JP4949240B2

JP4949240B2 - 転写因子をコードするヒト自閉症素因遺伝子及びその使用

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Publication number: JP4949240B2
Application number: JP2007519914A
Authority: JP
Inventors: フィリッピ，アン; ルソー，フランシス; ブルックス，ピーター; ハーガー，ヨルク
Original assignee: IntegraGen SA
Current assignee: IntegraGen SA
Priority date: 2004-07-01
Filing date: 2005-06-30
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2025-06-30
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Description

発明の領域
本発明は、一般に、遺伝学及び医学の領域に関する。

発明の背景
自閉症は、対人的社会的相互作用並びに言語性及び非言語性のコミュニケーションの障害、限定された常同的な関心及び活動のパターン、並びに３歳以前の発達異常の存在を特徴とする神経精神医学的な発達障害である（Bailey et al., 1996）。幼児自閉症の先駆的な記載において、Kanner(1943）は、以下の症状を含めた：言語障害、視線を合わせることの欠如、社会的相互作用の欠如、反復的行動、及び剛直な慣習の必要。彼は、大部分の症例において、子供の行動が幼児期初期から異常であることを認めた。これに基づき、彼は、先天性の、おそらくは遺伝学的な欠陥の存在を示唆した。１年後、ドイツのHans Aspergerが、類似の患者について記載し、その状態を「自閉性精神病質」と名付けた。

現在のところ、疾患の診断のための特異的な生物学的マーカーが既知でないため、自閉症は行動的基準を使用して定義されている。自閉症の臨床像は、重度にばらつきがあり、教育、能力、及び気質を含む多くの要因により修飾される。さらに、臨床像は、個体内でも発達の過程で変化する。さらに、自閉症は、注意欠陥障害、運動協調不能、並びに不安及びうつのような精神医学的症状のようなその他の障害に、高頻度に関連している。自閉症には、てんかん障害、代謝障害、及び免疫障害も包含され得るとのいくつかの証拠が存在する。臨床的な可変性の認識と一致して、現在では、全ての知能レベル及び言語能力の個体を含む、全ての重度に及ぶ自閉性障害のスペクトルが存在する、との一般的な合意が存在している。

自閉症スペクトルの一部であるが、特別な亜群と見なされているのが、アスペルガー症候群（ＡＳ）である。ＡＳは、自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）の特徴である社会的相互作用の障害及び限定された反復的な行動、関心、及び活動の存在下での、言語発達の臨床的に有意な遅延の欠如により、自閉性障害と区別される。

ＡＳＤは広汎性発達障害（ＰＰＤ）の型である。特定不能のＰＰＤ（PPD,”not otherwise specified”）（ＰＰＤ−ＮＯＳ）とは、自閉症の厳密な基準を満たさないが、非定型の自閉症の徴候を示しているか、又は重要エリアのうちの２つもしくは３つにおいて診断基準をほぼ満たしていることから近似している子供を分類するために使用される。

自閉症の診断を標準化するため、診断基準は、世界保健機関（World Health Organisation）（International Classification of Diseases, 10th Revision,10^th Revision(ICD-10), 1992）及び米国精神医学会（American Psychiatric Association）（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4^th edition(DSM-IV), 1994）により定義されている。自閉症診断インタビュー（Autism Diagnostic Interview）（ＡＤＩ）が開発されている（Le Couteur et al., 1989; Lord et al., 1994）。ＡＤＩは、標準化され、厳格に試験され、普遍的に認められている、ＡＳＤを診断するために利用可能な唯一の診断ツールである。ＡＤＩは、自閉症の診断のための、ＩＣＤ−１０及びＤＳＭ−ＩＶの基準に基づく、スコア化された半構造化（semi-structured）された親のインタビューである。それは、以下の３つの主なエリアにおける行動に焦点を当てている：対人的社会的相互作用の質；コミュニケーション及び言語；並びに限定された反復的、常同的な関心及び行動。これらの基準を使用すると、自閉症はもはや稀な障害とは見なされない。Kannerの基準に基づく１０，０００個体当たりの患者４〜５人という以前に報告された有病率と比較して、より高い１０，０００個体当たり１０〜１２例という率が、より最近の研究では報告されている（Gillberg and Wing, 1999）（Folstein and Rosen-Sheidley, 2001）。自閉性障害の全スペクトルの有病率の推定は、１．５〜２．５倍高い。女性と比較して４倍高い男性における発症率の報告は一致している。精神遅滞は、ＡＳＤを有する症例の２５％〜４０％に存在する（Baird et al. 2000; Chakrabarti and Fombonne, 2001）。脳に関わる付加的な医学的状態は、集団の約１０％に見られる（Gillberg and Coleman, 2000）。

報告される自閉症例の増加の基になるメカニズムは、未知である。この差が、自閉症の有病率の増加を反映しているのか、診断基準の徐々の変化を反映しているのか、疾患発現のより大きな可変性の認識を反映しているのか、又は増加した障害の意識を反映しているのか、は高度に討論されている。さらに、見かけの増加は主として環境因子によることが広範に公知である（Nelson, 1991; Rodier and Hyman, 1998）。しかしながら、増加した有病率の大部分は、診断基準の広がりと、これらの基準のより広い適用との組み合わせにより説明され得る可能性が高いと考えられる。

疾患を寛解させるための有効な治療は存在するが、治癒は得られておらず、治療の利益は緩やかである傾向がある。様々な行動的及び発達的な戦略を利用したいくつかのプログラムについて、有望な結果が入手されている。最も有望なものとしては、応用行動分析（ＡＢＡ）に基づくプログラムがある。いくつかの薬物療法は、自閉症に関連した様々な症状を改善させ、それにより、教育的及び行動的な介入から利益を得る個体の能力を増加させたようである。最も広範囲に研究されている薬剤は、ドパミン拮抗薬である。いくつかの研究は、様々な選択的セロトニン再吸収阻害剤の有用性を示唆している。

３つの双生児研究が、自閉症の遺伝率を推定するために実施されている（Folstein and Rutter, 1977; Bailey et al., 1995; Steffenburg et al., 1989）。地理的に定義された集団の中で生活していた全ての双生児が捜し出された。組み合わせられたデータにおいて、一卵性（ＭＺ）双生児３６組及び二卵性（ＤＺ）双生児３０組が研究された。０％というＤＺの率に対し、平均ＭＺ一致率は７０％である。ＭＺとＤＺとの一致率の比及び約２％〜４％であると推測されている同胞再発危険率から、９０％超という遺伝率が計算された（Jorde et al., 1991 Szatmari et al., 1998）。非自閉症血縁者の研究は、社会的消極性（social reticence）、コミュニケーションにおける困難、慣習の嗜好、及び変化に関する困難を含むＡＳＤのいくつかの特徴が、自閉症児の親において、対照の親より多く見出されることを明白に示した（Folstein and Rutter, 1977）。自閉症を有する個体の家族員においては、発語開始の遅延及び読解に関する困難も、より一般的であり、再発性うつ、不安障害、血小板セロトニン上昇、及び頭囲増加も同様であった（Folstein and Rosen-Sheidley, 2001）。

影響を受けた個体から遠縁になると、自閉症の罹患率は有意に低下し、このことは、単一遺伝子モデルが大部分の自閉症例を説明する可能性は低いことを示している（Jorde et al., 1990）。報告された分離分析は、多遺伝子性の遺伝モードと最も一致していた（Jorde et al., 1991）。最も簡素（parsimonious）な遺伝モデルは、いくつかの遺伝子が互いに相互作用して自閉症表現型を生ずるというものである（Folstein and Rosen-Sheidley, 2001）。

自己免疫が自閉症において役割を果たしている可能性を、相当の間接証拠が示している。ある研究は、対照発端者を含む家族と比較して、自閉症発端者を含む家族に、自己免疫疾患を有する家族員をより多く見出した（Comi et al., 1999）。自閉症を有する数人の子供又は彼らの母親に存在した主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）遺伝子座におけるハプロタイプが、自閉症児に自己免疫の素因を与え得ることを、少数の研究が報告した（Burger and Warren, 1998）。２つの研究において、ミエリン塩基性タンパク質、神経フィラメントタンパク質、及び血管上皮を含む、ある種の脳組織及びタンパク質に対する自己抗体が、自閉症児において、対照と比較してより多く見出された（Singh et al., 1993; Connolly et al., 1999; Weizman et al., 1982）。

大部分の自閉症例が、提唱されたオリゴジェニシティ（oligogenicity）及びエピスタシスのメカニズムと一致しているが、染色体異常及び特定の病因を有する障害と関連している少数派も見られる。Smalley(1997)は、既知の遺伝病又は染色体異例を有する５〜１４％を含め、自閉症例のおよそ１５〜３７％が、共存する医学的状態を有していると記述した。ほぼ全てのヒト染色体に関わる染色体異例が報告されている。これらには、常染色体異数性、性染色体異例、欠失、重複、転座、環状染色体、逆位、及びマーカー染色体が含まれる（Gillberg, 1998）。最も一般的なのは、第１５染色体上のプラダーウィリ／アンジェルマン症候群領域の異常である。自閉症と、メンデルの法則に従った状態又は遺伝的症候群との関連には、未治療のフェニルケトン尿症、脆弱Ｘ染色体症候群、結節性硬化症、及び神経繊維腫症が含まれていた。最近、Carneyら(2003)は、症例の８０％においてＭＥＣＰ２（メチルＣｐＧ結合タンパク質２）遺伝子の突然変異により引き起こされるレット症候群の徴候を示していない自閉症を有する女性２人において、ＭＥＣＰ２遺伝子の突然変異を同定した。

種々のグループが、自閉症又はより広いＡＳＤの表現型に関するゲノムスキャンを実行している。体系的であり、かつモデルフリーであるため、このアプローチは極めて有望であるようである。さらに、それは、既に成功していることが示されている。従って、比較的小さな研究群の分析によってすら、陽性の連鎖結果が入手された。より重要なこととして、いくつかの所見は既に複製されていた。最も一貫した結果は、染色体７ｑについて入手されたが、染色体２ｑ及び１６ｐにも相当のオーバーラップが存在する（Folstein and Rosen-Sheidley, 2001）。染色体領域の同定における相当の進歩が、染色体１５及びＸにおいてもなされている。ニューロリジンＮＬＧＮ３及びＮＬＧＮ４をコードする２つのＸ連鎖遺伝子の突然変異が、自閉症スペクトル障害を有する同胞において同定されている（Jamain et al., 2003）。ニューロリジンの突然変異が自閉性障害に関与しているという事実を、いくつかの証拠系列が支持している。第１に、報告された突然変異は、予測されたタンパク質構造の重度の改変を引き起こす。第２に、ＮＬＧＮ４を含むＸｐ２２．３における欠失が、数人の自閉症児において報告されている。第３に、ＮＬＧＮ４の突然変異が、影響を受けたある個体の母親にｄｅｎｏｖｏ出現した。

発明の概要
本発明は、ここで、自閉症、自閉症スペクトル障害、及び自閉症関連障害の診断、予防、及び治療のために使用され得、治療的に活性な薬物のスクリーニングのためにも使用され得る、ヒト自閉症感受性遺伝子の同定を開示する。

本発明は、特に、自閉症及び関連障害の診断、予防、及び治療のために使用され得、治療的に活性な薬物のスクリーニングのためにも使用され得る、ヒト自閉症感受性遺伝子の同定を開示する。本発明は、より具体的には、自閉症に対する感受性と関係があり、治療学介入のための新規の標的となる下垂体ホメオボックス転写因子１（ＰＩＴＸ１）遺伝子のある種のアレルを開示する。本発明は、ＰＩＴＸ１遺伝子及び発現産物の特定の突然変異に関し、これらの突然変異に基づく診断ツール及びキットにも関する。本発明は、アスペルガー症候群、広汎性発達障害、小児崩壊性障害、精神遅滞、不安、うつ、注意欠陥多動性障害、発語遅延又は言語障害、てんかん、代謝障害、免疫障害、双極性疾患、並びに統合失調症を含むその他の精神医学的及び神経学的な疾患の素因の診断、検出、予防、及び／又は治療において使用され得る。

本発明は、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の素因もしくは防御の診断、検出、予防、及び／又は治療において使用され得、その方法は、対象からの試料において、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の存在又は素因の指標となる、ＰＩＴＸ１の遺伝子又はポリペプチドの改変の存在を検出することを含む。該改変の存在は、自閉症からの防御の指標ともなり得る。

本発明の特定の目的は、対象からの試料において、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の存在又は素因の指標となる、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在を検出することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の存在又は素因を検出する方法にある。自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の存在又は素因の指標となる改変は、自閉症患者への優先的な伝達を有する改変である。又は、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の存在又は素因の指標となる改変は、影響を受けていない個体と比較して、自閉症患者において、より高い頻度を有する改変である。

本発明のさらなる特定の目的は、対象からの試料において、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害からの防御の指標となるＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在を検出することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害からの防御を検出する方法にある。自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害からの防御の指標となる改変は、自閉症患者への優先的な非伝達を有する改変である。又は、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害からの防御の指標となる改変は、影響を受けていない個体と比較して、自閉症患者において、より低い頻度を有する改変である。

本発明のもう一つの特定の目的は、対象からの試料において、治療に対する特定の応答の指標となるＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在を検出することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の治療に対する対象の応答を評価する方法にある。

本発明のさらなる特定の目的は、対象からの試料において、治療による有害作用の指標となるＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在を検出することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の治療による対象における有害作用を評価する方法にある。

本発明は、対象からの試料において、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の素因の指標となるＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在を検出すること；及び自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害に対する予防的治療を投与することを含む、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害を予防する方法にも関する。

好ましい実施態様において、該改変は、自閉症に関連した１個もしくは数個のＳＮＰ又はＳＮＰのハプロタイプである。好ましくは、該ＳＮＰは、表１ａ及び１ｂに開示されたもの、より好ましくは表３〜８に開示されたものより選択される。より好ましくは、該自閉症に関連したＳＮＰは、ＳＮＰ６及びＳＮＰ３３からなる群より選択され得る。より好ましくは、該自閉症に関連したハプロタイプは、表１ａ及び１ｂに開示されたＳＮＰより選択される数個のＳＮＰを含む、又はからなる。好ましくは、該ＳＮＰは、表３〜８に開示されたものからなる群より選択される。好ましい実施態様において、該自閉症に関連したハプロタイプは、ＳＮＰ６、ＳＮＰ３３、ＳＮＰ２５、ＳＮＰ２７、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３１、及びＳＮＰ３３からなる群より選択される数個のＳＮＰを含む、又はからなる。特定の実施態様において、該自閉症に関連したハプロタイプは、ＳＮＰ１、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ２１、及びＳＮＰ２２からなる群より選択される数個のＳＮＰを含む、又はからなる。さらに好ましくは、該ハプロタイプは、表４、６、７、及び８に開示されたハプロタイプより選択される。場合により、本発明において開示されたハプロタイプは、１個又は数個の付加的なＳＮＰを含み得る。より好ましくは、該自閉症に関連したＳＮＰは、ＳＮＰ６及びＳＮＰ３３であり得る。最も好ましい実施態様において、該ハプロタイプは、好ましくはそれぞれアレル１−２−１を有する、ＳＮＰ２４、ＳＮＰ２５、及びＳＮＰ４０からなる、又はを含む。もう一つの最も好ましい実施態様において、該ハプロタイプは、好ましくはそれぞれアレル１−２−１を有する、ＳＮＰ２３、ＳＮＰ２５、及びＳＮＰ３３からなる、又はを含む。さらなる最も好ましい実施態様において、該ハプロタイプは、好ましくはそれぞれアレル２−１−１−１−１を有する、ＳＮＰ２５、ＳＮＰ２７、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３１、及びＳＮＰ３３からなる、又はを含む。

好ましくは、ＰＩＴＸ１遺伝子座の改変は、ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、微量配列決定アッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、コンフォメーションに基づくアッセイ、融解曲線分析、変性高速液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ）アッセイ、又はアレル特異的増幅アッセイを実施することにより検出される。

本発明の特定の面は、ＰＩＴＸ１遺伝子を含むゲノム領域内の自閉症に関連したＳＮＰ又はハプロタイプを少なくとも１つ特異的に検出するために設計されたプライマー、プローブ、及び／もしくはオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む物質の組成物にある。好ましくは、該ＳＮＰは、表１ａ及び１ｂに開示されたもの、より好ましくは表３〜８に開示されたものより選択される。より好ましくは、該自閉症に関連したＳＮＰは、ＳＮＰ６及びＳＮＰ３３からなる群より選択され得る。より好ましくは、該自閉症に関連したハプロタイプは、表１ａ及び１ｂに開示されたＳＮＰより選択される数個のＳＮＰを含む、又はからなる。好ましくは、該ＳＮＰは、表３〜８に開示されたものからなる群より選択される。好ましい実施態様において、該自閉症に関連したハプロタイプは、ＳＮＰ６、ＳＮＰ３３、ＳＮＰ２５、ＳＮＰ２７、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３１、及びＳＮＰ３３からなる群より選択される数個のＳＮＰを含む、又はからなる。特定の実施態様において、該自閉症に関連したハプロタイプは、ＳＮＰ１、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ２１、及びＳＮＰ２２からなる群より選択される数個のＳＮＰを含む、又はからなる。さらに好ましくは、該ハプロタイプは、表４、６、７、及び８に開示されたハプロタイプより選択される。場合により、本発明において開示されたハプロタイプは、１個又は数個の付加的なＳＮＰを含み得る。より好ましくは、該自閉症に関連したＳＮＰは、ＳＮＰ６及びＳＮＰ３３であり得る。最も好ましい実施態様において、該ハプロタイプは、好ましくはそれぞれアレル１−２−１を有する、ＳＮＰ２４、ＳＮＰ２５、及びＳＮＰ４０からなる、又はを含む。もう一つの最も好ましい実施態様において、該ハプロタイプは、好ましくはそれぞれアレル１−２−１を有する、ＳＮＰ２３、ＳＮＰ２５、及びＳＮＰ３３からなる、又はを含む。さらなる最も好ましい実施態様において、該ハプロタイプは、好ましくはそれぞれアレル２−１−１−１−１を有する、ＳＮＰ２５、ＳＮＰ２７、ＳＮＰ２９、及びＳＮＰ３１からなる、又はを含む。

本発明は、ＰＩＴＸ１の発現又は活性のモジュレーションを通して、患者における自閉症及び／又は関連障害を治療する方法にもある。そのような治療は、例えば、ＰＩＴＸ１ポリペプチド、ＰＩＴＸ１ＤＮＡ配列（ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスに対するアンチセンス配列及びＲＮＡｉを含む）、抗ＰＩＴＸ１抗体、又はＰＩＴＸ１の発現もしくは活性をモジュレートする薬物を使用する。

本発明は、遺伝子療法、タンパク質補充療法、又はＰＩＴＸ１タンパク質の模倣体（mimetics）及び／もしくは阻害剤の投与のような、症状前治療又は組み合わせ療法を含む、ＰＩＴＸ１遺伝子の有害なアレルを保持している個体を治療する方法にも関する。

本発明のさらなる面は、自閉症又は関連障害に関連したＰＩＴＸ１遺伝子のアレル又はその遺伝子産物のモジュレーション、又はそれらとの結合に基づく、自閉症又は関連障害の治療のための薬物のスクリーニングにある。

本発明のさらなる面は、ＰＩＴＸ１ポリペプチド断片に特異的な抗体及びそのような抗体の誘導体、そのような抗体を分泌するハイブリドーマ、並びにそれらの抗体を含む診断キットを含む。より好ましくは、該抗体は、ＰＩＴＸ１の活性を修飾する改変を含むＰＩＴＸ１ポリペプチド又はその断片に特異的である。

本発明は、改変を含むＰＩＴＸ１遺伝子又はその断片にも関する。本発明は、さらに、改変を含むＰＩＴＸ１ポリペプチド又はその断片に関する。好ましくは、該改変は、ＰＩＴＸ１の活性を修飾する。特定の実施態様において、該改変は、表１１に開示された突然変異より選択される。

発明の詳細な記載
本発明は、ヒト自閉症感受性遺伝子としてのＰＩＴＸ１の同定を開示する。自閉症を有する家族１１４組からの様々な核酸試料を、特定のＧｅｎｏｍｅＨＩＰ過程に供した。この過程によって、自閉症対象において改変されている特定の同祖的（identical-by-descent）断片が、該集団において同定された。ＩＢＤ断片のスクリーニングにより、本発明者らは、染色体５ｑ３１．１上の下垂体ホメオボックス転写因子１遺伝子（ＰＩＴＸ１）を、自閉症及び関連表現型のための候補として同定した。この遺伝子は、実際、重要範囲内に存在し、自閉症の遺伝的制御と一致する機能的な表現型を発現する。ＰＩＴＸ１遺伝子のＳＮＰも、ヒト対象における自閉症と相関しているものとして同定された。ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスに位置するＳＮＰ６及びＳＮＰ３３が、自閉症に関連していることが見出された。ＳＮＰ１、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ２１、ＳＮＰ２２、ＳＮＰ２３、ＳＮＰ２４、ＳＮＰ２５、ＳＮＰ２７、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３１、ＳＮＰ３３、ＳＮＰ３６、ＳＮＰ３９、及びＳＮＰ４０からなる群より選択される数個のＳＮＰを含む、表４及び６〜８に開示されたハプロタイプも、自閉症に関連しているものとして同定された。

従って、本発明は、自閉症、自閉症スペクトル障害、及び自閉症関連障害の診断、予防、及び治療のため、そして治療的に活性な薬物のスクリーニングのため、ＰＩＴＸ１遺伝子及び対応する発現産物を使用することを提唱する。

定義
自閉症及び自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）：自閉症は、典型的には、アスペルガー症候群（ＡＳ）及びその他の広汎性発達障害（ＰＰＤ）を含む障害のスペクトル（ＡＳＤ）の一部として特徴付けられる。自閉症とは、健康が損なわれ得る程度の、３歳未満に存在する、限定された反復的かつ常同的な行動、関心、及び活動のパターンを伴う、社会的相互作用及びコミュニケーションの障害の状態として解釈されるべきである。ＡＳは、自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）の特徴である社会的相互作用の障害及び限定された反復的な行動、関心、及び活動の存在下での、言語発達の臨床的に有意な遅延の欠如によって、自閉性障害と区別される。ＰＰＤ−ＮＯＳ（特定不能のＰＰＤ）とは、自閉症のための厳密な基準を満たさないが、非定型自閉症の徴候を示しているか、又は重要エリアのうちの２つもしくは３つにおいて診断基準をほぼ満たしていることから近似している子供を分類するために使用される。

自閉症に関連した障害、疾患、又は病理には、より具体的には、代謝障害、免疫障害、てんかん、不安、うつ、注意欠陥多動性障害、発語遅延又は言語障害、運動不協調、精神遅滞、統合失調症、及び双極性障害が含まれる。

本発明は、様々な対象、特に、成人、子供を含むヒトにおいて、そして出生前段階において使用され得る。

本発明の情況において、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスとは、ＰＩＴＸ１コーディング配列、ＰＩＴＸ１非コーディング配列（例えば、イントロン）、転写、翻訳、及び／又は安定性を調節するＰＩＴＸ１制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）、並びにＰＩＴＸ１ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）及びＰＩＴＸ１ポリペプチド（例えば、プレタンパク質及び成熟タンパク質）のような全ての対応する発現産物を含む、細胞又は生物における全てのＰＩＴＸ１配列又は産物を意味する。ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスには、ＰＩＴＸ１遺伝子内に位置しているＳＮＰと連鎖不平衡のＳＮＰを含むＰＩＴＸ１遺伝子の周辺配列も含まれる。例えば、ＰＩＴＸ１ローカスには、表１ａ及び／又は１ｂに開示されたＳＮＰを含む周辺配列が含まれる。

本願において使用されるように、「ＰＩＴＸ１遺伝子」という用語は、ヒト染色体５ｑ３１．１上の下垂体ホメオボックス転写因子１遺伝子を意味し、自閉症及び自閉症関連障害に対する感受性と関係があるそれらのアレル（例えば、生殖細胞系列突然変異）を含むそれらのバリアント、アナログ、及び断片も意味する。ＰＩＴＸ１遺伝子は、ペアード様ホメオドメイン転写因子下垂体ホメオボックス（paired-like homeodomain transcription factor pituitary homeobox）１、ＰＴＸ１、バックフットマウスホモログオブ（backfoot,mouse,homolog of）、ＢＦＴ、下垂体ＯＴＸ関連因子（pituitary OTX-related factor）、ＰＯＴＸとも呼ばれ得る。

「遺伝子」という用語は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成又は半合成のＤＮＡ、並びに任意の型の対応するＲＮＡを含む、任意の型のコーディング核酸を含むものと解釈されるべきである。遺伝子という用語には、特に、ＰＩＴＸ１をコードする組換え核酸、即ち、例えば、配列の組み立て、切断、ライゲーション、又は増幅により人工的に作出された天然には存在しない核酸分子が含まれる。ＰＩＴＸ１遺伝子は典型的には二本鎖であるが、一本鎖のようなその他の型も企図され得る。ＰＩＴＸ１遺伝子は、様々な起源から、当技術分野において既知の様々な技術により、例えば、ＤＮＡライブラリーのスクリーニング、又は様々な天然起源からの増幅により、入手され得る。組換え核酸は、化学合成、遺伝子工学、酵素技術、又はそれらの組み合わせを含む従来の技術により調製され得る。適当なＰＩＴＸ１遺伝子配列は、ＰＩＴＸ１に関するユニジーン（Unigene）クラスター（Ｈｓ．８４１３６）及びユニジーン代表配列ＮＭ＿００２６５３のような遺伝子バンク上に見出され得る。ＰＩＴＸ１遺伝子の特定の例には、配列番号：１又は３７が含まれる。

「ＰＩＴＸ１遺伝子」という用語には、配列番号：１もしくは３７又は既に同定された任意のコーディング配列の任意のバリアント、断片、又はアナログが含まれる。そのようなバリアントには、例えば、個体間の対立形質変異（例えば、多形）による天然に存在するバリアント、自閉症と関係のある突然変異型アレル、オルタナティブスプライシング型等が含まれる。バリアントという用語には、他の起源又は生物に由来するＰＩＴＸ１遺伝子配列も含まれる。バリアントは、好ましくは、配列番号：１又は３７と実質的に相同であり、即ち、少なくとも約６５％、典型的には少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９５％の配列番号：１又は３７とのヌクレオチド配列同一性を示す。ＰＩＴＸ１遺伝子のバリアント及びアナログには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、既に定義されたような配列（又はその相補鎖）とハイブリダイズする核酸配列も含まれる。

典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、３０℃超、好ましくは３５℃超、より好ましくは４２℃を超える温度、及び／又は約５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満の塩分が含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩分、及び／又はＳＤＳ、ＳＳＣのようなその他の試薬の濃度等を修飾することにより、当業者によって調整され得る。

ＰＩＴＸ１遺伝子の断片とは、既に開示されたような配列の少なくとも約８個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５個、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの任意の部分を意味する。断片には、８〜１００ヌクレオチド、好ましくは１５〜１００、より好ましくは２０〜１００の全ての可能なヌクレオチド長が含まれる。

ＰＩＴＸ１ポリペプチドとは、既に開示されたようなＰＩＴＸ１遺伝子によりコードされた任意のタンパク質又はポリペプチドを意味する。「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のストレッチを含む任意の分子をさす。この用語には、ペプチド及びタンパク質のような様々な長さの分子が含まれる。ポリペプチドは、グリコシル化及び／又はアセチル化及び／又は化学反応又はカップリング等により修飾されていてもよく、１個又は数個の非天然又は合成のアミノ酸を含有していてもよい。ＰＩＴＸ１ポリペプチドの具体例には、配列番号：２（ＮＰ＿００２６４４）の全部又は一部が含まれる。

「治療に対する応答」という用語は、以下に限定はされないが、治療用化合物を代謝する能力、プロドラッグを活性薬物へと変換する能力、並びに個体における薬物の薬物動態（吸収、分布、排除）及び薬力学（受容体関連）を含む、治療の効力をさす。

「治療による有害作用」という用語は、薬物の主薬理作用の拡張に起因する療法の有害作用、又は特有の宿主因子との薬物の相互作用に起因する特異体質的な有害反応をさす。「治療による副作用」には、以下に制限はされないが、皮膚科学的、血液学的、又は肝臓病学的な毒性のような有害反応が含まれ、さらに、胃及び腸の潰瘍形成、血小板機能の妨害、腎損傷、全身性じん麻疹、気管支収縮、低血圧、並びにショックが含まれる。

診断
本発明は、ここで、対象におけるＰＩＴＸ１遺伝子ローカスのモニタリングに基づく診断法を提供する。本発明の情況において、「診断」という用語には、成人、子供、及び胎児における、初期段階、症状前段階、及び後期段階を含む様々な段階における、検出、モニタリング、投薬、比較等が含まれる。診断には、典型的には、予後、発症の素因又はリスクの評価、最も適切な治療を定義するための対象の特徴決定（薬理遺伝学）等が含まれる。

本発明は、個体が、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの突然変異又は多形に起因する、自閉症、自閉症スペクトル障害、もしくは自閉症関連障害を発症するリスクを有しているか否か、又は自閉症、自閉症スペクトル障害、もしくは自閉症関連障害に罹患しているか否かを決定するための診断法を提供する。本発明は、個体が治療剤に対して陽性に応答する可能性が高いか否か、又は個体が治療剤による有害副作用を発症するリスクを有しているか否かを決定する方法も提供する。

本発明の特定の目的は、対象からの試料において、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在を検出することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の存在又は素因を検出する方法にある。該改変の存在は、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の存在又は素因の指標となる。場合により、該方法は、対象からの試料を準備する前工程を含む。好ましくは、該試料におけるＰＩＴＸ１遺伝子座の改変の存在は、試料の遺伝子型決定を通して検出される。

本発明のもう一つの特定の目的は、対象からの試料において、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害からの防御の指標となるＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在を検出することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害からの防御を検出する方法にある。

本発明のもう一つの特定の目的は、（ｉ）対象からの試料を準備すること、及び（ｉｉ）該試料において、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在を検出することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の治療に対する対象の応答を評価する方法にある。

本発明のもう一つの特定の目的は、対象からの試料において、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在を検出することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の治療に対する対象の応答を評価する方法にある。該改変の存在は、該治療に対する特定の応答の指標となる。好ましくは、該試料におけるＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在は、試料の遺伝子型決定を通して検出される。

本発明のさらなる特定の目的は、対象からの試料において、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在を検出することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の治療による対象の有害作用を評価する方法にある。該改変の存在は、該治療による有害作用の指標となる。好ましくは、該試料におけるＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在は、試料の遺伝子型決定を通して検出される。

さらなる実施態様において、本発明は、対象からの試料において、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の素因の指標となるＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在を検出すること；及び自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害に対する予防的治療を投与することを含む、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害を予防する方法に関する。該予防的治療は、薬物投与であり得る。該予防的治療は、行動療法であってもよい。

治療もしくは薬物に対する応答、又は治療もしくは薬物による副作用を分析し予測する診断学は、個体が、特定の治療薬により治療されるべきか否かを決定するために使用され得る。例えば、診断学が、ある個体が、特定の薬物又は行動療法による治療に対して陽性に応答する可能性を示した場合、その薬物はその個体に投与され得る。反対に、診断学が、ある個体が、特定の薬物による治療に対して陰性に応答する可能性が高いことを示した場合には、別の治療のコースが処方され得る。陰性の応答とは、有効な応答の欠如又は毒性副作用の存在のいずれかとして定義され得る。

臨床的な薬物試験は、ＰＩＴＸ１ＳＮＰのもう一つの適用を表わす。薬物に対する応答又は薬物による副作用の指標となる１個以上のＰＩＴＸ１ＳＮＰが、上記の方法を使用して同定され得る。その後、そのような薬剤の臨床試験への可能性のある参加者が、その薬物に対して好適に応答する可能性が最も高い個体を同定し、副作用を経験する可能性が高いものを排除するため、スクリーニングされ得る。そのようにして、陽性に応答する可能性が低い個体を研究に含めた結果として測定値を低下させることなく、そして望ましくない安全性問題のリスクなしに、薬物に対して陽性に応答する個体において、薬物治療の有効性が測定され得る。

行動療法の有用性を評価する臨床試験も、ＰＩＴＸ１ＳＮＰの適用である。行動療法に対する応答又は行動療法による副作用の指標となる１個以上のＰＩＴＸ１ＳＮＰが、上記の方法を使用して同定され得る。その後、そのような療法の臨床試験への可能性のある参加者が、その療法に対して好適に応答する可能性が最も高い個体を同定し、副作用を経験する可能性が高いものを排除するため、スクリーニングされ得る。そのようにして、陽性に応答する可能性が低い個体を研究に含めた結果として測定値を低下させることなく、そして望ましくない安全性問題のリスクなしに、療法に対して陽性に応答する個体において、行動治療の有効性が測定され得る。

改変は、ＰＩＴＸ１のｇＤＮＡ、ＲＮＡ、又はポリペプチドのレベルで決定され得る。場合により、検出は、ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、微量配列決定アッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、コンフォメーションに基づくアッセイ、融解曲線分析、変性高速液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ）アッセイ（Jones et al, 2000）、又はアレル特異的増幅アッセイを実施することにより決定される。特定の実施態様において、検出は、ＰＩＴＸ１遺伝子の全部もしくは一部を配列決定することにより、又はＰＩＴＸ１遺伝子の全部もしくは一部の選択的なハイブリダイゼーションもしくは増幅により実施される。より好ましくは、ＰＩＴＸ１遺伝子特異的な増幅は、改変同定工程の前に実施される。

ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変は、単独の、又は様々に組み合わせられた、ローカスのコーディング領域及び／又は非コーディング領域における任意の型の突然変異、欠失、再編成、及び／又は挿入であり得る。突然変異には、より具体的には、点突然変異が含まれる。欠失には、２残基から遺伝子又はローカス全体までのような、遺伝子ローカスのコーディング部分又は非コーディング部分の１残基、２残基、又はそれ以上の任意の領域が包含され得る。典型的な欠失は、約５０連続塩基対未満のドメイン（イントロン）又は反復配列又は断片のようなより小さな領域に影響を与えるが、より大きな欠失も起こり得る。挿入には、遺伝子ローカスのコーディング部分又は非コーディング部分における１残基又は数残基の付加が包含され得る。挿入には、典型的には、遺伝子ローカスにおける１〜５０塩基対の付加が含まれ得る。再編成には、配列の逆位が含まれる。ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変は、終止コドンの作出、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のＲＮＡのスプライシング又はプロセシング、産物の不安定性、短縮型ポリペプチドの産生等をもたらし得る。改変は、改変された機能、安定性、ターゲティング、又は構造を有するＰＩＴＸ１ポリペプチドの産生をもたらし得る。改変は、タンパク質発現の低下、又は該産生の増加も引き起こし得る。

本発明に係る方法の特定の実施態様において、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変は、ＰＩＴＸ１遺伝子又は対応する発現産物における点突然変異、欠失、及び挿入、より好ましくは点突然変異及び欠失より選択される。改変は、ＰＩＴＸ１のｇＤＮＡ、ＲＮＡ、又はポリペプチドのレベルで決定され得る。

これに関して、本発明は、ここで、自閉症に関連しているＳＮＰ１、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ２１、及びＳＮＰ２２からなる群より選択されるＳＮＰを含むＰＩＴＸ１遺伝子のＳＮＰ及びある種のハプロタイプを開示する。ＳＮＰは、以下の表１ａに報告される。

本発明に係る任意の方法において、ＰＩＴＸ１遺伝子の１個又は数個のＳＮＰ、並びにＰＩＴＸ１遺伝子及び周辺領域のＳＮＰを含むある種のハプロタイプ、特に、本発明において開示されたものは、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害に関連した、その他の遺伝子に位置するその他のＳＮＰ又はハプロタイプと組み合わせて使用され得る。

もう一つの別実施態様において、方法は、改変されたＰＩＴＸ１ＲＮＡ発現の存在を検出することを含む。改変されたＲＮＡ発現には、改変されたＲＮＡ配列の存在、又は改変されたＲＮＡのスプライシングもしくはプロセシングの存在、改変された量のＲＮＡの存在等が含まれる。これらは、例えば、ＰＩＴＸ１ＲＮＡの全部もしくは一部の配列決定、又は該ＲＮＡの全部もしくは一部の選択的ハイブリダイゼーションもしくは選択的増幅を含む、当技術分野において既知の様々な技術により検出され得る。

さらなる別実施態様において、方法は、改変されたＰＩＴＸ１ポリペプチド発現の存在を検出することを含む。改変されたＰＩＴＸ１ポリペプチド発現には、改変されたポリペプチド配列の存在、改変された量のＰＩＴＸ１ポリペプチドの存在、改変された組織分布の存在等が含まれる。これらは、例えば、配列決定及び／又は（抗体のような）特異的リガンドとの結合を含む、当技術分野において既知の様々な技術により検出され得る。

既に示されたように、配列決定、ハイブリダイゼーション、増幅、及び／又は（抗体のような）特異的リガンドとの結合を含む、当技術分野において既知の様々な技術が、改変されたＰＩＴＸ１の遺伝子又はＲＮＡの発現又は配列を検出又は定量化するために使用され得る。その他の適当な方法には、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、オリゴヌクレオチドライゲーション、アレル特異的増幅、サザンブロット（ＤＮＡの場合）、ノーザンブロット（ＲＮＡの場合）、一本鎖コンフォメーション分析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲル移動、クランプド（clamped）変性ゲル電気泳動、変性ＨＬＰＣ、融解曲線分析、ヘテロ二重鎖分析、ＲＮａｓｅ防御、化学的又は酵素的なミスマッチ切断、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）が含まれる。

これらのアプローチのうちのいくつか（例えば、ＳＳＣＡ及びＣＧＧＥ）は、改変された配列の存在の結果としての核酸の電気泳動移動度の変化に基づく。これらの技術によると、改変された配列は、ゲル上の移動度のシフトにより可視化される。次いで、断片は、改変を確認するために配列決定され得る。

他のいくつかは、対象からの核酸と、野生型又は改変型のＰＩＴＸ１の遺伝子又はＲＮＡに特異的なプローブとの間の特異的なハイブリダイゼーションに基づく。プローブは、懸濁物中にあってもよいし、又は基質上に固定化されていてもよい。プローブは、典型的には、ハイブリッドの検出を容易にするために標識される。

ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ、及びＲＩＡのような、これらのアプローチのうちのいくつかは、ポリペプチドの配列又は発現レベルの評価に特に適している。これらの後者は、ポリペプチドに対して特異的なリガンド、より好ましくは特異的抗体の使用を必要とする。

特定の好ましい実施態様において、方法は、対象からの試料において、改変されたＰＩＴＸ１遺伝子発現プロファイルの存在を検出することを含む。既に示されたように、これは、より好ましくは、該試料中に存在する核酸の配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、及び／又は選択的増幅により達成され得る。

配列決定
配列決定は、自動シーケンサーを使用して、当技術分野において周知の技術を使用して実施され得る。配列決定は、完全ＰＩＴＸ１遺伝子、又はより好ましくは、その特異的なドメイン、典型的には、有害な突然変異又はその他の改変を保持していることが既知であるか又は推測されるものに対して実施され得る。

増幅
増幅は、核酸の複製を開始させるようはたらく相補的な核酸配列間の特異的なハイブリッドの形成に基づく。

増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、及び核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）のような当技術分野において既知の様々な技術に従い実施され得る。これらの技術は、商業的に入手可能な試薬及びプロトコルを使用して実施され得る。好ましい技術は、アレル特異的ＰＣＲ又はＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用する。増幅は、通常、反応を開始させるために、特異的な核酸プライマーの使用を必要とする。

ＰＩＴＸ１遺伝子又はローカスから配列を増幅するのに有用な核酸プライマーは、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害を有するある種の対象において改変されている該ローカスの標的領域に隣接するＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの一部と特異的にハイブリダイズすることができる。そのような標的領域の例は、表１ａ及び１ｂに提供される。

表１において同定されるようなＳＮＰを含むＰＩＴＸ１標的領域を増幅するために使用され得るプライマーは、配列番号１の配列又はＰＩＴＸ１のゲノム配列に基づき設計され得る。特定の実施態様において、プライマーは、配列番号３〜２６の配列に基づき設計され得る。

本発明のもう一つの特定の目的は、周辺領域を含むＰＩＴＸ１遺伝子又はローカスから配列を増幅するのに有用な核酸プライマーにある。そのようなプライマーは、好ましくは、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの核酸配列に相補的であり、特異的にハイブリダイズする。特定のプライマーは、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害を有するある種の対象において改変されている該ローカスの標的領域に隣接するＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの一部と特異的にハイブリダイズすることができる。

本発明は、自閉症、閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害を有するある種の対象において改変されているＰＩＴＸ１コーディング配列（例えば、遺伝子又はＲＮＡ）の一部に相補的であり、特異的にハイブリダイズする核酸プライマーにも関する。この点に関して、本発明の特定のプライマーは、ＰＩＴＸ１の遺伝子又はＲＮＡの改変された配列に対して特異的である。そのようなプライマーを使用することにより、増幅産物の検出によって、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の存在が示される。対照的に、増幅産物の欠如によって、特異的な改変が試料中に存在しないことが示される。

本発明の典型的なプライマーは、約５〜６０ヌクレオチド長、より好ましくは約８〜２５ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子である。配列は、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの配列に直接由来し得る。高度の特異性を保証するため、完全な相補性が好ましい。しかしながら、ある種のミスマッチは容認され得る。

本発明は、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、もしくは自閉症関連障害の存在もしくは素因を検出する方法、又は自閉症、自閉症スペクトル障害、もしくは自閉症関連障害の治療に対する対象の応答を評価する方法における、上記のような核酸プライマー又は核酸プライマー対の使用にも関する。

選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション検出法は、核酸配列改変を検出するようはたらく相補的な核酸配列間の特異的なハイブリッドの形成に基づく。

特定の検出技術は、野生型又は改変型のＰＩＴＸ１の遺伝子又はＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用、それに続く、ハイブリッドの存在の検出を含む。プローブは、懸濁物中にあってもよいし、又は（核酸アレイもしくはチップ技術のように）基質もしくは支持体の上に固定化されていてもよい。プローブは、典型的には、ハイブリッドの検出を容易にするために標識される。

この点に関して、本発明の特定の実施態様は、対象からの試料を、改変されたＰＩＴＸ１遺伝子ローカスに特異的な核酸プローブと接触させること、及びハイブリッドの形成を評価することを含む。特定の好ましい実施態様において、方法は、それぞれ野生型ＰＩＴＸ１遺伝子ローカス及びそれらの様々な改変型に特異的なプローブのセットと、試料を同時に接触させることを含む。この実施態様においては、試料中のＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変の様々な型の存在を直接検出することが可能である。また、様々な対象からの様々な試料が、平行して処理されてもよい。

本発明の情況において、プローブとは、ＰＩＴＸ１の遺伝子又はＲＮＡ（の標的部分）に相補的であり、特異的なハイブリダイゼーションが可能であり、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の素因を与える、又はそれらに関連しているＰＩＴＸ１アレルに関連したポリヌクレオチド多形を検出するのに適しているポリヌクレオチド配列をさす。プローブは、好ましくは、ＰＩＴＸ１の遺伝子、ＲＮＡ、又はそれらの標的部分に完全に相補的である。プローブは、典型的には、８〜１０００ヌクレオチド長、例えば、１０〜８００、より好ましくは、１５〜７００、典型的には２０〜５００の一本鎖核酸を含む。より長いプローブも使用され得ることが理解されるべきである。本発明の好ましいプローブは、改変を保持しているＰＩＴＸ１の遺伝子又はＲＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる、８〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子である。

本発明の特定の実施態様は、改変型の（例えば、突然変異型の）ＰＩＴＸ１の遺伝子又はＲＮＡに特異的な核酸プローブ、即ち、改変型のＰＩＴＸ１の遺伝子又はＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、該改変を欠くＰＩＴＸ１の遺伝子又はＲＮＡには本質的にハイブリダイズしない核酸プローブである。特異性とは、標的配列とのハイブリダイゼーションが、非特異的なハイブリダイゼーションを通して発生されたシグナルと区別され得る特異的なシグナルを発生することを示す。本発明に係るプローブを設計するためには、完全に相補的な配列が好ましい。しかしながら、特異的なシグナルが非特異的なハイブリダイゼーションと区別され得る限り、ある程度のミスマッチは容認され得ることが理解されるべきである。

そのようなプローブの特定の例は、前記表１に収載されたような点突然変異を保持しているＰＩＴＸ１の遺伝子又はＲＮＡを含むゲノム領域の標的部分に相補的な核酸配列である。特に、プローブは、配列番号３〜２６からなる群より選択される配列もしくはＳＮＰを含むその断片、又はその相補配列を含み得る。

プローブの配列は、本願において提供されたようなＰＩＴＸ１の遺伝子及びＲＮＡの配列に由来し得る。ヌクレオチド置換が実施され得、プローブの化学的修飾も実施され得る。そのような化学的修飾は、ハイブリッドの安定性を増加させるため（例えば、インターカレートする基）、又はプローブを標識するため、達成され得る。標識の典型的な例には、非制限的に、放射能、蛍光、発光、酵素標識等が含まれる。

本発明は、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、もしくは自閉症関連障害の存在もしくは素因を検出する方法、又は自閉症、自閉症スペクトル障害、もしくは自閉症関連障害の治療に対する対象の応答を評価する方法における、上記のような核酸プローブの使用にも関する。

オリゴヌクレオチドライゲーション
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、標的配列において、ＳＮＰ塩基特異的な３’末端を保持している２個のプライマー、及び５’が次の塩基で開始する１個の共通プライマーを含む、ＳＮＰ１個当たり３個の特異的プライマーを設計することからなる方法である。２個のアレル特異的プライマーは、各アレルを決定する特有の配列のタグを保持している。プライマーが標的配列にアニールさせられ、アレル特異的な３’塩基が存在する場合には、ライゲーション反応によって、アレル特異的プライマーが共通プライマーと接合されるであろう。次いで、特有の配列のタグに相同な短い蛍光色素で標識されたプローブが、固定化された産物にハイブリダイズさせられ、対応するアレルの検出が可能となる。オリゴライゲーションキットは、商業的に入手可能である（SNPlex,Applied Biosystems,Foster City）。

特異的リガンド結合
既に示されたように、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの改変は、ＰＩＴＸ１ポリペプチドの配列又は発現レベルの改変に関してスクリーニングすることにより検出され得る。この点に関して、本発明の特定の実施態様は、試料をＰＩＴＸ１ポリペプチドに特異的なリガンドと接触させること、及び複合体の形成を決定することを含む。

特異的抗体のような種々の型のリガンドが使用され得る。特定の実施態様において、試料は、ＰＩＴＸ１ポリペプチドに特異的な抗体と接触させられ、免疫複合体の形成が決定される。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）のような、免疫複合体を検出するための様々な方法が、使用され得る。

本発明の情況において、抗体とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を意味し、同抗原特異性を実質的に有しているそれらの断片又は誘導体も意味する。断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ領域等が含まれる。誘導体には、単鎖抗体、ヒト化抗体、多機能性抗体等が含まれる。

ＰＩＴＸ１ポリペプチドに特異的な抗体とは、ＰＩＴＸ１ポリペプチドと選択的と結合する抗体、即ち、ＰＩＴＸ１ポリペプチド又はそのエピトープ含有断片に対して作成された抗体を意味する。他の抗原との非特異的な結合も起こり得るが、標的ＰＩＴＸ１ポリペプチドとの結合は、より高い親和性で起こり、非特異的な結合から確実に識別され得る。

特定の実施態様において、方法は、対象からの試料を、改変型のＰＩＴＸ１ポリペプチドに特異的な抗体（でコーティングされた支持体）と接触させること、及び免疫複合体の存在を決定することを含む。特定の実施態様において、試料は、野生型及び様々な改変型のような種々の型のＰＩＴＸ１ポリペプチドに特異的な様々な抗体（でコーティングされた支持体）と、同時に、又は平行して、又は連続的に、接触させられてもよい。

本発明は、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、もしくは自閉症関連障害の存在もしくは素因を検出する方法、又は自閉症、自閉症スペクトル障害、もしくは自閉症関連障害の治療に対する対象の応答を評価する方法における、上記のようなリガンド、好ましくは抗体、その断片又は誘導体の使用にも関する。

本発明は、対象からの試料において、ＰＩＴＸ１の遺伝子もしくはポリペプチド、ＰＩＴＸ１の遺伝子もしくはポリペプチドの発現、及び／又はＰＩＴＸ１活性の改変の存在を検出するための生成物及び試薬を含む診断キットにも関する。本発明に係る該診断キットは、本発明において記載された、任意のプライマー、任意のプライマー対、任意の核酸プローブ、及び／又は任意のリガンド、好ましくは抗体を含む。本発明に係る該診断キットは、ハイブリダイゼーション、増幅、又は抗原−抗体免疫反応を実施するための試薬及び／又はプロトコルをさらに含み得る。

診断法は、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ、又はｉｎｖｉｖｏ、好ましくは、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで実施され得る。それらは、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの状態を評価するために対象からの試料を使用する。試料は、核酸又はポリペプチドを含有している、対象に由来する任意の生物学的試料であり得る。そのような試料の例には、液体、組織、細胞試料、器官、及び生検材料等が含まれる。最も好ましい試料は、血液、血漿、唾液、尿、精液等である。出生前診断も、例えば、胎児細胞又は胎盤細胞を試験することにより実施され得る。試料は、従来の技術に従い収集され、診断に直接使用されるか、又は保管され得る。試料は、方法を実施する前に、試験のための核酸又はポリペプチドの利用可能性を賦与するため又は改良するために処理されてもよい。処理には、例えば、溶解（例えば、機械的、物理的、化学的等）、遠心分離等が含まれる。また、核酸及び／又はポリペプチドは、従来の技術により予備精製又は濃縮され得、かつ／又は複雑度を低下されられ得る。核酸及びポリペプチドは、それらの断片を作製するため、酵素又はその他の化学的もしくは物理的な処理により処理されてもよい。特許請求の範囲に記載された方法の高い感度を考慮すると、極少量の試料が、アッセイを実施するのに十分である。

示されたように、試料は、好ましくは、改変されたＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの存在を評価するために、プローブ、プライマー、又はリガンドのような試薬と接触させられる。接触は、プレート、チューブ、ウェル、ガラス等のような任意の適当な装置において実施され得る。特定の実施態様において、接触は、核酸アレイ又は特異的リガンドアレイのような試薬によりコーティングされた基質上で実施される。基質は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマー等を含む任意の支持体のような固体又は半固体の基質であり得る。基質は、スライド、膜、ビーズ、カラム、ゲル等のような、様々な型及びサイズのものであり得る。接触は、試薬と、試料の核酸又はポリペプチドとの間に複合体を形成させるために適当な任意の条件の下で行われ得る。

試料中の改変されたＰＩＴＸ１のポリペプチド、ＲＮＡ、又はＤＮＡの所見は、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の存在、素因、又は進行段階と相関し得る、対象における改変されたＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの存在の指標となる。例えば、生殖細胞系列ＰＩＴＸ１突然変異を有する個体は、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害を発症する増加したリスクを有している。対象における改変されたＰＩＴＸ１遺伝子ローカスの存在の決定は、より有効で、かつカスタマイズされた適切な治療的介入の設計も可能にする。また、症状前レベルにおけるこの決定は、予防計画が適用されることを可能にする。

連鎖不平衡
目的のゲノム領域、特にＰＩＴＸ１遺伝子ローカスにおいて、第１のＳＮＰが同定されたならば、当業者は、この第１のＳＮＰと連鎖不平衡の付加的なＳＮＰを容易に同定することができる。実際、自閉症又は関連障害に関連した第１のＳＮＰと連鎖不平衡の任意のＳＮＰが、この形質に関連しているであろう。従って、所定のＳＮＰと自閉症又は関連障害との間に関連が証明されたならば、この形質に関連した付加的なＳＮＰの発見は、この特定の領域におけるＳＮＰの密度を増加させるために大いに重要であり得る。

所定のＳＮＰと連鎖不平衡の付加的なＳＮＰの同定は、以下のことを含む：（ａ）複数の個体から第１のＳＮＰを含むか又はその周辺のゲノム領域からの断片を増幅すること；（ｂ）該第１のＳＮＰを保有しているか又はその周辺のゲノム領域において第２のＳＮＰを同定すること；（ｃ）該第１のＳＮＰと第２のＳＮＰとの間で連鎖不平衡分析を実施すること；及び（ｄ）該第１のマーカーと連鎖不平衡である該第２のＳＮＰを選択すること。工程（ｂ）及び（ｃ）を含む部分的組み合わせも企図される。

ＳＮＰを同定し、連鎖不平衡分析を実行する方法は、周知の方法を使用することにより、過度の実験なしに、当業者によって実施され得る。

連鎖不平衡のこれらのＳＮＰは、本発明に係る方法、特に、本発明に係る診断法において使用され得る。

例えば、クローン病の連鎖ローカスは、染色体５ｑ３１上の１８ｃＭに及ぶ大きな領域にマッピングされた（Rioux et al., 2000 and 2001）。領域全体にわたるマイクロサテライトマーカー及びＳＮＰの密な地図を使用して、連鎖不平衡（ＬＤ）の強力な証拠が見出された。ＬＤの証拠が見出されたため、著者らは、超高密度ＳＮＰ地図を開発し、この地図から選択されたマーカーのより密な集団を研究した。マルチローカス分析は、ＴＤＴを使用して各々独立に関連付けられた複数のＳＮＰにより特徴付けられた単一の共通のリスクハプロタイプを定義した。これらのＳＮＰは、そのリスクハプロタイプに特有であり、相互にほぼ完全なＬＤにあるため、それらの情報内容は本質的に同一であった。これらのＳＮＰの等価な特性のため、遺伝学的証拠単独に基づき、この領域内の原因突然変異を同定することは不可能である。

原因突然変異
自閉症又は関連障害の原因であるＰＩＴＸ１遺伝子の突然変異は、自閉症又は関連障害を示す患者からのＰＩＴＸ１遺伝子の配列と、対照個体からのＰＩＴＸ１遺伝子の配列とを比較することにより同定され得る。ＰＩＴＸ１のＳＮＰと自閉症又は関連障害との同定された関連に基づき、同定されたローカスは、突然変異に関してスキャンされ得る。好ましい実施態様において、ＰＩＴＸ１遺伝子のエキソン及びスプライス部位、プロモーター及びその他の制御領域のような機能的領域が、突然変異に関してスキャンされる。好ましくは、自閉症又は関連障害を示す患者は、自閉症又は関連障害に関連していることが示された突然変異を保持しており、対照個体は、自閉症又は関連障害に関連した突然変異又はアレルを保持していない。自閉症又は関連障害を示す患者が、対照個体より高い頻度で、自閉症又は関連障害に関連していることが示された突然変異を保持しているという可能性もある。

そのような突然変異を検出するために使用される方法は、一般に、以下の工程を含む：自閉症又は関連障害を示す患者及び対照個体からのＰＩＴＸ１遺伝子のＤＮＡ試料からの、自閉症又は関連障害に関連したＳＮＰ又はＳＮＰ群を含むＰＩＴＸ１遺伝子の領域の増幅；増幅された領域の配列決定；自閉症又は関連障害を示す患者からのＰＩＴＸ１遺伝子のＤＮＡ配列と、対照個体からのＰＩＴＸ１遺伝子のＤＮＡ配列との比較；自閉症又は関連障害を示す患者に特異的な突然変異の決定。

従って、ＰＩＴＸ１遺伝子の原因突然変異の同定は、周知の方法を使用することにより、過度の実験なしに、当業者によって実施され得る。例えば、以下の例において、ルーチンの方法を使用することにより、原因突然変異が同定された。

Ｈｕｇｏｔら（２００１）は、以前にクローン病に対する感受性と連鎖していることが見出された第１６染色体の領域においてクローン病に対する感受性を有する遺伝子バリアントを同定するためにポジショナルクローニング戦略を適用した。可能性のある感受性ローカスの位置を精密化するため、２６個のマイクロサテライトマーカーを遺伝子型決定し、伝達不平衡試験を使用してクローン病との関連に関して試験した。境界線上の有意な関連が、マイクロサテライトマーカーＤ１６Ｓ１３６の１つのアレルとの間に見出された。付加的な１１個のＳＮＰが周辺領域から選択され、数個のＳＮＰが有意な関連を示した。この領域からのＳＮＰ５〜８は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の単一のエキソンに存在することが見出され、非同義バリアントであることが示された。このため、著者らは、５０人のＣＤ患者においてこの遺伝子の完全コーディング配列を配列決定することとした。２つの付加的な非同義突然変異（ＳＮＰ１２及びＳＮＰ１３）が見出された。家系伝達不平衡試験（pedigree transmission disequilibrium test）を使用したところ、ＳＮＰ１３が最も有意に関連していた（ｐ＝６×１０^−６）。もう一つの独立の研究において、対照４人と比較された影響を受けた個体１２人からのこの遺伝子のコーディング領域の配列決定によっても、同一のバリアントが見出された（Ogura et al., 2001）。ＳＮＰ１３の稀なアレルは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質を短縮すると予測される１ｂｐ挿入に相当した。このアレルは、頻度は対照と比較して有意に低かったが、正常な健康な個体にも存在した。

同様に、Lesageら(2002)は、散発性症例１６６及び家族性症例２８７を含むＣＤを有する患者４５３人、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を有する患者１５９人、並びに健康な対照対象１０３人において、コーディング領域の体系的配列決定によってＣＡＲＤ１５の突然変異分析を実施した。同定された配列変異６７個のうち、９個はＣＤを有する患者において＞５％のアレル頻度を有していた。それらのうちの６個は、多形と見なされ、３個（ＳＮＰ１２−Ｒ７０２Ｗ、ＳＮＰ８−Ｇ９０８Ｒ、及びＳＮＰ１３−１００７ｆｓ）が、独立に、ＣＤに対する感受性と関連していることが確認された。また、２７個の稀な付加的な突然変異も、可能性のある疾患原因突然変異（ＤＣＭ）として見なされた。３個の主なバリアント（Ｒ７０２Ｗ、Ｇ９０８Ｒ、及び１００７ｆｓ）は、全ＣＤ突然変異のそれぞれ３２％、１８％、及び３１％を表し、２７個の稀な突然変異は全部でＤＣＭの１９％を表した。合わせると、突然変異の９３％が、遺伝子の遠位の３分の１に位置していた。ＵＣに関連していることが見出された突然変異はなかった。対照的に、二重突然変異を有していた１７％を含め、ＣＤを有する患者の５０％が少なくとも１つのＤＣＭを保持していた。

薬物スクリーニング
本発明は、薬物候補又はリードのスクリーニングのための新規の標的及び方法も提供する。方法は、結合アッセイ及び／又は機能アッセイを含み、ｉｎｖｉｔｒｏ、細胞系、動物等において実施され得る。

本発明の特定の目的は、ｉｎｖｉｔｒｏで試験化合物を本発明に係るＰＩＴＸ１の遺伝子又はポリペプチドと接触させること、及びＰＩＴＸ１の遺伝子又はポリペプチドと結合する該試験化合物の能力を決定することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害に対して活性な化合物を選択する方法にある。該遺伝子又はポリペプチドとの結合は、該標的の活性をモジュレートし、従って、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害に至る経路に影響を与える化合物の能力に関する指標を提供する。好ましい実施態様において、方法は、ｉｎｖｉｔｒｏで試験化合物を本発明に係るＰＩＴＸ１ポリペプチド又はその断片と接触させること、及び該ＰＩＴＸ１ポリペプチド又はその断片と結合する該試験化合物の能力を決定することを含む。断片は、好ましくは、ＰＩＴＸ１ポリペプチドの結合部位を含む。好ましくは、該ＰＩＴＸ１の遺伝子もしくはポリペプチド又はそれらの断片は、改変型もしくは突然変異型のＰＩＴＸ１の遺伝子もしくはポリペプチド、又は改変もしくは突然変異を含むそれらの断片である。

本発明の特定の目的は、ｉｎｖｉｔｒｏで試験化合物を本発明に係るＰＩＴＸ１ポリペプチド又はその結合部位含有断片と接触させること、及び該ＰＩＴＸ１ポリペプチド又はその断片と結合する該試験化合物の能力を決定することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害に対して活性な化合物を選択する方法にある。好ましくは、該ＰＩＴＸ１ポリペプチド又はその断片は、改変型もしくは突然変異型のＰＩＴＸ１ポリペプチド、又は改変もしくは突然変異を含むその断片である。

さらなる特定の実施態様において、方法は、本発明に係るＰＩＴＸ１ポリペプチドを発現している組換え宿主細胞を試験化合物と接触させること、及び該ＰＩＴＸ１と結合し、ＰＩＴＸ１ポリペプチドの活性をモジュレートする該試験化合物の能力を決定することを含む。好ましくは、該ＰＩＴＸ１ポリペプチド又はその断片は、改変型もしくは突然変異型のＰＩＴＸ１ポリペプチド、又は改変もしくは突然変異を含むその断片である。

結合の決定は、試験化合物の標識、標識された参照リガンドとの競合等のような様々な技術により実施され得る。

本発明のさらなる目的は、ｉｎｖｉｔｒｏで試験化合物を本発明に係るＰＩＴＸ１ポリペプチドと接触させること、及び該ＰＩＴＸ１ポリペプチドの活性をモジュレートする該試験化合物の能力を決定することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害に対して活性な化合物を選択する方法にある。好ましくは、該ＰＩＴＸ１ポリペプチド又はその断片は、改変型もしくは突然変異型のＰＩＴＸ１ポリペプチド、又は改変もしくは突然変異を含むその断片である。

本発明のさらなる目的は、ｉｎｖｉｔｒｏで試験化合物を本発明に係るＰＩＴＸ１遺伝子と接触させること、及び該ＰＩＴＸ１遺伝子の発現をモジュレートする該試験化合物の能力を決定することを含む、自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害に対して活性な化合物を選択する方法にある。好ましくは、該ＰＩＴＸ１遺伝子又はその断片は、改変型もしくは突然変異型のＰＩＴＸ１遺伝子、又は改変もしくは突然変異を含むその断片である。

その他の実施態様において、本発明は、ＰＩＴＸ１遺伝子プロモーターの調節下にあるレポーター遺伝子を含むレポーター構築物を含む組換え宿主細胞と試験化合物と接触させること、及びレポーター遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、刺激する、又は低下させる）試験化合物を選択することを含む、活性化合物、特に、自閉症、自閉症スペクトル障害、及び自閉症関連障害に対して活性な化合物をスクリーニング、選択、又は同定する方法に関する。好ましくは、該ＰＩＴＸ１遺伝子プロモーター又はその断片は、改変型もしくは突然変異型のＰＩＴＸ１遺伝子プロモーター、又は改変もしくは突然変異を含むその断片である。スクリーニングの方法の特定の実施態様において、モジュレーションは阻害である。スクリーニングの方法のもう一つの特定の実施態様において、モジュレーションは活性化である。

上記のスクリーニングアッセイは、プレート、チューブ、ディッシュ、フラスコ等のような任意の適当な装置において実施され得る。典型的には、アッセイは、マルチウェルプレートにおいて実施される。数個の試験化合物が、平行してアッセイされてもよい。さらに、試験化合物は、様々な起源、性質、及び組成のものであり得る。それは、単離された、又は他の物質と混合された、脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、低分子等のような任意の有機又は無機の物質であり得る。化合物は、例えば、生成物のコンビナトリアルライブラリーの全部又は一部であり得る。

医薬組成物、療法
本発明のさらなる目的は、（ｉ）ＰＩＴＸ１ポリペプチド又はその断片、ＰＩＴＸ１ポリペプチドをコードする核酸又はその断片、上記のようなベクター又は組換え宿主細胞、及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体又は媒体を含む医薬組成物である。

本発明は、機能的な（例えば、野生型の）ＰＩＴＸ１ポリペプチド又はそれをコードする核酸を対象に投与することを含む、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害を治療又は予防する方法にも関する。

本発明のその他の実施態様は、本発明に係るＰＩＴＸ１の遺伝子又はタンパク質の発現又は活性をモジュレートする、好ましくは、活性化又は模倣する化合物を対象に投与することを含む、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害を治療又は予防する方法にある。該化合物は、ＰＩＴＸ１のアゴニスト又はアンタゴニスト、ＰＩＴＸ１のアンチセンス又はＲＮＡｉ、本発明に係るＰＩＴＸ１ポリペプチドに特異的な抗体又はその断片もしくは誘導体であり得る。方法の特定の実施態様において、モジュレーションは阻害である。方法のもう一つの特定の実施態様において、モジュレーションは活性化である。

本発明は、一般に、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、又は自閉症関連障害の治療又は予防のための医薬組成物の製造における、機能的なＰＩＴＸ１ポリペプチド、それをコードする核酸、又は本発明に係るＰＩＴＸ１の遺伝子もしくはタンパク質の発現もしくは活性をモジュレートする化合物の使用にも関する。該化合物は、ＰＩＴＸ１のアゴニスト又はアンタゴニスト、ＰＩＴＸ１のアンチセンス又はＲＮＡｉ、本発明に係るＰＩＴＸ１ポリペプチドに特異的な抗体又はその断片もしくは誘導体であり得る。方法の特定の実施態様において、モジュレーションは阻害である。方法のもう一つの特定の実施態様において、モジュレーションは活性化である。

本発明は、自閉症、自閉症スペクトル障害、及び自閉症関連障害と、ＰＩＴＸ１遺伝子ローカスとの相関を証明する。従って、本発明は、治療的介入の新規の標的を提供する。対象、特に、改変されたＰＩＴＸ１遺伝子ローカスを保持しているものにおいて、ＰＩＴＸ１の活性又は機能を回復させるか又はモジュレートするためには、様々なアプローチが企図され得る。そのような対象への野生型機能の供給は、病理学的な細胞又は生物における、自閉症、自閉症スペクトル障害、及び自閉症関連障害の表現型発現を抑制すると予想される。そのような機能の供給は、遺伝子療法もしくはタンパク質療法を通して、又はＰＩＴＸ１ポリペプチド活性をモジュレートもしくは模倣する化合物（例えば、上記のスクリーニングアッセイにおいて同定されたようなアゴニスト）を投与することによって、達成され得る。

野生型ＰＩＴＸ１遺伝子又はその機能的な一部は、上記のようなベクターを使用して、その必要のある対象の細胞へ導入され得る。ベクターは、ウイルスベクター又はプラスミドであり得る。遺伝子は、裸のＤＮＡとしても導入され得る。遺伝子は、レシピエント宿主細胞のゲノムへ組み込まれるか、又は染色体外に維持されるよう提供され得る。組み込みは、ランダムに起こるかもしれないし、又は相同的組換え等を通して正確に定義された部位において起こるかもしれない。特に、ＰＩＴＸ１遺伝子の機能的なコピーは、相同的組換えを通して、改変されたバージョンに代わって細胞に挿入され得る。さらなる技術には、遺伝子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション等が含まれる。遺伝子療法は、直接遺伝子注射により、又は機能的なＰＩＴＸ１ポリペプチドを発現するｅｘｖｉｖｏで調製された遺伝学的に修飾された細胞を投与することにより、達成され得る。

ＰＩＴＸ１活性を有するその他の分子（例えば、ペプチド、薬物、ＰＩＴＸ１アゴニスト、又は有機化合物）も、対象において機能的なＰＩＴＸ１活性を回復させるため、又は細胞における有害な表現型を抑制するため、使用され得る。

細胞における機能的なＰＩＴＸ１遺伝子機能の回復は、自閉症、自閉症スペクトル障害、もしくは自閉症関連障害の発症を予防するため、又は該疾患の進行を低下させるため、使用され得る。そのような治療は、細胞、特に、有害なアレルを保持している細胞の自閉症関連表現型を抑制し得る。

本発明のさらなる面及び利点は、例示的なものであって、本願の範囲を制限するものと見なされるべきではない以下の実験セクションにおいて開示されるであろう。

遺伝子、ベクター、組換え細胞、及びポリペプチド
本発明のさらなる面は、診断、療法、又はスクリーニングにおいて使用するための新規の生成物にある。これらの生成物には、ＰＩＴＸ１ポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子、それらを含むベクター、組換え宿主細胞、及び発現されたポリペプチドが含まれる。

特に、本発明は、改変型もしくは突然変異型のＰＩＴＸ１遺伝子、又は該改変もしくは突然変異を含むその断片に関する。本発明は、改変型もしくは突然変異型のＰＩＴＸ１ポリペプチド、又は該改変もしくは突然変異を含むその断片をコードする核酸分子にも関する。該改変又は突然変異は、ＰＩＴＸ１活性を修飾する。修飾された活性は、増加していてもよいし、又は減少していてもよい。本発明は、さらに、改変型もしくは突然変異型のＰＩＴＸ１遺伝子、もしくは該改変もしくは突然変異を含むその断片、又は改変型もしくは突然変異型のＰＩＴＸ１ポリペプチド、もしくは該改変もしくは突然変異を含むその断片をコードする核酸分子を含むベクター、組換え宿主細胞、及び発現されたポリペプチドに関する。

本発明のさらなる目的は、本発明に係るＰＩＴＸ１ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターである。ベクターは、クローニングベクター、又はより好ましくは、発現ベクター、即ち、コンピテントな宿主細胞において該ベクターからのＰＩＴＸ１ポリペプチドの発現を引き起こす制御配列を含むベクターであり得る。

これらのベクターは、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ、又はｉｎｖｉｖｏでＰＩＴＸ１ポリペプチドを発現させるため、トランスジェニック又は「ノックアウト」の非ヒト動物を作出するため、核酸を増幅するため、アンチセンスＲＮＡを発現させるため等に使用され得る。

本発明のベクターは、典型的には、制御配列、例えば、プロモーター、ポリＡ等に動作可能に結合された本発明に係るＰＩＴＸ１コーディング配列を含む。「動作可能に結合された」という用語は、制御配列がコーディング配列の発現（例えば、転写）を引き起こすよう、コーディング配列と制御配列とが機能的に関連付けられていることを示す。ベクターは、さらに、１個又は数個の複製開始点及び／又は選択マーカー含み得る。プロモーター領域は、コーディング配列に対して相同であってもよし、又は異種であってもよく、ｉｎｖｉｖｏの使用を含む、任意の適切な宿主細胞における遍在性の発現、構成性の発現、制御された発現、及び／又は組織特異的な発現を提供し得る。プロモーターの例には、細菌プロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーター等）、ウイルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥ等）、哺乳動物遺伝子プロモーター（アルブミン、ＰＧＫ等）等が含まれる。

ベクターは、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣ等であり得る。プラスミドベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ、ｐＢＲ等のような商業的に入手可能なベクターから調製され得る。ウイルスベクターは、当技術分野において既知の組み換えＤＮＡ技術に従い、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ等から作製され得る。

この点に関して、本発明の特定の目的は、既に定義されたようなＰＩＴＸ１ポリペプチドをコードする組換えウイルスにある。組換えウイルスは、好ましくは、複製欠損型であり、さらに好ましくは、Ｅ１及び／又はＥ４を欠損しているアデノウイルス、Ｇａｇ、ｐｏｌ、及び／又はｅｎｖを欠損しているレトロウイルス、並びにＲｅｐ及び／又はＣａｐを欠損しているＡＡＶより選択される。そのような組換えウイルスは、パッケージング細胞をトランスフェクトすること、又はヘルパープラスミドもしくはウイルスによる一過性トランスフェクションのような、当技術分野において既知の技術により作製され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例には、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞等が含まれる。そのような複製欠損型の組換えウイルスを作製するための詳細なプロトコルは、例えば、国際特許公報第９５／１４７８５号、国際特許公報第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号、及び国際特許公報第９４／１９４７８号に見出され得る。

本発明のさらなる目的は、組換えＰＩＴＸ１遺伝子又は既に定義されたようなベクターを含む組換え宿主細胞にある。適当な宿主細胞には、非制限的に、（細菌のような）原核細胞及び（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のような）真核細胞が含まれる。特定の例には、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）又はサッカロミセス（Saccharomyces）の酵母、哺乳動物細胞系（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等）が含まれ、（例えば、繊維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から作製された）哺乳動物細胞の初代培養物又は確立された培養物も含まれる。

本発明は、（ｉ）ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで、コンピテントな宿主細胞へ、上記のような組換え核酸又はベクターを導入すること、（ｉｉ）ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで入手された組換え宿主細胞を培養すること、及び（ｉｉｉ）場合により、ＰＩＴＸ１ポリペプチドを発現する細胞を選択することを含む、本発明に係るＰＩＴＸ１ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を作製する方法にも関する。

そのような組換え宿主細胞は、ＰＩＴＸ１ポリペプチドの作製のために使用され得、下記のような活性分子のスクリーニングのためにも使用され得る。そのような細胞は、自閉症を研究するためのモデル系としても使用され得る。これらの細胞は、任意の適切な培養装置（プレート、フラスコ、ディッシュ、チューブ、パウチ等）において、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＨＡＭ等のような適当な培養培地で維持され得る。

実施例
１．第５染色体感受性遺伝子を同定するためのＧｅｎｏｍｅＨＩＰプラットフォーム
自閉症感受性遺伝子の迅速な同定を可能にするために、ＧｅｎｏｍｅＨＩＰプラットフォームを適用した。簡単に説明すると、その技術は、血縁関係のある個体のＤＮＡから対を形成させることからなる。各ＤＮＡは、その同定を可能にする特異的な標識によりマーキングされる。次いで、２つのＤＮＡの間でハイブリッドが形成させられる。次いで、多工程手法において２つのＤＮＡから全ての同祖的（ＩＢＤ）断片を選択する特定の過程（ＷＯ００／５３８０２）が適用される。次いで、残存するＩＢＤについて濃縮されたＤＮＡが、染色体上のＩＢＤ画分の位置決めを可能にするＢＡＣクローン由来のＤＮＡマイクロアレイに対してスコア化される。

多くの異なる家族におけるこの過程の適用は、各家族からの各対についてのＩＢＤ画分のマトリックスをもたらす。次いで、統計分析が、試験された全ての家族の間で共有されている最小ＩＢＤ領域を計算する。有意な結果（ｐ値）は、陽性領域の目的の形質（ここでは自閉症）との連鎖の証拠である。連鎖範囲は、有意なｐ値を示す２つの最も遠位のクローンにより画定され得る。

本研究においては、（ＡＤＩ−Ｒにより定義されたような）厳密な自閉症に一致した米国の家族１１４組（１１４の独立した同胞対）を、ＧｅｎｏｍｅＨＩＰ過程に供した。次いで、得られたＩＢＤについて濃縮されたＤＮＡ画分を、Ｃｙ５蛍光色素により標識し、１．２メガ塩基対の平均間隔で全ヒトゲノムをカバーするＢＡＣクローン２２６３個からなるＤＮＡアレイに対してハイブリダイズさせた。Ｃｙ３により標識された非選択ＤＮＡを、シグナル値を規準化し、各クローンの比率を算出するために使用した。次いで、各クローン及び対についてＩＢＤ状態を決定するため、比率結果のクラスタリングを実施した。

この手法を適用することにより、自閉症との連鎖の有意な証拠（ｐ＜６．４０Ｅ−０７）を示した第５染色体上の領域（塩基１３４０９５５９５〜１３５５９３５２８）において、およそ１．５メガ塩基にわたる数個のＢＡＣクローンが同定された（ＢＡＣＡ１９ＺＢ０３、ＢＡＣＡ１６ＺＧ０６、ＢＡＣＡ４ＺＡ０８、及びＢＡＣＡ１１ＺＦ１２）。

表２：ＰＩＴＸ１ローカスにおける第５染色体の連鎖結果：連鎖の証拠を有する４個のＢＡＣクローンに対応する領域が示される。クローンの開始及び終止の位置は、染色体の開始に関するＮＣＢＩＢｕｉｌｄ３４に基づくゲノム位置に相当する（ｐ−ｔｅｒ）。

２．第５染色体上の自閉症感受性遺伝子の同定
連鎖した染色体領域における上記の１．５メガ塩基のスクリーニングにより、本発明者らは、下垂体ホメオボックス転写因子１（ＰＩＴＸ１）遺伝子を、自閉症及び関連表現型の候補として同定した。この遺伝子は、実際、既に概説されたクローンにより画定された連鎖の証拠を有する重要な範囲に存在する。

ＰＩＴＸ１遺伝子は、ビコイド（ｂｉｃｏｉｄ）関連脊椎動物ホメオボックス遺伝子の拡大しつつあるファミリーであるＲＩＥＧ／ＰＩＴＸホメオボックスファミリーのメンバーをコードする。このファミリーのメンバーは、器官、特に脳及び顔の発達、並びに左右非対称性に関与している。Lamonerieら(1996)は、下垂体におけるプロオピオメラノコルチン遺伝子（ＰＯＭＣ）の転写を活性化する能力に基づき、（彼らによってＰｔｘ１と名付けられた）マウス転写因子遺伝子をクローニングし特徴決定した。以下の６つのホルモンが、ＰＯＭＣ遺伝子に由来する：ＡＣＴＨ、リポトロピン、アルファ−ＭＳＨ、ベータ−ＭＳＨ、エンドルフィン、及び他のもう一つ。ＡＣＴＨ及びベータ−リポトロピン（ベータ−ＬＰＨ）は、大きな前駆ペプチドに由来する。これらのホルモンは、各々、別個の生物学的活性を有するより小さなペプチドを含むことが既知である：アルファ−メラニン細胞刺激ホルモン（アルファ−ＭＳＨ）及びコルチコトロピン様中葉ペプチド（ＣＬＩＰ）は、ＡＣＴＨから形成され；ガンマ−ＬＰＨ及びベータ−エンドルフィンは、ベータ−ＬＰＨのペプチド成分である。ベータ−ＭＳＨはガンマ−ＬＰＨ内に含有されている。

ＰＴＸ１、ＰＴＸ２、及びＰＴＸ３の遺伝子は、ホメオドメイン因子のペアード様（paired-like）クラス内の新規の転写因子のファミリー、ＰＴＸサブファミリーを定義する。マウスにおいて、Ｐｔｘ１及びＰｔｘ２の遺伝子発現は、下垂体原基のエリアに検出されており、ラトケ嚢及び成体下垂体において、発達の間中、維持されている。Pellegrini-Bouillerら(1999)は、正常ヒト下垂体及び種々の型のヒト下垂体腺腫におけるＰＴＸｌ、ＰＴＸ２、及びＰＴＸ３の遺伝子の発現を証明した。

Tremblayら(1998)は、大部分の下垂体ホルモンコーディング遺伝子のプロモーターが、Ｐｔｘ１により活性化されることを報告し、従って、Ｐｔｘ１は、下垂体特異的な転写の一般的な制御剤であるようである。さらに、Ｐｔｘ１の作用は、プロモーター特異的な発現を賦与する細胞限定的な転写因子により協力される。ａｌｐｈａＧＳＵ遺伝子を発現するａｌｐｈａＴ３−１細胞において実施されたアンチセンスＲＮＡ実験は、内因性のａｌｐｈａＧＳＵの発現が、Ｐｔｘ１に対して高度に依存性であり、その他の多くの遺伝子は影響を受けないことを示した。発現のためＰｔｘ１に対して高度に依存性であることが見出されている他の唯一の遺伝子は、Ｌｉｍ３／Ｌｈｘ３転写因子の遺伝子であった。従って、Ｐｔｘ１は、下垂体特異的、系統特異的、かつプロモーター特異的な転写を指図するためコンビナトリアルコード（combinatorial code）で作動するようである制御剤のカスケードにおいてＬｉｍ３／Ｌｈｘ３の上流にある。

Shapiroら(2004)は、ＰＩＴＸ１遺伝子発現の異なるパターン及び腹びれ解剖における機能的な違いをもたらす、トゲウオ科の魚におけるＰＩＴＸ１の制御領域に天然に存在するバリアントを記載した。彼らは、ＰＩＴＸ１のようなホメオボックス遺伝子の制御領域が、多数の遠く離れた部位に、遺伝子からの数百キロ塩基も離れて見出され得ることを強調している。

Szetoら(1999)は、Ｐｉｔｘ１欠失マウスが、後肢の形態形成及び成長に著しい異常を示すことを見出した。Ｐｉｔｘ１にターゲティングされた突然変異に関してホモ接合性のマウスは、直ちに、又は出生直後に死亡する。少数のＰｉｔｘ１ヌルマウスは、Ｅ１１．５の後、胚致死を示す。Ｐｉｔｘ１ヌルマウスの後肢は、有意に短い。骨盤のサイズも、著しく低下する。甲状腺刺激ホルモンベータ、黄体形成ホルモンベータ、及び共通の糖タンパク質アルファサブユニットの発現の調査は、性腺刺激ホルモン産生細胞（gonadotropes）及び甲状腺刺激ホルモン産生細胞（thyrotropes）の数、並びに個々の細胞内の黄体形成ホルモンベータ及び甲状腺刺激ホルモンベータの転写物及びタンパク質のレベルの両方が減衰することを示唆している。興味深いことに、ＴＳＨベータ転写物のレベルは、ＴＳＨベータ遺伝子活性化のためにＰｉｔ−１を必要としない吻側尖端部の甲状腺刺激ホルモン産生細胞集団において最も重度に低下する。成長ホルモン産生細胞（somatotropes）における成長ホルモン発現は不変であるようであり、中葉のメラニン細胞刺激ホルモン産生細胞（melanotropes）におけるＰＯＭＣ遺伝子の数及び発現レベルは、Ｅ１５．５〜Ｐ０の間、正常であるようである。下垂体前葉の副腎皮質刺激ホルモン産生細胞（corticotropes）においては、ＡＣＴＨ転写物の数及びペプチドレベルの両方のレベルが一貫して増加していた。

Chamberlain及びHerman(1990)は、自閉症個体の亜群が、下垂体におけるプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）ペプチドの対応する分泌過少、並びに視床下部におけるオピオイドペプチド及びセロトニン（５−ＨＴ）の分泌過多を含む、生化学的効果のカスケードを生じる、松果体メラトニンの分泌過多を有しているかもしれないという新規の生化学的モデルを提唱した。自閉症は、脳のＰＯＭＣ及び５−ＨＴ系をモジュレートする松果体−視床下部−下垂体−副腎軸における機能障害を反映しているのかもしれない。このモデルは、脳５−ＨＴ及びオピオイドペプチドの分泌過多を自閉症に結びつけている多数の臨床調査と一致している。

Ｃｕｒｉｎら（２００３）は、自閉症を有する個体が、対照の年齢及び性別をマッチングさせた対象より、有意に低いコルチゾールの血清濃度（ｐ＜１０（−６））及び有意に高いＡＣＴＨの濃度（ｐ＝０．００２）を有することを見出した。また、てんかんを有する自閉症患者におけるプロラクチン濃度は、正常対象と比較して、有意に高かった。観察されたホルモンの変化は、自閉症を有する個体における視床下部−下垂体−副腎軸の機能障害と一致している。

３関連研究
伝達不平衡試験（ＴＤＴ）を使用して、問題としている特異的な表現型（ここでは自閉症）と、遺伝学的マーカーアレル又は特異的なマーカーアレルを含有しているハプロタイプとの間の関連に関して試験するため、連鎖研究のために使用したのと同じ家族を使用した。ＴＤＴは、試験された試料における集団層化問題に対して非感受性であるため、強力な関連試験である。簡単に説明すると、ヘテロ接合性の親からの、影響を受けた子孫へのアレルの分離が、試験される。伝達されなかったアレルと比較された、影響を受けた子孫に伝達されたアレルの部分が、ランダム分布の下で予想される比率と比較される。期待値に対するアレル伝達の有意な過剰は、それぞれのアレル又はハプロタイプの、研究された自閉症表現型との関連の証拠である。

代替的な試験は、影響されていない個体の誤分類が存在する場合ですら、より強力なままである家系不平衡試験（ＰＤＴ）である（Martin et al.2000）。シミュレーションは、データが、拡大された家族情報のない独立した家族からなる場合ですら、ＰＤＴの使用には利点があり得ることを示唆している。

この分析の結果は、ＰＩＴＸ１遺伝子のある種のアレルが、自閉症と陽性に関連しており、従って、疾患に対する感受性を増加させることを示している。試験された集団において、ＳＮＰ６のアレルＧは、ＴＤＴ（ｐ値＝０．０２８）及びＰＤＴ（ｐ値＝０．００４４）により決定されたように、自閉症と相関している。対照的に、ＳＮＰ６のアレルＴは、自閉症個体へと有意に過少伝達されており、このことは、このアレルが疾患からの防御を補助することを示している。

自閉症患者へのアレルの伝達の例は、表３に与えられる。

さらに、全てのＳＮＰの相を同定するため、ＳＮＰ１、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ２１、及びＳＮＰ２２に関してハプロタイプを構築した。

試験された集団におけるこの分析の結果は、全て、ＳＮＰ６におけるアレルＧの存在を特徴としているある種のハプロタイプが、自閉症に強く関連しており、アレルＧを欠くある種のハプロタイプは自閉症患者へと優先的に非伝達されることを示した。一例は、ＳＮＰ３−ＳＮＰ６−ＳＮＰ２２についてのハプロタイプＡ−Ｇ−Ａ、ｐ＝３．６８×１０^−５である。ＳＮＰ６にアレルＧではなくアレルＴを保持しているハプロタイプは、自閉症対象において過少提示される有意な証拠を示す。一例は、ＳＮＰ３−ＳＮＰ６−ＳＮＰ２２についてのハプロタイプＡ−Ｔ−Ａ、ｐ＝０．０００２１８である。

ある種のハプロタイプの優先的な伝達は、オッズ比の計算によっても証明された。１より大きいオッズ比は、試験された遺伝学的なアレルが、疾患に関連しており、従って、そのアレルが疾患に対する感受性を増加させることを意味する。オッズ比が１未満である場合には、陰性の関連が存在し、それは、試験された遺伝学的なアレルが、疾患からの防御を補助することを示す。例えば、ＳＮＰ３−ＳＮＰ６−ＳＮＰ２２についてのハプロタイプＡ−Ｇ−Ｇの伝達についてのオッズ比は、４．３２であり、ｐ＝３．６２×１０^−５である。

自閉症患者へのＳＮＰ６の優先的な伝達及び非伝達を有するハプロタイプの例は、表４に与えられる。

情報内容を増加させ、関連の範囲をより限定するため、ＰＩＴＸ１遺伝子におけるＳＮＰ密度を、およそ２．５ｋｂごとに１個のＳＮＰにまで増加させた。数個の付加的なマーカーは、ＰＩＴＸ１遺伝子における陽性の単一点結果を示した。最も強い関連は、偶発的に予想されるより高頻度に自閉症患者に伝達されるアレル１を有するマーカーＳＮＰ３３に関して観察され、アレル２は自閉症患者に優先的に非伝達された（ｐ＝０．００１６７４）。興味深いことに、このマーカーは、以前の分析において関連していることが既に見出されたＳＮＰ６と同一である。自閉症患者に伝達されたアレル及び非伝達されたアレルの例は、表５に示される。

上記のような連鎖分析のため使用された完全な試料セットにおいても、相を決定するためにハプロタイプを構築し、関連に関して分析した。試験された集団におけるこの分析の結果は、ある種のハプロタイプが自閉症に強く関連していることを示したが、それらは、全て、それぞれマーカーＳＮＰ２５におけるアレル２、マーカーＳＮＰ２７におけるアレル１、マーカーＳＮＰ２９におけるアレル１、マーカーＳＮＰ３１におけるアレル１、又はマーカーＳＮＰ３３におけるアレル１の存在を特徴としている。最も有意な結果は、２．２４×１０^−０３のｐ値で、マーカーＳＮＰ２４、ＳＮＰ２５、及びＳＮＰ４０についてのハプロタイプ１−２−１で入手された。一方、それぞれ、マーカーＳＮＰ２５におけるアレル１、マーカーＳＮＰ２７におけるアレル２、又はマーカーＳＮＰ４０におけるアレル２を特徴とするある種のハプロタイプは、自閉症患者に優先的に伝達されない。

完全なデータセットからの自閉症患者への優先的な伝達及び非伝達を有するハプロタイプの例は、表６に与えられる。

この家族セットは、米国の集団内に代表される種々の民族群からの試料を含んでいる。集団層化効果を調整するため、ハプロタイプ分析を各民族群について繰り返した。有意な関連が、数個のハプロタイプに関して、コーカサス人集団において見出された。自閉症患者により多く伝達されるハプロタイプの一例は、マーカーＳＮＰ２３、ＳＮＰ２５、及びＳＮＰ３３についてのハプロタイプ１−２−１であり（ｐ＝４．４４×１０^−３）、マーカーＳＮＰ２５、ＳＮＰ２９、及びＳＮＰ３１についてのハプロタイプ１−２−２は自閉症患者に優先的に非伝達されった（ｐ＝０．００６）。

コーカサス人データセットからの自閉症患者への優先的な伝達及び非伝達を有するハプロタイプの例は、表７に与えられる。

３人からなる家族１６７組の第２の独立したセット（セット２）を、上記のような連鎖の証拠を提供した家族（セット１）において観察された関連の複製に関して研究した。

この第２の家族セット（セット２）も、セット１と同様に、米国の集団内に代表される種々の民族群からの試料を含むため、可能性のある集団層化効果を調整するために各民族群について別々にハプロタイプ分析を実施した。マーカーＳＮＰ２５、ＳＮＰ２７、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３１、及びＳＮＰ３３についてのアレル２、１、１、１、又は１の存在を特徴とする数個のハプロタイプについて、有意な関連が、コーカサス人集団において見出された。自閉症患者により多く伝達されるハプロタイプの一例は、マーカーＳＮＰ２５、ＳＮＰ２７、及びＳＮＰ３２についてのハプロタイプ２−１−２（ｐ＝５．９３×１０^−３）であり、マーカーＳＮＰ２５、ＳＮＰ２６、及びＳＮＰ２７についてのハプロタイプ２−２−１は、より高頻度に自閉症患者に非伝達された（ｐ＝０．０４）。

家族セット２におけるコーカサス人データセットからの自閉症患者への優先的な伝達及び非伝達を有するハプロタイプの例は、表８に与えられる。

要約すると、コーカサス人におけるハプロタイプ分析は、以下の表９に示されるように、セット２における、マーカーＳＮＰ２５、ＳＮＰ２７、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３１、及びＳＮＰ３３についてのハプロタイプ２−１−１−１−１の陽性の複製を示した（セット１においてはｐ＝３．２×１０^−３、セット２においてはｐ＝６．８５×１０^−３）。

４．ヌクレオチド変化の同定
血縁関係にない影響を受けた個体９６人を、突然変異スクリーンに含めた。ＰＩＴＸ１遺伝子のコーディング領域を増幅するため、プライマーを設計した。プライマーの配列は、下記表１０に提供される：

得られた増幅産物を、遺伝子の中の稀なヌクレオチド変化（突然変異）及び多形（アレル頻度＞１％）を同定するため、ダイターミネーター配列決定化学を使用して、一方向に直接配列決定した。

遺伝子のコーディング領域＋スプライス部位近傍の隣接するイントロン領域において、全部で１０個のヌクレオチド変化が検出された（位置については、表１１を参照のこと）。表１１に示されるように、これらのうちの２つは、それぞれのコドンにおけるアミノ酸の変化をもたらした。

非翻訳領域において、２つの欠失ＭＵＴ１及びＭＵＴ９が同定された。ＭＵＴ１は５’ＵＴＲに検出された。２つの点突然変異ＭＵＴ２及びＭＵＴ３も、５’ＵＴＲに検出された。これらの突然変異は、ＰＩＴＸ１ＲＮＡの転写レベルに対して効果を及ぼし得る。ＭＵＴ９は３’ＵＴＲに発見され、ＲＮＡの安定性に影響を与えるかもしれない。

タンパク質の機能に対して効果を及ぼし得る２つの非同義の突然変異ＭＵＴ６及びＭＵＴ７も見出された。

ゲノミックハイブリッドアイデンティティプロファイリング（Genomic Hybrid Identity Profiling）（GenomeHIP）を使用した高密度マッピング。全ヒトゲノムを表す、クローン間の平均間隔が１．２メガ塩基対の、全部で２２６３個のＢＡＣクローンが、ＧｅｎｏｍｅＨＩＰを使用して、連鎖に関して試験された。各点は、クローンに相当する。クローンＢＡＣＡ４ＺＡ０８について、有意な連鎖の証拠が計算された（ｐ値６．４×１０^−７）。全連鎖領域には、ヒト第５染色体上の１３４０９５５９５塩基対から１３５５９３５２８塩基対までの領域が包含される。有意な連鎖のための有意水準に相当するｐ値２×１０^−５が、Lander and Kruglyak(1995)により提唱されたように、全ゲノムスクリーンのための有意水準として使用された。

Claims

対象における自閉症、または自閉症スペクトル障害の存在、又はそれらの素因をインビ
トロで検出する方法であって、対象からの該試料においてＰＩＴＸ１遺伝子座の改変の存在を検出することを含み、ここで該改変が１個もしくは数個のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである、方法。
ＰＩＴＸ１遺伝子座の改変の存在が、配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、及び
／又は選択的増幅により検出される、請求項１の方法。
該自閉症に関連したＳＮＰが、ＳＮＰ６及びＳＮＰ３３からなる群より選択される、請
求項１〜２のいずれかの方法。
該自閉症に関連したハプロタイプが、ＳＮＰ６、ＳＮＰ３３、ＳＮＰ２５、ＳＮＰ２７
、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３１、及びＳＮＰ３３からなる群より選択される数個のＳＮＰを含む、又はそれらからなる、請求項１〜２のいずれかの方法。
該ハプロタイプが、ＳＮＰ２４、ＳＮＰ２５、及びＳＮＰ４０からなる、又はそれらを含む、請求項４の方法。
該ＳＮＰ２４、ＳＮＰ２５、及びＳＮＰ４０からなる又はそれらを含むハプロタイプが、アレルＣ−Ｔ−Ａである、請求項５の方法。
該ハプロタイプが、ＳＮＰ２３、ＳＮＰ２５、及びＳＮＰ３３からなる、又はそれらを含む、請求項４の方法。
該ＳＮＰ２３、ＳＮＰ２５、及びＳＮＰ３３からなる又はそれらを含むハプロタイプが、アレルＡ−Ｔ−Ｇである、、請求項７の方法。
該ハプロタイプが、ＳＮＰ２５、ＳＮＰ２７、ＳＮＰ２９、及びＳＮＰ３１からなる、又はそれらを含む、請求項４の方法。
該ＳＮＰ２５、ＳＮＰ２７、ＳＮＰ２９、及びＳＮＰ３１からなる又はそれらを含むハプロタイプが、アレルＴ−Ａ−Ｃ−Ａである、請求項９の方法。