KR101774465B1 - 암 치료 표적 Ｓｉｒｔ２ 및 그를 사용하여 암 치료제를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

Abstract

암 치료 표적 Sirt2 및 그를 사용하여 암 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, Sirt2의 발현 또는 활성이 억제되는 경우, 세포의 증식 속도가 대조군에 비해 유의적으로 감소되고, 세포주기가 이탈될 수 있으며, 암 발생 억제 유전자의 발현이 대조군에 비해 유의하게 증가되는 효과가 있다.

Description

암 치료 표적 Ｓｉｒｔ２ 및 그를 사용하여 암 치료제를 스크리닝하는 방법{Cancer therapeutic target Sirt2 and method for screening anti-cancer agent using the same}

암 치료 표적 Sirt2 및 그를 사용하여 암 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Sirt(Sirtuins)은 니코틴아마이드의존성의 탈아세틸화효소로서 세균에서부터 사람에 이르기까지 대부분의 종에서 잘 보존되어있다. 포유류에서는 Sirt1에서 Sirt2까지 총 7종류의 Sirtuin이 존재한다 (Journal of Cell Science. 2011;124:833-838).

한편, 주로 세포의 세포질 내에 위치하는 Sirt2는 아직까지 역분화줄기세포 제작효율의 변화에 미치는 역할이 규명되지 않았다. 다만 Sirt2는 Sirt1과는 반대로 배아줄기세포나 역분화줄기세포 같은 다능성줄기세포에서 적게 발현하고 분화된 세포에서 많이 발현함으로써 마우스 배아줄기세포의 분화과정에서 초기에 분화방향을 결정짓는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (PlosOne. 2013;8:e76699).

암은 그 원인 및 진행 과정이 대단히 이질적인 질병으로서 형태학적, 병리학적으로는 비슷하지만 분자수준에서는 서로 현저히 다른 형태로 진행한다. 최근의 임상 경험도 이를 뒷받침 하는데, 허셉틴이나 제피티닙과 같이 임상에서 성공적으로 쓰이고 있는 약물들의 표적인 ERBB2 및 EGFR들은 전체 암환자 중 약 20~30% 정도의 일부 환자들에서만 돌연변이되거나 과발현되고 있다.

이와 같이, 암 진행 과정이 서로 이질적이기 때문에, 중요 표적들을 찾기 위해서는 가능한 한 많은 임상 시료를 확보, 분석하는 것이 필요하다. 현재 전 세계적으로도 몇몇 연구 그룹만이 대규모 유전자 발현 데이터베이스를 확보하고 이를 이용해 표적화 암 치료 표적 발굴 연구를 진행하고 있으며, 국내의 많은 연구들은 아직 대규모 데이터베이스를 확보하지 못한 한계를 가지고 있다.

따라서, 새로운 암 치료 표적 발굴 및 발굴된 표적을 사용하여 새로운 암 치료제를 개발하고자 하는 요구가 존재한다.

일 양상은 Sirt2(Sirtuin 2) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 Sirt 2 유전자 또는 단백질 발현 세포주와 약물 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 약물 후보 물질이 접촉된 세포주의 Sirt2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; Sirt 2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 Sirt 2 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 감소된 경우, 상기 약물 후보 물질을 암 치료제의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 암 치료제를 선발하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 Sirt2(Sirtuin 2) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.

상기 Sirt 2 는 효소의 이름이 상이하더라도, 그와 유사한 활성을 갖는 효소를 포함할 수 있으며, 예를 들면 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다. 여기에서, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST [참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA [참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다. 서열번호 1은 인간의 Sirt2 아미노산 서열이고, 서열번호 2는 마우스의 Sirt2 아미노산 서열이다.

상기 체세포는 Sirt2를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 것일 수 있다. 용어 "외인성 핵산"은 정상적으로 또는 자연적으로 본래의 세포 내에 존재하거나 그에 의해 생산되지 않는 핵산을 의미할 수 있고, 세포에 도입(예를 들면, 전기 천공법, 형질 전환, 형질 감염, 리포펙션, 또는 그 외 핵산을 세포 내에 도입하는 방법)된 것일 수 있다. 상기 Sirt2를 코딩하는 외인성 핵산은 유전적으로 변형되지 않은 세포에 비해 발현이 증가된 것일 수 있다. 상기 Sirt2 유전자의 상동 유전자는 서로 다른 진핵 생물로부터 유래하였으나, 그들이 코딩하는 효소와 유사한 활성을 나타내는 효소를 암호화하는 유전자를 의미할 수 있다. 상기 Sirt2 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 Sirt2 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 3은 인간의 Sirt2 뉴클레오티드 서열이고, 서열번호 4는 마우스의 Sirt2 뉴클레오티드 서열이다.

상기 Sirt2 단백질의 발현 억제제는 Sirt2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다 또한, 상기 Sirt2 단백질의 활성 억제제는 Sirt2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

상기 siRNA는 인간 Sirt2 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것일 수 있다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 합성될 수 있다.

상기 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)는 Sirt2 단백질의 결합 도메인을 억제하는 Sirt2 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합(Benkirane, N., et al. J. Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, 구조적으로 강제된(conformationally constrained) 펩티드, 사이클릭 미메틱스(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 미메틱스일 수 있다. 펩티드 미메틱스는 Sirt2 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체(Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체(Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다.

상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.

상기 항체는 Sirt2에 특이적이고 직접적으로 결합하여 Sirt2의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 Sirt2에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 Sirt2에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 Sirt2 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 Sirt2 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.

일 구체예에 따른 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함하는 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은, 경구, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다.예를 들면, 핵산 또는 벡터가 주사가능한 형태로 사용된다. 이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도록 하므로 유리할 수 있다. 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 투여 개체는 척추동물이고 예를 들면, 인간, 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 또는 실험 동물, 예를 들면, 쥐, 토끼, 기니아피그, 또는 햄스터일 수 있다.

상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, Sirt2의 발현 또는 활성이 억제되는 경우, 세포의 증식 속도가 대조군에 비해 유의적으로 감소되고, 세포주기가 이탈될 수 있다. 또한, 다른 구체예에 있어서, Sirt2의 발현 또는 활성이 억제되는 경우, 암 발생 억제 유전자, 예를 들면, p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 또는 p21의 발현이 대조군에 비해 유의하게 증가될 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 세포주기 이탈 또는 세포 증식 억제능을 갖는 것일 수 있다. 또한 상기 약학적 조성물은 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 또는 p21 매개에 의한 세포주기 이탈 또는 세포 증식 억제능을 갖는 것일 수 있다.

다른 양상은 Sirt 2 유전자 또는 단백질 발현 세포주와 약물 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 약물 후보 물질이 접촉된 세포주의 Sirt2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; Sirt 2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 Sirt 2 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 감소된 경우, 상기 약물 후보 물질을 암 치료제의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 암 치료제를 선발하는 방법을 제공한다.

또 다른 양상은 Sirt 2 단백질과 약물 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 약물 후보 물질이 접촉된 Sirt2 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 상기 Sirt 2 단백질의 활성 수준을 대조군의 활성 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 Sirt 2 단백질의 활성 수준이 감소된 경우, 상기 약물 후보 물질을 암 치료제의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 암 치료제를 선발하는 방법을 제공한다.

일 양상에 따른 방법은 상기 약물 후보 물질이 접촉된 세포주의 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 또는 p21 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 또는 p21 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 또는 p21 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 증가된 경우, 상기 약물 후보 물질을 암 치료제의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 일 양상에 따른 방법은 Sirt 2 유전자 또는 단백질 발현 세포주와 약물 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 약물 후보 물질이 접촉된 세포주의 Sirt2, 및 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 및/또는 p21 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; Sirt 2, 및 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 및/또는 p21 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 Sirt 2, 및 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 및/또는 p21 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 감소된 경우, 상기 약물 후보 물질을 암 치료제의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

또 다른 양상에 따른 방법은 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 또는 p21 단백질과 약물 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 약물 후보 물질이 접촉된 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 또는 p21 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 상기 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 또는 p21 단백질의 활성 수준을 대조군의 활성 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 또는 p21 단백질의 활성 수준이 증가된 경우, 상기 약물 후보 물질을 암 치료제의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 다른 양상에 따른 방법은 Sirt 2, 및 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 및/또는 p21 단백질과 약물 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 약물 후보 물질이 접촉된 세포주의 Sirt2, 및 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 및/또는 p21 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; Sirt 2, 및 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 및/또는 p21 단백질의 활성 수준을 대조군의 활성 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 Sirt 2, 및 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 및/또는 p21 단백질의 활성 수준이 감소된 경우, 상기 약물 후보 물질을 암 치료제의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 Sirt 2 유전자 또는 단백질 발현 세포주는 Sirt2 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 발현 벡터에 포함되어 체세포에 도입된 것일 수 있다. 상기 Sirt2 단백질은 Sirt2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 이용하여 시험관 내에서 세포주로부터 발현된 형태의 단백질일 수 있으며, 상기 발현벡터는 바쿨로바이러스 발현 벡터, 포유류 발현 벡터, 또는 박테리아 발현 벡터를 이용할 수 있으며, 상기 세포주는 곤충세포주, 포유동물 세포주 또는 박테리아 세포주를 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 용어 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 분화된 세포에 Sirt2 단백질을 전달하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 상기 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현조절요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제기원을 포함한다. 발현벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 에피솜 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murineleukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스, 센다이 바이러스 (Sendai virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 선발하는 방법에 있어서, 약물 후보 물질은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 선발하는 방법에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting), 유세포 분석법(FACS) 또는 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 측정하는 것일 수 있다.

상기 선발하는 방법에 있어서, 상기 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석, 단백질 칩, 또는 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 측정하는 것일 수 있다.

상기 선발하는 방법에 있어서, 상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 세포 등에서 Sirt2의 발현 또는 활성이 억제되는 경우, 세포의 증식 속도가 대조군에 비해 유의적으로 감소되고, 세포주기가 이탈될 수 있다. 또한, 다른 구체예에 있어서, Sirt2의 발현 또는 활성이 억제되는 경우, 암 발생 억제 유전자, 예를 들면, p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 또는 p21의 발현이 대조군에 비해 유의하게 증가될 수 있다. 또한, 상기 암 치료제는 세포주기 이탈 또는 세포 증식 억제능을 갖는 것일 수 있으며, 상기 세포주기 이탈 또는 세포 증식 억제능은 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 또는 p21 매개에 의한 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 Sirt2, 및 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 및/또는 p21 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 방법은 암 치료제 후보 물질을 선발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

일 양상에 따른 Sirt2의 발현 또는 활성이 억제되는 경우, 세포의 증식 속도가 대조군에 비해 유의적으로 감소되고, 세포주기가 이탈될 수 있으며, 암 발생 억제 유전자의 발현이 대조군에 비해 유의하게 증가되는 효과가 있어, 일 양상에 따른 Sirt2의 발현 또는 활성 억제제는 암 치료를 위한 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있고, 암 치료 표적 Sirt2를 사용하여 암 치료제를 유용하게 스크리닝할 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 Sirt2 결손 세포에서의 세포 증식 속도를 나타낸 도면이다.
도 2a는 정상 세포에서의 세포 주기를 유세포분석법을 통해 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2b는 일 구체예에 따른 Sirt2 결손 세포에서의 세포 주기를 유세포분석법을 통해 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 일 구체예에 따른 Sirt2 결손 세포에서의 암 발생 억제 유전자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. Sirt2 결손(Knock-out) 마우스의 제조, 그의 배아로부터의 섬유아세포의 분리, 및 분리된 세포의 분석

1. Sirt2 발현(+/+), Sirt2 저발현 (+/-), Sirt2 결손(-/-) 마우스 배아와 그 섬유아세포의 분리

대조군으로서, Sirt2 정상 발현 마우스를 얻기 위해 8 내지 24주령의 Sirt2 발현(+/+) 암컷 마우스와 Sirt2 발현(+/+) 수컷 마우스(The Jackson Laboratory, C57BL/6J, #000664)를 합사하고, 다음날 오전에 교미마개(mating plug)를 확인한 암컷 마우스를 분리하였다.

Sirt2 저발현(+/-) 마우스를 얻기 위해 8 내지 24주령의 Sirt2 발현(+/+) 암컷 마우스와 Sirt2 결손(-/-) 수컷 마우스(The Jackson Laboratory, B6.129-Sirt2 ^tm1Fwa /J, #012772); 또는 8~24주령의 Sirt2 결손(-/-) 암컷 마우스와 Sirt2 발현(+/+) 수컷 마우스를 합사하고, 다음날 오전에 교미마개(mating plug)를 확인한 암컷 마우스를 분리하였다.

실험군으로서, Sirt2 결손(-/-) 마우스를 얻기 위해 8 내지 24주령의 Sirt2 결손(-/-) 암컷 마우스와 Sirt2 결손(-/-) 수컷 마우스를 합사하고, 다음날 오전에 교미마개(mating plug)를 확인한 암컷 마우스를 분리하였다.

교미마개를 확인한 날로부터 13.5일 내지 14.5일째에 임신한 각 암컷 마우스의 복강을 절개하여 배아(embryo)를 분리하였다. 머리와 내장을 제거한 배아의 몸통을 단면도를 이용하여 잘게 자르고 0.1% 트립신(trypsin)으로 5분간 처리하여 섬유아세포를 추출하였다. 추출된 섬유아세포는 하이 글루코오즈 DMEM에 10% FBS(Fetal Bovine Serum) + 1% penicillin/streptomycin의 배양액에서 배양하였다.

2. Sirt2 결손(-/-)된 마우스의 배아로부터 분리된 섬유아세포의 분석

(2.1) 세포 증식 속도 분석

Sirt2 유전자의 결손이 세포 증식 속도에 미치는 영향을 확인하기 위해, Sirt2 결손 세포(Knock-out: KO) 의 증식 속도를 Sirt2 정상 세포(Wild type: WT)의 증식 속도와 비교하였다.

먼저, 상기 실시예 1에서 제조된 Sirt2 KO, 및 Srit2 WT 섬유아세포를 한 번의 계대배양을 거친 후에 1 계대(1st passage)가 되었을 때 1 X 10⁵의 세포를 35mm 디쉬에 4세트씩 접종(seeding)하였다. 증식 속도를 측정하기 위해 24시간 간격으로 1세트씩의 세포를 떼어내어 트립판 블루 염색을 통해 숫자를 세고 이를 96시간까지 수행하였다. 또한, 증식 어세이를 위해 WST-1 Proliferation assay 키트(abcam, 뮤5473)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 증식 속도는 흡광도 595 nm에서 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 일 구체예에 따른 Sirt2 결손 세포에서의 세포 증식 속도를 나타낸 도면이다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 Sirt2 결손 세포에서는 정상 세포에 비해 유의적으로 세포의 증식속도가 현저하게 감소되었음을 확인할 수 있다. 상기의 결과로, Sirt2 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 저해되는 경우, 세포의 증식이 억제될 수 있음을 알 수 있다.

(2.2) 세포 주기 분석

Sirt2 유전자의 결손이 세포 주기에 미치는 영향을 확인하기 위해, Sirt2 결손 세포(Knock-out: KO)의 세포주기와 Sirt2 정상 세포(Wild type: WT)의 세포주기를 유세포분석법을 사용하여 비교하였다.

먼저, 상기 실시예 1에서 제조된 Sirt2 KO, 및 Srit2 WT 섬유아세포를 100% 밀집도(confluence)에서 배지를 교환하지 않은 상태로 72시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 High glucose DMEM + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin 배지 중 배양하여 세포주기의 동기화를 유도하였다. 이후에, 계대 배양을 실시하고, 24시간 동안 추가적으로 배양을 수행한 후에, 세포를 수집하였다. 다음으로, 수집된 세포를 프로피디움 요오드(propidium iodide)로 염색하고, 유세포분리분석기(BD, FACSAriaIII)를 사용하여 유세포 분석법을 통해 세포 주기를 분석하였다. 상기 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2a는 정상 세포에서의 세포 주기를 유세포분석법을 통해 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 2b는 일 구체예에 따른 Sirt2 결손 세포에서의 세포 주기를 유세포분석법을 통해 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 정상 세포의 경우 일반적인 패턴의 세포주기 분포도를 보이는 데 반해, Sirt2 결손 세포에서는 2N 상태의 세포분획과 4N 상태의 세포분획이 명확히 구분되지 못하고 겹치는 양태로 나타나 세포주기의 이탈이 발생했음을 확인할 수 있다. 따라서, 상기의 결과로 Sirt2 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 저해되는 경우, 세포 주기의 이탈이 일어나며, 그에 따라 세포의 증식이 억제될 수 있음을 알 수 있다.

(2.3) 암 발생 억제 유전자 발현 분석

Sirt2 유전자의 결손이 암 발생 억제 유전자인 p16/ink-4a, p15/ink-4b, 또는 p21의 발현에 미치는 영향을 분석하기 위해, 정량적 실시간 역전사효소 중합연쇄반응(qRT-PCR)을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 Sirt2 KO, 및 Srit2 WT 섬유아세포 총 RNA는 TRIZOL(invitrogen)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 추출하였다. 역전사를 통한 cDNA는 M-MLV reverse transcriptase(invitrogen)을 사용하여 제조사에 지시에 따라 합성하였다. PCR 반응에 사용된 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf, p21 및 beta-actin에 대한 프라이머는 각각 서열번호 5, 및 6의 조합, 서열번호 7 및 8의 조합, 서열번호 9 및 10의 조합, 서열번호 11 및 12의 조합, 서열번호 13 및 14의 조합, 및 서열번호 15 및 16의 조합을 사용하였고, PCR 조건은 다음과 같이 Fast two-step 법을 사용하였다; 95℃ 에서 5분 동안 DNA 중합효소 활성화, 95℃ 에서 5초 동안 변성, 60℃ 에서 10초 동안 결합 및 연장. qRT-PCR은 2x Rotor-Gene SYBR Green PCR Master Mix (qiagen) 시약 및 Rotor-Gene Q (qiagen) 기기를 사용하여 35-45 cycle로 수행하였으며 각 유전자의 발현양은 하우스키핑유전자인 beta-actin의 발현양을 기준으로 상대적 발현양이 산출되었는데 이는 Rotor-Gene Q series software를 사용하여 수행되었고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3은 일 구체예에 따른 일 구체예에 따른 Sirt2 결손 세포에서의 암 발생 억제 유전자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, Sirt2 결손 세포에서 대조군에 비해 유의적으로 암 발생 억제 유전자의 발현이 증가되어 있는 것을 확인할 수 있다. 특히 p16/ink-4a의 경우에는 Sirt2 결손 세포에서 대조군에 비해 약 80배 이상 발현이 증가되어 있음을 확인할 수 있다.

따라서, 이상의 결과로 Sirt2 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 저해되는 경우, 암 발생 억제 유전자의 발현이 증가되며, Sirt2 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 암 치료제에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Kyungpook National University <120> Cancer therapeutic target Sirt2 and method for screening anti-cancer agent using the same <130> PN112569 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Phe Leu Arg Asn Leu Phe Ser Gln Thr Leu Ser Leu Gly Ser 1 5 10 15 Gln Lys Glu Arg Leu Leu Asp Glu Leu Thr Leu Glu Gly Val Ala Arg 20 25 30 Tyr Met Gln Ser Glu Arg Cys Arg Arg Val Ile Cys Leu Val Gly Ala 35 40 45 Gly Ile Ser Thr Ser Ala Gly Ile Pro Asp Phe Arg Ser Pro Ser Thr 50 55 60 Gly Leu Tyr Asp Asn Leu Glu Lys Tyr His Leu Pro Tyr Pro Glu Ala 65 70 75 80 Ile Phe Glu Ile Ser Tyr Phe Lys Lys His Pro Glu Pro Phe Phe Ala 85 90 95 Leu Ala Lys Glu Leu Tyr Pro Gly Gln Phe Lys Pro Thr Ile Cys His 100 105 110 Tyr Phe Met Arg Leu Leu Lys Asp Lys Gly Leu Leu Leu Arg Cys Tyr 115 120 125 Thr Gln Asn Ile Asp Thr Leu Glu Arg Ile Ala Gly Leu Glu Gln Glu 130 135 140 Asp Leu Val Glu Ala His Gly Thr Phe Tyr Thr Ser His Cys Val Ser 145 150 155 160 Ala Ser Cys Arg His Glu Tyr Pro Leu Ser Trp Met Lys Glu Lys Ile 165 170 175 Phe Ser Glu Val Thr Pro Lys Cys Glu Asp Cys Gln Ser Leu Val Lys 180 185 190 Pro Asp Ile Val Phe Phe Gly Glu Ser Leu Pro Ala Arg Phe Phe Ser 195 200 205 Cys Met Gln Ser Asp Phe Leu Lys Val Asp Leu Leu Leu Val Met Gly 210 215 220 Thr Ser Leu Gln Val Gln Pro Phe Ala Ser Leu Ile Ser Lys Ala Pro 225 230 235 240 Leu Ser Thr Pro Arg Leu Leu Ile Asn Lys Glu Lys Ala Gly Gln Ser 245 250 255 Asp Pro Phe Leu Gly Met Ile Met Gly Leu Gly Gly Gly Met Asp Phe 260 265 270 Asp Ser Lys Lys Ala Tyr Arg Asp Val Ala Trp Leu Gly Glu Cys Asp 275 280 285 Gln Gly Cys Leu Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly Trp Lys Lys Glu Leu 290 295 300 Glu Asp Leu Val Arg Arg Glu His Ala Ser Ile Asp Ala Gln Ser Gly 305 310 315 320 Ala Gly Val Pro Asn Pro Ser Thr Ser Ala Ser Pro Lys Lys Ser Pro 325 330 335 Pro Pro Ala Lys Asp Glu Ala Arg Thr Thr Glu Arg Glu Lys Pro Gln 340 345 350 <210> 2 <211> 389 <212> PRT <213> Mouse <400> 2 Met Ala Glu Pro Asp Pro Ser Asp Pro Leu Glu Thr Gln Ala Gly Lys 1 5 10 15 Val Gln Glu Ala Gln Asp Ser Asp Ser Asp Thr Glu Gly Gly Ala Thr 20 25 30 Gly Gly Glu Ala Glu Met Asp Phe Leu Arg Asn Leu Phe Thr Gln Thr 35 40 45 Leu Gly Leu Gly Ser Gln Lys Glu Arg Leu Leu Asp Glu Leu Thr Leu 50 55 60 Glu Gly Val Thr Arg Tyr Met Gln Ser Glu Arg Cys Arg Lys Val Ile 65 70 75 80 Cys Leu Val Gly Ala Gly Ile Ser Thr Ser Ala Gly Ile Pro Asp Phe 85 90 95 Arg Ser Pro Ser Thr Gly Leu Tyr Ala Asn Leu Glu Lys Tyr His Leu 100 105 110 Pro Tyr Pro Glu Ala Ile Phe Glu Ile Ser Tyr Phe Lys Lys His Pro 115 120 125 Glu Pro Phe Phe Ala Leu Ala Lys Glu Leu Tyr Pro Gly Gln Phe Lys 130 135 140 Pro Thr Ile Cys His Tyr Phe Ile Arg Leu Leu Lys Glu Lys Gly Leu 145 150 155 160 Leu Leu Arg Cys Tyr Thr Gln Asn Ile Asp Thr Leu Glu Arg Val Ala 165 170 175 Gly Leu Glu Pro Gln Asp Leu Val Glu Ala His Gly Thr Phe Tyr Thr 180 185 190 Ser His Cys Val Asn Thr Ser Cys Arg Lys Glu Tyr Thr Met Gly Trp 195 200 205 Met Lys Glu Lys Ile Phe Ser Glu Ala Thr Pro Arg Cys Glu Gln Cys 210 215 220 Gln Ser Val Val Lys Pro Asp Ile Val Phe Phe Gly Glu Asn Leu Pro 225 230 235 240 Ser Arg Phe Phe Ser Cys Met Gln Ser Asp Phe Ser Lys Val Asp Leu 245 250 255 Leu Ile Ile Met Gly Thr Ser Leu Gln Val Gln Pro Phe Ala Ser Leu 260 265 270 Ile Ser Lys Ala Pro Leu Ala Thr Pro Arg Leu Leu Ile Asn Lys Glu 275 280 285 Lys Thr Gly Gln Thr Asp Pro Phe Leu Gly Met Met Met Gly Leu Gly 290 295 300 Gly Gly Met Asp Phe Asp Ser Lys Lys Ala Tyr Arg Asp Val Ala Trp 305 310 315 320 Leu Gly Asp Cys Asp Gln Gly Cys Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu Gly 325 330 335 Trp Lys Lys Glu Leu Glu Asp Leu Val Arg Arg Glu His Ala Asn Ile 340 345 350 Asp Ala Gln Ser Gly Ser Gln Ala Pro Asn Pro Ser Thr Thr Ile Ser 355 360 365 Pro Gly Lys Ser Pro Pro Pro Ala Lys Glu Ala Ala Arg Thr Lys Glu 370 375 380 Lys Glu Glu Gln Gln 385 <210> 3 <211> 1817 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 agagcagtcg gtgacaggac agagcagtcg gtgacgggac acagtggttg gtgacgggac 60 agagcggtcg gtgacagcct caagggcttc agcaccgcgc ccatggcaga gccagaccga 120 ctcagattca gactctgagg gaggagccgc tggtggagaa gcagacatgg acttcctgcg 180 gaacttattc tcccagacgc tcagcctggg cagccagaag gagcgtctgc tggacgagct 240 gaccttggaa ggggtggccc ggtacatgca gagcgaacgc tgtcgcagag tcatctgttt 300 ggtgggagct ggaatctcca catccgcagg catccccgac tttcgctctc catccaccgg 360 cctctatgac aacctagaga agtaccatct tccctaccca gaggccatct ttgagatcag 420 ctatttcaag aaacatccgg aacccttctt cgccctcgcc aaggaactct atcctgggca 480 gttcaagcca accatctgtc actacttcat gcgcctgctg aaggacaagg ggctactcct 540 gcgctgctac acgcagaaca tagataccct ggagcgaata gccgggctgg aacaggagga 600 cttggtggag gcgcacggca ccttctacac atcacactgc gtcagcgcca gctgccggca 660 cgaatacccg ctaagctgga tgaaagagaa gatcttctct gaggtgacgc ccaagtgtga 720 agactgtcag agcctggtga agcctgatat cgtctttttt ggtgagagcc tcccagcgcg 780 tttcttctcc tgtatgcagt cagacttcct gaaggtggac ctcctcctgg tcatgggtac 840 ctccttgcag gtgcagccct ttgcctccct catcagcaag gcacccctct ccacccctcg 900 cctgctcatc aacaaggaga aagctggcca gtcggaccct ttcctgggga tgattatggg 960 cctcggagga ggcatggact ttgactccaa gaaggcctac agggacgtgg cctggctggg 1020 tgaatgcgac cagggctgcc tggcccttgc tgagctcctt ggatggaaga aggagctgga 1080 ggaccttgtc cggagggagc acgccagcat agatgcccag tcgggggcgg gggtccccaa 1140 ccccagcact tcagcttccc ccaagaagtc cccgccacct gccaaggacg aggccaggac 1200 aacagagagg gagaaacccc agtgacagct gcatctccca ggcgggatgc cgagctcctc 1260 agggacagct gagccccaac cgggcctggc cccctcttaa ccagcagttc ttgtctgggg 1320 agctcagaac atcccccaat ctcttacagc tccctcccca aaactggggt cccagcaacc 1380 ctggccccca accccagcaa atctctaaca cctcctagag gccaaggctt aaacaggcat 1440 ctctaccagc cccactgtct ctaaccactc ctgggctaag gagtaacctc cctcatctct 1500 aactgcccca cggggccagg gctaccccag aacttttaac tcttccagga cagggagctt 1560 cgggccccca ctctgtctcc tgcccccggg ggcctgtggc taagtaaacc atacctaacc 1620 taccccagtg tgggtgtggg cctctgaata taacccacac ccagcgtagg gggagtctga 1680 gccgggaggg ctcccgagtc tctgccttca gctcccaaag tgggtggtgg gcccccttca 1740 cgtgggaccc acttcccatg ctggatgggc agaagacatt gcttattgga gacaaattaa 1800 aaacaaaaac aactaac 1817 <210> 4 <211> 1863 <212> DNA <213> Mouse <400> 4 gagttgtagt tctctatcct atctcggcct cttcttgttt ccgctgccgt cacgggacag 60 agcagtcggt gacagtcccg agggccccca ccccgttccc atggccgagc cggacccctc 120 tgaccctctg gagacccagg cagggaaggt gcaggaggct caggattcag actcggacac 180 tgagggagga gccactggtg gagaggcaga gatggacttc ctgaggaatt tattcaccca 240 gaccctgggc ctgggttccc aaaaggagcg tcttctagac gagctgaccc tcgaaggagt 300 gacacgctac atgcagagcg agcgctgccg caaggtcatc tgtttggtgg gagccggaat 360 ctccacgtcc gcgggtatcc ctgacttccg ctccccgtcc actggcctct atgcaaacct 420 ggagaagtac caccttcctt acccagaggc catctttgag atcagctact tcaagaaaca 480 tccggaaccc ttctttgccc ttgccaagga gctctatccc gggcagttca agccaaccat 540 ctgccactac ttcatccgcc tgctgaagga gaaggggctg ctgctgcgct gctacacgca 600 gaacatagac acgctggaac gagtggcggg gctggagccc caggacctgg tggaggccca 660 cggcaccttc tacacatcac actgtgtcaa cacctcctgc agaaaagaat acacgatggg 720 ctggatgaaa gagaagatct tctcagaagc aactcccagg tgtgagcagt gtcagagtgt 780 ggtaaagcct gatatcgtgt ttttcggtga gaaccttcca tcgcgcttct tctcctgcat 840 gcagtcagac ttctccaagg tggacctcct catcatcatg ggcacctccc tgcaggtgca 900 gcccttcgcc tccctcatca gcaaggcacc actagccacc ccacggctgc tcattaacaa 960 ggaaaagaca ggccagacgg accccttcct gggcatgatg atgggcctgg gaggtggcat 1020 ggattttgac tccaagaagg cttacaggga cgtggcctgg ctgggtgact gtgatcaagg 1080 ctgcctggct ctcgctgacc tcctcggatg gaagaaggaa ctggaagacc ttgtccggag 1140 ggagcatgcc aacatagatg cccagtcagg gtcacaggcc cccaacccca gcactaccat 1200 ctcccctgga aagtccccac cgcctgccaa ggaggcggcc aggaccaaag agaaagagga 1260 acagcagtaa cagtaaccat gacctcccgc aggacagcgg agcccggcca gcactgggcc 1320 ctcttaacat gcagcttgtg tgagctcaaa gacccttcgt tctttaacca cgttcttgaa 1380 atcagggtcc ccaactcaat cccagaaaag cctaatatac ctaggggctg aggcctgtgc 1440 agtctgtagc tggggcctct aaccaccata gcctctaacc accatagcct ctaaccacca 1500 tagcctctaa ccacccaggc aagaagcagc cttccctaac ttctaattat tcccagacaa 1560 caggctaccc caaaacccct aacagtgcca gaataaggca tttctctatt gttttcaggg 1620 ggcctatggc taaatcaaat taacctaccc cgcatagggg ctggactcta caaatagaac 1680 ttcacccaag ggggtggggc cttgtgggat ctctgagcct gaaggcctgc caactctctg 1740 cctccaacaa agtgggtact aggctccctt tcctggggac ccacttgcca gctgttggtg 1800 gatgagcaag agaccttgct tattagaaac aaattaaaaa acaaaacaaa gcaactaacc 1860 atg 1863 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for P15ink-4b <400> 5 tcagagacca ggctgtagca atc 23 <210> 6 <211> 352 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for P15ink-4b <400> 6 MDFLRNLFSQ TLSLGSQKER LLDELTLEGV ARYMQSERCR RVICLVGAGI STSAGIPDFR 60 SPSTGLYDNL EKYHLPYPEA IFEISYFKKH PEPFFALAKE LYPGQFKPTI CHYFMRLLKD 120 KGLLLRCYTQ NIDTLERIAG LEQEDLVEAH GTFYTSHCVS ASCRHEYPLS WMKEKIFSEV 180 TPKCEDCQSL VKPDIVFFGE SLPARFFSCM QSDFLKVDLL LVMGTSLQVQ PFASLISKAP 240 LSTPRLLINK EKAGQSDPFL GMIMGLGGGM DFDSKKAYRD VAWLGECDQG CLALAELLGW 300 KKELEDLVRR EHASIDAQSG AGVPNPSTSA SPKKSPPPAK DEARTTEREK PQ 352 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for P16ink-4a <400> 7 cccaacgccc cgaact 16 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for P16ink-4a <400> 8 gtgaacgttg cccatcatca 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for P21 <400> 9 ttccgcacag gagcaaagt 19 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for P21 <400> 10 cggcgcaact gctcact 17 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Rb <400> 11 tctacctccc ttgccctgtt t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Rb <400> 12 cagaaggcgt gcacagagtg t 21 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for P19Arf <400> 13 gccgcaccgg aatcct 16 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for P19Arf <400> 14 ttgagcagaa gagctgctac gt 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for beta-actin <400> 15 gacggccagg tcatcactat tg 22 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for beta-actin <400> 16 aggaaggctg gaaaagagcc 20

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. Sirt 2 유전자 또는 단백질 발현 세포주와 약물 후보 물질을 접촉시키는 단계;
   상기 약물 후보 물질이 접촉된 세포주의 Sirt2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하고, 상기 약물 후보 물질이 접촉된 세포주의 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 및 p21 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
   Sirt 2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하고, p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 및 p21 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
   대조군에 비하여 Sirt 2 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 감소되고, p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 및 p21 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 증가된 경우, 상기 약물 후보 물질을 암 치료제의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 암 치료제를 선발하는 방법으로서,
   상기 세포주는 섬유아세포인 것인 방법.
7. 삭제
8. 청구항 6에 있어서, 상기 암 치료제는 세포주기 이탈 또는 세포 증식 억제능을 갖는 것인 암 치료제를 선발하는 방법.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 암 치료제는 p16/ink-4a, p15/ink-4b, Rb, p19/Arf 또는 p21 매개에 의한 세포주기 이탈 또는 세포 증식 억제능을 갖는 것인 암 치료제를 선발하는 방법.
10. 청구항 6에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting), 유세포 분석법(FACS) 또는 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 측정하는 것인 암 치료제를 선발하는 방법.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 청구항 6에 있어서, 상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 암 치료제를 선발하는 방법.

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