MXPA01004035A - Gen prv-1 y el uso del mismo. - Google Patents
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Abstract
La presente invencion se relaciona a una secuencia de nucleotidos que codifica la proteina PRV-1 y que comprende esencialmente la secuencia ID No. 1, y a un proceso para detectar este gen asi como tambien a un polipeptido codificado por este gen.
Description
GEN PRV-l Y EL USO DEL MISMO
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a una secuencia de nucleótidos que codifica el -gen PRV-l, a ADN recombinante que contiene esta secuencia de nucleótidos, a vectores que contienen el AD? recombinante y a células que son transformadas con estos vectores, y también a un polipéptido PRV-l, a anticuerpos contra este polipéptido, a un proceso para detectar el polipéptido PRV-l y a drogas que comprenden el polipéptido PRV-l, o anticuerpos que so dirigidos contra el polipéptido PRV-l. La policite ia rubra vera (eritremia) , también llamada policitemia vera o p. vera, es una enfermedad hematológica maligna en la cual existe una formación incrementada de células eritroides, gránulocíticas o megacariocíticas. La enfermedad de origen clonal, y surge como resultado de la mutación de una sola célula precursora he atopoyética . En Alemania, la incidencia de p. Vera es de 4 a 6 por millón de habitantes. Si se deja sin tratar, la enfermedad da lugar a la muerte en 18 meses. El tratamiento por medio de extracción de sangre o de
quimioterapia extiende el tiempo de supervivencia promedio a más de 13 años. P. vera es diagnosticada por medio de criterio clínico. El cuadro clínico incluye dolores de cabeza, prurito, esplenomegalia en dos tercios de los pacientes, sagrado o trombosis, hipertensión en un tercio de los pacientes, gota, que es producida por un incremento en la producción de ácido úrico, y en algunos casos, úlceras sépticas. El descubrimiento de laboratorio más importantes es un incremento en los valores de hemoglobina, hematocrito, cuenta de eritrocito y volumen total de eritrocitos, y también una granulocitosis neutrofílica o tro?abocitosis en muchos casos. Puesto que, por un lado, la mayoría de los criterios son más bien difusos y, por otro lado, no todos los pacientes responden a estos criterios, es frecuentemente difícil distinguir p. vera de otras enfermedades ?aieloproliferativas, tales como leucemia granulocítica ?rónica o trombocitosis esencial/ y confirmar por medio de esto el diagnóstico, A la fecha, la causa molecular de la P- Vera es completamente desconocida. Puesto que, sin embargo, la p. Vera toma un curso severo s'i no es tratada, es importante un diagnóstico 'preciso.
Un objeto de la invención fue por lo tanto encontrar la causa molecular de la policitemia rubra vera, y crear la posibilidad de diagnosticarla. Este objeto se logró aislando un gen que es expresado específicamente en asociación con p. Vera y no en individuos de control saludables. Este gen es designado el gen de PRV-l (p_olicitemia rubra vera) . Una secuencia de nucleótidos similar está descrita en la solicitud internacional WO 98/50552. Una parte de la materia objeto de la invención por lo tanto se relaciona a un polinucleótido que codifica el gen PRV-l, y que esencialmente comprende la secuencia ID No. 1. Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser ADN o ARN de una sola hebra o de dos hebras. Si son ARN, entonces es claro para la persona experta que están presentes nucleótidos ,U" en vez de nucleótidos nT". "Polinucleótido" se entiende que significa ácidos nucleicos que contienen 15 o más nucleótidos. La secuencia de nucleótidos de acuerdo a la invención está representada en la Figura 1. La invención por lo tanto se relaciona a un polinucleótido que corresponde a la secuencia mostrada en la Figura 1, y también a un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos exhibe
diferencias minoritarias. Dentro del Significado de la presente solicitud, diferencias minoritarias se entiende que significan aquellas secuencias en las cuales unos pocos nucleótidos, preferiblemente no más de 50, y particularmente preferiblemente no más de 2 pueden ser intercambiados, sin que sea afectada, sin embargo, la función del gen codificado por la secuencia de nucleótidos. La persona experta está familiarizada con el hecho de que un triplete de bases que codifica un amino ácido puede ser reemplazado con otro triplete que codifica el mismo amino ácido. Además de esto, regiones que son de menor importancia pueden ser suprimidas y/o mutadas en un grado menor. En una modalidad particular, el polinucleótido comprende los nucleótidos 36 a 1346 de la secuencia No. 1, que es la región de codificación del gen PRV-l. Otra modalidad comprende los nucleótidos 36 a 1262 de la secuencia No. 1, Esta región, presumiblemente codifica la región activa del polipéptido PRV-l. Finalmente, el polinucleótido de la invención, también puede comprender los nucleótidos 39 a 1346 o los 39 a 1262 de la secuencia No. 1, de tal manera que el codon que codifica la metionina de partida 'no está presente. Una modalidad preferida es un polinucleótido que comprende los
nucleótidos 99-1346 o 99 a 1262 de la secuencia No. 1. Esto resulta en que los codones en el extremo 5' que codifican el péptido de señal del polipéptido no estén presentes. El polinucleótido de acuerdo a la invención también puede ser un fragmento del gen PRV-l. Como una regla, el fragmento posee más de 100 nucleótidos, preferiblemente sin embargo, más de 300 nucleótidos. Los fragmentos también pueden ser usados como iniciadores o como sondas, en particular para PCR; en este caso, los fragmentos pueden ser truncados para que se ajusten a este propósito. Usualmente, los iniciadores tienen una longitud de entre 10 y 30 nucleótidos, y las sondas tienen una longitud de entre 15 y 50 nucleótidos. El gen PRV-l es un gen endógeno cuya expresión en individuos saludables está/ sin embargo, restringida a solamente unos pocos órganos. Normalmente, se expresa en su mayor parte en los órganos hematopoyéticos, es decir en la médula ósea y en el hígado fetal, y se expresa débilmente en el bazo, pero no se expresa en corazón, músculo, páncreas o riñon. En pacientes que están sufriendo de p. vera, este gen está sobreexpresado muy fuertemente en las células hematopoyéticas, en particular.
El gen de PRV-l codifica una proteína que exhibe la secuencia de proteína mostrada en la Figura 2. El péptido de señal, que está presente en la secuencia de proteína de todas las moléculas de superficie, y normalmente es eliminada cuando la proteína es procesada, está dividida por un guión. La proteína tiene la secuencia ID No. 2. Otro aspecto de la invención es consecuentemente un polipéptido esencialmente puro que tiene la secuencia No. 2, o un polipéptido que tiene la secuencia No. 2 pero que carede del péptido de señal (es decir los amino ácidos 22 a 437 de la secuencia No. 2) . Otras modalidades incluyen los amino ácidos 1 a 409 o 22 a 409 de la secuencia No. 2 (que es probablemente la región activa de la proteína) . Con respecto a la actividad biológica, el polipéptido de acuerdo a la invención está preferiblemente glicosilado; más preferiblemente está N-glicosílado . Puede entonces ser glicosilado en al menos uno de los amino ácidos Asn-46, Asn-189 y Asn-382 del polipéptido PRV-l (los números e los amino ácidos se refieren a la secuencia No. 2) . La invención también incluye fragmentos de los polipéptidos de acuerdo a la invención que está N-glicosilados. Los fragmentos son de al menos 50 amino
ácidos de longitud, preferiblemente al menos 100 amino ácidos, y más preferiblemente al menos 150 amino ácidos. En otra modalidad, un polipéptido puede estar O-glicosilado . Es claro para la persor^a experta que pueden ser reemplazados amino ácidos particulares con otros amino ácidos sin deteriorar la actividad biológica de la proteína. Tales formas modificadas de los polipéptidos de acuerdo a la invención son también parte de la materia objeto de la invención. Los reemplazos de amino ácidos son aquellos que no tienen un efecto negativo sobre la actividad biológica de la proteína. La persona experta puede hacer uso de reglas muy conocidas para seleccionar los reemplazos. Dependiendo del método de preparación, el polipéptido PRV-l puede, por ejemplo, poseer un ancla de glicosil fosfatidilinositol. Esta es entonces unida a los amino ácidos que corresponden a los amino áóidos 407 a 409 en la secuencia ID No. 2. Un ancla de GPI se us para anclar una proteína por medio de un lípido sobre el lado exterior de la membrana celular. Sin embargo, por razones que no han sido elucidadas de forma conclusiva hasta ahora, f ecuentemente se observa que las proteínas unidas a GPI son también liberadas en el medio. Esto es
referido como "difusión". A la fecha, no ha sido clarificado si este es un proceso específico, es decir, tales proteínas son clivadas de la membrana por enzimas de una manera controlada, o si esto representa una pérdida no específica del ancla. Consecuentemente es muy probable que PRV-l va a encontrarse en ambas partes, sobre la membrana celular y extracelularmente . La forma segregada, que tio está unida a la membrana, es probablemente más importante para el efecto del polipéptido como un factor de crecimiento puesto que, como un factor de crecimiento, esta forma es capaz de difundirse y alcanzar otras células. Es claro para la persona experta que ella puede influenciar la unión de la proteína a la membrana celular manipulando estos amino ácidos. Esto concierne particularmente a la preparación dé constructps definidos de ADN que se proponen para expresar el polipéptido PRV-l o fragmentos de este polipéptido. Los codones que codifican estos amino ácidos pueden ser mutados o suprimidos. El gen codifica un receptor de superficie de la familia uPAR/Ly6. Esta familia de receptores puede transducir señales mitogénicas, es decir señales que estimulan la división celular. Por lo tanto se asume
que la sobreexpresión del gen PRV-l, inter alia sobre los granulocitos de pacientes con p. vera, contribuye a la hiperproliferación de estas células. Se ha encontrado que PVR-1 no es expresado sobre granulocitos en individuos saludables, o en pacientes que sufren de otras enfermedades ieloproliferativa=, por ejemplo qUe sufren de leucemia granulocitica crónica, leucemia granulocítica aguda o trombocitosis esencial. pa a poder usar el polipéptido codificado por el gen PRV-l para métodos de análisis y detección, éste es convenientemente generado a partir de ADN recombinante, el ADN recombinante preferiblemente comprende la secuencia de nucleótidos ID No. 1, o al menos la región de codificación del gen de PRV-l, esto e? los nucleótidos 36 a 1346 de la ecuencia ID No. 1, al menos, sin embargo, los nucleótidos 39 a 1262, unido de manera funcional a un promotor. Sin embargo, el ADN recombinante también puede comprender solamente un fragmento de ola s cuencia No. 1 * La invención además se relaciona a un vector que contiene el ADN recombinante para el polipéptido PRV-l, o un fragmento del mismo, y a una célula huésped que' es transfectada o transformada ' con este vector. Las células huésped pueden ser procarióticas,
por ejemplo bacterias tales como E. coli. Sin embargo, los polipéptidos que son expresados están entonces no glicosilados. Por lo tanto se da preferencia a células huésped eucarióticas, que pueden glicosilar la proteína expresada post-translacionalmente y modificarla d?s otras maneras. Los ejemplos de células huésped eucarióticas son células de insecto, tales como las células Sf9, para la expresión siguiendo a la infección con baculovirus recombinante, y las células de mamífero, tales como células COS, células CHO y células HeLa. Estos ejemplos no son exhaustivos. También es posible usar células de levaduras como las células huésped. Es claro para la persona experta que el patrón de glicosilación puede diferir dependiendo de la célula huésped. La actividad biológica del producto de expresión puede por lo tanto también variar. Se da Una preferencia particular a las células huésped que glicosilan el producto de expresión de tal manera que se retiene la actividad biológica de la proteína. El polipéptido de PRV-l que es aislado de los granulocitos o es producido de forma recombinante puede ser empleado para ambas cosas, para diagnosticar policitemia vera y para 'tratar la enfermedad.
Una posibilidad terapéutica es aquella de la "terapia de antisentido". Este método emplea una molécula de ARN d.e ??antisentido", esto es un ARN que es complementario al ARN de PRV. Puesto que el AR? del PRV-l tiene la secuencia 5'-* AAAAGCAGAAAGAGATTACCAGCC-3' (SEQ ID ?O: 3) en su inicio, el AR? de antisentido requisito dirigido contra esta secuencia poseería la siguiente secuencia de nucleótido: 5 -GGCTGGTiVATCTCTTTCTGCTTTT-3' (SEQ ID ?O: 4) . Este .ARN de antisentido es incorporado en un vector e introducido en las células con p. vera. Este AR? es introducido, por ejemplo, por medio de transíección, con el vector usado para la transfección preferiblemente configurado de tal manera que es introducido específicamente en las células con p. vera. La expresión del AR? de antisentido resulta en que ya no es posible para el mAR? ser trasladado dentro de Un polipéptido. Las células que han sido tratadas de esta manera no forman entonces ninguna proteína PRV-l. La invención por lo tanto se relaciona también a un proceso para detectar p. vera que está caracterizado porque el polipéptido PRV-l, o un epítope 'del mismo, es detectado y se etermina el grado de la expresión.
La sobreexpresión de este receptor sobre células maduras fuera de la médula ósea, por ejemplo sobre granulocitos, es una fuerte indicación de la presencia de la enfermedad p. vera. Esta sobreexpresión es convenientemente detectada por medio de un inmunoensayo usando anticuerpos que son dirigidos contra el receptor de PRV-l. Los métodos de prueba aceptables son las variantes de inmunoensayo conocidas que hacen uso de anticuerpos específicos del polipéptido PRV-l junto con otros anticuerpos marcados que pueden estar inmovilizados o eh solución. El marcado puede ser efectuado de una manera conocida per se, por ejemplo usando isótopos radioactivos, por medio de fluorescencia o luminiscencia, usando enzimas, por medio de reacciones que forman color, o usando otros grupos que son adecuados para la determinación. Estas variantes son conocidas para la persona experta, y no requieren ninguna explicación más detallada aquí. De acuerdo a la invención, las pruebas de ELISA son particularmente preferidas. Los anticuerpos que se requieren para detectar específicamente el receptor de PRV-l pueden asimismo ser preparados de una manera que es conocida per se. Ambos anticuerpos, monoclonales y
policlonales son adecuados, pero se le da preferencia a los anticuerpos monoclonales. Los péptidos que son derivados de la proteina también pueden ser usados para preparar anticuerpos, Dentro del contexto de la presente invención, se tuvo éxito usando los péptidos que tienen las secuencias: a) KVSDLPRQ TPKN (amino ácidos 34 a 46) [SÉQ ID NO 5], y b) SAREKRDVQPPASQH (amino ácidos 39J. a 40Ó) [SEQ ID NO 6] . Los anticuerpos psliclonales on producidos normalmente inmunizando un huésped adecuado (conejo) con el polipéptido PRV-l, cuando sea apropiado unido a un soporte inmunológico (adyuvante) , y produciendo una respuesta inmune. Los anticuerpos monoclonales pueden ser generados de una manera conocida per se usando la técnica del hibridoma. Los anticuerpos pueden ser purificados por medio de purificación de afinidad. La preparación y purificación de anticuerpos están descritas, por ejemplo, en "Antibodies; A Laboratory Manual" por Harlow y Lañe, Cóld Spring Harbor Laboratory Press. Además, tales anticuerpos monoclonales y policlonales que están dirigidos contra PRV-l también pueden ser usados para tratar la enfermedad.
En ptra modalidad, el receptor de PRV-l puede ser detectado usando un método RT-PRC. Para esto, en primer lugar se aisla ARN de las células que sobreexpresan PRV-l las cuales son como una regla granulocitos. Una transcripción inversa se realiza luego de una manera conocida per se usando un iniciador de RT . El iniciador de RT es preferiblemente un iniciador que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos: (SEQ ID NO: 7): TTAGGTTATGAGGTCAGAGGGAGGTT. De esta manera, el ARN específico de PRV-l es transformado en ADN. Este ADN es luego amplificado en una reacción de PCR de una manera conocida por si misma. Los siguientes dos iniciadores son preferiblemente empleados para los ciclos de amplificación : Como el iniciador de sentido (SEQ ID NO: 8) : GCAGAAAGAGATTACCAGCCACAGACGG . Como el iniciador de antisentido (SEQ ID NO: 9) : GAATCGTGGGGGTAÁTAGAGTTAGCAGG. La persona experta puede fácilmente usar la secuencia descrita para encontrar otros iniciadores que son también adecuados. Puesto que el ARN es usado como el material de partida para este método, la señal de PCR es
solamente positiva cuando el gen de PRV-l está también expresado. Como se explicó arriba, este solamente es el caso cuando el paciente está sufriendo de p. vera. PRV no es expresado en granulocitos de pacientes saludables. Consecuentemente, la ausencia de alguna señal de RT-PCR indica que no está presente p. vera. En otra alternativa, también es posible usar un método de transferencia, preferiblemente una transferencia de Northern, para diagnosticar p. vera. Para tal método, se aisla el ARN de granulocitos y luego es examinado para determinar la expresión de PRV-l usando un método de transferencia, por ejemplo transferencia de Northern. La secuencia de cADN de SEQ ID NO 1, o un segmento de la secuencia, puede ser usada como la sonda. La hibridación entonces ocurre solamente si los granulocitos son derivados de un paciente que sufre de p. vera, puesto que solamente entonces existe alguna expresión sobre los granulocitos. La ausencia de hibridación indica que el individuo del cual se derivan los granulocitos no tiene p. vera. También es posible usar un fragmento del gen para la hibridación por transferencia de Northern. Tal fragmento normalmente tiene más de 100 bases de
longitud, preferiblemente más de 300 bases de Ipngitud. Alternativamente, varios diferentes fragmentos del gen, que pueden ser usados como sondas en la trasferencia dé Northern, pueden ser preparados digiriendo el gen con endonucleasas de restricción. Si los fragmentos son derivados del cADN, entonces están presentes como hebras dobles que tienen que ser separadas en las hebras individuales para la hibridación. Los ejemplos adecuados son el fragmento Bam Hl-PstI del par de bases 420 al par de bases 831, o el fragmento Pstl-Pstl del par de bases 831 al par de bases 1900. El mARN de PRV-l, y consecuentemente la expresión de PRV-l, también pueden ser detectados primero transcribiendo de forma inversa el mARN en una reacción de RT<-PCR y luego amplificando el cADN; el ADN amplificado es luego detectado con una sonda en un método de hibridación. En el caso de un diagnóstico positivo, la enfermedad tiene que ser tratada, puesto que de otro modo da lugar a la muerte, en un periodo de tiempo relativamente corto. Para este tratamiento, es posible usar anticuerpos específicos que están dirigidos contra PRV-l, y a los cuales pueden ser unidos componentes citotóxicos, cuando sea apropiado.
La invención por lo tanto se relaciona también a una droga que, además de los excipientes usuales, comprenden anticuerpos que están dirigidos contra el receptor de PRV-l. Puesto que el receptor de PRV-l está sobreexpresado en p. vera, muchos anticuerpos están unidos sobre la superficie de los granulocitos afectados cuando se ponen en contacto con el anticuerpo anti-PRV-1. La unión de muchos anticuerpos a estas células estimula a las células inmunológicas a destruir estos granulocitos. De esta manera, es posible eliminar las células con p. vera específicamente . Sorprendentemente, también se ha encontrado que el polipéptido de PRV-l exhibe actividad bematopoyética. El polipéptido de PRV-l puede estimular ciertas células precursoras hematopoyéticas para qué formen colonias de eritroides. Particularmente son los polipéptidos de PRV-l N-glicosilados los qUe exhiben esta función. Los polipéptidos de acuerdo a la invención que se prefieren son por lo tanto los polipéptidos de PRV-l N-glicosilados, y los fragmentos de los mismos, que exhiben la actividad de factor' de crecimiento.
Otro aspecto de la invención es por lo tanto una droga que, además de un excipiente farmacéuticamente tolerado, comprende el polipéptido de PRV-l o un fragmento biológicamente activo del mismo. El polipéptido de PRV-l es preferiblemente un polipéptido de PRV-l glicosilado y, aun más prefe iblemente/ ün polipéptido de PRV-l N-glicosilado o un fragmento biológicamente activo del mismo. La invención también se relaciona a drogas que comprender al menos un polinucleótido de acuerdo a la invención . La presente invención además se relaciona al uso de un polipéptido de PRV-l, o un fragmento biológicamente activo del mismo, como un factor de crecimiento in vivo y ex vivo. El polipéptido de PRV- 1, o un fragmento biológicamente activo del mismo, puede ser us do para tratar todas las pancitopenias y pancitopatias en la médula ósea y en la circulación
(cambio en los constituyentes celulares de la sangre periférica y la médula ósea) . Los polipéptidos de la presente invención pueden, por ejemplo, ser uáados para tratar anemias en el caso de deficiencia renal, quimioterapia o radiación del cuerpo completo, para tratar neutropenias y trómbocitopenias durante la quimioterapia o radiación del cuerpo completo, para
el tratamiento ex vivo de células periféricas o células madre de la médula ósea, para expansión
(multiplicación) y retransfusión a los pacientes, y para tratar Sepsis, _ síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) o reacciones inflamatorias regionales. Los polipéptidos de la presente invención, o drogas que los comprenden, pueden ser administrados en una amplia variedad de maneras. Las formas de administración comprenden administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, oral, transdérmica y transmucosa . Los polinucleótidos de acuerdo a la invención también pueden ser usados para tratar pancitopenias y pancitopatías. En este caso, el objeto es expresar un polipéptido de PRV-l, o un fragmento funcional del mismo, en células del paciente afectado. Los métodos de terapia génica son primero y principalmente usados en esta conexión. Pueden aislarse células del paciente y ser transfectadas con un polinucleótido de acuerdo a la invención (manipulación ex vivo), después de lo cual son regresadas al paciente. También es posible concebir métodos en los cuales los polinucleótidos de acuerdo a la invención consiguen acceso a las células objetivo por medio de
transferencia viral. La expresión de los ácidos nucleicos insertados da lugar entonces a actividad hematopoyétic . La invención también se relaciona a estuches para detectar ya sea policitemia vera o alteraciones del sistema hematopsyético . Estos estuches comprenden un polinucleótido de acuerdo a la invención y/o un polipéptido de acuerdo a la invención y/o uno o más anticuerpos de acuerdo a la invención. Además de esto, el estuche también puede comprender un recipiente o composiciones que son adecuados para implementar reacciones de detección. Los ejemplos de tales composiciones son soluciones amortiguadoras, reactivos para bloquear membranas, soluciones de hibridación, anticuerpos secundarios, soluciones de substrato para reacciones de detección, etc. El estuche pref riblemente se usa para implementar reacciones de PCR/ transferencias de Northern, transferencias de Souther'n, transferencias de Western y ELISA, RÍA o reacciones similares. Los siguientes ejemplos se dan para explicación.
Ejemplo 1 Caracterización del gen PRV Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para caracterizar el gen: - el siguiente protocolo se usó para aislar granulócitos de sangre almacenada, o de sangre obtenida por extracción de pacientes con p. vera: - un volumen igual de solución de de?ctran al 3 % en NáCl al 0.9 % se agregó a la sangre, y la mezcla se dejó permanecer a temperatura ambiente (TA) por 20 minutos . - la mezcla sé separó en dos fases. La fase superior, de color ligero se retiró y se sometió a centrifugación por 10 minutos a 1800 g y a TA. - el sobrenadante se descartó y el pelet de células se volvió a suspender en el mismo volumen de NaCl ál 0.9 %. - en cada caso 35 ml de las células en NaCl se sembraron sobre 15 ml de Ficoll-íjypaque . - Las células sobre el Ficoll-Hypaque se sometieron entonces a centrifugación por 60 minutos a 1800 g y a TA sin usar el control. - Se formaron un pelet de sellas y dos capas con una interfase.
- Las capas y la interfase se aspiraron, y el pelet de células se volvió a suspender por 30 segundos en 10 ml de NaCl al 0.2 % enfriado en hielo, y 10 ml de NaCl al 1.6 % enfriado en hielo ge agregaron inmediatamente después de 30 segundos. * las células se sometieron a centrifugación por 10 minutos a 1800 g y a TA. - Luego se lavaron una vez en 10 mí de PBS y se sometieron a centrifugación. - el pelet de células contenía granulocitos con 95-99 % de pureza. se aisló ARN de estas células usando métodos estándar , - se xaminaron 10 mg de este ARN para determinar la expresión de PRV-l en una transferencia de Northern.
La secuencia de cADN completa mostrada en la SEQ ID NÓ 1 se usó como una sonda. Este experimento se realizó sobre 19 pacientes de p. vera y 21 muestras de control de sangre almacenada. Se encontró que la sonda de PRV-l se híbrida fuertemente en el caso de los pacientes de p. vera. No se observó hibridación en las muestras de control saludables.
Ejemplo 2 PRV-l posee actividad de* factor de crecimiento Se retiraron embriones de una ratón hembra embarazada 13.5 días después de la fertilización. Se retiraron los hígados fetales. Las células contenidas en ellos se tiñeron usando anticuerpos, y se enriquecieron para células particulares, y se empobrecieron para otros tipos de células, por medio de cromatografía en columna. Esto resultó en una mezcla de células que está enriquecida para ciertas células precursoras hematopoyéticas (unidades que forman colonias-eritroide, CFU-E) . así, mientras en conjunto aproximadamente 2 % del hígado fetal consiste de CFU-E, 30-40 % de las células enriquecidas consisten de CFU-E. Estas CFU-E fueron transfectádas usando un retrovirus. Para esto, una línea celular de empacado, designada 293-T, fue transfectada 48 horas antes. Las células 293-T son una línea celular de riñon embriónico humano establecida. Las células 293-T son transfectadas de manera estable con varios genes de un retr virus. Si estas células 293-T son ahora transfectadas con dos plásmidos, llamados pOS y pKAT, las células 293-T producen entonces un retrovirus que puede infectar células de hígado fetal de murino. Si
la células 293-T son transfectadas con un vector pOS vacío y pKAT, se produce entonces un retrovirus de tipo natural, que solamente expresa proteínas retrovirales. Por otro lado, clonar un gen humano, por ejemplo PRV-l, en el vector pOS resulta en la producción de un retrovirus que expresa esta proteína cuando ha infectado células. Las células 293-T segregan el retrovirus al medio de cultivo de las células. Después de dos días, el medio de cultivo de la células de las células 293-T transfectadas que contiene el retrovirus es cosechado y filtrado una vez a través de un filtro de 0.45 µm. .Para ttansfectar las células de hígado fetal, estas últiiaas células son mezcladas con el medio de cultivo de células filtrado, que contiene los retrovirus, y se someten a centrifugación por 2 horas a 1800 rpm y 20° C en presencia adicionada de Polybren. Las células de hígado fetal transfectadas se cultivaron entonces en un medio (Methocult, de Cell Systems) que contiene, además de las sales y amino ácidos usuales, suero de becerro fetal, 0.0001 - 0.4 Ul de erítrspoyetina (EPO) /ml y metil celulosa (0.8 %) . Las CFU-Es requieren EPO para formar colonias hematopoyéticas. La metil celulosa solidifica el
medio en forma de una jalea, fijando por medio de esto células individuales en esta jalea de modo que, en contraste a que estuvieran en un medio liquido, no se pueden mover. Por lo tanto es posible observar si una colonia hematopoyética está o no está formada a partir de una sola célula. Las CFU-Es forman colonias eritroides, esto es colonias que contienen células rojas sanguíneas y sus células precursoras. Después de tres días, se tomo una cuenta del número de colonias hematopoyéticas que se habían desarrollado. Se compararon varias mezclas. No se examinaron todas las mezclas en cada experimento; las mezclas 1-3 son controles muy similares, y cada una de ellas puede ser comparada individualmente con la mezcla 4. Mezcla 1: Células que no fueron transfectadas con un retrovirus ; Mezcla 2: Células que fueron transfectadas con un vector pOS vacío; Mezcla 3: Células que fueron transfectadas con una "proteína fluorescente verde" (GFP) , una proteína que no es hematopoyética ente activa . Mezcla 4: Células que fueron transfectadas con pQS- PRV-l (vector + gen de acuerdo a la
invención) .
Tabla 1: La tabla enlista los resultados obtenidos de tres experimentos que se realizaron como se describió. Las figuras en cada caso indican el número de colonias
Los experimentos demuestran que las CFU-Es que se transfectaron con PRV-l forman muchas más colonias (hasta tres veces más) que los diversos CFU- Es de control. Éste resultado indica que PRV-l es un factor de crecimiento para CFU-E.
Ejemplo 3 Solubilidad del factor de crecimiento de PRV-l Sé llevó a cabo un experimento adicional para investigar si PRV-l es un factor de crecimiento soluble o si se requiere un contacto célula-célula. No es solamente un retrovirus lo que se produce por
la línea celular 293-T de empacado, después de que ha sido transfectada con los vectores pOS y pKAT . Además, las células 293-T también sintetizan la proteína codificada por el gen clonado en pOS, es decir PRV-l en el presente caso. Si el producto del gen es una proteína soluble, se segrega en el medio que rodea a la línea celular de empaque 293-T. Si la células 293-T son transfectadas solamente con el vector pOS, sin pKAT, entonces no se forman retrovirus. El medio de cultivo de las células contiene entonces solamente la proteína soluble producida por las células. El medio que s,e deriva de las células transfectadas con pOS y PRV-l, y que no contiene ningún retrovirus, es mezclado con CFU-Es y el conjunto es sembrado en el medio de metil celulosa; se cuentan entonces las colonias resultantes . Se obtuvieron los siguientes resultados: Tabla 2: Solubilidad de PRV-l. las Figuras en cada caso indican el número de colonias.
En este experimento, también, las CFU-Es que fueron tratadas con medio que contenía PRV-l formaron muchas más colonias hematopoyéticas que las células de control. Puede concluirse de este resultado que PRV-l es un factor de crecimiento soluble.
Ejemplo 4 El factor de creciftiiento PRV-l está N-glicosilado Se aislaron granulocitos de un paciente que sufría de p. vera, y se prepararon extractos de proteína a partir de estas células usando un protocolo estándar. Estos extractos de proteína se trataron de acuerdo con el protocolo para el "N-Glycosidase F Deglycosylation Kit" suministrado por Boehringer Mannheim. En detalle, esto significa que se agregó una "solución amortiguadora de desnaturación" a los extractos de proteina, y las mezclas de calentaron a 95° C por 3 minutos, después 4e lo cual se trataron ya sea con "solución amortiguadora de reacción' con 'solución amortiguadora de reaóción" más N~glicosidasa. Cada mezcla se incubó toda la noche a 37° C, y las proteínas se analizaron en una electroforegis en gel PAGE seguida por una transferencia de Western. La proteína PRV-l se detectó con un anticuerpo dirigido
contra una proteína que tenía la secuencia de amino ácidos ID No. 5. los resultados muestran que mientras que la proteína PRV-l purificada de granulocitos tiene 60-65 kDa de tamaño, tiene solamente 40 kDa de tamaño después de haber sido digerida con N-glicosidasa. Esto prueba claramente que PRV-l está glicosilada en los residuos de asparagina (aspáragina - N) .
LISTADO DE SECUECIAS <110> Complejo del Hospital de la Uiversidad de Freiburg
<120> El gen PRV-l y su uso <130> E980930 <140> PCT/EP99/07238 <141> 1999-09-30 <150> 198 49 044.5 <151> 1998-10-23 <160> 9 <170> PADAT Sequenzmodul, Versión 1.0
<210> 1 <211> 1600 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <223> <400> 1
aaaagcagaa agagattacc agccacagac gggtcatgag cgcggtatta ctgctggccc 60 tcctggggtt catcctccca ctgecaggag tgcaggcgct gctctgccag tttgggacag 120 ttcagcatgt gtggaaggtg tccgacctgc cccggcaatg gacccctaag aacaccagct 180 gcgacagcgg cttggggtgc caggacacgt tgatgctoat tgagagcgga ccccaagtga 240 gcctggtgct ctccaagggc tgcacggagg ccaaggacca ggagccccgc gtcactgagc 300 accggatggg ccccggcctc tccctgatct cctacacctt cgtgtgccgc caggaggact 360 tctgcaacaa cctcgttaac tccctcccge tttgggcccc acagccccca gcagacccag 420 gatccttgag gtgcccagtc tgettgtcta tggaaggctg tctggagggg acaacagaag 480 agatctgccc caaggggaec acacactgtt atgatggcct cctcaggctc aggggaggag 540 geatcttctc caatctgaga gtccagggat gcatgcccca gccaggttgc aacctgctca 600 atgggacaca ggaaattggg cccgtgggta tgactgagaa ctgcaatagg aaagattttc 660 tgacctgtca tcgggggacc accattatga cacacggaaa cttggctcaa gaacccactg 720 attggaccac atcgaataec gagatgtgcg aggtggggca ggtgtgtcag gagacgctgc 780 tgctcataga tgtaggactc acatcaaccc tggtggggac aaaaggctgc agcactgttg 840 gggctcaaaa ttcccagaag aecaccatcc actcagcccc tcctggggtg cttgtggcct 900 cctataccca cttctgctcc tcggacctgt gcaatagtgc cagcagcagc agcgttctgc 960 tgaactccct cectcctcaa gctgcccctg tcccaggaga ccggcagtgt cctacctgtg 1020 tgcagcccct tggaacctgt tcaagtggct ccccccgaat gacctgcccc aggggcgcca 1080 ctcattgtta tg tgggtac attcatctct caggaggtgg gctgtccacc aaaatgagca 1140 ttcagggctg cgtggcccaa ccttccagct tcttgttgaa ccacaccaga caaatcggga 1200 tcttctctgc gcgtgagaag cgtgatgtgc agcctcctgc ctctcagsat gagggaggtg 1260 gggctgaggg cctggagtct ctcacttggg gggtggggct ggcactggcc ccagcgctgt 1320
ggtggggagt ggtttgccct tcctgctaac tctattaccc ccacgattct tcaccgctgc 1380 tgaceaccca cactcaacct ccctctgacc tcataaccta atggccttgg acaccagatt 1440 ctttcccatt ctgtccatga atcatcttcc ccacacacaa tcattcatat ctactcacct 1500 aacagcaaca ctggggagag cc ggagcat ccggac tgc cctatgggag aggggacgct 1560 ggaggagtgg ctgcatgtat ctgataatac agaccctgtc 1600
<210> 2 <211> 437 <212> PRT . <213> homo isapiens <400> 2
Met Ser Ala Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Phe* He Leu Pro Leu
1 5 10 15
Pro Gly Val Gln Ala Leu Leu Cys Gln Phe Gly Thr Val Gln His Val 20 25 30 Trp Lys Val Ser Asp Leu Pro Arg Gln Trp Thr Pro Lys Asn Thr Ser 35 40 45 Cys Asp Ser Gly Leu Gly Cys Gln Asp Thr Leu Met Leu He Glu Ser
50 55 60 Gly Pro Gln Val Ser Leu Val Leu Ser Lys Gly Cys Thr Glu Ala Lys
65 70 75 80
Asp Gln Glu Pro Arg Val Thr Glu His Arg Met Gly Pro Gly Leu Ser 85 90 95
Leu lie Ser Tyr Thr Phe Val Cys Arg Gln Glu Asp Phe Cys Asn Asn 100 105 110 Leu Val Asn Ser Leu Pro Leu Trp Ala Pro Gln Pro Pro Ala Asp Pro 115 120 125 Gly Ser Leu Arg Cys Pro Val Cys Leu Ser Met Glu Gly Cys Leu Glu
130 135 140 Gly Thr Thr Glu Glu He Cys Pro Lys Gly Thr Thr His Cys Tyr Asp
145 150 155 160
Gly Leu Leu Arg Leu Arg Gly Gly Gly He Phe Ser Asn Leu Arg Val 165 170 175
Gln Gly Cys Met Pro Gln Pro Gly Cys Asn Leu Leu Asn Gly Thr Gln
180 185 190 Glu He Gly Pro Val Gly Met Thr Glu Asn Cys Asn Arg Lys Asp Phe 195 200 205 Leu Thr Cys His Arg Gly Thr Thr He Met Thr His Gly Asn Leu Ala
210 215 220 Gln Glu Pro Thr Asp Trp Thr Thr Ser Asn Thr Glu Met Cys Glu Val
225 230 235 240
Gly Gln Val Cys Gln Glu Thr Leu Leu Leu He Asp Val Gly Leu Thr 245 250 255
Ser Thr Leu Val Gly Thr Lys Gly Cys Ser Thr Val Gly Ala Gln Asn
260 265 270 Ser Gln Lys Thr Thr He His Ser Ala Pro Pro Gly Val Leu Val Ala
275 280 285 Ser Tyr Thr His Phe Cys Ser Ser Asp Leu Cys Asn Ser Ala Ser Ser
290 295 300 Ser Ser Val Leu Leu Asn Ser Leu Pro Pro Gln Ala Ala Pro Val Pro 305 310 315 320 Gly Asp Arg Gln Cys Pro Thr Cys Val Gln Pro Leu Gly Thr Cys Ser 325 330 335
Ser Gly Ser Pro Arg Met Thr Cys Pro Arg Gly Ala Thr His Cys Tyr 340 345 350 Asp Gly Tyr He His Leu Ser Gly Gly Gly Leu Ser Thr Lys Met Ser
355 360 365 He Gln Gly Cys Val Ala Gln Pro Ser Ser Phe Leu Leu Asn His Thr
370 375 380 Arg Gln He Gly He Phe Ser Ala Arg Glu Lys Arg Asp Val Gln Pro 385 390 395 400 Pro Ala Ser Gln His Glu Gly Gly Gly Ala Glu Gly Leu Glu Ser Leu 405 410 415
Thr Trp Gly Val Gly Leu Ala Leu Ala Pro Ala Leu Trp Trp Gly Val 420 425 430 Val Cys Pro Ser Cys 435
<210> 3 <211> 24 <212> RNA <213> homo sapiens <220> <223> <400> 3
aaaagcagaa agagattacc agcc 24
<210> 4 <211> 24 <212> RNA <213> homo sapiens <220> <223> <400> 4
ggctggtaat ctctttctgc tttt 24
<210> 5 <211> 13 <212> PRT
<213> homo sapiens <400> 5
Lys Val Ser Asp Leu Pro Arg Gln Trp Thr Pro Lys Asn 1 5 10
<210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> homo sapiens - <400> 6
Ser Ala Arg Glu Lys Arg Asp Val Gln Pro Pro Ala Ser Gln His 1 5 10 15
<210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <223> <400> 7
attaggttat gaggtcagag ggaggtt 27
<210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <223> <400> 8
gcagaaagag attaccagcc acagacgg 28
<210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> homo sapiens
<220> <223> <400> 9
gaatcgtggg ggtaatagag ttagcagg 28
Claims (23)
- REIVINDICACIONES 1. Polipéptido N-glicosilado, que comprende una de las siguientes secuencias de amino ácidos: amino ácidos 1-437 de la secuencia No. 2; amino áóidos 1-409 de la secuencia No. 2 ¡ amino ácidos 22-437 de la secuencia No. 2; amino ácidos 22-409 de la secuencia No. 2.
- 2. Polipéptido que comprende una de las siguientes secuencias de amino ácidos: amino ácidos 1-437 de la secuencia No. 2; amino ácidos 1-409 de la secuencia No. 2 ; amino ácidos 22-437 de la secuencia No. 2; amino ácidos 22-409 de la secuencia No. 2.
- 3. El polipéptido esencialmente puro de la secuencia ID No. 2.
- 4. Polinucleótido, que comprende una de las siguientes secuencias de nucleótidos: nucleótidos 1-1600 de la secuencia No. 1; nucleótidos 36-1346 de la secuencia No. i nucleótidos 36--1262 de la secuencia No. 1 nucleótidos 39-1346 de la secuencia No. 1 nucleótidos 39-1262 de la secuencia No. 1 nucleótidos 99-1346 de la secuencia No. 1; nucleótidos 99-1262 de la secuencia No, 1.
- 5. ADN recombinante que comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4.
- 6. ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos está unida de manera funcional a un promotor .
- 7. Vector de expresión, que contiene el ADN recombinante de conformidad con ala reivindicación 5 o la 6.
- 8. Célula huésped transformada o transfectada que contiene un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4.
- 9. Anticuerpo contra un polipóptido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, o un epitope del mismo.
- 10. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal.
- 11. Proceso para detectar polícitemia vera, caracterizado porque el polipéptido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 se hace reaccionar, en un inmunoensayo, con uno o más anticuerpo (s) de conformidad con la reivindicación 9 o la 10.
- 12. Proceso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo empleado es un anticuerpo monoclonal o policlonal de conformidad con la reivindicación 9.
- 13. Proceso para detectar policitemia vera, ?aracterizado porque un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4 es detectado usando un método de RT-PCR, o usando un método de transferencia.
- 14. Droga para tratar la policitemia vera, caracterizada porque, además de los excipientes usuales, comprende anticuerpos monoclonales o policlonales de conformidad con ala reivindicación 9 o la 10.
- 15. Droga que comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y al menos un excipiente farmacéuticamente tolerado .
- 16. Droga que comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, y al menos un excipiente farmacéuticamente tolerado.
- 17. Uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como un factor de crecimiento.
- 18. Uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para producir una droga para tratar pancitopenias y pancitopatías en la médula ósea y en la circulación.
- 19. Uso de un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, para producir una droga para tratar pancitopenias y pancitopatias en la médula ósea y en la circulación.
- 20. Uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para tratar y/o multiplicar células endógenas y/o líneas celulares establecidas ex vivo o in vitro.
- 21. Estuche para detectar policitemia vera, que comprende: al menos un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, o un fragmento del mismo, y/o al menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y/o al menos un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9 o la 10.
- 22. Estuche para detectar alteraciones del sistema hematopoyético, que comprende: al menos un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, o un fragmento del mismo, y/o al menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y/o al menos un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9 o la 10.
- 23. Estuche para detectar la proteína PRV-l de conformidad con la reivindicación 21 o la 22, caracterizado porque es un estuche de prueba ELISA.
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