SK5402001A3 - Prv-1 gene and the use thereof - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka nukleotidovej sekvencie, ktorá kóduje gén PRV-1, rekombinantnej DNA, ktorá obsahuje takúto nukleotidovú sekvenciu, vektora obsahujúceho túto rekombinantnú DNA a buniek transformovaných takým vektorom. Vynález sa ďalej týka polypeptidu PRV-1, protilátok proti tomuto polypeptidu, spôsobu detekcie polypeptidu PRV-1 a nakoniec tiež liečiv, ktoré obsahujú polypeptid PRV-1 alebo protilátky proti polypeptidu PRV-1.

Doterajší stav techniky

Polycythaemia rubra vera (erytrémia), skrátene tiež polycythaemia vera alebo p. vera, je malígne hematologické ochorenie, pri ktorom dochádza k zvýšenej tvorbe erytroidných, ganulocytárnych a megakaryocytárnych buniek. Ide o ochorenie klonálneho pôvodu vznikajúce v dôsledku mutácií v jedinej hematopoetickej prekurzorovej bunke. V Nemecku je výskyt p. vera 4 až 6 na milión obyvateľov. Ak sa ochorenie nelieči, vedie k úmrtiu do 18 mesiacov. Liečenie formou odberov krvi alebo chemoterapiou predlžuje čas prežitia v priemere na viac ako 13 rokov.

P. vera je diagnostikovaná na základe klinických príznakov. Ku klinickému obrazu patria bolesti hlavy, svrbenie, splenomegália u dvoch tretín pacientov, krvácanie alebo trombózy, hypertenzia u tretiny pacientov, dna vznikajúca v dôsledku zvýšenej tvorby kyseliny močovej, a v niektorých prípadoch septické vredy. Najdôležitejšími laboratórnymi nálezmi sú zvýšené hodnoty hemoglobínu, hematokritu, počtu erytrocytov a celkového objemu erytrocytov a tiež v mnohých prípadoch neutrofilná granulocytóza alebo trombocytóza. Takže vzhladom na to, že na jednej strane • ···· ·· ···· ·· ·· · ··· ··· • · · · · · · ··· · ·· ··· ·· ··· väčšina kritérií je relatívne vágnych, na druhej strane nie všetci pacienti tieto kritériá spĺňajú, je často veľmi ťažké odlíšiť p. vera od iných myeloproliferatívnych ochorení, ako je chronická granulocytárna leukémia alebo esenciálna trombocytóza, a potvrdiť tak diagnózu. Dnes sú základné príčiny ochorenia na molekulovej úrovni celkom neznáme. Avšak pretože neliečená p. vera má závažný priebeh a následky, je dôležitá presná diagnóza.

Podstata vynálezu

Predmetom a cieľom predloženého vynálezu je nájsť molekulárnu príčinu polycythaemia rubra vera a umožniť tak jej diagnostikovanie .

Ciel sa dosiahol tým, že sa izoloval gén, ktorý je špecificky exprimovaný v spojení s p. vera a nie u zdravých kontrolných jedincov. Tento gén sa nazval PRV-1 (podlá polycythaemia rubra vera).

Podobná nukleotidová sekvencia je opísaná v medzinárodnej patentovej prihláške WO 98/50552.

Jeden aspekt predloženého vynálezu sa týka polynukleotidu, ktorý kóduje gén PRV-1 a obsahuje sekvenciu č. 1. Polynukleotidom podľa vynálezu je jednoreťazcová alebo dvojreťazcová DNA alebo RNA. Keď je to RNA, je odborníkovi jasné, že sú tu nukleotidy U namiesto T nukleotidov. Termín polynukleotid podľa vynálezu označuje nukleovú kyselinu obsahujúcu 15 a viac nukleotidov.

Nukleotidová sekvencia podlá vynálezu je uvedená na obr. 1. Vynález sa teda týka polynukleotidu, ktorý zodpovedá sekvencii na obr. 1, a tiež polynukleotidu, ktorého sekvencia vykazuje menšie rozdiely. Sekvenciou s menšími rozdielmi sa podľa vynálezu rozumie sekvencia, kde len niekoľko, výhodne nie viac ako 50, výhodnejšie nie viac ako 25 nukleotidov sa môže zmeniť, avšak funkcia génu kódovaného takou nukleotidovou sekvenciou ···· ·· ···· ·· • · · · · · · e · · ··· · · ···· ····· ·· · zostáva nezmenená. Odborníkovi je známe, že triplet nukleotidov kódujúci aminokyselinu sa môže nahradiť iným tripletom, ktorý kóduje rovnakú aminokyselinu. Okrem toho úseky génu, ktoré majú menší význam, sa môžu v určitom menšom rozsahu deletovať a/alebo mutovať. V jednom uskutočnení vynálezu polynukleotid obsahuje nukleotidy 36 až 1346 zo sekvencie č. 1, to znamená kódujúci úsek z génu PRV-1. Iné uskutočnenie vynálezu obsahuje nukleotidy 36 až 1262 zo sekvencie č. 1. Predpokladá sa, že tento úsek kóduje aktívny úsek polypeptidu PRV-1. Ešte iný polynukleotid podľa vynálezu obsahuje nukleotidy 39 až 1346 alebo 39 až 1262 zo sekvencie č. 1, kde nie je prítomný kodón kódujúci začiatočný metionín. Výhodným uskutočnením vynálezu je napr. polynukleotid obsahujúci nukleotidy 9 až 1346 alebo 99 až 1262 zo sekvencie č. 1. Tak vznikajú polynukleotidy, kde kodóny na 5'-konci kódujúce signálny peptid PRV-1 polypeptidu nie sú prítomné.

Polynukleotidom podľa vynálezu je tiež fragment génu PRV-1. Spravidla má taký fragment viac ako 100 nukleotidov, avšak výhodne má viac ako 300 nukleotidov. Fragmenty sa môžu použiť ako oligonukleotidové priméry pre PCR alebo ako sondy, v takom prípade sa môžu fragmenty skrátiť tak, aby vyhovovali zamýšľanému cieľu. Oligonukleotidové priméry sú obvykle dlhé 10 až 30 nukleotidov a sondy sú dlhé 15 až 50 nukleotidov.

Gén PRV-1 je endogénny gén, ktorého expresia je u zdravých jedincov obmedzená len na niekolko málo orgánov. Normálne je exprimovaný len v orgánoch hematopoéze, to znamená v kostnej dreni a fetálnej pečeni, a slabo v slezine, ale nie je exprimovaný v srdci, v schvaloch, v pankrease alebo obličkách.

U pacientov trpiacich p.vera je však tento gén veľmi silne nadmerne exprimovaný najmä v hematopoetických bunkách.

Gén PRV-1 kóduje protein, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená na obr. 2. Signálny peptid, ktorý je prítomný v proteínovej sekvencii všetkých povrchových molekúl a normálne je odstraňovaný pri opracovaní proteínu v bunke, je na obr. 2 • ···· ·· ···· ·· ·· · · · · · · • · · · ··· · · • · ··· ···· • · · · · · · ···· ····· ·· oddelený pomlčkami. Proteín má sekvenciu uvedenú na obr. 2. Ďalším aspektom vynálezu je teda v podstate čistý polypeptid, ktorý má uvedenú sekvenciu označenú ako sekvencia č. 2 alebo polypeptid ktorý má sekvenciu č. 2 ale bez signálneho peptidu (to znamená aminokyseliny 22 až 437 zo sekvencie č. 2) . Ďalšie uskutočnenie vynálezu zahŕňa aminokyseliny 1 až 409 alebo 22 až 409 sekvencie č. 2 (čo je pravdepodobne aktívny úsek proteínu).

Ak ide o biologickú aktivitu, polypeptid podľa vynálezu je výhodne glykozylovaný, najvýhodnejšie je N-glykozylovaný. V takom prípade je glykozylovaný aspoň na jednej z aminokyselín Asn-46, Asn-189 a Asn-382 polypeptidu PRV-1 (číslovanie aminokyselín zodpovedá sekvencii č. 2). Predložený vynález zahŕňa tiež fragmenty polypeptidu podľa vynálezu, ktoré sú N-glykozylované. Fragmenty sú dlhé aspoň 50 aminokyselín, výhodne aspoň 100 aminokyselín a najvýhodnejšie aspoň 150 aminokyselín. V inom uskutočnení vynálezu je polypeptid O-glykozylovaný.

Odborníkovi je jasné, že určité aminokyseliny sa môžu nahradiť inými aminokyselinami, bez toho aby došlo k poškodeniu biologickej aktivity proteínu. Také modifikované formy polypeptidu sú tiež predmetom predloženého vynálezu. Ide o také náhrady aminokyselín, ktoré nemajú negatívny vplyv na biologickú aktivitu peptidu. Odborník môže využiť známe pravidlá pre výber aminokyselín na také náhrady.

V závislosti od spôsobu prípravy polypeptid PRV-1 môže obsahovať glykozylfosfatidylinozitolovú kotvu. Tá je naviazaná na aminokyseliny 407 až 409 podľa sekvencie č. 2. Avšak z dôvodov, ktoré sa doteraz neobjasnili, GPI-viazané proteíny sú tiež uvoľňované do média. Tento proces je nazývaný lienenie (shedding“). Dodnes však nie je známe, či ide o špecifický proces, to znamená, či sú polypeptidy odštiepované od membrány enzýmami regulovaným spôsobom, alebo či ide o nešpecifickú stratu kotvy. Je teda veľmi pravdepodobné, že PRV-1 sa bude vyskytovať ako na bunkovej membráne, tak aj extracelulárne. Secernovaná forma,

• ····	• · • · • ·	···· • ···	• · • · · • ·
	• •
• ·	•	• ·	···	• · ·

ktorá nie je viazaná na membránu, je zrejme oveľa dôležitejšia vo funkcii rastového faktora, pretože táto forma je schopná difundovať a ako rastový faktor ovplyvniť ďalšie bunky.

Odborníkovi je jasné, že je možné ovplyvniť prichytenie proteínu na bunkovú membránu manipuláciou práve s týmito aminokyselinami. Týka sa to najmä prípravy definovaných konštruktov DNA, ktorých cieľom je expresia polypeptidu PRV-1 alebo jeho fragmentov. Kodóny kódujúce tieto aminokyseliny sa môžu mutovať alebo deletovať.

Gén kóduje povrchový receptor rodiny uPAR/Ly6. Táto receptorová rodina prenáša mitogénne signály, ktoré stimulujú bunkové delenie. Predpokladá sa preto, že nadmerná expresia (overexpression) génu PRV-1, okrem iného v granulocytoch u pacientov s p. vera, prispieva k proliferácii týchto buniek.

Zistilo sa, že PRV-1 nie je exprimovaný v granulocytoch zdravých jedincov alebo u pacientov trpiacich iným myeloproliferativnym ochorením, ako je napr. chronická granulocytárna leukémia, akútna granulocytárna leukémia alebo esenciálna trombocytóza.

Aby sa mohol použiť polypeptid kódovaný génom PRV-1 na analytické ciele a detekčné metódy, je výhodne pripravovaný rekombinantným spôsobom, keď rekombinantná DNA výhodne obsahuje nukleotidovú sekvenciu č. 1 alebo aspoň kódujúci úsek génu PRV-1, to znamená nukleotidy 36 až 1346 v sekvencii č. 1, najmenej však nukleotidy 39 až 1262, funkčne spojené s promótorom. Avšak rekombinantná DNA môže obsahovať tiež len fragment sekvencie č. 1.

Predložený vynález sa ďalej týka vektora, ktorý obsahuje rekombinantnú DNA pre polypeptid PRV-1 alebo jeho fragment, a ďalej hostitelských buniek, ktoré sú transfekované alebo transformované týmto vektorom. Hostiteľské bunky sú prokaryotické bunky, napr. baktérie ako je E. coli. Avšak exprimované

• · · · e · • · · • · ··· polypeptidy potom nie sú glykozylované. Prednostne sa teda používajú eukaryotické hostiteľské bunky schopné glykozylovať exprimovaný proteín posttranslačne a modifikovať ho aj iným spôsobom. Príkladom eukaryotických hostiteľských buniek sú bunky hmyzu, napr. bunky Sf9, na expresiu po infekcii bakulovírusovým vektorom, a cicavčie bunky, ako napr. bunky COS, CHO a HeLa. Avšak tieto príklady nie sú vyčerpávajúce. Tiež je možné použiť kvasinky ako hostiteľské bunky. Odborníkovi je jasné, že glykozylačný profil sa bude líšiť podľa typu použitých buniek. Biologická aktivita exprimovaného produktu sa preto bude tiež líšiť. Zvlášť výhodné sú preto hostiteľské bunky, ktoré glykozylujú exprimovaný produkt tak, že si uchováva svoju biologickú aktivitu.

Polypeptid PRV-1, ktorý je izolovaný z granulocytov alebo je pripravovaný rekombinantným spôsobom sa môže využiť ako na diagnostiku polycythaemia vera tak aj na liečenie tohto ochorenia.

Jednou terapeutickou možnosťou je tzv. antisense terapia. Pri tomto spôsobe sa používa antisense RNA molekula, čo je molekula RNA komplementárna k PRV-1 RNA. Pretože PRV-1 RNA začína na svojom 5'-konci sekvenciou:

5'-AAAAGCAGAAAGAGATTACCAGCC-3' (sekvencia č. 3), potom príslušná antisense RNA bude mať nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu:

5'-GGCTGGTAATCTCTTTCTGCTTTT-3' (sekvencia č. 4). Táto antisense RNA sa vloží do vektora a vnesie do buniek p.vera. RNA sa vnesie do buniek napr. transfekciou, keď je vektor použitý na transfekciu skonštruovaný tak, aby špecificky transfekoval bunky p.vera. Expresia antisense RNA vedie k tomu, že PRV-1 mRNA už naďalej nie je translatovaná na polypeptid, takže bunky ošetrené touto antisense RNA nevytvárajú žiadny proteín PRV-1.

Predložený vynález sa preto týka tiež spôsobu detekcie

p.vera, ktorý spočíva v tom, že polypeptid PRV-1, alebo jeho

• ····	• ·	····	··
• ·	•	•	•	• ·	··
• ·	•	•	···	e	•
• ·	•	•	•	•	•
• · ·	··	···	• ·	• ·

epitop, sa deteguje a určí sa rozsah jeho expresie.

Nadmerná expresia receptora na zrelých bunkách mimo kostnej drene, napr. na granulocytoch, je významnou indikáciou prítomnosti ochorenia p. vera. Táto nadmerná expresia sa výhodne deteguje použitím imunotestu s využitím protilátok proti receptoru PRV-1. Vhodné testovacie metódy sú známe varianty imunotestu, keď sa používajú protilátky špecifické k polypeptidu PRV-1 spolu s ďalšími značenými protilátkami, ktoré sú buď imobilizované alebo v roztoku. Značenie je možné uskutočniť známym spôsobom, napr. použitím rádioaktívnych izotopov alebo fluorescenčných alebo luminiscenčných značiek, pomocou enzýmov, využitím reakcie, pri ktorej vzniká farbivo alebo iné skupiny, ktoré sú vhodné na detekciu. Všetky tieto metódy a ich varianty sú odborníkom známe a nie je ich tu potrebné podrobne vysvetľovať. Podľa vynálezu je zvlášť výhodné použitie testu ELISA.

Protilátky potrebné na špecifickú detekciu receptora PRV-1 je možné pripraviť spôsobmi, ktoré sú tiež známe. Sú vhodné ako polyklonálne tak aj monoklonálne protilátky, avšak výhodné je použitie monoklonálnych protilátok.

Peptidy odvodené z proteínu sa môžu tiež použiť na prípravu protilátok. Podľa vynálezu sa s úspechom použili peptidy, ktoré mali nasledujúce sekvencie:

a) KVSDLPRQWTPKN (aminokyseliny 34 až 46) [sekvencia č. 5], a

b) SAREKRDVQPPASQH (aminokyseliny 391 až 405) [sekvencia č.

6] ·

Polyklonálne protilátky sa normálne pripravujú imunizáciou vhodného hostitela (králika) polypeptidom PRV-1, ktorý je naviazaný na vhodný imunologický nosič (adjuvans) a vyvoláva imunitnú reakciu. Monoklonálne protilátky sa pripravujú známymi metódami s využitím tzv. techniky hybridómov. Získané protilátky sa puri8

• ···· • · • e	·· • · • ·	···· • ···	• · • · · • ·
• · ·	··	···	·· ·

fikujú afinitnou metódou. Príprava a purifikácia protilátok sú podrobne opísané napr. v Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow a Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Naviac také polyklonálne alebo monoklonálne protilátky, namierené proti PRV-1, môžu sa použiť na liečenie ochorenia.

V inom uskutočnení vynálezu je receptor detegovaný použitím metódy RT-PCR. Na tento cieľ sa najskôr z buniek exprimujúcich PRV-1, čo sú spravidla granulocyty, izoluje RNA. Potom sa uskutoční reverzná transkripcia, čo je známa metóda, pomocou RT priméra. RT primér má výhodne nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu (sekvencia č. 7):

ATTAGGTTATGAGGTCAGAGGGAGGTT.

Týmto spôsobom sa RNA špecifická pre PRV-1 transformuje na DNA. Táto DNA sa potom amplifikuje v PCR známym spôsobom. Výhodne sa na amplifikačné cykly v PCR použijú nasledujúce priméry:

sense primér (sekvencia č. 8)

GCAGAAAGAGATTACCAGCCACAGACGG, antisense primér (sekvencia č. 9)

GAATCGTGGGGGTAATAGAGTTAGCAGG.

Odborník je pritom schopný ľahko použiť sekvenciu, ktorá je opísaná v predloženom vynáleze, na nájdenie ďalších vhodných primérov.

Pretože je v tejto metóde ako východiskový materiál použitá RNA, PCR je pozitívna len v prípade, že gén PRV-1 je exprimovaný. Ako je vysvetlené skôr, je to len v prípade, že pacient trpí p.vera. PRV-1 nie je exprimovaný v ganulocytoch u zdravých jedincov. Tiež neprítomnosť signálu v RT-PCR ukazuje, že nie je prítomná p.vera.

• ···· ·· ···· ·· ·· · · · · · · • · · I ··· · · • · ··· ····

V alternatívnom postupe je možné použiť tzv. prenosové alebo hybridizačné metódy (blotting), výhodne Northern blotting, na diagnózu p.vera. Pri tejto metóde sa z granulocytov izoluje RNA a skúma sa na expresiu PRV-1 metódou prenosu a hybridizácie, výhodne Northernovej hybridizácie.

Ako sonda sa pri Northernovej hybridizácii použije cDNA so sekvenciou č. 1 alebo fragment takej sekvencie. K hybridizácii dôjde len v prípade, že granulocyty sa získali z pacienta trpiaceho p.vera, lebo len v takom prípade dochádza v granulocytoch k expresii PRV-1. Neprítomnosť hybridizačného signálu indikuje, že jedinec, z ktorého pochádzajú granulocyty, netrpí p.vera.

Na Northenovú hybridizáciu je možné použiť len fragment génu. Taký fragment je obvykle dlhý viac ako 100 báz, výhodne viac ako 300 báz. Alternatívne rôzne fragmenty génu, ktoré sa môžu využiť ako sondy na Northernovú hybridizáciu, sa môžu pripraviť naštiepením génu reštrikčnými endonukleázami. Keď sú fragmenty získané z cDNA, sú vo forme dvojreťazcovej DNA, pričom pred hybridizáciou sa musia separovať na jednotlivé reťazce. K vhodným príkladom patrí fragment BamHI-Pstl zahŕňajúci páry báz 420 až 831, alebo fragment Pstl-PstI zahŕňajúci páry báz 831 až 1900.

PRV-1 mRNA, a tiež expresia génu PRV-1, sa môžu detegovať najskôr reverznou transkripciou mRNA a potom amplifikáciou cDNA v RT-PCR, pričom amplifikovaná DNA sa deteguje hybridizáciou pomocou sondy.

V prípade pozitívnej diagnózy sa musí ochorenie liečiť, lebo inak v relatívne krátkom čase vedie k úmrtiu. Na liečenie je možné využiť špecifické protilátky namierené proti PRV-1, na ktorého cytotoxickú zložku sa viažu, keď je to vhodné.

Predložený vynález sa ďalej týka lieku, ktorý obsahuje okrem bežných excipientov protilátky, ktoré sú namierené proti recep• ··· ·· ···· ·· ·· ···· ···

-ι Λ · · · · ··· * ·

1U · · · · · ···· • · · · · · · ·· · · ····· ·· · toru PRV-1.

Pretože je receptor PRV-1 nadmerne exprimovaný u pacientov trpiacich p.vera, veľa protilátok sa naviaže na povrch postihnutých granulocytov, keď sa granulocyty dostanú do kontaktu s protilátkami anti-PRV-1. Naviazanie protilátok na tieto bunky stimuluje bunky imunitného systému na to, aby tieto granulocyty likvidovali. Týmto spôsobom je možné špecificky eliminovať bunky p.vera.

Zistilo sa tiež, že polypeptid PRV-1 má tiež hematopoetickú aktivitu. Polypeptid PRV-1 je schopný stimulovať určité hematopoetické prekurzorové bunky, aby vytvárali erytroidné kolónie. Túto funkciu prejavuje najmä NB-glykozylovaná forma polypeptidu PRV-1. Výhodné polypeptidy podľa vynálezu sú preto N-glykozylované polypeptidy PRV-1 a ich fragmenty, ktoré vykazujú aktivitu rastového faktora.

Ďalším aspektom predloženého vynálezu je preto liek, ktorý obsahuje, okrem bežných farmaceutický prijateľných excipientov, polypeptid PRV-1 alebo jeho biologicky aktívny fragment. Polypeptid PRV-1 je výhodne glykozylovaný polypeptid PRV-1, ešte výhodnejšie N-glykozylovaný polypeptid PRV-1 alebo jeho biologicky aktívny fragment.

Predložený vynález sa ďalej týka použitia polypeptidu PRV-1 alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu, ako rastového faktora, a síce in vivo a in vitro. Polypeptid PRV-1 a jeho biologicky aktívne fragmenty sa môžu použiť na liečenie všetkých druhov pancytopénií a pancytopatii v kostnej dreni alebo v krvnom obehu (zmeny bunkových zložiek v periférnej krvi a kostnej dreni). Polypeptidy podľa vynálezu sa môžu použiť napríklad na liečenie anémií v prípade zlyhania obličiek, pri chemoterapii alebo celotelovom ožarovaní, na liečenie neutropénií a trombocytopénií v priebehu chemoterapie pri chemoterapii alebo celotelovom ožarovaní, na liečenie ex vivo periférnych kmeňových buniek alebo z kostnej dreni expanziou (multiplikáciou) a spätnou

• ···· • · • ·	·· • · • ·	···· • ···	·· • · · • ·
• ·	• ·	•	• ·
• · ·	• ·	• · ·	·· ·

transfúziou pacientovi, a na liečenie sepse, syndrómu systémovej zápalovej reakcie (SIRS) alebo lokálnych zápalových reakcií. Polypeptidy podľa vynálezu alebo lieky, ktoré ich obsahujú, sa podávajú rôznymi spôsobmi. K týmto spôsobom podávania patrí napr. podávanie intravenózne, intramuskulárne, subkutánne, intraperitoneálne, perorálne, transdermálne alebo transmukozálne.

Polypeptidy podľa vynálezu sa môžu tiež použiť na liečenie pancytopénií a pancytopatií. V takých prípadoch je cieľom liečby exprimovať polypeptid PRV-1 alebo jeho funkčný fragment v bunkách postihnutého pacienta. V tejto súvislosti sú hlavnými používanými metódami, metódy génovej terapie. Z postihnutého pacienta sa izolujú bunky, ktoré sa transfekujú polynukleotidom podľa vynálezu (ex vivo manipulácia), a po nej sa zasa vrátia pacientovi. Je tiež možné si predstaviť metódu, keď polynukleotid podľa vynálezu získa prístup do cieľových buniek prostredníctvom vírusového prenosu. Expresia vložených nukleových kyselín potom vedie k hematopoetickej aktivite.

Predložený vynález sa ďalej týka súprav na detekciu polycythaemia vera a tiež iných ochorení hematopoézy. Tieto súpravy obsahujú polynukleotid podľa vynálezu a/alebo polypeptid podľa vynálezu a/alebo jednu alebo viac protilátok podľa vynálezu. Okrem toho súpravy obsahujú tiež nádobku alebo prípravky vhodné na uskutočnenie detekčnej reakcie. K príkladom takých prípravkov patria pufri, reagencie na blokovanie membrány, hybridizačné roztoky, sekundárne protilátky, substrátové roztoky na detekčné reakcie a pod. Súpravy sa výhodne používajú na uskutočnenie PCR reakcií, Northernových hybridizácií, Southernových hybridizácií, Westernových blotov, ELISA testov, RIA testov a ďalších.

Na podrobnejšie vysvetlenie vynálezu sú uvedené nasledujúce príklady.

·· ···· ·· ·· ···· ··· • · · · ··· · · • · · · · » · a · • · · · · · · ····

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Charakterizácia génu PRV-1

Na charakterizáciu génu PRV-1 sa uskutočnili nasledujúce pokusy:

na izoláciu granulocytov z uskladnenej krvi získanej odberom od pacientov s p.vera sa použil nasledujúci protokol:

zhodný objem 3% roztoku dextránu v 0,9% NaCl sa pridal ku krvi a zmes sa nechala stáť pri teplote miestnosti (RT) 20 minút, zmes sa rozdelila na dve fázy, vrchná svetlo sfarbená fáza sa odobrala a centrifugovala 10 minút pri 1800 g pri RT, supernatant sa odstránil a bunkový pelet sa resuspendoval v rovnakom objeme 0,9% NaCl, na každú vzorku bolo 35 ml buniek v NaCl navrstvené na 15 ml Ficoll-Hypaque, bunky na Ficoll-Hypaque sa centrifugovali 60 minút pri 1800 g pri RT bez použitia brzdy, vytvoril sa bunkový pelet a dve vrstvy s medzifázou, vrstvy s medzifázou sa odsali a bunkový pelet sa resuspendoval 30 sekúnd v 10 ml ladovo studeného 0,2% NaCl a bezprostredne po 30 sekundách sa pridalo 10 ml ladovo vychladeného 1,6% NaCl, bunky sa centrifugovali 10 minút pri 1800 g pri RT, bunky sa raz opláchli v 10 ml PBS a znova sa centrifugovali, bunkový pelet obsahoval granulocyty v 95-99% čistote, z týchto buniek sa izolovala RNA štandardným postupom, mg RNA sa vyšetrilo Northernovou hybridizáciou na ···· j ········· • · · · · · · ··· · ·· ··· ·· expresii PRV-1, ako sonda sa použila celá sekvencia uvedená tu ako sekvencia č. 1.

Tento experiment sa uskutočnil s 19 pacientmi trpiacimi p.vera a s 21 kontrolnými vzorkami skladovanej krvi. Zistilo sa, že sonda PRV-1 hybridizovala silne v prípade pacientov s p.vera a žiadny hybridizačný signál sa nepozoroval pri kontrolných vzorkách zo zdravých jedincov.

Príklad 2

PRV-1 má aktivitu rastového faktora

Z brezivých myší 13,5 dní po fertilizácii sa vybrali embryá a vypreparovali sa fetálne pečene. Bunky, obsiahnuté v nich sa zafarbili protilátkami a obohatili sa o určitý typ buniek, pričom iné bunky sa zasa odstránili, a síce stĺpcovou chromatografiou. Výsledkom je zmes buniek obohatená o určité hematopoetické prekurzorové bunky (kolónie tvoriace jednotky - erytroidy, CFU-E). Takže zatial, čo vo fetálnych pečeniach asi 2% tvoria CFU-E, v obohatenej zmesi CEU-E predstavovali 30 až 40%.

Bunky CEU-E sa transfekovali pomocou retrovírusu. Takzvaná zbalovacia bunková línia 293-T sa sama 48 hodín pred tým transfekovala. Bunky 293-T sú bunky stabilnej línie ľudských embryonálnych obličkových buniek. Bunky 293-T sú trvalo transfekované niekoľkými génmi retrovírusov. Keď sú potom tieto bunky 293-T transfekované dvoma palzmidmi, nazývanými pOS a pKAT, potom bunky 293-T produkujú retrovírusy, ktoré sú schopné infikovať myšacie fetálne pečeňové bunky. Keď sú bunky 293-T transfekované prázdnym vektorom pOS a pKAT, potom je produkovaný retrovírus divého typu, ktorý exprimuje len retrovírusové proteíny. Na druhej strane, klonovanie ludského génu, napr. génu PRV-1, do vektora pOS vedie k produkcii retrovírusu, ktorý po infekcii bunky produkuje tento proteín. Bunky 293-T secernujú retrovírus do kultivačného média.

···· ·· ···· ·· • · · · · · • · · ·· · · • · · · · · ··· · ·· ··· ··

Po dvoch dňoch sa kultivačné médium z transfekovaných buniek 293-T obsahujúcich retrovírus odoberie a filtruje sa cez 0,45 pm filter. Aby bolo možné transfekovať fetálne pečeňové bunky, tieto bunky sa zmiešajú s prefiltrovaným kultivačným médiom, ktoré obsahuje retrovírus, a potom sa centrifugujú 2 hodiny pri 1800 rpm a 20°C s prídavkom Polybrenu. Fetálne pečeňové bunky sa potom kultivujú v médiu (Methocult, od firmy Celí Systems), ktoré obsahuje okrem obvyklých solí a aminokyselín, fetálne teľacie sérum, 0,0001 až 0, IU erytropoetínu (EP0)/ml a metylcelulózu (0,8%). Bunky CFU-E potrebujú EPO, aby vytvárali hematopoetické kolónie. Metylcelulóza stužuje médium do formy rôsolu, a tak fixuje jednotlivé bunky v tomto rôsole, takže na rozdiel od kultivácie v kvapalnom médiu sa bunky nemôžu pohybovať. Je možné teda pozorovať, či sa z jednotlivých buniek tvoria hematopoetické kolónie alebo nie. CFU-E vytvárajú erytroidné kolónie, teda kolónie obsahujúce červené krvinky a ich prekurzorové bunky.

Po troch dňoch sa hematopoetické kolónie, ktoré sa vyvinuli, spočítali. Porovnali sa rôzne zmesi, pritom nie všetky zmesi sa porovnali vo všetkých pokusoch: zmesi č. 1 až 3 sú velmi podobné kontroly a každá z nich sa môže porovnať jednotlivo so zmesou

č. 4.

Zmes 1: Bunky, ktoré nie sú transfekované retrovírusom.

Zmes 2: Bunky, ktoré sa transfekovali prázdnym vektorom pOS.

Zmes 3: Bunky transfekované zeleným fluorescenčným proteínom,

GFP, to znamená proteínom, ktorý nemá hematopoetickú aktivitu.

Zmes 4: Bunky, ktoré sa transfekovali pOS-PRV-1 {to znamená vektorom s génom podľa vynálezu).

Tabuľka 1

Prehľad výsledkov získaných v troch experimentoch uskutočnených už opísaným postupom. Uvedené hodnoty predstavujú počet kolónií.

• ···· ·· ···· ·· ·· ···· ··· • · · · ··· · · ·· ·· ···· ··· · ·· ··· ·· ···

	Zmes 1	Zmes 2	Zmes 3	Zmes 4
	neboli transfekované	prázdny vektor (pOS)	GFP (pOS-GFP)	PRV-1 (pOS-PRV-1)
Experiment 1	116	156	80	326
Experiment 2		271	273	410
Experiment 3	120		131	291

Experimenty ukázali, že bunky CFU-E, ktoré sa transfekovali PRV-1, vytvárali oveľa viac kolónii (až trikrát viac), ako rôzne kontrolné bunky. Tieto výsledky ukazujú, že PRV-1 pôsobí na CFU-E ako rastový faktor.

Príklad 3

Rozpustnosť rastového faktora PRV-1

Ďalší experiment sa uskutočnil s cielom skúmať, či PRV-1 je rozpustný rastový faktor alebo či je potrebný vzájomný kontakt buniek. Zbalovacia bunková línia 293-T po transfekcii vektormi pOS a pKAT neprodukuje len retrovírus. Bunky 293-T naviac syntetizujú proteín kódovaný génom v pOS, to znamená v tomto prípade PRV-1. Ak je génový produkt rozpustný proteín, je secernovaný do média obklopujúceho bunky 293-T. Ak sú bunky 293-T transfekované len vektorom pOS bez pKAT, netvoria sa žiadne retrovírusy. Kultivačné médium potom obsahuje len rozpustný proteín produkovaný bunkami. Médium pochádzajúce z kultivácie buniek transfekovaných pOS-PRV-1, ktoré neobsahuje žiadny retrovírus, sa zmiešalo s bunkami CFU-E a zmes sa vysiala na médium s metylcelulózou, vzniknuté kolónie sa spočítali.

V experimente sa získali nasledujúce výsledky.

·· ···· • · · • · ···

Tabulka 2

Rozpustnosť PRV-1. Uvedené hodnoty predstavujú počet kolónií.

	Zmes 1	Zmes 2	Zmes 3	Zmes 4
	neboli	prázdny	GFP	PRV-1
	transfekované	vektor (pOS)	(pOS-GFP)	(pOS-PRV-1)
Experiment 4		137	187	557

V tomto experimente tiež bunky CFU-E, ktoré sa ošetrili médiom obsahujúcim PRV-1, vytvárali oveľa viac hematopoetických kolónií ako kontrolné bunky. Z týchto výsledkov je teda možné odvodiť, že PRV-1 je rozpustný rastový faktor.

Príklad 4

Rastový faktor PRV-1 je N-glykozylovaný

Granulocyty sa izolovali z pacientov trpiacich p. vera a z týchto buniek sa štandardnými metódami pripravili proteínové extrakty. Proteínové extrakty sa ošetrili podľa návodu k súprave N-Glycosidase F Deglycosylation Kit od firmy Boehringer Mannheim. Podrobnejšie to znamená, že sa k proteínovým extraktom pridal denaturačný pufor a táto zmes sa zahriala na 3 minúty na 95°C, potom sa zmes ošetrila reakčným pufrom alebo reakčným pufrom s N-glykozidázou. Všetky zmesi sa potom inkubovali cez noc pri 37°C a potom sa proteíny analyzovali PAGE elektroforézou a potom Westernovým prenosom (Western blot). Proteín PRV-1 sa detegoval protilátkou namierenou proti proteínu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú tu ako sekvencia č. 5. Výsledky ukázali, že zatial čo proteín PRV-1 purifikovaný z granulocytov má veľkosť 60 až 65 kDa, potom, ako sa naštiepil N-glykozidázou, má veľkosť len 40 kDa. Dokazuje to, že PRV-1 je glykozylovaný na asparagínovom zvyšku (asparagín=N).

• · · · · · • · • ···

Zoznam sekvencii

<210>	1
<211>	1600
<212>	DNA
<213>	homo sapiens
<220> <223>
<400>	1

aaaagcagaa	agagattacc	agccacagac	gggtcatgag	cgcggtatta	ctgctggccc	60
tcctggggtt	catcctccca	ctgccaggag	tgcaggcgct	gctctgccag	tttgggacag	120
ttcagcatgt	gtggaaggtg	tccgacctgc	cccggcaatg	gacccctaag	aacaccagct	180
gcgacagcgg	cttggggtgc	caggacacgt	tgatgctcat	tgagagcgga	ccccaagtga	240
gcctggtgct	ctccaagggc	tgcacggagg	ccaaggacca	ggagccccgc	gtcactgagc	300
accggatggg	ccccggcctc	tccctgatct	cctacacctt	cgtgtgccgc	caggaggact	360
tctgcaacaa	cctcgttaac	tccctcccgc	tttgggcccc	acagccccca	gcagacccag	420
gatccttgag	gtgcccagtc	tgcttgtcta	tggaaggctg	tctggagggg	acaacagaag	480
agatctgccc	caaggggacc	acacactgtt	atgatggcct	cctcaggctc	aggggaggag	540
gcatcttctc	caatctgaga	gtccagggat	gcatgcccca	gccaggttgc	aacctgctca	600
atgggacaca	ggaaattggg	cccgtgggta	tgactgagaa	ctgcaatagg	aaagattttc	660
tgacctgtca	tcgggggacc	accattatga	cacacggaaa	cttggctcaa	gaacccactg	720
attggaccac	atcgaatacc	gagatgtgcg	aggtggggca	ggtgtgtcag	gagacgctgc	780
tgctcataga	tgtaggactc	acatcaaccc	tggtggggac	aaaaggctgc	agcactgttg	840
gggctcaaaa	ttcccagaag	accaccatcc	actcagcccc	tcctggggtg	cttgtggcct	900
cctataccca	cttctgctcc	tcggacctgt	gcaatagtgc	cagcagcagc	agcgttctgc	960
tgaactccct	ccctcctcaa	gctgcccctg	tcccaggaga	ccggcagtgt	cctacctgtg	1020
tgcagcccct	tggaacctgt	tcaagtggct	ccccccgaat	gacctgcccc	aggggcgcca	1080
ctcattgtta	tgatgggtac	attcatctct	caggaggtgg	gctgtccacc	aaaatgagca	1140
ttcagggctg	cgtggcccaa	ccttccagct	tcttgttgaa	ccacaccaga	caaatcggga	1200
tcttctctgc	gcgtgagaag	cgtgatgtgc	agcctcctgc	ctctcagcat	gagggaggtg	1260
gggctgaggg	cctggagtct	ctcacttggg	gggtggggct	ggcactggcc	ccagcgctgt	1320
ggtggggagt	ggtttgccct	tcctgctaac	tctattaccc	ccacgattct	tcaccgctgc	1380

• · ··· ·

tgaccaccca	cactcaacct	ccctctgacc	tcataaccta	atggccttgg	acaccagatt	1440
ctttcccatt	ctgtccatga	atcatcttcc	ccacacacaa	tcattcatat	ctactcacct	1500
aacagcaaca	ctggggagag	cctggagcat	ccggacttgc	cctatgggag	aggggacgct	1560
ggaggagtgg	ctgcatgtat	ctgataatac	agaccctgtc			1600

<210> 2 <211> 437 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2

Met 1

Ser Ala

Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly

Phe

íle

Leu

Pro 15

Leu

5

10 '

Pro

Gly

Val

Gin

Ala

Leu

Leu

Cys

Gin

Phe

Gly

Thr

Val

Gin

His

Val

20

25

30

Trp

Lys

Val

Ser

Asp

Leu

Pro

Arg

Gin

Trp

Thr

Pro

Lys

Asn

Thr

Ser

35

40

45

Cys

Asp

Ser

Gly

Leu

Gly

Cys

Gin

Asp

Thr

Leu

Met

Leu

íle

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Pro

Gin

Val

Ser

Leu

Val

Leu

Ser

Lys

Gly

Cys

Thr

Glu

Ala

Lys

65

70

75

80

Asp

Gin

Glu

Pro

Arg

Val

Thr

Glu

His

Arg

Met

Gly

Pro

Gly

Leu

Ser

85

90

95

Leu

íle

Ser

Tyr

Thr

Phe

Val

Cys

Arg

Gin

Glu

Asp

Phe

Cys

Asn

Asn

100

105

110

Leu

Val

Asn

Ser

Leu

Pro

Leu

Trp

Ala

Pro

Gin

Pro

Pro

Ala

Asp

Pro

115

120

125

Gly

Ser

Leu

Arg

Cys

Pro

Val

Cys

Leu

Ser

Met

Glu

Gly

Cys

Leu

Glu

130

135

140

Gly

Thr

Thr

Glu

Glu

íle

Cys

Pro

Lys

Gly

Thr

Thr

His

Cys

Tyr

Asp

145

150

155

160

Gly

Leu

Leu

Arg

Leu

Arg

Gly

Gly

Gly

íle

Phe

Ser

Asn

Leu

Arg

Val

165

170

175

Gin

Gly

Cys

Met

Pro

Gin

Pro

Gly

Cys

Asn

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Gin

180

185

190

Glu

íle

Gly

Pro

Val

Gly

Met

Thr

Glu

Asn

Cys

Asn

Arg

Lys

Asp

Phe

195

200

205

Leu

Thr

Cys

His

Arg

Gly

Thr

Thr

íle

Met

Thr

His

Gly

Asn

Leu

Ala

210

215

220

Gin

Glu

Pro

Thr

Asp

Trp

Thr

Thr

Ser

Asn

Thr

Glu

Met

Cys

Glu

Val

225

230

235

240

Gly

Gin

Val

Cys

Gin

Glu

Thr

Leu

Leu

Leu

íle

Asp

Val

Gly

Leu

Thr

245

250

255

Ser

Thr

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Gly

Cys

Ser

Thr

Val

Gly

Ala

Gin

Asn

260

265

270

• ···· ·· ···· ·· • · · ··· · · · • · · · ··· · · • · ··· ···· • · · 9 9 9 9

999 9 9 9 9 9 9 99 9

Ser Gin

Lys 275

Thr

Thr

íle His

Ser 280

Ala

Pro

Pro

Gly

Val 285

Leu

Val

Ala

Ser

Tyr

Thr

His

Phe

Cys

Ser

Ser

Asp

Leu

Cys

Asn

Ser

Ala

Ser

Ser

290

295

300

Ser

Ser

Val

Leu

Leu

Asn

Ser

Leu

Pro

Pro

Gin

Ala

Ala

Pro

Val

Pro

305

310

315

320

Gly

Asp

Arg

Gin

Cys

Pro

Thr

Cys

Val

Gin

Pro

Leu

Gly

Thr

Cys

Ser

325

330

335

Ser

Gly

Ser

Pro

Arg

Met

Thr

Cys

Pro

Arg

Gly

Ala

Thr

His

Cys

Tyr

340

345

350

Asp

Gly

Tyr

íle

His

Leu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Ser

Thr

Lys

Met

Ser

355

360

365

íle

Gin

Gly

Cys

Val

Ala

Gin

Pro

Ser

Ser

Phe

Leu

Leu

Asn

His

Thr

370

375

380

Arg

Gin

íle

Gly

íle

Phe

Ser

Ala

Arg

Glu

Lys

Arg

Asp

Val

Gin

Pro

385

390

395

400

Pro

Ala

Ser

Gin

His

Glu

Gly

Gly

Gly

Ala

Glu

Gly

Leu

Glu

Ser

Leu

405

410

415

Thr

Trp

Gly

Val

Gly

Leu

Ala

Leu

Ala

Pro

Ala

Leu

Trp

Trp

Gly

Val

420

425

430

Val

Cys

Pro

Ser

Cys

435

<210>	3
<211>	24
<212>	RNA
<213>	homo
<220> <223>
<400>	3

sapiens aaaagcagaa agagattacc agcc

<210>	4
<211>	24
<212>	RNA
<213>	homo
<220>
<223>
<400>	4

sapiens ggctggtaat ctctttctgc tttt • ···· »· *··· ·· ·· · · · · ··· • · · · ··· · · • · ··· · · · · ···· ····· ·· ·

<210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> homo <400> 5	sapiens
Lys Val Ser 1	Asp Leu 5	Pro Arg	Gin	Trp
<210>	6
<211>	15
<212>	PRT
<213>	homo	sapiens
<400>	6
Ser Ala Arg 1	Glu Lys 5	Arg Asp	Val	Gin
<210>	7
<211>	27
<212>	DNA
<213>	homo	sapiens
<220> <223>
<400>	7

Thr Pro Lys Asn 10

Pro Pro Ala Ser Gin His 10 15

attaggttat gaggtcagag ggaggtt
<210>	8
<211>	28
<212>	DNA
<213>	homo	sapiens
<220>
<223>
<400>	8

gcagaaagag attaccagcc acagacgg • ···· ·· ···· ·· ·· ···· ··· • · · · ··· · · ·· ·· ···· ··· · ·· ··· ·· ···

<210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> homo sapiens
<220>
<223>
<400>	9

gaatcgtggg ggtaatagag ttagcagg

Claims (23)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. N-glykozylovaný polypeptid, ktorý obsahuje jednu z nasledujúcich aminokyselinových sekvencii:

   aminokyseliny 1 až 437 sekvencie č. 2, aminokyseliny 1 až 409 sekvencie č. 2, aminokyseliny 22 až 437 sekvencie č. 2, aminokyseliny 22 až 409 sekvencie č. 2.
2. 2. Polypeptid, ktorý obsahuje jednu z nasledujúcich aminokyselinových sekvencii:

   aminokyseliny 1 až 437 sekvencie č. 2, aminokyseliny 1 až 409 sekvencie č. 2, aminokyseliny 22 až 437 sekvencie č. 2, aminokyseliny 22 až 409 sekvencie č. 2.
3. 3. V podstate čistý polypeptid majúci sekvenciu č. 2.
4. 4. Polynukleotid ktorý obsahuje jednu z nasledujúcich nukleotidových sekvencii:

   nukleotidy 1 , až 1600 sekvencie č. 1, nukleotidy 36 až 1346 sekvencie č. 1, nukleotidy 36 až 1262 sekvencie č. 1, nukleotidy 39 až 1346 sekvencie č. 1, nukleotidy 39 až 1262 sekvencie č. 1, nukleotidy 99 až 1346 sekvencie č. 1, nukleotidy 99 až 1262 sekvencie č. 1.
5. 5. Rekombinantná DNA, ktorá obsahuje polynukleotid podlá nároku

   4.
6. 6. Rekombinantná DNA podľa nároku 5, kde nukleotidová sekvencia • ···· ·· ···· ·· ·· ···· ··· • « · ··· · · ··· · ·· ··· ·· ··· je funkčne spojená s promótorom.
7. 7. Expresný vektor, ktorý obsahuje rekombinantnú DNA podľa nároku 5 alebo 6.
8. 8. Transformovaná alebo transfekovaná hostitelská bunka, ktorá obsahuje polynukleotid podlá nároku 4.
9. 9. Protilátka proti polypeptidu PRV-1 podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 alebo jeho epitopu.
10. 10. Protilátka podľa nároku 9, ktorou je monoklonálna protilátka.
11. 11. Spôsob detekcie polycythaemia vera, vyznačuj úci sa tým, že polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 reaguje v imunoteste s jednou alebo niekoľkými protilátkami podľa nároku 9 alebo 10.
12. 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že použitou protilátkou je polyklonálna alebo monoklonálna protilátka podľa nároku 9.
13. 13. Spôsob detekcie polycythaemia vera, vyznačuj úci satým, že polynukleotid podľa nároku 4 je detegovaný použitím metódy RT-PCR alebo metódou hybridizácie (blotting).
14. 14. Liek na liečenie polycythaemia vera, vyznačuj úci sa t ý m, že okrem obvyklých excipientov obsahuje polyklonálne alebo monoklonálne protilátky podľa nároku 9 alebo 10.
15. 15. Liek, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 a aspoň jeden farmaceutický prijateľný excipient.

    • ···· • · • · • · ···· • ··· ·· • · • · ·· • • • · • • · ·· · ·· ··
16. 16. Liek, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polynukleotid podľa nároku 4 a aspoň jeden farmaceutický prijateľný excipient.
17. 17. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 ako rastového faktora.

    a
18. 18. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 na i výrobu liekov na liečenie pancytopénií a pancytopatií v kostnej dreni a v krvnom obehu.
19. 19. Použitie polynukleotidu podľa nároku 4 na výrobu lieku na liečenie pancytopénií a pancytopatií v kostnej dreni a v krvnom obehu.
20. 20. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 na výrobu lieku na liečenie a/alebo multiplikáciu endogénnych buniek a/alebo bunkových línií ex vivo alebo in vitro.
21. 21. Súprava na detekciu polycythaemia vera, vyznačuj ú c a sa t ý m, že obsahuje:

    aspoň jeden polynukleotid podľa nároku 4 alebo jeho fragment a/alebo >

    aspoň jeden polypeptid podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 a/alebo aspoň jednu protilátku podľa nároku 9 alebo 10.
22. 22. Súprava na detekciu porúch hematopoetického systému, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

    aspoň jeden polynukleotid podlá nároku 4 alebo jeho fragment a/alebo ···· ·· ···· • · · • · ··· ·· • · • · • · · ·· ··· • · ·· aspoň jeden polypeptid podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 a/alebo aspoň jednu protilátku podľa nároku 9 alebo 10.
23. 23. Súprava na detekciu proteínu PRV-1 podľa nárokov 21 alebo 22, vyznačujúca sa tým, že je to súprava ELISA testu.