KR102175792B1 - 줄기세포의 증식능을 탐지하기 위한 마커 및 이를 이용한 줄기세포의 고효율 증식방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 줄기세포의 증식능을 탐지하기 위한 마커 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 줄기세포의 증식능을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물, 줄기세포의 증식능 탐지용 키트, 및 줄기세포의 증식능 향상용 조성물 등을 제공한다. 일 양상에 따른 조성물 또는 방법에 의하면, 높은 증식능을 갖는 줄기세포를 손쉽게 선별할 수 있고, 줄기세포의 증식능을 유의적으로 향상시킬 수 있다.

Description

줄기세포의 증식능을 탐지하기 위한 마커 및 이를 이용한 줄기세포의 고효율 증식방법 {A marker for detecting proliferation ability of stem cells and a method for highly efficient proliferation of stem cells using the same}

줄기세포의 증식능을 탐지하기 위한 마커 및 이를 이용한 줄기세포의 고효율 증식방법에 관한 것이다.

세포 치료제로 활용하기 위하여, 다양한 종류의 세포에 대한 연구 및 개발이 진행 중에 있으며, 상기 세포로는 분화적 위치에 따라 전분화능 줄기세포 (배아줄기세포, 유도만능줄기세포 등), 다분화능 줄기세포 또는 성체 줄기세포 (골수/지방 유래 줄기세포, 제대혈/탯줄 줄기세포, 태아 줄기세포 등), 그리고 체세포 등이 있다. 이들 중에서도 인간 배아 줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 만들어지기 때문에 많은 윤리적인 문제점이 있으며, 전분화능 줄기세포는 이의 분화 조절 기술이 아직 완전하지 못하여 세포 치료제로 개발되기까지에는 많은 시간이 더 소요될 것으로 알려져 있다. 또한, 체세포를 이용한 세포 치료제의 연구 개발이 많은 결실을 보여주긴 하였으나, 체세포가 태생적으로 지니고 있는 낮은 증식성과 원료 조직 확보의 어려움 등으로 인해 실용화에는 어려움이 있다. 따라서, 이러한 문제점들을 극복하기 위한 대안으로서 성체 줄기세포의 연구에 많은 관심이 집중되고 있다.

성체 줄기세포 중에서도 중간엽 줄기세포는 체세포에 비해 증식능이 우수하며 뼈, 연골, 지방 등으로 분화할 수 있는 다분화성 줄기세포로서, 배아줄기세포 등의 만능줄기세포에 비해 훨씬 유전적으로 안정화되어 있어 연골재생, 심근경색 치료, 이식편대숙주질환의 치료 등을 위한 세포 치료제로 개발되어 왔다. 중간엽 줄기세포가 체세포에 비해 높은 자가재생산 능력을 보이는 것은 사실이나, 체내에 있을 때와는 달리, 체외 배양 조건에서는 세포의 증식성을 유지하기 위한 최선의 조건을 구비하여야 하며, 생체의 조건에 가까운 영양분, pH, 온도, 삼투압 등의 환경 조건을 맞추어 주어야 하는 어려움이 있다.

따라서, 중간엽 줄기세포의 체외 증식의 향상을 위한 다양한 연구가 현재 진행 중에 있다. 이 중에서도, 대한민국 등록특허 제1138091호에서는 미분화 중간엽 줄기세포의 증식능을 향상시키기 위한 배지 내 조성으로서 아미노산, 무기염류, 비타민류 등 일부 영양물질의 종류와 구체적인 농도를 언급하고 있으며, 대한민국 등록특허 제1168994호에서는 증식능 향상을 위한 성분으로서 사상자 추출물, 산약 추출물 등을 개시하고 있다. 그러나, 이러한 노력에도 불구하고, 높은 증식능을 지닌 중간엽 줄기세포를 선별 또는 생산할 수 있는 기술에 대한 수요가 여전히 존재하는 실정이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 줄기세포의 증식능을 향상시킬 수 있는 기술을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, DANCE 유전자와 중간엽 줄기세포의 증식능간 유의적인 관련성을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.

일 양상은 DANCE 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 줄기세포의 증식능을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 DANCE의 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 줄기세포의 증식능 탐지용 키트를 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 개체로부터 분리된 줄기세포의 DANCE 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식능을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 DANCE 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 줄기세포의 증식능 향상용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 배지에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 높은 증식능을 갖는 줄기세포를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

일 양상은 DANCE (Developmental arteries and neural crest epidermal growth factor-like) 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 줄기세포의 증식능을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "줄기세포 (stem cell)"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 상기 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다. 상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 구체적으로, 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포 (mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으며, 구체적으로 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이 역시 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "줄기세포의 증식능"은 구체적으로 개체로부터 분리된 줄기세포의 체외 증식 능력을 지칭한다. 구체적으로, 골수 및 지방 조직 등의 성체 조직 내에 소수로 존재하는 중간엽 줄기세포는 미분화 상태에서 증식률이 낮고, 미분화 상태에서 장기간 유지가 어려워 체외에서 증식 배양하여 보존하기 어렵다는 단점을 지니고 있다. 따라서, 높은 증식능을 갖는 줄기세포를 선별할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.

일 구체예에 따르면, DANCE 유전자의 발현 수준은 줄기세포의 증식능과 밀접한 관련성이 있는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 줄기세포 내 DANCE 유전자의 고발현을 통하여, 높은 증식능을 갖는 줄기세포를 선별할 수 있음을 규명하였다. 따라서, DANCE 유전자의 발현 수준은 줄기세포의 증식능을 탐지하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에 있어서, DANCE 단백질은 천연적으로 존재하는 야생형 DANCE 및 그의 기능적 변이체를 포함하는 것으로 해석된다. 또한, 본 명세서에 있어서, DANCE 유전자는 천연적으로 존재하는 야생형 DANCE 단백질을 코딩하는 유전자 및 그의 기능적 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 것으로 해석된다. 한편, 상기 DANCE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 서열은 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 수득할 수 있다.

상기 발현 수준은 DANCE 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이면 어느 것이나 포함될 수 있다. 상기 발현 수준은 mRNA 또는 단백질 단계에서의 발현 수준인 것일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 DANCE 유전자의 mRNA의 양, 단백질의 양, 또는 그 조합을 측정하기 위한 제제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제제는 DANCE 유전자의 전사체에 특이적으로 결합하는 물질인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 물질은 DANCE 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 뉴클레오티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제 (agonist) 또는 길항제 (antagonist), 또는 이의 조합일 수 있다.

상기 mRNA 발현 수준 측정은 줄기세포의 증식능을 탐지하기 위하여, 줄기세포에서 DANCE 유전자의 mRNA의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서 mRNA 양의 측정일 수 있다. 이는 mRNA를 직접 분리하거나, 상기 mRNA에 대한 프라이머 또는 프로브를 이용하는 것으로 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이 또는 그 조합을 이용하는 것을 포함할 수 있다. RT-PCR은 RNA를 분석하는 방법으로, mRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석하는 방법이다. 상기 RT-PCR 중 증폭 단계에서 상기 유전자에 특이적으로 제조된 프라이머 쌍을 사용하며, RT-PCR 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 상기 유전자의 mRNA 발현 여부와 발현 수준을 확인할 수 있고 이를 평균적인 증식능을 갖는 줄기세포, 즉, 대조군과 비교함으로써, 줄기세포의 증식능을 간편하게 판단할 수 있다.

본 명세서에 있어서 용어 "프라이머 (primer)"는 자유 3-말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 특정 염기 서열에 대해 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 (즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 예를 들면 DANCE 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 프라이머로서 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 줄기세포의 증식능을 확인할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기 프라이머는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서 용어 "프로브 (probe)"란 표적 핵산 예를 들면, mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 특정 mRNA의 존재 유무, 함량 및 발현량을 확인할 수 있도록 라벨링 (labeling)되어 있을 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA (single strand DNA) 프로브, 이중가닥 DNA (double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 예를 들면 DANCE 유전자의 mRNA와 상보적인 핵산 서열을 갖는 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현량을 측정함으로써 줄기세포의 증식능을 확인할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 프로브는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.

상기 단백질 발현수준 측정은 줄기세포의 증식능을 탐지하기 위하여, 줄기세포에서 DANCE 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정일 수 있다. 이는 예를 들어, DANCE 단백질을 직접 분리하거나, DANCE 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 DANCE 단백질을 확인하는 것일 수 있다. 이를 위한 분석방법은 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 또는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA를 포함할 수 있다. 또한 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있고, 상기 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 중간엽 줄기세포의 증식능을 확인할 수 있다.

상기 검출 방법은 평균적인 증식능을 갖는 줄기세포, 즉, 대조군에서의 상기 단백질의 발현량과 대상 줄기세포에서의 상기 단백질의 발현량을 조사 및 비교하는 방법으로 이루어질 수 있고, mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 단백질의 절대적 (예: ㎍/㎖) 또는 상대적 (예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 DANCE 단백질 또는 이의 단편에 대해 특이적으로 결합할 수 있다. DANCE의 단백질 단편은 예를 들면 면역원성 단편일 수 있다. 상기 단편은 DANCE 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프 (epitope)를 가지고 있는 단백질 단편을 의미한다. DANCE 유전자를 발현벡터에 클로닝하고 그 유전자에 의해 코딩되는 DANCE 단백질을 수득하고, 수득된 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다.

상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 또는 재조합 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 폴리클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유 동물을 사용할 수 있다. 상기 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 아주반트 (adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제할 수 있다.

단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체의 제조 방법에 대해 간단히 설명하면, 상기 단백질을 정제하여 약 10 ㎍의 적당량을 Balb/C 마우스에 면역화를 시키거나, 상기 단백질의 폴리펩티드 단편을 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨 다음, 마우스에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 단일클론 항체를 분리, 정제할 수 있다. 또한 단일클론 항체는 상업적으로 판매되는 DANCE 단백질에 대한 항체를 입수하여 사용할 수 있다.

다른 양상은 DANCE의 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 줄기세포의 증식능 탐지용 키트를 제공한다.

상기 키트는 예를 들어, DANCE 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현량을 측정할 수 있는 마이크로어레이일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상기 DANCE 유전자를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 DANCE 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가 프로브로서 기판에 부착되어 있는 것일 수 있다.

상기 키트가 예를 들어, DANCE 유전자의 mRNA의 발현량을 측정하기 위한 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수 (dEPC-water), 또는 멸균수를 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 DANCE 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 버퍼, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 또는 유리 슬라이드글라스가 이용될 수 있다. 발색효소는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 또는 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase)가 사용될 수 있다. 형광물질은 FITC, 또는 RITC가 사용될 수 있다. 발색 기질은 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD (o-페닐렌디아민), 또는 TMB (테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

상기 키트에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

또 다른 양상은 개체로부터 분리된 줄기세포와 DANCE 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜, 이들의 복합체를 형성시키는 단계; 상기 복합체의 수준을 측정하여 DANCE 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준을 대조군에서 측정된 DANCE 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식능을 예측하기 위한 정보제공방법를 제공한다.

상기 방법은 또한 상기 복합체의 수준을 측정하여 시료 중의 DANCE 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 복합체의 수준을 측정하는 것은 상기 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질에 부착된 검출 가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 복합체의 수준을 측정하는 것은 복합체를 다시 분리하여 상기 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 측정하는 것, 또는 상기 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질의 수준을 측정하는 것 또는 상기 복합체를 분리하지 않고 그 수준을 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합으로 수행할 수 있다.

상기 방법은 상기 DANCE 유전자의 측정된 발현 수준을 대조군에서 측정된 동일한 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다.

상기 방법은 상기 줄기세포로부터 측정된 유전자의 발현 수준이 대조군에서 측정된 동일한 유전자의 발현 수준보다 높은 경우, 상기 줄기세포는 높은 증식능을 갖는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포로부터 측정된 유전자의 발현 수준이 대조군에서 측정된 동일한 유전자의 발현 수준보다 같거나 낮은 경우, 상기 줄기세포는 낮은 증식능을 갖는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 한편, 상기 대조군은 평균적인 증식능을 갖는 줄기세포를 지칭할 수 있다.

상기 발현 수준의 변화는 줄기세포의 발현 수준이 대조군에 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가하거나, 대조군에 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.

상기 정보제공방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

또 다른 양상은 DANCE 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 줄기세포의 증식능 향상용 조성물, 또는 상기 줄기세포의 증식능 향상용 조성물을 포함하는 배지에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식능을 향상시키는 방법을 제공한다.

일 구체예에 따르면, DANCE 유전자의 발현 수준의 조절 또는 DANCE 단백질의 처리를 통하여, 낮은 증식능을 갖는 줄기세포의 증식능을 회복시킬 수 있음을 규명하였다. 따라서, DANCE 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 줄기세포의 증식능을 향상시키는데 사용될 수 있다.

상기 조성물은 줄기세포의 증식능을 향상시키기 위하여, DANCE 단백질을 포함하는 배지 조성물 형태로 제공될 수 있다.

상기 배지 조성물은 DANCE 단백질을 예를 들어, 1 내지 50 ng/ml 범위의 농도로 포함할 수 있다. 상기 DANCE 단백질의 농도는 예를 들어, 5 내지 50 ng/ml, 10 내지 45 ng/ml, 15 내지 40 ng/ml, 20 내지 35 ng/ml, 25 내지 30 ng/ml일 수 있으며, 구체적으로, 5 내지 15 ng/ml일 수 있다.

상기 배지 조성물은 줄기세포를 증식시킬 수 있는 성분들을 포함하는 배지로서, 이에 한정되는 것은 아니나, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 80% knockout DMEM, MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium 및 Chang's Medium MesemCult-XF Medium으로 구성된 군으로부터 선택되는 기본 배지일 수 있다. 또한 상기 배지는 20% knockout serum replacer (Gibco), 글루타민, 머캅토에탄올, 비필수 아미노산, 베이직 섬유아세포 증식인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 체내 또는 체외의 줄기세포에 DANCE 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 운반 또는 전달하기 위하여, 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터에 포함되어 형태로 제공될 수 있다. 상기 바이러스성 벡터로는 예를 들어, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 등이 있고, 상기 비바이러스성 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 리포솜, 세균인공염색체, 효모인공염색체 등이 적용될 수 있다.

상기 줄기세포의 증식능 향상용 조성물 및 줄기세포의 증식능을 향상시키는 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기한 바와 같은 것으로 이해된다.

또 다른 양상는 줄기세포의 증식능 향상용 조성물을 포함하는 배지에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 높은 증식능을 갖는 줄기세포를 생산하는 방법, 및 상기 방법에 의해 생산된 줄기세포를 제공한다.

상기 줄기세포는 대조군, 예를 들어, 비처리된 줄기세포에 비해 DANCE 유전자의 높은 발현을 갖는 것일 수 있으며, 상기 DANCE 유전자의 높은 발현은 상기 대조군에 비하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가한 것을 포함할 수 있다.

또한, 상기 줄기세포는 70시간 이하, 65시간 이하, 60시간 이하, 55시간 이하의 배가 시간 (doubling time)을 갖는 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 줄기세포는 70 내지 40시간, 70 내지 45시간, 70 내지 50시간, 70 내지 55시간, 70 내지 60시간, 70 내지 65시간, 65 내지 40시간, 65 내지 45 시간, 65 내지 50 시간, 65 내지 55시간, 65 내지 60 시간, 60 내지 40시간, 60 내지 45 시간, 60 내지 50 시간, 60 내지 55 시간, 55 내지 40 시간, 55 내지 45 시간, 55 내지 50 시간, 50 내지 40시간, 또는 50 내지 45시간을 갖는 것일 수 있다.

일 양상에 따른 조성물 또는 방법에 의하면, 높은 증식능을 갖는 줄기세포를 손쉽게 선별할 수 있고, 줄기세포의 증식능을 유의적으로 향상시킬 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물 또는 방법은 종래 줄기세포 치료제의 문제점으로 지적되었던 공여자 간 편차 (Donor variation)를 해소할 수 있고, 줄기세포 치료제의 생산 효율을 향상시킬 수 있다.

도 1은 줄기세포의 부착능에 DANCE의 발현이 미치는 영향을 위상차 현미경을 사용하여 관찰한 결과이다.
도 2는 줄기세포의 증식능에 DANCE의 발현이 미치는 영향을 확인한 결과로서, 도 2의 A는 CCK-8 어세이 결과이고, 및 도 2의 B는 중간엽 줄기세포 내 ATP 수준을 정량화하여 평가한 결과이다.
도 3은 줄기세포의 세포사멸에 DANCE의 발현이 미치는 영향을 FITC Annexin Ⅴ/7-AAD 키트를 사용하여 확인한 결과로서, 도 3의 A는 유세포 분석 결과이고, 도 3의 B는 상기 유세포 분석 결과를 정량화하여 비교한 결과이다.
도 4는 총 4개의 줄기세포 군의 DANCE 발현량을 비교한 결과로서, 도 4의 A는 DANCE 발현량을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이고, 도 4의 B는 상기 웨스턴 블롯 결과를 정량화하여 비교한 결과이다.
도 5는 총 4개의 줄기세포 군의 증식능을 비교한 결과로서, 도 5의 A는 동일 양의 세포 수를 씨딩 후 수확 시 중간엽 줄기세포의 수를 비교한 결과이고, 도 5의 B는 도 5의 A 결과를 바탕으로 중간엽 줄기세포의 배가 시간을 비교한 결과이다.
도 6은 줄기세포의 부착능 향상에 DANCE의 배양 전 또는 배양 중 처리가 미치는 영향을 위상차 현미경을 사용하여 관찰한 결과이다.
도 7은 줄기세포의 증식능 향상에 DANCE의 배양 전 또는 배양 중 처리가 미치는 영향을 확인한 결과로서, 도 7의 A는 중간엽 줄기세포의 수를 비교한 결과이고, 도 7의 B는 중간엽 줄기세포의 배가 시간을 비교한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. DANCE의 발현에 따른 줄기세포의 부착능 및 증식능 변화

본 실시예에서는 DANCE 발현이 줄기세포의 부착능 및 증식능에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 중간엽 줄기세포에 DANCE를 표적으로 하는 siRNA (이하, siDANCE로 지칭함.)를 처리하여, 중간엽 줄기세포의 DANCE 발현을 억제한 뒤, 상기 중간엽 줄기세포의 부착능 및 증식능 변화를 관찰하였다. 더불어, 상기 siDANCE를 처리한 중간엽 줄기세포에 다시 DANCE 10 ng/ml를 배양 배지에 첨가하여 처리한 경우 (siDANCE+DANCE), 이에 따른 중간엽 줄기세포의 부착능 및 증식능 변화를 관찰하였다. 구체적으로, 중간엽 줄기세포의 부착능은 위상차 현미경으로 촬영한 이미지로 평가하였으며, 중간엽 줄기세포의 증식능은 Cell counting kit-8 (CCK-8), 및 세포 내 ATP 수준의 측정을 통해 평가하였다. 여기에서, 상기 DANCE 단백질 등은 bio-techne 사(USA)로부터 수득하여 사용하였다 (Catalog Number: 9006-FB). 한편, 본 실시예에서는 무혈청 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양한 군 (Serum(-)), 스크램블 siRNA를 처리한 군 (siCTRL)을 각각 대조군과 비교군으로 설정하였다.

도 1은 중간엽 줄기세포의 부착능에 DANCE의 발현이 미치는 영향을 위상차 현미경을 사용하여 관찰한 결과이고, 도 2는 중간엽 줄기세포의 증식능에 DANCE의 발현이 미치는 영향을 확인한 결과이다. 그 결과, 중간엽 줄기세포의 부착능은 DANCE 유전자의 발현 억제에 의하여 저하되었고, 상기 부착능이 저하된 중간엽 줄기세포는 DANCE의 처리에 의하여 종전과 유사한 수준으로 부착능이 회복되었다. 또한, 중간엽 줄기세포의 증식능도 상기와 마찬가지로, DANCE 유전자의 발현 억제에 의하여 저하되었고, 이러한 변화는 DANCE의 처리에 회복되었다.

한편, 도 3은 중간엽 줄기세포의 세포사멸 (Apoptosis)에 DANCE의 발현이 미치는 영향을 FITC Annexin Ⅴ/7-AAD 키트를 사용하여 확인한 결과이다. 그 결과, 중간엽 줄기세포의 세포사멸과 DANCE 유전자의 발현간 관련성은 확인할 수 없었다. 이러한 실험결과는 본 실시예에서 확인한 중간엽 줄기세포의 부착능 및 증식능 변화는 세포 사멸로부터 기인하는 결과가 아니라, 세포 본연의 특성 변화로부터 기인한 것임을 나타내는 것이다.

실시예 2. DANCE의 발현에 따른 줄기세포의 배가 시간 변화

본 실시예에서는 줄기세포의 배가 시간에 DANCE의 발현이 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 수득한 중간엽 줄기세포들을 임의적으로 4개의 중간엽 줄기세포 군으로 분류한 뒤 (MSC A, MSC B, MSC C, 및 MSC D), 상기 분류된 각각의 중간엽 줄기세포 군에서 DANCE의 발현량을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 이와 함께, 상기 중간엽 줄기세포 군에서 동일양의 세포를 씨딩 후 수확한 세포 수 및 배가 시간 (Doubling time)를 산출함으로써, DANCE의 발현과 중간엽 줄기세포의 증식능간 상관 관계를 재차 검증하고자 하였다.

도 4는 총 4개의 중간엽 줄기세포 군의 DANCE 발현량을 비교한 결과로서, DANCE 발현량은 MSC D, MSC A, MSC B, MSC C의 순서로 높게 관찰되었다. 또한, 도 5는 상기 중간엽 줄기세포 군의 증식능을 비교한 결과이다. 그 결과, 중간엽 줄기세포의 수는 상기 DANCE 발현량과 유사한 경향을 나타내었고, 중간엽 줄기세포의 배가 시간은 DANCE 발현량과 상반되는 경향을 보여주었다. 이러한 실험 결과는 중간엽 줄기세포의 증식능은 DANCE의 발현과 밀접한 관련성이 있음을 나타내는 것이다.

실시예 3. DANCE의 처리에 따른 줄기세포의 부착능 또는 증식능 향상

본 실시예에서는 줄기세포의 부착능 또는 증식능 향상에 DANCE의 처리가 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 낮은 증식능 등을 지닌 중간엽 줄기세포를 대상으로, 씨딩 1시간 전 배양 배지에 DANCE 단백질 10 ng/ml을 배양배지에 첨가하여 처리한 경우 (Pretreat), 또는 배양 과정에서 배양 배지에 DANCE 단백질을 첨가한 경우 (Treat), 이들의 부착능 또는 증식능 변화를 확인하였다. 중간엽 줄기세포의 부착능 또는 증식능은 각각 실시예 1 또는 실시예 2와 동일한 방법으로 평가하였다. 한편, 본 실시예에서는 DANCE 단백질 미처리 군(CTRL)을 대조군으로 설정하였다.

도 6은 중간엽 줄기세포의 부착능 향상에 DANCE의 처리가 미치는 영향을 위상차 현미경을 사용하여 관찰한 결과이고, 도 7은 중간엽 줄기세포의 증식능 향상에 DANCE의 처리가 미치는 영향을 중간엽 줄기세포의 수 및 배가 시간을 통해 확인한 결과이다. 그 결과, 중간엽 줄기세포의 부착능은 DANCE 단백질을 처리한 모든 군에서 유의적으로 향상되었다. 또한, 중간엽 줄기세포의 증식능도 DANCE 단백질의 전처리 또는 배양 과정에서의 처리에 의해 유의적으로 향상되었고, 특히, P2에서의 배가 시간은 종전 87시간에서 49시간으로, P3에서 배가 시간은 84시간에서 50시간으로 현격하게 단축되었다. 이러한 실험 결과는 중간엽 줄기세포의 배양 전 또는 배양 과정에서 DANCE 단백질의 처리는 중간엽 줄기세포의 부착능 또는 증식능을 향상시킬 수 있음을 나타내는 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (15)

1. DANCE (Developmental arteries and neural crest epidermal growth factor-like) 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체로부터 분리된 줄기세포의 증식능을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 발현 수준은 DANCE 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA의 수준인 것인, 마커 검출용 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 DANCE 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 것인, 마커 검출용 조성물.
   
4. 청구항 3에 있어서, 상기 물질은 DANCE 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 뉴클레오티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제(agonist) 또는 길항제(antagonist), 또는 이의 조합인 것인, 마커 검출용 조성물.
   
5. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포인 것인, 마커 검출용 조성물.
   
6. 청구항 5에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것인, 마커 검출용 조성물.
   
7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 줄기세포의 증식능 탐지용 키트.
   
8. 개체로부터 분리된 줄기세포와 DANCE (Developmental arteries and neural crest epidermal growth factor-like) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜, 이들의 복합체를 형성시키는 단계;
   상기 복합체의 수준을 측정하여 DANCE 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
   상기 측정된 발현 수준을 대조군에서 측정된 DANCE 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식능을 예측하기 위한 정보제공방법.
   
9. 청구항 8에 있어서, 상기 줄기세포로부터 측정된 DANCE 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우, 상기 줄기세포는 높은 증식능을 갖는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 정보제공방법.
   
10. 청구항 8에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합으로 수행하는 것인, 정보제공방법.
    
11. DANCE (Developmental arteries and neural crest epidermal growth factor-like) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 개체로부터 분리된 줄기세포의 증식능 향상용 조성물.
    
12. 청구항 11에 있어서, 상기 조성물은 DANCE 단백질을 포함하는 배지 조성물 형태로 제공되는 것인, 조성물.
    
13. 청구항 11에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포인 것인, 조성물.
    
14. 청구항 13에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것인, 조성물.
    
15. 청구항 11의 조성물을 포함하는 배지에 개체로부터 분리된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 높은 증식능을 갖는 줄기세포를 생산하는 방법.

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