KR20180010549A

KR20180010549A - 알앤에이 검출용 키트 및 방법

Info

Publication number: KR20180010549A
Application number: KR1020160092821A
Authority: KR
Inventors: 이재훈
Original assignee: (주) 하임바이오텍
Priority date: 2016-07-21
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2018-01-31
Also published as: KR101874089B1

Abstract

본 발명은 RNA 분자 특히 miRNA와 같은 작은 크기를 갖는 RNA 분자 검출용 키트 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 증폭대상 RNA 분자와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고 dT로 구성되는 poly A 꼬리와 혼성화하는 제1혼성화 올리고뉴클레오티드 구성된 역전사용 프라이머; 상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 및 검출 대상으로부터 수득된 시료 내의 RNA를 poly A 폴리머라제로 반응시켜 poly A 꼬리가 연결된 poly A 꼬리연결 RNA 분자 중 상기 증폭대상 RNA 분자로부터 역전사된 cDNA의 poly A 꼬리 부분을 제외한 3'-말단 부분과 특이적으로 혼성화 가능한 제2혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머; 및 상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 포함하는 RNA 분자 검출용 키트에 관한 것이다.

Description

알앤에이 검출용 키트 및 방법{A kit and method for detecting RNA molecules}

본 발명은 핵산 검출용 키트 및 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 알앤에이 검출용 키트 및 방법에 관한 것이다.

마이크로 RNA(microRNA 또는 miRNA, 이하, 'miRNA'로 약칭함)는 22개 정도의 리보뉴클레오티드로 구성된 비번역 RNA로, 전사단계에서 RNA 침묵(RNA silencing) 그리고 전사 후 단계에서 유전자의 발현을 조절하는 기능을 수행하며, 이러한 miRNA의 기능은 mRNA 내의 상보서열과의 염기쌍의 형성을 통해 수행되는 것으로 알려지고 있다(Bartel, D.P., Cell, 136(2): 215-233, 2009).

최초에 예쁜 꼬마선충(C. elegans)에서 발견된 이후, 동물, 식물 및 바이러스에 유전자 발현의 조절기구로 활용되고 있음이 알려지면서 다양한 종류의 miRNA들이 속속 보고되고 있는 실정이다. 뿐만 아니라, miRNA 유전자의 돌연변이 등에 기인하는 기능의 부조화에 의해 암 등 특정 질병이 발생할 수 있음이 알려지고 있어(Mraz, M. and Pospisilova, S., Expert Rev. Hematol., 5(6): 579-581, 2012; Hughes et al., Am. J. Hum. Genet., 89: 628-633, 2011; Pontual et al., Nat. Genet., 43(10): 1026-1030, 2011; Lu et al., Nature 435(9): 834-838, 2005), 그 중요성이 더욱 부각되고 있다.

miRNA는 그 크기가 매우 작고(~22 nt) mRNA보다 더 쉽게 분해되는 것으로 알려져 있기 때문에, 이를 분리하거나 검출하는데 큰 여려움이 있다. 이를 검출하기 위한 통상적인 방법으로는 노던 블랏 분석과 마이크로어레이를 이용한 교잡에 기반한 검출, 특정 miRNA와 특이적으로 상보결합을 하는 스템루프 구조의 프라이머를 이용한 RT-PCR과 그에 수반되는 정량적 PCR의 두 단계에 걸친 공정으로 검출 및 정량을 하는 방법(Chen et al., Nucleic Acids Res., 33(20): e179, 2005), 폴리 A polymerase로 miRNA의 3'-말단에 폴리 A 꼬리를 연결하고, Poly(T) 어댑터를 프라이머로 사용하여 cDNA를 합성한 후, miRNA 특이적 포워드 프라이머와 poly(T) 어댑터에 기반한 리버스 프라이머를 이용하여 miRNA를 증폭하는 방법(Shi, R. and Chiang, V.L., BioTechniques, 39: 519-525, 2005) 등이 알려져 있다.

그러나, 상기 방법들은 제한된 상보서열을 이용하기 때문에 비특이적 증폭이 가능할 수 있고, 통상적으로 실시간 PCR 기술에 기반하고 있기 때문에, 고가의 실시간 PCR 장비가 필요하며, 생성된 PCR 산물의 크기가 비슷하기 때문에 다양한 miRNA를 동시에 검출하는 멀티플렉스 분석이 제한적이라는 단점을 가지고 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적이고 경제적인 miRNA를 포함하는 작은 크기의 RNA 분자 검출용 키트 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고 dT로 구성되는 poly A 꼬리와 혼성화하는 제1혼성화 올리고뉴클레오티드 구성된 역전사용 프라이머; 상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 및 검출 대상으로부터 수득된 시료 내의 RNA를 poly A 폴리머라제로 반응시켜 poly A 꼬리가 연결된 poly A 꼬리연결 RNA 분자 중 상기 증폭대상 RNA 분자로부터 역전사된 cDNA의 올리고 dT 부분을 제외한 3'-말단 부분과 특이적으로 혼성화 가능한 제2혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머; 및 상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 포함하는 상기 증폭대상 RNA 분자 검출용 키트가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭대상 RNA 분자의 3'-말단의 5 내지 9 nt의 핵산으로 구성된 3'-말단 부분과 혼성화하는 핵산서열로 구성되는 역전사용 리버스 프라이머; 상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 상기 증폭대상 RNA 분자의 3'-말단 부분에 상응하는 부분을 제외한 상기 증폭대상 RNA 분자로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머; 및 상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 포함하는 상기 증폭대상 RNA의 검출용 키트가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 폴리 A 폴리머라아제를 이용하여 검출 대상으로부터 분리된 시료 내의 RNA 분자에 poly A 꼬리를 연결하는 poly A 꼬리연결 RNA 분자 제조단계;

상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 poly A 꼬리연결 RNA 분자의 poly A 꼬리와 특이적으로 혼성화하는 poly dT로 구성된 제1혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머로 역전사하는 역전사반응단계; 및

상기 역전사반응 산물의 전부 또는 일부를 상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 poly A 꼬리연결 RNA 분자 중 상기 증폭대상 RNA 분자로부터 역전사된 cDNA의 올리고 dT 부분과 특이적으로 혼성화 가능한 제2혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머, 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머 및 열안정성 DNA 중합효소를 포함하는 프라이머 연장 및 PCR 반응용 용기로 옮긴 후, 프라이머 연장 및 PCR 반응을 동시에 수행하는 PCR 반응단계를 포함하는 증폭대상 RNA 분자의 검출방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 증폭대상 RNA 분자를 상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭대상 RNA 분자의 3'-말단의 5 내지 9 nt의 핵산과 혼성화 가능한 제1혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 리버스 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 역전사하는 역전사반응단계; 및

상기 역전사반응 산물의 전부 또는 일부를 상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 상기 증폭대상 RNA 분자의 3'-말단에 상응하는 부분을 제외한 상기 증폭대상 RNA 분자로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머, 상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머 및 열안정 DNA 중합효소를 포함하는 프라이머 연장 및 PCR 반응용 용기로 옮긴 후 프라이머 연장 반응 및 PCR 반응을 동시에 수행하는 PCR 반응 단계를 포함하는, 증폭대상 RNA 분자의 검출방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 특정 miRNA를 고가의 장비 없이도 정확하고 신속하게 검출하는 것이 가능하며, 복수의 miRNA를 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스 분석 역시 가능하다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출용 키트 및 방법은 암을 비롯한 각종 질병의 진단 및 예후 판정 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리 A 폴리머라아제를 이용한 miRNA 검출방법을 개략적으로 나타낸 개요도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 특이적 역전사용 프라이머를 이용한 miRNA 검출방법을 개략적으로 나타낸 개요도이다.
도 3 내지 도 10은 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 poly A polymerase 및 oligo dT 프라이머를 이용한 miRNA 검출 키트 및 방법에 의해 miR-532, miR-196b, miR-362, miR-29c, miR-106b, miR-200c, miR-127 및 miR-145를 증폭한 결과를 나타낸다. 각각의 도에 있어서 상단은 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타내고, 중단은 온도에 따른 형광방출 속도의 변화를 나타내는 그래프이고, 하단의 왼쪽 표는 샘플의 종류 및 형광검출 기준값 및 녹는점을 나타내며, 하단의 오른쪽은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.
도 11 내지 도 18은 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 특이적 역전사용 프라이머를 이용한 miRNA 검출키트 및 방법에 의해 miR-532, miR-196b, miR-362, miR-29c, miR-106b, miR-200c, miR-127 및 miR-145를 증폭한 결과를 나타낸다. 각각의 도에 있어서 왼쪽 상단은 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타내고, 왼쪽중단은 온도에 따른 형광방출 속도의 변화를 나타내는 그래프이고, 왼쪽하단의 왼쪽 표는 샘플의 종류 및 형광검출 기준값 및 녹는점을 나타내며, 오른쪽은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.
도 19 내지 도 26은 비교예로서 각각 Qiagen사의 miRNA 검출키트를 이용하여 miR-532, miR-196b, miR-362, miR-29c, miR-106b, miR-200c, miR-127 및 miR-145를 증폭한 결과를 나타낸다. 각각의 도에 있어서 상단은 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타내고, 중단은 온도에 따른 형광방출 속도의 변화를 나타내는 그래프이고, 하단의 왼쪽 표는 샘플의 종류 및 형광검출 기준값 및 녹는점을 나타내며, 하단의 오른쪽은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출 키트와 시중에서 판매되는 miRNA 키트(Qiagen사 제품)을 이용한 miRNA let-7e에 대한 실시간 PCR 증폭 결과를 나타내는 그래프이다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출 키트와 시중에서 판매되는 miRNA 키트(Qiagen사 제품)을 이용한 miRNA has-let-7e에 대한 실시간 PCR 증폭 결과물에 대한 시퀀싱 결과를 나타내는 도면이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출 키트로 순차적으로 희석된 miRNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 수행한 결과 주형의 copy 수와 검출한계(Cq) 사이클 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출키트로 CAL27 세포 및 HSC3 세포에서의 miR-200의 세 서브타입인 miR-200a, miR-200b 및 miR-200c의 발현정도를 정량적으로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출 키트에서 역전사용 프라이머를 제2단계 반응인 프라이머 연장 및 실시간 PCR 반응시 첨가 여부에 따른 실시간 PCR 결과를 나타내는 그래프이다.

용어의 정의:

이하 본 문서에서 사용되는 용어를 정의한다:

본 문서에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 핵산을 구성하는 단위체 분자로 염기, 오탄당 및 인산으로 구성되어 있으며, 상기 염기는 DNA의 경우 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 시토신(cytosine), 및 티민(thymine)의 네 가지가 존재하고, RNA의 경우에는 상기 티민 대신 우라실(uracil)이 사용된다. 상기 오탄당은 DNA의 경우 2'-디옥시리보스(2'-deoxyribose), RNA의 경우 리보스(ribose)가 사용된다.

본 문서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 상기 뉴클레오티드 단위체 분자의 중합체로서 일반적으로 13 내지 25개까지의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 단일쇄 핵산 사슬을 의미하는데, 경우에 따라서는 6-mer, 7-mer, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer 및 12-mer 등 13개 미만의 뉴클레오티드로 구성되거나 25개 초과의 뉴클레오티드로 구성된 핵산 사슬을 지칭할 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 통상적으로 상기 올리고뉴클레오티드 보다 더 긴 뉴클레오티드 단위체의 중합체 사슬을 의미하나, 상기 올리고뉴클레오티드와 혼용되어 사용되기도 한다. 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥 핵산사슬 모두를 포함한다.

본 문서에서 사용되는 용어 "RNA 분자"는 유전자의 암호화, 탈암호화, 조절 및 발현에 있어서 다양한 역할을 수행하는 다량체성 분자로서, 단일가닥을 형성하고 구성단위인 핵산의 구성성분 중 5탄당인 리보오스의 2'-탄소에 히드록시기가 부착되어 있고, 염기에 티민(thymine) 대신 우라실(uracil)이 포함된다는 점에서 통상적으로 이중가닥으로 구성되는 DNA와 구분된다. RNA 분자에는 단백질을 암호화하는 mRNA, 리보좀의 구성 성분인 rDNA, 단백질의 번역에 관여하는 tRNA, 진핵세포의 세포핵의 스플라이싱 반점(splicing speckle) 및 카잘체(Cajal bodies) 내에서 발견되는 작은 RNA 분자로서 주로 전구성 전령 RNA(hnRNA)를 가공하는 역할을 수행하는 snRNA(small nuclear RNA), rRNA, tRNA, 상기 snRNA와 같은 다른 RNA의 수식을 가이드하는 역할을 수행하는 snoRNA(small nucleolar RNA), 특정 유전자의 발현을 억제하기 위해 합성된 인공 RNA 분자인 siRNA(small interfering RNA), 세포 밖으로 분비되는 엑소좀(exosome) 내에 존재하는 exRNA(extracellular RNA 또는 exosomal RNA), 레트로트랜스포존(retrotransposon) 및 생식계열 세포에서의 다른 유전학적 인자의 후생유전적(epigenetic) 및 전사후 유전자 침묵과 연관된 piwi 단백질과 상호작용하여 RNA-단백질 복합체를 형성하는 piRNA 및 특정 유전자의 발현을 조절하는 기능을 담당하는 약 22 nt로 구성된 작은 RNA 분자인 microRNA(또는 miRNA)를 포함한다.

본 문서에서 사용되는 "증폭대상 RNA 분자"는 검출 대상으로부터 수득된 시료 내에 존재하는 다양한 RNA 분자 중 PCR 반응에 의해 증폭하고자 하는 검출 대상이 되는 RNA 분자를 의미한다. 이러한 증폭대상 RNA 분자는 그 증폭 및 검출에 의해 특정 질환의 유무 및 정도, 특정 치료제에 대한 감수성 또는 내성의 여부를 판정하는 표지인자로 사용될 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "센스 가닥"은 이중가닥 DNA 분자 중 유전자의 코드의 진행방향과 동일한 방향의 단일가닥 핵산분자를 의미하고, "안티센스 가닥"은 상기 센스 가닥과 상보결합을 하는 다른 단일가닥 핵산분자를 의미하나, 유전자의 코드 진행방향과 무관하게, 최초로 핵산서열이 규명된 가닥을 "센스 가닥"으로 정의하고 그의 상보가닥을 "안티센스 가닥"으로 정의하는 것도 무방하다.

본 문서에서 사용되는 용어 "PCR(polymerase chain reaction)" 또는 "핵산증폭반응"은 열안정성 DNA 중합효소를 이용하여 특정 표적 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. PCR에는 DNA 중합효소 외에 표적 핵산 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 프라이머(포워드 프라이머, 리버스 프라이머), 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture), Mg²⁺ 등의 2가 이온을 포함하는 반응 완충액 등이 사용된다. 상기 PCR 반응에 의해 생성된 DNA 분자를 본 문서에서는 "증폭산물"이라고 지칭하였다.

본 문서에서 사용되는 용어 "프라이머 연장반응(primer extension)"은 DNA 중합효소가 제한된 길이의 주형 핵산에 상보적으로 혼성화된 프라이머를 연장시켜 상기 주형 핵산의 5'-말단에서 종료가 되는 비연쇄반응을 의미한다. 상기 프라이머 연장반응에 의해 생성된 DNA 분자를 본 문서에서는 "연장산물"이라고 지칭하였다.

본 문서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 PCR 반응 또는 프라이머 연장반응(primer extension) 반응의 개시를 위해 사용되는, 주형 핵산분자에 상보적으로 혼성화는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. PCR 반응을 위한 프라이머는 증폭되는 핵산분자의 유전자 코드 진행방향과 동일한 센스 가닥으로부터 선택되는 포워드 프라이머(또는 센스 프라이머) 및 상기 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥으로부터 선택되는 리버스 프라이머(또는 안티센스 프라이머)의 쌍이 사용되고, 프라이머 연장반응의 경우 통상적으로 단일한 연장용 프라이머가 사용된다.

본 문서에서 사용되는 용어 "어댑터(adaptor)"는 특정 RNA를 특이적으로 구분하기 위해 RNA에 상응하는 센스 DNA의 5'-말단에 부가되는 올리고뉴클레오티드 또는 RNA의 역전사를 위한 역전사용 프라이머의 5'-말단에 부가되는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이 경우 이들 어댑터는 연장된 cDNA를 증폭하는데 사용되는 프라이머 서열로 사용될 수 있고, 후자의 경우 RNA와 혼성화 가능한 핵산서열로만 프라이머를 구성할 경우 낮은 Tm 값을 보정할 목적으로 사용될 수 있다. 상기 어댑터는 증폭 대상 주형핵산과 연장용 올리고뉴클레오티드를 제외한 다른 프라이머와 상동성이 존재하지 아니하여 비특이적 증폭반응을 최소화하도록 고안될 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "혼성화 올리고뉴클레오티드"는 증폭대상 RNA 분자 또는 상기 증폭대상 RNA 분자로부터 역전사된 cDNA와 상보결합에 의해 혼성화가능한 핵산분자를 의미한다.

본 문서에서 사용되는 용어 "유니버셜 프라이머"는 증폭하고자 하는 대상 핵산분자의 종류에 무관하게 증폭이 가능한 프라이머로서 역전사 및 프라이머 연장 반응에 의해 추가된 어댑터 올리고뉴클레오티드의 핵산서열을 이용하여 제조가 가능하다. 이 경우 단일한 프라이머 세트를 활용함으로써 키트의 제조원가를 낮출 수 있는 장점이 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "포워드 프라이머"는 해당 프라이머의 방향(5' -> 3')이 유전자의 방향과 일치하는 경우의 프라이머를 의미한다. 반대로 "리버스 프라이머"는 해당 프라이머의 방향이 유전자의 방향과 반대로 되는 프라이머를 의미한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 일 관점에 따르면, 증폭대상 RNA 분자와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고 dT로 구성되는 poly A 꼬리와 혼성화하는 제1혼성화 올리고뉴클레오티드 구성된 역전사용 프라이머; 상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 및 검출 대상으로부터 수득된 시료 내의 RNA를 poly A 폴리머라제로 반응시켜 poly A 꼬리가 연결된 poly A 꼬리연결 RNA 분자 중 상기 증폭대상 RNA 분자로부터 역전사된 cDNA의 oligo dT 부분을 제외한 3'-말단 부분과 특이적으로 혼성화 가능한 제2혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머; 및 상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 포함하는 상기 증폭대상 RNA 분자 검출용 키트가 제공된다.

상기 키트에 있어서, 상기 증폭대상 RNA 분자는 길이 18 내지 180 nt, 20 내지 90 nt, 20 내지 70 nt, 20 내지 50 nt, 또는 20 내지 30 nt로 구성된 작은 크기의 RNA 분자일 수 있고, tRNA, snRNA, siRNA, exRNAs, piRNA, scaRNA 또는 miRNA일 수 있다.

상기 키트에 있어서, 상기 시료는 상피, 모발, 생검(biopsy), 부검(autopsy), 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 대변, 땀, 가래, 콧물, 또는 눈물일 수 있다.

상기 키트는 상기 제1어댑터 올리고뉴클테오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 리버스 프라이머는 증폭대상 RNA 분자의 종류에 무관하게 동일한 핵산서열로 구성되는 유니버셜 리버스 프라이머일 수 있다. 그러나, 바람직한 실시태양에서는 상기 추가적인 리버스 프라이머가 포함되지 않으며, 이 경우 역전사 반응에 사용되었던 역전사용 프라이머가 PCR 반응에서의 리버스 프라이머 역할까지 겸하게 되며, PCR 반응시 상기 역전사용 프라이머를 추가하지 않더라도 역전사 반응물 내에 포함되어 있던 상기 역전사용 프라이머가 PCR 반응에도 그대로 사용될 수 있다.

상기 키트에 있어서, 상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드는 증폭대상 RNA 분자 종류에 따른 증폭대상 RNA 표식(tagging) 올리고뉴클레오티드 또는 상기 증폭대상 RNA 표식 올리고뉴클레오티드 및 증폭대상 RNA 종류와 무관한 공통의 핵산서열로 구성되는 공통 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 상기 포워드 프라이머는 상기 공통 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는 유니버셜 포워드 프라이머일 수 있다.

상기 키트에 있어서, 상기 제1어댑터 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50 nt, 20 내지 40 nt, 또는 20 내지 30 nt로 구성될 수 있다.

상기 키트에 있어서, 상기 제2혼성화 올리고뉴클레오티드는 12 내지 16 nt, 13 내지 16 nt, 또는 14 내지 16 nt로 구성될 수 있으며 상기 역전사용 프라이머와 혼성화하지 않는다.

상기 키트에 있어서, 상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50 nt, 18 내지 40 nt, 18 내지 35 nt, 18 내지 30 nt 또는 18 내지 25 nt로 구성될 수 있고, 증폭대상 RNA의 종류에 따라 길이를 달리할 수 있다. 이 경우 2 이상의 증폭대상 RNA를 하나의 반응에 의해 다중으로(multiplex) 검출하는 것이 가능하다.

상기 키트는 상기 제1어댑터 올리고뉴클테오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 리버스 프라이머는 증복대상 RNA 분자의 종류에 무관하게 동일한 핵산서열로 구성되는 유니버셜 리버스 프라이머일 수 있다. 그러나, 바람직한 실시태양에서는 상기 추가적인 리버스 프라이머가 포함되지 않으며, 이 경우 역전사 반응에 사용되었던 역전사용 프라이머가 PCR 반응에서의 리버스 프라이머 역할까지 겸하게 되며, PCR 반응시 상기 역전사용 프라이머를 추가하지 않더라도 역전사 반응물 내에 포함되어 있던 상기 역전사용 프라이머가 PCR 반응에도 그대로 사용될 수 있다.

상기 키트에 있어서, 상기 제1혼성화 올리고뉴클레오티드는 6 내지 8 nt로 구성될 수 있고, 더욱 바람직하게는 6 내지 7 nt로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 6 nt로 구성될 수 있다.

상기 역전사반응 산물의 전부 또는 일부를 상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 poly A 꼬리연결 RNA 분자 중 상기 증폭대상 RNA 분자로부터 역전사된 cDNA의 올리고 dT 부분을 제외한 3'-말단 부분과 특이적으로 혼성화 가능한 제2혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머, 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머 및 열안정성 DNA 중합효소를 포함하는 프라이머 연장 및 PCR 반응용 용기로 옮긴 후, 프라이머 연장 및 PCR 반응을 동시에 수행하는 PCR 반응단계를 포함하는 증폭대상 RNA 분자의 검출방법이 제공된다.

상기 검출방법에 있어서, 상기 증폭대상 RNA 분자는 길이 18 내지 180 nt, 20 내지 90 nt, 20 내지 70 nt, 20 내지 50 nt, 또는 20 내지 30 nt로 구성된 작은 크기의 RNA 분자일 수 있고, tRNA, snRNA, siRNA, exRNAs, piRNA, scaRNA 또는 miRNA일 수 있다.

상기 검출방법에 있어서, 상기 시료는 상피, 모발, 생검(biopsy), 부검(autopsy), 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 대변, 땀, 가래, 콧물, 또는 눈물일 수 있다.

상기 검출방법에 있어서, 상기 PCR 반응단계에서 상기 제1어댑터 올리고뉴클테오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머가 추가로 사용될 수 있고, 상기 리버스 프라이머는 상기 증폭대상 RNA 분자의 종류에 무관하게 동일한 핵산서열로 구성되는 유니버셜 리버스 프라이머일 수 있다. 그러나, 바람직한 실시태양에서는 상기 추가적인 리버스 프라이머가 포함되지 않으며, 이 경우 역전사 반응에 사용되었던 역전사용 프라이머가 PCR 반응에서의 리버스 프라이머 역할까지 겸하게 되며, 상기 PCR 반응단계에서 상기 역전사용 프라이머를 추가하지 않더라도 역전사 반응물 내에 포함되어 있던 상기 역전사용 프라이머가 상기 PCR 반응 단계에서도 그대로 사용될 수 있다. 본 발명자들은 상기 PCR 반응단계에서 상기 역전사용 프라이머를 추가적으로 첨가할 경우, 비특이적인 밴드가 나타나는 등 바람직하지 않은 결과가 도출되고, 오히려 상기 역전사용 프라이머를 추가하지 않을 경우 보다 바람직한 결과가 도출됨을 확인하였다.

상기 검출방법에 있어서, 상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드는 증폭대상 RNA 분자 종류에 따른 증폭대상 RNA 표식(tagging) 올리고뉴클레오티드 또는 상기 증폭대상 RNA 표식 올리고뉴클레오티드 및 증폭대상 RNA 종류와 무관한 공통의 핵산서열로 구성되는 공통 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 상기 포워드 프라이머는 상기 공통 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는 유니버셜 포워드 프라이머일 수 있다.

상기 검출방법에 있어서, 상기 제1어댑터 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50 nt, 20 내지 40 nt, 또는 20 내지 30 nt로 구성될 수 있다.

상기 검출방법에 있어서, 상기 제2혼성화 올리고뉴클레오티드는 12 내지 16 nt, 13 내지 16 nt, 또는 14 내지 16 nt로 구성될 수 있으며 상기 역전사용 프라이머와 혼성화하지 않는다.

상기 검출방법에 있어서, 상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50 nt, 18 내지 40 nt, 18 내지 35 nt, 18 내지 30 nt 또는 18 내지 25 nt로 구성될 수 있고, 증폭대상 RNA의 종류에 따라 길이를 달리할 수 있다. 이 경우 2 이상의 증폭대상 RNA를 하나의 반응에 의해 다중으로(multiplex) 검출하는 것이 가능하다.

상기 검출방법에 있어서, 상기 제1혼성화 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 6 내지 8 nt로 구성될 수 있고, 더욱 바람직하게는 6 내지 7 nt로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 6 nt로 구성될 수 있다.

본 발명에서 특별히 언급되지 않은 한, 복수의 올리고뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드로 구성된 핵산분자는 5'-말단에서 3'-말단의 순서로 설명된다.

이하 본 발명의 일 실시예에 따른 키트 및 방법을 첨부된 도면을 통해 보다 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 poly A 폴리머라아제를 이용한 작은 크기의 RNA 검출방법을 개략적으로 나타낸 개요도이다. 도 1에 도시된 바와 같이, RNA 분자(101)는 miRNA와 같이 20 내지 30 nt 정도의 매우 짧은 핵산분자를 예시적으로 도시하였다. miRNA(101)는 mRNA와는 달리 폴리 A 꼬리가 없기 때문에, miRNA(101)가 포함된 시료에 폴리 A 폴리머라제와 ATP를 혼합하여 반응을 시키면, miRNA(101)에 폴리 A 꼬리(102)가 부착되어 폴리 A 꼬리화 miRNA가 생성된다(제1반응). 여기에 증폭대상 RNA 분자와 혼성화되지 않는 핵산서열로 구성된 제1어댑터 올리고뉴클레오티드(104) 및 제1혼성화 올리고뉴클레오티드(103)인 poly dT로 구성된 역전사용 프라이머(105)을 혼합하면 폴리 A 꼬리(102)와 제1혼성화 올리고뉴클레오티드(103)가 상보결합을 하게 되고, 여기에 역전사효소와 dNTP 혼합물을 첨가하여 역전사반응을 수행하면, 제1어댑터 올리고뉴클레오티드-제1 혼성화 올리고뉴클레오티드(103)-안티센스 가닥 cDNA(111)로 구성된 표적 miRNA의 역전사 산물(110)이 생성된다(제2반응). 상기 역전사 산물(110)의 전부 또는 일부를 제2반응용기로 옮긴 후 여기에 안티센스 가닥 cDNA에 상보적인 서열을 갖는 제2혼성화 올리고뉴클레오티드(122)를 3'-말단으로 갖고 miRNA(101) 및 안티센스 cDNA(111)와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제2어댑터 올리고뉴클레오티드(121)를 5'-말단으로 갖는 연장용 프라이머(120)와 혼성화시킨 후, DNA 중합효소로 프라이머 연장반응을 수행하면, 연장된 이중가닥 cDNA(140)가 생성된다. 연장된 이중가닥 cDNA(140)를 주형으로 제1어댑터 올리고뉴클레오티드와 동일한 핵산서열을 갖는 리버스 프라이머(131)와 제2어댑터 올리고뉴클레오티드의 5'-말단의 핵산서열을 갖는 포워드 프라이머(132)로 PCR 반응을 수행하면 연장된 이중가닥 cDNA(140) 지수적으로 증폭되게 된다(제3반응). 상기 프라이머 연장반응(제2반응)과 PCR 반응(제3반응)은 순차적으로 수행되지 않고, 하나의 반응로 수행될 수 있다. 아울러, 이 경우 리버스 프라이머(131) 대신 상기 제2반응에 사용된 역전사용 프라이머(105)가 리버스 프라이머(132)로 사용될 수 있고, 이 경우 제3반응에서 별도로 역전사용 프라이머(105)를 추가하는 것보다 제2반응 산물의 일부 또는 전부를 프라이머 연장 및 PCR 반응용 용기에 옮기는 과정에서 제2반응 산물에 포함되어 있던 역전사용 프라이머(105)가 제3반응에서 재활용될 수 있다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 특이적 포워드 프라이머를 이용한 짧은 크기의 RNA 검출방법를 개략적으로 나타낸 개요도이다. 도 5에 도시된 바와 같이, RNA(101)의 3'-말단의 5-7 nt 바람직하게는 6 nt의 부분과 특이적으로 상보결합할 수 있는 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드(134)를 3'-말단으로 하고 이와 연결되어 있으며, 표적 RNA와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제1어댑터 올리고뉴클레오티드(135)를 5'-말단으로 함으로써 구성된 RNA 특이적 리버스 프라이머(136)가 혼성된 후, 역전사효소에 의해 역전사 반응이 일어나면 안티센스 가닥 cDNA(137)이가 생성된다(제1반응). 안티센스 가닥 cDNA(137)에 상술한 6 nt를 제외한 RNA 부분(즉, 16 nt 정도)과 특이적으로 상보결합할 수 있는 제2혼성화 올리고뉴클레오티드(138)를 3'-말단으로 하고 이에 연결된 임의의 올리고뉴클레오티드로서 안티센스 가닥 cDNA(137)나 RNA(101) 모두에 대하여 상보결합하지 않는 제2어댑터 올리고뉴클레오티드(142)를 5'-말단으로 포함하는 연장용 프라이머(143)로 연장반응을 수행하면, 양방향으로 연장이 이루어져, RNA 특이적 프라이머(136) 부분 및 제2어댑터 올리고뉴클레오티드(142) 부분의 상보적인 가닥을 포함한 연장 산물이 생성된다. 이때, 제2어댑터 올리고뉴클레오티드(142)는 모든 RNA 검출 키트에서 공통으로 사용되는 유니버셜 포워드 프라이머 부분인 5'-영역(141)을 5'-말단에 포함하고 있고, 그 외의 부분인 3'-영역(139)은 RNA 종류에 따라 서열 및/또는 길이를 달리함으로써 multiplex 분석시 동시에 다양한 RNA를 검출할 수 있게 한다. 연장반응이 완료되면 동일 튜브에서 RNA 특이적 프라이머(136)와 5'-영역(141)에 상응하는 리버스 프라이머(144)를 이용한 PCR을 통해 PCR 산물(145)이 생성된다. 상기 리버스 프라이머(144)의 경우 제2어댑터 올리고뉴클레오티드의 5'-말단의 핵산서열로부터 선택되는데, 상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 서열을 RNA의 종류와 무관하게 동일한 서열로 고안할 경우, 유니버셜 리버스 프라이머가 되게 된다. 상기 리버스 프라이머(144)는 역전사 반응에서 사용된 역전사용 프라이머가 그대로 사용될 수 있으며, 이 경우 제2단계 반응에서 추가로 상기 역전사용 프라이머를 첨가할 수도 있고, 추가적인 첨가 없이 제1단계 반응물에 포함되어 있었던 역전사용 프라이머를 제2단계 반응에서 그대로 활용할 수도 있다. PCR 산물(145)은 실시간 PCR에 의해 반응과정에서 검출될 수 있고, 반응이 완결된 후, 아가로즈 겔 전기영동 등에 의해 확인이 가능하다.

이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

실시예 : 본 발명의 키트에 의한 RNA의 검출

본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른, miRNA에 poly A를 연결한 후 oligo dT 프라이머를 이용한 역전사하고, 역전사된 cDNA를 포함한 역전사 산물에 대하여 miRNA 특이적 서열을 포함한 연장용 프라이머를 이용한 양방향 연장반응과 동시에 실시간 PCR을 수행함으로써 이용하여 다양한 miRNA를 검출하였다. 아울러, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른, oligo dT 프라이머 사용 없이, miRNA의 3'-말단의 특이적인 6 nt의 핵산서열을 5'-말단으로 갖는 miRNA 특이적 포워드 프라이머와 상기 6 nt의 핵산서열 외의 miRNA 특이적 서열을 갖는 연장용 프라이머를 이용하여 다양한 miRNA를 검출하였다. 검출하고자 한 miRNA는 하기와 표 1과 같다.

폴리 A 폴리머라아제를 사용한 방법의 경우, 42℃에서 60분간 poly A 꼬리연결 및 역전사 반응을 수행한 후, 70℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시켰고, 프라이머 연장반응 및 PCR은 95℃에서 15분간 DNA를 녹인 후, 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 70℃에서 30초를 40 사이클 돌린 후, 녹는점곡선(melting curve)은 95℃ 10초 가열 후 65℃에서 95℃까지 5초당 0.5℃씩 상승하게 함으로써 측정하였다.

miRNA 특이적 프라이머를 사용한 방법의 경우, 42℃에서 60분간 역전사 반응을 수행한 후, 70℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시켰고, 프라이머 연장반응 및 PCR은 95℃에서 15분간 DNA를 녹인 후, 95℃에서 10초, 60℃에서 40초를 40 사이클 돌린 후, 녹는점곡선(melting curve)은 95℃ 10초 가열 후 65℃에서 95℃까지 5초당 0.5℃씩 상승하게 함으로써 측정하였다.

아울러, 역전사 반응과 실시간 PCR 반응에 각각 사용한 시약들의 사용량은 표 2 및 3과 같다.

PCR 반응은 BIO-RAD사의 실시간 PCR 장치를 이용하여 수행하였으며, 실제 PCR 반응이 제대로 이루어졌는지 확인하기 위하여, 1.5% 아가로즈 겔 전기영동을 통해 밴드패턴을 확인하였다.

본 발명의 실시예들

실시예	증폭 대상 miRNA	폴리 A 폴리머라아제 사용 여부	역전사용 프라이머 (서열번호)	연장용 프라이머 (서열번호)	포워드 프라이머	리버스 프라이머
1	miR-532	Y	1	10	18	19
2	miR-196b	Y		11
3	miR-362	Y		12
4	miR-29c	Y		13
5	miR-106b	Y		14
6	miR-200c	Y		15
7	miR-127	Y		16
8	miR-145	Y		17
9	miR-532	N	2	10		2
10	miR-196b	N	3	11		3
11	miR-362	N	4	12		4
12	miR-29c	N	5	13		5
13	miR-106b	N	6	14		6
14	miR-200c	N	7	15		7
15	miR-127	N	8	16		8
16	miR-145	N	9	17		9

역전사 반응 시약 사용량

시료	부피	최종 농도
2X 반응 완충액	10 μl
역전사 효소(AddScript)	1 μl	1 U
dNTP mix (10 mM)	2 μl	1 mM
역전사용 프라이머 (80 μM)	1 μl	4 μM
주형 (A549 세포의 total RNA, 1 μg/μl)	1 μl	1 μg
증류수	5 μl
총 부피	20 μl

실시간 PCR 반응 시약 사용량

시료	부피	최종 농도
2X SYBR Green PCR Master Mix	10 μl	1X
연장용 프라이머 (200 nM)	1 μl	10 nM
포워드 프라이머 (2 μM)	1 μl	100 nM
역전사 반응물	1 μl
증류수	7 μl
총 부피	20 μl

비교예 :

본 발명자들은 비교예로 Qiagen 사에서 판매되는 miRNA 검출키트를 사용하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 검출 키트와 성능을 비교하였다.

비교예

비교예	증폭 대상 miRNA	검출방식
1	miR-532	앵커 올리고 dT 어댑터 사용
2	miR-196b	앵커 올리고 dT 어댑터 사용
3	miR-362	앵커 올리고 dT 어댑터 사용
4	miR-29c	앵커 올리고 dT 어댑터 사용
5	miR-106b	앵커 올리고 dT 어댑터 사용
6	miR-200c	앵커 올리고 dT 어댑터 사용
7	miR-127	앵커 올리고 dT 어댑터 사용
8	miR-145	앵커 올리고 dT 어댑터 사용

상술한 분석 결과, 도 3 내지 26에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 검출 키트 및 방법에 따르면(도 3 내지 18), Qiagen사의 상용 miRNA 검출키트(도 19 내지 26)보다 더 선명하고 정확한 miRNA 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.

실험예 1: 증폭된 PCR 산물의 염기서열 결정

본 발명자들은 상기 실시예의 방법 중 poly A 폴리머라제를 사용하지 않는 방법 및 비교예로 Qiagen사에서 판매하고 있는 miRNA 검출키트를 사용하여, A549 세포에 대하여 miRNA hsa let-7e를 증폭하였으며, 증폭된 PCR 산물에 대한 염기서열을 결정하였다.

구체적으로 서열번호 20으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 역전사용 프라이머로, 서열번호 21로 기재되는 핵산서열로 구성되는 연장용 프라이머 및 서열번호 22로 기재되는 포워드 프라이머를 사용하였으며, 역전사 조건 및 실시간 PCR 조건은 상기 실시예들과 동일하게 설정하였다.

그 결과, 도 27에 도시된 바와 같이 비교예인 Qiagen 사의 키트를 이용한 실시간 PCR 키트 사용에는 음성대조군에서 비특이적인 증폭 산물이 관찰된 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출키트의 경우 비특이적인 증폭이 전혀 나타나지 않았다. 아울러, 증폭된 PCR 산물에 대하여 시퀀싱을 수행한 결과, 도 28에 도시된 바와 같이, Qiagen사의 miRNA 검출키트로 증폭된 증폭산물은 염기서열을 제대로 확인할 수 없어 표적 miRNA를 제대로 증폭한 것인지 확인하기 어려웠으나, 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 검출키트의 경우 염기서열을 정확하게 결정할 수 있었다.

실험예 2: 증폭된 PCR 산물의 검량곡선 확인

이어 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 검출 키트를 이용하여 시료 내에 포함된 miRNA의 수준을 정확하게 정량할 수 있는지 확인하기 위해 순차 희석한 미리 결정된 농도의 miRNA 샘플을 대상으로 실시간 PCR 반응을 수행한후, 검출 한계 사이클(Cq)를 측정하였다.

구체적으로 표적 miRNA는 miR-145를 사용하였으며, 역전사 및 PCR 조건은 상기 실시예 16에 기재된 조건을 그대로 사용하였다.

그 결과 도 29에 나타난 바와 같이, 매우 낮은 농도부터 Cq 값이 정확한 지수관계를 나타내는 것으로 확인되었으며, miRNA의 카피수의 로그값과 Cq와의 상관관계는 R2값이 0.9979에 이를 정도로 매우 높게 나타났다. 따라서, 상기 결과로부터 본원발명의 키트 및 방법은 miRNA의 검출은 물론 정확한 정량을 위해서도 사용이 가능함을 확인할 수 있었다.

실험예 3: miRNA의 서브타입 구분

miRNA의 경우 개체 또는 세포에 따라 동일한 miRNA라도 약간 서열이 상이한 서브타입의 차이를 보인다. 이에, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출 키트가 miRNA의 서브타입을 구분할 수 있는지 조사하였다.

구체적으로, CAL27 세포(ATCC CRL-2095), 및 HSC-3 세포로부터 총 RNA를 Trizol 시약으로 분리한 후, miR-200a, miR-200b 및 miR-200c의 3'-말단 6 nt와 각각 상보결합하는 3'-말단의 제1혼성화 올리고뉴클레오티드 및 5'-말단의 제1어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머(서열번호 23 내지 25)를 이용하여 42℃에서 60분간 역전사 반응을 수행하였다. 그런 다음 상기 역전사 반응 산물 1 μl를 상기 표 3에 기재된 실시간 PCR 반응액이 담긴 용기로 옮긴 후 70℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시켰고, BioRad CFX96 Toch Real-Time PCR 기기를 이용한 프라이머 연장반응 및 PCR은 있는 결과를 도출할 수 있음을 입증하는 것이다.

실험예 4: 실시간 PCR 반응시 역전사 프라이머의 추가 유무에 따른 결과

본 발명자들은 프라이머 연장 및 실시간 PCR 반응을 구분하여 수행하지 않고 단일 단계로 수행하는 것을 본 발명의 핵심적 기술적 특징으로 삼았다. 실시간 PCR 반응을 위한 프라이머쌍으로는 연장용 프라이머의 5'-말단의 고유의 핵산서열을 이용한 포워드 프라이머와 역전사 반응시 사용된 역전사용 프라이머를 리버스 프라이머로 사용하였다. 그런데 상기 리버스 프라이머는 이미 1단계 역전사 반응에 사용되었고, 2단계 프라이머 연장 및 실시간 PCR 반응에 참가된 1단계 역전사 반응물 내에 포함되어 있기 때문에, 2단계 프라이머 연장 및 실시간 PCR 반응에 리버스 프라이머를 별도로 추가하지 않더라도 2단계 반응이 정상적으로 수행될 것이라고 판단하였다. 이에, 역전사용 프라이머를 추가하지 않는 경우와 2단계 반응에서 역전사용 프라이머를 추가로 첨가하는 경우 두 가지 조건이 실시간 PCR 반응에 미치는 영향을 조사하였다.

구체적으로 증폭 대상 RNA로는 miR-16을 사용하였고, 세포로는 A549 폐암 세포주를 사용하였으며, 역전사용 프라이머를 추가로 첨가하지 않는 경우에는 상기 표 2 및 3에 기재된 조건을 사용하여 역전사 반응 및 프라이머 연장 및 실시간 PCR 반응을 수행하였으며, 역전사용 프라이머를 추가로 첨가하는 경우에는 역전사용 프라이머(2 μM) 1 μl를 추가적으로 첨가하고 해당 부피만큼 증류수를 적게 첨가하는 조건으로 제2단계 반응을 수행하였다. 역전사용 프라이머로는 서열번호 29으로 기재되는 핵산서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 사용하였고, 프라이머 연장 및 실시간 PCR 반응을 위한 miR-16 특이적 연장 프라이머로는 서열번호 30로 기재되는 핵산서열로 구성된 올리고뉴클레오티드, 그리고 포워드 프라이머로는 서열번호 22로 기재되는 핵산서열로 구성된 유니버셜 포워드 프라이머를 사용하였다. 역전사 반응 단계 및 프라이머 연장 및 실시간 PCR 반응 단계의 조건은 상기 실험예 2와 동일하였다.

그 결과, 도 31에 나타난 바와 같이, 제2단계 반응에서 역전사용 프라이머를 추가한 경우에는 음성대조군에서도 비특이적인 반응산물이 산출되는 것으로 나타난 반면, 역전사용 프라이머를 추가하지 않은 경우에는 그러한 비특이적 반응산물이 전혀 검출되지 않았다. 따라서, 오히려 제2단계 반응시 역전사용 프라이머를 추가로 넣지 않는 것이 보다 바람직한 결과를 도출할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구 범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

101: 증폭 대상 RNA 분자
110: 폴리 A 꼬리화 RNA
102: 폴리 A 꼬리
103: 제1혼성화 올리고뉴클레오티드(폴리(dT))
104: 제1어댑터 올리고뉴클레오티드
105: 역전사용 프라이머
110: 역전사 산물
111: 안티센스가닥 cDNA
120: 연장용 프라이머
121: 제2어댑터 올리고뉴클레오티드
122: 제2혼성화 올리고뉴클레오티드
131: 리버스 프라이머
132: 포워드 프라이머
134: RNA 특이적 제2혼성화 올리고뉴클레오티드
135: 제1어댑터 올리고뉴클레오티드
136: 역전사용 프라이머
137: 역전사 산물
138: 제2혼성화 올리고뉴클레오티드
139: RNA 특이적 태그 올리고뉴클레오티드
141: 유니버셜 포워드 프라이머 선택부위
142: 제2어댑터 올리고뉴클레오티드
143: 연장용 프라이머
144: 유니버셜 포워드 프라이머

<110> HeimBiotek Inc. <120> A kit and method for detecting RNA molecules <130> PD16-5400 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for reversetranscription with poly A tailing <400> 1 gcaccaccac tgattagttt ttttttttt 29 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for the reversetranscription and reverse primer for PCR of hsa-miR-532 <400> 2 gcgagcatgc agacggtc 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for the reversetranscription and reverse primer for PCR of hsa-miR-196b <400> 3 gctagtcatg ccagcccaac 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for the reversetranscription and reverse primer for PCR of hsa-miR-362 <400> 4 gcgagcatcg cagactcac 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for the reversetranscription and reverse primer for PCR of hsa-miR-29c <400> 5 gcgagcatcg cagtaaccg 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for the reversetranscription and reverse primer for PCR of hsa-miR-106b <400> 6 gcgagcactg cacatctgc 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for the reversetranscription and reverse primer for PCR of hsa-miR-200c <400> 7 gcgagcactt cacgtccatc 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for the reversetranscription and reverse primer for PCR of hsa-miR-127 <400> 8 gcgacgatgc agagccaa 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for the reversetranscription and reverse primer for PCR of hsa-miR-145 <400> 9 gcgagtccgc atagagggat 20 <210> 10 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for hsa-miR-532 <400> 10 gcacctccag gaccaatctt gtagccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga 60 gcatgccttg agtgtag 77 <210> 11 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for hsa-miR-196b <400> 11 gcacctccag gaccaatctt gtagccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga 60 gtaggtagtt tcctgtt 77 <210> 12 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for hsa-miR-362 <400> 12 gcacctccag gaccaatctt gtagccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga 60 gaatccttgg aacctaggt 79 <210> 13 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for hsa-miR-29c <400> 13 gcacctccag gaccaatctt gtagccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga 60 gtagcaccat ttgaaat 77 <210> 14 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for hsa-miR-106b <400> 14 gcacctccag gaccaatctt gtagccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga 60 gtaaagtgct gacagt 76 <210> 15 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for hsa-miR-200c <400> 15 gcacctccag gaccaatctt gtagccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga 60 gtaatactgc cgggtaat 78 <210> 16 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for hsa-miR-127 <400> 16 gcacctccag gaccaatctt gtagccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga 60 gtcggatccg tctgagc 77 <210> 17 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for hsa-miR-145 <400> 17 gcacctccag gaccaatctt gtagccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga 60 ggtccagttt tcccagga 78 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal forward primer for poly A tailed miRNA <400> 18 gcacctccag gaccaatc 18 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal reverse primer for poly A tailed miRNA <400> 19 gcaccaccac tgattag 17 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer for hsa-let-7e-5p <400> 20 tgcagggtgg cagccaacta t 21 <210> 21 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for hsa-let-7e-5p <400> 21 taagttccgc tgtgtgccgc atctcaccgg gcggcgcttt gagcacggtg tgacggtgag 60 gtaggaggtt gt 72 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal foward primer <400> 22 taagttccgc tgtgtgccgc 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer for miR-200a <400> 23 tgcagggtgg cagccgctac a 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer for miR-200b <400> 24 tgcagggtgg cagccactac t 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer for miR-200c <400> 25 tgcagggtgg cagccctacc t 21 <210> 26 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for miR-200a <400> 26 taagttccgc tgtgtgccgc atctcaccgg gcggcgcttt gagcacggtg tgacggtaac 60 actgtctggt aa 72 <210> 27 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for miR-200b <400> 27 taagttccgc tgtgtgccgc atctcaccgg gcggcgcttt gagcacggtg tgacggtaat 60 actgcctggt aa 72 <210> 28 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for miR-200c <400> 28 taagttccgc tgtgtgccgc atctcaccgg gcggcgcttt gagcacggtg tgacggtaat 60 actgccgggt aat 73 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer for miR-16 <400> 29 tgcagggtgg cagcccgcca a 21 <210> 30 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extension primer for miR-16 <400> 30 taagttccgc tgtgtgccgc atctcaccgg gcggcgcttt gagcacggtg tgacggtagc 60 agcacgtaaa ta 72

Claims

증폭대상 RNA 분자와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고 dT로 구성되는 poly A 꼬리와 혼성화하는 제1혼성화 올리고뉴클레오티드 구성된 역전사용 프라이머;
상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 및 검출 대상으로부터 수득된 시료 내의 RNA를 poly A 폴리머라제로 반응시켜 poly A 꼬리가 연결된 poly A 꼬리연결 RNA 분자 중 상기 증폭대상 RNA 분자로부터 역전사된 cDNA의 올리고 dT 부분을 제외한 3'-말단 부분과 특이적으로 혼성화 가능한 제2혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머; 및
상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 포함하는 RNA 분자 검출용 키트.
제1항에 있어서,
상기 증폭대상 RNA 분자는 길이 18 내지 180 nt로 구성된 작은 크기의 RNA 분자인, RNA 분자 검출용 키트.
제2항에 있어서,
작은 크기의 RNA 분자는 tRNA, snRNA, siRNA, exRNAs, piRNA, scaRNA 또는 miRNA인, RNA 분자 검출용 키트.
제1항에 있어서,
상피, 모발, 생검(biopsy), 부검(autopsy), 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 대변, 땀, 가래, 콧물, 또는 눈물, RNA 분자 검출용 키트.
제1항에 있어서,
상기 제1어댑터 올리고뉴클테오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 추가로 포함하는, RNA 분자 검출용 키트.
제5항에 있어서,
상기 리버스 프라이머는 증복대상 RNA 분자의 종류에 무관하게 동일한 핵산서열로 구성되는 유니버셜 리버스 프라이머인, RNA 분자 검출용 키트.
제1항에 있어서,
상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드는 증폭대상 RNA 분자 종류에 따른 증폭대상 RNA 표식(tagging) 올리고뉴클레오티드 또는 상기 증폭대상 RNA 표식 올리고뉴클레오티드 및 증폭대상 RNA 종류와 무관한 공통의 핵산서열로 구성되는 공통 올리고뉴클레오티드로 구성되는, RNA 분자 검출용 키트.
제1항에 있어서,
상기 제1어댑터 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50 nt로 구성되는, RNA 분자 검출용 키트.
제1항에 있어서,
상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50 nt, RNA 분자 검출용 키트.
증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭대상 RNA 분자의 3'-말단의 5 내지 9 nt의 핵산으로 구성된 3'-말단 부분과 혼성화하는 핵산서열로 구성되는 역전사용 리버스 프라이머;
상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 상기 증폭대상 RNA 분자의 3'-말단 부분에 상응하는 부분을 제외한 상기 증폭대상 RNA 분자로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머; 및
상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 포함하는 RNA 분자 검출용 키트.
제10항에 있어서,
상기 증폭대상 RNA 분자는 길이 18 내지 180 nt로 구성된 작은 크기의 RNA 분자인, RNA 분자 검출용 키트.
제11항에 있어서,
상기 작은 크기의 RNA 분자는 tRNA, snRNA, siRNA, exRNAs, piRNA, scaRNA 또는 miRNA인, RNA 분자 검출용 키트.
제10항에 있어서,
상기 제1어댑터 올리고뉴클테오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 추가로 포함하는, RNA 분자 검출용 키트.
제10항에 있어서,
상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드는 증폭대상 RNA 분자 종류에 따른 증폭대상 RNA 표식(tagging) 올리고뉴클레오티드 또는 상기 증폭대상 RNA 표식 올리고뉴클레오티드 및 증폭대상 RNA 종류와 무관한 공통의 핵산서열로 구성되는 공통 올리고뉴클레오티드로 구성되는, RNA 분자 검출용 키트.
제10항에 있어서,
상기 제1어댑터 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50 nt로 구성되는, RNA 분자 검출용 키트.
제10항에 있어서,
상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50 nt로 구성되는, RNA 분자 검출용 키트.
제10항에 있어서,
상기 제1혼성화 올리고뉴클레오티드는 6 내지 8 nt로 구성되는, RNA 분자 검출용 키트.
폴리 A 폴리머라아제를 이용하여 검출 대상으로부터 분리된 시료 내의 RNA 분자에 poly A 꼬리를 연결하는 poly A 꼬리연결 RNA 분자 제조단계;
상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 poly A 꼬리연결 RNA 분자의 poly A 꼬리와 특이적으로 혼성화하는 poly dT로 구성된 제1혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머로 역전사하는 역전사반응단계; 및
상기 역전사반응 산물의 전부 또는 일부를 상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 poly A 꼬리연결 RNA 분자 중 상기 증폭대상 RNA 분자로부터 역전사된 cDNA의 올리고 dT리 부분을 제외한 3'-말단 부분과 특이적으로 혼성화 가능한 제2혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머, 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머 및 열안정성 DNA 중합효소를 포함하는 프라이머 연장 및 PCR 반응용 용기로 옮긴 후, 프라이머 연장 및 PCR 반응을 동시에 수행하는 PCR 반응단계를 포함하는 증폭대상 RNA 분자의 검출방법.
증폭대상 RNA 분자를 상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭대상 RNA 분자의 3'-말단의 5 내지 9 nt의 핵산과 혼성화 가능한 제1혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 리버스 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 역전사하는 역전사반응단계; 및
상기 역전사반응 산물의 전부 또는 일부를 상기 증폭대상 RNA 분자와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 상기 증폭대상 RNA 분자의 3'-말단에 상응하는 부분을 제외한 상기 증폭대상 RNA 분자로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머, 상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머 및 열안정 DNA 중합효소를 포함하는 프라이머 연장 및 PCR 반응용 용기로 옮긴 후 프라이머 연장 반응 및 PCR 반응을 동시에 수행하는 PCR 반응 단계를 포함하는, 증폭대상 RNA 분자의 검출방법.
제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 증폭대상 RNA 분자는 길이 18 내지 180 nt로 구성되는 작은 크기의 RNA 분자인, 검출방법.
제20항에 있어서,
상기 작은 크기의 RNA 분자는 tRNA, snRNA, siRNA, exRNAs, piRNA, scaRNA 또는 miRNA인, 검출방법.
제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 시료는 상피, 모발, 생검(biopsy), 부검(autopsy), 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 대변, 땀, 가래, 콧물, 또는 눈물인, 검출방법.
제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 PCR 반응단계에서 상기 제1어댑터 올리고뉴클테오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머가 추가로 사용되는, 검출방법.
제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드는 증폭대상 RNA 분자 종류에 따른 증폭대상 RNA 표식(tagging) 올리고뉴클레오티드 또는 상기 증폭대상 RNA 표식 올리고뉴클레오티드 및 증폭대상 RNA 종류와 무관한 공통의 핵산서열로 구성되는 공통 올리고뉴클레오티드로 구성되는, 검출방법.
제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 제1어댑터 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50 nt로 구성되는, 검출방법.
제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 제2어댑터 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50 nt로 구성되는, 검출방법.
제19항에 있어서,
상기 제1혼성화 올리고뉴클레오티드는 6 내지 8 nt로 구성되는, 검출방법.