KR20110042468A

KR20110042468A - 줄기세포 이동성 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20110042468A
Application number: KR1020090099146A
Authority: KR
Inventors: 고성호; 김승현; 조광원; 노민영; 김경숙
Original assignee: 코아스템(주)
Priority date: 2009-10-19
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2011-04-27
Also published as: WO2011049346A2; US20120207724A1; EP2490724A4; WO2011049346A3; EP2490724B1; EP2490724A2; KR101229819B1; US8951511B2

Abstract

본 발명은 β- 픽스 ( PIX ) 유전자를 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 이동성 개선용 조성물, β-픽스( PIX ) 유전자의 발현량을 측정함으로서 줄기세포 이동성을 예측하는 방법 및 줄기세포의 이동성을 개선시키는 신경질환 치료 보조제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 이식된 치료용 줄기세포가 손상부위로 잘 이동하도록 유도함으로서 신경관련질환 치료의 효율성을 향상시키는 데 유용하게 이용될 수 있다.

β-PIX, 중간엽 줄기세포, 이동, 허혈성 뇌졸중,

Description

줄기세포 이동성 개선용 조성물{Compositions for Improving Migration Potential of Stem Cells}

본 발명은 줄기세포 이동성 개선용 조성물에 관한 것이다.

다른 타입의 조직에서 유래된 성체 줄기세포들은 각각 다른 분화능 및 기능적 특성을 가지므로 개개인의 질환을 치료하는데 더 효과적일수도, 덜 효과적일수도 있다(1). 환자의 치료를 위해 최적의 줄기세포 기원의 선택에 초점을 둔 임상 가이드라인을 만들기 위하여 각각의 줄기세포들의 기원에 따른 특성을 명확히 할 필요가 있다.

중간엽 기질세포(MSC)는 신경의 분화와 손상부위의 대체 또는 손상부위로 이동 후 손상된 뉴런에 신경보호를 제공함으로서 뇌허혈의 회복을 향상시킬 수 있다. MSC는 이처럼 세포치료에 있어서 매력적인 후보물질이나, 이식 후 세포의 이동 및 유도의 기작은 알려진 바가 없다. IGF-1(insulin-like growth factor-1)이 몇몇 줄기세포의 증식과 이동을 촉진한다고 알려졌으나, 줄기세포의 이동능력을 결정하는 핵심요소는 알려져 있지 않다. 자가 MSC는 면역 거부반응이 없어 치료적 이식에 유리하다. 그러나, 자가 MSC가 분화능이나 이동능이 결여 또는 손상된 경우, 치료효과는 현저히 감소하며 대안으로 만능공여자(universal donor) 방법을 사용해야 한다. 따라서 치료 효율의 향상을 위해 줄기세포의 이동에 관여하는 인자를 규명하는 것은 중요한 과제가 되어왔다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 이식된 줄기세포의 손상부위로의 이동성을 향상시킴으로서 줄기세포치료의 치료효능을 높이기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 줄기세포의 이동에 관여하는 인자를 규명함으로서, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 줄기세포 이동성 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 줄기세포의 이동성을 예측하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포의 이동성을 개선시키는 신경질환 치료 보조제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 가지는 β-픽스(PIX)를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 이동성 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 이식된 줄기세포의 손상부위로의 이동성을 향상시킴으로서 줄기세포치료의 치료효능을 증가시키기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 줄기세포의 이동에 관여하는 인자를 규명하였다.

본 명세서에서, 용어“유전자 전달체(gene carrier)”는 유전자를 세포 내로 운반하는 모든 수단을 의미하며, 유전자 전달은 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.

본 발명의 유전자 전달체는 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템이 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스 (Lockett LJ, et al., Clin . Cancer Res . 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies , Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies , Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin . Invest . 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 유전자 전달 시스 체은 β-PIX-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 렌티바이러스에 적용하여 제조된다.

본 발명의 유전자 전달 시스템을 제조하기 위해, β-PIX 인코딩 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, β- PIX 유전자는 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, β- PIX 유전자에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포 에서 작동하여 β-PIX 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, CMV 프로모터이다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다. 예를 들어, 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res . 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol . Cell Biol . 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res . 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol . Cell. Biol . 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell . Biol . 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어“이동성”은 치료용 세포가 이식부위로부터 손상부위로 효율적으로 이동하는 이동 활성(migratory activity)을 말한다.

본 발명에서 이용되는 서열목록 제 2 서열의 아미노산은 β- PIX 유전자에 의해 코딩되는 아미노산으로서, 본 발명자들의 실헌결과에 따르면 상기 아미노산의 발현은 줄기세포의 손상부위로의 이동능력을 크게 향상시킴으로서 신경질환에 대한 세포치료에 의한 신경기능의 개선에 매우 유효하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드는 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

본 발명에서 이용되는 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드는 β- PIX 유전자이다. 줄기세포 생물학에서 이 유전자의 알려진 기능은 아직까지 없으며, 다만 활성 장애물을 가로지르는 T 세포 주화성(3), 암세포의 이동(4) 및 신경돌기의 성장과 관련된 기능이 보고되었을 뿐이다.

본 발명이 적용될 수 있는 줄기세포는 제한이 없으며, 배아줄기세포, 성체줄 기세포, 유도만능줄기세포, 배아생식세포 및 배아종양세포를 포함하며, 바람직하게는 다분화능(multipotent) 성체줄기세포이고, 가장 바람직하게는 중간엽 줄기세포(MSC)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 전달체는 플라스미드, 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 배시니아 바이러스, 리포좀 또는 니오좀이며, 가장 바람직하게는 렌티바이러스이다.

레트로바이러스의 일종인 렌티바이러스는 현재 유전자 전달 벡터로 광범위하게 쓰이고 있지는 않으나, 줄기세포의 지놈에 통합(integration)되어 오랜 기간 전달된 유전자가 발현하도록 할 수 있고 분열중인 세포와 정지기에 있는 세포 모두에서 유전자 발현을 유도할 수 있어 일반적인 레트로바이러스와는 달리 분열하는 세포 뿐 아니라 성장이 멈춘 세포나 분화가 끝난 세포에도 감염할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 줄기세포 이동성 개선용 조성물로 형질전환된 줄기세포를 제공한다. 본 발명의 줄기세포 이동성 개선용 조성물 및 적용 가능한 줄기세포에 대해서는 상기에서 이미 언급하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 줄기세포 이동성 개선용 조성물로 형질전환된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 치료용 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 척수강내 주사 및 뇌실 내 주사 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 10²-10¹⁰ 세포이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 의해 치료되는 질환은 병리학적 또는 물리적으로 인한 신경조직의 손상으로부터 유래한 모든 신경 질환을 포함하며, 바람직하게는 파킨슨 병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 신경 위축성 경화증(ALS, amyotrophic lateral sclerosis), 뇌허혈(cerebral ischemia), 뇌출혈(cerebral hemorrhage), 척수손상(spinal cord injury), 운동신경원질환(motor neuron disease), 탈수초성 질환(demyelinating disease), 헌팅톤이며, 가장 바림직하게는 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생물학적 시료 내의 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 이식된 줄기세포의 이동성을 예측하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “생물학적 시료(biological sample)”은 분석 대상의 줄기세포가 활성을 띈 채로 포함되어 있는 물질을 말한다.

서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계는 통상적인 유전자의 발현 레벨을 측정하는 당업계에 알려진 모든 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 유전자에 의해 전사된 mRNA의 레벨을 측정하는 단계 또는 상기 mRNA에 의해 번역된 단백질의 레벨을 측정하는 단계를 통해 이루어질 수 있다.

구체적으로, mRNA 레벨의 측정은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다. mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal . Biochem . 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al. Science , 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus , Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus sp를 포함한다. 가장 바람직하게는 Pyrococcus sp . 유래의 중합효소로서, 본 발명자들은 Pyrobest^TM DNA 중합효소(TaKaRa, Japan)를 사용하였다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격 조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 이의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 상기 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다.

또한, 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드가 인코딩하는 단백질(β-PIX) 레벨의 측정을 통해 줄기세포의 이동성을 예측하는 방법에 있어 β-PIX 단백질에 대한 항체를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시할 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme -linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 β-PIX 단백질을 검출 하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료(예컨대, FLS) 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 β-PIX 단백질과 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p- phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 β-PIX 단백질에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료(예컨대, FLS)를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, β-PIX 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 β-PIX 단백질의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 줄기세포의 이동성을 예측할 수 있다.

또한 β-PIX 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅 및 면역세포화학 분석법을 수행할 수 있다. 구체적으로, 형질전환된 세포들을 배양 후 항-β-PIX 단일클론 항체와 반응시킨 뒤 TRITC(Tetramethylrhoodamine isothiocyanate) 등의 표지자가 접합된 적절한 2차 항체와 함께 배양한다. 이후, 음성 대조군과의 표지 검출정도를 비교하여 β-PIX 단백질의 발현 정도를 조사한다.

이러한 일련의 과정을 통하여, 분석대상의 줄기세포의 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드의 발현(예컨대, RT-PCR 방법 또는 웨스턴 블롯팅 방법에 의해 발현을 측정한 경우)이 정상 줄기세포보다 낮게 검출되는 경우(예컨대, 20% 이상 낮게 검출되는 경우) 줄기세포의 이동능력이 결여된 것(즉, 세포치료학적 효능이 없는 것)으로 판단한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 줄기 세포의 이동성을 개선시키는 신경질환 치료 보조제의 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오타이드의 발현량이 증가되는 경우 상기 시료는 줄기세포의 이동성을 개선시키는 신경질환 치료 보조제로 판정된다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포는 인간의 줄기세포이며, 가장 바람직하게는 중간엽 줄기세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 상기 뉴클레오티드 서열의 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학 물질, 뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이어, 시료가 처리된 세포에서 상기 뉴클레오티드 서열의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 상기 기재한 바와 같으며, 측정 결과, 상기 뉴클레오티드의 발현이 증가되는 경우에는 상기 시료는 줄기세포의 이동성을 개선시키는 신경질환 치료 보조제로 판정될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 줄기세포 이동성 개선용 조성물, 줄기세포 이동성을 예측하는 방법 및 줄기세포의 이동성을 개선시키는 신경질환 치료 보조제의 스크리닝 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 이식된 치료용 줄기세포가 손상부위로 잘 이동하도록 유도함으로서 신경관련 질환 치료의 효율성을 향상시키는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

실험동물의 준비 및 허혈 수술

모든 동물실험은 실험 동물의 취급 및 사용에 대한 한양대학교의 지침에 따라 실시되었으며, 한양대학교 동물실험윤리위원회(IACUC)의 승인을 받았다. 210-245 g 의 SD(Sprague-Dawley) 래트는 Biogenomics Inc.(Seoul, Korea)에서 구입하였다.

행동검사를 위한 적응 및 사전훈련 기간 후에 295-360 g 의 95마리의 SD 래 트의 중대뇌동맥(MCA)을 당업계에 공지된 내벽 필라멘트 기술(intraluminal filament technique)을 이용하여 2시간동안 폐색시켰다(1,2). 이후의 수술에서 래트를 타일타민(25 mg/kg) 및 졸라제팜(25 mg/kg Zoletil, Yuhan Corp., Seoul, Korea)을 자일라진(10 mg/kg, Rompun, Bayer, Frankfurt, Germany)과 함께 복강주사 함으로서 깊이 마취시켰고, 체온은 써미스터 보온 패드(Fine Science Tools Inc., Canada)를 이용하여 36.6 ± 0.5℃로 유지시켰다. 생리적 변화(pH, pCO₂, pO₂ 및 헤마토크릿)를 우측 대퇴 카테터에서 채취한 0.1 ml 동맥혈에서 혈액 분석시스템(International Technidyne, NJ, USA)을 이용하여 측정하였다. 동맥 카테터에서 스트레인 게이지 변환기(Strain Gauge Transducer)(LIFE KIT DX-360; Nihon Kohden, Tokyo, Japan) 및 증폭기(MacLab Bridge Amplifier, ADInstruments Pty Ltd., Castle Hill, Australia)를 이용하여 동맥압을 모니터링하였다. 위상성 압력, MAP(mean arterial pressure) 및 HR(heart rate)을 데이터 획득 시스템과 실험실 컴퓨터(MacLab 8 analog-to-digital converter 및 Macintosh Computer)을 이용하여 200/s의 표본추출 비율로 기록하였다. CBF(cerebral blood flow) 연구를 위해, Laser Doppler 유속계(ALF21; Advance, Tokyo, Japan)에 연결시킨 와이어형 프로브(지름 0.3 mm; Unique Medical, Tokyo, Japan)를 전정(bregma)의 2 mm 측면에 위치한 작은 버 홀(small burr hole)을 통해 6 mm 삽입하여 프로브가 전두엽 피질에 걸쳐있는 경막 표면을 마주보고 놓일 수 있도록 하였다. 허혈성 뇌조직 영역의 중심부를 관찰하기 위하여 피질의 6 mm 깊이에서 측정하였다.

폐색 2시간 후에, 공지된 방법에 의해 재관류를 실시하였다(1,3). 추가적인 10마리의 래트를 이용하여 좌측 총목동맥에 실을 삽입 후 즉시 당기므로서 샴 수술을 실시하였다. 그 밖의 과정은 통상적인 뇌허혈 수술에서의 방법과 동일하다.

페리덱스 및 프로타민 설페이트를 이용한 중간엽 기질세포의 표지

상업적으로 구입가능한 Feridex IV (TAEJOON Pharmaceutical Co., Ltd., Seoul, Korea Mfd by Advanded Managnetics, Inc. Combridge, MA, USA)는 11.2 mg/mL (11.2 iron /)의 철분 총함량을 가진다. 프로타민 설페이트(Sigma, USA)를 사용 직전 증류수에 1 mg/mL 농도로 신선한 저장액 상태로 준비하였다. 25 /mL 농도의 Feridex IV를 100 unit/ml의 페니실린(GIBCO, Grand Island, N.Y., USA) 및 100 mg/ml 스트렙토마이신(GIBCO, Grand Island, N.Y., USA)을 함유한 무혈청 DMEM 배지(Gibco invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 첨가하였다. 프로타민 설페이트를 이후 1μg/ml 농도로 용액에 첨가하였다. Feridex IV 및 프로타민 설페이트를 함유하는 용액(FE-Pro 복합체)을 60분 간 혼합하였다. 이후, 용액을 점착성의 hMSC 세포 배양액(GIBCO, Grand Island, N.Y,, USA)에 첨가하였다. FE-Pro 복합체를 직접 세포에 넣어주고 2시간동안 배양한 뒤 동일한 부피의 완전배지를 다시 세포에 넣어주었다. 이후 세포를 밤새 배양하였다.

허혈성 뇌졸증 래트에의 MSC 이식

이식된 MSC의 이동 활성이 그 유래에 따라 다른지를 검사하기 위해 4종류의 MSC(ALS환자의 ALS-MSC(IRB-No), Cambrex에서 구입한 C-MSC, 제대혈에서 채취한 UCB-MSC(IRB-No) 및 인간 제대의 피하층/내피하층에서 채취한 hUC-MSC)를 좌측 MCA 폐색 후 2주 뒤에 각각의 18마리의 SD 래트에 정위수술 방법으로 주입하였다(각각 ALS-MSC, C-MSC, UCB-MSC, 및 hUC-MSC 그룹). 동일한 부피의 PBS(GIBCO, Grand Island, N.Y,, USA)를 남은 18마리의 래트에 유사한 방법으로 주사하였다(PBS 그룹). 이들 모든 그룹은 체중(317.3 ± 22.0 g - 324.3 ± 14.1 g), 운동성, 행동부족 수치(6.6±0.7 - 7.0±0.8)가 통계적인 관점에서 이식 전과 다르지 않다. 동물들은 펜토바비탈 소듐(50 mg/kg, IP)으로 마취시켰다. 각각의 MSC 6 x 10⁵ 개의 5 부유액을 이식한 뒤 손상부위 반대측(Site: AP = +0.7, R= +2, V = -5.5)에 PBS를 주입하였다. 부유액을 2분간 주입하였으며, 주사기는 주입부위에 2분간 더 남겨두었다. 대조군에는 PBS 5 를 사용하였다. 양쪽 그룹의 래트에 세포이식 이틀 전부터 실험 종료시까지 사이클로스포린 A(10 mg/kg body weight, subcutaneously; Sandoz, Switzerland)로 면역억제를 하였다.

허혈성 뇌졸증 래트의 행동 테스트

모든 동물들은 MCA 폐색 7일 전부터 신경행동학적 평가를 위한 훈련을 받았다. 신경결핍 수치(NDS)를 평가하기 위해 의식(0, 정상l; 1, 불암함; 2, 둔감함; 3, 혼스상태; 4,사망), 걸음(0, 정상; 1, 발 내전; 2, 불균형 걸음; 3, 회전; 4, 서지 못함; 5, 움직임 없음) 및 다리 상태(0, 정상; 1, 경련; 2, 축 늘어짐)로 구성된 신경학적 시험을 매일 실시하였고, 고통에의 반사작용(0, 정상; 2, 활동저조; 4, 무반응) 시험을 MAC 폐색 후 2시간, 7일, 14일, 21일(이식 직전), 28일 및 35일 후에 실험군에 대한 정보를 모르는 실험자가 실시하였다(4).

인 비보 MRI 연구

본 발명자들은 래트 뇌졸중 모델에서 이식한 중간엽 기질세포(MSC, mesenchymal stromal cell)의 주입 부위로부터 손상 부위로의 이동을 비 침투적으로 추적하기 위해 in vivo MR 영상화에 기초한 스크리닝 방법을 개발하였다.

MRI 연구에서, 모든 래트들은 펜토바비탈 소듐(50 mg/kg IP)으로 마취하고 Taoka 래트 크래들에 고정시켰다. 래트들은 자력으로 호흡을 유지하였다. 3 인치 지름의 원형 수신 전용 표면코일을 각각의 래트의 머리 아래에 도말하되, 코일의 중심부가 양 귀 및 양 눈 사이의 중간선을 잇는 중간지점에 오도록 했다. 체온은 히팅 패드로 37℃를 유지하였다. MR 영상실의 온도는 대략 27℃로 조절하였으며, MR 이미징은 3T Clinical Instrument(Philips, Netherland)와 동물 코일(Shanghai Chenguang Medical Technologies Co., LTD, China)을 이용하여 수행하였다. 허열 손상의 정도를 알아보기 위하여 정수리와 뇌의 하부 사이의 스핀-에코 기술(TR=11,000 ms and TE=125 ms)을 이용한 FLAIR(Fluid Attenuated Inversion Recovery)영상을 얻었다. 그 밖의 이미지 파라미터로 슬라이스 두께 0.7mm, 점 해상도 284 X 286 m, 획득 숫자는 1이다. MPGR(Multiplanar Gradient-Recalled) 펄 스 시퀀스를 이용한 래트 뇌의 T2* 강조 영상을 얻기 위하여 다음과 같은 파라미터가 채택되었다 : TR= 596 ms, TE = 16 ms, 단면두께 = 0.7mm, 점 해상도 : 292 X 290 m, 획득 숫자 = 1.

인간 미토콘드리아의 면역조직화학

MPGR에 나타난 낮은 신호강도가 이식된 MSC에 의한 것인지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 C-MSC 그룹의 래트 3마리를 이식 35일 후에 죽였다. 항-인간 미토콘드리아 단일클론 항체(1:100, Chemicon, Temecula, CA, USA)를 1차 항체로 사용하였다. 뇌의 두정 단면(20 두께)을 만들고 1차 항체 중 하나와 4℃에서 72시간 동안 배양하였다. 단면은 결합하지 않은 항체들을 제거하기 위하여 5분간 3번 세척하고 TRITC(Tetramethylrhoodamine isothiocyanate; 적등색형광)(Invitrogen, Salsbad, CA, U.S.A)와 접합된 적절한 2차 항체와 함께 24시간동안 배양하였다. 결합하지 않은 2차 항체는 각각 5분간 세 번씩 세척함으로서 제거하였다. 공기건조 후, 커버슬립을 Vector Shield 봉입제와 합께 슬라이드에 올려놓았다. 음성 대조군으로서, 1차 항체 없이 상기의 과정을 반복하였다. 세포 염색은 음성 대조군에서 관찰되지 않았다.

LEICA DMIRE2 현미경(Germany)에 탑재된 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템을 사용하였다. 면역형광-표지 슬라이드를 위해, 슬라이드 위의 붉은(TRITC) 형광색소를 557 nm 파장의 레이저 빔으로 여기시켰다. 방사는 각각 광전자 배증관 튜브에서 576 nm 방사 필터를 통해 순차적으로 이루어졌다. 이식된 줄기세포 는 인간 미토콘드리아의 항체와 함께 염색하였다,

재조합 렌티바이러스의 제작 및 증식

인 비트로에서의 줄기세포 이동에 대한 β-PIX의 역할을 확인하기 위하여, β-PIX 특이적 shRNA 또는 cDNA를 가지는 렌티바이러스 DNA를 사용하였다. shRNA를 포함하는 렌티바이러스 DNA는 Trans-Lentiviral^TM GIPZ packaging System (Open Biosystem, USA)과 함께 Open biosystems에서 구입하였다. 바이러스 저장액은 제조자의 설명서대로 제작하였다. β- PIX 유전자의 과발현을 위하여, β- PIX 및 GFP cDNA를 pLenti6/V5-D-TOPO(Invitrogen, USA)에 서브클로닝한 후 시퀀싱을 통해 이를 확인하였다. 재조합 β-PIX- 또는 GFP- 렌티바이러스를 제조자(Invitrogen, USA)의 설명서를 조금 변형하여 제작하였다. 바이러스 저장액 내의 바이럿 농도를 측정하기 위하여 바이러스 상등액을 순차적으로 희석한 후 6 μg/ml 폴리브렌(Sigma, USA)과 함께 hBM-MSC 또는 HT1080 세포에 형질전환 시켰다. 이후 세포들은 10일동안 6 μg/ml 블라스티시딘(Invitrogen, USA)을 이용하여 선별하였다(M. Kimura et al., 1994). 나머지 세포는 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 현미경으로 콜로니의 숫자를 세었다. GFP 유전자를 운반하는 렌티바이러스에 있어서, 바이러스는 상기의 과정에 의해 hBM-MSC로 형질전환시켰다. GFP-형질전환 hBM-MSC를 3일간 성장시키고 1% 파라포름알데히드로 고정시킨 후 FACS 기기를 사용하여 형광 활성을 측정하였다. HT1080 세포에서 6 x 10⁵ TU(transduction unit)/ml 의 β - PIX 유전자-형질전환 바이러스 입자를, hBM-MSC에서 2 x 10⁵ TU/ml를 얻었으며, hBM-MSC에서 1 x 10⁵ TU/ml의 shRNA-형질전환 바이러스 입자를 얻었다. 고농도의 재조합 바이러스를 얻기 위해, 바이러스-함유 상등액을 90분간 28,000 g로 원심분리시키고 -80℃에서 저장하였다.

렌티바이러스 감염

hBM-MSC를 8 x 10⁵cells/75T 플라스크의 농도로 배양하였다. MSC를 37℃에서 5 ml DMEM 배지 내에서 shRNA, GFP 또는 β- PIX 유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자의 0, 2 또는 5 MOI(multiplicity of infection)에 밤새 노출시켰다. 이후 배지를 제거하고 세포들을 DMEM으로 1회 세척하였다. 정상 배지에서 세포들을 다시 4일간 배양한 뒤에, β- PIX 유전자 변형된 MSC에서의 이동활성의 변화를 인 비보 및 인 비트로에서 상기의 방법을 통해 측정하였다.

세포이동분석

세포이동을 QCM 주화성(포어크기 8 ) 96-웰 이동분석기(Chemicon, USA)를 사용하여 시험하였다. 요약하자면, 이동 챔버를 50 의 HA(5 mg/ml)로 코팅하고, 밤새 공기건조 하였다. 100 무혈청 배지 내의 5 X 10⁴ 개 MSC를 이동 챔버에 넣었다. 하부 챔버는 10% BSA(bovine serum albumin)를 포함하는 무혈청 배지 150 를 함유한다. 플레이트는 37℃ 로 5% CO₂ 내에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후에 이동챔버 내의 배지에 부유중인 MSC를 배지 밖으로 튕겨냄으로서 부드럽게 제거하였다. 막의 위쪽에 흡착한 세포들은 솜 면봉으로 긁어 제거하였고, 이동 챔버 플레이트는 150 μl의 전가온(prewarmed) 세포 분리용액을 포함하는 새로운 96-웰 피더 트레이에 위치시켰다. 37℃에서 30분간 배양한 후, 50 μl의 라이시스 완충액/염색 용액을 피더 트레이에 첨가하고 상온에서 15분간 배양하였다. 혼합물(150 μl)을 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고 플레이트를 480/520 nm 필터세트(HTS 7000 Bioassay reader)와 함께 형광 플레이트 리더를 이용하여 제조자의 설명서에 따라 측정하였다(5).

실시간 PCR 및 RT - PCR

β- PIX의 mRNA 발현량을 조사하기 위하여, 4종류의 MSC(ALS-MSC, C-MSC, UCB-MSC 및 hUC-MSC)을 수득하고 Trizol 시약(Invitrogen, USA)을 이용하여 제조자의 설명서에 따라 총 RNA를 추출하였다. 5 μg의 총 RNA를 RevertAid^TM M-MuLV 역전사 효소(MBI Fermentas, USA), 0.2 μg의 랜덤 프라이머(Invitrogen, USA), 1 mM dNTP 및 완충액을 이용하여 역전사 시켰다. cDNA의 첫 번째 가닥은 5’-AAGCGCAAACCTGAACGGAA-3’ (업스트림) 및 5’-TCACCTCAGAACTGGTCTTCA-3’ (다운스트림)를 β-PIX의 프라이머로 하고, 5’-TGCTATCCCTGAAAGCCTCTG-3’(업스트림) 및 5’-AGCTGGGGTGATGAAGCTGTA-3’ (다운스트림)를 β- actin의 프라이머로 하여 Taq DNA 중합효소(MBI Fermentas, MD)를 이용하여 증폭시켰다. 인간 β- PIX 유전자의 클로닝을 위하여, 야생형 MSC의 첫 번째 가닥 cDNA를 5’-CACCATGACCGATAATAGCAACAA -3’(정방향) 및 5’-TCACCTCAGAACTGGTCTTCA-3’(역방향)를 프라이머로 하여 Pyrobest^TM DNA 중합효소(TaKaRa, Japan)를 이용하여 증폭시켰다. PCR 순환 파라미터는 다음과 같다: 초기 분리(denaturation)를 2분간 94℃에서 수행하였고; 분리를 94℃에서 30초의 순환을 30회 실시함으로서 수행하였고; 프라이머 결합(annealing)을 30초간 55℃에서 수행하였으며, 연장(extension)을 1분간 72℃에서 수행하였고, 마지막 연장을 10분간 72℃에서 수행하였다. 증폭 후에, PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동으로 분석하였다. 유전자 전사물의 정량을 위하여 20 /웰의 최종 부피로 실시간 PCR을 SYBR Green PCR 키트(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA)를 이용하여 96 웰-플레이트에서 수행하였다. 각각의 반응부피에는 10 의 SYBR Green 혼합물(2배 농축), 6 의 H₂O, 1 의 cDNA 샘플 및 3 의 프라이머 혼합물(센스 및 안티센스 프라이머 각각 2 pmol/)이 포함되었다. 실시간 PCR 순환의 파라미터는 다음과 같다: 초기 분리(denaturation)를 10분간 95℃에서 수행하였고; 분리를 95℃에서 15초의 순환을 40회 실시함으로서 수행하였고; 프라이머 결합(annealing) 및 연장(extension)을 1분간 60℃에서 수행하였다. 증폭 후 온도를 60℃에서 90℃로 올림으로서 해리곡선을 만들었다. 얻어진 Ct값을 시료 내의 cDNA 절대량(E-Ct)으로 환산하였다(37). 시료간 서로 다른 cDNA의 양을 보정하기 위하여 타겟 PCR을 기준 유전자 의 세트에 대한 PCR의 기하평균값으로 표준화하였다.

정량적 PCR 어레이

인간 종양 전이의 RT² Profiler PCR 어레이(PAHS-028 SuperArray Bioscience Corporation, Frederick, MD, USA)의 두 플레이트를 이용하여 정상 MSC 및 ALS-MSC의 정량적 PCR 검증된 cDNA 시료를 비교하였다. 1 의 총 RNA에 해당하는 cDNA를 각각의 플레이트에 사용하였다. RT²SYBR Green/ROX Q-PCR Master Mix로 cDNA를 혼합하였고 각기 다른 프라이머를 함유하는 각각의 웰에 25 씩을 첨가하였다. 플레이트를 상기와 동일한 조건 하에서 통하여 PCR을 실시하였다. 결과물을 기준 유전자의 세트에 대해 표준화시켰다. 어레이 상의 기준 유전자를 이용한 분석으로 비교결과를 얻었다.

웨스턴 블롯팅 및 면역세포화학

β-PIX 단백질의 발현량 차이를 알아보기 위해 β-PIX 특이적 항체(Cell signaling, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯팅 및 면역세포화학 분석법을 수행하였다.

우선, 공지된 방법을 통해 항체(1:1000)를 이용하여 웨스턴블롯팅을 실시하였다(28). 24시간동안 배양한 5 X 10⁶ MSC에 대해 웨스턴블롯팅을 하였다. 모든 그림은 적어도 5개의 독립된 실험을 나타낸다. 그리고 나서, 면역세포화학 분석 을 수행하였다.

24시간의 배양 후에, 세포들을 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데히드를 녹인 PBS에서 20분간 4℃에서 고정시켰다. 이후 몇 번을 더 세척하고, 세포를 0.5 % Triton X-100으로 20분 간 가투과화 시켰다. 세포들을 5% BSA를 녹인 PBS에서 한 시간 동안 배양한 뒤, 항-β-PIX 단일클론 항체(1:100)와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 배양 후, 결합하지 않은 항체의 제거를 위해 세포들을 각기 5분간 세 번 세척한 뒤에, 상온에서 20분간 TRITC가 접합된 적절한 2차 항체와 함께 배양하였다. 결합하지 않은 2차 항체는 10분간의 세척을 세 번 실시하여 제거하였다. 커버슬립을 Vector Shield 탑재 배지(Vector Laboratories, CA, USA)로 도말하였다. 음성 대조군으로서, 상기 과정을 마우스 IgG 항체(Kamiya Biomedical, WA, USA)를 이용하여 수행하였다.

신경영양 인자의 비교

본 발명자들은 β-PIX 발현의 감소가 MSC의 운동신경 기능의 개선에 중요한 신경성장 인자의 분비를 감소시킬 것이라 가정하였다. 총 1 X 10⁴ 개의 ALS-MSC 또는 C-MSC를 96-웰 플레이트에 도말하였다. 24시간의 배양 후에, 각각의 배양 상등액을 200 μL 샘플 3개로 나누었다. 배양 상등액 내에서 VEGF(Vascular endothelial growth factor), SDF-1α(stromal cell-derived factor-1α) 및 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)의 양을 BDNF, SDF-1α 및 VEGF ELISA 키 트(R&D Systems, USA)를 이용하여 제조자의 설명서에 따라 측정하였다(2).

실험결과

유래를 달리하는 각 MSC 들의 이동능력의 비교

본 발명자들은 in vivo MR 이미지를 이용하여 래트 뇌의 Ferumoxides-표지 MSC의 이동을 추적하였다. MSC는 근위축성 측색 경화증 환자의 골수(ALS-MSC), Cambrex(C-MSC)에서 구입한 정상인의 골수, 인간 탯줄 조직(hUC-MSC) 및 인간 제대혈(UCB-MSC)을 포함한 각기 다른 곳에서 유래한 것들이다. 허혈성 래트 뇌의 T2*-강조 영상에서 이동성 MSC의 진로는 저음영 복셀(hypointense voxel)(예를 들어 어두운 부분)을 관찰함으로서 쉽게 추적할 수 있다(도 5). 놀랍게도, 다른 모든 MSC들이 손상부위로 이동한 반면 ALS-MSC는 이동 능력이 결여되어 있었다(도 1a). 각각의 그룹의 10마리의 래트 중에서 저음영 복셀이 C-MSC 그룹의 7마리, hUC-MSC 그룹의 8마리, UCB-MSC 그룹의 9마리, ALS-MSC 그룹의 한마리의 래트에서 검출되었다. 이로 인해 MSC 이식 분야에서 모든 MSC 들이 뇌에서 이동성을 가진다는 가정은 부정된다. MSC 이식 래트 뇌에서 ALS-MSC 및 C-MSC의 이동 습성은 이식 후 35일 후까지 나타났고, 35일 후에는 ALS-MSC는 C-MSC와 비교할 때 이동 활성이 관찰되지 않았다(도 1b). 이러한 각각 다른 MSC의 in vivo 이동능력에 대한 MR 연구의 결과는 도 1c에 나타난 in vitro 트랜스웰(transwell) 주화성 분석 결과에 의해서도 지지된다. 나아가 허혈성 뇌졸증에 걸린 래트는 ALSMSC가 이식된 경우 운동신경 기능이 개선되지 않은 반면, C-MSC, hUC-MSC 또는 UCB-MSC가 이식된 경우 운동신경의 기능 회복이 크게 향상되었다(도 2).

허혈성 뇌졸중 래트의 행동 테스트

NDS(neurologic deficit score)의 감소는 행동 기능이 향상되었음을 의미한다. 도 7에서 나타나듯이, 이식 전에는 다섯 개 그룹 간 차이가 없으나, 통계적으로 눈에 띄는 차이는 이식 21일 후부터 나타남에도 이식 7일 후부터는 C-MSC, hUC-MSC 및 UCB-MSC 그룹(각 그룹에서 N=10)이 ALS-MSC 그룹(N=10)보다 크게 낮아졌다. 다시 말하면, C-MSC, hUC-MSC 및 UCB-MSC는 허혈성 뇌졸증 래트의 행동기능을 크게 개선시켰지만, ALS-MSC는 그렇지 않았다.

정량적 PCR 어레이

암세포 이동에 필요하고, MSC가 손상부위로 이동하는데 중요한 역할을 하는 유전자를 동정하기 위하여 정량 PCR 방법을 사용하게 되었다(도 3). VEGFA, CTSK, β-PIX 및 MTSS1과 같은 유전자들의 발현은 C-MSC에서 보다 ALS-MSC에서 훨씬 낮다(도 2a). VEGFA는 ALS 환자에서 저발현된다고 알려져 있으므로 내부대조군으로 사용되었다(2). β-PIX 유전자의 발현은 7.58배 감소하였으나 줄기세포 생물학에서 이 유전자의 알려진 기능은 아직까지 없었다. 대신에, 활성 장애물을 가로지르는 T 세포 주화성(3), 암세포의 이동(4) 및 신경돌기의 성장과 관련된 확실한 기능이 보고된 바 있다.

독립 유전자	GeneBank 접근번호	심 볼	설 명
Hs.158932	NM_000038	APC	Adenomatous polyposis coli
Hs.100426	NM_015399	BRMS1	Breast cancer metastasis suppressor 1
Hs.251526	NM_006273	CCL7	Chemokine (C-C motif) ligand 7
Hs.502328	NM_000610	CD44	CD44 molecule (Indian blood group)
Hs.461086	NM_004360	CDH1	Cadherin 1, type 1, E-cadherin (epithelial)
Hs.116471	NM_001797	CDH11	Cadherin 11, type 2, OB-cadherin (osteoblast)
Hs.171054	NM_004932	CDH6	Cadherin 6, type 2, K-cadherin (fetal kidney)
Hs.512599	NM_000077	CDKN2A	Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4)
Hs.162233	NM_001273	CHD4	Chromodomain helicase DNA binding protein 4
Hs.508716	NM_001846	COL4A2	Collagen, type IV, alpha 2
Hs.143212	NM_003650	CST7	Cystatin F (leukocystatin)
Hs.208597	NM_001328	CTBP1	C-terminal binding protein 1
Hs.534797	NM_001903	CTNNA1	Catenin (cadherin-associated protein), alpha 1, 102kDa
Hs.632466	NM_000396	CTSK	Cathepsin K
Hs.716407	NM_001912	CTSL1	Cathepsin L1
Hs.522891	NM_000609	CXCL12	Chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell-derived factor 1)
Hs.593413	NM_003467	CXCR4	Chemokine (C-X-C motif) receptor 4
Hs.22393	NM_003677	DENR	Density-regulated protein
Hs.523329	NM_004442	EPHB2	EPH receptor B2
Hs.434059	NM_001986	ETV4	Ets variant 4
Hs.374477	NM_005243	EWSR1	Ewing sarcoma breakpoint region 1
Hs.481371	NM_005245	FAT1	FAT tumor suppressor homolog 1 (Drosophila)
Hs.165950	NM_002011	FGFR4	Fibroblast growth factor receptor 4
Hs.646917	NM_002020	FLT4	Fms-related tyrosine kinase 4
Hs.203717	NM_002026	FN1	Fibronectin 1
Hs.333418	NM_014164	FXYD5	FXYD domain containing ion transport regulator 5
Hs.82963	NM_000825	GNRH1	Gonadotropin-releasing hormone 1 (luteinizing-releasing hormone)
Hs.208229	NM_032551	KISS1R	KISS1 receptor
Hs.396530	NM_000601	HGF	Hepatocyte growth factor (hepapoietin A; scatter factor)
Hs.44227	NM_006665	HPSE	Heparanase
Hs.37003	NM_005343	HRAS	V-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog
Hs.90753	NM_006410	HTATIP2	HIV-1 Tat interactive protein 2, 30kDa
Hs.160562	NM_000618	IGF1	Insulin-like growth factor 1 (somatomedin C)
Hs.83077	NM_001562	IL18	Interleukin 18 (interferon-gamma-inducing factor)
Hs.126256	NM_000576	IL1B	Interleukin 1, beta
Hs.846	NM_001557	IL8RB	Interleukin 8 receptor, beta
Hs.524484	NM_002206	ITGA7	Integrin, alpha 7
Hs.218040	NM_000212	ITGB3	Integrin, beta 3 (platelet glycoprotein IIIa, antigen CD61)
Hs.527778	NM_002231	CD82	CD82 molecule
Hs.95008	NM_002256	KISS1	KiSS-1 metastasis-suppressor
Hs.505033	NM_004985	KRAS	V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
Hs.449909	NM_002295	RPSA	Ribosomal protein SA
Hs.599039	NM_006500	MCAM	Melanoma cell adhesion molecule
Hs.484551	NM_002392	MDM2	Mdm2 p53 binding protein homolog (mouse)
Hs.132966	NM_000245	MET	Met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor)
Hs.444986	NM_006838	METAP2	Methionyl aminopeptidase 2
Hs.651869	NM_002410	MGAT5	Mannosyl (alpha-1,6-)-glycoprotein beta-1,6-N-acetyl-glucosaminyltransferase
Hs.2258	NM_002425	MMP10	Matrix metallopeptidase 10 (stromelysin 2)
Hs.143751	NM_005940	MMP11	Matrix metallopeptidase 11 (stromelysin 3)
Hs.2936	NM_002427	MMP13	Matrix metallopeptidase 13 (collagenase 3)
Hs.513617	NM_004530	MMP2	Matrix metallopeptidase 2 (gelatinase A, 72kDa gelatinase, 72kDa type IV collagenase)
Hs.375129	NM_002422	MMP3	Matrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, progelatinase)
Hs.2256	NM_002423	MMP7	Matrix metallopeptidase 7 (matrilysin, uterine)
Hs.297413	NM_004994	MMP9	Matrix metallopeptidase 9 (gelatinase B, 92kDa gelatinase, 92kDa type IV collagenase)
Hs.525629	NM_004689	MTA1	Metastasis associated 1
Hs.700429	NM_014751	MTSS1	Metastasis suppressor 1
Hs.202453	NM_002467	MYC	V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)
Hs.437922	NM_005376	MYCL1	V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog 1, lung carcinoma derived (avian)
Hs.187898	NM_000268	NF2	Neurofibromin 2 (merlin)
Hs.118638	NM_000269	NME1	Non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in
Hs.463456	NM_002512	NME2	Non-metastatic cells 2, protein (NM23B) expressed in
Hs.9235	NM_005009	NME4	Non-metastatic cells 4, protein expressed in
Hs.279522	NM_006981	NR4A3	Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 3
Hs.466871	NM_002659	PLAUR	Plasminogen activator, urokinase receptor
Hs.409965	NM_002687	PNN	Pinin, desmosome associated protein
Hs.500466	NM_000314	PTEN	Phosphatase and tensin homolog
Hs.408528	NM_000321	RB1	Retinoblastoma 1
Hs.494178	NM_006914	RORB	RAR-related orphan receptor B
Hs.436687	NM_003011	SET	SET nuclear oncogene
Hs.12253	NM_005901	SMAD2	SMAD family member 2
Hs.75862	NM_005359	SMAD4	SMAD family member 4
Hs.195659	NM_005417	SRC	V-src sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2) viral oncogene homolog (avian)
Hs.514451	NM_001050	SSTR2	Somatostatin receptor 2
Hs.371720	NM_003177	SYK	Spleen tyrosine kinase
Hs.475018	NM_005650	TCF20	Transcription factor 20 (AR1)
Hs.645227	NM_000660	TGFB1	Transforming growth factor, beta 1
Hs.633514	NM_003255	TIMP2	TIMP metallopeptidase inhibitor 2
Hs.644633	NM_000362	TIMP3	TIMP metallopeptidase inhibitor 3
Hs.591665	NM_003256	TIMP4	TIMP metallopeptidase inhibitor 4
Hs.478275	NM_003810	TNFSF10	Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10
Hs.654481	NM_000546	TP53	Tumor protein p53
Hs.155942	NM_002420	TRPM1	Transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 1
Hs.160411	NM_000369	TSHR	Thyroid stimulating hormone receptor
Hs.73793	NM_003376	VEGFA	Vascular endothelial growth factor A
Hs.534255	NM_004048	B2M	Beta-2-microglobulin
Hs.412707	NM_000194	HPRT1	Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
Hs.523185	NM_012423	RPL13A	Ribosomal protein L13a
Hs.592355	NM_002046	GAPDH	Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
			β-PIX
Hs.520640	NM_001101	ACTB	Actin, beta
N/A	SA_00105	HGDC	Human Genomic DNA Contamination
N/A	SA_00104	RTC	역전사 대조군
N/A	SA_00104	RTC	역전사 대조군
N/A	SA_00104	RTC	역전사 대조군
N/A	SA_00103	PPC	양성 PCR 대조군
N/A	SA_00103	PPC	양성 PCR 대조군
N/A	SA_00103	PPC	양성 PCR 대조군

β- PIX 발현량에 따른 세포이동분석

β-PIX가 MSC의 이동에 필요한지를 알아보기 위하여, 본 발명자들은 렌티바이러스 형질전환(lentiviral-transduced) shRNA에 의해 β-PIX가 녹-다운된 C-MSC 및 β-PIX를 이소성으로 발현하는 ALS-MSC를 제작하였다. 녹다운 모델은 β-PIX 의 mRNA 및 단백질 발현량이 감소하였다(도 3a). β-PIX cDNAs PIX를 함유하는 렌티바이러스 DNA로 형질전환이 된 ALS-MSC에서는 β-PIX가 과발현되었다(도 3b). β-PIX 발현량의 변화는 MSC 표면의 마커 CD45-CD34-CD29+CD73+CD105+CD44+HLA-DR-의 표현형에 영향을 미치지 않는다(도 4). 그러나, β-PIX 녹-다운 C-MSC에서는 이동능력이 극적으로 감소한 반면, β-PIX가 과발현된 ALS-MSC는 이동 능력을 회복함을 in vitro 트랜스웰 주화성 분석으로 확인하였다(도 3c). 이들 결과는 β-PIX가 MSC 이동을 용이하게 함을 확인시켜준다.

본 발명자들은 다음으로 β-PIX을 과발현하는 ALS-MSC 및 β-PIX가 녹-다운된 CMSC의 in vivo 이동을 조사하였다. 이들 MSC를 허혈성 뇌졸중에 걸린 래트 뇌에 이식시켰다. 래트 뇌의 T2*-강화 영상에 의해 β- PIX 발현이 MSC의 이동에 필수적이라는 in vitro 상의 발견이 확증되었다(도 4a-4b). β-PIX 녹다운 CMSC는 허혈 부위로의 이동 효율이 매우 낮았다(10개중 2)(도 4a). 그러나, 이동은 ALS-MSC에 비하여(10개 중 1개) β-PIX가 과발현된 ALS-MSC에서 촉진되었다(10개 중 7개)(도 4b).

웨스턴 블롯팅 및 면역세포화학분석

본 발명자들은 β-PIX 의 mRNA 및 단백질 발현량이 MSC의 이동 활성과 연관되었는지를 알아보기 위해 RT-PCR, 면역블롯팅 및 면역조직화학 방법을 수행하였다(도 2). β-PIX 의 mRNA 및 단백질 발현량은 ALS-MSC에서보다 C-MSCs, UCB-MSCs 및 hUC-MSC에서 훨씬 높았다(도 2b-2d). 따라서 β-PIX 의 mRNA 및 단백질 발현량의 감소는 MSC의 이동능력 감소와 연관되어 있음을 확인하였다.

β- PIX 녹다운 C- MSC 및 정상 C- MSC 에 의한 행동 기능의 비교

본 발명자들은 이식된 MSC들의 손상부위로의 이동이 허혈성 뇌졸중에 걸린 래트에서 운동신경 기능 회복을 개선시키는지를 알아보았다. β-PIX 녹-다운 C-MSC가 이식된 래트는 어떠한 신경 기능의 회복도 보이지 않은 반면, C-MSC가 이식된 래트는 개선되었다(도 9). 더구나, β-PIX 과발현 ALS-MSC를 이식받은 래트는 신경기능의 향상을 보이지 않았으며, ALS-MSC 이식 래트와 유사했다. 이들 결과는 이식된 MSC의 이동이 필수적이나, 허혈성 뇌졸중 래트의 운동 신경 기능을 개선하는 데는 불충분하다는 점을 말해준다.

신경영양인자의 비교

본 발명자들은 두 가지 신경성장 인자인 SDF-1α 및 VEGF의 양이 C-MSC에서보다 ALS-MSC에서 훨씬 낮음을 발견하였다(도 10a 및 10b). 그러나, C-MSC에서의 β-PIX 녹-다운이나 ALS-MSC에서의 β-PIX 과발현은 SDF-1α 또는 VEGF의 발현량에 영향을 미치지 못한다(도 10a 및 10b). 따라서, 자가 ALS-MSC 이식은 손상부위로의 줄기세포의 이동성을 회복하기 위해서는 β-PIX의 과발현과 SDF-1α 및 VEGF의 신경성장요인의 모두를 필요로 할 것으로 보인다.

참고문헌

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Mesenchymal Stem Cell Treatment in Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Korean Neurol Assoc 27 (2), 163 (2009).

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12. Koh, S. H. et al., Erythropoietin increases the motility of human bone marrow multipotent stromal cells (hBM-MSCs) and enhances the production of neurotrophic factors from hBM-MSCs. Stem Cells Dev (2009).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1a-1c는 각 MSC(mesenchymal stromal cell)의 기원에 따른 이동능력을 나타낸 그림이다. 도 1a는 근위축성 측색 경화증 환자의 MSC(ALSMSC), C-MSC(Cambrex에서 구입), 인간 탯줄 유래 MSC(hUC-MSC) 및 제대혈 유래 MSC(UCB-MSC)을 포함하는 다양한 기원의 페루목사이드-표지 MSC의 허혈성 뇌졸중 래트 뇌에서의 운동능력을 in vivo MR 영상으로 나타낸 그림이다. MR 영상으로 허혈이 손상된 뇌의 반대측에 이식된 C-MSC, hUC-MSC 및 UCB-MSC가 손상부위로 이동하지만, ALS-MSC는 그렇지 않음을 알 수 있다. 도 1b는 ALS-MSC가 이식 35일 뒤에도 이동하지 않음을 보여준다. 도 1c는 C-MSC, hUC-MSC 및 UCB-MSC는 이동능력을 가지나 ALS-MSC는 그렇지 않음을 In vitro 세포 이동 분석을 통해 보여주는 그림이다.

도 2는 각각의 다른 기원을 가지는 MSC의 β- PIX 발현량 및 이동-관련 인자를 나타낸 그림이다. 도 2a는 β- PIX 및 몇몇 이동-관련 유전자의 발현량이 C-MSC에서보다 ALS-MSC에서 더 낮음을 정량 PCR 어레이를 통해 확인한 결과이다. mRNA(도 2b) 및 단백질의 발현량(도 2c 및 2d)은 ALS-MSC에서 가장 낮았다.

도 3은 β-PIX 분비의 변화가 이동능력에 영향을 미침을 보여주는 그림이다. C-MSC에서 β-PIX의 mRNA 및 단백질을 shRNA을 이용하여 녹다운 시켰다(도 3a). ALS-MSC에서 β- PIX-Lentivirus를 이용하여 β-PIX를 과발현 시키자 ALS-MSC의 이동 능력이 증가하였다(도 3b). β- PIX 녹-다운에 의해 C-MSC 이동 능력이 감소하였다(도 3c).

도 4는 β-PIX의 발현량에 따른 MSC의 In vivo 이동능력을 나타낸 그림이다. 래트 뇌졸중 모델에서 인간 MSC의 손상부위의 이동을 MR 영상으로 나타냈다. β-PIX가 격감된 C-MSC는 손상부위로 이동하지 않았으나 아무런 처리를 하지 않은(mock treated) C-MSC는 이동하였다(도 4a). β-PIX 과발현은 ALS-MSC의 손상부위로의 이동능력을 회복시켰다(도 4b).

도 5는 이식된 MSC의 이동모습을 MR 영상 및 면역조직화학 분석을 통하여 나타낸 그림이다. MPGR 영상 및 면역조직화학 염색 결과, MSC가 1차 주입 부위에서 반대측의 손상부위로 이동하는 것은 MPGR 영상에서 이동 점(spot)으로서 나타난다.

도 6은 이식된 MSC의 기원에 따른 행동 기능의 차이를 보여주는 그림이다. NDS(neurologic deficit score)의 감소는 행동 기능이 향상되었음을 의미한다. 그림에서 나타나듯이, 이식 전에는 다섯 개 그룹 간 차이가 없으나, 통계적으로 눈에 띄는 차이는 이식 21일 후부터 나타남에도 이식 7일 후부터는 C-MSC, hUC-MSC 및 UCB-MSC 그룹(각 그룹에서 N=10)이 ALS-MSC 그룹(N=10)보다 크게 낮아졌다. 다시 말하면, C-MSC, hUC-MSC 및 UCB-MSC는 허혈성 뇌졸증 래트의 행동기능을 크게 개선시켰지만, ALS-MSC는 그렇지 않았다[*p<0.05 when compared with the PBS group, Wilcoxon Scores (Rank Sums) Test after Kruskal-Wallis Test].

도 7은 ALS-MSC 및 C-MSC 사이의 이동성 차이와 관련된 유전자를 분석하기 위한 정량 PCR 어레이를 나타낸 그림이다.

도 8는 ALS-MSC, UCB-MSC, hUC-MSC 및 C-MSC의 표면 마커 발현의 측정 결과를 나타낸 그림이다. 세포들을 다음의 항-인간 항체로 염색하였다: CD45-PE(phycoerythrin), CD44-FITC(fluorescein isothiocyanate)(DakoCytomation, Denmark), CD73-PE(BD Pharmingen, CA, USA), CD34-PE, CD29-FITC, CD49C-PE, CD54-FITC, CD105-FITC, CD106-FITC, HLA-DR-FITC 및 PE- 와 FITC-접합 아이소타입 대조군(Serotec, UK). 염색 후, 세포들을 유세포 분석기(Calibur, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 표면 마커를 분석한 결과 ALS-MSC, UCB-MSC, hUC-MSC 및 C-MSC는 CD45^-CD34^-CD29⁺CD73⁺CD105⁺CD44⁺HLA-DR^-표현형을 보였다. 이들 표면마커는 β-PIX 녹다운 C-MSC 및 β-PIX 과발현 C-MSC와 다르지 않다

도 9는 β-PIX 녹다운 C-MSC 및 정상 C-MSC에 의한 행동 기능을 비교한 그림이다. 본 발명자들은 이식된 MSC들의 손상부위로의 이동이 허혈성 뇌졸중에 걸린 래트에서 운동신경 기능 회복을 개선시키는지를 알아보았다. β-PIX 녹-다운 C-MSC가 이식된 래트(N=10)는 어떠한 신경 기능의 회복도 보이지 않은 반면, C-MSC가 이식된 래트(N=10)는 개선되었다(도 9). [*p<0.05 when compared with the PBS group, Wilcoxon Scores (Rank Sums)].

도 10은 신경영양인자의 비교를 나타낸 그림이다. C-MSC와 비교했을 때, ALS-MSC의 배양 상등액의 SDF-1α(A) 및 VEGF(B)의 농도는 크게 감소하였으나 BDNF(C)의 농도는 그렇지 않았다. 이들 신경영양인자의 발현량은 β-PIX의 유전자 변형에 영향을 받지 않는다.

도 11은 β- PIX 클로닝을 위해 이용한 pLenti6/V5-D-TOPO의 벡터 지도를 나타낸 그림이다.

<110> Corestem corporation <120> Compositions for improving migration potential of stem cells <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1941 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (4)..(1938) <400> 1 atg acc gat aat agc aac aat caa ctg gta gta aga gca aag ttt 45 Thr Asp Asn Ser Asn Asn Gln Leu Val Val Arg Ala Lys Phe 1 5 10 aac ttc cag cag acc aat gag gac gag ctt tcc ttc tca aaa gga gac 93 Asn Phe Gln Gln Thr Asn Glu Asp Glu Leu Ser Phe Ser Lys Gly Asp 15 20 25 30 gtc atc cat gtc acc cgt gtg gaa gag gga ggc tgg tgg gag ggc aca 141 Val Ile His Val Thr Arg Val Glu Glu Gly Gly Trp Trp Glu Gly Thr 35 40 45 ctc aac ggc cgg acc ggc tgg ttc ccc agc aac tac gtg cgc gag gtc 189 Leu Asn Gly Arg Thr Gly Trp Phe Pro Ser Asn Tyr Val Arg Glu Val 50 55 60 aag gcc agc gag aag cct gtg tct ccc aaa tca gga aca ctg aag agc 237 Lys Ala Ser Glu Lys Pro Val Ser Pro Lys Ser Gly Thr Leu Lys Ser 65 70 75 cct ccc aaa gga ttt gat acg act gcc ata aac aaa agc tat tac aat 285 Pro Pro Lys Gly Phe Asp 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Asn Val Leu Thr Glu His Ser Glu Glu Leu Gly Glu Phe 195 200 205 atg gag acc aaa ggt gcc agc agc cct ggg att ctc gtg ctg acc acg 669 Met Glu Thr Lys Gly Ala Ser Ser Pro Gly Ile Leu Val Leu Thr Thr 210 215 220 ggc ctg agc aaa ccc ttc atg cgc ctg gat aaa tac cct acg ctg ctc 717 Gly Leu Ser Lys Pro Phe Met Arg Leu Asp Lys Tyr Pro Thr Leu Leu 225 230 235 aaa gag ctc gag aga cac atg gag gat tat cat aca gat aga caa gat 765 Lys Glu Leu Glu Arg His Met Glu Asp Tyr His Thr Asp Arg Gln Asp 240 245 250 att caa aaa tcc atg gct gcc ttc aaa aac ctt tca gcc caa tgt caa 813 Ile Gln Lys Ser Met Ala Ala Phe Lys Asn Leu Ser Ala Gln Cys Gln 255 260 265 270 gaa gtc cgg aag agg aaa gag ctt gag ctg cag atc ctg acg gaa gcc 861 Glu Val Arg Lys Arg Lys Glu Leu Glu Leu Gln Ile Leu Thr Glu Ala 275 280 285 atc cgg aac tgg gag ggc gat gac att aaa act ctg ggc aac gtc act 909 Ile Arg Asn Trp Glu Gly Asp Asp Ile Lys Thr Leu Gly Asn Val Thr 290 295 300 tac atg tcc cag gtc ctg att cag tgt gcc gga agt gag gaa aag aat 957 Tyr Met Ser Gln Val Leu Ile Gln Cys Ala Gly Ser Glu Glu Lys Asn 305 310 315 gaa aga tat ctt cta ctc ttc cca aat gtt ttg cta atg ttg tct gcc 1005 Glu Arg Tyr Leu Leu Leu Phe Pro Asn Val Leu Leu Met Leu Ser Ala 320 325 330 agt cct agg atg agt ggc ttt atc tat cag gga aag ctt cca acg aca 1053 Ser Pro Arg Met Ser Gly Phe Ile Tyr Gln Gly Lys Leu Pro Thr Thr 335 340 345 350 gga atg aca atc aca aag ctt gag gac agt gaa aat cat aga aat gca 1101 Gly Met Thr Ile Thr Lys Leu Glu Asp Ser Glu Asn His Arg Asn Ala 355 360 365 ttt gaa ata tca ggg agc atg att gag cgg ata tta gtg tcg tgc aac 1149 Phe Glu Ile Ser Gly Ser Met Ile Glu Arg Ile Leu Val Ser Cys Asn 370 375 380 aac cag cag gat ctg cag gaa tgg gtg gag cac cta cag aag caa acg 1197 Asn Gln Gln Asp Leu Gln Glu Trp Val Glu His Leu Gln Lys Gln Thr 385 390 395 aag gtc acg tct gtg gga aac ccc acc ata aag cct cat tca gtg cca 1245 Lys Val Thr Ser Val Gly Asn Pro Thr Ile Lys Pro His Ser Val Pro 400 405 410 tct cat acc ctc ccc tcc cac ccg gtc act ccg tcc agc aag cac gca 1293 Ser His Thr Leu Pro Ser His Pro Val Thr Pro Ser Ser Lys His Ala 415 420 425 430 gac agc aag ccc gcg ccg ctg acg ccc gcc tac cac acg ctg ccc cac 1341 Asp Ser Lys Pro Ala Pro Leu Thr Pro Ala Tyr His Thr Leu Pro His 435 440 445 ccc tcc cac cac ggc acc ccg cac acc acc atc aac tgg gga ccc ctg 1389 Pro Ser His His Gly Thr Pro His Thr Thr Ile Asn Trp Gly Pro Leu 450 455 460 gag cct ccg aaa aca ccc aag ccc tgg agc ctg agc tgc ctg cgg ccc 1437 Glu Pro Pro Lys Thr Pro Lys Pro Trp Ser Leu Ser Cys Leu Arg Pro 465 470 475 gcg cct ccc ctc cgg ccc tca gct gct ctc tgc tac aag gag gat ctt 1485 Ala Pro Pro Leu Arg Pro Ser Ala Ala Leu Cys Tyr Lys Glu Asp Leu 480 485 490 agt aag agc cct aag acc atg aaa aag ctg ctg ccc aag cgc aaa cct 1533 Ser Lys Ser Pro Lys Thr Met Lys Lys Leu Leu Pro Lys Arg Lys Pro 495 500 505 510 gaa cgg aag cct tca gat gag gag ttc gcg tcc cgg aaa agc aca gct 1581 Glu Arg Lys Pro Ser Asp Glu Glu Phe Ala Ser Arg Lys Ser Thr Ala 515 520 525 gct ttg gaa gaa gat gct cag att ctg aaa gtc att gaa gct tac tgc 1629 Ala Leu Glu Glu Asp Ala Gln Ile Leu Lys Val Ile Glu Ala Tyr Cys 530 535 540 acc agc gcc aaa aca agg caa aca ctc aat tca agt tca cgc aaa gaa 1677 Thr Ser Ala Lys Thr Arg Gln Thr Leu Asn Ser Ser Ser Arg Lys Glu 545 550 555 tct gct cca caa gtt ttg ctt cca gaa gaa gag aaa att ata gtg gaa 1725 Ser Ala Pro Gln Val Leu Leu Pro Glu Glu Glu Lys Ile Ile Val Glu 560 565 570 gaa act aaa agt aat ggt cag aca gtg ata gaa gaa aag agt ctt gtg 1773 Glu Thr Lys Ser Asn Gly Gln Thr Val Ile Glu Glu Lys Ser Leu Val 575 580 585 590 gat acc gta tat gca tta aag gat gaa gtt caa gaa tta aga cag gac 1821 Asp Thr Val Tyr Ala Leu Lys Asp Glu Val Gln Glu Leu Arg Gln Asp 595 600 605 aac aaa aag atg aag aaa tct cta gag gaa gaa cag aga gcc cgc aaa 1869 Asn Lys Lys Met Lys Lys Ser Leu Glu Glu Glu Gln Arg Ala Arg Lys 610 615 620 gac ctg gag aag ctg gtg agg aaa gtc ctg aag aac atg aat gat cct 1917 Asp Leu Glu Lys Leu Val Arg Lys Val Leu Lys Asn Met Asn Asp Pro 625 630 635 gcc tgg gat gag acc aat cta ta a 1941 Ala Trp Asp Glu Thr Asn Leu 640 645 <210> 2 <211> 645 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Asp Asn Ser Asn Asn Gln Leu Val Val Arg Ala Lys Phe Asn Phe 1 5 10 15 Gln Gln Thr Asn Glu Asp Glu Leu Ser Phe Ser Lys Gly Asp Val Ile 20 25 30 His Val Thr Arg Val Glu Glu Gly Gly Trp Trp Glu Gly Thr Leu Asn 35 40 45 Gly Arg Thr Gly Trp Phe Pro Ser Asn Tyr Val Arg Glu Val Lys Ala 50 55 60 Ser Glu Lys Pro Val Ser Pro Lys Ser Gly Thr Leu Lys Ser Pro Pro 65 70 75 80 Lys Gly Phe Asp Thr Thr Ala Ile Asn Lys Ser Tyr Tyr Asn Val Val 85 90 95 Leu Gln Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn Glu Tyr Ser Lys Glu Leu Gln 100 105 110 Thr Val Leu Ser Thr Tyr Leu Arg Pro Leu Gln Thr Ser Glu Lys Leu 115 120 125 Ser Ser Ala Asn Ile Ser Tyr Leu Met Gly Asn Leu Glu Glu Ile Cys 130 135 140 Ser Phe Gln Gln Met Leu Val Gln Ser Leu Glu Glu Cys Thr Lys Leu 145 150 155 160 Pro Glu Ala Gln Gln Arg Val Gly Gly Cys Phe Leu Asn Leu Met Pro 165 170 175 Gln Met Lys Thr Leu Tyr Leu Thr Tyr Cys Ala Asn His Pro Ser Ala 180 185 190 Val Asn Val Leu Thr Glu His Ser Glu Glu Leu Gly Glu Phe Met Glu 195 200 205 Thr Lys Gly Ala Ser Ser Pro Gly Ile Leu Val Leu Thr Thr Gly Leu 210 215 220 Ser Lys Pro Phe Met Arg Leu Asp Lys Tyr Pro Thr Leu Leu Lys Glu 225 230 235 240 Leu Glu Arg His Met Glu Asp Tyr His Thr Asp Arg Gln Asp Ile Gln 245 250 255 Lys Ser Met Ala Ala Phe Lys Asn Leu Ser Ala Gln Cys Gln Glu Val 260 265 270 Arg Lys Arg Lys Glu Leu Glu Leu Gln Ile Leu Thr Glu Ala Ile Arg 275 280 285 Asn Trp Glu Gly Asp Asp Ile Lys Thr Leu Gly Asn Val Thr Tyr Met 290 295 300 Ser Gln Val Leu Ile Gln Cys Ala Gly Ser Glu Glu Lys Asn Glu Arg 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Leu Phe Pro Asn Val Leu Leu Met Leu Ser Ala Ser Pro 325 330 335 Arg Met Ser Gly Phe Ile Tyr Gln Gly Lys Leu Pro Thr Thr Gly Met 340 345 350 Thr Ile Thr Lys Leu Glu Asp Ser Glu Asn His Arg Asn Ala Phe Glu 355 360 365 Ile Ser Gly Ser Met Ile Glu Arg Ile Leu Val Ser Cys Asn Asn Gln 370 375 380 Gln Asp Leu Gln Glu Trp Val Glu His Leu Gln Lys Gln Thr Lys Val 385 390 395 400 Thr Ser Val Gly Asn Pro Thr Ile Lys Pro His Ser Val Pro Ser His 405 410 415 Thr Leu Pro Ser His Pro Val Thr Pro Ser Ser Lys His Ala Asp Ser 420 425 430 Lys Pro Ala Pro Leu Thr Pro Ala Tyr His Thr Leu Pro His Pro Ser 435 440 445 His His Gly Thr Pro His Thr Thr Ile Asn Trp Gly Pro Leu Glu Pro 450 455 460 Pro Lys Thr Pro Lys Pro Trp Ser Leu Ser Cys Leu Arg Pro Ala Pro 465 470 475 480 Pro Leu Arg Pro Ser Ala Ala Leu Cys Tyr Lys Glu Asp Leu Ser Lys 485 490 495 Ser Pro Lys Thr Met Lys Lys Leu Leu Pro Lys Arg Lys Pro Glu Arg 500 505 510 Lys Pro Ser Asp Glu Glu Phe Ala Ser Arg Lys Ser Thr Ala Ala Leu 515 520 525 Glu Glu Asp Ala Gln Ile Leu Lys Val Ile Glu Ala Tyr Cys Thr Ser 530 535 540 Ala Lys Thr Arg Gln Thr Leu Asn Ser Ser Ser Arg Lys Glu Ser Ala 545 550 555 560 Pro Gln Val Leu Leu Pro Glu Glu Glu Lys Ile Ile Val Glu Glu Thr 565 570 575 Lys Ser Asn Gly Gln Thr Val Ile Glu Glu Lys Ser Leu Val Asp Thr 580 585 590 Val Tyr Ala Leu Lys Asp Glu Val Gln Glu Leu Arg Gln Asp Asn Lys 595 600 605 Lys Met Lys Lys Ser Leu Glu Glu Glu Gln Arg Ala Arg Lys Asp Leu 610 615 620 Glu Lys Leu Val Arg Lys Val Leu Lys Asn Met Asn Asp Pro Ala Trp 625 630 635 640 Asp Glu Thr Asn Leu 645

Claims

서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 가지는 β-픽스(PIX)를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 이동성 개선용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 줄기세포 이동성 개선용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)인 것을 특징으로 하는 줄기세포 이동성 개선용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 플라스미드, 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 배시니아 바이러스, 리포좀 또는 니오좀인 것을 특징으로 하는 줄기세포 이동성 개선용 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 렌티바이러스인 것을 특징으로 하는 줄기세포 이동성 개선용 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 줄기세포.
제 6 항의 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환 치료용 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 신경질환은 허혈성 뇌졸증인 것을 특징으로 하는 신경질환 치료용 조성물.
생물학적 시료 내의 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 이식된 줄기세포의 이동성을 판단하는 방법.
다음의 단계를 포함하는 줄기세포의 이동성을 개선시키는 신경질환 세포치료 보조제의 스크리닝 방법:

(a) 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오타이드의 발현량이 증가되는 경우 상기 시료는 줄기세포의 이동성을 개선시키는 신경질환 세포치료 보조제로 판정된다.