる。このようなアッセイは、動物モデルまたは細胞について次に記載
されているように、ヒト被験者から得られた生物サンプルに対して実施すること
ができる。 【０２１７】 グルコース摂取アッセイ 試験ラットの腹膜後脂肪足からの脂肪細胞を、別で記載されているように調製
する（Ｒｏｄｂｅｌｌ，１９６４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２３９：３７５
−３８０）。但し、すべてのインキュベーションにおいて、ＣａＣｌ２（１ミリ
モル／ｌ）およびアデノシン（２００ｎモル／ｌ）を含むＨＥＰＥＳベース緩衝
液が用いられる。非固定脂肪細胞の容積および数を、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ Ｉ
Ｉ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて測定する。脂肪細胞は、細胞回収を可能にするた
めに１ｍｌあたり約１０５の固定細胞密度まで希釈され、３０分間予備インキュ
ベーションされる。 【０２１８】 インシュリン媒介グルコース摂取を、記載されているような（Ｒｅａｖｅｎ、
１９８９ｃ、上記）オスのラットからの単離された腹膜後脂肪細胞において測定
する。但しインキュベーションは、アデノシンデアミナーゼ（ｌ単位／ｍｌ）、
フェニルイソプロピルアデノシン（２５ｎモル／ｌ）、および［１４Ｃ］−標識
Ｄ−グルコースのトレーサ（３００ｎモル／ｌ）量を、インシュリンと共にまた
はこれを伴なわずに（５０，０００ｐモル／ｌ）含んでいる。インキュベーショ
ンは、このインキュベーション媒質をシリコーン油を通してスピンさせて終了す
る。次いで脂肪細胞を洗浄し、組込まれた［１４Ｃ］−グルコースをシンチレー
ションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で計数する。 【０２１９】 各足の対照インキュベーションは、サイトカラシンＢ（２０μＭ）、または［１４ −Ｃ］Ｄ−グルコースの代わりに［１４−Ｃ］Ｌ−グルコースで実施する。
サイトカラシンＢまたはＬ−グルコースでのインキュベーションは、一般的には
基礎Ｄ−グルコース摂取の２０％未満を示し、インシュリンでの増加は示さない
。基礎および最大限のグルコース摂取は、各々の足について複製法で測定され、
この脂肪足についてのサイトカラシン対照についての値を差引いた後、１細胞あ
たりの［１４−Ｃ］Ｄ−グルコースの蓄積として計算される。典型的な結果は、
連続的な動物の左足および右足について高度に相関しており、従って左足および
右足の平均値が、ある一定の動物についての表現型の値として考えられる。 【０２２０】 脂肪分解アッセイ 脂肪組織を、グルコース摂取アッセイについて前記されているように調製する
。別々の反応において、脂肪細胞を、４５分間イソプロテレノールを用いてまた
は用いずに（２００ｎモル／ｌ）インキュベーションする。下澄みのＮＥＦＡ濃
度を、酵素比色分析アッセイ（ＷＡＫＯ ＮＥＦＡ−Ｃキット、Ａｌｐｈａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＫ）によって測定し、左足および右足の平均値を、
その動物の表現型値として考える。 【０２２１】 ＣＤ３６活性およびこれのモジュレータについての細胞ベーススクリーニング アッセイ ＣＤ３６の生物学的作用を調節する化合物を同定するために、既知のリガンド
のＣＤ３６への結合に影響を与える化合物を捜すことができる。公開されている
データでは、ＣＤ３６タンパク質が、あるいくつかの遊離脂肪酸（Ａｂｕｍｒａ
ｄら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：１７６６５−１７６６８）お
よびいくつかのリポタンパク質錯体（Ｅｎｄｅｍａｎｎら、１９９３、Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：１１８１−１１８１６）に対する細胞受容体および輸
送体であることを示している。ＣＤ３６に対して向けられている抗体は、これら
のリガンドの結合および摂取を妨げることが証明されている。これらのＣＤ３６
リガンドの摂取は、内生あるいは組換えＣＤ３６を発現する細胞系において測定
された（Ａｂｕｍｒａｄら、１９９３、上記；Ｅｎｄｅｍａｎｎら、１９９３、
上記）。多様な細胞型が、ＣＤ３６を発現することが証明されている。これには
、心筋細胞、脂肪細胞、単核細胞、および骨格筋細胞が含まれる（Ｉｂｒａｈｉ
ｍｉら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９
３：２６４６−２６５１；ｖａｎ Ｎｉｅｕｗｅｎｈｏｖｅｎら、１９９５、Ｂ ＢＲＣ 、２０７：７４７−７５２）。ＣＤ発現がまったくない細胞系は、ＣＤ３
６を発現させるＤＮＡ構成体でトランスフェクションされ、この結果、脂肪酸お
よびリポタンパク質リガンドの結合および摂取においてより効率的な細胞を生じ
る（Ｅｎｄｅｍａｎｎら、１９９３、上記：Ａｂｕｍｒａｄら、１９９３、上記
）。このような細胞型は、ＣＤ３６に結合する物質の同定のための細胞ベースア
ッセイ系において用いられる。これによってこれらの物質は、本発明によるＣＤ
３６媒介活性のモジュレータまたは候補モジュレータである。 【０２２２】 １つのこのようなアッセイにおいて、酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ
）のＣＤ３６発現細胞への結合を阻害する能力について、試験化合物を評価する
。ＣＤ３６を発現しないヒト２９３細胞を、ＣＤ３６をコードする発現ベクター
でトランスフェクションさせる。ｍＲＮＡ発現は、この技術で知られているいく
つかの調節成分によって制御されている。これらのうち１つの非限定的な例は、
既に記載されているようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＬＴＲプロモータ
である（Ｓｔａｎｔｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２
２４４６−２２４５１）。対照として２９３細胞が、ＣＤ３６遺伝子を欠いてい
るＤＮＡベクターでトラスフェクションされる。安定的にトランスフェクトされ
た２９３細胞系は、ＣＤ３６を発現するクローンを確立するために通常の方法で
選択され、負（ベクターのみ）の対照細胞系も選択される。細胞を、アッセイ用
９６ウエルミクロ滴定プレートに植付ける。放射標識ｏｘＬＤＬリガンドを、本
質的には記載されているように調製する（Ｓｔａｎｔｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：２２４４６−２２４５１）。要するに、１００−５
００ｃｐｍ／タンパク質ｎｇの特異的活性に対する一塩化ヨウ素方法（Ｃｏｎｔ
ｒｅｒａｓら、１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：２７７−
２９２）を用いて、ＬＤＬを放射ヨウ素化する。１２５Ｉ−ｏｘＬＤＬを発生さ
せるために、１２５Ｉ−ＬＤＬの酸化を、３７℃で４４時間、５μＭＣｕＳＯ４ の存在下におけるインキュベーションによって実施する。ＣＤ３６発現細胞およ
び対照細胞を、３７℃で２時間、血清を含まない細胞培養媒質中において１２５ Ｉ−ｏｘＬＤＬでインキュベーションする。試験化合物は、一般的には１〜１０
０μＭの濃度において、細胞およびリガンドと共に同時インキュベーションされ
る。次いで、非結合リガンドを除去するために、細胞をＰＢＳで３回洗浄する。
各々のウエルにおける放射能を計数して、１２５Ｉ−ｏｘＬＤＬの結合度を確立
し、どの化合物がＣＤ３６とのｏｘＬＤＬ相互作用を阻害または強化するかを決
定する。ヒトＣＤ３６に特異的なモノクローナル抗体（例えばＯＫＭ５；Ｔａｌ
ｌｅら、１９８３、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７８：８３−９９参
照；これもＣｏｌｕｍｂｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ
，ＣＡから商品として入手可能である）は、リガンド結合の阻害についてのアッ
セイにおける対照として役立つ。 【０２２３】 ＣＤ３６活性の別のアッセイにおいて、Ａｂｕｍｒａｄらによって本質的に記
載されているように脂肪酸の結合および摂取を改変する能力について化合物を試
験する（１９９１、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６１：Ｅ７６−Ｅ８６）。
ＣＤ３６を発現する発現ベクターでトランスフェクトされたヒト２９３細胞、お
よびベクターのみ（すなわち同じベクターであるが、ＣＤ３６遺伝子を発現しな
いもの）でトランスフェクトされた対照細胞を、３Ｈ−オレイン酸脂肪酸リガン
ドでインキュベーションする。細胞＋このリガンドを、１−１００μＭ濃度で存
在する試験化合物で、４時間室温で、Ｋｒｅｂｓ―ＲｉｎｇｅｒＨＥＰＥＳ（Ｋ
ＲＨ）緩衝液ｐＨ７．４中でインキュベーションする。この反応は、氷冷ＫＲＨ
緩衝液の添加によって終了させ、細胞をＫＲＨで２回洗浄し、次いで０．１Ｎ
ＮａＯＨ中の細胞溶解を行う。３Ｈ−オレイン酸脂肪酸の摂取は、シンチレーシ
ョン計数によって決定する。細胞による脂肪酸摂取を実質的に（すなわち少なく
とも１０％、好ましくは少なくとも２０％）阻害または強化する物質は、本発明
によるＣＤ３６活性の候補モジュレータとしてさらなる研究のために選択される
。 【０２２４】 ＣＤ３６によって媒介される生物活性を調節する物質についての追加アッセイ
では、ＣＤ３６媒介輸送によって細胞に入った脂質に応答する遺伝子の転写にお
ける変化を調べる。酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）のＣＤ３６を通じ
た摂取は、ＰＰＡＲγ―依存性転写を活性化することが証明された（Ｎａｇｙら
、１９９８、Ｃｅｌｌ，９３：２２９−２４０；Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、１９９８
、Ｃｅｌｌ，９３：２４１−２５２）。ＰＰＡＲγは、脂質代謝の転写調節剤と
して作用する核受容体である（Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、１９９４、Ｃｅｌｌ，７９
：１１４７−１１５６）。ＰＰＡＲγによって調節されたいくつかの遺伝子が同
定された。これらには、脂肪酸結合タンパク質ａＰ２、ホスホエノールピルビン
酸カルボキシキナーゼ、リポタンパク質リパーゼ、脂肪非カップリングタンパク
質ＵＣＰ１、およびＣＤ３６が含まれる。９−ＨＯＤＥおよび１３−ＨＯＤＥを
含む、ＰＰＡＲγを活性化する脂質は、ＣＤ３６によって細胞に送り出され、Ｃ
Ｄ３６発現は、ＰＰＡＲγ活性化によって上昇する。ＣＤ３６に標的された試験
化合物の作用は、ＰＰＡＲγ経路を通って脂質によって調節される遺伝子の応答
を評価することによって監視することができる。レポータ構成体は、この明細書
の別のところに記載されているようにこの技術でよく知られている方法によって
、ＣＤ３６リガンドによって誘発された遺伝子発現における変化の監視を容易に
するために、遺伝子プロモータおよび脂質応答遺伝子の調節領域をレポータ遺伝
子に、例えば蛍ルシフェラーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ遺伝子に融合させて生産する。ＣＤ３６を発現する細胞は、レ
ポータ構成体での標準的方法によってトランスフェクションし、次いでＣＤ３６
依存的に遺伝子発現を調節するこれらの能力について物質を試験するためにアッ
セイにおいて用いる。この技術でよく知られており、かつ、ここに記載されてい
る転写アッセイのこれらの種類は、数千の試験化合物の急速スクリーニングに用
い得る。 【０２２５】 Ｅ．本発明による薬剤スクリーニング ｉ．本発明における薬剤標的 前記のように、インシュリン作用、グルコース代謝、脂質代謝または摂取、ま
たはカテコールアミン作用における前記のような欠陥にリンクした病気に対する
効力について、候補治療用化合物をスクリーニング（同定およびアッセイ）する
のに本発明は有用である。突然変異体または野生型ヌクレオチド配列またはこれ
らの断片、インシュリン抵抗性遺伝子座１〜４のうちの１つにリンクした遺伝子
の断片、並びにこのような配列または断片によってコードされたアミノ酸配列を
用いて、多様な薬剤スクリーニング方法が、本発明に従って実施される。 【０２２６】 これらの方法によれば、このような試験に用いられる標的突然変異体または野
生型核酸、タンパク質産物または断片は、溶液中に遊離しているか、あるいは固
体支持体に付着されるか、あるいは細胞の表面上に発現されるか、あるいは細胞
内に位置していてもよい。このことは同様に、これがインシュリン抵抗性遺伝子
座にリンクされている核酸であるにせよ、ポリペプチドであるにせよ、考察され
ている候補薬剤に当てはまる。生きている細胞が用いられるならば、これらは培
養されてもよく、あるいはまた単離（例えば外植）されてもよく、あるいは多細
胞生物から構成されていてもよい。 【０２２７】 本発明による薬剤スクリーニングに特に好ましい標的は、それぞれラットおよ
びヒトのＣｄ３６およびＣＤ３６遺伝子である。下記のようにラットＣｄ３６遺
伝子は、インシュリン抵抗性遺伝子座１にリンクされ、この遺伝子座における突
然変異は、自然発生高血圧ラットにおける脂質代謝における欠陥にリンクされて
いる。同様に、糖尿病、インシュリン抵抗性、および冠状心臓病のリスクにリン
クされているヒトＣＤ３６遺伝子において突然変異が発見された。突然変異体ま
たは野生型Ｃｄ３６またはＣＤ３６核酸配列またはこれらの断片、あるいは突然
変異体または野生型Ｃｄ３６またはＣＤ３６タンパク質またはこれらの断片は、
下記の方法を含むがこれらに限定されるわけではない方法によって、標的あるい
は候補薬剤として、本発明のスクリーニングアッセイに有利に用いることができ
る。 【０２２８】 ｉｉ．本発明に用いられる候補薬剤 前記のようにインシュリン抵抗性遺伝子座の１つまたはそれ以上の中に同定遺
伝子を有するので、潜在的治療剤を、このような１つまたは複数の遺伝子または
これらの産物の活性を調節するこれらの能力について試験することができる。遺
伝子の活性は、転写のそのレベル、分配、またはタイミングを測定することによ
って、あるいはそのコードされた核酸産物（例えばメッセンジャーまたはその他
のＲＮＡ分子）のサイズ、配列、プロセシング、または安定性、またはコードさ
れたタンパク質の存在または不存在を（例えば免疫学的に）測定することによっ
て評価することができる。さらにはタンパク質の活性（例えば酵素活性、シグナ
ルカスケードにおける役割、受容体／リガンド結合相互作用等）をアッセイする
ことができる。数多くの酵素アッセイがこの技術で知られている。このようなタ
ンパク質は、本発明により同定された標的遺伝子の産物であってもよく、あるい
はまたこのようなタンパク質は別の遺伝子によってコードされてもよいが、標的
遺伝子の作用に応答して生産または活性化されてもよい。これは、次に簡単に記
載されるように、ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施されてもよい
。 【０２２９】 核酸配列によって有用にコードされ得るインシュリン抵抗性遺伝子座関連遺伝
子の候補モジュレータ；あるいはまたタンパク質またはその他の物質を直接投与
してもよい（下記参照）。有用なタンパク質には、核タンパク質、細胞質タンパ
ク質、ミトコンドリアタンパク質、分泌されたタンパク質、原形質膜関連タンパ
ク質、受容体、酵素、リガンド、調節因子、構造タンパク質、血清タンパク質、
ホルモン、成長因子、神経伝達物質、酵素、凝固因子、アポリポタンパク質、薬
剤、腫瘍タンパク質、腫瘍抗原、腫瘍サプレッサー、ウイルス抗原、細菌抗原、
原生動物抗原、および寄生体抗原、リポタンパク質、糖タンパク質、およびリン
タンパク質が含まれるが、これらに限定されるわけではない。有用な核酸は、前
記のようなタンパク質をコードすることもあり、あるいはその代わりに、これら
自体が核酸であるモジュレータをコードすることもある（例えばＲＮＡ、例えば
リボザイムまたはアンチセンス核酸）。組込むことができる化合物は、ある一定
の産物をコードする核酸配列の有効性によってのみ限定される。当業者なら、よ
り多くのタンパク質およびポリペプチドが同定されるようになる時、これらの対
応する遺伝子が、選ばれた遺伝子発現ベクターにクローンされ、前記のような受
容体生物の組織、例えば哺乳類組織（ヒト組織を含む）に投与され、この組織に
おいて発現され得ることが容易に分かるであろう。 【０２３０】 本発明によりスクリーンされ得る候補モジュレータは、試験細胞または生物が
欠損している物質、あるいは正常以上の濃度において臨床的に効果的な物質、並
びに望まれないタンパク質の翻訳を排除するように設計されたものを含んでいる
。本発明に従って使用される核酸は、受容体の欠失産物または機能の代わりにな
るかまたはこれを強化する候補モジュレータをコードし得るのみならず、その代
わりに欠失タンパク質を排除する産物を排除またはコードし得る。このような核
酸配列は、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイム、並びにこれらをコードするＤ
ＮＡ発現構成体である。アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、またはこれらを
コードする遺伝子は、下記のようなこの技術で知られている核酸送り出し方法に
よって試験細胞または生物に投与されてもよい。核酸配列の不活性化は、標的ｍ
ＲＮＡに特異的なリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡをコードし得る。ハンマ
ーヘッド綱のリボザイムは、知られているうちで最も小さいものであり、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ合成と細胞への送達との両方に役立つ（Ｓｕｌｌｉｖａｎ、１９９４
、Ｊ．Ｉｎｖｅｓ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０３：８５Ｓ−９８Ｓ；Ｕｓｍａｎ
ら、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、６：５２７−
５３３によって要約されている）。 【０２３１】 さらには合成または天然化合物の大きいライブラリーからの候補モジュレータ
化合物をスクリーンすることができる。現在数多くの手段が、糖類、ペプチド、
および核酸ベースの化合物のランダムまたは直接合成に用いられている。合成化
合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｔｒｅ
ｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔ
ｏｎ，ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，
ＮＨ）、およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ）を含
むいくつかの会社から商品として入手し得る。珍しい化学ライブラリーが、Ａｌ
ｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手し得る。組み合わせライブラ
リーは入手可能であるが、合成することもできる。あるいはまた、細菌、菌類、
植物抽出物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、Ｐａｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、またはＭｙｃｏＳｅａｒ
ｃｈ（ＮＣ）から入手し得る。あるいはこの技術でよく知られている方法によっ
て容易に生産可能である。さらには天然および合成的に生産されたライブラリー
および化合物は、通常の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に修
飾される。 【０２３２】 有用な化合物は、数多くの化学綱の中に見ることができる。但し、一般的には
これらは有機化合物であり、好ましくは小さい有機化合物である。小さい有機化
合物は、５０ダルトンよりも大きいが、約２，５００ダルトンよりも小さい、好
ましくは約７５０ダルトンよりも小さい、より好ましくは約３５０ダルトンより
も小さい分子量を有する。これらの綱の例には、複素環、ペプチド、糖類、ステ
ロイド等が含まれる。これらの化合物は、効力、安定性、製薬適合性等を高める
ために修飾されてもよい。１つの物質の構造的同定は、追加物質を同定するか、
発生させるか、またはスクリーンするために用いることができる。例えばペプチ
ド物質が同定された場合、これらは安定性を高めるために、多様な方法で、例え
ば非天然アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸、特にＤ−アラニンを用いて、アミノま
たはカルボキシル末端を官能化することによって、例えばアミノ基の場合、アシ
ル化またはアルキル化によって、およびカルボキシル基の場合、エステル化また
はアミド化等によって修飾することができる。 【０２３３】 本発明に有用な核酸、タンパク質、またはペプチドの製造方法 タンパク質（例えばインシュリン抵抗性遺伝子座、別のタンパク質、またはこ
れの断片にリンクされている遺伝子の産物であってもよい、前記のようなモジュ
レータ）または関係のある核酸（例えばアンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）
をコードする配列は、この技術で知られている化学的方法を用いて全部または一
部合成されてもよい（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． 、７：２１５；Ｈｏｒｎら、１９８０、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． 、７；２２５；など参
照）。このように合成された核酸は、単独であれ、あるいは追加の調節および／
またはベクター配列に連結されているにせよ（下記参照）、受容体哺乳類に直接
投与されてもよく、あるいは所望の最終産物を生じるために転写および／または
翻訳のための遺伝子発現系（例えば形質転換またはトランスフェクトされた細胞
または無細胞系、例えばウサギの網状赤血球溶解産物）に入れられてもよい。あ
るいはまたタンパク質またはこれの一部分は、化学的合成方法を用いて生産する
ことができる。例えばペプチド合成は、様々な固相技術を用いて実施することが
でき（Ｒｏｂｅｒｇｅら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：２０２）、自動
合成は、例えば製造業者によって与えられる指示に従ってＡＢＩ４３１Ａペプチ
ド合成器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施することができる。 【０２３４】 新たに合成されたタンパク質またはペプチドは、この技術で知られているクロ
マトグラフィ手順、例えば分取高性能液体クロマトグラフィ（例えばＣｒｅｉｇ
ｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、または二次元ゲル電気泳動法によって実質的に
精製することができる。次いで、これも同様に標準的方法、例えばマススペクト
ロメトリ（例えば液体クロマトグラフィ／電子スプレーイオン化／イオントラッ
プ縦列マススペクトロメトリ）あるいはＥｄｍａｎ分解（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，
１９８３、上記参照）によって、単離されたタンパク質の組成が決定される。さ
らには関係するアミノ酸配列またはこれらの一部を、直接合成の間に改変し、お
よび／または化学的方法を用いて他のタンパク質またはこれらの一部からの配列
と組み合わせて、変異型ポリペプチドを生産してもよい。 【０２３５】 より大きいアミノ酸配列、例えば完全なまたは端が切り取られたポリペプチド
を作るために、関係するタンパク質またはその機能的同等物をコードするヌクレ
オチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコーディング配列の転
写および翻訳に必要な要素を含むベクターの中に挿入する。 【０２３６】 タンパク質エンコーディング配列を含む発現ベクターおよび適切な転写または
翻訳対照を構成するために、当業者によく知られている方法を用いることができ
る。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローニング方法、ｉｎ ｖｉｖｏ組
換え、および遺伝子組換えが含まれるが、これらに限定されるわけではない。こ
のような方法はこの技術でよく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５、上
記；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記参照）。 【０２３７】 投与量 本発明において投与される組成物の治療的有効量は、とりわけ、組成物の細胞
摂取の効率、投与スケジュール、投与される単位用量、これらの組成物が他の治
療薬と組み合わせて投与されるかどうか、受容体の健康、および特定のタンパク
質またはその他の製薬物質の治療活性によることは当業者には明白であろう。 【０２３８】 本発明に従って投与された核酸にも当てはまるが、投与される必要があるタン
パク質またはその他の製薬物質の正確な量は、実施者の判断に依るものであり、
限定された範囲の値内で各被験者に固有のものであってもよい。タンパク質また
はその他の物質の適切な用量は、すぐ下に示されているように計算されてもよい
（または下記参照）。 【０２３９】 動物モデル、例えば前記のようなものを、インシュリン抵抗性遺伝子座関連遺
伝子活性の調節におけるタンパク質またはその他の物質の多様な用量の有効性を
アッセイするために用いることができる。ある一定の治療用組成物の場合、臨床
状況において有用であるが比較的安全な適切な範囲の投与量を確立することが必
要である。ヒト被験者において本発明を使用する前に、投与曲線を確立するため
に動物モデルを用いることができる。あるいはまた本発明によって有用な製薬物
質に既に当局の承認が与えられているならば、ヒトおよびその他の哺乳類につい
ての投薬許容性の許容し得る上限は、その他の臨床使用に有用な全身的濃度のよ
うに、試験前にこれらの薬剤について既に確立されていると考えられる。これら
の既知の投与量は、動物モデルの使用前にこれに基づいて計算がなされ得るベー
スとして用いることができる。 【０２４０】 ｉｉ．インシュリン抵抗性遺伝子座関連遺伝子機能の候補モジュレータのｉｎ ｖｉｖｏアッセイ インシュリン抵抗性遺伝子座が同定される連鎖研究の間に、ＳＨＲモデルにお
けるいくつかのパラメータ（全体的な体重、脂肪足重量、脂肪細胞容積、最大の
グルコース摂取、増分グルコース摂取、最大／基礎グルコース摂取、絶対ＮＥＦ
Ａ分泌、および増分グルコース分泌）を、これらの動物、およびＷｉｓｔａｒ
Ｋｙｏｔｏ（ＷＫＹ）およびＢｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙ（ＢＮ）株の正常ラット
から得られた、単離された脂肪細胞においてアッセイした。ＳＨＲへの候補モジ
ュレータの投与に続いて、これらのパラメータの１つまたはそれ以上を、処理さ
れた動物対未処理対照における変化について監視してもよい。 【０２４１】 前記のものを含むがこれらに限定されない細胞および／または動物モデルにお
ける予備試験に続いて、安全かつ効果的に見えるインシュリン抵抗性遺伝子座に
リンクされたＣＤ３６またはその他の遺伝子の機能の候補モジュレータを、本発
明による病気治療における使用への承認前にヒト被験者において試験してもよい
。投与量は、細胞または動物被験者において有効であることが分かっているｍｇ
／ｋｇ投与量をベースとして、ヒト被験者の体重に依って、さらには当業者の一
人、例えば医師または臨床研究者によって判断された、ヒト被験者の要因、例え
ば年齢、性、または肉体的状態を考慮に入れて計算される。次いで、下記の分子
的および生化学的基準によって、あるいはこの候補薬剤が照準を当てている病気
に対して特定の臨床的指標における変化について、ヒト被験者を監視する。この
ような指標には、インシュリン、グルコース、トリグリセリド、脂肪酸、および
高密度リポタンパク質コレステロールの血液レベル；非常に低い密度のリポタン
パク質コレステロール、トリグリセリド、およびアポＢ、および中間的密度リポ
タンパク質を含むリポタンパク質画分および細画分における脂質レベル；および
低密度リポタンパク質粒子のサイズおよび密度が含まれるが、これらに限定され
るわけではない。脂質、グルコース、およびインシュリンの変数は、グルコース
「負荷」後または混合食後、絶食状態で測定されてもよい。前記変数の２４時間
プロフィールを調べてもよい。これらの結果を、有利には本発明に従って用いる
ことができる。ヒトにおける動脈硬化症の証拠は、動脈、例えば頚動脈の超音波
画像化、および冠状画像化によって検出することができる。これには、血管造影
および超高速コンピュータ化トモグラフィーを含むがこれらに限定されるわけで
はない。さらには、体重、血圧、あるいはインシュリン作用、グルコース代謝、
脂質代謝、またはカテコールアミン作用に関連したその他の機能、あるいは患者
の全体的な健康が評価されてもよい。ヒト被験者を利用することが必要なこれら
のスクリーニングアッセイは、承認された規制ガイドライン下に実施される。こ
れには、研究被験者からのインフォームドコンセントの入手、この研究に入る前
の完全な肉体的および病歴的評価、薬剤の効力と安全性（有害な副作用の不在）
との両方を評価するためのスクリーニングの進行中全体にわたる臨床的監視、お
よび候補薬剤の長期作用（もしあれば）を検出するための追跡調査が含まれる。 【０２４２】 候補モジュレータは、通常の薬剤投与プロトコルによって、好ましくは動物使
用および看護のための承認されたガイドラインに従うプロトコルによって投与さ
れると考えられる。本発明によるインシュリンまたは脂肪酸代謝の候補モジュレ
ータを送り出すために有利に用いることができる薬剤送達方法および投与量は、
次に記載されているものを含むが、これらに限定されるわけではない。 【０２４３】 候補モジュレータ化合物の投与 ａ．全身 全身への薬剤送達方法はこの技術でよく知られている。これらの方法には、静
脈内ドリップまたは注入、皮下、筋肉内、腹膜内、頭蓋内、および脊椎注入、経
口経路による摂取、吸入、上皮経由拡散（例えば薬剤が含浸された接着剤パッチ
によるもの）、あるいは外生的に生産されたモジュレータの貯蔵器を含んでいる
か、あるいはその代わりに調節物質を生産および分泌する細胞を含んでいてもよ
い、インプラント可能な徐放性薬剤送達装置の使用が含まれるが、これらに限定
されるわけではない。注射は、通常の手段によって（すなわち皮下注射針を用い
て）、あるいはハイポスプレーによって実施することができる（Ｃｌａｒｋｅお
よびＷｏｏｄｌａｎｄ，１９７５、Ｒｈｕｍａｔｏｌ．Ｒｅｈａｂｉｌ．，１４
：４７−４９参照）。 【０２４４】 本発明のスクリーニングアッセイへの核酸の導入方法には、無細胞アッセイ系
への核酸分子の単純付加、細胞内へのトランスフェクションまたは形質転換、ま
たは形質転換技術を含む前記手段による多細胞動物例えば哺乳類への導入が含ま
れる。核酸分子を細胞または動物まるごとに送り出す方法は、この技術において
よく知られている（前記パートＤ、セクションｉ参照）。例えば関連するコーデ
ィング配列と適切な調節シグナルとを接合させるのに必要な分子クローニング方
法である（下記参照）。前記のように、薬剤標的のため、あるいは本発明による
候補薬剤として使用するのに特に好ましい核酸配列は、野生型または突然変異体
ラットＣｄ３６またはヒトＣＤ３６タンパク質の全部または一断片をコードする
もの、並びにＣｄ３６またはＣＤ３６転写にハイブリッドされる核酸配列、例え
ば突然変異体Ｃｄ３６またはＣＤ３６ｍＲＮＡの翻訳を妨げるために用い得るよ
うな、これらの配列に特異的なアンチセンス分子またはリボザイムである。 【０２４５】 ｂ．局所 候補モジュレータを含む局所組成物は、次に要約されているいくつかの物理的
形態のどれを取っていてもよい。 【０２４６】 液体、例えばチンキまたはローション。これは、注ぐか、滴下するか、あるい
は「塗りつける」（すなわち手で、またはブラシまたはその他の塗布器、例えば
へらで広げる）ことにより広げることができる。 【０２４７】 軟膏またはクリーム。これは、手で、またはブラシまたはその他の塗布器（例
えばへら）で広げるか、あるいは容器例えば押出しチューブから、ノズルまたは
その他の小さい開口部を通して押出すことができる。 【０２４８】 乾燥粉末。これは、潜在的なまたは実際の腫瘍細胞成長部位の上に振りかける
か、篩ってかけるか、あるいはまた噴霧スプレーとして付けることができる。 【０２４９】 液体ベースエアロゾル。これは、圧力駆動スプレー瓶（例えば握りしめて活性
化されるもの）、自然な噴霧器（または圧縮推進剤を用いずに作用する「ポンプ
スプレー」瓶）、または加圧キャニスターを含む群から選ばれた容器からディス
ペンスすることができる。 【０２５０】 カーボワックスまたはグリセリン調製物、例えば座薬。これは、モジュレータ
の直腸または膣投与に用いることができる。 【０２５１】 吸入による薬剤送達は、局所用（すなわち肺の内側表面に）でも全身分配用で
も、この技術でよく知られている。特に、その本来の活性をｉｎ ｖｉｖｏに保
持するように、タンパク質をエアロゾル吸入によって送り出すことができること
が証明されている（Ｈｕｂｂａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ． ，８４：１３４９−１３５４）。 【０２５２】 候補モジュレータの投与 投与量は、全身用量に基づいて計算される。血清中のある一定のモジュレータ
の本来の活性の半減期を考慮に入れると、平均循環投与量は、体重１ｋｇあたり
１０μｇ〜１００ｍｇであってもよい。好ましくはこれは１ｋｇあたり１００μ
ｇから１０ｍｇである。次いで、選ばれたキャリア組成物中のモジュレータの濃
度を、必要とされる投与量が都合のよい容積で送り出されるように調節する。出
発投与量または出発投与量の範囲を選ぶことは当業者の知識の範囲内にある。効
果がまったく見られないならば、１つまたは複数の出発投与量の上下の４つの位
数規模内にある投与量を試みる。 【０２５３】 一般に核酸分子は、投薬配合物と適合する方法で、および予防的および／また
は治療的に効果的であるような量で投与される。最終産物（例えばアンチセンス
ＲＮＡ分子またはリボザイム）が直接投与された時、投与される投与量は、分子
の摂取の効率のための補正因子と共に、１細胞あたり必要とされる量、および処
理される細胞の数に正比例する。遺伝子が、核酸分子から発現されなければなら
ない場合、関連転写調節配列の強度も、コードされた産物の適切なレベルを結果
として生じる１標的細胞あたりの核酸分子数を計算する上で考察されなければな
らない。適切な投与量範囲は、遺伝子発現構成体が投与される場合、単一用量に
おいて核酸０．５〜１μｇ、または１〜１０μｇ、または場合によっては１０〜
１００μｇ程度である。１ｍｇまでの投与量が有利に用いられ得ると考えられる
。１細胞あたりのモル当量数は、この構成体のサイズと共に様々であり、用いら
れるＤＮＡの絶対量は、大きい構成体が研究被験者または患者に投与された時、
適切な遺伝子コピー数を確保するためにこれに応じて調節されるべきであること
に留意のこと。最初の概算として、１細胞あたり１〜１０コピーの核酸分子当量
の量が送り出されるべきである。当業者は、核酸摂取を最適化するのに必要な標
的において、核酸分子対細胞の比を調節することができる。 【０２５４】 用いられるタンパク質またはその他の治療薬の量を考察する場合、標的部位、
組織、または細胞において所望の程度の活性を与える最低用量を用いるべきであ
る；あり得る副作用の可能性を最小限にするために、低い用量が有利であろう。
有用な投与量は一般に、約１μｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲にある。候補薬
剤がペプチドまたはポリペプチドである場合、一般的には１用量あたり約１００
〜５００μｇ／ｍｌの範囲で投与される。本発明において投与される組成物の生
物学的または治療的に有効な量は、とりわけ、組成物の細胞摂取の効率、投与ス
ケジュール、投与される単位用量、これらの組成物が他の治療薬と組み合わせて
投与されるかどうか、受容体の健康、および特定のタンパク質またはその他の製
薬物質の治療活性に依ることは当業者には明白であろう。本発明によるスクリー
ニングまたは治療のために投与された核酸にも当てはまるが、投与される必要が
あるタンパク質またはその他の製薬物質の正確な量は、実施者の判断に依るもの
であり、限定された範囲の値内で各被験者に固有なものであってもよい。 【０２５５】 その際インシュリンまたは脂肪酸代謝に対する効果が見られないならば、この
候補モジュレータは、効果がないと見なされる。アッセイされるパラメータのう
ちの１つまたはそれ以上について、基礎（治療前）値と治療後の値との間に少な
くとも２０％の変化が見られるならば、この候補物質は効果があると判定される
。 【０２５６】 候補モジュレータの薬理学的製剤 液剤、軟膏および液体をベースとしたエアロゾルの場合、好ましい溶媒は、阻
害剤の活性を保存し、組成物と接触させる細胞の浸透圧変化を回避する、生理学
的塩レベルを模擬した、イオン平衡を有する水性媒体である。かかる媒体の実施
例は、イオン強度の低い生理食塩水溶液または他の生理学的に適合性の緩衝液で
ある。本明細書に使用した「生理学的に適合性の緩衝液」または「生理学的緩衝
液」という用語は、生細胞と接触させて置いた場合に、数分間、数時間または数
日間におよび細胞の生存を可能とする液体組成物と定義する。従って、生理学的
緩衝液は、細胞と実質的に等張性であり、よって細胞容量は、内部および外部イ
オン強度の差異により２０％以上は変化しない。生理学的に適合性の緩衝液また
は生理学的緩衝液の非制限的な実施例は、緩衝化し得る希釈生理食塩水（例えば
、ＨＡＮＫＳの緩衝食塩水またはリン酸緩衝溶液）、または他の生理学的塩（例
えばリンガー液）、希グルコース、スクロースまたは他の糖、塩または糖を含む
または含まない希グリセロール、当分野で公知の細胞培養培地、血清および血漿
を含む。 【０２５７】 脂質、他の炭化水素、フルオロカーボンまたはハロゲンをベースとした媒体も
、それらが生理学的塩平衡を維持するように調合する。 【０２５８】 タンパク質または炭水化物を含む乾燥粉末は、沈降物の空気乾燥により、また
は凍結乾燥により製造し得、候補モジュレータは、乾燥粉末としてまたは結晶と
して商業的に公知であり入手可能である有機または無機塩である場合もある。ど
ちらの場合でも、操作を簡便にするために、候補モジュレータを、当分野で一般
的に知られる増量剤と配合することが望ましい。 【０２５９】 グルコースもしくは脂肪酸の代謝またはインシュリンもしくはカテコールアミ
ンの作用に関連した遺伝子活性のモジュレータは、タンパク質、炭水化物、核酸
または他の生分解性基質（例えば、有機または無機化合物）を含み得、それゆえ
、投与経路に応じて、少なくともそれらが標的に到達するまで、医薬分野で公知
の方法により、それを分解（例えば、消化酵素、酸および塩基による）から保護
するようにカプセル化または緩衝化することが必要であり得る。 【０２６０】 ｉ．インシュリン抵抗性遺伝子座に関連した遺伝子機能の候補モジュレータの ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ インシュリン抵抗性遺伝子座に連関したモジュレータのスクリーニング 本発明により同定した遺伝子は、薬剤標的として作用し得る。有用なスクリー
ニング法は、遺伝子の転写を、候補薬剤の存在下または非存在下でモニタリング
するという方法を含み、この場合、遺伝子の活性は、分子手段（例えば、天然遺
伝子またはその調節領域から誘導されるマーカー遺伝子のノザン解析、原位置ハ
イブリッド形成または定量ＰＣＲ）または生化学的／免疫学的技法（例えば、遺
伝子産物のウェスタンまたは免疫組織化学的検出、または遺伝子産物の機能的ア
ッセイ−例えば、コードされた産物が酵素、受容体等である場合）により評価し
得る。これらの手順の選択は以下に記載する。 【０２６１】 薬剤スクリーニングアッセイは、細胞非含有遺伝子発現系、細胞抽出物を含む
遺伝子発現系、または全細胞発現系、またはｉｎ ｖｉｖｏで実施し得る。最小
のものでは、本発明に従って実施したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、本発明によ
り同定した遺伝子の調節領域を含む遺伝子発現作成物を含み、この領域は、天然
遺伝子またはマーカー遺伝子（下記参照）に機能的に連関している。アッセイは
、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、遺伝子発現作成物の発現が可能な
条件下で実施する。ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（製造番号Ｌ
１１７０；Ｐｒｏｍｅｇａ）は、目的のＤＮＡおよび検出標識を除く、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ転写／翻訳に必要な全ての試薬を含む。入手可能なＴＮＴ（登録商標）
Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（
ウサギ網状赤血球溶解液を含む）群は、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ３Ｃｏｕｐｌｅｄ
Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（製造番号Ｌ４９
５０；Ｐｒｏｍｅｇａ）；ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃ
ｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（製造番号Ｌ４６１０；Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）；ＴＮＴ（登録商標）ＳＰ６Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙ
ｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（製造番号Ｌ４６００；Ｐｒｏｍｅｇａ）
；ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７／ＳＰ６Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ
Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（製造番号Ｌ５０２０；Ｐｒｏｍｅｇａ）；お
よびＴＮＴ（登録商標）Ｔ７／Ｔ３Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ
Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（製造番号Ｌ５０１０；Ｐｒｏｍｅｇａ）を含
む。 【０２６２】 細胞溶解液または全細胞に関するアッセイは、細胞溶解液、または全細胞、好
ましくは天然の真核細胞（例えば、酵母；真菌；ショウジョウバエなどの昆虫；
マウス；またはヒト）で実施し得る。細胞溶解液を使用するアッセイは、標準的
なｉｎ ｖｉｔｒｏ系で、遺伝子発現作成物の発現が可能な条件下で実施する。
ヌクレアーゼ処理（製造番号Ｌ４９６０）または非処理（製造番号Ｌ４１５１）
の、ウサギ網状赤血球溶解液単品も、Ｐｒｏｍｅｇａから入手できる。 【０２６３】 全細胞を使用するアッセイも公知であり、および、典型的には、目的の遺伝子
の調節領域がレポータ遺伝子に機能的に連関している遺伝子発現作成物の使用を
含み、かかる作成物は、培養中の細胞にトランスフェクトし、この細胞は、哺乳
動物細胞（好ましくは、本発明により同定した遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで発現す
る細胞型の）であり得るか、または別に、酵母または他の真核細胞、例えば昆虫
細胞を使用してもよい。かかる系でマーカー遺伝子の機能を検出する方法は下記
する。 【０２６４】 別に、リポータ遺伝子発現系は、ｉｎ ｖｉｖｏで、すなわち無傷の生多細胞
生物、例えばＳＨＲ系または上記した他の動物モデルで作動し得る。例えば、イ
ンシュリン抵抗性遺伝子座の１つに連関するとして、本発明により同定された遺
伝子活性の調節を指向する薬剤を、ＳＨＲに投与し、グルコース組み込みまたは
ＮＥＦＡ分泌などの臨床指標を、上記の方法により改善についてモニタリングす
る。 【０２６５】 結合アッセイ 薬剤スクリーニングの１つの方法は、候補モジュレータと、標的遺伝子または
タンパク質の間の直接的な物理的相互作用について、或いは目的の野生型または
変異型遺伝子またはタンパク質と、第二遺伝子、タンパク質または他の細胞成分
の間の直接的な相互作用の妨害または増強について試験する結合アッセイの実施
を包含する。ポリペプチドを発現する組換えポリヌクレオチド、核酸またはその
断片を用いて安定に形質転換し得る、真核または原核宿主細胞を、競合的結合ア
ッセイに使用し得る。生存形または固定形のかかる細胞を、標準的な結合アッセ
イに使用できる。特に、これらの細胞は、インシュリン抵抗性遺伝子座連関タン
パク質産物または断片および試験する物質を含む、複合体の形成を測定するため
に使用できる。別に、これらの細胞は、ＩＲＬ連関タンパク質産物または断片と
、そのタンパク質に特異的な既知のリガンドまたは受容体の間での複合体の形成
が、試験する物質により妨害されるかを決定するために使用できる。他の手順（
例えば、候補モジュレータの効果が、転写、ｍＲＮＡプロセシングまたは目的の
遺伝子転写物の翻訳にある、または候補モジュレータそれ自体が、核酸分子であ
る場合の手順）では、タンパク質：核酸または核酸：核酸複合体の形成をアッセ
イし得る。最後に、タンパク質でも核酸でもない候補モジュレータがＩＲＬ連関
タンパク質または核酸に結合できる能力をアッセイし得る。 【０２６６】 従って、本発明は、薬剤スクリーニングに有用な方法を開示し、かかる方法は
、候補薬剤を、変異型または野生型ＩＲＬ連関ポリペプチド、核酸またはその断
片に接触させ、（ｉ）薬剤と、変異型ＩＲＬ連関ポリペプチド、核酸または断片
の間の複合体の存在について、または（ｉｉ）変異型または野生型ＩＲＬ連関ポ
リペプチド、核酸または断片とリガンドの間の複合体の存在について、当分野で
公知の方法によりアッセイすることを含む。好ましくは、ＩＲＬ連関ポリペプチ
ド、核酸または断片は、競合的結合アッセイに使用するために標識する。標識タ
ンパク質またはペプチドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳または化学合成により、
標識アミノ酸または放射ヨウ素化を使用して製造する方法は当分野で公知である
。遊離標識タンパク質、ポリペプチドまたは断片を、タンパク質：タンパク質ま
たはタンパク質：核酸複合体に存在するものから分離し、遊離（すなわち複合体
非形成）標識の量を、標的への候補薬剤の結合、または標的タンパク質：リガン
ドまたは核酸：タンパク質結合を妨害する能力の指標として使用する。 【０２６７】 変異型または野生型ＩＲＬ連関ポリペプチドまたは他のポリペプチドへの適切
な結合親和性を示す化合物のハイスループットスクリーニングを可能とする、別
の薬剤スクリーニング法が詳細に記載されている（Ｇｅｙｓｅｎ、ＷＯ８４／０
３５６４）。この方法に従って、大量の異なる小ペプチド試験化合物を、プラス
チックピンなどの固相基質または別の適切な表面上で合成する。ペプチド試験化
合物を、検出可能な標識と複合体を形成した、変異型または野生型ＩＲＬ連関タ
ンパク質、ペプチド、遺伝子または他の標的と反応させ、次いで洗浄する。次い
で、結合した標識を当分野で公知の方法（オートラジオグラフィ、シンチレーシ
ョン計測および蛍光定量法を含むがこれに限定されない）により検出する。上記
したように、試験化合物の固定ライブラリーは市販されている。 【０２６８】 試験ライブラリーを支持体に固定する手順の代替法として、精製した標的ポリ
ペプチドまたは核酸を、前記薬剤スクリーニング技法に使用するプレート上に直
接覆膜できる。別に、ポリペプチドに対する非中和抗体または他の連結分子、例
えば標的核酸の目的の薬剤結合部位の外の部位に相補的なオリゴヌクレオチドを
使用して、ＩＲＬ連関ポリペプチド、ペプチド、核酸またはその断片を捕獲し、
それを固相支持体上に固定できる。 【０２６９】 変異型または野生型ＩＲＬ連関ポリペプチドに特異的に結合できる中和抗体が
、試験化合物と、ＩＲＬ連関ポリペプチドまたはその断片への結合について競合
する、競合的薬剤スクリーニングアッセイも本発明に有用である。この方法によ
り、抗体を使用して、ＣＤ３６と１つ以上の抗原決定基を共有する任意の試験ペ
プチドまたは他のポリペプチドの存在を検出できる。 【０２７０】 他の方法 薬剤スクリーニングのさらなる技法は、欠陥タンパク質を産生する変異型ＩＲ
Ｌ連関遺伝子を有する、宿主真核細胞系または上記したような細胞の使用を含む
。この方法に従って、宿主細胞系または細胞を、試験薬剤化合物の存在下で増殖
させる。宿主細胞の増殖速度を測定して、化合物が、非機能的ＩＲＬ連関タンパ
ク質産物を発現する細胞の増殖を調節できるかを決定する。別に、試験化合物が
、変異型ＩＲＬ連関タンパク質の機能を回復する能力は、上記したような、細胞
のグルコースまたは脂質代謝を定量するアッセイなどの、ＩＲＬ連関タンパク質
基能についての、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用することにより測定で
きる。宿主細胞系または細胞が、異常な細胞局在パターンを示す、ＩＲＬ連関タ
ンパク質を発現する場合、試験化合物が、ＩＲＬ連関タンパク質の細胞局在化を
変化させる能力を決定する。目的のタンパク質の細胞局在化の変化は、生合成的
に標識した細胞を用いた細胞分画試験を実施することにより検出し得る。別に、
目的のタンパク質の細胞局在化は、当分野で公知の免疫細胞化学的方法により決
定できる（下記参照）。 【０２７１】 薬剤スクリーニング法は、異常な発現パターンを示す、変化したＩＲＬ連関遺
伝子を有する、宿主真核細胞系または上記細胞の使用を含み得る。本明細書に使
用した「異常発現パターン」という用語は、異常に高いまたは低い発現レベル、
或いは、ある野生型遺伝子のものとは異なる空間的または一時的発現パターンを
意味する。かかる遺伝子の非制限的な実施例は、ＳＨＲラットＣＤ３６遺伝子で
ある。試験薬剤が、ＣＤ３６の変異形の発現を変化させる能力は、上記した結合
アッセイにより、またはノザンブロット解析、Ｓ１ヌクレアーゼ解析、プライマ
ー伸長、ＲＮアーゼ保護アッセイまたは下記した他の分子技法により測定できる
。別に、ＣＤ３６の変異形が、ＣＤ３６遺伝子のプロモータ領域に変異を含む場
合、細胞を工学して、リポータ遺伝子の発現を誘導する変異ＣＤ３６プロモータ
を含むリポータ作成物、例えばＣＡＴ、ルシフェラーゼ、緑蛍光タンパク質を発
現できる。これらの細胞は、試験化合物の存在下で増殖でき、試験化合物の、変
異ＣＤ３６プロモータの活性レベルを変化させる能力を、当分野で公知の各レポ
ータ遺伝子の標準的なアッセイにより決定できる（下記も参照）。 【０２７２】 レポータ遺伝子 レポータ遺伝子を使用する場合、その発現が、ｍＲＮＡまたはタンパク質産生
に関してモニタリングできるように選択し、ここでのタンパク質産生は、存在す
るタンパク質の量の直接的測定により、またはタンパク質活性（例えば酵素活性
）の測定により評価し得る。本発明で使用するレポータ遺伝子は、細菌遺伝子Ｌ
ａｃＺ（酵素β−ガラクトシダーゼをコードする）、およびＣａｔ（酵素クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする）、Ｌｕｃ
（ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）をコードする）、ｇｆｐ（緑蛍光タンパク質（ｇｆ
ｐ、紫外線光に曝露すると、ｉｎ ｖｉｖｏで蛍光を発する）をコードする）、
ｈｒｐ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｒｐ）をコードする）、ヘル
ペスウイルスｔｋ遺伝子（酵素チミジンキナーゼ（ｔｋ）をコードする）、およ
びショウジョウバエ遺伝子Ａｄｈ（アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）をコ
ードする）、およびＲｏｓｙ（キサンチンデヒドロゲナーゼ（Ｘｄｈ）をコード
する）を含むが、これに限定されない。 【０２７３】 レポータ遺伝子のタンパク質産物は、酵素の活性などのその活性を、その基質
および必要であれば指示化合物（酵素により基質が変換されるとシグナルを発生
する）の存在下でモニタリングすることにより、間接的に検出し得る。かかる指
示薬は、レポータ遺伝子産物の触媒活性の結果として遊離または別様に活性化さ
れる、色素生産性または蛍光性指示薬であり得、指示薬は、基質分子と複合体を
形成していても、分離していてもよい。上記に列挙したレポータ酵素の活性につ
いての生化学的アッセイは当分野で公知である。 【０２７４】 インシュリン抵抗性遺伝子座関連遺伝子発現の検出 上記したように、インシュリン抵抗性遺伝子座の１つに連関した、遺伝子活性
のレベルまたは性質を、時候補モジュレータをｉｎ ｖｉｖｏでアッセイする場
合の、表現型指標の観察を含む、多くの手段のいずれかにより測定できる。別に
、核酸またはタンパク質のレベルまたは分布、または、標的遺伝子それ自体の、
または標的遺伝子の調節配列に機能的に連関したレポータ遺伝子のタンパク質活
性の測定を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ系で実施してもよい。本発
明に記載の薬剤スクリーニングプロトコルに有利に適用され得るこれらの多くの
検出法を、以下に要約する： ａ．標的インシュリン抵抗性遺伝子座連関遺伝子活性に対する、候補薬剤の効 果の表現型定量化 グルコースまたは脂肪酸代謝に対する候補薬剤の効果をアッセイするために、
上記のグルコース組み込みまたは脂肪分解アッセイを、細胞または試験動物（例
えばＳＨＲまたはＧＫラット、または他のラットまたはマウス株）で上記のよう
に実施し得る。 【０２７５】 ｂ．タンパク質またはｍＲＮＡの検出 ＲＮＡの検出 ｍＲＮＡ転写物の検出は、当分野で公知の分子技法により実施し得、これらの
技法は、核酸ハイブリッド形成（ノザン解析など）、相補配列（すなわち緊縮調
節ハイブリッド形成条件下で、ワトソン−クリック塩基対を介して、転写物にハ
イブリッドする配列）を有する固定核酸分子への親和性結合、オリゴヌクレオチ
ドプライマーを使用した逆転写、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ）を含むがこれに限定されない。 【０２７６】 ｉ．ノザン解析 ノザン解析などの分子法は当分野で公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８
９、分子クローニング、実験マニュアル、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ、ＮＹ参照）。 【０２７７】 ｉｉ．ＲＴ−ＰＣＲ ノザン解析の代替法として、逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
を実施し得る。ＲＴ−ＰＣＲの逆転写（ＲＴ）段階では、ＲＮＡは、第一鎖ｃＤ
ＮＡに変換され、これは比較的に安定であり、ＰＣＲ反応に適した鋳型である。
第二の段階で、目的のｃＤＮＡ鋳型をＰＣＲを使用して増幅する。これは、配列
特異的プライマーを、鋳型の一方の鎖にアニーリングし、熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼを使用して、それらから相補ＤＮＡの新規な鎖を合成するというサイクル
を繰返すことにより達成される。 【０２７８】 １μｇの全ＲＮＡおよび７５ｐｍｏｌのランダム六量体プライマー（例えばＰ
ｄ（ｎ）６、Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪにより供給）を
、ＤＥＰＣで処理した水を含む１０μｌの容量で、ＲＮアーゼ非含有０．５μｌ
チューブに再懸濁した。この混合物を７０℃で１０分間インキュベートし、２分
間氷上に放置する。以下の試薬を１０μｌの反応液に加える。１μｌ（２００Ｕ
）ＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素、ＢＲＬ、
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、４
μｌの５ｘ反応緩衝液（ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭ
ｄＮＴＰおよび１μｌのヒト胎盤ＲＮアーゼ阻害剤（１０〜５０単位／μｌ；Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）。
さらに、各ＲＮＡサンプルについて、第二反応液を調製し、但しＭＭＬＶ−ＲＴ
は除外する（ＲＴ陰性対照）。１９μｌの反応液を、５０分間４２℃で、プログ
ラム可能な熱サイクラー（例えば、ＭＪ Ｒｅｓｅｒｃｈにより製造；Ｗａｔｅ
ｒｔｏｗｎ、ＭＡ）中でインキュベートし、９０℃まで５分間加熱することによ
り不活性化する。３７℃まで冷却した後、１μｌのＲＮアーゼＨ（３単位／μｌ
；ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、
ＭＤ）を加え、反応液を３７℃で２０分間インキュベートし、次いで、４℃まで
冷却する。ＲＮＡの完全性が、構成的に発現する遺伝子（例えば、アクチン、イ
ンターロイキン−２またはＧαｓ）の転写物の増幅により確認され、それゆえ、
試験サンプルでその後に観察された陰性結果は、その特異的ｍＲＮＡの欠失に原
因を帰し得、ｍＲＮＡプールの分解または逆転写反応の失敗には帰し得ないこと
が確認される。 【０２７９】 次いで、ポリメラーゼ連鎖反応すなわちＰＣＲを、以前に記載された通りに実
施する（ＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏｏｎａ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ ｚｙｍｏｌ． ，１５５：３３５−３５０、本明細書に参考として組み込む）。Ｐ
ＣＲ（これは、熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮ
Ａ複製を多サイクル使用して、目的の標的配列を増幅する）は当分野で公知であ
る。 【０２８０】 本発明で有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸鋳型にハイブリッドし
、第二核酸鎖の酵素的合成を開始する、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
プライマーは、核酸分子のプールに存在する標的分子の一部に相補的である。か
かる分子は、化学的または酵素的な合成法により調製されると考えられる。別に
、かかる分子またはその断片は天然に存在し、その天然源から単離するか、また
は業者から購入する。オリゴヌクレオチドプライマーは、１５〜１００ヌクレオ
チド長であり、理想的には２０〜４０ヌクレオチドであるが、異なる鎖長のオリ
ゴヌクレオチドも有用である。 【０２８１】 典型的には、選択的なハイブリッド形成は、２つの核酸配列が実質的に相補的
である場合に起こる（少なくとも１４〜２５ヌクレオチドにおよび、少なくとも
約６５％相補的、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約
９０％相補的）。Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．，１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓ． １２：２０３（本明細書に参考として組み込む）参照。緊縮調節
アニーリング条件下で、より長いハイブリッド形成プローブ（例えば、ノザン解
析に使用）または合成プライマーは、より短いもの（これはより許容的な条件下
で十分である）より効率的にハイブリッドする。緊縮調節ハイブリッド形成条件
は、典型的には、約１Ｍ以下、より通常には約５００ｍＭ以下、好ましくは約２
００ｍＭ以下の塩濃度を含む。ハイブリッド形成温度は、０℃という低い温度か
ら、２２℃以上、約３０℃以上、および（最も頻繁には）約３７℃以上の範囲で
ある。より長い断片は、特異的ハイブリッド形成のために、より高いハイブリッ
ド形成温度を必要とし得る。数個の因子がハイブリッド形成の緊縮に影響を及ぼ
すので、パラメータの組合せが、１つの因子の絶対的測定よりも重要である。 【０２８２】 電気泳動を用いずに定量的にＰＣＲ産物を検出する数個の技法を、本発明の薬
剤スクリーニングアッセイと共に有利に使用し、より簡単に臨床に使用するのに
適したものとし得る。これらの技法の１つ（これには、ＴａｑｍａｎＴＭ（Ｐｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）などの市販で入手でき
るキットがある）は、転写特異的アンチセンスプローブを用いて実施される。こ
のプローブは、ＰＣＲ産物（例えば、レポータ遺伝子またはインシュリン抵抗性
遺伝子座連関標的遺伝子から得られる核酸断片）に特異的であり、オリゴヌクレ
オチドの５’末端に複合体形成した消光物質および蛍光リポータプローブを用い
て調製される。異なる蛍光マーカーは、異なるレポータに結合し得、１つの反応
で２つの産物の測定が可能となる。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが活性化されると
、その５’から３’の核酸溶解活性により蛍光レポータは切断される。ここで消
光物質のないレポータは発光する。色変化は、各特異的産物の量に比例し、蛍光
測定計により測定し、それゆえ、各色の量を測定でき、ＲＴ−ＰＣＲを定量化で
きる。レポータ遺伝子転写物の検出は、有利には、ＲＮＡの逆転写および目的の
転写物の特異的増幅のための１つのチューブ反応で実施し得る。ＡｃｃｅｓｓＴ Ｍ ＲＴ−ＰＣＲ系（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などの市販のキッ
トは慣用的には、このように方法を実施するのに必要な全ての物質（プライマー
を除く）を構成する。この技法による１チューブＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用し
て、血清または他のサンプルをアッセイし得る。 【０２８３】 別に、ｍＲＮＡ転写物の原位置検出は、下記のように調製した、ガラス表面に
固定した、「押しつぶした」細胞物質または切片化組織サンプルを使用して実施
し得る。パラフィン、プラスチックまたは凍結（Ｓｅｒｒａｎｏら、１９８９、
Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３２：４１０−４１８）切片を、下記したように調製した
後者に使用する。押しつぶしたまたは切片化した組織を調製した後、サンプルの
ＲＮＡ分子を原位置で逆転写する。 【０２８４】 逆転写は、逆転写酵素、（例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、ＡＭ
Ｖ−ＲＴ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬまたはモ
ロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、製造業者の推奨
する反応条件下で実施する。 【０２８５】 逆転写後に、試薬をピペットで取り出し、調製物を、得られたｃＤＮＡ分子を
増幅する前に、ＴＥ緩衝液で十分に濯ぐ。次いで、増幅反応を実施し、増幅産物
を検出する。 【０２８６】 タンパク質の検出 本発明はまた、レポータ遺伝子タンパク質を検出する、スクリーニングアッセ
イに関する。タンパク質の検出は、精製（例えば、タンパク質、タンパク質の二
量体形成対、またはタンパク質に対して指向する抗体に結合する、受容体または
リガンドを使用した、親和性精製）、免疫学的検出（例えば、ウェスタンブロッ
トで、または、固定もしくは凍結細胞もしくは組織の標本のタンパク質に対する
抗体の原位置結合により免疫組織化学的に）、またはタンパク質産生が起こる前
および十分な時間の後のレポータ遺伝子発現系のエネルギー吸収測定（例えば、
分光測定または蛍光測定）などにより直接的に実施し得る。 【０２８７】 レポータタンパク質検出は、例えば、レポータ遺伝子産物（すなわち抗原）に
特異的な抗体を使用して達成し得る。抗体は、慣用的な方法に従って調製する。 【０２８８】 ｉ．抗体の調製 組換えタンパク質または天然源由来のタンパク質を使用して、当業者に公知の
標準的な技法を使用して抗体を作成できる。例えば、タンパク質を投与して、サ
ル、ヤギ、ウサギまたはマウスなどの哺乳動物を攻撃する。得られた抗体をポリ
クローナル血清として回収するか、または攻撃した動物から得られた抗体産生細
胞を不死化（例えば、不死化融合対との融合により）し、モノクローナル抗体を
作成できる。 【０２８９】 １．ポリクローナル抗体 抗原タンパク質を慣用的な担体に結合して、その免疫原性を高め、ペプチド−
担体結合に対する抗血清を生成する。ペプチドの担体タンパク質への結合および
免疫化は、記載の通りに実施し得る（Ｄｙｍｅｃｋｉら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ． ，２６７：４８１５−４８２３）。血清を、ＥＬＩＳＡ（下記）
によりタンパク質抗原に対して滴定するか、または別法としてドットまたはスポ
ットブロッティング（ＢｏｅｒｓｍａおよびＶａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ、１９９４
、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、５１：３１７）により滴定する。同
時に、抗血清を、下記のように調製した組織切片に使用し得る。血清は、例えば
、Ｇｒｅｅｎら、１９８２、Ｃｅｌｌ、２８：４７７−４８７の手順に従って、
ＥＬＩＳＡにより、適切なペプチドと強力に反応することが示される。 【０２９０】 ２．モノクローナル抗体 モノクローナル抗体の調製技法は公知であり、モノクローナル抗体は、レベル
を測定すべきである、または不活性化または親和性精製すべき、好ましくは担体
に結合した、候補抗原を使用して、Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９
４、２７８−２８０（１９８１）に記載のように調製し得る。 【０２９１】 モノクローナル抗体は、典型的には、ハイブリドーマ組織培養物から、または
ハイブリドーマ組織を導入した動物から得られた腹水液から得られる。それにも
関わらず、モノクローナル抗体は、「生じる」またはタンパク質「により誘導」
されると記載され得る。 【０２９２】 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（またはポリクローナル血清）を、標
的タンパク質への抗体の結合についてスクリーニングできる。抗体により、我々
は、かかる抗体の結合（可変）領域および他の抗体修飾を使用した作成物を含む
。従って、本発明で有用な抗体は、全抗体、抗体断片、多機能抗体凝集物、また
は一般に抗体の１つ以上の特異的結合部位を含む物質を含み得る。抗体断片は、
Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片またはその誘導体、例えば単鎖Ｆｖ断片
などの断片であり得る。抗体または抗体断片は、非組換え、組換えまたはヒト化
であり得る。抗体は、免疫グロブリンアイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ等で
あり得る。さらに、免疫グロブリンまたはその断片の凝集物、ポリマー、誘導体
および結合を適宜使用できる。 【０２９３】 ｉｉ．免疫学的検出法 特に好ましい免疫学的試験は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の使
用に依拠し、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、イムノブロットおよび免
疫沈降法（Ｖｏｌｌｅｒ、１９７８、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ 、２：１−７、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕ
ａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ；
Ｖｏｌｌｅｒら、１９７８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，３１、５０７−５
２０；米国再発行特許第３１，００６号；英国特許第２，０１９，４０８号；Ｂ
ｕｌｔｅｒ、１９８１、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３：４８２−５
２３；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ（編）、１９８０、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ参照）またはラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ、ラジオイムノアッセイの原 理 、Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉ
ｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ
Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８６年３月、ｐｐ．１−５、４６−４９および６８−７８
）を含む。本発明のタンパク質の存在下または非存在下で組織を解析するために
、免疫組織化学技法を使用し得る。これらの方法により解析する組織サンプルは
、下記のように調製する。標的タンパク質を容易に検出するために、抗体分子を
標識しなければならないことは当業者には明らかである。抗体分子の標識技法は
、当業者には公知である（ＨａｒｌｏｕｒおよびＬａｎｅ、１９８９、Ａｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ 、Ｃｏｌｄ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐｐ．１−７
２６参照）。 【０２９４】 別に、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、ウェスタンブロット、ＨＰＬＣお
よびキャピラリー電気泳動などのクロマトグラフィ法を含む、他の技法を使用し
て、標的タンパク質を検出することもできる。 【０２９５】 組織学的サンプルの調製 ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の原位置検出に使用する組織サンプルを、上
記のように得、凍結または慣用的な試薬の使用により固定し、かかるサンプルは
、全細胞または押しつぶした細胞を含んでも、その代わりに切片化組織を含んで
もよい。かかる手順に適切な固定液は、ホルマリン、等張緩衝液中４％パラホル
ムアルデヒド、ホルムアルデヒド（各々、サンプルの核酸分子に対するＲＮＡア
ーゼ抵抗性の指標を付与する）または多成分固定液、例えばＦＡＡＧ（８５％エ
タノール、４％ホルムアルデヒド、５％酢酸、１％ＥＭ等級グルタルアルデヒド
）を含むがこれに限定されない。ＲＮＡの検出において、組織を包埋されるまで
曝露する、溶液の水性成分の調製に使用する水は、ＲＮＡを含まず、すなわち、
０．１％ジエチルプロカーボネート（ＤＥＰＣ）を用いて室温で一晩処理し、そ
の後１．５〜２時間オートクレーブにかけることを注記する。組織を４℃で、サ
ンプルローラーまたは振盪プラットフォーム上で、１２〜４８時間で固定し、サ
ンプルの中心に固定液が到達させる。 【０２９６】 包埋前に、サンプルから固定液を一掃し、脱水するが、これは、開始時６０％
〜、終了時９５％〜の２回のエタノール洗浄を行い、さらに１００％エタノール
で２回洗浄して終了する、漸増濃度のエタノールの一連の２〜１０分間の洗浄を
通して、その後、キシレン中で２回１０分間洗浄して達成される。サンプルを、
多様な切片化支持体、例えばパラフィン、プラスチックポリマーまたは混合パラ
フィン／ポリマー媒体（例えば、Ｐａｒａｐｌａｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｔ
ｉｓｓｕｅ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｌａｂｗａｒ
ｅから供給）の１つに包埋する。例えば、固定し脱水した組織を、第二のキシレ
ン洗浄液から、約５８℃の液相中のパラフィンまたはパラフィン／ポリマーレジ
ンに移し、次いで、約３時間かけて３〜６回交換し、残留キシレンを希釈して除
去し、真空下５８℃で一晩インキュベートし、包埋培地の組織への浸潤を最適化
する。翌日、培地を２０分から１時間間隔で、ここでも５８℃で培地を数回さら
に交換した後、組織サンプルを切片化したカビに配置し、カビは表氷に囲まれ、
培地を硬化させる。厚さ６μｍの切片をとり、タンパク質性基質物質、通常ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）で覆膜して粘着を促進したものである、「下塗り」ス
ライドに加える。別の固定および包埋法も、本発明の方法における使用に適用可
能であり、これらの例は、凍結切片化のように、Ｈｕｍａｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．、１
９７９、Ａｎｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 第４版（Ｗ．Ｈ
．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）に見られる（Ｓ
ｅｒｒａｎｏら、１９８９、上記）。 【０２９７】 Ｆ．本発明による疾病の診断法 本発明による疾病診断は、患者からの生物学的サンプルにおいて、インシュリ
ン抵抗性遺伝子座に連関した遺伝子、特にＣＤ３６遺伝子の変異の検出を含む。
このヒト遺伝子およびそのラット相同体Ｃｄ３６における変異が、インシュリン
媒介グルコース組み込み、カテコールアミン媒介脂質分解、血中トリグリセリド
およびリポタンパク質レベルおよび高血圧の欠陥と連関していることが判明し、
数個のかかる変異を以下に開示する。これらの知見により、これらの変化とＣＤ
３６欠損症の間の連鎖の最初の認識が示される。目的の遺伝子の変異を検出する
方法は以下のように簡潔に記載する。 【０２９８】 ｉ．本発明に使用する生物学的サンプルの調製 本発明に記載の生物学的液体および細胞溶解液 本発明による変異の検出に使用するのは、細胞を含む体液であり、ここでの細
胞は、普通、液体に存在するか（例えば血中のリンパ球）または液体が通過する
固体組織から液体へ流れ出る。本発明に使用する液体は、血液、血清、血漿、粘
液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液および精子
を含む。本発明による生物学的液体のアッセイは、特に有利である。かかるサン
プルの獲得は、比較的非侵襲的であり、典型的には最も標準的な静脈切開（採血
）を必要とするからである。 【０２９９】 生物学的液体の細胞を全体的にアッセイしても、溶解してもよい。細胞溶解液
からＤＮＡを調製する方法は、典型的には、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０または同
等な試薬Ｉｐｅｇａｌ ＣＡ−６３０（製造番号Ｉ３０２１、Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（これは核エンベロープを溶解しない）などの洗浄剤で形
質膜を破壊し、次いで、遠心分離により核を単離し、トリトンＸ−１００（例え
ば製造番号Ｔ９２８４；Ｓｉｇｍａ）などの洗浄剤を含む緩衝液中で核エンベロ
ープを破壊する。別法として、細胞破壊剤として低張緩衝液を使用するプロトコ
ルを、以前に記載されたように、使用し得る（ユニット１２．１、「Ｐｒｅｐａ
ｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘ
ｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，ｉｎ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編、１９９５、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．参照）。
細胞溶解液は、培養哺乳動物細胞から、または哺乳動物の固体組織から得られた
細胞から同等な方法により調製され得る。かかる組織は、外科的な生検により哺
乳動物から収集しても、こするまたは拭き取ることにより得てもよい（例えば、
口腔または他の生体腔の内張り）。組織からのＤＮＡを単離するプロトコルを下
記する。 【０３００】 ｉｉ．哺乳動物からの生物学的サンプルにおける変異の検出 ＤＮＡサンプルは、任意の組織または細胞系から調製し得、調製手順は当分野
で公知である。ゲノムＤＮＡの組織からの調製は、以下のように実施する。約１
００ｍｇの組織を、５００μｌのＴＢ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８
．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、６００μｇ／ｍｏｌプロテイナーゼ
Ｋ）中に入れ、一晩５５℃でインキュベートする。次いで、サンプルを５００μ
ｌの１：１（ｗ／ｗ）のフェノール／クロロホルムで抽出し、２容量のエタノー
ルで沈降させる。次いで、ＤＮＡペレットを５００μｌのＨ２Ｏに再懸濁する。 【０３０１】 ｃＤＮＡサンプルもまた、本発明により同定した遺伝子における変異の検出に
使用し得る。上記したように、ｃＤＮＡの調製は公知であり、従来技術に十分に
記載されている。 【０３０２】 本発明によるＤＮＡサンプルの獲得に有用な組織は、血球、配偶子、脳、性腺
、肝臓、心臓、腎臓、副腎、脾臓および筋肉を含むがこれに限定されず、一方、
ＲＮＡサンプルは、目的の遺伝子を発現する組織から最善に得られる。遺伝子の
ｍＲＮＡ発現パターンは、様々な組織で実施するノザン解析、原位置ハイブリッ
ド形成、またはｉｎ ｖｉｖｏ試験などの方法により決定し得、目的の遺伝子の
調節領域により誘導されるマーカー遺伝子の発現を、トランスフェクト細胞培養
液またはトランスジェニック動物で試験する。 【０３０３】 本発明に有用なプローブは、目的の遺伝子に独特であり、好ましくは３０〜４
０ヌクレオチド以下であり、最適には２５ヌクレオチド以下、例えば１８〜２２
ヌクレオチドで、最小１０ヌクレオチドである、配列を有する核酸である。核酸
プローブの調製および標識化、並びに、プローブ検出法は公知であり、従来技術
に十分に記載されている。 【０３０４】 一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）スクリーニングおよび蛍光ＳＳＣ Ｐスクリーニング 生物におけるＤＮＡ変異を検出する１つのアプローチは、一本鎖コンフォメー
ション多型（ＳＳＣＰ）である（Ｇｌａｖａｃら、１９９３、Ｈｕｍ．Ｍｕｔ． 、２：４０４；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら、１９９３、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１６：３
２５）。ＳＳＣＰは、一塩基変異を検出する簡単で効果的な技法である。この技
法は、一本鎖ＤＮＡ分子が、非変性条件下で、特異的配列に基づいた二次構造（
配座異性体）をとるという原則に基づく。一本鎖コンフォメーション多型による
点変異の検出は、一本鎖ＤＮＡの構造の変化に起因すると考えられる。一塩基置
換のみが異なる分子でも、異なる配座異性体を形成し得、非変性ポリアクリルア
ミドゲルで別様に移動し得る。変異一本鎖ＤＮＡは、ポリアクリルアミドゲル上
での異常な移動度により同定される。プローブ領域内（ＰＣＲプライマー間）に
存在する全種類の点変異および短い挿入または欠失を、見かけ上等しい効率で検
出できる。この技法は、複数の変異および多型の検出に有用であることが判明し
た。ＳＳＣＰ感度は、解析するＤＮＡ断片のサイズにより劇的に変化する。ＳＳ
ＣＰによる感度の高い検出に最適のサイズ断片は、約１５０〜３００ｂｐである
。この手順でゲル上に検出できるような、標識ＰＣＲ産物の調製法は、当分野で
公知である。 【０３０５】 ＳＳＣＰ解析を以下の通りに実施する。１０μｌのホルムアミド色素（９５％
ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．
０５％キシレンシアノール）を、１０μｌの放射標識ＰＣＲ産物に加える。反応
液を１００℃で５分間変性し、次いで氷上に置く。２μｌを、８％アクリルアミ
ド：ビスアクリルアミド（３７．５：１）、０．５ＸＴＢＥ（４５ｍＭトリスホ
ウ酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、５％グリセロールゲル上にのせる。電気泳動を２
５Ｗで、４℃で、８時間、０．５×ＴＢＥ中で実施する。乾燥させたゲルをＸ−
ＯＭＡＴ ＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝露し、オートラジオグラフを、異常
なバンド移動（バンドシフト）について評価する。ＳＳＣＰを、Ｇｌａｖａｃら
、１９９３、Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．，２：４０４で教えるように、所望の通り最適化
し得る。 【０３０６】 ｆＳＳＣＰ解析 ＤＮＡサンプルを、蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）アッセイを使用して、本発明
によりマッピングし同定した遺伝子の変異についてアッセイし得る（Ｍａｋｉｎ
ｏら、１９９２、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．２：１０；Ｅｌｌｉｓｏ
ｎら、１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：６８４）。ＰＣＲ産物を
可視化し、ＡＢＩ蛍光ＤＮＡ配列機を使用して解析する。異なる色の蛍光色素（
例えば、ＨＥＸ、ＦＡＭ、ＴＥＴおよびＪＯＥ）を異なるプライマー対に使用で
きる。ｆＳＳＣＰのＳＳＣＰに優る利点は、後者は、放射性物質の操作が必要で
あるが、ｆＳＳＣＰは必要でないことである。データ回収は自動であり、データ
解析プログラムを使用して、異常移動サンプルの信号を出すことが可能であり、
一方、ＳＳＣＰ評価は、眼による検査を含み、電気泳動状態でのレーン毎の修正
は不可能であり、有用なデータ回収および解析ソフトウェアは、ジーンスキャン
およびゲノタイププログラム（ＡＢＩ）を含むがこれに限定されない。 【０３０７】 ＳＳＣＰ手順により、変異を含む１５０〜３００塩基対の領域が同定される。
具体的に配列変化を同定するために、異常移動を示す断片を、非蛍光プライマー
を使用して、変異を有する哺乳動物ＤＮＡから再度増幅し、配列を標準的なＤＮ
Ａ配列技法を使用して決定する。 【０３０８】 変性勾配ゲル電気泳動 変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）は、僅か一塩基対の配列が変化したＤＮＡ
断片の電気泳動分離を可能とするゲルシステムである。分離は、野生型および変
異型分子が鎖解離する温度の差異に基づく。断片がゲルを移動するにつれて、ゲ
ル中の漸増濃度の変性剤に曝露される。分子が臨界変性レベルまで到達すると、
ＤＮＡ鎖は解離し始める。これにより、断片移動度は有意に減少する。この臨界
点の位置は、Ｔｍの関数であり、これは野生型と変異型分子の移動度遅延が異な
る点であり、よって分離が起こる。断片サイズは、ポリアクリルアミドゲルの分
解限界により、１００〜８００ｂｐに制限される。ＤＧＧＥによりゲルからゲノ
ムＤＮＡ断片を効率的に移行する方法については、米国特許第５，１９０，８５
６号参照。 【０３０９】 ミスマッチの化学的切断 ミスマッチの化学的切断（ＣＣＭ）による変異の検出は、インシュリン抵抗性
遺伝子座に連関した遺伝子の変異を同定するに有用な別の変異走査技法である。
それは、ＤＮＡヘテロ二本鎖のミスマッチと反応する、化学物質ヒドロキシルア
ミンおよび四酸化オスミウムに依拠する。ピペリジンによるその後の処理により
、ミスマッチ点でヘテロ二本鎖は切断される。変性ポリアクリルアミド上で非処
理ヘテロ二本鎖よりも小さい断片を変異として検出する。１ｋｂのサイズまでの
ＤＮＡ断片を走査できることと合わせて、約１００％の検出率により、ＣＣＭは
理想的な変異検出法のようである。ＣＣＭは、ＤＮＡ断片の全ての変異を検出す
ることが望ましいか、または変異を含まないＤＮＡ片を検出することが望ましい
場合に、特に有用である。 【０３１０】 一定変性剤キャピラリー電気泳動（ＣＤＣＥ）解析 ＣＤＣＥは、ハイスループットスクリーニングに特に有用であり、すなわち大
量のＤＮＡサンプルを解析する場合に有用である（例えば、系図により、インシ
ュリンまたは脂肪酸代謝の欠陥が、インシュリン抵抗性遺伝子座を含む遺伝子ま
たは染色体領域に連鎖していることが判明した家族のメンバーのサンプルの処理
を試みる場合）。この方法はＫｈｒａｐｋｏら（１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ 、２２［３］：３６４）により詳述され、キャピラリー電気泳
動において一定温度および変性剤濃度の領域の使用を含む。検出の相対的限界は
、約３／１０，０００であり、すなわち、３×１０８野生型配列中に１００，０
００の変異配列が認識される。 【０３１１】 ＲＮアーゼ切断 ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＴ１およびＲＮアーゼＴ２を含む、様々なリボヌク
レアーゼ酵素は、特異的に一本鎖ＲＮＡを消化する。ＲＮＡをアニーリングして
二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を形成させると、これらの酵素により
もはや消化され得ない。しかし、ミスマッチが二本鎖分子に存在すれば、ミスマ
ッチ点での切断は起こり得る。 【０３１２】 リボヌクレアーゼＡは特異的に一本鎖ＲＮＡを消化する。この酵素はまた、ミ
スマッチ点でヘテロ二本鎖分子を切断できる。技法は、放射標識一本鎖ＲＮＡプ
ローブ（リボプローブ）と、変異哺乳動物から得られたＰＣＲ産物の間のヘテロ
二本鎖形成に基づく。得られたヘテロ二本鎖は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド二
本鎖である。ＲＮアーゼＡで処理すると、点変異が存在する場合、二本鎖のＲＮ
Ａ鎖は切断され得る。次いで、サンプルを加熱して変性し、変性ポリアクリルア
ミドゲル上で走行させる。ＲＮＡプローブが切断されていれば、そのサイズはＰ
ＣＲ産物よりも小さい。１ｂｐという小さな欠失も容易に検出できる。 【０３１３】 ヘテロ二本鎖解析 ヘテロ二本鎖分子、すなわちミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ分子は、普通のゲ
ル上でホモ二本鎖から分離できる。ＤＮＡ断片の中間部のミスマッチは、最も容
易に検出される。ヘテロ二本鎖解析は感度が低いが、その簡易さから本発明に有
用であると考えられ得る。 【０３１４】 ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ） ＭＲＤは、ＤＮＡ配列変異を検出するために、細菌コロニーの色の変化を利用
するｉｎ ｖｉｖｏ法である。変異についてスクリーニングすべきＤＮＡ断片を
、２つのＭＲＤプラスミドにクローン化し、細菌を、これらの作成物のヘテロ二
本鎖を用いて形質転換する。得られたコロニーは、ミスマッチの非存在下で青で
あり、ミスマッチ存在下では白である。ＭＲＤは、１０ｋｂのサイズという大き
なＤＮＡ断片において１つのミスマッチを検出することができる。ＭＲＤにより
、遺伝的変異のハイスループットスクリーニングが可能となり、詳細に記載され
ており（Ｆａｈａｍら、１９９５、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、５：４７４）、家
系解析などの手順に有用である。 【０３１５】 ＤＮＡ修復酵素によるミスマッチ認識 ＤＮＡ修復は、変異検出に活用できる可能性のある別の系である。Ｅ．ｃｏｌ
ｉミスマッチ修正システムは十分に理解されている。メチル基指向ＤＮＡ修復経
路に必要な３つのタンパク質：ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬおよびＭｕｔＨは、潜在的な
８中７つの一塩基対ミスマッチ（Ｃ／Ｃミスマッチではない）を認識し、最も近
いＧＡＴＣ配列でＤＮＡを切断／ニック化するに十分である。ＭｕｔＹタンパク
質（これは異なる修復系に関与する）もまた、Ａ／ＧおよびＡ／Ｃミスマッチの
検出に使用できる。いくつかの哺乳動物酵素も有用である：チミジングリコシラ
ーゼは全種類のＴミスマッチを認識でき、「全種類エンドヌクレアーゼ」または
トポイソメラーゼＩは、全８つのミスマッチを検出できるが、ミスマッチおよび
隣接配列の種類の両方に応じて、様々な効率で検出する。ＭｕｔＳ遺伝子産物は
、一塩基対長以上のミスマッチに結合する、メチル基指向修復タンパク質である
。ゲル移動度アッセイを実施でき、ＭｕｔＳタンパク質に結合したＤＮＡは、遊
離ＤＮＡよりもアクリルアミドゲルをよりゆっくりと移動する。 【０３１６】 別の型式のＭｕｔＳミスマッチ認識（これはゲル電気泳動を必要としない）は
、ニトロセルロース膜へのＭｕｔＳタンパク質の固定を含む。標識ヘテロ二本鎖
ＤＮＡを使用して、ドット−ブロット形式で膜を探索する。両ＤＮＡ鎖を使用す
る場合、全てのミスマッチは、膜へ付着したタンパク質へのＤＮＡの結合により
認識できる。 【０３１７】 ハイブリッド形成による配列決定 ハイブリッド形成による配列決定において（ＳＢＨ、オリゴヌクレオチドマト
リクスへのハイブリッド形成による配列決定、すなわちＳＨＯＭとも呼ばれる。
Ｄｒｍａｎａｃら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０（５１１４）：１６４９
−５２；Ｋｈｒａｐｋｏら、１９９１、上記；Ｍｕｇａｓｉｍａｎｇａｌａｍら
、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：８００−８０５）
、短い（８〜１０塩基長）オリゴヌクレオチドアレイを、リバースドットブロッ
トと類似の様式で固相支持体に固定し、標的ＤＮＡ断片で探索する。このシステ
ムは、オリゴヌクレオチドを支持体上で共に直接的に合成するという先端化学に
基づく。３２サイクルの特定の添加（すなわち、４つの各ヌクレオチドを８回添
加）により、チップの一定の位置で、可能な全６５，５３６の８ｍｅｒオリゴヌ
クレオチドの製造が可能になる。チップをＤＮＡ分子、例えば蛍光標識ＰＣＲ産
物で探索すると、完全にマッチしたハイブリッドは、強度の高い蛍光を与え、１
つ以上のミスマッチを含むハイブリッドは、実質的に強度のより低い蛍光を与え
る。チップ上のシグナルの位置および強度の組合せにより、コンピュータを用い
て配列を得ることができる。 【０３１８】対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリッド形成 特異的ハイブリッド形成条件下で、オリゴヌクレオチドはＰＣＲ産物のみに、
２つが完全にマッチする場合に結合する。一塩基対のミスマッチはハイブリッド
形成を防止するに十分である。オリゴヌクレオチド対（一方は変異塩基を有し、
他方は野生型塩基を有する）の使用は、ＰＣＲ産物を、ホモ接合性野生型、特定
の既知の変異についてのヘテロ接合性野生型変異体、またはホモ接合性変異体で
あると決定するのに使用できる。これは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド
（ＡＳＯ）ハイブリッド形成または「ドットブロット」と称される。慣用的なド
ットブロットでは、ＰＣＲ産物を、ナイロン膜に固定し、標識オリゴヌクレオチ
ドで標識する。「リバースドットブロット」では、オリゴヌクレオチドを、膜に
固定し、標識ＰＣＲ産物で探索する。プローブは、同位体標識しても非同位体標
識してもよい。さらに、多くのＰＣＲ増幅サンプルを、１つの既知変異について
類別し得る。 【０３１９】 対立遺伝子特異的ＰＣＲ 対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（増幅困難変異システムすなわちＡＲ
ＭＳ）において、検出アッセイは、ＰＣＲ反応自体内で起こる。その末端３’ヌ
クレオチドで互いに異なる配列特異的ＰＣＲプライマーを使用して、１つの反応
で正常な対立遺伝子のみを増幅し、別の反応では変異対立遺伝子のみを増幅する
。これは、特異的変異が疾病または疾病の危険性に連関していることが本発明に
より発見された場合に、個体を、その特定の変異の有無について試験するのに特
に有用である。特異的プライマーの３’末端が完全にマッチする場合、増幅が起
こる。特異的プライマーの３’末端がミスマッチする場合、増幅は起こらない。
増幅は、数個の既知の変異のアガロースゲル電気泳動による解析により評価する
。（ホモ接合型）野生型サンプルの遺伝子型は、両方の反応における増幅産物を
特徴とし、ホモ接合型変異サンプルは、変異反応のみにおいて産物を生成する。
このアッセイの変形で、対立遺伝子特異的プライマーの５’末端を様々な蛍光ラ
ベルで標識し、共通プライマーの５’末端をビオチン標識する。次いで、野生型
特異的および変異型特異的反応を１つのチューブで実施し得る。このアプローチ
の利点は、ゲル電気泳動が必要でなく、この方法は自動化できることである。 【０３２０】 プライマー導入制限解析 プライマー導入制限解析（ＰＩＲＡ）は、既知の変異を制限消化により診断で
きる技法である。ＰＣＲプライマーに、ミスマッチによる既知の変異の位置に近
い塩基変化を導入することにより、変異を診断する制限エンドヌクレアーゼ認識
部位を創製することが可能である。プライマー配列での変化した塩基および変異
部位での変化した塩基の組合せは、新規な制限標的部位を創製する効果を有する
。このアプローチを使用して、新規標的部位を、野生型対立遺伝子または変異対
立遺伝子に創製し得る。かかる状況で、ホモ接合性野生型形は、全長サイズの一
本バンドを特徴とする。ホモ接合性変異形は、サイズの減少した一本のバンドを
特徴とし、ヘテロ接合形は両方のサイズのバンドを特徴とする。制限消化後の異
なるサイズの野生型対変異型ＰＣＲ断片を、ゲル電気泳動により解析する。 【０３２１】 オリゴヌクレオチド結合アッセイ ＤＮＡ鎖にアニーリングした２本のオリゴヌクレオチドが正確に並列する場合
、それらを酵素ＤＮＡリガーゼにより連結できる。２本のオリゴヌクレオチドの
接合部での一塩基対のミスマッチで、結合を防ぐには十分である。ゲル電気泳動
や新規でより大きなサイズのＤＮＡ断片を可視化することによる結合のアッセイ
ではなく、結合は、単一分子上に存在するようになった２本のオリゴヌクレオチ
ド上の標識についてアッセイすることにより評価する。結合をＥＬＩＳＡにより
評価し、反応を９６ウェルマイクロタイタープレートで実施する場合、オリゴヌ
クレオチド結合アッセイは、ロボットにより実施でき、結果はプレート解読機に
より解析し、コンピュータに直接組み込むことができる。それゆえ、この方法は
、多数のサンプル中の、既知変異の評価に優れている。アッセイは２つの主な形
に該当する：オリゴヌクレオチド結合アッセイ（これはＰＣＲ増幅ＤＮＡ上で実
施する）およびリガーゼ連鎖反応（これはゲノムＤＮＡ上で実施し、熱安定ＤＮ
Ａリガーゼを用いて増幅する）。 【０３２２】直接的ＤＮＡ配列決定 本発明による変異検出はまた、当分野で公知のＤＮＡ配列決定手順を使用して
、本発明により同定した遺伝子領域において、変異ＤＮＡサンプルを直接的に配
列決定することにより実施し得る。 【０３２３】 ミニ配列決定法 ミニ配列決定技法（単一ヌクレオチドプライマー伸長法としても知られる）を
使用して、任意の既知の点変異、欠失または挿入を診断できる。単に一塩基対の
配列情報を得るには、その特定の塩基を配列にかけることのみが必要である。こ
れは、配列反応液に、４つ全部ではなく唯１つの塩基を含めることにより実施で
きる。この塩基が標識され、（標的鎖上の）プライマーのすぐ３’の最初の塩基
に相補的である場合、標識は組み込まれない。従って、ある塩基対を、電気泳動
でサイズ分離する必要なく、標識組み込みまたは組み込み失敗を基に配列決定で
きる。 【０３２４】 ５’ヌクレアーゼアッセイ ５’ヌクレアーゼアッセイは、反応混液の蛍光度に基づいた、ＰＣＲ反応の増
幅程度をモニタリングする技法である。低い蛍光は、増幅が全くないかまたは非
常に少ないことを示し、高い蛍光は、良好な増幅を示す。このシステムは、蛍光
発光解析以外のポストＰＣＲ解析の必要のない、インシュリン抵抗性遺伝子座の
１つへの連関が判明した遺伝子の既知の変異の同定に適応できる。Ｔａｑポリメ
ラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性は、ＰＣＲ増幅アッセイに使用
する。酵素は、二本鎖ＤＮＡの５’末端ヌクレオチドを切断する。その好ましい
基質は、部分的に二本鎖の分子であり、最も近い遊離５’末端で鎖を切断する。
５’ヌクレアーゼアッセイで、オリゴヌクレオチド「プローブ」（ＤＮＡ合成プ
ライマーとして作用できないように、その３’末端でリン酸化されている）を、
ＰＣＲ反応に含める。プローブは、２つの増幅プライマーの間の位置にアニール
するように設計する。活発に伸長しているＴａｑポリメラーゼ分子がプローブ分
子に達すると、それは一部それを置換し、次いで、一本鎖／二本鎖切断部位また
はその近くでプローブを切断し、全プローブが分解し、鋳型から除去される。ポ
リメラーゼはこの置換および切断プロセスを、全プローブが分解し鋳型から除去
されるまで続ける。標識システムはプローブの除去をモニタリングする。 【０３２５】 制限断片長多型（ＲＦＬＰ）： 野生型ＤＮＡ配列と変異含有ＤＮＡ配列の間の制限地図における差異を使用し
て、変異ＤＮＡ配列を特徴づけることができる。野生型ＤＮＡ配列を単離し、野
生型および変異型ＤＮＡ配列の間で異なる制限断片を与えることが知られる、制
限酵素による切断にかける。次いで、制限パターンを同定する。特徴的なパター
ンの制限断片を与える制限酵素を使用することにより、制限部位がいずれにも欠
けるか、または追加の制限部位を変異ＤＮＡ配列に導入する。 【０３２６】 ポリメラーゼ連鎖反応−制限断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ） ＰＣＲ−ＲＦＬＰによる変異解析法では、制限酵素認識配列に位置し、部位を
、対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に抵抗性とする、塩基対変化、欠
失および挿入を検出する。野生型ＤＮＡを制限消化により削除した後に、変異部
位を含む抵抗性ＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅する。増幅ＤＮＡを直接的に配列
するかまたはクローン化し、変異体を同定する。Ｆｅｌｌｅｙ−Ｂｏｓｃｏ，Ｅ
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９１、１９：２９１３−２９１
９；Ｐｏｕｒｚａｒｄ Ｃ、Ｃｅｒｕｔｔｉ Ｐ、Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ １９９
３年７月；２８８（１）；１１３−２１。 【０３２７】 Ｇ．インシュリン抵抗性表現型に関連したラットＣｄ３６／ＦＡＴ遺伝子およ び変異のマッピングおよび特徴づけ 本発明により遺伝子の地図位置がいったん確立されると、観察された表現型の
根底にある目的の遺伝子のクローン化が可能である。かかる遺伝子の同定は、さ
らなる実験交差における細かい遺伝子マッピング、次いで物理的単離および遺伝
子が存在する染色体セグメントのマッピング、および続く遺伝子それ自体の回収
の慣用的な経路により実施し得る。遺伝子クローニングは下記のように実施し得
る。 【０３２８】 我々は、高血圧自然発症ラットすなわちＳＨＲにおけるインシュリンおよびカ
テコールアミンの調査を遂行した。我々は、ラットＣｄ３６遺伝子（ラット第４
染色体上の、インシュリン抵抗性遺伝子座１として以前に定義された染色体遺伝
子座、ラットＦＡＴ遺伝子（ラットＣｄ３６遺伝子）としても知られる）を発見
した。ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ１９６５８。下記に示した全てのヌクレオチド
位置はこのＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ１９６５８を参照する。ＳＨＲラットのＣ
ｄ３６遺伝子の全コード領域および３’非翻訳領域の一部を包含する核酸配列を
、寄託番号ＡＦ１１１２６８でＧｅｎＢａｎｋに提出し、この提出は、１９９９
年１月１日まで内密であり、その日に配列が公開される。 【０３２９】 ＳＨＲおよび対照株（Ｓｃｉｏｓ Ｉｎｃ．）の脂肪組織において異なって発
現される遺伝子の探索により、同時に数百の遺伝子の発現レベルのモニタリング
、および２つ以上の組織サンプルにおけるこれらの遺伝子の発現レベルの比較が
可能となった。 【０３３０】 ＳＨＲおよび２つの対照株での遺伝子発現の比較により、ＳＨＲのマイクロア
レイ上で、５〜１０倍のＣｄ３６のハイブリッド形成シグナルの減少が判明した
。これは、ＳＨＲにおけるＣｄ３６遺伝子の異常発現を示す。 【０３３１】 本発明は、以下の発見に一部基づく： １．Ｃｄ３６遺伝子は、ラット第４染色体のインシュリン抵抗性遺伝子座１に位
置する； ２．ＳＨＲのＣｄ３６遺伝子は、ＳＨＲ Ｃｄ３６タンパク質の推定アミノ酸配
列における１１の変化をもたらす、ｃＤＮＡ配列における少なくとも１８の変化
を含む。これらの配列の差異は、配列変異型番号として以下に詳述し、ここでの
各配列変異型番号は、あるトリプレットコドンに生じる配列変化を意味する。（
配列変異型番号４は、２つの変化したヌクレオチドを含み、これらは同じトリプ
レットコドンにあるので、一緒にする）。 【０３３２】 ３．ＳＨＲラットのＣｄ３６ｍＲＮＡは、野生型Ｃｄ３６転写物の長さに比べて
、長多型を示す分子を含む。 【０３３３】 従って、本発明は、Ｃｄ３６遺伝子の配列および／または発現レベルおよび／
またはＣｄ３６遺伝子産物の長さの変化により、ラット第４染色体上のインシュ
リン抵抗性遺伝子座に連関した、いくつかまたは全てのＳＨＲ株の表現型特徴、
すなわち、脂肪組織のインシュリン媒介グルコース組み込み欠陥、（Ａｉｔｍａ
ｎら、１９９７；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６：１９７−２０１）、
イソプロテレノール媒介脂肪分解または脂肪破壊の制御欠陥（Ａｉｔｍａｎら、
１９９７、上記）、高血圧（Ｐｒａｖｅｎｅｃら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ ｎｖｅｓｔ． ，９６：１９７３−１９７８）、および異常脂肪血症（Ｂｏｔｔｇ
ｅｒら、１９９６、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９８：８５６−８６２；Ｋ
ｏｖａｃｓおよびＫｌｏｔｉｎｇ、１９９８、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ ｏｐｈｙｓ． ，３５４：１３９−１４３）が起こることに関する。 【０３３４】 本発明はまた、２型糖尿病および２型糖尿病の異常脂肪血症、本態性高血圧、
複合型高脂血症（家族性複合型高脂血症を含むがこれに限定されない）および冠
動脈性心疾患の素因（このいくつかはヒトＣＤ３６遺伝子の変異により一部引き
起こされ得る）を含む、関連したヒト状態のための、ラットおよび対応するヒト
ＣＤ３６変異配列の使用に関する。 【０３３５】 ラットＣｄ３６の調節または構造または機能の欠陥は、ラットにおいて、イン
シュリンおよびカテコールアミン抵抗性並びに高血圧および異常脂肪血症を引き
起こし得るという知見は、これらの異常を特徴とするヒト疾病の予防、検出およ
び治療に有用であり得る。ヒトＣＤ３６遺伝子およびその変異体は、これらのヒ
ト疾患の診断試験およびそれらの治療を目的とした薬剤開発に考えられる。 【０３３６】 以下に列挙したのは、ＳＨＲ Ｃｄ３６ ｃＤＮＡ配列の本明細書で開示した
配列変化である。各々の番号を付した配列変異型において、最初に列挙した配列
は、Ｗｉｓｔｅｒ Ｋｙｏｔｏ（ＷＫＹ、最初の対照株）であり、第二はブラウ
ン・ノルウェイ（ＢＮ、第二の対照株）であり、第三はＳＨＲである。 【０３３７】 各々の番号を付した配列変異型は、単一コドンのヌクレオチド変化を示す。太
い（下線部の）印字体は、ＷＫＹおよびＢＮの両方と比較したＳＨＲのヌクレオ
チド差異を示す。アミノ酸変化を、標準的な１文字アミノ酸記号を使用して列挙
する。以下のＷＫＹ、ＢＮおよびＳＨＲ変異型核酸配列によりコードされたペプ
チド配列を図９に示す。 【０３３８】配列変異型番号１ ３６２ ｔａｔｔｔａｇｃｃ ａａｇｇａａａａｔａ ｔａａｃｔｃａｇｇａ
３９０ [配列ＩＤ番号：１] ３６２ ｔａｔｔｔａｇｃｃ ａａｇｇａａａａｔａ ｔａａｃｔｃａｇｇａ
３９０ [配列ＩＤ番号：３] ３６２ ｔａｔｔｔａｇｃｃ ａａｇｇａａａｇｔａ ｔａａｃｔｃａｇｇａ
３９０ [配列ＩＤ番号：５] アミノ酸変化：Ｎ→Ｓ配列変異型番号２ ３８１ ｔａａｃｔｃａｇｇａ ｃｃｃｃａａｇｇａｃ ａｇｃａｃｔｇｔｃｔ ４１０ [配列ＩＤ番号：７] ３８１ ｔａａｃｔｃａｇｇａ ｃｃｃｃａａｇｇａｃ ａｇｃａｃｔｇｔｃｔ ４１０ [配列ＩＤ番号：９] ３８１ ｔａａｃｔｃａｇｇａ ｃｃｃｃａａａｇａｃ ａｇｃａｃｔｇｔｃｔ ４１０ [配列ＩＤ番号：１１] サイレント多型：Ｋ→Ｋ配列変異型番号３ ４９１ ｃｔｇｇｃｔｇｔｇｇ ｃａｇｃｔｇｃａｃｃ ａｃａｔａｔｃｔａｃ ５２０ [配列ＩＤ番号：１３] ４９１ ｃｔｇｇｃｔｇｔｇｇ ｃａｇｃｔｇｃａｃｃ ａｃａｔａｔｃｔａｃ ５２０ [配列ＩＤ番号：１５] ４９１ ｃｔｇｇｃｔｇｔｇｇ ｃａｇｃｔｇｔａｃｃ ａｃａｔａｔｃｔａｃ ５２０ [配列ＩＤ番号：１７] アミノ酸変化：Ａ→Ｖ配列変異型番号４ ５１１ ａｃａｔａｔｃｔａｃ ａｃａａａｃｔｃａｔ ｔｔｇｔｔｃａａｇｇ ５４０ [配列ＩＤ番号：１９] ５１１ ａｃａｔａｔｃｔａｃ ａｃａａａｃｔｃａｔ ｔｔｇｔｔｃａａｇｇ ５４０ [配列ＩＤ番号：２１] ５１１ ａｃａｔａｔｃｔａｃ ｃａａａａｃｔｃａｔ ｔｔｔｔｔｃａａｇｇ ５４０ [配列ＩＤ番号：２３] アミノ酸変化：Ｔ→Ｑ配列変異型番号５ ５２１ ａｃａａａｃｔｃａｔ ｔｔｇｔｔｃａａｇｇ ｔｇｔｇｃｔｃａａｃ ５５０[配列ＩＤ番号：２５] ５２１ ａｃａａａｃｔｃａｔ ｔｔｇｔｔｃａａｇｇ ｔｇｔｇｃｔｃａａｃ ５５０[配列ＩＤ番号：２７] ５２１ ｃａａａａｃｔｃａｔ ｔｔｔｔｔｃａａｇｇ ｔｇｔｇｃｔｃａａｃ ５５０[配列ＩＤ番号：２９] アミノ酸変化：Ｖ→Ｆ配列変異型番号６ ５４１ ｔｇｔｇｃｔｃａａｃ ａｇｃｃｔｔａｔｃａ ａａａａｇｔｃｃａａ ５７０ [配列ＩＤ番号：３１] ５４１ ｔｇｔｇｃｔｃａａｃ ａｇｃｃｔｔａｔｃａ ａａａａｇｔｃｃａａ ５７０ [配列ＩＤ番号：３３] ５４１ ｔｇｔｇｃｔｃａａｃ ａｔａｔｔｔａｔｃａ ａａａａｇｔｃｃａａ ５７０ [配列ＩＤ番号：３５] アミノ酸変化：Ｓ→Ｉ配列変異型番号７ ５４１ ｔｇｔｇｃｔｃａａｃ ａｇｃｃｔｔａｔｃａ ａａａａｇｔｃｃａａ ５７０ [配列ＩＤ番号：３７] ５４１ ｔｇｔｇｃｔｃａａｃ ａｇｃｃｔｔａｔｃａ ａａａａｇｔｃｃａａ ５７０ [配列ＩＤ番号：３９] ５４１ ｔｇｔｇｃｔｃａａｃ ａｔａｔｔｔａｔｃａ ａａａａｇｔｃｃａａ ５７０ [配列ＩＤ番号：４１] アミノ酸変化：Ｌ→Ｆ配列変異型番号８ ５８１ ｔｔｃｃａａａｃａｃ ｇａａｇｔｔｔｇａａ ｇｇａａｃｔｃｔｔｇ ６１０ [配列ＩＤ番号：４３] ５８１ ｔｔｃｃａａａｃａｃ ｇａａｇｔｔｔｇａａ ｇｇａａｃｔｃｔｔｇ ６１０ [配列ＩＤ番号：４５] ５８１ ｔｔｃｃａａａｃａｃ ｇａａｇｔｔｔｇａａ ａｇａａｃｔｃｔｔｇ ６１０ [配列ＩＤ番号：４７] サイレント多型：Ｋ→Ｋ配列変異型番号９ ６０１ ｇｇａａｃｔｃｔｔｇ ｔｇｇｇｇｔｔａｃａ ａａｇａｔｃｃａｔｔ ６３０ [配列ＩＤ番号：４９] ６０１ ｇｇａａｃｔｃｔｔｇ ｔｇｇｇｇｔｔａｃａ ａａｇａｔｃｃａｔｔ ６３０ [配列ＩＤ番号：５１] ６０１ ａｇａａｃｔｃｔｔｇ ｔｇｇｇｇｔｔａｔｇ ａａｇａｔｃｃａｔｔ ６３０ [配列ＩＤ番号：５３] サイレント多型：Ｙ→Ｙ配列変異型番号１０ ６０１ ｇｇａａｃｔｃｔｔｇ ｔｇｇｇｇｔｔａｃａ ａａｇａｔｃｃａｔｔ ６３０ [配列ＩＤ番号：５５] ６０１ ｇｇａａｃｔｃｔｔｇ ｔｇｇｇｇｔｔａｃａ ａａｇａｔｃｃａｔｔ ６３０ [配列ＩＤ番号：５７] ６０１ ａｇａａｃｔｃｔｔｇ ｔｇｇｇｇｔｔａｔｇ ａａｇａｔｃｃａｔｔ ６３０ [配列ＩＤ番号：５９] アミノ酸変化：Ｋ→Ｅ配列変異型番号１１ ６３１ ｃｔｔｇａｇｔｔｔｇ ｇｔｔｃｃａｔａｔｃ ｃｔａｔａａｇｔａｃ ６６０ [配列ＩＤ番号：６１] ６３１ ｃｔｔｇａｇｔｔｔｇ ｇｔｔｃｃａｔａｔｃ ｃｔａｔａａｇｔａｃ ６６０ [配列ＩＤ番号：６３] ６３１ ｃｔｔｇａｇｔｔｔｇ ａｔｔｃｃａｔａｔｃ ｃｔａｔａａｇｔａｃ ６６０ [配列ＩＤ番号：６５] アミノ酸変化：Ｖ→Ｉ配列変異型番号１２ ７２１ ｔｇｇａａａｇｇａｔ ａａｃａｔａａｇｃａ ａｇｇｔｔｇｃｃａｔ ７５０ [配列ＩＤ番号：６７] ７２１ ｔｇｇａａａｇｇａｔ ａａｃａｔａａｇｃａ ａｇｇｔｔｇｃｃａｔ ７５０ [配列ＩＤ番号：６９] ７２１ ｔｇｇａａａｇｇａｔ ａａｃａｔａａｇｃａ ａａｇｔｔｇｃｃａｔ ７５０ [配列ＩＤ番号：７１] サイレント多型：Ｋ−＞Ｋ配列変異型番号１３ ７８１ ｇｔｃｃｔａｔｔｇｇ ｇａａａｇｔｔａｔｔ ｇｃｇａｃａｔｇａｔ ８１０ [配列ＩＤ番号：７３] ７８１ ｇｔｃｃｔａｔｔｇｇ ｇａａａｇｔｔａｔｔ ｇｃｇａｃａｔｇａｔ ８１０ [配列ＩＤ番号：７５] ７８１ ｇｔｃｃｔａｔｔｇｇ ａａａａｇｔｔａｔｔ ｇｃｇａｃａｔｇａｔ ８１０ [配列ＩＤ番号：７７] アミノ酸変化：Ｅ→Ｋ配列変異型番号１４ ８５１ ａａａｔｃｔｃａａａ ｃａｃｔｇａｇｇｔｔ ｃｔｔｔｔｃｃｔｃｔ ８８０ [配列ＩＤ番号：７９] ８５１ ａａｇｔｃｔｃｇａａ ｃａｃｔｇａｇｇｔｔ ｃｔｔｔｔｃｃｔｃｔ ８８０ [配列ＩＤ番号：８１] ８５１ ａａｇｔｃｔｃａａａ ｃａｃｔｇａｇｇｔｔ ｔｔｔｔｔｃｃｔｃｔ ８８０ [配列ＩＤ番号：８３] サイレント多型：Ｆ→Ｆ配列変異型番号１５ １２６１ ｔａｇａａａａａｔａ ｇａａｇｃａｃｔｇａ ａｇａａｔｃｔｇａ
ａ １２９０ [配列ＩＤ番号：１６４] １２６１ ｔａｇａａａａａｔａ ｇａａｇｃａｃｔｇａ ａｇａａｔｃｔｇａ
ａ １２９０ [配列ＩＤ番号：１６５] １２６１ ｔａｇａａａａａｔａ ｇａａｃｃａｃｔｇａ ａｇａａｔｃｔｇａ
ａ １２９０ [配列ＩＤ番号：１６７] アミノ酸変化：Ａ→Ｐ ［配列ＩＤ番号：１６４］および［配列ＩＤ番号：１６５］によりコードされ
るアミノ酸配列は、［配列ＩＤ番号：１６６］に示し、一方ＳＨＲ変異型１５ア
ミノ酸配列は［配列ＩＤ番号：１６８］に示す。 【０３３９】配列変異型番号１６ １３２１ ａａａｔｇａｇａｃｔ ｇｇｇａｃｃａｔｃｇ ｇｃｇａｔｇａｇａ
ａ １３５０ [配列ＩＤ番号：１６９] １３２１ ａａａｔｇａｇａｃｔ ｇｇｇａｃｃａｔｃｇ ｇｃｇａｔｇａｇａ
ａ １３５０ [配列ＩＤ番号：１７０] １３２１ ａａａｔｇａｇａｃｔ ｇｇｇａｃｃａｔｔｇ ｇｃｇａｔｇａｇａ
ａ １３５０ [配列ＩＤ番号：１７１] サイレント多型：Ｉ−＞Ｉ配列変異型番号１７ １４４１ ｔｇｔｔｇｃｔｔｔｔ ａｔｇａｔｔｔｃａｔ ａｃｔｇｔｇｃｔｔ
ｇ １４７０ [配列ＩＤ番号：１７２] １４４１ ｔｇｔｔｇｃｔｔｔｔ ａｔｇａｔｔｔｃａｔ ａｃｔｇｔｇｃｔｔ
ｇ １４７０ [配列ＩＤ番号：１７３] １４４１ ｔｇｔｔｇｃｔｔｔｃ ａｔｇａｔｔｔｃａｔ ａｃｔｇｔｇｃｔｔ
ｇ １４７０ [配列ＩＤ番号：１７４] サイレント多型：Ｆ→Ｆ配列変異型番号１８ １４６１ ａｃｔｇｔｇｃｔｔｇ ｃａｇａｔｃｔａａｇ ａａｔｇｇａａａａ
ｔ １４９０ [配列ＩＤ番号：１７５] １４６１ ａｃｔｇｔｇｃｔｔｇ ｃａｇａｔｃｔａａｇ ａａｔｇｇａａａａ
ｔ １４９０ [配列ＩＤ番号：１７６] １４６１ ａｃｔｇｔｇｃｔｔｇ ｃａｇａｔｔｔａａｇ ａａｔｇｇａａａａ
ｔ １４９０ [配列ＩＤ番号：１３８] アミノ酸変化：Ｓ→Ｆ ［配列ＩＤ番号：１７５］および［配列ＩＤ番号：１７６］によりコードされ
るアミノ酸配列は、［配列ＩＤ番号：１７７］に示し、一方ＳＨＲ変異型１８ア
ミノ酸配列は、［配列ＩＤ番号：１４１］に示す。 【０３４０】 上記の核酸配列に対する予測アミノ酸配列は、配列ＩＤ表に含まれ、各ヌクレ
オチド配列ＩＤ番号に従って（すなわち、偶数２、４、６、８等を使用して）番
号を付した。完全な野生型ラットＣｄ３６配列（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｌ１９
６５８）を［配列ＩＤ番号：８５］に示す（図１１）。予測ポリペプチド配列は
［配列ＩＤ番号：８６］に示す（図１２）。本明細書に開示したラット株ＳＨＲ
における完全なラットＣｄ３６コード配列および部分非翻訳配列を［配列ＩＤ番
号：８７］に示す（図１３）。予測ポリペプチド配列は［配列ＩＤ番号：８８］
に示す（図１４）。本明細書に開示した部分的ラットＣｄ３６配列ラット株Ｗｉ
ｓｔｅｒ Ｋｙｏｔｏは［配列ＩＤ番号：８９］に示す（図１５）。予測ポリペ
プチド配列は［配列ＩＤ番号：９０］に示す（図１６）。ラット株ＢＭの部分的
ラットＣｄ３６配列は［配列ＩＤ番号：９１］に示す（図１７）。予測ポリペプ
チド配列は［配列ＩＤ番号：９２］に示す（図１８）。 【０３４１】 これらの配列変化に加えて、我々は、ＳＨＲにおいて長多型Ｃｄ３６ ｍＲＮ
Ａの証拠を検出した。ＳＨＲおよびＷＫＹなどの２つのこのように密接に関連し
た株における大量の配列変異は、ＷＫＹおよびＧＮのゲノムＤＮＡにおける意外
な７７塩基対ＨｉｎｆＩ制限断片と共に（図３）、ＷＫＹおよびＢＮにおけるＣ
ｄ３６のゲノムの重複、およびＳＨＲにおけるその欠失の可能性を示唆する。 【０３４２】 これを追跡するために、ＨｉｎｆＩ ＲＦＬＰ（ＳＨＲ Ｃｄ３６遺伝子のヌ
クレオチド６４０〜６４５に存在するが、ＷＫＹ ｃＤＮＡには存在しない、Ｈ
ｉｎｆＩ切断部位）に隣接する、Ｈｉｎ３Ｆ／３Ｒプライマーにより増幅される
ゲノム断片の直接的な配列を実施した。プライマー配列は以下の通りであった：
Ｈｉｎ３Ｆ： ５’−ＡＣＡＫＭＹＴＴＡＴＣＡＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＴＡＴＧＴ
ＴＣ−３’[配列ＩＤ番号：１３０]、および Ｈｉｎ３Ｒ： ５’−ＡＣＣＡＡＣＴＧＴＧＧＴＡＣＴＴＡＴＣＧ−３’[配列ＩＤ番号：１３
１]。 【０３４３】 これらのプライマーは、このＲＦＬＰを増幅し、１２２ｂｐの産物を与える。プ
ライマーＨｉｎ３Ｆは、ＳＨＲとＷＫＹ ＤＮＡ配列の間の差異の原因である、
Ｋ（Ｇ／Ｔ）、Ｍ（Ａ／Ｃ）およびＹ（Ｃ／Ｔ）を含む縮重物である。プライマ
ーＨｉｎ３Ｆは、完全な消化を示す、太字（下線部）で示した、工学ＨｉｎｆＩ
部位を含む。ＰＣＲ産物を、ＨｉｎｆＩを用いて完全に消化し、４％Ｎｕｓｉｅ
ｖｅ／アガロースゲルで分離した。これにより、ＷＫＹおよびＢＮゲノムＤＮＡ
には２コピーのＨｉｎ３Ｆ／３Ｒ断片が存在することが示され、ＷＫＹおよびＢ
Ｎゲノム配列の見かけのヘテロ接合性により明白である。ＷＫＹおよびＢＮゲノ
ムＤＮＡのＨｉｎ３Ｆ／３Ｒ断片の第二コピーは、ＳＨＲ ＤＮＡから得られた
配列に正確に対応するが、ＷＫＹまたはＢＮでは転写されない。なぜならこれら
の株からの脂肪組織ＤＮＡでは検出不可能であるからである。ＳＨＲゲノムＤＮ
Ａにおける唯１つのＨｉｎ３Ｆ／３Ｒ配列の存在により、ＷＫＹからの２つのゲ
ノムコピーのうち１つの、ＳＨＲゲノムＤＮＡからの欠失が示唆される。 【０３４４】 この結果を確認するために、サザン解析を、ＳＨＲ、ＷＫＹおよびＢＮラット
のゲノムＤＮＡで実施した。推定エキソン６の領域のプローブ、およびＷＫＹ３
’ＵＴＲのプローブは、ＨｉｎｆＩ、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したＳＨ
ＲゲノムＤＮＡにおいて単一の制限断片を検出した。ＷＫＹおよびＢＮは、ＳＨ
Ｒに見られるものとサイズが同一またはほぼ同一の制限断片を含んだが、追加の
バンドにより、ＷＫＹおよびＢＮの両方において少なくとも１つのさらなる遺伝
子コピーの存在が示された。 【０３４５】 遺伝子の５’末端の重複を試験するために、直接的な配列解析を実施した。こ
れにより再度、（Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｌ１９６５８；［配列ＩＤ番号：８５］の
）ヌクレオチド４６、８２、８７および１１３で、ＷＫＹおよびＢＮゲノムＤＮ
Ａに、見かけのヘテロ接合性が示されたが、ＳＨＲゲノムＤＮＡには僅か１つの
配列であった。ＳＨＲゲノム配列は、全３つの株のｃＤＮＡ配列に同一であった
。これにより、遺伝子の５’末端は、ＳＨＲ、ＷＫＹおよびＢＮの同じ転写単位
から転写されることが示される。正常に転写されていない遺伝子のコピーからの
ＳＨＲにおけるエキソン６の転写により、欠失事象がＳＨＲで起こり、この株に
単一のキメラ転写単位を創製することが示唆される。このキメラ遺伝子の大半は
第二の正常に転写されていないＣｄ３６遺伝子のコピーから得られるので、これ
は、ＳＨＲに見られる複数のＤＮＡ配列変異型および発散した３’末端の説明と
なる。 【０３４６】 本発明により、診断評価下での被検者からの生物学的サンプルにおけるｍＲＮ
Ａサイズ変異型の存在を、ラットまたはヒトにおけるインシュリン抵抗性表現型
の指標として使用し得る。 【０３４７】 ＳＨＲラットにおけるＣｄ３６の機能的解析 ＳＨＲ転写物により、機能的な成熟タンパク質が産生されるかを決定するため
に、我々は、形質膜画分（これにはＣｄ３６タンパク質が普通存在する）を含む
ように調製した、ＳＨＲミクロソームペレットのウェスタンブロット解析を実施
した。ＷＫＹおよびＢＮ脂肪組織由来の形質膜は、かなりの量のＣｄ３６を含み
、一方、ＳＨＲには全くＣｄ３６タンパク質は検出できなかった（図４）。類似
の結果が心臓ミクロソームで観察されたが、発現レベルは対照においてより低か
った。ＳＨＲ転写物が翻訳されると仮定すると、データにより、ＳＨＲでは正常
なＣｄ３６プロセシングが実施されず、ＳＨＲ株の、少なくとも脂肪および心臓
では、Ｃｄ３６が機能的に欠損していることが示された。 【０３４８】 Ｃｄ３６トランスジェニックマウスにおける脂肪酸およびリポタンパク質表現 型 無傷生物における脂質代謝に対するＣｄ３６の効果を調べるために、心臓およ
び骨格筋でＣｄ３６を過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて、血中ト
リグリセリドおよび非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）を調べた。１．３ｋｂのＣ
ｄ３６コード配列およびマウスクレアチンキナーゼ遺伝子（３．３ｋｂ）の制御
下にあるポリアデニル化シグナルを含む、１．７ｋｂのＤＮＡ断片をもつ、ＭＣ
Ｋ−ＣＤ３６ミニ遺伝子と呼ばれるミニ遺伝子を、以前に記載の通りに作成し（
Ｌｅｖａｋ−Ｆｒａｎｋら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９６：
９７６−９８６）、過排卵ＦＶＢ雌マウスからの受精卵の雄性前核に注入した。
卵を、代理ＦＶＢ雌の卵管に移した。トランスジェニックマウスを、尾生検から
単離したゲノムＤＮＡを、放射標識Ｃｄ３６ＤＮＡ（１．３ｋｂ断片）でスクリ
ーニングすることにより同定した。標準的な方法により実施した、ノザンおよび
ウェスタンブロットにより、トランスジェニックマウスからの心臓および骨格筋
組織におけるＣｄ３６の過剰発現が確認された。血液を尾静脈から回収し、トリ
グリセリドおよびＮＥＦＡを、Ｓｉｇｍａおよび和光からそれぞれ入手できるキ
ットを使用して、一晩断食した動物から新しく採血した血液について測定した。 【０３４９】 表１は、同じ遺伝的（ＦＶＢ）背景をもつ、トランスジェニックＭＣＫ−Ｃｄ
３６マウスおよび対照マウス（年齢および性の一致するもの）における、血中ト
リグリセリドおよび非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）を示す。トランスジェニッ
クマウスは、血中トリグリセリドおよびＮＥＦＡの顕著な減少を示し、全身の脂
質恒常性におけるＣｄ３６の重要な生理理学的役割が確立される。 【０３５０】 Ｃｄ３６導入遺伝子が、被検哺乳動物において脂質代謝に影響を及ぼせること
により、本発明による、治療剤（この場合、Ｃｄ３６遺伝子および／またはその
発現タンパク質産物）を試験する上での動物モデルの有用性、並びに、インシュ
リン抵抗性遺伝子座に連関した遺伝子またはタンパク質を使用した、被検哺乳動
物の疾病の処置実施の可能性が示される。 【０３５１】 Ｈ．インシュリン抵抗性表現型に関連したヒトＣＤ３６多型 冠動脈心疾患をもつ１２個体のＣＤ３６遺伝子の、配列解析を実施した。観察
された配列変異型を下に提示する。各番号の配列変異型について、最初に列挙し
た配列は、発表された配列であり、第二の配列は本明細書に開示した配列解析か
ら得られたものである。太い印字体（下線部）は、発表された配列と比較した、
個体（そのＤＮＡをこれらの実験で配列にかけた）におけるヌクレオチドの違い
を示す。配列変異型番号１および２では、塩基の位置は、Ａｒｍｅｓｉｌｌａお
よびＶｅｇａ（１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１８３８５−１
８９９１）により発表された配列を示す。配列変異型番号３の塩基位置は、Ｇｅ
ｎｂａｎｋ寄託番号Ｚ３２７５３を示し、配列変異型番号４のそれは、Ｇｅｎｂ
ａｎｋ寄託番号Ｚ３２７６４を示す。配列変異型番号１および２はプロモータ領
域にあり、配列変異型３は５’非翻訳領域にあり、配列変異型番号４は３’非翻
訳領域にある。残りの変異型は下に示したように位置する。ＣＤ３６アミノ酸配
列の変化をコードするものは全くない。 【０３５２】配列変異型番号１ −７３ ｇｃｔｔｔｃｔｃｔｔ ｃｔｃｔｔｔｔｔｔｔ ｇｇｇｇｇｇｇｇｇａ −４４ [配列ＩＤ番号：１３２] −７３ ｇｃｔｔｔｃｔｃｔｔ ｃｔｃ−ｔｔｔｔｔｔ ｇｇｇｇｇｇｇｇｇａ −４４ [配列ＩＤ番号：１３３]配列変異型番号２ −７３ ｇｃｔｔｔｃｔｃｔｔ ｃｔｃｔｔｔｔｔｔｔ ｇｇｇｇｇｇｇｇｇａ −４４ [配列ＩＤ番号：１３４] −７３ ｇｃｔｔｔｃｔｃｔｔ ｃｔｃｔｔｔｔｔｔｔ ｔｇｇｇｇｇｇｇｇａ −４４ [配列ＩＤ番号：１３５]配列変異型番号３ ６５ ｃｔｇｔｇａｃｔｃａ ｔｃａｇｔｔｃｃｔｔ ｔｃｃｔｇｔａａａａ
９４ [配列ＩＤ番号：１３６] ６５ ｃｔｇｔｇａｃｔｃａ ｔｃａｇｔｔｃａｔｔ ｔｃｃｔｇｔａａａａ
９４ [配列ＩＤ番号：１３７]配列変異型番号４ [配列ＩＤ番号：１３９] ４２１ ａｔｔｇｔａａｃａａ ｔａｇｃａｃａａａｔ ａａａｇｃａｃｔｔｇ ｔｇｃｃａａａｇｔｔ ４６０ ４２１ ａｔｔｇｔａａｃａａ ｔａ―――――――― ――――――――ｔｇ ｔｇｃｃａａａｇｔｔ ４６０ [配列ＩＤ番号：１４０] ハイフン／実線は、配列の欠失を示す。 【０３５３】 サイレント核酸置換が、発表されたヒトｃＤＮＡ配列に関連して、エキソン１
０のコード配列に観察された（Ａｒｍｅｓｉｌｌａら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ． 、２６９：１８９８５−１８９９１；Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｚ３
２７６０）。発表された配列は、本明細書に開示した配列変異型体の上に示す。
配列に、Ａｒｍｅｓｉｌｌａら（１９９４、上記）に従って番号を付す。 【０３５４】 １１４９ ｇａａｔｃｃｃｔｇｔ ｇｔａｔａｇａｔｔｔ ｇｔｔｃｔｔｃｃａ
ｔ １１７８ [配列ＩＤ番号：１４２] １１４９ ｇａａｔｃｃｃｔｇｔ ｇｔａｔａｇａｔｔｃ ｇｔｔｃｔｔｃｃａ
ｔ １１７８ [配列ＩＤ番号：１４３] Ａｒｍｅｓｉｌｌａら（１９９４、上記）の配列に関連した、さらなる配列変
異型が非コード配列に発見され、以下に、ここでも発表された配列の下に示す（
エキソン２、５’非翻訳ｃＤＮＡ配列；Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｚ３２７５３）
。 【０３５５】 １４１ ｃｔｇｔｇａｃｔｃａ ｔｃａｇｔｔｃｃｔｔ ｔｃｃｔｇｔａａａａ １７０ [配列ＩＤ番号：１４４] １４１ ｃｔｇｔｇａｃｔｃａ ｔｃａｇｔｔｃａｔｔ ｔｃｃｔｇｔａａａａ １７０ [配列ＩＤ番号：１４５] ２つの配列変異型が、エキソン２と３の間を配列決定することにより、イント
ロン２（エキソン２の配列の下流）に同定された。第一のものは、比較的稀であ
る第二のよりも頻繁に観察される。 【０３５６】 ５’ ｔｇａｔａｃｇｔｔｔ ｃａｇｔｇｇｇｔｇｔ ｔｔｔｃｔｔｔｇｔａ
３’ [配列ＩＤ番号：１４６] ５’ ｔｇａｔａｃｇｔｔｔ ｃａｇｔｇｇａｔｇｔ ｔｔｔｃｔｔｔｇｔａ
３’ [配列ＩＤ番号：１４７] 上記の配列の変異型ヌクレオチドは、イントロン２／エキソン３境界の下流の７
３塩基対である。 【０３５７】 イントロン１２に位置する、配列変異型がヒトＣＤ３６で発見された最終部位
が、エキソン１２と１３の間を配列決定することにより得られた。２つの配列が
得られた。最初のものは一般的な配列であるが、第二のものは稀な配列である。 【０３５８】 ５’ ｇｇｔｔａｔｔｔｔｇ ａｔａｔｇａｔｃｔｇ ｔａｇｔａｔｃｇｔａ
３’ [配列ＩＤ番号：１４８] ５’ ｇｇｔｔａｔｔｔｔｇ ａｔａｔｇａｔｃｔａ ｔａｇｔａｔｃｇｔａ
３’ [配列ＩＤ番号：１４９] これらの配列の変異型ヌクレオチドは、エキソン１２／イントロン１２の境界の
上流の３７塩基対である。 【０３５９】 ５つの追加の変異が、表現型ＣＤ３６に欠陥のある、５人のアフリカ系カリブ
人および１人のアフリカ系アメリカ人で発見された。第６の変異が、糖尿病に罹
患したアフリカ系カリブ人に発見された。これらの変異の中で、４つは、機能的
ＣＤ３６タンパク質の翻訳を防ぐ、別個のナンセンスまたはフレームシフト変異
である。これらの変異の１つ（［配列ＩＤ番号：１７９］）は、Ａｒｍｉｓｉｌ
ｌａら（ＧｅｎｂａｎｋＺ３２７６０、［配列ＩＤ番号：１７８］）に報告され
たｃＤＮＡ配列のエキソン１０におけるヌクレオチド１１４５での１ヌクレオチ
ド欠失である。この点欠失は、リーディングフレームにシフトを引き起こし、こ
の変異を含むＣＤ３６対立遺伝子が機能的ＣＤ３６タンパク質をコードする能力
を消失させる。 【０３６０】 １１２７ ｇａａｔｃｃｇａｃｇ ｔｔａａｔｃｔｇａａ ａｇｇａａｔｃｃｃ
ｔ １１５６ [配列ＩＤ番号：１７８] １１２７ ｇａａｔｃｃｇａｃｇ ｔｔａａｔｃｔ−ａａ ａｇｇａａｔｃｃｃ
ｔ １１５６ [配列ＩＤ番号：１７９] 配列ＩＤ番号：１９０、１９１および１９２は、同じ点変異を含むヌクレオチ
ドを含む。しかし、これらの配列は、８、１２および１６ヌクレオチド長である
。点変異は、これらの各ヌクレオチドの中心にある。しかし、点変異は、８、１
２または１６ヌクレオチド配列のどの位置でも起こり得る。例えば、変異は、８
ヌクレオチドの配列の１〜８の各々の位置で起こり得る。 【０３６１】 １１２７ ｇａａｔｃｃｇａｃｇ ｔｔａａｔｃｔｇａａ ａｇｇａａｔｃｃｃ
ｔ １１５６ [配列ＩＤ番号：１７８] ａｔｃｔ−ａａ ａｇ
[配列ＩＤ番号：１９０] １１２７ ｇａａｔｃｃｇａｃｇ ｔｔａａｔｃｔｇａａ ａｇｇａａｔｃｃｃ
ｔ １１５６ [配列ＩＤ番号：１７８] ｔａａｔｃｔ−ａａ ａｇｇａ
[配列ＩＤ番号：１９１] １１２７ ｇａａｔｃｃｇａｃｇ ｔｔａａｔｃｔｇａａ ａｇｇａａｔｃｃｃ
ｔ １１５６ [配列ＩＤ番号：１７８] ｇ ｔｔａａｔｃｔ−ａａ ａｇｇａａｔ
[配列ＩＤ番号：１９２] これらの第二の変異において（［配列ＩＤ番号：１８１］）、同じＣＤ３６遺
伝子（ＧｅｎｂａｎｋＺ３２７６０、［配列ＩＤ番号：１８０］）のエキソン１
０のヌクレオチド１２６４が、ＴからＧに変異している。この変異は、表現型Ｃ
Ｄ３６に欠陥のある５人中３人のアフリカ系カリブ人被検者にホモ接合形で認め
られ、残りの２人の被検者にはヘテロ接合形で認められた。 【０３６２】 １２４７ ａａａａａｔｔｇｔａ ｃａｔｃａｔａｔｇｇ ｔｇｔｇｃｔａｇａ
ｃ １２７６ [配列ＩＤ番号：１８０] １２４７ ａａａａａｔｔｇｔａ ｃａｔｃａｔａｇｇｇ ｔｇｔｇｃｔａｇａ
ｃ １２７６ [配列ＩＤ番号：１８０] 配列ＩＤ番号：１９３、１９４および１９５は、同じＴからＧへの変異を含む
ヌクレオチドを含む。しかし、これらの配列は９、１３および１７ヌクレオチド
長である。ＴからＧへの変異は、これらの各ヌクレオチドの中心にある。しかし
、変異は、９、１３または１７ヌクレオチド配列のどの位置でも起こり得る。 【０３６３】 １２４７ ａａａａａｔｔｇｔａ ｃａｔｃａｔａｔｇｇ ｔｇｔｇｃｔａｇａ
ｃ １２７６ [配列ＩＤ番号：１８０] ｃａｔａｇｇｇ ｔｇ
[配列ＩＤ番号：１９３] １２４７ ａａａａａｔｔｇｔａ ｃａｔｃａｔａｔｇｇ ｔｇｔｇｃｔａｇａ
ｃ １２７６ [配列ＩＤ番号：１８０] ａｔｃａｔａｇｇｇ ｔｇｔｇ
[配列ＩＤ番号：１９４] １２４７ ａａａａａｔｔｇｔａ ｃａｔｃａｔａｔｇｇ ｔｇｔｇｃｔａｇａ
ｃ １２７６ [配列ＩＤ番号：１８０] ａ ｃａｔｃａｔａｇｇｇ ｔｇｔｇｃｔ
[配列ＩＤ番号：１９５] この被検者群で発見された第三の変異（［配列ＩＤ番号：１８３］）は、Ｇｅ
ｎｂａｎｋＺ３２７５７（［配列ＩＤ番号：１８２］）のエキソン７のヌクレオ
チド９９６の後に始まる４塩基挿入である。挿入はフレームシフトを引き起こし
、変異を含む対立遺伝子からの機能的ＣＤ３６タンパク質の発現を消失させると
予測される。この変異は、唯１人の被検者に存在し、この者はまた［配列ＩＤ番
号：１８１］に示した変異についてホモ接合性であった。 【０３６４】 ９７９ ｔａａａｇｇｔａａａ ａｇｇｔａａｇｔ ａｔｔｃｔｇｇｔ ａａａａ ［配列ＩＤ番号：１８２］ ９７９ ｔａａａｇｇｔａａａ ａｇｇｔａａｇｔａａ ｇｔａｔｔｃｔｇｇｔ ａａａａ ［配列ＩＤ番号：１８３］ 配列ＩＤ番号：１９６、１９７および１９８は、同じ４塩基挿入を含むヌクレ
オチドを含む。しかし、これらの配列は８、１２および１６ヌクレオチド長であ
る。４塩基挿入は、これらの各ヌクレオチドの中心にある。しかし、挿入は、８
、１２または１６ヌクレオチド配列のどの位置でも起こり得る。 【０３６５】 ９７９ ｔａａａｇｇｔａａａ ａｇｇｔａａｇｔ ａｔｔｃｔｇｇｔ ａａａａ ［配列ＩＤ番号：１８２］ ｇｔａａ ｇｔａｔ
［配列ＩＤ番号：１９６］ ９７９ ｔａａａｇｇｔａａａ ａｇｇｔａａｇｔ ａｔｔｃｔｇｇｔ ａａａａ ［配列ＩＤ番号：１８２］ ａａｇｔａａ ｇｔａｔｔｃ
［配列ＩＤ番号：１９７］ ９７９ ｔａａａｇｇｔａａａ ａｇｇｔａａｇｔ ａｔｔｃｔｇｇｔ ａａａａ ［配列ＩＤ番号：１８２］ ｇｔａａｇｔａａ ｇｔａｔｔｃｔｇ
［配列ＩＤ番号：１９８］ 第四の変異（［配列ＩＤ番号：１８５］）が、５人中１人の表現型的にＣＤ３
６に欠陥のあるアフリカ系カリブ人被検者に認められた。この変異は、Ｇｅｎｂ
ａｎｋＺ３２７５３（［配列ＩＤ番号：１８４］）のイントロン２内の点欠失で
ある。この変異が、機能的ＣＤ３６タンパク質の産生に有意な効果を及ぼすかは
不明である。 【０３６６】 ｔｃｔａｔｔｔａｃｃ ｃａｔｇｃｔｔｔｔｃ ｔｔａｔｔｔｔｃａｃ ａｇａ １０７ ［配列ＩＤ番号：１８４］ −ｃｔａｔｔｔａｃｃ ｃａｔｇｃｔｔｔｔｃ ｔｔａｔｔｔｔｃａｃ ａｇａ １０７ ［配列ＩＤ番号：１８５］ 配列ＩＤ番号：１９９、２００および２０１は、同じ点欠失を含むヌクレオチ
ドを含む。しかし、これらの配列は８、１２および１６ヌクレオチド長である。
欠失は、これらの各ヌクレオチドの開始点に位置する。しかし、欠失は、８、１
２または１６ヌクレオチド配列のどの位置でも起こり得る。 【０３６７】 ｔｃｔａｔｔｔａｃｃ ｃａｔｇｃｔｔｔｔｃ ｔｔａｔｔｔｔｃａｃ ａｇａ １０７ ［配列ＩＤ番号：１８４］ −ｃｔａｔｔｔａｃ
［配列ＩＤ番号：１９９］ ｔｃｔａｔｔｔａｃｃ ｃａｔｇｃｔｔｔｔｃ ｔｔａｔｔｔｔｃａｃ ａｇａ １０７ ［配列ＩＤ番号：１８４］ −ｃｔａｔｔｔａｃｃ ｃａｔ
［配列ＩＤ番号：２００］ ｔｃｔａｔｔｔａｃｃ ｃａｔｇｃｔｔｔｔｃ ｔｔａｔｔｔｔｃａｃ ａｇａ １０７ ［配列ＩＤ番号：１８４］ −ｃｔａｔｔｔａｃｃ ｃａｔｇｃｔｔ
［配列ＩＤ番号：２０１］ 第五の変異（［配列ＩＤ番号：１８７］）が、表現型ＣＤ３６に欠陥のあるア
フリカ系アメリカ人に認められた。変異は、新規な１４ヌクレオチドの反復から
生じ、エキソン１３（［配列ＩＤ番号：１８６］）における１４ヌクレオチドの
挿入である。１４ヌクレオチド挿入断片は、ヌクレオチド１５３０の後で起こり
、ヌクレオチド１５１７〜１５３０の反復配列を含む。変異は、オープンリーデ
ィングフレームのフレームシフトを予測する、機能的に有意な変異であり、これ
は、ＣＤ３６の配置および機能に必須である、Ｃ末端膜内外ドメインを含む、正
常なタンパク質のＣ末端を消失させる。 【０３６８】 １５１１ ｃｃｔａｔｔｃｔ ｔｔｇｇｃｔｔ
ａ ［配列ＩＤ番号：１８６］ １５１１ ｃｃｔａｔｔｃｔａｔ ｔｇｔｇｃｃｔａｔｔ ｃｔｔｔｇｇｃｔｔ
ａ ［配列ＩＤ番号：１８７］ 配列ＩＤ番号：２０２、２０３および２０４は、同じ１４塩基挿入断片を含む
ヌクレオチドを含む。しかし、これらの配列は１４、２２および２６ヌクレオチ
ド長である。１４塩基挿入変異は、２２および２６塩基の各ヌクレオチドの中心
にある。しかし、挿入は、２２または２６ヌクレオチド配列内のどの位置でも起
こり得る。 【０３６９】 １５１１ ｃｃｔａｔｔｃｔ ｔｔｇｇｃｔｔ
ａ ［配列ＩＤ番号：１８６］ ａｔ ｔｇｔｇｃｃｔａｔｔ ｃｔ
［配列ＩＤ番号：２０２］ １５１１ ｃｃｔａｔｔｃｔ ｔｔｇｇｃｔｔ
ａ ［配列ＩＤ番号：１８６］ ｔｔｃｔａｔ ｔｇｔｇｃｃｔａｔｔ ｃｔｔｔｇｇ
［配列ＩＤ番号：２０３］ １５１１ ｃｃｔａｔｔｃｔ ｔｔｇｇｃｔｔ
ａ ［配列ＩＤ番号：１８６］ ｔａｔｔｃｔａｔ ｔｇｔｇｃｃｔａｔｔ ｃｔｔｔｇｇｃｔ
［配列ＩＤ番号：２０４］ 第六変異（［配列ＩＤ番号：１８９］）は、糖尿病に罹患したアフリカ系カリ
ブ人に認められた。変異は、エキソン１０（［配列ＩＤ番号：１８８］）のＴか
らＣへのサイレント置換である。変異は、タンパク質のアミノ酸配列の変化を予
測しない。 【０３７０】 ｔｃｃｃｔｇｔｇｔａ ｔａｇａｔｔｔｇｔｔ ｃｔｔｃｃａｔｃｃａ
［配列ＩＤ番号：１８８］ ｔｃｃｃｔｇｔｇｔａ ｔａｇａｔｔｃｇｔｔ ｃｔｔｃｃａｔｃｃａ
［配列ＩＤ番号：１８９］ 配列ＩＤ番号：２０５、２０６および２０７は、同じＴからＣへの変異を含む
ヌクレオチドを含む。しかし、これらの配列は、９、１３および１７ヌクレオチ
ド長である。ＴからＣへの変異は、これらの各ヌクレオチドの中心にある。しか
し、変異は９、１３または１７ヌクレオチド配列のどの位置でも起こり得る。 【０３７１】 ｔｃｃｃｔｇｔｇｔａ ｔａｇａｔｔｔｇｔｔ ｃｔｔｃｃａｔｃｃａ
［配列ＩＤ番号：１８８］ ｇａｔｔｃｇｔｔ ｃ
［配列ＩＤ番号：２０５］ ｔｃｃｃｔｇｔｇｔａ ｔａｇａｔｔｔｇｔｔ ｃｔｔｃｃａｔｃｃａ
［配列ＩＤ番号：１８８］ ｔａｇａｔｔｃｇｔｔ ｃｔｔ
［配列ＩＤ番号：２０６］ ｔｃｃｃｔｇｔｇｔａ ｔａｇａｔｔｔｇｔｔ ｃｔｔｃｃａｔｃｃａ
［配列ＩＤ番号：１８８］ ｔａ ｔａｇａｔｔｃｇｔｔ ｃｔｔｃｃ
［配列ＩＤ番号：２０７］ 別のＣＤ３６変異を、以下のように、配列ＩＤ番号：２０９に提示する。 【０３７２】 １４２８−ＣＴＴＴＡＣＡＡＴＴ ＴＧＣＡＡＡＡＣＧＧ ＣＴＧＣＡＧＧ
ＴＣＡ ＡＣ ［配列ＩＤ番号：２０８］ １４２８−ＣＴＴＴＡＣＡＡＴＴ ＴＣＣＡＡＡＣＧＧ ＣＴＧＣＡＧＧ
ＴＣＡ ＡＣ ［配列ＩＤ番号：２０９］ 配列ＩＤ番号：２０９は、見かけ上２つの事象により引き起こされる、異常な化
合物変異である：１４３９位の正常なＧは、変異体（Ｇ１４３９Ｃ）ではＣに変
化し、単一ヌクレオチド欠失が１４４４位で起こった。Ｇ１４３９Ｃ変異は、ア
ラニンからプロリンへの置換を引き起こし、単一塩基対欠失は、Ｃ末端膜内外ド
メインおよびＣ末端細胞質尾を含む、遺伝子の正常な３’末端を消失させる、オ
ープンリーディングフレームのフレームシフトを引き起こす。（配列ＩＤ番号：
２０８および２０９で示した配列の番号付けは、ＡｒｍｅｓｉｌｌａおよびＶｅ
ｇａ、１９９４、Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１８９８５−９１に
より作成された番号付けによる）。配列ＩＤ番号：２０９に開示された二重変異
は、マラリアに対する保護には関連していないが、小児期（生殖年齢に達する前
）に感染を引き起こす疾病などの疾病に対して生存または保護を付与し得、乳児
下痢症、赤痢、呼吸器疾患、またはウイルスによる疾病を含み得る。従って、配
列ＩＤ番号：２０８および２０９は、かかる疾病の診断および／または治療に有
用であり得る。 【０３７３】 本明細書に記載したヒトＣＤ３６多型、特に［配列ＩＤ番号：１３３］および
［配列ＩＤ番号：１３５］（これはＣＤ３６プロモータ領域にある）は、特定の
集団、特にパンジャブシーク教徒および南アジアおよびその他の地域の者におけ
る、インシュリン抵抗性、糖尿病および冠動脈心疾患の主な原因であり得、かか
る集団は、他のインド系アジア人を含むがこれに限定されない。［配列ＩＤ番号
：１３３］および［配列ＩＤ番号：１３５］に見られる配列多型は、プロモータ
のホルボールエステル応答エレメント内にあり、またヌクレアーゼ過敏症の領域
内である。これらのエレメントは、ＣＤ３６調節を制御し得、ＣＤ３６遺伝子は
、高レベルで転写され、高い程度の転写制御を受けることが知られている。これ
らの変異型の一方または両方が、これらの集団の６０％まで存在し得、それゆえ
、英国または米国のカフカス人被検者と比較して、２〜４倍高い糖尿病および冠
動脈心疾患の危険性を説明し得る。従って、これらの変異型は、インシュリン抵
抗性、ＩＩ型糖尿病および冠動脈心疾患の診断、危険評価、予防および治療に有
用なマーカーである。 【０３７４】 別々の実験で、肥満パンジャブシーク教徒男性（ｎ＝４６）のＣＤ３６遺伝子
のジヌクレオチド反復（非常に有益な遺伝子マーカー）と、糖尿病、耐糖能障害
、冠動脈心疾患、グルコース負荷試験における断食中および２時間目（グルコー
ス添加後）のグルコースレベル、および最後に、断食中および２時間目（グルコ
ース添加後）のインシュリンレベル（すなわち、被検者は最初に断食し、経口グ
ルコース添加を受け、２時間後に血中インシュリンおよびグルコースレベルにつ
いて試験する）の間に、意義ある関連が観察された。これらの結果は、変異と、
観察された表現型の間の実際の連鎖は、統計学的解析（ｐ＝０．００５という低
いｐ値が観察された）により支持される。 【０３７５】 これらの実験を、Ｌｉｐｓｋｙら（１９９４、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ． 、３：２１７）により記載されたヒトＣＤ３６のミクロサテライトマーカーを使
用して、パンジャブシーク教徒男性の試験集団に実施した。糖不耐性との関連が
観察され、対立遺伝子３および４と本明細書で呼称した、２つの一般的な対立遺
伝子は、対立遺伝子Ａ１およびＡ４に対応する（Ｌｉｐｓｋｙら、１９９４、上
記）。表２は、対立遺伝子３の関連を示し、数値は、個体数として表現する（合
計に対する％）。 【０３７６】 【表１】 【０３７７】 これらのデータにより、少なくとも１コピーの対立遺伝子３を有するパンジャ
ブシーク教徒の糖尿病の相対的危険性は、対立遺伝子３を有さないことが判明し
たその者よりも６倍高いことが示された。対立遺伝子３と糖尿病の間の連鎖の統
計学的有意性は、対立遺伝子３＋ｖｅ対対立遺伝子３−ｖｅ：ｐ＝０．０１であ
る。 【０３７８】 表３は、対立遺伝子４とＩＧＴまたは糖尿病の危険性の間の関連を示す。 【０３７９】 【表２】 表３のデータにより、少なくとも１コピーの対立遺伝子４を有するパンジャブシ
ーク教徒の糖尿病の相対的危険性は、全く有さないその者よりも３倍低いことが
示された（統計学的有意性：対立遺伝子４＋ｖｅ対対立遺伝子４−ｖｅについて
ｐ＝０．００４）。 【０３８０】 配列変異型および冠動脈心疾患（ＣＨＤ）の間の関連も調べた。表４は、対立
遺伝子３変異型とＣＨＤの間の関連に関するデータを示す。 【０３８１】 【表３】 これにより、少なくとも１コピーの対立遺伝子３を有するパンジャブシーク教
徒のＣＨＤの相対的危険性の増加が示される（統計学的有意性：対立遺伝子３＋
ｖｅ対対立遺伝子３−ｖｅについてｐ＝０．２）。対立遺伝子３を欠失した個体
においてＣＨＤについて０が観察された結果、この危険性は完全に定量化できな
いが、１５倍までの大きな相対的危険性を示し得る。 【０３８２】 対立遺伝子４の存在または非存在に関連した危険性の変化も決定し、結果を表
５に示す。 【０３８３】 【表４】 【０３８４】 この結果により、１コピーの対立遺伝子４を有するパンジャブシーク教徒のＣ
ＨＤの相対的危険性の減少が示される（統計学的有意性：対立遺伝子４＋ｖｅ対
対立遺伝子４−ｖｅについてｐ＝０．０２）。この危険性は、ＣＨＤに罹患する
対立遺伝子４＋ｖｅ個体における数値が０であるため、定量化されないが、この
対立遺伝子を欠失した個体の１５倍以下という大きな相対的危険性を示し得る。 【０３８５】 注記すべき他の有意な結果は、対立遺伝子３についてホモ接合性である、パン
ジャブシーク教徒の断食中およびグルコース添加２時間後のインシュリンレベル
の上昇である（両方についてｐ＜０．００９）。これにより、対立遺伝子３につ
いてホモ接合性である個体のインシュリン抵抗性への素因が示される。 【０３８６】 ミクロサテライト対立遺伝子自体が上記の疾患に対する遺伝的素因の原因では
ないようであるが、１型糖尿病についてありそうもない結果がインシュリン遺伝
子座で観察され、インシュリン遺伝子転写に影響を及ぼすミニサテライトが、疾
病の危険性を付与し、それゆえ、対立遺伝子３および４と、糖尿病、ＩＧＴまた
はＣＨＤの間の連関が他の集団で観察され得る。少なくともパンジャブシーク教
徒では、およびおそらく他の集団でも、これらのマーカーは糖尿病、インシュリ
ン抵抗性および冠動脈心疾患の危険性の素因の重要な診断マーカーであり得る。
別に、これらの対立遺伝子は、それ自体、疾病の根本原因を示さないことがある
が、個体間の疾病危険性の差異の主な原因であるＣＤ３６遺伝子内の他の対立遺
伝子への連鎖不均衡（すなわち、強固な遺伝的連鎖）にあり得る。本明細書に開
示した多型、並びに、他の依然として同定されていない変異または多型は、観察
された疾病関連の根底にある遺伝的欠陥の候補である。それゆえ、それらは、こ
れらの疾患に対する素因について個体を選別するのに、並びに、薬剤スクリーニ
ングおよびこれらの対立遺伝子をもつ個体を本発明により疾病を治療する標的と
して有利には使用され得る。 【０３８７】 ＣＤ３６遺伝子の対立遺伝子変異型は、パンジャブシーク教徒およびおそらく
他の集団における、インシュリン抵抗性、糖尿病および冠動脈心疾患についての
、感受性の主な原因を示す。かかる結果は、公衆衛生および疾病予防および治療
に意義がある。上記に示したように、疾病連関対立遺伝子変異型は、例えば、上
記に示したものを含むがこれに限定されない、観察された多型部位を包囲する、
変異または野生型配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブを使用して、本発明
に記載の診断法で検出できる。他の適用可能な技法は、直接的ＤＮＡ配列決定、
一本鎖コンフォメーション多型解析、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、マイクロアレイ
ハイブリッド形成解析またはミスマッチ解析（酵素的切断または電気泳動法によ
る）（例えば勾配変性ゲル）を含むがこれに限定されない。さらに、これらの変
異型によりコードされるタンパク質は、診断目的のために（例えば、変異型特異
的標識抗体を用いて）検出され得、但し、目的の変異型は、非疾病関連変異型と
は免疫学的に異なる。最後に、これらの結果は、ヒトＣＤ３６遺伝子またはその
タンパク質産物を標的として使用する、薬剤スクリーニングプロトコルを支持す
る。 【０３８８】 Ｉ．本発明による候補疾病連関遺伝子のクローニング 位置クローニング法 ｉ．酵母人工染色体を使用した、染色体セグメントの物理的マッピングおよ び単離 この方法により、本発明のインシュリン抵抗性遺伝子座に位置する遺伝子を同
定する第一段階は、特定のインシュリン抵抗性遺伝子座を包含する領域を網羅す
るゲノム断片の単離である。酵母人工染色体（ＹＡＣ）が、挿入断片長の点で有
利に使用される。なぜなら、これらの染色体は、２メガ塩基対（Ｍｂ）までの挿
入断片ＤＮＡを保持し、例えば、１５０ｋｂ以下の挿入断片サイズを有する細菌
人工染色体（ＢＡＣ）に比べて、あるゲノム領域を網羅するのに数個のクローン
しか必要としないからである。ＢＡＣはＹＡＣよりもキメラ化および再編成する
傾向が低い点で、それらは、ＹＡＣからのセグメントのサブクローニングにも、
およびＹＡＣコンティグ内および接合部領域にギャップを構築するのにも有用で
ある。それゆえ、ＹＡＣとＢＡＣコンティグの組み合わせは、目的の染色体セグ
メントを物理的にマッピングするのに有用である。 【０３８９】 ラット、マウスおよびヒトＹＡＣおよびＢＡＣライブラリーは、市販されてい
る（例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａ
Ｌ）。末端断片配列は、ＹＡＣコンティグのＹＡＣから単離し、クローンをこれ
らから得、互いにクローンを要求するためのプローブとして使用できる。切断部
位の稀な酵素を使用した部分的消化およびパルスフィールドゲル電気泳動を用い
た制限マッピングを使用して、コンティグのＴＡＣと、コンティグの実際の長さ
の間の重複程度を決定できる。遺伝子位置づけ手順に含まれる分子法（例えば、
制限マッピング、ゲル電気泳動、核酸ハイブリッド形成およびサブクローニング
）を、当分野で公知の方法により実施し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ ｌ．第２版 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。物理的に単離し
たＤＮＡからの候補遺伝子の同定は、ここでも当分野で公知の方法による、直接
的ＹＡＣハイブリッド形成、直接的ｃＤＮＡ選択、エキソン捕獲および長い範囲
の配列を含む、数個を技法を組合せて使用してアプローチできる。これらの方法
の１つまたは組合せを、ある遺伝子の単離に使用し得る。例えば、インシュリン
抵抗性遺伝子座の遺伝子は、細かい遺伝子マッピング、次いで物理的マッピング
、長い範囲の配列決定およびエキソン捕獲の組合せにより同定し得る。これらの
各段階は次の効率を高める。最終段階は、ＤＮＡ配列解析または下記した方法（
Ｅ章参照）により遺伝子の変異（群）を同定し、変異が関連変異表現型と同時分
離することを示し、これも上記したように（Ｄ章参照）、細胞、細胞系または動
物での変異および／または対応する野生型遺伝子の効果を規定することである。 【０３９０】 ｉｉ．プラスミドレスキュー 上記したように、レトロウイルスベクター、プラスミドまたは可動遺伝要素（
例えばトランスポゾン）などの変異原性ベクターを使用して、目的の遺伝子をマ
ッピングできる。特別なサブクラスのかかる変異原性核酸は、最初にＤｒｏｓｏ
ｐｈｉｌａ（ショウジョウバエ）で記載されたが、等しく哺乳動物モデル系にも
適用可能である（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏ ａｃｈ におけるＰｉｒｏｔｔａ、１９８６、Ｒｏｂｅｒｔｓ編、ＩＲＬ Ｐｒｅ
ｓｓ、ＯｘｆｏｒｄおよびＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）、「プラスミドレ
スキュー」として知られる技法による、宿主（すなわち試験動物）のベクター組
込み部位に隣接した染色体配列の回復を可能とする。この手順により、変異原性
作成物は、細菌複製起源および選択マーカー（例えば薬剤耐性遺伝子）の両方を
含み、これは共に最小のプラスミドを構成する。最小プラスミドカセットの片側
には、制限エンドヌクレアーゼの独特な認識部位があり、典型的には１つ以上の
かかる部位がある。変異原性作成物を有する生物からのゲノムＤＮＡを、これら
の独特な制限酵素の１つで切断し、環化し（例えば自己結合により）、細菌に形
質転換する。最小プラスミドのみを、使用する酵素の最も近いゲノム切断部位ま
で伸長している染色体配列と共に、細菌中で増殖できる。 【０３９１】 ｉｉｉ．ミクロクローニング 目的の遺伝子は、いったんマッピングすると、支持体基質（例えばガラス顕微
鏡スライド）に付着させた染色体領域を物理的に切断し、次いで無作為にベクタ
ーにクローン化し、増殖することにより得られた豊富なライブラリーからクロー
ン化できるが、この技法は、数多くの生物の全ゲノムにおよぶＹＡＣライブラリ
ーは入手できるために、幾分時代遅れである。 【０３９２】 Ｊ．本発明による疾病治療 本発明は、インシュリン作用、カテコールアミン作用、グルコース代謝または
脂肪酸代謝または輸送の欠陥に関連した疾病の診断の方法、並びに、かかる疾病
の治療に有用であり得る候補薬剤の同定およびアッセイの方法を提供する。イン
シュリン作用または脂肪酸代謝または輸送の欠陥は、インシュリン抵抗性症候群
（代謝症候群Ｘ）または心筋症を引き起こす。インシュリン抵抗性症候群に関連
した疾病は、インシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）および本態性高血圧を
含むがこれに限定されず、一方、心筋症に関連した疾病は、遺伝性肥大型、拡張
型、圧過負荷、または特発性心筋症を含むがこれに限定されない。本発明はさら
に、グルコースまたは脂質代謝に関連した機能の調節に効果的であると同定およ
び判明した薬剤を、かかる機能の欠陥を有する患者に投与することによる方法を
提供し、ここでの薬剤の標的は、目的の機能を調節し、上記で定義したインシュ
リン抵抗性遺伝子座に連関する。 【０３９３】 ＣＤ３６タンパク質欠乏症を有する患者、例えば配列ＩＤ番号：１７９、１８
１、１８３および１８７に開示した変異の１つ、またはＣＤ３６タンパク質欠乏
症を引き起こす他の変異を有する患者を治療する１つの方法は、野生型ＣＤ３６
遺伝子または機能的ＣＤ３６タンパク質の発現を引き起こす他の組換え核酸を導
入する遺伝子療法を含む。遺伝子療法は、Ｄ．ｉ章で上記に列挙した方法のいず
れか、または当分野で公知の任意の適切な方法により実施できる。ＣＤ３６タン
パク質欠乏症は、機能的ＣＤ３６タンパク質をコードする任意の核酸配列、例え
ば[配列ＩＤ番号：１０１]、[配列ＩＤ番号：１０２]、[配列ＩＤ番号：１０３]
、[配列ＩＤ番号：１０４]、[配列ＩＤ番号：１０５]、[配列ＩＤ番号：１０６]
、[配列ＩＤ番号：１０７]、[配列ＩＤ番号：１０８]、[配列ＩＤ番号：１０９]
、[配列ＩＤ番号：１１０]、[配列ＩＤ番号：１１１]、[配列ＩＤ番号：１１２]
、[配列ＩＤ番号：１１３]、[配列ＩＤ番号：１１４]、[配列ＩＤ番号：１１５]
、[配列ＩＤ番号：１１６]、[配列ＩＤ番号：１１７]、[配列ＩＤ番号：１１８]
、[配列ＩＤ番号：１１９]、[配列ＩＤ番号：１２０]、[配列ＩＤ番号：１２１]
、[配列ＩＤ番号：１２２]、[配列ＩＤ番号：１２３]、[配列ＩＤ番号：１２４]
、[配列ＩＤ番号：１２５]、[配列ＩＤ番号：１２６]、[配列ＩＤ番号：１２７]
、[配列ＩＤ番号：１２８]、[配列ＩＤ番号：１２９]、[配列ＩＤ番号：１３２]
、[配列ＩＤ番号：１３３]、[配列ＩＤ番号：１３４]、[配列ＩＤ番号：１３５]
、[配列ＩＤ番号：１３６]、[配列ＩＤ番号：１３７]、[配列ＩＤ番号：１３９]
、[配列ＩＤ番号：１４０]、[配列ＩＤ番号：１４２]、[配列ＩＤ番号：１４３]
、[配列ＩＤ番号：１４４]、[配列ＩＤ番号：１４５]、[配列ＩＤ番号：１４６]
、[配列ＩＤ番号：１４７]、[配列ＩＤ番号：１４８]および[配列ＩＤ番号：１
４９] に開示された配列の導入により治療できる。 【０３９４】 本発明によりグルコースまたは脂質代謝を調節する薬剤の投与量および投与法
は、動物モデルまたはヒト被検者に関するスクリーニング法について上記した通
りである。かかる薬剤は、医者などの当業者の判断により、患者の身体的必要性
および状態に応じて、１回投与または頻回投与計画で投与し得る。治療は、上記
したような、臨床指示薬または生化学係数のモニタリングに基づき効果的である
と判断され、一般に、定量可能な場合には、少なくとも１０％、好ましくは２０
％以上の比率変化が有効の指標である。 【０３９５】Ｋ．本発明による供与のための生物学的サンプルのスクリーニング 本発明は、別のヒトまたは哺乳動物に供与するための、ヒトまたは哺乳動物由
来の血液または他の細胞、組織、臓器、または体液をスクリーニングする方法を
提供する。スクリーニング法は、ＣＤ３６遺伝子または非ヒト哺乳動物種の相同
的遺伝子における変異を試験する方法、並びに、ＣＤ３６タンパク質欠乏症、ま
たは非ヒト哺乳動物種の相同的タンパク質の欠乏症を検出する検出する方法を含
む。 【０３９６】 ＣＤ３６タンパク質欠乏症を有し、ＣＤ３６タンパク質欠乏症を有さないヒト
または哺乳動物由来の細胞、組織（例えば、血小板を含む、血液または血液製剤
）、臓器、体液のレシピエントである、ヒトまたは哺乳動物に、ＣＤ３６タンパ
ク質に対する抗体の産生などの、有害な免疫反応を発達させる。それゆえ、ＣＤ
３６または相同的タンパク質の欠乏症を有するヒトまたは哺乳動物への供与また
は移植前に、細胞、組織、臓器または体液などの供与物質を探索する場合、可能
な供与体を選抜し、適合性ＣＤ３６欠乏症を有するものを選択し、細胞、組織、
臓器または体液が野生型ＣＤ３６タンパク質を含む可能な供与体を却下すること
が望ましくあり得る。かかるスクリーニングは、供与または移植する物質が、全
血或いはレシピエントの免疫応答を刺激し得るＣＤ３６タンパク質型を潜在的に
含む血液から調製した血液製剤、例えば充填血球、赤血球、血小板または任意の
他の物質である場合に特に重要であり得る。 【０３９７】 供与物質のスクリーニングは、ＣＤ３６遺伝子の変異またはＣＤ３６タンパク
質欠乏症について、可能性ある供与体からの、血液を含む、任意の生物学的サン
プルを試験することにより実施できる。試験した物質は、供与物質自体または供
与体から得られた血液などの別の生物学的サンプルであり得る。変異の検出は、
上記の任意の方法により実施できる。Ｃ３６タンパク質欠乏症の検出は、ＣＤ３
６遺伝子の変異について試験することにより、または、例えばウェスタンブロッ
ト、ＥＬＩＳＡ、またはＣＤ３６タンパク質変異型を区別できる別の技法を使用
して、レシピエントに見られないＣＤ３６タンパク質の変異型について試験する
ことにより実施できる。ＣＤ３６欠乏症またはＣＤ３６遺伝子変異のスクリーニ
ング法は、配列ＩＤ番号：１７９、１８１、１８３、１８５および１８７に記載
したような一般的に起こる変異、或いは、ＣＤ３６タンパク質欠乏症を引き起こ
すかまたはその指標となることが知られる他の変異についての、かかる欠乏症試
験を示すことが好ましい。試験後に、細胞、組織（血液および血液製剤を含む）
、臓器、または体液などの供与物質を、結果をエンドユーザ（例えば医者または
その関連者）またはかかる供与物質のレシピエントに結果を伝えるに適切な任意
の方法で標識する。例えば、供与物質を貯蔵する容器を、ＣＤ３６遺伝子型また
は供与物質の表現型の表示で標識できるか、または類似の情報を、エンドユーザ
またはレシピエントへの供与物質の発送に伴いまたはそれに関連して、明細書類
を使用してまたは電子形で伝達できる。 【０３９８】 本発明はまた、供与体を、ＣＤ３６欠乏症に基づいたレシピエントに適合させ
る方法を提供する。細胞、組織（血液または血液製剤を含む）、臓器、または体
液のレシピエントを試験して、レシピエントが、ＣＤ３６遺伝子産物欠乏症また
はかかる欠乏症を引き起こすＣＤ３６遺伝子の変異を有するかを決定する。レシ
ピエントが、かかる欠乏症を有する場合、レシピエントを、類似の欠乏症を有す
る供与体、またはレシピエント欠乏症と適合性の供与体と適合させる。供与物質
が、供与物質に発現されるＣＤ３６遺伝子産物のために、レシピエントにおいて
免疫応答を引き起こさないようである場合、供与体のＣＤ３６欠乏症は、レシピ
エントの欠乏症と適合性である。かかる免疫応答の確率は、ＣＤ３６遺伝子産物
の欠乏症またはＣＤ３６遺伝子変異についてレシピエントを試験した結果を、上
記の通りに実施した供与物質のスクリーニング結果と比較することにより、当業
者により予測され得る。 【０３９９】 Ｌ．本発明による寄生虫感染に対する抵抗性およびその治療 本発明は、患者が、ある寄生虫感染に抵抗性であることが遺伝的に素因づけら
れているかを決定する方法を提供する。ヒトまたは他の動物被検者の感染過程で
、機能的ＣＤ３６または相同的タンパク質を必要とする任意の寄生虫病が、これ
らの方法の使用に適切である。かかる疾病の例は、熱帯熱マラリア、脳性マラリ
アおよび黒水熱を含む。 【０４００】 本明細書に記載したＣＤ３６変異体の中で、４つ（配列ＩＤ番号：１７９、１
８１、１８３および１８７）が、ホモ接合性個体の完全なＣＤ３６タンパク質欠
乏症と関連している。これらの変異および依然として発見されていないその他の
変異を使用して、熱帯熱マラリアおよびＣＤ３６タンパク質に関与する他の寄生
虫感染に抵抗性のようである患者を同定できる。かかる寄生虫感染の危険性のあ
る患者を試験して、それらが配列ＩＤ番号：１７９、１８１、１８３および１８
７に開示したような変異或いはＣＤ３６タンパク質欠乏症を引き起こすまたは指
標となる別の変異を有するかを決定することにより、これらの患者は、予防的薬
剤療法などの適切な注意を払うことや、Ｃ３６タンパク質欠乏症の指標となる変
異を有さない場合には感染の危険性を回避することができる。 【０４０１】 さらに、本発明は、熱帯熱マラリア、脳性マラリア、黒水熱、および、寄生虫
薬のリガンドとしてＣＤ３６タンパク質に関与する他の疾病といった、寄生虫感
染の予防および治療の方法を提供する。この方法は、ＣＤ３６遺伝子発現阻害を
含む。ＣＤ３６遺伝子発現の阻害により、ＣＤ３６タンパク質欠乏症が誘導され
得、熱帯マラリア原虫またはリガンドとしてＣＤ３６を使用する他の寄生虫によ
る感染プロセスを阻害できる。それゆえ、これらの方法を実践するために、ＣＤ
３６遺伝子発現の阻害剤を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する
。患者が、かかる寄生虫に感染したり、またはかかる寄生虫による感染の危険性
がある場合には、患者にはかかる医薬組成物が必要である。ＣＤ３６遺伝子発現
の阻害剤は、上記に開示した任意の物質、例えば、ＣＤ３６タンパク質に対する
抗体、ＣＤ３６ｍＲＮＡに結合するアンチセンス核酸、宿主の細胞に組み込まれ
、ＣＤ３６遺伝子発現の任意の態様を阻害する、アンチセンス核酸、リボザイム
、または小分子を産生するベクターであり得る。かかる物質は、患者の細胞で、
少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、
少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、
または少なくとも９９％のＣＤ３６タンパク質発現を阻害する用量で投与される
。ＣＤ３６遺伝子産物の量の減少は、Ｈａｎｄｕｎｎｅｔｔｉら、１９９２、Ｂ
ｌｏｏｄ ８０：２０９７（本明細書に参考として組み込む）に記載のように赤
血球（Ｃ３６を有する）によるロゼット形成阻害を介して、または、Ｅｎｄｅｍ
ａｎｎら、１９９３、Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１８１１（本
明細書に参考として組み込む）に記載のように、酸化低密度リポタンパク質の、
ＣＤ３６を有する細胞（例えば血小板）への結合阻害を介して決定し得る。 【０４０２】 本発明はまた、寄生虫のＣＤ３６タンパク質への結合に関与する、寄生虫感染
の予防または治療における効力について、薬剤をスクリーニングする方法を提供
する。候補薬剤を、ＣＤ３６タンパク質の欠乏症を引き起こすように、ＣＤ３６
遺伝子の発現を破壊する能力について試験し、従って、寄生虫により感染を予防
または治療する薬剤の効力を示す。寄生虫のＣＤ３６タンパク質への結合を破壊
または阻害することにより、薬剤は、細胞または組織が感染されることを防ぎ、
または感染が宿主内で蔓延することを防ぐことができる。かかる薬剤スクリーニ
ングアッセイにおいて、ＣＤ３６遺伝子は、転写および／または転写／翻訳アッ
セイ、また全細胞アッセイで試験でき、薬剤の存在下でのＣＤ３６遺伝子発現の
阻害レベルは、本明細書に開示したＣＤ３６変異遺伝子による遺伝子発現のレベ
ルと比較できる。候補薬剤のＣＤ３６タンパク質への結合は、寄生虫のＣＤ３６
タンパク質への結合を防止する薬剤の効力を予測でき、それゆえ、寄生虫による
感染の予防または治療におけるその効力を予測できる。寄生虫感染の治療に可能
性のある薬剤はまた、薬剤により産生されるＣＤ３６転写活性化遺伝子発現の阻
害レベルのアッセイによりスクリーニングし得る。ＣＤ３６遺伝子のかかる正の
調節因子である遺伝子は、ｐｐｒ−γ遺伝子を含む。ＣＤ３６遺伝子発現を定性
または定量的に測定できる当分野で公知の任意のアッセイが、本発明のこの態様
に有用である。様々な濃度の候補薬剤を試験して、治療有効濃度を決定し得、い
ったん治療がもはや必要でなくなると容易に戻り得る。 【０４０３】 候補抗マラリア薬剤として同定した薬剤は、ＳＨＲ（高血圧自然発症ラット）
動物モデルでさらに試験できる。ＳＨＲラットは、ＣＤ３６タンパク質を欠失し
ている。なぜならＣＤ３６遺伝子の一部は、このラットの両方の染色体上で欠失
しているからである。候補抗マラリア薬剤は、ＣＤ３６トランスジェニックＳＨ
ＲラットおよびＳＨＲラットの両方で試験する。 【０４０４】 Ｍ．本発明に記載のキット 本発明に記載のキットは、本明細書に開示したＣＤ３６の変異配列のいずれか
１つを含むまたはからなる核酸およびそのパッケージを含み得る。 【０４０５】 本発明に記載のキットはまた、スクリーニングされ本発明に記載の疾病の治療
に効果的であると判明した薬剤から選択した薬剤、担体（例えば、緩衝液または
薬剤スクリーニングの説明で上記した他の物質）、およびそのパッケージを含み
得る。本発明のキットに供給される薬剤は、本明細書に開示した方法に従ってス
クリーニングした、１つまたは１つ以上の物質を含み得る。薬剤成分は、タンパ
ク質、タンパク質をコードする遺伝子発現作成物を含む核酸または他の核酸（例
えば、リボザイムまたはアンチセンス分子）として提供され、溶液中（好ましく
は冷蔵または冷凍）または上記のように（「候補モジュレータ」参照）他の物質
中、分解を阻害し、薬剤の生物活性を維持する緩衝液中にある。かかる緩衝液は
、上記に定義したように、生理学的に適合性の緩衝液ではなく貯蔵緩衝液である
場合、薬剤の希釈および／または送達に生理学的に適合性の緩衝液を使用しなけ
ればならない。生理学的に適合性の緩衝液は、所望によりかかるキットと共に供
給される。別に、薬剤は、乾燥形、すなわち凍結乾燥形で提供され、この場合、
成分は、投与前に生理学的に適合性の緩衝液中に再懸濁し、この緩衝液はキット
と共に供給され、かかる緩衝液は、それと共に混合される薬剤の生物活性を保存
し、患者への安全な投与を可能とする。これらの各成分は、チューブ、バイアル
、シリンジまたは瓶を含むがこれに限定されない群から選択した容器に、別々に
含まれて供給されるか、または１つ以上のその他の物質と混合して供給される。
全成分を単一温度で発送および／または貯蔵しても、別に、異なる成分を、各有
効期間が最適化されるように別々の温度で維持してもよい。 【０４０６】 所望により、キットは細胞を含む。かかる細胞は所望により、本発明に記載の
治療プロトコルで、患者に送達される薬剤を含む。上記した、真核または原核細
胞は、液体または固体の生理学的緩衝液または培養培地（例えば、懸濁液、穿刺
培養、または培養プレート、例えばペトリ皿中）に供給される。発送を簡易化す
るために、細胞は、典型的には、瓶、チューブまたはバイアル中で、冷蔵、冷凍
または凍結乾燥する。細胞保存法は、当分野で公知であり、適切な緩衝液および
培地は当分野で公知であり、業者（例えば、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ）から得られるか、または標準的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，第２版 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ
Ｙ参照）により製造する。 【０４０７】 Ｎ．本発明に記載の核酸配列の有用性 本発明のポリヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドは、例えば、独特
な製品の識別子を確立し続いて追跡するための、多くの多様な物質（例えばイン
ク、有害な廃棄物質、銃、貴重品）のいずれか１つのマーカーまたはタグとして
、染色体マッピングのマーカーとして、および法医学解析のマーカーとして、様
々な用途を有する。本発明のポリヌクレオチドのさらなる用途は、例えば、細胞
または組織中の対応するＤＮＡまたはＲＮＡを検出するプローブとして（疾病の
診断用に）およびコードされたポリペプチドを製造するための、その配列の独特
なコード特徴を含むがこれに限定されない。ポリヌクレオチドによりコードされ
たポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な抗体の調製に使用し得、抗体は、細
胞または組織のポリペプチドを検出するために、またはポリペプチドに関連した
疾病の診断指示薬として使用し得る。 【０４０８】 ポリヌクレオチドは、後の同定および／または追跡の目的で、物体または物質
をマークするために使用できる。従って、本発明のポリヌクレオチドは、（１）
動物、植物、油、鉱物、および水などの天然源、（２）薬剤、溶媒、石油製品、
および爆薬などの化学物質、（３）放射性または他の危険な廃棄物などの汚染物
質を含む市販の副生成物、および（４）銃、タイプライター、自動車および自動
車部品などの製造品を含むがこれに限定されない、多くの多様な物質の製造およ
び分布の追跡に有用である。従って、本発明の核酸は、タグとして使用する場合
、製品確認の決定を補助し、製造者および消費者に有用な情報を提供する。 【０４０９】 タグとして有用であるのは、ポリヌクレオチドのその独特な配列に起因する。
なぜなら、配列またはその配列から得られた特徴的パターンが、ポリヌクレオチ
ドに、追跡を可能とする特性を付与するからである。 【０４１０】 本発明の新規なポリヌクレオチド配列、またはその断片または誘導体は、タグ
する物体または物質へのまたはその混合物への付着により、タグとして使用し得
る。様々な種類の物質をタグし、それらの物質中のタグを後に検出する方法は、
米国特許第５，４５１，５０５号および第５，６４３，７２８号（本明細書に参
考として組み込む）に開示されている。 【０４１１】 簡潔には、本発明のポリヌクレオチドのタグとしての使用は、１）物質または
物体に適切な方法を使用した、タグする物質または物体と、ポリヌクレオチド、
またはポリヌクレオチドの断片または誘導体の組合せ、および２）物質および物
体からのタグの遊離を介したタグの検出、およびＰＣＲ技法、次いで配列解析ま
たは当分野で公知の他の手段（例えばハイブリッド形成アッセイ）による同定を
使用した、ポリヌクレオチドタグ配列の増幅を包含し得る。 【０４１２】 核酸タギングが適している物質の１つの実施例は、火薬である。タグした火薬
は以下のように調製され得る：１）選択したタグ配列（本発明のポリヌクレオチ
ドから得られる）を有する１６ｎｇの核酸を、１ｍｌの蒸留水に加える、２）核
酸溶液を、１ｇのニトロセルロースをベースとした火薬と混合する、３）空気中
でまたは真空下で８５℃で乾燥させる。火薬からタグを回収するために：１）火
薬サンプルを、１ｍｌの蒸留水で洗浄する、２）５０μｌの洗浄溶液を、標準的
なＰＣＲ混液に加えるか、または別に、火薬片を直接１００μｌのＰＣＲ混液に
入れる、および３）タグとして使用する配列の反対の末端および反対の鎖でアニ
ールするプライマーを使用して、標準的なＰＣＲ法に従って増幅する（アニーリ
ングおよび伸長条件は、オリゴヌクレオチドプライマーに選択した正にその配列
に依存し、当分野で公知の方法に従って調整し得る）。 【０４１３】 実施例１ 本実施例は、候補遺伝子の染色体マッピング、および、その地図上の位置と、
本発明に記載のインシュリン抵抗性遺伝子座の地図位置との比較を示す。ラット
第４染色体の近位領域の放射線雑種（ＲＨ）地図を、この領域からのミクロサテ
ライトおよび遺伝子マーカーを使用して作成し、ラットに以前にマッピングされ
ていない５つの遺伝子のマーカーを配置するために使用する。これは、ラットへ
のマッピングの最初の適用の１つを示す。この地図により、第４染色体のインシ
ュリン抵抗性遺伝子座１に位置することが知られる、心血管および代謝機能の根
底にある遺伝子の、本発明による同定を容易にし、この染色体セグメントの物理
地図の作成の基礎を提供する。使用した方法および得られた結果は以下の通りで
ある。 【０４１４】 これらの実験に使用した１０６ハイブリッドＤＮＡの全ゲノムラット／ハムス
ターＲＨパネルは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌ
ｅ、Ａｌａｂａｍａ）から購入した。パネルは、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ
繊維芽細胞系（ラットＦＲ）からの照射細胞を、レシピエントハムスター系（Ａ
２３）と融合することにより作成した。ＦＲ供与細胞を、Ａ２３レシピエント細
胞と融合する前に、３，０００ｒａｄで照射した。 【０４１５】 様々な起源の２４匹のラットミクロサテライトマーカー（Ｊａｃｏｂら、１９
９５、Ｃｅｌｌ、６７：２１３−２２４；Ｇｏｌｄｍｕｎｔｚら、１９９５、Ｍ ａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ 、６：４５９−４６３；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏ
ｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｒａｔ／ｐｕｂｌｉｃ／）を使用して、ＦＲとＡ
２３の間の変異性について、供与およびレシピエントＤＮＡを選抜した（表６）
。ＩＬＧ６のプライマー配列は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＩＬＧ
６Ｆ５’−ＴＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＴＡＣＣＣＡＧＧ−３’［配列ＩＤ番号：
９３］；ＩＬＧ６Ｒ５’−ＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＣＴＴＴＧＣ−３
’［配列ＩＤ番号：９４］から得た。Ｎｏｓ３ミクロサテライトのプライマーは
、Ｎｏｓ３（Ｈｕｂｎｅｒら、１９９５、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ６：７５８
−７５９）：Ｎｏｓ３Ｆ：５’−ＡＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧ−
３’［配列ＩＤ番号：９５］；Ｎｏｓ３Ｒ：５’−ＧＴＧＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡ
ＴＡＡＡＣＡＴＧ−３’［配列ＩＤ番号：９６］のラットゲノム配列から設計し
た。Ｄ９Ｂｒｏ１と称されるプライマー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
）は、Ａｅ２遺伝子に対応し（Ｊａｃｏｂら、１９９５、上記；Ｓｉｍｏｎら、
１９９６、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ、７：３８０−３８２）、この研究のために
呼称Ｄ９Ｂｒｏ１を得た。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｇｅｎｏｓｙｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）により商業的に合成
した。オイルフリーＰＣＲを、タッチダウン周囲以下熱サイクラー（Ｈｙｂａｉ
ｄ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）で、９４℃で３分間の最初の変性、次いで９
４℃で３０秒間の３５サイクルの変性、適切な温度（表６）で４５秒間のアニー
リング、および７２℃で１分間の伸長、７２℃で８分間の最終伸長を実施した。
各反応液は、１０ｍＭトリスＨＣｌ中５０ｎｇのハイブリッド細胞系ＤＮＡ、０
．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）および０．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼを含む全容量１０μｌを有した。他の試薬の最終濃度は以下の通りであった。
各オリゴヌクレオチドプライマー０．６６μＭ、ｄＮＴＰ０．２ｍＭおよび１×
ＰＣＲ反応緩衝液。ＭｇＣｌ２濃度およびアニーリング温度を、各プライマー対
について最適化した（表６）。 【０４１６】 ＰＣＲ産物を、１×ＴＢＥ中３％アガロースゲル（２％Ｎｕｓｉｅｖｅ；１％
アガロース）上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。Ａ２３とＦＲ
の間のサイズ差異は、アガロースゲル電気泳動上で検出されず、ＰＣＲ産物を、
ＡＢＩ３７７自動シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でサイズ差異につ
いて試験し、産物を、蛍光標識ｄＵＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の組み込
みにより可視化した。 【０４１７】 この方法により試験した２４のミクロサテライトの中で、全てが、ＦＲとＡ２
３ＤＮＡの間に長さの変異を示すか、またはＦＲ ＤＮＡによるＰＣＲ産物を与
えたが、Ａ２３の産物は与えなかった。ミクロサテライトマーカーＤ４Ｒａｔ１
１７により、一貫性のない増幅が得られ、これはデータ解析から排除した。それ
ゆえ、２４のミクロサテライトを使用して、ＲＨ細胞系をＦＲ染色体断片の保持
について評価した。各遺伝子座の別々の重複ＰＣＲ反応を、２人の観察者により
個別に有無について評価した。典型的には、９５％〜９９％の一致が、重複ＰＣ
Ｒ反応間に得られた。あるマーカーについての矛盾した結果を示すハイブリッド
から得られた結果を廃棄した。 【０４１８】 可能であれば、対照ハムスタープライマーを、ラット特異的プライマーと共に
ＰＣＲ反応に使用し、全ＰＣＲ反応においてハムスター特異的バンドを得た。Ｄ
ＨＦＲ遺伝子のハムスター配列から得られた以下のプライマー： ＨＡＭ１Ｆ：５’−ＴＡＴＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧ−３’［配列
ＩＤ番号：９７］； ＨＡＭ１Ｒ：５’−ＡＣＴＣＡＣＧＡＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧ−３’［配列
ＩＤ番号：９８］； ＨＡＭ２Ｆ：５’−ＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧ−３’［配列
ＩＤ番号：９９］；および ＨＡＭ２Ｒ：５’−ＧＡＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡ−３’［配列
ＩＤ番号：１００］ を、ハムスターゲノムＤＮＡの増幅に使用した。 【０４１９】 ＨＡＭ２ＦおよびＨＡＭ２Ｒを、Ｄ４Ａｒｂ１３、Ｄ４Ｒａｔ２、Ｄ４Ｒａｔ
５、Ｄ４Ｒａｔ１１７、Ｄ４Ｍｇｈ１、Ｎｏｓ３、Ｆｉｎ１３、Ｐｇｙ１、およ
びＰｓｍｃ２と共に使用し、ＨＡＭ１ＦおよびＨＡＭ２Ｒを、Ｄ４Ｒａｔ１、Ｄ
４Ｒａｔ３、Ｄ４Ｒａｔ４、Ｄ４Ｒａｔ６、Ｄ４Ｒａｔ７、Ｄ４Ｒａｔ９、Ｄ４
Ｒａｔ１０、Ｄ４Ｒａｔ１２５、Ｄ４Ｒａｔ１２６、Ｄ４Ｒａｔ１３３、Ｄ４Ｒ
ａｔ１３６、Ｄ４Ｒａｔ１３９、Ｄ４Ｒａｔ１４２、Ｄ４Ｒａｔ１４９、Ｄ４Ｒ
ａｔ１５０、Ｄ９Ｂｒｏ１、ＩＬＧ６、Ｓｌｃ４ａ２、およびＣａｃｎａ２に使
用し、ＨＡＭ１ＦおよびＨＡＭ１Ｒを、Ｄ４Ｒａｔ１５０に使用した。ＨＡＭ２
Ｆ／２Ｒは２３０ｂｐのサイズの産物を与え、ＨＡＭ１Ｆ／２Ｒは、３００ｂｐ
のサイズの産物を与え、ＨＡＭ１Ｆ／１Ｒは２８０ｂｐのサイズの産物を与えた
。 【０４２０】 ラットＲＨ地図上に新規な遺伝子を配置するために、ＰＣＲアッセイを、ラッ
ト第４染色体にシンテニーである、マウス第５染色体およびヒト第７染色体に位
置する、マウスおよびヒト遺伝子について展開した（Ｙａｍａｄａら、１９９４
、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ、５：６３−８３）。各マウスおよびヒト遺伝子用の
プライマーを、両方のコード配列および３’非翻訳配列から設計した。コード配
列から設計したプライマーを用いた特異的増幅の確率を最大化するために、各オ
リゴヌクレオチドの最後の２つの３’塩基は、コドンの第一および第二塩基に対
応し、種を超えた配列の保存は最大のようである。ＰＣＲプライマー対はまた、
Ｌ型カルシウムチャネル遺伝子のラットｃＤＮＡ配列から設計し（Ｇｅｎｂａｎ
ｋ寄託番号Ｍ８６６２１）、そのマウス相同体はマウス第５染色体に位置する（
Ｃｈｉｎら、１９９２、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３：１３２５−１３２７）。 【０４２１】 保持パターンを、ＲＨＭＡＰパッケージのプログラムＲＨ２ＰＴ、ＲＨＭＩＮ
ＢＲＫおよびＲＨＭＡＸＬＩＫを使用して、２点および多点法により解析した（
Ｂｏｅｈｎｋｅｅｔら、１９９１；Ｌａｎｇｅら、１９９５；ＲＨＭＡＰ、Ｖｅ
ｒｓｉｏｎ ３．０、１９９６年９月；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｐｈ．ｕｍｉ
ｃｈ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｓｔａｔｇｅｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ）。これらの実
験に使用した最尤モデルは、放射線誘導破壊が無作為に起こると仮定した。さら
なる仮定は、期待される保持頻度は染色体を通じて等しいというものであった。
しかし、観察された保持頻度のばらつきに関して、左側終了点の保持モデル下の
最尤解析（Ｂｏｅｈｎｋｅら、１９９１；ＢｉｓｈｏｐおよびＣｒｏｃｋｆｏｒ
ｄ、１９９２；Ｂｏｅｈｎｋｅら、１９９２）も実施した。分岐および結合法を
使用して、全体の最小破壊数を計算した。しかし、分岐および結合アルゴリズム
を適用できない場合（例えば、考慮する遺伝子座の数があまりにも多いために）
、絶対的染色体切断に関する１セットの最善の次数が、プログラムＲＨＭＩＮＢ
ＲＫの段階的アルゴリズムを用いて確立された。次いで、結果を、無作為な次数
で始める、１０回の模擬アニーリング走行で確認した。最尤法を使用して、地図
距離を推定し、センチレイ（ｃＲ）で測定し、ここで１ｃＲ３０００は、３００
０ｒａｄのＸ線に曝露した後のマーカー間の１％切断確率に等価である。切断頻
度Ｐは、ｄ＝−Ｌｎ（１−Ｐ）（Ｃｏｘら、１９９０、上記）により、推定地図
距離ｄに変換した。 【０４２２】 １０６ＲＨ細胞系を、最初に、ラット第４染色体の近位領域に以前に位置づけ
られていた、２４のラットミクロサテライトマーカーについて評価した（表６）
。次いで、マウスおよびヒトゲノムのシンテニー領域からの我々のフレームワー
クＲＨ地図への遺伝子のマッピングを試みた。マウス第５染色体上の１９のマウ
ス遺伝子およびヒト第７染色体の１０のヒト遺伝子から設計したプライマーを使
用して、アガロースゲル電気泳動上で正しいサイズの１本のバンドとして規定さ
れた、ＦＲゲノムＤＮＡの成功裡の増幅が、１０のマウス遺伝子および３のヒト
遺伝子で達成された。ＦＲとＡ２３の間の長さの変異が、６のマウス遺伝子で検
出されたが、ヒト遺伝子には検出されなかった。それゆえ、ＲＨ細胞系を、これ
らの６のマウス遺伝子について評価した（表７）。Ｐｓｍｃ２遺伝子のマーカー
から得られたＰＣＲ産物の保持パターンを図５に示す。観察された７０ｂｐのサ
イズは、期待した断片サイズ７４ｂｐに近い。陽性対照として各反応に含まれる
ハムスタープライマーから生じる、２３０ｂｐのハムスター産物は、全てのサン
プルに存在する。（「ＳＨＲ」は、高血圧自然発症ラットゲノムＤＮＡからのＰ
ＣＲ産物を示す）。 【０４２３】 ２つのマウス由来ＰＣＲマーカー、Ｆｉｎ１３およびＴｙｍｓは、互いに緩く
連関していたが（２点ｌｏｄスコア２．４）、ラット第４染色体上ではどの他の
マーカーにも連関していなかった。残りの４つのマーカーのＰｓｍｃ２、Ｆｇｌ
２、Ｓｌｃ４ａ２およびＰｇｙ１は、ＲＨパネル上で、６以上のｌｏｄスコアで
、既存の第４染色体マーカーに連関していた。Ｐｓｍｃ２の保持パターンは、Ｄ
４Ｒａｔ１３６のそれと同一性を示し、これらの２つのマーカー間の全体的な連
鎖（ｌｏｄスコア２８．４）が実証される。 【０４２４】 マーカーＦｇｌ２は、Ｄ４Ｒａｔ１３６に、ｌｏｄスコア１９．６で連関し、
Ｓｌｃ４ａ２はＮｏｓ３（ｌｏｄスコア２２．５）およびＤ９Ｂｒｏ１（ｌｏｄ
スコア１９．０）に、およびＰｇ１はＤ４Ｒａｔ９（ｌｏｄスコア７．０）に連
関していた。結果により、ラット相同体Ｐｓｍｃ２、Ｆｇｌ２、Ｓｌｃ４ａ２お
よびＰｇｙ１は、ラット第４染色体上に存在することが示される。それゆえ、こ
れらの４つのマーカーは、第４染色体ＲＨ地図に組込まれた。ラット遺伝子Ｃａ
ｃｎａ２から設計したプライマーを使用して（表７）、Ｃａｃｎａ２とミクロサ
テライトＤ４Ｒａｔ１４９の間の強固な連鎖が観察され（ｌｏｄスコア１５．７
）、第４染色体上でのその位置が確立された。 【０４２５】 ｌｏｄスコア閾値６を使用してプログラムＲＨ２ＰＴによる初期の対解析に基
づいて、２８のマーカーを２つの連鎖群に分類した（図６）。この遺伝子地図上
でのマーカー位置は、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ地図（ｈｔｔｐ
：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）に基づいた。追加のマ
ーカーを、オックスフォード地図（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｅｌｌ．ｏｘ．ａ
ｃ．ｕｋ／〜ｂｉｈｏｒｅａｕ／ｋｅｙ．ｈｔｍｌ）およびＨｕｂｎｅｒら（１
９９５、上記）のデータを使用して遺伝地図上に配置した。（ｃＭ、センチモル
ガン；ｃＲ、センチレイ）。２つの連鎖群は、１５センチモルガン（ｃＭ）の遺
伝距離に対応する、全距離７３０ｃＲ３０００を網羅した。それゆえ、ラット第
４染色体のこの領域上で、１ｃＭは、約５０ｃＲ３０００に相当する。 【０４２６】 マーカーの最尤順位および既存の遺伝地図との比較を図６に示す。マーカー間
の距離を表８に示す。マーカー順位は、２つの連鎖群から別々に決定し、連鎖群
の配向は、遺伝子地図および２点解析の結果を参照して決定した。最尤解析によ
り得られた順位の多様性は、図７に示し、ここでの観察された順位は、２つの連
鎖群のいずれかのｌｏｇ尤度比（１、２および３）の３つのレベルで示される。
４つのマウス遺伝子の封入は、２４のラット遺伝子座の最尤推定値の順位には影
響を及ぼさなかったが、順位の多様性は、４つのマウス遺伝子の封入により減少
した。 【０４２７】 ２８の第４染色体の平均保持頻度は３６％であり、保持頻度６５％の最も動原
体性のマーカーＩＬＧ６から、１１％まで下がった保持頻度をもつより遠位のマ
ーカーまで顕著な勾配があった（表８）。 【０４２８】 シンテニー基の保存は、図８に示したように、ラットとヒト間よりもラットと
マウス間の方がかなり強く、この図は、マウス第５染色体およびヒト第７染色体
のシンテニーセグメント上の遺伝子の順位と比べて、ラット第４染色体上の遺伝
子の最尤順位を示す。ラット第４染色体上の遺伝子間の距離は、ＲＨＭＡＸＬＩ
Ｋ解析から計算した。ヒトおよびマウス遺伝子の位置は、マウスゲノムデータベ
ース（ｈｔｔｐ：／／ｍｇｄ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／）およびヒトゲ
ノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｄ／ｇ
ｄｂ）から得た。ラット地図上のマーカー間の距離は、ｃレイ３０００で、マウ
ス地図上のはｃモルガンである。（ＵＮ、不明）。ＲＨ地図上の遺伝子の順位は
、マウス第５染色体上のそれと正確に対応し、但し、遺伝子は、動原体に関して
逆位である。さらに、ラットおよびマウスの両方における遺伝子は、そのそれぞ
れの染色体の単一の２０ｃＭセグメントに制限されている。これに対し、ヒトに
おけるこれらの遺伝子の相同体は、ヒト第７染色体の長および短アームに分布し
、少なくとも１つの遺伝子順位の逆位がシンテニー関係を破壊する。 【０４２９】 重要なこととして、Ｐｓｍｃ２、Ｆｇｌ２、Ｓｌｃ４ａ２およびＰｇｙ１の遺
伝子の地図位置は、これらの遺伝子のマウス配列から設計されたＰＣＲプライマ
ーに基づく。これらの産物は、マウス遺伝子の相同体のマーカーのようである。
第一に、これらの全てのプライマー対に観察されたサイズのＰＣＲ産物は、マウ
ス配列から推定されるものの１０塩基対以内である（表７；図５）。第二に、第
５染色体上のこれらのマウス遺伝子の位置は、近位ラット第４染色体のシンテニ
ー群内で、ラット第４染色体上のその相同体の局在化に予め支持を提供する。第
三に、マウスＳｌｃ４ａ２配列から設計されたマーカーは、以前にはＡｅ２と呼
ばれた、ラット遺伝子Ｓｌｃ４ａ２の第４染色体上のミクロサテライトマーカー
である、Ｄ９Ｂｒｏ１から１０ｃＲ３０００以下の距離に位置する。第四に、Ｐ
ｇｙ１のラット遺伝子は、体細胞ハイブリッド解析により、ラット第４染色体上
に以前に位置づけられた（Ｈａｎｓｏｎら、１９８８、Ａｂｓｔｒａｃｔ、Ｂｉ
ｏＳｃｉｅｎｃｅ、ＭａｌｍＵＥ、Ｓｗｅｄｅｎ）。それゆえ、本実施例に記載
した実験で決定した地図位置は、ラットＰｇｙ１の以前の染色体位置を確認およ
び改良する。 【０４３０】 この戦略は、コード配列からと同じ程に３’非翻訳配列から設計されたプライ
マーについて成功したので、それをまた、多くの利用可能な無記名マウスまたは
他の異種（例えばヒト）発現配列タグ（ＥＳＴ）、並びに、認識された異種遺伝
子に適用し得る。 【０４３１】 Ｌ型カルシウムチャネルのマウス遺伝子Ｃａｃｎａ２は、ラット第４染色体に
対するシンテニー領域のマウス第５染色体上に存在するが（Ｃｈｉｎら、１９９
２、上記）、本明細書に提示した実験前にラットには位置づけらておらず、Ｃａ
ｃｎａ２とミクロサテライトＤ４Ｒａｔ１４９の間の強固な連鎖により、Ｃａｃ
ｎａ２は、Ｄ４Ｒａｔ１４９の近くのラット第４染色体上に存在することが示さ
れた。 【０４３２】 ラット／ハムスターＲＨパネルにより、約７３０ｃＲ３０００の物理的距離に
対応する、ラット第４染色体の約１５ｃＭにおよぶ２８マーカーの高分解能地図
が提供された。図６に示すように、ＲＨ地図の分解能は、既存の遺伝地図のそれ
よりもかなり高い。ラットＲＨ地図により供される分解能は、マウスの３０００
ｒａｄＲＨパネルのそれと類似しているが（Ｓｃｈｍｉｔｔら、１９９６、Ｇｅ ｎｏｍｉｃｓ 、３４：１９３−１９７）、同じ放射線量を使用して作成したヒト
ＲＨパネルのそれよりも見かけ上高かった（Ａｈｌｂｏｍら、１９９７、Ｈｕｍ ．Ｇｅｎｅｔ． 、９９：１８６−１９０）。 【０４３３】 一般に、マーカーの順位は以前の地図研究と一致している。主な差異は、以前
に不正確に位置づけられたＮｏｓ３などのマーカー、または以前に遺伝地図に分
離されていなかったマーカーに関する（図６）。しかし、Ｄ４Ｒａｔ１５０とＤ
４Ｒａｔ１４９間の強力な連鎖およびｌｏｇ１０−尤度−比差異＞３をもつこの
順位の支持により（図７）、他の第４染色体マーカーに関するこのＤ４Ｒａｔ１
５０の配置は正しく、以前に示唆された順位の改良である。この確認には、物理
地図研究からのより多くの交雑またはデータについての遺伝子マッピングが待た
れる。 【０４３４】 結果により、顕著な遺伝子座保持頻度勾配が示される。動原体またはその近く
の遺伝子座は、より遠位に位置づけられたものよりも、はるかに高い頻度で保持
された（表７）。類似しているが、より小さな勾配が、他のＲＨパネルで観察さ
れ、動原体配列の優先的な保持に起因し得る（Ｂｅｎｈａｍら、１９８９、Ｇｅ ｎｏｍｉｃｓ 、４：５０９−５１７；Ｃｏｘら、１９９０、上記；Ｒｉｃｈａｒ
ｄら、１９９１、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９：１１８９−１１９６）
。顕著な勾配の点から、多点解析を、染色体における等しいまたは等しくない保
持頻度を仮定したモデル下で実施した。データをこれらの２つのモデルで解析し
た場合に、実質的な差異は見られなかった。 【０４３５】 要約すると、我々は、本実施例で、遺伝子が、インシュリン抵抗性遺伝子座、
この場合、ラットの第４染色体上のインシュリン抵抗性遺伝子座１の位置と一致
した地図位置に位置することを決定する戦略を実証した。ＲＨマッピング技法を
使用して、近位ラット第４染色体の高分解能地図を作成し、上記した疾病といっ
た、グルコースまたは脂肪酸代謝の欠陥に関連した代謝疾患を目的とした、薬剤
または診断手順の標的として作用し得る遺伝子を同定した。グルコースまたは脂
肪酸代謝に関連した疾患に罹患した哺乳動物に見られるこれらの遺伝子の１つの
変異の哺乳動物における存在（この変異はかかる疾患に罹患していない哺乳動物
には見られない）は、哺乳動物におけるかかる疾病の存在または素因の指標であ
る。本実施例で同定した遺伝子、並びに、インシュリン抵抗性遺伝子座に同じよ
うに同定されたその他の遺伝子、例えばインシュリン抵抗性遺伝子座１、２、３
、４または別のこのような遺伝子座が同定され得、さらに上記の方法による薬剤
スクリーニングの標的として作用し得る。 【０４３６】 実施例２ 本実施例では、位置づけられていない遺伝子が、本発明に記載のインシュリン
抵抗性遺伝子座の地図位置に連関することが示される。 【０４３７】 上記したように、候補遺伝子は、１つ以上のインシュリン作用または脂肪酸代
謝または輸送における欠陥に関連した変異表現型に基づいて選択する。連鎖研究
は、糖尿病を呈するラット（例えばＧＫラット）のファミリーの一員を正常な対
照動物と交雑させる遺伝スキームで実施する。 【０４３８】 インシュリン抵抗性遺伝子座１に特徴的な欠陥の連鎖のピーク内に位置する３
つの各マーカー（Ｄ４Ａｒｂ１３、Ａｅ２およびＤ４Ｒｔ８）を、この表現型へ
の連鎖についてアッセイする。これらのマーカーは、ラット株間で多型であり、
それゆえ、糖尿病の表現型が観察された株とは異なることが知られる株を、糖尿
病株と交雑する。Ｆ１世代の後代を、自己交雑し（すなわち、親株または非関連
株のメンバーではなく、姉妹細胞への交雑）、Ｆ２世代を、Ｆ０糖尿病親に存在
する３つのマーカーの各々の対立遺伝子変異型の分類について評価した。これは
、Ｆ２個体の３つの各マーカーのＰＣＲ増幅および配列比較、糖尿病を有するま
たは有さない各ラットに存在する対立遺伝子の相関、ＡＮＯＶＡの結果への適用
により達成され得る。観察された糖尿病の表現型と少なくとも１つのマーカーの
間のＰ＜０．０００１の数値は、インシュリン抵抗性遺伝子座１への有意な連鎖
形質を示すと考えられ、試験ラットの糖尿病に関与する遺伝子は、１つ以上のマ
ーカーからのその距離が、上記のＳＨＲモデルの代謝欠陥の遺伝子座の連鎖中心
から、１５ｃＭまたはそれ以下、または好ましくは１０ｃＭまたはそれ以下であ
るならば、インシュリン抵抗性遺伝子座１の染色体地図位置に存在すると判断さ
れる。 【０４３９】 実施例３ 本実施例は、本発明による疾病診断を示す。 【０４４０】 第一段階として、インシュリン抵抗性遺伝子座の染色体地図位置に位置するこ
とが判明し、その後クローン化された（両方共上記）１つ以上の遺伝子を、個体
間の対立遺伝子多型の存在について調べた（例えば核酸配列決定により）。系図
解析（これも上記している）を、多くの個体が、インシュリン作用および脂肪酸
代謝および／または輸送の１つ以上の代謝プロセスの欠陥に関連した代謝疾患に
罹患しているファミリーに実施して、疾病状態が、任意の罹患ファミリーにおけ
る遺伝子（群）の特定の対立遺伝子変異型に連関しているかを決定する。 【０４４１】 インシュリン抵抗性遺伝子座に位置する遺伝子の変異と、かかる代謝疾患の間
の統計学的に有意な連鎖が明らかになったので、遺伝子は診断手段として役立つ
。家族歴または環境因子に基づいて、疾病の危険性のある臨床患者を、疾病連関
変異についてアッセイする（例えば、遺伝子のＰＣＲ増幅および配列決定により
、これは当分野で公知の方法および試薬を使用して別々にまたは統合反応で行う
）。変異の存在は、疾病の素因の指標となる。かかる試験により、上記で議論し
たように、早期医療介入が可能となり、個体の生命の早期に、生誕前にさえ、最
も有利には実施される。 【０４４２】 実施例４ 実施例４は、本明細書に記載したＣＤ３６遺伝子の変異のために、状態、すな
わち２型糖尿病、２型糖尿病の異常脂肪血症、本態性高血圧、複合型高脂血症お
よび／または心疾患の素因の１つを有することが疑われる患者のＤＮＡ（ゲノム
またはｃＤＮＡ）のスクリーニングを示す。 【０４４３】 ＤＮＡサンプルは、任意の組織または細胞系から調製され得、調製手順は当分
野で公知である。ゲノムＤＮＡの組織からの調製は、以下のように実施し得る。
約１００ｍｇの組織を、５００μｌのＴＢ緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ
８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、６００μｇ／ｍｌのプロテイナー
ゼＫ）に入れ、一晩５５℃でインキュベートする。次いで、サンプルを５００μ
ｌの１：１（ｗ／ｗ）のフェノール／クロロホルムで抽出し、２容量のエタノー
ルで沈降させる。次いで、ＤＮＡペレットを５００μｌのＨ２Ｏに再度懸濁する
。 【０４４４】 ｃＤＮＡサンプルはまた、本発明に従って同定した遺伝子の変異の検出にも使
用し得る。 【０４４５】 本発明によりＤＮＡサンプルを得るに有用な組織は、血球、配偶子、脳、性腺
、肝臓、心臓、腎臓、副腎、脾臓および筋肉を含むがこれに限定されず、ＲＮＡ
サンプルは、目的の遺伝子を発現する組織、例えば脂肪組織から最善には得られ
る。 【０４４６】 本実施例に有用な核酸プローブは、［配列ＩＤ番号：５］、[配列ＩＤ番号：
１１]、[配列ＩＤ番号：１７]、[配列ＩＤ番号：２３]、[配列ＩＤ番号：２９]
、[配列ＩＤ番号：３５]、[配列ＩＤ番号：４１]、[配列ＩＤ番号：４７]、[配
列ＩＤ番号：５３]、[配列ＩＤ番号：５９]、[配列ＩＤ番号：６５]、[配列ＩＤ
番号：７１]、[配列ＩＤ番号：７７]、[配列ＩＤ番号：８３]、[配列ＩＤ番号：
８７]、[配列ＩＤ番号：１６４]、[配列ＩＤ番号：１６５]、[配列ＩＤ番号：１
６７]、[配列ＩＤ番号：１６９]、[配列ＩＤ番号：１７０]、[配列ＩＤ番号：１
７１]、[配列ＩＤ番号：１７２]、[配列ＩＤ番号：１７３]、[配列ＩＤ番号：１
７４]、[配列ＩＤ番号：１７５]、[配列ＩＤ番号：１７６]、[配列ＩＤ番号：１
３８]、および[配列ＩＤ番号：２０９] のいずれかのうちの、１つまたはそれ以
上に記載されるか、または［配列ＩＤ番号：８７］のヌクレオチド位置３７８、
３９７、５０７、５２１、５２２、５３３、５５２、５５３、５５４、６０１、
６１９、６２０、６４１、７４２、７９１、８７１、１４３９からなる群から選
択した１つ以上の変異を単に使用して記載される。 【０４４７】 プローブは、目的の遺伝子に独特な配列を有する核酸を包含する。完全なＳＨ
Ｒ Ｃｄ３６遺伝子は、変異表現型［配列ＩＤ番号：８７］のプローブとして使
用し得、サイレント変異を含むＳＨＲ Ｃｄ３６遺伝子（上記参照）または野生
型Ｃｄ３６［配列ＩＤ番号：８５］遺伝子は対照プローブとして使用し得るが、
最適には、プローブは、好ましくは、３０〜４０ヌクレオチドより長く、最適に
は２５ヌクレオチド以下、例えば１８〜２２ヌクレオチドであり、最小１０ヌク
レオチドである。プローブは、上記のいずれか１つのＤＮＡ検出アッセイに使用
する。結果は、本明細書に同定した変異配列、特にアミノ酸配列変化に関連した
配列（すなわち非サイレント変化）と、インシュリン抵抗性症候群（代謝症候群
Ｘ）または心筋症をそれぞれ生じる、インシュリン作用または脂肪酸代謝または
輸送の欠陥に関連したヒト疾病における疾病の存在または素因の間の関連を確立
すると考えられる。さらに、血小板異常症は、ＣＤ３６欠陥に関連し得る。イン
シュリン抵抗性症候群に関連した疾病は、インシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤ
ＤＭ）、複合型高脂血症および本態性候血圧を含むがこれに限定されず、心筋症
に関連した疾病は、遺伝性肥大型、拡張型、圧過負荷、または特発性心筋症を含
むがこれに限定されない。 【０４４８】 別に、変異ＣＤ３６タンパク質に特異的であるが、野生型ＣＤ３６タンパク質
には特異的ではない抗体を、記載のように、本明細書で上記に開示した技法を使
用して、変化アミノ酸を含むペプチドまたは完全変異タンパク質を使用して作成
し得る。抗体を、疾病の指示薬として使用して、ＣＤ３６ｍＲＮＡの長さ変異体
のタンパク質産物または正常な長さの変異型ＣＤ３６ｍＲＮＡのタンパク質産物
を検出し得る。 【０４４９】 実施例５ 実施例５は、多型長さのｍＲＮＡ転写物についての、患者の生物学的サンプル
のスクリーニングを示し、この転写物は、ＣＤ３６遺伝子の配列を含む核酸プロ
ーブにハイブリダイズする。上記の状態に罹患することが疑われる患者を、本明
細書に記載したように、ＣＤ３６遺伝子の変異についてスクリーニングする。 【０４５０】 組織を実施例４に記載のように選択し、ＣＤ３６遺伝子のｍＲＮＡ発現プロフ
ィールを、ノザン解析または検出されたｍＲＮＡ分子のサイズ決定を可能にする
他の技法などの方法により決定し、この方法は、評価すべき被検者の１つ以上の
異なる組織または体液から得られた生物学的サンプルで実施する。野生型ＣＤ３
６転写物に観察されたｍＲＮＡ（すなわち、インシュリン抵抗性または本明細書
に記載した関連状態に関して正常である個体のｍＲＮＡ）からの、異なるサイズ
のｍＲＮＡの検出は、本明細書に記載した１つ以上の疾病に対する素因の存在に
相関すると期待される。 【０４５１】 実施例６ 本実施例は、本明細書に開示したＣＤ３６変異を使用した疾病診断に関する。
糖尿病、高血圧、複合型高脂血症、肥満、並びにインシュリン作用および脂肪酸
代謝または組み込みの欠陥に連関した他の病理状態の１つ以上、およびヒトの生
殖年齢の到達前の感染から生じる疾病、例えば乳児性下痢または赤痢、および呼
吸器およびウイルス性疾病を有する患者の生物学的サンプルを得て、核酸、細胞
またはタンパク質を、所望であれば、サンプルから調製する。 【０４５２】 核酸を解析する場合、１０〜５０ヌクレオチド長の核酸プローブを調製し、こ
こでのプローブは、任意のＣＤ３６変異配列について、本明細書に開示した変異
を含む。対照プローブを望む場合、対照プローブを、ここでも本明細書に開示し
たように、対応する正常な配列を使用して調製する。本実施例に有用な核酸プロ
ーブは、［配列ＩＤ番号：５］、[配列ＩＤ番号：１１]、[配列ＩＤ番号：１７]
、[配列ＩＤ番号：２３]、[配列ＩＤ番号：２９]、[配列ＩＤ番号：３５]、[配
列ＩＤ番号：４１]、[配列ＩＤ番号：４７]、[配列ＩＤ番号：５３]、[配列ＩＤ
番号：５９]、[配列ＩＤ番号：６５]、[配列ＩＤ番号：７１]、[配列ＩＤ番号：
７７]、[配列ＩＤ番号：８３]、[配列ＩＤ番号：８７]、[配列ＩＤ番号：１６４
]、[配列ＩＤ番号：１６５]、[配列ＩＤ番号：１６７]、[配列ＩＤ番号：１６９
]、[配列ＩＤ番号：１７０]、[配列ＩＤ番号：１７１]、[配列ＩＤ番号：１７２
]、[配列ＩＤ番号：１７３]、[配列ＩＤ番号：１７４]、[配列ＩＤ番号：１７５
]、[配列ＩＤ番号：１７６]、[配列ＩＤ番号：１３８]、[配列ＩＤ番号：２０５
]、[配列ＩＤ番号：２０７]、および[配列ＩＤ番号：２０９]に、または［配列
ＩＤ番号：８７］のヌクレオチド位置３７８、３９７、５０７、５２１、５２２
、５３３、５５２、５５３、５５４、６０１、６１９、６２０、６４１、７４２
、７９１、８７１、１４３９からなる群から選択した１つ以上の変異を単純に使
用して記載される。プローブは、目的の遺伝子に独特な配列を有する核酸を包含
する。完全なＳＨＲ Ｃｄ３６遺伝子は、変異表現型［配列ＩＤ番号：８７］の
プローブとして使用し得、サイレント変異を含むＳＨＲ Ｃｄ３６遺伝子（上記
参照）または野生型Ｃｄ３６［配列ＩＤ番号：８５］遺伝子を対照プローブとし
て使用し得るが、最適には、プローブは、好ましくは、３０〜４０ヌクレオチド
より長く、最適には２５ヌクレオチド以下、例えば１８〜２２ヌクレオチドであ
り、最小１０ヌクレオチドである。プローブは、上記のいずれか１つのＤＮＡ検
出アッセイに使用する。次いで、患者のサンプルを、本明細書に開示したまたは
当業者に公知の任意の核酸解析技法を使用して、本明細書に記載したようにＣＤ
３６遺伝子の変異についてスクリーニングする。 【０４５３】 ＣＤ３６変異タンパク質を解析する場合、変異核酸配列によりコードされるア
ミノ酸配列を使用して、抗体を調製し、次いで抗体を使用して、変異タンパク質
の存在について、例えば患者から得られたサンプルをスクリーニングする。 【０４５４】 用途 本発明は、非インシュリン抵抗性依存性糖尿病、高血圧、複合型高脂血症、肥
満、並びに、インシュリン作用および脂肪酸代謝または組み込みの欠陥に連関し
た他の病理状態の根底にある機序の発見に有用である。本発明により得られたこ
れらの状態に関与する遺伝子の知識は、前記遺伝子に変異を有し得る患者の疾病
の存在またはその傾向の診断法を可能とする。さらに、本発明は、インシュリン
抵抗性症候群（代謝症候群Ｘ）、心筋症または血小板欠陥をもたらす、インシュ
リン作用または脂肪酸代謝または輸送の欠陥に対して指向された候補薬剤のスク
リーニングに有用である。インシュリン抵抗性症候群に関連した疾病は、インシ
ュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、複合型高脂血症および本態性高血圧を含
むがこれに限定されず、心筋症に関連した疾病は、遺伝性肥大型、拡張型、圧過
負荷、または特発性心筋症を含むがこれに限定されない。本発明によりスクリー
ニングした薬剤は、効力があると決定された場合、上記したように、インシュリ
ン作用および脂肪酸代謝または組み込みの欠陥に連関した疾病の治療に有用であ
る。本発明はまた、上記したように、インシュリン作用および脂肪酸代謝または
組み込みの欠陥に連関した疾病の治療用のキットを提供するに有用であり、よっ
て、本発明のスクリーニング法により同定した治療薬の分布および臨床使用を容
易にする。本発明はまた、１つ以上のマラリア、およびヒトの生殖年齢に到達す
る前の感染から生じる疾病、例えば乳児性下痢または赤痢、および呼吸器および
ウイルス性疾病に対して保護する変異の同定に有用である。従って、本発明に記
載のＣＤ３６変異ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、疾病または疾病
傾向の診断に、またはこれらの疾病の治療の標的として有用であり得る。 【０４５５】 【表５】 【表６】 【表７】【表８】 【０４５６】 他の実施形態 他の実施形態は、当業者には明白である。前記は、明瞭化のみのために提供さ
れ、単なる例示であることが理解される。本発明の精神および範囲は、上記の実
施例に限定されないが、以下の特許請求の範囲により包含される。 【図面の簡単な説明】 【図１】 Ｃｄ３６遺伝子の位置を示す、インシュリン抵抗性遺伝子座１の放射ハイブリ
ッド地図を表わしている。 【図２】 インシュリン抵抗性遺伝子座１およびインシュリン抵抗性遺伝子座２の遺伝的
連鎖群のグラフ図である。 【図３】 ＳＨＲ、ＷＫＹ、ＢＮ、（ＳＨＲ×ＷＫＹ）Ｆ１および（ＳＨＲ×ＷＫＹ）Ｆ２ ゲノムＤＮＡからのＣｄ３６遺伝子のＨｉｎｆｌ消化物を表わしている。 【図４】 ＢＮ、ＷＫＹ、およびＳＨＲラットにおけるミクロソームおよび血漿膜タンパ
ク質のウェスタンブロットを表わしている。 【図５】 マウスＰｓｍｃ２から設計されたプライマーの増幅からのＰＣＲ産物を示して
いる。 【図６】 近位ラット染色体４（右）の、同じ領域（左）の統合遺伝地図と比較した最大
限の可能性の放射ハイブリッド地図を表わしている。 【図７】 最大限の可能性の解析により得られたマーカーオーダーにおけるバリエーショ
ンの図式である。 【図８】 ラット染色体４上の遺伝子の最大限の可能性のオーダーと、マウス染色体５お
よびヒト染色体７のシンテニックセグメント上の遺伝子オーダーとの比較を表わ
している。 【図９】 ＷＫＹ、ＢＮ、およびＳＨＲＣｄ３６タンパク質配列から誘導されたペプチド
配列を表わしている。 【図１０】 野生型ヒトＣＤ３６核酸配列を表わしている。 【図１１】 完全野生型ラットＣＤ３６配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号Ｌ１９６５８；［
配列ＩＤ番号８５］）を表わしている。 【図１２】 ラットＣＤ３６の予測されたポリペプチド配列［配列ＩＤ番号８６］を表わし
ている。 【図１３】 ラット株ＳＨＲについての完全コーディング配列および部分非翻訳Ｃｄ３６配
列［配列ＩＤ番号８７］を表わしている。 【図１４】 ＳＨＲについての予測されたＣｄ３６ポリペプチド配列［配列ＩＤ番号８８］
を表わしている。 【図１５】 ラット株Ｗｉｓｔａｒ Ｋｙｏｔｏからの部分Ｃｄ３６配列［配列ＩＤ番号８
９］を表わしている。 【図１６】 ラット株Ｗｉｓｔａｒ Ｋｙｏｔｏからの予測された部分Ｃｄ３６ポリペプチ
ド配列［配列ＩＤ番号９０］を表わしている。 【図１７】 ラット株ＢＮについての部分Ｃｄ３６配列［配列ＩＤ番号９１］を表わしてい
る。 【図１８】 ラット株ＢＮについての予測された部分Ｃｄ３６ポリペプチド配列［配列ＩＤ
番号９２］を表わしている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｈ０４５ 3/10 9/12 9/00 33/06 9/12 Ｃ０７Ｋ 14/47 33/06 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０９／２７０，５４２ (32)優先日 平成11年３月17日(1999．3．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 スコット、 ジェイムズ イギリス国 ダブリュー４ ３ピーディー ロンドン ストランド オン ザ グリ ーン 49 (71)出願人 スタントン、 ローレンス ダブリュー． アメリカ合衆国 94062 カリフォルニア 州 レッドウッド シティ ターンズワー ス アヴェニュー 73 (72)発明者 アイトマン、 ティモスィー ジェイ． イギリス国 ダブリュー４ ３エヌケイ ロンドン ホワイトホール パーク ロー ド 63 (72)発明者 スコット、 ジェイムズ イギリス国 ダブリュー４ ３ピーディー ロンドン ストランド オン ザ グリ ーン 49 (72)発明者 スタントン、 ローレンス ダブリュー． アメリカ合衆国 94062 カリフォルニア 州 レッドウッド シティ ターンズワー ス アヴェニュー 73 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CA25 CA26 DA36 FB02 FB03 FB05 4B024 AA01 AA11 AA13 CA02 CA09 DA03 HA12 4B063 QA01 QA07 QA17 QA19 QQ03 QQ12 QQ42 QQ53 QQ79 QR32 QR40 QR55 QS32 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA17 NA14 ZA36 ZA42 ZB35 ZB38 ZC33 ZC35 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZA42 ZB35 ZB38 ZC33 ZC35 4H045 AA10 AA30 CA40 DA50 EA27 EA50 EA52 FA74

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１７９]、[配列
    ＩＤ番号：１８１]、[配列ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列
    ＩＤ番号：１８７]、[配列ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列
    ＩＤ番号：１９２]、[配列ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列
    ＩＤ番号：１９５]、[配列ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列
    ＩＤ番号：１９８]、[配列ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列
    ＩＤ番号：２０１]、[配列ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]、[配列
    ＩＤ番号：２０５]、[配列ＩＤ番号：２０７]および[配列ＩＤ番号：２０９]か
    ら成る群から選ばれる配列を含む単離された核酸分子。 【請求項２】 ［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８１]、[配列
    ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８７]、[配列
    ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９２]、[配列
    ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９５]、[配列
    ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９８]、[配列
    ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０１]、[配列
    ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]、[配列ＩＤ番号：２０５]、[配列
    ＩＤ番号：２０７]および[配列ＩＤ番号：２０９]に示されている突然変異の１
    つまたはそれ以上を有する突然変異体ＣＤ３６遺伝子。 【請求項３】 ［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８１]、[配列
    ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８７]、[配列
    ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９２]、[配列
    ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９５]、[配列
    ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９８]、[配列
    ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０１]、[配列
    ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]、[配列ＩＤ番号：２０５]、[配列
    ＩＤ番号：２０７]および[配列ＩＤ番号：２０９]によってコードされた突然変
    異の１つまたはそれ以上を有する突然変異体ＣＤ３６タンパク質。 【請求項４】 生物サンプルにおけるＣＤ３６タンパク質欠失を検出する方
    法であって、ＣＤ３６遺伝子における突然変異を検出するステップを含み、前記
    突然変異が、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８１]、[配列ＩＤ番
    号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８７]、[配列ＩＤ番
    号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９２]、[配列ＩＤ番
    号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９５]、[配列ＩＤ番
    号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９８]、[配列ＩＤ番
    号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０１]、[配列ＩＤ番
    号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]、[配列ＩＤ番号：２０５]、[配列ＩＤ番
    号：２０７]および[配列ＩＤ番号：２０９]から成る群から選ばれる配列に対応
    する方法。 【請求項５】 哺乳類への投与のための組織のスクリーニング方法であって
    、（ａ）ＣＤ３６遺伝子における突然変異について前記組織のサンプルを試験す
    るステップと、（ｂ）前記突然変異の存在または不存在に基づいて前記組織サン
    プルを標識するステップとを含む方法。 【請求項６】 （ｃ）標識された前記組織サンプルを保存するステップをさ
    らに含む、請求項５に記載の方法。 【請求項７】 前記組織が、血液、または血小板を含む血液産物を含んでい
    る、請求項６に記載の方法。 【請求項８】 突然変異が、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１
    ８１]、[配列ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１
    ８７]、[配列ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１
    ９２]、[配列ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１
    ９５]、[配列ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１
    ９８]、[配列ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２
    ０１]、[配列ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]、[配列ＩＤ番号：２
    ０４]および[配列ＩＤ番号：２０６]から成る群から選ばれる配列に対応する、
    請求項５に記載の方法。 【請求項９】 ドナーと受容体とをマッチさせる方法であって、（ａ）ＣＤ
    ３６遺伝子における突然変異であって、前記突然変異の結果としてＣＤ３６遺伝
    子産物の欠失を生じるものについて、前記ドナーまたは前記受容体のうちの１つ
    からの生物サンプルを試験するステップと、（ｂ）前記ドナーと受容体とをマッ
    チさせるステップであって、前記受容体がＣＤ３６遺伝子産物の欠失を結果とし
    て生じる突然変異を有するならば、同様にＣＤ３６遺伝子産物の欠失を有するド
    ナーが選ばれるステップとを含む方法。 【請求項１０】 生物サンプルが血液である、請求項９に記載の方法。 【請求項１１】 この突然変異が、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番
    号：１８１]、[配列ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番
    号：１８７]、[配列ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番
    号：１９２]、[配列ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番
    号：１９５]、[配列ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番
    号：１９８]、[配列ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番
    号：２０１]、[配列ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]および[配列Ｉ
    Ｄ番号：２０４]から成る群から選ばれる配列に対応する、請求項９に記載の方
    法。 【請求項１２】 寄生体による感染への患者の抵抗性を測定する方法であっ
    て、ＣＤ３６遺伝子における突然変異であって、この突然変異が寄生体による感
    染への抵抗性を示しているものについてこの患者を試験するステップを含む方法
    。 【請求項１３】 この寄生体が、熱帯マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
    ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）である、請求項１２に記載の方法。 【請求項１４】 この突然変異が、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番
    号：１８１]、[配列ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番
    号：１８７]、[配列ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番
    号：１９２]、[配列ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番
    号：１９５]、[配列ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番
    号：１９８]、[配列ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番
    号：２０１]、[配列ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]および[配列Ｉ
    Ｄ番号：２０４]から成る群から選ばれる配列に対応する、請求項１２に記載の
    方法。 【請求項１５】 寄生体感染の治療方法であって、ＣＤ３６遺伝子発現の阻
    害剤を含む製薬組成物を、これを必要としている患者に投与するステップを含む
    方法。 【請求項１６】 前記阻害剤が、ＣＤ３６ｍＲＮＡにハイブリッドするアン
    チセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の方法。 【請求項１７】 感染を引き起こす寄生体が、熱帯マラリア原虫である、請
    求項１５に記載の方法。 【請求項１８】 ＣＤ３６遺伝子における突然変異の検出ステップを含む、
    哺乳類におけるインシュリン作用および／またはグルコース代謝および／または
    脂肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用における欠陥に関連した病気の
    診断方法であって、前記突然変異が、[配列ＩＤ番号：１７９]、[配列ＩＤ番号
    ：１８１]、[配列ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号
    ：１８７]、[配列ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号
    ：１９２]、[配列ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号
    ：１９５]、[配列ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号
    ：１９８]、[配列ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号
    ：２０１]、[配列ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]および[配列ＩＤ
    番号：２０４]から成る群から選ばれる配列に対応する方法。 【請求項１９】 この病気が、インシュリン抵抗性、耐糖能傷害、２型真性
    糖尿病、複合高脂血症、本態性高血圧、心筋症、および冠状心臓病から成る群か
    ら選ばれる、請求項１８に記載の方法。 【請求項２０】 ＣＤ３６遺伝子における突然変異を有すると決定された被
    験者におけるインシュリン作用および／またはグルコース代謝および／または脂
    肪酸代謝および／またはカテコールアミン作用の欠陥に関連した病気の治療方法
    であって、前記突然変異の結果としてＣＤ３６遺伝子産物の欠失を生じ、前記突
    然変異が、［配列ＩＤ番号１７９］、[配列ＩＤ番号：１８１]、[配列ＩＤ番号
    ：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８５]、[配列ＩＤ番号：１８７]、[配列ＩＤ番号
    ：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９１]、[配列ＩＤ番号：１９２]、[配列ＩＤ番号
    ：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９４]、[配列ＩＤ番号：１９５]、[配列ＩＤ番号
    ：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９７]、[配列ＩＤ番号：１９８]、[配列ＩＤ番号
    ：１９９]、[配列ＩＤ番号：２００]、[配列ＩＤ番号：２０１]、[配列ＩＤ番号
    ：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０３]および[配列ＩＤ番号：２０４]から成る群
    から選ばれる配列に対応する方法であって、この方法が、ＣＤ３６活性を増加さ
    せるモジュレータを被験者に投与するステップを含む方法。 【請求項２１】 前記モジュレータがポリペプチドである、請求項２０に記
    載の方法。 【請求項２２】 前記ポリペプチドが、ＣＤ３６タンパク質とＣＤ３６ペプ
    チドとから成る群から選ばれる、請求項２１に記載の方法。 【請求項２３】 前記ポリペプチドがヒトのものである、請求項２２に記載
    の方法。 【請求項２４】 前記ポリペプチドが、［配列ＩＤ番号１０１］、[配列Ｉ
    Ｄ番号：１０２]、[配列ＩＤ番号：１０３]、[配列ＩＤ番号：１０４]、[配列Ｉ
    Ｄ番号：１０５]、[配列ＩＤ番号：１０６]、[配列ＩＤ番号：１０７]、[配列Ｉ
    Ｄ番号：１０８]、[配列ＩＤ番号：１０９]、[配列ＩＤ番号：１１０]、[配列Ｉ
    Ｄ番号：１１１]、[配列ＩＤ番号：１１２]、[配列ＩＤ番号：１１３]、[配列Ｉ
    Ｄ番号：１１４]、[配列ＩＤ番号：１１５]、[配列ＩＤ番号：１１６]、[配列Ｉ
    Ｄ番号：１１７]、[配列ＩＤ番号：１１８]、[配列ＩＤ番号：１１９]、[配列Ｉ
    Ｄ番号：１２０]、[配列ＩＤ番号：１２１]、[配列ＩＤ番号：１２２]、[配列Ｉ
    Ｄ番号：１２３]、[配列ＩＤ番号：１２４]、[配列ＩＤ番号：１２５]、[配列Ｉ
    Ｄ番号：１２６]、[配列ＩＤ番号：１２７]、[配列ＩＤ番号：１２８]および[配
    列ＩＤ番号：１２９]から成る群から選ばれる核酸配列によってコードされたア
    ミノ酸配列を含んでいる、請求項２３に記載の方法。 【請求項２５】 前記ポリペプチドが、組換え核酸分子によって発現される
    、請求項２１に記載の方法。 【請求項２６】 前記組換え核酸分子が、［配列ＩＤ番号１０１］、[配列
    ＩＤ番号：１０２]、[配列ＩＤ番号：１０３]、[配列ＩＤ番号：１０４]、[配列
    ＩＤ番号：１０５]、[配列ＩＤ番号：１０６]、[配列ＩＤ番号：１０７]、[配列
    ＩＤ番号：１０８]、[配列ＩＤ番号：１０９]、[配列ＩＤ番号：１１０]、[配列
    ＩＤ番号：１１１]、[配列ＩＤ番号：１１２]、[配列ＩＤ番号：１１３]、[配列
    ＩＤ番号：１１４]、[配列ＩＤ番号：１１５]、[配列ＩＤ番号：１１６]、[配列
    ＩＤ番号：１１７]、[配列ＩＤ番号：１１８]、[配列ＩＤ番号：１１９]、[配列
    ＩＤ番号：１２０]、[配列ＩＤ番号：１２１]、[配列ＩＤ番号：１２２]、[配列
    ＩＤ番号：１２３]、[配列ＩＤ番号：１２４]、[配列ＩＤ番号：１２５]、[配列
    ＩＤ番号：１２６]、[配列ＩＤ番号：１２７]、[配列ＩＤ番号：１２８]、[配列
    ＩＤ番号：１２９]、[配列ＩＤ番号：１３２]、[配列ＩＤ番号：１３３]、[配列
    ＩＤ番号：１３４]、[配列ＩＤ番号：１３５]、[配列ＩＤ番号：１３６]、[配列
    ＩＤ番号：１３７]、[配列ＩＤ番号：１３９]、[配列ＩＤ番号：１４０]、[配列
    ＩＤ番号：１４２]、[配列ＩＤ番号：１４３]、[配列ＩＤ番号：１４４]、[配列
    ＩＤ番号：１４５]、[配列ＩＤ番号：１４６]、[配列ＩＤ番号：１４７]、[配列
    ＩＤ番号：１４８]および[配列ＩＤ番号：１４９]から成る群から選ばれる配列
    を含む、請求項２５に記載の方法。 【請求項２７】 前記モジュレータが核酸分子である、請求項２０に記載の
    方法。 【請求項２８】 前記核酸分子が、［配列ＩＤ番号１０１］、[配列ＩＤ番
    号：１０２]、[配列ＩＤ番号：１０３]、[配列ＩＤ番号：１０４]、[配列ＩＤ番
    号：１０５]、[配列ＩＤ番号：１０６]、[配列ＩＤ番号：１０７]、[配列ＩＤ番
    号：１０８]、[配列ＩＤ番号：１０９]、[配列ＩＤ番号：１１０]、[配列ＩＤ番
    号：１１１]、[配列ＩＤ番号：１１２]、[配列ＩＤ番号：１１３]、[配列ＩＤ番
    号：１１４]、[配列ＩＤ番号：１１５]、[配列ＩＤ番号：１１６]、[配列ＩＤ番
    号：１１７]、[配列ＩＤ番号：１１８]、[配列ＩＤ番号：１１９]、[配列ＩＤ番
    号：１２０]、[配列ＩＤ番号：１２１]、[配列ＩＤ番号：１２２]、[配列ＩＤ番
    号：１２３]、[配列ＩＤ番号：１２４]、[配列ＩＤ番号：１２５]、[配列ＩＤ番
    号：１２６]、[配列ＩＤ番号：１２７]、[配列ＩＤ番号：１２８]、[配列ＩＤ番
    号：１２９]、[配列ＩＤ番号：１３２]、[配列ＩＤ番号：１３３]、[配列ＩＤ番
    号：１３４]、[配列ＩＤ番号：１３５]、[配列ＩＤ番号：１３６]、[配列ＩＤ番
    号：１３７]、[配列ＩＤ番号：１３９]、[配列ＩＤ番号：１４０]、[配列ＩＤ番
    号：１４２]、[配列ＩＤ番号：１４３]、[配列ＩＤ番号：１４４]、[配列ＩＤ番
    号：１４５]、[配列ＩＤ番号：１４６]、[配列ＩＤ番号：１４７]、[配列ＩＤ番
    号：１４８]および[配列ＩＤ番号：１４９]から成る群から選ばれる配列を含む
    、請求項２７に記載の方法。 【請求項２９】 前記核酸分子が、ＣＤ３６タンパク質とこれの断片とから
    成る群かれ選ばれるポリペプチドを宿主細胞において発現する、請求項２７に記
    載の方法。 【請求項３０】 前記核酸分子が、前記宿主細胞において自己複製する、請
    求項２９に記載の方法。 【請求項３１】 前記宿主細胞が、前記核酸分子で形質転換される、請求項
    ３０に記載の方法。 【請求項３２】 前記モジュレータが、ペプチド、ホスホペプチド、小さい
    有機分子、小さい無機分子、抗体、および抗体のエピトープ結合断片から成る群
    から選ばれる、請求項２０に記載の方法。 【請求項３３】 前記モジュレータが、アンチセンス核酸分子、リボザイム
    、および三重螺旋核酸分子から成る群から選ばれる、請求項２７に記載の方法。 【請求項３４】 寄生体感染を治療するための薬剤をスクリーニングする方
    法であって、前記感染を引き起こす寄生体は、感染を発生させるためにはリガン
    ドとしてＣＤ３６タンパク質を必要とし、この方法は、ＣＤ３６遺伝子発現の阻
    害のための候補薬剤を試験するステップを含む方法。 【請求項３５】 この寄生体が、熱帯マラリア原虫である、請求項３４に記
    載の方法。 【請求項３６】 寄生体感染を治療するための薬剤をスクリーニングする方
    法であって、前記感染を引き起こす寄生体は、感染を発生させるためにはリガン
    ドとしてＣＤ３６タンパク質を必要とし、この方法は、ＣＤ３６遺伝子の正の調
    節遺伝子の阻害のための候補薬剤を試験するステップを含む方法。 【請求項３７】 前記正の調節遺伝子が、ｐｐｒ−γである、請求項３６に
    記載の方法。 【請求項３９】 この寄生体が、熱帯マラリア原虫である、請求項３６に記
    載の方法。 【請求項４０】 個体のヒトＣＤ３６遺伝子における突然変異の存在または
    不存在を決定する方法であって、個体の生物サンプルと、長さが少なくとも１０
    ヌクレオチドのプローブ（ここにおいて前記プローブが、［配列ＩＤ番号１７９
    ］、[配列ＩＤ番号：１８１]、[配列ＩＤ番号：１８３]、[配列ＩＤ番号：１８
    ５]、[配列ＩＤ番号：１８７]、[配列ＩＤ番号：１９０]、[配列ＩＤ番号：１９
    １]、[配列ＩＤ番号：１９２]、[配列ＩＤ番号：１９３]、[配列ＩＤ番号：１９
    ４]、[配列ＩＤ番号：１９５]、[配列ＩＤ番号：１９６]、[配列ＩＤ番号：１９
    ７]、[配列ＩＤ番号：１９８]、[配列ＩＤ番号：１９９]、[配列ＩＤ番号：２０
    ０]、[配列ＩＤ番号：２０１]、[配列ＩＤ番号：２０２]、[配列ＩＤ番号：２０
    ３]、[配列ＩＤ番号：２０５]、[配列ＩＤ番号：２０７]および[配列ＩＤ番号：
    ２０９] から成る群から選ばれる配列において提示された突然変異に対応する突然変異を
    含む）とを接触させるステップ、および前記サンプルにおける前記突然変異の存
    在または不存在を検出するステップを含む方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008142076A (ja) * 2006-11-15 2008-06-26 Nipro Corp 結核菌における薬剤感受性を検出するための試験片

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6486299B1 (en) * 1998-09-28 2002-11-26 Curagen Corporation Genes and proteins predictive and therapeutic for stroke, hypertension, diabetes and obesity
GB9927502D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Isis Innovation CD36 Polymorphisms
EP1162458A1 (en) * 2000-06-05 2001-12-12 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and compositions for modulating oxidized LDL transport
AU8742301A (en) * 2000-08-21 2002-03-04 Univ Kingston Methods and kits for separation and detection of proteins in biological samples
WO2002090979A1 (en) * 2001-05-08 2002-11-14 Histatek, Inc. Biochips and method of screening using drug induced gene and protein expression profiling
US20080200453A1 (en) 2002-07-29 2008-08-21 Cincotta Anthony H Methods of treating metabolic syndrome using dopamine receptor agonists
US20040220190A1 (en) * 2002-07-29 2004-11-04 Cincotta Anthony H. Methods of treating metabolic syndrome using dopamine receptor agonists
US9655865B2 (en) 2002-07-29 2017-05-23 Veroscience, Llc Therapeutic treatment for metabolic syndrome, type 2 diabetes, obesity, or prediabetes
US8821915B2 (en) 2002-08-09 2014-09-02 Veroscience, Llc Therapeutic process for the treatment of the metabolic syndrome and associated metabolic disorders
US20040081678A1 (en) * 2002-08-09 2004-04-29 Anthony Cincotta Therapeutic process for the treatment of obesity and associated metabolic disorders
US20040076621A1 (en) * 2002-10-16 2004-04-22 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of CD36 expression
US20040077567A1 (en) * 2002-10-16 2004-04-22 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of CD36 expression
CN1833034B (zh) 2003-06-20 2014-04-16 埃克斯魁恩公司 用于分析核酸混合物的探针、文库和试剂盒及其构建方法
US8137994B2 (en) * 2004-03-25 2012-03-20 Veroscience Llc Methods of identifying responders to dopamine agonist therapy and treating metabolic conditions thereof
US20050215558A1 (en) * 2004-03-25 2005-09-29 Cincotta Anthony H Methods of identifying responders to dopamine agonist therapy
US8137993B2 (en) * 2004-03-25 2012-03-20 Veroscience Llc Methods of identifying responders to dopamine agonist therapy and treating metabolic conditions thereof
US8080374B2 (en) * 2004-05-11 2011-12-20 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of diagnosing cardiovascular disease
BRPI0511489B8 (pt) * 2004-05-26 2016-12-20 Aase Handberg método de avaliação do risco relativo de desenvolver aterosclerose em pacientes
ES2571929T3 (es) * 2004-05-26 2016-05-27 Region Nordjylland Procedimiento para determinar la cantidad de CD36 circulante
US20070020657A1 (en) * 2005-05-20 2007-01-25 Grebe Stefan K Methods for detecting circulating tumor cells
WO2009128734A1 (en) * 2008-04-18 2009-10-22 Vialactia Biosciences (Nz) Limited Marker assisted identification of mammals for desired phenotypic trait
US9352025B2 (en) 2009-06-05 2016-05-31 Veroscience Llc Combination of dopamine agonists plus first phase insulin secretagogues for the treatment of metabolic disorders
CN103037901B (zh) * 2010-06-01 2018-04-27 康奈尔大学 抑制cd36以控制肥胖和胰岛素敏感性
WO2012149465A2 (en) * 2011-04-27 2012-11-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of cd36 expression

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2422956A1 (fr) 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
NO169351C (no) 1987-10-02 1992-06-10 Boerresen Anne Lise Masseundersoekelsesmetode for deteksjon av enkeltbasemutasjoner i multiple loci i genomisk dna ved bruk av denatureringsgradient-gelelektroforese fulgt av effektiv overfoeringog hybridisering til forskjellige prober
US5506126A (en) * 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US5338839A (en) * 1988-04-12 1994-08-16 Massachusetts Institute Of Technology DNA encoding nestin protein
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5629158A (en) * 1989-03-22 1997-05-13 Cemu Bitecknik Ab Solid phase diagnosis of medical conditions
DK0554389T4 (da) * 1990-10-17 2002-11-11 Us Health Molekylære kloner af HIV-1 og anvendelse deraf
US5976789A (en) * 1991-07-17 1999-11-02 Bio Merieux System of probes enabling HLA-DR typing to be performed, and typing method using said probes
WO1993006849A1 (en) * 1991-10-03 1993-04-15 The Center For Blood Research Binding of plasmodium falciparum-infected erythrocytes to cd36
US5837832A (en) * 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US5834183A (en) * 1993-06-29 1998-11-10 Regents Of The University Of Minnesota Gene sequence for spinocerebellar ataxia type 1 and method for diagnosis
EP0730663B1 (en) * 1993-10-26 2003-09-24 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US5550020A (en) * 1994-07-08 1996-08-27 Visible Genetics Inc. Method, reagents and kit for diagnosis and targeted screening for retinoblastoma
US5646040A (en) * 1995-06-30 1997-07-08 Millennium Pharmaceutical, Inc. Mammalian tub gene
US5992926A (en) * 1997-07-30 1999-11-30 Dana Corporation Vehicular skid plate and cross member assembly

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008142076A (ja) * 2006-11-15 2008-06-26 Nipro Corp 結核菌における薬剤感受性を検出するための試験片
JP2008142075A (ja) * 2006-11-15 2008-06-26 Nipro Corp 結核菌におけるピラジナミド感受性を検出するための試験片
JP2013059354A (ja) * 2006-11-15 2013-04-04 Nipro Corp 結核菌における薬剤感受性を検出するための試験片

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