MXPA02006433A - Metodos y composiciones que se refieren a la modulacion del crecimiento de hepatocitos, diferenciacion de celulas plasmaticas o actividad de subgrupos de celulas t mediante la modulacion de la actividad de xbp-1. - Google Patents

Metodos y composiciones que se refieren a la modulacion del crecimiento de hepatocitos, diferenciacion de celulas plasmaticas o actividad de subgrupos de celulas t mediante la modulacion de la actividad de xbp-1.

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Abstract

La invencion demuestra que el factor de transcripcion XBP-1 es un regulador de crecimiento de hepatocitos, de la diferenciacion de celulas plasmaticas y de la actividad de subgrupos de celulas T. Se proporcionan metodos para identificar moduladores de crecimiento de hepatocitos, diferenciacion de celulas plasmaticas y/o actividad de subgrupos de celulas T, empleando composiciones indicadoras que contiene XBP-1 o celulas deficientes en XBP-1. Se proporcionan tambien metodos para modular el crecimiento de hepatocitos, diferenciacion de celulas plasmaticas y/o actividad de subgrupos de celulas T (por ejemplo, produccion de citocinas Th2) utilizando agentes que modulan la actividad de XBP-1. Metodos para diagnosticar trastornos asociados con un crecimiento aberrante de hepatocitos, diferenciacion aberrante de celulas plasmaticas y/o actividad aberrante de subgrupos de celulas T, mediante la evaluacion de un cambio en la expresion de XBP-1, se proporcionan tambien. La invencion ofrece tambien celulas, animales y embriones deficientes en XBP-1 asi como kits para los metodos de la invencion.

Description

.
PIASMÁTICAS O ACTIVIDAD DE SUBGRUPOS DE CÉLULAS T MEDIANTE LA MODULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE XBP-1 APOYO ECONÓMICO DEL GOBIERNO El trabajo descrito aqui fue apoyado, por lo menos en parte, a través de las aportaciones AR43661 y A132412 otorgadas por los National Institutes of Health [Institutos Nacionales de la Salud] . El gobierno norteamericano por consiguiente puede tener ciertos derechos sobre esta invención. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Miembros de la familia CREB/ATF de factores de transcripción forman dimeros y se unen a elementos de respuesta de AMP cíclicos encontrados en un gran número de promotores celulares. La diversidad de genes regulados por este gran grupo de factores de transcripción es reflejada en las funciones esenciales de factores individuales en la supervivencia fetal, desarrollo neurológico, crecimiento óseo asi como activación del sistema inmune (Rudolph y colaboradores 1998, Porc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4481-4486; Reimold y colaboradores 1996, Nature, 379:262-265; Mae awa y colaboradores 1999, J. Biol Chem. 274:17813-17819). Recientemente, una función importante en la coordinación de la sincronización de la proliferación de hepatocitos en la regeneración del higado fue demostrada para el miembro de hfa^_e_fc__^_ _^______ __2J__ _^ familia CREB/ATF CREM (Servillo y colaboradores 1998, Genes Dev. 12:3639-3643). Además se encontró que el factor de transcripción ATF-3 era inducido en la regeneración hepática con las caracteristicas cinéticas de un gen de respuesta S temprana {Chen y colaboradores 1996, Mo. Cell.Biol 16:1157- ;¿¿68). . £&s funciones de un miembro adicional de familia CREB/ATF XBP-1, no han sido definidas con detalles. Este factor de transcripción es expresado de manera generalizada en adultos 10 pero se encuentra principalmente en glándulas exocrinas y precursores óseos en el ratón embriónico (Liou y colaboradores 1990, Science 247:1581-1584; Clauss y colaboradores 1993, Dev. Dynamics 197:146-156). Estudios In • vitro han demostrado la regulación descendente del gen XBP-1 15 por BSAP, dimerización de proteina de XBP-1 con c-Fos, y una disminución de la expresión de gen II de clase MHC cuando se introducen secuencias de XBP-1 de antisentido en células Raji (Rei old y colaboradores 1996, J. Exp. Med., 183:393-401; Ono y colaboradores 1991, Proc Natl. Acad. Sci. USA 88:4309- 20 4312) . Recientemente se encontró que la expresión de XBP-1 se • elevaba dramáticamente en carcinoma hepatocelulares (Kishimoto y colaboradores 1998, Cell Growth Dic. 9:337-344), aún cuando no se estableció si esta regulación ascendente desempeñaba una función en el fenotipo maligno, o bien si era 25 un subproducto de dicha regulación ascendente.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Esta invención se enfoca a métodos y composiciones que se relacionan con la modulación del crecimiento de hepatocitos, diferenciación de células plasmáticas y/o subgrupos de c lulas T mediante la modulación de la actividad de XBP-1. Se ha descubierto ahora que el factor de transcripción XBP-1 desempeña una función critica en la regulación del crecimiento de hepatocitos, la diferenciación de células plasmáticas y la actividad de subgrupos de células T. La invención se basa, por lo menos en parte, en la observación que ratones que no presentan XBP-1 tienen un desarrollo severamente afectado de hepatocitos, identificando XBP-1 como un factor de transcripción esencial para el crecimiento de hepatocitos, y, además que ratones que no presentan XBP-1 son severamente afectados en cuanto a generación de células plasmáticas y presentan defectos en la producción de citocinas Th2, identificando XBP-1 como factor de j transcripción esencial para la diferenciación de células plasmáticas e involucrado en la regulación de subgrupos de células T. Según nuestro conocimiento, esto es la primera demostración de una función para XBP-1 en la regulación del crecimiento de hepatocitos, diferenciación de células plasmáticas y subgrupos de células T. La invención ofrece métodos para identificar compuestos que modulan el crecimiento de hepatocitos, diferenciación de '*^' *^'^ximr ?MmM^?*- u>*-** células plasmáticas y/o subgrupos de células T, métodos para modular el crecimiento de hepatocitos, diferenciación de células plasmáticas y/o subgrupos de células T utilizando agentes que modulan la actividad XBP-1 (por ejemplo métodos para extender hepatocitos en cultivo mediante la estimulación líe la actividad de XBP-1 en las células de tal manera que la proliferación de los hepatocitos sea estimulada, métodos para diferenciar células plasmáticas en cultivo mediante la estimulación de actividad de XBP-1 en las células de tal manera que la diferenciación de las células plasmática sea estimulada y/o métodos para modular la producción de citocinas Th2 mediante la modulación de la actividad de XBP- 1) y métodos para diagnosticar trastornos asociados con un crecimiento aberrante de hepatocitos, diferenciación aberrante de células plasmáticas y/o actividad aberrante de subgrupos de células T con base en la evaluación de un cambio en la expresión de XBP-1 (por ejemplo, el nivel de expresión o la forma de XBP-1 expresados) . En un aspecto, la invención se refiere a un método para identificar compuestos que modulan el crecimiento de hepatocitos, diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T. En una modalidad, la invención ofrece un método para identificar un compuesto que modula el crecimiento de hepatocitos, diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T j|fc, i-ti.e1M_-_Jj «__&-»_<___. utilizando una composición indicadora que comprende proteina de XBP-1, en donde un compuesto de prueba que modula la actividad de XBP-1 es seleccionado y después se evalúa el efecto de este compuesto seleccionado sobre el crecimiento de 5 hepatocitos, la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T (por ejemplo producción I de citocina Th2) . En el método, la composición indicadora que comprende XPB-1 está en contacto primero con cada miembro de una biblioteca de compuestos de prueba. El (los) compuesto (s) 10 de prueba que modula (n) la actividad de proteina de XBP-1 se selecciona (n) y se determina la capacidad del (de los) compuesto (s) seleccionado (s) para modular el crecimiento de á^. hepatocitos, diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T (por ejemplo producción 15 de citocinas Th2) . La composición indicadora puede ser, por ejemplo una célula que expresa proteina de XBP-1, una célula que ha sido manipulada para expresar la proteina de XBP-1 mediante la introducción de un vector de expresión que codifica la proteina de XBP-1 en la célula o bien una 20 composición sin células. Alternativamente, la composición indicadora puede ser una composición de células o una composición sin células que incluye una proteina de XBP-1 y una molécula blanco y se monitorea la capacidad del compuesto de prueba para modular la interacción de la proteina XBP-1 25 con una molécula blanco. En otra modalidad, la composición indicadora es una célula indicadora, que comprende una proteina de XBP-1 y un gen reportero que responde a la proteina de XBP-1. El nivel de expresión del gen reportero puede ser utilizado para determinar la capacidad de un 5 compuesto de prueba para modular la actividad de proteina de XBP-1 mediante la producción de una célula indicadora que contiene un vector de expresión recombinante que codifica la I • proteina XBP-1 y un vector que comprende un elemento regulador que responde a XBP-1 enlazado operativamente a un 10 gen reportero. La célula indicadora está en contacto con un compuesto de prueba y se determina el nivel de expresión del gen reportero de la célula indicadora en presencia de compuesto de prueba. Mediante la comparación del nivel de expresión del gen reportero en la célula indicadora en 15 presencia del compuesto de prueba con el nivel de expresión del gen reportero en la célula indicadora en ausencia del compuesto de prueba, se puede determinar un compuesto de interés que modula la actividad de proteina de XBP-1. En otra modalidad del método para identificar compuestos que 20 mqdulan el crecimiento de hepatocitos o diferenciación de • células plasmáticas, un (unos) compuesto (s) de pruebas se pepe (n) en contacto con un hepatocito o precursor de célula I plasmática (célula B) o una célula T deficiente en XBP-1 y se determina el efecto del (de los) compuesto (s) de prueba sobre 25 el crecimiento, diferenciación y/o actividad de la célula, itoi ijfl Üfife-f f?? con el objeto de identificar de esta forma compuestos que modulan el crecimiento de hepatocitos, diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos T a través de edios otros que a través de XBP-1 (es decir, compuestos que pueden ^rescatar*' el fenotipo deficiente en XPB-1) . Por ejemplo, un compuesto que induce el crecimiento de i?epatocitos deficientes en XBP-1 o que induce la diferenciación de células B deficientes en XBP-1 en células plasmáticas o que induce la producción de una(s) Th2 citocina (s) por células T deficientes en XBP-1 puede seleccionarse. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para modular el crecimiento de hepatocitos, diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T mediante la puesta en contacto de hepatocitos, precursores de hepatocitos, células plasmáticas, precursores de células plasmáticas (células B) , células T o precursores de células T con un modulador de la actividad de XBP-1 de tal manera que se module el crecimiento de los hepatocitos, diferenciación de las células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T. En un aspecto, este método modulador se refiere a métodos de expansión de hepatocitos o células plasmáticas in vitro, a través del cultivo de las células con un estimulador de actividad de XBP-1 de tal manera que se estimule el crecimiento de los hepatocitos o la diferenciación de las _ _...... ^-_____J__a._^_a,..-__c ^ ^¡t¡¿..?i..i^M?ÚI MÉAÉ?&ésí^'l'^' ^t?j células plasmáticas. Estos métodos in vitro permiten la expansión de los hepatocitos para su uso en el tratamiento, por ejemplo de lesiones hepáticas, insuficiencias hepáticas provocadas por enfermedad (por ejemplo, infecciones virales tales como hepatitis) o bien insuficiencias hepáticas provocadas por toxinas (por ejemplo cirrosis hepática) . Estos métodos in vitro permiten también la expansión de células plasmáticas para su uso en el tratamiento, por ejemplo de inmunodeficiencias caracterizadas por una producción disminuida de anticuerpos, asi como para la estimulación general de respuestas inmunes humorales a patógenos. Además, estos métodos in vitro permiten la modulación de la producción de citocinas Th2. En otro aspecto, este método modulador se refiere a métodos para la modulación de crecimiento aberrante de hepatocitos, diferenciación aberrante de células plasmáticas y/o actividad aberrante de subgrupos de células T en un sujeto mediante la administración del sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un modulador especifico de actividad de XBP-1 de tal manera que se module dicho crecimiento aberrante de hepatocitos, diferenciación aberrante de células plasmáticas y/o actividad aberrantes de subgrupos de células T en un sujeto. En una modalidad, el modulador inhibe la actividad de XBP-1 por ejemplo, un oligonucleótido de antisentido, un anticuerpo intracelular, o un péptido que inhibe la l i-i?-if-fthiHi i_^-*^gi^ interacción de XBP-1 con otra proteina, de tal manera que se inhiba el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas en el sujeto, o de tal manera que se inhiba la producción de citocinas Th2. Dichos métodos de inhibición pueden ser útiles, por ejemplo en carcinoma hepatocelular, mieloma múltiple, trastornos autoinmunes asociados con la producción de autoanticuerpos patogénicos (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico) , y trastornos asociados con un exceso de actividad de células Th2. en otra modalidad, el modulador estimula la actividad de XBP-1, por ejemplo, un vector que codifica XBP-1 de tal manera que se estimule el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o bien de tal manera que se estimule la producción de citocmas Th2 en el sujeto. Tales métodos de estimulación pueden ser útiles para el tratamiento, por ejemplo, de lesión hepática, insuficiencia hepática provocada por enfermedad hepática, insuficiencia hepática provocada por toxinas hepáticas, trastornos de inmunodeficiencia caracterizados por una producción disminuida de anticuerpos, o bien trastornos asociados con una actividad deficiente de células Th2. la estimulación de la estimulación de células plasmáticas puede también ser útil en la estimulación de respuestas humorales a patógenos y en el incremento de la eficiencia de la vacunas. En los métodos de modulación mencionados arriba, el modulador puede ser administrado directamente, por ejemplo al higado de un sujeto, un sitio de diferenciación de células plasmáticas en el sujeto o bien un sitio de actividad de subgrupos de células T. Alternativamente, el modulador puede entrar en contacto ex S vivo con hepatocitos, precursores de hepatocitos, células plasmáticas, precursores de células plasmáticas, células T o I I bien precursores de células T aislados de sujetos, seguido • por la administración de las células de nuevo al sujeto. En otro aspecto la invención se refiere a un método para 10 diagnosticar un sujeto para un trastorno asociado con un crecimiento aberrante de hepatocitos, diferenciación aberrante de células plasmáticas y/o actividad aberrante de - subgrupos de células T mediante la detención de un cambio en la expresión de XBP-1 en células de un sujeto del cual se 15 sospecha que tiene un trastorno asociados con un crecimiento aberrante de hepatocitos, una diferenciación aberrante de células plasmáticas y/o una actividad aberrante de subgrupos de células T. La expresión de la XBP-1 en células de un sujeto del cual se 20 sospecha que tiene el trastorno se compara, por ejemplo, con • la expresión de XBP-1 en células de un sujeto de control sin el trastorno. El diagnóstico para un trastorno en un sujeto se basa en un cambio de expresión de XBP-1 (por ejemplo, el nivel o forma de XBP-1) en células, relaciona a un sujeto de 25 control. Niveles elevados de expresión XBP-1 o bien la expresión de una forma más activa de XBP-1 (por ejemplo, una forma mutante constitutivamente activa de XBP-1) pueden ser asociados con un trastorno caracterizado por un crecimiento incrementado de hepatocito (por ejemplo, carcinoma hepatocelular) , diferenciación de células plasmáticas (por * jemplo, mielomas múltiples o bien enfermedades auto-inmunes caracterizadas por la producción de auto-anticuerpos patogénicos, tales como lupus sistémico eritematoso) o bien actividad de células Th2 (por ejemplo, alergia, cáncer, enfermedades infecciosas) mientras que niveles reducidos de expresión XBP-1 o bien la expresión de una forma mutante inactiva de XBP-1 pueden relacionarse con una enfermedad caracterizada por un crecimiento disminuido de hepatocitos, una diferenciación menor de células plasmáticas (por ejemplo, trastornos de inmunodeficiencia) , o bien una actividad menor de células Th2 (por ejemplo, ciertas enfermedades auto- inmunes) . I Células deficientes XBP-1 y animales no humanos (por ejemplo, ratones) para su uso en los métodos de tamizado de la presente invención se proporcionan también. Células deficientes en cuanto a XBP-1 tales como hepatocitos, pueden obtenerse a partir de embriones iniciales de animales deficientes en XBP-1 (antes de letalidad in útero) . Además, se puede emplear complementación de blastocistos para crear animales deficientes tanto en XBP-1 como en un segundo gen . _i & J_.á. _____*__... , y^iíí^^^^ ^^ x.í¡¡i. &^V^^J^?^íi^. ...^.i, {por ejemplo, RAG-2), para obtener animales viables en los cuales células deficientes en XBP-1 contribuyen a ciertos compartimientos celulares, tales como sistema de linfoides con el objeto de obtener de esta forma células T y células B deficient s en XBP-1. Además, la invención ofrece animales que tienen un trastorno ho ocigótico en el gen XBP-1 endógeno I pero que llevan un transgen XBP-1 impulsado por un promotor i especifico para higado (por ejemplo, promotor de albúmina) .
Kits para desarrollar los varios métodos de la invención están también abarcados dentro del marco de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un diagrama esquemático del constructo utilizado para trastornar el gen XBP-1 en ratones. Partes de los exones 1 y 2 de XBP-1 fueron removidas y reemplazadas por el gen de neo resistencia, en la orientación opuesta de XBP- La figura 2 es una gráfica de barras que ilustra producción de IL-4 por poblaciones de células T ya sea a partir de ratones de tipo silvestre 129 de control (129w+; barras punteadas) o bien ratones deficientes en cuando a XBP-1 / deficientes en cuanto a RAG-2 (XBP-rag; barras sombreadas), en donde las células T fueron cultivadas en condiciones que favorecen o bien un fenotipo de Thl ("Thl") o bien de fenotipo de Th2 ("Th2") o no favorecen ninguno de ellos ("No _-_..._._ fee__JÉÉ__^_.._,.?_.,a___^^ sesgado) . Los resultados mostrados provienen de dos grupos diferentes de animales. La figura 3 es una gráfica de barras que ilustra la producción de interferón-gamma (IFN-gamma) por poblaciones de células T ya sea a partir de ratones de tipo silvestre 129 de -Control (129W+; barras punteadas) o bien los ratones deficientes en XBP-1 / deficientes en RAG-2 (XBP-rag; barras sombreadas), en donde las células T fueron cultivadas en condiciones que favorecen ya sea un fenotipo Thl ("Thl") o 10 bien fenotipo de Th2 ("Th2") o bien no favorecen ninguno de los ("no sesgado") . Los resultados mostrados provienen de dos grupos diferentes de animales. La figura 4 es una gráfica de barras que ilustra la producción de IL-10 por poblaciones de células T ya sea de 15 ratones de tipo silvestre 129 de control (129w+; barras punteadas) o bien ratones deficientes en cuanto XBP-1 / deficientes en cuanto a RAG-2 (XBP-rag; barras sombreadas), en donde las células T fueron cultivadas bajo condiciones que favorecen ya sea un fenotipo de Thl ("Thl") o bien un 20 fenotipo de Th2 ("Th2") o bien no favorecen ninguno de ellos ' ¡ ("No sesgado") . Los resultados mostrados provienen de dos tipos diferentes de animales. La figura 5 es una gráfica de barras que ilustra la producción de IL-5 o poblaciones de células T provenientes ya 25 sea de ratones de control de tipo silvestre 129 (129w+; barras punteadas) o bien ratones deficientes para XBP-1 / deficientes para RAG-2 (XBP-1-rag; barras sombreadas), en donde las células T fueron cultivadas bajo condiciones que favorecen ya sea un fenotipo Thl ("Thl") o bien un fenotipo S de Th2 (*?Th2") o bien no favorecen ninguno de ellos ("sin * sesgo") . La figura 6 es una gráfica de barras que ilustra la producción de IL-6 por poblaciones de células T ya sea de ratones de control de tipo silvestre 129 (129w+; barras 0 punteadas) o bien ratones deficientes para XBP-1 / deficientes para RAG-2 (XBP-1/rag; barras sombreadas) , en donde las células T fueron cultivadas bajo condiciones que favorecen ya sea el fenotipo Thl ("Thl") o bien el fenotipo Th2 ("Th2") o bien no favorecen ninguno de ellos ("sin 5 sesgo") . Los resultados mostrados provienen de dos grupos diferentes de animales. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos y composiciones que se relacionan a la modulación del crecimiento de hepatocitos, 0 diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T mediante la modulación de la actividad de XBP-1. Esta invención se basa, por lo menos en parte en el descubrimiento que ratones deficientes en cuanto a la proteina de XBP-1 presentan hígados fetales sorprendentemente 5 hipoplásicos debido a un desarrollo severamente afectado de y«_^_________-|¿^.yj los hepatocitos. Este desarrollo afectado fue el resultado tanto de una velocidad de crecimiento disminuida como de una apóptosis prominente. Genes objetivo específicos XBP-1 en el hígado fueron identificados como miembros de familia de |>roteina de fase aguda, incluyendo alfa-1 antitripsina y alfa-fetoproteína (AFP) . Asi, los datos descritos aquí identifican XBP-1 como un factor de transcripción esencial para el crecimiento de hepatocitos. Puesto que ratones deficientes en cuanto a XBP-1 mueren in útero por hígados hipoplásicos, se utilizó la complementación de blastocistos deficientes en RAG-2 para examinar la función de XBP-1 en el sistema linfoide. Se descubrió además que ratones quiméricos elaborados utilizando este sistema de complementación secretan muy poca inmunoglobulina sérica de cualquier isotipo secundario a la falla de generación del compartimiento de células plasmáticas. Por consiguiente, la invención se basa también por lo menos en parte, en el descubrimiento que XBP-1 es un factor de transcripción del cual se ha demostrado que era necesario para la generación de células plasmáticas. Además, se descubrió que células T provenientes de ratones deficientes en XBP-1 presentan un defecto en cuando a su capacidad de secretar citocinas del tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-5, IL-6) . Por consiguiente, la invención se basa también, por lo menos en parte, en el descubrimiento que XBP-1 es un factor de transcripción del cual se ha demostrado *li___Mfc_fcá-- ___-__-?_ *__________ ... _..,___*_---_.--___j...j^ i. i.^U?^¿í jí^Í?¡^ ¡ ¿ ?Mgí^lg?m¿i ahora que estaba involucrado en la regulación de la producción de citocinas Th2 y por consiguiente en la regulación de la actividad de subgrupos de células T (es decir, actividad Thl vs. Th2) . En un aspecto, la invención se refiere a un método para 'identificar un compuesto que modula el crecimiento de hepatocitos, la diferenciación de células plasmáticas y/o la actividad de subgrupos de células T. En la modalidad de estos ensayos de tamizado, una composición indicadora que incluye, XBP-1 se utiliza para identificar y seleccionar compuestos que modulan la actividad XBP-1 y después se evalúa el efecto de los compuestos seleccionados sobre el crecimiento de riepatocitos, la diferenciación de células plasmáticas o bien la producción de citocinas Th2. En otra modalidad de estos ensayos de tamizado, hepatocitos, células B o células T deficientes en cuanto a XBP-1 se ponen en contacto con un compuesto de prueba y se determina el efecto del compuesto sobre el crecimiento de hepatocitos, la diferenciación de células plasmáticas o bien la actividad de subgrupos de células T con el objeto de identificar compuestos que modulan el crecimiento de hepatocitos, la diferenciación de células plasmáticas o bien la actividad de subgrupos de células T a través del "rescate" del fenotipo deficiente en XBP-1. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para modular el crecimiento de hepatocitos, diferenciación de __j-_j_i-_to_É_a__?¡?¡_. células plasmáticas o bien actividad de subgrupos de células T, ya sea in vitro o bien in vivo, utilizando moduladores de la actividad XBP-1. En una modalidad, hepatocitos, precursores de hepatocitos, células plasmáticas, precursores 5 de células plasmáticas, (células B) o bien células T (por 4 ejemplo, aisladas de un sujeto)1 se ponen en contacto con compuesto modulador estimulador mediante el cultivo de las células con el modulador in vi tro, con el objeto de estimular de esta manera el crecimiento de hepatocitos, la 10 diferenciación de células plasmáticas o bien la producción de citocinas Th2. Los hepatocitos que crecen en cultivo o células plasmáticas que se han formado al momento de la át diferenciación de células B en cultivo o células de tipo Th2 que se diferencian en cultivo, pueden después ser 15 administradas de nuevo al sujeto. En otra modalidad, el crecimiento aberrante de hepatocitos, la diferenciación aberrante de células plasmáticas o bien la actividad aberrante de subgrupos de célula? T en un sujeto es modulada mediante la administración a un sujeto de una cantidad ^^ 20 terapéuticamente efectiva de un modulador inhibidor de actividad de XBP-1 de tal manera que el crecimiento aberrante de hepatocitos, la diferenciación aberrante de células plasmáticas o bien la actividad aberrante de subgrupos de células T en un sujeto es modulado. El uso de moduladores que 25 inhiben o estimulan la actividad de XBP-1 se encuentra también comprendido dentro del marco de los métodos moduladores de la presente invención. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para diagnosticar un sujeto para un trastorno asociado con 5 crecimiento aberrante de hepatocitos, diferenciación aberrante de céiulas plasmáticas o bien actividad aberrante de subgrupos de (células T mediante la detección de un cambio • de expresión de XBP-1 en hepatocitos (o bien precursores de hepatocitos) o bien células plasmáticas (o bien precursores 10 de células plasmáticas) o bien células T (o bien precursores de células T) de un sujeto del cual se sospecha que tiene un trastorno asociado con el crecimiento aberrante de hepatocitos, la diferenciación aberrante de células plasmáticas o bien la diferenciación aberrante de células T 15 auxiliares. Para que la invención pueda ser entendida más fácilmente, ciertos términosj se definen primero. I Co o se emplea quí el término "XBP-1" tiene el propósito de referirse a una proteína humana que es una proteína de unión 20 ADN y que tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad • con lo descrito, por ejemplo, en Liou, H-C. y colaboradores (1990) Science 247:1581-1584 y Yoshimura, T. y colaboradores. (1990) EMBO J. 9:2537-2542, y otros homólogos de mamíferos de la misma, de conformidad con lo descrito en 25 Kishimoto T. y colaboradores (1996) Biochem. Biophys . Res.
Común. 223:746-751 (homólogo de rata). Proteínas contempladas para encontrarse dentro del marco definido por el término "XBP-1" incluyen las proteínas que tienen secuencias de aminoácidos divulgadas en GenBank con número de acceso 61, CAA39149 y BAA82600. XBP-1 se conoce TREB5 o HTF. las varias formas del término "modular" manera que incluyan la estimulación (por ejemplo, incremento o regulación ascendente de una respuesta I o actividad particular) y la inhibición (por ejemplo, disminución o regulación descendente de una respuesta o actividad particular) . Como se empleó aquí el término "poner en contacto" (es decir, poner en contacto una célula, (por ejemplo, una célula, con un compuesto) incluye la incubación del compuesto y de la célula conjuntamente in vi tro, entonces por ejemplo, agregando el compuesto a células en cultivo y la i administración del compuesto a un sujeto de tal manera el compuesto y las células del sujeto estén en contacto in vivo. El término "poner en contacto" no pretende incluir la exposición de células a un modulador XBP-1 que puede ocurrir naturalmente en un sujeto (es decir, la exposición que puede ocurrir como resultado de un proceso fisiológico natural) . Como se emplea aquí el término "compuesto de prueba" tiene el propósito de referirse a un compuesto que no ha sido j-_---_-...Í*J¡-_i¡___t , _____ __;i*..__ _____a*-t._ identificado previamente o bien reconocido como un modulador de la actividad XBP-1 y/o del crecimiento de hepatocitos y/o de diferenciación células plasmáticas y/o de actividad de subgrupos de células T. r El término "biblioteca de compuestos de pruebas" tiene el Xf>ropósito e referirse a un panel que comprende varios compuestos de prueba. t Como siempre aquí el término "células deficientes en XBP-1" abarca células de un sujeto que son naturalmente deficientes en XBP-1, así como células de un animal no humano deficiente en cuanto a XBP-1, por ejemplo, un ratón, que han sido alteradas de tal manera que presenten deficiencias en cuando XBP-1. 1. El término "células deficientes en XBP-1" tiene también el propósito de incluir células aisladas de animales no humanos deficientes en cuanto a XBP-1 o bien de un sujeto, que son cultivadas in vi tro. Como se emplea aquí, el término "animal no humano deficiente para XBP-1" se refiere a un animal no humano, de preferencia un mamífero, con mayor preferencia un ratón, en el cual un gen endógeno ha sido alterado por recombinación homologa entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógena introducida en una célula del animal, por ejemplo, una célula embriónica del animal, antes del desarrollo del animal, de tal manera que el gen, XBP-1 endógeno sea alterado, ,._*___._ >. t*?**»«*y ÍÍ£.?JÍt¡¡A.S provocando por consiguiente ya sea la ausencia de producción de XBP-1 o bien la producción de una forma mutante de XBP-1 que tiene una actividad XBP-1 deficiente. De preferencia, la actividad de XBP-1 es totalmente bloqueada aún cuando se 5 incluye también una inhibición parcial de la actividad XBP-1 uí el animal. El término "animal no humano deficiente para XBP-1" contempla también animales quiméricos (por ejemplo, # ratones), producidos empleando un sistema de complementación de blastocistos, tales como sistema de complementación de 10 blastocistos, RAG-2 en donde un órgano particular o bien órganos particulares (por ejemplo, los órganos linfoides) surgen de la células madres embriónicas (ES) con mutaciones homocigóticas del gen XBP-1. # Como se utiliza aquí, el término "composición indicadora", se 15 refiere a una composición que incluye proteína XBP-1 como por ejemplo, una célula que expresa naturalmente proteína XBP-1, una célula que ha sido manipulada para expresar la proteína XBP-1 mediante la introducción de un reactor de expresión que codifica la proteína XBP-1 en la célula, o bien una 20 composición sin célula que contiene XBP-1 (por ejemplo, XBP-1 que ocurre naturalmente o bien XBP-1 manipulada de manera recombinada) . Como se emplea aquí, el término "manipulado" (como por ejemplo en una célula manipulada) , se refiere a una célula en 25 la cual un vector de expresión que codifica la proteína XBP-1 X. _.«_,_- _l3_L»«____Íj_»._l__>_,a_ll-... - . -%MÍ-^- ...»«.. ..¡¡Hjjé- ^ -^ ^- yi?. ,-^^&?,&MÍ&l?» i^.4l^j?^^f ha sido introducido. Como se emplea aquí, el término "composición sin células" se refiere a una composición aislada, que no contiene células intactas. Ejemplos de composiciones sin células incluyen extractos de células y composiciones que contienen proteínas aisladas. Como se utiliza aquí, el término "una molécula blanco .?*¡ para XBP-1 se refiere a una molécula con la cual XBP-1 puede interactuar incluyendo otras proteínas y secuencias .ADN, incluyendo por ejemplo las regiones de promotor/realizador de genes como por ejemplo alfa-1 antitripsina, alfa- fetoproteína, HLA DR alfa, y el realizador de repetición de 21 pares de bases de HTLV-1 LTR, y otras proteínas b-ZIP como por ejemplo c-Fos. Como se emplea aquí, el término "gen reportero que responde a XBP-1" se refiere a que un gen expresa un producto de gen detectable, que puede ser ARN o proteína. Genes reporteros son los genes fácilmente detectables. El gen reportero' puede también estar incluido en un constructo en forma de un gen de fusión con un gen que incluye secuencias reguladoras de I transcripción deseadas o bien que muestran otras propiedades deseables. Ejemplos de genes reporteros incluyen, sin limitarse a CAT (clorafenicol acetil transferase) (Alton y Vapnek (1979), Nature 282: 864-869) así como otros sistemas enzimáticos de detección como por ejemplo, beta- galactosidasa; luciferaza de luciérnaga (de Wet y colaboradores. (1987), Mol. Cell. Biol. 7:725-737); luciferaza bacterial (Engebrecht y Silverman (1984), PNAS 1:4154-4158; Bald in y colaboradores (1984), Bijochemistry 23* 3663-3667; fosfatasa alcalina (Tor y colaboradores (1989) Biochem. 182:231-239, Hall y colaboradores (1983) J. Mol. «ftppl. Gen. 2: 101), fosfatasa alcalina| secretada placenta! humana (Cullen y Malim (1992) Methods in Enzymol. 216:362- 368) y proteína fluorescente verde (patente norteamericana 5,491,084; WO 96/23898) . Como se utiliza aquí, el término "elemento que responde a XBP-1" se refiere a una secuencia de ADN que es regulada directa o indirectamente por la actividad de XBP-1 (por lo que la actividad de XBP-1 puede ser monitoreada como por ejemplo, a través de transcripción de los genes reporteros) . Como se utiliza aquí, el término "aberrante" (como por ejemplo en crecimiento aberrante i de hepatocitos o diferenciación aberrante de células plasmáticas) se refiere al crecimiento o la diferenciación que se desvía del crecimiento normal o de la diferenciación normal en el sujeto. El crecimiento aberrante o1 la diferenciación aberrante puede ser ya sea un crecimiento excesivo o una i diferenciación excesiva o bien un crecimiento un crecimiento reducido o una diferenciación reducida con relación al crecimiento o diferenciación normal en un sujeto.
Como se emplea aquí, el término "un modulador de la actividad de XBP-1" se refiere a un agente, por ejemplo un compuesto o varios compuestos, que modula la transcripción de un gen de XBP-1, la traducción de ARNm de XBP-1 o actividad de una proteína XBP-1. Un Vmodt?ladfor de XBP-1" incluye tamfcáéir H^ mpestos que modulan Le manera indirecta la actinricí f" " "xk l ,*' , i XBP-1, por ejemplo, moduladores de una via de traduccióa de ^ señales que pueden incluir XBP-1. Ejemplos de moduladores ^ie modulan directamente la actividad de XBP-1 incluyen moléculas de ácido nucleico de antisentido que se unen a ARNm XBP-1 o ADN genómico, anticuerpos intracelulares que se unen a XBP-1 intracelularmente y modulan (es decir, inhiben) la actividad XBP-1, péptidos XBP-1 que inhiben la interacción de XBP-1 con una molécula blanco (por ejemplo, c-Fps) y vectores de expresión que codifican XBP-1 que permiten la expresión incrementada de expresión de actividad de XBP-1 en una célula, así como compuestos químicos que actúan para modular específicamente la actividad de XBP-1. Como se emplea aquí, un "oligonucleótido de antisentido" se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótidos que es complementaria de un ácido nucleico de "sentido" que codifican la proteína, por ejemplo, I complementaria de la cadena codificadora de una molécula demostrada en una cadena doble, complementaria de una ADNc o complementaria de la cadena codificadora de un gen. Por _,_»...._--_->_-_, ______ , _. ¿í .¿ _. ;, consiguiente, un ácido nucleico de antisentido puede estar unido a un enlace de hidrógeno a un ácido nucleico de sentido. Como se emplea aquí, el término "anticuerpo intracelular" tiene objeto de incluir moléculas de inmunoglobulina así como porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con un antígeno, por ejemplo, fragmentos Fab y F (ab')2. El término "anticuerpo intracelular" tiene también el propósito de referirse a un anticuerpo que funciona en la región intracelular de una célula, por ejemplo, citoplasma o núcleo, para modular la expresión o actividad de XBP-1. Como se emplea aquí, el término "diagnóstico" se refiere a la identificación de un trastorno en un sujeto o la susceptibilidad de un sujeto a dicho trastorno (por ejemplo, predisposición a desarrollar un trastorno) . Como se emplea aquí, el término "Actividad de subgrupos de células T" se refiere a la actividad de células T Thl vs. Th2 auxiliares. La actividad de subgrupos de célula T puede ser modulada mediante la regulación ascendente de la actividad de células Th2, la regulación descendente de actividad de células Th2, la regulación ascendente de actividad de células Thl o la regulación descendente de actividad de células Thl .
Como se emplea aquí, el término "citocina Th2" se refiere a cítocinas producidas predominantemente por las células Th2 (en lugar de las células Thl) e incluyen sin limitarse a ellas) IL-4, IL-10, IL-5 y IL-6. Varios aspectos de la presente invención se describen con detalles adicionales en las subsecciones siguientes. I. Ensayos de tamizado para identificar compuestos que modulan el crecimiento de hepatocitos y/o la diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T A.- Ensayos que utilizan composiciones indicadoras que contienen XBP-1 En una modalidad, la invención ofrece métodos para identificar compuestos que modulan el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o bien la actividad de subgrupos de células T utilizando composiciones indicadoras que incluyen XBP-1. Como se describió en los ejemplos, XBP-1 es un regulador del crecimiento de hepatocitos de la diferenciación de células plasmáticas y de la actividad de subgrupos de células T. Por consiguiente, compuestos que modulan de manera específica la actividad de XBP-1 pueden ser identificados de conformidad con lo descrito aquí, y se puede evaluar el efecto de un compuesto de prueba seleccionado sobre el crecimiento de hepatocitos o sobre la diferenciación de células plasmáticas -_Í__-__-i__i-J -?M__i_._.<- i?mí. ?.ttnti^iiéi?tAM AÉdk *-. o bien sobre la actividad de subgrupos de células T. Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a ensayos de tamizado para identificar compuestos que modulan el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T, que joomprende: proporcionar una composición indicadora que comprende proteína XBP-1. poner en contacto la composición indicadora con cada miembro de una biblioteca de compuestos de prueba. seleccionar a partir de la biblioteca de compuestos de prueba un compuesto de interés que modula la actividad de proteína XBP-1; y determinar el efecto del compuesto de interés sobre el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o actividad de subgrupos de células T, (por ejemplo, producción de citocinas Th2) par,a identificar de esta forma un compuesto que modula el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T. La composición indicadora puede ser una célula que expresa una proteína XBP-1, por ejemplo, una célula que expresa I naturalmente XBP-1, o bien con mayor preferencia una célula que ha sido manipulada para expresar la proteína XBP-1 mediante la introducción en la célula de un vector de tafe&-faAt-i _i_-,j> a__fc_»M.?__t¡¿?__^**fc_____--..--_?_«_;. fa_JA-,A-^_-___i-_j|i^j-l»?g^fca M^ expresión que codifica la proteína XBP-1. Alternativamente, la composición indicadora puede ser una composición sin células que incluye XBP-1 (por ejemplo, un extracto celular proveniente de una célula que expresa XBP-1 o una composición que incluye proteína de XBP-1 purificada, ya sea XBP-1 natural o XBP-1 recombinada) . En una modalidad la composición indicadora injcluye una proteína XBP-1 y una molécula blanco con la cual interactúa XBP-1, y la capacidad del compuesto de prueba de modular la interacción de la proteína XBP-1 con la molécula blanco es monitoreada con el objeto de identificar de esta manera el compuesto de prueba como modulador de actividad de XBP-1. En modalidades preferidas, la composición indicadora comprende una célula indicadora, en donde la célula indicadora comprende una proteína XBP-1 y un gen reportero que responde a la proteína XBP-1. De preferencia, la célula indicadora contiene: un vector de expresión recombinante que codifica la proteína XBP-1; y un vector que comprende un elemento regulador que responde a XBP-1 enlazado operativamente a un gen reportero; y el método de tamizado comprende: I poner en contacto la célula indicadora con un compuesto de prueba; determinar el nivel de expresión del gen reportero en la _H.J_a.A___i-te»-Á«?V -• *¿t»__ .>._______,^.-__¿__, -^----fc¿^s«jL-i_._*____»_¿E_t-:¿».,¡¡_.,»? Mttxé , célula indicadora en presencia del compuesto de prueba ; y comparar el nivel de expresión del gen reportero en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba con el nivel de expresión del gen reportero en la célula indicadora en ausencia del compuesto de prueba con el objeto de seleccionar de esta forma un compuesto de interés que modula la actividad de proteína XBP-1. üha vez identificado un compuesto de prueba como modulador de la actividad de XBP-1, el efecto del compuesto de prueba sobre el crecimiento de hepatocitos o sobre la diferenciación de células plasmáticas o sobre la actividad de subgrupos de células T es probado. Elementos que responden a XBP-1 pueden ser utilizados en el constructo de gen reportero como se sabe la técnica e incluyen, por ejemplo, regiones reguladoras corriente arriba provenientes de genes tales como alfa-1 antitripsma, alfa-fetoproteína, HLA Dr alfa, así como el realzado de repetición de 21 pares de bases del HTLV-ILTR. Un ejemplo de gen reportero que responde a un XBP-1 es el constructo de HLA DR alfa-CAT descrito en Ono, S.J. y colaboradores (1991) Proc., Natl. Acad. Sci. USA 88:4309-4312. Una célula que ha sido manipulada para expresar la proteína XBP-1 puede ser producida mediante la introducción en la célula de un vector de expresión que codifica la proteína XBP-1. Vectores de expresión recombinante que pueden ser ¿ _tj.l i___l_ __s _tt-A___fcí utilizados para expresión de proteína XBP-1 en la célula indicadora son conocidos en la técnica. Típicamente, el XBP-1 es introducido primero en un vector de expresión recombinante utilizando técnicas estándares de biología molecular. Un ADNc 5 XBP-1 puede ser obtenido, por ejemplo, mediante amplificación utilizando reacción en cadena de polimerasa (PCR) o bien mediante el tamizado de una biblioteca de ADNc apropiada. Las secuencias de nucleótidos de ADNc XBP-1 (por ejemplo, de ser humano y de ratas) son conocidas en la técnica y pueden ser 10 utilizadas para el diseño de cebadores para reacciones en cadena de polimerasa que permiten la amplificación de un ADNc por métodos estándares de reacción en cadena de pollmerasa o bien para el diseño de una sonda de hibridación que puede ser • utilizado para tamizar una biblioteca de ADNc utilizando 15 métodos estándares de hibridación. La secuencias de nucleótidos y aminoácidos predichas de ADNc XBP-1 se divulgan en Liou, H-C y colaboradores (1990) Science 247:15 81-15 84, Yoshimura, T. y colaboradores (1990) EMBO J. 9:2537-2542, Y Kishimoto T. y colaboradores (1996) Biochem, Biophys. Ress. 20 Commun. 223:746-751. • Después del aislamiento o amplificación de ADNc XBP-1, el fragmento de ADN es introducido en un vector de expresión. Como se empleó aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido 25 nucleico al cual está unida. Un tipo de vector es "plásmido", a^i.__ai._ _ *i«*a*'fct-t^ *-______.__ i«,_ t, .¡¡.-..táfe JEA-_*_»..fufe>Mbfc?_l___l__-j________'*-fc-«^ que se refiere a un bucle de ADN con doble cadena, circular, en el cual pueden ligarse segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vectores, un vector viral, en donde segmentos adicionales de ADN pueden ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una Célula huésped en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores mamíferos episomales) . Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) son integrados en el genoma de una célula huésped a través de introducción en la célula huésped, y por consiguiente son replicados juntos con el genoma huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente. Tales vectores se conocen aquí como "vectores de expresión recombinante" o bien simplemente "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión útiles en técnicas de ADN recombinante tienen frecuentemente la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmidos" y "vector" pueden utilizarse de manera intercambiable puesto que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención contempla la inclusión de otras formas de vectores de expresión, como por ejemplo, vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus asociados con adeno defectuosos en cuanto a replicación) , que desempeñan ._a__B-_j____e«_._, .«a3__ _a,-.•., .i._.--.4......-£--!__a_^-.s^.c_._^a é__á____i lí_¡._._tif__ funciones equivalente. Los vectores de expresión recombinante de la presente invención comprenden un ácido nucleico en forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o varias secuencias reguladoras seleccionadas con base en las células huéspedes a utilizar para expresión y el nivel de expresión deseado, que se encuentra unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. En un vector de expresión recombinante, la expresión "enlazada operativamente" significa que la secuencia del nucleótido de interés está enlazada a la(s) secuencia (s) reguladora (s) de una manera que - permite la expresión de la secuencia nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector es introducido en la célula huésped) . El término "secuencia reguladora" tiene el propósito de incluir promotores, realizadores y otros elementos de control .de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) . Tales secuencias reguladoras están descritas por ejemplo, ' en Goeddel; Gene Expresión Techology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Secuencias reguladoras incluyen las secuencias que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huéspedes, las que dirigen la expresión de la secuencia de i^-j6-Éj-__a___.iy --^aa-_--_-8_______j nucleótido solamente en ciertas células huéspedes (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas para tejido) o bien las que dirigen la expresión de la secuencia nucleótídos solamente bajo ciertas condiciones (por ejemplo, secuencias 5 reguladoras) . Se observará por parte de los expertos en la materia que el i diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de proteína que se desea, etc. Cuando se 10 utiliza en células de mamíferos, las funciones de control de vector de expresión son frecuentemente proporcionadas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, promotores habitualmente utilizados se derivan de virus de polioma, adenovirus, citomegalovirus y virus del 15 simio 40. Ejemplos no limitativos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDMd (Seed, B., (1987) Nature 329:840) y PMT2PC (Kaufman y colaboradores (1987), EMBO J. 6:187-195). Varios vectores de expresión de mamífero que llevan ' diferentes secuencias reguladoras están disponibles en el 20 comercio. Para la expresión constitutiva del ácido nucleico ^P en una célula huésped de mamífero, un elemento regulador preferido es el promotor/realzador e citomegalovirus. Además, sistemas reguladores inducibles para su uso en células de mamíferos son conocidos en la técnica por ejemplo, sistemas 25 en los cuales la expresión de genes es regulada por iones de «Í>?i ?-?_ ___._- r,___!_.- l?__li-_¡_'?__--|. metales pesados (véase, por ejemplo Mayo y colaboradores (1982) Cell 29:99-108; Brinster y colaboradores (1982) Nature 296:39-42; Searle y colaboradores (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489), choque térmico (véase por ejemplo Nouer y 5 colaboradores (1991) en Heat Shock Response, (Respuesta a choque térmico) e.d. Nouer, L., CRC, Boca Ratón, FL, pp 167- 220), hormonas (véase, por ejemplo Lee y colaboradores (198 • I) Nature 294:228-232; Hynes y colaboradores (198 1) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042; Klock y colaboradores 10 (1987) Nature 329:734-736; Israel & Kaufman (989) Nucí. Acids Res. 17:2589-2604; publicación PCT número W093/2343 1 ), moléculas relacionadas con FK506 (véase, por ejemplo, publicación PCT número WO 94/18317) o tetraciclinas (Gossen, M y Bujard, H (1992) Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:5547-555 1; 15 Gossen, M. y colaboradores (1995) Science 268:1766-1769; PCT publicación No. WO 94/29442; y Publicación PCT No. WO 96/01313) . Además, muchas secuencias reguladoras específicas para tejido son conocidas en la técnica, incluyendo el promotor de albúmina (específico para hígado; Pinkert y 20 colaboradores (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores • específicos para linfoides (Caíame y Eaton (1988) Adv. I munol 43:235-275) en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimores (1989) EMBO J. 8:729-73 3) así como inmunoglobulinas (Banerji y colaboradores (1983) Cell 25 33:729-740; Queen y Baltimores (1983) Cell 33:741-748), c,^,.,c___?_J¿J_..__^¡-____Í-Á thá itf____¿fei¡aá¡-_-. promotores específicos para neuronas (por ejemplo el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores específicos para páncreas (Edlun y colaboradores (1985) Science 230:912-916) así como promotores específicos para glándulas mamarias (por ejemplo, promotor de suero de leche, patente norteamericana número 4,873, 316 y publicación de solicitud europea número 264,166). Promotores regulados en cuando a desarrollo están también abarcados, por ejemplo, los promotores hox de murino (Kessel y Gruss (1990) Science 249:3 74-3 79) y el promotor de alfa-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546) . El ADN de vector puede ser introducido en células de mamíferos a través de técnicas convencionales de transfección. Como se emplea aquí, las varias formas del término "transfección" tienen el propósito de referirse a varias técnicas conocidas para la introducción de ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en células huéspedes de mamíferos huéspedes de mamíferos, incluyendo con precipitación de fosfato de calcio transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o bien electroporación. Métodos adecuados para la transfección de células huéspedes pueden encontrarse en Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, (Clonación Molecular; : un manual de laboratorio) segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory .,._-_-.c,__Á>a^.-,_g.--«f.__i_i-¿,fetr_j^iLe press (1989)), y otros manuales de laboratorio. Para una transfección estable de células de mamíferos, se sabe que según el vector de expresión y la técnica de transfección que se utilizan, solamente una pequeña transfección de células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el objeto de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo resistencia a los antibióticos) es generalmente introducido en las células huéspedes junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen los marcadores que proporcionan resistencia a fármacos tales como G418, higromicina y metotrexato, ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede ser introducida en una célula huésped en un vector separado del que codifica XBP-1 o bien con mayor preferencia en el mismo vector. Células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas por selección fármacos (por ejemplo, células que tienen incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán mientras que las demás células morirán) . En otras modalidades, la composición indicadora es una composición sin células. XBP-1 expresado por métodos recombinantes en una célula huésped o un medio de cultivo puede ser aislada de las células huéspedes o medio de cultivo celular utilizando métodos estándares para la purificación de proteína, por ejemplo, por cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis, y purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para XBP-1 para producir proteína de XBP-1 que puede ser utilizada en una composición sin células. Alternativamente, un extracto de células que expresan XBP-1 puede prepararse para su uso como composición sin células. En una modalidad, compuestos que modulan de manera específica la actividad de XBP-1 son identificados con base en su capacidad para modular la interacción de XB P-l con una molécula blanco a la cual se une XBP-1. La molécula blanco puede ser la proteína como por ejemplo c-Fos. Alternativamente el blanco puede ser una secuencia de ADN (es decir, un elemento que responde a XBP-1) . Ensayos adecuados son conocidos en la técnica los cuales permiten la detección de interacciones proteína-proteína (por ejemplo, inmunoprecipitaciones, ensayos de dos híbridos y similares) o bien que permiten la detección de interacciones entre una proteína de enlace de ADN con una secuencia de ADN blanco (por ejemplo, ensayos de desplazamientos de movilidad electroforética, ensayos de huellas de DNasa I y similares) . Mediante la realización de tales ensayos en presencia y ausencia de compuestos de prueba, estos ensayos pueden ser utilizados para identificar compuestos que modulan (por ejemplo, inhiben, o incrementan) la interacción de XBP-1 con una molécula blanco. En una modalidad, la cantidad de enlace de XBP-1 con la molécula blanco en presencia del compuesto de prueba es mayor que la cantidad de enlace del XBP-1 con la molécula blanco en ausencia del compuesto de prueba, en dicho caso, el compuesto de prueba es identificado como un compuesto que incrementa la unión de XBP-1. En otra modalidad, la cantidad de enlace del XBP-1 con la molécula blanco en presencia del compuesto de prueba es menor que la cantidad del enlace del XBP-1 con la molécula blanco en ausencia del compuesto de prueba, en dicho caso, el compuesto de prueba es identificado como un compuesto que inhibe la unión de XBP-1. En los métodos de la presente invención para identificar compuesto de prueba que modulan una interacción entre proteína de XBP-1 y una molécula blanco, la proteína XBP-1 entera puede ser utilizada en el método o bien alternativamente, solamente porciones de la proteína XBP-1 pueden utilizarse. Por ejemplo una estructura b-XIP de XBP-1 aislada (o bien una subregión más grande XBP-1 que incluye la estructura b-ZIP puede utilizarse) . El grado de interacción entre proteína XBP-1 y la molécula blanco puede ser determinado, por ejemplo, mediante el etiquetado de una de las proteínas con una sustancia detectable que ha sido asociada con la proteína no marcada. El ensayo puede ser utilizado para identificar compuestos de prueba que ya sea estimulan o inhiben la interacción entre la proteína XBP-1 y una molécula blanco. Un compuesto de prueba que estimula la interacción entre la proteína XBP-1 y una molécula blanco es identificado con base en su capacidad para incrementar el grado de interacción entre la proteína XBP-1 y una molécula blanco en comparación con el grado de interacción en ausencia del compuesto de prueba, por lo que un compuesto de prueba que inhibe la interacción entre la proteína XBP-1 y una molécula blanco es identificado con base en su capacidad para disminuir el grado de interacción entre la proteína XBP-1 y una molécula blanco en comparación con el grado de interacción en ausencia del compuesto. Vectores de expresión recombinante que pueden ser utilizados para expresión de XBP-1 en la célula indicadora son conocidos en la técnica (véase comentarios arriba) . En una modalidad, en el vector de expresión, las secuencias codificadoras de¡ XBP-1 están enlazas operativamente con secuencias reguladoras que permiten la expresión constitutiva de XBP-1 en la célula indicadora (por ejemplo, secuencias reguladoras virales, tales como promotor/realzador de citomegalovirus, pueden emplearse) . El uso de un vector de expresión recombinante que I permite la expresión constitutiva de XBP-1 en la célula indicadora es preferido para identificación de compuestos que incrementan o inhiben la actividad de XBP-1 en una modalidad alternativa, dentro del vector de expresión, las secuencias codificadoras de XBP-1 están unidas operativamente a secuencias reguladoras del gen XBP-1 endógeno (es decir, la región reguladora promotora derivada del gen endógeno) . El uso del vector de expresión recombinante en donde la expresión de XBP-1 es controlada por secuencias reguladoras endógenas es preferido para la identificación de compuestos que incrementan o inhiben la expresión transcripcional de XBP-1. Varios genes reporteros son conocidos en la técnicas y son adecuados para su uso en los ensayos de tamizado de la invención. Ejemplos de genes reporteros adecuados incluyen los que codifican cloranfenicol acetiltransferasa, beta-galactocidasa, fosfatasa alcalina o luciferaza. Métodos estándares para medir la actividad de estos productos génicos son conocidos en la técnica. Varios tipos de células son adecuados como célula indicadora en el ensayo de tamizado. De preferencia, una línea celular es utilizada la cual expresa niveles bajos de XBP-1 endógeno, y después es manipulada para expresar XBP-1 recombinante.
En una modalidad, el nivel de expresión del gen reportero en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba es mayor que el nivel de expresión del gen reportero en la célula indicadora en ausencia del compuesto de prueba y el compuesto de prueba es identificado como un compuesto que _ ^ . ^'j&ujhMi lia la expresión o actividad de XBP-1. En otra modalidad, el nivel de expresión del gen reportero en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba es menor que el nivel de expresión del gen reportero en la célula indicadora en ausenóia del compuesto de prueba y el compuesto de prueba es identificado como un compuesto que inhibe la expresión o actividad de XBP-1. De manera alternativamente al uso de un constructo de gen reportero, compuestos que modulan la expresión o actividad de XBP-1 pueden ser identificados mediante la utilización de otras "lecturas".- por ejemplo, una célula indicadora puede ser transfectada con un vector de expresión de XBP-1, incubada en presencia y en ausencia de un compuesto de prueba, y la proliferación y/o modificación de células puede ser utilizada como un indicador de la modulación de XBP-1. La proliferación/diferenciación de células puede ser monitoreada directamente (por ejemplo, conteo de células o absorción de timidina radiomarcada para monitorear la proliferación de células, o bien examen microscópico de las células para monitorear la diferenciación de las células) o bien indirectamente mediante el monitoreo de uno o varios marcadores de proliferación o diferenciación celular (por ejemplo, un incremento en ARNm para un producto génico asociado con proliferación o diferenciación celular, o bien la secreción de un producto génico asociado con proliferación o diferenciación celular, como por ejemplo la secreción de inmunoglobulina por células plasmáticas diferenciadas o la secreción de citocinas Th2 por células Th2 diferenciadas) . Métodos estándares para detectar ARNm de interés por ejemplo reacción eri cadena de polimerasa - transcripción reversa (RT-fCR) y análisis Northern blot, son conocidos en la técnica. Métodos estándares para detectar la secreción de proteína en sobrenadantes de cultivo, como por ejemplo ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzima (ELISA) , son también conocidos en la técnica. Una vez identificado un compuesto de prueba que modula la actividad XBP-1 a través de uno de varios métodos descritos arriba, el compuesto de prueba seleccionado o bien ("compuesto de interés") puede ser evaluado adicionalmente para determinar su efecto sobre el crecimiento de hepatocitos o diferenciación de células plasmáticas o actividad de subgrupos e células T por ejemplo, mediante la puesta en contacto del compuesto de interés con hepatocitos o células B o bien células T, ya sea in vivo (por ejemplo, mediante la administración del compuesto de interés a un su_eto o bien ex vivo (por ejemplo mediante el aislamiento de los hepatocitos o células B o células T y mediante la puesta en contacto de las células aisladas con el compuesto de interés o bien, alternativamente mediante la puesta en contacto del compuesto de interés con un hepatocito o línea de células B o células t AA A?t &ájfa jfc _ri__f»* ..- «Mái-_A. __*.-__,. JB+J, ^<^|iu^__aÉ___t_____?.
T) y la determinación del efecto del compuesto de interés sobre el crecimiento de los hepatocitos o la diferenciación de las células B o bien la actividad de subgrupos de células T en comparación con un control apropiado (como por ejemplo células no tratadas o bien células tratadas con un compuesto de control o vehículo, que no modulan en crecimiento de hepatocitos ni la diferenciación de células plasmáticas ni la actividad de subgrupos de células T) . El efecto del compuesto de prueba sobre el crecimiento de los hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T puede ser determinada directamente mediante el monitoreo de la proliferación de células y/o diferenciación de células (de conformidad con lo deserits arriba) o bien indirectamente mediante el onitoreo de uno o varios marcadores de proliferación y/o diferenciación de células como por ejemplo ARNm o secreción de proteína (de conformidad con lo descrito arriba) o bien mediante el monitoreo de la producción de citocina Th2 por células T. B. Ensayos utilizando células deficientes en cuanto a XBP-1 En otra modalidad, la invención ofrece métodos para identificar compuestos que modulan el crecimiento de hepatocitos y/o la diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T utilizando células deficientes en cuanto a XBP-1. De conformidad con lo descrito en los ejemplos, la inhibición de la actividad de XBP-1 (por ejemplo, mediante el trastorno del gen XBP-1) provoca la formación de hepatocitos embriónicos con velocidad de crecimiento menor y apóptosis prominente, lo que provoca letalidad embriónica empezando en E12.5. Así, heptatocitos embriónicos de ratón tempranos (por ejemplo, antes de E.12-5) (o bien precursores de hepatocitos deficientes en cuanto a XBP-1 pueden ser utilizados como agentes de identificación que modulan el crecimiento de hepatocitos por medios otros que la modulación de XBP-1 mismo (es decir, compuestos que ^rescatan el fenotipo deficiente de XBP1) . Alternativamente, un sistema "no creado condicional" en donde el gen de XBP1 es tornado no funcional de manera condicional, puede ser utilizado para crear hepatocitos deficientes en XBP-1 (o bien precursores de hepatocitos) para su uso en ensayos de tamizado. Por ejemplo, un sistema regulado por tetraciclina para interrupción condicional de un gen de conformidad con lo descrito en el documento W094/29442 y en la patente norteamericana 5,650,298, puede ser utilizado para crear hepatocitos (o bien precursores de hepatocitos) o bien animales deficientes en cuanto a XBP-1 a partir de los cuales se pueden aislar hepatocitos (o bien precursores de hepatocitos, que pueden ser tornados deficientes en XBP-1 de manera controlada a través de la modulación de la concentración de tetraciclina en contacto con las células. Para ensayos que se relacionan con la diferenciación de ^A^-^fl^til^^^ células plasmáticas o actividad de subgrupos de células T, un enfoque de trastorno condicional similar puede emplearse, o bien, alternativamente, el sistema de complementación de blastocistos deficientes en RAG-2 puede utilizarse para generar ratones con órganos linfoides que provienen de células madres embríónicas con mutaciones homocigóticas del gen de XBP-1 (véase ejemplo 2) células linfoides deficiente en XBP-1 (por ejemplo, células de timo, bazo, y/o nodos linfáticos) o bien células B deficientes en XBP-1 purificadas o bien células T de tales animales pueden emplearse en ensayos de tamizado. En el método de tamizado, células deficientes en XBP-1 están en contacto con un compuesto de prueba y se monitorea el crecimiento y/o diferenciación y/o actividad de las células. La modulación y el crecimiento de los hepatocitos deficientes en cuanto a XBP-1 (o bien precursores de hepatocitos) (en comparación con un control apropiado como por ejemplo, células no tratadas o bien células tratadas a través de un agente de control) identifica un compuesto de prueba como modulador del crecimiento de hepatocitos. De la misma mañera la modulación de la diferenciación de los precursores de células plasmáticas deficientes en XBP-1 (en comparación con un control apropiado, por ejemplo células no tratadas o bien células tratadas con agente de control) identifica un compuesto de prueba como modulador de diferenciación de r -*. células plasmáticas. De la misma manera, la modulación de la actividad de células Thl versus Th2, por ejemplo, producción de citocinas Th2, (en comparación con un control apropiado como por ejemplo células no tratadas o bien células tratadas con un agente de control) identifica un compuesto de prueba como modulador de la actividad de subgrupos de células T.En una modalidad, el compuesto de prueba es administrado directamente a un animal no humano deficiente en cuanto a XBP-1, de preferencia un ratón, (por ejemplo un ratón en el cual el gen de XBP-1 es trastornado condicional ente por medios descritos arriba o bien un ratón quimérico en el cual los órganos linfoides son deficientes en XBP-1 de conformidad con lo descrito arriba), para identificar otro compuesto de prueba que modula el crecimiento in vivo de hepatocitos deficientes en XBP-1 o bien diferenciación in vivo de células plasmáticas deficientes en XBP-1 o bien actividad de subgrupos de células T in vivo de células T deficientes en células XBP-1 en otra modalidad, células deficientes en XBP-1 son aisladas del animal no humano deficiente en XBP-1 y puestas en contacto con el compuesto de prueba ex vivo para identificar un compuesto de prueba que modula el crecimiento de los hepatocitos aislados deficientes en cuanto al XBP-1 o la diferenciación de las células plasmáticas aisladas (o bien precursores de células plasmáticas) deficientes en cuanto a XBP-1 o actividad de células T aisladas (por ejemplo producción de citocinas Th2) . Células deficientes en XBP-1 pueden ser obtenidas a partir de animales no humanos creados para ser deficientes en XBP-1. /Animales no humanos preferidos incluyen monos, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, cabras y ovejas. En modalidades preferidas el animal |deficiente en cuanto a XBP-1 1 es un ratón. Ratones deficientes en cuanto a XBP-1 pueden ser elaborados de conformidad con lo descrito en el ejemplo 1. Animales no humanos deficientes en un producto génico particular típicamente son creados por recombinación homologa. En resumen, se prepara un vector que contiene por lo menos una porción del gen de XBP-1 en donde se ha introducido una deleción, adición o sustitución con el objeto de alterar de esta forma, por ejemplo, trastornar funcionalmente el gen de XBP-1 endógeno. El gen de XBP-1 es de preferencia un gen de XBP-1 de ratón. Por ejemplo, un gen de XBP-1 de ratón puede ser aislado de una biblioteca de ADN i genómico de ratón utilizando el ADNc de XBP-1 de ratón como sonda. El gen de XBP-1 de ratón puede ser utilizado después para construir un vector de recombinación homologa adecuado I para alterar un gen de XBP-1 endógeno en el genoma de ratón. En una modalidad preferida, el vector es diseñado de tal manera que, al ser sometido a recombinación homologa, el gen de XBP-1 endógeno se ha trastornado funcionalmente (es decir, que ya no codifique una proteína funcional; se conoce también como vector noqueado) alternativamente, el vector puede ser diseñado de tal manera que al ser sometido a recombinación homologa, el gen de XBP-1 endógeno es mutado o bien alterado de otra forma pero sigue codificando una proteína funcional 5 (por ejemplo, la región reguladora corriente arriba puede ser alterada con el objeto de modificar de esta forma la expresión de la proteína de XBP-1 endógena) . En el vector de recombinación homologa, la porción alterada del gen de XBP-1 es flanqueada en sus extremos 5' y 3' por ácido nucleico 10 adicional del gen de XBP-1 para permitir que ocurra la recombinación homologa entre el gen de XBP-1 exógeno portado por el vector y un gen de XBP-1 endógeno en una célula madre embriónica. El ácido nucleico de XBP.-l de flanco adicional tiene una longitud suficiente para la recombinación homologa 15 exitosa con el gen endógeno. Típicamente, varios kilobases de ADN de flanco (tanto en el extremo 5' como en el extremo 3') están incluidas en el vector (véase por ejemplo Thiomas, K.R. y Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 para una descripción de vectores de recombinación homologa) el vector es introducido 20 en una línea de células madres embriónicas (por ejemplo por electroporación) y se seleccionan células en las cuales el gen de XBP-1 introducido ha sido recombinado de manera homologa con el gen de XBP-1 endógeno (véase Li, E. y colaboradores (1992) Cell 69:915). Las células seleccionadas 25 son después inyectadas en blastocistos de un animal (por ?__ ______&______¿ » J _ ' * i * __a^___j^______fj__|Íj___.-..-..i átájOUmc? 4. i**^.«* .,__.-...- _J__^.«1^^ . I __._l___t_l ejemplo, un ratón, para formar quimeras de agregación (véase por ejemplo, Bradley, A. en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell: A Practical Approaach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152). Un embrión quimérico puede ser €te'spués implantado en un animal adoptivo hembra pseudo a término. La progenie homologa en sus para criar animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN recombinado de manera homologa por transmisión de líneas germinal del transgen. Métodos para construir vectores de recombinación homologa y animales recombinantes homólogos se describen adicionalmente en Bradley, A. (1991) Current Opinión in Biotechnology 2:823-829 y en la publicación internacional PCT números WO90/11354 de Le Mouellec y colaboradores; WO91/01140 por Smithies y colaboradores; WO 92 0968 por Zijlsan y colaboradores; y WO 93/04169 por Berns y 'colaboradores En una modalidad del ensayo de tamizado, compuestos probados pa[ra determinar su capacidad de modular el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T se ponen en contacto con células deficiente en cuanto a XBP-1 mediante la administración del compuesto de prueba a un animal humano deficiente en cuanto a XBP-1 in vivo y mediante la evaluación del compuesto de prueba sobre el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T en el animal. El compuesto de prueba puede ser administrado a un animal no humano deficiente en cuanto a XBP-1 como una composición farmacéutica. Tales composiciones comprenden típicamente el compuesto de prueba y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se emplea aquí el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios y dispersión, revestimientos, compuestos antibacterianos y antifungales, compuestos de retardo de absorción e isotónicos y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y compuestos para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la media en que un medio convencional o compuesto de este tipo es incompatible con el compuesto activo. Su uso en la composición se contempla. Compuestos activos suplementarios pueden también ser incorporados en las composiciones. Una composición farmacéutica de la presente invención es formulada para que sea compatible con su vía de administración contemplada. Por ejemplo, soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral intradérmica o subcutánea puede incluir los siguiente componentes: un diluyente estéril como por ejemplo agua para inyección, solución salina, aceite fijados, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol o bien otros solvente sintéticos; compuestos antibacterianos tales como alcohol etílico o metilparabens; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; compuestos de quelacíón tales como ácido etilendiamintetraacético; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos y compuestos para ajustar la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ser ajustado con ácidos o bases, como por ejemplo ácido clorhídrido o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encontrarse en ampolletas, jeringas desechables o bien frascos para dosis múltiples elaborados de vidrio o plástico. Composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando están solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. Para administración intravenosa, vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL ® (BASF, Parsipppany NJ) o bien solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que existe una capacidad fácil de aplicación con jeringa debe ser adecuada en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser conservada contra la acción contaminante de organismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo mediante el uso de un revestimiento como por ejemplo lecitina, mediante el , I mantenimiento del tamaño requerido de partículas en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de microorganismo puede lograrse a a través de varios compuestos antibacterianos y antifungales, por ejemplo parabens, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, tímerosal, y similares. En muchos casos, es preferible incluir compuesto isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada mediante la inclusión en la composición de un compuesto que retarda la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina. Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno de los ' ingredientes mencionados arriba o bien con una combinación de los ingredientes mencionados arriba, según lo requerido, seguido por esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingrediente requeridos seleccionados entre los mencionados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado en vacío y liofilización que proporciona un polvo del ingrediente activo I más cualquier otro ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo. Composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden encontrarse en cápsulas de gelatina o bien comprimidas en tabletas. Para el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser incorporado con excipientes y utilizado en forma de tabletas, grajeas o cápsulas. Composiciones orales pueden ser también preparadas empleando un vehículo fluido para su uso como enjuague bucal en donde el compuesto en el vehículo fluido es aplicado oralmente y se hacen gárgaras y se expectora o se traga. Compuestos de enlace farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes pueden ser incluidos como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, grajeas y similares pueden contener cualesquiera de los siguientes ingredientes, o i compuestos de una naturaleza similar: un aglomerante como por ejemplo, celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente como por ejemplo almidón o lactosa. un compuesto desintegrante como por ejemplo ácido algínico, Primogel, o bien almidón de maíz; un lubricante como por ejemplo estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante como por ejemplo dióxido de silicio coloidal; un compuesto oxidante como por ejemplo sucrosa o sacarina; o bien un compuesto saborizante, cómo por ejemplo sabor a menta, salicilato de metilo o bien sabor a naranja. En una modalidad, los compuestos de prueba se preparan con vehículos que protegen el compuesto contra una eliminación rápida del cuerpo, como por ejemplo formulación de liberación controlada incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Polímeros biocompatibles, biodegradables, pueden ser utilizados, como por ejemplo etilenvinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágena, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Métodos para la preparación de tales formaciones serán aparentes a los expertos en la materia. Los materiales pueden también ser obtenidos comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensiones liposomales {incluyendo líposomas enfocados hacia células infectadas con anticuerpo monoclonales para antígenos virales) pueden también ser utilizadas como vehículos farmacéuticamente aceptables. Pueden prepararse de conformidad con métodos conocidos por parte de los expertos en la materia, por ejemplo, de conformidad con lo descrito en la patente norteamericana número 4,522,811. En otra modalidad, compuestos que modulan el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o actividad de subgrupos de células T son identificados mediante la puesta en contacto de células deficientes en cuanto a XBP-1 ex vivo con uno o varios compuestos de prueba y mediante la determinación del efecto del compuesto de prueba sobre el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T. En una modalidad, células deficientes en cuanto a XBP-1 en contacto con un compuesto de prueba ex vivo pueden ser readministradas a un sujeto. Para la práctica del método de tamizado ex vivo, células" -deficientes en cuanto a células XBP-1 pueden ser aisladas de un animal no humano deficiente en cuanto a XBP-1 o embrión a través de métodos estándares o incubadas (es decir, cultivadas) in vitro con un compuesto de prueba. Hepatocitos y células linfoides (por ejemplo, células B o células T) pueden ser aislados de animales deficientes en cuanto a XBP-1 o técnicas estándares. Después del contacto de las células deficientes en cuanto XBP-1 con un compuesto de prueba (ya sea ex vivo o in vivo) , el efecto del compuesto de prueba sobre el crecimiento de las células de hepatocitos o diferenciación de células plasmáticas o actividad de subgrupos de células T puede ...jjy-^^^ k^íak .iYli.íéiíi Mi-iíl determinarse a través de cualesquiera de varios métodos adecuados, incluyendo análisis microscópico de luz de las células, análisis histoquímico de las células, análisis de la capacidad proliferativa de las células o análisis de la producción de la citocina Th2. Por ejemplo, para monitorear la proliferación de hepatocitos se puede monitorear la absorción de timidina radiomarcada, absorción de BrdU, tinción TÚNEL (para monitorear la apóptosis) o bien inducción de la transcripción de genes tempranos inmediatos (ver ejemplo 1) . Para monitorear la diferenciación de células plasmáticas, se puede monitorear, por ejemplo, la secreción de inmunoglobulina o la regulación ascendente de la expresión de Syndecan-1 (ver ejemplo 2) . Para monitorear la actividad de subgrupos de células T, se puede monitorear, por ejemplo, la producción de citocina Th2 versus Th2 por Elisa (ver ejemplo 4) . Un compuesto de prueba es identificado como modulador de crecimiento de hepatocitos o diferenciación de células plasmáticas o actividad de subgrupos de células T con base en su capacidad de modular el crecimiento de hepatocitos deficientes en XBP-1 o células T deficientes en XBP-1 de la actividad de subgrupos de células T en comparación con un control apropiado (por ejemplo células no tratadas o bien células tratadas con un compuesto de control o vehículo que no modula el crecimiento de hepatocitos ni la diferenciación de células plasmáticas ni la actividad de subgrupos de células T) . Varios compuestos de prueba pueden ser evaluados utilizando los ensayos de tamizados descritos en las subsecciones A y B en ciertas modalidades, los compuestos a probar pueden ser derivados de bibliotecas (es decir, todos los miembros de una biblioteca de compuestos) . Mientras que el uso de bibliotecas de péptidos es bien establecido en la técnica, nuevas técnicas han sido desarrolladas las cuales han permitido la producción de mezclas de otros compuestos como por ejemplo benzodiazepinas (Bunin y colaboradores (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:10987; DeWitt y colaboradores (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90;6909), peptoides (Zuckennann (1994) J. Med Chem 37:2618) oligocarba atos (Cho y colaboradores (1993) Science 261:1303-) e hidantoinas (DeWitt y colaboradores supra) . Un enfoque par la síntesis de bibliotecas moleculares de pequeñas moléculas orgánicas con una diversidad de 104-105 ha sido descrita (Carell y colaboradores (1994) Angew. Chem Int. Ed Engl. 33:2059-Carrell y colaboradores (1994) Angew. Chem Int. Ed. Engl. 33:2061). Los compuestos de la presente invención pueden ser obtenidos utilizando cualesquiera de los números de sus enfoque en métodos de biblioteca de combinación conocidos en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas en fase de solución o fase sólida paralelas espacialmente accesibles, métodos de bibliotecas sintéticas que requieren de una desconvolución, el método de biblioteca de "una perla un compuesto", y métodos de bibliotecas sintéticas que utilizan selección por cromatografía de afinidad. El enfoque de bibliotecas biológicas es limitado a bibliotecas de péptidos, mientras que los demás cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de péptidos, oligómeros no péptidos o bien I moléculas pequeñas de compuestos (Lam, K.S. (1997)} otros métodos ejemplares para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo, en : Erb y colaboradores (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:11422; Horwell y colaboradores (1996) Immunopharmacology 33:68-; - and in Gallop y colaboradores (1994); J. Med Chem 37; 1233- . Bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solución (por ejemplo, Joughten (1992) Biotechniques 13:412-42 1), o bien en perlas (Lam (199 1) Nature 354:82-84), lascas (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacteria (Ladner USP 5,223,409), I esporas (Ladner USP 409) , plásmidos (Culi y ' colaboradores (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) o bien fagos (Scott and Smith (1990) Science 249:3 86-390) ; I (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla y colaboradores (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991 I) J I Mol. Biol, 222:301-310); en otra modalidad, los polipéptidos de combinación son producidos a partir de una biblioteca de ADNc. _-. M .______ta__... a__ -a_?_. Ati-fc. <?»*-ec-«-*a.Jfc-»j Compuestos ejemplares que pueden ser tamizados para actividad incluyen, sin limitarse a ellos, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, pequeñas moléculas orgánicas, y bibliotecas de extractos de productos naturales. II. Métodos para modular el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de .subgrupos de células T En otro aspecto, la invención presenta un método para modular el crecimiento de hepatocitos o diferenciación de células plasmáticas o actividad de subgrupos de células T mediante la puesta en contacto de hepatocitos o células B (precursores de células plasmáticas) o células T (precursoras de células T) -con un modulador de la actividad de XBP-1 de tal manera que se module el crecimiento de los hepatocitos o la diferenciación de las células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T. Los métodos de modulación de la invención son particularmente interesantes para su uso en la expansión de poblaciones de hepatocitos o células plasmáticas o subgrupos de células T in vitro para su administración a un sujeto con subconjunto de células T o célula plasmáticas o hepatocitos insuficientes. La invención permite también la modulació? del crecimiento aberrante de hepatocitos o de la diferenciación aberrante de células plasmáticas o de la actividad aberrante de subgrupos de células T en un sujeto, in vivo, mediante la ,_.•-___._*•_, .___.t______ter__ __&__> ___&l_______í _________L administración del sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un modulador de la actividad de XBP-1 de tal manera que se module el crecimiento aberrante de hepatocitos o la diferenciación aberrante de células plasmáticas o la actividad aberrante de subgrupos de células T en un sujeto. El término "sujeto" tiene el propósito de incluir organismos vivos pero los sujetos preferidos son mamíferos. Ejemplos de sujetos que incluyen seres humanos, monos, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, cabras y ovejas. La modulación de XBP-1, por consiguiente, proporciona un medio para regular el crecimiento aberrante de hepatocitos o la diferenciación aberrante de células plasmáticas o la actividad aberrante de subgrupos de células T en varios estados de enfermedad. En una modalidad, para estimular el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de células de Th2, el modulador estimula la actividad de XBP-1. En otra modalidad, para inhibir el crecimiento de hepatocitos o para inhibir la diferenciación de células plasmáticas o para inhibir la actividad de células Th2, el modulador inhibe la actividad de XBP-1. La identificación de compilestos que modulan el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T mediante la modulación de la actividad de células XBP-1 permite la manipulación fr_L_».__ ii.Jf selectiva de hepatocitos o células plasmáticas o células T auxiliares en varias situaciones clínicas utilizando métodos de modulación de la presente invención. Los métodos de estimulación de la invención (es decir, métodos que utilizan "> « agente de estimulación) resultan en una actividad incrementada de XBP-1, lo que estimula el crecimiento de epatocitcís y la diferenciación de células plasmáticas y I actividad de células Th2. En contraste, los métodos de inhibición de la invención, (es decir, métodos que utilizan un agente de inhibición) inhiben la actividad de XBP-1 e inhiben el crecimiento de hepatocitos y la diferenciación de células plasmáticas y la actividad de células Th2, de conformidad con lo demostrado en los ejemplos. Así, para tratar un trastorno en donde la inhibición del crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de células Th2 es benéfica, se selecciona un método de inhibición de la presente invención I de tal manera que se inhiba la actividad de XBP-1. Ejemplo de trastornos en los cuales estos métodos de inhibición pueden ser útiles; incluyen carcinoma hepatocelular, mieloma múltiple, enfermedades autoinmunes caracterizadas por la producción de anticuerpos patogénicos, y trastornos que involucran la actividad indeseada de células Th2 (de conformidad con lo comentado adicionalmente abajo) . Alternativamente para tratar un trastorno en donde la fc-_.¿_ __-.-_¡á-i'>-t-y~M-_____..--.-._-____jhj_-^^ jc li estimulación del crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de células Th2 es benéfica, se selecciona un método de estimulación de la presente invención de tal manera que se regule de manera ascendente la actividad de XBP-1. Ejemplo de situaciones en las cuales estos métodos de estimulación pueden ser útiles incluyen lesión hepática, insuficiencia hepática provocada por enfermedad hepática, por ejemplo enfermedad viral, como por ejemplo hepatitis, insuficiencia hepática provocada por toxinas hepáticas (como por ejemplo cirrosis), trastorno de inmunodeficiencia caracterizados por una producción insuficiente de anticuerpos, trastornos que involucran la actividad no deseada de células Thl (comentado adicionalmente abajo) así como el uso en la mejora de respuestas humorales a patógenos en un sujeto y para mejorar la eficacia de vacunación en un sujeto. La aplicación de métodos moduladores en la invención al tratamiento de un trastorno puede resultar en la cura del trastorno, una disminución en cuanto al tipo o número de síntomas asociados con el trastorno, ya sea a largo plazo o a corto plazo, (es decir mejora de la condición) o bien simplemente un efecto benéfico pasajero para el sujeto. La aplicación de los métodos de inmunomodulación de la presente invención se describe con detalles abajo. A. Compuestos inhibidores S¡_¡____at___ »aAtt»»-^"^s**fc*-» ' Puesto que la inhibición de la actividad de XBP-1 está asociada con la inhibición del crecimiento de hepatocitos y diferenciación de células plasmáticas y actividad de células Th2, para inhibir el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de células Th2, las células están en contacto con un agente que inhibe la actividad de XBP-1. Células pueden estar en contacto con el agente in vitro y después las células pueden ser administradas a un sujeto, o bien alternativamente, el agente puede ser administrado al sujeto. Los métodos de la presente invención que utilizan compuestos inhibidores de XBP-1 pueden ser utilizados en el tratamiento de trastornos en donde el crecimiento de hepatocitos ~o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de células Th2 es realzada, estimulada, regulada de manera ascendente o similares. Por ejemplo, el carcinoma hepatocelular está asociado con la proliferación incrementada de hepatocitos, mientras que múltiples mielomas y ciertas enfermedades autoinmunes están asociados con una producción incrementada de inmunoglobulina por células plasmáticas. Por consiguiente, trastornos preferidos para su tratamiento, utilizando el compuesto inhibidor de la presente invención incluyen carcinoma hepatocelular, miola a múltiple, trastornos autoinmunes caracterizados por una producción incrementada de inmunoglobulina así como trastornos que involucran una _-_.._ te_itg.*il«__-__-t.áa?_tf--<«"-*»"• ? a?^t?,, actividad de células Th2 no deseada (se comenta con mayores detalles abajo) . Compuestos inhibidores de la presente invención, pueden ser, por ejemplo, moléculas de enlace intracelular que actúan para inhibir específicamente la expresión o actividad de XBP-1. Como se emplea aquí, el término "molécula de enlace intracelular" tiene el propósito de abarcar moléculas que actúan intracelularmente para inhibir la expresión o actividad de una proteína mediante unión con la proteína o con un ácido nucleico, por ejemplo, una molécula de ARNm, que codifica la proteína. Ejemplos de moléculas de enlace intracelular, descritas con detalles adicionales abajo, incluyen ácidos nucleicos de antisentido, anticuerpos intracelular, compuestos péptidos que inhiben la interacción de XBP-1 con una molécula blanco así como agente químicos que inhiben específicamente la actividad de XBP-1. i. Moléculas de ácido nucleico de antisentido En una modalidad, un compuesto de inhibidor de la presente invención es una molécula de ácido nucleico de antisentido que es complementaria de un gen que codifica XBP-1 o bien de una porción de dicho gen, o bien un vector de expresión recombinante que codifica dicha molécula de ácido nucleico de antisentido. El uso de ácidos nucleicos de antisentido para regular de manera descendente la expresión de una proteína particular de una célula es bien conocida en la técnica _A_. __»i ,fe_,__-!_-.. (véase Weintraub, H. Y colaboradores, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis (ARN de antisentido como herramienta molecular para análisis genético) Reviews - rends in Genetics, Vol 1(1) 1986; Askari, F.K. and IScDonnell, W.M. (1996) N. Eng. J. Med. 334:316-318; Bennett, H.R. and Schwartz, S.M. (1995) Circulation 92:1981-1993; Üercola, D. And Cohén, J.S. (1995) Cáncer Gene Ther. 2:47-59; Eossi, J.J. (1995) Br. Med Bull. 51:217-225; Wagner, R.W. (1994) Nature 372:333-335) una molécula de ácido nucleico de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos complementaria de la cadena codificadora de otra molécula de ácido nucleico (por ejemplo una secuencia de ARNm) y por consiguiente puede enlazarse con hidrógeno a la cadena codificadora de la otra molécula de ácido nucleico. Secuencia de antisentido, complementarias de una secuencia de un ARNm pueden ser complementarias de una secuencia encontrada de la región codificadora del ARNm, la región no traducida 5X 3' del ARNm o una región de puente entre la región codificadora y una región no traducida (por ejemplo, én la unión de la región no traducida 5' y la región codificadora) . Además un ácido nucleico de antisentido puede estar en secuencia de manera complementaria con una región reguladora del gen que codifica el ARNm, por ejemplo, una secuencia de inicio de transcripción o elemento de regulación. De preferencia, un ácido nucleico de antisentido es diseñado de tal manera que a.t__á sea complementario de una región precedente o de tal manera que abarque el codón inicial en la cadena de codificación o en la región no traducida 3' de un ARNm. Dada la secuencia conocida de nucleótidos para la cadena codificadora del gen de XBP-1 (y por consiguiente la secuencia conocida del ARNm de¡XBP-l), ácidos nucleicos de antisentido de la presente invención pueden ser diseñados de conformidad con las reglas de apareamiento de bases Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico de antisentido puede ser complementaria de la región codificadora entera de un ARNm de XBP-1, pero con mayor preferencia es un oligonucléotido que es de antisentido solamente con relación a una parte de la región codificadora o no codificadora de un ARNm de XBP-1 por ejemplo, el oligonucléotido de antisentido puede ser complementario de la región que rodea el sitio de inicio de traducción de un ARNm de XBP-1. Un oligonucléotido de antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Un ácido nucleico de antisentido de la presente invención puede ser construido utilizando síntesis química y reacciones de ligación enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido ¡nucleico de antisentido (por ejemplo, un oligonucléotido de antisentido) puede ser sintetizado químicamente utilizando nucleótidos que ocurren naturalmente o bien nucleótidos modificados de manera variada -¿>c^__-«_~-c¡a diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o bien para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos de antisentido y sentido, por ejemplo, derivados de fosforotioato así como nucleótidos sustituidos con acridina pueden emplearse. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden ser utilizados para generar ei (ácido nucleico de antisentido incluyen 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-iodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitocina, 5- (carboixídroxilmentil) uracilo, 5-carboximetilaminomentil-2 tiouridina, 5-carboximetilamdnometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2, 2-dimetilguanina, 2- etiladenina, 2-metilguani_aa, 3, metilcitocina, 5-metilcitocina, N6-adeni??a, 7-metilguanina, 5- et ilaminomet ilur aci lo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5' -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltic-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5- oxiacético (v) , wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitocina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouiracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3- (amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3) w, y 2, 6-diaminopurina . Para inhibir la expresión de XBP-1 en células en cultivo, uno o varios oligonucléotidos de \--* j?^-'^*t »I^MáU?Í^?i ?'^^ -^ptA^ antisentido pueden ser agregados a células en medio de cultivo. Alternativamente, un ácido nucleico de antisentido puede ser producido biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual la totalidad o una porción de ADNc de XBP-1 ha sido subclonada en una orientación de antisentido (es decir, ácido nucleico transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de orientación de antisentido con relación a un ácido ¡nucleico objetivo de interés) . Secuencias reguladoras enlazadas operativamente a un ácido nucleico clonado en la orientación de antisentido pueden ser seleccionadas las cuales dirigen la expresión de la molécula ARN de antisentido en una célula de interés, por ejemplo, promotores y/o realzadores o bien otras secuencias reguladoras pueden seleccionarse las cuales dirigen la expresión constitutiva, específica para tejido o inducible de ARN de antisentido. El vector de expresión de antisentido es preparado de conformidad con métodos de ADN recombinante estándares para I la construcción de vectores de expresión recombinante, iexcepto que el ADNc de XBP-1 (o bien una porción del mismo) es clonado en el vector en la orientación de antisentido. El ivector de expresión de antisentido puede tener la forma, por ejemplo, de un plásmido recombinante, fagémido o bien virus atenuado. El vector de expresión de antisentido es introducido en células utilizando una técnica de transfección estándar. Las moléculas de ácido nucleico de antisentido de la presente invención son administradas típicamente a un sujeto o generadas in si tu de tal manera que se hibriden o se unan a ARNm celular y/o ADN genómico que codifica una proteína XBP-1 con el objeto de inhibir de esta forma la expresión de la i proteína, por ejemplo, mediante la inhibición de la transcripción y/o traducción. La hibridación puede efectuarse a través de complementaridad de nucleótidos convencionales para formar un dúplex estable, o bien, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico de antisentido que se une a dúplex ADN a través de interacciones específicas en la hendidura mayor de la doble hélice. Un ejemplo de una vía de administración de una molécula de ácido nucleico de antisentido de la presente invención incluye la administración directa en un sitio tisular. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico de antisentido puede ser modificada para enfocar células seleccionadas y después administrada sistémicamente. Por ejemplo, en el caso de administración sistémica, una molécula de antisentido puede ser modificada de tal manera que se una específicamente a un receptor o un antígeno expresado en una superficie celular seleccionada, por ejemplo, mediante enlace de la molécula de ácido nucleico de antisentido con un péptido o un anticuerpo que se une a un receptor de superficie celular o antígeno. La molécula de ácido nucleico de antisentido puede también ser administrada a células utilizando los vectores descritos aquí. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas de antisentido, se prefieren constructos de vector en los cuales la molécula de ácido nucleico de antisentído es colocada bajo el control de un promotor fuerte pol II o pol III. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico de antisentido de la presente invención es una molécula de ácido nucleico a-anomérica. Una molécula de ácido nucleico a- anomérica forma híbridos de doble cadena específicos con ARN complementario en donde, a diferencia de las unidades P habituales, las cadenas son paralelas entre ellas (Gaultier y colaboradores (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico de antisentido puede comprender también un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue y colaboradores (1987) Nucleic Acids Res. 15 : 6131 -6148) o bien un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y colaboradores (1987) FEBS Lett. 215:327-330) . En otra modalidad, un ácido nucleico de antisentido de la presente invención es una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad ribonocleasa que pueden disociar un ácido nucleico de cadena única, por ejemplo, un ARNm, con el cual tiene una región complementaria. Así, ribozimas (por ejemplo ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haelhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) pueden utilizarse para disociar catalíticamente transcritos de ARNm de XBP-1 con el objeto de inhibir de esta forma la traducción de ARNm de XBP-1. Una ribozima que tiene especificidad para un ácido nucleico que codifica XBP-1 puede ser diseñada con base en la secuencia de nucleótídos del ADNc de XBP-1. Por ejemplo, un derivado de un ARN de Tetrahimena L-19IVS puede ser construido en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos a disociar en un ARNm que codifica XBP-1. Véase, por ejemplo, Cech y colaboradores patente norteamericana número 4,987,071 y Cech y colaboradores patente norteamericana número 5,116,742. Alternativamente, se puede utilizar ARNm de XBP-1 para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad ribonucleasa específica a partir de un grupo de moléculas de ARN. Véase, por ejemplo, Bartel D. y Szostak, J: W: (1993) Science 261:1411-1418. Alternativamente, la expresión de gen de XBP-1 puede ser inhibida mediante el enfoque de secuencias de nucleótidos I complementarias de la región reguladora de región de XBP-1 (por ejemplo, un promotor y/o realzador de XBP-1) para formar estructuras helicoidales triples que previenen la transcripción de un gen de XBP-1 en células blanco. Véase generalmente, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. y colaboradores (1992) Ann N: Y: Acad. Sci . 660:27-36; y Maher, L: J: (1992) Bioassays 14(12) :807-15. ii. Anticuerpos intracelulares Otro tipo de compuesto inhibidor que puede utilizarse para inhibir la expresión y/o actividad de proteína XBP-1 en una I célula es un anticuerpo intracelular específico para XBP-1 comentado aquí. El uso de anticuerpos intracelulares para inhibir la función de proteína en una célula es conocido en la técnica (véase por ejemplo, Carlson, J. R. (1998) Mol Cell . Biol . 8:2638-2646; Bicoca, S. y colaboradores (1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T. M. y colaboradores (1990) FEBS Letters 274:193-198; Carlson, J: R: (1993) Proc. Natl . Aad. Sci . USA 90:7427-7428; Marasco W. A. y colaboradores (1993) Proc. Natl . Acad. Sci . USA 90:7889-7893; Biocca, S. y colaboradores (1994) Bio/Technology 12: 396-399; Chen, S-Y y colaboradores (1994) Human Gene Therapy 5:595-601; Duan, L. y colaboradores (1994) Proc. Natl . Acad. Sci . USA 91:5075-5079; Chen, S-Y. y colaboradores (1994) Proc. Natl . Acad. Sci . USA 91:5932-5936;m Beerli, R. R. y colaboradores (1994) J. Biol . Chem. 269:23931-23936; Beerli, R.R. y colaboradores (1994) Biochem. Biophys. Común . 204:666-672; Mhashilkar, A. M. y colaboradores (1995) EMBO J. 14:1542-155 1; Richardson, J. H. Y colaboradores (1995) Proc. Natl . Acad. Sci . USA 92:2127-3141; Publicación PCT No. WO94/02610 por Marasco y colaboradores; y Publicación PCT No. WO 95/03832 por Duan y colaboradores) . Para inhibir la actividad de proteína utilizando un anticuerpo intracelular, se prepara un vector de expresión recombinante que codifica las cadenas de anticuerpo en una forma tal, que al momento de la introducción del vector en una célula, las cadenas' de anticuerpo son expresadas como un anticuerpo funcional en un compartimiento intracelular de la célula. Para inhibir la actividad de factor de transcripción de conformidad con los métodos de inhibición de la presente invención, de preferencia un anticuerpo intracelular que se une específicamente al factor de transcripción es expresado dentro del núcleo de la célula. La expresión nuclear de un anticuerpo intracelular puede lograrse mediante la remoción de los genes de cadena ligera y pesada de anticuerpo de las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias líderes hidrofóbicas de terminal N y mediante la adición de secuencias de nucleótidos que codifican una señal de localización nuclear ya sea en la terminal N o bien en la terminal C de los genes de cadena ligera y cadena pesada (véase, por ejemplo, Bicoca, S. y colaboradores (1990) EMBO J. 9:101-108; Mhashilka^:, A. M. y colaboradores (1995) EMBO J. 1_4 : 1542-1551) . Una señal preferida de localización nuclear a utilizar para enfoque nuclear de las cadenas de anticuerpos intracelulares es la señal de localización nuclear de a^_^a«I---. ,_?__,,i_ri_j__.-_. antígeno T Grande de SV40 (véase Bicoca, S. y colaboradores (1990) EMBO J. 9:101-108; Mhashilkar, A. M. y colaboradores (1995) EMBO J. 14:1542-1551). Para preparar un vector de expresión anticuerpo intracelular, ADNc dé cadena ligera y de cadena pesada de anticuerpos ue1 codifican cadenas de anticuerpo específicas para la proteina I de intjerés objetivo, por ejemplo, proteína de XBP-1, es aislado típicamente de un hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal específico para proteína XBP-1. Anticuerpos de proteína de XBP-1 pueden ser preparados mediante la inmunización de un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón, o bien otro mamífero) con un inmunógeno de proteína XBP-1. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, proteína XBP-1 expresada recombinantemente o bien un péptido de XBP-1 sintetizado químicamente. La preparación puede incluir además un adyuvante, como por ejemplo adyuvante completo o incompleto de Fr und, o bien un compuesto inmuno-estimulador similar. Células que producen anticuerpos pueden ser obtenidas del sujeto y pueden ser utilizadas para preparar anticuerpos onocl?nales mediante técnicas estándares, como por ejemplo la técnica hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1995), Nature 256-495-497) (véase también, Brown y colaboradores (1981) J. Immunol 127:539-46; Brown y colaboradores (1980) J. Biol . Chem 255:490-83; Yeh y colaboradores (1976) PNAS 76:2927-3 1; y Yeh y colaboradores (1982) Int. Cáncer 29:269-75) .La tecnología para la producción de hibridomas de anticuerpo monoclonal es bien conocida (véase generalmente, R. H. Kenneth, en Monoclonal 5 Antibodies: A New Dimensión In Biological Analices Anticuerpos Monoclonales: Una Nueva Dimensión en Análisis Biolicos), Plenum Publishing Corp., Nueva York, Nueva York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol . Med, 54387-402; M: L: Gefter y colaboradores (1977) Somatic Cell Genet . , 3:231- 10 36) . En resumen, una línea de células inmortales (típicamente un mieloma) es fusionada con linfocitos (típicamente esplenocitos) a partir de un mamífero inmunizado con un • inmunógeno de proteína XBP-1 de conformidad con lo descrito arriba, y los sobrenadantes de cultivo de las células de 15 hibridoma resultantes son tamizados para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente con la proteína de XBP-1. Cualesquiera de los muchos protocolos conocidos utilizados para fusionar linfocitos y líneas de células inmortalizadas puede aplicarse 20 para el propósito de generar un anticuerpo monoclonal de proteína anti-XBP-1 (véase, por ejemplo, G. Galfre y colaboradores (1977) Nature 266:5 50-52; Gefter y colaboradores Somatic Cell Genet. , citado arriba; Lerner, Yale J. Biol . Med, citado arriba; Kenneth, Monoclonal 25 Antobodies {Anticuerpos Monoclonales] , citado arriba) .
Má____M____É____b__Í_______i V Además, la persona con conocimientos normales en la materia observará que existen muchas variaciones de tales métodos que son también útiles. Típicamente, la línea de células inmortales (por ejemplo, una línea celular de mieloma) se deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, hibridomas de murino pueden formarse mediante la fusión de linfocitos de un ratón inmunizado ccn una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea de células de ratón inmortalizadas. Líneas de células inmortales preferidas son líneas de células de mieloma de ratón sensibles a medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT") . Cualesquiera de numerosas líneas de células de mieloma pueden ser utilizadas como socio de fusión de conformidad con técnicas estándares, por ejemplo, las líneas de mieloma, P3-NSl/l-Ag4-l, P3-x63- Ag653 o bien Sp2/0-Agl4 Estas líneas de mieloma están disponibles en el American Type Culture Collection (ATCC), Rockvill, Md. Típicamente, células de mieloma de ratón sensibles a HAT son fusionadas sobre esplenocitos de ratón utilizando polietileno glicol ("PEG") . Células de hibridoma que resultan de la fusión son después seleccionadas empleando un medio HAT, que mata las células de mieloma no fusionadas o bien fusionadas de manera improductiva (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días puesto que no son transformados) . Células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína de XBP-1 son identificadas por tamizado de los sobrenadantes de cultivo de hibridoma para tales anticuerpos, empleando por ejemplo un ensayo ELISA estándar. De manera alternativa a la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, un anticuerpo monoéloial que se une a XBP-1 puede ser identificado y aislado ellante el tamizado de una biblioteca de inmunoglobulina de combinación recombinante (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos de anticuerpos) con una proteína o péptido del mismo, para aislar de esta forma miembros de biblioteca de inmunoglobulina que se unen específicamente a la proteína. Kits para la generación y el tamizado de bibliotecas de despliegue de fagos están disponibles en el comercio (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, "Sistema de Anticuerpo de Fagos Recombinantes de Pharmacia", No. de Catálogo 27-9400-01; y el SurfZAI^ Phage Display Ki t de Stratagene, No. de Catalogo 240612) . Adicionalmente, ejemplos de métodos y compuestos particularmente adecuados para su uso en la generación y en el tamizado de biblioteca de despliegue de anticuerpos pueden encontrarse, por ejemplo, en La ner y colaboradores, patente norteamericana número 5,223,409; Kang y colaboradores Publicación Internacional No. WO 92/18619; Dower y colaboradores Publicación Internacional No. WO 91/1727 1; Winter y colaboradores Publicación Internacional WO 92/20791; Markland y colaboradores Publicación Internacional No. WO 92/15679; Breitling y colaboradores Publicación Internacional WO 93/01288: McCafferty y colaboradores Publicación International No. WO 92/01047; Garrard y colaboradores Publicación Internacional No. HO 92/09690; Fuchs y colaboradores (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay y colaboradores (1992) Hum Antibod híbridomas 3:81-85; Huse y colaboradores (1989) Science 246; 1275-128 1; Griffiths y colaboradores (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins y colaboradores (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clarkson y colaboradores (1991) Nature 352:624-628; Gram y colaboradores (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad y colaboradores (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom y colaboradores (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; Barbas y colaboradores (1991) PNAS 88:7978-7982; y McCafferty y colaboradores Nature (1990) 348:552-554. Una vez identificado un anticuerpo monoclonal de interés específico para XBP-1 (por ejemplo , ya sea un anticuerpo monoclonal derivado de hibridoma o un anticuerpo recombinante proveniente de una biblioteca de combinación que tiene anticuerpos monoclonales para XBP-1 que ya son conocidos en i la técnica) , los ADN a codificar en las cadenas ligera y pesada del anticuerpo monoclonal son aislados a través de técnicas de biología molecular estándares. Para anticuerpos -i i" - .i?.Bi??:m. derivados de hibridoma, se puede obtener ADNc de cadena ligera y pesada, por ejemplo, por amplificación, por reacción en cadena de polimerasa o bien tamizado de biblioteca de ADNc. En el caso de anticuerpos recombinantes, como por ejemplo provenientes de una biblioteca de despliegue de fagos, ADNc que codifica las cadenas pesadas y ligeras puede ser recuperado del paquete de despliegue (por ejemplo, fago) aislado durante el proceso de tamizado de biblioteca. Secuencias de nucleótidos de genes de cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo a partir de las cuales se pueden preparar sondas de biblioteca de ADNc o bien cebadores de reacción en cadena de polimerasa son conocidas en la técnica. Por ejemplo, muchas de estas secuencias son divulgadas en Kabat, EA., y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Inmunological Interest, /"Secuencias de proteínas de interés inmunológico] quinta edición , Departamento Norteamericano de Servicios de Salud y Humanos; Publicación NIH No. 91-3242 y en la base de datos de secuencias de línea germinal de ser humano "Vbase". Una vez obtenidas, las secuencias de cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo son clonadas en un vector de expresión recombinante utilizando métodos estándares. Como se comento arriba, las secuencias que codifican los líderes hidrofóbicos de las cadenas ligeras y pesadas son removidas y secuencias que codifican una señal de localización nuclear (del Antígeno T SV40) son enlazadas en marco con secuencias que codifican ya sea la terminal amino o la terminal carboxil tanto de cadena ligera como de cadena pesada. El vector de expresión puede codificar un anticuerpo intracelular en una de varias formas diferentes. Por ejemplo, en una modalidad $ ' el vector codifica cadenas ligeras y pesadas de' anticuerpo de longitud completa de tal manera que se exprese I intracelularmente anticuerpo de longitud completa. En otra modalidad, el vector codifica una cadena ligera de longitud completa pero solamente la región VH/CH I de la cadena pesada 0 como por ejemplo un fragmento Fab es expresada de manera intracelular. En la modalidad más preferida el vector codifica un anticuerpo de cadena única (scFv) en donde las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas están unidas a través de un enlazador flexible de péptido (por 5 ejemplo, (Gly4Ser)3) y se expresa como una molécula de cadena única. Para inhibir la actividad de factor de trascripción en una célula, el vector de expresión que, codifica el anticuerpo intracelular específico para XBP-1 es introducido en la célula a través de métodos estándares de transfección 0 de conformidad con lo descrito arriba. iii Compuestos Peptídicos Derivados de XBP-1 ] En otra modalidad, un compuesto inhibidor de la ¡presente I invención es un compuesto peptídico derivado de la secuencia de aminoácidos de XBP-1. En particular, el compuesto 5 inhibidor comprende una porción de XBP-1 (o bien un mimético del mismo) que media la interacción en XBP-1 con una molécula blanco de tal manera que el contacto XBP_! con éste compuesto peptídico inhiba competitivamente la interacción de XBP-1 con la molécula objetivo. Por ejemplo, el compuesto de péptido puede ser diseñado con base en la región b-Zip de XBP-1 que media la interacción XBP-1 con Ic-Fos. 81 compuesto peptídico de la siguiente invención puede formarse intracelularmente en células mediante la introducción en las células de un vector de expresión que codifica el péptido. Tales vectores de expresión pueden elaborarse a través de técnicas estándares utilizando oligonucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos del compuesto peptídico. El péptido puede ser expresado en forma intracelular como fusión con otra proteína o péptido (por ejemplo, una fusión GST) . De manera alternativa a la síntesis recombinante de los péptidos en las células, los péptidos pueden elaborarse mediante síntesis química utilizando técnicas estándares ' de síntesis de péptidos. Péptidos sintéticos pueden ser introducidos en células a través de varios medios conocidos en la técnica para introducir péptidos en células (por ej emplo liposomas, y similares) . Otros agentes inhibidores que pueden ser utilizados para inhibir específicamente la actividad de una proteína XBP-1 son compuestos químicos que inhiben directamente la actividad de XBP-1 o inhiben la interacción entre XBP-1 y moléculas objetivo. Tales compuestos pueden ser identificados utilizando ensayos de tamizado que selecciona tales compuestos, de conformidad con lo descrito con detalles arriba. B. Compuesto Estimulador Puesto que la Regulación descendente de XBP-1 está asociada con el crecimiento disminuido de hepatocitos la diferenciación menor de células plasmáticas y actividad menor 10 de células Th2 un compuesto que estimula específicamente la actividad de XBP-1 puede ser utilizado para estimular el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de células Th2. En los métodos estimuladores de la presente invención, un sujeto es tratado 15 con un compuesto estimulador que estimula la expresión y/o actividad de XBP-1. Los métodos de la presente invención que utilizan compueistos estimuladores de XBP-1 pueden ser utilizados en el tratamiento de trastornos en donde el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células 20 plasmáticas o la actividad e Th2 es inhibido, bloqueado, regulado de manera descendente o similar. Trastornos asociados con un crecimiento disminuido de hepatocitos que pueden beneficiarse de los métodos estimuladores de la presente invención incluyen lesión hepática, insuficiencia 25 hepática provocada por enfermedad hepática (por ejemplo -IJIBIIB?ÉI í I I I I I infección viral, por ejemplo hepatitis) , así como insuficiencia hepática provocada por toxinas hepáticas (por ejemplo, cirrosis) . Trastornos asociados con una diferenciación disminuida de las células plasmáticas que ' pueden beneficiarse de los métodos de estimulación de la presente invención incluyen trastornos de inmunodeficiencia caracterizados por una producción insuficiente de anticuerpos. Además, los métodos para estimular la diferenciación de células plasmáticas son de uso general en la estimulación de respuestas inmunes o morales a patógenos en un sujeto y en respuesta de anticuerpo mejoradas durante i la vacunación de un sujeto. Además, métodos para estimular la actividad de células Th2 pueden ser benéficos en trastornos que involucran la actividad indeseada de células de Thl (para desplazar de esta forma el balance de células Thl versus Th2 hacia la ruta Th2) , o bien trastornos en los cuales la actividad de células Th2 incrementada es indeseable (esto se comenta adicionalmente más adelante) . Ejemplos de compuestos estimuladores incluyen proteína XBP-1 activa, vectores de expresión que codifican XBP-1 así como agentes químicos que estimulan específicamente la actividad de XBP-1. Un compuesto estimulador preferido es una molécula de ácido nucleico que codifica XBP-1, en donde la molécula de ácido nucleico es introducida en el sujeto en la forma adecuada para la expresión de XBP-1 en las células del sujeto. Por ejemplo, un ADNc XBP-1 (secuencia de ADNc XBP-1 de longitud completa o parcial) es clonado en un vector de expresión , recombinante y el vector es transfectado en células S utilizando técnicas estándares de biología molecular. El ADÜc -íXj XBP-1 puede ser obtenido, por ejemplo mediante la amplificación utilizando la reacción en cadena de polímerasa (PCR) o bien mediante tamizado de una biblioteca de ADNc apropiada. Las secuencias de nucleótidos de ADNc XBP-1 es 10 conocida en la técnica y puede utilizarse para el diseño de cebadores de reacción en cadena de polimerasa que permite la amplificación de un ADNc por métodos estándares de reacción en cadena de polimerasa o bien para el diseño de una sonda de hibridación que puede ser utilizada para tamizar una 15 biblioteca de ADNc utilizando métodos estándares de hibridación. Después del aislamiento o amplificación de ADNc XBP-1, el fragmento de ADN es introducido en un vector de expresión adecuada, de conformidad con lo descrito arriba. Moléculas de 20 ácido nucleico que codifica XBP-1 en la forma adecuada para expresión del XBP-1 en una célula huésped, pueden ser preparadas de conformidad con lo descrito arriba empleando secuencias de nucleótidos conocidas en la técnica. Las secuencias de nucleótidos pueden ser utilizadas para el 25 diseño de cebadores de reacción en cadena de polimerasa que permiten la amplificación de un ADNc por métodos estándares de reacción en cadena de polimerasa o bien para el diseño de sondas de hibridación que pueden utilizarse para tamizar una biblioteca de ADNc utilizando métodos estándares de hibridación. Otra forma de un compuesto estimulador para estimular la expresión XBP-1 en una célula es un compuesto químico que estimula específicamente la expresión o actividad de XBP-1 endógeno en la célula. Tales compuestos pueden ser identificados empleando ensayos de tamizado que seleccionan compuestos que estimulan la expresión o actividad de XBP-1 de conformidad con lo descrito aquí. El método de la presente invención para modular el crecimiento de aberrante hepatocitos o la diferenciación aberrante de células plasmáticas o la actividad aberrante de subgrupos de células T en un sujeto puede ser practicado ya sea in vi tro o in vivo. Para practicar el método in vi tro, células puede ser obtenidas de un, sujeto por métodos I estándares e incubadas (es decir cultivadas in vi tro) con un compuesto estimulador o inhibidor de la invención para estimular o inhibir, respectivamente la actividad XBP-1. Métodos para aislar hepatocitos, precursores de hepatocitos, células plasmáticas, precursores de células plasmáticas (Células B) , células T o precursores de células T son conocidos en la técnica. Células tratadas in vi tro ya sea con un compuesto estimulador 0 con un compuesto inhibidor pueden ser administradas a un sujeto para influenciar el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T en el sujeto. Por ejemplo, células pueden ser aisladas de un sujeto, extendidas en cuanto a su numero ín vitro mediante la estimulación de actividad de XBP- 1 en las células Utilizando un agente estimulador (estimulando de esta manera el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células B en células plasmáticas o bien la actividad de células Th2) y después las células pueden ser administradas al mismo sujeto, o bien a otro tejido del sujeto compatible con el donador de las células. Por consiguiente, en otra modalidad, el método modulador de la presente invención comprende el cultivo de hepatocitos o células B o células T in vi tro con un modulador XBP-1 y comprende además la administración de las células a un sujeto con el objeto de modular de esta forma el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T en un sujeto. Al efectuarse el cultivo in vi tro, las células pueden ser diferenciadas en hepatocitos maduros o células plasmáticas o en células Th2, y¡por consiguiente los métodos abarcan la administración de estos hepatocitos maduros o células plasmáticas o células Th2 al sujeto. Para la administración de células a un sujeto puede ser preferido remover primero compuestos residuales en el cultivo de las células antes de su administración al sujeto. Esto puede efectuarse, por ejemplo, mediante centrifugación de gradiente de las células o bien mediante el lavado del tejido. Para comentarios 5 adicionales de modificación genética ex vivo de células seguido por readministración a un sujeto, véase también la patente norteamericana No. 5,399,346 de WF. Anderson y colaboradores . En otras modalidades, un compuesto estimulador o inhibidor es 10 administrado a un sujeto in vivo como la administración de hepatocitos directamente al sitio del hígado de un sujeto o bien la administración de células plasmáticas en la circulación o en el sistema linfoide de un sujeto. Para agentes estimuladores que comprenden ácidos nucleicos (por 15 ejemplo, vectores de expresión recombinante que codifican XBP-1 ARN de antisentido, anticuerpos intracelulares o bien péptidos derivados de XBP-1), los compuestos pueden ser introducidos en células de un sujeto utilizando métodos i conocidos en la técnica para introducir ácido nucleico (por 20 ejemplo ADN) en células in vivo . Ejemplos de tales métodos incluyen: Invección directa : el ADN desnudo puede ser introducido en células in vivo mediante la inyección de directa ADN en las células (véase, por ejemplo, Acsadi y colaboradores (1991) 25 Nature 332:815-818; Wolf y colaboradores (1990) Science 247:1465-1468). Por ejemplo, se puede utilizar un aparato de administración (por ejemplo, una "pistola génica" para inyectar ADN en células in vivo. Dicho aparato se encuentra disponible en el comercio (por ejemplo BioRad) . Mbsorción de ADN mediada por receptores: el ADN desnudo puede "Ser introducido también en células in vivo mediante la formación de complejos de ADN con un catión, por ejemplo polilisina, acoplado a un ligando para un receptor de superficie celular (Véase, por ejemplo Wu, G y Wu, C.H. (1988) J Biol . Chem.263: 14621; IIson y colaboradores (1992) y patente norteamericana No.5, 166,320). La unión del complejo ADN-ligando al receptor facilita la absorción de ADN por endocitosis mediada por receptor. Un complejo ADN ligando enlazado a cápsides de adenovirus que trastornan naturalmente los endoso as, liberando por consiguiente material en el citoplasma puede emplearse para evitar la degradación del complejo por lisosomas intracelulares (véase, por ejemplo, Curiel y colaboradores (1991) Proc. Natl . Acad. Sci . USA 88:8850); Cristiano y colaboradores (1993) Proc. Na tl . Acad. Sci . USA90:2122-2126) . Retrovirus: Retrovirus defectuosos son bien caracterizados para su uso en transferencia de genes para propósitos de terapia génica (para una reseña véase Miller, A.D. (1990) Blood 76:271) . Un retrovirus recombinante puede ser construido el cual tiene una secuencia de nucleótidos de interés incorporada en el genoma retroviral, además, porciones del genoma retroviral pueden ser removidas para hacer que la replicación del retrovirus sea defectuosa. El retrovirus defectuoso en cuanto a replicación es después empacado en viriones que pueden ser utilizados para infectar una célula objetivo a través de la utilización de un virus auxiliar por técnicas estándares. Protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vi tro o in vivo con tales virus pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, [Protocolos Actuales en Biología Molécula] Ausbel, F.M. y colaboradores (eds) . Green Publishing Asociates, (1989), secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio estándares. Ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM que son bien conocidos por parte de los expertos en la materia. Ejemplos de líneas de virus de empaque adecuadas incluyen ? Crip, ?Cre, ?2 y ?Am. Retrovirus han sido utilizados para introducir varios genes en varios tipos diferentes de células, incluyendo células epiteliales, células endoteliales, linfocitos, mioblastos, hepatocitos, células de médula ósea in vitro y/o in vivo (véase, por ejemplo Eglitis, y colaboradores (1985) Science 230:1395-1398; Danos y Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson y colaboradores (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano y colaboradores (1990) Proc. Natl. ..tete_____il_-__-il_-_-___J -^^ * ' Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber y colaboradores (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry y colaboradores (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury y colaboradores (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu y colaboradores (1993) J.Immunol. 150:4104-4115; atente norteamericana No. 4,868,116; patente norteamericana No. 4,980,286; solicitud PCT WO 89/07136; solicitud PCT WO 89/02468; solicitud PCT WO 89/05345; y solicitud PCT WO 89/07573) . Vectores retrovirales requieren de división de célula blanco de integrar el genoma retroviral (y el ácido nucleico foráneo insertado ahí) en el genoma huésped con el objeto introducir de manera estable el ácido nucleico en la célula. Así, puede ser necesario estimular la replicación de la célula objetivo. Adenovirus : El genoma de un adenovirus puede ser manipulado de tal manera que codifique o exprese un producto génico de interés pero de tal manera que sea desactivado en términos de su capacidad para replicarse en un ciclo de vida viral lítico normal. Véase como por ejemplo Berkner y colaboradores (1988) Bio techniques 66:616; Rosenfeld y colaboradores (1991) Science 252:431-434; y Rosenfeld y colaboradores (1992) Cell 68:143-155. Vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 dl324 o bien otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7 etc.) son bien conocidos de los expertos de la materia. Adenovirus recombinantes son provechosos en la medida en que no requieren de la división de células para ser vehículos efectivos para suministrar genes pueden ser utilizados para infectar una amplia variedad de tipos de células, incluyendo epitelio de las vías respiratorias (Rosenfeld y colaboradores (1992) citado supra) , células endoteliales (Lemarchand y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482- 6486), hepatocitos (Herz y Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816) y células de músculo (Quantin y colaboradores (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584) . -Además, el ADN adenoviral introducido (y el ADN foráneo contenido ahí no es integrado en el genoma humano de una célula huésped sino que permanece episomal, evitando por consiguiente los problemas potenciales que ocurren como resultado de mutagénesis de inserción en situaciones en las cuales el ADN introducido se vuelve integrado en el genoma huésped (por ejemplo, ADN retroviral) . Además la capacidad de transporte del genoma adenoviral para ADN foráneo es grande (hasta 8 Kilo bases) en comparación1 con otros vectores que suministran genes Berkner y colaboradores. Citado supra; Haj-Ahmand y Graham (1986) J. Virol. 57:267). La mayoría de los vectores adenovirales defectuosos en cuanto a replicación actualmente utilizados son removidos de la totalidad o de ítfltf f?W-Étit?l i?X'XTÍ partes de los genes de El y E3 virales pero conservan hasta el 80% del material génico adenoviral. Virus asociados con adeno: Un virus asociado con adeno (AAV) es un virus defectuoso que ocurre naturalmente que requiere de otro virus, como por ejemplo adenovirus o herpesvirus, como virus auxiliar para replicación eficiente y para un ciclo de vida productivo. (Para una reseña véase Muziczka y colaboradores. Curr. topics in Micro, and Immunol. (1992)158:97-129). Es también uno de los pocos virus que pueden integrar su 7?DN en células que no se están dividiendo y presenta una alta frecuencia de integración estable (véase, por ejemplo, Flotte y colaboradores (1992) Am. J Respir. Cell. Mol. Biol.7: 349-356; Samulski y colaboradores (1989) J Virol. 63:3822-3828; y McLaughlin y colaboradores. (1989) J. Virol. 62:1963-1973) . Vectores que contienen desde 300 pares de bases AAV pueden ser empacados y pueden ser integrados. El espacio ADN exógeno es limitado a aproximadamente a 4.5 kb. Un vector AAV tal como el descrito en Traschin y colaboradores (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 puede ser utilizado para introducir ADN en células. Varios ácidos nucleicos han sido introducidos en tipos de células diferentes utilizando vectores AAV (véase, por ejemplo Hermonat y colaboradores (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Traschin y colaboradores (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford y colaboradores. (1988) Mol. *tí ¡ * a *m Endocrinol. 2:32-39; Traschin y colaboradores (1984) J. Virol. 51:611-619; y Flotte y colaboradores (1993) j Biol. Chem. 268:3781-3790) . La eficacia de un sistema particular de vectores de expresión y método para introducir ácido nucleico en una célula puede evaluarse a través de enfoques estándares empleados de manera ordinaria en la técnica. Por ejemplo, el ADN introducido en un célula puede ser detectado por una técnica de hibridación de filtro (por ejemplo, análisis Southern Blot) y el ARN producido por trascripción de ADN introducido puede ser detectado, por ejemplo, por análisis Nothern Blot, protección RNasa o bien reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa reversa (RT-PCR) . El producto génico puede ser detectado a través de un ensayo apropiado, por ejemplo, mediante la detección inmunológica de una proteína producida, por ejemplo de un anticuerpo específico, o bien mediante un ensayo funcional para detectar una actividad funcional ¡del producto génico como por ejemplo un ensayo e-nzimáticd. Si los compuestos estimuladores o inhibidores son compuestos químicos que modulan la actividad de XBP-1, los compuestos estimuladores o inhibidores son compuestos químicos que modulan la actividad de XBP-1, los compuestos estimuladores o inhibidores pueden ser administrados a un sujeto como una composición farmacéutica. Tales composiciones comprenden típicamente los compuestos estimuladores o inhibidores y un „., j_i___. _____t__l vehículo farmacéuticamente aceptable. Vehículos farmacéuticamente aceptables y métodos de administración a un sujeto se describen arriba. En cuanto los métodos de la presten invención para modular la actividad de subgrupos T mediante la modulación de la actividad de XBP-1, numerosas condiciones asociadas con una respuesta predominante de tipo Thl o Th2 han sido indentificadas y podrían beneficiarse de la modulación del tipo de respuesta que se observa en el individuo que padece de la condición. La aplicación de los métodos inmunomoduladores de la presente invención a tales enfermedades se describe con detalles adicionales abajo A. Alergias Las alergias son mediadas a través de anticuerpos IgE cuya producción es regulada por la actividad de la células Th2 y las citocinas producidas de esta manera. En reacciones alérgicas, 11-4 es producida por células Th2, que estimula adicionalmente la producción de anticuerpos IgE y activación de células que median reacciones alérgicas, es decir, mastocitos y basófilos. 11-4 desempeña también una función importante en reacciones inflamatorias mediadas por eosinófilos. Por consiguiente, los métodos inhibidores de la presente invención puede ser utilizados para inhibir la producción de citocinas asociadas Th2 y en particular 11-4, en pacientes alérgicos como un medio para regular de manera d descendente la producción de anticuerpos IgE patogénicos. Un agente inhibidor puede ser administrado directamente al sujeto o bien células (por ejemplo, células Thp o células Th2) pueden ser obtenidas del sujeto, puestas en contacto con un agente inhibidor ex vivo, y readministradas al sujeto. Además, en ciertas situaciones puede ser benéfico coadministrar al sujeto el alérgeno junto con el agente inhibidor o células tratadas con el agente inhibidor para inhibir (por ejemplo, desensibilizar) la respuesta específica para alérgeno. El tratamiento puede ser incrementado adicionalmente mediante la administración de otros agentes promotores de Thl, tales como citocinas 11-12 o anticuerpos a citocinas asociadas Th2 (por ejemplo, anticuerpos anti-Il-4) al sujeto alérgico en cantidades suficientes para estimular adicionalmente una respuesta de tipo Thl . B. Cáncer La expresión de citocinas que promueven Th2 ha sido reportada como elevada en pacientes con cáncer (véase, por ejemplo, Yamamura, M., y colaboradores (1993) J. Clin. Inves 91:1005-1010; Pisa, P., y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:7708-7712) y una enfermedad maligna es frecuentemente asociada con un desplazamiento de respuestas de tipo Thl a respuestas Th2 junto con un empeoramiento del curso de la enfermedad. Por consiguiente, los métodos inhibidores de la invención pueden ser utilizados para inhibir la conducción de citocinas asociadas con Th2 en pacientes con cáncer, como forma de contrarrestar el desplazamiento de Thl a Th2 y por consiguiente para promover una respuesta Thl en curso en los pacientes con el objeto de mejorar la evolución de la enfermedad. El método inhibidor puede involucrar ya sea la administración directa de un agente inhibidor a un sujeto con cáncer o bien el tratamiento ex vivo de células obtenidas del sujeto (por ejemplo, Thp o Th2) con un agente inhibidor seguido por la readministración de las células al sujeto. El tratamiento puede ser incrementado adicionalmente mediante la administración de otros agentes promotores de Thl, como por ejemplo citocinas 11-12 o bien anticuerpos para las citocinas asociadas a Th2 entre {por ejemplo, anticuerpos anta-Il-4) al receptor en cantidades suficientes para estimular adicionalmente una respuesta de tipo Thl C. Enfermedades Infecciosas La expresión de citocinas que promueven Th2 ha sido reportada también como incrementándose durante varias enfermedades infecciosas como incluyendo infección por VIH, tuberculosis, leishmaniasis, esquistosomiasis, infección por nemátodo filarial así como infección por nemátodo intestinal (así como por ejemplo: Shearer, G. M. y Clerici M. (1992) Prog. Chem. Immunol. 54:21-43; Clerici, M y Shearer, G. M. (1993) I munology Today 14:107-111; Fauci, A.S. (1988) Science 293:617623; Locksley, R. M. Scott, P. (1992) Immunology Today 14:A58-A61; Pearce, E. J. y colaboradores (1991) J. Exp. Med. 173:159-166; Grzych, J-M., y colaboradores (1991) J. Immunol. 141:1322-1327; Kullberg, M. C, y colaboradores (1992) J. Immunol. 148:3264-3270; Bancroft, A. J. y colaboradores. J. Im unol. 150:1395-1402; Pearlman, E. y colaboradores (1993) Infect. Immun. 61:1105-1112; Else, K. J. y colaboradores (1994) J. Exp. Med. 179:347-351 y estas enfermedades infecciosas, están también asociadas con un cambio de Thl, Th2 en cuanto a la respuesta inmune. Por consiguiente, los métodos inhibidores de la presente invención pueden utilizarse para inhibir la producción de citocinas asociadas Th2 en sujetos con enfermedades infecciosas, como una forma de contrarrestar el cambio de Thl, Th2 y por consiguiente promover una respuesta Thl en curso en los pacientes con el objeto de mejorar la evolución de la infección. El método inhibidor podría involucrar ya sea la administración directa de un agente inhibidor a un sujeto con una enfermedad infecciosa o bien el tratamiento ex vivo de células obtenidas del sujeto (por ejemplo, células Thp o Th2) con un agente inhibidor seguido de la readministración de las células al sujeto. El tratamiento puede ser realzado adicionalmente mediante la administración de otros agentes promotores de Thl, tales como la citocina 11-12 o anticuerpos para acitocinas asociadas como Th2 (por ejemplo, anticuerpos, anti-Il-4), al receptor en cantidades suficientes para j^f f^._____B¡rr__Jrf«_._.______..1 ' estimular adicionalmente una respuesta de tipo Thl. D. Enfermedades autoinmunes Los métodos estimuladores de la presente invención pueden ser utilizados terapéuticamente en el tratamiento de enfermedades autoinmunes asociadas con una disfunción de tipo Th2 muchos trastorno autoinmunes son el resultado de una activación ínapropiada de células T que son reactivas contra el tejido propio y que promueven la producción de citocina y anticuerpos involucrados en la patología de las enfermedades. La modulación de respuestas del tipo T auxiliar puede tener un efecto sobre el transcurso de la enfermedad autoinmune. Por ejemplo, en encéfalo mielitis alérgica experimental (EAE) , la estimulación de una respuesta de tipo Th2 por administración de 11-4 al momento de la inducción de la enfermedad disminuye la intensidad de la enfermedad autoinmune (Paul, W. E, y colaboradores (994) Cell 76:241 -251) . Además la recuperación de los animales de la enfermedad es asociada con un incremento de la respuesta de tipo Th2, como se evidencia a través de un incremento de citocinas específicas para Th2 (Kdury, S. J., y colaboradores J. exp. I Med. 176:1355-1364). Además, células T que pueden suprimir EAE secretan citocinas específicas para Th2 (Chen, C, y colaboradores (1994) Iirununity 1:147-154). Puesto que la estimulación de una respuesta de tipo Th2 en EAE tiene un efecto protector contra la enfermedad, es probable que la f, -^ estimulación de una respuesta Th2 en sujetos con esterosis múltiple (para la cual EAE es un modelo) sea terapéuticamente benéfica. De manera similar la estimulación de una respuesta de tipo Th2 en diabetes I en ratones proporciona un efecto protector contra la enfermedad. De hecho, el tratamiento de ratones NOD con 11-4 (que , promueve una reapuesta Th2 previene o retarda el inicio de la diabetes de tipo I que se desarrolla normalmente en estos ratones (Rapoport, M. J., y colaboradores (1993) J. Exp. Med. 178:87-99). Así, la estimulación de una respuesta Th2 en un sujeto que padece de diabetes o susceptible de padecer diabetes puede mejorar los efectos de la enfermedad o inhibir el inicio de dicha enfermedad. Otra enfermedad autoinmune en la cual la estimulación de un respuesta de tipo Th2 puede ser benéfica es la artritis reumatoide (ERA) estudios han mostrado que pacientes con artritis reumatoide tienen predominante células Thl en tejido sinovial (Simón, A. K., y colaboradores (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:8562-8566). Mediante la estimulación de una respuesta Th2 en un sujeto con RA la respuesta Thl perjudicial puede ser concomitantemente modulada de manera descendente con el objeto de mejorar de esta manera los efectos de la enfermedad. Por consiguiente, los métodos estimuladores de la presente invención pueden ser utilizados para estimular la producción de citocinas - i¡,í??¡<?-.?i«.? é*MM *u*¿¡ á ¡í* asociadas con Th.2 en sujetos que padecen de una enfermedad autoinmune en la cual la respuesta de tipo Th2 es benéfica para el transcurso de la evolución o bien en sujetos susceptibles de padecer una enfermedad autoinmune de este 5 tipo. El método estimulador puede involucrar ya sea la administración directa de un agente estimulador al sujeto al sujeto o bien el tratamiento ex vivo de células obtenidas del sujeto (por ejemplo, células Thp, Thl, células B, células no- linfoides) con un agente estimulador seguido por la 10 readministración de las células al sujeto. El tratamiento puede ser realzado adicionalmente mediante la administración dé otros agentes promotores de Th2, tales como 11-4 misma o anticuerpos para citocinas asociadas Thl al sujeto en c ntidades suficientes para estimular adicionalnente una 15 respuesta de tipo Th2. En contraste con las enfermedades autoin unes descritas aitriba en donde una respuesta Th2 es deseable, otras enfermedades autoinmunes pueden ser mejoradas a través de una respuesta Thl . Tales enfermedades pueden ser tratadas j^ 20 utilizando un agente inhibidor de la presente invención (de conformidad con lo descrito arriba en el caso de cáncer y enfermedades infecciosas) . El tratamiento puede ser realzado adicionalmente mediante la administración de una citocina promotora de Thl (por ejemplo IFN-?) al sujeto en cantidades 25 suficientes para estimular adicionalmente una respuesta de tipo Thl. La eficacia de agentes para el tratamiento de enfermedades autoinmunes puede probarse en los modelos de animales descritos arriba de enfermedades humanas (por ejemplo, EAE como modelo de esclerosis múltiple y los ratones como modelo de diabetes) o bien otros modelos de animales bien caracterizados de enfermedades autoinmunes humanas. Tales modelos de animales incluyen el ratón mrl/lpr/lpr como modelo para lupus eritematoso, artritis inducida por colágena de murino como modelo para la artritis reumatoide, así como miastenia gravis experimental de murino (véase Paul Ed., Fundamental Immunology [Inmunología Fundamental] Raven Press Nueva York, 1989, Págs. 840-856) . Un agente modulador (es decir estimulador o inhibidor) de la presente invención es administrado a animales de prueba y el transcurso de la enfermedad en los animales de prueba es después monitoreado por los métodos estándares para el modelo particular utilizador. La efectividad del agente modulador es evidenciada por la mejora de la condición de enfermedad en animales tratados con el agente en comparación con animales no tratados (o bien animales tratados con un agente de control) . Ejemplos no limitativos de enfermedades autoinmunes y trastornos que tienen un componente autoinmune que pueden ser tratados de conformidad con la presente invención incluyen diabetes mellitus, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteo artritis, artritis soriática, esclerosis múltiple, miastenia gravis, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmune, dermatitis, (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis excematosa), psoriasis, síndrome de Sjogren, incluyendo queratoconjuntivitis sicca secundaria al síndrome de Sjogren, alopecia areata, respuestas alérgicas provocadas por reacciones a mordeduras de artrópodos, enfermedad de Crohn, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis, qeratoconjuntivitis, colitis ulcerativa, asma, asma alérgica, lupus eritematoso cutáneo, esclerodermia, vaginitis, proctitis, erupciones farmacológicas, reacciones de inversión de lepra, eritema nodosum leprosu , uveitis autoinmune, encefalo ielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, pérdida del oído sensorineural progresiva bilateral ideopática, anemia aplásica, anemia de glóbulos rojos pura, trombocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegene, hepatitis activa crónica, síndrome de Stevenson-Johnson, esprue idiopática, liquen planus, enfermedad de Crohn, oftalmopatía de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveitis posterior, así como fibrosis pulmonar intersticial. E. Transplante Mientras que el rechazo de un trasplante o la aceptación de .,,J__^->_^_____J>_^_A.._-_________!_ un injerto puede no ser atribuible exclusivamente a la acción de un subgrupo particular de células T (es decir células Thl o Th2) en el receptor del injerto (para comentarios véase Dallman, M.J. (1995) Curr. Opin. Immunol. 7:632-638), i numerosos estudios han implicado una respuesta Th2 predominante en la supervivencia prolongada del injerto o una respuesta Th2 predominante en rechazo de injerto. Por ejemplo, la aceptación de un injerto ha sido asociada con la producción de un patrón de citocina Th2 y/o el rechazo de injerto ha sido asociado con la producción de un patrón de citocina Thl (véase Takeuchi, T y colaborador (1992) Transplantation [Transplante] 53:1281-1291; Tzakis A. G. y colaboradores. (1994) J. Pediatr. Surg. 29:754-7556; Thai, N.L. y colaboradores (1995) Transplantation 59:274-281). Adicionalmente, la transferencia adoptiva de células que tienen un genotipo Th2 prolonga la supervivencia de injerto cutáneo (Maeda H. y colaboradores (1994) int . Immunol . 6:855-862) y reduce la enfermedad de injerto versus huésped (Fowler, D. H. y colaboradores (1994) Blood 84:3540-3549; Fowler, D. H. y colaboradores (1994) Prog, Clin . Biol . Res 389:533-540) . Además la administración de 11-4 que promueve la diferenciación de Th2, prolonga la supervivencia de I aloinjertos cardiacos (Levy, A. E. y Alexander, J.W. (1995) Transplantation 60: 405-406) , mientras que la administración de 11 -12 en combinación de anticuerpos anti-Il-10 que . ?«é*>JL?*» lt* -*'± - .~¿- ~ -*aJ promueve la diferenciación de Thl, incremente los rechazos de aloinjerto cutáneo (Gorczynski, R. M y colaboradores (1995) transplantation 60:1337-1341). Por consiguiente, los métodos estimuladores de la presente invención pueden ser utilizados para estimular la producción de citocinas asociadas con Th2 en receptores de transplante con el objeto de prolongar la supervivencia del injerto. Los métodos estimuladores pueden ser utilizados tanto en Transplante de órganos sólidos o en transplante de médula ósea (Por ejemplo, para inhibir la enfermedad de injerto versus huésped) . El método estimulador puede incluir la administración directa de un agente estimulador al receptor del transplante o bien el tratamiento ex vivo de células obtenidas del sujeto (por ejemplo Thp, células Thl, células B, células no-linfoide) con un agente estimulador seguido por la readministración de las células al sujeto. El tratamiento puede ser realzado adicionalmente mediante la administración de otros agentes promotores de Th2, tales como 11-4 misma o bien anticuerpos para citocinas asociadas Thl, al receptor en cantidades suficientes para estimular adicionalmente una respuesta de tipo Th2. Además de las situaciones de enfermedad mencionadas arriba, los métodos moduladores de la presente invención son también útiles para otros propósitos. Por ejemplo, los métodos estimuladores de la presente invención (es decir métodos que utilizan un agente estimulado) pueden ser utilizados para estimular la producción de citocinas que promueven Th2 (por ejemplo, 11-4 in vi tro para la producción comercial de esta citocinas (por ejemplo, las células pueden estar colocada en contacto con el agente estimulador in vi tro con el objeto de estimular la producción ¡11-4 y la 11-4 puede ser recuperada del sobrenadante de cultivo, purificada adicionalmente en caso necesario, y empacada para uso comercial) . Además, los métodos moduladores de la presente invención pueden ser aplicados a vacunas para promover ya sea una respuesta Thl o una respuesta Th2 a un antígeno de interés en un sujeto. Es decir, los agentes de la presente invención pueden servir como adyuvantes para dirigir una respuesta inmune a una vacuna ya sea hacia una respuesta Thl o hacia una respuesta Th2. Por ejemplo, para estimular una respuesta de anticuerpo a un antígeno de interés (es decir, para propósitos de vacunas) , el antígeno y un agente estimulador de la presente invención pueden ser coadministrados al sujeto con el objeto de promover una respuesta de Th2 al antígeno en el sujeto, Puesto que respuestas Th2 proporcionan células B eficientes y promueven la producción de IgGl. Alternativamente, para promover una respuesta inmune celular a un antígeno de interés, el antígeno y un agente inhibidor de la presente invención pueden ser coadministrados a un sujeto para promover una respuesta Thl a un antígeno en un sujeto, puesto que respuestas Thl favorecen el desarrollo de respuestas inmunes mediadas por células (por ejemplo, respuestas de hipersensibílidad retardadas) . El antígeno de interés y el agente modulador pueden ser formulados juntos en una sola composición farmacéutica o bien en composiciones separadas. En la modalidad preferida, el antígeno de interés y el agente modulador se administran de manera simultanea al sujeto. Alternativamente, en ciertas situaciones, puede ser deseable administrar el antígeno primero y después el agente . modulador o viceversa (por ejemplo, en el caso de un antígeno que provoca naturalmente una respuesta Thl, puede ser benéfico administrar primero el antígeno solo para estimular una respuesta Thl y después administrar un agente estimulador solo o junto con un refuerzo de antígeno, para cambiar la respuesta inmune a una respuesta Th2) . III. Ensayos de Diagnóstico En otr^ aspecto, la invención presenta un método para • diagnosticar un sujeto para un trastorno asociado con el ; crecimiento aberrante de hepatocitos y/o diferenciación ' aberrante de células plasmáticas y/o actividad aberrante de subgrupos de células T, que comprende: (a) La detección de la expresión de XBP-1 en células (por ejemplo, hepatocitos, o precursores de los mismos, o células plasmáticas o precursores de las mismas o células T, o precursores de las mismas) de un sujeto del cual se sospecha que tiene un trastorno relacionado con el crecimiento aberrante de hepatocitos y/o la diferenciación aberrante de células plasmáticas y/o la actividad aberrante de subgrupos de células T; (b) comparar la expresión de XBP-1 en células de dicho sujeto con un control no asociado con el crecimiento aberrante de hepatocitos y/o la diferenciación aberrante de células plasmáticas y/o la actividad aberrante de subgrupos de células T; y (c) diagnosticar el sujeto para un trastorno con base en un cambio de expresión de XBP-1 en células del sujeto en comparación con el control. El "cambio de expresión de XBP-1" en células del sujeto puede ser, por ejemplo, un cambio en cuanto al nivel de expresión de XBP-1 en células del sujeto, que puede ser detectado mediante el hecho de ensayar niveles de ARNm de XBP-1, por ejemplo, mediante el aislamiento de células del sujeto y mediante la determinación del nivel de expresión de ARNm de XBP-1 en las células a través de métodos estándares conocidos en la técnica, incluyendo análisis Northern blot, análisis de reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa reversa así como hibridaciones in si tu . Alternativamente, el nivel de expresión de XBP-1 en células del sujeto puede ser detectado mediante el hecho de ensayar niveles de proteína XBP-1 por *x ejemplo, mediante el aislamiento de células del sujeto y mediante la determinación del nivel de expresión de proteír.a XBP-1 por métodos estándares conocidos en la técnica, incluyendo análisis Western blot, inmuno- precipitaciones, ensayos de inmo-absorción enlazada a enzima (ELISAs) así como ínmunofluorescencia. En otra modalidad, un cambio de expresión de XBP-1 en células del sujeto resulta en una o varias mutaciones (es decir, alteraciones en comparación con el tipo silvestre) en el gen de XBP-1 y ARNm lo que provoca una o varias mutaciones (es decir, alteraciones en comparación con el tipio silvestre) en la secuencia de aminoácidos de XBP-1 de la proteína XBP-1. En una modalidad, la mutación (las mutaciones) lleva (n) a una forma de XBP-1 con actividad incrementada (por ejemplc, actividad constitutiva parcial o completa) . En otra modalidad, la(s) mutación (es) lleva (n) a una forma de XBP-1 con actividad disminuida (por ejemplo, inactividad parcial o completa). La(s) mutación (es) puede (n) cambiar el nivel de expresión de XBP-1, por ejemplo, puede incrementar o disminuir el nivel de expresión de XBP-1 en un sujeto con un trastorno. Alternativamente, la(s) mutación (es) puede (n) cambiar la regulación de XBP-1, por ejemplo, mediante la alteración de la interacción del XBP-1 mutante con blancos de XBP-1. Mutaciones en la secuencia de nucleótidos o en las secuencias de aminoácidos de XBP-1 pueden ser determinadas empleando técnicas estándares para análisis de ADN o secuencias de proteína, por ejemplo, para secuenciamiento de proteína o ADN, análisis RFLP, y análisis de polimorfismos de aminoácidos o nucleótido individual . En modalidades preferidas el ensayo de diagnóstico es efectuado en la muestra biológica del sujeto, como por • I I ejemplo una muestra células o una sección de tejido (por ' ejemplo, una sección liofilizada o congelada fresca de tejido removido de un sujeto) . En otra modalidad, el nivel de expresión de XBP-1 en células del sujeto puede ser detectado in vivo, utilizando un método de formación de imagen apropiado, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-XBP-1 radio-marcad . En una modalidad, el nivel de expresión de XBP-1 en células del sujeto de prueba puede ser elevado (es decir, incrementado) en comparación con el control no asociado con el trastorno o el sujeto puede expresar una forma I constitutivamente activa (parcial o totalmente) de XBP-1. Este nivel de expresión elevado de XBP-1 o expresión de una forma constitutivamente activa de XBP-1 puede emplearse para diagnosticar un sujeto para un trastorno asociado con crecimiento incrementado de hepatocito tales como carcinoma hepacelular, o bien diferenciación incrementada de células plasmáticas, tales como mieloma múltiple o una enfermedad auto-inmune asociada con una producción patogénica de auto- . £?,*i I¡ .l,>,..^M^M.*, anticuerpos, o bien una actividad incrementada de células Th2 (de conformidad con lo comentado arriba) . En otra modalidad, el nivel de expresión de XBP-1 en células del sujeto puede ser reducido (es decir, disminuido) con 5 ' relación al control no asociado con el trastorno o bien el sujeto puede expresar una forma mutante inactiva (parcial o totalmente) de XBP-1. Este nivel reducido de expresión de XBP-1 o expresión de una forma mutante inactiva de XBP-1 puede ser utilizado para diagnosticar un sujeto para un 0 trastorno asociado con un crecimiento disminuido de hepatocitos, como por ejemplo, lesión hepática, enfermedad hepática (por ejemplo, infección viral), o bien toxicidad ~~ hepática (por ejemplo, cirrosis) o bien diferenciación disminuida de células plasmáticas, por ejemplo, trastornos de 5 inmunodeficiencia caracterizados por una producción insuficiente de anticuerpos, o bien una actividad disminuida de células Th2 y/o una actividad incrementada ¡de células Thl (de conformidad con lo comentado arriba) . ' IV. Kits de la Invención 0 Otro aspecto de la presente invención se refiere a kits para efectuar los ensayos de tamizado, métodos moduladores o ensayos de diagnóstico de la invención. Por ejemplo un kit para efectuar un ensayo de tamizado de la presente invención puede incluir una composición indicadora que contiene XBP-1, 5 un medio para determinar el crecimiento de hepatocitos y/o la diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T e instrucciones para utilizar el kit para identificar moduladores de crecimiento de hepatocitos y/o diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T (por ejemplo, producción de citocina Th2), en otra modalidad, un kit para efectuar un ensayo de tamizado de la invención puede incluir células deficientes en XBP-1, dispositivos para determinar el crecimiento de hepatocitos y/o diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T (por ejemplo producción de citocina Th2 e instrucciones para utilizar el kit para identificar moduladores del crecimiento de hepatocitos y/o diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T. En otra modalidad, la invención ofrece un kit para efectuar un método modulador de la presente invención. El kit puede incluir, por ejemplo, un agente modulador de la presente invención (por ejemplo, agente inhibidor o estimulador de XBP-1) en un vehículo adecuado y empacado en un contenedor adecuado con instrucciones de uso del modulador para modular el crecimiento de hepatocitos y/o la diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T. Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para diagnosticar un trastorno asociado con el crecimiento aberrante de hepatocitos y/o diferenciación aberrante de _ Áltete ?a r****h& *i¿ J __-_£_«-__ ..___, ^ askÁ , células plasmáticas y/o actividad aberrante de subgrupos de células T en un sujeto. El kit puede incluir un reactivo para determinar la expresión de XBP-1 (por ejemplo una sonda de ácido nucleico para detectar ARNm de XBP-1 o un anticuerpo para detectar proteína de XBP-1), un control con el cual se comparan los resultados del sujeto, e instrucciones para utilizar el kit para propósitos de diagnóstico. V. Células, Embriones y Animales de la Invención Otro aspecto de la presente invención se refiere a células deficientes en XBP-1 aisladas, embriones así como animales no humanos que pueden ser utilizados en los varios métodos de tamizado de la invención. Células deficientes en XBP-1 preferidas son hepatocitos, precursores de hepatocitos, células plasmáticas, precursores de células plasmáticas (células B) , células T y precursores de células T. Animales no humanos preferidos y embriones de los mismos son ratones. En una modalidad, la invención ofrece un animal recombinante homólogo que comprende un trastorno homocigótico de su gen de XBP-1 endógeno, debido a la inserción de AD? exógeno en el gen, en donde este trastorno del gen de XBP-1 impide la expresión de proteína de XBP-1 funcional, y además en donde el fenotipo de este animal con relación a un animal que tiene una proteína de XBP-1, funcional comprende el crecimiento disminuido de hepatocitos o la diferenciación disminuida de células plasmáticas o la producción disminuida de citocinas de Th2. En otra modalidad, la invención ofrece un animal deficiente en XBP-1 homocigótico que tiene una mutación homocigótica insertada en su gen de XBP-1 endógeno por recombinación homologa en células madres embriónicas de tal manera que el gen de XBP-1 del animal no es funcional ni expresa una proteína de XBP-1 funcional, y en donde el animal ! presenta un crecimiento disminuido de hepatocitos o una diferenciación menor de células plasmáticas o una producción menos de citocinas Th2. La construcción y caracterización fenotípica de animales no humanos deficientes en XBP-1 preferidos de la invención se describen con detalles en el Ejemplo 1. Puesto que el genotipo de XBP-1 -/- provoca letalidad in útero cuando la deficiencia es constitutiva, otro animal deficiente en XBP-1 preferido es un animal en el cual la expresión del fenotipo deficiente en XBP-1 es controlada de , manera regular de "apagado" del gen de XBP-1 de manera 1 controlada (por ejemplo, a través del uso de un sistema regulador controlable, por ejemplo, un sistema regulado por tetraciclina) . Por consiguiente, la invención ofrece además un animal no humano transgénico cuyos alelos de XBP-1 endógeno han sido alterados, a través de ADN exógeno, de tal manera que la expresión de los alelos de XBP-1 endógenos es regulada de manera controlada mediante un agente inductor o supresor, de tal manera que por lo menos bajo ciertas ....^«-__.- _--*' '-^-^•^^^•^••?^^^ ^..- .. _._._______*- condiciones, los alelos de XBP-1 no son funcionales o bien no expresan una proteína de XBP-1 funcional y en donde el animal muestra un crecimiento menor de hepatocitos o una diferenciación disminuida de células plasmáticas o una producción mayor de citocinas Th2. Métodos para construir tales animales noqueados "condicionales" son conocidos en la técnica como por ejemplo, un sistema regulado por tetraciclina para el trastorno condicional de un gen de conformidad con lo descrito en el documento WO 94/29442 y en la patente norteamericana número 5,650,298. Otro animal deficiente en XBP-1 preferido es un animal quimérico (por ejemplo, ratones) producido empleando sistema de complementación de blastocistos, por ejemplo sistema de complementación de blastocistos RAG-2, en donde un órgano particular o bien varios órganos particulares (por ejemplo, los órganos linfoides) provienen de células madres embriónicas (ES) con mutaciones homocigóticas del gen de XBP-1. Por consiguiente la invención ofrece un animal quimérico no humano en el cual por lo menos un órgano surge de células madres embriónicas con mutaciones homocigóticas del gen de XBP-1. La construcción y caracterización fenotípica de animales no humanos quiméricos deficientes en XBP-1 preferidos de la invención se describen con detalles en el Ejemplo 2. Los animales -/- de XBP-1 de la presente invención pueden ser empleados adicionalmente para crear animales transgénicos que llevan un transgen de XBP-1 que permite la expresión del transgen del XBP-1 en uno o varios tipos específicos de células o tejidos, como por ejemplo hepatocitos. Tales animales pueden ser particularmente útiles en el "rescate" de la letalidad embriónica de los animales -/- de XBP-1 {por ejemplo, permitiendo la expresión de XBP-1 en hepatocitos en desarrollo) mientras siguen manteniendo la deficiencia en cuanto a XBP-1 en otros tipos de células o en otros tejidos del animal (por ejemplo, el sistema linfoide) . Un animal transgénico preferido es un animal noqueado XBP-1 -/- que lleva un transgen de XBP-1 controlado por el promotor de albúmina (un elemento regulador específico para hígado descrito en Pinkert y colaboradores (1987) Genes Dev- l.:268-277) . Alternativamente otros elementos reguladores específicos para hígado conocidos en la técnica pueden ser utilizados para controlar la expresión del transgen. Por consiguiente, la invención proporciona un animal no humano que tiene una mutación homocigótica insertada en su gen dé XBP-1 endógeno por recombinación homologa en células madrea embriónicas, de tal manera que el gen de XBP-1 endógeno del animal no sea funcional ni exprese una proteína de XBP-1 funcional pero en donde el animal no humano comprende además un transgen de XBP-1 que dirige la expresión de XBP-1 en por lo menos un tipo de células o un tipo de tejido en el animal. ttA1_Pi fI-Í.éll_liÉ«^*t-**fc¿--'-« ->»»*>*»*»**.*>***» ^«-^AA-kfatfa- -^-^-a-^^-j...^-¿caAi : De preferencia, el transgen dirige la expresión de XBP-1 en por lo menos los hepatocitos. Esta invención es ilustrada adicionalmente a través de los siguientes ejemplos que no deben considerarse como limitativos. El contenido de todas las referencias patentes y solicitudes de patente publicadas citadas en esta solicitud se incorporan aquí por referencia. EJEMPLO 1: Producción y Caracterización del Genotipo Hepático de Ratones Deficientes en Cuanto a XBP-1 Trastornos del gen XBP-1 Para definir las acciones de la proteína XBP-1 in vivo, el gen de XBP-1 fue trastornado en células madres embriónicas mediante el reemplazo de un fragmento de 0.8 kb que contiene partes de exones 1 y 2 así como el intron que interviene con un gen de resistencia a la neomicina, lo que resulta en un cambio de marco de los aminoácidos restantes (de conformidad con lo representado en la figura 1) . El constructo de enfoque fue generado mediante la clonación del fragmento XBP-1 trastornado en el vector pBS/TK, seguido por la linearización e introducción en células D3 ES por electroporación. Las células fueron cultivadas en neomicina y ganciclovir para lograr una selección positiva/negativa, y clones resistentes fueron probados para la integración homologa del fragmento de XBP-1 trastornado mediante la realización de ensayos Southern blots de ADN genómico. Uno de tres clones ES que había sido e£^__J__J.É__Í____,í sometido a trastorno dirigido del gen de XBP-1 transmitió el alelo trastornado a la progenie y ratones XBP-1 +/- fueron cruzados para generar ratones XBP-/-, de conformidad con lo demostrado por análisis Southern blot de ADN genómico proveniente de embriones. Un análisis de Northern blot de ARN celular total elaborado a partir de embriones +/+ y -l-reveló la ausencia de un transcripto de XBP-1 de tamaño correcto en las muestras -/- y la ocurrencia de un transcripto de MW mayor, más débil, que se híbrido también con una sonda de ADNc de neomicina. Un análisis Western blot de extractos de hígados fetales de XBP-1 +/+ +/- y -/-utilizando antisuero monoclonal específico para XBP-1 reveló ausencia de proteína de XBP-1 inmunorreactiva en las muestras -/-. Letalidad Embriónica de Hipoplasía Hepática en Ra tones de XBP-1 -/- El hecho de cruzar ratones XBP-1 heterocigóticos no produjo crías vivas -/-. De las más de 400 crías nacidas, no1 se obtuvieron homocigotos, lo que sugiere que XBP-1 es necesario para la supervivencia. El genotipificado de carnadas cosechadas de cruces seriados reveló que la letalidad embriónica empieza en E12.5. En E13.5 los embriones XBP-1 ,-/- 1 pudieron ser reconocidos por su retardo de crecimiento, coloración pálida, e hígados hipoplásicos. La inspección de hígados -/- mostró que presentaban un tamaño notablemente *-i___fa,.-^_&^___-,_. li^^^^,,*^** * ***»* . _.«____« reducido en comparación con hígados E13.5 normales y los conteos de células hepáticas totales fueron 15% de los hígados +/+ a esta edad. Un análisis histológico de hígados -/- E14.5 reveló una celularidad reducida y un espacio vacío incrementado lo que indica una concentración menos densa de células en -/- en comparación con los hígados de control. Puesto que el hígado fetal se vuelve el órgano hematopoyético principal para E13.5, los conteos sanguíneos fetales fueron determinados para evaluar si una hipoplasia hepática severa se correlacionaba con una producción anormal de glóbulos rojos. Se observó una anemia evidente en embriones XBP-1 -/-después de E 11.5 cuando la hematopoyesis cambió del saco vitelino al hígado fetal. Para E 14.5, con conteos sanguíneos totales de los ratones XBP-1 -/- sobrevivientes fueron 20% de los valores encontrados en compañeros de carnada normales. Preparaciones de citocina de sangre periférica a E 13.5 revelaron que células eritroides -/- fueron células nucleadas, predominantemente inmaduras de origen en el saco vitelino, mientras que las células eritroides +/+ fueron células no nucleadas derivadas de hígado al 80%. Preparaciones de citospina de células hepáticas E 13.5 demostraron la presencia de células de linaje eritroide y mieloide en todas las etapas de madurez en muestras -/-, aún cuando en números reducidos lo que es consistente con los hígados hipoplásicos.
Para comparar el potencial de células progenitoras hematopoyéticas +/+ y -/- para desarrollarse en linajes eritroides y mieloides, ensayos de colonias en metilcelulosa in vitro, fueron efectuados utilzando AGM fetal ( esonefros 5 aorto-gonado) , saco vitelino, o bien hígado como la fuente de células progenitoras (Muller y colaboradores (1994), Imrpunitu 1:291-301; Wang y colaboradores 1997, EMBO J. , 16:4374-4383). Los cultivos fueron efectuados de conformidad con lo descrito en Wang y colegas con cultivos empleando eritropoyetina sola 10 o eritropoyetina, IL-1, IL-3 y G-CSF. Los tres tejidos (AGM fetal, saco vitelino e hígado proporcionaron números equivalentes de colonias eritroides y mieloides a partir de ? muestras +/+ y -/-, lo que indica que células madres hematopoyéticas pluripotentes se encuentran en las tres 15 ubicaciones. Aún cuando hígados fetales -/- son severamente hipoplásicos, ciertas células madres hematopoyéticas migran allá y tienen el potencial de provocar el surgimiento de todos los linajes hematopoyéticos, como se puede observar también en preparaciones de citospina de hígado fetal. Puesto 20 que las células progenitoras adscritas hematopoyéticas de XBP-1 -/- pudieron proliferar y diferenciarse normalmente cuando fueron probadas in vi tro, la anemia observada en estos embriones no puede ser atribuida a un defecto autónomo de células hematopoyéticas. Estos hallazgos fueron reforzados 25 por un análisis de ratones quiméricos derivados de células ,-__-!_-*- _..«_____a_____..1>_AaaMMfcta madres embriónicas deficientes en XBP-1 en el sistema de complementación deficiente en RAG-2 (descrito adicionalmente en el Ejemplo 2) . En estos animales, los hígados fueron casi exclusivamente de origen de células deficientes en RAG-2, 5 mientras ' que la reconstitución de elementos hematopoyéticos, por ejemplo linfocitos B y linfocitos T de precursores deficientes en XBP-1 se presentó. Por consiguiente, aún cuando células madres embriónicas deficientes en XBP-1 no contribuyen al desarrollo normal del hígado, no son 10 defectuosas en cuanto a la reconstitución de elementos hematopoyéticos . Expresión de XBP-1 en el Hígado en Desarrollo de Ra tones de Tipo Silvestre El hígado fetal empieza su desarrollo como un crecimiento del 15 endodermo de la parte delantera del tubo digestivo (Gualdi y colaboradores 1996, Genes Dev. 10:1670-1682). En E10.5, la yema hepática de ratones de tipo silvestre expresa niveles altos de 7?RNm de XBP-1 mediante hibridación in si t? . XBP-1 Para la hibridación in si tu, embriones de tipo silvestre átk 20 fueron seccionados y sondeados para XBP-1 de conformidad con lo descrito (Clauss y colaboradores 1993 Dev. Dynamics 197: 146-156) . Puesto que E10.5 representa un punto de tiempo antes de una población significativa del hígado por células hematopoyéticas, demuestra que XBP-1 es expresado en células 25 parenquimatosas hepáticas. Un análisis Northern blot de ARN mostró también niveles altos de ARNm de XBP-1 en líneas de células estromales hepáticas y en células de hepatocarcinoma HepG2. Esta evidencia apoya adicionalmente una función para XBP-1 en el crecimiento del hígado en vez de una función en la división y diferenciación de células hematopoyéticas. Velocidad de Crecimiento Reducida y Apóptosis Incrementada en hígados deficientes en XBP-1 Dos mecanismos que explican la presencia de hígados severamente hipoplásicos en embriones XBP-1 fueron identificados: Una velocidad de crecimiento reducida y una apóptosis incrementada. Para demostrar directamente el crecimiento celular reducido, ratones en el día 13.5 de embarazo recibieron inyección de BrdU, y los fetos fueron cosechados y analizados para incorporación de BrdU. Ratones hembras preñadas fueron inyectadas con IV con 0.3 ml de 50 mg/ml BrdU (Sigma) en PBS. Los embriones fueron cosechados después de una hora y fijados en agente de fijación de Carnoy. Después de integración en parafina, la detección de BrdU fue efectuada siguiendo las instrucciones del kit de marcado BrdU (Roche) . Hígados fetales de tipo silvestre mostraron una tinción nuclear fuerte en todo el hígado, mientras que muestras deficientes en XBP-1 presentaron una menor tinción con áreas importantes que permanecieron no teñidas, especialmente hacia el centro del hígado. La incorporación reducida de BrdU en hígados XBP-1 -/- demuestra -_,__,A.__..<fe____-_t-_,-fe-a...i____á__-________i_»?^____,_____k___^ te_t_- directamente una velocidad subnormal de crecimiento en este organismo. Se identificó apóptosis morfológicamente mediante la tinción TÚNEL de hígados fetales de E13.5. El ensayo TÚNEL fue efectuado empleando el Cell Death Kit (Roche) . Estos experimentos mostraron una velocidad notablemente elevada de hepatocitos apoptóticos en muestras XBP-1 -/-. En contraste, las células apoptóticas identificadas en +/+ fueron generalmente de linaje mieloide. La tinción con estearasa de cloroacetato fue utilizada para confirmar que los hepatocitos y no las células de linaje mieloide representaban la mayor parte de las células apoptóticas en muestras del hígado -/-. Inducción de XBP-1 después de hepa tectomía parcial Para estudiar adicionalmente la función de XBP-1 en el crecimiento hepático y en la inducción de genes, hepatectomías parciales fueron efectuadas en ratones adultos normales. En este modelo, el hígado restante se revierte a un fenotipo casi fetal y es sometido a una división rápida de células para reestablecer el peso original de órgano dentro de un periodo de 10 días (Michalopoulos y DeFrances 1997, Science 276: 60-66. Entre las primeras etapas en este proceso se encuentra la activación de factores de transcripción preformados, tales como, NF-?B o STAT3 (Tabú 1996, FASEB J. l_0:413-427) .Estos factores inducen después la transcripción de genes tempranos inmediatos, muchos de los cuales codifican ¡j.-ta_a.-.-«,iiA factores de transcripción tales como AP-1, NT-?B, y ciertos miembros de la familia CREB/ATF tales como CREB y CREM (Servillo y colaboradores 1998, Genes Dev. 12:3639-3643; Tabú 1996, FASEB J. 10:413-427). Los lóbulos izquierdo y caudado del hígado fueron removidos de ratones adultos de tipo silvestre. El tejido hepático restante fue cosechado en un periodo de tiempo para aislamiento de ARN total. Se sondearon Northern blots con ADNc para XBP-1, C/EBPß, y el gen de control ß2M. Los resultados de hepatectomías parciales en ratones demuestran ahora que XBP-1 es un gen temprano inmediato en este proceso, inducido dentro de 30 minutos de una intervención quirúrgica pero que tiene un pico prolongado de inducción de más de 16 horas. Este periodo de tiempo es similar a la inducción de C/EBPß, que presenta un pico ligeramente más temprano a las 14 horas después de la hepatectomía. Se espera que XBP-1 actúe como homodímero o heterodímero para unirse en sitios de tipo CRE y a su vez regule de manera ascendente los genes tempranos retardados involucrados en la regeneración del hígado. La proliferación disminuida de células hepáticas observada en embriones XBP-l/-indica que XBP-1, como CREB y CREM, es un factor de transcripción de enlace con CRE involucrado en la proliferación hepática. Identificación de genes blanco XBP-1 en el higado Para identificar genes blanco para acción de XBP-1 en el hígado, se comparó una hibridación diferenciada en chips de microconjunto en muestras derivadas de hígados E13.5 +/+ o -/-. Se aisló el ARN de hígados E13.5 +/+ y-/- mediante lisis en guanidina y mediante centrifugación a través de un cojín de CsCl. Diez µg de ARN total fueron convertidos en ADNc de doble cadena empleando un cebador oligo dT con un sitio de T7 ARN polimerasa en su extremo 5' (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGAC TCACTATAGGGAGGCGG-3') (SEQ ID N0:1). El ADNc fue utilizado directamente en una reacción de transcripción in vi tro en presencia de nucleótidos biotmilados Bio-11-UTP y Bio-11-CTP (Enzo, Far ingdale, NY) . Para mejorar las características cinéticas de hibridación, el ARN de antisentido marcado fue fragmentado por incubación a una temperatura de 94° C durante 35 minutos en MgOAC 30mM, KOAc 100 mM. La hibridación en Genechips™ (Affymetrix, San José, CA) que presenta sondas para 250 genes de interés inmunológico o 250 genes con funciones en el desarrollo fue efectuada a una temperatura de 240° C durante la noche en una mezcla que incluía 10 µg de ARN fragmentado, 6 X SSPE, 0.005% Triton-X-100, y 100 mg/ml de ADN de esperma de arenque en un volumen total de 200 µl. Los chips fueron lavados, teñidos con ficoeritrina-streptavidina, y leídos utilizando un explorador de Affymetrix GeneChip y programática de expresión de gen acompañante. La programática incluye algoritmos que . s,^&__*^_ éfa _t._»-_..- fe__.-¿ determinan si un gen está ausente o presente y si el nivel de expresión de un gen en la muestra -/- fue incrementad significativamente o disminuido de manera importante con relación a la muestra +/+. Los genes para al-antitripsina y a-fetoproteína fueron expresados en niveles significativamente reducidos en muestras -/-, como se observó también en los análisis Northern Blot de ARNm de hígado fetal +/+ y -/-. Ambos productos génicos son proteínas de fase aguda sintetizadas por hepatocitos y son expresados durante el desarrollo así como en el hígado adulto. Dos otras proteínas de fase aguda, la transtiretina y la apolipoproteína Al fueron también encontradas con niveles disminuidos de ARN en hígados -/-, mientras que múltiples otras proteínas de fase aguda y genes expresados en hepatocitos (proteínas de enlace de vitamina D, proteína reactiva con C, amiloide sérico P, glicoproteína diácido, factor de crecimiento de hepatocitos) fueron expresados de manera igual en muestras +/+ y -/-. Esto indica que hepatocitos deficientes en XBP-1 tienen defectos en la síntesis de productos génicos específicos en vez de una reducción global de la transcripción. Para demostrar la regulación directa del promotor de dl-antitripisina por XBP-1, transfecciones pasajeras fueron efectuadas utilizando un plásmido de expresión de XBP-1 y constructos reporteros de dl-antitripisina luciferaza en la ta_A __ -_ _t.i f¡to , ti-r TIIÍÍÉIHÍIII n? _______ftt?>__?___t______u^^ lina de células HepG2. Aún cuando esta línea de células contiene XBP-1 endógeno, la sobreexpresión de XBP-1 podría transactivar el promotor de dl-antitripsina 3.5 veces. Como controles para la especificidad del efecto de XBP-1, el uso 5 de un constructo de expresión de XBP-1 con desplazamiento de marco o la mutación de un sitio blanco de XBP-1 en el promotor de al-antitripsina eliminó toda la transactivación. La transactivación de un constructo reportero de d- fetoproteína por el plásmido de expresión de XBP-1 fue 10 también demostrada in vi tro . Por consiguiente, XBP-1 tiene un efecto de transcripción específico sobre estos dos genes de proteína de fase aguda. El fenotipo de embriones deficientes en XBP-1 muestra semejanzas con varios modelos de ratón en los cuales 15 trastornos de genes resultan en un desarrollo anormal del hígado. El trastorno del gen de ho eocaia Hlx resultó en la especificación hepática inicial pero solamente en un crecimiento mínimo y representa un defecto más temprano, más severo que la deficiencia en XBP-1 (Hentsch y colaboradores, JB 20 1996, Genes Dev. 10_:70-79). El crecimiento anormal de hígados ha sido descrito en embriones deficientes en cuanto a HGF/SF con un fenotipo similar a los embriones XBP-1 -/-: estructura hepática menos firme, espacios sinusoidales ampliados y disociación de células parenqui atosas (Schmidt y 25 colaboradores, 1995, Nature 373:699-702; Uehara y colaboradores 1995, Nature 373:702-705). Sin embargo, los niveles de ARNm de HGF son normales en embriones XBP-1 -/-. La deficiencia en MTF-1 resultó en un compartimiento epitelial hepático disociado, sinusoides ampliados, pero a diferencia de embriones XBP-1 -/-, no se observó una disminución significativa del tamaño del hígado y no se observó anemia (Gunes y colaboradores, 1998, EMBO J. 17 :2846-2854) . La deficiencia en c-jun provocó también hipoplasia y disociación de células hepáticas y muerte para E15.5, pero los niveles de ARNm de c-jun fueron normales en embriones XBP-1-/-. Un hígado pequeño puede ser el resultado de una proliferación anormal de células hematopoyeticas, de conformidad con lo descrito en embriones deficientes en cuanto a c-myb (Mucenski y colaboradores, 199, Cell 65: 677-689) , o bien una proliferación y diferenciación anormal de células eritroides, como se puede observar en embriones Rb -/- (Lee y colaboradores 1992, Nature 359:288-294; Jacks y colaboradores 1992, Naure 359:295-300) . En constraste, encontramos una función proliferativa y diferenciativa in vi tro normal de células progenitoras hematopoyeticas de XBP-1 -/-. El direccionamiento de las células hematopoyeticas hacia el hígado fue el supuesto defecto en ausencia de integrina ßl (Hirsch y colaboradores 1996, Nature 380:171-175; Faessler y colaboradores 1995, Genes Dev. 9:1896-1908), pero hígados XBP-1 -/- mostraron un potencial hemapoyetico normal en base §_l_f__..! __..!__-_-__*_*-__ „__!_..___. ..-_..?_ _^__*4__|____.. _L_E___a_J*-i por célula. Finalmente, la apóptosis contribuyó a la insuficiencia hepática en Rb -/-, RelA -/- (Beg y colaboradores 1995, Nature 376:167-170), y embriones HGF/SF -/- /(Schmidt y colaboradores 1995, Nature 373:699-702; Uehara y colaboradores 1995, Uature 373:702-705) , como se observó también en embriones XBP-1 -/-. XBP-1 no se conoce por actuar directamente corriente arriba de estos factores múltiples que son importantes en una hepatogénesis normal sino que contribuye con una función única al crecimiento y desarrollo del hígado. Es posible que células parenqui atosas hepáticas XBP-1 -/- puedan ser defectuosas en cuanto a su capacidad de soportar la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas. El análisis de ARNm no ha identificado niveles alterados de integrina ßl, HGF, c-myb, ligando de c-kit, AML-1, Rb, o c-jun en embriones XBP-1 -/-, lo que hace que estos genes que sean blancos principales improbables de la regulación por XBP-1 durante el desarrollo del hígado. Nuestros datos han identificado cuatro genes de proteína de fase aguda expresados en hepatocitos durante el crecimiento hepático como blancos específicos de XBP-1. La inducción de proteínas de fase aguda representa una activación génica específica para hígado, ya sea durante el desarrollo embriónico o bien en adultos después de una lesión como resultado de hepatectomía parcial, inflamación, infección, toxinas o enfermedad maligna. La función sistémica de ciertas proteínas de fase aguda ha sido definida con detalle, por ejemplo, la inhibición de proteasa sérica por dl-antitripsina o las propiedades antiaterogénicas de la apolipoproteína-Al (Andersson 1997, Curr. ppin. Lipidol . 8:225-228; Gabay y Kushner 1999, New Engl . J. Med 340:448-454) . Una reducción de los niveles de estas proteínas de fase aguda refleja una disminución de la síntesis de proteína de hepatocitos específica, pero individualmente, la deficiencia de estos genes no se conoce como resultando en los defectos observados en hígados deficientes en XBP-1. La proteína de fase aguda regulada por XBP-1 AFP es expresada en gran medida en hígados fetales y en el saco vitelino y representa uno de los marcadores fenotípicos más tempranos del hígado fetal (Gualdí y colaboradores. 1996, Genes Dev. 10:1670-1682). Se ha especulado que una función principal de AFP es promover el crecimiento de células en el hígado, posiblemente mediante el secuestro de estrógeno, lo que tiene por otra parte efectos antiproliferativos (reseñado por Chen y colaboradores. 1997, Crit . Rev. Euk . Gene . Exp. 7:11-41). Los niveles de AFP son muy bajos en hígado adulto pero se elevan al llevarse a cabo la regeneración del hígado y en la mayoría de los carcinomas hepatocelulares. De hecho, AFP fue uno de los primeros marcadores tumorales reconocidos. Hemos demostrado que en ausencia de XBP-1, se expresa AFP solamente en niveles reducidos, y que el crecimiento del hígado es severamente afectado. Nuestros datos establecen que XBP-1 participa en el crecimiento y supervivencia de hepatocitos, y a través de su regulación de genes de proteína de fase aguda, también en la expresión de genes específicos para el hígado. Estos estudios han demostrado que XBP-1 controla directamente un subgrupo de la actividad sintética de proteína hepática, y que un crecimiento normal del hígado no puede lograrse en ausencia de proteína XBP-1. II. EJEMPLO 2: Caracterización del fenotipo de células plasmáticas de ratones deficientes en XBP-1 La generación de ratones quiméricos deficientes en XBP-1/deficiente en RAG-2 La deficiencia en cuanto a XBP-1 provoca la muerte por anemia y por hiplapasia hepática in útero (véase ejemplo 1) . Po consiguiente, estudios de la función inmune en el entorno de deficiencia de XBP-1 fueron efectuados en el sistema de complementación de RAG-2. Primero, células madres embriónicas con un alelo de XBP-1 previamente trastornado por un cassette de Neomicina tuvieron su segundo alelo XBP-1 trastornado por recombinación homologa. El constructo removió partes de exones 1 y 2, así como el intron que interviene, y sustituyó una secuencia de resistencia a la Higromicina. Células ES con un alelo de XBP-1 previamente trastornado por el gen de neomicina fueron transfectadas con el nuevo constructo y seleccionadas en higromicina, neomicina y ganciclovir. Clones i__._tijJ._iaa ___-..- . -_j_ _-i>_._-. ..- ^M _a -_,__-^^¡ ^iµ____ I___ - J*|tf|jág j^ ¡rfj sobrevivientes fueron tamizados por Southern blot para determinar la presencia de dos alelos de XBP-1 trastornados y la perdida del alelo de tipo silvestre. Clones de ES apropiados fueron inyectados en blastocistos deficientes en RAG-2 e implantados en ratones hembras pseudopreñadas por métodos estándares. Los ratones resultantes fueron ensayados para reconstitución de linfoides por análisis FACS de células mononucleares de sangre periférica utilizando anticuerpos anti-CD3 y anti-B220. Después de inyección en blastocistos deficientes en RAG-2, células deficientes en XBP-1 contribuyeron a la reconstitución de linfocitos B y T de sangre periférica en aproximadamente la mitad de los ratones nacidos. En estos animales reconstituidos, células ES deficiente en XBP-1 contribuyeron fuertemente a los órganos linfoides, de manera variable al corazón, pulmón, riñon y músculos, pero de manera mínima al hígado, lo que es consistente con la función esencial de XBP-1 en el desarrollo de hepatocitos que se observa en embriones XBP-1 -/-. La reconstitución de nodos linfáticos y bazo en animales XBP- l/RAG-2-/- resultó en números normales y porcentajes normales de linfocitos B y T en la mayoría de los animales quiméricos en comparación con ratones de control 129 de tipo silvestre. Además, linfocitos B de ratones de tipo silvestre y ratones XBP-l/RAG-2 presentaron patrones no distinguibles de tinción de superficie celular para IgM, IgD y B220. Producción de inmunoglobulina sérica deficiente por cél ulas B XBP-1 -/- Para evaluar una función principal de linfocitos B, niveles de inmunoglobulina fueron ensayados por ELISA en el suero de ratones XBP-l/RAG/2-/- y ratones de control 129Sv/ImJ. Todos los animales fueron alojados en condiciones específicas sin patógenos. Ensayos ELISA de niveles de inmunoglobulina en el suero fueron efectuados utilizando técnicas estándares. Los hallazgos fueron que los animales XBP-l/RAG/2-/- presentaban una disminución profunda de los niveles de inmunoglobulina sérica para todos los subtipos Ig probados, con una pequeña cantidad de IgG2a detectada en algunos de los ratones. Para probar el potencial de células B deficientes en XBP-1 para la producción de Ig después de estimulación in vi tro, esplenocitos o células B purificadas (selección de perlas magnéticas B220+, Miltenyi Biotech) fueron colocadas en placas a razón de 1 x 106 células/ml y estimuladas con anticuerpo anti-CD40 (1 µg/ml), IL-4 anti-CD40 más (10 ng/ml), LPS (20 µg/ml) o LPS más durante 4 días. Cuando los niveles de inmunoglobulina fueron determinados en los sobrenadantes de cultivo (por ELISA, utilizando métodos estándares) , todos los subtipos de Ig probados fueron encontrados otra vez en niveles inferiores en las muestras de XBP-1/-/- en comparación con las muestras de control.
Finalmente, la producción de inmunoglobulina específica APRA antígeno fue evaluada después de inmunización de ratones con DNP-albumina, cosecha de células B, así como estimulación in vi tro de células B con DNP-KLH. La producción de inmunoglobulina específica para antígeno por células B XBP-1/-/- fue severamente disminuida en este ensayo. Los hallazgos indican que aún cuando las células B deficientes en cuanto a XBP-1 pueden ser generadas en números normales, son defectuosas par volverse células plasmáticas que secretan anticuerpos. Fenotipo in vitro de células B deficientes en cuanto a XBP-1 Después de haber identificado números normales de células B en el bazo y nodos linfáticos pero con diferenciación de terminal de células B defectuosa en ratones XBP-l/RAG/2-/-, el fenotipo de la activación de células B fue investigado in vi tro. Células B fueron estimuladas in vi tro con anticuerpo anti-CD40 {lµg/ml), IL-4 anti-CD40 + (10 ng/ml), LPS (20 µg/ml), ó bien IL-4 LPS + durante hasta cuatro días. La proliferación de células fue la misma en muestras deficientes en cuanto a XBP-1 y en muestras de controlo, de conformidad con lo determinado por conteos de células equivalentes los días 1 y 4 después del cultivo. Además, las poblaciones de células B fueron activadas de manera similar, de conformidad con lo determinado por análisis de los marcadores de activación de superficie celular clase 11 MHC y CD69. Los estímulos in vi tro fueron tambiéß diseñados para inducir una recombinación de cambio de clase en células B, por ejemplo, el cambio a IgG2a e IgE por IL-4, y el cambio a IGG por anti-CD40 solo. La recombinación de cambio de clase fue equivalente en muestras XBP-1/-/- y muestras de control, de conformidad con lo determinado por análisis FACS de ínmunoglobulina de superficie celular y por los niveles de ARNm de Ig recombinada. El perfil de citocina en células B cultivadas in vi tro fue también estudiado. La producción de IL-6 por células B XBP- 1/-/- mostró una disminución promedio de 51% en comparación con células B de tipo silvestre, después de estimulación LPS (50 µm/ml) y 46% en comparación con células B de tipo silvestre, después de estimulación con LPS e IL-4 (10 ng/ml) . Sin embargo, no se observó ninguna disminución de la producción de IL-6 después de tratamiento con IL-4 anti-CD40 (10 µg/ml) o anti-CD40 +. Además, en dos experimentos, la producción de IL-10 por células XBP-1/-/- fue la misma que por las células de tipo silvestre independientemente del estímulo (LPS, LPS+ IL4, anti-CD40 o anti-CD40+) . Por consiguiente, células B deficientes en cuanto a XBP-1 están presentes en números normales y pueden ser activadas in vi tro para presentar proliferación, expresión de marcador de activación de superficie celular, recombinación de cambio de clase, y secreción de citocinas a niveles casi normales.
Por consiguiente, otros mecanismos deben explicar la producción afectada de inmunoglobulina por células B XBP-1-/-Generación disminuida de cél ulas plasmáticas en ausencia de XBP-1 Para evaluar si células B de dicientes en XBP-1 responden a estímulos de activación in vivo, ratones fueron inmunizados con DNP-albumina y nodos linfáticos de drenaje fueron cosechados después de 9 días. El análisis histológico demostró una formación normal de centros germinales en animales XBP-l/RAG/2-/-. Esto indica que muchas de las funciones de células B ensayadas in vi tro, por ejemplo, proliferación de células, activación, y recombinación de cambio de clase, estuvieron también intactas in vi vo. Sin embargo, la generación de células plasmáticas fue severamente afectada en animales XBP-l/RAG/2-/-. Secciones de yeyuno de ratones de ratones XBP-l/RAG/2-/- versus ratones de control presentaron 70 veces más células plasmáticas en los controles. Además, se observó que las células plasmáticas escasas observadas en animales XBP-l/RAG/2-/- en general no presentaban el halo perinuclear, lo que indica que estas células no tenían un aparato de Golgi grande y probablemente no secretaban grandes cantidades de inmunoglobulinas. Una prueba adicional de generación de células plasmáticas fue un ensayo para células positivas para Syndecan-1 en ratones inmunizados con DNP-albumina. Syndecan-1 es una glicoproteína de superficie celular regulada de manera ascendente en células plasmáticas diferenciadas terminalmente pero ausente en células B maduras. De conformidad con lo predicho por el bajo nivel de producción de inmunoglobulina, muestras de XBP- 1/-/- no provocan la producción de cantidades significativas de células positivas Sindican-1, mientras que fueron fácilmente detectadas en el control de tipo silvestre. Además, cultivos de células B de XBP-1/-/- estimuladas in vitro no solamente secretaron menos inmunoglobulina que los controles, pero también fueron menos diferenciadas cuando se ensayaron por técnicas moleculares. Northern blot de ARNm de células B de tipo silvestre y XBP-1/-/- estimuladas durante 4 días in vi tro fueron sondeadas para expresión de cadena J, lo que se requiere para el ensamblaje de IgM e IgA en células plasmáticas, así como para c-myc, que se vuelve regulado de manera descendente conforme las células B salen del ciclo celular para diferenciarse terminalmente. El ADN total fue aislado utilizando TriZol (Gibco) de conformidad con lo recomendado por el fabricante. Células B XBP-1-/- presentaban un fenotipo menos maduro que las células B de control, lo que muestra cantidades menores de ARNm de cadena J y niveles mayores de ARNm de c-myc. Por consiguiente, animales XBP- l/RAG/2-/- presentaron un defecto severo en cuanto al número de células plasmáticas terminalmente diferenciadas. Expresión de XBP-1 en cél ulas plasmáticas en sinovia reumatoide XBP-1 es expresado de manera ubicua en tejidos adultos y un trabajo previo mostró que de dos a cuatro líneas de células plasmáticas probadas presentaban niveles extremadamente altos de ARNm de XBP-1. La artritis reumatoide ofreció una fuente de material clínico para estudiar la expresión de XBP-1 en una condición caracterizada por infiltrados de células inflamatorias y producción de factor reumatoide por células plasmáticas. Utilizando la hibridación in situ (que fue efectuada empleando sondas específicas para XBP-1 de las porciones no trasladadas 5' y 3' del ADNc), una sonda de antisentido para XBP-1 mostró una fuerte hibridación con células plasmáticas en sinovia reumatoide, mientras que una sonda de sentido no mostró ninguna hibridación específica. Secciones en serie confirmaron histológicamente la identificación de las células plasmáticas. Este ejemplo muestra la expresión de alto nivel de XBP-1 en el infiltrado de células plasmáticas de una enfermedad inflamatoria. XBP-1 impulsa la diferenciación de cél ulas B El hallazgo de muy pocas células plasmáticas en ratones XBP-l/RAG/2-/- a pesar de centros germinales aparentemente normales localizan el sitio primario de acción de XBP-1 en el intervalo entre la activación de células B completa y la diferenciación terminal. La línea de células BCLI-3B3 es una línea de células B altamente activada que puede ser impulsada a una etapa de células plasmáticas temprana por tratamiento con IL-2 + IL-5. La línea de células BCLI-3B3 fue obtenida a partir del American Type Culture Collection y cultivada de conformidad con el protocolo suministrado. Un constructo de expresión que contiene XBP-1 y proteína fluorescente verde (GFP) fue transfectado en esta línea de células para estudiar su capacidad de afectar la etapa de diferenciación. La transfección fue mediante electroporación a 290V, 275 µF en un electroporador BioRad. Mediante el análisis FACS, células que sobreexpresan XBP-1 pero no el vector de GFP solo mostraron signos de maduración adicional: una disminución de los niveles de CD44 y el surgimiento de células positivas Syndecan-1. Es interesante observar que un efecto idéntico ha sido descrito para la transfección del factor de transcripción Blimp-1 en células BCL1-3B3. Sin embargo, Northern blot de células B activadas provenientes de fuentes normales y de fuentes XBP-l/RAG/2-/- no mostraron diferencias en cuanto a niveles de ARNm de Blimp-1. Por consiguiente, XBP-1 actúa corriente debajo de Blimp-1 o bien a través de una ruta separada en su regulación de la diferenciación de células B. Una segunda acción de Blimp-1 sobreexpresado es provocar la apóptosis de células B que son inmaduras o bien no totalmente activadas. Para examinar si la sobreexpresión de XBP-1 pudiera provocar la apóptosis de células B, un constructo de expresión de XBP-1 fue transfectado en la línea de células B maduras Ball7. Un hallazgo similar al hallazgo observado con Blimp-1 fue demostrado en la línea Ball7 después de la transfección de cantidades crecientes de constructo de expresión de XBP-1. La transfección de Ball7 fue por electroporación a 290V, 275 µF en un electroporador BioRad. La línea de células Ball7 fue cultivada en medio RPMI con suero fetal de becerro al 10%, glutamina 2 mM, 50 Ul/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina, lOOµl de beta-mercaptoetanol. Se observó hasta 12% de apóptosis cuando se agregaron las cantidades más altas de XBP-1. EJEMPLO 3: Preparación de anticuerpos monoclonales anti- XBP- 1 Para preparar anticuerpos monoclonales contra XBP-1, el ADNc de XBP-1 que codifica las posiciones 226-884 fue clonado en el vector pQR9, que codifica un marcador de histidma fusionado en cuadro con las secuencias codificadoras de XBP-1 al introducirse el ADNc en el vector. La proteína de XBP-1 marcada con His fue expresada y utilizada para inmunizar ratones y anticuerpos monoclonales fueron elaborados a partir de linfocitos de los ratones inmunizados por técnicas estándares. EJEMPLO 4: Caracterización del fenotipo de células T auxiliares de ratones deficientes en XBP-1 La producción de citocinas por células T de ratones quiméricos deficientes en XBP-1/deficientes en RAG-2 fue Í?.áii. É-J É_i__. _3___¿_a___ ...|_--_,-^.rf. — fabm?MÉ? estudiada con el objeto de examinar el efecto de la deficiencia de XBP-1 sobre subgrupos de células T auxiliares. Células T fueron aisladas de ratones deficientes en cuanto a XBP-1/deficientes en cuanto a RAG-2 (XBP/rag) y de ratones de tipo silvestre cepa 129(129w+) como controles. Las células fueron cultivadas in vi tro en condiciones que favorecieron ya I ! ¡sea la diferenciación de Thl o bien la diferenciación de Th2, bien que no favorecieron el desarrollo de ningún tipo de célula auxiliar (condiciones no sesgadas) . Para inducir la diferenciación de Thl, células fueron cultivadas con 5 ng/ml de IL12 y 10 µg/ml de anticuerpo anti-IL4. Para inducir la diferenciación, células fueron cultivadas con 10 ng/ml de IL-4 recombinante y 10 µg/ml de anticuerpo anti-IFN-? y 10 µg/ml de anticuerpo anti-IL-12. La producción de las citocinas siguientes por las diferentes poblaciones de células fue medida por ELISA: IL-4, IFN-?, IL-10, IL-5 e IL-6. Gráficas de barras que ilustraron los resultados de dos conjuntos 'diferentes de animales aparecen en la figura 2 (IL-4), Figura 3 (IFN-?), Figura 4 (IL-10), Figura 5 (IL-5), y Figura 6 (IL- 6) . Los resultados demuestran que para las citocinas de tipo Th2 examinadas (114, IL-10, IL-5 e IL-6) , células T de los I ratones deficientes en cuanto de XBP-1 presentaron un defecto en cuanto a la capacidad de producir estas citocinas cuando las células fueron cultivadas en condiciones no sesgadas (ver figuras 2, 4,5 y 6, colfismas de la izquierda). En contraste, células T de ratones deficientes en cuanto a XBP-1 siguen conservando la capacidad de producir la citocina de tipo Thl IFN-? cuando se cultivan en condiciones no sesgadas (ver figura 3, columnas de la izquierda) , así como en condiciones que favorecen el desarrollo de células Thl (ver figura 3, columnas centrales) . El defecto en la producción de citocinas Th2 por las células T deficientes en XBP-1 fue superado por el cultivo de la células T en condiciones que favorecen el 10 desarrollo de células Th2 (ver figuras 2,4,5 y 6, columnas de la derecha. Estos datos indican que la falta de factor de transcripción de XBP-1 provoca un defecto en la producción de p citocinas Th2 que puede ser superado por factores exógenos que sesgan el desarrollo de células T a lo largo de la ruta 15 Th2. III. EQUIVALENTES Los expertos en la materia reconocerán, o bien podrán determinar utilizando solamente experimentos de rutina muchos equivalentes a las modalidades específicas de la presente ^ 20 invención descrita aquí. Tales equivalentes están abarcados dentro del marco de las reivindicaciones siguientes. 25 —^« Kfcj|í____tt . ;•IÍL ' _ • LISTA DE SECUENCIAS <110> Glmc-e: _aur?e H. <120> MÉTODOS : COMPOSICIONES QUE SE REFIEREN A LA MODULACIÓN DEL CRECIMIENIC DE HEPATOCITOS, DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS P SMICAS O ITIVIDAD DE SUBGRUPOS DE CÉLULAS T MEDIANTE LA MODULACIÓN DE ACTIVIDAD DE XBP-1 <130> 144452O03Z^-~---30 <140> <141> <160> 1 <170> Paten lr. _-_.-__=_=r. 2.0 <210> 1 <211> 39 <212> ADN <213> Mus 3us~ __s <400> 1 ggccagtgaa - -? racg actcactata gggaggcgg _ .

Claims (1)

  1. REIVINIDICAIONES 1. Un método para identificar un compuesto que modula el crecimiento de hepatocitos, la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T, que comprende a) suministrar una composición indicadora que comprende una proteína XBP-1; # b) poner en contacto la composición indicadora con cada miembro de una biblioteca de compuestos de 10 prueba; c) seleccionar a partir de la biblioteca de compuesto de prueba un compuesto de interés que modula la actividad de proteína XBP-1; y d) determinar el efecto del compuesto de interés 15 sobre el crecimiento de hepatocitos o sobre la diferenciación de células plasmáticas o sobre la actividad de subgrupos de células T con el objeto de identificar de esta forma un compuesto que modula el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la composición indicadora es una célula que expresa una proteína XBP-1. 25 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde la célula ha sido mani _lada para expresar la proteína XBP-1 mediante la introducción en la célula de un vector de expresión que codiiXca la proteína XBP-1. El método de conformidad con l-a reivindicación 1, en donde la composición indicadcora es una composición libre de células. El método de conformidad con Xa reivindicación 1, en donde la composición indicadcrra es una célula que expresa una proteína XBP-1 y u-ré molécula blanco, y se monitorea la capacidad del cciiapuesto de prueba para modular la interacción de la proteína XBP-1 con una molécula blanco. El método de conformidad con Is. reivindicación 1, en donde la composición indicadcr:.-. comprende una célula indicadora en donde la célula indicadora comprende una proteína XBP-1 y un gen reportero que responde a la proteína XBP-1. El método de conformidad con 1= reivindicación 6, en donde dicha célula indicadora contiene: un vector de expresión recombinante que cod-üca la proteína XBP-1; y un vector que comprende un elemento regulador que responde a XBP-1 enlazado operativamente a un gen reportero; y dicho método comprsride: a) poner en contacto la célula indicadora con un compuesto de prueba; t? ^?'?tf^*i?*^^^m?^ím ^i A b) determinar el nivel de expresión del gen reportero en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba; y c) comparar el nivel de expresión del gen reportero en la célula indicadora en presencia del compuesto de prueba con el nivel de expresión del gen reportero en la célula indicadora en ausencia del compuesto de prueba con el objet© de seleccionar de esta forma un compuesto de interés que modula la actividad de proteína XBP-1. 8. Un método para identificar un compuesto que modula el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la actividad de subgrupos de células T, que comprende: a) poner en contacto hepatocitos o células B o % células T deficientes en XBP-1 con un compuesto de prueba; y b) determinar el efecto del compuesto de prueba sobre el crecimiento de los hepatocitos o la diferenciación de las células B en células plasmáticas o la producción de citocinas Th2 por las células T, el compuesto de prueba es identificado como modulador del crecimiento de hepatocitos o diferenciación de células plasmáticas o actividad de subgrupos de células T con base en la capacidad del compuesto de prueba para modular el crecimiento de los hepatocitos o la diferenciación de las células B o la producción de citocinas Th2 por las células T deficientes en XBP-1. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde las células deficientes en XBP-1 se encuentran en un animal no humano deficiente en XBP-1 y las células entran en contacto con el compuesto de prueba mediante la administración del compuesto de prueba al animal no humano deficiente en XBP-1. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el animal no humano deficiente en XBP-1 es un ratón. 11. El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde las células deficientes en XBP-1 son aisladas de un animal no humano deficiente en XBP-1, o embrión del mismo, y las células están en contacto con el compuesto de prueba mediante el cultivo del compuesto de prueba con las células aisladas deficientes en XBP-1. 12. El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde el compuesto estimula el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o la producción de citocinas Th2. 13. Un método para modular el crecimiento de hepatocitos o la diferenciación de células plasmáticas o actividad de subgrupos de células T, que comprende la puesta en contacto de hepatocitos o precursores de células plasmáticas o células T con un modulador de la » actividad de XBP-1 de tal manera que se module el crecimiento de los hepatocitos o la diferenciación de las células plasmáticas o la producción de citocinas Th2 por las células T. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el modulador inhibe la actividad de XBP-1. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el modulador es un oligonucléotido de antisentido. 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el modulador es un anticuerpo intracelular. 17. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el modulador estimula la actividad de XBP-1. 18. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el modulador es un vector de expresión que codifica XBP-1. 19. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde los hepatocitos o los precursores de células plasmáticas o células T están en contacto con el modulador mediante el cultivo de los hepatocitos ó precursores de células plasmáticas o células T in vitro con el modulador. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde los hepatocitos o precursores de células plasmáticas o células T están en contacto con un modulador que estimula la actividad de XBP-1 de tal manera que se estimule el crecimiento de los hepatocitos o la diferenciación de los precursores de células plasmáticas en células plasmáticas o la producción de citocinas Th2 por las células T, el método comprende además la administración de los hepatocitos o células plasmáticas o células T a un sujeto después de la estimulación in vi tro. diferenciación de células plasmáticas y de la actividad de subgrupos de células T. Se proporcionan métodos para identificar moduladores de crecimiento de hepatocitos, diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de • subgrupos de células T, empleando composiciones indicadoras que contiene XBP-1 o células deficientes en XBP-1. Se 10 proporcionan también métodos para modular el crecimiento de hepatocitos, diferenciación de células plasmáticas y/o actividad de subgrupos de células T (por ejemplo, producción de citocinas Th2) utilizando agentes que modulan la actividad de XBP-1. Métodos para diagnosticar trastornos asociados con 15 un crecimiento aberrante de hepatocitos, diferenciación aberrante de células plasmáticas y/o actividad aberrante de subgrupos de células T, mediante la evaluación de un cambio en la expresión de XBP-1, se proporcionan también. La invención ofrece también células, animales y embriones 20 deficientes en XBP-1 así como kits para los métodos de la ^F invención.
MXPA02006433A 1999-12-30 2000-12-29 Metodos y composiciones que se refieren a la modulacion del crecimiento de hepatocitos, diferenciacion de celulas plasmaticas o actividad de subgrupos de celulas t mediante la modulacion de la actividad de xbp-1. MXPA02006433A (es)

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