KR101619433B1 - 개체의 제엽염 진단용 조성물 및 키트, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법 및 치료제를 탐색하는 방법 - Google Patents

Abstract

개체의 제엽염 진단용 조성물 및 키트, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법 및 제엽염 치료제를 탐색하는 방법이 제공된다.

Description

개체의 제엽염 진단용 조성물 및 키트, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법 및 치료제를 탐색하는 방법{Composition and kit for detecting a laminitis in a subject, method for detecting a laminitis in a subject and method for screening a therapeutic agent for a laminitis}

개체의 제엽염 진단용 조성물 및 키트, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법 및 제엽염 치료제를 탐색하는 방법에 관한 것이다.

제엽이란 단제류의 제 3지골에 발굽을 지지하는 결합조직으로 발굽벽 안쪽에서 돌출된 상피층과 진피층이 질긴 기저막을 사이에 두고 서로 돌기를 이루어 맞물린 구조이다. 도 1은 제엽의 구조를 나타내는 도면이다. 제엽의 진피층은 뼈에 견고하게 연결되어 있는 제 1형 콜라겐으로 이루어진 결합조직으로서 혈관이 분포하여 발굽을 자라게 하고 유지하는데 필요한 영양분을 공급한다.

제엽염은 연결 구조 중 상대적으로 취약한 곳인 기저막에 문제가 생겨 골과 발굽 사이의 견고한 연속성이 소실되는 질병으로 만성화될 경우 제 3지골이 발바닥을 뚫고 나오며 심각한 통증과 파행을 초래한다.

제엽염의 원인은 명확히 밝혀져 있지 않지만, 주로 탄수화물 과식증에 의한 위장관계의 문제에 의한 것으로 알려져 있다. 짧은 사슬의 탄수화물은 포유동물의 위내에서 소화가 되지 않은 상태로 맹장으로 이동하고 정상세균총의 그람양성균에 의하여 발효되어 장 후반부 (hindgut)의 환경을 산성화시킨다. 산성화된 장내 환경은 그람양성균의 과다 증식과 사멸을 일으키며, 사멸된 균에서 유래한 내독소는 투과성이 증대된 장벽을 통해 흡수되어 전신적인 독혈증을 일으킨다. 독혈증은 기저막의 반부착반점에 존재하는 효소인 MMP(matrix metalloproteinase)를 활성화시켜 기저막과 진피조직의 분리를 일으키거나 제엽에 분포한 혈관에 영향을 주어 염증반응을 일으키게 된다.

제엽염 (laminitis)은 말, 당나귀, 및 얼룩말을 포함한 개체의 사육 중 안락사 조치를 필요하게 하는 중요 질병 중 하나이다. 이에 따라 정확한 진단이 치료 가능성과 예후를 판정하는데 필요하지만, 현재 심혈관계 지표 및 임상증상에만 의존하여 진단하고 있다. 그러므로 특이적인 제엽염 조기진단을 위한 생체 지표 발굴 및 진단법 개발이 요구되고 있다.

일 양상은 개체의 제엽염 진단용 조성물을 제공한다.

다른 양상은 개체의 제염엽 진단용 키트를 제공한다.

다른 양상은 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 개체의 제엽염 치료제를 탐색하는 방법을 제공한다.

일 양상은 eca-miR-199a-5p, eca-miR-27a, eca-miR-27b 및 eca-miR-324-5p로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 개체의 제엽염 진단용 조성물을 제공한다.

용어 "miRNA"는 microRNA 또는 miRs로 지칭될 수 있다. miRNA의 길이는 약 19 내지 25, 또는 21 내지 23개의 뉴클레오티드인 RNA 가닥일 수 있다. miRNA는 DNA로부터 전사되지만 단백질로 번역되지 않으므로, 비-코딩 RNA를 포함하는 유전자에 의해 코딩된다. miRs는 공지의 원발성 전사체 pri-miRNA로부터 pre-miRNA라고 불리는 짧은 스템-루프 (stem-loop) 구조로 프로세스되고, 최종적으로 생성된 단일 가닥 miRNA로 프로세스된다. pre-miRNA는 자가-상보 영역내에서 자체적으로 안으로 접히는 구조를 형성할 수 있다. 그 후 상기 구조는 동물에서는 뉴클레아제에 의해 프로세스된다. 성숙 miRNA 분자는 하나 이상의 mRNA 분자에 부분적으로 상보적이며, 단백질의 전사를 조절하는 기능을 할 수 있다. miRNA의 확인된 서열은 www.microRNA.org, www.mirbase.org, 또는 www.mirz.unibas.ch/cgi/miRNA.cgi.와 같은 공개된 이용가능한 데이터베이스에서 평가할 수 있다. miRNAs는 " mir-[숫자]"와 같은 작명 협정에 따라 일반적으로 번호를 할당받는다. miRNA의 숫자는 이미 확인된 miRNA 종에 대해 발견된 순서에 따라 할당된다. miRNA가 상이한 유기체의 공지의 miRNA에 유사한 것으로 발견되었다면, 이름은 [유기체 확인자]- mir-[숫자]의 형태로, 선택적 유기체 확인자 이름이 제공된다. 성숙한 microRNA는 보통 접두사 "miR"가 붙고, 유전자 또는 전구물질 miRNA는 접두사 "mir"가 붙는다. 본 발명의 내용에서, 접두사 mir-* 또는 miR-*를 가진 임의의 microRNA (miRNA 또는 miR)는 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 전구물질 및/또는 성숙 종을 모두 포함하는 것으로 이해해야 한다. miR 명명에 대한 상세한 내용은 www.mirbase.org 또는 Ambros et al., A uniform system for microRNA annotation, RNA 9:277-279 (2003)을 참고한다.

상기 eca-miR-199a-5p, eca-miR-27a, eca-miR-27b 및 eca-miR-324-5p는 각각 서열번호 1 내지 4의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이를 표 1에 나타내었다. 상기 miRNA는 에쿠스 카발루스 유래이다. 상기 eca-miR-199a-5p, eca-miR-27a, eca-miR-27b 및 eca-miR-324-5로 이루어지 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현의 증가는 제엽염과 연관된 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀?다. 따라서, 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준은 제엽염을 진단하는데 사용될 수 있다.

eca-miR-199a-5p 의 Aceession Number는 이다. eca-miR-27a는 MIR27A로도 지칭될 수 있으며, Aceession Number는 MIMAT0012988이다. eca-miR-27b의 Aceession Number는 MIMAT0013114이다. eca-miR-324-5p의 Aceession Number는 MIMAT0013033이다.

본 명세서에 있어서, 용어 "eca-miR-199a-5p", "eca-miR-27a", "eca-miR-27b" 및 "eca-miR-324-5p"는 천연적으로 존재하는 eca-miR-199a-5p, eca-miR-27a, eca-miR-27b 및 eca-miR-324-5p 및 그의 기능적 변이체를 포함하는 것으로 해석된다.

miRNA	서열
eca-miR-199a-5p	CCCAG UGUUC AGACU ACCUG UUC (서열번호 1)
eca-miR-27a	UUCAC AGUGG CUAAG UUCCG C (서열번호 2)
eca-miR-27b	UUCAC AGUGG CUAAG UUCUG C (서열번호 3)
eca-miR-324-5p	CGCAU CCCCU AGGGC AUUGG UGU (서열번호 4)

상기 개체의 제엽염 진단용 조성물은 상기 하나 이상의 miRNA의 양을 측정하기 위한 제제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제제는 상기 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있다. 상기 제제는 상기 하나 이상의 miRNA 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 이들의 안티센스 서열; 또는 그 조합일 수 있다. 상기 프라이머는 중합효소에 의한 중합 반응에서 중합개시점을 제공하는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 핵산 증폭 반응에서 사용되는 것일 수 있다. 용어 "증폭 (amplification)"은 표적 서열 또는 그의 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것을 나타낸다. 상기 핵산 증폭 반응은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 핵산의 증폭은 증폭 동안 복수의 사이클을 필요로 하는 방법 또는 단일 온도에서 수행되는 방법을 포함한다. 순환 방법 (cycling techniques)의 예는 열 순환을 필요로 하는 방법을 포함한다. 열 순환을 필요로 하는 방법은 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 포함한다. PCR은 당업계에 알려져 있다. PCR은 보통 열변성에 의하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA으로 변성시키는 단계, 프라이머를 상기 단일가닥 DNA에 어닐링하는 단계; 및 상기 프라이머로부터 상보적 가닥을 합성하는 단계를 포함한다. 등온 증폭 방법은 단일 온도 또는 증폭 과정의 주요 양상이 단일 온도에서 수행되는 방법이다. 이중가닥을 분리하기 위하여 반응 산물을 가열하여 추가적 프라이머가 결합할 수 있도록 하는 PCR과는 대조적으로, 등온 방법은 이중가닥을 분리하고 주형을 재카피하기 위하여 가닥 치환 폴리머라제 (strand displacing polymerase)에 의존한다. 등온 방법은 반복 주형 카피 (reiterative template copying)를 개시하기 위하여 프라이머의 치환에 의존하는 방법과 단일 프라이머 분자의 연속된 재사용 또는 신규 합성에 의존하는 방법으로 구분할 수 있다. 프라이머의 치환에 의존하는 방법은 헬리카제 의존적 증폭 (helicase dependant amplification: HDA), 엑소뉴클레아제 의존적 증폭 (exonuclease dependant amplification), 리콤비나제 중합효소증폭 (recombinase polymerase amplification: RPA) 및 루프 매개된 증폭 (loop mediated amplification: LAMP)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 포함한다. 단일 프라이머 분자의 연속된 재사용 또는 신규 합성에 의존하는 방법은 가닥치환증폭 (strand displacement amplification: SDA) 및 핵산 기반 증폭 (nucleic acid based amplification : NASBA 및 TMA)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 포함한다. 상기 프라이머는 선택되는 증폭 방법에 따라 하나, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 세트로 포함될 수 있다. 상기 프라이머는 PCR용 프라이머일 수 있다.

miRNA 발현 수준 측정은 제엽염 유무 및 정도를 진단하기 위하여 개체의 miRNA의 존재여부와 발현정도를 확인하는 과정으로서 miRNA 양의 측정일 수 있다. 이는 miRNA를 직접 분리하거나, 상기 miRNA에 대한 프라이머 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이 또는 그 조합을 이용하는 것을 포함할 수 있다. RT-PCR은 RNA를 분석하는 방법으로, miRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석하는 방법이다. 상기 RT-PCR 중 증폭 단계에서 상기 유전자에 특이적으로 제조된 프라이머 쌍을 사용하며, RT-PCR 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 상기 유전자의 miRNA 발현 여부와 발현 수준을 확인할 수 있고 이를 정상대조군과 비교함으로써, 개체의 제엽염의 유무 또는 그 발병 정도를 간편하게 판단할 수 있다.

본 명세서에 있어서 용어 "프라이머"는 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 (즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 예를 들면 상기 하나 이상의 miRNA에 대한 특이적인 프라이머로서 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 개체의 제엽염의 유무 또는 그 발병 정도를 확인할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기 프라이머는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서 용어 "프로브"란 표적 핵산 예를 들면, miRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 miRNA의 존재 유무, 함량 및 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 예를 들면 상기 miRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 miRNA의 발현량을 측정함으로써 개체의 제엽염의 유무 또는 그 발병 정도를 확인할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 프로브는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.

또한, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한 이러한 핵산 서열은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 또는 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형될 수 있다. 상기 표지의 예는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 또는 바이오틴를 포함할 수 있다.

상기 발현 수준은 개체로부터 분리된 시료 중의 발현 수준일 수 있다. 상기 시료는 개체로부터 분리된 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 대변, 타액, 눈물, 뇌척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있다. 상기 조직은 제엽일 수 있다. 상기 개체는 단제류 (Perissodactypa)에 속하는 것일 수 있다. 상기 개체는 에쿠스 (Equus) 속일 수 있다. 에쿠스 속은 말, 당나귀, 또는 얼룩말을 포함할 수 있다. 상기 말은 에쿠스 페루스 (equus ferus) 종일 수 있다. 상기 에쿠스 페루스 (equus ferus) 종은 에쿠스 페루스 카발루스 (Equus ferus caballus), 에쿠스 페루스 페루스 (Equus ferus ferus), 또는 에쿠스 페루스 프르즈왈스키 (Equus ferus przewalskii) 아종을 포함할 수 있다. 상기 개체는 말, 물소, 코뿔소, 또는 낙타를 포함할 수 있다.

다른 양상은 eca-miR-199a-5p, eca-miR-27a, eca-miR-27b 및 eca-miR-324-5p로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 제엽염 진단용 키트를 제공한다.

"하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 제제", "개체" 및 "제엽염 진단용"에 대하여는 상기 제엽염 진단용 조성물에 대한 설명에서 기술한 바와 같다.

상기 키트는 예를 들면 miRNA의 발현량을 측정할 수 있는, 제엽염 진단용 마이크로어레이일 수 있다. 상기 제엽염 진단용 마이크로어레이는 상기 miRNA를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상술한 miRNA 또는 그와 상보적 서열, 또는 그에 대응되는 핵산 서열이 프로브로서 기판에 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 핵산 서열은 DNA, PNA (peptide nucleic acids), LNA (locked nucleic acids), 이들의 조합, 및 이들의 유사체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 키트가 예를 들면 상술한 유전자의 miRNA의 발현량을 측정하기 위한 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자의 miRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 또는 멸균수를 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 시료 중의 eca-miR-199a-5p, eca-miR-27a, eca-miR-27b 및 eca-miR-324-5p로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계, 및 상기 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 대조군에서 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법을 제공한다.

상기 개체는 단제류 (Perissodactyla)에 속하는 것일 수 있다. 에쿠스(Equus) 속일 수 있다. 에쿠스 속은 말, 당나귀, 또는 얼룩말을 포함할 수 있다. 상기 말은 에쿠스 페루스 (equus ferus) 종일 수 있다. 상기 에쿠스 페루스 (equus ferus) 종은 에쿠스 페루스 카발루스 (Equus ferus caballus), 에쿠스 페루스 페루스 (Equus ferus ferus), 또는 에쿠스 페루스 프르즈왈스키 (Equus ferus przewalskii) 아종을 포함할 수 있다. 상기 개체는 말, 물소, 코뿔소, 또는 낙타를 포함할 수 있다.

상기 발현 수준은 miRNA의 발현 수준일 수 있다. 따라서, 상기 측정은 miRNA의 양일 수 있다. 상기 miRNA의 양의 측정에 대하여는 상기한 바와 같다.

*상기 시료는 개체로부터 분리된 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 대변, 타액, 눈물, 뇌척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있다. 상기 조직은 제엽일 수 있다.

상기 방법은 상기 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 대조군에서 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함한다. 상기 대조군은 제엽염에 걸리지 않은 개체일 수 있다.

상기 방법은 상기 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 대조군에서 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준보다 높은 경우, 상기 개체는 제엽염에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 대조군에서 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준보다 같거나 낮은 경우, 상기 개체는 제엽염에 걸리지 않은 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

다른 양상은 후보물질을 개체에 투여하는 단계; 상기 개체로부터 분리된 시료 중의 eca-miR-199a-5p, eca-miR-27a, eca-miR-27b 및 eca-miR-324-5p로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 대조군에서 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 제엽염 치료제를 탐색하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 후보 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 후보 물질은 제엽염 치료에 효과적인 것으로 예상되는 임의의 물질일 수 있다. 상기 투여는 선택되는 물질에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 상기 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여된다. 상기 물질은 전신적으로 또는 국부적, 예를 들면 제엽에 투여될 수 있다.

"상기 개체로부터 분리된 시료 중의 eca-miR-199a-5p, eca-miR-27a, eca-miR-27b 및 eca-miR-324-5p로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계" 및 "상기 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 대조군에서 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계"에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 개체는 제엽염을 갖는 개체일 수 있다.

상기 방법은, 상기 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 대조군에서 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준보다 낮은 경우, 상기 후보 물질을 제엽염 치료에 효과적인 것으로 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

일 양상에 따른 제엽염 진단용 조성물에 따르면, 제엽염 유무를 효율적으로 진단할 수 있다.

일 양상에 따른 제엽염 진단용 키트에 따르면, 제엽염 유무를 효율적으로진단할 수 있다.

일 양상에 따른 개체가 제염염에 걸렸는지를 진단하는 방법에 따르면, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 효율적으로 진단할 수 있다.

일 양상에 따른 제엽염 치료제를 탐색하는 방법에 따르면, 제염염 치료제를 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

도 1은 제엽의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 eca-miR-199a-5p, eca-miR-27a, eca-miR-27b 및 eca-miR-324-5p의 miRNA를 제엽염 조기 진단을 위한 지표로 실시한 과정을 나타내는 도면이다.
도 3은 제엽염 유발을 위한 올리고당 투여 용량 및 일정을 나타낸 도면이다.
도 4는 제엽염이 유발된 제엽 조직의 조직학적 검사 사진이다.
도 5는 라이브러리 제작 과정을 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1 . miRNA 를 이용한 제엽염의 진단

본 실시예에서는 말에서 제엽염을 인공적으로 유도하여 그 전후에 eca-miR-199a-5p, eca-miR-27a, eca-miR-27b 및 eca-miR-324-5p 각각이 분별적으로 발현된다는 것을 확인하고, 상기 miRNA의 발현 수준이 제엽염의 진단에 사용될 수 있다는 것을 확인하였다. 도 2는 eca-miR-199a-5p, eca-miR-27a, eca-miR-27b 및 eca-miR-324-5p의 miRNA를 제엽염 조기 진단을 위한 지표로 실시한 과정을 나타내는 도면이다.

1. 제엽염의 실험적 유발

(1) 올리고당 투여를 통한 제엽염의 유발

약 600kg의 20세 Warmblood 종의 거세마를 사용하였으며, 약 3개월 동안 마방에서 운동 없이 관리하였다. 프락토올리고당 (썬 올리고 P2®, (주)큐원, 한국)을 사용하였다. 도 3은 제엽염 유발을 위한 올리고당 투여 용량 및 일정을 나타낸 도면이다. 도 3과 같이 3일간 (Day 0, 1, 2) 유도 용량인 1 g/kg을 투여한 후, Day 3에 10 g/kg의 유발 투여용량을 주입하였다. 1 g/kg의 유도 용량은 가루형태로 사료에 섞어 투여하였으며, 유발 투여용량은 10 g/kg의 용량인 6 kg을 반으로 나누어 각각 4 L의 수돗물에 녹인 후, Day 3 오전 및 오후와 같이 2회에 걸쳐 비위강 (nasogastric) 튜브를 이용하여 주입하였다. Day 4와 Day 5에는 임상검사 및 혈액검사를 실시한 후 안락사시켰다.

(1.2) 제엽염 유발 평가

신체검사는 Day 3부터 1일 2회씩 실시하였다. 체온을 직장 내에 전자체온계 (MT 1961®, Microlife)를 삽입하여 측정하였다. 프락토올리고당이 10 g/kg으로 투여된 Day 3부터 1일 2회 측정한 체온의 변화양상은 투여 12시간 이후부터 지속적인 상승을 보였으며 Day 5 오전에는 39.5 ℃의 고열을 보였다.

발굽의 열감은 상시, 즉 차가운 느낌을 0으로 하고, 상온 (room temperature)과 동일할 경우 (+), 상온보다 높은 열감이 느껴질 때 (++)으로 기록하였다. Day 1에 왼쪽 앞발을 제외한 발굽에 열감 (++)이 나타났고 Day 1 에서 2사이에는 네 개의 발굽에 모두 열감 (++)이 확인되었으며, Day 2에는 상온 (+)으로 떨어졌다.

심박수는 청진기를 이용하여 좌흉부에서 직접 측정하였다. 파행등급을 미국 말 수의사협회에서 제시한 등급 시스템으로 평가하였다. 올리고당이 10 g/kg으로 투여된 Day 3부터 1일 2회 측정한 심박수의 변화 양상은 다음과 같다. Day 3에 심박수는 30 회/분으로 정상치를 나타내었다. Day 4부터는 지속적으로 상승하였다가 Day 5에는 다소 감소하였지만 여전히 정상보다 높은 심박수를 보였다.

또한 위장관계와 관련된 기타 임상증상들이 나타나는지 관찰하였다. Day 4에 식욕부진과 설사를 보였으며 이후 지속적인 식욕부진을 보였다. Day 3에 앞다리를 넓게 벌리고 서있는 자세를 보였으며, grade 4부터 5 사이의 높은 파행등급을 보였다 표 1에 나타낸 단백질은 제엽염 진단용 마커로 사용될 수 있다.

Day 5 오전 및 오후에 경정맥으로부터 채혈하여 BD vacutainer EDTA-K2 10.8 mg (6 ml)에 보관한 후, ADVIA 120 혈액검사기기 (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, USA), 및 FUJI DRY-CHEM 3500i (Fugi film, Japan, Tokyo)를 이용하여 혈액 및 혈청학적 검사를 각각 실시하였다. Day 5에 실시한 혈액검사 결과는 다음과 같다. RBC, Hematocrit (Hct), Hemoglobin (Hb) 이 참고범위 보다 높게 관찰되었으며, WBC 수치는 참고범위 아래로 약간 떨어져 있었다. 상대적으로 심한 림프구 감소증이 관찰되었으며, 호중구, 호염구, 단핵구를 비롯한 기타 백혈구 비율은 다소 증가된 것으로 측정되었다. 또한, Day 5에 혈청화학적 검사 결과는 다음과 같이 기록되었다. 혈당은 정상의 약 1.5~2배 증가하였으며, 크레아티닌(creatinine), 요산, 총 빌리루빈, ALP(alkaline phosphatase)도 약 2배 상승하였다. 총단백질과 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase)는 소폭 상승하였다. 빌리루빈을 제외한 나머지 수치들은 안락사 직전에 더욱 상승된 모습을 보였다. 전해질 검사 결과 미약한 저나트륨혈증을 보였고 저마그네슘혈증을 보였다. CPK(Creatine phosphokinase), 및 BUN(blood urea nitrogen)은 안락사 직전 검사에서 미약한 증가를 보였다.

또한, 조직학적 검사를 위해 채취한 제엽 조직을 약 10% 포르말린에 고정한 후, 통상적인 방법에 따라 파라핀으로 포매(包埋)하고 4~6㎛로 절편하여 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 폐는 전반적으로 발적되어 퇴축되지 않았으며, 거품양 수액이 기관지에 존재하였다. 결장은 전반적으로 발적되어 있었으며, 장관벽은 수종성 변화를 보이며 비후되어 있었다. 제엽조직 단면에서 미약한 발적이 관찰되었다. 도 4는 제엽염이 유발된 제엽 조직의 조직학적 검사 사진이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 제엽 결합조직의 혈관은 충혈되어 있으며, 소수의 호중구가 침윤되어 있으며, 수종성 변화를 나타내었다.

2. 제엽염 유발 전, 후 혈장 내 miRNA NGS 분석과 제엽 특이적 miRNA 선별

(1) 혈장 샘플링

제엽염 유발 전 혈장은 Day 0의 유도용량 투여 전에 경정맥으로부터 채혈하여 BD vacutainer EDTA-K2 10.8 mg (6 ml)에 넣은 후 원심분리기로 3000 rpm, 10분 원심 분리하여 샘플링하였다. 그리고 제엽염 유발 후 혈장은 Day 5에 경정맥으로부터 채혈한 후 BD vacutainer EDTA-K2 10.8 mg (6 ml)에 넣은 후 원심분리기로 3000 rpm, 10분 원심 분리하여 샘플링하였다.

(2) 조직 샘플링

진정 (Domosedan^®, 10mg/kg, Orion Co./ Ketamine, 1500mg/kg, 유한양행) 후 안락사 (1 ml당 Embutramide 200 mg Mebezonium iodine 50 mg Tetracaine 5 mg, T-61^®, 50 ml, 유럽연합)하였으며, 부검을 실시한 다음 제엽염이 유발된 말의 간, 신장, 폐, 위, 소장, 결장, 맹장, 갑상선, 부신, 근육, 비장,및 심장의 12개의 주요 장기 조직과 4개의 발굽으로부터 제엽 조직을 채취한 후 액체 질소에서 급냉 후 -70℃에서 보관하였다.

(2) RNA 추출

제엽염이 유발된 말의 제엽과 12가지 주요 장기 조직 50 mg 당 Trizol 0.75 ml을 넣고 균질화시켰다(homogenize). 균질화된 샘플을 상온에서 5분간 인큐베이션 한 후 Trizol 0.75 ml 당 클로로폼 0.2 ml을 넣고 15초 동안 흔들어 혼합하였다. 혼합물을 RT에서 3분 동안 인큐베이션한 후 14000 rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리를 진행하였다. 원심분리 후 상층액 약 500 ul를 확보하여 이소프로필알콜과 1:1로 혼합한 후, RT에서 10분 동안 인큐베이션을 하였다. 그리고 14000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리를 하고, RNA 펠릿을 확인한 후 상층액을 모두 제거하였다. 세척 과정으로 70% EtOH 1 ml을 넣은 후 8000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리를 하였다. 상층액을 모두 제거한 후 RT에서 튜브 뚜껑을 열어놓은 채 RNA 펠렛을 완전히 건조하였다. 펠릿이 완전히 마르면 HPLC 물 20~100 ul를 넣어서 용리시켰다. 그 후 Dnase I을 RT에서 15분 동안 처리하여 DNA를 완전히 제거함으로써 순수한 RNA를 추출하였다.

(3) RNA 농도 및 품질 분석

말 혈장에서 분리된 전체 RNA는 Nano drop기계와 bioanalyzer 기계를 사용하여 RNA 농도 및 품질(quality)을 아래 기준을 이용하여 분석하였다.

핵산과 단백질은 각각 260 nm, 280 nm에서 최대의 흡광도를 가진다. 이러한 260 nm 와 280 nm에서의 흡광도 비(260/280)는 DNA, RNA의 순도를 평가하는 기준이 되며 ratio 1.8은 일반적으로 순수한 DNA를, ratio 2.0은 순수한 RNA를 의미한다. 추출된 RNA의 260/280 값이 1.6 - 2.0 일 때 순도가 높다고 판단하여 후속 분석에 사용하였다.

대상 말의 혈장으로부터 전체 RNA를 분리한 결과 평균 혈장 1 ml 당 123 ng의 순도가 높은 전체 RNA를 얻을 수 있었다.

(4) NGS (Next Generation Sequencing)를 이용한 조직 내 miRNA 분석

(4.1) stem loop RT- PCR 를 이용한 정량

추출한 전체 RNA를 Size-fractionation방법을 이용하여 18-32 nt 크기의 small RNAs를 분리하였다. 이들 small RNA에 adapter를 부착한 뒤 RT-PCR 및 cDNA 클로닝의 일련 과정을 거쳐 Size-fractionated cDNA 라이브러리를 제작하였다. 도 5는 라이브러리 제작 과정을 나타내는 도면이다.

추출된 전체RNA를 폴리아크릴아마이드젤 상에 로딩한 후 전기영동을 통하여 크기별로 분리한 후 small <40-nt RNA에 상당하는 부분을 잘라내었다. <40-nt fraction을 flashPAGE clean up kit (Life Technologies Corp.)를 이용하여 씻어내고 30 ul의 용리 버퍼 (elution buffer)로 녹여서 분리하였다. 그 후 약 80% 에탄올로 세척하였다. 펠릿은 50 ul의 RNase-free TE로 재현탁시켰다. 그 다음 <40-nt RNA의 품질 검사를 하였다.

역전사 반응 (Reverse transcriptase reaction)은 다음과 같이 실시하였다: 정제된 총 RNA 샘플과 50 nM stem-loop RT 프라이머, 1x RT 버퍼, 0.25 mM dNTPs, 역전사효소 및 RNase inhibitor가 포함된 RT 반응 프리믹스를 섞어 약 7.5 uL의 반응 혼합물을 제조하였다. 제조된 혼합물을 96-well 플레이트에 로딩하고 약 16℃에서 약 30분, 약 42℃에서 약 30분, 약 85℃에서 약 5분 동안, 및 약 4℃에서 홀딩하는 순차적인 반응을 실시하였다. 역전사반응은 no-template control과 reverse transcriptase minus controls를 negative controls로 하여 상기 반응을 수행하였다. 또한 상기 반응을 duplicate 또는 triplicate로 수행하여 오차범위를 줄였다.

실시간 정량적 중합반응 (Real-time qPCR)은 다음과 같이 실시하였다: 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 가수분해 프로브 (hydrolysis probe)를 포함하는 약 18.7 uL의 PCR 프리믹스를 준비하였다. 이 프리믹스를 96-well 플레이트에 로딩하고, 여기에 약 1.3 ul의 RT 산물을 옮겨 넣었다. 상기 실시간 정량적 중합반응은 약 95℃에서 약 10 분씩 40 사이클로 하여 약 95℃에서 약 15 초, 약 60℃에서 약 1분으로 순차적으로 반응을 triplicate로 수행하였다.

(4.2) NGS (Next Generation Sequencing) 수행

Small RNA cDNA를 로딩한 후, HiSeq 2000 machine(Iluumina inc.)을 이용하여 50 bp single-end로 리딩하여 NGS (Next Generation Sequencing)를 수행하였다. 그 후 정상말의 혈장과 제엽염을 갖는 말의 혈장으로부터 수득된 NGS 결과에 대하여 1차적으로 아래와 같은 기준에 따라 Data cleaning을 다음과 같이 실시하였다:

낮은 품질의 리드 데이타 (read data)를 제거하였다. 그 후, 5’ 프라이머 contaminant를 지닌 리드 데이타를 제거하였다. 그 후, 3’ 프라이머가 없는 리드 데이타를 제거하였다. 그 후, Poly A를 가진 리드 데이타를 제거하였다. 그 후, 18 nt보다 더 짧은 리드 데이타를 제거하였다. 그 후, insert tag가 없는 리드 데이타를 제거하였다.

그 결과, 각각 95%, 94% 이상의 clean reads를 확인할 수 있었다. Data cleaning을 통하여 확인된 양질의 small RNA중 Clean Read data만 선별한 후, 표준 바이오인포매틱스 (Standard Bioinformatics) 분석을 통해 기존에 알려진 microRNAs, 새로운 microRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 및 snoRNA의 small RNA에 대한 발현양상을 분석하였다. 표준 바이오인포매틱스 분석은 논문 등으로 발표된 miRNA의 염기서열과 annotation에 대한 정보가 데이타베이스로 구축되어 있는 miRBase (www.mirbase.org)를 이용하여 수행하였다.

3. 결과

말의 제엽 및 그외 주요 장기 조직의 miRNA의 발현 수준을 비교 분석한 결과, 제엽 조직에서 높은 발현 수준을 갖고 그 외 주요 장기 조직에서 발현 수준이 미미한 miRNA를 선별하였다. 선별된 miRNA 및 그의 발현 수준을 표 2에 나타내었다.

miRNA	제엽조직평균(RPM*)	제엽 외 주요 장기 조직에서의 발현 수준 평균(RPM)	배수 변화
eca-miR-199b-5p	약 2,706.80	약 13.12	약 206.37
eca-miR-27a	약 2,278.84	약 239.93	약 9.50
eca-miR-27b	약 2,528.12	약 406.23	약 6.22
eca-miR-324-5p	약 9.43	약 2.85	약 3.31

*RPM: Reads per million

말의 제엽염 유발 전후 혈장의 miRNA 발현 수준을 비교 분석한 결과, 제엽염 유발 전 보다 제엽적 유발 후 발현 수준이 높은 miRNA는 각각 eca-miR-199a-5p, eca-miR-27a, eca-miR-27b 및 eca-miR-324-5p이며, 이를 표 3에 나타내었다.

miRNA	제엽염 유발 후 혈장에서의 발현 수준 (RPM*)	제엽염 유발 전 혈장에서의 발현 수준 (RPM)	배수 변화
eca-miR-199a-5p	약 40.99	약 5.71	약 7.18
eca-miR-27a	약 10,198.85	약 674.73	약 15.12
eca-miR-27b	약 45,170.26	약 9,245.79	약 4.89
eca-miR-324-5p	약 88.96	약 16.51	약 5.39

*RPM: Reads per million

<110> SNU R&DB Foundation <120> Composition and kit for detecting a laminitis in a subject, method for detecting a laminitis in a subject and method for screening a therapeutic agent for a laminitis <130> PN111999 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Equus caballus <400> 1 cccaguguuc agacuaccug uuc 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Equus caballus <400> 2 uucacagugg cuaaguuccg c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Equus caballus <400> 3 uucacagugg cuaaguucug c 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Equus caballus <400> 4 cgcauccccu agggcauugg ugu 23

Claims (11)

1. 서열번호 3의 miRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 제엽염(laminitis) 진단용 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 서열번호 3의 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질인 것인 개체의 제엽염 진단용 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 서열번호 3의 miRNA 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 그 조합인 것인 개체의 제엽염 진단용 조성물.
4. 서열번호 3의 miRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 제엽염 진단용 키트.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 제제는 상기 서열번호 3의 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질인 것인 개체의 제엽염 진단용 키트.
6. 청구항 4에 있어서, 상기 제제는 상기 서열번호 3의 miRNA 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 그 조합인 것인 개체의 제엽염 진단용 키트.
7. 개체로부터 분리된 시료 중의 서열번호 3의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계, 및
   상기 측정된 서열번호 3의 miRNA의 발현 수준을 대조군에서 측정된 서열번호 3의 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 측정된 서열번호 3의 miRNA의 발현 수준이 대조군에서 측정된 서열번호 3의 miRNA의 발현 수준보다 높은 경우, 상기 개체는 제엽염에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
9. 청구항 7에 있어서, 상기 측정하는 단계는 상기 서열번호 3의 miRNA의 양을 측정하는 것인 방법.
10. 후보물질을 개체에 투여하는 단계;
    상기 개체로부터 분리된 시료 중의 서열번호 3의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 서열번호 3의 miRNA의 발현 수준을 대조군에서 측정된 서열번호 3의 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 제엽염 치료제를 탐색하는 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 측정된 서열번호 3의 miRNA의 발현 수준이 대조군에서 측정된 서열번호 3의 miRNA의 발현 수준보다 낮은 경우, 상기 후보 물질을 제엽염 치료에 효과적인 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.

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