ES2283340T3 - Metodos referentes a la modulacion de la actividad del subconjunto de celulas th2 mediante modulacion de la actividad de xbp-1. - Google Patents

Metodos referentes a la modulacion de la actividad del subconjunto de celulas th2 mediante modulacion de la actividad de xbp-1. Download PDF

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Abstract

Método de identificación de un compuesto que modula la actividad de células Th2, que comprende: a) proporcionar una composición indicadora que comprende proteína XBP-1; b) poner en contacto la composición indicadora con cada miembro de una biblioteca de compuestos de prueba; c) seleccionar de la biblioteca de compuestos de prueba un compuesto de interés que modula la actividad de la proteína XBP-1; y

Description

Métodos referentes a la modulación de la actividad del subconjunto de células Th2 mediante modulación de la actividad de XBP-1.
Financiación gubernamental
El trabajo descrito en el presente documento se apoyó, al menos en parte, con las subvenciones AR43661 y A132412 concedidas por los Institutos Nacionales de la Salud. El gobierno de los EE.UU. puede por tanto tener ciertos derechos en esta invención.
Antecedentes de la invención
Los miembros de la familia CREB/ATF de factores de transcripción forman dímeros y se unen a elementos de respuesta de AMP cíclico encontrados en un gran número de promotores celulares. La diversidad de los genes regulados por este gran grupo de factores de transcripción se refleja en las funciones esenciales de factores individuales en la supervivencia del feto, desarrollo neurológico, crecimiento óseo y activación del sistema inmunitario (Rudolph et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4481-4486; Reimold et al. 1996, Nature, 379:262-265; Maekawa et al. 1999, J. Biol. Chem. 274:17813-17819). Recientemente, se demostró un importante papel en la coordinación del momento de la proliferación de hepatocitos en el hígado en regeneración para el miembro CREM de la familia CREB/ATF (Servillo et al. 1998, Genes Dev. 12:3639-3643). Además, se encontró que el factor de transcripción ATF-3 se inducía en el hígado en regeneración con la cinética de un gen de respuesta temprana (Chen et al. 1996, Mol. Cell. Biol. 16:1157-1168).
Las funciones de un miembro adicional de la familia CREB/ATF, XBP-1, no se han identificado en detalle. Este factor de transcripción se expresa de manera omnipresente en adultos pero se encuentra principalmente en las glándulas exocrinas y precursores óseos en el ratón embrionario (Liou et al. 1990, Science 247:1581-1584; Clauss et al. 1993, Dev. Dynamics 197:146-156). Estudios in vitro han demostrado la regulación por disminución del gen de XBP-1 por BSAP, la dimerización de la proteína XBP-1 con c-Fos, y una disminución en la expresión de genes de clase II del MHC cuando se introducen secuencias de XBP-1 antisentido en células Raji (Reimold et al. 1996,J. Exp. Med., 183:393-401; Ono et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4309-4312). Recientemente, se encontró que la expresión de XBP-1 aumenta drásticamente en carcinomas hepatocelulares (Kishimoto et al. 1998, Cell Crecimiento Diff. 9:337-344), aunque no se estableció si esta regulación por incremento desempeñaba un papel en el fenotipo cancerígeno o era simplemente un subproducto del mismo.
Sumario de la invención
Esta invención se refiere a métodos y composiciones referentes a la modulación de la actividad de células Th2 mediante modulación de la actividad de XBP-1. Ahora se ha descubierto que el factor de transcripción XBP-1 desempeña un papel crítico en la regulación del crecimiento de hepatocitos, la diferenciación de células plasmáticas y la actividad de subconjuntos de células T. La invención se basa, al menos en parte, en la observación de que los ratones que carecen de XBP-1 tienen un desarrollo de hepatocitos gravemente afectado, identificando XBP-1 como un factor de transcripción esencial para el crecimiento de hepatocitos y, además, que ratones que carecen de XBP-1 tienen una generación de células plasmáticas gravemente afectada y muestran defectos en la producción de citocinas Th2, identificando XBP-1 como un factor de transcripción esencial para la diferenciación de células plasmáticas e implicado en la regulación de subconjuntos de células T. Hasta nuestro conocimiento, esta es la primera demostración de un papel de XBP-1 en la regulación del crecimiento de hepatocitos, diferenciación de células plasmáticas y subconjuntos de células T.
La invención proporciona métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de células Th2. En la memoria descriptiva también se describen métodos para modular la actividad de células Th2 usando agentes que modulan la actividad de XBP-1 (por ejemplo, métodos para modular la producción de citocinas Th2 modulando la actividad de XBP-1) y métodos para diagnosticar trastornos asociados con actividad aberrante de células Th2 basándose en la evaluación de un cambio en la expresión de XBP-1 (por ejemplo, el nivel de expresión o la forma del XBP-1 expresado).
En un aspecto, la invención se refiere a métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de células Th2. En una realización, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que modula la actividad de células Th2 usando una composición indicadora que comprende proteína XBP-1, en la que se selecciona un compuesto de prueba que modula la actividad de XBP-1 y entonces se somete a ensayo el efecto de este compuesto seleccionado sobre la actividad de células Th2 (por ejemplo, producción de citocinas Th2). En el método, la composición indicadora que comprende XBP-1 se pone en contacto en primer lugar con cada miembro de una biblioteca de compuestos de prueba. Se selecciona(n) el/los compuesto(s) de prueba que modula(n) la actividad de proteína XBP-1 y se determina la capacidad del/de los compuesto(s) seleccionado(s) para modular la actividad de células Th2 (por ejemplo, producción de citocinas Th2). La composición indicadora puede ser, por ejemplo, una célula que expresa proteína XBP-1, una célula que se ha diseñado mediante ingeniería para que exprese la proteína XBP-1 introduciendo un vector de expresión que codifica para la proteína XBP-1 en la célula o una composición libre de células. Alternativamente, la composición indicadora puede ser una célula o composición libre de células que incluye una proteína XBP-1 y una molécula diana, y se monitoriza la capacidad del compuesto de prueba para modular la interacción de la proteína XBP-1 con una molécula diana. En otra realización, la composición indicadora es una célula indicadora, que comprende una proteína XBP-1 y un gen indicador sensible a la proteína XBP-1. El nivel de expresión del gen indicador puede usarse para determinar la capacidad de un compuesto de prueba para modular la actividad de proteína XBP-1 produciendo una célula indicadora que contiene un vector de expresión recombinante que codifica para la proteína XBP-1 y un vector que comprende un elemento regulador sensible a XBP-1 operativamente unido a un gen indicador. Se pone en contacto la célula indicadora con un compuesto de prueba y se determina el nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba. Comparando el nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba con el nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en ausencia del compuesto de prueba, puede determinarse un compuesto de interés que modula la actividad de proteína XBP-1.
También se describen animales no humanos (por ejemplo, ratones) y células con deficiencia de XBP-1 para su uso en los métodos de selección de la invención. Pueden obtenerse células con deficiencia de XBP-1, tales como hepatocitos, a partir de embriones tempranos o animales con deficiencia de XBP-1 (antes de la mortalidad intrauterina).
Además, puede usarse la complementación de blastocitos para crear animales con deficiencia tanto de XBP-1 como de un segundo gen (por ejemplo, RAG-2), para obtener animales viables en los que las células con deficiencia de XBP-1 contribuyen en ciertos compartimientos celulares, tales como el sistema linfoide, para obtener así células T y células B con deficiencia de XBP-1. Todavía adicionalmente, la invención proporciona animales que tienen una interrupción homocigótica en el gen de XBP-1 endógeno pero que llevan un transgén de XBP-1 accionado por un promotor específico del hígado (tal como el promotor de albúmina).
También se describen kits para realizar los diversos métodos de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama esquemático del constructo usado para alterar el gen de XBP-1 en ratones. Se delecionaron partes de los exones 1 y 2 de XBP-1 y se sustituyeron por el gen de la resistencia a neo, en la orientación opuesta desde XBP-1.
La figura 2 es un gráfico de barras que ilustra la producción de IL-4 por poblaciones de células T a partir o bien de ratones de tipo natural 129 de control (129w+; barras con puntos) o bien ratones con deficiencia de XBP-1/con deficiencia de RAG-2 (XBP-rag; barras sombreadas), en las que se cultivaron las células T en condiciones que favorecen o bien un fenotipo Th1 ("Th1") o bien un fenotipo Th2 ("Th2") o bien no favorecen ninguno ("Sin sesgo"). Se muestran resultados de dos conjuntos diferentes de animales.
La figura 3 es un gráfico de barras que ilustra la producción de interferón-gamma (IFN-g) por poblaciones de células T a partir o bien de ratones de tipo natural 129 de control (129w+; barras con puntos) o bien de ratones con deficiencia de XBP-1/con deficiencia de RAG-2 (XBP-rag; barras sombreadas), en las que se cultivaron las células T en condiciones que favorecen o bien un fenotipo Th1 ("Th1") o bien un fenotipo Th2 ("Th2") o bien no favorecen ninguno ("Sin sesgo"). Se muestran resultados de dos conjuntos diferentes de animales.
La figura 4 es un gráfico de barras que ilustra la producción de IL-10 por poblaciones de células T a partir o bien de ratones de tipo natural 129 de control (129w+; barras con puntos) o bien de ratones con deficiencia de XBP-1/con deficiencia de RAG-2 (XBP-rag; barras sombreadas), en las que se cultivaron las células T en condiciones que favorecen o bien un fenotipo Th1 ("Th1") o bien un fenotipo Th2 ("Th2") o bien no favorecen ninguno ("Sin sesgo"). Se muestran resultados de dos conjuntos diferentes de animales.
La figura 5 es un gráfico de barras que ilustra la producción de IL-5 por poblaciones de células T a partir o bien de ratones de tipo natural 129 de control (129w+; barras con puntos) o bien de ratones con deficiencia de XBP-1/con deficiencia de RAG-2 (XBP-rag; barras sombreadas), en las que se cultivaron las células T en condiciones que favorecen o bien un fenotipo Th1 ("Th1") o bien un fenotipo Th2 ("Th2") o bien no favorecen ninguno ("Sin sesgo").
La figura 6 es un gráfico de barras que ilustra la producción de IL-6 por poblaciones de células T a partir o bien de ratones de tipo natural 129 de control (129w+; barras con puntos) o bien de ratones con deficiencia de XBP-1/con deficiencia de RAG-2 (XBP-rag; barras sombreadas), en las que se cultivaron las células T en condiciones que favorecen o bien un fenotipo Th1 ("Th1") o bien un fenotipo Th2 ("Th2") o bien no favorecen ninguno ("Sin sesgo"). Se muestran resultados de dos conjuntos diferentes de animales.
Descripción detallada de la invención
Esta invención se refiere a métodos y composiciones referentes a la modulación de la actividad de células Th2 mediante la modulación de la actividad de XBP-1. La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que los ratones con deficiencia de la proteína XBP-1 muestran hígados fetales sorprendentemente hipoplásicos debido a un desarrollo de hepatocitos gravemente afectado. Este desarrollo afectado fue el resultado tanto de una tasa de crecimiento disminuida como de una apoptosis prominente. Los genes diana específicos de XBP-1 en el hígado se identificaron como miembros de la familia de proteínas de fase aguda, incluyendo \alpha-1-antitripsina y \alpha-fetoproteína (AFP). Por tanto, los datos descritos en el presente documento identifican XBP-1 como un factor de transcripción esencial para el crecimiento de hepatocitos. Ya que los ratones que con deficiencia de XBP-1 mueren dentro del útero debido a hígados hipoplásicos, se usó complementación de blastocitos con deficiencia de RAG-2 para examinar el papel de XBP-1 en el sistema linfoide. Se descubrió adicionalmente que los ratones quiméricos preparados usando este sistema de complementación segregan muy poca inmunoglobulina sérica de cualquier isotipo de manera secundario a no poder generar el compartimiento de células plasmáticas. En consecuencia, la invención también se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que XBP-1 es un factor de transcripción que ahora se ha demostrado que se requiere para la generación de células plasmáticas. Todavía adicionalmente, se descubrió que las células T de ratones con deficiencia de XBP-1 presentan un defecto en su capacidad para segregar citocinas del tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-5, IL-6). En consecuencia, la invención también se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que XBP-1 es un factor de transcripción que ahora se ha demostrado que está implicado en la regulación de la producción de citocinas Th2 y por tanto en la regulación de la actividad de subconjuntos de células T (es decir, actividad Th1 frente a Th2).
En un aspecto, la invención se refiere a un método de identificación de un compuesto que modula la actividad de células Th2. En una realización de estos ensayos de selección, se usa una composición indicadora que incluye XBP-1 para identificar y seleccionar compuestos que modulan la actividad de XBP-1 y entonces se evalúa el efecto de los compuestos seleccionados sobre la producción de citocinas Th2. En otros ensayos de selección, pueden ponerse en contacto células T con deficiencia de XBP-1 con un compuesto de prueba y se determina el efecto del compuesto sobre la actividad del subconjunto de células T para identificar compuestos que modulan la actividad del subconjunto de células T mediante el "rescate" del fenotipo con deficiencia de XBP-1.
Los métodos reivindicados de la invención pueden permitir un método para modular el crecimiento de la actividad de un subconjunto de células T, ya sea in vitro o in vivo, usando moduladores de la actividad de XBP-1. En un método de este tipo, pueden ponerse en contacto células T (por ejemplo, aisladas de un sujeto) con un compuesto modulador estimulante mediante cultivo de las células con el modulador in vitro, para estimular así la producción de citocinas Th2. Las células de tipo Th2 que se diferencian en cultivo, pueden volver a administrarse entonces al sujeto. Puede modularse la actividad del subconjunto de células T aberrante en un sujeto mediante administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador inhibidor de la actividad de XBP-1 de tal manera que se modula la actividad del subconjunto de células T en un sujeto.
Los métodos reivindicados de la invención pueden permitir un método de diagnóstico de un sujeto para un trastorno asociado con actividad del subconjunto de células T aberrante detectando un cambio en la expresión de XBP-1 en células T (o precursores de células T) de un sujeto que se sospecha que tiene un trastorno asociado con una diferenciación aberrante de células T cooperadoras.
Para que pueda entenderse más fácilmente la invención, en primer lugar se definen ciertos términos.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término "XBP-1" se refiera a una proteína humana que es una proteína de unión a ADN y tiene una secuencia de aminoácidos tal como se describe en, por ejemplo, Liou, H-C. et al. (1990) Science 247:1581-1584 y Yoshimura, T. et al. (1990) EMBO J. 9:2537-2542, y otros homólogos mamíferos de la misma, tal como se describe en Kishimoto T. et al., (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 223:746-751 (homólogo de rata). Las proteínas que se pretende que se abarquen por el término "XBP-1" incluyen aquellas que tienen secuencias de aminoácidos descritas en GenBank con números de registro A36299, 4827058, P17861, CAA39149 y BAA82600. XBP-1 también se denomina en la técnica como TREB5 o HTF.
Tal como se usan en el presente documento, se pretende que las diversas formas del término "modular" incluyan la estimulación (por ejemplo, aumento o regulación por incremento de una actividad o respuesta particular) e inhibición (por ejemplo, disminución o regulación por disminución de una actividad o respuesta particular).
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término "poner en contacto" (es decir, poner en contacto una célula por ejemplo, una célula, con un compuesto) incluya incubar el compuesto y la célula juntos in vitro (por ejemplo, añadir el compuesto a células en cultivo) y administrar el compuesto a un sujeto de tal manera que el compuesto y las células del sujeto entran en contacto in vivo. No se pretende que el término "poner en contacto" incluya la exposición de células a un modulador de XBP-1 que puede producirse de manera natural en un sujeto (es decir, exposición que puede producirse como resultado de un proceso fisiológico natural).
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término "compuesto de prueba" se refiera a un compuesto que no se ha identificado previamente como, o no se ha reconocido que sea, un modulador de la actividad de XBP-1 y/o del crecimiento de hepatocitos y/o de la diferenciación de células plasmáticas y/o de la actividad del subconjunto de células T.
Se pretende que el término "biblioteca de compuestos de prueba" se refiera a un panel que comprende una multiplicidad de compuestos de prueba.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término "células con deficiencia de XBP-1" incluya células de un sujeto que con deficiencia natural de XBP-1, así como células de un animal con deficiencia de XBP-1 no humano, por ejemplo, un ratón, que se ha alterado de tal manera que son con deficiencia de XBP-1. Se pretende que el término "células con deficiencia de XBP-1" también incluya células aisladas de un animal con deficiencia de XBP-1 no humano o un sujeto que se cultivan in vitro.
Tal como se usa en el presente documento, el término "animal con deficiencia de XBP-1 no humano" se refiere a un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en el que un gen endógeno se ha alterado mediante recombinación homóloga entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógena introducida en una célula del animal, por ejemplo, una célula embrionaria del animal, antes del desarrollo del animal, de tal manera que se altera el gen de XBP-1 endógeno, conduciendo así o bien a la no producción de XBP-1 o bien a la producción de una forma mutante de XBP-1 que tiene una actividad de XBP-1 deficiente. Preferiblemente, la actividad de XBP-1 se bloquea totalmente, aunque también se incluye la inhibición parcial de la actividad de XBP-1 en el animal. Se pretende que el término "animal con deficiencia de XBP-1 no humano" también incluya animales quiméricos (por ejemplo, ratones) producidos usando un sistema de complementación de blastocitos, tal como el sistema de complementación de blastocitos RAG-2, en el que surgen un órgano u órganos particular(es) (por ejemplo, los órganos linfoides) de células madre embrionarias (ES) con mutaciones homocigóticas del gen de XBP-1.
Tal como se usa en el presente documento, el término "composición indicadora" se refiere a una composición que incluye proteína XBP-1, por ejemplo, una célula que expresa proteína XBP-1 de manera natural, una célula que se ha diseñado mediante ingeniería para expresar la proteína XBP-1, introduciendo un vector de expresión que codifica para la proteína XBP-1 en la célula, o una composición libre de células que contiene XBP-1 (por ejemplo, XBP-1 que se produce de manera natural o XBP-1 diseñada mediante ingeniería de manera recombinante).
Tal como se usa en el presente documento, el término "diseñado mediante ingeniería" (tal como en célula diseñada mediante ingeniería) se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión que codifica para la proteína XBP-1.
Tal como se usa en el presente documento, el término "composición libre de células" se refiere a una composición aislada que no contiene células intactas. Ejemplos de composiciones libres de células incluyen extractos celulares y composiciones que contienen proteínas aisladas.
Tal como se usa en el presente documento, el término "una molécula diana" para XBP-1 se refiere a una molécula con la que puede interactuar XBP-1, incluyendo otras proteínas y secuencias de ADN, incluyendo por ejemplo, las regiones promotoras/potenciadoras de genes tal como \alpha-1-antitripsina, \alpha-fetoproteína, HLA DR\alpha, y el potenciador de repetición de 21 pares de bases de HTLV-1 LTR, y otras proteínas b-ZIP tales como c-Fos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "gen indicador sensible a XBP-1" se refiere a cualquier gen que expresa un producto génico detectable, que puede ser ARN o proteína. Genes indicadores preferidos son aquellos que pueden detectarse fácilmente. El gen indicador también puede incluirse en forma de un gen de fusión con un gen que incluye secuencias reguladoras de la transcripción deseadas o muestra otras propiedades deseables. Ejemplos de genes indicadores incluyen, pero no se limitan a, CAT (cloramfenicol acetil transferasa) (Alton y Vapnek (1979), Nature 282: 864-869) luciferasa, y otros sistemas de detección enzimáticos, tales como beta-galactosidasa; luciferasa de la luciérnaga (deWet et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7:725-737); luciferasa bacteriana (Engebrecht y Silverman (1984), PNAS 1:4154-4158; Baldwin et al. (1984), Biochemistry 23: 3663-3667); fosfatasa alcalina (Toh et al. (1989) Eur. J. Biochem. 182: 231-239, Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen 2: 101), fosfatasa alcalina segregada por placenta humana (Cullen y Malim (1992) Methods in Enzymol. 216:362-368) y proteína fluorescente verde (patente estadounidense 5.491.084; documento WO 96/23898).
Tal como se usa en el presente documento, el término "elemento sensible a XBP-1" se refiere a una secuencia de ADN que está directa o indirectamente regulada por la actividad de XBP-1 (mediante lo cual puede monitorizarse la actividad de XBP-1, por ejemplo, mediante transcripción de los genes indicadores).
Tal como se usa en el presente documento, el término "aberrante" (tal como en diferenciación de células plasmáticas o crecimiento de hepatocitos aberrante) se refiere al crecimiento o diferenciación que se desvía del crecimiento o diferenciación normales en un sujeto. El crecimiento o diferenciación aberrante puede o bien ser crecimiento o diferenciación excesiva o bien crecimiento o diferenciación reducidos con respecto al crecimiento o diferenciación normales en un sujeto.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término "un modulador de la actividad de XBP-1" se refiera a un agente, por ejemplo un compuesto o compuestos, que modula la transcripción de un gen de XBP-1, la traducción de ARNm de XBP-1 o la actividad de una proteína XBP-1. Un "modulador de la actividad de XBP-1" también incluye compuestos que modulan indirectamente la actividad de XBP-1, por ejemplo, moduladores de una ruta de transducción de señales que puede incluir XBP-1. Ejemplos de moduladores que modulan directamente la actividad de XBP-1 incluyen moléculas de ácido nucleico antisentido que se unen a ADN genómico o ARNm de XBP-1, anticuerpos intracelulares que se unen a XBP-1 de manera intracelular y modulan (es decir, inhiben) la actividad de XBP-1, péptidos de XBP-1 que inhiben la interacción de XBP-1 con una molécula diana (por ejemplo, c-Fos) y vectores de expresión que codifican para XBP-1 que permiten una expresión aumentada de la actividad de XBP-1 en una célula, así como compuestos químicos que actúan para modular específicamente la actividad de XBP-1.
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Tal como se usa en el presente documento, un "oligonucleótido antisentido" se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica para una proteína, por ejemplo, complementaria a la cadena codificante de una molécula de ADNc de doble cadena, complementaria a una secuencia de ARNm, o complementaria a la cadena codificante de un gen. En consecuencia, el ácido nucleico antisentido puede unirse mediante enlaces de hidrógeno a un ácido nucleico sentido.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término "anticuerpo intracelular" incluya moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno, tal como fragmentos Fab y F(ab')2. Se pretende que el término "anticuerpo intracelular" también se refiera a un anticuerpo que funciona en una región intracelular de una célula, por ejemplo, el citoplasma o el núcleo, para modular la expresión o actividad de la XBP-1.
Tal como se usa en el presente documento, el término "diagnosticar" se refiere a identificar un trastorno en un sujeto o la susceptibilidad de un sujeto al trastorno (por ejemplo, una predisposición para desarrollar un trastorno).
Tal como se usa en el presente documento, el término "actividad de subconjunto de células T" se refiere a la actividad de células T cooperadoras Th1 frente a Th2. La actividad del conjunto de células T puede modularse mediante regulación por incremento de la actividad de células Th2, regulación por disminución de la actividad de células Th2, regulación por incremento de la actividad de células Th1 o regulación por disminución de la actividad de células Th1.
Tal como se usa en el presente documento, el término "citocina Th2" se refiere a citocinas producidas predominantemente mediante células Th2 (en vez de células Th1) e incluyen (pero no se limitan a) IL-4, IL-10, IL-5 y IL-6.
Diversos aspectos de la presente invención se describen en más detalle en las siguientes subsecciones.
I. Ensayos de selección para identificar compuestos que modulan la actividad de células Th2 A. Ensayos usando composiciones indicadoras que contienen XBP-1
En una realización, la invención proporciona métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de células Th2 usando composiciones indicadoras que incluyen XBP-1. Tal como se describe en los ejemplos, se ha demostrado que XBP-1 es un regulador del crecimiento de hepatocitos, la diferenciación de células plasmáticas y la actividad del subconjunto de células T. En consecuencia, pueden identificarse compuestos que modulan específicamente la actividad de XBP-1, tal como se describe en el presente documento, y puede evaluarse el efecto de un compuesto de prueba seleccionado sobre la actividad de células Th2.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a ensayos de selección para identificar compuestos que modulan la actividad de células Th2 que comprenden,
proporcionar una composición indicadora que comprende proteína XBP-1;
poner en contacto la composición indicadora con cada miembro de una biblioteca de compuestos de prueba;
seleccionar de la biblioteca de compuestos de prueba un compuesto de interés que modula la actividad de proteína XBP-1;
determinar el efecto del compuesto de interés sobre la actividad de células Th2 (por ejemplo, producción de citocinas Th2) para así identificar un compuesto que modula la actividad de células Th2.
La composición indicadora puede ser una célula que expresa proteína XBP-1, por ejemplo, una célula que expresa XBP-1 de manera natural o, más preferiblemente, una célula que se ha diseñado mediante ingeniería para expresar la proteína XBP-1 introduciendo en la célula un vector de expresión que codifica para la proteína XBP-1. Alternativamente, la composición indicadora puede ser una composición libre de células que incluye XBP-1 (por ejemplo, un extracto celular de una célula que expresa XBP-1 o una composición que incluye proteína XBP-1 purificada, ya sea XBP-1 natural o XBP-1 recombinante). En una realización, la composición indicadora incluye una proteína XBP-1 y una molécula diana con la que interacciona XBP-1, y se monitoriza la capacidad del compuesto de prueba para modular la interacción de la proteína XBP-1 con una molécula diana para así identificar el compuesto de prueba como un modulador de la actividad de XBP-1.
En realizaciones preferidas, la composición indicadora comprende una célula indicadora, en la que la célula indicadora comprende una proteína XBP-1 y un gen indicador sensible a la proteína XBP-1. Preferiblemente, la célula indicadora contiene:
un vector de expresión recombinante que codifica para la proteína XBP-1; y
un vector que comprende un elemento regulador sensible a XBP-1 operativamente unido a un gen indicador; y
el método de selección comprende:
poner en contacto la célula indicadora con un compuesto de prueba;
determinar el nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba; y
comparar el nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba con el nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en ausencia del compuesto de prueba para así seleccionar un compuesto de interés que modula la actividad de proteína XBP-1.
Una vez que se identifica un compuesto de prueba como modulador de la actividad de XBP-1, entonces se somete a prueba el efecto del compuesto de prueba sobre la actividad de células Th2.
Los elementos sensibles a XBP-1 que pueden usarse en el constructo de gen indicador se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, regiones reguladoras en sentido 5' de genes tales como \alpha-1-antitripsina, \alpha-fetoproteína, HLA DR\alpha, así como el potenciador de repetición de 21 pares de bases del HTLV-1 LTR. Un ejemplo de un gen indicador sensible a XBP-1 es el constructo HLA DR\alpha-CAT descrito en Ono, S.J. et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:4309-4312.
Una célula que se ha diseñado mediante ingeniería para expresar la proteína XBP-1 puede producirse introduciendo en la célula un vector de expresión que codifica par la proteína XBP-1. Se conocen en la técnica vectores de expresión recombinantes que pueden usarse para la expresión de proteína XBP-1 en la célula indicadora. Normalmente, se introduce en primer lugar el ADNc de XBP-1 en un vector de expresión recombinante usando técnicas de biología molecular habituales. Puede obtenerse un ADNc de XBP-1, por ejemplo, mediante amplificación usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o examinando una biblioteca de ADNc apropiada. Las secuencias de nucleótidos de ADNc de XBP-1 (por ejemplo, humanas y de rata) se conocen en la técnica y pueden usarse para diseñar los cebadores de PCR que permiten la amplificación de un ADNc mediante métodos de PCR habituales o el diseño de una sonda de hibridación que puede usarse para examinar una biblioteca de ADNc usando métodos de hibridación habituales. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos previstos de ADNc de XBP-1 de mamíferos se describen en Liou, H-C. et al. (1990) Science 247:15 81-15 84, Yoshimura, T. et al. (1990) EMBO J. 9:2537-2542, y Kishimoto T. et al., (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 223:746-751.
Tras el aislamiento o amplificación de un ADNc de XBP-1, se introduce el fragmento de ADN en un vector de expresión. Tal como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores pueden replicarse de manera autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y así se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente unidos. Tales vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" o simplemente "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, pueden usarse "plásmido" y "vector" de manera intercambiable ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, se pretende que la invención incluya otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, virus adenoasociados, adenovirus y retrovirus defectuosos para la replicación), que sirven para funciones equivalentes.
Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células huésped que van a usarse para la expresión y el nivel de expresión deseado, que se une operativamente a la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse. Dentro de un vector de expresión recombinante, se pretende que "operativamente unido" se refiera a que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando se introduce el vector en la célula huésped). Se pretende que el término "secuencia reguladora" incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se definen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Emymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva se una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped, aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejidos) o aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en cierta condiciones (por ejemplo, secuencias reguladoras inducibles).
Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Cuando se usa en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión se proporcionan a menudo por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados se derivan de poliomavirus, adenovirus, citomegalovirus y virus del simio 40. Ejemplos no limitativos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195). Hay una variedad de vectores de expresión de mamíferos que llevan diferentes secuencias reguladoras comercialmente disponibles. Para la expresión constitutiva del ácido nucleico en una célula huésped de mamífero, un elemento regulador preferido es el promotor/potenciador de citomegalovirus. Además, en la técnica se conocen sistemas reguladores inducibles para su uso en células de mamíferos, por ejemplo, sistemas en los que la expresión génica se regula mediante iones de metales pesados (véase por ejemplo, Mayo et al. (1982) Célula 29:99-108; Brinster et al. (1982) Nature 296:39-42; Searle et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489), choque térmico (véase por ejemplo, Nouer et al. (1991) en Heat Shock Response, e. d. Nouer, L., CRC, Boca Raton, FL, págs. 167-220), hormonas (véase por ejemplo, Lee et al. (198 1) Nature 294:228-232; Hynes et al. (198 1) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042; Klock et al. (1987) Nature 329:734-736; Israel & Kaufman (1989) Nucl. Acids Res. 17:2589-2604; y la publicación PCT número WO 93/2343 1), moléculas relacionadas con FK506 (véase por ejemplo, la publicación PCT número WO94/18317) o tetraciclinas (Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:5547-555 1; Gossen, M. et al. (1995) Science 268:1766-1769; la publicación PCT número WO 94/29442; y la publicación PCT número WO 96/01313). Todavía adicionalmente, en la técnica se conocen muchas secuencias reguladoras específicas de tejidos, incluyendo el promotor de albúmina (específico del hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos de linfoides (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol.43:235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-73 3) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:5473-5477), promotores específicos del páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916) y promotores específicos de glándulas mamarias (por ejemplo, promotor de suero de la leche; patente estadounidense número 4.873.316 y publicación de solicitud europea número 264.166). También se incluyen promotores regulados en el desarrollo, por ejemplo los promotores hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249:3 74-3 79) y el promotor de \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).
El ADN de vector puede introducirse en células de mamíferos mediante técnicas de transfección convencionales. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que las diversas formas del término "transfectar" se refieran a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en células huésped de mamíferos, incluyendo coprecipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Pueden encontrarse métodos adecuados para transfectar células huésped en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros manuales de laboratorio.
Para la transfección estable de células de mamíferos, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y técnica de transfección usados, sólo una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica para un marcador seleccionable puede introducirse en una célula huésped en un vector separado del que codifica para XBP-1 o, más preferiblemente, en el mismo vector. Las células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección de fármacos (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).
En otras realizaciones, la composición indicadora es una composición libre de células. El XBP-1 expresado mediante métodos recombinantes en células huésped o medio de cultivo puede aislarse de las células huésped, o medio de cultivo celular, usando métodos habituales para la purificación de proteínas, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración de gel, ultrafiltración, electroforesis, y purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para XBP-1 para producir proteína XBP-1 que puede usarse en una composición libre de células. Alternativamente, puede prepararse un extracto de células que expresan XBP-1 para su uso como composición libre de células.
En una realización, se identifican compuestos que modulan específicamente la actividad de XBP-1 basándose en su capacidad para modular la interacción de XBP-1 con una molécula diana a la que se une XBP-1. La molécula diana puede ser una proteína, tal como c-Fos. Alternativamente, la diana puede ser una secuencia de ADN (es decir, un elemento sensible a XBP-1). En la técnica se conocen ensayos adecuados que permiten la detección de interacciones proteína-proteína (por ejemplo, inmunoprecipitaciones, ensayos de dos híbridos y similares) o que permiten la detección de interacciones entre una proteína de unión a ADN con una secuencia de ADN diana (por ejemplo, ensayos de desplazamiento de movilidad en electroforéticos, ensayos de huella de ADNasa I y similares). Realizando tales ensayos en presencia y ausencia de compuestos de prueba, estos ensayos pueden usarse para identificar compuestos que modulan (por ejemplo, inhiben o potencian) la interacción de XBP-1 con una molécula diana.
En una realización, la cantidad de unión de XBP-1 a la molécula diana en presencia de compuesto de prueba es superior a la cantidad de unión de XBP-1 a la molécula diana en ausencia del compuesto de prueba, en cuyo caso el compuesto de prueba se identifica como un compuesto que potencia la unión de XBP-1. En otra realización, la cantidad de unión de XBP-1 a la molécula diana en presencia del compuesto de prueba es inferior a la cantidad de unión de XBP-1 a la molécula diana en ausencia del compuesto de prueba, en cuyo caso el compuesto de prueba se identifica como un compuesto que inhibe la unión de XBP-1.
En los métodos de la invención para identificar compuestos de prueba que modulan una interacción entre la proteína XBP-1 y una molécula diana, puede usarse la proteína XBP-1 completa en el método, o, alternativamente, pueden usarse sólo partes de la proteína XBP-1. Por ejemplo, puede usarse una estructura b-ZIP de XBP-1 aislada (o una subregión mayor de XBP-1 que incluye la estructura b-ZIP). El grado de interacción entre proteínas XBP-1 y la molécula diana puede determinarse, por ejemplo, marcando una de las proteínas con una sustancia detectable (por ejemplo, un radiomarcador), aislando la proteína no marcada y cuantificando la cantidad de sustancia detectable que se ha asociado con la proteína no marcada. El ensayo puede usarse para identificar compuestos de prueba que o bien estimulan o bien inhiben la interacción entre la proteína XBP-1 y una molécula diana. Un compuesto de prueba que estimula la interacción entre la proteína XBP-1 y una molécula diana se identifica basándose en su capacidad para aumentar el grado de interacción entre la proteína XBP-1 y una molécula diana comparado con el grado de interacción en ausencia del compuesto de prueba, mientras que un compuesto de prueba que inhibe la interacción entre la proteína XBP-1 y una molécula diana se identifica basándose en su capacidad para disminuir el grado de interacción entre la proteína XBP-1 y una molécula diana comparado con el grado de interacción en ausencia del compuesto.
En la técnica se conocen vectores de expresión recombinantes que pueden usarse para la expresión de XBP-1 en la célula indicadora (véanse las discusiones anteriores). En una realización, dentro del vector de expresión las secuencias que codifican para XBP-1 están operativamente unidas a secuencias reguladoras que permiten la expresión constitutiva de XBP-1 en la célula indicadora (por ejemplo, pueden usarse secuencias reguladoras virales, tales como un promotor/potenciador de citomegalovirus). Se prefiere el uso de un vector de expresión recombinante que permite la expresión constitutiva de XBP-1 en la célula indicadora para la identificación de compuestos que potencian o inhiben la actividad de XBP-1. En una realización alternativa, dentro del vector de expresión las secuencias que codifican para XBP-1 están operativamente unidas a secuencias reguladoras del gen de XBP-1 endógeno (es decir, la región reguladora de promotor derivada del gen endógeno). Se prefiere el uso de un vector de expresión recombinante en el que la expresión de XBP-1 está controlada por las secuencias reguladoras endógenas para la identificación de compuestos que potencian o inhiben la expresión transcripcional de XBP-1.
En la técnica se conoce una variedad de genes indicadores y son adecuados para su uso en los ensayos de selección de la invención. Ejemplos de genes indicadores adecuados incluyen aquellos que codifican para cloramfenicol acetil transferasa, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina o luciferasa. En la técnica se conocen métodos habituales para medir la actividad de estos productos génicos.
Una variedad de tipos celulares son adecuados para su uso como célula indicadora en el ensayo de selección. Preferiblemente, se usa una línea celular que expresa niveles bajos de XBP-1 endógeno, que entonces se diseña mediante ingeniería para expresar XBP-1 recombinante.
En una realización, el nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba es superior al nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en ausencia del compuesto de prueba y se identifica el compuesto de prueba como un compuesto que estimula la expresión o actividad de XBP-1. En otra realización, el nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba es inferior al nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en ausencia del compuesto d prueba y se identifica el compuesto de prueba como un compuesto que inhibe la expresión o actividad de XBP-1.
Alternativamente al uso de un constructo de gen indicador, pueden identificarse compuestos que modulan la expresión o actividad de XBP-1 usando otras "lecturas". Por ejemplo, puede transfectarse una célula indicadora con un vector de expresión de XBP-1, incubarse en presencia y ausencia de un compuesto de prueba, y puede usarse la proliferación y/o diferenciación de las células como un indicador de la modulación de XBP-1. Puede monitorizarse la proliferación/diferenciación celular directamente (por ejemplo, recuentos celulares o captación de timidina radiomarcada, para la monitorización de la proliferación celular, o examen microscópico de las células para la monitorización de la diferenciación celular), o indirectamente monitorizando uno o más marcadores de proliferación o diferenciación celular (por ejemplo, un aumento de ARNm para un producto génico asociado con la proliferación o diferenciación celular, o la secreción de un producto génico asociado con la proliferación o diferenciación celular, tal como la secreción de inmunoglobulina por células plasmáticas diferenciadas o la secreción de citocinas Th2 por células Th2 diferenciadas). En la técnica se conocen métodos habituales para detectar ARNm de interés, tales como reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) e inmunotransferencia tipo Northern. En la técnica también se conocen métodos habituales para detectar la secreción de proteínas en sobrenadantes de cultivo, tales como ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzima (ELISA).
Una vez que se identifica un compuesto de prueba que modula la actividad de XBP-1, mediante uno de la variedad de métodos descritos anteriormente en el presente documento, el compuesto de prueba seleccionado (o "compuesto de interés") puede evaluarse adicionalmente para determinar su efecto sobre el crecimiento de hepatocitos o diferenciación de células plasmáticas o actividad del subconjunto de células T, por ejemplo poniendo en contacto el compuesto de interés con hepatocitos o células B o células T ya sea in vivo (por ejemplo, administrando el compuesto de interés a un sujeto)o ex vivo (por ejemplo, aislando hepatocitos o células B o células T y poniendo en contacto las células aisladas con el compuesto de interés o, alternativamente, poniendo en contacto el compuesto de interés con una línea de hepatocitos o células B o células T) y determinando el efecto del compuesto de interés sobre el crecimiento de los hepatocitos o diferenciación de las células B o actividad del subconjunto de células T, comparado con un control apropiado (tal como células que no se han tratado o células tratadas con un compuesto control, o vehículo, que no modula el crecimiento de hepatocitos o diferenciación de células plasmáticas o actividad del subconjunto de células T). El efecto del compuesto de prueba sobre el crecimiento de los hepatocitos o diferenciación de células plasmáticas o actividad del subconjunto de células T puede determinarse directamente, monitorizando la proliferación y/o diferenciación celular (tal como se describió anteriormente) o indirectamente, monitorizando uno o más marcadores de la proliferación y/o diferenciación celular, tales como ARNm o secreción de proteínas (tal como se describió anteriormente) o monitorizando la producción de citocinas Th2 por células T.
B. Ensayos usando células con deficiencia de XBP-1
En el presente documento se describen métodos para la identificación de compuestos que modulan la actividad del subconjunto de células T usando células que tienen deficiencia de XBP-1. Tal como se describe en los ejemplos, la inhibición de la actividad de XBP-1 (por ejemplo, mediante alteración del gen de XBP-1) conduce a hepatocitos embrionarios con una tasa de crecimiento disminuida y apoptosis prominente, lo que conduce a mortalidad embrionaria comenzando en E12.5. Por tanto, los hepatocitos embrionarios de ratón tempranos (por ejemplo, antes de E12.5) (o precursores de hepatocitos) con deficiencia de XBP-1 pueden usarse para identificar agentes que modulan el crecimiento de hepatocitos por medios distintos de la modulación de la propia XBP-1 (es decir, compuestos que "rescatan" el fenotipo con deficiencia de XBP-1). Alternativamente, un sistema "deficiente condicional", en el que el gen de XBP-1 se vuelve no funcional de una manera condicional, puede usarse para crear hepatocitos con deficiencia de XBP-1 (o precursores de hepatocitos) para su uso en ensayos de selección. Por ejemplo, puede usarse un sistema regulado por tetraciclina para la alteración condicional de un gen tal como se describe en el documento WO94/29442 y la patente estadounidense número 5.650.298 para crear hepatocitos (o precursores de hepatocitos), o animales con deficiencia de XBP-1 de los que pueden aislarse hepatocitos (o precursores de hepatocitos), que pueden volverse con deficiencia de XBP-1 de una manera controlada mediante la modulación de la concentración de tetraciclina en contacto con las células. Para ensayos relacionados con la diferenciación de células plasmáticas o actividad del subconjunto de células T, puede usarse un enfoque de alteración condicional similar o, alternativamente, puede usarse el sistema de complementación de blastocitos con deficiencia de RAG-2 para generar ratones con órganos linfoides que surgen de células madre embrionarias con mutaciones homocigóticas del gen de XBP-1 (véase el ejemplo 2). Las células linfoides con deficiencia de XBP-1 (por ejemplo, células del timo, del bazo y/o de ganglios linfáticos) o células T o células B con deficiencia de XBP-1 purificada de tales animales pueden usarse en ensayos de selección.
En el método de selección descrito anteriormente, se ponen en contacto células con deficiencia de XBP-1 con un compuesto de prueba y se monitoriza el crecimiento y/o diferenciación y/o actividad de las células. La modulación de la actividad de células Th1 frente a Th2, por ejemplo, producción de citocinas Th2 (comparado con un control apropiado, tal como, por ejemplo, células no tratadas o células tratadas con un agente de control) identifica un compuesto de prueba como modulador de la actividad del subconjunto de células T. El compuesto de prueba puede administrarse directamente a un animal con deficiencia de XBP-1 no humano, preferiblemente un ratón (por ejemplo, un ratón en el que el gen de XBP-1 está condicionalmente alterado por medios descritos anteriormente, o un ratón quimérico en el que los órganos linfoides tienen deficiencia de XBP-1 tal como se describió anteriormente), para identificar un compuesto de prueba que modula la actividad del subconjunto de células T in vivo de células T con deficiencia de XBP-1. Las células con deficiencia de XBP-1 pueden aislare del animal con deficiencia de XBP-1 no humano, y ponerse en contacto con el compuesto de prueba ex vivo para identificar un compuesto de prueba que modula la actividad de células T aisladas (por ejemplo, la producción de citocinas Th2).
Pueden obtenerse células con deficiencia de XBP-1 a partir de animales no humanos creados para que tengan deficiencia de XBP-1. Animales no humanos preferidos incluyen monos, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, cabras y ovejas. Se prefiere aún más que el animal con deficiencia de XBP-1 sea un ratón. Los ratones con deficiencia de XBP-1 pueden prepararse tal como se describe en el ejemplo 1. Los animales no humanos con deficiencia de un producto génico particular se crean normalmente mediante recombinación homóloga. En resumen, se prepara un vector que contiene al menos una parte del gen de XBP-1 en el que se ha introducido una deleción, adición o sustitución para así alterar, por ejemplo, alterar funcionalmente, el gen de XBP-1 endógeno. El gen de XBP-1 es preferiblemente un gen de XBP-1 de ratón. Por ejemplo, puede aislarse un gen de XBP-1 de ratón a partir de una biblioteca de ADN genómico de ratón usando el ADNc de XBP-1 de ratón como sonda. Entonces puede usarse el gen de XBP-1 de ratón para construir un vector de recombinación homóloga adecuado para alterar un gen de XBP-1 endógeno en el genoma del ratón. El vector puede diseñarse de manera que, mediante recombinación homóloga, el gen de XBP-1 endógeno se altera funcionalmente (es decir, ya no codifica para una proteína funcional; también denominado vector "deficiente"). Alternativamente, el vector puede diseñarse de manera que, mediante recombinación homóloga, el gen de XBP-1 endógeno se muta o altera de otro modo pero todavía codifica para proteína funcional (por ejemplo, puede alterarse la región reguladora en sentido 5' para así alterar la expresión de la proteína XBP-1 endógena). En el vector de recombinación homóloga, la parte alterada del gen de XBP-1 está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por ácido nucleico adicional del gen de XBBP-1 para permitir que se produzca la recombinación homóloga entre el gen de XBP-1 exógeno llevado por el vector y el gen de XBP-1 endógeno en una célula madre embrionaria. El ácido nucleico de XBP-1 de flanqueo adicional tiene longitud suficiente para la recombinación homóloga satisfactoria con el gen endógeno. Normalmente, se incluyen varias kilobases de ADN flanqueante (tanto en el extremo 5' como 3') en el vector (véase, por ejemplo, Thomas, K. R. y Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503 para una descripción de vectores de recombinación homóloga). El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan células en las que el gen de XBP-1 introducido se ha recombinado de manera homóloga con el gen de XBP-1 endógeno (véase por ejemplo, Li, E. et al. (1992) Cell 69:915). Entonces se inyectan las células seleccionadas en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón) para formar quimeras de agregación (véase por ejemplo, Bradley, A. en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) págs. 113-152). Entonces puede implantarse un embrión quimérico en un animal hembra de acogida pseudopreñada adecuado y se lleva el embrión a término. Pueden usarse las crías que albergan el ADN recombinado de manera homóloga en sus células germinales para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado de manera homóloga mediante transmisión de línea germinal del transgén. Métodos para la construcción de vectores de recombinación homóloga y animales recombinantes homólogos se describen adicionalmente en Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829 y en las publicaciones internacionales PCT números: WO90/11354 de Le Mouellec et al.; WO 91/01140 de Smithies et al; WO 92/0968 de Zijlstra et al.; y WO 93/04169 de Berns et al.
El método de la invención puede permitir compuestos sometidos a prueba para determinar su capacidad para modular el crecimiento de hepatocitos o diferenciación de células plasmáticas o actividad de subconjunto de células T en los que las especies mencionadas anteriormente se ponen en contacto con células con deficiencia de XBP-1 administrando el compuesto de prueba a un animal con deficiencia de XBP-1 no humano in vivo y evaluando el efecto del compuesto de prueba sobra crecimiento de hepatocitos o diferenciación de células plasmáticas o actividad del subconjunto de células T en el animal. El compuesto de prueba puede administrarse a un animal con deficiencia de XBP-1 no humano como una composición farmacéutica. Tales composiciones normalmente comprenden el compuesto de prueba y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluya todos y cada un disolvente, medio de dispersión, recubrimiento, compuesto antibacteriano y antifúngico, compuesto de retraso de la absorción e isotónico, y similares, compatible con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y compuestos para principios farmacéuticamente activos se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o compuesto convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones. También pueden incorporarse principios activos complementarios en las composiciones.
Una composición farmacéutica puede formularse para ser compatible con la vía de administración prevista. Por ejemplo, las disoluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; compuestos antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; compuestos quelatantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y compuestos para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Puede ajustarse el pH con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringuillas desechables o viales de múltiples dosis fabricados en vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o disoluciones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de que exista jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos compuestos antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir compuestos isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composición un compuesto que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden prepararse disoluciones inyectables estériles incorporando el principio activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con un o una combinación de los componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el principio activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización, que da un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional a partir de una disolución previamente filtrada estéril del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el fin de la administración terapéutica oral, el principio activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse usando un vehículo fluido para su uso como enjuague bucal, en el que el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral y se enjuaga y se expectora o se traga. Pueden incluirse compuestos de unión farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, pastillas, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes componentes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un compuesto disgregante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un compuesto aromatizante tal como menta, salicilato de metilo, o aromatizante de naranja.
Los compuestos de prueba pueden prepararse con vehículos que protegerán el compuesto frente a la rápida eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Los métodos para la preparación de tales formulaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden usarse suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales frente a antígenos virales) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos pueden prepararse según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense número 4.522.811.
Los compuestos que modulan la actividad del subconjunto de células T pueden identificarse poniendo en contacto células con deficiencia de XBP-1 ex vivo con uno o más compuestos de prueba, y determinando el efecto del compuesto de prueba sobre la actividad del subconjunto de células T. Las células con deficiencia de XBP-1 puestas en contacto con un compuesto de prueba ex vivo pueden volver a administrarse a un sujeto.
Para poner en práctica el método de selección ex vivo, pueden aislarse células con deficiencia de XBP-1 a partir de un embrión o animal con deficiencia de XBP-1 no humano mediante métodos habituales e incubarse (es decir, cultivarse) in vitro con un compuesto de prueba. Pueden aislarse células linfoides (por ejemplo, células T) a partir de animales con deficiencia de XBP-1 mediante técnicas habituales.
Tras el contacto de las células con deficiencia de XBP-1 con un compuesto de prueba (ya sea ex vivo o in vivo), puede determinarse el efecto del compuesto de prueba sobre la actividad de subconjuntos de células T mediante uno cualquiera de una variedad de métodos apropiados, incluyendo el análisis por microscopía óptica de las células, análisis histoquímico de las células, análisis de la capacidad proliferativa de las células o análisis de la producción de citocinas Th2. Por ejemplo, para monitorizar la actividad del subconjunto de células T, puede monitorizarse, por ejemplo, la producción de citocinas Th2 frente a Th2 mediante ELISA (véase el ejemplo 4). Un compuesto de prueba se identifica como un modulador de la actividad del subconjunto de células T basándose en su capacidad para modular la actividad de subconjuntos de células T comparado con un control apropiado (tal como células no tratadas o células tratadas con un compuesto de control, o vehículo, que no modula la actividad del subconjunto de células T).
Puede evaluarse una variedad de compuestos de prueba usando los ensayos de selección descritos en las subsecciones A y B anteriores. Los compuestos que van a someterse a prueba pueden derivarse de bibliotecas (es decir, son miembros de una biblioteca de compuestos). Aunque el uso de bibliotecas de péptidos está bien establecido en la técnica, se han desarrollado nuevas técnicas que han permitido la producción de mezclas de otros compuestos, tales como benzodiazepinas (Bunin et al. (1992). J Am. Chem. Soc. 114:10987; DeWitt et al. (1993). Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6909) peptoides (Zuckennann. (1994).J Med Chem. 37:2678) oligocarbamatos (Cho et al. (1993). Science. 261:1303-), e hidantoínas (DeWitt et al. citado anteriormente). Se ha descrito un enfoque para la síntesis de bibliotecas moleculares de moléculas orgánicas pequeñas con una diversidad de 104-105 (Carell et al. (1994). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 33:2059-Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed Engl.33:2061-).
Los compuestos pueden obtenerse usando cualquiera de varios enfoques en métodos de biblioteca combinatorios conocidos en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase en disolución o de fase sólida paralelas espacialmente direccionables, métodos de bibliotecas sintéticas que requieren la desconvolución, el método de biblioteca de "una perla, un compuesto", y métodos de bibliotecas sintéticas que usan selección mediante cromatografía de afinidad. El enfoque de biblioteca biológica se limita a las bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques pueden aplicarse a bibliotecas de péptidos, oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas de compuestos (Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145). Otros métodos a modo de ejemplo para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo, en: Erb et al. (1994). Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:11422-; Horwell et al. (1996) Immunopharmacology 33:68-; y en Gallop et al. (1994); J Med Chem. 37:1233-.
Las bibliotecas de compuestos pueden estar presentes en disolución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-42 1), o en perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner documento USP 5.223.409), esporas (Ladner documento USP '409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) o sobre fagos (Scott y Smith (1990) Science 249:3 86-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad Sci.87:6378-6382); (Felici (1991) J Mol. Biol. 222:301-310). Todavía en otra realización, los polipéptidos combinatorios se producen a partir de una biblioteca de ADNc.
Compuestos a modo de ejemplo que pueden examinarse para determinar su actividad incluyen, pero no se limitan a, péptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, moléculas orgánicas pequeñas, y bibliotecas de extractos de productos naturales.
II. Métodos para modular la actividad del subconjunto de células T
Los métodos reivindicados de la invención pueden permitir un método para modular el la actividad de subconjuntos de células T poniendo en contacto células T (o precursores de células T) con un modulador de la actividad de XBP-1 de tal manera que se modula la actividad de subconjuntos de células T. Los métodos moduladores son de interés particular para su uso en poblaciones en expansión de subconjuntos de células T in vitro para la administración a un sujeto con subconjuntos de células T insuficientes.
Los métodos reivindicados de la invención también pueden permitir un método que permite la modulación de la actividad del subconjunto de células T aberrante en un sujeto in vivo, administrando a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de la actividad de XBP-1 de tal manera que se modula la actividad del subconjunto de células T aberrante en un sujeto. Se pretende que el término "sujeto" incluya organismos vivos pero los sujetos preferidos son mamíferos. Ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, monos, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, cabras y ovejas. Por tanto, la modulación de la actividad de XBP-1 proporciona un medio para regular la actividad del subconjunto de células T aberrante en diversos estados patológicos. Para la estimulación de la actividad de células Th2, el modulador estimula la actividad de XBP-1. Para inhibir la actividad de células Th2 el modulador inhibe la actividad de XBP-1.
La identificación de compuestos que modulan la actividad del subconjunto de células T modulando la actividad de XBP-1 permite la manipulación selectiva de células T cooperadoras en una variedad de situaciones clínicas usando los métodos moduladores descritos en el presente documento. Los métodos estimulantes (es decir, métodos que utilizan un agente estimulante) dan como resultado el aumento de actividad de XBP-1, que estimula la actividad de células Th2. En cambio, los métodos inhibidores (es decir, métodos que utilizan un agente inhibidor) inhiben la actividad de XBP-1 e inhiben la actividad de células Th2, tal como se demuestra en los ejemplos.
Por tanto, para tratar un trastorno en el que la inhibición de la actividad de células Th2 es beneficiosa, puede seleccionarse un método inhibidor de tal manera que se inhibe la actividad de XBP-1. Ejemplos de trastornos en los que estos métodos inhibidores pueden ser útiles incluyen carcinoma hepatocelular, mieloma múltiple, enfermedades autoinmunitarias caracterizadas por la producción de autoanticuerpos patogénicos, y trastornos que implican actividad de células Th2 no deseada (tratado adicionalmente a continuación). Alternativamente, para tratar un trastorno en el que la estimulación de la actividad de células Th2 es beneficiosa, puede seleccionarse un método estimulante de tal manera que se regula por incremento la actividad de XBP-1. Ejemplos de situaciones en las que estos métodos estimulantes pueden ser útiles incluyen lesión hepática, insuficiencia hepática debida a enfermedad hepática (por ejemplo, infección viral, tal como hepatitis), insuficiencia hepática debida a toxinas hepáticas (tales como cirrosis), trastornos de inmunodeficiencia caracterizados por producción insuficiente de anticuerpos, trastornos que implican actividad de células Th1 no deseada (tratado adicionalmente a continuación), así como el uso para mejorar las respuestas humorales frente a patógenos en un sujeto y para mejorar la eficacia de la vacunación en un sujeto. La aplicación de métodos moduladores al tratamiento de un trastorno puede dar como resultado la cura del trastorno, una disminución del tipo o número de síntomas asociados con el trastorno, ya sea a largo plazo o a corto plazo (es decir, mejora del estado) o simplemente un efecto beneficioso transitorio en el sujeto.
La aplicación de los métodos inmunomoduladores se describe en más detalle a continuación.
A. Compuestos inhibidores
Ya que la inhibición de la actividad de XBP-1 está asociada con la inhibición de la actividad de células Th2, para inhibir la actividad de células Th2, se ponen en contacto células con un agente que inhibe la actividad de XBP-1. Las células pueden ponerse en contacto con el agente in vitro y entonces pueden administrarse las células a un sujeto o, alternativamente, puede administrarse el agente al sujeto. Pueden usarse compuestos inhibidores de XBP-1 en el tratamiento de trastornos en los que se potencia, estimula, regula por incremento o similar la actividad de células Th2. Los trastornos para su tratamiento usando un compuesto inhibidor incluyen trastornos que implican actividad de células Th2 no deseada (tratado adicionalmente a continuación).
Los compuestos inhibidores pueden ser, por ejemplo, moléculas de unión intracelular que actúan para inhibir específicamente la expresión o actividad de XBP-1. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término "molécula de unión intracelular" incluya moléculas que actúan de manera intracelular para inhibir la expresión o actividad de una proteína uniéndose a la proteína o a un ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNm) que codifica para la proteína. Ejemplos de moléculas de unión intracelular, descritas en más detalle a continuación, incluyen ácidos nucleicos antisentido, anticuerpos intracelulares, compuestos peptídicos que inhiben la interacción de XBP-1 con una molécula diana y agentes químicos que inhiben específicamente la actividad de XBP-1.
i. Moléculas de ácido nucleico antisentido
Un compuesto inhibidor puede ser una molécula de ácido nucleico antisentido que es complementaria a un gen que codifica para XBP-1, o a una parte de dicho gen, o un vector de expresión recombinante que codifica para dicha molécula de ácido nucleico antisentido. El uso de ácidos nucleicos antisentido para regular por disminución la expresión de una proteína particular en una célula se conoce bien en la técnica (véase por ejemplo, Weintraub, H. et al., Antisense ARN as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986; Askari, F. K. y McDonnell, W. M. (1996) N. Eng. J Med. 334:316-318; Bennett, M. R. y Schwartz, S. M. (1995) Circulation 92:1981-1993; Mercola, D. y Cohen, J. S. (1995) Cancer Gene Ther. 2:47-59; Rossi, J. J. (1995) Br. Med Bull. 51:217-225; Wagner, R. W. (1994) Nature 372:333-335). Una molécula de ácido nucleico antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la cadena codificante de otra molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia de ARNm) y en consecuencia puede unirse mediante enlace de hidrógeno a la cadena codificante de la otra molécula de ácido nucleico. Las secuencias antisentido complementarias a una secuencia de un ARNm pueden ser complementarias a una secuencia encontrada en la región codificante del ARNm, la región no traducida en 5' o 3' del ARNm o una región que hace de puente entre la región codificante y una región no traducida (por ejemplo, en la unión de la región no traducida en 5' y la región codificante). Además, un ácido nucleico antisentido puede tener una secuencia complementaria a una región reguladora del gen que codifica para el ARNm, por ejemplo una secuencia de inicio de la transcripción o un elemento regulador. Preferiblemente, un ácido nucleico antisentido se diseña de manera que sea complementario a una región que precede o abarca el codón de inicio en la cadena codificante o en la región no traducida en 3' de un ARNm.
Teniendo en cuenta la secuencia de nucleótidos conocida para la cadena codificante del gen de XBP-1 (y por tanto la secuencia conocida del ARNm de XBP-1), pueden diseñarse ácidos nucleicos antisentido de la invención según las reglas del apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a toda la región codificante de un ARNm de XBP-1, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido sólo con respecto a una parte de la región codificante o no codificante de un ARNm de XBP-1. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción de un ARNm de XBP-1. Un oligonucleótido antisentido puede tener una longitud de, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos. Un ácido nucleico antisentido de la invención puede construirse usando reacciones de síntesis química y de ligación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos que se producen de manera natural o nucleótidos diversamente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Para inhibir la expresión de XBP-1 en células en cultivo, pueden añadirse uno o más oligonucleótidos antisentido a células en el medio de cultivo.
Alternativamente, puede producirse biológicamente un ácido nucleico antisentido usando un vector de expresión en el que se ha subclonado todo o parte del ADNc de XBP-1 en una orientación antisentido (es decir, el ácido nucleico transcripto a partir del ácido nucleico insertado será de orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés). Pueden seleccionarse secuencias reguladoras operativamente unidas a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirigen la expresión de una molécula de ARN antisentido en una célula de interés, por ejemplo, pueden seleccionarse promotores y/o potenciadores u otras secuencias reguladoras que dirigen la expresión constitutiva, específica de tejidos o inducible de ARN antisentido. El vector de expresión antisentido se prepara según métodos de ADN recombinante habituales para construir vectores de expresión recombinante excepto porque el ADNc de XBP-1 (o parte del mismo) se clona dentro del vector en la orientación antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de, por ejemplo, un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado. El vector de expresión antisentido se introduce en células usando una técnica de transfección habitual.
Las molécula de ácido nucleico antisentido normalmente se administran a un sujeto o se generan in situ de tal manera que se hibridan con, o se unen a, ARNm celular y/o ADN genómico que codifica para una proteína XBP-1 para así inhibir la expresión de la proteína, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción. La hibridación puede realizarse mediante complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a dúplex de ADN, mediante interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice. Un ejemplo de una vía de administración de una molécula de ácido nucleico antisentido incluye la inyección directa en un sitio tisular. Alternativamente, puede modificarse una molécula de ácido nucleico antisentido para seleccionar como diana células seleccionadas y entonces administrarse sistémicamente. Por ejemplo, para la administración sistémica, una molécula antisentido puede modificarse de tal manera que se une específicamente a un receptor o un antígeno expresado sobre una superficie de célula seleccionada, por ejemplo, uniendo la molécula de ácido nucleico antisentido a un péptido o un anticuerpo que se une a un antígeno o receptor de superficie celular. La molécula de ácido nucleico antisentido también puede administrarse a células usando los vectores descritos en el presente documento. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren constructos de vectores en los que la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte pol II o pol III.
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La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos de cadena doble específicos con ARN complementario en los que, al contrario que las unidades P habituales, las cadenas discurren en paralelo entre sí (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue et al. (1987)Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).
Un ácido nucleico antisentido puede ser una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad ribonucleasa que pueden escindir un ácido nucleico de cadena sencilla, tal como un ARNm, con respecto al cual tienen una región complementaria. Por tanto, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) pueden usarse para escindir catalíticamente transcriptos de ARNm de XBP-1 para así inhibir la traducción de ARNm de XBP-1. Puede diseñarse una ribozima que tiene una especificidad por un ácido nucleico que codifica para XBP-1 basándose en la secuencia de nucleótidos del ADNc de XBP-1. Por ejemplo, puede construirse un derivado de ARN de L-19IVS de Tetrahymena en el que la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que debe escindirse en un ARNm que codifica para XBP-1. Véase, por ejemplo, Cech et al. patente estadounidense número 4.987.071 y Cech et al. patente estadounidense número 5.116.742. Alternativamente, puede usarse ARNm de XBP-1 para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad ribonucleasa específica de una combinación de moléculas de ARN. Véase, por ejemplo, Bartel, D. y Szostak, J. W. (1993) Science 261:1411-1418.
Alternativamente, puede inhibirse la expresión de un gen de XBP-1 seleccionando como diana secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de un gen de XBP-1 (por ejemplo, un promotor y/o potenciador de XBP-1) para formar estructuras de triple hélice que evitan la transcripción de un gen de XBP-1 en células diana. Véase de manera general, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L. J. (1992) Bioassays 14(12):807-15.
ii. Anticuerpos intracelulares
Otro tipo de compuesto inhibidor que puede usarse para inhibir la expresión y/o actividad de proteína XBP-1 en una célula es un anticuerpo intracelular específico para la XBP-1 tratada en el presente documento. El uso de anticuerpos intracelulares para inhibir la función proteica en una célula se conoce en la técnica (véase por ejemplo, Carlson, J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S. et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T. M. et al. (1990) FEBS Letters 274:193-198; Carlson, J. R. (1993) Proc. Natl. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W. A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S. et al. (1994) Bio/Technology 12:396-399; Chen, S-Y. et al. (1994) Human Gene Therapy 5:595-601; Duan, L et al. (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y. et al. (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:5932-5936; Beerli, R. R. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R. R. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A. M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-155 1; Richardson, J. H. et al. (1995) Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:3137-3141; publicación PCT número WO 94/02610 de Marasco et al.; y publicación PCT número WO 95/03832 de Duan et al.).
Para inhibir la actividad proteica usando un anticuerpo intracelular, se prepara un vector de expresión recombinante que codifica para las cadenas de anticuerpo de una manera tal que, al introducir el vector en una célula, se expresan las cadenas de anticuerpo como un anticuerpo funcional en un compartimiento intracelular de la célula. Para la inhibición de la actividad de factor de transcripción según los métodos inhibidores descritos en el presente documento, se expresa preferiblemente un anticuerpo intracelular que se une específicamente al factor de transcripción dentro del núcleo de la célula. La expresión nuclear de un anticuerpo intracelular puede lograrse eliminando de los genes de cadena ligera y pesada del anticuerpo aquellas secuencias de nucleótidos que codifican para las secuencias líder hidrófobas N-terminales y añadiendo secuencias de nucleótidos que codifican para una señal de ubicación nuclear en el extremo o bien N-terminal o bien C-terminal de los genes de cadena ligera y pesada (véase por ejemplo, Biocca, S. et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Mhashilkar, A. M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551). Una señal de ubicación nuclear preferida para usar para la selección como diana nuclear de las cadenas de anticuerpo intracelular es la señal de ubicación nuclear del antígeno T grande de SV40 (véase Biocca, S. et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Mhashilkar, A. M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551).
Para preparar un vector de expresión de anticuerpo intracelular, se aíslan ADNc de cadena ligera y pesada de anticuerpo que codifican para cadenas de anticuerpos específicas para la proteína diana de interés, por ejemplo, proteína XBP-1, normalmente de un hibridoma que segrega un anticuerpo monoclonal específico para proteína XBP-1. Pueden prepararse anticuerpos anti-proteína XBP-1 inmunizando un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con un inmunógeno de proteína XBP-1. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, proteína XBP-1 expresada de manera recombinante o un péptido de XBP-1 sintetizado químicamente. La preparación puede incluir adicionalmente un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o compuesto inmunoestimulante similar. Pueden obtenerse células productoras de anticuerpos a partir del sujeto y usarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas habituales, tales como la técnica del hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497) (véase también, Brown et al. (1981) J Immunol 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-3 1; y Yeh et al. (1982) Int. J Cancer 29:269-75). La tecnología para producir hibridomas de anticuerpo monoclonal se conoce bien (véase de manera general R. H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., Nueva York, Nueva York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J Biol. Med, 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36). En resumen, se fusiona una línea celular inmortal (normalmente un mieloma) con linfocitos (normalmente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno de proteína XBP-1 tal como se describió anteriormente, y se examinan los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma resultantes para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína XBP-1. Puede aplicarse cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas con el fin de generar un anticuerpo monoclonal anti-proteína XBP-1 (véase, por ejemplo, G. Galfre et al. (1977) Nature 266:5 50-52; Geftet et al. Somatic Cell Genet., citado anteriormente; Lerner, Yale J Biol. Med, citado anteriormente; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citado anteriormente). Además, el experto en la técnica apreciará que hay muchas variaciones de tales métodos que también serán útiles. Normalmente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) se deriva de las mismas especies de mamíferos que los linfocitos. Por ejemplo, pueden prepararse hibridomas murinos fusionando linfocitos a partir de un ratón inmunizado con una preparación inmunógena de la presente invención con una línea celular de ratón inmortalizada. Líneas celulares inmortales preferidas son las líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles a medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Puede usarse cualquiera de varias líneas celulares de mieloma como compañero de fusión según técnicas habituales, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, Md. Normalmente, se fusionan células de mieloma de ratón sensibles a HAT con esplenocitos de ratón usando polietilenglicol ("PEG"). Entonces se seleccionan las células de hibridoma resultantes de la fusión usando medio HAT, que mata las células de mieloma no fusionadas y fusionadas de manera no productiva (los esplenocitos no fusionados mueren tras varios días porque no se transforman). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína XBP-1 se identifican examinando los sobrenadantes de cultivo de hibridoma para detectar tales anticuerpos, por ejemplo, usando un ensayo ELISA habitual.
Como alternativa a preparar hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales, puede identificarse y aislarse un anticuerpo monoclonal que se une a XBP-1 examinando una biblioteca de inmunoglobulinas combinatoria recombinante (por ejemplo, una biblioteca de presentación a fagos de anticuerpos) con la proteína, o un péptido de la misma, para así aislar miembros de la biblioteca de inmunoglobulinas que se unen específicamente a la proteína. Hay kits para generar y examinar bibliotecas de presentación a fagos comercialmente disponibles (por ejemplo, el sistema de anticuerpos de fagos recombinantes de Pharmacia, número de catálogo 27-9400-01; y el kit de presentación de fagos SurfZAP™ de Stratagene, número de catálogo 240612). Adicionalmente, pueden encontrarse ejemplos de métodos y compuestos particularmente útiles para su uso para generar y examinar bibliotecas de presentación de anticuerpos, por ejemplo, en Ladner et al. patente estadounidense número 5.223.409; Kang et al. publicación internacional número WO 92/18619; Dower et al. publicación internacional número WO 91/1727 1; Winter et al. publicación internacional WO 92/20791; Markland et al. publicación internacional número WO 92/15679; Breitling et al. publicación internacional WO 93/01288; McCafferty et al. publicación internacional número WO 92/01047; Garrard et al. publicación internacional número WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982; y McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554.
Una vez que se ha identificado un anticuerpo monoclonal de interés específico para XBP-1 (por ejemplo, o bien un anticuerpo monoclonal derivado de hibridoma o bien un anticuerpo recombinante de una biblioteca combinatoria, incluyendo anticuerpos monoclonales frente a XBP-1 que ya se conocen en la técnica), se aíslan los ADN que codifican para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo monoclonal mediante técnicas de biología molecular habituales. Para anticuerpos derivados de hibridoma, pueden obtenerse ADNc de cadena ligera y pesada, por ejemplo, mediante amplificación por PCR o examen de biblioteca de ADNc. Para anticuerpos recombinantes, tales como de una biblioteca de presentación a fagos, puede recuperarse ADNc que codifica para las cadenas ligera y pesada a partir del envase de presentación (por ejemplo, fago) aislado durante el proceso de examen de la biblioteca. En la técnica se conocen secuencias de nucleótidos de genes de cadena ligera y pesada de anticuerpos a partir de las que pueden prepararse cebadores de PCR o sondas de biblioteca de ADNc. Por ejemplo, muchas de tales secuencias se describen en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU.), publicación NIH número 91-3242 y en la base de datos de secuencias de líneas germinales humanas "Vbase".
Una vez obtenidas, se clonan las secuencias de cadena ligera y pesada de anticuerpo en un vector de expresión recombinante usando métodos habituales. Tal como se trató anteriormente, las secuencias que codifican para los líderes hidrófobos de las cadenas ligera y pesada se eliminan y se unen en marco a secuencias que codifican para una señal de ubicación nuclear (por ejemplo, del antígeno T grande de SV40) a secuencias que codifican para el extremo o bien amino-terminal o bien carboxi-terminal de las cadenas tanto pesada como ligera. El vector de expresión puede codificar para un anticuerpo intracelular de una de varias formas. Por ejemplo, en una realización, el vector codifica para las cadenas ligera y pesada de anticuerpo de longitud completa de tal manera que se expresa intracelularmente un anticuerpo de longitud completa. En otra realización, el vector codifica para una cadena ligera de longitud completa pero sólo para la región VH/CH I de la cadena pesada de tal manera que se expresa intracelularmente un fragmento Fab. En la realización más preferida, el vector codifica para un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) en el que las regiones variables de las cadenas ligera y pesada están unidas por un ligador peptídico flexible (por ejemplo (Gly_{4}Ser)_{3})
y se expresan como una molécula de cadena sencilla. Para inhibir la actividad del factor de transcripción en una célula, se introduce el vector de expresión que codifica para el anticuerpo intracelular específico para XBP-1 en la célula mediante métodos de transfección habituales tal como se describió anteriormente en el presente documento.
iii. Compuestos peptídicos derivados de XBP-1
Otro compuesto inhibidor es un compuesto peptídico derivado de la secuencia de aminoácidos de XBP-1. En particular, el compuesto inhibidor comprende una parte de XBP-1 (o un compuesto mimético de la misma) que media en la interacción de XBP-1 con una molécula diana de tal manera que el contacto de XBP-1 con este compuesto peptídico inhibe competitivamente la interacción de XBP-1 con la molécula diana. Por ejemplo, el compuesto peptídico puede diseñarse basándose en la región b-Zip de XBP-1 que media en la interacción de XBP-1 con c-Fos.
Los compuestos peptídicos pueden producirse de manera intracelular en células introduciendo en las células un vector de expresión que codifica para el péptido. Tales vectores de expresión pueden prepararse mediante técnicas habituales usando oligonucleótidos que codifican para la secuencia de aminoácidos del compuesto peptídico. El péptido puede expresarse de manera intracelular como una fusión con otra proteína o péptido (por ejemplo, una fusión de GST). Como alternativa a la síntesis recombinante de los péptidos en las células, pueden prepararse los péptidos mediante síntesis química usando técnicas de síntesis de péptidos habituales. Entonces pueden introducirse los péptidos sintetizados en las células mediante una variedad de medios conocidos en la técnica para introducir péptidos en células (por ejemplo, liposomas y similares).
Otros agentes inhibidores que pueden usarse para inhibir específicamente la actividad de una proteína XBP-1 son compuestos químicos que inhiben directamente la actividad de XBP-1 o inhiben la interacción entre XBP-1 y moléculas diana. Tales compuestos pueden identificarse usando ensayos de selección que seleccionan tales compuestos, tal como se describió en detalle anteriormente.
B. Compuesto estimulante
Ya que la regulación por disminución de XBP-1 se asocia con la disminución de la actividad de células Th2, puede usarse un compuesto que estimula específicamente la actividad de XBP-1 para estimular la actividad de células Th2. En los métodos estimulantes descritos en el presente documento, puede tratarse un sujeto con un compuesto estimulante que estimula la expresión y/o actividad de XBP-1. Los métodos que usan compuestos estimulantes de XBP-1 pueden usarse en el tratamiento de trastornos en los que la actividad de las células Th2 está inhibida, bloqueada, regulada por disminución o similar. Los métodos para estimular la actividad de células Th2 pueden ser beneficiosos en trastornos que implican actividad de células Th1 no deseada (para así desplazar el equilibrio de células Th1 frente a Th2 hacia la ruta de Th2) o en trastornos en los que puede desearse un aumento de la actividad de células Th2 (tratado adicionalmente a continuación).
Ejemplos de compuestos estimulantes incluyen proteína XBP-1 activa, vectores de expresión que codifican para XBP-1 y agentes químicos que estimulan específicamente la actividad de XBP-1.
Un compuesto estimulante preferido es una molécula de ácido nucleico que codifica para XBP-1, en el que la molécula de ácido nucleico se introduce en el sujeto de una manera adecuada para la expresión de la proteína de XBP-1 en las células del sujeto. Por ejemplo, se clona un ADNc de XBP-1 (secuencia de ADNc de XBP-1 de longitud completa o parcial) en un vector de expresión recombinante y se transfecta el vector dentro de células usando técnicas de biología molecular habituales. El ADNc de XBP-1 puede obtenerse, por ejemplo, mediante amplificación usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o mediante examen de una biblioteca de ADNc apropiada. Las secuencias de nucleótidos del ADNc de XBP-1 se conocen en la técnica y pueden usarse para diseñar cebadores de PCR que permiten la amplificación de un ADNc mediante métodos de PCR habituales o para el diseño de una sonda de hibridación que puede usarse para examinar una biblioteca de ADNc usando métodos de hibridación habituales.
Tras el aislamiento o amplificación de ADNc de XBP-1, se introduce el fragmento de ADN en un vector de expresión adecuado, tal como se describió anteriormente. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para XBP-1 en forma adecuada para la expresión de XBP-1 en una célula huésped pueden prepararse tal como se describió anteriormente usando secuencias de nucleótidos conocidas en la técnica. Las secuencias de nucleótidos pueden usarse para el diseño de cebadores de PCR que permiten la amplificación de un ADNc mediante métodos de PCR habituales o para el diseño de una sonda de hibridación que puede usarse para examinar una biblioteca de ADNc usando métodos de hibridación habituales.
Otra forma de un compuesto estimulante para estimular la expresión de XBP-1 en una célula es un compuesto químico que estimula específicamente la expresión o actividad de XBP-1 endógeno en la célula. Tales compuestos pueden identificarse usando ensayos de selección que seleccionan compuestos que estimulan la expresión o actividad de XBP-1 tal como se describe en el presente documento.
Los métodos para modular la actividad del subconjunto de células T aberrante en un sujeto pueden ponerse en práctica o bien in vitro o bien in vivo. Para poner en práctica el método in vitro, pueden obtenerse células a partir de un sujeto mediante métodos habituales e incubarse (es decir, cultivarse) in vitro con un compuesto estimulante o inhibidor para estimular o inhibir, respectivamente, la actividad de XBP-1. En la técnica se conocen métodos para aislar células T o precursores de células T.
Las células tratadas in vitro con un compuesto o bien estimulante o bien inhibidor pueden administrarse a un sujeto para influir sobre la actividad del subconjunto de células T en el sujeto. Por ejemplo, pueden aislarse células a partir de un sujeto, expandir su número in vitro estimulando la actividad de XBP-1 en las células usando un agente estimulante (estimulando así la actividad de células Th2), y luego pueden volver a administrarse las células al mismo sujeto, o a otro tejido del sujeto compatible con el donante de células. El método modulador descrito en el presente documento puede comprender cultivar células T in vitro con un modulador de XBP-1 y comprende además administrar las células a un sujeto para así modular la actividad del subconjunto de células T en un sujeto. Al cultivarse in vitro, las células pueden diferenciarse en células Th2 maduras, respectivamente, y por tanto los métodos abarcan la administración de estas células Th2 maduras al sujeto. Para la administración de células a un sujeto, puede ser preferible retirar en primer lugar los compuestos residuales en el cultivo de las células antes de administrarlas al sujeto. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante centrifugación en gradiente de las células o lavando el tejido. Para una discusión adicional de la modificación genética ex vivo de células seguido por nueva administración a un sujeto, véase también la patente estadounidense número 5.399.346 de W. F. Anderson et al.
Un compuesto estimulante o inhibidor puede administrarse a un sujeto in vivo. Para agentes estimulantes o inhibidores que comprenden ácidos nucleicos (por ejemplo, vectores de expresión recombinantes que codifican para XBP-1, ARN antisentido, anticuerpos intracelulares o péptidos derivados de XBP-1), los compuestos pueden introducirse en células de un sujeto usando métodos conocidos en la técnica para introducir ácido nucleico (por ejemplo, ADN) en células in vivo. Ejemplos de tales métodos incluyen:
Inyección directa: puede introducirse ADN desnudo en células in vivo inyectando directamente el ADN dentro de las células (véase por ejemplo, Acsadi et al. (1991) Nature 332:815-818; Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468). Por ejemplo, puede usarse un aparato de administración (por ejemplo, una "pistola génica") para inyectar ADN dentro de células in vivo. Un aparato de este tipo está comercialmente disponible (por ejemplo, de BioRad).
Captación de ADN mediada por receptor: También puede introducirse ADN desnudo en células in vivo complejando el ADN a un catión, tal como polilisina, que está acoplado a un ligando para un receptor de superficie celular (véase por ejemplo Wu, G. y Wu, C. H. (1988) J Biol. Chem. 263:14621; Wilson et al. (1992) J Biol. Chem. 267:963-967; y la patente estadounidense número 5.166.320). La unión del complejo ADN-ligando al receptor facilita la captación del ADN mediante endocitosis mediada por receptor. Puede usarse un complejo ADN-ligando unido a cápsidas de adenovirus que alteran de manera natural los endosomas, liberando así el material en el citoplasma, para evitar la degradación del complejo por lisosomas intracelulares (véase por ejemplo Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:8850; Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:2122-2126).
Retrovirus: Los retrovirus defectuosos están bien caracterizados para su uso en la transferencia génica para fines de terapia génica (para una revisión, véase Miller, A. D. (1990) Blood 76:271). Puede construirse un retrovirus recombinante que tenga una secuencia de nucleótidos de interés incorporada en el genoma retroviral. Adicionalmente, pueden eliminarse partes del genoma retroviral para hacer defectuosa la replicación del retrovirus. Entonces se envuelve el retrovirus defectuoso para la replicación en viriones que pueden usarse para infectar una célula diana mediante el uso de un virus cooperador mediante técnicas habituales. Protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con tales virus pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio habituales. Ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM que se conocen bien por los expertos en la técnica. Ejemplos de líneas de virus de envase adecuadas incluyen yCrip, yCre, y2 y yAm. Se han usado retrovirus para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentes, incluyendo células epiteliales, células endoteliales, linfocitos, mioblastos, hepatocitos, células de médula ósea, in vitro y/o in vivo (véase por ejemplo Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos y Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; patente estadounidense número 4.868.116; patente estadounidense número 4.980.286; solicitud PCT WO89/07136; solicitud PCT WO 89/02468; solicitud PCT WO 89/05345; y solicitud PCT WO 92/07573). Los vectores retrovirales requieren la división de la célula diana con el fin de que se integre el genoma retroviral (y ácido nucleico extraño insertado en el mismo) en el genoma huésped para introducir de manera estable ácido nucleico en la célula. Por tanto, puede ser necesario estimular la replicación de la célula diana.
Adenovirus: el genoma de un adenovirus puede manipularse de tal manera que exprese y codifique para un producto génico de interés pero esté inactivo en cuanto a su capacidad para replicarse en un ciclo de vida viral lítico normal. Véase por ejemplo Berkner et al. (1988) Bio Techniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; y Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155. Vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 d1324 u otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7 etc.) se conocen bien por los expertos en la técnica. Los adenovirus recombinantes son ventajosos porque no requieren la división celular para ser vehículos de administración de genes eficaces y pueden usarse para infectar una amplia variedad de tipos de células, incluyendo el epitelio de las vías respiratorias (Rosenfeld et al. (1992) citado anteriormente), células endoteliales (Lemarchand et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:6482-6486), hepatocitos (Herz y Gerard (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA90:2812-2816) y células musculares (Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:2581-2584). Adicionalmente, el ADN adenoviral introducido (y ADN extraño contenido en el mismo) no se integra en el genoma de una célula huésped, sino que permanece episomal, evitando así problemas potenciales que pueden producirse como resultado de mutagénesis de inserción en situaciones en las que el ADN introducido se integra en el genoma huésped (por ejemplo, ADN retroviral). Además, la capacidad de carga del genoma adenoviral para ADN extraño es grande (hasta 8 kilobases) con respecto a otros vectores de administración de genes (Berkner et al. citado anteriormente; Haj-Ahmand y Graham (1986) J Virol. 57:267). La mayoría de los vectores adenovirales defectuosos para la replicación actualmente en uso tienen todo o partes de los genes E1 y E3 virales delecionadas pero conservan hasta el 80% del material genético adenoviral.
Virus adenoasociados: Un virus adenoasociado (VAA) es un virus defectuoso que se produce de manera natural que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un virus del herpes, como virus cooperador para la replicación eficaz y un ciclo de vida productivo (para una revisión véase Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129). También es uno de los pocos virus que pueden integrar su ADN en células que no se dividen, y muestra una alta frecuencia de integración estable (véase por ejemplo Flotte et al. (1992) Am. J Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-3 56; Samulski et al. (1989) J Virol. 63:3822-3828; y McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973). Pueden empaquetarse vectores que contienen tan sólo 300 pares de bases de VAA y pueden integrarse. El espacio para ADN exógeno está limitado a aproximadamente 4,5 kb. Puede usarse un vector de VAA tal como el descrito en Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 para introducir ADN en células. Se ha introducido una variedad de ácidos nucleicos en diferentes tipos de células usando vectores de VAA (véase por ejemplo Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J Viral. 51:611-619; y Flotte et al. (1993) J Biol. Chem. 268:3781-3790).
La eficacia de un sistema de vector de expresión particular y método para introducir ácido nucleico en una célula pueden evaluarse mediante enfoques habituales usados de manera rutinaria en la técnica. Por ejemplo, el ADN introducido en una célula puede detectarse mediante una técnica de hibridación en filtro (por ejemplo, inmunotransferencia de tipo Southern) y el ARN producido mediante transcripción de ADN introducido puede detectarse, por ejemplo, mediante inmunotransferencia de tipo Northern, protección de ARNasa o reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR). El producto génico puede detectarse mediante un ensayo apropiado, por ejemplo, mediante detección inmunológica de una proteína producida, tal como con un anticuerpo específico, o mediante ensayo funcional para detectar una actividad funcional del producto génico, tal como un ensayo enzimático.
Si los compuestos estimulantes o inhibidores son compuestos químicos que modulan la actividad de XBP-1, los compuestos estimulantes o inhibidores pueden administrarse a un sujeto como una composición farmacéutica. Tales composiciones comprenden normalmente los compuestos estimulantes o inhibidores y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables y métodos de administración a un sujeto se describieron anteriormente.
Con respecto a los métodos descritos en el presente documento para modular la actividad del subconjunto de células T mediante modulación de la actividad de XBP-1, se han identificado numerosos estados patogénicos asociados con una respuesta de tipo Th1 o Th2 predominante y pueden beneficiarse de la modulación del tipo de respuesta montada en el individuo que padece el estado patogénico. La aplicación de los métodos inmunomoduladores a tales enfermedades se describe en más detalle a continuación.
A. Alergias
Las alergias están mediadas por anticuerpos IgE cuya producción está regulada por la actividad de células Th2 y las citocinas producidas por las mismas. En reacciones alérgicas, se produce IL-4 por las células Th2, que estimula adicionalmente la producción de anticuerpos IgE y activación de células que median en las reacciones alérgicas, es decir, mastocitos y basófilos. IL-4 también desempeña un papel importante en las reacciones inflamatorias mediadas por eosinófilos. En consecuencia, los métodos inhibidores de la invención pueden usarse para inhibir la producción de citocinas asociadas a Th2, y en particular IL-4, en pacientes alérgicos como un medio para regular por disminución la producción de anticuerpos IgE patogénicos. Un agente inhibidor puede administrarse directamente al sujeto o pueden obtenerse las células (por ejemplo, células Thp o células Th2) del sujeto, ponerse en contacto con un agente inhibidor ex vivo, y volver a administrarse al sujeto. Además, en ciertas situaciones, puede ser beneficioso administrar conjuntamente al sujeto el alérgeno junto con el agente inhibidor o células tratadas con el agente inhibidor para inhibir (por ejemplo, desensibilizar) la respuesta específica de alérgeno. El tratamiento puede potenciarse adicionalmente administrando otros agentes promotores de Th1, tales como citocina IL-12 o anticuerpos frente a citocinas asociadas a Th2 (por ejemplo, anticuerpos anti-IL-4), al sujeto alérgico en cantidades suficientes para estimular adicionalmente una respuesta de tipo Th1.
B. Cáncer
Se ha notificado que la expresión de citocinas promotoras de Th2 es elevada en pacientes con cáncer (véase por ejemplo, Yamamura, M., et al. (1993) J. Clin Invest. 91:1005-1010; Pisa, P., et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci USA 89:7708-7712) y la enfermedad cancerígena está a menudo asociada con un desplazamiento desde respuestas de tipo Th1 hacia respuestas de tipo Th2 junto con un empeoramiento del transcurso de la enfermedad. En consecuencia, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para inhibir la producción de citocinas asociadas a Th2 en pacientes con cáncer, como un medio para contrarrestar el desplazamiento de Th1 a Th2 y así promover una respuesta de Th1 continua en los pacientes para mejorar el transcurso de la enfermedad. El método inhibidor puede implicar o bien la administración directa de un agente inhibidor a un sujeto con cáncer o bien el tratamiento ex vivo de células obtenidas del sujeto (por ejemplo, células Thp o Th2) con un agente inhibidor seguido por la nueva administración de las células al sujeto. El tratamiento puede potenciarse adicionalmente administrando otros agentes promotores de Th1, tales como citocina IL-12 o anticuerpos frente a citocinas asociadas a Th2 (por ejemplo, anticuerpos anti-IL-4), al receptor en cantidades suficientes para estimular adicionalmente una respuesta de
tipo Th1.
C. Enfermedades infecciosas
También se ha notificado que la expresión de citocinas que promueven Th2 aumenta durante una variedad de enfermedades infecciosas, incluyendo la infección por VIH, tuberculosis, leishmaniosis, esquistomsomosis, infección por nematodos filariales e infección por nematodos intestinales (véase por ejemplo; Shearer, G. M. y Clerici, M. (1992) Prog. Chem. Immunol. 54:21-43; Clerici, M y Shearer, G. M. (1993) Immunology Today 14:107-111; Fauci, A. S. (1988) Science 239:617623; Locksley, R. M. y Scott, P. (1992) Immunoparasitology Today 1:A58-A61; Pearce, E. J., et al. (1991) J. Exp. Med. 173:159-166; Grzych, J-M., et al. (1991) J. Immunol. 141:1322-1327; Kullberg, M. C., et al. (1992) J. Immunol. 148:3264-3270; Bancroft, A. J., et al. (1993) J. Immunol. 150:1395-1402; Pearlman, E., et al. (1993) Infect. Immun. 61:1105-1112; Else, K. J., et al. (1994) J. Exp. Med. 179:347-351) y tales enfermedades infecciosas también están asociadas con un desplazamiento de Th1 a Th2 en la respuesta inmunitaria. En consecuencia, los métodos inhibidores de la invención pueden usarse para inhibir la producción de citocinas asociadas a Th2 en sujetos con enfermedades infecciosas, como un medio para contrarrestar el desplazamiento de Th1 a Th2 y así promover una respuesta de Th1 continua en los pacientes para mejorar el transcurso de la infección. El método inhibidor puede implicar o bien la administración directa de un agente inhibidor a un sujeto con una enfermedad infecciosa o bien el tratamiento ex vivo de células obtenidas del sujeto (por ejemplo, células Thp o Th2) con un agente inhibidor seguido de la nueva administración de las células al sujeto. El tratamiento puede potenciarse adicionalmente administrando otros agentes promotores de Th1, tales como la citocina IL-12 o anticuerpos frente a citocinas asociadas a Th2 (por ejemplo, anticuerpos anti-IL-4), al receptor en cantidades suficientes para estimular una respuesta de tipo Th1.
D. Enfermedades autoinmunitarias
Los métodos estimulantes descritos en el presente documento pueden usarse de manera terapéutica en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias que están asociadas con una disfunción de tipo Th2. Muchos trastornos autoinmunitarios son resultado de una activación inapropiada de las células T que son reactivas frente al propio tejido y que promueven la producción de citocinas y anticuerpos implicados en la patología de las enfermedades. La modulación de respuestas de tipo cooperador T puede tener un efecto sobre el transcurso de la enfermedad autoinmunitaria. Por ejemplo, en la encefalomielitis alérgica experimental (EAE), la estimulación de una respuesta de tipo Th2 administrando IL-4 en el momento de la inducción de la enfermedad disminuye la intensidad de la enfermedad autoinmunitaria (Paul, W. E., et al. (1994) Cell 76:241-251). Además, se ha demostrado que la recuperación de los animales de las enfermedades está asociada con un aumento en una respuesta de tipo Th2 tal como se pone en evidencia mediante un aumento de citocinas específicas de Th2 (Koury, S. J., et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1355-1364). Además, las células T que pueden suprimir la EAE segregan citocinas específicas de Th2 (Chen, C., et al. (1994) Immunity 1:147-154). Ya que la estimulación de una respuesta de tipo Th2 en EAE tiene un efecto protector frente a la enfermedad, la estimulación de una respuesta de Th2 en sujetos con esclerosis múltiple (para lo que EAE es un modelo) es posible que sea terapéuticamente beneficiosa.
De manera similar, la estimulación de una respuesta de tipo Th2 en diabetes tipo I en ratones proporciona un efecto protector frente a la enfermedad. De hecho, el tratamiento de ratones NOD con IL-4 (que promueve una respuesta de Th2) evita o retrasa la aparición de la diabetes tipo I que normalmente se desarrolla en estos ratones (Rapoport, M. J., et al. (1993) J. Exp. Med. 178:87-99). Por tanto, la estimulación de una respuesta de Th2 en un sujeto que padece o es susceptible a la diabetes puede mejorar los efectos de la enfermedad o inhibir la aparición de la enfermedad.
Aún otra enfermedad autoinmunitaria en la que la estimulación de una respuesta de tipo Th2 puede ser beneficiosa es la artritis reumatoide (AR). Estudios han mostrado que los pacientes con artritis reumatoide tienen predominantemente células Th1 en el tejido sinovial (Simon, A. K., et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:8562-8566). Estimulando una respuesta de Th2 en un sujeto con AR, puede regularse por disminución de manera concomitante la respuesta de Th1 perjudicial para así mejorar los efectos de la enfermedad.
En consecuencia, los métodos estimulantes pueden usarse para estimular la producción de citocinas asociadas a Th2 en sujetos que padecen, o son susceptibles a, una enfermedad autoinmunitaria en la que una respuesta de tipo Th2 es beneficiosa para el transcurso de la enfermedad. El método estimulante puede implicar o bien la administración directa de un agente estimulante al sujeto o bien el tratamiento ex vivo de células obtenidas del sujeto (por ejemplo, células Thp, Th1, células B, células no linfoides) con un agente estimulante seguido por la nueva administración de las células al sujeto. El tratamiento puede potenciarse adicionalmente administrando otros agentes promotores de Th2, tales como la propia IL-4 o anticuerpos frente a citocinas asociadas a Th1, al sujeto en cantidades suficientes para estimular adicionalmente una respuesta de tipo Th2.
Al contrario que las enfermedades autoinmunitarias descritas anteriormente en las que es deseable una respuesta de Th2, pueden mejorarse otras enfermedades autoinmunitarias mediante una respuesta de tipo Th1. Tales enfermedades pueden tratarse usando un agente inhibidor (tal como se describió anteriormente para el cáncer y enfermedades infecciosas). El tratamiento puede potenciarse adicionalmente administrando una citocina promotora de Th1 (por ejemplo, IFN-g) al sujeto en cantidades suficientes para estimular adicionalmente una respuesta de tipo Th1.
La eficacia de agentes para tratar enfermedades autoinmunitarias puede someterse a prueba en los modelos de animales descritos anteriormente de enfermedades humanas (por ejemplo, EAE como modelo de esclerosis múltiple y los ratones NOD como modelo para la diabetes) u otros modelos de animales bien caracterizados de enfermedades autoinmunitarias humanas. Tales modelos de animales incluyen el ratón mrl/lpr/lpr como modelo para lupus eritomatoso, artritis inducida por colágeno murina como modelo de artritis reumatoide, y miastenia experimental murina grave (véase Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, 1989, págs. 840-856). Un agente modulador (es decir, estimulante o inhibidor) se administra a animales de prueba y entonces se monitoriza el transcurso de la enfermedad en los animales de prueba mediante los métodos habituales para el modelo particular que está usándose. Se demuestra la eficacia del agente modulador mediante la mejora del estado patológico en animales tratados con el agente comparado con animales no tratados (o animales tratados con un agente de control).
Ejemplos no limitativos de enfermedades autoinmunitarias y trastornos que tienen un componente autoinmunitario que pueden tratarse según la invención incluyen diabetes mellitus, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica), esclerosis múltiple, miastenia grave, lupus eritomatoso sistémico, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eczematosa), psoriasis, síndrome de Sjogren, incluyendo queratoconjuntivitis seca secundaria al síndrome de Sjogren, alopecia areata, respuestas alérgicas debidas a reacciones a mordeduras de artrópodos, enfermedad de Crohn, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, asma, asma alérgico, lupus eritomatoso cutáneo, esclerodermia, vaginitis, proctitis, erupciones producidas por fármacos, reacciones de cambios producidas por la lepra, eritema nodular leproso, uveitis autoinmunitaria, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, pérdida auditiva sensorineural progresiva bilateral idiopática, anemia aplásica, anemia de glóbulos rojos pura, trombocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa crónica, síndrome de Stevens-Johnson, esprue idiopático, liquen plano, enfermedad de Crohn, oftalmopatía grave, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveitis posterior, y fibrosis de pulmón intersticial.
E. Transplante
Aunque el rechazo de injertos o aceptación de injertos puede no ser atribuible exclusivamente a la acción de un subconjunto de células T particular (es decir, células Th1 o Th2) en el receptor del injerto (para una evaluación, véase Dallman, M. J. (1995) Curr. Opin. Immunol. 7:632-638), numerosos estudios han implicado una respuesta de Th2 predominante en la supervivencia de injerto prolongada o una respuesta de Th2 predominante en el rechazo de injerto. Por ejemplo, la aceptación del injerto se ha asociado con la producción de un patrón de citocinas Th2 y/o el rechazo del injerto se ha asociado con la producción de un patrón de citocinas Th1 (véase por ejemplo, Takeuchi, T. et al. (1992) Transplantation 53:1281-1291; Tzakis, A. G. et al. (1994) J. Pediatr. Surg 29:754-756; Thai, N. L. et al. (1995) Transplantation 59:274-281). Adicionalmente, la transferencia adoptiva de células que tienen un fenotipo de citocinas Th2 prolonga la supervivencia del injerto de piel (Maeda, H. et al. (1994) Int. Immunol. 6:855-862) y reduce la enfermedad de injerto contra huésped (Fowler, D. H. et al. (1994) Blood 84:3540-3549; Fowler, D. H. et al. (1994) Prog. Clin. Biol. Res. 389:533-540). Todavía adicionalmente, la administración de IL-4, que promueve la diferenciación de Th2, prolonga la supervivencia del aloinjerto cardiaco (Levy, A. E. y Alexander, J. W. (1995) Transplantation 60:405-406), mientras que la administración de IL-12 en combinación con anticuerpos anti-IL-10, que promueve la diferenciación de Th1, potencia el rechazo de aloinjerto de piel (Gorczynski, R. M. et al. (1995) Transplantation 60:1337-1341).
En consecuencia, los métodos estimulantes descritos en el presente documento pueden usarse para estimular la producción de citocinas asociadas a Th2 en receptores de transplantes para prolongar la supervivencia del injerto. Los métodos estimulantes pueden usarse tanto en transplantes de órganos sólidos como en transplantes de médula ósea (por ejemplo, para inhibir la enfermedad de injerto contra huésped). El método estimulante puede implicar o bien la administración directa de un agente estimulante al receptor del transplante o bien el tratamiento ex vivo de células obtenidas a partir del sujeto (por ejemplo, células Thp, Th1, células B, células no linfoides) con un agente estimulante seguido por la nueva administración de las células al sujeto. El tratamiento puede potenciarse adicionalmente administrando otros agentes que promueven Th2, tales como la propia IL-4 o anticuerpos frente a citocinas asociadas a Th1, al receptor en cantidades suficientes para estimular adicionalmente una respuesta de tipo Th2.
Además de las anteriores situaciones patológicas, los métodos moduladores también son útiles para otros fines. Por ejemplo, los métodos estimulantes (es decir, métodos que utilizan un agente estimulante) pueden usarse para estimular la producción de citocinas que promueven Th2 (por ejemplo, IL-4) in vitro para la producción comercial de estas citocinas (por ejemplo, pueden ponerse en contacto las células con el agente estimulante in vitro para estimular la producción de IL-4 y puede recuperarse la IL-4 del sobrenadante de cultivo, purificarse adicionalmente si es necesario, y envasarse para su uso comercial).
Además, los métodos moduladores pueden aplicarse a vacunas para promover una respuesta o bien Th1 o bien Th2 frente a un antígeno de interés en un sujeto. Es decir, los agentes pueden servir como adyuvantes para dirigir una respuesta inmunitaria frente a una vacuna o bien frente a una respuesta de Th1 o bien frente a una respuesta de Th2. Por ejemplo, para estimular una respuesta de anticuerpos frente a un antígeno de interés (es decir, para fines de vacunación), pueden administrarse conjuntamente el antígeno y un agente estimulante de la invención a un sujeto para promover una respuesta de Th2 frente al antígeno en el sujeto, ya que las respuestas de Th2 proporcionan ayuda de células B eficaz y promueven la producción de IgG1. Alternativamente, para promover una respuesta inmunitaria celular frente a un antígeno de interés, pueden administrarse conjuntamente el antígeno y un agente inhibidor de la invención a un sujeto para promover una respuesta de Th1 frente al antígeno en un sujeto, ya que las repuestas de Th1 favorecen el desarrollo de respuestas inmunitarias mediadas por células (por ejemplo, respuestas de hipersensibilidad retrasada). El antígeno de interés y el agente modulador pueden formularse juntos en una única composición farmacéutica o en composiciones separadas. El antígeno de interés y agente modulador pueden administrarse simultáneamente al sujeto. Alternativamente, en ciertas situaciones puede ser deseable administrar el antígeno en primer lugar y luego el agente modulador o viceversa (por ejemplo, en el caso de un antígeno que provoca de manera natural una respuesta de Th1, puede ser beneficioso administrar en primer lugar sólo el antígeno para estimular una respuesta de Th1 y luego administrar un agente estimulante, sólo o junto con un refuerzo de antígeno, para desplazar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de Th2).
III. Ensayos de diagnóstico
Los métodos reivindicados de la invención pueden permitir un método para diagnosticar a un sujeto con un trastorno asociado con actividad del subconjunto de células T aberrante que comprende:
(a) detectar la expresión de XBP-1 en células (por ejemplo, células T o precursores de las mismas) de un sujeto que se sospecha que tiene un trastorno asociado con la actividad del subconjunto de células T aberrante;
(b) comparar la expresión de XBP-1 en células de dicho sujeto con un control que no está asociado con la actividad del subconjunto de células T aberrante; y
(c) diagnosticar al sujeto con un trastorno basándose en un cambio de expresión de XBP-1 en células del sujeto comparadas con el control.
El "cambio en la expresión de XBP-1" en células del sujeto puede ser, por ejemplo, un cambio en el nivel de expresión de XBP-1 en células del sujeto, que puede detectarse sometiendo a ensayo los niveles de ARNm de XBP-1, por ejemplo, aislando células del sujeto y determinando el nivel de expresión de ARNm de XBP-1 en las células mediante métodos habituales conocidos en la técnica, incluyendo análisis de inmunotransferencia de tipo Northern, análisis de PCR de transcriptasa inversa e hibridaciones in situ. Alternativamente, puede detectarse el nivel de expresión de XBP-1 en células del sujeto sometiendo a ensayo los niveles de proteína XBP-1, por ejemplo, aislando células del sujeto y determinando el nivel de expresión de proteína XBP-1 mediante métodos habituales conocidos en la técnica, incluyendo análisis de inmunotransferencia de tipo Western, inmunoprecipitaciones, ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzima (ELISA) e inmunofluorescencia.
Un cambio en la expresión de XBP-1 en células del sujeto puede resultar de una o más mutaciones (es decir, alteraciones de tipo natural) en el gen de XBP-1 y ARNm que conduce a una o más mutaciones (es decir, alteraciones de tipo natural) en la secuencia de aminoácidos de XBP-1 de la proteína XBP-1. La(s) mutación/mutaciones puede(n) conducir a una forma de XBP-1 con actividad aumentada (por ejemplo, actividad constitutiva parcial o completa). La(s) mutación/mutaciones puede(n) conducir a una forma de XBP-1 con actividad disminuida (por ejemplo, inactividad parcial o completa). La(s) mutación/mutaciones puede(n) cambiar el nivel de expresión de XBP-1, por ejemplo, aumentando o disminuyendo el nivel de expresión de XBP-1 en un sujeto con un trastorno. Alternativamente, la(s) mutación/mutaciones puede(n) cambiar la regulación de XBP-1, por ejemplo, alterando la interacción de la XBP-1 mutante con dianas de XBP-1. Pueden determinarse mutaciones en la secuencia de nucleótidos o secuencias de aminoácidos de XBP-1 usando técnicas habituales para el análisis de ADN o secuenciación de proteínas, por ejemplo para la secuenciación de ADN o proteínas, análisis RFLP, y análisis de polimorfismos de aminoácidos o de un solo nucleótido.
El ensayo de diagnóstico puede realizarse en una muestra biológica del sujeto, tal como una muestra celular o sección de tejido (por ejemplo, una sección de tejido liofilizada o recién congelada extraída de un sujeto). El nivel de expresión de XBP-1 en células del sujeto puede detectarse in vivo, usando un método de formación de imágenes apropiado, tal como usando un anticuerpo anti-XBP-1 radiomarcado.
Puede incrementarse (es decir, aumentarse) el nivel de expresión de XBP-1 en células del sujeto de prueba con respecto al control no asociado con el trastorno o el sujeto puede expresar una forma de XBP-1 constitutivamente activa (parcial o completamente). Este nivel de expresión elevado de XBP-1 o expresión de una forma de XBP-1 constitutivamente activa puede usarse para diagnosticar a un sujeto con un trastorno asociado con la actividad de células Th2 aumentada (tal como se trató anteriormente).
Puede reducirse (es decir, disminuirse) el nivel de expresión de XBP-1 en células del sujeto con respecto al control no asociado con el trastorno o el sujeto puede expresar una forma de XBP-1 mutante inactiva (parcial o completamente). Este nivel de expresión de XBP-1 reducido o expresión de una forma de XBP-1 mutante inactiva puede usarse para diagnosticar a un sujeto con un trastorno asociado con actividad de células Th2 disminuida y/o actividad de células Th1 aumentada (tal como se trató anteriormente).
IV. Kits de la invención
A continuación se describen kits para llevar a cabo los ensayos de selección de la invención y los métodos moduladores o ensayos de diagnóstico descritos en el presente documento. Por ejemplo, un kit para llevar a cabo un ensayo de selección de la invención puede incluir una composición indicadora que contiene XBP-1, medios para determinar la actividad de células Th2 e instrucciones para usar el kit para identificar moduladores de la actividad de células Th2 (por ejemplo, producción de citocina Th2). Un kit para llevar a cabo un ensayo de selección puede incluir células con deficiencia de XBP-1, medios para determinar la actividad de células Th2 (por ejemplo, producción de citocina Th2) e instrucciones para usar el kit para identificar moduladores de la actividad de células Th2.
Un kit para llevar a cabo un método modulador puede incluir por ejemplo, un agente modulador (por ejemplo, agente estimulante o inhibidor de XBP-1) en un vehículo adecuado y acondicionado en un envase adecuado con instrucciones para el uso del modulador para modular la actividad del subconjunto de células T.
Un kit para diagnosticar un trastorno asociado con la actividad del subconjunto de células T aberrante en un sujeto puede incluir un reactivo para determinar la expresión de XBP-1 (por ejemplo, una sonda de ácido nucleico para detectar ARNm de XBP-1 o un anticuerpo para detectar la proteína XBP-1), un control con el que se comparan los resultados del sujeto e instrucciones para usar el kit con fines de diagnóstico.
V. Células, embriones y animales
Pueden usarse células, embriones y animales no humanos con deficiencia de XBP-1 aislados en los diversos métodos de selección de la invención. Células con deficiencia de XBP-1 preferidas son células T y precursores de células T. Animales no humanos preferidos, y embriones de los mismos, son ratones. Otras especies incluyen un animal recombinante homólogo que comprende una alteración homocigótica de su gen de XBP-1 endógeno, debido a la inserción de ADN exógeno en el gen, en el que esta alteración del gen de XBP-1 evita la expresión de proteína XBP-1 funcional y, además, en el que el fenotipo de este animal con respecto a un animal que tiene una proteína XBP-1 funcional comprende la producción disminuida de citocinas Th2; y un animal con deficiencia de XBP-1 homocigótico que tiene una mutación homocigótica insertada en su gen de XBP-1 endógeno mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de tal manera que el gen de XBP-1 del animal no es funcional o no expresa proteína XBP-1 funcional y en el que el animal muestra producción disminuida de citocina Th2. La construcción y caracterización fenotípica de animales no humanos con deficiencia de XBP-1 preferidos se describen con detalle en el ejemplo 1.
Dado que el fenotipo XBP-1 -/- conduce a la mortalidad intrauterina cuando la deficiencia es constitutiva, otro animal con deficiencia de XBP-1 preferido es uno en el que se controla de forma regulada la expresión del fenotipo con deficiencia de XBP-1, mediante "apagado" del gen de XBP-1 de una forma controlada (por ejemplo, mediante el uso de un sistema regulador controlable, tal como el sistema regulado por tetraciclina). Una de tales especies es un animal no humano transgénico cuyos alelos de XBP-1 endógenos se han alterado, mediante ADN exógeno, de manera que la expresión de alelos de XBP-1 endógenos esté regulada de una forma controlada mediante un agente inductor o supresor, de manera que al menos en ciertas condiciones los alelos de XBP-1 no sean funcionales o no expresen una proteína XBP-1 funcional y en el que el animal muestra producción disminuida de citocina Th2. En la técnica se conocen métodos para construir tales animales deficientes "condicionales", tales como, por ejemplo, un sistema regulado por tetraciclina para la alteración condicional de un gen tal como se describe en el documento WO 94/29442 y la patente estadounidense número 5.650.298.
Otro animal con deficiencia de XBP-1 preferido es un animal quimérico (por ejemplo, ratones) producido usando un sistema de complementación de blastocitos, tal como el sistema de complementación de blastocito RAG-2, en el que surge un órgano u órganos particulares (por ejemplo, los órganos linfoides) de células madre embrionarias (ES) con mutaciones homocigóticas del gen de XBP-1. Una de tales especies es un animal quimérico no humano en el que al menos un órgano surge a partir de células madre embrionarias con mutaciones homocigóticas del gen de XBP-1. La construcción y caracterización fenotípica de animales no humanos quiméricos con deficiencia de XBP-1 preferidos se describen en detalle en el ejemplo 2.
Los animales XBP-1 -/- pueden usarse adicionalmente para crear animales transgénicos que llevan un transgén de XBP-1 que permite la expresión del transgén de XBP-1 en uno o más tipos de células o tejidos específicos, tales como hepatocitos. Tales animales pueden ser de uso particular en el "rescate" de la mortalidad embrionaria de animales XBP-1 -/- (por ejemplo, permitiendo la expresión de XBP-1 en hepatocitos en desarrollo) mientras aún se mantiene la deficiencia de XBP-1 en otros tipos de células o tejidos del animal (tales como el sistema linfoide). Un animal transgénico preferido es un animal deficiente para XBP-1 -/- que lleva un transgén de XBP-1 controlado por el promotor de albúmina (un elemento regulador específico del hígado descrito en Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277). Alternativamente, pueden usarse otros elementos reguladores específicos del hígado conocidos en la técnica para controlar la expresión del transgén. Una de tales especies es un animal no humano que tiene una mutación homocigótica insertada en su gen de XBP-1 endógeno mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de tal manera que el gen de XBP-1 del animal no es funcional o no expresa la proteína XBP-1 funcional pero en el que el animal no humano comprende además un transgén de XBP-1 que dirige la expresión de XBP-1 en al menos un tipo de célula o tipo de tejido en el animal. Preferiblemente, el transgén dirige la expresión de XBP-1 al menos en hepatocitos.
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Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos. Los contenidos de toda la bibliografía, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan en el presente documento como referencia.
Ejemplo 1 Producción y caracterización del fenotipo del hígado de ratones con deficiencia de XBP-1 Interrupción del gen de XBP-1
Para definir las acciones de la proteína XBP-1 in vivo, se interrumpió el gen de XBP-1 en células madre embrionarias sustituyendo un fragmento de 0,8 kb que contenía partes de los exones 1 y 2 así como el intrón intermedio con un gen de resistencia a neomicina, dando como resultado un desplazamiento de marco de los aminoácidos restantes (tal como se representa en la figura 1). Se generó el constructo de selección como diana clonando el fragmento de XBP-1 alterado en el vector pBS/TK, seguido por linealización e introducción en células ES D3 mediante electroporación. Se hicieron crecer las células en neomicina y ganciclovir para lograr una selección positiva/negativa, y se sometieron a prueba clones resistentes para determinar la integración homóloga del fragmento de XBP-1 alterado realizando inmunotransferencias tipo Southern de ADN genómico. Uno de tres clones de ES que se habían sometido a alteración dirigida del gen de XBP-1 transmitió el alelo alterado a las crías y se cruzaron ratones XBP-1 +/- para generar ratones XBP -/-, tal como se demuestra mediante el análisis de inmunotransferencia de tipo Southern de ADN genómico de embriones. El análisis de inmunotransferencia de tipo Northern de ARN celular total preparado a partir de embriones +/+ y -/- reveló una ausencia de un transcrito de XBP-1 correctamente dimensionado en muestras -/- y la aparición de un transcrito de mayor PM, menos visible que también se hibridó con una sonda de ADNc de neomicina. Los análisis de inmunotransferencia de tipo Western de extractos de hígados fetales XBP-1 +/+, +/-, y -/- usando un antisuero monoclonal específico para XBP-1 reveló la ausencia de proteína XBP-1 inmunorreactiva en las muestras -/-.
Mortalidad embrionaria de hipoplasia de hígado en ratones XBP- 1 -/-
Los apareamientos de ratones XBP-1 heterocigóticos no produjeron nacimientos vivos -/-. De aproximadamente 400 crías nacidas no se obtuvieron homocigotos, lo que sugiere que XBP-1 es necesario para la supervivencia. La determinación del genotipo de camadas criadas a partir de apareamientos programados en serie reveló que la mortalidad embrionaria comenzó a E12.5. Antes de E13.5, pudieron reconocerse embriones XBP-1 -/- por el retraso en su crecimiento, coloración pálida e hígados hipoplásicos. La inspección de hígados -/- mostró que tenían un tamaño marcadamente reducido comparado con hígados E13.5 normales, y los recuentos de células hepáticas totales fueron del 15% de hígados +/+ en esta edad. El análisis histológico de hígados -/- de E14.5 reveló una celularidad reducida y espacio vacío aumentado, lo que indica una menor densidad de empaquetamiento de las células -/- comparadas con los hígados de control.
Dado que el hígado fetal se convierte en el principal órgano hematopoyético antes de E 13.5, los recuentos de sangre fetal se determinaron para evaluar si la hipoplasia de hígado grave se correlacionaba con la producción de glóbulos rojos anómala. La anemia se volvió evidente en embriones XBP-1 -/- tras E 11.5 a medida que la hematopoyesis cambió desde el saco vitelino hasta el hígado fetal. Antes de E 14.5, los recuentos de sangre total de los ratones XBP-1 -/- supervivientes fueron del 20% de los valores encontrados en crías normales. Preparaciones de citospina de sangre periférica en E 13.5 revelaron que las células eritroideas -/- eran predominantemente células inmaduras, nucleadas de origen de saco vitelino, mientras que las células eritroideas +/+ eran células no nucleadas derivadas del hígado al 80%. Preparaciones de citospina de células hepáticas E 13.5 demostraron la presencia de células de linaje eritroide y mieloide en todos los estados de madurez en muestras -/-, aunque en números reducidos de acuerdo con los hígados hipoplásticos.
Para comparar el potencial de células progenitoras hematopoyéticas +/+ y -/- para desarrollarse en linajes eritroides y mieloides, se realizaron ensayos de colonias de metilcelulosa in vitro usando AGM fetal (aorta gónada mesonefros), saco vitelino, o hígado como fuente de células progenitoras (Muller et al. 1994, Immunity 1:291-301; Wang et al. 1997, EMBO J., 16:4374-4383). Se realizaron los cultivos tal como se describe en Wang et al. con cultivos que usan eritropoyetina sola o eritropoyetina, IL-1, IL-3, y G-CSF. Los tres tejidos (AGM fetal, saco vitelino e hígado) dieron origen a números equivalentes de colonias eritroides y mieloides a partir de muestras +/+ y -/-, lo que indica que se encuentran células madre hemotopoyéticas pluripotentes en las tres ubicaciones. Aunque los hígados fetales -/- son gravemente hiploplásicos, algunas células madre hematopoyéticas migran allí y tienen el potencial para dar origen a todos los linajes hematopoyéticos, tal como también se observa en preparaciones de citospina de hígado fetal. Dado que las células progenitoras comprometidas hematopoyéticas XBP-1 -/- pudieron proliferar y diferenciarse normalmente cuando se sometieron a prueba in vitro, la anemia observada en estos embriones no puede atribuirse a un defecto autónomo de células hematopoyéticas. Estos hallazgos se refuerzan por un análisis de ratones quiméricos derivados a partir de células madre embrionarias con deficiencia de XBP-1 en el sistema de complementación con deficiencia de RAG-2 (descrito adicionalmente en el ejemplo 2). En estos animales, los hígados eran casi exclusivamente de origen de células con deficiencia de RAG-2, aunque se produjo la reconstitución de elementos hematopoyéticos tales como linfocitos B y T a partir de precursores con deficiencia de XBP-1. Por tanto, aunque las células madre embrionarias con deficiencia de XBP-1 no contribuyen al desarrollo normal del hígado, no son defectuosas en la reconstitución de elementos hemaotopoyéticos.
Expresión de XBP-1 en el hígado en desarrollo de ratones de tipo natural
El hígado fetal comienza su desarrollo como una evaginación del endodermo del intestino anterior (Gualdi et al. 1996, Genes Dev. 10:1670-1682). En E10.5, se encontró que el brote hepático de ratones de tipo natural expresa niveles altos de ARNm de XBP-1 mediante hibridación in situ. Para la hibridación in situ, se seccionaron embriones de tipo natural y se analizaron con sonda para determinar XBP-1 tal como se describe (Clauss et al. 1993, Dev. Dynamics 197:146-156). Ya que E10.5 representa un punto de tiempo antes de una población significativa del hígado por células hematopoyéticas, demuestra que XBP-1 se expresa en células parenquimales hepáticas. La inmunotransferencia de tipo Northern de ARN también mostró altos niveles de ARNm de XBP-1 en líneas celulares del estroma hepáticas y en células de hepatocarcinoma HepG2. Esta evidencia apoya adicionalmente un papel para XBP-1 en el crecimiento del hígado más que en la división y diferenciación de células hematopoyéticas.
Tasa de crecimiento reducida y apoptosis aumentada en hígados con deficiencia de XBP-1
Se identificaron dos mecanismos que explican los hígados gravemente hipoplásicos en embriones XBP-1: tasa de crecimiento reducida y apoptosis aumentada. Para demostrar directamente el crecimiento celular reducido, se inyectó BrdU a ratones el día 13,5 de embarazo, y se recogieron los fetos y se analizaron para determinar la incorporación de BrdU. Se inyectaron por vía i.v. a ratones preñadas 0,3 ml de BrdU 50 mg/ml (Sigma) en PBS. Se recogieron los embriones después de 1 hora y se fijaron en fijador de Carnoy. Tras incrustarse en parafina, se realizó la detección de BrdU siguiendo las instrucciones del kit de marcación de BrdU (Roche). Los hígados fetales de tipo natural mostraron tinción nuclear fuerte en todo el hígado, mientras que muestras con deficiencia de XBP-1 tuvieron menor tinción con zonas significativas que permanecieron sin teñir, especialmente hacia el centro del hígado. La incorporación de BrdU reducida en hígados XBP-1 -/- demuestra directamente una tasa por debajo de la normal de crecimiento en este órgano.
Se identificó la apoptosis morfológicamente y mediante tinción TUNEL de hígados fetales E13.5. Se realizó el ensayo TUNEL usando el kit de muerte celular (Roche). Estos experimentos mostraron una tasa marcadamente elevada de hepatocitos apoptóticos en muestras XBP-1 -/-. Por el contrario, las células apoptóticas identificadas en +/+ eran generalmente de linaje mieloide. Se usó la tinción con cloroacetato esterasa para confirmar que los hepatocitos, y no las células de linaje mieloide, representaban la mayoría de las células apoptóticas en muestras de hígado -/-.
Inducción de XBP-1 tras hepatectomia parcial
Para estudiar adicionalmente el papel de XBP-1 en el crecimiento del hígado y la inducción de genes, se realizaron hepatectomias parciales en ratones adultos normales. En este modelo, lo que queda de hígado vuelve hasta un fenotipo casi fetal y experimenta división celular rápida para reestablecer el peso original del órgano en 10 días (Michalopoulos y DeFrances 1997, Science 276:60-66). Entre las primeras etapas de este proceso está la activación de factores de transcripción previamente formados tales como NF-\kappaB o STAT3 (Taub 1996, FASEB J. 10:413-427). Después estos factores inducen la transcripción de genes tempranos inmediatos, muchos de los cuales codifican para factores de transcripción tales como AP-1, NF-\kappaB, y ciertos miembros de la familia CREB/ATF tales como CREB y CREM (Servillo et al. 1998, Genes Dev. 12:3639-3643; Taub 1996, FASEB J. 10:413-427).
Se eliminaron los lóbulos izquierdo y caudado del hígado de ratones adultos de tipo natural. Se recogió el tejido de hígado restante en un perfil temporal para el aislamiento de ARN total. Se analizaron con sondas inmunotransferencias tipo Northern con ADNc para XBP-1, C/EBPb, y el gen de \beta2M de control. Los resultados de las hepatectomias parciales en ratones ahora demuestran que XBP-1 es un gen temprano inmediato en este proceso, inducido en el plazo de 30 minutos desde la cirugía pero que tiene un pico prolongado de inducción pasadas 16 horas. Este perfil temporal es similar a la inducción de C/EBP\beta, que alcanza un pico ligeramente más temprano a las 14 horas tras la hematectomia. Se espera que XBP-1 actúe como un homodímero o heterodímero para unirse a sitios del tipo CRE y a su vez regule por incremento los genes tempranos retrasados implicados en la regeneración del hígado. La proliferación de células hepáticas disminuida observada en embriones XBP-1 -/- indica que XBP-1, como CREB y CREM, es un factor de transcripción que se une a CRE implicado en la proliferación hepática.
Identificación de genes diana de XBP-1 en el hígado
Para identificar genes diana para la acción de XBP-1 en el hígado, se comparó la hibridación diferencial con chips de micromatriz en muestras derivadas de hígados de E13.5 +/+ ó -/-. Se aisló ARN de hígados de E13.5 +/+ y -/- mediante lisis en guanidina y centrifugación a través de un colchón de CsCl. Se convirtieron diez \mug de ARN total en ADNc de cadena doble usando un cebador oligo dT con un sitio de ARN polimerasa de T7 en su extremo 5' (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-3') (SEQ ID NO: 1). Se usó el ADNc directamente en una reacción de transcripción in vitro en presencia de nucleótidos biotinilados Bio-11-UTP y Bio-11-CTP (Enzo, Farmingdale, NY). Para mejorar la cinética de hibridación, se fragmentó el ARN antisentido marcado incubándolo a 94ºC durante 35 min en MgOAc 30 mM, KOAc 100 mM. La hibridación con Genechips™ (Affymetrix, San José, CA) que presentan sondas para 250 genes de interés inmunológico o 250 genes con papeles en el desarrollo se realizó a 40ºC durante la noche en una mezcla que incluía 10 \mug de ARN fragmentado, 6X SSPE, Triton-X-100 al 0,005%, y ADN de esperma de arenque 100 mg/ml en un volumen total de 200 \mul. Se lavaron los chips, se tiñeron con ficoeritrina-estreptavidina, y se leyó usando un analizador GeneChip de Affymetrix y software de expresión génica adjunto. El software incluye algoritmos que determinan si un gen está ausente o presente y si el nivel de expresión de un gen en la muestra -/- está significativamente aumentado o disminuido con respecto a la muestra +/+.
Se encontró que los genes para \alpha1-antitripsina y \alpha-fetoproteína se expresaban a niveles significativamente reducidos en muestras -/-, tal como también se observaba en inmunotransferencias tipo Northern de ARNm de hígado fetal +/+ y -/-. Ambos productos génicos son proteínas de fase aguda sintetizadas mediante hepatocitos y se expresan durante el desarrollo así como en hígado adulto. También se encontró que otras dos proteínas de fase aguda, transtiretina y apolipoproteína Al tenían niveles disminuidos de ARNm en hígados -/-, mientras que varias otras proteínas de fase aguda y genes expresados por hepatocitos (proteína de unión a vitamina D, proteína sensible a C, P amiloide sérica, glucoproteína \alpha1-ácida, factor de crecimiento de hepatocitos) se expresaban por igual en muestras +/+ y -/-. Esto indica que los hepatocitos con deficiencia de XBP-1 tienen defectos en la síntesis de productos génicos específicos en vez de una reducción global en la transcripción.
Para demostrar la regulación directa del promotor de \alpha1-antitripsina por XBP-1, se realizaron transfecciones transitorias usando un plásmido de expresión de XBP-1 y constructos indicadores de \alpha1-antitripsina luciferasa en la línea celular HepG2. Aunque esta línea celular contiene XBP-1 endógeno, la sobreexpresión de XBP-1 puede transactivar el promotor de \alpha1-antitripsina 3,5 veces. Como controles para determinar la especificidad del efecto de XBP-1, el uso de un constructo de expresión de XBP-1 con desplazamiento de marco o la mutación de un sitio diana de XBP-1 en el promotor de \alpha1-antitripsina eliminó toda la transactivación. También se demostró in vitro la transactivación de un constructo indicador de \alpha-fetoproteína mediante el plásmido de expresión de XBP-1. Por tanto, XBP-1 tiene un efecto transcripcional específico sobre estos dos genes de proteína de fase aguda.
El fenotipo de embriones con deficiencia de XBP-1 muestra similitudes con diversos modelos de ratón en los que la alteración génica da como resultado el desarrollo de hígado anómalo. La alteración del gen de secuencia homeótica Hlx dio como resultado la especificación de hígado inicial pero sólo crecimiento mínimo y representa un defecto más temprano, más grave que la deficiencia de XBP-1 (Hentsch et al. 1996, Genes Dev. 10:70-79). Se ha descrito el crecimiento de hígado anómalo en embriones con deficiencia de HGF/SF con un fenotipo similar a los embriones XBP-1 -/-: estructura del hígado relajada, espacios sinusoidales ampliados, y disociación de células parenquimales (Schmidt et al. 1995, Nature 373:699-702; Uehara et al. 1995, Nature 373:702-705). Sin embargo, los niveles de ARNm de HGF son normales en embriones XBP-1 -/-. La deficiencia de MTF-1 dio como resultado un compartimiento epitelial hepático disociado, sinusoides ampliados, pero al contrario que los embriones XBP-1 -/-, sin descenso significativo del tamaño del hígado y sin anemia (Gunes et al. 1998, EMBO J. 17:2846-2854). La deficiencia de c-jun también dio como resultado hipoplasia y disociación de células hepáticas y muerte antes de E15.5, pero los niveles de ARNm de c-jun eran normales en embriones XBP-1 -/-. Un hígado pequeño puede ser el resultado de proliferación de células hematopoyéticas anómala, tal como se describe en embriones con deficiencia de c-myb (Mucenski et al. 1991, Cell 65:677-689), o diferenciación y proliferación de células eritroides anómala, tal como se observa en embriones Rb -/- (Lee et al. 1992, Nature 359:288-294; Jacks et al. 1992, Nature 359:295-300). Por el contrario, se encontró función proliferativa y de diferenciación in vitro normal de células progenitoras hematopoyéticas XBP-1 -/-. El retorno dirigido de células hematopoyéticas al hígado fue el defecto supuesto en ausencia de integrina \beta1 (Hirsch et al. 1996, Nature 380:171-175; Faessler et al. 1995, Genes Dev. 9:1896-1908), pero los hígados XBP-1 -/- mostraron potencial hematopoyético normal por célula. Finalmente, la apoptosis contribuyó a la insuficiencia hepática en embriones Rb -/-, RelA -/- (Beg et al. 1995, Nature 376:167-170), y HGF/SF -/- (Schmidt et al. 1995, Nature 373:699-702; Uehara et al. 1995, Nature 373:702-705), tal como también se observó en embriones XBP-1-/-. Se desconoce que XBP-1 actúe directamente en sentido 5' de estos factores múltiples que son importantes en la hepatogénesis normal pero en su lugar contribuye a una función única del crecimiento y desarrollo del hígado. Es posible que las células parenquimales hepáticas XBP-1 -/- sean defectuosas en su capacidad para apoyar la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas. El análisis de ARNm no ha identificado niveles alterados de integrina \beta1, HGF, c-myb, ligando c-kit, AML-1, Rb, o c-jun en embriones XBP-1 -/-, haciendo poco probable que estos genes sean dianas principales de regulación por XBP-1 durante el desarrollo del hígado.
En vez de eso, nuestros datos han identificado cuatro genes de proteínas en fase aguda expresados en hepatocitos durante el crecimiento del hígado como dianas específicas de XBP-1. La inducción de proteínas en fase aguda representa la activación de genes específica del hígado, ya sea durante el desarrollo embrionario o en adultos tras una lesión de hepatectomía parcial, inflamación, infección, toxinas o cáncer. El papel sistémico de algunas proteínas en fase aguda se ha definido en detalle, tal como la inhibición de la proteasa sérica por \alpha1-antitripsina o las propiedades antiaterogénicas de la apolipoproteína-A1 (Andersson 1997, Curr. Opin. Lipidol.8:225-228; Gabay y Kushner 1999, New Engl. J. Med. 340:448-454). Una reducción en los niveles de estas proteínas en fase aguda refleja una disminución en la síntesis de proteínas de hepatocitos específica, pero individualmente, no se sabe si la deficiencia de estos genes da como resultado los defectos observados en hígados con deficiencia de XBP-1. La proteína en fase aguda regulada por XBP-1 AFP se expresa sumamente en el hígado fetal y saco vitelino y representa uno de los marcadores fenotípicos más tempranos del hígado fetal (Gualdi et al. 1996, Genes Dev. 10: 1670-1682). Se ha especulado que una función principal de AFP es promover el crecimiento celular en el hígado, posiblemente secuestrando estrógeno, lo que de otro modo tiene efectos antiproliferativos (revisado por Chen et al.1997, Crit. Rev. Euk Gene. Exp. 7:11-41). Los niveles de AFP son muy bajos en el hígado adulto, pero aumentan con la regeneración del hígado y en la mayoría de los carcinomas hepatocelulares. De hecho, AFP estaba entre los primeros marcadores tumorales que se reconocieron. Se ha demostrado que en ausencia de XBP-1, AFP sólo se expresa en niveles reducidos, y que el crecimiento del hígado se ve gravemente afectado. Los datos establecen que XBP-1 está implicada en el crecimiento y supervivencia de hepatocitos, y mediante su regulación de genes de proteína en fase aguda, también en la expresión de genes específicos del hígado. Estos estudios han demostrado que XBP-1 controla directamente un subconjunto de la actividad sintética de proteínas del hígado, y que no puede lograrse el crecimiento normal del hígado en ausencia de proteína XBP-1.
Ejemplo 2 Caracterización del fenotipo de células plasmáticas de ratones con deficiencia de XBP-1 Generación de ratones quiméricos con deficiencia de XBP-1/deficiencia de RAG-2
La deficiencia de XBP-1 provoca la muerte por anemia e hipoplasia del hígado de manera intrauterina (véase el ejemplo 1). Por tanto, se realizaron estudios de la función inmunitaria en el entorno de la deficiencia de XBP-1 en el sistema de complementación de RAG-2. En primer lugar, se interrumpió el segundo alelo de XBP-1 mediante recombinación homóloga de células madre embrionarias con un alelo de XBP-1 previamente interrumpido. El constructo delecionó partes de los exones 1 y 2, así como su intrón intermedio, y sustituyó una secuencia de resistencia a la higromicina. Se transfectaron las células ES, con un alelo de XBP-1 previamente alterado por el gen de la neomicina, con el nuevo constructo y se seleccionaron en higromicina, neomicina y ganciclovir. Se examinaron los clones supervivientes mediante inmunotransferencia de tipo Southern para determinar la presencia de 2 alelos de XBP-1 alterados y la pérdida del alelo de tipo natural. Se inyectaron los clones de ES apropiados en blastocitos con deficiencia de RAG-2 y se implantaron en ratones hembra pseudopreñadas mediante métodos habituales. Se sometieron a ensayo los ratones resultantes para determinar la reconstitución linfoide mediante análisis FACS de células mononucleares de sangre periférica usando anticuerpos anti-CD3 y anti-B220.
Tras la inyección en blastocitos con deficiencia de RAG-2, las células con deficiencia de XBP-1 contribuyeron a la reconstitución de linfocitos B y T de sangre periférica en aproximadamente la mitad de los ratones nacidos. En estos animales reconstituidos, las células ES con deficiencia de XBP-1 contribuyeron enormemente a los órganos linfoides, de manera variable al corazón, pulmón, riñón y músculos, pero mínimamente al hígado, de acuerdo con el papel esencial de XBP-1 en el desarrollo de hepatocitos observado en embriones XBP-1 -/-.
La reconstitución de ganglios linfáticos y el bazo en animales XBP-1/RAG-2 -/- dio como resultado números y porcentajes normales de linfocitos B y T en la mayoría de los animales quiméricos comparado con ratones control 129 de tipo natural. Además, los linfocitos B de ratones de tipo natural y XBP-1/RAG-2 tenían patrones indistinguibles de tinción de superficie celular para IgM, IgD y B220.
Producción de inmunoglobulinas séricas deficiente por células B XBP-1 -/-
Para evaluar una función principal de los linfocitos B, se sometieron a ensayo los niveles de inmunoglobulinas mediante ELISA en el suero de ratones XBP-1/RAG-2 -/- y ratones 129 Sv/ImJ control. Todos los animales se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos. Se realizaron ensayos de ELISA de los niveles de inmunoglobulinas en el suero usando técnicas habituales. El hallazgo fue que los animales XBP-1/RAG-2 -/- tenían una profunda disminución de los niveles de inmunoglobulinas séricas para todos los subtipos de Ig sometidos a prueba, con una pequeña cantidad de IgG2a detectada en algunos de los ratones. Para someter a prueba el potencial de las células B con deficiencia de XBP-1 para la producción de Ig tras la estimulación in vitro, se sembraron en placas células B purificadas o esplenocitos (selección en perlas magnéticas B220+, Miltenyi Biotech) a 1 x 10^{6} células/ml y se estimularon con anticuerpo anti-CD40 (1 mg/ml), anti-CD40 más IL-4 (10 ng/ml), LPS (20 mg/ml), o LPS más IL-4 durante cuatro días. Cuando se determinaron los niveles de inmunoglobulinas en los sobrenadantes de cultivo (mediante ELISA, usando métodos habituales), todos los subtipos de Ig sometidos a prueba se encontraron de nuevo a niveles inferiores en las muestras de XBP-1 -/- comparado con las muestras de control. Finalmente, se evaluó la producción específica de antígenos de inmunoglobulina tras la inmunización de ratones con DNP-albúmina, recolección de células B, y estimulación in vitro de células B con DNP-KLH. La producción de inmunoglobulinas específicas de antígeno por células B XBP-1 -/- disminuyó gravemente en este ensayo. Los hallazgos indican que aunque las células B con deficiencia de XBP-1 pueden generarse en números normales, son defectuosas para convertirse en células plasmáticas segregadoras de anticuerpos.
Fenotipo in vitro de células B con deficiencia de XBP-1
Habiendo identificado números normales de células B en el bazo y ganglios linfáticos, aunque con diferenciación terminal de células B funcionalmente defectuosa en ratones XBP-1/RAG-2 -/-, se investigó in vitro el fenotipo de la activación de células B. Se estimularon las células B in vitro con anticuerpo anti-CD40 (1 \mug/ml), anti-CD40 más IL-4 (10 ng/ml), LPS (20 \mug/ml), o LPS más IL-4 durante hasta cuatro días. La proliferación celular fue la misma en las muestras con deficiencia de XBP-1 y control, según se evaluó mediante recuentos de células equivalentes los días 1 y 4 tras el cultivo. Además, se activaron las poblaciones de células B de manera similar, según se evaluó mediante el análisis de marcadores de superficie celular clase II de MHC y CD69. Los estímulos in vitro también se diseñaron para inducir recombinación de cambio de clase en células B, por ejemplo, cambio a IgG2a e IgE mediante IL-4, y cambio a IgG mediante anti-CD40 solo. La recombinación de cambio de clase fue equivalente en muestras de XBP-1 -/- y control, según se evaluó mediante análisis de FACS de la inmunoglobulina de superficie celular y mediante niveles de ARNm de Ig recombinada.
También se estudió el perfil de citocinas de células B cultivadas in vitro. La producción de IL-6 por células B XBP-1 -/- mostró una disminución media del 51%, comparado con las células B de tipo natural, tras la estimulación con LPS (50 \mug/ml) y el 46%, comparado con células B de tipo natural, tras la estimulación con LPS e IL-4 (10 ng/ml). Sin embargo, no se observó ninguna disminución en la producción de IL-6 tras el tratamiento con anti-CD40 (10 \mug/ml) o anti-CD40 más IL-4. Además, en dos experimentos, la producción de IL-10 por células B XBP-1 -/- fue la misma que en las células de tipo natural independientemente del estímulo (LPS, LPS + IL-4, anti-CD40 o anti-CD40 + IL-4). Por tanto, las células B con deficiencia de XBP-1 están presentes en números normales y pueden activarse in vitro para experimentar proliferación, expresión de marcador de activación de superficie celular, recombinaciones de cambio de clase, y secreción de citocinas a niveles próximos a los normales. Por tanto, otros mecanismos deben representar la producción afectada de inmunoglobulinas por las células B XBP-1 -/-.
Generación de células plasmáticas disminuida en ausencia de XBP-1
Para evaluar si las células B con deficiencia de XBP-1 responden a estímulos de activación in vivo, se inmunizaron ratones con DNP-albúmina y se extirparon ganglios linfáticos de drenaje tras 9 días. Los análisis histológicos demostraron una formación de centro germinal normal en animales XBP-1/RAG-2 -/-. Esto indica que muchas de las funciones sometidas a ensayo in vitro, tales como proliferación celular, activación, y recombinación de cambio de clase, también estaban intactas in vivo.
Sin embargo, la generación de células plasmáticas se vio gravemente alterada en animales XBP-1/RAG-2 -/-. Las secciones del yeyuno de ratones XBP-1/RAG-2 -/- frente a control mostraron 70 veces más células plasmáticas en los controles. Además, se observó que las pocas células plasmáticas observadas en animales XBP-1/RAG-2 -/- carecían generalmente del halo perinuclear, lo que indica que estas células no tienen un gran aparato de Golgi y era probable que no secretasen grandes cantidades de inmunoglobulinas.
Una prueba adicional de la generación de células plasmáticas fue un ensayo para determinar células positivas para Syndecan-1 en ratones inmunizados con DNP-albúmina. Syndecan-1 es una glucoproteína de superficie celular regulada por incremento sobre células plasmáticas terminalmente diferenciadas pero ausente sobre células B maduras. Tal como se prevé por el bajo nivel de producción de inmunoglobulinas, las muestras XBP-1 -/- no condujeron a la producción de cantidades significativas de células positivas para Syndecan-1, mientras que se detectaron fácilmente en el control de tipo natural. Además, no sólo se encontró que los cultivos de células B XBP-1 -/- estimuladas in vitro segregaban menos inmunoglobulinas que los controles, sino que también estaban menos diferenciadas según se evaluó mediante técnicas moleculares. Se examinaron con sondas inmunotransferencias tipo Northern de ARNm de células B de tipo natural y XBP-1 -/- estimuladas durante 4 días in vitro para determinar la expresión de cadena J, que se requiere para el montaje de IgM e IgA en células plasmáticas, así como para determinar c-myc, que se regula por disminución a medida que las células B salen del ciclo celular para diferenciarse terminalmente. Se aisló ARN total usando TriZol (Gibco) según recomendaciones del fabricante. Las células B XBP-1 -/- tenían menos fenotipo maduro que las células B de control, lo que muestra cantidades menores de ARNm de cadena J y niveles superiores de ARNm de c-myc. Por tanto, los animales XBP-1/RAG-2 -/- presentan un defecto grave en su número de células plasmáticas terminalmente diferenciadas.
Expresión de XBP-1 en células plasmáticas en sinovio reumatoide
XBP-1 se expresa de manera omnipresente en tejidos adultos y trabajos anteriores han demostrado que dos de las cuatro líneas de células plasmáticas sometidas a prueba tienen niveles extremadamente altos de ARNm de XBP-1. La enfermedad artritis reumatoide ofreció una fuente de material clínico para estudiar la expresión de XBP-1 en un estado caracterizado por infiltrados celulares inflamatorios y producción de factor reumatoide por células plasmáticas. Utilizando la hibridación in situ (que se realizó usando sondas específicas de XBP-1 para las partes no traducidas en 5' y 3' del ADNc), una sonda antisentido para XBP-1 mostró una fuerte hibridación con células plasmáticas en sinovio reumatoide, mientras que una sonda sentido no mostró hibridación específica. Secciones en serie confirmaron de manera histológica la identificación de las células plasmáticas. Este ejemplo muestra el alto nivel de expresión de XBP-1 en el infiltrado de células plasmáticas de una enfermedad inflamatoria.
XBP-1 dirige la diferenciación de células B
El hallazgo de muy pocas células plasmáticas en ratones XBP-1/RAG-2 -/- a pesar de los centros germinales aparentemente normales ubica el sitio primario de la acción de XBP-1 en el intervalo entre la activación de células B completa y la diferenciación terminal. La línea de células BCLI-3B3 es una línea de células B sumamente activadas que puede dirigirse hasta una fase de célula plasmática temprana por tratamiento con IL-2 más IL-5. La línea de células BCLI-3B3 se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo y se hizo crecer según el protocolo suministrado. Se transfectó un constructo de expresión que contenía XBP-1 y proteína verde fluorescente (GFP) dentro de esta línea celular para estudiar su capacidad para afectar a la fase de diferenciación. La transfección se realizó mediante electroporación a 290 V, 275 mF en un electroporador BioRad. Mediante análisis de FACS, las células que sobreexpresaban XBP-1 pero no el vector GFP solo mostraron signos de maduración adicional: una disminución en los niveles de CD44 y la aparición de células positivas para Syndecan-1. De manera interesante, se ha descrito un efecto idéntico para la transfección del factor de transcripción Blimp-1 en células BCL1-3B3. Sin embargo, las inmunotransferencias de tipo Northern de células activadas a partir de fuentes normales y XBP-1/RAG-2 -/- no mostraron diferencia en los niveles de ARNm de Blimp-1. Por tanto, XBP-1 actúa en sentido 3' de Blimp-1 o mediante una ruta separada en su regulación de la diferenciación de células B.
Una segunda acción de Blimp-1 sobreexpresado es provocar la apoptosis de células B que son inmaduras o no están totalmente activadas. Para examinar si la sobreexpresión de XBP-1 podría provocar la apoptosis de células B, se transfectó un constructo de expresión de XBP-1 en la línea de células B maduras Bal17. Se demostró un hallazgo, similar al observado con Blimp-1, en la línea Bal17 tras la transfección de aumentar las cantidades de constructo de expresión de XBP-1. La transfección de Bal17 se realizó mediante electroporación a 290 V, 275 \muF en un electroporador BioRad. La línea de células Bal17 se hizo crecer en medio RPMI con suero de ternero fetal al 10%, glutamina 2 mM, penicilina 50 UI/ml, estreptomicina 50 \mug/ml, beta-mercaptoetanol 100 \mul. Se observó hasta el 12% de apoptosis cuando se añadieron las mayores cantidades de XBP-1.
Ejemplo 3 Preparación de anticuerpos monoclonales anti-XBP-1
Para preparar anticuerpos monoclonales frente a XBP-1, se clonaron las posiciones codificantes 226-884 de ADNc de XBP-1 en el vector pQR9, que codifica para una etiqueta de histidina que se fusiona en el marco a las secuencias que codifican para XBP-1 al introducir el ADNc en el vector. Se expresó la proteína XBP-1 marcada con His y se usó para inmunizar ratones y se prepararon anticuerpos monoclonales a partir de linfocitos de los ratones inmunizados mediante técnicas habituales.
Ejemplo 4 Caracterización del fenotipo de células T cooperadoras de ratones con deficiencia de XBP-1
Se estudió la producción de citocinas por células T de ratones quiméricos con deficiencia de XBP-1/deficiencia de RAG-2 para examinar el efecto de la deficiencia de XBP-1 sobre subconjuntos de células T cooperadoras. Se aislaron las células T de ratones con deficiencia de XBP-1/deficiencia de RAG-2 (XBP-rag) y de ratones de tipo natural de la cepa 129 (129w+) como controles. Se cultivaron las células in vitro en condiciones que favorecían o bien la diferenciación de Th1 o bien la diferenciación de Th2, o que no favorecían el desarrollo de ningún tipo de células cooperadoras (condiciones sin sesgo). Para inducir la diferenciación de Th1, se cultivaron las células con IL-2 recombinante 5 ng/ml y anticuerpo anti-IL-4 10 \mug/ml. Para inducir la diferenciación de Th2, se cultivaron las células con IL-4 recombinante 10 ng/ml, anticuerpo anti-IFN-\gamma 10 \mug/ml y anticuerpo anti-IL-2 10 \mug/ml. Se midió la producción de las siguientes citocinas por las diferentes poblaciones celulares mediante ELISA: IL-4, IFN-\gamma, IL-10, IL-5 e IL-6. Se muestran gráficos de barras que ilustran los resultados de dos conjuntos diferentes de animales en la figura 2 (IL-4), figura 3 (IFN-\gamma), figura 4 (IL-10), figura 5 (IL-5) y figura 6 (IL-6).
Los resultados demuestran que para las citocinas de tipo Th2 examinadas (IL-4, IL-10, IL-5 e IL-6), las células T de ratones con deficiencia de XBP-1 presentaron un defecto en la capacidad para producir estas citocinas cuando se cultivaron las células en condiciones sin sesgo (véanse las figuras 2, 4, 5 y 6, columnas de la izquierda). En cambio, las células T de ratones con deficiencia de XBP-1 todavía conservaban la capacidad para producir la citocina de tipo Th1 IFN-\gamma cuando se cultivaban en condiciones sin sesgo (véase la figura 3, columnas de la izquierda), así como en condiciones que favorecían el desarrollo de células Th1 (véase la figura 3, columnas del medio). El defecto en la producción de citocinas Th2 por las células T con deficiencia de XBP-1 se superó cultivando las células T en condiciones que favorecían el desarrollo de células Th2 (véanse las figuras 2, 4, 5 y 6, columnas de la derecha). Estos datos indican que la carencia del factor de transcripción XBP-1 conduce a un defecto en la producción de citocinas Th2 que puede superarse por factores exógenos que sesgan el desarrollo de células T junto con la ruta de Th2.
Equivalentes
Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar usando únicamente la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en el presente documento. Se pretende que las siguientes reivindicaciones abarquen tales equivalentes.
<110> Glimcher, Laurie H.
\hskip1cm
Reimold, Andreas M. 
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<120> MÉTODOS Y COMPOSICIONES REFERENTES A LA MODULACIÓN DEL CRECIMIENTO DE HEPATOCITOS, DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS PLASMÁTICAS O ACTIVIDAD DEL SUBCONJUNTO DE CÉLULAS T MEDIANTE MODULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE XBP-1
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 144452000240
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<140>
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<141>
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<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcgg 
\hfill
39

Claims (10)

1. Método de identificación de un compuesto que modula la actividad de células Th2, que comprende:
a) proporcionar una composición indicadora que comprende proteína XBP-1;
b) poner en contacto la composición indicadora con cada miembro de una biblioteca de compuestos de prueba;
c) seleccionar de la biblioteca de compuestos de prueba un compuesto de interés que modula la actividad de la proteína XBP-1; y
d) determinar el efecto del compuesto de interés sobre la actividad de células Th2 para así identificar un compuesto que modula la actividad de células Th2.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la composición indicadora es una célula que expresa la proteína XBP-1.
3. Método según la reivindicación 2, en el que la célula se ha diseñado mediante ingeniería para expresar la proteína XBP-1 introduciendo en la célula un vector de expresión que codifica para la proteína XBP-1.
4. Método según la reivindicación 1, en el que la composición indicadora es una composición libre de células.
5. Método según la reivindicación 1, en el que la composición indicadora es una célula que expresa una proteína XBP-1 y una molécula diana, y se monitoriza la capacidad del compuesto de prueba para modular la interacción de la proteína XBP-1 con una molécula diana.
6. Método según la reivindicación 1, en el que la composición indicadora comprende una célula indicadora, en el que la célula indicadora comprende una proteína XBP-1 y un gen indicador sensible a la proteína XBP-1.
7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha célula indicadora contiene: un vector de expresión recombinante que codifica para la proteína XBP-1; y un vector que comprende un elemento regulador sensible a XBP-1 operativamente unido a un gen indicador; y dicho método comprende:
a) poner en contacto la célula indicadora con un compuesto de prueba;
b) determinar el nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba; y
c) comparar el nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba con el nivel de expresión del gen indicador en la célula indicadora en ausencia del compuesto de prueba para así seleccionar un compuesto de interés que modula la actividad de proteína XBP-1.
8. Método según la reivindicación 6, en el que el elemento sensible a XBP-1 se selecciona del grupo que consiste en \alpha-1-antitripsina, \alpha-fetoproteína, HLA DR\alpha, y el potenciador de repetición de 21 pares de bases de HTLV-1 LTR.
9. Método según la reivindicación 1, en el que la actividad de células Th2 se determina midiendo la producción de citocinas de células Th2.
10. Método según la reivindicación 9, en el que la citocina de células Th2 se selecciona del grupo que consiste en IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10.
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