ES2377407T3 - Utilización de la proteína ASC como marcador para cáncer de seno - Google Patents

Abstract

Metodo para el diagnostico in vitro de cancer de seno, que comprende las siguientes etapas: a) preparar una muestra liquida obtenida de un individuo,b) establecer contacto de dicha muestra con un agente de union especifico para la proteina tipo mancha ("speck-like"), que contiene un dominio de reclutamiento asociado a cas pasa (A SC), bajo condiciones apropiadas para la formacion de un complejo entre dicho agente de union y ASC, yc) correlacionar la cantidad de complejo formado en (b) con el diagnostico de cancer de seno, de manera que un nivel elevado de ASC en comparacion con controles sanos es indicativo de cancer de seno.

Description

Utilizacion de la proteina ASC como marcador para cancer de seno

La presente invencion se refiere al diagnostico de cancer de seno. Da a conocer la utilizacion de una proteina tipo mancha ("speck-like") asociada a apoptosis, que contiene un dominio de reclutamiento asociado a caspasa (= ASC) en el diagnostico de cancer de seno. Ademas, se refiere, en especial, a un metodo para el diagnostico de cancer de seno a partir de una muestra de liquido, derivada de un individuo para la medicion de ASC en dicha muestra. La medicion de ASC puede ser utilizada en la deteccion precoz o diagnostico de cancer de seno. El cancer sigue siendo un importante reto para la salud publica, a pesar de los avances en la deteccion y en la terapia. Entre los diferentes tipos de cancer, el cancer de seno (=BC) es uno de los canceres mas frecuentes entre las mujeres del mundo occidental. Cuando mas pronto se pueda detectar/diagnosticar, mejor es la tasa general de supervivencia. Esto es especialmente cierto para BC. El pronostico en etapas avanzadas del tumor es poco satisfactorio. Mas de un tercio de los pacientes moriran por el avance de la enfermedad dentro de los cinco aros despues del diagnostico, correspondiendo a una tasa de supervivencia de aproximadamente 40% para cinco aros. El tratamiento actual cura solamente una fraccion de l os pacientes y, de manera clara, tiene los mejores efectos en los pacientes diagnosticados en una etapa precoz de la enfermedad. Con respecto a BC como problema de salud publica, es esencial que se desarrollen medidas mas efectivas de deteccion y medidas preventivas, para el cancer de seno. Los procedimientos de dete ccion mas precoces, actualmente disponibles para el cancer de seno comportan la utilizacion de examenes clinicos de los senos y la mamografia. No obstante, debe existir un tamaro significativo del tumor antes de que pueda ser palpable o pueda ser detectado por una mamografia. La densidad de los tejidos del seno y la edad son importantes elementos de prediccion de la exactitud de la mamografia. Las tasas de sensibilidad oscilan entre el 63 % en m ujeres con se nos extremadamente densos hasta 87 % en mujeres con senos casi enteramente grasos. La sensibilidad aumenta con la edad, desde 69% en mujeres de unos 40 aros hasta 83% en mujeres de 80 aros y mas (Carney, P.

A., y otros, Ann. Intern. Med. 138 (3) (2003) 168-175). Solamente, el 20-25% de las a normalidades detectadas mamograficamente, que son objeto de bi opsia, llegan a ser malignas. La visualizacion de lesiones precancerosas y cancerosas representa el mejor enfoque para la deteccion precoz, pero la mamografia es una prueba costosa que requiere gran cuidado y experiencia, tanto para llevarla a cabo como para la interpretacion de los resultados (WHO, Screening for Breast Cancer, May 10, 2002; Esserman,L., y otros, J. Natl. Cancer Inst. 94 (2002) 369-375). En estos ultimos aros, se ha informado sobre una gran cantidad de los llamados genes especificos para senos, o incluso llamados especificos para cancer de senos. La inmensa mayoria de los documentos de investigacio n correspondientes o solicitudes de patentes se basan en datos obtenidos por analisis de modelos de expresion de ARN en teji dos de se no (cancer), en c omparacion con un tejido distinto o a un tejido normal adyacente, respectivamente. Estos enfoques se pueden resumir como tecnicas de visualizacion diferencial de mARN. Como ejemplo de los datos disponibles de las tecnicas de visualizacion de mARN, el documento WO 00/60076 se mencionara y se explicara. Esta solicitud de patente describe y reivindica mas de doscientos polinucleotidos aislados, y los correspondientes polipeptidos asi como, su utilizacion en la deteccion de BC. No obstante, es conocimiento general que las diferencias en el nivel d e mARN no se reflejan po r el nivel de las proteinas correspondientes. Una proteina codificada por un mARN raro puede ser encontrada en cantidades muy grandes, y una proteina codificada por un mARN abundante puede ser, no obstante, dificil de detectar y encontrar en absoluto (Chen, G., y otros, Molecular and Cellular Proteomics, 1.4 (2002) 304-313). Esta falta de correlacion entre el nivel de mARN y el nivel de la proteina es debido a razones tales como la estabilidad de mARN, la eficacia de la traduccion, la estabilidad de la proteina, etc. El documento WO 01/29235 da a conocer que TMS1 es un nuevo gen regulador apoptotico que es silenciado como resultado de una metilacion anormal. Zhang, H., y otros han analizado la expresion de la proteina de cancer 3 amplificada en un seno (AIB3, conocida tambien como ASC-2, RPA250, PRIP, TRBP y (CNR) en ratones (Zhang, H., y otros, Endocrinology 144(4):14351443). Sus mediciones cuantitativas han rebelado que las concentraciones de AIB3 mARN difieren sustancialmente en diferentes tejidos, en ord en descendente de los siguientes: testiculos, cerebro, timo, grasa blanca, pituitaria, ovario, glandulas adrenales, pulmon, utero, riron, corazon, musculos esqueleticos, higado, y glandulas mamarias virgenes. Han existido tambien enfoques recientes investigando las diferencias de modelos de proteina entre diferentes tejidos

o entre tejidos sanos y enfermos, a efectos de identificar moleculas marcadoras candidato que puedan ser utilizadas en el diagnostico de BC. Wulfkuhle y otros. Cancer Research 62 (2002) 6740-6749 han identificado cincuenta y siete proteinas que fueron expresadas de manera diferencial entre tejidos de BC y tejidos normales adyacentes. No se informo de datos sobre muestras de liquidos obtenidas a partir de un individuo.

El documento WO 02/23200 da a c onocer aproximadamente doce puntos asociados con ca ncer de s eno, por desabsorcion laser e ioni zacion con a mpliacion sup erficial (SELDI). Estos pun tos son apreciados mas frecuentemente en sueros obtenidos a partir de pacientes con BC, en comparacion con los sueros obtenidos a partir de controles sanos. No obstante, la identidad de la molecula o moleculas comprendidas en dicho punto, por ejemplo, su secuencia, no es conocida.

El liquido aspirado de los pezones (NAF) como metodo potencial no invasivo se ha utilizado durante muchos aros, para identificar marcadores especificos para el cancer de seno. Kuerer y otros compararon fluidos aspirados de un par de pezon es, compensa dos bil ateralmente, de muj eres con car cinoma de se no invasiv o u nilateral p or electroforesis de gel 2D (Kuerer, H.M., y otros, Cancer 95 (2002) 2276-2282). Se detectaron de 30 a 202 puntos de diferentes proteinas en el NAF de senos afectados de carcinoma de seno yno en el NAF equilibrado de senos sanos. Estos puntos fueron detectados por el analisis de una imagen de gel. Sin e mbargo, la identidad de los puntos de proteina no es conocida.

A pesar de la larga y creciente lista de proteinas candidatas a marcadores en el sector del cancer d e seno (BC), hasta la actualidad, la utilidad clin ica de diagnostico de estas moleculas no es conocida. Para que sea utilidad clinica un nuevo marcador diagnostico, un marcador unico debe ser, como minimo, tan satisfactorio como el mejor marcador individual conocido en la tecnica. Es decir, un nuevo marcad or debe de conducir a un avance en la sensibilidad d el diagnostico y /o a la esp ecificidad utili zado solo o en combinaci on con uno u otros varios marcadores, respectivamente. La sensibilidad al diagnostico y/o especificidad de una prueba es mejor evaluada por sus caracteristicas de receptor-operativas, que se describiran en detalle mas adelante.

En la actualidad, solamente se disponen, pa ra ayudar al diagnostico en el sector BC, pruebas de sang re basadas en la detecci on del antige no del cance r 15-3 (CA 15-3), una mucina asociada al tumor, y un antigeno carcinoembrionario (CEA), una glicoproteina asociada al tumor estan disponibles para ayudar al diagnostico de BC. El CA 15-3 tiene valores habitualmente incrementados en pacientes con cancer de seno avanzado. Los niveles de CA 15-3 son dificilmente elevados en mu jeres con etapas precoce s de cancer de seno (Duffy , M.J., Cri tical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262). Los canceres de ovario, pulmon y prostata pueden aumentar tambien los niveles de CA 15-3. Los niveles elevados de CA 15-3 pueden ser asociados a estados no cancerosas, tales como enfermedades benignas de senos u ovarios, endometriosis, enfermedad inflamatoria de la pelvis y la hepatitis. El embarazo y la lactancia pueden provocar tambien un aumento en los niveles de CA 15-3 (National Cancer Institute, Cancer Facts, Fact Sheet 5.18 (1998) 1-5). La utilizacion principal de CEA es el control de cancer de colon, especialmente cuando la enfermedad ha producido metastasis. No obstante, una serie de canceres pueden producir niveles elevados de CEA, incluyendo el cancer de seno.

Debido a la falta de esp ecificidad de organo y tumor, ni la me dicion de CA 1 5-3, ni la me dicion de CEA s e recomienda para la deteccion de BC. Estos marcadores d e tumor son una herramienta util de diagnostico en los cuidados de seguimiento de pacientes de BC (Untch, M., y otros, J. Lab. Med. 25 (2001) 343-352).

La sangre entera, suero, plasma, o liquido aspirado de pezones son las fuentes mas ampliamente utilizadas de muestras en la rutina clinica. La i dentificacion precoz de un marcad or de tumor BC que p ermita una deteccio n fiable de cancer o proporcionar una informacion de pronostico precoz podria conducir a un ensa yo de diagnostico que a yudaria notablemente en el dia gnostico y en a l g estion de esta enfermedad. Por lo tanto, existe un a necesidad clinica urgente de mejorar e l diagnostico de BC a partir de sangre. Es especialmente importante, mejorar el di agnostico pre coz de BC, dado q ue p ara pacientes diagnosticados de modo a nticipado, la s probabilidades de supervivencia son mucho mas elevadas, en comparacion con los diagnosticados a una etapa avanzada de la enfermedad.

Ha sido la tarea de la presente invenc ion, investigar si se puede identificar un nuevo marcador que pueda ayudar en el diagnostico de BC.

De manera so rprendente se ha descubiert o que la utiliz acion del mar cador ASC puede superar, por lo menos parcialmente, los problemas conocidos en el estado de la tecnica.

Por lo tanto, la presente invencion se refiere a un metodo para el diagnostico in vitro de cancer de seno, que comprende las etapas de: a) proporcionaruna muestra de liquido obtenida a partir de un individuo, b) poner en contacto dicha muestra con un agente de union especifico para ASC, en condiciones apropiadas para la formacion de un complejo entre dicho agente de union y ASC, y c) correlacionar la cantidad de complejo formada en b) con el diagnostico de cancer de seno, de manera que un nivel elevado de ASC, en comparacion con controles sanos, es indicativo de cancer de seno. Otra realizacion prefer ente de la invencion es un metodo para el diagnostico de cancer de seno, que comprende las etapas a) poner en contacto una muestra de liquido obtenida a partir de un individuo con un agente especifico de union para ASC, bajo condiciones apropiadas para la formacion de un complejo entre dicho agente de union yASC, y b) correlacionar la cantidad de complejo formado en a) con el diagnostico de cancer de seno.

Tal como apreciaran los exp ertos en la ma teria, cualquiera de dichos diagnosticos se realiza in vitro. La muestra del paciente es eliminada posteriormente. La muestra del paciente es utilizada solamente para el metodo de diagnostico in vitro de la invencion, y el material de la muestra del paciente no es devuelto al cuerpo del mismo. De manera tipica, la muestra es una muestra liquida.

La "proteina tipo mancha ("speck-like") asociada a apoptosis, que contiene un dominio de reclutamiento asociado a caspasa" (ASC), tambien conocida como diana del silenciamiento 1, inducida por metilacion (TMS1) (Swiss-PROT: Q9ULZ3) se caracteriza por la secuencia indicada en IDNO:1. Esta secuencia se traduce en un peso molecular teorico de 21.627 Da y en un punto isoelectrico teorico de pH 6,29.

Los dominios de reclutamiento asoci ados a caspasa (los CARD) median la i nteraccion en tre proteinas adaptadoras, tales como APAF1 (proteasa apoptotica activadora de factor 1) y la pro-forma de caspasas (por ejemplo, CASP 9) que participan en la apoptosis. La ASC es un miembro de la familia de proteinas adaptadoras que contienen CARD.

Por inmunorastreo de una linea celular pro-mielocitica, Masumoto y otros aislaron un cADN que codifica ASC. La proteina deducida de 195 aminoacidos contiene un dominio de terminal N similar a la pirina (PYD), y un terminal CARD-C de 87 residuos. El analisis de transferencia Western mostro la expresion de una proteina de 22 kDa e indico que el ASC puede tener una actividad pro-apoptotica al incrementar la susceptibilidad de las lineas celulares de leucemia a estimulos a poptoticos, por medicamentos anti-cancer (Masumoto, J, y otros,J. Biol. Chem. 274 (1999) 33835-33838).

Los analisis de restriccion de PCR sensible a metilacion y PCR (MSP) especifica a metilacion, por Conway y otros, indicaron que el silenciamiento de ASC se correlaciona con la hipermetilacion de la isla CpG que rodea el exon1 y que la sobreexpresion DNMT1 (ADN citosina-5-metiltransferasa-1) proporciona la hipermetilacion y silenciamiento de ASC. Las lineas celulares de cancer de seno, pero no los tejidos de seno normales, mostraron una metilacion completa de ASC y no expresaron mensaje ASC. La expresion de ASC en lineas celulares de ca ncer de seno inhibio el crecimiento y redujo el numero de colonias supervivientes. Conway y otros llegaron a la conclusion de que ASC funciona en el fomento de apoptosis dependiente de caspasa, y que la sobreexpresion de ASC inhibe el crecimiento de las celulas de cancer de seno (Conway, K.E., y otros, Cancer Research 60 (2000) 6236-6242).

McConnell y Vertino han demostrado que la expresion inducible de ASC inhibe la proliferacion celular e induce a la fragmentacion del ADN, que puede ser bloqueada por un inhibidor de caspasa. A partir de un microscopio de inmunofluorescencia se ha demostrado que la induccion de apoptosis provoca un desplazamiento dependiente de CARD de expresion citoplasmica difusa a agregados perinucleares esfericos (McConnell, B.B., y Vertino, P.M., Cancer Research 60 (2000) 6243-6247).

Moriani y otros observaron la metilacion de un gen de ASC, no solamente en celulas de cancer de seno, sino tambien en las de cancer gastrico. Sugirieron un papel directo para la metilacion aberrante del gen de ASC en el avance de cancer de seno ydel cancer gastrico, comportando una regulacion descendente del gen de ASC proapoptotico (Moriani, R., y otros, Anticancer Research 22 (2002) 4163-4168).

Conway y otros examinaron tejidos primarios de senos en cuanto a metilacion TMS1, y compararon los resultados de la metilacion de los tejidos sanos (Conway K.E., y otros, Cancer Research 60 (2000) 6236-6242). Levine y otros descubrieron que el silenciamiento de ASC no estaba correlacionado con la metilacion de sitios CpG especificos, sino que estaba asociado a una metilacion densa de la isla ASC CpG. Las line as de celulas tumorales de seno, contendiendo exclusivamente copias de ASC metilada s, no expresa n ASC, mientras que en li neas celul ares parcialmente metiladas los niveles de expresion de ASC estan directamente relacionados a un porcentaje de alelos de ASC metilados presentes en la poblacion celular (Levine, J.J., y otros, Oncogene 22 (2003) 3475-3488).

Virmani y otros examinaron la situacion de la metilacion de ASC en tejidos de cancer de pulmon y tejidos de cancer de seno. Descubrieron que la met ilacion aberrante de ASC se encontr aba presente en un 46% de las lineas celulares de cancer de seno, y un 32% de los tejidos tum orales de seno. La metilacion era rara en tej idos de seno beningnos (7%) (Virmani, A., y otros, Int. J. Cancer 106 (2003) 198-204).

Shiohara y otros descubrieron que la regulacion ascendente de ASC esta asociada intimamente con la inflamacion y apoptosis en neutrofilos humanos (Shiohara, M., y otros, Blood 98 (2001) 229a).

Masumoto y otros observaron eleva dos n iveles de ASC abun dantemente expresados en ce lulas epitelial es y leucocitos (Masumoto, J., y otros, Journal of Histochemistry and Cytochemistry 49 (2001) 1269-1275).

Tal como es evidente para los tecnicos en la materia, la presente invencion ha de ser considerada limitada a la proteina de longitud completa ASC de SEQ ID NO: 1. La presente invenc ion tambien comprend e fragmentos fisiologicos o artificiales de ASC, modificaciones secund arias de ASC, asi como variantes alelicas de ASC. Los fragmentos artificiales comprenden preferentemente un peptido p roducido sint eticamente o por tecnicas recombinantes que, como minimo comprende un epitopo de interes diagnostico, que consiste, como minimo, en 6 aminoacidos contiguos derivados de la secuencia dada a conocer en SEQ ID NO:1. Este fragmento puede ser utilizado ventajosamente para la generacion de anticuerpos o como estandar en un inmunoensayo. De modo mas preferente, el fragmento artificial co mprende, como minimo, dos e pitopos de interes apropiados para disponer un inmunoensayo sandwich.

En realizaciones preferentes, el nuevo marcador ASC puede ser utilizado para el control, y tambien para objetivos de rastreo.

Cuando se utiliza, en el control de paciente, el metodo de diagnostico, segun la presente invencion, puede ayudar a evaluar la carga tumoral, la eficacia de tratamiento y la recurrencia del tumor en el seguimiento de pacientes. Los niveles incrementados de ASC estan correlacionados directamente a la carga tumoral. Despues de quimioterapia, un corto plazo (desde pocas horas a 14 dias) de incremento en ASC puede servir como indicador de muerte de celulas tumorales. En el seguimiento de p acientes (de 3 meses a 10 aros), un incremento de ASC puede ser utilizado como indicador de recurrencia del tumor.

En una realizacion preferente, el metodo de diagnostico, de acuerdo con la presente invencion, es utilizado para objetivos de rastreo, es decir, es utilizado para evaluar individuos sin diagnostico precoz de BC, por la medicion del nivel de ASC y la correlacion del nivel medido con la presencia o ausencia de BC.

La calificacion del cancer es la clasificacion de la enfermedad en terminos de extension, progresion, y gravedad. Agrupa a pacientes de cancer, de manera que se pueden realizar generalizaciones con respecto al pronostico y la eleccion de terapia.

En la actualidad, el sistema TNM es la clasificacion mas ampliamente utilizada de la extension anatomica de cancer. Representa un sistema de calificac ion uniforme, ace ptado i nternacionalmente. Ha y tres variabl es basicas: T (extension del tu mor primario), N (si tuacion de ga nglios limfaticos regionales), y M (prese ncia o ause ncia de metastasis distante). Los criterios TNM han sido publicados por la UICC (International Union Against Cancer) (Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (eds): TNM Classification of Malignant Tumours, fifth edition, 1997). El sistema de calificacion para cancer de seno ha sidorevisado recientemente (Singletary, S.E., y otros, Journal of Clinical Oncology 20 (2002) 3628-3636).

Lo que es especialmente importante es que el diagnostico precoz de BC se traduce en un pronostico mucho mejor. Por lo tanto, tienen el mejor pronostico precoz en los pacientes, tal como en la etapa Tis, N0, M0 o T1-3; N0; M0, si se tratan de manera aprop iada, tiene una probabilidadsuperior a 90% de supervivencia 5 aros despues del diagnostico, en comparacion con una tasa de supervivencia a los 5 aros de 18% solamente para pacientes diagnosticados cuando ya se encuentran presentes metastasis distantes.

En el sentido de la presente invencion, el diagnostico precoz de BC se refiere a un diagnostico en situacion precancerosa (DCIS) o en una etapa del tumor en la que no se encuentran presente ninguna metastasis (ni proximal ni distal), es decir, Tis, N0, M0 o T1-4; N0; M0. Tis indica carcinoma in situ.

En una realizacion preferente, se utiliza ASC para diagnosticar BC en una etapa sin metastasis, es decir, que el diagnostico es llevado a cabo en la etapa Tis, N0, M0 o T1-3; N0; M0 (=Tis -3; N0; M0).

El metodo de diagnostico, de acuerdo con la presente invencion, se basa en una muestra de liquido que se extrae de un individuo. A diferencia de metodos conocidos en la tecnica, el ASC es medido de manera especifica a partir de esta muestra de liquido por la utilizacion de un agente de union especifico.

Un agente de union especifico es, por ejemplo, un re ceptor para ASC, una lectina que se une a ASC, o u n anticuerpo a ASC. Un agente especifico de union tiene, como minimo una afinidad de 107 l/mol para su molecula diana correspondiente. El agente de union especifico tiene preferentemente una afinidad de 108 l/mol, o incluso, de manera mas preferente, de 109 l/mol para su molecula diana. Tal como apreciaran los expertos en la materia, el termino especifico se utiliza para indicar que otras biomoleculas presentes en la muestra no se unen de manera significativa al agente de u nion especifico para ASC . Preferentemente, el nivel de union a una biomolecula distinta de la molecula objetivo tiene como resu ltado una afinidad de union que es solamente del 10%, mas preferentemente solo 5% de la afinidad de la molecula diana, o menos. Un agente de union, mas preferentemente especifico, cumplira ambos criterios minimos indicados, en cuanto a afinidad y tambien especificidad.

Un agente de union especifico es pre ferentemente un anticuerpo reactivo con ASC. El termino anticuerpo se refiere a un anticuerpo policlonal, un an ticuerpo mono clonal, frag mentos de dichos anticuerpos, asi como constructos geneticos que comprenden el dominio de union de un anticuerpo. Cualquier fragmento de anticuerpo que retenga los anteriores criterios de un agente de union especifico, puede ser tambien utilizado.

Los anticuerpos son generados por procedimientos del estado de la tecnica, por ejemplo, tal como se describe en Tijssen (Tijssen, P., Practice and the ory of enzyme immunoassays 11 (1990) toda la obra, especialmente paginas 43-78; Elsevi er, Amsterda m). Ademas, los tecn icos en l a m ateria conoc en metodos basados e n inmunoabsorbentes que pueden ser utilizados para el aislamiento especifico de anticuerpos. Por estos medios, se puede i ncrementar la calid ad de l os ant icuerpos policl onales, y c omo consecue ncia, su comportamiento e n inmunoensayos. (Tijssen, P., supra, paginas 108-115).

Para los objetivos que se dan a conoc er en la presente invencion, se han utilizado an ticuerpos monoclonales y policlonales. Los anticuerpos policlonales han sido cultivados en conejos. No obstante, es evidente tambien que se pueden utilizar anticuerpos policlonales procedentes de diferentes especies, por ejemplo, ratas o coballas. Los anticuerpos monoclonales han sido producidos utilizando celulas del bazo de ratones inmunizados. Dado que se pueden produ cir anticuerpo s monoclonal es en cualq uier c antidad r equerida con caract eristicas constantes, representan herramientas ideales en el desarrollo de un ensayo para una rutina clinica. La generacion yuso de anticuerpos monoclonales a ASC en un metodo, segun la presente invencion, es otra realizacion preferente.

Tal como apreciaran los tecnicos en la materia, partiendo del hecho de que se ha identificado ASC como marcador util en el diagnostico de BC, se deben utilizar metodos alternativos para alcanzar un resultado comparable a los objetivos alca nzados por la presente invencion. Por ej emplo, se pu eden utilizar estrategias alternativas para generar anticuerpos. Estas estrategias comprende, entre otros, la utilizacion de peptidos sinteticos que representan un epitopo de ASC para la inmunizacion. Preferentemente, un p eptido sintetico comprende una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, que es especifica para ASC, es decir, que tiene una homologia comparativamente baja con respecto a otros polipeptidos relacionados. Es preferible que el peptido sintetico comprenda una subsecuencia contigua consistiendo de 5 a 25 residuos de aminoacidos de SEQ ID NO: 1. De modo mas preferente, el peptido comprende una subsecuencia contigua consistiendo en 10 a 15 residuos de aminoacidos de SEQ ID NO: 1. Otra s estrategias incluyen la utilizacion de una proteina de fusion SLyD-ASC, tal como se describe en el ejemplo 2 para la inmunizacion. Preferentemente, se utiliza una proteina de fusion de formula SlyD-(GG GS)5-GGG-IEGR-ASCGGGS-HHH-HHH, de manera que-(GGGS)5 -GGG es una primera secuencia de enlace rica en glicina, en la que IEGR es un sitio de fraccionamiento de factor Xa, de manera que GGGS es una segunda secuencia de enlace rica en glicina y HHHHHH es un marcador His.

De manera alternativa, se puede utilizar la inmunizacion, conocida tambien como vacuna de ADN.

Para la medicion, la muestra de liquid o obtenida a partir de un individuo es incubada con el agente de union especifico para ASC en condiciones apropiadas para la formacion de un agente de union ASC-complejo. No es necesario especificar estas condiciones, dado que los tecnicos en la materia, sin ningun esfuerzo inventivo, pueden identificar facilmente estas condiciones de incubacion apropiadas.

Como etapa final, segun el metodo dado a conocer en la presente invencion, la cantidad de complejo se mide y se correlaciona al diagnostico de BC. Tal como apreciaran los tecnicos en la materia, hay numerosos metodos para medir la cantidad de agente de union especifico ASC-complejo, todos ellos descritos en detalle en obras relevantes (ver, por ejemplo, Tijssen P., supra, o Diamandis y otros, eds. (1996) Immunoassay, Academic Press, Boston).

Preferentemente, se det ecta ASC en un formato de ensa yo tipo sand wich. En este ensa yo se utiliza un primer agente de union especifico para captar ASC por un lad o, y por otro lado es utilizado un segundo agente de union especifico, que esta marcado como directamente o indirectamente detectable.

Tal como se ha mencionado anteriormente, se ha descubierto de modo sorprendente que se puede medir ASC a partir de una muestra de liquido obtenida de una muestra de un individuo. No son necesarios los tejidos ni muestras de biopsia para aplicar el marcador ASC en el diagnostico de BC.

En una realizacion preferente, el metodo, segun la presente invencion, es practicado con suero como material de muestra liquido.

En otra realizacion preferente, el metodo, segun la presente invencion, es practicado con plasma como material de muestra liquido.

En otra realizacion preferen te, se practica el met odo, segun la presente invenc ion, con sangre entera como material de muestra liquido.

En otra realizacion preferente, el metodo, segun la presente invencion, es practicado con liquido aspirado de pezones como material de muestra liquido.

Mientras que la aplicacion d e metodos proteonicos de rutina a muestras de tejidos conduce a la iden tificacion de muchos candidatos a marcadores potenciales para el tejido selecciona do, los inventores de la presente invencion han sido capaces de detectar de modo sorprendente ASC en una muestra de fluido corporal. De modo todavia mas sorprendente, han sido capaces de demostrar que la presencia de ASC en esta muestra de liquido obtenida a partir de un individuo se puede correlacionar con el diagnostico de cancer de seno.

Se pueden utilizar anticuerpos para ASC de manera muy ventajosa en procedimientos establecidos, por ejemplo, para detectar celulas de cancer de seno in situ, en biopsias, o en procedimientos inmunoistologicos.

Preferentemente, se utiliza un anticuerpo para ASC en un inmunoensayo cualitativo (ASC presente o ausente), o cuantitativo (determinacion de la cantidad de ASC).

La medicion del nivel de proteina ASC se ha demostrado muyventajosa en el campo de BC. Por lo tanto, en otra realizacion pr eferente, la presente inven cion se refiere a la utilizac ion de la pr oteina ASC como molecula marcadora en el diagnostico de cancer de seno, a partir de una muestra de liquido obtenida de unindividuo, de manera que una cantidad elevada de ASC, en comparacion con controles sanos, es indicativa de cancer de seno.

El termino de molecula marcadora se utiliza para indicar que un nivel incrementado del analito ASC, medido a partir de un fluido corporal de un individuo, marca la presencia de BC.

Es especialmente preferente utilizar el nuevo marcador ASC en el diagnostico anticipado de cancer de seno.

La utilizacion de la propia proteina ASC representa un avance significativo en el exigente campo del diagnostico de BC. Combinando mediciones de ASC con otros marcadores conocidos, por ejemplo, CA15-3, CEA, proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373) o con otros marcadores de BC conocidos en l a actualidad o que todavia se tienen que d escubrir, conducen a mejoras adicionales. Por lo tanto, en una realizaci on adicional preferente, la presente invencion se refiere a la utilizacion de ASC como molecula marcadora para cancer de seno en combinacion con una o mas moleculas marcadoras para cancer de seno en el diagnostico de cancer de seno a partir de una muestra de liquido obtenida de un individuo. A este respecto, la expresion "una o mas" indica de 1 a 10, preferentemente de 1 a 5, de modo mas preferente 3. Otros marcadores de BC seleccionados preferentemente con los que se puede combinar la medicion de ASC son CEA, proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373) y CA 15-3. De modo mas preferente, se utiliza ASC como parte de un panel de marcadores que comprenden, como minimo, ASC y CA 15-3. Por lo tanto, una realizacion adicionalmente preferente de la presente invencion, co nsiste en la uti lizacion de l a proteina AS C como mol ecula marcador a para cancer de se no en combinacion con una o mas moleculas marcadores para cancer de seno en el diagnostico de cancer de seno a partir de una muestra de liquido o btenida de un i ndividuo, de mane ra que la, co mo minimo, o tra molecula marcadora es CA 15-3. Incluso, de m anera mas preferente, se utiliza ASC como parte de un pan el marcador que comprende, como minimo, ASC y proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373). Por lo tanto, una realizacion adicionalmente preferente de la presente invencion consiste en la utilizacion de la proteina ASC como molecula marcadora para cancer de seno en combinacion con una o mas moleculas marcadoras para cancer de seno en el diagnostico de cancer de seno a partir de una muestra liquida obtenida de un individuo, de manera que, como minimo, otra mo lecula marcad ora es prot eina celular II d e union a aci do retinoico (S wiss-PROT: P29373). Incluso, de modo mas preferente, se utiliza ASC como parte de un panel marcador que comprende, como minimo, ASC, proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373) y CA 15-3. Por lo tanto, otra realizacion preferente de la presente invencion es la utilizacion de la proteina ASC como molecula marcadora para cancer de seno en combinac ion con dos o mas molecula s marcadoras para cancer de seno en el d iagnostico de cancer de seno a partir de una muestra de liquido obtenida de un individuo, de manera que las, como minimo, otras dos moleculas marcadoras son proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373) y CA 15

3.

Preferentemente, el metodo de la invencion es utilizado con muestras de pacientes de los que se sospecha que sufren cancer de seno. Un individuo de l que se sospec ha que esta afe ctado de cancer de seno es un individu o para el que otros tipos de canceres han sido excluidos. Otros canceres incluyen, sin que ello sea limitativo, cancer de colon, de pulmon, de estomago, de ovario, yde prostata. Una realizacion preferente de la invencion es, por lo tanto, un metodo para el diagnostico de cancer de seno, que comprende las etapas a) disponer una muestra de liquido obtenida de un individuo del que se sospecha que sufre cancer de seno, b ) poner en contacto dicha muestra con un agente de union especifico para ASC bajo condiciones apropiadas, para la formacion de un complejo entre dicho agente de union y ASC, y c) correlacionar la cantidad de complejo formado en b) con el diagnostico de cancer de seno.

Los reactivos de diagnostico en el campo de los ensayos de union especificos, tales como inmunoensayos, se facilitan usualmente en forma de un kit que comprende el agente de union especifico y los reactivos auxiliares requeridos para llevar a cabo el ensayo. Por lo tanto, la presente invencion se refiere, asimismo, al kit inmunologico que comprende, como minimo, un agente de union especifico para ASC y reactivos auxiliares para la medicion de ASC. Tambien, es pre ferible un kit inmuno logico que comprenda, como minimo, un agente de uni on especifico para ASC, como minimo, un agente de union especifico para CA 15-3 y reactivos auxiliares para la medicion de ASC y CA 15-3. Tambien es preferible un kit inmunologico que comprenda, como minimo, un agente de unio n especifico para ASC, como minimo, un ag ente de union especifico para la proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373) y reactivos auxiliares para la medicion de ASC y proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373). Tambien es preferible un kit inmunologico que comprenda, como minimo, un agente de union especifico para ASC, como minimo, un agente de union especifico para la proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373), como minimo, un agente de union especifico para CA 15-3 y reactivos auxiliares para la medicion de ASC, CA 15-3 y proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373).

La exactitud de una prue ba se describe mejor por sus ca racteristicas operativas del receptor (ROC) (ver, especialmente, Zweig, M. H., y Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577). El grafico ROC es un grafico de todos los par es de sensibil idad/especificidad resultante s de la variac ion continua del umbral de decision con respecto a la totalidad del rango de los datos observados.

El comportamiento clinico de una prueba de laboratorio depende de su exactitud diagnostica o de la facilidad de clasificar correctamente los sujetos en s ubgrupos clini camente relev antes. La e xactitud diagnos tica mide l a capacidad de la prueba de distinguir correctamente do s estados dist intos de los s ujetos investig ados. Estos estados son, por ejemplo, salud y enfermedad, o enfermedad benigna con respecto a enfermedad maligna.

En cada caso, el grafico R OC indica el solape entre las dos distribuciones al representar la sensibilidad con respecto a la especificidad por el rango completo de umbrales de decision. En el eje y se representa la sensibilidad

o la fraccion positiva real [definida como (numero de los resultados de pruebas positivas) (numero de resultados de pruebas reales + numero de pruebas de falso negativo)]. Se ha hecho referencia a ello, asimismo, como positividad en presencia de una enfermedad o estado de salud. Se calcula solamente a partir del subgrupo afectado. En el eje x, se encuentra la fraccion falsa positiva o 1 - especificidad [definida como (numero de resultados falsos-positivos) / (numero de resultados negativos reales + numero de resultados falsos positivos)]. Es un indice de especificidad y se calcula completamente a partir del subgrupo no afectado. Dado qu e las fracciones verdadero positivo y falso positivo se calculan de manera completamente separada utilizando los resultados de prueba de dos subgrupos diferentes, el grafico ROC es independiente de la prevalencia de enfermedad en la muestra. Cada punto del grafico ROC representa un par de sensibilidad/ - especificidad que corresponde a un umbral de decision especifico. Una prueba con discriminacion perfecta (sin solape en las dos distribuciones de resultados) tiene un grafico ROC que pasa a traves de la esquina superior izquierda, en la que la fraccion positivo verdadero es 1,0 o 100% (sensibilidad perfecta) y la fraccion falso positiv o es 0 (perfecta especificidad). El grafico te orico para un a prueba si n discriminacion (distribuciones identicas de resultados para los dos grupo s) es una linea diagon al a 4 5° desde la esquina inferior izquierda a la esquina superior derecha. La mayor parte de graficos se encuentran entre estos dos extremos. (Si el grafico ROC se enc uentra por complet o por de bajo de la d iagonal a 45°, esto se solucion a facilmente invirtiendo el criterio para "positividad" desde "mayor que" a "menor que", o viceversa). Cualitativamente, cuanto mas cerca se encuentre el grafico respecto a la esquina superior izquierda, mayor sera la exactitud global de la prueba.

Una meta con veniente para cuantificar la exactitud de diagnostico de una prueb a de laboratorio consiste en expresar su comportamiento por un solo numero. La medida global mas comun es el area por debajo del grafico ROC. De modo convencional esta area es siempre ; 0,5 (si no lo es, se puede invertir la norma de d ecision para que lo sea). Los valores varian entre 1,0 (separacion perfecta de los val ores de prueba de los dos grupos) y 0,5 (sin diferencia aparente de distribucion entre los dos grupos de valores de prueba). El area no depende solamente de una parte particular de grafico tal como el punto mas proximo a la diagonal o la sensibilidad para el 90% de especificidad, sino del grafico completo. Esto es una expresion cuantitativa, descriptiva, de la proximidad a la que el grafico ROC se encuentra del perfecto (area = 1,0).

La utilidad clinica del nuevo marcador ASC ha sido evaluada en comparacion con el marcador establecido CA 153, y en combinacion con el mismo, utilizando analisis de curva de operador receptor (ROC; Zweig, M. H., y Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577). Es te analisis se ha basado en grupos bien definidos de pacientes, consistiendo en 50 muestras procedentes de pacientes con carcinoma invasivo ductal o lobular en T1-3; N0; M0, tumor mas avanzado, es decir, T4 y/o varias gravedades de metastasis (N+ y/o M+), carcinoma medular, papilar, mucinoso y tubular, carcinoma ductal in situ, y controles sanos, respectivamente.

Los siguientes ejemplos, referencias, listas de secuencias, y cifras, se facilitan para ayudar a la comprension de la presente invencion, cuyo ambito real es definido en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción de las figuras

Figura 1 La figura muestra un ejemplo tipico de un gel 2D, al que se ha cargado una muestra de tumor (lado

izquierdo), yun gel, al que se ha cargado una muestra de control correspondiente (lado derecho). El

circulo de la seccion a mayor escala de estos geles indica la posicion para la proteina ASC. Utilizando el

mismo metodo, esta proteina no ha sido detectada en tejidos sanos . El ASC emigra en e l gel 2D correspondiente a un punto isoelectrico de aproxim adamente pH 6 y un peso molecular aparent e aproximado de 22 kDa.

Figura 2 La figura muestra curvas ROC para CA 1 5-3: cancer de seno con respecto a controles sanos (linea trazada; ROC: 57%) y cancer de seno con respecto a controles sanos y controles con enfermedad (linea seguida ; ROC: 57%). El eje x ind ica el valor calculado, sustra yendo de 1 el valor de l a especificidad. El eje y indica sensibilidad. En ambos casos, el valor de 1 corresponde al 100%. Cancer de seno: 174 muestras. Controles sanos: 234 muestras. Controles con enfermedad: 86 muestras.

Figura 3 La figura mue stra curvas R OC para CEA: Canc er de seno con resp ecto a controles sanos (linea trazada; ROC: 69%) y cancer de seno con respecto a controles sanos y controles con enfermedad (linea continua; ROC: 67%). El eje x indica el valor calculado restando de 1 el valor de especificidad. El eje y indica sensibilidad. En ambos casos, el valor de 1 corresponde al 100%. Cancer de seno: 174 muestras. Controles sanos: 234 muestras. Controles con enfermedad: 86 muestras.

Figura 4 La figura mue stra curvas R OC para ASC: Canc er de seno con resp ecto a controles sanos (linea trazada; ROC: 80%) y cancer de seno con respecto a controles sanos y controles con enfermedad (linea continua; ROC: 72%). El eje x indica el valor calculado restando de 1 el valor de especificidad. El eje y indica sensibilidad. En ambos casos, el valor de 1 corresponde al 100%. Cancer de seno: 174 muestras. Controles sanos: 234 muestras. Controles con enfermedad: 86 muestras.

Abreviaturas

ABTS 2,2�-Azino-di- [3-etillbenztiazolin sulfonato (6)] sal de diamionio.

BSA suero albumina bovina

cDNA ADN complementario

CHAPS 3-[(3-Cholamidopropil)-dimetilammonio]- 1-propano-sulfonato)

DMSO dimetil sulfoxido

DTT ditiotreitol

EDTA etileno diamina de acido tetraacetico

ELISA ensayo inmunoabsorbente enlazado con enzima

HRP h peroxidasa de rabano

IAA iodoacetamida

IgG immunoglobulina G

IEF enfoque isoelectrico

IPG gradiente pH inmovilizado

LDS dodecil sulfato de litio

MALDI-TOF tiempo de desaobsorcion para la ionizacion por laser con asistencia matricial de espectrometia de masas

MES mesitil, 2,4,6-trimetilfenilo

OD densidad optica

PAGE electroforesis de gel de poliacrilamida

PBS solucion salida tamponada con fosfato

PI punto isoelectrico

RTS sistema de traduccion rapida

SDS dodecil sulfato sodico

UICC Union Internacional Contra el Cancer

Ejemplo 1

Identificación de ASC como potente marcador de cáncer de seno

Fuentes de tejidos

Con el objetivo de identificar proteinas especificas de tumor como m arcadores potenciales de diagnostico para cancer de seno, se llevo a cabo el analisis de dos tipos distintos de tejidos, utilizando metodos proteomicos.

En total, se analizaron muestras de tejidos de 14 pacientes afectados de cancer de seno. De cada paciente, se recogieron dos tipos diferentes de tejidos, a partir de resecciones terapeuticas: tejido tumoral (� 80% tumor) (T), y tejidos sanos adyacentes (N). El ultimo tipo de tejid os sirve como muestra de control sano correspondiente. Los tejidos son congelados inmediatamente despues de la reseccion, y almacenados a -80°C antes del proceso. Los tumores son diagnosticados por criterios histopatologicos.

Preparación de tejidos

Se colocan 0,8-1,2g de tejidos congelados en un mortero y son completamente congelados por nitrogeno liquido. El tejido es pulverizado en el mortero, disuelto en un volumen 10 veces (peso/volumen) de tampon de lisis (40 mM Na-citrato, 5 mM MgCl 2, 1% Genapol X-080, 0,02% Na-azida, libre de Complete® EDTA [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Cat. No. 1873 580]) yhomogeneizado posteriormente en un homogeneizador de cristal Wheaton® (20 x acoplamiento libre, 20 x acoplamiento ajustado). 3 ml del homogeneizado son sometidos a centrifugacion de la densidad de sacarosa (10-60% sacarosa) durante 1 hora a 4.500 g. Despues de esta etapa de centrifugacion, se obtienen tres fracciones. La fraccion superior del gradiente contiene las proteinas solubles y es utilizada para otros analisis.

Inmovilización de albúmina antihumana de anticuerpo monoclonal sobre sefarosa 4B activada por CNBr

Sefarosa 4B activada por CNBr, liofilizada (Amersham Biosciences, 17-0430-01) es humedecida nuevamente y lavada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo monoclonal dirigido contra albumina humana es disuelto en 0,1 M NaHCO3, pH 8,3, 0,5 M NaCl, 10 mg/ml. 1 ml de solucion de anticuerpo es mezclada con 1 ml de sefarosa 4B activada por CNBr rehumedecida. El tiem po de reaccion es de 1 hora. El bloqueo del resto de grupos activos y el lavado del gel es llevado a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Agotamiento de suero albúmina

Se equilibran 7 ml de gel anti-albumina en un tampon de lisis sin Genapol-X-080. 7 ml de la fraccion superior de la centrifugacion de densidad de sacarosa (ver anterior, la preparacion de tejidos) se aplican a la columnay se lavan con un tampon de lisis sin Genapol-X-080. El efluente combinado es utilizado para los experimentos de enfoque isoelectrico.

Enfoque isoeléctrico (IEF) y SDS-PAGE

Para IEF, 3 ml de la preparacion de tejido agotada de HSA, se mezclan con 12 ml de un tampon de muestra (7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 0,4% IPG tampon pH 4-7, 0,5% DTT) y se incuba durante 1 hora. Las muestras son concentradas en un dispositivo Amicon® Ultra-15 (Millipore GmbH, Schwalbach, Alemania) y la concentracion de la proteina es determinad a utilizando el ensayo de proteina BioRad® Cat. No. 500-0006; Bio-Rad Laboratories GmbH, Munchen, Alemani a) siguien do las instrucci ones de l ma nual d el su ministrador. A un vol umen correspondiente a 1,5 mg de un tampon de muestra de proteina se arade hasta un volumen final d e 350 !l. Esta solucion es utilizada para rehidratar tiras IPG pH 4-7 (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania) durante una noche. El IEF es llevado a cabo utilizando el siguiente protocolo de gradiente: (1.) 1 minuto a 500 V; (2.) 2 horas a 3500 V; (3.) 22 horas a 3500 V constante, dando lugar a 82 kVh. Despues de IEF, las tiras son almacenadas a 80aC o utilizadas directamente para SDS-PAGE.

Antes de SDS-PAGE, las tiras son incubadas en un tam pon de equilibrado (6 M urea, 50 mM Tris/HCl, pH 8,8, 30% glicerol, 2% SDS), se araden, para su reduccion, DTT (15 min, + 50 mg DTT/10 ml), y para alquilacion IAA (15 min, + 235 mg iodacetamida/10 ml). Las tiras son colocadas sobre geles de poliacridamida al 12,5% y sometidas a electroforesis a 1 W/gel y, posteriormente, 1 hora a 17 W/gel. A continuacion, los geles son fijados (50% metanol, 10% acetato) y sometidos a tincion durante una noche con Novex™ Colloidal Blue Staining Kit (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, Cat No. LC6025, 45-7101).

Detección de ASC como marcador potencial para cáncer de seno

Cada uno de los pacientes es analizado separadamente por analisis e imagen con un software ProteomeWeaver® (Definiens AG, Alemania, Munich). Ademas, todos los puntos del gel son extraidos mediante un robot de recogida, ylas proteinas presentes e n dichos puntos son identific adas mediante espectrometria de masas MALDI-T OF (Ultraflex™ Tof/Tof, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Para cada paciente, se compararon 4 geles de la muestra del tumor con 4 geles procedentes, cada uno de ellos, de un tejido adyacente, y se analizaron en cuanto a puntos distintivos correspondientes a proteinas expresadas diferencialmente. Por estos medios, la proteina ASC se ha enc ontrado que es e xpresada especificamente o s obreexpresada fuerte mente en tejid os de tumor y n o detectable en tejidos de co ntrol sanos. Por lo tanto, entre muchas otras proteinas, se califica co mo marcador candidato para su utilizacion en el diagnostico de cancer de seno.

Ejemplo 2

Generación de anticuerpos para la proteína marcadora de cáncer ASC

Se genera un anticuerpo policlonal para la proteina marcadora de cancer de pecho ASC para el uso adicional del anticuerpo en la medicion de suero y plasma y niveles de sangre de ASC por ensayos de inmunodeteccion, por ejemplo, Western Blotting y ELISA.

Expresión y purificación recombinante de la proteína

Para generar anticuerpos para ASC, se lleva a cabo u na expresion recombinante de la proteina para obtener inmunogenos. La expresion se lleva a cabo aplicando una combinacion del sistema de expresion RTS 100 y E. coli. En una primera etapa, se analiza la s ecuencia de ADN y se o btienen recom endaciones p ara variantes mutacionales silentes de c ADN de alto rendimiento y sus correspondientes secu encias de ce bador de PCR utilizando el sistema "ProteoExp ert RTS E.coli HY" . Este es un servicio co mercial basad o en la web (www.proteoexpert.com). Utilizando los pares de cebadores recomendados. Se utiliza el sistema "RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His-tag" (Roche Dia gnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Cat. No. 31862 37) para generar plantillas lineales de PCR a partir de cADN para la transcripcion in vitro y expresion de la secuencia de nucleotido que codifica para la proteina ASC. Para la deteccion por transferencia W estern y purificacion posterior, la proteina expresada contiene una etiqueta His. Se identifica la variante de mejor expresion. Todas las etapas, desde PCR a expresion y deteccion son llevadas a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El respectivo producto PCR que contiene todas las regiones reguladoras T7 necesarias (promotor, sitio de union ribosomal y terminador T7) es clonado en el vector pBAD TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, Cat. No. K 4300/01) siguiendo las instrucciones del fabr icante. Para la expresion utilizando las secuencias reguladoras T7, el constructo es transformado en E. coli BL 21 (DE 3) (Studier, F.W., y otros, Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89)y las bacterias transformadas son cultivadas en lote de 1 litro para la expresion de la proteina.

La purificacion de la pr oteina de fusion His-ASC se lleva a cabo si guiendo unos procedimientos estandar en una columna de Ni-quelato. De forma breve, un 1l de cultivo de bacterias conteniendo el vector de expresion para la proteina de fusion His-ASC es compactado por centrifugacion. La pastilla de celulas es resuspendida en un tampon de lisis, obteniendo fosfato. pH 8,0, cloruro de guanidinio 7 M, imidazol y tioglicerol, seguido de la homogeneizacion utilizando un Ult ra-Turrax®. E l m aterial ins oluble es a glomerado po r c entrifugacion a alt a v elocidad, y e l sobrenadante es aplicado a una column a cromatografica de Ni-quelato. La columna es lavada con varios volumenes de lecho de tampon de lisis seguido de lavad os con tampon de fosfato, pH 8,0 y urea. Finalmente, el antigeno unido es eluido utilizando un tampon de fosfato conteniendo SDS en condiciones acidas.

Síntesis de conjugados hemocianina-péptido para la generación de anticuerpos

La sintesis es llevada a cabo utilizando quimica heterobifuncional (quimica maleimida/SH). Cisteinas seleccionadas conteniendo peptidos de ASC son acopladas a hemociani na activada por 3-maleimidohe xanoil-Nhidroxisuccinimidester (MHS) procedente de Concholepas concholepas (Sigma, B-8556).

La hemocianina es llevada a 10 mg/ml e n 100 mM NaH 2PO4/NaOH, pH 7,2. Por cada ml de hemocianina s e araden 100 !l MHS (12,3 mg en DMSO) y se incuba durante 1 hora. La muestra es dializada durante una noche contra 100 mM NaH2PO4/NaOH, pH 6,5 y se aj usta a 6 mg/ml con tampon de dialisis. Se disolvio una cisteina seleccionada conteniendo peptido de ASC en DMSO (5 mg/ml para un peptido de 15 00 Dalton). Por cada ml de hemocianina activada por MHS (6 mg/ml), se ara den 20 !l de 100 mM EDTA, pH 7,0 y 100 !l de l a cisteina seleccionada conteniendo un peptido de ASC. Despues de 1 hora, los grupos maleimida restantes son bloqueados por adicion de 10 !l 0,5 M cisteina/HCl por cada ml de mezcla de reac cion. Esta preparacion es utili zada para la inmunizacion sin purificacion adicional.

Expresión recombinante y purificación de proteína de fusión

Para generar anticuerpos para ASC se lleva a cabo una expresion recombinante de una proteina de fusion SlyD-ASC para obtener inmunogenos. Por lo tanto, se construye un vector de expr esion que contiene un gen que codifica Sly D-(GGGS)5-GGG-IEGR-ASC-GGGS-HHHHHH. Para la purificaci on y deteccion por transferenci a Western, el constructo contiene un carboxi terminal His-Tag (HHHHHH). Un enla zador adicional GS ((GGGS)5-GGG) y un sitio de fraccion amiento para el facto r Xa (IEGR) es inse rtado entre Sl yD y ASC. La expresion es llevada a cabo en E. coli bajo control del promotor T5.

En una primera etapa, se re aliza PCR utilizando el vector pSO60 (pET24 que lleva un cassette de expresion que codifica SlyD-(GGGS)5-GGG-SlyD) como plantilla. Mediante la utilizacion del cebador 1 (SEQ ID N O: 2) y del cebador 2 (SEQ ID NO: 3), se obtiene monoSlyD llevando un sitio EcoRI y un sitio de union ribosomal en el terminal 5� yun sitio BamHI, la secuencia que codifica IEGR yun sitio Sacl en el extremo 2�, respectivamente. El producto PCR generado es clonado como fragmento EcoRI/SacI en pQE80L (Qiagen, Hilden) pr oporcionando pQE80-SlyD.

En segundo lugar, se amplifica ASC a partir de pBC14 (p ET24 que lleva ASC) como plantilla. Por utilizacion del cebador 3 (SEQ ID N O: 4) y del cebador 4 (SEQ ID NO: 5), se insertan un lugar BamHI y una secuencia que codifica IEGR en el extremo 5�, asi como la secuencia de codificacion GGGS-HHHHHH y un sitio HindIII en el extremo 3�.

El producto PCR es clonado como fragm ento BamHI/HindIII en pQE80-SlyD resultando, en el constructo final de expresion, (pQE80-SlyD-ASC). Todas las etapas PCR y de clon ado son llevadas a cabo de ac uerdo con las instrucciones del fabricante.

Para una expresion bajo control del promotor T5, se transforman celulas E. coli C600 (Stratagene, Heidelberg) con el constructo final. Las cepas de expresion son cultivadas en un lote de 1l para la produccion de proteina.

La purificacion de la proteina de fusion His-SlyD-ASC es llevada a cabo siguiendo procesos estandar en una columna de Ni-quelato. De modo breve, un 1 litro de cultivo de bacterias conteniendo el vector de expresion para la proteina de fusion SlyD-ASC-His es aglomerado por centrifugacion. La pastilla de celulas es resuspendida en un tampon de lisis, que contiene Tris/HCl, pH 8, CHAPS, EDTA y lisozima, seguido de la homogeneizacion utilizando un Ultra-Turrax®. Se degrada enzimaticamente AND por la adicion d e cloruro de magnesio y DNasa. Los cuerpos de inclusion son aglomerados por centrifugacion. La pastilla es disuelta en un tampon de fosfato, pH 8,0, cloruro de guanidinio 7 M y cargada en una columna de Ni-quelato. La columna es lavada con varios volumenes de lecho d e tampon de fosfato pH 8,0, cloruro de gu anidinio 7 M. A continuacion, el tampon de fosfato, pH 8,0, cloruro de guanidinio 7 M es sustituido por un tampon de fosfato, pH 8,0, NaCl, para inducir el replegado de la proteina unida a la matriz. La proteina de fusion replegada es eluida mediante un tampon de fosfato, pH 8,0, NaCl, imidazol.

Producción de anticuerpos monoclonales contra ASC

a) Inmunización de ratones

Ratones A/J de doce semanas de edad son inmunizados inicialmente por via intraperitoneal con 100 !g de ASC, proteina de fusion o conjug ado hemocia nina-peptido (v er anterior). Esta operacion es seguida despues de 6 semanas, por otras dos inmunizaciones intraperitoneales a intervalos mensuales. En este proceso, cada raton recibe 100 !g de ASC o conjugado de hemocianina-peptido adsorbido en hidroxido de aluminio y 109 germenes de Bordetella pertussis. A continuacion, las dos ultimas inmu nizaciones son llevadas a cabo por via intravenosa en el tercer y segundo dias antes de la fusion, utilizando 100 !g de ASC o conjuga do de h emocianina-peptido en u n tampon de PBS para cada uno.

b) Fusión y clonado

Las celulas del bazo de los ratones inmunizados, de acuerdo con a), son fusionadas con celulas de mieloma, de acuerdo con Galfre, G., y Milstein, C., Methods in Enzymology 73 (1981) 3-46. En este proceso, aproximadamente 1 x 108 celulas del bazo del raton inmunizado son mezcladas con 2 x 107 de mieloma (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL1580) ycentrifugadas (10 minutos a 300 x g y 4aC). Las celulas son seguidamente lavadas una vez con el medio RPMI 1640 sin suero fetal de vaca (FCS) y centrifugadas nuevamente a 400 x g en un tubo conico de 50 ml. El sobre nadante es eliminado, el sedi mento de celulas es liberado sua vemente por percusion, se a rade 1 ml de PEG (peso molecular 4000, Merck, Darmstadt) y se mezcla por pipeteado. Despues de 1 minuto en un baro de agua a 37aC, se araden gota a gota, a te mperatura ambiente, durante un periodo de 4-5 minutos, 5 ml de RPMI 1640 sin F CS. Despues de ello, se arade n gota a gota, al cabo de 1 minuto aproxi madamente, mezclados d e manera completa, 5 ml de RPMI 1640 conteniendo un 10% de FCS, llenando hasta 50 ml con el medio (RPMI 1640

+ 10% FCS) y centrifugando, a continuacion, durante 10 minutos, a 400 x g y 4aC. Las celulas sedimentadas son recogidas en el medio RPMI 1640 conteniendo un 10% de FCS y sembradas en un medio de seleccion de hipoxantina-azaserina (10 0 mmol/l hipo xantina, 1 !g/ml azaserina en RPMI 1640 + 10% F CS). Se ara de Interleukina 6 a 100 U/ml al medio como factor de crecimiento.

Despues de u nos 10 dias, los cultivos primarios son comprobados pa ra el anticuerpo especifico. Los cultivos primarios positivos de ASC son clonados en placas de cultivo de celulas de 96 pocillos por medio de un clasificador de celulas activadas por fluorescencia. En este proceso, se arade nuevamente Interleukina 6 a 100 U/ml al medio como aditivo de crecimiento.

c) Aislamiento de inmunoglobulina a partir de los sobrenadantes del cultivo de células

Las celulas de hibridoma obtenidas son sembradas a una densidad de 1 x 105 por ml en el medio RPMI 1640, conteniendo 10% de F CS y con proliferacion durante 7 dias en un ferment ador (Thermodux Co., Wertheim/Main, Mo del MCS-104XL, Order No. 144-050). Como promedio, se obtienen concentraciones de 100 !g de anticuerpo monoclonal por ml en el sobrenadante del cultivo. La purificacion de este anticuerpo a partir del sobrenadante del cultivo es llevada a cabo por metodos convencionales de la quimica de proteinas (por ejemplo, de acuerdo con Bruck, C., y otros, Methods in Enzymology 121 (1986) 587-695).

Generación de anticuerpos policlonales

a) Inmunización

Para la inmunizacion, se prepara una emulsion nueva de la solucion de proteina (100 !g/ml ASC, proteina de fusion o conjugado de hemocianina-peptido) y coadyuvante completo de Freund�s con una proporcion 1:1. Cada uno de los conejos es inmunizado con 1 ml de la emulsion en los dias 1, 7, 14 y 30, 60 y 90. Se extrae la sangre, y el suero anti-ASC resultante es usado para otros experimentos, tal como se describe en los ejemplos 3 y 4.

b) purificación de IgG (inmunoglobulina G) de suero de conejo por precipitación secuencial con ácido caprílico y sulfato amónico

Se diluye un volumen de suero de conejo con 4 volumenes de tampon de acetato (60 mM, pH 4,). El pH es ajustado a 4,5 con Tris-base 2 M. Se arade acido caprilico (25 !l/ml de muestra diluida) gota a gota con agitacion vigorosa. Despues de 30 minutos, la muestra es centrifugada (13.000 x g, 30 min, 4aC), el sedimento es eliminado y el sobrenadante es recogido. El pH del sobrenadante es ajustado a 7,5 por aradidura de Tris-base 2 M yes filtrado (0,2 !m).

La inmunoglobulina del sobrenadante es precipitada por la agitacion vigorosa por la adicion gota a gota de una solucion de sulfato amonico 4 M, hasta una concentracion final de 2 M. Las inmunoglobulinas precipitadas son recogidas por centrifugacion (8.000 x g, 15 min, 4aC).

El sobrenadante es eliminado. El sedimento es disuelto en 10 mM NaH2PO4/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl y dializado de manera exhaustiva. El dializado es centrifugado (13.000 x g, 15 min, 4aC) y filtrado (0,2 !m).

Biotinilación de IgG policlonal de conejo

IgG policlonal de conejo es ll evada a 10 mg/ml en 10 mM NaH 2PO4/NaOH pH 7,5, 3 0 mM NaCl. Se araden, por cada ml de solucion de IgG, 50 !l de Biotina-N-hidroxisuccinimida (3,6 mg/ml en DMSO). Despues de 30 minutos a temperatura ambiente, la muestra es cromatografiada sobre Superdex 200 (10 mM NaH2PO4/NaOH pH 7,5, 30 mM NaCl). La fraccion que contiene IgG biotinilado es recogida. Los anticuerpos monoclonales son biotinilados, de acuerdo con el mismo procedimiento.

Digoxigenilación de IgG policlonal de conejo

IgG policlonalde conejo es llevada a 10 mg/ml en 10 mM NaH2PO4 /NaOH, 30 mM NaCl, pH 7,5. Por cada ml de solucion d e Ig G se araden 50 !l de di goxigenin-3-O-metilcarbonil-s-acido amin ocaproico-N-hidroxisuccinimida ester (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania, Cat. No. 1 333 054) (3,8 mg/ml en DMSO). Despues d e 30 minutos a temperatura am biente, la muestra es cromatografiada sobre Superdex® 200 (10 mM N aH2PO4/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl). L as fracciones que contien en IgG dig oxigenilada so n recogidas. L os anticuerpo s monoclonales son marcados con digoxigenina, de acuerdo con el mismo procedimiento.

Ejemplo 3

Transferencia Western para la detección de ASC en muestras de suero y plasma humanos

Se llevan a cabo SDS-PAGE y Western Blotting utilizando reactivos y equipos de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania. Las muestras de plasma humano son diluidas 1:20 en tampon de mue stra LDS reductor NuPAGE® (Invitrogen) y se calienta durante 5 minutos a 95aC. Se hacen pasar partes alicuotas de 10 !l sobre geles 4-12% NuPAGE® (Bis-Tris) en el sistema de tampon MES. La mezcla de protei na separada del gel es transferida sobre membranas de nitrocelulosa utilizando el modulo de trans ferencia Invitrogen XCell II™ (Invitrogen) y el sistema de tampon de transferencia NuPAGE®. Las membranas son lavadas 3 veces en PBS/0,05% Tween-20 y bloqueadas con un tampon de bloqueo SuperBlock (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA). El anticuerpo primari o biotinilado es diluido en un tampon de bloqueo SuperBlock (0,01-0,2 !g/ml) e incubado con la membrana durante 1 hora. Las membranas son lavad as 3 veces en PBS/0,05% Tween-20. El anticuerpo primario biotinilado, especificamente unido, es marcado con un conjuga do de estreptavidina-HRP (20 mUAB TS /ml en un tampon de bloque o SuperBlock). Despues de la incubacion durante 1 hora, las membranas son lavadas 3 veces en PBS/0,05% Tween

20. El conjugado unido de estreptavidina-HRP es detectado utilizando un sustrato quimioluminiscente (SuperSignal West Femto Substrate, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA) y una pelicula autorradiografica. Los tiempos de exposicion varian de 10 minutos a una noche.

Ejemplo 4

Ensayo ELISA para la medición de ASC en muestras de suero y plasma humanos

Para la deteccion de ASC en suero o plasma humano, se desarrollo un sandwich ELISA utilizando placas de microtitulacion de 96 pocillos con recubrimiento de estreptavidina.

Una parte alicuota de 20 !l de una muestra de suero o plasma humano,o una dilucion seriada de la proteina de fusion recombinante SlyD-ASC-His- como antigeno estandar, fueron incubadas con 100 !l de anticuerpo biotinilado policlonal anti-ASC (1!g/ml) y con un anticuerpo digoxigenilado policlonal anti-ASC (1 !g/ml) en 10 mM de fosfato, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl y0,1% Tween-20. Despues de la incubacion durante 90 minutos a 30°C, las placas fueron lavadas 3 veces con 0,9% NaCl, 0,1% Tween-20. Para la deteccion de complej os antigeno-anticuerpo, 150 !l de un conjugado monoclonal anti-digoxigenina peroxidasa en 10 mM de fosfato, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl y 0,1% Tween-20 fueron aradidos e incubados durante 30 minutos a 30°C. El ex ceso de conjugado fue eliminado por el lavad o de las placas, 3 veces, con 0,9% NaCl, 0,1% T ween-20. La cantida d de conju gado unid o fue detectada por incubacion, con una solucion de 200 !l TMB (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Alemania, No. de catalogo. 12034425) durante 15 minutos. La reaccion e nzimatica fue interrumpida por la adicion de 50 !l 1 M H2SO4. El desarrollo de co lor fue cuantificado a 450 nm utilizando un lector ELISA. La concentracion de ASC en una muestra de suero o plasma se calculo a partir de la curva estandar utilizando una dilucion serial de proteina de fusion recombinante SlyD-ASC-His.

Ejemplo 5

Evaluación de marcador, sensibilidad y especificidad.

Análisis ROC para evaluar la utilidad clínica en términos de exactitud del diagnóstico.

La exactitud es evaluada al analizar muestras liquidas de individuos, obtenidas a partir de grupos de pacientes bien caracterizados. El colectivo de control (ver Tabla 1) contiene 234 hembras consistentes en 172 donantes de sangre y 62 pacientes que habian pasado poruna mamografia. Estos 62 pacientes fueron hallados negativos en la mamografia, y no se detectaron sintomas de otras enfermedades de senos.

Los 174 pacientes de cancer de seno fueron reunidos de pacientes afectados por carcinomas ductal, lobular, tubular, medular, y mucinoso de diferentes etapas. Debido al objetivo de diagnosticar un cancer de seno en etapas precoces, la proporcion de UICC I and UICC II era de 80%. Para analizar la especificidad con respecto a otras enfermedades no mal ignas de se no, se inclu yeron 7 7 enfermedades distintas d e senos, no malignas, y 9 enfermedades ginecologicas no malignas. El grupo se resume en la tabla 1.

Se midieron CA 15-3 y CEA mediante ensayos disponibles comercialmente (ensayo Roche Diagnostics, CA 15-3: Cat. No. 0 304 5838 yensayo CEA: Cat. No. 1731629) para el analizador de inmunoensayos Elecsys® Systems y se midio ASC, tal como se ha descrito en lo anterior, en una parte alicuota de suero obtenida de cada uno de estos individuos.

Tabla 1: Conjunto de Pacientes

El corte se define con respecto al percentil de 95% del grupo de control sano, igualando el 95% de especificidad. De 5 este modo, en la presente serie de experimentos el valor de corte para ASC es ajustado a 0,60 ng/ml.

Atendiendo al grupo de control de enfermedad, la especificidad de la mamografia es muybaja (18,2%). La ventaja de un marcador de cancer de seno es la mayor especificidad en comparacion con la mamografia. Utilizando el corte de 0,6 ng/ml, la especificidad de ASC en el grupo de control de enfermedad, fue determinada en 68,6%, que es

10 inferior que p ara CA 15-3 o CEA. Debi do al ma yor ni vel de ASC e n el grup o de control de e nfermedad, en comparacion con los controles sanos, existe la necesidad de incluir controles de enfermedad en la determinacion de la concentracion de corte. Sin embargo, utilizando este valor de cort e en las mu estras de cancer de seno, se consiguio una sensibilidad de 30,5%, que es superior a la de los, bien conocidos, marcadores CA 15-3 y CEA. Hay tambien una buena tasa de deteccion en las etapas precoces (ver Tabla 2).

15 Los datos que resumen la sensibilidad y especificidad de ASC en comparacion con los marcadores CEA y CA 15-3 se indican en las Tablas 2 y 3.

Tabla 2: Sensibilidad

Para observar la potencia de diferenciacion de un nuevo marcador, sin consideracion de un valor de corte, se llevo a cabo un analisis ROC, de acuerdo con Zweig, M. H., y Campbell, a ntes indicados. La potencia discriminatoria para la diferenciacion de pacientes en el grupo de cancer de seno con respecto al grupo de control "sano" medido

10 por el area situada por deb ajo de la cu rva, fue de 80% para ASC y superior en comparacion con lo s marcadores establecidos CA 15-3 (57%) y CEA (69%), respectivamente. Si los controles con enfermedad se incl uyeron en el grupo de "control", el area situada debajo de la curva bajo a 72%, pero siempre fue superior que la de CA 15-3 y CEA.

15 Tabla 4: Valores ROC

Dado que la sensibilidad yespecificidad de un marcador se puede cambiar facilmente desplazand o el valor de corte, la mejor herramienta para analizar la potencia de diferenciacion de un nuevo marcador es el analisis ROC.

20 Utilizando esta herramienta, ASC tiene lamayor potencia de discriminacion entre pacientes con cancer de seno y muestras de control, incluyendo otras enfermedades de seno en comparacion con los, bien conocidos, marcadores CA 15-3 y CEA. Ademas, la ASC es ca paz de detectar mas tumores en etapas precoces. Utilizando todas las muestras de control, incluyendo controles con enfermedad, la potencia de discriminacion de ASC (72%) es superior a la de CA 15-3 (57%) y CEA (67%). Los datos indican que ASC puede ser de gran interes en el d iagnostico de

25 cancer de seno o en el seguimiento de pacientes despues de cirugia.

En algunas de las muestras de pacientes de BC, tanto los niveles deASC como los de CA 15-3 son elevados. Ademas, uno de ASC o CA 15-3 es positivo en muestras individuales obtenidas a partir de diferentes pacientes con cancer de seno. Esto conduce a una ma yor sensibilidadsi ambos marcadores son medidos en una muestra de

30 paciente. Si una muestra de paciente es clasificada como positiva en caso de que uno de los marcadores ASC o CA 15-3 es positivo, entonces se puede conseguir una elevada sensibilidad.

Datos preliminares indican que ASC puede ser tambien muy interesante en el seguimiento de pacientes despues de cirugia.

Lista de referencias

Bruck, C., y Chen, G., y otros, Methods Enzymol. 121 (1986) 587-695 Carney, P.A., y otros, Ann. Intern. Med. 138 (2003) 168-175 Chen, G., y otros, Molecular and Cellular Proteomics 1.4 (2002) 304-313 Conway, K.E., y otros, Cancer Research 60 (2000) 6236-6242 Diamandis y otros, eds. (1996) Immunoassay, Academic Press, Boston Duffy, M.J., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262 Essermann, L., y otros, J. Natl. Cancer Inst. 94 (2002) 369-375 Galfre, G., and Milstein, C., Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46 Kuerer, H.M., y otros, Cancer 95 (2002) 2276-2282 Levine, J.J., y otros, Oncogene 22 (2003) 3475-3488 Masumoto, J, y otros,J. Biol. Chem. 274 (1999) 33835-33838 Masumoto, J., y otros, Journal of Histochemistry and Cytochemistry 49 (2001) 1269-1275 McConnell, B.B., y Vertino, P.M., Cancer Research 60 (2000) 6243-6247 Moriani, R., y otros, Anticancer Research 22 (2002) 4163-4168 National Cancer Institute, Cancer Facts, Fact Sheet 5.18 (1998) 1-5 Shiohara, M., y otros, Blood 98 (2001) 229a Singletary, S.E., y otros, Journal of Clinical Oncology 20 (2002) 3628-3636 Studier, F.W., y otros, Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89 Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11 (1990) libro completo, especialmente paginas 43-78; Elsevier, Amsterdam UICC (International U nion A gainst Canc er), Sobin, L.H., W ittekind, Ch . eds), T NM Classification of Malignant Tumours, fifth edition, 1997 Untch, M., y otros, J. Lab. Med. 25 (2001) 343-352 Virmani, A., y otros, Int. J. Cancer 106 (2003) 198-204 WHO, Screening for Breast Cancer, May 10, 2002 WO 00/60076 WO 02/23200 Wulfkuhle, J.D., y otros, Cancer Research 62 (2002) 6740-6749 Zweig, M. H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577

LISTADO DE SECUENCIAS

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Metodo para el diagnostico in vitro de cancer de seno, que comprende las siguientes etapas:

   a) preparar una muestra liquida obtenida de un individuo,

   b) establecer contacto de dicha muestra con un agente de union especifico para la proteina tipo mancha ("speck-like"), que co ntiene un d ominio de r eclutamiento as ociado a cas pasa (A SC), ba jo c ondiciones apropiadas para la formacion de un complejo entre dicho agente de union y ASC, y

   c) correlacionar la cantidad de complejo formado en (b) con el diagnostico de cancer de seno, de manera que un nivel elevado de ASC en comparacion con controles sanos es indicativo de cancer de seno.

2. 2.

   Metodo, segun la reivindicacion 1, caracterizado, ademas, porque dicha muestra es suero.

3. 3.

   Metodo, segun la reivindicacion 1, caracterizado, ademas, porque dicha muestra es plasma.

4. 4.

   Metodo, segun la reivindicacion 1, caracterizado, ademas, porque dicha muestra es sangre entera.

5. 5.

   Metodo, segun la reivindicacion 1, caracterizado, ademas, porque dicha muestra es liquido aspirado de pezones.

6. 6.

   Utilizacion in vitro de la proteina ASC en el diagnostico de cancer de seno a partir de una muestra de liquido obtenida de un individuo, en el que un nivel elevado de ASC, en comparacion con controles sanos, es indicativo de cancer de seno.

7. 7.

   Utilizacion in vitro de la proteina ASC en el diagnostico precoz de cancer de seno a partir de una muestra de liquido obtenida de un individuo, en el que un nivel elevado de ASC, en c omparacion con controles sanos, es indicativo de cancer de seno.

8. 8.

   Utilizacion in vitro de la proteina ASC en combinacion con una o mas moleculas marcadoras de cancer de seno en el diagnostico de cancer de seno, a partir de una muestra liquida obtenida de un in dividuo, en el que un nivel elevado de ASC, en comparacion con controles sanos, es indicativo de cancer de seno.

9. 9.

   Utilizacion, segun la reivindicacion 8, en la que, como minimo, otra molecula marcadora es CA 15-3.

10. 10.

    Utilizacion, segun la reivindicacion 8, en la que, como minimo, otra molecula marcadora es proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373).

11. 11.

    Utilizacion, segun la reivindicacion 8, en la que, como minimo, dos moleculas marcadoras son proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373) y CA 15-3.

12. 12.

    Kit inmunologico que comprende, como minimo, un agente de union especifico para ASC, como minimo, u n agente de union especifico para CA 15-3, y reactivos auxiliares para la medicion de ASC y CA 15-3.

13. 13.

    Kit inmunologico que comprende, como minimo, un agente de union especifico para ASC, como minimo, u n agente de union especifico para la proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373) y reactivos auxiliares para la medicion de ASC y proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373).

14. 14.

    Kit inmunologico que comprende, como minimo, un agente de union especifico para ASC, como minimo, u n agente de union especifico para la pr oteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373), como minimo, un agente de union especifico para CA 15-3, y reactivos auxiliares para la medicion de ASC, CA 15-3 y proteina celular II de union a acido retinoico (Swiss-PROT: P29373).