KR101744313B1 - 개체의 제엽염 진단용 조성물 및 키트, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법 및 제엽염 치료제를 탐색하는 방법 - Google Patents

Abstract

개체의 제엽염 진단용 조성물 및 키트, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법 및 제엽염 치료제를 탐색하는 방법이 제공된다.

Description

개체의 제엽염 진단용 조성물 및 키트, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법 및 제엽염 치료제를 탐색하는 방법{A composition and kit for detecting a laminitis in a subject, method for detecting a laminitis in a subject and method for screening a therapeutic agent for a laminitis}

개체의 제엽염 진단용 조성물 및 키트, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법 및 제엽염 치료제를 탐색하는 방법에 관한 것이다.

제엽이란 단제류의 제 3지골에 발굽을 지지하는 결합조직으로 발굽벽 안쪽에서 돌출된 상피층과 진피층이 질긴 기저막을 사이에 두고 서로 돌기를 이루어 맞물린 구조이다. 도 1은 제엽의 구조를 나타내는 도면이다. 제엽의 진피층은 뼈에 견고하게 연결되어 있는 제 1형 콜라겐으로 이루어진 결합조직으로서 혈관이 분포하여 발굽을 자라게 하고 유지하는데 필요한 영양분을 공급한다.

제엽염은 연결 구조 중 상대적으로 취약한 곳인 기저막에 문제가 생겨 골과 발굽 사이의 견고한 연속성이 소실되는 질병으로 만성화될 경우 제 3지골이 발바닥을 뚫고 나오며 심각한 통증과 파행을 초래한다.

제엽염의 원인은 명확히 밝혀져 있지 않지만, 주로 탄수화물 과식증에 의한 위장관계의 문제에 의한 것으로 알려져 있다. 짧은 사슬의 탄수화물은 포유동물의 위내에서 소화가 되지 않은 상태로 맹장으로 이동하고 정상세균총의 그람양성균에 의하여 발효되어 장 후반부 (hindgut)의 환경을 산성화시킨다. 산성화된 장내 환경은 그람양성균의 과다 증식과 사멸을 일으키며, 사멸된 균에서 유래한 내독소는 투과성이 증대된 장벽을 통해 흡수되어 전신적인 독혈증을 일으킨다. 독혈증은 기저막의 반부착반점에 존재하는 효소인 마트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)를 활성화시켜 기저막과 진피조직의 분리를 일으키거나 제엽에 분포한 혈관에 영향을 주어 염증반응을 일으키게 된다.

제엽염 (laminitis)은 말, 당나귀, 및 얼룩말을 포함한 개체의 사육 중 안락사 조치를 필요하게 하는 중요 질병 중 하나이다. 이에 따라 정확한 진단이 치료 가능성과 예후를 판정하는데 필요하지만, 현재 심혈관계 지표 및 임상증상에만 의존하여 진단하고 있다. 그러므로 특이적인 제엽염 조기진단을 위한 생체 지표 발굴 및 진단법 개발이 요구되고 있다.

일 양상은 개체의 제엽염 진단용 조성물을 제공한다.

다른 양상은 개체의 제엽염 진단용 키트를 제공한다.

다른 양상은 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 제엽염 치료제를 탐색하는 방법을 제공한다.

일 양상은 미오신-9의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 제엽염 진단용 조성물을 제공한다.

상기 미오신-9 (Myosin-9)는 미오신의 중쇄 9 (heavy chain 9)로, 비근육성 (non-muscle) 단백질일 수 있다. 말에서는 MYH9에 의하여 코딩될 수 있다. 미오신-9는 서열번호 1 (NCBI Accession No: XM_001500202.3; GI number: 338721109)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 미오신-9의 발현의 증가는 제엽염과 연관된 것으로 본 발명자들에 의하여 밝혀졌다. 따라서, 미오신-9의 발현 수준은 제엽염을 진단하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에 있어서, 용어 "미오신-9 (myosin-9)"는 천연적으로 존재하는 야생형 미오신-9 및 그의 기능적 변이체를 포함하는 것으로 해석된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 용어 "미오신-9 (myosin-9)를 코딩하는 유전자"는 천연적으로 존재하는 야생형 미오신-9 유전자 및 그의 기능적 변이체를 포함하는 것으로 해석된다.

상기 발현 수준은 미오신-9를 코딩하는 유전자의 발현 수준이면 어느 것이나 포함될 수 있다. 상기 발현 수준은 mRNA 또는 단백질 단계에서의 발현 수준인 것일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 미오신-9의 mRNA의 양, 미오신-9 단백질의 양, 또는 그 조합을 측정하기 위한 제제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제제는 미오신-9의 전사체에 특이적으로 결합하는 물질인 것일 수 있다. 상기 제제는 미오신-9의 mRNA 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 이들의 안티센스 서열; 또는 그 조합일 수 있다. 상기 제제는 미오신-9를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 이들의 안티센스 서열; 또는 그 조합일 수 있다. 상기 미오신-9를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 중합효소에 의한 중합 반응에서 중합개시점을 제공하는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 핵산 증폭 반응에서 사용되는 것일 수 있다. 용어 "증폭 (amplification)"은 표적 서열 또는 그의 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것을 나타낸다. 상기 핵산 증폭 반응은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 핵산의 증폭은 증폭 동안 복수의 사이클을 필요로 하는 방법 또는 단일 온도에서 수행되는 방법을 포함한다. 순환 방법 (cycling techniques)의 예는 열 순환을 필요로 하는 방법을 포함한다. 열 순환을 필요로 하는 방법은 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 포함한다. PCR은 당업계에 알려져 있다. PCR은 보통 열변성에 의하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA으로 변성시키는 단계, 프라이머를 상기 단일가닥 DNA에 어닐링하는 단계; 및 상기 프라이머로부터 상보적 가닥을 합성하는 단계를 포함한다. 등온 증폭 방법은 단일 온도 또는 증폭 과정의 주요 양상이 단일 온도에서 수행되는 방법이다. 이중가닥을 분리하기 위하여 반응 산물을 가열하여 추가적 프라이머가 결합할 수 있도록 하는 PCR과는 대조적으로, 등온 방법은 이중가닥을 분리하고 주형을 재카피하기 위하여 가닥 치환 폴리머라제 (strand displacing polymerase)에 의존한다. 등온 방법은 반복 주형 카피 (reiterative template copying)를 개시하기 위하여 프라이머의 치환에 의존하는 방법과 단일 프라이머 분자의 연속된 재사용 또는 신규 합성에 의존하는 방법으로 구분할 수 있다. 프라이머의 치환에 의존하는 방법은 헬리카제 의존적 증폭 (helicase dependant amplification: HDA), 엑소뉴클레아제 의존적 증폭 (exonuclease dependant amplification), 리콤비나제 중합효소증폭 (recombinase polymerase amplification: RPA) 및 루프 매개된 증폭 (loop mediated amplification: LAMP)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 포함한다. 단일 프라이머 분자의 연속된 재사용 또는 신규 합성에 의존하는 방법은 가닥치환증폭 (strand displacement amplification: SDA) 및 핵산 기반 증폭 (nucleic acid based amplification : NASBA 및 TMA)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 포함한다. 상기 프라이머는 선택되는 증폭 방법에 따라 하나, 또는 2이상의 세트로 포함될 수 있다. 상기 프라이머는 PCR용 프라이머일 수 있다.

mRNA 발현 수준 측정은 제엽염 유무 및 정도를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 개체의 미오신-9 유전자의 mRNA의 존재여부와 발현정도를 확인하는 과정으로서 mRNA 양의 측정일 수 있다. 이는 mRNA를 직접 분리하거나, 상기 mRNA에 대한 프라이머 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이 또는 그 조합을 이용하는 것을 포함할 수 있다. RT-PCR은 RNA를 분석하는 방법으로, mRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석하는 방법이다. 상기 RT-PCR 중 증폭 단계에서 상기 유전자에 특이적으로 제조된 프라이머 쌍을 사용하며, RT-PCR 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 상기 유전자의 mRNA 발현 여부와 발현 수준을 확인할 수 있고 이를 정상대조군과 비교함으로써, 개체의 제엽염의 유무 또는 그 발병 정도를 간편하게 판단할 수 있다.

본 명세서에 있어서 용어 "프라이머"는 자유 3-말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 (즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 예를 들면 미오신-9 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 프라이머로서 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 개체의 제엽염의 유무 또는 그 발병 정도를 확인할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기 프라이머는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서 용어 "프로브"란 표적 핵산 예를 들면, mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 함량 및 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA (single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 예를 들면 미오신-9 폴리뉴클레오티드의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현량을 측정함으로써 개체의 제엽염의 유무 또는 그 발병 정도를 확인할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 프로브는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.

또한, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 (phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한 이러한 핵산 서열은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 또는 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형될 수 있다. 상기 표지의 예는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 또는 바이오틴을 포함할 수 있다.

상기 제제는 미오신-9에 특이적으로 결합하는 단백질인 것일 수 있다. 상기 단백질은 항체, 리간드, 수용체, 작용제 (agonist), 길항체 (antagonist), 또는 이들의 결합 단편; 또는 그 조합일 수 있다.

단백질 발현수준 측정은 개체의 제엽염 유무 또는 그 발병 정도를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 미오신-9 유전자에서 발현된 단백질의 존재여부와 발현 정도를 확인하는 과정일 수 있다. 이는 예를 들면 미오신-9 단백질을 직접 분리하거나, 미오신-9 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 결합 단편을 이용하여 상기 미오신-9 단백질을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석방법은 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 또는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA를 포함할 수 있다. 또한 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있고, 상기 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 개체의 제엽염 유무 또는 그 발병 정도를 확인할 수 있다.

또한, 예를 들면 상기 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 이용할 수 있다. 상기 웨스턴 블롯 분석은 샘플에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동을 하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 그 후 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 상기 단백질의 양을 확인하여, 개체의 제엽염 유무 또는 그 발병 정도를 확인할 수 있다.

상기 검출 방법은 정상 대조군에서의 상기 단백질의 발현량과 생물학적 샘플에서의 상기 단백질의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어질 수 있고, mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

용어 "항체"란 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 미오신-9 또는 이의 단편에 대해 특이적으로 결합할 수 있다. 미오신-9의 단편은 예를 들면 면역원성 단편일 수 있다. 상기 단편은 미오신-9 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프 (epitope)를 가지고 있는 미오신-9 단백질의 단편을 의미한다. 미오신-9 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 미오신-9 유전자에 의해 코딩되는 미오신-9 단백질을 수득하고, 수득된 미오신-9 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다.

상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 또는 재조합 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 폴리클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유 동물을 사용할 수 있다. 상기 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 아주반트 (adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제할 수 있다.

단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체의 제조 방법에 대해 간단히 설명하면, 상기 단백질을 정제하여 약 10 ㎍의 적당량을 Balb/C 마우스에 면역화를 시키거나, 상기 단백질의 폴리펩티드 단편을 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨 다음, 마우스에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 단일클론 항체를 분리, 정제할 수 있다. 또한 단일클론 항체는 상업적으로 판매되는 미오신-9에 대한 항체를 입수하여 사용할 수 있다.

이러한 항체들을 이용하여 당해 기술분야에 공지된 효소 면역측정법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역 측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯팅 또는 면역 블롯팅 등의 방법에 의해 생물학적 샘플 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인할 수 있다.

용어 "결합 단편"은 예를 들면 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위 또는 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 결합 단편은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체가 아닌 항체 분자의 기능적 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 또는 Fv일 수 있다. 상기 결합 단편은 최소한 7개 이상의 아미노산, 예를 들면 9 개 이상의 아미노산, 12개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

상기 발현 수준은 개체로부터 분리된 시료 중의 발현 수준일 수 있다. 상기 시료는 개체로부터 분리된 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 대변, 타액, 눈물, 뇌척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있다. 상기 개체는 단제류 (Perissodactypa)에 속하는 것일 수 있다. 상기 개체는 에쿠스 (Equus) 속일 수 있다. 에쿠스 속은 말, 당나귀, 또는 얼룩말을 포함할 수 있다. 상기 말은 에쿠스 페루스 (equus ferus) 종일 수 있다. 상기 에쿠스 페루스 (equus ferus) 종은 에쿠스 페루스 카발루스 (Equus ferus caballus), 에쿠스 페루스 페루스 (Equus ferus ferus), 또는 에쿠스 페루스 프르즈왈스키 (Equus ferus przewalskii) 아종을 포함할 수 있다. 상기 개체는 말, 물소, 코뿔소, 또는 낙타를 포함할 수 있다.

다른 양상은 미오신-9의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 제엽염 진단용 키트를 제공한다.

"미오신-9의 발현 수준을 측정하기 위한 제제", "개체" 및 "제엽염 진단용"에 대하여는 상기 제엽염 진단용 조성물에 대한 설명에서 기술한 바와 같다.

상기 키트는 예를 들면 미오신-9 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현량을 측정할 수 있는, 제엽염 진단용 마이크로어레이일 수 있다. 상기 제엽염 진단용 마이크로어레이는 상기 미오신-9를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 미오신-9 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가 프로브로서 기판에 부착되어 있는 것일 수 있다.

상기 키트가 예를 들면 미오신-9 유전자의 mRNA의 발현량을 측정하기 위한 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수 (dEPC-water), 또는 멸균수를 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한 상기 키트는 미오신-9 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 버퍼, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 또는 유리 슬라이드글라스가 이용될 수 있다. 발색효소는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 또는 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase)가 사용될 수 있다. 형광물질은 FITC, 또는 RITC가 사용될 수 있다. 발색 기질은 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD (o-페닐렌디아민), 또는 TMB (테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 시료 중의 미오신-9의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 미오신-9의 발현 수준을 대조군에서 측정된 미오신-9의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 개체로부터 분리된 시료 중의 미오신-9의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 개체는 단제류 (Perissodactypa)에 속하는 것일 수 있다. 상기 개체는 에쿠스 (Equus) 속일 수 있다. 에쿠스 속은 말, 당나귀, 또는 얼룩말을 포함할 수 있다. 상기 말은 에쿠스 페루스 (equus ferus) 종일 수 있다. 상기 에쿠스 페루스 (equus ferus) 종은 에쿠스 페루스 카발루스 (Equus ferus caballus), 에쿠스 페루스 페루스 (Equus ferus ferus), 또는 에쿠스 페루스 프르즈왈스키 (Equus ferus przewalskii) 아종을 포함할 수 있다. 상기 개체는 말, 물소, 코뿔소, 또는 낙타를 포함할 수 있다. 상기 발현 수준은 mRNA 또는 미오신-9 단백질 단계에서의 발현 수준일 수 있다. 따라서, 상기 측정은 mRNA의 양, 미오신-9 단백질의 양 또는 그 조합일 수 있다. 미오신-9의 mRNA의 양의 측정 및 미오신-9 단백질의 양의 측정에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 시료는 개체로부터 분리된 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 대변, 타액, 눈물, 뇌척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있다. 상기 조직은 제엽일 수 있다.

상기 방법은 상기 측정된 미오신-9의 발현 수준을 대조군에서 측정된 미오신-9의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함한다. 상기 대조군은 제엽염에 걸리지 않은 개체일 수 있다.

상기 방법은 상기 측정된 미오신-9의 발현 수준이 대조군에서 측정된 미오신-9의 발현 수준보다 높은 경우, 상기 개체는 제엽염에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 측정된 미오신-9의 발현 수준이 대조군에서 측정된 미오신-9의 발현 수준보다 같거나 낮은 경우, 상기 개체는 제엽염에 걸리지 않은 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

다른 양상은 후보 물질을 개체에 투여하는 단계; 및 상기 개체로부터 분리된 시료 중의 미오신-9의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 미오신-9의 발현 수준을 대조군에서 측정된 미오신-9의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 제엽염 치료제를 탐색하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 후보 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 후보 물질은 제엽염 치료에 효과적인 것으로 예상되는 임의의 물질일 수 있다. 상기 투여는 선택되는 물질에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 상기 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여된다. 상기 물질은 전신적으로 또는 국부적, 예를 들면 제엽에 투여될 수 있다.

"상기 개체로부터 분리된 시료 중의 미오신-9의 발현 수준을 측정하는 단계" 및 "상기 측정된 미오신-9의 발현 수준을 대조군에서 측정된 미오신-9의 발현 수준과 비교하는 단계"에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 방법은, 상기 측정된 미오신-9의 발현 수준이 대조군에서 측정된 미오신-9의 발현 수준보다 낮은 경우, 상기 후보 물질을 제엽염 치료에 효과적인 것으로 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

일 양상에 따른 제엽염 진단용 조성물에 따르면, 제엽염 유무를 효율적으로 진단할 수 있다.

일 양상에 따른 제엽염 진단용 키트에 따르면, 제엽염 유무를 효율적으로 진단할 수 있다.

일 양상에 따른 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법에 따르면, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 효율적으로 진단할 수 있다.

일 양상에 따른 제엽염 치료제를 탐색하는 방법에 따르면, 제엽염 치료제를 효과적으로 탐색할 수 있다.

도 1은 제엽의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 제엽염 유발을 위한 올리고당 투여 용량 및 일정을 나타낸 도면이다.
도 3은 제엽염이 유발된 제엽 조직의 조직학적 검사 사진이다.
도 4는 SDS-PAGE 겔에 제엽염 유발 전, 후 혈장 단백질을 각각50 ug씩 로딩하여 단백질 크기 순으로 분리한 겔 사진이다.
도 5는 mRNA 라이브러리 제작 과정을 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 미오신 -9 및 그 mRNA 를 이용한 제엽염의 진단

본 실시예에서는 말에서 제엽염을 인공적으로 유도하여 그 전후에 미오신-9가 분별적으로 발현된다는 것을 확인하고, 미오신-9의 발현 수준이 제엽염의 진단에 사용될 수 있다는 것을 확인하였다.

1. 제엽염의 실험적 유발

(1) 올리고당 투여를 통한 제엽염의 유발

약 600kg의 20세 Warmblood 종의 거세마를 사용하였으며, 약 3개월 동안 마방에서 운동 없이 관리하였다. 프락토올리고당 (썬 올리고 P2^®, (주)큐원, 한국)을 사용하였다. 도 2는 제엽염 유발을 위한 올리고당 투여 용량 및 일정을 나타낸 도면이다. 도 2와 같이 3일간 (Day 0, 1, 2) 유도 용량인 1 g/kg을 투여한 후, Day 3에 10 g/kg의 유발 투여용량을 주입하였다. 1 g/kg의 유도 용량은 가루형태로 사료에 섞어 투여하였으며, 유발 투여용량은 10 g/kg의 용량인 6 kg을 반으로 나누어 각각 4 L의 수돗물에 녹인 후, Day 3 오전 및 오후와 같이 2회에 걸쳐 비위강 (nasogastric) 튜브를 이용하여 주입하였다. Day 4와 Day 5에는 임상검사 및 혈액검사를 실시한 후 안락사시켰다.

(2) 제엽염 유발 평가

신체검사는 Day 3부터 1일 2회씩 실시하였다. 체온을 직장 내에 전자체온계 (MT 1961^®, Microlife)를 삽입하여 측정하였다. 프락토올리고당이 10 g/kg으로 투여된 Day 3부터 1일 2회 측정한 체온의 변화양상은 투여 12시간 이후부터 지속적인 상승을 보였으며 Day 5 오전에는 39.5 ℃의 고열을 보였다.

발굽의 열감은 상시, 즉 차가운 느낌을 0으로 하고, 상온 (room temperature)과 동일할 경우 (+), 상온보다 높은 열감이 느껴질 때 (++)으로 기록하였다. Day 1에 왼쪽 앞발을 제외한 발굽에 열감 (++)이 나타났고 Day 1에서 2사이에는 네 개의 발굽에 모두 열감 (++)이 확인되었으며, Day 2에는 상온 (+)으로 떨어졌다.

심박수는 청진기를 이용하여 좌흉부에서 직접 측정하였다. 파행등급을 미국 말 수의사협회에서 제시한 등급 시스템으로 평가하였다. 올리고당이 10 g/kg으로 투여된 Day 3부터 1일 2회 측정한 심박수의 변화 양상은 다음과 같다. Day 3에 심박수는 30 회/분으로 정상치를 나타내었다. Day 4부터는 지속적으로 상승하였다가 Day 5에는 다소 감소하였지만 여전히 정상보다 높은 심박수를 보였다.

또한 위장관계와 관련된 기타 임상증상들이 나타나는지 관찰하였다. Day 4에 식욕부진과 설사를 보였으며 이후 지속적인 식욕부진을 보였다. Day 3에 앞다리를 넓게 벌리고 서있는 자세를 보였으며, grade 4부터 5사이의 높은 파행등급을 보였다 표 1에 나타낸 단백질은 제엽염 진단용 마커로 사용될 수 있다.

Day 5 오전 및 오후에 경정맥으로부터 채혈하여 BD vacutainer EDTA-K2 10.8 mg (6 ml)에 보관 한 후, ADVIA 120 혈액검사기기 (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, USA), 및 FUJI DRY-CHEM 3500i (Fugi film, Japan, Tokyo)를 이용하여 혈액 및 혈청학적 검사를 각각 실시하였다. Day 5에 실시한 혈액검사 결과는 다음과 같다. RBC, Hematocrit (Hct), Hemoglobin (Hb)이 참고범위 보다 높게 관찰되었으며, WBC 수치는 참고범위 아래로 약간 떨어져 있었다. 상대적으로 심한 림프구 감소증이 관찰되었으며, 호중구, 호염구, 단핵구를 비롯한 기타 백혈구 비율은 다소 증가된 것으로 측정되었다. 또한, Day 5에 혈청화학적 검사 결과는 다음과 같이 기록되었다. 혈당은 정상의 약 1.5~2배 증가하였으며, 크레아티닌 (creatinine), 요산, 총 빌리루빈, ALP (alkaline phosphatase)도 약 2배 상승하였다. 총단백질과 GOT (glutamic oxaloacetic transaminase)는 소폭 상승하였다. 빌리루빈을 제외한 나머지 수치들은 안락사 직전에 더욱 상승된 모습을 보였다. 전해질 검사 결과 미약한 저나트륨혈증을 보였고 저마그네슘혈증을 보였다. CPK (Creatine phosphokinase), 및 BUN (blood urea nitrogen)은 안락사 직전 검사에서 미약한 증가를 보였다.

또한, 조직학적 검사를 위해 채취한 제엽 조직을 약 10% 포르말린에 고정한 후, 통상적인 방법에 따라 파라핀으로 포매 (包埋)하고 4~6㎛로 절편하여 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 폐는 전반적으로 발적되어 퇴축되지 않았으며, 거품양 수액이 기관지에 존재하였다. 결장은 전반적으로 발적되어 있었으며, 장관벽은 수종성 변화를 보이며 비후되어 있었다. 제엽조직 단면에서 미약한 발적이 관찰되었다. 도 3은 제엽염이 유발된 제엽 조직의 조직학적 검사 사진이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 제엽 결합조직의 혈관은 충혈되어 있으며, 소수의 호중구가 침윤되어 있으며, 수종성 변화를 나타내었다.

2. 제엽염 유발 전, 후 혈장 내 단백질 발현량 분석에 따른 제엽염 특이적 혈장 단백질 선별

(1) 혈장 샘플링

제엽염 유발 전 혈장은 Day 0의 유도용량 투여 전에 경정맥으로부터 채혈하여 BD vacutainer EDTA-K2 10.8 mg (6 ml)에 넣은 후 원심분리기로 3000 rpm, 10분 원심 분리하여 샘플링하였다. 그리고 제엽염 유발 후 혈장은 Day 5에 경정맥으로부터 채혈한 후 BD vacutainer EDTA-K2 10.8 mg (6 ml)에 넣은 후 원심분리기로 3000 rpm, 10분 원심 분리하여 샘플링하였다.

(2) MS ( Mass Spectrometry )를 이용한 혈장 단백질 분석

(2.1) Enzymatic in - gel digestion

제엽염 유발 전, 후 말의 혈장 단백질 50 ug을 SDS-PAGE를 이용하여 분리한 후, 겔을 동일하게 5 등분 자른다. 5 등분한 겔 조각 각각을 서로 다른 튜브로 나누어 담고, 50% 아세토니트릴 (ACN)이 포함된 50 mM NH₄HCO₃를 첨가한 후 CBB (Coomassie Brilliant Blue)가 완전히 제거될 때까지 볼텍싱하여 탈염색 (destaining)시켰다. 그리고 겔 조각들은 100% 아세토니트릴로 탈수하고, speedVac으로 20분 동안 진공-건조 해주었다. 소화 (Digestion)시키기 위해서 겔 조각들은 56℃에서 45분 동안 10 mM DTT가 포함된 50 mM NH₄HCO₃에 넣은 후 환원 (reduction) 해준다. 그 후 어두운 곳에서 30분 동안 55 mM 아이오도아세트아미드 (iodoacetamide)가 포함된 50 mM NH₄HCO₃로 시스테인 알킬화 (cysteine alkylation)를 실시한다. 그 후 각각의 겔 조각들을 12.5 ng/μl sequencing grade modified trypsin (Promega, Madison, WI)가 포함된 50 mM NH₄HCO₃ 버퍼 (pH 7.8)에 넣은 후, 37℃에서 밤새 (overnight) 둔다. 소화 후, 트립신에 의해 생긴 펩티드 (tryptic peptide)는 5% 포름산이 포함된 50% ACN 용액을 첨가한 후 20분 동안 실온 (Room Temperature)에서 반응 후 추출한다. 상청액을 모으고 SpeedVac으로 건조시키며, 0.1% 포름산으로 재-현탁하여 정제한다. 그리고 MS 분석 전 C18 ZipTips (Millipore, MA)을 사용하여 농축시킨다.

(2.2) Nano - LC - ESI - MS / MS 분석

트립신에 의해 생긴 펩티드는 C18 reversed phase resin (5 μm, 200 A)으로 구성된 fused silica microcapillary 컬럼 (12 cm x 75 μm)에 로딩하였다.

LC separation은 다음과 같은 직선 구배 (linear gradient) 아래 60분 동안 250 nL/min의 유량으로 수행하였다: 3~40% 용매 B (0.1% 포름산이 포함된 ACN), 용매 A (0.1% 포름산이 포함된 DW). 컬럼은 nano-electrospray ion source가 장착된 LTQ linear ion-trap mass spectrometer (Finnigan, CA)에 곧바로 연결된다. Electrospray voltage는 1.95 kV이며, MS에서 MS/MS로 전환하기 위한 역치는 500이었다. MS/MS에 정규화된 충돌 에너지 (collision energy)는 main radio frequency amplitude (RF)의 35%이고, 지속시간은 30 ms이었다. 모든 스펙트라는 data-dependent scan mode에서 수득하였다 (Kim S, Jho EH. J Biol Chem. 2010 Nov 19; 285(47):36420-6).

(2.3) 데이터베이스 검색 및 검증 ( Database searching and validation )

생산된 LC-ESI-MS/MS 단편 스펙트라는 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 SEQUEST 검색 엔진을 포함하고 있는 BioWorkBrowser (version Rev. 3.3.1 SP1, Thermo Fisher Scientific Inc., CA)를 사용하여 검색한다. 검색 조건은 트립신 효소 특이성 (trypsin enzyme specificity)과 2개의 missed cleavage에 대한 permissible level, 및 peptide tolerance 등이었다.

(2.4) 결과

제엽염 유발 전, 후 혈장 내 존재하는 전체 단백질을 동정하고, 제엽염 유발 전, 후 혈장 내 단백질의 상대적 발현량을 비교하기 위해 제엽염 유발 전 혈장, 및 제엽염 유발 후 혈장 내의 단백질에 대하여 Nano-LC-ESI-MS/MS 분석을 하였다.

도 4는 SDS-PAGE 겔에 제엽염 유발 전, 후 혈장 단백질을 각각 50 ug씩 로딩하여 단백질 크기 순으로 분리한 겔 사진이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 빨간 점선으로 표시된 것처럼 겔을 동일하게 5등분하여 자른 후 제엽염 유발 전, 후 각각의 혈장 내 단백질을 Nano-LC-ESI-MS/MS 분석법을 사용하여 동정하였고, 혈장 내 단백질 상대적 발현량을 비교하였다.

Nano-LC-ESI-MS/MS 분석을 통해 생성된 신뢰성 범위를 벗어난 데이타 값, 즉 검출된 펩티드의 수가 1 이하인 단백질은 제외하고, 신뢰성 범위에 해당하는 값인 검출된 펩티드의 수가 2이상인 단백질들에 대하여 제엽염 유발 전, 후 혈장 내 발현되는 단백질의 종류를 비교 분석하였다.

그 결과 제엽염 유발 전 혈장 내에서는 발현되지 않지만, 제엽염 유발 후 혈장에서만 발현되는 것으로서, 미오신-9 단백질을 확인하였다. 표 1에, 제엽염 유발 전 혈장 내에서 발현되는 단백질과 비교하여 제엽염 유발 후 혈장 내에서만 발현되는 제엽염 특이적 단백질 미오신-9을 나타낸 것이다. 상기 미오신-9 단백질을 제엽염 전, 후 혈장 내 펩티드 비 (peptide ratio) 및 단백질 분자량 (MW)을 나타내었다. 펩티드 비는 각각의 단백질 펩티드 수를 전체 단백질 펩티드 수로 나눈 값이다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 제엽염 유발 전 혈장과 비교하여 제엽염 유발 후 혈장 내에서만 발현되는 미오신-9는 펩티드 비가 0.008228461이었다. 그리고 표 1에 나타낸 미오신-9는 제엽염 유발 전과 비교하여 제엽염 유발 후 혈장 내에서만 발현되는 것으로, 제엽염 유발 전 혈장의 펩티드 비는 모두 0을 나타내었다.

제엽염 유발 전과 비교하여 제엽염 유발 후 혈장 내에서만 발현되는 미오신-9 단백질

단백질	분자량(kDa)	제엽염 유발 전 혈장 내 단백질 비	제엽염 유발 후 혈장 내 단백질 비
미오신-9	209	0	0.008228461

3. 말 제엽 조직 및 그 외 12개 주요장기 조직 내 mRNA 차세대 서열 분석( NGS )과 제엽 특이적 mRNA 선별

(3.1) 조직 샘플링

진정제 (Domosedan^®, 10mg/kg, Orion Co./ Ketamine, 1500mg/kg, 유한양행)를 투여한 후 안락사 (1 ml당 Embutramide 200 mg Mebezonium iodine 50 mg Tetracaine^® 5 mg, T-61^®, 50 ml, 유럽연합)하였으며, 부검을 실시한 다음 제엽염이 유발된 말의 간, 신장, 폐, 위, 소장, 결장, 맹장, 갑상선, 부신, 근육, 비장,및 심장의 12개의 주요 장기 조직과 4개의 발굽으로부터 제엽 조직을 채취한 후 액체 질소에서 급냉 후 -70℃에서 보관하였다.

(3.2) RNA 추출

제엽염이 유발된 말의 제엽과 12가지 주요장기 조직 50 mg 당 Trizol 0.75 ml을 넣고 균질화시켰다(homogenize). 균질화된 샘플을 상온에서 5분간 인큐베이션 한 후 Trizol 0.75 ml 당 클로로폼 0.2 ml을 넣고 15초 동안 흔들어 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 3분 동안 인큐베이션한 후 14000 rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리를 진행하였다. 원심분리 후 상층액 약 500 ul를 확보하여 이소프로필알콜과 1:1로 혼합한 후, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그리고 14000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리를 하고, RNA 펠릿을 확인한 후 상층액을 모두 제거하였다. 세척 과정으로 70% EtOH 1 ml을 넣은 후 8000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리를 하였다. 상층액을 모두 제거한 후 실온에서 튜브 뚜껑을 열어놓은 채 RNA 펠렛을 완전히 건조하였다. 펠릿이 완전히 마르면 HPLC 물 20~100 ul를 넣어서 용리시켰다. 그 후 Dnase I을 실온에서 15분 동안 처리하여 DNA를 완전히 제거함으로써 순수한 RNA를 추출하였다.

(3.3) mRNA NGS ( Next Generation Sequencing )를 이용한 조직 내 mRNA 분석

(3.3.1) mRNA 라이브러리 제작

총 RNA 중 mRNA는 클러스터 생성 (cluster generation)을 위해 TrusSeq RNA Sample Preparation Kit (Illumina, Inc.)에서 제공되는 시약을 사용하여 아래의 과정에 의해 주형 라이브러리 (template library)로 만들었다. 도 5는 mRNA 라이브러리 제작 과정을 나타내는 도면이다:

mRNA단편화 (fragmentation) 및 정제: poly-T oligo가 붙어있는 마그네틱 비드를 사용하여서 poly-A만 포함된 mRNA를 정제하였다. 2번의 정제과정을 통해 poly-A RNA를 정제하고 RNA는 cDNA합성을 위해 단편화시켰다.

첫 번째 가닥 (first strand) cDNA합성: 역전사효소 (Reverse transcriptase)와 임의의 프라이머를 사용하여 조각난 RNA 단편으로부터 첫 번째 가닥의 cDNA를 합성하는 역전사 과정을 수행하였다.

두번째 가닥 (second strand) cDNA 합성: 첫 번째 가닥 cDNA합성에 사용된 RNA 주형을 제거하고, 이전 과정에서 합성된 첫 번째 가닥cDNA를 이용하여 Double-stranded(ds) cDNA를 합성하였다. 이때 Ampure XP bead를 이용하여 2^nd strand reaction mix로부터 dscDNA를 분리하게 된다.

말단 복원 (end repair): End Repair (ERP) mix를 사용하여 cDNA의 말단을 blunt end로 만들었다. 즉, 3'->5' exonuclease activity를 가지는 ERP mix는 cDNA의 3'-overhang은 제거하고, 동시에 폴리머라제 활성 (polymerase activity)을 가져서 5'-overhang은 염기를 채워준다.

3' 말단 A single 첨가: 어댑터 라이게이션 반응 (Adapter ligation reaction) 동안 이전 과정에서 만들어진 블런트 단편 (blunt fragment)간의 라이게이션 반응을 막기 위해 3' 말단에 A염기를 첨가하였다. 이로 인해 어댑터의 3' 말단 부분은 single T 염기로 상보적으로 구성되게 되고, 연쇄적으로 이루어진 cDNA의 비율을 줄일 수 있게 되었다.

어댑터 부착 (ligation): ds cDNA의 양끝 말단에 어댑터 (adapter)를 부착하였고, 흐름 흐름 (flow cell) 위에 혼성화를 하기 위한 준비 단계이다.

DNA 단편의 양 증폭: PCR를 이용하여 선택적으로 양끝 말단에 2개의 adapter molecule를 가지는 DNA 단편만을 증폭시키는 과정이다. 이 PCR과정은 어댑터의 양끝에 PCR primer cocktail이 붙어서 진행되며, 이 때 PCR 사이클 수는 최소화시켰다.

라이브러리 검증 (library validation): 라이브러리가 잘 제작되었는지 확인하기 위해서 PCR 산물의 크기를 DNA 1000 칩을 사용하는 Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer를 이용하여 확인하였다. 그 후 Illumina sequencing platform을 사용하여 가장 질 높은 데이타를 생산해 내기 위해, 모든 흐름 세포 (flow cell)의 레인마다 최적의 클러스터 밀도 (cluster density)를 만들기 위해서 qPCR을 사용하여 라이브러리의 정확한 농도를 확인하였다.

(3.3.2) 클러스터링 및 시퀀싱

Illumina의 흐름 세포의 표면에서 일어나는 독특한 "Bridged" 증폭 과정을 사용한다. 흐름 세포는 수백만의 독특한 클러스터를 포함하며, 이를 HiSeq 2000 장비에 장착하여 시퀀싱을 수행하였다. 다시 되돌릴 수 있는 형광단 (reversible fluorophore)과 반응 종료 (termination) 특징을 가지는 4가지의 염기들을 이용하여, 매 시퀀싱 사이클마다 동시에 4가지 염기가 존재하는 상태에서 진행되며, 특이적 클러스터에 대해 하나의 염기가 신장되는 것을 시리즈 이미지 (series image)로 나타내었다.

(3.3.3) 시퀀스 품질 점검 ( Sequence quality check )

도 5와 같이 SolexaQA라는 Perl-based software package를 사용하여 Illumina에 의해서 만들어진 FASTQ file (raw data)들로부터 데이터 품질 (data quality)을 시각적으로 나타내고, 통계적으로 계산함으로써 서열 품질을 분석하였다.

(3.3.4) 데이터 분석

서열 품질 분석 후, TopHat과 Cufflinks & Cuffdiff를 이용하여 데이터 분석을 진행하였다. RNA-Seq read에 대한 fast splice junction mapper인 TopHat (version 1.3.3)을 이용하였고 상기 TopHat은 ultra high-throughput short read aligner인 Bowtie에 기반을 두고 있다. 이를 이용하여 생산된 RNA-Seq read들은 에쿠스 카발루스 (Equus caballus)의 염색체 (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Equus_caballus/GFF/ref_EquCab2.0_top_level.gff3. gz)에 정렬시켰다.

RNA-Seq 샘플 내에 분별적 발현 (differential expression)과 조절 정도를 비교, 분석하고, 전사체를 조립 (assemble)하기 위해서 Cuffdiff와 Cufflink (version 1.2.1)를 사용하였다. 즉, 정렬된 RNA-Seq read들을 받은 후, Cufflink를 사용하여 전사체 세트 (transcript set)로 조립하였다. 이렇게 조립된 전사체 세트들을 Cuffdiff를 사용하여 상대적인 양을 비교, 분석하였다 (Trapnell C, et al, Nat Protoc. 2012 Mar 1;7(3):562-78.).

(3. 4) 결과

제엽 특이적 생체지표 발굴을 위한 기초 확립을 위해 올리고당을 투여한 후 체온, 발굽열감, 심박수, 임상증상, 혈액학적 검사, 혈청학적 검사, 육안 및 조직학적 검사 소견 등을 토대로 인공적인 제엽염 유발이 확인된 말의 제엽 조직과 그 외 12개 주요장기 (신장, 심장, 폐, 간, 대장, 소장, 결장, 비장, 위, 갑상선, 부신, 근육) 조직에서 발현되는 mRNA의 발현 수준을 차세대 염기 서열 분석법인 NGS (Next Generation Sequencing)을 통해서 비교, 분석하였다.

그 결과, 미오신-9 mRNA가 제엽 조직에서만 발현되는 것을 확인하였다. 표 2는 제엽 조직 특이적으로 발현되는 미오신-9 mRNA를 나타낸 것으로, FPKM (Fragments Per Kilobase of exon per Million fragments mapped) 값이 50 이상이었다. 미오신-9 단백질에 대한 제엽 조직 내 발현량과 그 외 주요장기 조직 내 발현량을 정규화 (normalizaion)된 값인 FPKM 값으로 나타내었다. 상기 제엽 특이적 mRNA는 12개 주요장기 조직 내에서의 발현율 (FPKM)은 0을 나타내었다.

제엽염이 유발된 말의 제엽 조직과 그 외 12개 주요장기 조직 내 발현되는 mRNA를 비교하였을 때, 제엽 조직 특이적으로 발현되는 미오신-9 mRNA

mRNA	12개 주요장기 조직 FPKM	제엽 조직 FPKM
미오신-9	0	54.37

이상의 결과로부터, 미오신-9가 제엽 조직에서 특이적으로 발현되고, 제엽염에 의해 혈장 내 발현이 증가되어, 제엽염 조기 진단을 위한 생체 지표가 될 수 있다는 것을 확인하였다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> Myosin-9, a marker for diagnosing laminitis, a composition for diagnosing laminitis to measure the level of expression of the marker, a kit for diagnosing laminitis comprising the composition, and a method for diagnosing laminitis using the marker <130> PN102416 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1816 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 1 Met Ala Gln Gln Ala Ala Asp Lys Tyr Leu Tyr Val Asp Lys Asn Phe 1 5 10 15 Ile Asn Asn Pro Leu Ala Gln Ala Asp Trp Ala Ala Lys Lys Leu Val 20 25 30 Trp Val Pro Ser Glu Lys Ser Gly Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Glu 35 40 45 Glu Val Gly Glu Glu Ala Ile Val Glu Leu Val Glu Asn Gly Lys Lys 50 55 60 Val Lys Val Asn Lys Asp Asp Ile Gln Lys Met Asn Pro Pro Lys Phe 65 70 75 80 Ser Lys Val Glu Asp Met Ala Glu Leu Thr Cys Leu Asn Glu Ala Ser 85 90 95 Val Leu His Asn Leu Lys Glu Arg Tyr Tyr Ser Gly Leu Ile Tyr Thr 100 105 110 Tyr Ser Gly Leu Phe Cys Val Val Ile Asn Pro Tyr Lys Asn Leu Pro 115 120 125 Ile Tyr Ser Glu Glu Ile Val Glu Met Tyr Lys Gly Lys Lys Arg His 130 135 140 Glu Met Pro Pro His Ile Tyr Ala Ile Thr Asp Thr Ala Tyr Arg Ser 145 150 155 160 Met Met Gln Asp Arg Glu Asp Gln Ser Ile Leu Cys Thr Gly Glu Ser 165 170 175 Gly Ala Gly Lys Thr Glu Asn Thr Lys Lys Val Ile Gln Tyr Leu Ala 180 185 190 His Val Ala Ser Ser His Lys Ser Lys Lys Asp Gln Gly Glu Leu Glu 195 200 205 Arg Gln Leu Leu Gln Ala Asn Pro Ile Leu Glu Ala Phe Gly Asn Ala 210 215 220 Lys Thr Val Lys Asn Asp Asn Ser Ser Arg Phe Gly Lys Phe Ile Arg 225 230 235 240 Ile Asn Phe Asp Val Asn Gly Tyr Ile Val Gly Ala Asn Ile Glu Thr 245 250 255 Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Arg Ala Ile Arg Gln Ala Lys Glu Glu Arg 260 265 270 Thr Phe His Ile Phe Tyr Tyr Leu Leu Ser Gly Ala Gly Glu His Leu 275 280 285 Lys Thr Asp Leu Leu Leu Glu Pro Tyr Asn Lys Tyr Arg Phe Leu Ser 290 295 300 Asn Gly His Val Thr Ile Pro Gly Gln Gln Asp Lys Asp Met Phe Gln 305 310 315 320 Glu Thr Met Glu Ala Met Arg Ile Met Gly Ile Pro Glu Glu Glu Gln 325 330 335 Met Gly Leu Leu Arg Val Ile Ser Gly Val Leu Gln Leu Gly Asn Ile 340 345 350 Val Phe Lys Lys Glu Arg Asn Thr Asp Gln Ala Ser Met Pro Asp Asn 355 360 365 Thr Ala Ala Gln Lys Val Ser His Leu Leu Gly Ile Asn Val Thr Asp 370 375 380 Phe Thr Arg Gly Ile Leu Thr Pro Arg Ile Lys Val Gly Arg Asp Tyr 385 390 395 400 Val Gln Lys Ala Gln Thr Lys Glu Gln Ala Asp Phe Ala Ile Glu Ala 405 410 415 Leu Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Arg Met Phe Arg Trp Leu Val Leu Arg 420 425 430 Ile Asn Lys Ala Leu Asp Lys Thr Lys Arg Gln Gly Ala Ser Phe Ile 435 440 445 Gly Ile Leu Asp Ile Ala Gly Phe Glu Ile Phe Asp Leu Asn Ser Phe 450 455 460 Glu Gln Leu Cys Ile Asn Tyr Thr Asn Glu Lys Leu Gln Gln Leu Phe 465 470 475 480 Asn His Thr Met Phe Ile Leu Glu Gln Glu Glu Tyr Gln Arg Glu Gly 485 490 495 Ile Glu Trp Asn Phe Ile Asp Phe Gly Leu Asp Leu Gln Pro Cys Ile 500 505 510 Asp Leu Ile Glu Lys Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ile Leu Ala Leu Leu 515 520 525 Asp Glu Glu Cys Trp Phe Pro Lys Ala Thr Asp Lys Ser Phe Val Glu 530 535 540 Lys Val Met Gln Glu Gln Gly Thr His Pro Lys Phe Gln Lys Pro Lys 545 550 555 560 Gln Leu Lys Asp Lys Ala Asp Phe Cys Ile Ile His Tyr Ala Gly Lys 565 570 575 Val Asp Tyr Lys Ala Asp Glu Trp Leu Met Lys Asn Met Asp Pro Leu 580 585 590 Asn Asp Asn Ile Ala Thr Leu Leu His Gln Ser Ser Asp Lys Phe Val 595 600 605 Ser Glu Leu Trp Lys Asp Val Asp Arg Ile Ile Gly Leu Asp Gln Val 610 615 620 Ala Gly Met Ser Glu Thr Ala Leu Pro Gly Ala Phe Lys Thr Arg Lys 625 630 635 640 Gly Met Phe Arg Thr Val Gly Gln Leu Tyr Lys Glu Gln Leu Ala Lys 645 650 655 Leu Met Ala Thr Leu Arg Asn Thr Asn Pro Asn Phe Val Arg Cys Ile 660 665 670 Ile Pro Asn His Glu Lys Lys Ala Gly Lys Leu Asp Pro His Leu Val 675 680 685 Leu Asp Gln Leu Arg Cys Asn Gly Val Leu Glu Gly Ile Arg Ile Cys 690 695 700 Arg Gln Gly Phe Pro Asn Arg Val Val Phe Gln Glu Phe Arg Gln Arg 705 710 715 720 Tyr Glu Ile Leu Thr Pro Asn Ser Ile Pro Lys Gly Phe Met Asp Gly 725 730 735 Lys Gln Ala Cys Val Leu Met Ile Lys Ala Leu Glu Leu Asp Ser Asn 740 745 750 Leu Tyr Arg Ile Gly Gln Ser Lys Val Phe Phe Arg Ala Gly Val Leu 755 760 765 Ala His Leu Glu Glu Glu Arg Asp Leu Lys Ile Thr Asp Val Ile Ile 770 775 780 Gly Phe Gln Ala Cys Cys Arg Gly Tyr Leu Ala Arg Lys Ala Phe Ala 785 790 795 800 Lys Arg Gln Gln Gln Leu Thr Ala Met Lys Val Leu Gln Arg Asn Cys 805 810 815 Ala Ala Tyr Leu Lys Leu Arg Asn Trp Gln Trp Trp Arg Leu Phe Thr 820 825 830 Lys Val Lys Pro Leu Leu Gln Val Ser Arg Gln Glu Glu Glu Met Ile 835 840 845 Ala Lys Glu Glu Glu Leu Val Lys Val Arg Glu Lys Gln Leu Ala Ala 850 855 860 Glu Asn Arg Leu Thr Glu Met Glu Thr Leu Gln Ser Gln Leu Met Ala 865 870 875 880 Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Gln Leu Gln Ala Glu Thr Glu Leu Cys 885 890 895 Ala Glu Ala Glu Glu Leu Arg Ala Arg Leu Thr Ala Lys Lys Gln Glu 900 905 910 Leu Glu Glu Ile Cys His Asp Leu Glu Ala Arg Val Glu Glu Glu Glu 915 920 925 Glu Arg Cys Gln His Leu Gln Ala Glu Lys Lys Lys Met Gln Gln Asn 930 935 940 Ile Gln Glu Leu Glu Glu Gln Leu Glu Glu Glu Glu Ser Ala Arg Gln 945 950 955 960 Lys Leu Gln Leu Glu Lys Val Thr Thr Glu Ala Lys Leu Lys Lys Leu 965 970 975 Glu Glu Asp Gln Ile Ile Leu Glu Asp Gln Asn Cys Lys Leu Ala Lys 980 985 990 Glu Lys Lys Leu Leu Glu Asp Arg Ile Ala Glu Phe Thr Thr Asn Leu 995 1000 1005 Thr Glu Glu Glu Glu Lys Ser Lys Ser Leu Ala Lys Leu Lys Asn Lys 1010 1015 1020 His Glu Ala Met Ile Thr Asp Leu Glu Glu Arg Leu Arg Arg Glu Glu 1025 1030 1035 1040 Lys Gln Arg Gln Glu Leu Glu Lys Thr Arg Arg Lys Leu Glu Gly Asp 1045 1050 1055 Ser Thr Asp Leu Asn Asp Gln Ile Ala Glu Leu Gln Ala Gln Ile Ala 1060 1065 1070 Glu Leu Lys Met Gln Leu Ala Lys Lys Glu Glu Glu Leu Gln Ala Ala 1075 1080 1085 Leu Ala Arg Val Glu Glu Glu Ala Ala Gln Lys Asn Met Ala Leu Lys 1090 1095 1100 Lys Ile Arg Glu Leu Glu Ser Gln Ile Ser Glu Leu Gln Glu Asp Leu 1105 1110 1115 1120 Glu Ser Glu Arg Ala Ser Arg Asn Lys Ala Glu Lys Gln Lys Arg Asp 1125 1130 1135 Leu Gly Glu Glu Leu Glu Ala Leu Lys Thr Glu Leu Glu Asp Thr Leu 1140 1145 1150 Asp Ser Thr Ala Ala Gln Gln Glu Leu Arg Ser Lys Arg Glu Gln Glu 1155 1160 1165 Val Asn Ile Leu Lys Lys Thr Leu Glu Glu Glu Ala Lys Thr His Glu 1170 1175 1180 Ala Gln Ile Gln Glu Met Arg Gln Lys His Ser Gln Ala Val Glu Glu 1185 1190 1195 1200 Leu Ala Glu Gln Leu Glu Gln Thr Lys Arg Val Lys Ala Asn Leu Glu 1205 1210 1215 Lys Ala Lys Gln Thr Leu Glu Asn Glu Arg Gly Glu Leu Ala Asn Glu 1220 1225 1230 Val Lys Ala Leu Leu Gln Gly Lys Gly Asp Ser Glu His Lys Arg Lys 1235 1240 1245 Arg Val Glu Ala Gln Leu Gln Glu Leu Gln Val Lys Phe Asn Glu Gly 1250 1255 1260 Glu Arg Val Arg Thr Glu Leu Ala Asp Lys Val Ser Lys Leu Gln Val 1265 1270 1275 1280 Glu Leu Asp Asn Val Thr Gly Leu Leu Thr Gln Ser Asp Ser Lys Ser 1285 1290 1295 Ser Lys Leu Thr Lys Asp Phe Ser Ala Leu Glu Ser Gln Leu Gln Asp 1300 1305 1310 Thr Gln Glu Leu Leu Gln Glu Glu Asn Arg Gln Lys Leu Ser Leu Ser 1315 1320 1325 Thr Lys Leu Lys Gln Met Glu Asp Glu Lys Asn Ser Phe Lys Glu Gln 1330 1335 1340 Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Lys Arg Asn Leu Glu Lys Gln Ile Ala 1345 1350 1355 1360 Thr Leu His Ala Gln Val Ser Asp Met Lys Lys Lys Val Glu Asp Gly 1365 1370 1375 Val Gly Cys Leu Glu Thr Ala Glu Glu Ala Lys Arg Lys Leu Gln Lys 1380 1385 1390 Asp Leu Glu Gly Leu Thr Gln Arg Tyr Glu Glu Lys Val Ala Ala Tyr 1395 1400 1405 Asp Lys Leu Glu Lys Thr Lys Thr Arg Leu Gln Gln Glu Leu Asp Asp 1410 1415 1420 Leu Leu Val Asp Leu Asp His Gln Arg Gln Ser Val Ser Asn Leu Glu 1425 1430 1435 1440 Lys Lys Gln Lys Lys Phe Asp Gln Leu Leu Ala Glu Glu Lys Thr Ile 1445 1450 1455 Ser Ala Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asp Arg Ala Glu Ala Glu Ala Arg 1460 1465 1470 Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ser Leu Ala Arg Ala Leu Glu Glu Ala 1475 1480 1485 Met Glu Gln Lys Ala Glu Leu Glu Arg Leu Asn Lys Gln Phe Arg Thr 1490 1495 1500 Glu Met Glu Asp Leu Met Ser Ser Lys Asp Asp Val Gly Lys Ser Val 1505 1510 1515 1520 His Glu Leu Glu Lys Ser Lys Arg Ala Leu Glu Gln Gln Val Glu Glu 1525 1530 1535 Met Lys Thr Gln Leu Glu Glu Leu Glu Asp Glu Leu Gln Ala Thr Glu 1540 1545 1550 Asp Ala Lys Leu Arg Leu Glu Val Asn Leu Gln Ala Met Lys Ala Gln 1555 1560 1565 Phe Glu Arg Asp Leu Gln Gly Arg Asp Glu Gln Ser Glu Glu Lys Lys 1570 1575 1580 Lys Gln Leu Val Arg Gln Val Arg Glu Met Glu Ala Glu Leu Glu Asp 1585 1590 1595 1600 Glu Lys Lys Gln Arg Ser Leu Ala Val Ala Ala Arg Lys Lys Leu Glu 1605 1610 1615 Met Asp Leu Lys Asp Leu Glu Ala His Ile Asp Thr Ala Asn Lys Asn 1620 1625 1630 Arg Asp Glu Ala Ile Lys Gln Leu Arg Lys Leu Gln Ala Gln Met Lys 1635 1640 1645 Asp Tyr Met Arg Glu Leu Glu Asp Thr Arg Ala Ser Arg Glu Glu Ile 1650 1655 1660 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Asn Glu Lys Lys Leu Lys Ser Met Glu Ala 1665 1670 1675 1680 Glu Met Ile Gln Leu Gln Glu Glu Leu Ala Ala Ala Glu Arg Ala Lys 1685 1690 1695 Arg Gln Ala Gln Gln Glu Arg Asp Glu Leu Ala Glu Glu Ile Ala Asn 1700 1705 1710 Ser Ser Gly Lys Gly Ala Leu Ala Leu Glu Glu Lys Arg Arg Leu Glu 1715 1720 1725 Ala Arg Ile Ala Gln Leu Glu Glu Glu Leu Glu Glu Glu Gln Gly Asn 1730 1735 1740 Thr Glu Leu Val Asn Asp Arg Leu Lys Lys Ala Asn Leu Gln Ile Asp 1745 1750 1755 1760 Gln Ile Asn Thr Asp Leu Asn Leu Glu Arg Ser His Ala Gln Lys Asn 1765 1770 1775 Glu Thr Arg Gly Asp Leu Pro Phe Val Val Pro Arg Arg Met Ala Arg 1780 1785 1790 Lys Gly Thr Gly Asp Gly Ser Asp Glu Glu Met Asp Gly Lys Ala Asp 1795 1800 1805 Gly Ala Glu Ala Lys Ala Ala Glu 1810 1815 <210> 2 <211> 5451 <212> DNA <213> Equus caballus <400> 2 atggcgcagc aagctgctga taagtatctc tatgtggaca aaaacttcat caataaccca 60 ctggcccagg ccgactgggc tgccaagaag ctggtatggg tgccttccga gaagagtgga 120 tttgagcccg ccagcctcaa ggaagaggta ggcgaggagg ccatcgtgga gctggtggag 180 aatgggaaga aggtgaaagt gaacaaggat gacatccaga agatgaaccc gcccaagttc 240 tccaaggtgg aggacatggc ggagctcacg tgcctcaacg aagcctcggt cttgcacaac 300 ctcaaggagc gctactactc agggctcatc tacacctatt cagggctgtt ctgtgtggtc 360 atcaatcctt ataagaacct gcccatctac tccgaagaga ttgtggaaat gtacaagggc 420 aagaagaggc acgagatgcc cccccacatc tatgccatca cagacaccgc ctacaggagt 480 atgatgcaag atcgagagga ccagtccatt ttgtgcacgg gtgagtctgg agctggcaag 540 acagagaaca ccaagaaagt cattcagtat ctggctcacg tggcctcctc acacaagagc 600 aagaaagacc agggcgagct ggagcggcag ctgctgcagg ccaaccccat cctggaggcc 660 ttcgggaatg ccaagaccgt gaaaaatgac aactcctcac gatttggcaa attcattcgc 720 atcaactttg atgtcaatgg ctacatcgtt ggagccaata ttgagactta tcttctggag 780 aaatcccggg ccatccgcca ggccaaggag gagcgcacct tccacatctt ctactatctc 840 ctgtccgggg ctggggagca cctgaagact gacctgctgt tggagccgta caacaaatac 900 cgcttcctgt ccaatgggca cgtcaccatc cctgggcagc aggacaaaga catgttccag 960 gagaccatgg aggccatgag gattatgggc atcccagaag aggagcaaat gggcttgctg 1020 cgggtcatct cgggggttct tcagctcggc aacatcgtct tcaagaagga gcgcaacacc 1080 gaccaggcgt cgatgcccga caacacagct gcccaaaaag tgtcccacct cctggggatc 1140 aacgtgactg atttcaccag aggaatcctc accccgcgca tcaaggtggg acgggattac 1200 gtccagaagg cgcagactaa ggaacaggct gactttgcca ttgaggccct ggccaaggcc 1260 acctacgaac gcatgttccg ctggctggtg ctgcgcatca acaaggctct ggacaagacc 1320 aagaggcagg gcgcctcctt catcgggatc ctggacattg ccggcttcga gatcttcgat 1380 ctcaactcct tcgagcagct ctgcatcaac tacaccaacg agaagctgca acagctcttc 1440 aaccacacca tgttcatcct ggagcaggag gagtaccagc gcgagggcat cgagtggaac 1500 ttcatcgact tcggcctcga cctgcagccc tgcatcgacc tcatcgagaa gccagcaggc 1560 ccccctggca tcctggctct gctggacgag gagtgctggt tccccaaagc caccgacaag 1620 agcttcgtgg agaaggtgat gcaggagcag ggcacccacc ccaagttcca gaagcccaag 1680 cagctgaagg acaaagctga tttctgcatc atccactatg ctggcaaggt ggattacaaa 1740 gctgatgagt ggctgatgaa gaacatggac cccctgaacg acaacatcgc cacgcttctg 1800 caccagtcct ccgacaagtt cgtctcggag ctgtggaagg atgtggaccg catcatcggc 1860 ctggaccagg tggccggcat gtcagagacg gcgctgcccg gggccttcaa gacacggaag 1920 ggcatgttcc gcaccgtggg gcagctctac aaggagcagc tggccaagct gatggccacg 1980 ctgaggaaca ccaaccccaa cttcgtccgc tgtatcatcc ccaaccatga gaagaaggct 2040 ggcaaactgg acccccatct ggtgcttgac cagctgcgct gcaacggggt ccttgagggc 2100 atccggatct gccgccaagg cttccccaac cgagtggtct tccaggagtt ccggcagaga 2160 tacgagatcc tgacaccaaa ttccattccc aagggcttca tggacggcaa gcaggcctgt 2220 gtgctcatga tcaaagcctt ggagctggac agcaacctgt accgcatcgg ccagagcaag 2280 gtcttcttcc gggctggggt gctggcccat ctggaggagg agcgggacct gaagatcact 2340 gacgtcatca tcggcttcca ggcctgctgc aggggctacc tggccagaaa ggccttcgcc 2400 aagcggcagc agcagctgac ggccatgaag gtcctgcagc ggaactgcgc cgcctacctc 2460 aagctgcgca actggcagtg gtggaggctc ttcaccaagg tcaagccgct gctgcaggtg 2520 agccgacagg aggaggagat gatcgccaag gaggaggagc tggtgaaggt ccgagagaag 2580 cagctggccg ctgagaacag gctcacggag atggagacgc tgcagtccca gctcatggcg 2640 gagaagctgc agctgcagga gcagctccag gcagaaacag aactgtgtgc cgaggccgag 2700 gagctccggg ctcgcctgac ggccaagaag caggagctgg aggagatttg ccacgacctg 2760 gaagccaggg tggaagagga ggaggagcgc tgccagcatc tgcaggcgga gaagaagaaa 2820 atgcaacaga acatccagga actggaggag cagctggagg aggaggagag tgcccgccag 2880 aagctgcagc tggagaaggt gaccaccgag gccaagctga agaagctgga ggaggaccag 2940 atcatcttgg aagaccagaa ctgcaaactg gccaaggaga agaagttgct ggaagacaga 3000 atagctgagt tcaccaccaa cctcacagaa gaggaggaga aatcgaagag cctggccaag 3060 ctcaagaaca agcacgaggc catgatcact gacctggagg agcgcctccg aagagaggag 3120 aagcagcgtc aggagctgga aaagacccgc cggaagctgg agggagactc cacagacctc 3180 aacgaccaga tcgccgagct ccaggctcag atcgccgagc tcaagatgca actggctaag 3240 aaagaggagg agctccaggc tgccctggcc agggtggagg aagaagccgc ccagaagaac 3300 atggccctaa agaagatccg ggagctggaa tctcagattt ctgaactcca ggaagatctg 3360 gaatctgagc gtgcttctag gaataaagct gagaagcaga aacgggacct cggggaagag 3420 ctggaggctc tgaaaacaga gttggaggac actctggatt ccaccgctgc ccagcaggag 3480 ctcaggtcca aacgtgaaca ggaagtgaac atcctgaaga agacccttga ggaggaggcc 3540 aagacccacg aggcccagat ccaggagatg aggcagaagc actcgcaggc cgtggaggag 3600 ctggcggagc agctggagca gacgaagcgg gtgaaggcca acctcgagaa ggccaagcag 3660 accctggaga acgagcgggg ggagctggcc aacgaggtga aggccctgct gcagggcaag 3720 ggagactcag agcacaagcg caagcgggtg gaggcgcagc tgcaggagct gcaggtgaag 3780 ttcaacgagg gagagcgagt gcgcacggag ctggccgaca aggtctccaa gctgcaggtt 3840 gagctggaca acgtgacagg tcttctcacc cagtctgaca gcaagtccag caagctcacc 3900 aaggatttct ctgctctgga gtcccagctg caggacacgc aggagctgct gcaggaggag 3960 aaccggcaga agctaagcct gagcaccaag ctgaagcaga tggaggacga gaagaactcg 4020 ttcaaggagc agctggagga ggaggaggag gccaagcgga acctcgagaa gcagattgcc 4080 accctccatg cccaggtgag cgacatgaag aagaaggtgg aggacggtgt cgggtgcctg 4140 gagactgcag aagaagccaa gaggaagctc cagaaggacc tggaggggct gacccagcgc 4200 tacgaagaga aggtggccgc ctacgacaag ctggagaaga ccaagacccg gctgcagcag 4260 gagctagatg acctgctcgt ggacttggac caccagcggc agagcgtctc caacctggag 4320 aagaagcaga agaagttcga ccagctcctg gccgaggaga agaccatctc cgccaagtat 4380 gccgaggagc gtgaccgggc cgaggcggag gcgcgtgaga aggagaccaa ggcgctgtcg 4440 ctggcccggg ccctggagga agccatggag cagaaggcgg agctggagcg gctcaacaag 4500 cagttccgca cggagatgga ggatctcatg agctccaagg acgacgtcgg caagagtgtc 4560 cacgagctgg agaagtccaa gcgggccctg gagcagcagg tggaggagat gaagacccag 4620 ctggaggagc tggaggacga gctgcaggcc accgaggacg ccaagctgcg gctggaggtg 4680 aacctgcagg ccatgaaggc ccagttcgag cgggacctgc agggccgcga cgagcagagt 4740 gaggagaaga agaagcagct ggtcagacag gtgcgggaga tggaggcaga gctggaggat 4800 gagaagaagc agcgctcgct ggctgtggcc gctcggaaga agctggagat ggacctgaag 4860 gacctggagg cccacatcga cactgccaac aagaaccgag acgaagccat caaacagctg 4920 cggaagctgc aggcccagat gaaggactac atgcgcgagc tggaggacac gcgtgcttcc 4980 cgcgaggaga tcctggcgca ggccaaggag aacgagaaga agctgaagag catggaggcc 5040 gagatgattc agctgcagga ggaactggca gctgctgagc gtgccaagcg ccaggcccag 5100 caggagcggg acgagctggc cgaggagatt gccaacagca gcggcaaagg agccctggca 5160 ctggaggaga agcggcgtct ggaggcccgc atcgcccagc tggaggagga gctggaggag 5220 gagcagggca acacggagct ggtgaacgac cggctgaaga aggccaacct gcagatcgac 5280 cagatcaaca ccgacctgaa cctcgagcgc agccatgccc agaagaacga gacgcgtggg 5340 gacctgccgt ttgtcgtgcc ccgccggatg gcccggaaag gtacaggcga cggctccgac 5400 gaggagatgg acggcaaggc cgacggggct gaggccaaag ctgccgagta a 5451

Claims (15)

1. 미오신-9의 mRNA 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 개체의 제엽염 진단용 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 서열인 것인 개체의 제엽염 진단용 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 미오신-9은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 개체의 제엽염 진단용 조성물.
4. 미오신-9의 mRNA 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 개체의 제엽염 진단용 키트.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 서열인 것인 개체의 제엽염 진단용 키트.
6. 미오신-9 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 개체의 제엽염 진단용 조성물.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 폴리펩티드는 항체 또는 그 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제 (agonist) 또는 길항체 (antagonist)인 것인 개체의 제엽염 진단용 조성물.
8. 청구항 6에 있어서, 상기 미오신-9 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 개체의 제엽염 진단용 조성물.
9. 미오신-9 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 개체의 제엽염 진단용 키트.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 폴리펩티드는 항체 또는 그 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제 (agonist) 또는 길항체 (antagonist)인 것인 개체의 제엽염 진단용 키트.
11. 개체로부터 분리된 시료 중의 미오신-9의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 미오신-9의 발현 수준을 대조군에서 측정된 미오신-9의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 측정된 미오신-9의 발현 수준이 대조군에서 측정된 미오신-9의 발현 수준보다 높은 경우, 상기 개체는 제엽염에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
13. 청구항 11에 있어서, 상기 측정하는 단계는 미오신-9 단백질, 미오신-9의 mRNA, 또는 그 조합의 양을 측정하는 것인 방법.
14. 후보 물질을 개체에 투여하는 단계; 및
    상기 개체로부터 분리된 시료 중의 미오신-9의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 미오신-9의 발현 수준을 대조군에서 측정된 미오신-9의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 제엽염 치료제를 탐색하는 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 측정된 미오신-9의 발현 수준이 대조군에서 측정된 미오신-9의 발현 수준보다 낮은 경우, 상기 후보 물질을 제엽염 치료에 효과적인 것으로 단계를 더 포함하는 것인 방법.

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