KR102512411B1 - 항체 파지 디스플레이 라이브러리 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 나이브 항체 파지 디스플레이 라이브러리 (APDL), 이의 제조방법 및 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 가용성 Fab로서 제조 가능한 항체를 수득하는 방법을 개시한다.

Description

항체 파지 디스플레이 라이브러리
본 발명은 생명공학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대형 항체 파지 디스플레이 라이브러리, 라이브러리에 도달하는 방법 및 상기 라이브러리를 통해 항원-특이 Fab를 제조하는 방법에 관한 것이다.
항체 발견은 비-인간 숙주 종을 면역화하여 혈청으로부터 다클론 항체를 생성하거나 하이브리도마 기술에 의해 단클론 항체를 생성함으로써 가능해졌다(Kohler G and Milstein C, 1975). 그러나 면역화에 의한 항체 발견 방법은 면역화의 생물학에서의 불확실성에 의존하며 전장 비-인간 IgG 만을 야기한다. 게다가, 이러한 비-인간 IgG는 우리의 면역계에 의해 이물(foreign)로서 인지되어 안티-종(anti-species) 항체를 야기한다. 항원-인지 설치류 가변 도메인을 인간 불변 도메인에 이식(-ximAbs)하거나 설치류로부터의 상보-결정 영역을 인간 가변 영역 프레임워크에 이식(-zumabs)하는 기술 뿐만 아니라 인간 Ig 유전자좌에 대한 마우스 유전자이식의 기술의 출현이 안티-종 항체 생성의 문제를 감소시켰다. 그럼에도 불구하고, 인간 항체 생성의 이러한 방법은, 특히 인간과 설치류 간의 아미노산 서열에 있어 매우 보존된 독성 항원 또는 단백질 표적에 관한 한, 바람직하지 않다.
이러한 기술의 또 다른 대안은 항체 파지 디스플레이 라이브러리(APDL)이다. 항체 파지 디스플레이는 항원-특이 항체의 생산에 사용될 수 있는 기술이다. APDL의 초기 참고문헌 중의 하나는 파지 디스플레이 개념을 처음으로 설명한 조지 피 스미스(George P Smith (1985))와 관련된다. APDL은 항체의 라이브러리를 생성하기 위해 면역글로불린 유전자 조각의 클로닝에 의존하는 시험관내 재조합 항체 합성 기술을 사용한다. 이 기술에서, 항체 유전자 또는 유전자 단편이 파지 유전자에 융합되고, 이에 따라 항체 유전자가 융합체로서 발현되고 디스플레이되어 파지 표면 상에 단백질을 피복할 수 있게 된다.
발현된 레퍼토리의 전체 디스플레이를 구비한 인간 항체의 대형 레퍼토리를 생성할 수 있는 능력은 표적 분자에 대한 바이오패닝 후 목적하는 특이성을 갖는 개별 항체의 선택을 가능하게 한다. 이러한 기술을 사용하여, 맞춤 항체(tailor-made antibody)가 합성되고 선택되어 시험관내 및 생체내 진단을 위해, 또는 인간 질환의 면역요법을 위해 목적하는 결합 친화도 및 특이성을 획득할 수 있다. 이 기술은 인간 단백질에 상동성인 단백질과 같은 힘든 항원에 대한 항체의 생산, 및 종래의 항체 생산 면역화 방법이 종종 실패하는 분야에서 특히 유용하다.
파지 디스플레이를 위해 일반적으로 사용되는 항체 포맷은 단일-쇄 가변 단편(scFv) 및 단편 항체 결합(Fab) 단편을 포함한다. scFv는 짧은 가요성 링커를 통해 단일 폴리펩타이드 쇄에 융합된 항체 분자의 중쇄 및 경쇄의 V 영역을 포함하는 1가 구조이다. 각각의 Fab는 단일 항원 결합 부위를 디스플레이하며 디설파이드 결합에 의해 C-말단에서 서로 결합된 Fd 쇄(VH　-CH1-힌지 단편) 및 경쇄(VL　-CL)로 이루어진다.
선행 기술은 특정 scFv 라이브러리 및 합성 라이브러리를 개시한다. 예를 들면, 제WO1992/001047 A1호는 scFv 포맷의 항체 라이브러리를 개시한다. 나이브(naive) 인간 IgM 공급원으로부터 작제된 107 내지 2x107 cfu, 및 scFv 포맷으로 파지미드 벡터 pHEN1에서 클로닝된 나이브 인간 IgG 공급원으로부터의 5x107 cfu의 크기를 갖는 라이브러리가 개시되어 있다. 호박 코돈 억제자 숙주 HB2151에서 형질전환된 파지미드 벡터로부터의 scFv 및 Fab 항체 단편의 분비 및 다클론성 또는 태그-특이 항체를 사용한 웨스턴(Westerns)에서의 이들의 검출이 개시되어 있다. 그러나, WO'047은 세균 배양물로부터의 이러한 분비된 scFv 또는 Fab가 관심 항원에 결합할 수 있는지 없는지에 대해서는 개시하고 있지 않다.
제US6794128 B2호는 7.0x109개 구성원의 scFv 파지 항체 라이브러리를 개시한다. 이것은 추가로 항원에 대한 라이브러리의 선택 및 파지 ELISA에 의한 바인더의 확인을 개시한다. 그러나, 이러한 항원-특이 ELISA에 대해 스크리닝된 샘플의 수와 상응하는 히트(hits)의 수 사이에는 유의적인 차이가 있는 것으로 보인다. 게다가, 동족 항원을 인지할 수 있는 수용성 scFv로의 히트의 전환 비율이 매우 낮다.
제US6696248 B1호는 인간 면역글로불린 레퍼토리의 컨센서스 서열에 기초한 완전 합성 인간 조합 항체 라이브러리(HuCAL)를 개시한다. 사용되는 포맷은 scFv 포맷이며 라이브러리의 크기는 107 내지 108개 이상의 구성원으로 달라진다. US'248은 정제된 scFv의 5-10mg/L의 수율을 개시하지만 이러한 scFv의 친화도는 개시하고 있지 않다.
제US2005/0119455 A1호는 (i) 단일 쇄 Fv (scFv); (ii) 지퍼 도메인을 갖는 단일 쇄 Fv (scFvzip); (iii) Fab 단편 (Fab); 및 (iv) 최소 외피 단백질 (gIII)의 C-말단 도메인에 융합된 지퍼 도메인을 갖는 Fab 단편 (Fabzip)을 개시한다. 게다가, 폴리펩타이드가 바이러스 입자의 표면 상에 융합 단백질로서 발현되며, 여기서 중쇄 가변 도메인이 바이러스 외피 단백질의 일부에 융합된다. US'455는 scFv 포맷으로의 1011 폴리펩타이드 서열 또는 항체 가변 서열의 디스플레이를 추가로 개시한다. L3/H3 다양성을 갖는 F(ab')2 라이브러리 및 H1/H2/H3 다양성을 갖는 Fab 및 F(ab')2 라이브러리 둘 다의 작제가 또한 개시되어 있지만 이러한 라이브러리에 도달하는 어떠한 방법도 제공하지 않으며 라이브러리의 크기 또한 당해 문헌에 제시되어 있지 않다.
제US2005/0164180 A1호는 향상된 발현을 위해 CDR 영역에서 돌연변이된 인간 단클론 항체의 VH 부위를 갖는 인간 단클론 항체 BT32/46으로부터 유도된 dAB (단일 중쇄 도메인 항체 단편) 파지 라이브러리를 생성하는 방법을 개시한다. 설명부는 2.4x108 cfu의 라이브러리 크기를 개시한다.
제KR2009/100961392호는 프레임워크로서의 VH3-23/VL1g 유전자, 및 파지 디스플레이 벡터 pFDV를 사용하여 항체 파지 표면 디스플레이 라이브러리를 생산하는 방법을 개시한다. AE(2.1x109 cfu), BE(2.7x109 cfu), CF(1.1x109 cfu) 및 DF(1.7x109 cfu)의 서브라이브러리로 이루어진 scFv 유전자 라이브러리는 SfiI 부위에서 pFDV 벡터와 절단된 서브라이브러리 간의 순차적인 중합에 의해 수득되었다. ELISA를 수행하고 히트를 공표하기 위한 패닝 라운드로부터의 균주 ER2537의 단일 콜로니로부터의 주변세포질의 보레이트 추출물이 개시되어 있지만, 이러한 히트에 대한 스코어 비 및 친화도 추정치는 개시되어 있지 않다.
제US2009/0054254 A1호는 B 세포의 서브세트로부터 RNA를 단리함으로써 면역글로불린 라이브러리를 생성하는 방법을 제공한다. 이것은 a) 본질적으로 IgM 기억 B 기원의 B 세포의 서브세트를 단리하는 단계; b) 이러한 B 세포의 서브세트로부터 RNA를 단리하는 단계; c) 단리된 RNA를 cDNA로 전환시키는 단계; d) cDNA의 면역글로불린 서열을 증폭시키는 단계; e) 증폭된 면역글로불린 서열을 벡터에 삽입시키는 단계, 및 f) 숙주 세포를 증폭된 서열을 함유하는 벡터로 형질전환시켜 면역글로불린 라이브러리를 수득하는 단계를 포함하여, 면역글로불린 라이브러리를 생성하는 방법을 개시한다. 개시된 포맷은 scFv 및 Fab 둘 다이지만, 개시된 라이브러리의 크기는 단지 scFv 포맷에 대한 것이다(107 cfu).
제US2011/236372 A1호는 scFv 포맷의 합성 항체 라이브러리를 개시한다. 설명부는 전체 라이브러리 크기가 109 개별 클론 이상이며, 이들 중 ~80%가 세균 상청액에서 scFv를 분비할 수 있는 것으로 밝혀졌다고 개시하고 있다.
따라서, 선행 기술들은 대개 scFv 포맷으로 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 생산하는 방법에 관한 것이다. 그러나, 이러한 방법들은 Fab 포맷의 초대형 나이브 라이브러리는 개시하고 있지 않다. 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 생산하기 위해 Fab 포맷을 사용하는 것은 종종 단일 쇄 Fv(scFv)와 같은 다른 포맷의 파지 디스플레이에 비해 특정한 이점을 제공한다. Fab 파지 디스플레이 라이브러리의 이점은 이러한 라이브러리 중의 항원-선택된 Fab가 수-용해된 단백질로서 높은 안정성을 갖는다는 것이다. 이에 반해, 단일 쇄 단편 가변(scFv) 포맷의 항체는 응집물을 형성하는 경향이 있으며 보다 긴 기간에 걸쳐 비교적 불안정하다(Weidner KM et al., 1992; Holliger P et al., 1993; Kortt et al., 1997; Quintero-Hernandez V et al., 2007). 게다가, scFv는 상응하는 Fab 단편에 비해 한 자릿수 이하의 감소된 친화도를 나타낼 수 있다.
특정 선행 기술은 나이브 인간 Fab 라이브러리를 개시한다. 예를 들어, 제EP2067788 A2호는 4.3x1010개 개별 클론을 갖는 나이브 인간 Fab 라이브러리를 개시한다. EP'788은 주변세포질 추출물을 사용한 항원-특이 히트의 스코어링을 추가로 개시하지만, 주변세포질 추출물로부터의 히트 스크리닝에 대해 인용된 방법은 Fab의 주변세포질 추출을 가능하게 하기 위해 설계된 것이 아니라 scFv을 위해 설계된 것이다.
이용 가능한 참고문헌들로부터, 작은 크기(108-109개 클론)의 라이브러리를 입수하는 것은 쉽지만, 포유류 면역 다양성의 이론적 한계(1014 순열)인 크기의 라이브러리를 수득하는 것은 전혀 쉽지 않다는 것이 자명하다. 게다가, 재조합 항체 조립 및 발견 과정의 본질적인 결함으로 인해, 및 또한 재조합 파지를 능가하여 비-재조합 (야생형) 또는 부분 재조합 파지를 전파시키는 경향이 있는 파지의 생물학으로 인해 거짓 양성(false positive)을 생성하거나 바인더를 생성하지 않을 기회가 여전히 매우 높다. 따라서, 본 발명은 이러한 결점을 극복하도록 그려진다.
라이브러리 포맷에 상관없이, 바이오패닝이 항체 라이브러리로부터 바인더를 선택하는데 사용될 수 있다. 바이오패닝은 폴리스티렌과 같은 고체 표면 상에 순수 항원을 고정화시킴으로써, 또는 순수 항원을 비오티닐화시키고 이들을 스트렙트아비딘-코팅된 폴리스티렌 표면 상에 고정화시킨 다음 다양한 포맷으로 Fv 도메인을 디스플레이하는 파지에 노출시킴으로써 시험관내에서 수행될 수 있다. 바이오패닝은 또한 비오티닐화 항원을 스트렙트아비딘 코팅된 자기 마이크로비드 상에 포획한 다음 다양한 포맷으로 Fv 도메인을 디스플레이하는 파지에 노출시킴으로써 시험관내에서 수행될 수 있다. 후자의 접근법은 액체 상에서 패닝을 수행할 수 있는 이점을 가지며, 여기서 반응 평형 및 동역학을 관장하는 법칙이 바람직한 친화도 및 열역학적 특성을 갖는 바인더를 산출하는데 한층 자신있게 적용될 수 있다. 바이오패닝은 또한 살아있는 세포 표면 또는 내부에 존재하는 표적 항원에 대해, 또는 지질 이중층에 안정화된 세포 표면 수용체와 같은 항원에 대해 실시될 수 있다.
바이오패닝의 과정 동안, 소정의 항원에의 특이 바인더(바인더)의 수는 파지 집단에 존재하는 비-특이 바인더(백그라운드) 전반의 극히 일부분이다. 따라서, 백라운드를 능가하여 특이 결합 하위집단을 풍부화시키는 데에는 몇 라운드의 패닝이 요구된다. 게다가, 각 라운드의 패닝에서 포획된 특이 바인더의 작은 비율은 다음 라운드의 패닝을 수행할 수 있도록 F+ 숙주에서의 형질도입에 의한 이들 바인더의 증폭을 필요로 한다. 그러나, 이러한 증폭 사이클은 성장 이점을 갖는 (파지 복제 개시점을 지닌) 임의의 게놈을 전파시킬 가능성을 갖는다 - 개방형 해독틀 내에 보다 짧은 길이의 게놈 또는 번역 종결 코돈을 함유하는 파지가 이러한 이점을 갖는 것으로 보인다. 이러한 생물학적 사실이, 특히 대부분의 파지가 벗겨지기 시작하는 파지미드 라이브러리로부터 유래하는 파지의 경우에, 진짜 바인더(genuine binder)의 회수 및 분석을 복잡하게 만들 수 있다.
선행 기술에서 논의된 바이오패닝의 다양한 방법들은 파지 클론을 표적 항원과 배양한 다음 다양한 용출 전략에 의해 표적 항원에 결합된 파지를 회수함을 포함한다. 또한, ELISA, Westerns 및 SPR에 의한 친화도 평가를 위한 방법들이 선행 기술에 개시되어 있지만, 목적하는 제조능(manufacturability) 특성을 가진 표적 항원에 대한 항체의 최적 수율을 수득하기 위한 정확한 방법은 개시되어 있지 않다.
따라서, 다양한 현존 항체 파지 디스플레이 라이브러리 및 이들의 생산방법은 다양성 포획(diversity capture)을 주요 목표로 하여 기술되어 있으며, 단클론 리드 확인 또는 제조능 측면에서의 본질적인 문제에 대해서는 거의 또는 전혀 주목하지 않았다. 따라서, 대형 항체 파지 디스플레이 라이브러리 및 이들로부터 재현가능하게, 자신있게, 신속하게 항체를 생산하는 방법이 개발될 필요가 있다. 본 발명은 상업적으로 실행 가능하고 짧은 기간에 생산될 수 있는 크고 매우 다양한 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 생명공학의 확립된 도구를 사용하여 제조하기에 적합한 대형 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 뿐만 아니라 이러한 라이브러리로부터의 항체 회수의 신규한 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 치료적 및 진단적 목적으로 사용하기 위한 대형 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하는 것이다.
본 발명은 5.38 x 1010 내지 2.55 x 1011 (1.26 x 1011) cfu 카파 라이브러리 및 7.33 x 1010 내지 3.59 x 1011 (1.79 x 1011) cfu 람다 라이브러리를 포함하는, 8.86 x 1010 내지 9.13 x 1011 (3.06 x 1011) cfu 범위의 크기를 갖는 나이브 항체 파지 디스플레이 라이브러리(APDL)를 개시한다.
본 발명은 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 면역 레퍼토리 포획은 다음의 단계를 포함한다:
i) RNA 단리 및 cDNA 합성 단계;
ii) 서열 번호 1-23 및 42-54를 포함하는 프라이머를 사용한 VL (람다 및 카파) 및 VH 도메인의 증폭 단계;
iii) 서열 번호 27-31을 포함하는 프라이머를 사용하고 서열 번호 24-26을 사용한 C 도메인의 증폭 단계;
iv) 서열 번호 30, 32, 35-37 및 55를 포함하는 프라이머를 사용한, 각각 단계 (ii) 및 (iii)으로부터 수득된 Vκ 및 Cκ 도메인 및 Vλ 및 Cλ 도메인의 융합에 의한 경쇄의 중첩 PCR 단계;
v) 서열 번호 28 & 33을 포함하는 프라이머를 사용한 단계 (ii) 및 (iii)으로부터 수득된 VH 및 CH1의 융합으로부터 수득된 중쇄의 중첩 PCR 단계;
vi) 서열 번호 32, 34, 35-37 및 55를 사용하는 프라이머를 사용한 Fab를 수득하기 위해 각각 단계 (iv) 및 (v)로부터 수득된 경쇄 및 중쇄의 중첩 PCR 단계;
vii) 각 단계에서 앰플리콘을 정제하는 단계.
본 발명은 또한 동적 순위매김(kinetic ranking) 후 이렇게 수득된 >90%의 표현형 대 유전자형 상관도를 초래하도록 다음의 단계를 포함하는 정의된 순서로 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 가용성 Fab로서 제조 가능한 항체를 수득하는 방법을 개시한다:
i) 표적 특이 패닝 단계;
ii) 주변세포질 정량적 ELISA (qELISA) 단계;
iii) 동적 순위매김 단계;
iv) 생물검정 단계;
v) 제조능 평가 단계.
도 1은 단리된 PBMC로부터 추출된 전체 RNA의 품질 확인을 도시한다.
도 2는 Sso Fast Evagreen에서의 가변 및 불변 유전자 증폭을 도시한다. 패널 A & B는 각각 증폭 및 용융 곡선 피크를 보여준다. 패널 C의 레인 2, 3 및 4는 각각의 불변 유전자 프라이머 viz. 서열 번호 29/서열 번호 30, 서열 번호 31/서열 번호 30 및 서열 번호 27/서열 번호 28을 갖는 주형 (20ng/25㎕ 반응)으로서의 람다, 카파 및 중쇄 불변 합성 유전자의 PCR 산물을 함유한다. 레인 5, 6 및 7은 각각의 람다, 카파 및 중쇄 가변 프라이머 viz. 서열 번호 14/서열 번호 23, 서열 번호 9/서열 번호 13 및 서열 번호 1/서열 번호 7을 갖는 주형으로서의 cDNA (20ng/25㎕ 반응)의 PCR 산물을 함유한다. 레인 1은 Fermentas로부터의 1kb plus DNA 마커를 함유한다. PCR 산물은 0.01㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 1xTBE에서 주조된 1.2% 겔 상에서 시험하였으며, 5V/cm에서 90 min 동안 실시하였다.
도 3은 최적화된 PCR 완충액 및 DNA 폴리머라제 조합을 사용한 인간 항체 가변 유전자의 증폭가능성(amplifiability)의 시험을 도시한다. 94℃에서 5min 동안 예열한 후, 94℃에서 15s 동안의 변성 단계, 72℃에서 45s 동안의 동시 어닐링 및 연장 단계에 이은 72℃에서 10min 동안의 연장 및 닉-실링(nick-sealing) 단계로 하여 반응을 30회 사이클링하였다. 패널 A: 중쇄 V-유전자; 레인 3, 5, 7, 9, 11 및 13은 여섯 개의 정방향 프라이머 (서열 번호 1-6)와 역방향 프라이머 서열 번호 7로부터의 산물을 함유하는 반면, 레인 2, 4, 6, 8, 10 및 12는 이들의 각각의 음성 (비 주형) 대조군을 함유한다. 레인 15, 17, 19, 21, 23 및 25는 동일한 정방향 프라이머 세트와 역방향 프라이머 서열 번호 8로부터의 산물을 함유한다. 레인 14, 16, 18, 20, 22 및 24는 이들의 각각의 음성 (비 주형) 대조군을 함유한다. 패널 B: 카파 V-유전자; 레인 3, 5, 7 및 9는 네 개의 카파 정방향 프라이머 (서열 번호 9-12)와 역방향 프라이머 서열 번호 13으로부터의 산물을 함유하는 반면, 레인 2, 4, 6, 및 8은 이들의 각각의 음성 (비 주형) 대조군을 함유한다. 레인 10은 비어 있었다. 패널 C: 람다 V-유전자; 레인 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19는 아홉 개의 정방향 프라이머 (서열 번호 14-22)와 역방향 프라이머 서열 번호 23으로부터의 산물을 함유하는 반면, 레인 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 및 18은 이들의 각각의 음성 (비 주형) 대조군을 함유한다. 레인(들) 1은 1kb plus DNA 마커(Fermentas)를 함유한다. 모든 PCR 산물은 0.01㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 1xTBE에서 주조된 1.2% 겔 상에서 시험하였으며, 5V/cm에서 90 min 동안 실시하였다.
도 4는 모든 Vλ 프라이머 쌍의 최적화된 증폭 조건의 재시험을 도시한다. 모든 증폭은 Pfu Ultra II HS 및 PCR Extender 완충액을 사용하여 수행하였다. 프라이머 쌍은 서열 번호 14-22와 역방향 프라이머 서열 번호 23이다. 투입 cDNA는 50㎕ 반응 당 50ng이었다. 94℃에서 5min 동안 예열한 후, 94℃에서 15s 동안의 변성 단계, 72℃에서 45s 동안의 동시 어닐링 및 연장 단계에 이은 72℃에서 10min 동안의 연장 및 닉-밀봉 단계로 하여 반응을 30회 사이클링하였다. 짝수 레인은 레인 위에 명시된 각각의 Vλ 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 서열 번호 23으로부터 유도된 산물을 함유한다. 홀수 레인은 이들의 각각의 음성 (비 주형) 대조군을 함유한다. M은 Fermentas로부터의 Generuler 1kb plus DNA 마커이다. 모든 PCR 산물은 0.01㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 1xTBE에서 주조된 1.2% 겔 상에서 시험하였으며, 5V/cm에서 90 min 동안 실시하였다.
도 5는 모든 Vκ 프라이머에 의한 증폭을 도시한다. 패널 A에서의 반응은 Pfu Ultra II HS 폴리머라제 및 Pfu 완충액을 사용하여 증폭시켰다. 레인 2 및 4는 각각 프라이머 서열 번호 9 및 10과 역방향 프라이머 서열 번호 13으로부터 유도된 산물을 함유하는 반면, 레인 1 및 3은 이들의 각각의 음성 (비 주형) 대조군을 함유한다. 패널 B 및 C는 서열 번호 11 및 12에 의한 증폭을 호전시키는 효소-완충액 매트릭스를 보여준다. 패널 둘 다에서의 반응은 PCR Extender 폴리머라제 블렌드를 사용하여 증폭시켰다. 패널 B는 서열 번호 11에 의한 증폭을 보여주는 반면 패널 C는 서열 번호 12에 의한 증폭을 보여주며, 둘 다는 역방향 프라이머 서열 번호 13과 쌍을 이룬다. 95℃에서 5 min 동안 예열한 후, 94℃에서 15s 동안의 변성 단계, 60℃에서 30s 동안의 어닐링, 72℃에서 30s 동안의 연장에 이은 72℃에서 10min 동안의 연장 및 닉-밀봉 단계로 하여 반응을 30회 사이클링하였다. 레인 2, 4, 6, 및 8은 각각 Advantage 2 완충액, Advantage 2 SA 완충액, PCR Extender 완충액 및 Tuning 완충액을 사용한 PCR 산물을 함유한다. 레인 1, 3, 5, 및 7은 이들의 각각의 음성 (비 주형) 대조군을 함유한다. 투입 cDNA는 모든 패널에 대해 50㎕ 반응 당 50ng이었다. M은 Fermentas로부터의 Generuler 1kb plus DNA 마커이다. 모든 PCR 산물은 0.01㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 1xTBE에서 주조된 1.2% 겔 상에서 시험하였으며, 5V/cm에서 90 min 동안 실시하였다.
도 6은 최적화된 PCR 완충액 및 DNA 폴리머라제 조합과 모든 Scripps VH 프라이머 쌍을 사용한 VH 유전자의 증폭의 시험을 도시한다. 상부 패널은 Advantage 2 SA 완충액에서 수행되는 반응을 나타내는 반면, 하부 패널은 Tuning 완충액에서 수행되는 반응을 나타낸다. 사용되는 효소는 모든 반응에 대해 Pfu Ultra II HS 폴리머라제이었다. 레인 1 내지 12는 모든 6개의 VH 센스 프라이머 (서열 번호 1-6)와 역방향 프라이머 서열 번호 7을 함유한다. 레인 13 내지 24는 모든 6개 VH 센스 프라이머와 역방향 프라이머 서열 번호 8을 함유한다. 50㎕ 반응 당 투입 cDNA 양은 50ng이었다. 짝수 웰은 그 위에 명시된 각각의 프라이머 쌍으로부터의 산물을 함유하는 반면, 홀수 웰은 이들의 각각의 음성 (비 주형) 대조군을 함유한다. M은 Fermentas로부터의 Generuler 1kb plus DNA 사다리이다.
도 7은 모든 불변 도메인 프라이머 (Cκ, Cλ, CH)의 증폭을 확인하기 위한 최적화된 효소-완충액 매트릭스의 적용을 도시한다. 모든 반응은 Pfu Ultra II HS 폴리머라제 및 PCR Extender 완충액을 사용하여 증폭시켰다. 투입 DNA 농도는 50㎕ 반응 당 50ng이었다. 레인 1은 프라이머 쌍 서열 번호 29/서열 번호 30을 사용하여 증폭된 주형으로서의 서열 번호 26으로부터 유도된 산물을 함유하고, 레인 2는 프라이머 쌍 서열 번호 31/서열 번호 30을 사용하여 증폭된 주형으로서의 서열 번호 25로부터 유도된 산물을 함유하는 반면, 레인 3은 프라이머 쌍 서열 번호 27/서열 번호 28을 사용하여 증폭된 주형으로서의 서열 번호 24로부터 유도된 산물을 함유한다. M은 Fermentas로부터의 Generuler 1kb plus DNA 마커이다. 모든 PCR 산물은 0.01㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 1xTBE에서 주조된 1.2% 겔 상에서 시험하였으며, 5V/cm에서 90 min 동안 실시하였다.
도 8은 VλCλ의 1st 중첩 PCR를 개선시키기 위한 투입 DNA 농도 대 다양한 폴리머라제 농도를 도시한다. 모든 반응은 Advantage 2 폴리머라제 및 Advantage 2 SA 완충액을 사용하여 수행하였다. 투입 DNA는 50㎕ 반응 당 정제된 Vλ 및 Cλ 산물에 대해 등몰량이었다. 프라이머 쌍은 서열 번호 32/서열 번호 30이었다. 패널 A, B, 및C는 각각 10, 25, 및 50ng 투입 DNA에 대한 결과를 보여준다. 짝수 레인은 레인 위에 명시된 각각의 효소 농도(0.25x, 0.5x, 0.75x 및 1.0x)로부터의 산물을 함유하는 반면 홀수 레인은 이들의 각각의 음성 (비 주형) 대조군을 함유한다. M은 Generuler 1 kb plus DNA 마커(Fermentas)이다.
도 9는 VHCH1의 1st 중첩 산물의 최적화를 위한 효소 완충액 매트릭스를 도시한다. 패널 A, B, C, D, E, 및 F는 각각 Advantage 2 완충액, Advantage 2 SA 완충액, Exact 폴리머라제 완충액, PCR Extender 완충액, Tuning 완충액 및 Vent 완충액에서의 PCR 산물을 보여준다. VHCH1 중첩을 위한 프라이머 쌍은 서열 번호 33/서열 번호 28이다. VH에 대한 투입 DNA 농도는 50ng이었고, 등몰량의 CH1이 중첩 반응을 위해 사용되었다. 레인 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14는 각각 Advantage 2 폴리머라제, Exact 폴리머라제, Pfu Ultra II HS 효소, AmpliTaq 폴리머라제, PCR Extender, Vent 폴리머라제 및 Deep Vent 폴리머라제로부터 유도된 산물을 함유한다. 레인 1, 3, 5, 7, 9, 11, 및 13은 이들의 각각의 음성 (비 주형) 대조군을 함유한다. M은 Fermentas로부터의 Generuler 1 kb plus DNA 마커이다.
도 10은 최종 Fab 산물의 증폭을 위한 효소 완충액 매트릭스를 사용하는 SOE PCR 메가프라이머 전략을 도시한다. 초기 15회 사이클은 각각의 1st 중첩 산물 50ng을 갖는 프라이머를 첨가하지 않고서 수행하였다. 15회 사이클 후, 30회 이상의 사이클은 프라이머 쌍 서열 번호 32와 서열 번호 34를 첨가하여 수행하였다. 패널 A, B, C, 및 D는 각각 Advantage 2 SA 완충액, Expand LT 완충액, PCR Extender 완충액 및 Thermopol 완충액에서의 증폭을 보여준다. 레인 2, 4, 6 및 8은 각각 Advantage 2 폴리머라제 믹스, Expand LT 폴리머라제, PCR Extender 효소 및 Deep Vent 폴리머라제를 사용함으로써 유도된 증폭 산물을 보여주는 반면, 레인 1, 3, 5 및 7은 이들의 각각의 음성 (비 주형) 대조군을 함유한다. M은 Fermentas로부터의 Generuler 1 kb plus DNA 마커이다.
도 11은 최종 Fab 산물의 증폭을 위한 효소 완충액 매트릭스를 사용하는 2-단계 PCR 전략을 도시한다. 프라이머 쌍은 각각의 1st 중첩 산물 50ng을 갖는 서열 번호 32 및 서열 번호 34이었다. 패널 A, B, C, 및 D는 각각 Advantage 2 SA 완충액, Expand LT 완충액, PCR Extender 완충액 및 Thermopol 완충액에서의 증폭을 보여준다. 레인 2, 4, 6 및 8은 각각 Advantage 2 폴리머라제 믹스, Expand LT 폴리머라제, PCR Extender 효소 및 Deep Vent 폴리머라제로부터 유도된 증폭 산물을 보여주는 반면, 레인 1, 3, 5 및 7은 이들의 각각의 음성 (비 주형) 대조군을 함유한다. M은 Fermentas로부터의 Generuler 1 kb plus DNA 마커이다.
도 12는 pCOMB3XSS의 원형 플라스미드 지도를 도시한다.
도 13은 pCOMB3XSS 벡터의 SfiI 소화를 도시한다. 패널 A는 밴드-절단 전의 SfiI-소화된 pCOMB3XSS 벡터 및 스터퍼(stuffer) 단편을 보여주는 반면 패널 B는 원하는 밴드가 절단된 후의 동일 겔을 보여준다. 레인 2는 비절단 pCOMB3XSS를 함유하는 반면 레인 4 내지 15는 SfiI-소화된 pCOMB3XSS를 함유한다. 상부 밴드는 3.3kb 벡터 백본인 반면 하부 밴드는 1.6 kb 스터퍼 단편이다. 10U/㎍의 SfiI 효소가 50℃에서 밤새 소화를 위해 사용되었다. M은 Fermentas로부터의 1 kb plus DNA 마커이다.
도 14A는 결찰 믹스의 열 불활성화의 효과를 도시한다. 패널 A는 열 불활성화의 부재하에서의 1:0.35 결찰 믹스로부터의 형질전환체의 수를 보여주는 반면, 패널 B는 열 불활성화 처리의 존재하에서의 동일한 1:0.35 결찰 믹스에 대한 형질전환체의 수를 보여준다. 형질전환을 위해, TG1 세포 25㎕ 당 비처리된 또는 열 불활성화된 결찰 믹스로부터의 순수한 (비희석된) 1㎕를 전기천공시켰으며, 전기천공 후 1, 10 및 100㎕의 배양물을 플레이팅하였다. 데이터는 편의상 1:0.35 결찰 비에 대해서만 나타내어져 있다. 다른 두 가지 결찰 비 (1:1 및 1:3.5)가 또한 동일한 추세를 따르지만 훨씬 더 매트한 성장을 갖는다. 도 14B는 벡터 백그라운드의 계산을 도시한다. 패널 A는 단지 140ng 벡터가 임의의 삽입물 없이 첨가된 벡터 대조 결찰을 보여주는 반면, 패널 B는 1:1 열 불활성화된 결찰 믹스의 플레이트를 보여준다. 데이터는 단지 1㎕ 플레이팅 용적에 대해서만 나타내어져 있다.
도 15는 SfiI 소화에 의한 TOPO-Fab 클론 확인을 도시한다. 모든 반응은 각각의 TOPO-Fab 클론으로부터의 1㎍의 miniprep 플라스미드를 함유한다. 소화는 20㎕ 반응에서 DNA ㎍ 당 5U의 SfiI를 갖는 NEB 완충액 4 중에서 수행하였다. 레인 위의 숫자는 각각의 클론 수를 나타낸다. 샘플은 5V/cm에서 1.5h 동안 0.1㎍/ml 에티듐 브로마이드를 갖는 1xTBE 중의 1% 분석 등급 아가로스 겔에서 시험하였다. M은 Fermentas로부터의 1kb plus DNA 마커이다. 화살표는 SfiI 소화 후 방출된 1.5kb Fab 밴드를 나타낸다.
도 16은 결찰 가능한 SfiI 말단을 갖는 Fab를 방출하기 위한 자가-원형화(self-circularization)의 개념을 예시하는 개략도를 도시한다.
도 17은 자가-결찰 전략에 의한 선형 Fab의 SfiI 소화를 도시한다. 사용되는 Fab는 TOPO-Fab 클론으로부터 단리된 플라스미드로부터 증폭된 단일 유형의 것이었다. 레인 2, 3 및 4는 각각 1㎍의 PCR 증폭된 Fab 산물, 자가-결찰 후의 Fab 및 SfiI 소화 후의 Fab를 함유한다. 산물들을 0.1㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 1xTBE에서 제조된 1% 아가로스 겔 상에서 분석하였으며 5V/cm에서 1.5h 동안 실시하였다. M은 Fermentas로부터의 1kb plus DNA 마커이다. 좌측의 숫자는 염기 쌍에서의 마커 크기를 보여준다.
도 18은 단일 집단의 Fab에 대한 1차 자가-결찰 시험의 결과를 도시한다. 패널 A는 벡터 대조 플레이트를 보여주는 반면 패널 B는 자가-결찰된 Fab에 대한 것을 보여준다. 패널 C는 스터퍼 대조군이다. 1㎕ 플레이팅 용적으로부터의 플레이트가 나타내어져 있다.
도 19는 다양한 집단의 Fab에 대한 자가-결찰 시험의 결과를 도시한다. 패널 A는 벡터 대조 플레이트를 보여주는 반면 패널 B는 자가-결찰 전략에 의해 제조된 람다 Fab 혼주물(pool)을 보여준다. 패널 C는 스터퍼 대조 플레이트를 보여준다.
도 20은 자가-결찰 라이브러리 클론의 특성화를 도시한다. 패널 A는 카파 자가-결찰 클론에 대한 PCR 증폭을 보여주는 반면 패널 B는 람다 자가-결찰 클론에 대한 PCR 증폭을 보여준다. 10㎕의 PCR 산물이 각 레인에 부하되었다. 패널 C는 카파 자가-결찰 클론에 대한 SfiI 소화 패턴을 보여주는 반면 패널 D는 람다 자가-결찰 클론에 대한 SfiI 소화 패턴을 보여준다. 패널 C & D의 모든 레인은 각각의 클론으로부터 단리된 1㎍의 SfiI 소화된 플라스미드 DNA를 함유한다. 레인 위의 숫자는 클론 수를 나타낸다. 분석은 0.1㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 1xTBE에서 제조된 1% 아가로스 겔에서 이루어졌으며 5V/cm에서 1.5h 동안 실시되었다. M은 Fermentas로부터의 1kb plus DNA 마커이다. 좌측의 숫자는 염기 쌍에서의 마커 크기를 보여준다.
도 21은 카파 및 람다 Fab 클론의 BstNI 분석을 도시한다. 모든 레인은 40㎕의 BstNI 소화 반응물을 함유한다. 상부 패널은 카파 Fab의 핑거프린트를 보여주는 반면 하부 패널은 람다 Fab 핑거프린트를 보여준다. 이미지는 1xTBE에서 주조되고 4V/cm에서 3h 동안 실시되는 에티듐 브로마이드 염색된 3% 아가로스 겔을 나타낸다. 레인 위의 숫자는 각각의 클론 수를 나타낸다. M은 1kb plus DNA 마커(Fermentas)이다. 좌측의 숫자는 염기 쌍에서의 마커 크기를 보여준다.
도 22는 모든 서열분석된 람다 Fab의 ClustalW 리포트를 도시한다. 람다 Fab의 뉴클레오티드 서열을 pCOMB3XSS와 비교하여 5' 및 3' 말단 둘 다에 대한 SfiI의 존재 및 무손상을 입증하였다.
도 23은 단위 용적당 DNA 농도 증가 및 PEG 8000의 사용에 의해 자가-결찰법을 개선시키는 방법을 도시한다. 레인 2는 포스포릴화 Fab 혼주물 단독을 함유하는 반면, 레인 4, 5 및 6은 16℃에서 16h의 배양 후 결찰 혼합물의 샘플을 함유한다. 시각적 비교를 위해 모두를 등량(2.5㎍)으로 부하하였다. 레인 4는 표준 83ng/l 결찰 반응물로부터의 샘플을 함유하는 반면, 레인 5는 6% PEG로 보충된 표준 반응물을 함유한다. 레인 6은 6% PEG로 보충된 200ng/l의 DNA를 함유한 결찰 반응물을 샘플로 한다. 레인 1 및 3은 비어 있다. M은 Fermentas로부터의 1kb plus DNA 마커이다. 좌측의 숫자는 염기 쌍에서의 마커 크기를 보여준다. 우측의 패널은 0.1㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 1xTBE에서 제조되고 5V/cm에서 1.5h 동안 실시되는 1% 아가로스 겔의 에피형광 이미지(epifluorescent image)를 보여준다. 우측의 이미지는 이것의 네거티브 사진(photographic negative)이다.
도 24A는 세포 대 DNA 비 적정 실험의 사진 증거를 도시한다. 1:25000 희석으로부터의 플레이트가 나타내어져 있다. 도 24B는 표 37에 열거된 세포 대 DNA 비 적정 실험의 그래프 도식을 나타낸다.
도 25는 최종 대형 Fab 라이브러리 제조를 위한 선형 Fab의 자가-결찰을 도시한다. 패널 A 및 B는 각각 카파 및 람다 Fab에 대한 에피형광 이미지를 보여주는 반면, 패널 C는 람다 Fab 겔의 네거티브 사진(패널 B)이다. 레인 2는 500ng의 Fab 혼주물 단독을 함유하는 반면, 레인 4는 16℃에서 16h의 배양 후 Fab 자가-결찰 혼합물의 샘플 1㎍을 함유한다. 레인 6은 SfiI 소화된 염 정제된 자가-결찰된 결찰 혼합물을 함유한다. 레인 3 및 5는 비어 있다. M은 Fermentas로부터의 1kb plus DNA 마커이다. 좌측의 숫자는 염기 쌍에서의 마커 크기를 보여준다. 샘플을 0.1㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 1xTBE에서 제조된 1% 아가로스 겔에서 시험하였으며 5V/cm에서 1.5h 동안 실시하였다.
도 26은 두 개의 최종 중첩 프라이머 서열 번호 32 및 서열 번호 34의 서열 및 쌍을 이룬 정렬을 도시한다. 상부 패널은 서열 번호와 함께 프라이머 서열 및 배향을 보여준다. VL-CL 또는 VH-CH1 주형에 정렬하는 부분은 굵은 글씨체로 표시된다. 오버행(overhangs)은 일반 글꼴로 표시된다. 서열 번호 32에서 SfiI 및 SacI 부위는 이탤릭체로 표시된다. 하부 패널은 66.7%의 유사 지수로 Martinez-Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용한 두 개 서열의 쌍을 이룬 정렬을 보여준다.
도 27은 PCR 조립된 카파 Fab 혼주물의 통상적인 SfiI 소화를 도시한다. SfiI로 소화된 모든 PCR 중첩 산물은 1xSYBR safe™을 함유하는 1xTAE에서 주조된 1.2% 겔 상에서 시험하였으며, 5V/cm에서 90 min 동안 실시하였다. 상부 패널은 시험 후 이들 겔의 이미지를 보여주는 반면, 하부 패널은 SfiI 소화된 Fab 혼주물의 1.5kb 밴드를 절단한 후의 동일 겔을 보여준다. 어닐링 부위의 오버행 5'의 길이를 따라 최종 Fab 조립을 위해 사용되는 프라이머가 각 컬럼의 상단에 나타내어져 있다.
도 28은 pSSY1 (서열 번호 38)의 원형 플라스미드 지도를 도시한다.
도 29는 가변 유전자 증폭을 시험함으로써 제조된 cDNA의 품질의 확인을 도시한다. 당해 도면은 모든 Vκ 정방향 프라이머 (서열 번호 42-45)와 쌍을 이루는 Vκ-특이 역방향 프라이머 (서열 번호 13)에 의한 시험 증폭 및 모든 Vλ 정방향 프라이머 (서열 번호 46-54)와 쌍을 이루는 Vλ 역방향 프라이머 (서열 번호 23)에 의한 시험 증폭을 보여준다. 겔의 상단의 숫자는 각각의 정방향 프라이머의 서열 번호를 나타낸다. 산물을 0.1㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 1xTBE에서 제조된 1.2% 아가로스 겔에서 분석하였으며 5V/cm에서 1.5h 동안 실시하였다. M은 Fermentas로부터의 1kb plus DNA 마커이다.
도 30은 초대형 라이브러리의 V-계열 범위를 도시한다.
도 31은 파지 형질도입체 클론으로부터의 콜로니 PCR에 의한 파지 라이브러리의 품질 확인을 도시한다. Fab 삽입물은 벡터 백본 프라이머를 사용하여 랜덤하게 선택된 클론의 희석된 배양물로부터 PCR-증폭시켰다. 산물은 0.1g/mL 에티듐 브로마이드를 함유하는 1xTBE에서 제조된 1% 아가로스 겔 상에서 분석하였으며 5V/cm에서 1.5h 동안 실시하였다.
도 32는 (표적 항원에 대해 3rd 라운드 패닝된 혼주물로부터의) P04 클론의 BstNI 핑거프린팅을 도시한다. 제한 패턴을 분석하기 위해 소화는 3% 아가로스 겔 상에서 실시하였다. 결합 패턴 간의 보다 양호한 대비를 위해 역전 모드의 아가로스 겔이 나타내어져 있다. 산물을 6V/cm에서 2.5h 동안 동일한 완충액에서 제조된 3% 아가로스 겔에서 0.1㎍/mL 에티듐 브로마이드를 함유하는 1xTBE 완충액 중에서 시험하였다. 레인 상단의 숫자는 각각의 반복 패턴 클론을 나타낸다. 좌측의 숫자는 bp 단위의 각각의 DNA 마커 위치를 보여준다.
도 33은 Fab의 주변세포질 웨스턴을 도시한다. 주변세포질 추출물의 웨스턴 블롯은 실시예 26 및 27에 기재된 바와 같은 패닝 캠페인으로부터 수득되었으며 HRP-접합된 토끼 다클론 IgG (Jackson ImmunoResearch#309-036-003)로 프로빙하였다. 화살표는 추정된 ~50kDa Fab 이형이량체를 나타내는 반면, *는 추정된 23 또는 27 kDa 단량체(경쇄 또는 중쇄)를 나타낸다. 상단의 박스는 이러한 클론이 속하는 VL/VH 계열과 함께 클론 수를 나타낸다. 각 이미지의 좌측 가장자리를 따라 있는 숫자는 kDa 단위의 마커의 분자량을 나타낸다(예비-염색된 All-Blue SDS-PAGE 마커; BioRad).
도 34는 파지 혼주물 ELISA를 나타낸다. 패널 A는 나이브 라이브러리, 라운드 1 및 라운드 2 솔루션 패닝(solution panning) 용출액으로부터 유도된 파지 혼주물 간의 동시 비교를 보여준다. 파지를 RT에서 1h 동안 라운드 1에서 500nM 비오티닐화 항원에 이어 동일한 배양 조건하에 라운드 2에서 다양한 농도의 동일 항원과 배양하였다. 흑색 막대는 Polysorp 웰 상에 고정화된 표적 항원에 대한 반응성을 나타내는 반면 회색 막대는 평행 웰에 고정화된 인간 혈청 알부민(HsSA)에 대한 동일 혼주물의 반응성을 나타낸다. 항원-특이 웰에서의 보다 높은 반응성은 2nd 라운드에 의한 항원-특이 바인더의 풍부를 시사하지만, 유인 용량 의존적 풍부(bait dose dependent enrichment)는 보이지 않는다. 패널 B는 파지를 라운드 2에서 RT에서 16h 동안 항원과 배양시키는 것을 제외하고는 패널 A에서와 같이 나이브 라이브러리, 라운드 1 및 라운드 2 솔루션 패닝 용출액으로부터 유도된 파지 혼주물 간의 동시 비교를 보여준다. 유인 용량 의존성은 라운드 2로부터의 더 긴 배양 조건하에서 자명하다. 패널 C는 파지를 라운드 2에서 다양한 길이의 시간 동안 100nM 비-비오티닐화 항원의 첨가 전 RT에서 1h 동안 10nM 비오티닐화 항원과 배양시키는 것을 제외하고는 패널 A 및 B에서와 같이 나이브 라이브러리, 라운드 1 및 라운드 2 솔루션 패닝 용출액으로부터 유도된 파지 혼주물 간의 동일한 동시 비교를 보여준다. 2h에 걸친 풍부의 지속은 이러한 혼주물에서의 고 친화도(느린 분해) 바인더의 존재를 시사한다.
도 35는 항원-특이 ELISA를 도시한다. 네 개의 96-웰 플레이트가 이 스크린샷에 나타내어져 있다. 홀수 웰은 2㎍/ml 인간 혈청 알부민으로 피복시키는 반면 짝수 웰은 동일한 양의 표적 항원으로 피복시켰다. 단클론 재조합체로부터 문헌에 기술된 바와 같이 제조된 전 세포 추출물을 이중(duplicate)으로 이러한 예비-피복된 웰에서 최적화된 희석물로 배양하여, 하나의 분취량의 희석물을 홀수 웰에 피펫팅하는 반면 다른 분취량을 쌍의 짝수 웰에 피펫팅한다. 결합된 Fab는 인간 Fab-특이 다클론 혈청(Jackson ImmunoResearch 309-036-003)으로 검출되었다. 쌍을 이루는 비특이 항원 웰보다 적어도 2배 높은 항원-특이 반응성을 보이는 클론이 하이라이트로 굵게 표시되어 있다.
도 36은 주변세포질 게이트를 도시한다. 이미지는 솔루션 패닝 캠페인으로부터의 주변세포질 추출물의 30개 웨스턴 블롯의 복합이다. 블롯은 HRP-접합된 토끼 다클론 IgG(Jackson ImmunoResearch 309-036-003)로 프로빙하였다. 화살표는 추정된 ~50kDa Fab 이형이량체 및 추정된 23 또는 27 kDa 단량체(경쇄 또는 중쇄)를 나타낸다. 각 레인의 상단의 라벨은 클론 수를 나타낸다. 각 이미지의 좌측 가장자리를 따라 있는 숫자는 kDa 단위의 마커의 분자량을 나타낸다(예비-염색된 All-Blue SDS-PAGE 마커; BioRad).
도 37은 Fab 히트 확인을 위한 다클론 검출 항체의 혼란스러운 성질을 묘사한다.
도 38은 수정된 주변세포질 게이트를 도시한다. 이미지는 실시예 30에서와 같은 솔루션 패닝 캠페인으로부터의 주변세포질 추출물의 33개 웨스턴 블롯의 복합이다. 블롯은 HRP-접합된 마우스 단클론 항-HA IgG (클론 3F10; Roche)로 프로빙하였다. 화살표는 추정된 ~50kDa Fab 이형이량체 및 추정된 23 또는 27 kDa 단량체(경쇄 또는 중쇄)를 나타낸다. 각 레인의 상단의 라벨은 클론 수를 나타낸다. 각 이미지의 좌측 가장자리를 따라 있는 숫자는 kDa 단위의 마커의 분자량을 나타낸다(예비-염색된 All-Blue SDS-PAGE 마커; BioRad).
도 39는 웨스턴에 의한 주변세포질 서브타이핑(subtyping)을 도시한다. 이미지는 실시예 30에서와 같은 솔루션 패닝 캠페인으로부터의 주변세포질 추출물의 16개 웨스턴 블롯의 복합이다. 블롯은 HRP-접합된 항-카파 또는 항-람다 단클론 (Sigma)으로 프로빙하였다. 화살표는 추정된 ~50kDa Fab 이형이량체 및 추정된 23 또는 27 kDa 단량체(경쇄 또는 중쇄)를 나타낸다. 각 레인의 상단의 라벨은 클론 수를 나타낸다. 각 이미지의 좌측 가장자리를 따라 있는 숫자는 kDa 단위의 마커의 분자량을 나타낸다(예비-염색된 All-Blue SDS-PAGE 마커; BioRad).
도 40은 인-프레임(in-frame) 대 오프-프레임(off-frame) 클론 실험을 도시한다. 비-환원된 조건에서 3개의 고의 탠덤 인-프레임 클론 대 3개의 고의 오프-프레임(HC에서) 클론으로부터의 주변세포질 추출물의 웨스턴 분석은 항-람다 (패널 a), 항-카파 (패널 b), 항-CH1 (패널 c) 및 HRP-접합된 항-Hu (H+L) F(ab')2 단편 항체 (패널 d)로 프로빙하였다.
도 41은 진짜 히트로부터 가짜 Fab 단백질 히트를 제거하기 위한 연쇄-스위치 표현형 분석(chain-switch phenotyping) 개념을 도시한다.
도 42는 Fab 연쇄-스위치 정량 ELISA로부터의 적합 곡선 및 역 예측의 예를 도시한다. 패널 A는 X-축 상의 투입 표준물의 질량 대 Y-축 상의 출력 A450 값에 대한 4-파라미터 적합 곡선을 보여주는 반면 패널 B는 F-검정으로부터의 확률 점수에 의해 나타내어지는 바와 같이 적합 파라미터의 추정치 뿐만 아니라 적합도를 보여준다. 패널 C는 적합 곡선으로부터의 투입 Fab 농도, 원래의 A450 값 및 역-예측된 농도를 보여준다.
도 43은 qELISA에 의한 인-프레임 클론 및 오프-프레임 클론의 구별을 도시한다. 패널 A는 A450 값을 보여주는 반면 패널 B는 출력의 용이한 시각화를 위한 막대 그래프와 동일한 데이터를 보여준다. 패널 C는 이 실험에 대한 적합 표준 곡선을 보여주는 반면 패널 D는 4-PL 적합 파라미터 및 적합도를 보여준다.
도 44는 다양한 SPR Fab 포획 표면으로부터 가능한 최대 반응 단위의 요약을 도시한다. 실험은 재조합 표준 인간 Fab 또는 PPE-Fab를 사용하여 GLC, GLM 또는 NLC 칩 상에 ProteOn XPR36 기기 (BioRad)를 사용하여 수행하였다. 작용 완충액은 20mM PBS, pH 7.4 및 0.05% Tween-20 또는 0.05% Tween-20을 갖는 10mM HEPES이었다. 포획 항체 viz. 다클론 항-Fab, 항-His, 항-HA 또는 이가 항-CH1/항-λ 또는 항-CH1/항-κ의 1:1 혼합물을 각각의 칩 상에 수직으로 고정화하였다. 1:2 내지 1:10 희석도의 시험 Fab 및 5㎍/ml의 표준 Fab를 25㎕/min 유속에서 180s-300s 동안 각각의 수평 채널 상에 포획시켰다. 필요하다면, 2회의 연속 포획을 수행하여 포획 수준을 증가시키고, 100㎕/min에서 18s 동안 H3PO4 주사에 의해 표면을 안정화시켰다. 센서그램(sensorgram)을 적당하게 참조하고 Fab 포획 수준을 기록하였다. 이가 항-Fab 항체가 나머지 항체(70-600RU)에 비해 최대 Fab 포획 수준(800-2000RU)을 야기하였다.
도 45는 베바시주맙의 정제된 Fab' 단편과의 VEGF165 상호작용의 SPR 기반 동적 분석을 도시한다. Fab 포획 방법은 베바시주맙의 정제된 Fab' 단편을 리간드로 사용하고 VEGF165를 분석물로 사용하여 검증하였다. 작용 완충액은 생리 식염/0.005% Tween-20 또는 0.5M NaCl/0.05% Tween-20을 함유하는 PBS, pH 7.4이었다. 패널 A는 포획 표면에 대한 분석물 (VEGF165)의 비-특이 결합 (NSB)의 문제해결을 위한 SPR 프로파일을 보여준다. 작용 및 샘플 완충액 중의 Tween-20 및 염 농도를 증가시키면 NSB가 대폭 감소하였다. 패널 B는 이들 각각의 잔차 플롯(residual plot)과 함께 Fab' 단편의 상이한 포획 수준에서의 결합 곡선을 보여준다. 패널 C는 각각의 포획 수준에서 유도된 동적 값 (k a , k d 및 KD) 및 다른 관련 파라미터를 보여준다.
도 46은 조제(crude) 주변세포질 추출물에 존재하는 발현된 BevacizuFab과의 VEGF165 상호작용의 SPR 기반 동적 분석을 도시한다. Fab 포획 방법은 BevacizuFab를 주변세포질 발현된 Fab 포맷으로 리간드로서 사용하고 VEGF165를 분석물로서 사용하여 검증하였다. 도 45에 기술된 바와 같은 최적화된 조건을 사용하였다. 패널 A는 BevacizuFab의 결합 곡선을 보여주는 반면 패널 B는 이의 각각의 잔차 패널을 보여준다. 패널 C는 (도 45의 패널 C와 비교하여) 각 포획 수준에서 상응하는 동적 값 (k a , k d 및 KD) 및 다른 관련 파라미터를 보여준다. PPE-Fab LB 및 PPE-Fab MM은 상이한 배지에서 성장한 BevacizuFab의 주변세포질 추출물을 가리킨다.
도 47은 Fab 라이브러리로부터의 항체 발견의 펀넬을 도시한다.
도 48은 b-TNFα 순도 및 품질 확인을 도시한다. 샘플을 90℃에서 5min 동안 가열하고 5㎍의 각각의 환원된 및 비-환원된 단백질을 150V에서 40min 동안 4-15% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 전기영동시켰다. 우측의 이미지는 Coomassie Brilliant Blue R-250에서 2h 동안 염색시키고 물: 메탄올: 아세트산 (50:40:10)을 사용하여 2h 동안 탈-염색시킨 겔을 보여준다. M은 Biorad로부터의 Precision plus All Blue SDS-PAGE 마커이고 - NR은 비-환원된 것에 대한 것이며, R은 환원된 것에 대한 것이다. 웨스턴 블롯팅을 위해, 100nM (50ng) 및 30nM (~16ng) 환원된 단백질 샘플을 제조하고 상기와 같이 전기영동시켜 100V에서 1.5h 동안 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 블롯을 TBST (0.05% Tween-20) 중의 3% BSA에서 1h 동안 차단시키고 3% BSA에서 1h 동안 1:40000 희석도에서 스트렙트아비딘-HRP (Dako# P0397)로 프로빙하였다. 블롯을 Clarity Western ECL 기질(Biorad#170-5060)을 사용하여 전개시켰다. 생성된 웨스턴 블롯의 이미지 (좌측)는 ChemiDoc XRS 시스템 (Biorad)을 사용하여 기록하였다.
도 49는 연쇄 스위치(chain switch) qELISA를 사용한 항-TNFα 가용성 Fab 스크리닝에 대한 대표적인 데이터를 도시한다. 상부 패널은 클론 번호 481 내지 576을 갖는 TNFα 캠페인의 플레이트 6의 레이아웃을 보여준다. 중간 패널은 람다 검출 항체를 사용한 표준 곡선 및 A450 값을 보여주는 반면 하부 패널은 카파 검출 항체를 사용한 표준 곡선 및 A450 값을 보여준다. 흑색은 고 발현 클론을 나타내고, 진회색은 중간 발현 클론을 나타내는 반면 연회색은 저 발현 클론을 나타낸다.
도 50은 500nM 분석물 농도에서 항-TNFα의 SPR 양성 클론의 동적 스크리닝 프로파일을 도시한다. 실험은 뉴트라비딘-피복된 (NLC) 칩 상의 ProteOn XPR36 기기 (BioRad)를 사용하여 수행하였다. 작용 완충액은 0.5M 염 및 0.05% Tween-20을 갖는 20mM PBS, pH 7.4이었다. 포획 항체는 비오티닐화 이가 항-CH1/항-λ 및 항-CH1/항-κ 항체의 1:1 혼합물이었다. 이 혼합물의 세 가지 상이한 농도(10, 3 및 1㎍/ml)를 이중으로 수직으로 고정화하였다; 하나는 시험 표면으로 하고 다른 것은 NLC 칩 상의 각각의 포획 농도에 대한 기준 표면으로 하였다. 1:10 희석도의 시험 Fab를 25㎕/min 유속에서 300s 동안 각각의 수평 채널 상에 포획시켰다. 2회 내지 3회의 연속 포획을 수행하여 포획 표면을 포화시켰다. 하나의 수평 채널을 기준 채널로 하고, 여기서 비-특이 (비-TNFα 바인더) 상업적 인간 Fab를 사용하여 기준 표면이 시험 표면을 정확하게 모방하도록 표면을 포화시켰다. 분석물 주사 전에, 100㎕/min에서 60s 동안 작용 완충액의 3회 연속 주사를 사용하여 베이스라인을 안정화시켰다. 1st 완충액 주사 후 시스템을 5min 동안 정지시킨 다음 남은 2회 주사를 수행하였다 - 이것은 신호를 신속하게 안정화시키는데 도움을 준다. 500nM의 분석물 (sTNFα)을 25㎕/min에서 120s (2min) 동안 수평으로 주사한 다음 300s (5min) 동안 해리시켰다. 표면을 60s 동안 글리신 pH 2.0을 사용하여 재생시킨 다음 30s 동안 2차 주사를 실시하였다. 센서그램을 적당하게 참조하고 Langmuir 1:1 적합 모델을 사용하여 분석하였다. 수득된 친화도 상수 값 (k a , k d , KD), 및 Rmax 및 χ2와 같은 다른 관련 파라미터를 기록하였다.
도 51은 10개의 항-TNFα SPR 양성 클론의 에피토프 결합의 설계 및 결과의 개략도를 도시한다. 1차 실험에서, 5개의 Fab viz. bT1, bT16, bT38, bT59 및 bT75를 각각 NLC 칩의 수평 채널 1 내지 5 상에 고정화하였다. 표면을 25㎕/min에서 300s 동안 시험 Fab의 3회 연속 주사를 사용하여 포화시켰다. 분석물 (sTNFα)을 수직 방향으로 다음에 주사하여 이들 Fab와 상호작용시키고 각각의 표적 에피토프를 차단하였다. 마지막으로, 동일한 다섯 개의 Fab를 이들 표면 상에 다시 띠우되 이번에는 수직으로 하여 상호작용 패턴을 본다. 2차 실험은 다음 다섯 개의 클론의 세트 viz. bT76, bT77, bT84, bT86 및 bT88을 사용하여 유사하게 실시하였다. 3차 및 최종 실험에서, 이전의 두 가지 세트의 5개 클론을 서로 유사하게 시험하였다. (√) 마크는 양성 SPR 반응을 나타내는 반면 (X) 표시는 음성 SPR 반응을 나타낸다. 각각의 실험 개략도 아래의 표는 클론의 각각의 조합에 대해 생성된 빈(bin)을 보여준다.
도 52는 항-TNF 단클론 Fab bT1, bT59 및 bT88의 SPR 프로파일 및 파라미터의 요약된 도면을 도시한다. 비오티닐화 이가 항-CH1/항-κ 및 항-CH1/항-λ 포획 항체를 이중으로 수직으로 세 가지 상이한 농도(10, 3 및 1㎍/ml)에서 고정화하였다; 하나는 시험 표면으로 하고 다른 것은 NLC 칩 상의 각각의 포획 농도에 대한 기준 표면으로 한다. 1:10 희석도의 시험 Fab를 25㎕/min 유속에서 300s 동안 세 가지 수평 채널(L1, L3 및 L5) 상에 포획시켰다. 2회 내지 3회의 연속 포획을 수행하여 포획 표면을 포화시켰다. 기준 표면 (L2, L4 및 L6)을 비-특이 (비-TNFα 바인더) 상업적 인간 Fab를 사용하여 포화시켜 시험 표면을 정확하게 모방하였다. 분석물 주사 전에, 100㎕/min에서 60s 동안 작용 완충액의 3회 연속 주사를 사용하여 베이스라인을 안정화시켰다. 1차 완충액 주사 후 시스템을 10min 동안 정지시킨 다음 남은 2회 주사를 수행하였다 - 이것은 신호를 신속하게 안정화시키는데 도움을 준다. bT1의 경우 10nM-0.625nM 및 bT59 및 bT88의 경우 1000pM 내지 62.5pM 범위의 sTNFα의 다섯 가지 농도 (상호 희석)를 25㎕/min에서 900s (15min) 동안 수평으로 주사한 다음 900s (15min) 동안 해리시켰다. 표면을 60s 동안 글리신 pH 2.0을 사용하여 재생시킨 다음 30s 동안 2차 주사를 실시하였다. 데이터 분석을 위해, 마지막 세 가지 농도를 고려하였으며, 즉, bT1에 대해 2.5nM-0.625nM를 사용하는 반면 bT59 및 bT88에 대해 사용되는 범위는 250pM 내지 62.5pM이었다. 센서그램을 적당하게 참조하고 Langmuir 1:1 적합 모델을 사용하여 분석하였다. 수득된 친화도 상수 값 (k a , k d , KD), 및 Rmax 및 χ2와 같은 다른 관련 파라미터를 필요에 따라 기록하였다.
도 53은 PfRh5 순도 및 품질 확인을 도시한다. 샘플을 90℃에서 5min 동안 가열하고 2㎍의 각각의 환원된 및 비-환원된 단백질을 150V에서 40min 동안 4-15% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 전기영동시켰다: 겔을 2h 동안 Coomassie Brilliant Blue R-250에서 염색시키고 물: 메탄올: 아세트산 (50:40:10)을 사용하여 2h 동안 탈염색시켰다. M은 Biorad로부터의 Precision plus All Blue SDS-PAGE 마커이다 - NR = 비-환원됨, R = 환원됨.
도 54는 연쇄 스위치 qELISA를 사용한 항-PfRh5 가용성 Fab 스크리닝에 대한 대표적인 데이터를 도시한다. 상부 패널은 클론 번호 193 내지 288을 갖는 Rh5 캠페인의 플레이트 11의 레이아웃을 보여준다. 중간 패널은 람다 검출 항체를 사용한 표준 곡선 및 A450 값을 보여주는 반면 하부 패널은 카파 검출 항체를 사용한 표준 곡선 및 A450 값을 보여준다. 흑색은 고 발현 클론을 나타내고, 진회색은 중간 발현 클론을 나타내는 반면 연회색은 저 발현 클론을 나타낸다.
도 55는 500nM 분석물 농도에서 항-PfRh5의 SPR 양성 클론의 동적 스크리닝 프로파일을 도시한다. 비오티닐화 이가 항-CH1/항-λ 포획 항체를 L1 내지 L3 채널 상에서 3㎍/ml에서 고정화시키고 유사하게 항-CH1/항-κ를 수직 방향으로 NLC 칩의 L4 내지 L6 채널 상에서 고정화시켰다. 1:5 희석도의 다섯 개의 시험 Fab의 세트를 25㎕/min 유속에서 300s 동안 수평 방향으로 한번에 포획하였다. 2회 연속 포획을 수행하여 포획 표면을 포화시켰다. 기준 표면 (6번째 수평 채널)을 비-특이 (비-PfRh5 바인더) 상업적 인간 Fab를 사용하여 포화시켜 시험 표면을 정확하게 모방하였다. 분석물 주사 전에, 100㎕/min에서 60s 동안 작용 완충액의 3회 연속 주사를 사용하여 베이스라인을 안정화시켰다. 1차 완충액 주사 후 시스템을 5min 동안 정지시킨 다음 남은 2회 주사를 수행하였다 - 이것은 신호를 신속하게 안정화시키는데 도움을 준다. 500nM의 PfRh5의 단일 농도를 25㎕/min에서 120s (2min) 동안 모든 6개 수평 채널 상에서 수평으로 주사한 다음 300s (5min) 동안 해리시켰다. 표면을 60s 동안 글리신 pH 2.0을 사용하여 재생시킨 다음 30s 동안 2차 주사를 실시하였다. 센서그램을 적당하게 참조하고 Langmuir 1:1 적합 모델을 사용하여 분석하였다.
도 56은 항-PfRh5 단클론 Fab의 SPR 프로파일 및 파라미터의 요약된 도면을 도시한다. 비오티닐화 이가 항-CH1/항-λ 포획 항체를 L1 내지 L3 상에 3㎍/ml에서 고정화하고 유사하게 항-CH1/항-κ를 수직 방향으로 NLC 칩의 L4 내지 L6 채널 상에 고정화시켰다. 1:5 희석도의 시험 Fab를 네 개의 수직 채널 상에 포획하였다; 람다 클론에 대해서는 L1 및 L2에 반해 25㎕/min 유속에서 300s 동안 카파 클론에 대해서는 채널 L3 및 L4. 2회 연속 포획을 수행하여 포획 표면을 포화시켰다. 기준 표면 (L3 및 L6)을 비-특이 (비-Rh5 바인더) 상업적 인간 Fab를 사용하여 포화시켜 시험 표면을 정확하게 모방하였다. 분석물 주사 전에, 100㎕/min에서 60s 동안 작용 완충액의 3회 연속 주사를 사용하여 베이스라인을 안정화시켰다. 1차 완충액 주사 후 시스템을 10min 동안 정지시킨 다음 남은 2회 주사를 수행하였다 - 이것은 신호를 신속하게 안정화시키는데 도움을 준다. 500nM-31.25nM 범위의 PfRh5의 다섯 가지 농도 (상호 희석)를 600s (10min) 동안 수평 방향으로 주사하였다. 표적 항원에의 결합된 Fab의 해리를 작용 완충액을 사용하여 900s (15min) 동안 실시하였다. 표면을 60s 동안 글리신 pH 2.0을 사용하여 재생시킨 다음 30s 동안 2차 주사를 실시하였다. 데이터 분석을 위해, 센서그램을 적당하게 참조하고 Langmuir 1:1 적합 모델을 사용하여 분석하였다. 수득된 친화도 상수 값 (k a , k d , KD)를 필요에 따라 기록하였다.
도 57은 PfCSP 순도 및 품질 확인을 도시한다. 샘플을 90℃에서 5min 동안 가열하고 5㎍의 각각의 환원된 및 비-환원된 단백질을 150V에서 40min 동안 4-15% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시켰다; 겔을 2h 동안 Coomassie Brilliant Blue R-250에서 염색시키고 물: 메탄올: 아세트산 (50:40:10)을 사용하여 2h 동안 탈-염색시켰다. M은 Biorad로부터의 Precision plus All Blue SDS-PAGE 마커이다 - NR은 비-환원된 것에 대한 것이고, R은 환원된 것에 대한 것이다.
도 58은 연쇄 스위치 qELISA를 사용한 항-PfCSP 가용성 Fab 스크리닝에 대한 대표적인 데이터를 도시한다. 상부 패널은 클론 번호 289 내지 384를 갖는 PfCSP 캠페인의 플레이트 8의 레이아웃을 보여준다. 중간 패널은 람다 검출 항체를 사용한 표준 곡선 및 A450 값을 보여주는 반면 하부 패널은 카파 검출 항체를 사용한 표준 곡선 및 A450 값을 보여준다. 흑색은 고 발현 클론을 나타내고; 진회색은 중간 발현 클론을 나타내는 반면 연회색은 저 발현 클론을 나타낸다.
도 59는 (두 부분 59A 및 59B로서 도시된) 500nM 분석물 농도에서 항-PfCSP의 SPR 양성 클론의 동적 스크리닝 프로파일을 도시한다. 비오티닐화 이가 항-CH1/항-κ 및 항-CH1/항-λ 포획 항체의 1:1 혼합물을 이중으로 세 개의 상이한 농도(10, 3 및 1㎍/ml)에서 수직으로 고정화시켰다. 1:5 희석도의 다섯 개의 시험 Fab의 세트를 25㎕/min 유속에서 300s 동안 수평 방향으로 한번에 포획하였다. 2회 연속 포획을 수행하여 포획 표면을 포화시켰다. 기준 표면 (6번째 수평 채널)을 비-특이 (비-PfCSP 바인더) 상업적 인간 Fab를 사용하여 포화시켜 시험 표면을 정확하게 모방하였다. 분석물 주사 전에, 100㎕/min에서 60s 동안 작용 완충액의 3회 연속 주사를 사용하여 베이스라인을 안정화시켰다. 1차 완충액 주사 후 시스템을 5min 동안 정지시킨 다음 남은 2회 주사를 수행하였다 - 이것은 신호를 신속하게 안정화시키는데 도움을 준다. 500nM의 단일 농도를 25㎕/min에서 120s (2min) 동안 모든 6개 수평 채널 상에서 수평으로 주사한 다음 300s (5min) 동안 해리시켰다. 표면을 60s 동안 글리신 pH 2.0을 사용하여 재생시킨 다음 30s 동안 2차 주사를 실시하였다. 센서그램을 적당하게 참조하고 Langmuir 1:1 적합 모델을 사용하여 분석하였다.
도 60은 항-PfCSP 단클론 Fab의 SPR 프로파일 및 파라미터의 요약된 도면을 도시한다. 비오티닐화 이가 항-CH1/항-κ 및 항-CH1/항-λ 포획 항체의 1:1 혼합물을 수직 방향으로 NLC 칩 상에 이중으로 세 가지 상이한 농도 (10, 3 및 1㎍/ml)에서 고정화시켰다. 1:5 희석도의 시험 Fab를 25㎕/min 유속에서 300s 동안 다섯 개의 수직 채널 (L1 내지 L5) 상에 포획시켰다. 2회 내지 3회 연속 포획을 실시하여 포획 표면을 포화시켰다. 기준 표면 (L6)을 비-특이 (비-PfCSP 바인더) 상업적 인간 Fab를 사용하여 포화시켜 시험 표면을 정확하게 모방하였다. 분석물 주사 전에, 100㎕/min에서 60s 동안 작용 완충액의 3회 연속 주사를 사용하여 베이스라인을 안정화시켰다. 1차 완충액 주사 후 시스템을 5min 동안 정지시킨 다음 남은 2회 주사를 수행하였다 - 이것은 신호를 신속하게 안정화시키는데 도움을 준다. 500nM-31.25nM 범위의 PfCSP의 다섯 가지 농도 (상호 희석)를 600s (10min) 동안 수평 방향으로 주사하였다. 표적 항원에의 결합된 Fab의 해리를 작용 완충액을 사용하여 900s (15min) 동안 실시하였다. 표면을 60s 동안 글리신 pH 2.0을 사용하여 재생시킨 다음 30s 동안 2차 주사를 실시하였다. 데이터 분석을 위해, 센서그램을 적당하게 참조하고 Langmuir 1:1 적합 모델을 사용하여 분석하였다. 수득된 친화도 상수 값 (k a , k d , KD)를 필요에 따라 기록하였다.
본 발명은 대형 항체 파지 디스플레이 라이브러리, 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는 방법 및 다양한 항원을 스크리닝하여 상기 항원에 대한 제조 가능한 항체를 수득하는 방법을 개시한다.
본 발명은 표적에 대한 높은 친화도 및 높은 특이성을 갖는 결합 화합물을 확인하는 기회를 상당히 증가시키는 Fab 포맷의 다양한 대형 라이브러리를 개시한다. 또한, 본 발명은 최소 서열 조작으로 표적-특이 가용성 Fab의 용이한 단리를 제공한다. 본 발명에서 Fab는 검출 및 제조하고 추가로 임상적 또는 진단적 목적을 위해 사용하기에 보다 용이한 출력으로서 대장균 주변세포질에서 자기-접힌 단백질로서 발현된다. 본 발명은 리드 단클론의 패닝 및 확인을 위해 라이브러리를 작제하는 공정이 몇 주 내에 수행될 수 있기 때문에 속도 및 비용-효과의 이점을 제공한다. 따라서, 본 발명은 제조 가능한 항체를 수득하기 위한 고 충실도 제조방법이며 다양한 항원을 스크리닝하여 이러한 항체를 조절된 방식으로 수득하는 방법을 확립한다.
본 발명은 파지 상에 디스플레이된 항체 단편의 대형 레퍼토리로부터 출발하는 일련의 단계화된 평가로서 정렬된 제조를 위한 사전-설정된 중요 품질 속성을 매치하는 항체 발견 방법을 개시한다 - 이 방법은 하기 실시예에서 예시되고 논의된다. 본 발명의 이익은 파지 디스플레이된 항체 단편을 포함하며, 디스플레이를 위해 항체 단편을 또한 사용하고 수용성 단백질과 특히 고속 처리 포맷(high throughput format)으로 계획된 평가의 동일한 엄격한 요건에 적용되는 효모 디스플레이 또는 세균 디스플레이와 같은 다른 생체내 디스플레이 시스템으로 확대될 수 있다.
항체 발견에 있어서의 CQA : 산업적 항체 발견 및 제조는 공정 전반에 걸친 단백질 산물의 모니터링을 필요로 한다(Alt N et al., 2016; Kepert JF et al., 2016). 즉, 치료적 표적에 대해 사전-정의된 결합, 활성화, 효능적 또는 접합 표현형(문헌[Labrijn AF et al., 2008]에 검토됨)은 이러한 표현형을 책임지는 중요 품질 속성(Critical Quality Attribute; CQA)이 가능한 빨리 정의될 수 있도록 단백질 잔기에 할당 가능해야 한다. 이러한 정의는 통상적으로 친화도, 표적에 대한 특이성, 및 공통 목적으로서 생물학적 기능성의 평가를 포함하며, 생산성, 응집 경향, 열역학적 안정성(Thiagarajan G et al., 2016) 및 잠재적인 면역원성(Hai S-H et al., 2009. Immunogenicity screening using in silico methods: Correlation between T-Cell epitope content and clinical immunogenicity of monoclonal antibodies. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic)의 추가의 평가를 포함할 수 있으며, 이들 모두는 물에 용해된 단백질로서의 항체의 거동에 직접적으로 할당 가능한 특성이거나 이들의 구조적 특성에 내재한다. 따라서, 이러한 초기 단계 CQA를 정의하는 의도는 표적화된 및 관찰된 표현형 뿐만 아니라 관찰된 표현형 및 기본 유전자형 간의 불일치에서 본질적인 위험을 가능한 빨리 완화시키려는 것이다. 본 발명은 나이브 인간 파지 디스플레이 라이브러리 플랫폼으로부터 발견된 항체에 대해 이러한 목적을 달성하는 방법을 입증한다.
치료적 또는 진단적 항체 용법은 항체를 발견하기 위해 이용 가능한 포맷에 따라 크게 좌우된다. 역사적으로, 항체 발견은 비-인간 숙주 종을 면역화하여 혈청으로부터 다클론 항체를 생성하거나(von Behring EA and Kitasato S, 1890), 또는 하이브리도마 기술에 의해 단클론 항체를 생성함(Kohler G and Milstein C, 1975)으로써 가능해졌다. 따라서, 면역화에 의한 항체 발견의 방법은 면역화의 생물학에 있어서의 불확실성에 의존하며 전장 비-인간 IgG 만을 야기한다. 이러한 비-인간 IgG는 우리의 면역계에 의해 이물로서 인지되어 반복된 사용 후 치료적 이익을 중화시키는 안티-종 항체를 야기하기 때문에 통상적으로 인간 사용을 위해서는 적합하지 않다(Chester KA and Hawkins RE, 1995; Glennie MJ and Johnson PWM, 2000). 따라서, 비-인간 면역화 경로에 의해 생성된 항체는 인간 불변 도메인 상에 항원-인지 가변 도메인을 이식하거나(-ximabs; Liu AY et al., 1987) 인간 가변 영역 상에 상보-결정 영역을 이식하는(-zumabs; Jones PT et al., 1986; Carter P et al., 1992) 기술이 산업 선구자들에 의해 개발되기 전까지 수 년 동안 연구 또는 진단 시약으로서 단지 유용할 뿐이었다. 인간 Ig 유전자좌에 대한 이식 유전자를 가진 마우스의 사용(Bruggemann M and Taussig MJ, 1997; Green LL, 1999; Lonberg N, 2008; Dechiara TM et al., 2009)이 오늘날 면역화로부터 치료적 단클론 항체를 생성하기 위한 비-인간 Ig 기원의 문제를 대부분 우회하였으며 몇몇 항체들이 이러한 기술로부터 현재 판매되고 있다(Panitumumab aka Vectibix®, Golimumab aka Simponi®, Canakinumab aka Ilaris®, Ustekinumab aka Stelara®, Ofatumumab aka Arzerra®, 및 Denosumab aka Xgeva/Prolia®). 그럼에도 불구하고, 이러한 인간 항체 생성 방법은, 특히 인간 및 설치류 간의 아미노산 서열에 고도로 보존된 독성 항원 또는 단백질 표적에 관한 한, 여전히 면역화의 불확실성이 적용된다(Frenzel A et al., 2016).
전장 IgG는 Fc 도메인으로 암호화된 특성들 덕분에 혈중 순환의 긴 반감기 또는 면역 효과기 세포와 맞물리는 능력 또는 둘 다의 내재된 이익을 가지며, 따라서 다수의 치료적 시나리오에서 설계에 의해 구조적 CQA 이점을 갖는다. 추가의 이점은 이와 같은 IgG가 분비 단백질로서 발견되며, 단백질 자체에의 표현형 품질의 속성 및 이러한 단백질에의 CQA의 할당이 간단하다는 사실에 담겨 있다. 표현형을 기본 유전자형에 연결시키는 것은 제조 불변성을 위한 중요한 지식이며, 또한 정기적으로 하이브리도마에 의해 분비되는 항체에 대해 기술적으로 실행 가능하지만(Bradbury A, 2010. Cloning hybridoma cDNA by RACE. In: Antibody Engineering; Vol. 1), 이것은 일상적인 사용을 위해 생체내 다수의 B-세포에 의해 분비되는 다클론 종에 대해서는 만만찮은 기술적 문제로 남아 있다(Meijer PJ et al., 2006; Tiller T et al., 2008).
생체내 또는 시험관내에서 항체 단편을 디스플레이할 수 있는 시스템의 출현으로, 면역화의 예상 밖의 변화(항원 독성, 항원 상동성, 반응의 부족)를 우회하는 것이 가능해졌으며 발견을 위한 포맷이 더 이상 전장 IgG에만 국한되지 않는다. 이러한 시스템은 재조합 DNA 기술의 힘에 의존하며, 이것은 본질적으로 Ig 단백질 구조에 고유한 모듈성 뿐만 아니라 이들의 게놈 기원을 이용하여 다양한 형태로 시험관내 면역글로불린 유전자의 항원 인지 요소를 재조합한다. 이러한 유전자의 공급원은 천연 또는 합성일 수 있다. 원핵생물 또는 진핵생물 기원의 숙주 세포에서의 이러한 다양한 V-도메인 순열의 적합한 포획 및 후속적인 발현 및 디스플레이시, 이러한 재조합 포맷이 시험관내에서 항원에 결합할 수 있으며, 그후 이러한 바인더가 단리되고 쉽게 서열분석되어 결합 표현형을 유한 유전자형에 할당할 수 있다. 따라서, 용이한 표현형-대-유전자형 연결의 가능성은 단백질로서의 바인더에의 총 CQA의 할당의 가능성을 허용한다. 본원에 인용된 실시예들은 파지 디스플레이로서 항체를 수득하는 것에 관한 한, 이러한 할당은 분명하지 않으며 발명될 필요가 있음을 기술한다.
본 발명은 면역글로불린 단편이 대장균 주변세포질에서 분비 단백질로서 발견될 수 있고, 단백질 자체에 대한 표현형 품질의 속성을 가능케 하는 방법을 개시한다. 본 발명은 표현형을 기본 유전자형에 연결시키며, 이것은 제조 불변성을 위한 중요한 지식이다.
본 발명은 또한 동적 순위매김 후 이렇게 수득된 항체에서 >90%의 표현형 대 유전자형 상관도를 초래하도록 다음의 단계를 포함하는 정의된 순서로 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 가용성 Fab로서 제조 가능한 항체를 수득하는 방법을 개시한다:
i) 표적 특이 패닝 단계;
ii) 주변세포질 qELISA 단계;
iii) 동적 순위매김 단계;
iv) 생물검정 단계;
v) 제조능 평가 단계.
파지 디스플레이 기술은 다섯 가지 핵심 아이디어에 기초한다: (a) 박테리오파지는 숙주 세균에서 형질도입되는 경우 이들의 외피 단백질에 융합된 이종 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현할 수 있고; (b) 다수의 이러한 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 고려하여, 선택되는 외피 단백질 상에 이러한 모든 변이체를 디스플레이하는 재조합 파지의 라이브러리가 생성될 수 있으며; (c) 파지의 이러한 라이브러리는 시험관내에서 표적 분자에 결합(인지)하는 능력을 위해 집단으로 스크리닝될 수 있고; (d) 바인더는 사금으로부터 모래를 씻어내는 것과 유사한 공정으로 이들을 씻어냄(패닝)으로써 비-바인더로부터 분리될 수 있으며, (e) 단리된 바인더는 이의 게놈 내에 암호화된 변이체의 서열에 대해 분석될 수 있다. 이의 개념화(Smith GP, 1985) 이래로, 이 기술은 항체 발견, 에피토프 매핑, 단백질 상호작용 부위 매핑, 효소 기질 발견 및 분자 진화를 포함한 다양한 조사를 위해 매우 귀중한 것으로 판명되었다(문헌[Burton DR, 1995; Azzazy HM and Highsmith WE, 2002]에 검토됨).
본 발명은 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 항체를 수득하는 방법을 개시하며, 여기서 패닝은 4 내지 37℃ 범위의 다양한 온도에서 1h 내지 16h 범위의 다양한 길이의 시간 동안 고체 또는 용액 상에서 수행된다. 고체 상 패닝은 다음의 단계들을 포함할 수 있다:
i) 하전된 폴리스티렌과 같은 고체 표면 상에 소정의 항원에 대한 최대 피복 농도를 최적화하는 단계;
ii) 파지미드 라이브러리를 파지 포맷으로 전환시키는 단계;
iii) 선택된 표면을 단계(i)에서 결정된 바와 같은 최적 농도의 항원으로 피복시킨 다음 단백질 또는 비-단백질 분자로 차단하여 비-특이 부위를 차단하는 단계;
iv) 비차단된 폴리스티렌 표면 상에 단계(ii)에서 수득된 바와 같은 파지 혼주물을 사전-흡착시켜 플라스틱 바인더를 제거하는 단계;
v) 단계(iv)로부터의 사전-흡착된 파지를 고정화된 표적 항원(단계 iii)과 정의된 기간 동안 배양하는(incubating) 단계;
vi) 수 차례 세척하여 단계(v)로부터의 비결합 파지를 제거하는 단계;
vii) 호박 코돈 억제자 뿐만 아니라 비-호박 코돈 억제자(non-amber suppressor) 숙주에서 트립신 소화 및 동시 형질도입에 의해 단계(v)로부터의 결합된 파지를 용출시켜 파지 역가(phage titer)를 수득하는 단계;
viii) 다음 차례의 패닝을 위해 호박 코돈 억제자 숙주에서 형질도입에 의해 단계 (vii)로부터의 용출된 파지를 증폭시키는 단계;
ix) 감소된 항원 농도를 사용하고 단계 (iii) 내지 (viii)을 반복함으로써 다음 차례의 패닝을 수행하여 표적 특이 항체 집단을 풍부화시키는 단계;
x) 단계 (vii) 내지 (ix)를 반복하는 단계;
xi) 표적 특이 ELISA를 사용하여 수 차례의 패닝에 걸쳐 결합의 풍부화에 대해 단계 (vii) 및 (x)로부터의 용출된 파지를 평가하는 단계.
용액 상 패닝은 다음의 단계들을 포함할 수 있다:
xii) 소정의 항체의 최적의 비오티닐화를 위한 반응 조건을 최적화하여 <10, 바람직하게는 1-5의 비오틴 대 단백질 몰 비를 달성하는 단계;
xiii) 파지미드 라이브러리를 파지 포맷으로 전환시키는 단계;
xiv) 단계(ii)에서 수득된 파지를 단백질 또는 비-단백질 분자로 차단하여 스트렙트아비딘 비드 세척과 동시에 정의된 기간 동안 비-특이 부위를 차단한 다음 비드를 단백질 또는 비-단백질 분자로 차단하여 비-특이 부위를 차단하는 단계;
xv) 단계(xiii)로부터의 차단된 파지를 정의된 기간 동안 가용성 표적 비오티닐화 항원(단계 xii)과 배양하는 단계;
xvi) 단계(xiv)에서 수득된 파지-항원 복합체를 예비-차단된 스트렙트아비딘 비드와 배양하는 단계;
xvii) 단계(xv)에서 항원-파지 접합체에 결합된 비드를 수 차례 세척하여 비결합 파지를 제거하는 단계;
xviii) 호박 코돈 억제자 뿐만 아니라 비-호박 코돈 억제자 숙주에서 DTT 또는 트립신 소화 및 동시 형질도입에 의해 단계(xvi)에서의 결합된 파지를 용출시켜 파지 역가를 수득하는 단계;
xix) 다음 차례의 패닝을 위해 호박 코돈 억제자 숙주에서 형질도입에 의해 단계(xviii)로부터의 용출된 파지를 증폭시키는 단계;
xx) 감소된 항원 농도를 사용하고 단계(xiv) 내지 (xviii)을 반복함으로써 다음 차례의 패닝을 수행하여 표적 특이 항체 집단을 풍부화시키는 단계;
xxi) 단계 (xix) 내지 단계 (xx)을 반복하는 단계;
xxii) 표적 특이 ELISA를 사용하여 수 차례의 패닝에 걸쳐 결합의 풍부화에 대해 단계 (xviii) 및 (xxi)로부터의 용출된 파지를 평가하는 단계.
파지 디스플레이 기술 내에 담긴 매우 중요한 개념은 재조합 파지 내의 암호화된 유전자형에의 결합 표현형의 물리적 연결이다. 이에 반해, cDNA 발현 라이브러리가 또한 다수의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있지만, 집단-기반 스크리닝 후의 특정 클론의 표현형은 단지 클론의 평행 마스터 세트(parallel master set)에서 수행된 별도의 조사 단계 후 이의 암호화된 유전자형에 연결될 수 있다(hybridization with radiolabeled probe and colony picking, for example; Sambrook J and Russell DW, 2001a. Preparation of cDNA libraries and gene identification. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 2). 따라서, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 수득될 수 있는 속도 및 처리량이 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것에 비해 비교가 안될 정도로 빠르고 높다.
그러나, 항체를 단백질로서 평가하는 것에 관한 한, 디스플레이 기술은 원칙적으로 다음으로 인해 이의 힘을 잃는다; 발견된 실체를 단백질로서 평가해야 한다(must-assess-discovered-entity-as-protein)는 산업적 제안은 cDNA 라이브러리와 동일한 장점 또는 단점 수준을 야기한다. 게다가, 단백질의 변이체 집단의 개개의 평가를 위해 오늘날 가능하고 항체 발견을 위해 정기적으로 하이브리도마로부터의 분비 IgG에 적용되는 고속 처리(Hay FC and Westwood OMR, 2002. Preparation of human B-cell hybridoma. In: Practical Immunology)가 파지 디스플레이된 항체에 사용하기에 가능하지 않다. 파지 디스플레이 기술을 사용한 고속 처리에 대한 주요 장애물은 성장하는 세균 배양물을 감염성 파지로 형질도입한 다음 증폭된 파지를 수확해야 하는 필요성이며, 이것은 파지로부터 세균을 분리하기 위한 원심분리, 파지를 농축시키기 위한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개된 침전의 2차 단계에 이어 임의의 결합 표현형을 평가하기 시작하기 전에 임의의 세균 오염을 제거하기 위한 반복된 세척을 포함한다. 반대로 이 공정에 들어가기 위해서는, 하이브리도마를 96-웰 플레이트에서 배양하고 원심분리하여 상청액을 수집할 수 있으며, 이것을 결합 표현형에 대해 직접 평가할 수 있다(Green LL, 1999).
부차적이지만 중요한 장애물은 설계에 의해, 파지 디스플레이된 항체가 N- 또는 C-말단에서 훨씬 더 큰 파지 입자에 연결된다는 사실에 있다. 발견된 항체 단편에 대한 이러한 큰 "태그"의 존재는 여러 보고서에서 문서화된 바와 같이 결합의 기본 표현형에 영향을 미친다는 것을 확실히 예측할 수 있다(Lou J et al., 2001; Chowdhury PS, 2002. Targeting random mutations to hotspots in antibody variable domains for afnity improvement. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols; Pavoni E et al., 2007). 파지 생물학의 내재된 한계는 (a) 전혀 항체 단편을 디스플레이하지 못하고(Winter G et al., 1994; Azzazy HM and Highsmith WE, 2002; Hust M et al., 2009. Antibody phage display. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic), (b) 재조합체 게놈의 예상된 크기에 비해 크기가 더 짧고(de Bruin R et al., 1999; Lowe D and Vaughan TJ, 2009. Human antibody repertoire libraries; In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic), (c) 항체 디스플레이 재조합체 만을 증폭시키는 실험 목표와는 반대로 최대 성장 이점을 갖는(de Bruin R et al., 1999; Loset GA et al., 2005; Lowe D and Vaughan TJ, 2009. Human antibody repertoire libraries; In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic) 대부분의 클론의 증식을 초래한다. 이러한 내재된 오류는 유전자형-표현형 연결의 원리로부터 예상되는 바와 같이 표적 항원에 대한 단클론 파지의 결합 능력이 동일 클론으로부터 생산된 단백질 항체의 결합 능력에 반영되지 않는 상황을 초래할 수 있다(Vaughan TJ et al., 1996; Chowdhury PS, 2002. Targeting random mutations to hotspots in antibody variable domains for afnity improvement. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols; US 6,794,128; Pavoni E et al., 2007). 본원에 인용된 실시예는 이러한 현상을 매우 상세하게 기술하며, 공정의 위험을 인지하여 이를 우회할 수 있는 방법을 발명하는 것을 필요로 한다.
파지-항체 융합에 의해 나타나는 결합 표현형이 파지 태그 없이 발현되는 경우 단백질로서의 항체에 의해 반영될 수 없는 위험을 완화시키는 일반적인 방법은 바인더의 게놈이 발현 가능한 개방형 해독틀(ORF)을 나타내는지를 알아보는 것이다 - 통상적으로 서열분석(sequencing)에 의해 달성된다(Buckler DR et al., 2008). 자동화의 중요한 진전에도 불구하고, 이러한 접근법은, 클론 평가에 매우 유용하기는 하지만, 여전히 노동-집약적이고 고속 처리 방법으로 해석될 수 없다. 게다가, 서열분석 자체는 항체 ORF가 발현 가능할지를 보장하지 못한다. 어떤 종류의 항체 ORF가 세균 및 포유류 세포에서 발현 가능한지에 대한 규칙이 제안된 바 있으며(Ewert S et al., 2004; Rothlisberger D et al., 2005) 합성 항체 라이브러리는 오늘날 이들의 성공을 위해 이러한 규칙에 의존한다(Knappik A et al., 2000; Rothe C et al., 2008; Prassler J et al., 2011; Tiller T et al., 2013). 이러한 어떠한 결정 규칙도 나이브 또는 면역 파지 디스플레이 라이브러리를 나타내는 V-도메인의 무작위 조합으로부터 유도되는 바인더에 대해 확실히 가능하지는 않다. 따라서, 본 발명은 하이브리도마 배양물로부터 분비된 IgG의 고속 처리 평가와 유사한 세균으로부터 분비된 단백질로서의 항체 단편의 평가를 가능하게 하는 방법을 개시한다. 본원에 개시된 바와 같은 이러한 방법은 고속 처리를 가능하게 하는 인자들 중의 하나이다. 특정 선행 기술이 이러한 방법들을 개시하지만(Winter G et al., 1994., Kirsch M et al., 2005; Loset GA et al., 2005; Petropoulos K, 2012. Phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols; Rader C, 2012a. Selection of human Fab libraries by phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols), 이러한 방법들은 이 접근법으로부터 예상되는 유전자형-표현형 해리의 추가의 해결책을 제안하지 못한다. 따라서, 본원에 인용된 실시예들은 관찰된 표현형을 기본 유전자형에 할당하는 능력을 유지하면서, 일제히 스크리닝할 때에는 파지 디스플레이 기술(유전자형-에-연결된-표현형)의 본질적인 힘을 계속해서 이용하지만, 각 클론의 표현형(유전자형으로부터 연결을 끊은 표현형)을 스크리닝할 때에는 항체를 단백질로서 분석하는 생화학적 원리를 이용하는 신규한 단계화된 평가 시스템을 기술한다.
본 발명의 방법은 파지에 의해 디스플레이될 수 있지만 또한 물 중에서 단리된 단백질로서 안정한 항체의 포맷에 관한 이론 및 방법, 및 다른 인자들 및 방법들 중에서도 이러한 형태를 단백질로서 분비하는 숙주 세균의 능력을 실험하여 확립함으로써 목표를 달성한다. 단백질로서의 scFv는 수성 환경에 있는 경우 Fab에 비해 일반적으로 덜 안정하고 더 응집되는 경향이 있는 것으로 알려져 있지만(Weidner KM et al., 1992; Holliger P et al., 1993; Kortt AA et al., 1997; Quintero-Hernandez V et al., 2007), 신중한 연구들은 이것이 VL- 및 VH-도메인의 소정의 조합에 의해 지시되는 부수현상임(Rothlisberger D et al., 2005)을 시사할 뿐만 아니라 Fab의 비접힘 동력학이 임의의 본질적으로 향상된 열역학적 안정성보다는 다소 느리다는 사실을 시사한다(Honegger A, 2008). Fab는 scFv보다 더 높은 고유 안정성을 갖기 때문에, 본 발명은 상기 라이브러리의 작제를 위한 Fab의 사용을 개시한다. Fab 또는 페길화 Fab는 치료 구조로서 직접적으로 작용할 수 있기 때문에 Fab의 사용은 더욱 유리하며, 이것은 발견과 제조 간의 시간을 단축시키는데 있어서의 이득을 고려하는 경우 바람직하다. 이와 달리, scFv는 혈액 순환에서의 이들의 짧은 수명으로 인해 단지 진단제 또는 접합 치료제로서 작용할 수 있으며(Chames P et al., 2009), 따라서 대안적인 치료적 사용을 위해서는 일반적으로 재-포맷될 필요가 있다. 따라서 발견과 제조 사이의 속도 저하가 상당할 수 있다. 게다가, Fab의 구조 요소를 고려하는 경우, Fab에서 VL-VH 계면에 의해 생성된 파라토프(결합 표면)는 천연 단백질 상호작용 도메인인 반면 scFv에서 VL-VH 계면에 의해 생성된 것은 링커 길이에 의해 제약되고 따라서, 인공적이다(Kortt AA et al., 1997). 따라서, 특정 항원에 대한 Fab에 의해 나타내어지는 친화도는 천연 VL-VH 계면에 의해 구동되는 반면 scFv에 의해 나타내어지는 친화도는 비천연의 것에 의해 구동되며, 이것은 Fab 또는 IgG 포맷으로의 후보 scFv의 재포맷 동안 예측할 수 없는 결과를 가질 수 있다. 치료적 IgG 포맷으로의 Fab 재포맷은, 다른 한편으로, 안정성 이득으로부터 실제로 유익할 것이다(Casadevall A and Janda A, 2012).
숙주 세균이 단백질로서 이러한 안정한 형태를 분비할 수 있게 하기 위해, 본 발명은 유리하게는 주변세포질 공간을 사용하여 파지 생산을 지시하는 파지 디스플레이 기술에 고유한 설계를 사용한다(Webster R, 2001. Filamentous phage biology. In: Phage Display: A Laboratory Manual). 본 발명은 항체 단편에 대한 성장하는 세균 재조합체로부터의 주변세포질 추출물을 Fab의 존재, 부재 및 상대적 수율에 대해 실험할 수 있는 하이브리도마형 스크린(hybridoma-like screen)을 개시한다 - 이것은 본 발명의 충실도를 상실하지 않으면서 고속 처리를 가능하게 한다. 발현된 scFv의 정량적 분석을 위한 주변세포질 웨스턴의 적용이 선행 기술에 보고된 바 있지만(Loset GAet al., 2005; Eisenhardt SU and Peter K, 2010. Phage display and subtractive selection on cells. In: Antibody Engineering; Vol. 1), 본 출원은 패닝된 Fab 디스플레이 라이브러리로부터 단백질로서 Fab를 스크리닝하는 방법을 처음으로 개시한다. 이러한 접근법은 또한 두 개의 상이한 시스트론(경쇄 및 중쇄)에 대한 두 개의 상이한 주변세포질 리더의 표준 Fab 설계가 주변세포질에서 발현되는 이형이량체성 Fab 단백질을 실제로 야기하는지의 중대한 검증을 가능케 한다. 따라서, 이러한 접근법의 이점은 합당한 검출 수준으로 존재하는 기능적 Fab 단백질을 수득하는데 주의와 노력을 집중하며, 초기 발견 단계에서는 낮은 검출 수준으로 있는 클론을 거부한다는 것이다. 그러나, 대장균 주변세포질에서 인간 Fab를 가용성 단백질로서 발현하는 이러한 접근법은 낮은 수율을 유발할 수 있다(Better M et al., 1993; Humphreys DP, 2003). 낮은 수율에 대한 근접 원인은 주변세포질에서의 미스폴딩(Skerra A and Pluckthun A, 1991; Humphreys DP, 2003) 및 이러한 미스폴딩된 폴리펩타이드, 특히 경쇄를 소화시킬 수 있는 주변세포질 프로테아제의 존재(Chen C et al., 2004)를 포함한다. 미스폴딩의 원위 원인은 숙주 및 게스트 종 간의 차등 코돈 사용빈도의 내재된 제한, 뿐만 아니라 계열-특이 VL-VH 계면 안정성 특성을 포함할 수 있다(Ewert S et al., 2004, Tiller T et al., 2013).
합성 라이브러리 구성을 위해 대장균 주변세포질에서 Fab 또는 Fab' 수율을 증가시키거나 다운스트림 목적을 위해 수 그램의 단백질을 제조하는데 특정 방법들이 이용 가능하지만, 선행 기술의 방법들 대부분은 특정한 제한을 가지며(Humphreys DP and Bowering L, 2009. Production of antibody Fab' fragments in E. coli. In: therapeutic Monoclonal Antibodies: from Bench to Clinic; US 8,062,865; Tiller T et al., 2013), 초기 발견 단계에 나이브 라이브러리로부터 수 백 개의 Fab를 단백질로서 스크리닝하는데 적용할 수 있는 것은 아무것도 존재하지 않는다. 본 발명은 향상된 화학발광 기반 웨스턴(1-3 pg/밴드)을 위한 검출 한계에서 주변세포질에서 이형이량체성 Fab를 생산하지 않는 클론을 제거하기 위한 주요 표현형 스크린으로서 이러한 평가를 처음으로 개시한다. 따라서 본 발명은 일부 항원 특이 바인더를 소실할 가능성은 있지만 유리하게는 시간과 비용 측면에서 유익하며 불량하게 발현된 클론을 취급할 필요성의 단점을 극복한다. 이러한 게이트의 또 다른 이점은 항-인간 카파 및 람다-특이 항체로의 동시 면역블롯팅에 의해 이러한 주변세포질 히트를 타이핑하여, 패닝이 혼합된 카파 및 람다 라이브러리로 수행되는 경우에 이러한 클론을 서열분석할 필요를 방지한다는 것이다.
본 발명은 항원-특이 Fab 단백질 바인더를 높은 충실도로 수득하는데 있어서의 제한을 극복할 수 있는 최적 세트의 방법 및 프로토콜에 도달하기 위한 방법/공정을 개시한다. 위에 기술된 초기 접근법의 한계는 주변세포질에 존재하는 것으로 발견되고 이형이량체인 것으로 추정되는 항체가 다수의 경우에 경쇄 또는 중쇄에 대해 실제로는 동형이량체였다는 것이었다. 상기 한계는 이형이량체성 Fab를 생산할 것 같은 클론을 동정하기 위한 ELISA 개발을 위해 2-사이트 개념(2-site concept)을 사용함으로써 극복되었다(Harlow E and Lane D, 1988. Immunoassays. In: Antibodies: A Laboratory Manual; Lawson ADG et al., 1997). 본원에 포함된 실시예는 본 출원이 이형이량체성 Fab를 생산하는 클론을 동형이량체성 Fab를 생산하는 클론과 구별할 수 있을 뿐만 아니라 질량 Fab/용적 측면에서 수율을 정량으로 추정하려는 매우 중대한 목적을 달성할 수 있게 하는 신규한 연쇄-스위치 ELISA 시스템을 개발하도록 기본적인 2-사이트 개념을 확대시켰음을 입증한다. 이러한 획기적인 개선은 웨스턴에 의한 정량적 평가의 초기 시스템으로부터의 주요한 진보이며 본 출원의 발명 가치들 중의 하나를 입증한다.
본 발명은 패닝된 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 항체를 수득하는 방법을 개시하며, 여기서 주변세포질 qELISA는 다음의 단계들을 포함한다:
i) 용출물 역가 플레이트로부터의 단일 세균 클로니로부터 가용성 Fab를 수득하는 단계;
ii) 96-웰 충전된 폴리스티렌 플레이트의 표면을 중쇄에 대한 포획 항체로 피복시키는 단계;
iii) 단계(ii)의 피복된 표면 상에 단계(i)로부터의 가용성 Fab를 포획하는 단계;
iv) 경쇄 특이 항체의 사용에 의해 경쇄를 검출하여 전장, 탠덤 인-프레임, 이형이량체성, 가용성 Fab를 동정하는 단계.
게다가, ELISA 포맷에서의 Fab 단백질 평가의 개발은 패닝 캠페인으로부터의 바인더의 혼주물로부터의 잠재적인 바인더 클론이 96-웰 플레이트에서 성장할 수 있게 됨에 따라 즉시 고속 처리를 가능케 하며, 이러한 배양물은 주변세포질(Kontermann RE, 2010. Immunotube selections. In: Antibody Engineering; Vol. 1; Hust M and Mersmann M, 2010. Phage display and selection in microtitre plates. In: Antibody Engineering; Vol. 1; Petropoulos K, 2012. Phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols), 원 위치에서 단순 용해에 의해 수확된 주변세포질(W01/94585; Humphreys DP and Bowering L, 2009. Production of antibody Fab' fragments in E. coli. In: Therapeutic 단클론 Antibodies: From Bench to Clinic), 및 하이브리도마 배양 상청액과 유사한 동일한 96-웰 포맷에서 단백질로서의 Fab의 평가를 위해 수확된 상청액에서 Fab를 생산하도록 유도한다. 이러한 마스터 배양액의 복제물(replica)은 글리세롤 스톡으로서 동결된 채로 저장될 수 있으며(Petropoulos K, 2012. Phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols; Protocol: Use of Glycerol Stocks and Preparation of Transfection-Quality Plasmid DNA; Broad Institute, Boston, MA, 2015.), 바람직한 단백질 특성을 갖는 클론이 가장 쉽게 재성장하고 심문한다. 이러한 단계들 중 어느 것도 파지 디스플레이의 추가의 개입을 필요로 하지 않는다.
본 발명은 패닝된 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 가용성 Fab를 수득하는 방법을 개시하며, 여기서 가용성 Fab를 수득함은 다음의 단계들을 포함한다:
i) 비-호박 코돈 억제자 숙주의 역가 플레이트로부터 단일 클론을 선발하고 37℃ 및 250 rpm에서 밤새 성장을 위해 96-웰 딥웰 플레이트에서 액체 배양시키는 단계;
ii) 밤샌 배양물을 10배 희석시키고 (i)과 동일한 조건하에서 대수기(log phase)로 성장되도록 하는 단계;
iii) 단계(ii)에서의 대수기 배양물을 1mM IPTG로 유도하고 30℃ 및 250 rpm에서 밤새 성장되도록 하는 단계;
iv) 단계(iii)에서의 배양물을 96-웰 플레이트에서 원심분리하여 유도된 세포를 펠렛화하는 단계;
v) 완충액-현탁된 세포를 동일한 96-웰 플레이트에서 30℃에서 밤새 서서히 진탕시키면서 완충 용액 중의 고 농도의 EDTA를 사용함으로써 단계(iv)에서의 펠렛화된 세포를 주변세포질 추출하는 단계;
vi) 원심분리하여 단계(v)에서의 확산된 주변세포질 분획을 스페로플라스트 및 세포 파괴물로부터 분리하는 단계.
선행 기술은 솔루션 패닝 캠페인으로부터 바인더 혼주물을 수득한 후 가용성 단백질로서의 단클론 Fab의 특정한 고속 처리 스크리닝을 개시한다(Petropoulos K, 2012. Phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols; Rader C, 2012a. Selection of human Fab libraries by phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols). 그러나, 문헌[Petropoulos K, 2012]에 기술된 프로토콜이 가진 주요 단점은, 가용성 Fab로서 스크리닝하기 전에 발현 벡터로의 혼주물로서 잠재적인 단클론 바인더의 파지미드 DNA의 재-클로닝을 필요로 한다는 것이다. 이러한 요건은 확실히 속도의 상당한 감속에 더하여 서브클로닝 과정 동안 바인더를 소실할 가능성을 초래할 것이다. 게다가, 프로토콜은 세포질 분획으로부터 주변세포질 분획을 분리하기 위한 어떠한 노력도 하지 않으며, 이것은 Fab의 주변세포질 전좌 특성이 검증될 수 없는 한 단점이다. 마지막으로, 선행 기술 프로토콜은 Fab 수율을 정량하기 위해서가 아니라 검출하기 위해 항-Fab 다클론 항체를 사용한다. 이에 반해, 본 출원의 발명은 (a) 중쇄 및 gIII 사이에 호박 중지 코돈 및 비-호박 코돈 억제자 숙주의 사용을 이용함으로써 바인더 혼주물의 재-클로닝을 필요로 하지 않고(또한 이러한 맥락에서 pSSY1에 대한 부분 참조), (b) 대장균 분획의 나머지로부터 주변세포질 분획의 분리를 가능케 하는 온화한 주변세포질 단리 방법을 이용하며, (c) 이형이량체성 Fab 만을 분명하게 정성 및 정량하기 위해 연쇄 스위치 개념을 사용한다.
문헌[Rader C, 2012a]에 제시된 프로토콜은, 폴리스티렌 플레이트 상에 경쇄 다클론 항체를 고정화시키고, 이러한 항체 상에 조제 Fab 제제를 포획하며, 중쇄 C-말단 태그로 검출함으로써 2-사이트 ELISA의 개념을 사용한다. 그러나, 공정이 정량적 분석으로 발전하지는 못한다. 기술된 바와 같이, 공정은 처리량이 낮으며(32개 클론을 샘플링하기 위해 14ml 튜브가 사용됨), 주변세포질 단백질에 풍부한 분획을 단리하지 못할 것 같은 유도된 배양물의 단순 원심분리로부터 단리된 Fab-pIII 융합물을 실제로 샘플링한다. 이와 달리, 본원에 예시된 본 출원은 (a) 기술된 바와 매우 유사한 고속 처리 배양, 유도 및 저장 방법을 사용하고(Petropoulos K, 2012. Phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols), (b) 중쇄와 gIII 사이에 호박 중지 코돈 및 비-호박 코돈 억제자 숙주의 사용을 이용하여 pIII이 없는 Fab를 생산하고(또한 이러한 맥락에서 pSSY1에 대한 부분 참조), (c) 대장균 분획의 나머지로부터 주변세포질 분획의 분리를 가능케 하는 온화한 주변세포질 단리 방법을 사용하도록 주의하며, (d) 어떠한 pIII 융합도 없는 이형이량체성 Fab 만을 분명하게 정성 및 정량하기 위해 연쇄 스위치 개념을 사용한다.
본 출원은 추가로 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 항체를 수득하는 방법을 개시하며, 여기서 표면은 MaxiSorp™ 또는 PolySorp™과 같은 하전된 폴리스티렌 표면일 수 있거나 아비딘 또는 스트렙트아비딘 또는 뉴트라비딘으로 피복될 수 있고, 바람직하게는 Maxisorp™ 표면은 20 내지 100㎍/ml, 가장 바람직하게는 100㎍/ml 범위의 농도로 스트렙트아비딘으로 피복된다.
포획 항체는 1000-100ng/ml, 가장 바람직하게는 250ng/ml 농도로 염소 항-인간 IgG(염소 항-인간 IgG (H+L); F(ab')2 단편) 또는 포획 선택 비오틴 항-IgG-CH1 접합체, 바람직하게는 비오티닐화 항-CH1 항체를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
경쇄 특이 항체는 바람직하게는 1-20000, 가장 바람직하게는 항-람다의 경우 1:10000 및 항-카파의 경우 1:2000 범위의 희석도에서 염소 항-인간 람다 LC 특이 퍼옥시다제 접합체, 염소 항-인간 카파 LC 특이 퍼옥시다제 접합체, 염소 항-인간 F(ab')2-HRP, 마우스 항-인간 카파 경쇄 퍼옥시다제 접합체, 마우스 항-인간 카파 경쇄 단클론 및 토끼 항-인간 카파 쇄 단클론을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본원에 제시된 바와 같은 정량적 연쇄 스위치 ELISA의 개발은 산업-표준 평가 방법에 연속적으로 직접 연결할 수 있다 - 고속 처리 항체 발견을 위한 동적 스크리닝 또는 친화도 순위매김(Schraml M and Biehl M, 2012. Kinetic screening in the antibody development process. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols; Drake AW and Papalia GA, 2012. Biophysical considerations for development of antibody-based therapeutics. In: Development of Antibody-based Therapeutics). 친화도 순위매김을 위한 실제 이유는 문헌에 제시되어 있다(Tabrizi MA. 2012. Considerations in establishing affinity design goals for development of antibody-based therapeutics. In: Development of Antibody-based Therapeutics). 이것은 관리가능한 상품 비용으로 최대 치료 이득(효능)을 위해 요구되는 항체 용량의 최상의 예측인자 중의 하나이다. 보다 높은 친화도 항체는 일반적으로 생체내 항원 농도 및 턴오버(turnover)에 의해 주로 결정되는 보다 높은 효능을 초래할 것이다. 발견 단계에서 초기에 이들의 동적 파라미터 측면에서 항체를 순위매기는 능력은 본 발명의 방법이 파지 디스플레이 시스템의 성능을 이러한 측면에서 하이브리도마 시스템의 성능에 매치시킬 수 있게 한다. 동적 순위매김의 또 다른 이점은 고속 처리 및 열역학적 안정성의 평가 가능성이며(Schraml M and von Proff L, 2012. Temperature-dependent antibody kinetics as a tool in antibody lead selection. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols), 이것은 결국 종종 단백질 응집의 예측인자이다(Thiagarajan G et al., 2016) - 항체를 제조하기 위한 매우 중요한 관심사.
친화도 순위매김은 경쟁 ELISA 또는 표면 플라스몬 공명을 사용하여 이루어질 수 있다. 경쟁 ELISA는 검출 손잡이로서 사용될 수 있는 표지된 항원을 필요로 한다. 이러한 추가의 종종 달성하기 어려운 요건으로 인해, 이러한 검정은 오늘날 데이터 생성의 주요 방법이라기 보다는 검증을 위해 더 많이 사용된다. 이와 달리, SPR은 무-표지 방법(label-free method)이며, 소프트웨어 및 하드웨어의 지속적인 개선과 함께, 항체 친화도 데이터를 생성하기 위해 오늘날 선택되는 방법으로 부상하였다. 동적 분석을 위해 바람직한 SPR 표면은 Fab가 SPR 유동 세포에서 유동하는 수 상(항원을 갖거나 갖지 않음)과 대면하는 이들의 Fv 표면(파라토프)과 배향되는 곳이다. 이것은 배향된 방식으로 조제 Fab 후보물질의 정량적 포획을 가능케 하고 동적 순위매김을 가능케 하는 표면을 필요로 한다. 전장 IgG를 위한 이러한 배향된 표면은 문헌에 널리 기술되어 있지만(Canziani GA et al., 2004; Schraml M and Biehl M, 2012. Kinetic screening in the antibody development process. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols), Fab(정의상 Fc 도메인이 결핍됨)에 대해서는 이러한 문헌이 참으로 드물다(Leonard P et al., 2007). 따라서 선구자들도 동적 파라미터를 결정하기 위해 SPR 칩의 표면 상에 항원 자체를 고정화시킬 수 밖에 없었다(de Haard HJ et al., 1999; Steukers M et al., 2006). 이러한 접근법은 관심 에피토프를 차폐할 뚜렷한 가능성을 갖는 직접 ELISA를 모방한다. Fab에 대해서도 이러한 배향된 표면의 생성을 가능케 하는 새로운 시약들이 이제 상업적으로 이용 가능해졌지만, 상세한 프로토콜은 선행 기술에서 이용 가능하지 않다. 본 발명은 몇 가지 이러한 표면을 조사하며, 예들을 본원에 제시한다.
본 발명은 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 항체를 수득하는 방법을 개시하며, 여기서 동적 순위매김은 다음의 단계들을 포함한다:
i) 50ml 개별 배양물에서 qELISA 양성 클론으로부터 가용성 Fab를 수득하는 단계;
ii) 단계(i)로부터 수득된 Fab를 1xPBS에 대해 투석하는 단계;
iii) 동적 분석을 위한 생리학적 강도 및 pH의 작용 완충액을 사용하는 단계 - 완충액은 0.1 내지 1.0M, 바람직하게는 0.25 내지 0.75M, 보다 바람직하게는 0.4 내지 0.6M의 NaCl 또는 KCl 농도, 및 0.005 내지 0.05%의 Tween-20 농도를 함유하는 인산염 또는 HEPES, 보다 바람직하게는 인산염일 수 있다;
iv) SPR (표면 플라스몬 공명) 칩 고정화 표면을 선택하는 단계 - 이러한 표면은 하전된 덱스트란, 하전된 알기네이트, 하전된 덱스트란 또는 알기네이트 표면 상에 피복된 니켈 니트릴로테트라아세트산, 또는 하전된 덱스트란 또는 알기네이트 표면 상에 피복된 스트렙트아비딘 또는 뉴트라비딘일 수 있다;
v) 단계(iv)에서의 SPR 표면을 위한 고정화 화학을 선택하는 단계 - 이러한 화학은 EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드) 및 설포-NHS(N-하이드록시석신이미드)를 사용한 아민 커플링, 10mM 황산니켈을 사용한 Ni2 + 충전, 또는 스트렙트아비딘-비오틴 인지 화학일 수 있다;
vi) 단계(v)로부터의 칩 표면 상에 항-Fab 포획 항체를 고정화시키는 단계 - 포획 항체는 항-Fab IgG, 항-태그 항체, 예를 들어 항-His, 항-HA 또는 비오티닐화 항-CH1 또는 비오티닐화 이가 항-CH1/항-Cλ 또는 비오티닐화 항-CH1/항-Cκ 또는 비오티닐화 이가 항-CH1/항-Cλ와 비오티닐화 항-CH1/항-Cκ 둘 다의 50:50 혼합물을 포함할 수 있다;
vii) 단계(ii)로부터 수득된 조제 주변세포질 Fab를 단계(vi)으로부터의 칩의 포획 항체-피복된 표면 상에 포획하는 단계;
viii) 칩 표면에 걸친 1-3 차례의 작용 완충액 주사와 2-15 min의 중간 정지(intermediate pause)에 의해 신호를 안정화시키는 단계;
ix) 분석물의 최적 농도에서 단계(vii)의 포획된 Fab에 대한 분석물 반응을 시험하여 표적 항원 바인더와 비-바인더를 구별하는 단계;
x) 표면이 다음 차례의 스크리닝을 위해 재-사용되도록 하기 위해 재생 시약을 사용하여 Fab-분석물 복합체를 제거하는 단계 - 재생제는 2M MgCl2, 0.85% H3PO4, 50mM NaOH 또는 10mM 글리신, pH 2.0을 포함할 수 있다.
상기 단락에 기술된 바와 같은 Fab 발견을 위한 방법들의 조합은 두 가지 목적을 달성한다. 첫번째는 파지 라이브러리로부터 항체 발견으로의 제조능의 개념의 확대가 초기 단계로부터 본원에 입증된 바와 같이 가능해진다는 것이다 - 이러한 시스템으로부터 발견된 Fab는 설계에 의해서가 아니라 게이팅 시스템이 적용될 수 있는 다양한 수율로 설계에 의해 주변세포질에서 발현되는 정량 가능한 이형이량체성 분자로서 자신있게 평가될 수 있다. 두번째는 SPR 칩 상의 조제 Fab 포획을 위한 일관된 방법의 확립이 칩 자체 상의 포획된 Fab에 대한 표적 항원의 결합을 조회할 수 있게 한다는 것이다 - 항원이 폴리스티렌 표면 상에 고정화되는 직접/간접 ELISA에 의해 통상적으로 실시되는 기능. 후자의 접근법은 앞서 논의된 바와 같이 관심을 끄는 관련 에피토프를 차폐시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 SPR 칩 상의 신규한 조제 Fab 포획 시스템은 오류 발생이 쉬운 항원-특이 ELISA를 우회할 뿐만 아니라 항원을 인지하는 Fab에 대해 직접 동적 파라미터를 수득할 수 있어, 발견에 필요한 시간이 단축된다는 점에서 두 배로 유리하다. 본원에 포함된 실시예들은 이러한 방식으로 평가된 Fab가 또한 진짜 유전자형(genotype true)임을 입증한다 - 즉, 주변세포질 추출물에 대한 연쇄 스위치 ELISA 및 온-칩 동적 순위매김(표현형 분석)의 조합이 사후 서열 분석(post hoc sequence analysis) (유전자형 분석)에 의해 결정되는 바와 같이 이들의 탠덤 인-프레임 경쇄-중쇄 Fab 구조에 온전한 ORF를 갖는 클론만을 선발한다.
항체의 공급원으로서 초대형 나이브 파지 디스플레이 라이브러리를 생성함
상기 부분에 기술된 단계화된 평가 시스템은 안정성 이유로 항체 발견을 위해 바람직한 포맷이며, 고속 처리 방식으로 단백질로서 성공적으로 평가될 수 있음을 시사한다. 따라서, 이러한 설계 결정은, 파지 증폭의 제약, 대장균에서의 불량한 발현, 뿐만 아니라 단계화된 평가 과정 자체에 의해 부과되는 엄격성으로 인해 많은 수의 잠재적인 바인더들이 소실될 것이라는 현실에 더하여, 소실을 보상하기 위해 Fab의 초대형 라이브러리가 생성되어야 하고, 디스플레이 방법에 의한 항원 인지를 위해 이용 가능해져야 함을 필요로 한다.
대형 라이브러리를 생성해야 하는 주요 근거는 가능한 V-도메인의 여러 다양한 조합으로서 포획하여 항체를 치료 범위(서브-nM 내지 pM 범위의 KD)에서 검색하는 것이다. 따라서 라이브러리 크기가 이러한 발견을 나타낸다 - 근본적 가정은 각 재조합 클론이 상이한 VL-VH 조합을 나타낸다는 것이다(Hoogenboom HR et al., 1991; Waterhouse P et al., 1993). 이러한 가정은 매우 많은 수의 클론을 서열분석하지 않고서는 검증하기 어렵다. 플라스미드 DNA를 빈번한 절단 효소(BstNI, BstOI, AluI 등)로 소화시키고 소화물을 아가로스 겔 상에 흐르게 하여 생성된 핑거프린트를 연구하는 것이 다양성을 평가하는데 통상적이지만 가장 확실하게는 서열 정보의 약한 대용물이다. 생어 서열분석(Sanger sequencing)은, 긴 단편 길이를 판독하는 이의 능력 때문에, scFv 또는 Fab 포맷으로 매봉된 VL-VH 쌍을 판독하는데 매우 적합하지만, 샘플 제제의 처리량, 서열분석 및 분석이 수 백 개 이상의 클론에 대해 실행될 수 없다. 차세대 서열분석(Next-Generation Sequencing; NGS)이 이러한 문제를 해결하기 위해 적용되었지만(Geyer CR et al., 2012. Recombinant antibodies and in vitro selection technologies. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols; Glanville J et al., 2015), 판독 길이의 제한으로 인해 106개 이상의 클론에 대해 scFv 라이브러리의 VL-VH 쌍을 명확하게 판독하지 못한다. 따라서, 과정은 적어도 한 차례의 패닝 후 라이브러리의 다양성이 감소된 후에 바인더를 풍부화시키는데 더 성공적이다(Ravn U et al., 2013; Glanville J et al., 2015). 판독 길이의 제한은 VL-VH 쌍 이외에는 경쇄 및 중쇄 카세트의 탠덤 인-프레임 성질을 확인할 필요가 있는 Fab 라이브러리가 현재 NGS에 의한 검증을 받아들일 수 없음을 의미한다. 복합 라이브러리의 지도를 작제하기 위해 짧은 판독치의 데 노보 조립(de novo assembly)의 최근의 발달(Cho N et al., 2015)이 이러한 문제를 해결할 수 있다. 이러한 검증 문제에 상관없이, 최대 파라토프 커버리지의 핵심 원칙은 면역화로부터 수득하기가 거의 불가능한 자가-항원을 포함한 거의 모든 항원에 대한 항체를 찾아내는 파지 디스플레이 라이브러리의 능력의 열쇠이다. 게다가, 라이브러리 크기와 바인더의 친화도 사이에는 거의 선형 상관관계가 존재한다 - 라이브러리가 클수록, 치료 범위 항체를 발견할 기회도 커진다(Hust M et al., 2009. Antibody phage display. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic; Lowe D and Vaughan TJ, 2009. Human antibody repertoire libraries; In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic). 따라서, 대형 라이브러리를 구축하는 것이 역시 이러한 측면으로부터 유리하다.
초대형 나이브 라이브러리를 구축하면서, 본 발명 및 본원에서 사용되는 방법은 크기, 빠른 처리속도 및 경제적 이점을 보장하면서 라이브러리의 다양성에 균형을 맞춘다.
본 발명은 5.38 x 1010 내지 2.55 x 1011 (1.26 x 1011) cfu 카파 라이브러리 및 7.33 x 1010 내지 3.59 x 1011 (1.79 x 1011) cfu 람다 라이브러리를 포함하는, 8.86 x 1010 내지 9.13 x 1011 (3.06 x 1011) cfu 범위의 크기를 갖는 나이브 항체 파지 디스플레이 라이브러리(APDL)를 개시한다.
대안적인 디스플레이 시스템을 구축함으로써 선행 기술의 단점을 극복하려는 몇몇 시도들이 초기에 이루어졌다. 대안적인 디스플레이 시스템은 효소 디스플레이(Boder ET and Wittrup KD, 1997; Weaver-Feldhaus JM et al., 2004), 세균 디스플레이(van Blarcom TJ and Harvey BR, 2009. Bacterial display of antibodies. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic) 및 포유류 디스플레이(Tomimatsu K et al., 2013; Horlick RA et al., 2013)를 포함하는 생체내 시스템, 및 리보솜 디스플레이(Hanes J and Pluckthun A, 1997), DNA 디스플레이(Sumida T et al., 2009), mRNA 디스플레이(Roberts RW and Szostak JW, 1997) 및 비드 디스플레이(Diamante L et al., 2013)를 포함하는 시험관내 시스템으로 분류될 수 있다. 생체내 시스템은 통상적으로 표현형-유전자형 연결을 유지하기 위해 세포 표면 단백질 상에 발현된 항체 포맷(scFv, Fab)을 고정시키는 것을 필요로 한다. 유사하게, 시험관내 시스템은 표현형-유전자형 연결을 유지하기 위해 전사 단위를 링커를 통해 앵커(anchor)(리보솜, 퓨로마이신 또는 폴리스티렌 비드)에 고정시킨다. 그러나, 파지 디스플레이 시스템과 유사하게, 생체내 시스템은 라이브러리 크기가 통상적으로 109개 변이체를 초과하지 못하게 하는 형질전환 효율에 의해 제한되어, 나이브 면역 레퍼토리를 포획하기 위한 이들의 유용성을 제한한다. 이와 달리, 시험관내 시스템은 1012-1014개 정도로 많은 변이체를 디스플레이할 수 있지만, 조작의 어려움 및 설계에 의한 이형이량체성 단백질 생산 불능 둘 다에 의해 제한된다(유일한 예외는 DNA 디스플레이 시스템을 최적화하기가 어럽다는 것이다). 따라서 이러한 시스템들은 모 Fab 주형의 친화도 성숙과 같은 후보 단백질의 분자 진화가 요구되는 시나리오에서 가장 유용하다. 따라서, 파지 디스플레이 라이브러리는, 다수의 치료적 또는 진단적 항체를 발견하는데 있어서의 이들의 단순성, 견고성 및 추적 기록을 위해, 소정의 항원을 인지할 수 있는 능력을 갖는 VL-VH 조합의 1차-통과 검색(first-pass retrieval)을 위해 선택되는 방법으로 남는다(Hust M et al., 2009. Antibody phage display. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic; Lowe D and Vaughan TJ, 2009. Human antibody repertoire libraries; In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic).
파지 디스플레이 라이브러리는 그에 따른 장점과 단점을 갖고서 파지 또는 파지미드 벡터 백본 상에 생성될 수 있다(Scott JK and CF Barbas III. 2001. Phage-display vectors. In: Phage Display: A Laboratory Manual). 파지미드가, 대장균에서의 형질전환 효율이 파지 벡터에 비해 훨씬 우수하다는 사실로 또한 진정한 친화도에 의한 선택을 가능케 하는 항체의 다가 디스플레이에 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 이러한 우수한 효율 조차도 삽입 단편에 결찰된 제한 소화된 플라스미드 벡터에 대해 통상적으로 달성 가능한 최대 효율(이것은 약 109cfu/㎍이다)에 의해 제한된다. 이와 달리, 초나선화 플라스미드 제제에 대해 달성 가능한 최대 효율은 적어도 로그 이상이다(1010cfu/㎍; Hoogenboom HR et al., 1991; Sambrook J and Russell DW. 2001b. The Hanahan method for preparation and transformation of competent E. coli: High efficiency transformation. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 1). 그러나, 상기 본원에 제시된 바와 같이, 형질전환 효율의 이러한 한도는 대장균에 포획되어 라이브러리를 생성할 수 있는 랜덤 VL-VH 순열의 수를 제한하며, 따라서 항체 공동체(antibody community)가 두 개의 단계 또는 동시에 형질전환된 두 개의 독립적인 카세트로 이러한 대형 라이브러리를 생성하게 하여(Waterhouse P et al., 1993; Griffiths AD et al., 1994; de Haard HJ et al., 1999; Ostermeier M and Benkovic SJ, 2000; Hoet RM et al., 2005) VL 및 VH 다양성 둘다의 포획을 보장한다. 따라서, 이러한 한도가 더 올라갈 수 있다면 대형 Fab-파지 디스플레이 라이브러리를 구축하는 것이 유리하다. 본원에 제시된 실시예는 이러한 한도를 초과하는 것이 정말로 가능하며, 하나의 단계로 대형 Fab-파지 디스플레이 라이브러리를 구축하는데 적용될 수 있음을 입증하며, 여기서 유일한 제한은 1 리터의 세균 배양물에 있을 수 있는 대장균의 최대 수이다(1012/L; Hoogenboom HR et al., 1991).
본 발명은 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 형질전환은 초수용 세포(ultracompetent cell) 50㎕ 당 25 내지 400, 바람직하게는 100 내지 350, 보다 바람직하게는, 200 내지 300 ng의 DNA 대 세포 용적 비에서 수행된다.
본 발명은 추가로 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 형질전환은 0.1, 0.2, 0.4 cm, 바람직하게는 0.2 cm의 전극간 간격의 큐벳 중에서 1500 내지 3500 volts, 바람직하게는 2500 내지 3200 volts 범위의 전압, 10 내지 30μF, 바람직하게는 20 내지 28μF 범위의 정전용량 및 100 내지 400 ohms, 바람직하게는 250 내지 350 ohms의 저항에서 수행된다. 숙주는 TG1, XL-1 Blue 및 ER2537, 바람직하게는 초고 수용성(ultrahigh competence)의 TG1(4 x 1010 cfu/㎍)을 포함하는 그룹으로부터 선택된 호박 코돈 억제자 t-RNA 암호화 숙주이다.
본 발명은 더 높은 등급의 형질전환 효율 세포(Lucigen로부터 입수됨)의 사용을 개시한다. 따라서 본 발명은 Fab 삽입 단편에 결찰된 제한 소화된 파지미드 벡터의 보다 높은 형질전환 효율을 보고한다. 이러한 유리한 활용은 본 발명이 더 적은 수의 형질전환을 사용하여 본원에 제시된 바와 같은 대형 나이브 라이브러리에 도달하게 할 수 있다.
본 발명은 또한 벡터 및 삽입 결찰의 형질전환 효율이 DNA 품질 및 결찰의 적절성에 따라 좌우된다고 개시한다. DNA 품질의 문제는 초기에 초점을 맞추어 개선되어 왔지만(Martineau P, 2010. Synthetic antibody libraries. In: Antibody Engineering; Rader C, 2012b. Generation of human Fab libraries by phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols), 결찰의 적절성의 문제는 그렇지 못했다. 정교화하기 위해, 대부분의 항체 클로닝 포맷은 VL, VH, CL 또는 CH1 단편이 PCR-기반 증폭, 융합, V-도메인 내에는 좀처럼 절단되지 않는 효소로의 제한 소화(Persic L et al., 1997), 및 벡터에의 결찰을 위해 모듈식으로 처리되는 카세트 클로닝 접근법을 사용한다. 본 발명은 PCR 증폭된/융합된 단편의 집단의 제한 소화 후에 생성된 점착성 말단이 벡터에서 양립할 수 있는 점착성 말단과 최소의 미스매치 수를 가질 때 최고의 형질전환 효율이 수득될 수 있다고 개시한다. 전기천공에 의해 보다 높은 형질전환 효율을 달성하기 위한 결찰 혼합물로부터의 염 제거의 중요성과 같은 다른 개선점들이 기술된 바 있으며(Chowdhury PS, 2002. Targeting random mutations to hotspots in antibody variable domains for afnity improvement. In: Methods in Molecular Biology, vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols), 본 발명은 실시예에서 마이크로농축기를 통한 한외여과를 사용한 유사한 유익한 효과를 입증한다(de Haard HJW, 2002. Construction of large naive Fab libraries. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols; Green MR and Sambrook J, 2012a. Concentrating and desalting nucleic acids with microconcentrators. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 1). 실용성을 유리하게 개선시킨 포획된 Fab의 잠재적인 번역가능성을 증가시키기 위한 이러한 단편들의 이음매없는(seamless) 융합 및 고 충실도(high-fidelity) 증폭의 유익한 효과가 또한 본 출원에 개시되어 있다.
본 발명은 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 벡터에 포획된 면역 레퍼토리를 디스플레이하는 것은 다음의 단계들을 포함한다:
i) Fab를 파지미드 벡터에 결찰시키는 단계;
ii) 결찰된 혼합물을 적합한 숙주에 형질전환시키는 단계.
본 발명은 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 서열 번호 32 및 34를 사용하여 수득된 Fab 레퍼토리의 결찰은
i) 11-37℃, 바람직하게는 11℃에서 T4 DNA 폴리머라제의 3'-5' 엑소뉴클레아제 특성을 사용한 Fab 블런팅(blunting) 및 37℃에서 1-1.5h, 바람직하게는 1.5h 동안 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용한 블런팅된 Fab의 5' 말단의 포스포릴화;
ii) 1.5-9% w/v, 바람직하게는 4-7% w/v, 보다 바람직하게는 6% w/v 범위의 최종 퍼센트로 6000-32000 Daltons, 바람직하게는 8000 Daltons 분자량의 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 그룹으로부터 선택된 첨가제의 존재하에 50-400ng/㎕의 총 DNA, 바람직하게는 200ng/㎕의 농도 범위로 4-16℃의 온도 범위, 바람직하게는 16℃에서 16h 동안에 이어 25℃에서 1h 동안 단계(i)에서 수득된 Fab의 자가-결찰에 의해;
iii) 점착성 말단을 갖는 선형 Fab를 방출하기 위한 50℃에서 16h 동안 32U/㎍ SfiI로 (ii)로부터의 자가-결찰된 Fab 집단의 제한 소화에 이은 아가로스 겔 정제;
iv) 16℃의 온도에서 16h에 이어 37℃에서 1h 동안 단계(iii)에서 수득된 pCOMB3XSS에의 선형 Fab의 점착성 말단 결찰 및 70℃에서 15min 동안의 열-불활성화에 의해 수행된다.
본 발명은 추가로 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 pCOMB3XSS 벡터에의 서열 번호 34 및 35-37을 사용하여 수득된 Fab 레퍼토리의 결찰은
i) 점착성 말단을 갖는 선형 Fab를 방출하기 위해 50℃에서 16h 동안 32U/㎍ SfiI로 선형 Fab 집단의 제한 소화에 이은 아가로스 겔 정제;
ii) 16℃의 온도에서 16h에 이어 37℃에서 1h 동안 단계(i)에서 수득된 선형 Fab의 점착성 말단 결찰 및 70℃에서 15min 동안의 열-불활성화에 의해 수행된다.
본 발명은 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서, pSSY1 벡터에의 서열 번호 34 및 55를 사용하여 수득된 Fab 레퍼토리의 결찰은
i) 점착성 말단을 갖는 선형 Fab를 방출하기 위해 50℃에서 16h 동안 32U/㎍ SfiI로 선형 Fab 집단의 제한 소화에 이은 아가로스 겔 정제;
ii) 16℃의 온도에서 16h에 이어 37℃에서 1h 동안 단계(i)에서 수득된 선형 Fab의 점착성 말단 결찰 및 70℃에서 15min 동안의 열-불활성화에 의해 수행된다.
본 발명은 또한 효율 감소 없이 고정된 용적의 고 형질전환 효율 TG1 세포로 형질전환될 수 있는 DNA의 최대량을 실시예를 참고하여 개시한다. 라이브러리를 구축하는 것이 형질전환의 크기 및 효율 간의 타협점이라는 것이 명백해 보이지만, 최적 크기, 다양성 및 비용 균형을 갖는 라이브러리가 현재로서는 선행 기술에서 밝혀진 바 없다. 본 출원은 적정 원리를 사용함으로써 그러한 수치를 개시한다. 본원에 포함된 실시예는 이러한 결정이 본원에 제시된 바와 같은 본 발명의 방법이 형질전환의 수를 극적으로 감소시키도록 하였음을 입증한다. 이러한 감소는 비교적 적은 양의 결찰된 DNA와 또한 훨씬 더 짧은 턴어라운드 시간을 갖는 매우 큰 라이브러리 크기를 초래하였다. 라이브러리-제조 속도의 증가는 면역 라이브러리가 생체방어-유사 시나리오에서 병원체-특이 항체를 신속하게 발견하기 위해 생성될 필요가 있을 때 유리할 수 있다. 유사하게, 시약 사용시 상당한 비용 절감은 보다 적은 양의 PCR-증폭되고 융합된 DNA를 사용함으로써 달성될 수 있다. 본 발명은 형질전환의 수를 감소시켜 시간과 비용의 이익을 가지면서 크기를 증가시키는 방법을 개시하며, 이것이 본원에 제시된 바와 같은 라이브러리 및 라이브러리에 도달하는 방법의 몇 가지 이점 중의 하나이다.
본 발명에서, APDL은 형질전환의 단일 단계에서 15-160 ㎍의 결찰된 DNA, 바람직하게는 20-100㎍, 보다 바람직하게는 40 내지 50㎍의 결찰된 DNA로부터 수득된다. 본 발명은 카파 서브타입 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 APDL은 단일 단계의 형질전환에서 수득되는 바와 같은 10 내지 70㎍의 결찰된 DNA, 바람직하게는 20 내지 50㎍, 보다 바람직하게는 25 내지 30㎍의 결찰된 DNA로부터 수득된다. 본 발명은 람다 서브타입 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 APDL은 단일 단계의 형질전환에서 단계15 내지 20에서 수득되는 바와 같은 5 내지 60㎍의 결찰된 DNA, 바람직하게는 8 내지 50㎍, 보다 바람직하게는 10 내지 20㎍의 결찰된 DNA로부터 수득된다.
본 발명은 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 카파 APDL은 1.92 x 109 내지 1.98 x 1010 cfu/㎍의 효율로 수득되고 람다 APDL은 1.92 x 109 내지 9.1 x 109 cfu/㎍의 효율로 수득된다.
pSSY1 - 신규한 파지미드 디스플레이 벡터: 본 발명은 초대형 라이브러리(pSSY1; 서열 번호 38 및 도 28)를 제조하기 위한 신규한 파지미드 벡터를 개시한다. 실시예에 예시된 바와 같이, 이러한 벡터의 생성은 비효율적인 결찰로 인해 초대형 라이브러리를 생성할 수 없었던 모 벡터 pCOMB3XSS의 고유의 결함에 의해 필요로 되었다(도 12; Barbas CF III et al., 1991; Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual). 본 발명은 모 벡터의 설계 의도에 기초한 벡터의 재-설계를 개시하지만, 이러한 노력이 또한 전체 서열의 주요한 변화를 도입하였으며 본원의 실시예에 예시된 상당한 이점을 제공하였다. 이러한 플라스미드의 추가의 특성들, 및 pCOMB3XSS와의 유사성 뿐만 아니라 차이점은 실시예 24에 예시되어 있다.
V- 및 C-유전자의 PCR 증폭 및 융합에 의한 재조합 항체의 제조: 본 발명은 파지미드 디스플레이 벡터 pSSY1로의 후속적인 클로닝 및 디스플레이를 위해 조합 인간 면역글로불린 레퍼토리를 생성하기 위한 인간 V-유전자의 고 충실도 증폭 및 인간 C-유전자와의 융합을 위한 PCR 조건의 최적화된 세트를 설계하고 이용한다. 이러한 목적을 위해, 이것은 pSSY1 벡터에의 효율적인 결찰을 가능케 하도록 후속적으로 변형되는 선행 기술에 제시된 35개 프라이머 세트를 사용한다(Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual). 본 발명은 상기 35개 프라이머의 증폭 및 pCOMB3XSS 벡터에서의 이들의 후속적인 결찰을 위한 신규한 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 변형된 프라이머 및 이들의 증폭 및 신규한 벡터 pSSY1로의 후속적인 결찰을 개시한다.
재조합 항체 생성은 면역글로불린이 어떻게 생체내에서 조립되는지에 내재된 모듈성에 따라 좌우된다. 간략하게, 면역글로불린 분자의 경쇄 및 중쇄 둘 다는 거울같은(mirrored) 5' - 3' 엑손-인트론 방식으로 염색체 내에 이들의 각각의 유전자군(유전자좌)로부터 비롯되는 N-말단 - C-말단 방향으로 가변 (V), 힌지 (H) 및 불변 (C) 영역으로 이루어진다. 이러한 유전자군의 염색체 위치는 다르다 - 인간 중쇄 유전자좌는 염색체 14 (IGH 유전자좌; 14q32.33)에 있는 반면, 인간 경쇄 유전자좌는 염색체 2 (카파 또는 IGK 유전자좌; 2p11.2) 및 22 (람다 또는 IGL 유전자좌; 22q11.2)에 있다. 각각의 유전자좌는 다수의 유전자를 함유할 수 있다 - 모든 인간 Ig 유전자의 전체 수는 371 내지 422의 범위인 것으로 추정된다. 중쇄의 레퍼토리에 있어서의 다양성은 주로 생식계열 V, 다양성 (D) 및 접합성 (J) 엑손의 재조합에 의해 생성되는 반면, 경쇄의 레퍼토리에 있어서의 다양성은 주로 생식계열 V 및 J 엑손의 재조합에 의해 생성된다. 세 가지 추가의 메카니즘이 면역글로불린 쇄 다양성에 기여한다. 첫번째는 N 다양성(N, 뉴클레오티드에 대해)이라고 불리며, 이것은 V-D-J 접합부에서 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)에 의해 무작위로 뉴클레오티드의 결실 및/또는 부가로부터 야기되어 생식계열 DNA에서 암호화되지 않는 영역을 초래한다. 두번째 메카니즘은 체세포 초돌연변이(SHM)라고 불리며, 이것은 V-D-J 재배열된 유전자에 특이적으로 영향을 미치며, 활성화-유도된 시티딘 데아미나제-우라실 DNA 글리코실라제-DNA 폴리머라제 에타(eta) 효소 복합체, 또는 오류 발생이 쉬운 RNA-지시된 DNA 폴리머라제에 의해 조절되는 것으로 믿어진다. 메카니즘에 상관없이, 최종 결과는 "핫-스팟"에서의 뉴클레오티드의 변화이며, 따라서 이것은 생식계열 코드(germline code)와는 다르며, 일반적으로 표적 항원에 대한 친화도의 개선을 초래한다. 세번째 메카니즘은 클래스 스위치(class switch)라고 불리며, 이것은 중쇄의 재배열된 V-D-J 클러스터를 다양한 힌지 및 불변 엑손에 접합시킨다. 클래스 스위치는 면역글로불린의 항원 인지 능력에는 영향을 미치지 않지만, 분자에 최종 기능성을 제공하는 불변 영역에의 면역 효과기 세포의 차등적인 상호작용을 가능하게 한다.
면역글로불린 유전자는 먼저 막-결합된 수용체로서 B-계통의 세포에서만 발현된 다음 면역글로불린 단백질로서 분비된다. B-세포 경쇄 및 중쇄 조합이 함유할 수 있는 재조합, SHM 또는 클래스 스위치의 유형은 이의 생활 주기에서의 단계에 따라 좌우된다. 따라서, 재조합 항체 행성을 위한 면역 조직의 공급원은 프로젝트 목표에 따라 좌우된다 - 나이브 라이브러리를 생성하는 것은 바람직하게는 N-부가 또는 SHM 없이 생식계열의 최소 재-배열을 겪은 B-세포의 수확을 필요로 한다. 이와 달리, 면역 라이브러리를 생성하는 것은 친화도 성숙된 V-D-J 또는 V-J 조합을 회수하기 위해 우선적으로 SHM을 겪은 B-세포의 수확을 필요로 한다. 인체의 상이한 구획들은 이들의 생활 주기의 상이한 단계에서 B-세포를 둘러싸며, 따라서 적절한 조직 수확을 위해 주의해야 한다(Dobson CL et al., 2012. Naive antibody libraries from natural repertoires. In: Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery). 본원에 예시된 바와 같이, 본 발명에 기술된 초대형 나이브 Fab 라이브러리는 인간 말초 혈액 단핵 세포군, 편도선 및 골수로부터 수확된 B-세포를 사용한다.
본 발명은 다음의 단계들을 포함하여 APDL을 생산하는 방법을 개시한다:
i) Fab를 수득하기 위한 면역 레퍼토리 포획 단계;
ii) 적합한 벡터에 상기한 바와 같은 포획된 면역 레퍼토리 디스플레이 단계.
본 발명은 추가로 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 면역 레퍼토리 포획은 다음의 단계들을 포함한다:
i) RNA 단리 및 cDNA 합성 단계;
ii) 서열 번호 1-23 및 42-54를 포함하는 프라이머를 사용한 VL (람다 및 카파) 및 VH 도메인의 증폭 단계;
iii) 서열 번호 27-31을 포함하는 프라이머를 사용하고 서열 번호 24-26을 사용한 C 도메인의 증폭 단계;
iv) 서열 번호 30, 32, 35-37 및 55를 포함하는 프라이머를 사용한, 각각 단계(ii) 및 (iii)으로부터 수득된 Vκ 및 Cκ 도메인 및 Vλ 및 Cλ 도메인의 융합에 의한 경쇄의 중첩 PCR 단계;
v) 서열 번호 28 & 33을 포함하는 프라이머를 사용한 단계(ii) 및 (iii)로부터 수득된 VH 및 CH1의 융합으로부터 수득된 중쇄의 중첩 PCR 단계;
vi) 서열 번호 32, 34, 35-37 및 55를 포함하는 프라이머를 사용하여 Fab를 수득하기 위한 각각 단계(iv) 및 (v)로부터 수득된 경쇄 및 중쇄의 중첩 PCR 단계;
vii) 각 단계에서 앰플리콘 정제 단계.
이와 달리, 합성 또는 반-합성 라이브러리는 가변 도메인 (상보 결정 영역 또는 CDR)의 중심 항원-인지 아미노산이 시험관내 합성 후 서브클로닝되는 가변 도메인의 고정된 천연 Ig 주형 또는 고정된 합성 프레임워크 영역에 의존한다.
천연 공급원으로부터의 재조합 항체 생성은 표적 B-세포군의 전사체(mRNA)를 수확한 다음 이를 역 전사시켜 상보적 DNA (cDNA)를 생성한 후 시작된다. 그후 도메인 특이 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 cDNA 주형으로부터 서브타입-특이 (카파 또는 람다) V-유전자 레퍼토리를 증폭시킨다. 그후, 하나의 서브타입의 증폭된 V-도메인을 시험관내에서 반대 서브타입과 무작위로 쌍을 이루게 하여 다수의 파라토프를 생성하게 한다. 재조합효소 또는 DNA 폴리머라제에 기반하는 추가의 시험 관내 조작은 H- 또는 C-영역의 접합을 가능케 하여 디스플레이될 수 있는 Ig 단편 또는 전장 Ig를 생성한다. 명백한 바와 같이, V-도메인 특이 증폭 및 무작위 쌍 형성은 고유의 파라토프 정보를 파괴한다. 어느 정도까지, 이것은 자가-항원을 인지할 수 있거나 표적 항원에 대해 매우 높은 친화도를 가질 수 있는 신규한 파라토프를 생성하는 것인 재조합 항체의 설계 목표 중의 하나를 위해 의도적이다. 이러한 파라토프는 정상적으로 생체내에서 선택취소되며, 따라서, B-세포 면역 레퍼토리에서 발견되지 않는다(Foote J and Eisen HN, 1995; Hai S-H et al., 2009. Immunogenicity screening using in silico methods: Correlation between T-Cell epitope content and clinical immunogenicity of monoclonal antibodies. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic). 그러나, 몇몇 용도를 위해서는, 파라토프 정보를 포착하는 것이 중요하다. 관련된 PCR의 시스템이 이러한 목적을 위해 기술된 바 있다(Meijer PJ et al., 2006).
설계 의도가 파라토프를 있는 그대로 포획하는 것인지 V-도메인를 무작위로 재조합하는 것인지에 상관없이, PCR 프라이머는 V-도메인을 특이적으로 증폭시키는데 필요하다. 대립유전자 변형을 추가로 암호화하는 V-유전자 계열의 다중성, 뿐만 아니라 나이브 또는 면역 라이브러리를 생성하고자 하는지에 따라 특정 클래스의 V-D-J 또는 V-J 조합이 포획될 필요가 있다는 사실 둘 다로 인해, 여러 가지 세심한 프라이머 세트가 설계되어 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하는데 성공적으로 사용되어 왔다(Marks JD et al., 1991; de Boer M et al., 1994; Sblattero D and Bradbury A, 1998). 이러한 모든 프라이머는 특정 위치에 약화된 뉴클레오티드를 포함하여 항체 데이터베이스(http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html; http://www.vbase2.org/; http://www.imgt.org/)에서 이용 가능한 서열에 의해 드러난 바와 같이 이러한 위치에서 아미노산의 변형을 수용한다. 본 발명은 Scripps 그룹에 의해 기술된 프라이머 세트를 사용하는 방법을 개시한다(Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual). 설계 의도 및 이러한 프라이머를 설계하는데 사용되는 방법은 이용 가능하다(Burton DR, 2001. Overview: Amplification of antibody genes. In: Phage Display: A Laboratory Manual).
본 발명은 또한 수용자 파지미드 디스플레이 벡터 pCOMB3XSS로 진행되는 경우 선행 기술에 제시된 초기의 프라이머 세트가 이러한 프라이머에 의해 증폭된 V-도메인의 효율적인 카세트 클로닝을 허용하기 않았기 때문에 신규한 프라이머 세트를 개시한다. 이러한 재-설계는 프라이머의 제한 말단을 포함하였다. 특히, 재-설계는 모든 Vκ 및 Vλ 정방향 프라이머, 뿐만 아니라 최종 중첩 정방향 프라이머에 만들어진 SfiI 부위의 중심 펜타뉴클레오티드 서열을 변화시킴을 포함하였다. 추가의 재-설계는 최종 중첩 정방향 및 역방향 프라이머 간의 상동성을 감소시킴을 포함하였다. 본원에 예시된 바와 같이, 이러한 설계 변화는 신규한 파지미드 디스플레이 벡터 pSSY1에의 증폭된 Fab의 고 효율 결찰을 위해 중대하였다. 앞서 논의되고 본원에 예시된 바와 같이, 본원에 개시된 바와 같은 파라미터-조절된 고 효율 형질전환과 조합된 매우 효율적인 결찰은 처음으로 단일 단계 형질전환이 >1011 cfu Fab-파지 디스플레이 라이브러리를 생성할 수 있게 한다.
PCR 프라이머 단독은 주형, 특히 V-도메인에 의해 암호화된 것과 같은 다수의 변형을 암호화하는 주형의 고 충실도 증폭을 보장하기에 자체로 충분하지 않다. 선행 기술은 주로 Taq 폴리머라제의 사용을 개시하는데, 부분적으로는 이것이 장시간 이용 가능한 유일한 열안정성 DNA 폴리머라제이기 때문이었다. 그러나, Taq 폴리머라제는 종결 코돈의 도입 및 V-도메인 또는 V-C 융합에 있어서의 프레임시프트(문헌[Lowe D and Vaughan TJ, 2009. Human antibody repertoire libraries; In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic; Azzazy HM and Highsmith WE, 2002]에 검토됨)를 초래하는 상당히 높은 오류율을 갖는다(Tindall KR and Kunkel TA, 1988; Gelfand DH and White TJ, 1990). 이러한 문제의 인식에 있어서, 당해 분야의 보다 최근의 실무자들은 LA-PCR 원리(Barnes WM, 1994)에 기초하여 열안정성 폴리머라제 블렌드(Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual; Rader C, 2012b. Generation of human Fab libraries by phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols)를 사용하여 왔지만, 이것도 여전히 모든 V-도메인의 증폭을 보장하지는 못한다(Loset GA et al., 2005; Rader C, 2012b. Generation of human Fab libraries by phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols). Taq 또는 Taq 블렌드가 사용되는지에 상관없이, 거의 모든 실무자들은 약화된 프라이머가 최대로 증폭되도록 하기 위해 보존적 어닐링 온도(~56℃)를 사용하였다(Marks JD et al., 1991; de Boer M et al., 1994; Sblattero D and Bradbury A, 1998; Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual; Rader C, 2012b. Generation of human Fab libraries by phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols). 본원에 예시된 바와 같이, 주형의 세밀한 분석은 인간 VH 및 Vλ 계열 유전자의 대부분이 이들의 앰플리콘 길이의 대부분에 대해, 특히 선행 기술에 기술된 Scripps 프라이머를 포함한, 모든 정방향 V-도메인 프라이머가 어닐링되도록 설계되는 1st 프레임워크(FR1) 영역에서 GC-풍부하다는 것을 시사한다. 이와 달리, Vκ 계열 유전자는 FR1 영역을 포함하여 이들의 앰플리콘의 길이 대부분에 대해 평균 GC 함량(~50%)을 갖지만, GC-풍부 스트레치가 또한 이러한 유전자 계열 내에 존재한다. 본 발명은 광범위한 실험을 통해, 선행 기술에 제안된 DNA 폴리머라제 조합이나 낮은 어닐링 온도 어느 것도 프라이머 설계의 정확성과 상관없이 이러한 주형으로부터의 효율적인 증폭을 위해 적합하지 않다고 개시한다. 본원에 예시된 바와 같이, 이러한 GC-풍부 영역을 통한 증폭의 현재 기준을 따르는 특정 완충액-폴리머라제 조합이 설계되었다(Green MR and Sambrook J. 2012b. PCR amplification of GC-Rich Templates. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 1). 게다가, 생성된 초대형 라이브러리로부터의 제한된 수의 클론의 분석은 본 발명의 전략으로부터 다양성의 손실은 초래되지 않았으며 라이브러리가 세밀한 분석에 의해 결정되는 바와 같이 세 가지 시험된 항원 각각에 대해 상이한 바인더 서열을 생산할 수 있었다는 것을 시사한다. 대부분의 공개된 데이터와는 달리, 이러한 바인더 모두는 또한 10-4 내지 10- 5.s-1 범위의 오프-레이트(off-rate)를 가지며 동적으로 안정하다. 이것은 본 발명의 증폭 시스템이 높은 충실도 및 효율로 나이브 B-세포 면역 레퍼토리의 목적하는 다양성을 포착하였음을 시사한다. 이러한 원리를 예시하는 실시예가 본원에 제시되어 있다.
본 출원은 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 가변 람다 도메인의 증폭은 다음의 단계들을 포함하여 서열 번호 14-23 및 46-54를 포함하는 프라이머를 사용하여 2-단계 PCR에서 수행된다:
i) 수용액 중의 cDNA 주형, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
ii) 단계(i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
iii) 다양한 Vλ 레퍼토리 포획을 초래하도록 65 내지 72℃의 온도에서 (ii)로부터의 변성된 주형을 동시에 어닐링 및 연장시켜 가변 람다 도메인을 수득하는 단계.
가변 카파 역방향 프라이머에 대한 Tm이 다르다는 사실을 고려하여, 2-단계 PCR을 3-단계 PCR로 더욱 최적화시켰다. 가변 카파 도메인의 증폭은 다음의 단계들을 포함하여 서열 번호 9-13 및 42-45를 포함하는 프라이머를 사용한 3-단계 PCR에 의해 수행된다:
i) 수용액 중의 cDNA 주형, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
ii) 단계(i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
iii) 단계(ii)로부터의 변성된 주형에 대한 프라이머를 55 내지 70℃의 온도 범위에서 어닐링시키는 단계;
iv) 다양한 Vκ 레퍼토리 포획을 초래하도록 65 내지 72℃의 온도에서 단계(iii)으로부터의 어닐링된 주형 상에 프라이머를 연장시켜 가변 카파 도메인을 수득하는 단계.
본 출원은 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 모든 가변 중쇄 도메인의 증폭은 다음의 단계들을 포함하여 서열 번호 1-8을 포함한 프라이머를 사용하여 3-단계 PCR에서 수행된다:
i) 수용액 중의 cDNA 주형, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
ii) 단계(i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
iii) 단계(ii)로부터의 변성된 주형에 프라이머를 55 내지 70℃의 온도 범위에서 어닐링시키는 단계;
iv) 다양한 VH 레퍼토리 포획을 초래하도록 65 내지 72℃의 온도에서 단계(iii)으로부터의 어닐링된 주형 상에 프라이머를 연장시켜 가변 중쇄 도메인을 수득하는 단계.
C-도메인 주형이 플라스미드 기반(합성 작제물)이며, 프라이머에 의해 스캔되고 혼성화되는 표적 염기 쌍의 측면에서 덜 복잡하다는 것을 고려하여, 본 발명은 증폭을 위해 3-단계 PCR (CH1 도메인) 및 2-단계 PCR (Cκ 및 Cλ) 둘 다를 개시한다.
본 출원은 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 CH1 도메인의 증폭은 다음의 단계들을 포함하여 서열 번호 27-28을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 24 및 39를 포함하는 주형을 사용하는 3-단계 PCR로서 수행된다:
i) 수용액 중의 합성 CH1-도메인 주형, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
ii) 단계(i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
iii) 단계(ii)로부터의 변성된 주형에 프라이머를 55 내지 70℃의 온도 범위에서 어닐링시키는 단계;
iv) 65 내지 72℃의 온도에서 단계(iii)으로부터의 어닐링된 주형 상에 프라이머를 연장시켜 불변 중쇄 도메인을 수득하는 단계.
본 출원은 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 Cĸ 및 Cλ 도메인의 증폭은 다음의 단계들을 포함하여 서열 번호 29-31을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 25-26 및 40-41을 포함하는 주형을 사용한 2-단계 PCR에서 수행된다:
i) 수용액 중의 합성 Cκ 및 Cλ 도메인, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
ii) 단계(i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
iii) 65 내지 72℃의 온도에서 단계(ii)로부터의 변성된 주형을 동시에 어닐링 및 연장시켜 불변 카파 및 람다 도메인을 수득하는 단계.
APDL을 생산하기 위한 Vκ 및 Cκ 도메인 및 Vλ 및 Cλ 도메인의 융합은 다음의 단계들을 포함하여 서열 번호 30, 32, 35-37 및 55를 포함하는 프라이머를 사용한 2-단계 PCR에서 수행된다:
i) 수용액 중의 상기한 바와 같이 수득된 경쇄 가변 및 불변 유전자 주형, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
ii) 단계(i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
iii) 65 내지 72℃의 온도에서 단계(ii)로부터의 변성된 주형을 동시에 어닐링 및 연장시켜 람다 및 카파 경쇄 레퍼토리를 수득하는 단계.
APDL을 생산하기 위한 VH 및 CH1 도메인의 융합은 다음의 단계들을 포함하여 서열 번호 28 및 33을 포함하는 프라이머를 사용한 3-단계 PCR에서 수행된다:
i) 수용액 중의 각각의 중쇄 가변 및 불변 유전자 주형, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
ii) 단계(i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
iii) 단계(ii)로부터의 변성된 주형에 대한 프라이머를 55 내지 70℃의 온도 범위에서 어닐링시키는 단계;
iv) 68 내지 72℃의 온도에서 단계(iii)으로부터의 어닐링된 주형 상에 프라이머를 연장시켜 중쇄 레퍼토리를 수득하는 단계.
상기 언급된 단계들로부터 수득된 경쇄 및 중쇄의 융합은 최적 효소 및 완충액 조성을 사용하여 2-단계 또는 3-단계 PCR에 의해 실시되었다. APDL을 생산하기 위한 경쇄 및 중쇄의 융합 PCR은 다음의 단계들을 포함하여 서열 번호 32, 34, 35-37 및 55를 포함한 프라이머를 사용한 2-단계 PCR에서 수행된다:
i) 수용액 중의 경쇄 및 중쇄 레퍼토리, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
ii) 단계(i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
iii) 65 내지 72℃의 온도에서 단계(ii)로부터의 변성된 주형을 동시에 어닐링 및 연장시켜 람다 및 카파 Fab 레퍼토리를 수득하는 단계.
대안적으로, APDL을 생산하기 위한 경쇄 및 중쇄의 융합 PCR은 다음의 단계들을 포함하여 서열 번호 32, 34, 35-37 및 55를 포함하는 프라이머를 사용한 3-단계 PCR에서 수행된다:
i) 수용액 중의 경쇄 및 중쇄 레퍼토리, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
ii) 단계(i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
iii) 단계(ii)로부터의 변성된 주형에 대한 프라이머를 55 내지 70℃의 온도 범위에서 어닐링시키는 단계;
iv) 65 내지 72℃의 온도에서 단계(iii)으로부터의 어닐링된 주형 상에 프라이머를 연장시켜 람다 및 카파 Fab 레퍼토리를 수득하는 단계.
본 출원은 추가로 APDL을 생산하는 방법을 개시하며, 여기서, 완충액은 AmpliTaq® Gold 완충액, AmpliTaq® PCR 완충액, AmpliTaq® PCR 완충액 II, Expand™ 완충액 2, Expand™ 완충액 3, Expand™ 완충액 4, Thermopol® 완충액, Pfu Ultra II 완충액, Exact™ 폴리머라제 완충액, PCR Extender 완충액, Tuning 완충액, Vent® 완충액, Advantage®2 완충액, Advantage®2 SA 완충액을 포함하는 그룹으로부터 선택되고 열안정성 DNA 폴리머라제 효소는 AmpliTaq® Gold DNA 폴리머라제, Expand™ LT Taq DNA 폴리머라제 블렌드, Phusion® 고 충실도 DNA 폴리머라제, PfuUltra™ II HS DNA 폴리머라제, PCR Extender™ DNA 폴리머라제 블렌드, Exact™ DNA 폴리머라제, Vent® DNA 폴리머라제, Deep Vent® DNA 폴리머라제, 및 Advantage®2 DNA 폴리머라제 믹스를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
실시예
본 발명을 뒷받침하는 실시예가 아래와 같이 기술된다. 하기 실시예는 본 발명의 예시에 의해 제공되며 따라서 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
RNA 단리 및 cDNA 합성
총 RNA를 조합된 TRIzol (Invitrogen/ThermoFisher) plus RNeasy 키트 (Qiagen) 방법을 사용하여 인간 PBMC로부터 단리하였다. 신선하게 수확된 PBMC를 TRIzol에서 초음파처리하고 용해물을 -80℃에서 저장하였다. 용해물을 0.2 용적의 클로로포름으로 추출하여 수성 상에 핵산 분획을 단리하였다. 수성 상을 70% 에탄올과 즉시 혼합하고 그후 RNeasy 키트 지침서에 따랐다. RNA를 260nm에서 정량하고, 중성 pH에서 아가로스 겔 전기영동에 의해 품질을 확인하였다. 도 1은 어떠한 게놈 DNA 오염 없이 특징적인 28S 및 16S 밴드를 갖는 고 품질의 온전한 RNA의 존재를 입증하는 에티듐-브로마이드 염색된 겔의 이미지를 보여준다.
이러한 총 RNA 제제로부터 제조된 cDNA는 V-도메인의 증폭을 가능하게 한다. cDNA는 올리고 dT18 및 랜덤 헥사머 프라이머의 혼합물을 사용하는 Superscript III 첫번째 가닥 cDNA 합성 시스템(Invitrogen/ThermoFisher)을 사용하여 이러한 총 RNA 제제로부터 합성하였다. 20㎕ 반응 당 1㎍의 RNA를 첨가하였으며 동일물의 20회 반응을 수행하였다. 완료 후 반응물을 혼주하였다. 혼주된 cDNA를 물에 용해시키고, 페놀 클로로포름 추출에 의해 정제하고 에탄올 침전시켰다. cDNA의 수율은 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전 후 Picogreen 및 Ribogreen 방법 둘 다에 의해 추정하였다. 표 1은 두 개의 염료에 의해 추정된 수율의 차이의 예를 보여준다.
Figure 112019007425361-pct00001
실시예 2
V-도메인의 증폭
23개 프라이머의 세트(서열 번호 1-23)를 사용하여, 합성된 cDNA로부터의 인간 면역글로불린 계열의 VL, VH 및 J 영역을 증폭시켰다. 그러나, 권장된 PCR 조건(Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual)은, 적용되는 경우, 어떠한 앰플리콘도 생산하지 않았다. 급속 PCR 증폭 조건(도 2)을 사용한 매우 효율적인 실시간 PCR 칵테일을 사용하여 앰플리콘을 생산하였다. PCR 반응을 다음의 프로토콜로 사이클링시켰다: 95℃에서 30s 동안 핫 스타트(hot start)에 이어, 95℃에서 5s 동안의 변성, 58℃에서 5s 동안의 어닐링, 플레이트 판독, 72℃에서 30s 동안의 연장의 40회 사이클에 이어, 동시 플레이트 판독과 함께 0.5℃ 증분으로 65℃ 내지 95℃에서 앰플리콘의 용융 곡선 분석. 결과는 도 2에 나타내어져 있다.
본 발명은 IMGT 데이터베이스(Lefranc M-P., 2001)에서 이용 가능한 서열 정보에 기초하여 30개 뉴클레오티드 창에서 모든 인간 가변 유전자 계열의 GC 함량을 분석한다. 표 2A-2C는 모든 V-계열의 평균 % GC 함량은 50%에 가깝지만, 대부분의 VH 및 Vλ 계열 뿐만 아니라 몇몇 Vκ 계열은 다수의 스트레치에서, 특히 처음 두 개의 30nt 창에서 60-70% GC 함량을 가짐을 보여준다. 후자의 스팬은 정방향 V-도메인 증폭 프라이머가 어닐링되도록 설계된 FR1 영역을 포함한다.
[표 2A]
Figure 112019007425361-pct00002
[표 2B]
Figure 112019007425361-pct00003
[표 2C]
Figure 112019007425361-pct00004
도 2 및 표 2A-C로부터의 데이터에 기반하여, 본 발명은 상이한 완충액 뿐만 아니라 병용시 긴 프라이머를 갖는 복합 cDNA 주형의 증폭에 적합한 고 충실도 Taq 폴리머라제와 교정(proofreading) 폴리머라제의 블렌드의 사용을 개시한다. 또한, 본 발명은 선행 기술에 기술된 조건에 반하여 보다 긴 변성 및 조합된 어닐링/연장 사이클을 갖는 2-단계 PCR, 또는 높은 어닐링 온도를 갖는 3-단계 PCR을 이용한다(Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual). Vλ 프라이머 세트(서열 번호 23과 쌍을 이루는 서열 번호 14)에 대한 실험에서, 표적 앰플리콘이 Vλ 도메인에 대해 수득되는 것으로 관찰되었다. 이러한 조건에 기초하여, 실험은 이들의 게놈 기원에 관계없이 유사한 열역학적 특성을 갖는 모든 V 도메인 프라이머(서열 번호 1-23)에 대해 수행하였다. 도 3은 상기 조건이 대다수의 Vλ 도메인에 대해 최적이지만 카파 및 중쇄 가변 도메인에는 적합하지 않다는 것을 입증한다.
실시예 3
V λ -도메인의 최적화된 증폭
도 3에 기반하여, 9개 Vλ 프라이머 쌍 중 8개가 우수한 증폭을 제공하였다고 해도 과언이 아니다. 서열 번호 23으로 증폭시킬 수 없는 정방향 프라이머는 서열 번호 19이었다(도 3). 모든 프라이머를 증폭시키기 위해, 반응당 투입 cDNA를 20ng 내지 50ng로 증가시킴으로써 조건을 더욱 최적화시켰다. PCR 반응은 도 3에 제시된 바와 같은 조건을 사용하여 실시하였다. 도 4에 제시된 결과는 나머지 Vλ-특이 프라이머 쌍과 함께 프라이머 세트 서열 번호 23/서열 번호 19로부터의 Vλ 유전자의 증폭을 입증한다.
실시예 4
V k -도메인의 최적화된 증폭
도 3에 기반하여, 상이한 프로토콜을 사용하여 카파-특이 프라이머(서열 번호 9-13)로 Vκ 도메인을 증폭시킬 필요가 있다고 이해된다. 카파 역방향 프라이머 (서열 번호 13)에 대한 Tm은 72℃보다 낮은 70.6℃인 것으로 관찰되었으며, 이것은 2-단계 PCR에는 너무도 적합하지 않기 때문에, Vκ 증폭을 대표적인 프라이머 쌍으로서 서열 번호 9/서열 번호 13을 사용하는 3-단계 사이클링 프로토콜로 수행하였다. Pfu Ultra II HS 효소를 이 실험에서 사용하였으며, R x C 설계는 일련의 PCR 완충액 및 네 가지 상이한 Ta 온도(56.2℃, 60.7℃, 67.3℃ 및 70℃)를 수반하였다. 이러한 프라이머 쌍으로부터의 최적의 증폭은 증폭 완충액이 Pfu 완충액이고 증폭 효소가 Pfu Ultra II HS 효소인 경우 ~60℃의 어닐링 온도에서 수득되었다.
유사한 3-단계 PCR 조건이 나머지 카파 프라이머 쌍(대표적인 쌍을 포함한 총 4개)에 적용되는 경우, 모두 예상된 크기의 앰플리콘을 생산하였다. 구체적으로, 95℃에서 5min 동안 예열한 후, 반응물을 94℃에서 15s 동안의 변성 단계, 60℃에서 30s 동안의 어닐링, 72℃에서 30s 동안의 연장에 이어 72℃에서 10min 동안의 연장 및 닉-밀봉 단계로 하여 30회 사이클링하였다. 그러나, 프라이머 쌍 서열 번호 9/서열 번호 13 및 서열 번호 10/서열 번호 13은 다른 두 개의 쌍, 즉 서열 번호 11/서열 번호 13 및 서열 번호 12/서열 번호 13와 비교하는 경우 더 효율적으로 증폭되었다(도 5, 패널 A).
대안으로, 본 발명은 또한 Vκ 유전자의 최적의 증폭이 프라이머 쌍 서열 번호 11/서열 번호 13 및 서열 번호 12/서열 번호 13로 수득되고 여기서 증폭 완충액은 Tuning 완충액이고 증폭 효소는 PCR Extender 블렌드인 추가의 프로토콜을 제공한다(도 5, 패널 B & C).
실시예 5
V H -도메인의 최적화된 증폭
도 3에 기반하여, 상이한 프로토콜로 VH 계열을 계열-특이 프라이머(서열 번호 1-9)로 증폭시킬 필요가 있는 것으로 이해된다. 특정 수율의 VH 도메인을 얻기 위해, PCR 완충액의 R x C 설계를 Pfu Ultra II HS 폴리머라제를 사용하여 3-단계 PCR 프로토콜에서 세 가지 상이한 어닐링 온도(56℃, 60℃ 및 68℃)에서 수행하였다. 대표적인 프라이머 쌍은 서열 번호 5/서열 번호 8이었다. 증폭은 시험된 완충액 중의 어느 것을 사용하여 세 가지 모든 온도에서 가능하였지만, 완충액은 수율 또는 특이성에 있어서 다르지 않았다.
최상의 조건은 Pfu Ultra II HS 효소와 완충액 둘 다, 즉 Advantage 2 SA 완충액 및 Tuning 완충액을 사용하여 모든 나머지 VH 쌍의 증폭을 가능하게 하였다. 구체적으로, 95℃에서 5min 동안 예열한 후, 반응물을 94℃에서 15s 동안의 변성 단계, 68℃에서 30s 동안의 어닐링, 72℃에서 30s 동안의 연장에 이어 72℃에서 10min 동안의 연장 및 닉-밀봉 단계로 하여 30회 사이클링하였다. 결과는 도 6에 나타내어져 있다.
실시예 6
C-도메인의 최적화된 증폭
C 도메인-특이 프라이머(서열 번호 27-31)는 V 도메인-특이 프라이머(서열 번호 1-23)에 비해 더 짧으며, 비-어닐링 오버행(플랫 프라이머)을 갖지 않는 것으로 관찰되었다. 본 발명은 또한 플라스미드 기반(합성 작제물; 서열 번호 24-26)이고, 따라서 V 도메인-특이 프라이머에 비해 프라이머에 의해 스캔되고 혼성화되는 표적 염기 쌍의 측면에서 덜 복잡한 C-도메인 주형의 사용을 개시한다.
본 발명의 하나의 측면에서, MgCl2 및 Ta 적정이 이러한 증폭을 위한 최적 조건을 결정하는데 사용되었다. AmpliTaq Gold 완충액과 함께 AmpliTaq Gold 폴리머라제가 이러한 적정을 위해 사용되었다. 구체적으로, 95℃에서 5min 동안 예열한 후, 반응물을 94℃에서 15s 동안의 변성 단계, 72℃에서 30s 동안의 동시 어닐링 및 연장 단계에 이어 72℃에서 10min 동안의 연장 및 닉-밀봉 단계로 하여 30회 사이클링하였다. 모든 C 도메인(CH1, CK 및 CL)은 이러한 접근법에 의해 풍부하게 증폭될 수 있었다.
본 발명의 또 다른 측면에서, C 도메인을 Pfu Ultra II HS 폴리머라제 및 PCR Extender 완충액의 조합을 사용하여 증폭시켰다. 구체적으로, 95℃에서 5min 동안 예열한 후, 주형으로서 서열 번호 24를 함유하는 반응물을 95℃에서 30s 동안의 변성 단계, 65℃에서 30s 동안의 어닐링, 72℃에서 30s 동안의 연장에 이어 72℃에서 10min 동안의 연장 및 닉-밀봉 단계로 하여 30회 사이클링하였다. 유사하게, 95℃에서 5min 동안 예열한 후, 주형으로서 서열 번호 25 또는 26을 함유하는 반응물을 95℃에서 30s 동안의 변성 단계, 72℃에서 30s 동안의 동시 어닐링 및 연장 단계에 이어 72℃에서 10min 동안의 연장 및 닉-밀봉 단계로 하여 30회 사이클링하였다. 도 7은 C-도메인 앰플리콘을 풍부하게 생산하는데 있어서의 이러한 접근법의 유용성을 입증한다.
실시예 7
V λ 및 C λ 도메인의 일차 중첩 조립
Vλ 및 Cλ 융합체를 분명하게 충분히 풍부하게 융합 및 증폭시키기 위해, 도 5에 예시된 바와 같은 R x C 효소 대 완충액 설계를 사용하였다. 표 3A 및 3B에 제시된 바와 같은 효소-완충액 조합 및 PCR 파라미터를 사용하여 등몰 농도의 중첩 산물을 시험하였다.
[표 3A]
Figure 112019007425361-pct00005
[표 3B]
Figure 112019007425361-pct00006
Advantage 2 폴리머라제 블렌드는 상당한 비-특이 증폭 없이 두 개의 완충액에서 정확한 크기의 PCR 앰플리콘의 증폭을 가능케 하였다. 증폭의 특이성은 표 4A 및 4B에 제시된 바와 같은 대안적인 프로토콜의 사용에 의해 증가될 수 있다.
[표 4A]
Figure 112019007425361-pct00007
[표 4B]
Figure 112019007425361-pct00008
수행된 실험은 연장 시간은 줄이지만 사이클 횟수는 줄이지 않고서 비-특이성의 상당한 감소가 있음을 입증한다. 증폭의 특이성은 표 5A 및 5B에 제시된 바와 같은 대안적인 프로토콜의 사용에 의해 더욱 증가될 수 있다.
[표 5A]
Figure 112019007425361-pct00009
[표 5B]
Figure 112019007425361-pct00010
도 8은 보다 낮은 투입 DNA 농도(25ng) 및 폴리머라제 농도(0.5x)의 조합이 비-특이 증폭이 거의 없이 목적하는 PCR 산물(750-800 bp)의 예리하고 풍부한 증폭을 초래하였음을 입증한다. 따라서, Vκ-Cκ 융합을 위한 프라이머 쌍이 Vλ-Cλ(서열 번호 32/서열 번호 30)에 대한 것과 정확히 동일하기 때문에, VλCλ에 대해 최적화된 것과 동일한 조건이 VκCκ 융합을 위해 사용되었다. 이러한 전략은 첫 번째 시도에서 이루어졌으며, 더 이상 최적화할 필요는 없었다.
실시예 8
V H 및 C H 1 도메인의 일차 중첩 조립
VH-CH1 증폭은 표 6A 및 6B에 기술된 바와 같은 프로토콜을 사용하여 수행하였다.
[표 6A]
Figure 112019007425361-pct00011
[표 6B]
Figure 112019007425361-pct00012
시험된 모든 조합은 VH-CH1의 목적하는 750-800bp 중첩 산물의 증폭을 가능케 하였다. 증폭의 특이성은 표 7A 및 7B에 제시된 바와 같은 대안적인 프로토콜의 사용에 의해 더욱 증가될 수 있다.
[표 7A]
Figure 112019007425361-pct00013
[표 7B]
Figure 112019007425361-pct00014
도 9는 고 충실도 Vent 폴리머라제와 Exact 폴리머라제 완충액의 조합(패널 C, 레인 12)이 최소의 스미어링(smearing) 및 비-특이성을 갖는 목적하는 예리한 밴드를 나타냄을 입증한다.
실시예 9
Fab를 생성하기 위한 V L -C L 및 V H -C H 1 도메인의 이차 중첩 조립
VL-CL 및 VH-CH1 주형의 융합은 서열 번호 32/서열 번호 34의 프라이머 쌍을 사용하여 표 8A 및 8B에 기술된 바와 같이 수행하였다. 이 실험에서, VλCλ 증폭 산물 만이 VHCH1 증폭 산물과의 융합을 위해 사용되었다.
[표 8A]
Figure 112019007425361-pct00015
[표 8B]
Figure 112019007425361-pct00016
어떠한 뚜렷한 온도 의존적 동향 없이, 표적 밴드에 매우 가까운 비특이 산물 및 스미어링을 동반한, 매우 적은 양의 목적하는 (~1.5 kb) 2nd 중첩 산물이 형성되었다. 가장 강렬한 증폭은 65.9℃에서 관찰되었으며, 그 다음은 72℃이었다. 대안적인 프로토콜(표 9A 및 9B)에서, Expand LT 폴리머라제가 Ta 적정 포맷으로 사용되었다.
[표 9A]
Figure 112019007425361-pct00017
[표 9B]
Figure 112019007425361-pct00018
Expand LT 효소 블렌드는 자체의 완충액 중에서 또는 PCR Extender 완충액 중에서 VλCλ-VHCH1 주형을 융합시키는데 성공적이었다. 그러나, 융합 산물이 모호하였으며, 1.5 kb 중첩 산물과 함께, 스미어링 및 비특이 밴드가 또한 시험된 모든 어닐링 온도에서 자명하였다.
증폭의 특이성을 개선시키기 위해, Expand LT 폴리머라제를 대안적인 프로토콜(표 10A 및 10B)에서 56℃의 고정된 Ta에서 몇 가지 PCR 완충액으로 추가로 시험하였다.
[표 10A]
Figure 112019007425361-pct00019
[표 10B]
Figure 112019007425361-pct00020
Expand LT가 시험된 모든 8개 완충액 중에서 목적하는 산물을 증폭시킬 수 있기는 하지만, 모든 완충액에서 고분자량 스미어링이 흔하였다. VLCL-VHCH1 융합의 특이성을 개선시키기 위해, 세 가지 전략이 설계되었다(Higuchi R et al., 1988, Horton RM et al., 1989, Sarkar G and Sommer SS, 1990, Warrens AN et al., 1997, Heckman KL and Pease LR, 2007). 비대칭 SOE-PCR(Warrens AN et al., 1997)의 전략 A는 표 11A 및 11B에서와 같이 실행하였다.
[표 11A]
Figure 112019007425361-pct00021
[표 11B]
Figure 112019007425361-pct00022
15 사이클 후, 8㎕의 각각의 VλCλ 및 VHCH1 PCR 반응물을 중첩 주형으로서 사용하였으며 효소 완충액 매트릭스를 중첩 반응을 위해 실시하였다(표 11C). 구체적으로, 반응물을 95℃에서 5min 동안 예열한 다음 95℃에서 30s 동안의 변성 단계, 56℃에서 30s 동안의 어닐링, 72℃에서 3min 동안의 연장 단계에 이어 72℃에서 10min 동안의 연장 및 닉-밀봉 단계로 하여 30회 사이클링하였다. 문헌(Warrens AN et al., 1997)에 기술된 바와 같은 비대칭 PCR 프로토콜은 1.5kb의 목적하는 산물을 형성하지 못했다.
[표 11C]
Figure 112019007425361-pct00023
중간 메가프라이머 정보(Sarkar G and Sommer SS, 1990)의 전략 B를 실행하기 위해, 50ng의 각각의 VλCλ 및 VHCH1을 어떠한 정방향 또는 역방향 프라이머를 첨가하지 않고서 50㎕ 반응물에 혼합하였다. 그후, PCR 반응을 표 12에서와 같이 실시하였다. 그후, 정방향 및 역방향 프라이머(서열 번호 32/서열 번호 34)를 첨가하고, 반응을 동일한 3-단계 조건(표 12) 하에서 30회 이상 사이클링하였다(도 10).
Figure 112019007425361-pct00024
도 10은 Deep Vent 폴리머라제를 제외하고는, 모든 다른 효소-완충액 조합이 목적하는 1.5kb 산물을 형성할 수 있었으며, 선택된 방법이 PCR Extender 효소와 Advantage 2 SA 완충액일 수 있음을 입증한다. 전략 C를 실행하기 위해, 2-단계 PCR 프로토콜을 효소-완충액 R x C 설계 포맷으로 72℃(표 13)에서 실시하였다.
Figure 112019007425361-pct00025
도 11은 이러한 전략이 스미어를 상당히 감소시키면서 확실한 1.5kb Fab 단편을 야기하였음을 입증한다. 따라서, 전략 C의 경우, 최상의 조건은 PCR Extender 효소와 Advantage 2 SA 완충액일 수 있다.
실시예 10
벡터 제조
이러한 목적을 위해, 충분한 양의 pCOMB3XSS(실험실에서 재생성됨; 도 12) 벡터 백본은 총 60㎍의 벡터(3개 반응 튜브; 20㎍/100㎕ 반응)를 50℃에서 밤새 완충액 M (Roche) 중에서 SfiI(10U/㎍ 벡터)로 소화시킴으로써 제조하였다. 반응 혼합물을 혼주하고, 페놀 처리하고, 에탄올 침전시키고 TE에 용해시켰다. SfiI-소화된 벡터를 에티듐 브로마이드 없는 0.8% 예비 겔(preparative gel)의 웰에 부하하였다. 겔을 5V/cm에서 2.5 h 동안 작동시켰다. 에티듐 브로마이드 염색 후, ~3.3 kb pCOMB3XSS 벡터 백본을 겔 추출하고, QIAEXII 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다(도 13). 동시에, SfiI 소화 후 벡터로부터 방출된 ~1.6 kb 스터퍼를 또한 단리하고 겔 정제하였다(도 13). 벡터 백본과 스터퍼 둘 다를 시험 결찰에 사용하여 결찰 효율을 최적화할 뿐만 아니라 벡터 품질을 확인하였다.
도 13은 밤새 과-소화(over-digestion) 후에도, 상당량의 벡터가 소화되지 않을 수 있으며, 소화 패턴이 스미어링하다는 것을 보여준다. pCOMB3XSS에서 두 개의 SfiI 부위의 세밀한 실험은 둘 다(5'-GGCCcaggcGGCC-3' 및 5'-GGCCaggccGGCC-3')가 dcm 메틸트랜스퍼라제 만감성(밑줄 그어진 인지 부위)이기 때문에 이것이 이러한 부위에서의 플라스미드의 헤미-메틸화 성질로 인한 것일 수 있음을 시사한다. dam -/dcm - 대장균 균주의 사용이 시토신 메틸화를 감소시키고 SfiI로의 소화를 개선시키는데 유용할 수 있다. 이러한 균주의 예는 INV110 및 ER2925를 포함한다.
실시예 11
시험 결찰 및 라이브러리 크기 계산
시험 결찰은 SfiI를 사용한 제한 소화 후 벡터로부터 방출된 1.6kb 스터퍼 단편을 사용하여 수행하였다(도 12 및 13 참조). 이 시험을 뒷받침하는 근거는 1.6kb 스터퍼 단편에 대해 최적화된 결찰 조건이 최적화에 있어 유사한 크기(~1.5kb)의 Fab 단편을 낭비하지 않으면서 유사한 크기(~1.5kb)의 Fab 단편에 직접 적용될 수 있다는 것이다.
첫 라운드의 시험 결찰에서, 최적의 벡터: 삽입물 결찰 비에 대한 적정을 수행하였으며, 여기서 일정 질량의 140ng의 SfiI-소화된 벡터(386fmoles)를 하프-로그 단계에서 적합한 몰 비의 SfiI-소화된 스터퍼 및 Fab로 결찰시켰다(1:0.35, 1:1 및 1:3.5 벡터:삽입물 몰 비). 결찰을 위해, 10㎕ 결찰 믹스 당 1U의 T4 DNA 리가제가 사용되었으며, 결찰물을 16℃에서 밤새 배양하였다. 벡터 품질을 확인하고 백그라운드를 계산하기 위해 벡터-단독(자가-결찰) 대조군을 포함시켰다.
결찰 비의 최적화와 함께, 형질전환의 효율에 대한 결찰 혼합물의 열 불활성화의 효과를 또한 시험하였다. 이 목적을 위해, 각 10㎕ 결찰 믹스의 절반을 70℃에서 15min 동안 열 불활성화시켰다. 나머지 5㎕는 있는 그대로 사용하였다. 비가열된 및 열-처리된 결찰 믹스 둘 다의 형질전환은 전기천공에 의해 수행하였다. 형질전환된 세포의 전기천공 및 회수는 제조자의 프로토콜(Lucigen)을 사용하여 실시하였다. 형질전환된 배양물을 100㎍/ml 카베니실린을 함유하는 90mm LB 플레이트 상에 각각 1, 10 및 100㎕를 확산시키기 전에 37℃ 및 250 rpm에서 1h 동안 배양하였다. 플레이트를 37℃ 배양기에서 밤새 배양하였다.
결찰 믹스의 열 불활성화의 효과를 먼저 비교하였다. 도 14A로부터, 전기천공적격(electrocompetent) TG1 세포(Lucigen)를 사용하는 경우 전기천공 전의 결찰 믹스의 열 불활성화가 형질전환의 효율에 극적인 효과를 갖는다는 것이 자명하다. 열 불활성화된 형질전환에서, 콜로니의 수는 비가열된 결찰 믹스로 수행된 형질전환에 비해 수 배 더 높다. 단지 열 불활성화된 샘플로부터의 결과 만이 최적 결찰 비를 결정하기 위해 추가로 고려되었다. 벡터 백그라운드를 계산하기 위해, 열 불활성화된 1:1 비 결찰 믹스를 벡터-단독 플레이트와 비교하였다(도 14B; 표 14).
Figure 112019007425361-pct00026
계산된 벡터 백그라운드는 1.8%이었으며(표 14), 이것은 품질 확인 권장 범위 내에서 잘 고려되었다(Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual). 표 14는 또한 열-처리된 결찰 반응은 전형적인 종-모양 프로파일을 따른다는 것을 보여주며 여기서 1:1 비가 최대 콜로니 수를 제공하며, 따라서 최적 결찰 비로 간주될 수 있다. 따라서, 이 단계에서 계산된 라이브러리 크기(효율)는 형질전환된 벡터 ㎍ 당 1.07 x 108이었다.
이러한 첫 라운드의 형질전환로부터, 열 불활성화가 효율을 개선시키며 1:1 벡터:삽입물 비가 최적인 것으로 결론지어졌다. 본 발명은 형질전환 전에 결찰 혼합물을 희석시킴으로써 효율이 더욱 증가될 수 있음을 개시한다. 본 실험을 열 불활성화된 및 원래의 1:1 믹스 둘 다로 수행하여 열 불활성화의 결과를 재확인하였다.
이러한 실험을 수행하기 위해, 2㎕의 결찰 믹스를 38㎕의 물과 혼합함으로써 1:1 결찰 믹스를 1:20 희석시켰다. 그후, 1, 3, 5, 7 및 10㎕의 희석된 결찰 믹스를 상기한 바와 같이 형질전환시켰다. 전기천공(만약에 있다면) 동안 상이한 용적의 영향을 피하기 위해 모든 희석된 분취량의 용적을 물로 10㎕로 되게 하였다. 그후, 1, 10 및 100㎕의 형질전환체를 이전과 같이 90 mm LB+ 카베니실린(100㎍/ml) 플레이트 상에 플레이팅하였다.
본 발명은 형질전환체의 수가 희석된 결찰물로부터 샘플링된 용적의 동반 증가에 따라 증가한다고 개시한다. 그러나, 이러한 증가는 단지 2 단계(1 내지 3㎕) 내에 이의 최대치에 도달하며, 그후 형질전환은 억제되지는 않지만 안정기(plateau)에 머문다(표 15).
Figure 112019007425361-pct00027
표 15는 결찰 혼합물을 희석시킨 후, 벡터 백그라운드가 1.8%에서 0.23%로 감소됨을 추가로 보여준다. 백그라운드의 이러한 감소는 라이브러리 효율에 있어서의 6배 증가에 기여한다(3㎕의 희석된 1:1 비가 형질전환 용적으로 간주되는 경우 벡터 ㎍ 당 1.07 x 108 내지 6 x 108 cfu; 표 15를 표 14와 비교).
실시예 12
경쇄 및 중쇄 둘 다를 포함하는 상기 면역글로불린 또는 단편의 상이한 도메인을 Sfi I 소화된 pCOMB3XSS에 결찰시킴
Fab 시험 결찰은 스터퍼 대조군(실시예 11)을 사용하여 최적화된 조건(열 불활성화 및 결찰 믹스의 희석)에 따라 수행하였다. Fab는 실시예 9에 입증된 바와 같은 최적 프로토콜에 의해 제조하였다. 결찰 믹스를 70℃에서 15min 동안 열 불활성화시키고 2㎕의 결찰 믹스를 38㎕의 물과 혼합함으로써 1:20 희석시켰다. 3㎕의 결찰 믹스를 25㎕의 TG1 전기천공-적격 세포에서 형질전환시켰다. 배양물을 250 rpm 및 37℃에서 1h 동안 배양하였다. 1, 10 및 100㎕의 배양물을 100㎍/ml 카베니실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. 이 실험으로부터의 콜로니 수가 표 16에 나타내어져 있다.
[표 16]
Figure 112019007425361-pct00028
결찰 믹스 중의 벡터의 양(50ng)을 변경하고 삽입물 대 벡터의 몰 비율(1:1, 1:3 및 1:10 벡터: 삽입물 비; 표 17 참조)을 변경하여 추가의 실험을 수행하였다.
Figure 112019007425361-pct00029
표 16 및 17로부터, Fab에 대한 결찰 효율이 대형 항체 라이브러리의 형성을 야기하는데 최적이 아니었음을 알 수 있다.
실시예 13
Sfi I 소화된 pCOMB3XSS 제제에서 초나선 / 비절단 플라스미드 오염
SfiI-소화된 pCOMB3XSS에 대한 PCR-증폭된 Fab의 낮은 결찰 효율에 책임이 있는 요인(들)을 실험하였다. Fab 결찰 플레이트로부터의 콜로니를 Fab 단편의 존재에 대해 실험하였다. 48개 콜로니를 SfiI 소화 후 1.5kb 밴드의 존재에 대해 이들의 플라스미드 DNA에 대해 분석하였다.
아가로스 겔 분석은 48개 중 46개 클론이 ~ 1.5kb 밴드에 대해 양성임을 보여주었다. ~1.5kb 삽입물을 갖는 양성 클론을 벡터-특이 프라이머로 서열분석하였다. 모든 46개 클론의 서열이 파지 디스플레이 벡터(pCOMB3XSS)의 1.6 kb 스터퍼 단편과 동일한 것으로 관찰되었으며, 이러한 재조합체에 벡터 단독의 존재를 입증한다.
초나선 벡터는 이의 고유의 특성으로 인해 불완전하게 소화되는 것으로 추측되었다. 따라서, 아가로스 겔 상의 단일-종 벡터 밴드는 SfiI 소화된 3.3kb 벡터 밴드 뿐만 아니라 초나선 잔사 둘 다를 함유할 것이며, 후자의 종이 형질전환 동안 우세할 것이다. 따라서, 아가로스 겔 상에서 분해되는 경우, 선형 DNA가 5kb 위치에서 작동하고 초나선 위치가 3.3kb에 있어, 겔에서 분해될 수 있도록 스터퍼 단편 내에 먼저 절단함으로써 벡터를 선형화시켰다. 최상의 결과를 위해서는, 두 차례의 SacI 소화가 바람직하다.
이러한 삼중-소화된 (SacI-SfiI-SacI) 벡터를 사용하여, 오직 벡터 및 스터퍼 대조군과 함께 Fab 제조, SfiI 소화 및 결찰의 완전한 사이클을 수행하여 벡터 백그라운드를 0.02%로 감소시켰다. 스터퍼가 또한 3x108/㎍의 효율로 결찰되지만 Fab의 경우에는 효율이 낮았다.
실시예 14
성공적인 벡터 결찰에 대한 장애물로서의 Fab의 부정확한 말단
Fab의 결찰 효율을 개선시키기 위해, PCR 증폭된 Fab의 5' 및 3' 말단에서 SfiI 인지 서열을 서열분석에 의해 추가로 조사하였다. 이러한 목적을 위해, SfiI 소화 없이 실시예 9에 따라 제조된 분취량의 혼주된 Fab 단편을 키트(TOPO-TA 4.0 kit; Life Technologies/ThermoFisher) 및 키트 내에 함유된 벡터를 사용하여 토포이소머라제 I 매개된 결찰에 의해 클로닝하였다. 24개 클론을 LB-카베니실린 플레이트로부터 선발하고, 플라스미드 DNA를 소규모로 제조하였다. 플라스미드가 SfiI로 소화된 경우, 24개 중 15개(62.5%)는 SfiI 방출을 나타내었다(도 15). 8개 클론의 서열분석은 양 말단에 온전한 SfiI 서열을 갖는 클론(c1, c3, c4, c8 - 표 18)이 또한 제한 소화 후 1.5 kb Fab 밴드를 방출하였음을 입증하였다(도 15). 따라서, 이러한 실험으로부터 혼주된 Fab 단편의 5개 중 1개(20%)는 5' 또는 3' 말단에 부정확한 SfiI를 함유하는 것으로 추측될 수 있다.
Figure 112019007425361-pct00030
실시예 15
Topo 벡터로부터 방출된 Fab는 재- 결찰될 수 있다
도 15는 SfiI 부위가 어느 하나의 말단에서 온전하다면 Fab 단편이 초나선 TOPO 벡터로부터 성공적으로 방출될 수 있음을 충분히 밝혔다. 또한, 본 발명은 TOPO 벡터로부터 방출된 Fab 단편이 SfiI-소화된 TOPO 벡터(Fab 양성 클론으로부터)에 또는 삼중-소화된 pCOMB3XSS 벡터에 다시 결찰될 수 있는지를 조사하였다.
단일 Fab 양성 클론으로부터의 SfiI 방출된 단편을 10㎕ 반응물에서 140ng의 각각의 삼중-소화된 pCOMB3XSS 벡터 뿐만 아니라 SfiI-소화되고 겔 정제된 pCRTOPO4 벡터로 결찰시켰다. 벡터-단독 대조군은 TOPO 및 pCOMB3XSS 벡터 둘 다에 대해 유지시키는 반면 스터퍼 결찰 대조군은 pCOMB3XSS 벡터를 위해서만 사용하였다. pCOMB3XSS 벡터로 결찰시키는 경우, 벡터의 포스포릴화 및 탈포스포릴화 버전 둘 다가 사용되었다(표 19에서 CIP 및 비-CIP로 표시됨).
SfiI-소화된 pCRTOPO4 벡터 및 pCOMB3XSS 벡터로의 TOPO 방출된 Fab의 재-결찰의 결과가 표 19에 나타내어져 있다. 이 데이터는 TOPO 방출된 Fab가 스터퍼 단편에 대해 달성된 바와 유사한 효율로 모 벡터(pCR-TOPO4) 뿐만 아니라 삼중-소화된 pCOMB3XSS 벡터에 다시 성공적으로 재-결찰될 수 있음을 분명히 나타낸다.
Figure 112019007425361-pct00031
따라서, 본 발명은 효율적인 SfiI 소화를 가능하게 하는 초나선 형태의 Fab의 사용 및 Fab의 결찰의 높은 효율을 수득하기 위한 SfiI의 최적 사용을 처음으로 개시한다.
실시예 16
Sfi I 소화를 촉진시키기 위한 자가- 결찰에 의한 Fab의 원형화
Fab 결찰 효율을 개선시키기 위해, 본 발명은 선형 Fab 단편을 자가-결찰시킴으로써 초나선 Fab를 생성하기 위한 접근법을 개시한다. 자가-결찰 후, 단일 선형 Fab가 원형화될 수 있거나 다중 선형 Fab가 서로 결찰되어 선형 연쇄체(concatemer)를 형성할 수 있다. 후자는 그대로 있을 수 있거나, 추가로 결찰되어 SfiI를 위해 더욱 적합한 기질이 되는 초나선 플라스미드를 모방한 보다 큰 원형 분자를 형성할 수 있다. 개념은 도 16에 예시되어 있다.
10㎍의 블런트 말단 Fab를 Pfu Ultra II HS 폴리머라제를 사용하여 생성하고, 37℃에서 2h 동안 T4 폴리뉴클레오티드 키나제와 함께 배양함으로써 포스포릴화시켰다. 키나제 반응을 페놀처리 및 에탄올 침전 전에 65℃에서 열 불활성화시켰다. 그후, 단백질 또는 염 오염물이 없는 포스포릴화된 Fab(2.5㎍)를 30㎕ 반응에서 DNA ㎍ 당 2 단위의 T4 DNA 리가제를 첨가함으로써 16℃에서 밤새 자가-결찰시켰다. 그후, 자가-결찰된 원형 또는 연쇄체 Fab를 페놀처리에 이은 에탄올 침전에 의해 정제시키고, Picogreen 검정에 의해 정량하였다.
분취량의 1㎍의 자가-결찰된 Fab를 아가로스 겔 분석을 위해 저장하고 나머지를 수욕에서 50℃에서 밤새 SfiI 소화(16U/㎍)에 적용하였다. 소화 후, 분취량의 소화물을 원래의 비-결찰된 PCR 산물 및 이전에 저장된 분취량의 결찰된 Fab와 함께 아가로스 겔 분석을 위해 사용하였다. 도 17은 1.5kb Fab 산물의 동반 소멸과 함께 3kb 이상의 범위에 걸친 스미어를 갖는 성공적인 자가-결찰을 입증한다. 도 17은 또한 SfiI 소화 후 선형 Fab 단편의 효율적인 방출을 입증한다.
1.5 kb SfiI-소화된 자가-결찰된 Fab 밴드를 QiaQuik 겔 추출 키트(Qiagen GmBH, Hilden, Germany)를 사용하여 겔 정제하였다. Picogreen에 의한 정량 후, Fab 제제를 140ng의 탈포스포릴화 pCOMB3XSS 벡터에 ~1:2 몰 비로 결찰시켰다. 결찰은 16℃에서 밤새 실시하였다. 결찰 믹스를 70℃에서 15min 동안 열 불활성화시키고 2㎕의 열 불활성화된 결찰 믹스를 38㎕의 물과 혼합함으로써 1:20 희석시켰다. 3㎕의 결찰 믹스를 실시예 11에 예시된 바와 같이 25㎕ TG1 전기천공-적격 세포에서 형질전환시켰다. 밤새 배양 후, 각 플레이트 상에 콜로니가 관찰되었다. 1㎕의 플레이팅 용적이 잘 단리된 콜로니를 나타내었으며 효율 계산을 위해 고려되는 반면(도 18), 10 및 100㎕ 플레이팅 용적 플레이트는 각각 무성하고 빽빽한 성장을 보였다.
제로 벡터 백그라운드와 함께, 자가-결찰되고 SfiI-소화된 Fab는 벡터 ㎍ 당 3.7 x 108 클론의 효율을 나타내었으며(표 20), 따라서 효율을 실시예 12에 비해 3 로그까지 증가시켰다(표 16 및 17과 비교). 자가-원형화의 효율은 실시예 17의 다양한 Fab 혼주물에서 추가로 입증된다.
Figure 112019007425361-pct00032
실시예 17
Sfi I 소화를 촉진시키기 위한 자가- 결찰에 의한 Fab 혼주물의 원형화
카파 Fab 혼주물을 중첩 PCR에 의해 제조하고 실시예 9에 입증된 바와 같이 겔 정제하였다. Fab를 위한 최종 중첩 PCR은 "A" 오버행을 생성하는 PCR Extender 효소 블렌드로 최적화되기 때문에, Fab 결찰 전에 T4 폴리머라제에 의한 블런팅의 부가 단계를 추가하였다. 블런팅된 Fab는 자가-결찰 전에 페놀처리 및 에탄올 침전에 의해 단백질 및 염으로 오염되지 않고 만들어졌다. 자가-결찰, SfiI 소화, 벡터 결찰 및 형질전환 과정은 실시예 16에서와 같이 실시하였다. 이 연구의 결과는 표 21에 제시되어 있다.
Figure 112019007425361-pct00033
표 21의 결과는 자가-결찰 전략이 혼주된 Fab에 대해서도 잘 작동하는 것으로 보이지만 효율이 감소됨을 입증한다(단일 집단 Fab에 비해 1 로그 작음 - 표 21과 표 20 비교). 그러나, 초기에 3.7 x 108/㎍ DNA 효율을 보였던 동일한 단일 집단 Fab 대조물 또한 이 실험에서 반 로그 이상 감소된 효율을 보였다. 이를 고려하여, 자가-결찰된 카파 혼주물의 진짜 결찰 효율은 5.6배 더 높았다(2.1 x 108/㎍ 벡터 DNA).
유사하게, 람다 Fab 혼주물을 중첩 PCR에 의해 제조하고 실시예 9에 입증된 바와 같이 겔 정제하였다. 람다 Fab 혼주물 형질전환의 결과는 도 19에 나타내어져 있으며, 효율 데이터는 표 22에 제시되어 있다.
Figure 112019007425361-pct00034
자가-결찰의 요약이 표 23에 제시되어 있으며, 이것은 본 발명의 대형 나이브 라이브러리를 생성하는데 필요한 결찰 효율을 입증한다.
Figure 112019007425361-pct00035
실시예 18
자가- 결찰되고 Sfi I -소화된 Fab 혼주물에의 pCOMB3XSS 결찰로부터의 재조합 클론의 분석
총 24개 클론(카파 및 람다에 대해 각각 12개)을 초기에 선발하고 플라스미드 DNA를 소규모로 추출하였다. Fab 동일성을 확인하기 위해, PCR를 표 24에 나타낸 바와 같이 2-단계 PCR 프로토콜을 사용하여 주형으로서의 플라스미드 DNA 및 Fab 말단-특이 프라이머 서열 번호 32/서열 번호 34로 수행하였다. 이러한 증폭을 위해 AmpliTaq Gold 효소를 1.5mM MgCl2를 함유하는 AmpliTaq Gold 완충액과 함께 사용하였다.
Figure 112019007425361-pct00036
동시에, 플라스미드 DNA 샘플을 SfiI로 소화시켰다. 클론이 Fab 양성이라면, 분석 둘 다로부터 1.5kb 밴드가 예상될 것이다. 모든 12개 카파 및 12개 람다 클론이 Fab 특이 PCR 증폭에 대해(도 20, 패널 A 및 B) 뿐만 아니라 SfiI 방출에 대해(도 20, 패널 C 및 D) 양성인 것으로 관찰되었다.
모든 12개 클론이 Fab 양성임을 확인시, 카파 및 람다 결찰 플레이트에 대해 각각 또 다른 36개 클론을 퍼센트 및 다양성 질문에 대답하기 위해 추가로 분석하였다. 따라서 카파 및 람다 Fab에 대해 각각 총 48개 클론을 표 24에 타나낸 바와 같이 2-단계 PCR 프로토콜을 사용하여 Fab 특이 프라이머 서열 번호 32/서열 번호 34을 사용하여 Fab의 존재에 대해 PCR에 의해 분석하였다. 각 50㎕ PCR 반응으로부터 10㎕를 아가로스 겔 분석을 위해 사용하였다. 결과는 모든 96개 클론이 Fab 삽입물에 대해 양성이며 분명한 1.5kb 밴드를 보임을 입증한다.
그후, 모든 48개 클론을 BstNI 핑거프린팅에 적용하였다. 이러한 분석을 수행하기 위해, 각 50㎕ PCR 반응으로부터 남은 40㎕를 BstNI 소화에 적용하였다. 소화 혼합물은 표 25에 나타내어져 있다.
Figure 112019007425361-pct00037
각 소화 믹스로부터 40㎕를 3% 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 도 21은 카파 및 람다 클론 중 어느 것도 임의의 반복 패턴을 보이지 않았으며 각각의 클론은 다르다는 것을 보여준다.
각 라이브러리로부터의 모든 48개 클론을 두 개의 벡터 백본 특이, 두 개의 pelB 인접 영역 특이, 및 하나의 CH1 특이 프라이머를 사용한 디데옥시 서열분석에 적용하였다. 각 클론의 Fab 서열을 서열 크로마토그램으로부터의 콘틱(contig) 구축의 알고리즘, 및 비정상 염기 호출의 시각적 확인에 따라 분석하였다. 그후, 콘틱을 5' 및 3' 말단의 SfiI 부위, VL, VH, CL 및 CH1 도메인과 같은 지표에 대해, 및 개시에서 종결 코돈까지의 개별 경쇄 및 중쇄의 완전성에 대해 수동으로 주석을 달았다. 도 22는 모든 람다 클론의 양 말단 상의 온전한 SfiI 부위의 확인을 입증하는 예이다.
수동 분석 및 주해(annotation)의 결과가 표 26 및 27에 요약되어 있다. 이들 표에 기초하여, 신규한 자가-결찰 방법에 의해 제조된 카파 또는 람다 Fab 라이브러리로부터의 클론의 ~80%는 전장 번역 가능한 Fab이다.
Figure 112019007425361-pct00038
Figure 112019007425361-pct00039
모든 클론의 VL 및 VH 도메인의 서열을 생식계열 계열, 프레임워크 및 CDR에 대한 상세한 주해 뿐만 아니라 기준 인간 서열과 비교한 아미노산의 차이에 대해 IMGT 데이터베이스에 제출하였다. 이러한 분석(표 28)은 각각의 VH (VH6) 및 Vλ (VL10)의 하나의 계열을 제외하고는, 모든 다른 계열이 이들 클론에 나타내어져 있음을 보여주었다(표 28). 이러한 없어진 계열은 다른 계열에 비해 더 적은 변이체를 나타내기 때문에, 이러한 계열에 속하는 클론은 이러한 서열 데이터세트에서 이들의 희귀성 및 낮은 샘플링 수 둘 다 때문에 없어진 것일 수 있다. 모든 VH 도메인의 46%이 VH4 계열에 속하고 24%가 VH3에 속하는 반면, 다른 계열(VH1, VH2 및 VH5)은 5-18% 범위이었다. 유사하게, Vκ의 5개 계열 및 Vλ의 8개 계열이 나타내어졌다. 카파 계열에서, 클론의 50%는 VK3 계열에 속하고 30%는 VK1 계열에 속하였다. 다른 계열의 표현은 2.5 내지 10%이었다. 람다 계열에서, 표현은 VL1의 경우 33%, VL2의 경우 31%이었으며, 나머지 계열(VL3, VL4, VL6, VL7, VL8 및 VL9)은 3-13% 범위이었다.
IMGT 데이터베이스로부터의 나머지 주해가 서열분석된 클론의 서브세트에 대해 표 29-31에 요약되어 있다. 모든 클론의 97%는 어떠한 종결 코돈도 없이 V 도메인을 가지며, 따라서 기능적이다. 이것은 주목할 만한 수치이며, 우리의 증폭 전략이 기능적 Ig mRNA의 충실한 포착을 초래함을 시사한다.
Figure 112019007425361-pct00040
Figure 112019007425361-pct00041
Figure 112019007425361-pct00042
Figure 112019007425361-pct00043
실시예 19
자가- 원형화 공정 및 회수 계산의 개선
도 17의 데이터는 SfiI 소화된 Fab가 자가-결찰된 선형 Fab로부터 제조된 경우, 식별할 수 있는 비율의 비-결찰된 Fab가 남아있음을 보여준다. 초기에 생성된 프로토콜에서, 이러한 소화되지 않은 Fab 집단은 아가로스 겔 분별화 동안 방출된 (SfiI 소화된 결찰 가능한) Fab와 함께 이동된다(도 17). 이러한 소화되지 않은 Fab 집단은 라이브러리의 효율을 감소시킬 뿐만 아니라 결찰 가능한 Fab의 비율을 희석시킬 것 같다. 선형 Fab의 자가-원형화의 최적화 방법이 아래에 본원에 제시되어 있다:
접근법 1 - 결찰 DNA를 군집화시킴으로써 자가- 결찰(스미어 형성)을 개선시 킴: Fab를 실시예 16 및 17에 따라 결찰시켰다. ~83ng/㎕ DNA를 20㎕의 결찰 반응에 사용하였다. 농도를 200ng/㎕로 증가시킴으로써 선형 Fab의 군집화(crowding)를 시도하였다. Fab의 농도 둘 다를 반응 당 6% 최종 농도에서 분자 군집화제 PEG 8000의 존재 및 부재하에서 자가-결찰시켰다(Green MR and Sambrook J, 2012c. Cloning in plasmid vectors: Blunt end cloning; In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 1). 결찰 반응물을 16℃에서 밤새 배양하고, 아가로스 겔 분석 전에 유기 추출에 의해 정제하였다(도 23).
잔류 1.5kb 비-결찰된 Fab의 감소된 양에 의해 나타내어지는 바와 같이, PEG 8000의 존재 및 단위 용적당 DNA 농도의 증가가 자가-결찰을 상당히 개선시켰음이 도 23으로부터 자명하다.
접근법 2 - HMW 스미어 집단의 겔 정제 및 소화에 의해 100% 결찰 가능한 Fab를 수득함: SfiI 소화된 결찰 가능한 Fab 집단으로부터 비-결찰 가능한 Fab를 피하는 또 다른 접근법은 고분자량(HMW) DNA 스미어(도 23의 상자 영역 참조) 만을 겔 추출하여, SfiI 소화 전에 1.5kb 밴드를 배제하는 것이다. 아가로스 겔로부터의 HMW 스미어의 회수는 아래와 같은 다양한 방법으로 수행하였다:
a. 표준 QIAEXII 프로토콜을 사용한 스미어의 겔 추출(아가로스 겔 조각의 단위 그램당 3 용적의 QX1).
b. 수정된 QIAEXII 프로토콜을 사용한 스미어의 겔 추출(de Haard HJW, 2002. Construction of large naive Fab libraries. In: Methods in Molecular Biology, vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols; 30 volumes of QX1 per unit gram of agarose gel piece and 100㎕ of beads per 5㎍ of DNA).
c. 전기-용출 방법에 의한 겔 추출(Sambrook J and Russell DW, 2001c. Recovery of DNA from agarose gels: electroelution in dialysis bags; In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 1).
d. 겔 추출 없이 - 겔 추출 대신에, 자가-결찰 혼합물을 Nanosep (Pall) 또는 Microcon (Millipore) 스핀 필터를 사용하여 물로 정화 및 완충액 교체하고, SfiI로 직접 소화시킴.
실험 a. 내지 d.를 실행하기 위해, 총 75㎍의 Fab를 실시예 9에 따라 PCR Extender 폴리머라제 블렌드를 사용하여 생성하였다. 블런팅 및 포스포릴화 후, ~23㎍의 Fab를 회수하였다. 이 과정 동안 항상 큰 손실이 있으며, 특히 T4 DNA 폴리머라제에 의한 블런팅 후 회수하는 동안 그러하다. 그러나, 블런팅은 최종 SOE PCR 단계에 의해 Fab을 생성하는데 사용되는 열안정성 DNA 폴리머라제가 블런트 말단을 생성하지 않는 경우 선형 Fab 단편의 자가-결찰에 대해 필수적이다. 23㎍의 Fab를 자가-결찰 프로토콜에 따라 결찰시키고 세 가지 상이한 예비 미니 겔에 균일하게 (~5.6㎍/겔)에 부하하여 실험 a. 내지 c.를 실행하였다. 네 번째 5.6㎍의 분취량을 실험 d.를 위해 저장하였다.
각각 5.6㎍으로 시작하여, 회수량은 PicoGreen 검정을 사용하여 측정되는 바와 같이 각각 230ng (4.1% - 표준 QIAEX II 프로토콜), 180ng (3.2% - 수정된 QIAEX II 프로토콜), 900ng (16% - 전기용출), 및 4.6㎍ (~82% - 단지 스핀 필터에서 완충액 교환)이었다. 이러한 HMW 스미어링된 Fab의 SfiI 소화 패턴을 확인하기 위해, 방법 a. 내지 c.로부터 회수된 물질을 혼주하고 16U/㎍의 SfiI(Roche Diagnostics)를 사용하여 완충액 M (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) 중에서 50℃에서 밤새 소화시켰다. 유사하게, 실험 d.로부터 회수된 Fab(~4.6㎍)를 세 부분(각각 1.5㎍)으로 나누었다. 한 부분은 자가-결찰을 확인하기 위해 그대로 유지시키는 반면 다른 두 부분은 완충액 M (Roche) 중에서 50℃에서 밤새 Fab ㎍당 16U 및 32U의 SfiI를 사용하여 소화시켰다. SfiI는 이들이 겔 추출 또는 단순 완충액 교환을 통해 수득되었는지에 관계없이 HMW 스미어로부터 1.5kb Fab 밴드를 확실히 방출할 수 있었다.
SOE PCR Fab 혼주물로부터의 50㎍의 PCR-증폭된 Fab로 다시 시작하는 두 번째 라운드의 최적화에서, 대형 라이브러리를 생성하기 전에 각 단계의 정확한 수율을 산출하였다(표 32).
Figure 112019007425361-pct00044
실시예 20
초수용 TG1 세포에서의 전기천공 파라미터
2 x (5 x 108) = 109 클론의 표적 라이브러리 크기에 도달하기 위해, 본 발명은 초나선 플라스미드 대조물보다 2 로그 더 높은 형질전환 효율(즉, 4-5 x 1010 cfu/㎍; Lucigen, Madison, WI, USA)을 갖는 전기천공적격 세포를 시용한다.
형질전환은 pUC 대조물(10pg/25㎕ TG1 세포; 1800V, 25μF, 600Ω으로 설정된 전기천공 펄스)을 사용하여 삼중으로 1mm 갭 큐벳에서 수행하였다. 효율은 1-1.6x1010 cfu/㎍ DNA (표 33)에 이른다 - 이러한 세포에 대해 pUC 대조물에 대해 보고된 제품 내역(≥4 x 1010 cfu/㎍)에 반해. 본 발명은 신규한 TG1 세포가 1mm 갭 큐벳에서 바람직한 1010 cfu/㎍ 규모의 효율을 가지며 대규모 Fab 라이브러리 제조에 사용될 수 있다고 결론짓는다.
Figure 112019007425361-pct00045
1mm 갭 큐벳은 40㎕ 단독의 권장 최대 충전 용적을 갖고, 따라서 대형 라이브러리를 제조하기에는 너무 단조롭기 때문에, 본 발명은 동일한 세포의 효율을 실험하되 더 큰 2mm 큐벳에서 용적을 배가시켰다. 이러한 확장성 질문은 1mm에서 2mm 큐벳으로 최적화를 이동시킬 때 역사적 결과들 간의 재현성과 비교 가능성을 이해하기 위해 매우 중요하였다.
이 실험을 실행하기 위해, 상이한 전기천공 프로토콜을 전압, 정전용량 및 저항을 변화시킴으로써 2mm 큐벳에 대해 시험하여 최적 파라미터를 찾았다. 두 개의 예비-설정된 프로토콜이 이용 가능한 전기천공기(Genepulser Xcell, BioRad)에서 2mm 큐벳에 대해 제안된다 - a) 2500V, 25μF, 200Ω, 및 b) 3000V, 25μF, 200Ω. 1mm 내지 2mm 큐벳에 대해 파라미터를 비례적으로 증가시킴으로써 하나 이상의 프로토콜을 설계하였다. 시도된 첫번째 변화는 증가된 세포 질량에 대해 보상하기 위해 암페어를 비례적으로 증가시킴과 함께 전극 플레이트 판 사이의 거리의 배가(doubling)를 보상하기 위해 전압을 배가시키는 것이었다. 이러한 전기천공기는 3600V 상태를 설정하지 못하기 때문에, 3000V, 25μF 및 300Ω의 설정을 수행하였다. 상기한 프로토콜을 사용하여 50㎕ 세포당 20pg의 pUC19 플라스미드를 전기천공시켰다.
Figure 112019007425361-pct00046
주어진 로트의 TG1 세포에 대한 효율은 ~1x1010/DNA ㎍으로 남아있는 것으로 관찰되었다(표 34). 최적화는 1mm에서 2mm 갭 BioRad 큐벳으로 선형으로 확장 가능한 것으로 결론지어졌다. 따라서, 이러한 측면으로부터 모든 최적화는 달리 명시하지 않는 한 3000V, 25μF 및 300Ω의 프로토콜로 2mm 큐벳에서 수행하였다.
실시예 21
초수용 TG1 세포에서의 형질전환 파라미터
결찰 및 전기천공 시험을 위한 최적화된 과정에 따라(표 15 참조), 25㎕의 TG1 세포당 3㎕의 열 불활성화되고 1:20 희석된 결찰 믹스를 형질전환시킬 필요가 있으며, 이것은 형질전환 당 2.2ng에 등가이다(벡터 및 Fab 각각 1.1ng). 따라서, 109/㎍의 벡터 DNA의 라이브러리 크기에 도달하기 위해, ~1000회 개별 형질전환을 수행하는 것이 필요하다는 결론이 나온다. 본 발명은 침전에 의해 또는 완충액 교환에 의해 염을 제거함으로써, 및 아래 본원에 입증된 바와 같이 투입 총 결찰 DNA의 양에 비하여 고정된 용적의 TG1 세포에 대해 포화점을 정확히 적정함으로써 형질전환의 수의 감소를 개시한다.
실시예 21a - 형질전환 효율에 대한 결찰 믹스의 염 제거의 효과: 이 실험을 위해 스터퍼-pCOMB3XSS 결찰을 사용하였다. 총 22개 결찰 반응물을 설정하여(140ng 벡터 + 140ng 스터퍼/20㎕ 반응물) ~6㎍의 결찰된 DNA 혼합물을 얻었다. 선형화된 벡터 및 스터퍼 DNA 믹스를 45℃에서 5min 동안 가열하고, 부당한 응집 말단 결찰을 방지하기 위해 리가제 완충액 및 리가제 효소를 첨가하기 전에 빙상에서 즉시 냉각시켰다. 16℃에서 밤새 결찰 후, 결찰물을 70℃에서 15min 동안 열 불활성화시켰다. 6㎍ 결찰 혼주물을 2 부분(각각 3㎍)으로 나누었다. 한 부분은 에탄올 침전에 의해 염 제거에 적용하는 반면 두 번째 부분은 Microcon DNA 신속 유동 스핀-필터를 사용하여 염 제거에 적용하였다. 초나선 pCOMB3XSS 플라스미드 단독을 양성 대조군으로서 유지시켰으며, 여기서 이것을 결찰 믹스에 첨가하고 스터퍼-pCOMB3XSS 결찰과 정확히 같은 방식으로 처리하였다. 실험 과정 및 세포가 예상대로 작동하는지를 보장하기 위해 초나선 pUC19 대조물을 또한 포함시켰다. 이 실험을 수행하면서 투입 DNA의 양 및 각 단계에서의 회수율을 기록하였다(표 35).
Figure 112019007425361-pct00047
에탄올 침전에 의해 또는 Microcon 스핀 필터에 의해 정화된 DNA를 2mm BioRad 큐벳에서 TG1 세포 50㎕ 마다 4.4ng(총 DNA)의 양으로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 2% 글루코스 및 50㎍/ml 카베니실린을 함유하는 90mm LB 한천 플레이트 상에 2, 5 및 10㎕ 플레이팅하기 전에 950㎕의 회수 완충액 (Lucigen)에서 재생시켰다. 표 36은 효율 계산을 보여준다.
~1010/㎍ 효율이 초나선 pUC 대조군에 대해 반복되었으며, Microcon 스핀-필터 정제된 샘플은 에탄올 침전된 샘플보다 약간 더 양호한 효율을 제공하였다. 플레이팅 데이터는 Microcon 스핀-필터 정제된 샘플 단독에 대한 스터퍼-pCOMB3XSS 결찰에 대해 나타내어져 있다.
Figure 112019007425361-pct00048
표 36은 0.2% 미만의 벡터 백그라운드, 및 2.89 x 109/㎍의 벡터의 형질전환 효율을 갖는 혼잡한 성장에 의해 나타내어지는 바와 같이 스터퍼가 성공적으로 결찰한다는 것을 입증한다. 표 36으로부터, 다수의 형질전환을 야기하는, 희석(1:20)에 의한 결찰 믹스로부터의 염의 제거가 결찰된 DNA의 90% 이상의 회수율을 갖는 Microcon 스핀-필터 장치를 사용한 염 제거에 의한 방법으로 대체될 수 있으며, 형질전환 효율은 단순 희석과 동일하거나 더 양호한 것으로 또한 결론지어질 수 있다.
실시예 21b - 효율 ≥10 10 cfu / ㎍의 TG1 세포 형질전환을 위한 최적의 세포-대--DNA 비: 109개 클론의 라이브러리 크기에 도달하기 위해 형질전환의 수를 감소시키는 또 다른 가능한 접근법은 어떠한 효율 감소 없이 고정된 용적(50㎕)의 TG1 세포로 형질전환될 수 있는 DNA의 최대량을 찾아내는 것이다. 총 18개의 표준 결찰 반응물, 각각 140ng 벡터 + 140ng 스터퍼 = 280ng 총 DNA를 함유하는 20㎕ 반응물을 실시예 21a에 기재된 바와 정확하게 설정하여 ~5㎍의 결찰된 DNA를 수득하였다. 모든 반응물을 혼주하고, 혼주된 결찰 믹스를 Microcon 스핀-필터를 사용하여 세정한 후 ~3.5㎍의 결찰된 DNA를 회수하였다. 실시예 21a에 제시된 프로토콜에 따라 총 4.4ng(벡터 + 삽입물)로 시작하여, 50㎕의 TG1 세포당 다음의 DNA 양을 형질전환시켰다: 6.25, 12.5, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 400 및 800ng. 형질전환된 세포를 2% 글루코스 및 50㎍/ml 카베니실린을 함유하는 90mm LB 한천 플레이트 상에 1:1000, 1:5000, 1:25000 및 1:50000 희석으로부터 각각 100㎕를 플레이팅하기 전에 950㎕의 회수 완충액 (Lucigen)에서 재생시켰다. 1:100000 희석은 단지 400 및 800ng 샘플에 대해서만 수행하였다. 도 24A는 이러한 결찰로부터의 형질전환된 플레이트를 보여주고, 표 37은 계수되고 프로세싱된 데이터를 보여준다.
Figure 112019007425361-pct00049
투입 DNA 질량 대 콜로니 계수 데이터의 그래프 분석(표 37)은 선형 적합도는 불량하였지만(0.769의 R2; 도 24B, 패널 A), 비-선형(2차 다항식) 적합도는 훨씬 양호한 것(0.922의 R2; 도 24B, 패널 B)으로 판명되었음을 보여주었다. 비-선형 적합도는 투입 DNA 질량에 대한 콜로니 수의 의존도가 직선이 아니며, 비-선형 적합 곡선의 점근선이 포화점임을 분명히 시사한다. 본 발명은 또한 전체 선형 적합도를 전체 적합도(도 24B, 패널 C)보다 훨씬 더 양호한 결정 계수(R2)를 갖는 두 개의 개별 선형 적합도로 파단시키기 위한 도 24B에 제시된 바와 같은 대안적인 그래픽 접근법(segmented regression; Jones RH and Mollitoris BA, 1984; Kuchenhoff H, 1996)을 개시하며, 두 개의 개별 적합도의 교차점을 포화점으로 간주하였다. 이 값이 50㎕의 TG1 세포 당 ~272ng의 총 결찰된 DNA이다.
본 발명은 또한 세포의 용적 증가와 관련한 형질전환 효율의 영향을 실험한다. 동일한 2mm 큐벳에서 100㎕의 TG1 세포당 400ng 투입 DNA를 형질전환시켰다. 효율은 투입 DNA 질량을 200에서 400ng으로 비례적으로 증가시킴으로써 실험하였다. 데이터에 기반하여, 효율은 용적 증가시 절반까지(9.13 x 108 cfu/㎍) 감소되는 것으로 결론지어질 수 있다.
실시예 22
자가- 원형화 프로토콜에 의한 대형 파지미드 라이브러리 제조
RNA를 CTL(Cellular Technologies Ltd., Cleveland, OH, USA)로부터의 특성화된 PBMC를 사용하고 실시예 1에 상세화된 다음 단계들에 의해 12명의 기증자 혼주물로부터 단리하였다. cDNA는 실시예 1에 상세화된 바와 같이 제조하였다. 제조된 cDNA의 품질을 시험하기 위해, 각각 VH, Vk 및 Vλ 도메인에 특이적인 하나의 프라이머 쌍을 50㎕ 반응당 50ng 주형으로 혼주된 cDNA에 사용하였다. 실시예 3-5에 기술된 바와 같은 최적 PCR 사이클링 프로토콜의 사용은 이러한 cDNA 제제로부터의 각각의 V-계열의 명백한 증폭을 초래하였다.
이러한 결과에 기초하여, RNA 샘플을 이 시점에서 혼주하고(~900㎍), 분취하고, -80℃에서 저장하였다. 인간 PBMC의 혼주된 총 RNA로부터의 maxi-cDNA 제제에 대해, 120개 반응물을 반응당 1㎍의 총 RNA와 조립하였다. 수율은 RiboGreen 방법에 의해 추정하였다. 13.6㎍ cDNA의 총 수율(표 38)을 CTL로부터의 비특성화된 PBMC로부터 초기에 제조된 4.2㎍ cDNA와 혼주하였다(3명의 기증자; 표 1).
Figure 112019007425361-pct00050
최종 카파 및 람다 Fab 단편을 제조하기 위한 PCR 증폭은 실시예 3-9에 기술된 방법을 사용하여 수행하였다.
자가-결찰 과정에 대한 회수 차트(표 32 및 35)에 기초하여, 5㎍의 각각의 최종 결찰 가능한 카파 및 람다 Fab를 생성하기 위해서는, 100㎍의 각 타입의 Fab가 자가-결찰 과정을 시작할 필요가 있는 것으로 계산되었다. 1차 중첩 (SOE) PCR을 등몰량의 V 및 C 유전자를 사용하여 수행하였다. 각 경쇄에 대해 총 50회 SOE 반응 및 각 중쇄에 대해 100회 SOE 반응을 설정하였다. QIAEXII 겔 추출 키트에 의한 최종 수율은 VλCλ의 경우 27㎍, VkCk의 경우 31㎍ 및 VHCH1의 경우 53㎍이었다. 2차 중첩 (SOE) PCR을 등몰량의 VLCL 및 VHCH1 앰플리콘을 사용하여 유사하게 수행하였다. 각각의 카파 및 람다 쇄에 대해 총 500회 PCR을 수행하였다. QIAEXII 겔 추출 키트에 의한 최종 수율은 λ-Fab의 경우 96㎍ 및 k-Fab의 경우 99㎍이었다.
블런팅 및 키나싱(kinasing) 후, 샘플을 ~500ng/㎕로 조절하고, 1U/㎍의 T4 DNA 리가제를 사용하여 15㎕ 반응당 3.0㎍의 Fab를 결찰시켰다. 15㎕ 반응 용적에서의 최종 농도가 200ng/㎕에 도달하도록 DNA 농도를 조절하였다. 실시예 19에 예시된 바와 같이, PEG 8000을 6%의 최종 농도로 되도록 첨가하였다. 반응물을 16℃에서 PCR 블럭에서 14-16h 동안 배양하였다. 결찰물을 더욱 진행하기 전에 밤새 배양 후 실온에서 1h 동안 방치하였다.
분취량(1-2㎍)의 자가-결찰된 Fab(스미어)를 분석을 위해 저장하였다. 남은 결찰 반응물을 혼주하고 먼저 페놀처리에 의해 정화한 다음 Microcon 스핀-필터를 사용하여 물로 세 차례의 완충액 교환을 거쳤다. A260 /A280 비를 NanoVue (GE)를 사용하여 확인하였으며 이것은 대개 1.7 내지 1.9의 범위였다. 실제 dsDNA 농도를 PicoGreen 검정을 사용하여 측정하였다. 염- 및 단백질-비함유 자가-결찰된 고분자량(HMW) Fab 스미어를 SfiI를 사용하여 1.5kb Fab 방출에 적용하였다. 완충액 M(Roche) 중 Fab의 ㎍ 당 32U의 SfiI(Roche)를 첨가하고, 50℃에서 밤새 배양하였다. 분취량(1-2㎍)의 DLM SfiI 방출된 Fab를 아가로스 겔 분석을 위해 저장하고, 나머지를 컬럼 기반 겔 추출을 사용하여 겔 정제하였다.
분석용 겔(도 25)은 90% 이상의 선형 Fab가 HMW 스미어 형성에 참여하였으며 유사한 퍼센트가 1.5kb SfiI 방출을 보였음을 나타낸다. 따라서, 전체 공정이 90% 이상의 SfiI 결찰 가능한 Fab를 함유하는 Fab 혼주물을 생성하는데 있어서 성공적인 것으로 결론지어졌다. 표 39는 각 단계에서의 출발 물질 및 회수 퍼센트에 대한 결찰 가능한 Fab 제조의 보고를 제공한다. SfiI 소화된 pCOMB3XSS 벡터로의 결찰을 위해 ~3.4㎍의 카파 및 ~4.65㎍의 람다 Fab를 최종적으로 제조하였다.
Figure 112019007425361-pct00051
140ng의 SfiI 소화된 pCOMB3XSS 벡터를 1U/㎍의 T4 DNA 리가제(Roche)를 사용하여 20㎕ 반응에서 140ng의 SfiI-소화된 Fab(벡터 : 삽입물에 대해 1:2 몰 비)와 결찰시키고, 16℃에서 밤새 배양하였다. 총 ~3.4㎍의 카파 및 ~4.65㎍의 람다 Fab를 결찰시키기 위해, 상기 부분에 상세히 기술된 바와 같이 필요한 수의 결찰을 설정하였다. 밤새(16h) 배양 후, 결찰 혼합물을 70℃에서 15min 동안 열 불활성화시키고 함께 혼주하였다. 카파 및 람다 Fab를 별도로 가공하였다. 혼주물을 Microcon 스핀-필터를 사용하여 3회 염 제거 및 완충액 교환에 적용하였다. A260 /A280 비를 NanoVue를 사용하여 확인하였으며 1.7 내지 1.9의 범위였다. 실제 dsDNA 농도는 PicoGreen 검정을 사용하여 측정하였다. 염 제거 후, 결찰된 물질의 총 회수는 카파 및 람다 결찰에 대해 각각 5.2 및 6.5㎍(벡터 + Fab)이었다.
최대 272ng의 정제된 결찰 DNA(벡터 + 삽입물)가 효율의 감소 전 최적화된 전기천공 파라미터를 갖는 2mm 갭 BioRad 큐벳에서 50㎕ TG1 세포당 전기천공될 수 있다는 추정(표 37, 도 24B)에 기초하여, 라이브러리 형질전환을 이에 따라 설정하였다. 카파 라이브러리(5166ng, 벡터 + Fab)를 제조하기 위해, 총 20회 형질전환을 2 세트(10회 형질전환/세트)로 수행하였으며, 이것은 카파에 대해 2개 서브-라이브러리를 야기하였다. 이것은 50㎕ 세포당 ~258ng DNA(129ng의 결찰된 벡터)를 형질전환시킴과 같았다. 배양물을 37℃ 및 250rpm에서 1h 동안 배양하였다. 10회 형질전환(세트 1) 후 생성된 10ml 배양물을 15ml로 되도록 희석시키고 3ml/플레이트의 양으로 50㎍/ml 카베니실린 및 2% 글루코스를 함유하는 총 5개 대형 LB 한천 플레이트(245 x 245mm) 상에 확산시켰다. 따라서, 카파 라이브러리가 총 10개 플레이트 상에 플레이팅되었다(세트 1 및 2; 카파 서브-라이브러리 001 및 002; 표 40 참조). 50㎕ 분취량의 각각의 서브-라이브러리를 서브-라이브러리의 형질전환 효율을 계산하기 위해 남겨두었다.
유사하게, 람다 라이브러리(6500ng, 벡터 + Fab)를 제조하기 위해, 총 30회 형질전환을 3 세트(10회 형질전환/세트)로 수행하였으며, 이것은 람다에 대해 15개 대형 플레이트 및 3개 서브-라이브러리를 야기하였다(세트 3-5; 람다 서브-라이브러리 001, 002, 및 003; 표 40 참조). 이것은 50㎕ 세포당 ~216ng DNA(108ng의 결찰된 벡터)를 형질전환시킴과 같았다. 50㎕ 분취량의 각각의 서브-라이브러리를 다시 서브-라이브러리의 형질전환 효율을 계산하기 위해 남겨두었다.
㎍당 형질전환의 효율을 계산하기 위해, 각각의 카파 및 람다 서브-라이브러리로부터 저장된 50㎕ 분취량을 회수 배지에서 1:1000, 1:5000, 1:25000, 1:50000 및 1:100000 희석시켰다. 100㎕의 각각의 희석물을 50㎍/ml 카베니실린 및 2% 글루코스를 함유하는 90mm LB 한천 플레이트 상에 삼중으로 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 배양 후, 대형 라이브러리 플레이트 상에서 빽빽한 성장이 관찰되었으며 효율 플레이트는 잘 단리된 콜로니를 나타내었다. 각각의 형질전환 효율 및 라이브러리 크기의 요약된 결과가 표 40에 나타내어져 있다.
각각의 대형 플레이트로부터의 박테리아 론(bacterial lawn)을 5ml의 LB + 1% 글루코스 브로스(스크레이핑을 위해 4ml + 1ml 세정)에서 멸균 스크레이퍼를 사용하여 긁어냈다. 각각의 서브-라이브러리로부터 긁어낸 배양물을 단일 튜브에 모은 다음 등용적의 저장 배지(65% 글리세롤, 100mM Tris pH 8.0, 25mM MgSO4)를 첨가하고, 50㎕의 분취량을 각 서브-라이브러리의 cfu/ml를 계산하기 위해 저장하고, 세균 현탁액을 추가의 작업을 위해 적합한 크기로 분취하고, 개별 서브-라이브러리로서 -80℃에서 저장하였다. 카파의 두 개의 서브-라이브러리를 HsNkFab001 및 HsNkFab002로 표시하였으며, 여기서 Hs는 Homo sapiens를 의미하고, N은 Naive를 의미한다. 유사하게, 3개의 서브-라이브러리를 람다 Fab에 대해 생성하고, HsNλFab001, HsNλFab002 및 HsNλFab003로 표시하였다.
Figure 112019007425361-pct00052
개별 서브-라이브러리의 cfu/ml를 계산하기 위해, 로그 희석법을 사용하였다. 20㎕의 저장된 분취량을 180㎕의 LB 배지와 혼합하여 10-1 희석을 제공하였다. 200㎕의 최종 용적에서 10-10 희석에 도달할 때까지 이 스톡으로부터 로그 희석물을 제조하였다. 마지막 네 번의 희석(10-7, 10-8, 10-9 및 10-10)으로부터의 각각 100㎕를 100㎍/ml 카베니실린 및 2% 글루코스를 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침에 콜로니를 계수하였으며, 생성된 cfu/ml는 0.675 - 1.82 x 1010 cfu/ml에 이르렀다.
라이브러리의 품질을 추정하기 위해, 자가-결찰 전략에 의해 제조된 제한된 수의 카파 및 람다 클론을 분석하였다. 총 96개 클론(카파 및 람다에 대해 각각 48개)을 선발하고 플라스미드 DNA를 소규모로 추출하였다. Fab 동일성을 확인하기 위해, PCR을 주형으로서의 플라스미드 DNA 및 Fab 말단-특이 프라이머(서열 번호 32/서열 번호 34)로 수행하였다. 카파 및 람다 서브타입 각각의 모든 48개 클론은 Fab 특이 PCR 증폭에 대해 양성이었다(100% 양성). 모든 96개 클론이 Fab 양성임을 확인시, PCR 산물을 다양성 분석을 위해 BstNI 핑거프린팅에 적용하였다. 카파 및 람다 클론 중 어느 것도 임의의 반복 패턴을 보이지 않았으며 각 클론은 상이하였다.
각 라이브러리로부터의 클론의 샘플 세트를 실시예 18에 기재된 바와 동일한 세트의 5개 프라이머를 사용하여 디데옥시 서열분석에 적용하였다. 각 클론의 Fab 서열을 크로마토그램으로부터의 콘틱 건설의 알고리즘, 및 비정상 염기 호출의 시각적 확인에 따라 분석하였다. 그후, 콘틱을 5' 및 3' 말단의 SfiI 부위, VL, VH, CL 및 CH1 도메인과 같은 지표에 대해, 및 개시에서 종결 코돈까지의 개별 경쇄 및 중쇄의 완전성에 대해 수동으로 주석을 달았다. 수동 분석 및 주해의 결과가 표 41에 요약되어 있다. 이용 가능한 데이터에 기반하여, 신규한 자가-결찰 방법에 의해 제조된 카파 또는 람다 라이브러리로부터의 클론의 ~80%가 전장 번역 가능한 Fab이다.
모든 클론의 VL 및 VH 도메인의 서열을 또한 생식계열 계열, 프레임워크 및 CDR에 대한 상세한 주해 뿐만 아니라 기준 인간 서열과 비교한 아미노산의 차이에 대해 IMGT 데이터베이스에 제출하였다. 계열 커버리지에 대한 결과가 표 42에 나타내어져 있다. IMGT 데이터베이스로부터의 나머지 주해는 서열분석된 클론의 서브세트에 대해 표 43-44에 요약되어 있다. 모든 분석된 클론의 83-93%가 어떠한 종결 코돈도 없이 V 도메인을 가졌으며, 따라서 기능적이다.
Figure 112019007425361-pct00053
Figure 112019007425361-pct00054
Figure 112019007425361-pct00055
Figure 112019007425361-pct00056
실시예 23
성공적인 벡터 결찰의 장애물에 대한 추가의 연구
보다 큰 나이브 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 수득하기 위해, 본 발명은 또한 본원에 대안적인 방법 및 프로토콜을 개시한다. 에티듐 브로마이드와 유사한 dsDNA-인터칼레이팅 염료이기도 한 SYBR safe™가 합성 scFv 라이브러리에 대한 결찰 효율을 증가시키는 것으로 보고되었다(Martineau P, 2010. Synthetic antibody libraries. In: Antibody Engineering, Vol. 1). 근거는 에티듐 브로마이드-염색된 겔을 UV 광에 노출시키면 DNA 손상이 야기되고, 따라서 클로닝 효율이 저하된다는 것이다. 선행 기술에 제시된 이러한 발상을 시험하기 위해, 20㎍의 pCOMB3XSS 벡터를 실시예 13에 예시된 바와 같이 SacI-SfiI-SacI로 삼중 소화시켰다. 겔 당 10㎍의 소화된 pCOMB3XSS 벡터 산물을 1x TAE에서 주조된 두 개의 상이한 1% 저 용융 아가로스 겔 상에서 작동시키고 5V/cm에서 90 min 동안 작동시켰다. Gel#1은 0.01㎍/ml 에티듐 브로마이드로 염색시키는 반면 Gel#2는 Milli-Q 물 중의 SYBR safe™의 1:10000 희석물에서 염색시켰다. 겔 둘 다를 어둡게 만든 실험실 구역에서 부드럽게 진탕시키면서 20min 동안 염색시켰다. 겔 둘 다로부터의 벡터 백본(~3.3kb) 및 스터퍼(~1.7kb)를 잘라내고 QiaQuik 키트를 사용하여 정제하였다. DNA 단편을 뉴클레아제-비함유 물 중에서 용출시키고 Picogreen 검정에 의해 정량하였다. 각각의 벡터 및 스터퍼 결찰 및 TG1 세포로의 형질전환은 적절한 실험 대조군과 함께 실시예 11에 예시된 바와 같이 수행하였다. 표 45는 결찰/형질전환 효율이 Martineau에 따르는 방법을 사용함으로써 TG1 세포에서 적어도 3배 증가될 수 있음을 보여준다(2010; Synthetic antibody libraries. In: Antibody Engineering; Vol. 1).
Figure 112019007425361-pct00057
도 17, 23, 및 25는 자가-원형화된 스미어의 상당부가 SfiI로의 소화 후 ~1.5kb 결찰 가능한 Fab 분자로 전환되지 않음을 예시한다. 이것은 PCR-증폭된 집단에서 Fab 분자의 전부가 소화 가능한/정확한 SfiI 말단을 갖는 것은 아님을 나타낸다. 표 18에 제시된 데이터가 또한 이 사실을 입증한다(TOPO 클로닝된 Fab의 20%의 DNA 서열에서 부정확한 SfiI 말단). DNA 서열에서 부정확한 SfiI 말단은 서열 번호 32 및 서열 번호 34인 최종 Fab 증폭을 위해 사용된 정방향 및 역방향 프라이머의 고유한 특성으로부터 기인한다. 도 26은 이들 프라이머의 서열 및 서로에 대한 이들의 쌍방향 정렬을 보여준다.
도 26에 기반하여 (a) 프라이머 중 어느 하나의 5' 말단에서 처음 18개 뉴클레오티드는 동일하며 (b) 전반적으로, 역방향 프라이머(서열 번호 34)의 39개 뉴클레오티드 중 30개(76.9%)는 정방향 프라이머(서열 번호 32)와 동일한 것으로 주지된다. 최종 중첩 조립 동안, VL-CL 및 VH-CH1 주형이 이미 이러한 두 개의 프라이머의 어닐링 부위를 함유하는 것으로 추가로 주지된다. 따라서, 프라이머 중 어느 하나의 5' 말단이 2nd 사이클 후(즉, 처음 이중-가닥 블런트 주형의 형성 후) PCR 반응에서 새로이 생성된 주형에서 잘못된 배향으로 어닐링될 수 있음을 생각할 수 있다. 표 46에 나타낸 바와 같이 PCR의 초기 적은 사이클에서 앰플리콘의 네 가지 상이한 조합이 발생할 수 있다.
Figure 112019007425361-pct00058
표 46에 기반하여, 가능할 것 같은 결과는 25-30 사이클의 표준 PCR 반응에서 증폭의 지수적 특성으로 인한 25%의 정확하게 증폭된 산물에 비해 75%의 부정확하게 증폭된 산물의 우세일 것이며, 이것이 표 18 및 도 17, 23 및 25에 제시된 바와 같은 데이터를 야기할 수 있다.
본 발명은 상이한 길이의 5' 오버행(서열 번호 35-37)을 따라 원래의 역방향 프라이머(서열 번호 32)에 비상동성인 최종 Fab 융합을 위한 대안적인 정방향 증폭 프라이머를 개시한다. 이러한 신규한 프라이머의 후자의 측면을 설계하기 위한 개념은 New England Biolabs 연간 카탈로그(New England Biolabs Product Catalog and Technical Reference, 2007)에 "Cleavage Close To 5' Ends"라는 제목의 표에서 찾아볼 수 있다. 서열 번호 34에 대한 이러한 새로이 설계된 정방향 프라이머의 정렬은 원래의 쌍에서 계산된 77% 동일성과는 달리 단지 20-36% 동일성을 나타내었다. 본원에 제시된 바와 같은 프라이머 쌍을 시험하여 Vκ-Cκ 및 VH-CH1 혼주물을 융합된 Fab에 조립한 다음 Fab 혼주물을 SfiI로 소화시키켰다(도 27).
겔-추출되고 SfiI-소화된 Fab 혼주물을 삼중 결찰된 pCOMB3XSS에 결찰시키고, 결찰 믹스를 실시예 21 및 22에 예시된 방법을 사용하여 고효율 TG1 세포(Lucigen)에서 형질전환시켰다. 결과가 표 47에 나타내어져 있다.
Figure 112019007425361-pct00059
시험 Fab 혼주물의 형질전환 효율의 실험(표 47의 Avg 효율 컬럼)은 서열 번호 36/서열 번호 34 쌍에 의해 증폭된 시험 Fab 혼주물이 최상의 형질전환 효율을 보이며, 이것은 스터퍼 대조군의 형질전환 효율(표 47에서 밑줄친 값)과 매우 가깝다는 것을 입증한다. 증폭 프라이머 및 형질전환 효율 간의 상동성은 음의 상관관계가 있는 것으로 보인다 - 상동성이 클수록, 형질전환의 효율을 작아진다. 상동성이 동일한 경우(서열 번호 35 및 서열 번호 36 - 둘 다는 서열 번호 34에 대해 20% 상동성이다), 4bp 5' 오버행을 갖는 것(서열 번호 36)은 1bp 오버행을 갖는 것(서열 번호 35)보다 더 잘 수행한다. 표 45에 나타낸 형질전환 효율은 실시예 12에 상세히 기술된 바와 같이 희석된 결찰 혼합물로 수득되었으며, 이것은 실시예 21에 예시된 바와 같은 정화된 결찰 믹스 샘플과 비교할 때 2-3배 덜 효율적임을 주지해야 한다. 본원에 개시된 방법은 본원에 제시된 바와 같은 대형 나이브 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 달성할 수 있게 한다.
실시예 24
pSSY1 - pCOMB3XSS를 능가하여 뚜렷하게 개선된 신규한 파지 벡터
도 13은 SfiI로의 플라스미드 pCOMB3XSS의 소화가 불완전하다는 것을 예시하며, 실시예 10은 이러한 거동에 대한 근거가 5' 및 3' 부위의 dcm 메틸트랜스퍼라제 민감성 펜타뉴클레오티드 코어에 있을 수 있으며, 이것은 dcm + 숙주가 플라스미드 번식에 사용되는 경우 이러한 부위를 반-메틸화된 채로 둔다는 것을 가리킨다. 이러한 문제가 상업적 dam -/dcm - 대장균 균주의 사용에 의해 완화될 수 있기는 하지만, 실시예 13은 일반적인 Fab 결찰을 위해 이러한 플라스미드 제제를 사용하는 실제적인 어려움을 추가로 예시한다. pCOMB3XSS 플라스미드의 세밀한 실험은 아래에 열거된 바와 같은 추가의 설계 문제를 밝힌다(뉴클레오티드의 위치는 Barbas 랩 사이트에서 이용 가능한 것과 동일하다 - http://www.scripps.edu/barbas/content/pcomb_images/pcomb_images_files/pComb_Text_Files/pComb3XSS.txt 참조):
1. 경쇄 및 경쇄 스터퍼 둘 다를 이들이 대장균에서 번역 가능하도록 하는 방식으로 설계하고;
2. 경쇄 스터퍼의 경우에, 이것은 OmpA 주변세포질 리더를 포함한 55 aa' 단백질을 생산할 것으로 예측되고;
3. 중쇄 스터퍼의 경우에, 이것은 N-말단에 pelB 주변세포질 리더, 및 C-말단에 박테리오파지 fd 유전자 III의 CTD(C-말단 도메인)와 함께 대장균 티오레독신 유전자(GenBank M10424.1; nt1584-1940)를 포함하는 351 aa' 단백질을 생산할 것으로 예측되고;
4. 경쇄 스터퍼는 Fab 유사 클론의 일부를 포함하고(nt527-977 - GenBank AB608265 및 nt930-1469의 VH 단편과 동일함 - GenBank 람다 클론 L22157.1과 동일함);
5. 6XHis 태그는 혈구응집소(HA) 태그 내부에 있으며, 이것은 대중적인 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 포맷에 기초하여 어려운 검출 및/또는 정제를 초래할 수 있다.
상기 본원에 제시된 바와 같은 결점을 개선하기 위해, 본 발명은 (a) dam 또는 dcm 메틸트랜스퍼라제에 의해 시토신 메틸화될 수 있는 5' 및 3' SfiI 부위의 펜타뉴클레오티드 코어에 이러한 뉴클레오티드를 갖지 않고, (b) OmpA 또는 pelB 리더의 개시 코돈을 사용해서는 번역될 수 없어 번식 동안 플라스미드 안정성을 증가시키는 비-원핵생물 기원의 스터퍼를 갖는 신규한 벡터의 설계가 적합한 제한 소화에 이은 아가로스 겔 상의 분해에 의해 Fab 삽입물과 모 클론 사이를 구별할 수 있고, (c) 후보 Fab에 대한 표준 IMAC 프로토콜의 적용 동안 잠재적인 병목을 피하도록 HA 태그가 6XHis 태그 내에 있음을 개시한다. V-도메인 내에 낮은 절단 확률로 제한 단편으로서 VL/VH 또는 경쇄/중쇄 도메인 셔플링(Persic L et al., 1991) 을 가능케 하는 것과 같은 다른 바람직한 특성은 항체 클로닝 분야의 실무자들에게 자명할 것이다. 서열 번호 38은 이러한 벡터(pSSY1)의 완전한 서열을 제공하는 반면, 도 28은 원형 플라스미드 형태의 동일물의 지도를 보여준다.
신규한 벡터 pSSY1은 복제 수, 플라스미드/파지 복제개시점, 항생제 마커에 있어서 및 pCOMB3XSS로서의 fd gIII의 CTD의 사용에 있어서 동일하지만, 파지 디스플레이 뿐만 아니라 단백질 발현 둘 다를 위해 더 잘 사용될 수 있다. 표 48은 pCOMB3XSS는 제로 벡터 백그라운드를 달성하는 두 가지 제한 소화(SacI-SfiI)를 소요하지만, pSSY1은 SfiI의 단일 소화로 이를 달성한다는 것을 보여준다. 이것은 이러한 플라스미드에서 두 개의 SfiI 부위의 펜타뉴클레오티드 코어를 변화시킴의 유리한 효과를 명백히 나타낸다. 게다가, 당해 표는 또한 SfiI-소화된 pSSY1 벡터가 스터퍼 재-결찰에 있어서 이중 소화된 pCOMB3XSS 벡터만큼 효과적임을 입증한다.
Figure 112019007425361-pct00060
실시예 25
pSSY1 백본 상의 초대형 라이브러리 구축
RNA를 CTL(Cellular Technologies Ltd., Cleveland, OH, USA)로부터의 특성화된 PBMC를 사용하여 15명의 기증자 혼주물로부터 단리하고, 각 기증자(AMS Biotechnology, Abingdon, Oxford, UK)로부터의 골수, 비장 및 편도선의 상업적 RNA와 혼주하였다.
RNA 제제를 40:20:20:20(PBMC: 골수: 비장: 편도선) 혼합하고, cDNA를 실시예 1에 상세히 기술된 바와 같이 이러한 혼주된 샘플로부터 제조하였다. 제조된 cDNA의 품질을 시험하기 위해, 각각의 VH, Vk 및 Vλ 도메인에 대해 특이적인 신규한 프라이머 쌍을 50㎕ 반응당 50ng 주형을 갖는 혼주된 cDNA 상에 사용하였다. 생성된 앰플리콘은 최소의 비-특이 증폭을 갖는 정확한 크기였으며(도 29), 이것은 cDNA의 품질이 허용 가능함을 시사한다. 인간 PBMC, 비장, 골수 및 편도선의 혼주된 총 RNA로부터의 maxi-cDNA 제조를 위해, 130개 반응물을 반응당 1㎍의 총 RNA와 조립하였다. 수율을 RiboGreen 방법으로 추정하였다. cDNA의 총 수율은 26.7㎍이었다.
최종 카파 및 람다 Fab 단편을 제조하기 위한 PCR 증폭은 이전에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 수행하였다(실시예 3-9 참조). 도입된 변화는 (a) 실시예 24에 예시된 바와 같이 dcm 메틸트랜스퍼라제(서열 번호 39)에 의해 메틸화되지 않은 CH1 주형에 3' SfiI를 포함하는 것, (b) pSSY1(서열 번호 40-41)의 경쇄 및 중쇄 스터퍼 사이의 유전자간 서열에 필적하는 3' 서열을 갖는 Cκ 및 Cλ 주형을 사용하는 것, (c) dcm 메틸트랜스퍼라제(서열 번호 42-54; 도 28)에 의해 메틸화되지 않은 모든 V-도메인 정방향 프라이머에 5' SfiI 부위를 포함하는 것 및 (d) 실시예 23에 예시되고 pSSY1 벡터에 대해 적합한 바와 같이 최종 중첩 정방향 프라이머(서열 번호 55)를 사용하는 것이었다.
신규한 프라이머로부터 수득된 효율에 기반하여(표 47), 20㎍의 각각의 최종 결찰 가능한 카파 및 람다 Fab를 생성하기 위해, 공정을 시작하는데 100㎍의 각 타입의 Fab가 필요할 것으로 추측되었다. 일차 중첩 (SOE) PCR을 등몰량의 V 및 C 유전자를 사용하여 실시하였다. 각 경쇄에 대해 총 100회 SOE 반응 및 중쇄에 대해 200회 SOE 반응을 설정하였다. QIAEXII 겔 추출 후 최종 수율은 Picogreen 검정에 의해 측정되는 바와 같이 VλCλ의 경우 27㎍, VkCk의 경우 38.5㎍ 및 VHCH1의 경우 93.4㎍이었다. 2차 중첩 (SOE) PCR을 등몰량의 VLCL 및 VHCH1 앰플리콘을 사용하여 유사하게 수행하였다. 각각의 카파 및 람다 쇄에 대해 총 775회 PCR을 수행하였다. QIAEXII 겔 추출 후 최종 수율은 Picogreen 검정에 의해 측정되는 바와 같이 λ-Fab의 경우 96㎍ 및 k-Fab의 경우 98.5㎍이었다.
카파 및 람다 fab 둘 다를 별도로 SfiI 소화에 적용하였다. 완충액 M (Roche)에서 Fab의 ㎍당 32U의 SfiI를 첨가하고, 50℃에서 밤새 배양하였다. 소화된 Fab를 QIAEXII 겔 추출 키트를 사용하여 겔 정제하고 DNA를 뉴클레아제 비함유 물에서 용출시켰다. Fab를 Picogreen 검정에 의해 정량하였으며, 최종 수율은 가각 카파 ~17.2㎍ 및 람다 ~17.5㎍이었다. A260 /A280 비를 NanoVue를 사용하여 확인하였으며 1.7 내지 1.9의 범위였다. pSSY1 벡터를 실시예 10에 예시된 바와 같이 밤새 SfiI 소화에 의해 제조하였다.
140ng의 SfiI 소화된 pSSY1 벡터를 1U/㎍의 T4 DNA 리가제를 사용하여 20㎕ 반응에서 140ng의 SfiI-소화된 Fab(벡터: 삽입물에 대해 1:2 몰 비)와 결찰시키고, 16℃에서 밤새 배양하였다. 총 ~17.2㎍의 카파 및 ~17.5㎍의 람다 Fab를 결찰시키기 위해, 상기 실시예에 상세히 기술된 바와 같이 필요한 수의 결찰을 설정하였다. 밤새(16h) 배양 후, 결찰 혼합물을 37℃에서 1h 동안 닉-밀봉한 다음 70℃에서 15min 동안 열 불활성화시키고 함께 모았다. 카파 및 람다 Fab를 별도로 가공하였다. 혼주물을 Microcon 스핀-필터를 사용하여 3회 염 제거 및 물로의 완충액 교환에 적용하였다. A260 /A280 비를 NanoVue를 사용하여 확인하였으며 1.7 내지 1.9의 범위였다. 실제 dsDNA 농도를 PicoGreen 검정을 사용하여 측정하였다. 염 제거 후, 결찰된 물질의 총 회수량은 카파 및 람다 결찰에 대해 각각 28 및 18.15㎍(벡터 + Fab)이었다.
표 37 및 도 24B에 기반하여, 최대 272ng의 정제된 결찰 DNA(벡터 + 삽입물)는 실시예 20에 제시된 바와 같은 전기천공 파라미터를 갖는 2mm 갭 BioRad 큐벳에서 50㎕ TG1 세포당 전기천공될 수 있을 것으로 추측된다. 카파 라이브러리(26384ng, 벡터 + Fab)를 제조하기 위해, 총 97회 형질전환을 8 세트(12-13회 형질전환/세트)로 수행하였으며, 이것은 카파에 대해 8개 서브-라이브러리를 야기하였다. 세트 당 12-13회 형질전환 후 생성된 ~12ml 배양물을 125ml 코닝 플라스크로 옮겨 37℃ 및 250rpm에서 1h 동안 배양하였다. 이러한 각각의 세트로부터의 형질전환된 배양물을 ~1.5ml/플레이트의 양으로 50㎍/ml 카베니실린 및 2% 글루코스를 함유하는 7개의 대형 LB 한천 플레이트(245mm x 245mm,) 상에 확산시켰다. 따라서, 카파 라이브러리가 총 62개 플레이트 상에 플레이팅되었다(카파 서브-라이브러리 001 - 008; 표 49 참조). 50㎕ 분취량의 각각의 서브-라이브러리를 서브-라이브러리의 형질전환 효율을 계산하기 위해 남겨두었다.
유사하게, 람다 라이브러리(18033ng, 벡터 + Fab)를 제조하기 위해, 총 66회 형질전환을 6 세트(7-13회 형질전환/세트)로 수행하였으며, 이것은 람다에 대해 39개 대형 플레이트 및 6개 서브-라이브러리를 야기하였다(람다 서브-라이브러리 001.1 - 006.1; 표 49 참조). 50㎕ 분취량의 각각의 서브-라이브러리를 다시 서브-라이브러리의 형질전환 효율을 계산하기 위해 남겨두었다.
㎍당 형질전환의 효율을 계산하기 위해, 각각의 카파 및 람다 서브-라이브러리로부터의 이러한 50㎕ 분취량을 회수 배지(Lucigen)에서 1:25000, 1:100000, 1:500000 및 1:800000 희석시켰다. 100㎕의 각각의 희석물을 50㎍/ml 카베니실린 및 2% 글루코스를 함유하는 90mm LB 한천 플레이트 상에 삼중으로 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 배양 후, 대형 라이브러리 플레이트 상에서 빽빽한 성장이 관찰되었으며 효율 플레이트는 잘 단리된 콜로니를 나타내었다. 각각의 형질전환 효율 및 라이브러리 크기의 요약된 결과가 표 49에 나타내어져 있다.
각각의 대형 플레이트로부터의 박테리아 론을 5ml의 LB + 1% 글루코스 브로스(스크레이핑을 위해 3ml + 2ml 세정)에서 멸균 스크레이퍼를 사용하여 긁어냈다. 각각의 서브-라이브러리로부터 긁어낸 배양물을 단일 튜브에 모은 다음 등용적의 저장 배지를 첨가하고, 50㎕의 분취량을 각 서브-라이브러리의 cfu/ml를 계산하기 위해 저장하고, 세균 현탁액을 추가의 작업을 위해 적합한 크기로 분취하고, 개별 서브-라이브러리로서 -80℃에서 저장하였다. 카파의 8개 서브-라이브러리를 HsN3kFab001 - HsN3kFab008로 표시하였으며, 여기서 Hs는 Homo sapiens를 의미하고, N은 Naive를 의미한다. 유사하게, 6개의 서브-라이브러리를 람다 Fab에 대해 생성하고, HsN2LFab001.1 - HsN2LFab006.1로 표시하였다.
Figure 112019007425361-pct00061
개별 서브-라이브러리의 cfu/ml를 계산하기 위해, 로그 희석법을 사용하였다. 20㎕의 저장된 분취량을 180㎕의 LB 배지와 혼합하여 10-1 희석을 제공하였다. 200㎕의 최종 용적에서 10-10 희석에 도달할 때까지 이 스톡으로부터 로그 희석물을 제조하였다. 마지막 네 번의 희석(10-7, 10-8, 10-9 및 10-10)으로부터의 각각 100㎕를 100㎍/ml 카베니실린 및 2% 글루코스를 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침에 콜로니를 계수하였으며, 생성된 cfu/ml는 0.63-5.4 x1010 cfu/ml에 이르렀다.
총 96개 클론(카파 및 람다에 대해 각각 48개)을 선발하고 플라스미드 DNA를 소규모로 추출하였다. Fab 동일성을 확인하기 위해, PCR을 주형으로서의 플라스미드 DNA 및 벡터 백본-특이 프라이머로 수행하였다. 다양성 분석을 위해, 라이브러리 중의 어느 하나로부터의 클론의 대부분이 Fab 양성(카파의 경우 97%, 람다의 경우 100%)임을 확인한 후 PCR 산물을 BstNI 핑거프린팅에 적용하였다. 카파 및 람다 클론 중 어느 것도 임의의 반복 패턴을 보이지 않았으며 각 클론은 상이하였다. BstNI 핑거프린팅은 카파 및 람다 클론 중 어느 것도 반복 패턴을 나타내지 않았으며 각 클론은 상이하다는 것을 보여준다.
각 라이브러리로부터의 96개 클론을 실시예 18에 기재된 바와 동일한 두 개의 벡터 백본 특이 및 하나의 CH1 특이 프라이머를 사용하여 디데옥시 서열분석에 적용하였다. 그러나, 두 개의 pelB 인접 영역 특이 프라이머를 카파 클론의 경우 Cκ-특이 정방향 및 역방향 서열분석 프라이머로 대체하고 람다 클론의 경우 Cλ-특이 정방향 및 역방향 서열분석 프라이머로 대체하였다. 각 클론의 Fab 서열을 서열 크로마토그램으로부터의 콘틱 건설의 통상의 알고리즘, 및 비정상 염기 호출의 시각적 확인에 따라 분석하였다. 그후, 콘틱을 5' 및 3' 말단의 SfiI 부위, VL, VH, CL 및 CH1 도메인과 같은 지표에 대해, 및 개시에서 종결 코돈까지의 개별 경쇄 및 중쇄의 완전성에 대해 수동으로 주석을 달았다. 수동 분석 및 주해의 결과가 표 50에 요약되어 있다.
Figure 112019007425361-pct00062
모든 "우수한" 클론(즉, LC 및 HC 둘 다가 인-프레임인 클론)의 VL 및 VH 도메인의 서열을 또한 생식계열 계열, 프레임워크 및 CDR에 대한 상세한 주해에 대해 IMGT 데이터베이스에 제출하였다. 계열 커버리지에 대한 요약된 결과가 도 30에 나타내어져 있는 반면 표 51-53은 클론의 서브세트에 대한 IMGT 데이터베이스로부터의 나머지 주해를 담고 있다.
당해 분석은 각각의 VH (VH6, VH7) 및 Vλ (VL9, VL10)의 두 개의 계열, 및 Vκ의 하나의 하나의 계열(VK5)을 제외하고는, 모든 다른 계열이 이들 클론에 나타내어져 있음을 보여주었다(도 29). 이러한 계열은 다른 계열에 비해 더 적은 변이체를 나타내기 때문에, 이러한 계열에 속하는 클론은 이러한 서열 데이터세트에서 이들의 희귀성 및 낮은 샘플링 수 둘 다 때문에 없어진 것일 수 있다. 모든 VH 도메인의 44.1%가 VH4 계열에 속하고 19.7%가 VH3에 속하는 반면, 다른 계열(VH1, VH2 및 VH5)은 5-17% 범위이었다. 유사하게, Vκ의 4개 계열 및 Vλ의 8개 계열이 나타내어졌다. 카파 계열에서, 클론의 51.9%는 VK3 계열에 속하고 31.5%는 VK1 계열에 속하였다. 다른 계열의 표현은 5 내지 13%이었다. 람다 계열에서, 표현은 VL1의 경우 54.8%, VL3의 경우 11%이었으며, 나머지 계열(VL2, VL4, VL6, VL7, VL8 및 VL9)은 0-10% 범위이었다.
Figure 112019007425361-pct00063
Figure 112019007425361-pct00064
Figure 112019007425361-pct00065
실시예 26
파지 전환 및 고체 상 패닝
실시예 22에서 수득되고 박테리아에서 파지로의 표 40에 나타내어져 있는 총 3.4 x 109 cfu의 나이브 인간 파지미드 라이브러리의 예비 대규모 전환을 위해, 5개 서브-라이브러리 각각의 10배 과량의 박테리아 세포를 정의된 용적으로 배양 배지에 접종하여 최종 OD600 ~0.1을 얻었다. 라이브러리 크기의 일차 접종물로서의 10배 과량의 세포는 저장된 라이브러리의 독립적인 형질전환체 각각으로부터의 완전한 표시를 얻도록 선택하였다. 각각의 5개 서브-라이브러리(표 40)를 400ml의 배지에 독립적으로 접종하였다. 접정된 일차 라이브러리 배양물을 0.5 OD600까지 성장시키고, VCSM13을 사용한 감염을 위해 사용하였다. 감염된 배양물을 저하된 온도에서 밤새 배양물(용적 ~4000ml)에서의 파지 번식을 위해 최종적으로 10배 희석시켜 항체 단편-pIII 융합 폴리펩타이드의 용해도를 장려하였다(Thie et al., 2008). 밤새 배양물으로부터의 파지는 2회의 연속 원심분리에 의해 수득하였다. 파지 디스플레이 라이브러리의 효율적인 스크리닝은 고 순도의 투입 파지를 필요로 한다. 파지를 정제하기 위해 폴리에틸렌 글리콜(PEG 8000)에 의한 이중 침전을 사용하였다. 파지 역가 측면에서 파지의 수율은 (a) 대장균 TG1 세포를 적절한 희석물로 감염시킴으로써 형질도입 또는 콜로니 형성 단위(cfu)로서; 및 (b) 하기 실험식(Bonnycastle LLC et al., 2001. General phage methods. In: Phage Display: A Laboratory Manual)을 사용함으로써 결정되었다:
파지/ml = OD 260 x 희석률 x 22. 14 x 10 10
하나의 브로스로부터의 5개 서브-라이브러리 각각으로부터의 총 파지 수율은 2-4 x 1014 cfu 범위인 것으로 결정되었다. 이러한 라이브러리 스톡 파지를 1-2 x 1013/ml로 -80℃에서 저장하였다. 전환된 라이브러리를 12개의 무작위 선택된 클론의 콜로니 PCR에 의한 전장 Fab(~1.5kb)의 존재에 대해 확인하였다.
도 31은 파지 포맷으로의 상기 라이브러리의 전환의 결과를 입증한다. 결과로부터, 전환 후 짧은 길이 클론이 존재함(~20%까지)이 자명하다. 증폭 후 및 패닝 동안 짧은 길이 클론의 대다수를 제거하기 위해서는, 바람직하게는 더 적은 수의 패닝으로 높은 퍼센트의 전장 클론을 수득하기 위해 아래에 제시된 바와 같은 신규한 전략의 공식화를 필요로 한다.
고체 상 패닝 동안 초대형 scFv 라이브러리로부터 짧은 길이 클론을 제거하는 방법이 기재된 바 있다(de Bruin R et al., 1999). 문헌(de Bruin R et al., 1999)에 제시된 방법을 본원에서 실험하였다. 2세트의 12x8-웰 PolySorp 스트립(Nunc)을 96-웰 프레임(2개 PolySorp 96-웰 플레이트) 상에 정렬하였다. 플레이트 1을 탄산염-중탄산염 완충액, pH 9.6 중에서 37℃에서 1h 동안 10㎍/mL의 유인 항원으로 피복시켰다. 플레이트 2를 피복 완충액(탄산염-중탄산염 완충액, pH 9.6) 만이 첨가된 "비 피복 대조물"로서 사용하였다. 배양 후, 플레이트 1 및 2의 웰을 37℃에서 1h 동안 1xTBS 중의 2% BSA로 차단하였다. 1 x 1012 pfu/mL의 혼합된 카파 및 람다 파지를 플레이트 1 및 2의 모든 웰로 옮기고 37℃에서 2h 동안 배양하였다. 플레이트 1 및 2로부터의 비결합 파지를 1xTBST로의 15회 세척에 이어 1xTBS로의 10회 세척에 의해 제거하였다. 모든 세척은 마이크로플레이트 세척기(BioRad Model PW-40)에서 수행하였다. 세척 후, 단계 용출 접근법은 문헌(de Bruin R et al., 1999)에 기술된 바와 같이 사용하였다. 10min 예비-배양 후, 37℃에서 각각 10min의 배양 후 4회 연속 용출을 수행하였다. 각 단계로부터의 용출된 파지의 역가를 대장균(TG1 균주; 표 54)에서 분취량을 형질도입함으로써 계산하였다.
Figure 112019007425361-pct00066
형질도입체의 샘플을 삽입물의 크기를 추정하기 위해 콜로니 PCR에 의해 스크리닝하였다. 이러한 분석은 트리에틸아민과의 상이한 길이의 배양 후 짧은 길이 Fab의 비율의 사소한 감소를 보여주었다. 게다가, 서열분석은 전장 Fab의 대부분이 인-프레임 종결 코돈의 존재로 인해 번역 가능하지 않았음을 입증하였다.
실시예 27
짧은 길이 클론의 존재에도 불구하고 패닝의 자명한 성공
표 54의 개별 시점으로부터의 모든 용출물을 다음 두 라운드에서 패닝을 위해 전방으로 이동시켰다. 유인 항원 농도를 2nd 라운드에서는 5㎍/ml 및 3rd 라운드에서는 2㎍/ml로 감소시켰다. 파지 용출물 역가를 패닝의 각 라운드에서 모니터링하고, TG1 형질도입에 의해 파지미드 포맷으로 전환시키고, 글리세롤 스톡으로서 저장하였다. 이러한 글리세롤 스톡을 각 라운드의 패닝 전에 VCSM13 형질도입에 의해 (증폭된) 파지 포맷으로 전환시켰다. 2nd 및 3rd 라운드로부터의 이러한 증폭된 용출물 혼주로부터 유인-특이 파지 ELISA를 수행하였다. 이러한 목적을 위하여, 8-웰 PolySorp 스트립(Nunc)을 96-웰 프레임 상에 정렬하고 실시예 26에 기술된 바와 같이 유인 항원으로 피복시켰다. 평행 세트의 스트립을 항원 피복 없이 또한 설정하였다. 2x1012/mL의 평균 출발 역가와 2.6x109/mL의 말기 역가를 갖는 100㎕의 각각의 파지 혼주물을 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 2h 동안 배양하였다. TBST를 사용하여 3회 세척 후, 100㎕의 HRP 접합된 항-gVIII 검출 항체를 웰당 1:5000 희석물로 첨가하여 37℃에서 1h 동안 배양하였다. 비결합된 검출 항체를 TBST로 3회 세척한 다음 TBS로 3회 측정하여 제거하였다. 그후, 100㎕의 TMB 기질을 웰당 첨가하고 암흑에서 20min 동안 배양하였다. 2M H2SO4의 첨가에 의해 반응을 중단시키고 생성된 색상을 450nm에서 판독하였다. 표 55에 강조표시된 A450 값은 0.5에 가까운 A450을 제공하는 각각의 2nd 라운드 파지 혼주물의 역가(PO3)를 나타내며, 이것은 비 피복 대조물 판독치, 즉 0.06보다 ~10배 더 높다. 이러한 데이터는 2nd 라운드의 패닝 후 파지가 라이브러리 클론을 능가하여 항원 반응성이 풍부함을 시사한다(백그라운드 A450 값을 능가하는 10x 값을 갖는 라이브러리 혼주물로부터의 역가를 패닝된 혼주물로부터의 역가에 대해 비교함).
Figure 112019007425361-pct00067
신선하게 제조된 P03(라운드 2 패닝됨) 및 P04(라운드 3 패닝됨) 파지 혼주물에 대한 항-항원 ELISA를 동시에 수행하였다. 그러나, 이전 라운드와 비교하는 경우, PO4 파지에서 ELISA 반응성은 풍부하지 않았으며, 이는 패닝 과정이 포화점에 도달하였음을 시사하였다. 이러한 결론은 또한 P04로부터의 전장 클론(102개 클론)의 BstNI 핑거프린팅에 의해 뒷받침되었다. 이러한 목적을 위해, 콜로니 PCR 운동으로부터의 분취량의 PCR 산물을 각 클론에 대한 샘플로서 사용하였다. 이러한 분석은 성공적인 패닝 및 표적 항원에 대한 명백하게 진짜인 바인더의 발견을 나타내는 반복 핑거프린트를 갖는 다수의 클론을 분명히 보여준다(도 32).
패닝의 라운드 2 & 3으로부터 단클론 바인더를 단리하기 위해, 라운드 2로부터의 576개 개별 클론(파지미드) 및 라운드 3으로부터의 288개 클론을 선발하여 콜로니 PCR로 분석하였다. 이러한 전장 클론 중의 20개는 VCSM13 형질도입에 의해 파지 포맷으로 전환시켰으며, 파지 제제를 이전과 같이 유인 항원에 대한 ELISA 반응성에 대해 시험하였다. 표 56은 이들 모두가 ELISA 반응성이었음을 보여준다.
Figure 112019007425361-pct00068
그러나, 항원 ELISA 양성 클론을 실시예 18에 상세하게 기술된 바와 같이 5개 프라이머로 서열분석하는 경우, 이들 전부는 오프-프레임이었으며, 이것은 인-프레임 바인더 클론에 도달하기 위해 다수의 클론의 스크리닝을 필요로 하였다.
실시예 28
Fab는 주변세포질 추출물에서 웨스턴에 의해 검출할 수 있다
본 발명은 또한 이 단계에서 서열분석하지 않고서 인-프레임 바인더 클론에 도달하는 또 다른 해법을 개시한다. 따라서, 본 발명은 단클론 항원 바인더를 파지 융합체로서가 아니라 비-억제자 균주에서 발현되는 가용성 Fab로서 스크리닝한다. 이러한 전략은 pCOMB3XSS 또는 pSSY1 벡터 중의 어느 하나에서 gIII의 CTD와 태그 사이에 배치된 호박 종결 코돈을 이용하며, 이것은 supE 또는 supF 균주에서 Gln 또는 Phe 잔사로서 판독되지만 비-억제자 균주에서 번역 종결 코돈으로서 판독된다(Hoogenboom HR et al., 1991). 도 33은 항-인간 경쇄 & 중쇄-특이 혈청이 면역블로팅 후 패닝 캠페인으로부터 수득된 단클론의 주변세포질 추출물에서 ~50kDa 밴드를 인지할 수 있음을 시사한다.
단클론 히트의 주변세포질에서의 ~50kDa 밴드의 존재는 이들의 설계에 따른 Fab의 표적화된 발현을 입증한다(경쇄 및 중쇄 둘 다의 리더 서열이 주변세포질에 의해 표적화되도록 설계된다). 게다가, 과정은 개별 클론 형질도입에 비해 더 높은 처리량 및 ELISA 전에 파지로의 재포맷팅을 가능하게 한다. 당해 실시예에 제시된 개념은 신규한 스크리닝 과정의 설계를 가능하게 하며, 이것은 후속 실시예에 추가로 예시되어 있다.
실시예 29
일련의 게이트로서의 히트 선택
짧은 클론 및 오프-프레임 클론에 관한 실시예 26, 27 및 28로부터의 증거에 기반하여, 일련의 게이트가 짧은 클론 및 오프-프레임 클론을 제거하기 위해 고안되었다. 본 발명은 도 33에 예시된 바와 같이 비-억제자 세포로부터의 주변세포질 추출물의 웨스턴 블롯 상의 ~50kDa 면역반응성 밴드의 검출에 의해 오프-프레임 클론을 제거하기 위해 전장 클론을 발현하기 위해 콜로니 PCR 및 비-호박 코돈 억제자 균주를 사용하는 방법을 개시한다. 친화도 순위매김에 이은 생물검정 검증이 종결 조건에 더하여 또한 고려되었다.
실시예 30
패닝 캠페인을 위한 비오티닐화 항원에 대한 로지컬 게이트의 적용 및 이에 따른 결과
실시예 29에 제시된 바와 같은 개념은 모델 비오티닐화 항원을 사용하여 솔루션 패닝(Chames P and Baty D. 2010. Phage display and selection on biotinylated antigens. In: Antibody Engineering; Vol. 1)에 의해 본원에서 시험된다. 박테리아에서 파지로의 총 3.06 x 1011 cfu의 나이브 인간 파지미드 라이브러리(실시예 25, 표 49)의 예비 대규모 전환을 위해, 14개 서브-라이브러리 각각의 2-10배 과량의 박테리아 세포를 충분한 용적(~800ml)으로 배양 배지에 접종하기 위해 표적화하여 최종 OD600 ~0.1을 수득하였다. 합당한 배양 용적 내에서 0.1 OD600을 유지하면서 10배 과량에 도달하는 것은 초대형 라이브러리에서 종종 어려우며 3.3배 과량이 이전에 사용되었다(Schwimmer et al., 2013). 표 57은 라이브러리의 3x 묘사를 샘플링하였음을 보여준다.
Figure 112019007425361-pct00069
접종된 일차 라이브러리 배양물을 0.5 OD600으로 될 때까지 성장시키고, VCSM13을 사용한 감염에 사용하였다. 감염된 배양물을 저하된 온도에서 밤새 배양물(500ml; 서브-라이브러리 당 1x2L 플라스크)에서의 파지 번식을 위해 최종적으로 10배 희석시켜 실시예 26에 예시된 바와 같이 수확하였다. 하나의 전환 라운드로부터 14개 서브-라이브러리 각각으로부터의 파지 수율은 0.2-2 x 1015 pfu의 범위였다.
상기 라이브러리 스톡 파지는 용액 상에서 모델 비오티닐화 항원을 패닝하기 위해 신선하게 사용되었다(Chames P and Baty D. 2010. Phage display and selection on biotinylated antigens. In: Antibody Engineering; Vol. 1). 간략히 말해서, 500nM의 비오티닐화 항원을 3x1013 pfu의 예비-차단된 라이브러리 파지(100x의 라이브러리를 나타냄)와 1h 동안 배양하면서 200㎕의 M280 스트렙트아비딘 피복된 비드를 세척하고 유사하게 인산염 완충 염수(1xPBS) 중의 2% 우유로 예비-차단하였다. 예비-차단된 파지를 100배 몰 과량의 비-비오티닐화 항원의 존재 또는 부재하에서 항원-항체 평형을 모방하도록 상이한 길이의 시간 동안 비드와 배양되도록 한 다음 200㎕의 50mM DTT에서 용출시키기 전에 Tween-20 함유 PBS에서 반복해서 세척하였다. 용출된 파지를 물에 희석시키고 적당량의 10xPBS를 첨가하여 즉각 pH 7.4로 되게 하였다. 용출된 파지를 TG1 세포에서 형질도입에 의해 역가측정하고, 다음 라운드의 패닝 전에 동일한 숙주에서 증폭시켰다. 파지 혼주물 ELISA를 실시예 27에 기술된 바와 같이 이러한 증폭된 파지로부터 수행하여 각 라운드에서 바인더 혼주물의 풍부를 결정하였다. 도 34는 평형 또는 경쟁 모델에 따름으로써 여러 라운드의 패닝에 걸쳐 유인 용량 의존성 및 풍부 둘 다가 관찰됨을 보여준다(Hawkins RE et al., 1992).
패닝의 라운드 2 & 3으로부터 단클론 바인더를 단리하기 위해, 1536개 개별 파지미드-암호화 재조합체를 선발하여 콜로니 PCR에 의해 분석하였다. 1162개 전장 클론을 10ml 배양물에서 성장시키고 밤새 1mM IPTG로 유도하여 Fab를 발현시켰다. 전 세포 용해물을 PopCulture™ 시약(Novagen, Merck)으로 제조하고, 모델 항원을 Polysorp 플레이트 상에 피복시키고 항원-결합된 Fab로 HRP-접합된 다클론 Fab로 검출하는 간접 ELISA로 시험하였다. 도 35는 이러한 바인더의 검출의 예를 보여준다.
282개 ELISA 양성 단클론을 다시, 문헌(Humphreys DP and Bowering L, 2009. Production of antibody Fab' fragments in E. coli. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic)에 기술된 바와 같이 제조한 주변세포질 추출물 및 이전과 같은 10ml 배양물 용적으로 발현시켰다. 이러한 추출물을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분해하고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅하며, 항-인간 Fab 특이 다클론 혈청으로 프로빙하여 발현된 Fab가 주변세포질에서 분명히 검출될 수 있는 클론을 동정하였다. 도 36은 이러한 "주변세포질 게이트"의 부분도를 보여주는 반면, 표 58은 이러한 패닝 캠페인에 적용된 게이팅 과정(실시예 29)의 요약을 제공한다.
Figure 112019007425361-pct00070
이러한 주변세포질 히트의 서브세트의 서열분석시, 모든 서열분석된 클론은 중쇄의 100bp의 ATG 내에 종결 코돈을 나타내었으며, 이는 게이팅 과정의 기본 가정이 오프-프레임 클론을 제거하는데 불충분하다는 것을 시사한다.
실시예 31
연쇄 스위치의 개념
실시예 30은 주변세포질 스크리닝 동안 삼중 게이팅된 클론의 서브세트로부터 수득된 웨스턴 신호가 비-환원된 겔 상의 다클론 항체의 사용으로부터 생긴다는 것을 나타내며, 여기서 ~50 kDa 밴드는 LC-HC 이형이량체(~23 kDa LC + ~27 kDa HC; 목적하는 표현형), LC-LC 또는 HC-HC 동형이량체(~23 kDa LC + ~23 kDa LC 또는 ~27kDa HC + ~27kDa HC; 바람직하지 않은 표현형; 도 37) 둘 다로부터 유도될 수 있다. 본 발명은 HC 또는 LC를 분명히 ~50kDa 이량체의 일부로서 검출할 수 있는 항체를 사용한다. 웨스턴은 두 개의 상이한 경쇄-특이(카파 및 람다) 및 두 개의 상이한 중쇄 C-말단 태그-특이 항체(폴리히스티딘 및 헤마글루티닌)에 대해 최적화되었다. 헤마글루티닌-특이 mAb는 표 58에 나타낸 단리된 항원 ELISA 반응성 히트에의 반복 적용을 위해 선택되었다.
도 38은 도 36에서 사용된 다클론 혈청을 대체하는 이러한 항체의 적용을 보여주는 반면, 도 39는 항-카파 또는 항-람다 항체를 갖는 서브타입 주변세포질 히트에의 카파 및 람다-특이 항체의 적용을 보여준다. 두 도면 간의 비교는 서브타이핑이 대부분의 경우 완벽하게 작용하지만, 항-중쇄 스크리닝에서 관찰되는 히트가 가끔 항-경쇄 스크린에 나타내지 않기 때문에 실패 염려가 없는 것은 아님을 시사한다(도 38과 39 간의 클론 24, 32, 157, 161, 203 및 253의 신호를 비교함). 더욱이, 서브타이핑은 또한 단량체 밴드에만 경쇄 신호의 존재를 보인다(도 39에서 클론 162, 254, 274, 275, 276 및 281). 이러한 중쇄-경쇄 이중 양성 주변세포질 히트의 서브세트의 서열분석시, 전부는 아니지만 대부분의 서열분석된 클론은 다시 중쇄의 ATG의 100bp 내에 종결 코돈을 나타내었다.
항체가 인-프레임 및 오프-프레임 클론을 구별할 수 있는지를 실험하기 위해, 주변세포질 추출물을 항-람다, 항-카파, 항-CH1 및 항-Hu (H+L) F(ab')2 항체로 프로빙된 비-환원된 웨스턴에서 3개의 고의 탠덤 인-프레임 클론 대 3개의 고의 오프-프레임(HC에서) 클론으로부터 시험하였다. 이러한 클론은 임의의 특정 항원에 대해 반응성인 것이 아니라, 모 라이브러리로부터 선택되거나 스크리닝 공정으로부터 폐기되며, 이때 유일한 특징은 이들의 주변세포질 추출물이 HRP-접합된 항-Hu (H+L) F(ab')2 단편으로 프로빙하는 경우 비-환원된 SDS 겔에서 ~50kDa 이량체를 보인다는 것이다(도 40, 패널 d). 이 분석은 카파 또는 람다 쇄-특이 항체는 인-프레임 또는 오프-프레임 클론을 구별할 수 없지만, 항-CH1 항체는 분명히 그렇게 할 수 있음을 보여주었다(도 40, 패널 c).
이러한 데이터에 기초하여, "진짜" LC-HC 이형이량체를 구별할 수 있는 항-CH1 항체의 명백한 능력(도 40, 패널 c)과 동시에 그렇게 하지 못하는 항-LC 항체의 무능력(도 40, 패널 a & b)이 어느 하나의 서브-타입 특이 항체 단독을 사용함으로써 이형이량체성 Fab 클론의 검출을 제한하는 것으로 추정된다. 따라서, 본 발명은 이러한 연쇄-스위칭에 의해 클론의 유전자형을 추론하기 위해 LC 또는 HC에 대해 특이적인 검출 항체의 연속 스위칭의 신규한 방법을 개시한다(도 41).
검출 항체의 연속 스위칭의 방법은 상이한 게이팅 오더(gating order)의 제형화를 가능케 하며, 여기서 선택 배지 플레이트로부터 수거된 파지 형질도입된 "단클론" 대장균 콜로니를 먼저 PCR 필터를 통해 통과시켜 1.5kb 삽입물을 갖는 클론을 동정한 다음 삽입물-양성 클론을 유도하여 주변세포질로부터 추출된 Fab를 생산한다. 항-CH1 항체로 프로빙된 이들 추출물의 웨스턴 블롯은 LC-HC 이형이량체 또는 HC-HC 동형이량체(둘 다 ~50 kDa에서)를 주변세포질에서 검출 가능한 수준(1-3pg/밴드)으로 생산하는 클론의 구분을 가능케 한다. 다음 단계에서, 이형- 또는 동형이량체를 함유하는 이러한 주변세포질 추출물을 폴리스티렌 웰에 고정화된 표적 항원에 결합시키고 LC-특이 검출 항체로 검출한다. 따라서, 이러한 연쇄 스위치는 실제로 주변세포질로 전환된 항원-결합된 LC-HC 이형이량체(바람직한 특성을 갖는 클론)만을 검출하며, 항원-결합된 HC-HC 동형이량체(바람직하지 않은 클론)는 전혀 검출되지 않으며, 따라서, 걸러내어 진다. 따라서, 조합된 접근법은 주변세포질에 검출 가능하게 전좌된 이형이량체성 Fab에 대한 클론의 항원-특이 ELISA 반응성을 분명히 할당하며 Fab가 추출되는 클론의 "진짜" 유전자형을 반영한다.
실시예 32
정량적 ELISA를 개발하기 위해 적용되는 연쇄-스위치의 이론
실시예 31에 예시된 연쇄-스위치 ELISA의 개념의 개발은 Fab 정량 ELISA의 개발을 가능하게 한다. 이러한 시스템에서, 주변세포질 Fab는 CH1 특이 항체를 사용하여 이들의 중쇄를 통해 포획되고, 경쇄-특이(항-카파 또는 항-람다) 항체로 검출된다. 사용되는 인간 Fab 표준은 상업적으로 이용가능하다. 최적화된 결합 및 세척 조건은 우수한 동적 범위 및 분석 직선성을 가능케 한다. 도 42는 인간 Fab 표준으로부터의 적합 곡선의 예를 보여준다.
실시예 33
오프 -프레임 클론을 검출하기 위해 적용되는 정량적 ELISA
실시예 32에 예시된 바와 같은 연쇄 스위치 ELISA는 오프-프레임 클론으로부터 측정 가능한 신호를 생성한다. 본 발명은 또한 인-프레임 클론으로부터의 Fab 만을 검출하도록 개질된 ELISA를 개시한다. 본 발명은 도 40에 예시된 바와 같은 개념에 따르는 인-프레임 및 오프-프레임 클론의 검출을 개시한다. 게다가, 본 발명은 주변세포질로부터 추출된 Fab에서 CH1 에피토프와의 최대 상호작용을 위해 플레이트 표면에 90°로 VL-VH 파라토프를 배향시키기 위한 스트렙트아비딘 표면 상의 포획 Fab의 고정화를 개시한다. 결과가 도 43에 나타내어져 있다.
실시예 34
플라스몬 공명에 의한 Fab의 동적 순위매김
본 발명은 몇 가지 SPR 칩 표면을 조사하며 항-CH1/항-CK 또는 항-CH1/항-Cλ 포획을 위한 이중 헤드를 갖는 이가 항체(CaptureSelect™; 인간 Fab-카파 또는 Fab-람다 Kinetics Biotin Conjugates; Life Technologies/ThermoFisher)를 개시한다. 도 44는 예비 실험에서, 이것은 어떠한 다른 포획 항체보다 상당히 많이, 주변세포질 추출물로부터의 인간 Fab 또는 무작위 인-프레임 Fab의 상업적으로 이용 가능한 표준 혼합물을 포획할 수 있음을 보여준다. 게다가, 표면은 포획 Fab의 상당한 침출 없이 반복적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 표획 표면을 최적화하기 위한 공지된 항체-리간드 쌍의 사용을 개시한다. 이러한 목적을 위하여, 전장 베바시주맙(IgG)의 내부(in-house) 정제된 제제를 파파인으로 소화시켰다. 생성된 Fab' 단편을 친화도 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합을 사용하여 Fc 단편으로부터 정제하였다. 짧은 2-단계 최적화 후, 이러한 Fab' 단편은 고 친화도 Fab에 대해 예상되는 동적 파라미터로 VEGF165에 결합하는 것으로 보여질 수 있다(도 45).
본 발명은 또한 베바시주맙 IgG의 Fab 부분이 조제 주변세포질 추출물로서 리간드 및 표면에 제시된다면 유사한 동적 파라미터가 관찰되는지를 실험한다. 도 46은 도메인 교체된 "BevacizuFab"의 조제 주변세포질 추출물이 베바시주맙의 정제된 Fab' 단편에서 관찰되는 바와 매우 유사한 동적 파라미터를 가짐을 입증한다.
실시예 35
일련의 수정된 게이트로서의 히트 선택
실시예 33-34에 기초하여, 본 발명은 파지 생물학에 고유한 짧은 오프-프레임 클론의 문제를 우회하고, 파지-표현형분석 동안 근본적인 유전자형 정보에 대해 고 충실도를 유지하면서 항원-결합 능력 및 동적 안정성과 같은 표현형 평가를 위해 Fab 융합체를 Fab 단백질로 대체하고, 자동화된 고속 처리를 포함하는 고속 처리를 할 수 있고, 노동의 엄청난 투입 및 오류 발생이 쉬운 조작 없이 히트들 간에 신속하고 의미있는 비교를 가능케 하는 신규한 일련의 게이트를 개시한다(도 47).
실시예 36
항- TNFα 바인더를 찾기 위한 단계화된 평가 과정의 적용
인간 가용성 TNFα(sTNFα: Uniprot P01375)는 단량체 형태의 17.5kDa 단백질이며 따라서, 1㎍/ml의 sTNFα의 용액은 57.1nM에 상응한다. 이러한 질량-몰 전환은 각 라운드의 패닝 동안 투입 유인 농도를 결정하기 위해 고려되었다. Acro-Biosystems(Cat#TNA-H821R, Lot#BL271R-65HS1-BQ)으로부터의 인간 TNFα(b-TNFα)의 상업적으로 이용 가능한 비오티닐화 버전이 패닝에 사용되었다. PBS, pH 7.4 중의 200㎍의 동결건조된 분말을 2ml의 멸균수에 용해시켜 570nM에 상응하는 0.1mg/ml의 최종 농도를 수득하였다. 사용되는 비오티닐화 화학은 NHS-LC-비오틴이었으며 제조업자는 TNFα의 몰 당 1-3개 비오틴 태그를 청구하였다. pSSY1에서 생산된 Fab의 중쇄 및 gIII 단백질 사이의 트립신 절단 부위의 존재는 이러한 비오티닐화 항원에 결합된 파지의 용출을 가능케 할 것이다.
b-TNFα의 품질은 Coomassie 염색 뿐만 아니라 SDS-PAA 겔의 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하였으며 허용 가능한 것으로 밝혀졌다(도 48). 비오틴 태그의 수는 Quanti*Tag™ 비오틴 키트(Vector Labs, Cat# BDK 2000)를 사용하여 확인하였다. 비오틴 태그의 수는 ~4.7mol/mol sTNFα이었다.
패닝을 위해 라운드당 200㎕ 비드(M280, Life Technologies/ThermoFisher)를 사용한다. b-TNFα에 대한 비드 포화 농도를 실험하였다. 이 과정은 투입 항원이 이용 가능한 비드 결합 표면적에 대해 최적이도록 200㎕ 비드의 비드 표면을 포화시키는데 필요한 b-TNFα의 최적 농도를 결정함을 포함한다. 이것은 2% M-PBS에서 1h 동안 미리 차단시긴 고정 용적의 비드(40㎕)를 고정된 양의 시간(1h) 동안 다양한 농도의 b-TNFα(60, 80, 100, 120nM)와 배양함으로써 결정된다. 통과량(flow through)(FT)을 추가의 분석을 위해 저장하고 비드를 0.05% Tween-20을 갖는 1x DPBS로 8회 및 Tween-20이 없는 1x DPBS를 사용하여 2회 세척하였다. 30㎕의 부하량, FT 및 비드를 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 부하하고 웨스턴 블롯팅에 적용하였다.
100nM b-TNFα는 60 내지 80nM에 비해 통과량에 더 많은 단백질을 보이는 것으로 관찰되었으며, 이것은 b-TNFα의 포화 농도가 40㎕ 비드의 경우 80nM임을 나타낸다. 따라서, 400nM b-TNFα가 200㎕의 M280 비드 용적을 위한 포화 농도로서 사용되어야 하는 것으로 결정되었다.
항체 파지는 실시예 30에 기술된 바와 같이 3.06 x 1011 cfu 라이브러리(표 49)를 전환시킴으로써 생성하였다. 첫 라운드의 패닝을 위해, 100배 과량의 라이브러리 파지(~3x1013 pfu)를 5ml 단백질 Lobind 튜브(Eppendorf)로 옮기고 튜브 회전기 상에서 15rpm에서 2ml의 2% MPBS 중에서 1h 동안 차단시켰다. 동시에, 200㎕의 스트렙트아비딘 비드(M280 Dynabeads)를 2ml의 1xPBS, pH 7.4로 3회 세척한 다음 파지에 대해 기술된 바와 같이 2% MPBS 중에서 차단하기 위해 유지시켰다. 그후, 예비-차단된 파지를 혼합하고 15rpm에서 Hula 혼합기 상에서 1h 동안 400nM의 b-TNFα와 배양하였다. 비드의 차단을 완료한 후, 비드를 자석(DynaMag-5; Life Technologies/ThermoFisher)을 사용하여 튜브의 측벽에 분리함으로써 차단 용액을 폐기하였다. 항원-파지 항체 복합체를 혼합하고 실온 및 15rpm에서 1h 동안 배양함으로써 상기 복합체를 스트렙트아비딘 비드 상에 포획시켰다 - 4㎕의 100% Tween-20을 2ml 혼합물에 가하여 0.2%의 최종 Tween 농도를 수득하였다. 비드-Ag-Ab 복합체를 자석을 사용하여 튜브의 측벽으로 끌어당기고 비결합된 파지는 버렸다. 비드 복합체를 2M-PBST(2% Tween-20을 가진 2% 탈지유)를 사용하여 2회 세척한 다음 1xPBS로 2회 세척에 적용하였다. 마지막 세척 전, 비드 복합체를 새로운 튜브로 옮기고, 비드를 자석에 의해 튜브의 벽으로 끌어당겼다. 항원 결합된 파지를 간간이 손가락으로 두드리면서 30min 동안 200㎕의 10㎍/ml의 트립신을 사용하여 용출시켰다. 항원 특이 파지를 함유하는 용출물을 자석을 사용하여 혼합물로부터 제거하고 새로운 튜브로 옮겼다. 용출물의 용적을 1xPBS를 사용하여 2ml로 되도록 만들고 용출물 역가 추정을 위해 40㎕를 별도로 분취하였다.
용출물을 다음의 패닝 라운드를 위해 파지 증폭에 적용하였다. 증폭을 위해, 이것을 용출 단계 2h 전에 접종한 1000배 과량(2-10ml)의 대수기(0.5OD600) TG1 세포와 혼합하였다. 파지가 37℃에서 진탕 없이 30min 동안 세포를 감염시키도록 한 다음 항생제 없이 250 rpm에서 1h 동안 추가로 배양하였다. 1h 후, 세포(10ml)를 100㎍/ml 카베니실린을 갖는 90ml의 2xYT 배지에서 1:10 희석시키고 37℃ 및 250rpm에서 추가로 1-2h 동안 성장시켰다. VCSM13 헬퍼 파지 감염은 30min 동안 진탕 없이 37℃에서 1:20 비로 수행하였다. 헬퍼 파지 감염된 세포를 동일한 온도에서 30min 동안 250rpm에서 추가로 성장시켰다. 마지막으로, 50㎍/ml 카나마이신을 100ml 배양물에 첨가하고 30℃ 및 250rpm에서 밤새(16h) 배양하였다. 다음 날, 증폭된 파지를 실시예 26에 기술된 바와 같이 PEG 침전시켰다.
용출물의 역가 추정은 TG1 및 Top10F' 세포에서 동시에 수행하였다 - 후자의 목적은 스크리닝을 위한 가용성 Fab를 얻는 것(Kontermann RE, 2010. Immunotube selections. In: Antibody Engineering; Vol. 1)인 반면 증폭된 파지는 10-9 내지 10-11 희석도에서 TG1에서만 적정되었다. 적정을위해, 20㎕의 라운드 1 파지 용출물을 멸균 96-웰 플레이트의 웰에서 180㎕의 LB 배지와 혼합하여 파지의 10-1 희석을 초래하였다. 유사하게, 파지의 로그 규모 희석은 10-4 희석도까지 수행하였다. 증폭된 파지의 역가 추정을 위해, 희석은 10-11까지 수행하였다. 100㎕의 마지막 세 가지 파지 희석물을 새로운 96-웰 플레이트에서 100㎕의 TG1 또는 Top10F' 세포의 대수기(0.5 OD600) 배양물과 혼합하고 37℃에서 30min 동안 배양하였다. 모두 3개 희석도의 100㎕의 파지 감염된 배양물을 100㎍/ml 카베니실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 콜로니의 수를 기록하고 용출물의 역가를 추정하였다.
패닝 라운드 2, 3 및 4는 각 연속 단계에 걸쳐 b-TNFα 농도의 일 로그(one log) 감소를 제외하고는 라운드 간에 투입 파지를 일정하게(1012 pfu) 유지함으로써 수행하였다. 표 50은 모든 4 라운드에 대한 용출물 역가 데이터를 보여준다. 증폭된 파지에 대한 역가 데이터는 1.4 내지 6.0 x1013 pfu에 이르렀다.
Figure 112019007425361-pct00071
역가 데이터는 용출물 역가가 패닝 라운드에 걸쳐 유인 농도의 감소에 따라 비례적으로 감소하였음을 개시한다. 모든 3 라운드로부터의 증폭된 파지의 수율은 상당히 유사하였다. 당해 과정이 네 번째 라운드 후 중단되었고 따라서 이들에 대한 역가 값이 이용 가능하지 않았기 때문에 라운드 4 파지는 증폭되지 않았다.
클론을 단클론 가용성 Fab 포맷으로 스크리닝하고 박테리아성 조제 주변세포질 추출물(PPE)로서 수확하였다. 클론의 공급원은 각 라운드의 패닝 동안 생성된 Top10F' 역가 플레이트였다. 모든 과정은 96-웰 포맷으로 고속 처리 방식으로 수행되었다. 항-TNFα 단클론 Fab 클론의 마스터 플레이트를 제조하기 위해, 단일의 잘 단리된 콜로니를 멸균 이쑤시개를 사용하여 Top10F' 역가 플레이트로부터 선발하고 멸균 96-웰 플레이트에서 2% 글루코스 및 100㎍/ml 카베니실린을 함유하는 150㎕의 LB 배지에 접종하였다. 총 960개 클론(10개 플레이트 x 96)이 라운드 3 및 라운드 4 플레이트로부터 접종되었다. 플레이트를 항원 명칭, 패닝 라운드, 일자 등이 적절하게 표지된 Breathe-seal®로 밀봉하고 37℃ 및 250rpm에서 밤새(16h) 배양하였다.
가용성 Fab의 발현을 위해, 각 클론의 밤새 배양물로부터의 50㎕를 다중채널 피펫을 사용하여 멸균 96-딥 웰 플레이트에서 0.1% 글루코스 및 100㎍/ml 카베니실린을 함유하는 450㎕의 CircleGrow 배지(MP Biomedicals)로 옮겼다. 플레이트를 Breathe-seal®로 밀봉하고 OD600이 도달할 때까지 37℃ 및 250rpm에서 배양하였다. 나머지 100㎕의 밤새 배양물에, 33㎕의 45% LB-글리세롤을 첨가하고, 혼합하고, 플레이트를 글리세롤 스톡(Master Plates)으로서 -80℃에서 저장하였다.
유도는 배양물이 성장의 대수기에 도달한 후 딥웰 플레이트에서 1mM의 최종 농도로 되도록 IPTG를 첨가함으로써 수행하였다. IPTG 첨가 후 플레이트를 Breathe-seal®로 재-밀봉하고, 30℃ 및 250rpm에서 밤새(16h) 유도하였다. 밤새 유도된 배양물을 30min 동안 96-웰 스윙아웃 플레이트 버킷에서 4℃에서 4000rpm로 펠렛화하였다. 플레이트를 주의해서 뒤집고 종이 타월 상에 가볍게 두드림으로써 상청액을 버렸다.
주변세포질 Fab의 추출을 위해, 100㎕의 주변세포질 추출 완충액(100mM Tris, pH 7.5, 10mM EDTA, 프로테아제 억제제 칵테일)을 다중채널 피펫을 사용하여 각각의 펠렛에 첨가하고 균질 재-현탁액을 위해 가볍게 혼합하였다. 플레이트를 밀봉하고 30℃ 및 150rpm에서 16h 동안 배양하였다. 밤새 추출 후, 플레이트를 4℃에서 30min 동안 스윙 아웃 96-웰 플레이트 버킷 중에서 4000rpm에서 원심분리하였다. 상청액은 가용성 단클론 Fab를 함유하는 주변세포질 추출물(PPE)이다. PPE를 적절하게 표지된 멸균 96-웰 플레이트로 옮기고, 분석시까지 4℃에서 저장하였다.
전장 인-프레임 리드 만을 선택하기 위해, 클론을 실시예 33에 기술된 바와 같이 카파 및 람다 검출 항체를 사용하여 연쇄 스위치 정량 ELISA에 적용하였다. 카파 및 람다 라이브러리가 패닝 전에 혼합되기 때문에, 각 PPE 추출물의 평행 세트를 카파 및 람다 특이 항체를 사용하여 시험하였다. qELISA를 수행하기 위해, 필요한 수의 플레이트를 0.5% 젤라틴을 함유하는 1xPBS 중에서 100㎍/ml의 비오티닐화 BSA(Sigma Cat#A8549)로 피복시키고 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 이들을 작동화된 96-웰 플레이트 세척기를 사용하여 0.05% Tween-20을 함유하는 1xPBS pH 7.4로 3회 세척하였다. 스트렙트아비딘(ThermoFisher, Cat# 21135)을 웰 당 100㎕를 첨가함으로써 비오티닐화 BSA 상에 포획하고 30℃ 및 150rpm에서 1h 동안 배양하였다. 이전과 같이 3회 세척함으로써 과량의 스트렙트아비딘을 제거하였다. 100㎕의 비오티닐화 항-CH1 포획 항체(ThermoFisher, Cat#7103202500)를 스트렙트아비딘 표면 상에 피복시키고 30℃에서 1h 동안 배양하였다. 웰을 100μM의 비오틴을 함유하는 200㎕의 1-2% BSA-PBS를 사용하여 1h 동안 차단하였다. 차단 동안, 카파 및 람다의 각각의 차단 용액에서 100ng/ml 내지 1.56ng/ml 범위의 상업적으로 이용 가능한 표준 인간 Fab(MP Biomedicals, Cat#855909)를 사용하여 표준물을 제조하였다. 이전과 같이 3회 세척하여 차단제를 제거하고, 조제 주변세포질 Fab를 100㎕의 PPE 및 Fab 표준물을 첨가하고, 플레이트를 30℃에서 1h 동안 배양함으로써 항-CH1 항체 상에 포획하였다. 이전과 같이 3회 세척함으로써 비결합된 Fab를 제거하였다. 포획된 Fab를 각각의 차단 용액에서 제조된 항체를 갖는 1:2000 희석도의 HRP 접합된 항-카파(Sigma; Cat#SAB3701414) 및 1:10000 희석도의 항-람다(Sigma; Cat#A5175)를 사용하여 검출하였다. 웰 당 100㎕의 각각의 항체를 첨가하고 37℃에서 1h 동안 배양하였다. 100㎕의 TMB 기질의 첨가 및 37℃에서 20-30min 동안의 배양에 의해 색을 전개시키기 전에 플레이트를 3회 세척하였다. 100㎕의 2M 황산의 첨가에 의해 반응을 중단시키고 플레이트를 450nM에서 판독하였다. 판독치를 기록하고 표준 그래프를 비선형 회귀 곡선을 사용하여 플롯팅하였다.
도 49는 연쇄 스위치 qELISA를 사용한 항-TNFα 가용성 Fab 스크리닝에 대한 플레이트 6의 대표적인 데이터를 보여준다. qELISA 양성 클론을 고(흑색 셀), 중(짙은 회색 셀) 및 저(옅은 회색 셀) 발현자(expresser)로 분류하였다. 각 카테고리에 대한 컷오프 값은 방법 개발 동안 인-프레임 및 오프-프레임 클론의 세트를 취하여 경험적으로 결정하였다(실시예 33).
qELISA에 의해 스크리닝된 960개 클론 중, 108개 클론이 람다 양성인 반면 373개 클론은 카파 양성이었다. 동적 순위매김을 위해 클론을 선택하는 동안, 고 발현자에 더 높은 우선권을 주고, 그 다움에 중 및 저 발현자 순으로 우선권을 준다.
연쇄 스위치 qELISA는 오프-프레임 Fab의 제거를 보장할 것이며 전장 인-프레임 클론 만을 선택할 것이지만 이들이 표적 항원에 결합할 것인지를 표명하지는 못할 것이다. 표적 특이 결합은 항원-특이 ELISA에 의해 확립될 수 있다. 본원에 기술된 과정은 이러한 ELISA 단계를 생략하고 SPR-기반 방법을 사용하여 클론을 직접 스크리닝한다. 동적 순위매김은, 이것이 최종 친화도(KD) 값과 함께 귀중한 동적 파라미터(k on , k off )를 제공할 뿐만 아니라 다른 클론보다 우수한 오프 속도를 갖는 클론 만을 선택하도록 할 수 있어 치료적 또는 진단적 용도를 보장할 것이기 때문에, 명백히 ELISA를 능가하여 유리하다.
이러한 고려사항에 기반하여, 100개 클론을 선발하여 이들의 PPE를 용적 및 용기를 상기한 바와 같이 96-웰 시스템에 조잘함으로써 50ml 규모로 생성하였다. PPE를 멸균 15ml 튜브로 옮기고 4℃에서 저장하였다. SPR 연구를 수행하기 전에, 100mM Tris를 함유하는 추출 완충액을 제거하는 것이 필수적이었다. 이러한 높은 완충액 염 농도는 PBS를 작동 및 샘플 완충액으로 하는 SPR 연구 동안 상당한 벌크 효과를 야기할 수 있다. 따라서, 모든 PPE를 10ml 용량 접선 유동 시스템(Millipore; 10kDa cut off)을 사용하여 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)의 존재하에서 1xPBS로 완충액 교환하였다. 투석물의 용적이 1/4th까지 더욱 감소되어, 소정의 총 OD600의 원래의 배양물 용적의 총 100x 압축을 야기하였다. 완충액 교환된 PPE를 멸균 1.5 또는 2.0ml 튜브로 옮기고 사용시까지 -20℃에서 저장하였다.
100 qELISA 양성 클론의 첫번째 라운드 친화도 순위매김을 단일 농도(500nM)의 sTNFα(박테리아에 의해 생산된 내부 생성물)를 사용하여 수행하였다. 그후, 첫번째 라운드 스크리닝으로부터의 SPR 양성 클론을 분석물 용량 적정으로 주의해서 분석하여 신뢰할 수 있는 동적 값을 얻었다. 모든 연구는 상기 단락에 기술된 바와 같이 50ml 규모로 추출된 조제 PPE를 사용하여 수행하였다. 도 50은 단일 분석물 농도(500nM)를 사용한 TNFα의 SPR 양성 클론에 대한 각각의 동적 스크리닝 프로파일 및 시험적인 동적 파라미터를 보여준다.
100개 qELISA 양성 히트 중의 10개 클론(10%)은 SPR 양성이었다. 용량 적정을 사용한 주의깊은 분석을 수행하기 전에, 모든 SPR 양성 클론을 실시예 25에 기술된 바와 같이 5개의 프라이머로 서열분석하였으며 모두 전장 탠덤 경쇄-중쇄 인-프레임 클론인 것으로 밝혀졌다(표 60). 이러한 데이터는 당해 실시예에 예시된 바와 같은 게이팅 시스템이 청구된 바와 같이(제28항) 100% 실패할 염려가 없음을 나타낸다. 추가로, 이러한 10개 항-TNFα 히트를 에피토프 비닝이라 불리는 공정에 의해 이들의 에피토프 특이성에 따라 분류하였다(Abdiche et al., 2009). 이러한 방식으로, 모든 이용 가능한 SPR 히트를 서로에 대해 시험할 수 있으며 에피토프 특이 빈(epitope specific bin)으로 분류하였다. 각 빈으로부터의 오직 하나의 대표적인 클론을 추가의 연구를 위해 채택하였다. 10개 항-TNFα 클론을 도 51에 나타낸 바와 같이 5개의 세트로 R x C 방식으로 주사하였다.
도 51로부터 자명한 바와 같이, 10개 항-TNFα 클론을 세 개의 에피토프 특이 빈으로 분류할 수 있다. 첫 번째 빈은 두 개의 클론 viz. bT1 및 bT86을 함유하고, 두 번째 빈은 일곱 개의 클론 viz. bT16, bT38, bT59, bT75, bT76, bT77 및 bT84를 함유하는 반면, 세 번째 빈은 단일 클론 viz. bT88을 함유한다. 표 60은 항-TNFα Fab의 데이터 빈을 요약한다. 각 빈의 하나의 대표적인 클론이 추가의 연구를 위해 채택하였다. 다음 단계는 신뢰할 수 있는 동적 파라미터(k a 및 k d ) 및 친화도 값(KD)을 얻기 위해 분석물 용량 적정에 의해 이러한 세 가지 클론을 주의해서 분석하는 것이었다.
Figure 112019007425361-pct00072
도 52는 모든 세 가지 클론의 SPR 프로파일 및 파라미터의 요약도를 보여준다. 도 52로부터, 모든 관련 SPR 파라미터(Rmax, χ2)가 범위내에 든다는 것이 자명하다. bT1의 친화도 값(KD)은 11.3nM이었고, bT59의 경우 12.9nM이었으며 bT88의 경우 13.8pM이었다.
실시예 37
항- Pf Rh5 바인더를 찾기 위한 단계화된 평가 공정의 적용
열대 열 말라리아 원충(P. falciparum) 망상적혈구-결합 단백질 동족체 5(PfRh5; UniProt Q8IFM5)는 59.8kDa 단백질이며 따라서, 1㎍/ml의 PfRh5의 용액은 16.7nM에 상응한다. 이러한 질량-몰 전환은 각 라운드의 패닝 동안 투입 유인 농도를 결정하기 위해 고려되었다. PfRh5의 내부 제제가 이러한 연구를 위해 사용되었다.
단백질의 품질을 SDS-PAA 겔의 Coomassie 염색에 의해 확인하였으며 허용 가능한 것으로 밝혀졌다(도 53). 설포-NHS-비오틴(Pierce)을 실시예 30에 기술된 바와 같이 정제된 항원을 비오티닐화하는데 사용하였다. Quanti*Tag™ 비오틴 키트(Vector Labs, Cat# BDK 2000)를 비오틴 태그를 추정하는데 사용하였으며, 2.22(~2)mol/mol의 PfRh5인 것으로 결정되었다.
항체 파지는 실시예 30에 기술된 바와 같이 3.06 x 1011 cfu 라이브러리를 전환시킴으로써 생성하였다(표 49). b-PfRh5의 솔루션 패닝을 위해, M280 Dynabead를 사용하였다. 4 라운드의 패닝, 용출 및 역가 추정을 두 가지를 변화시키면서 실시예 36에 기재된 바와 같이 수행하였다 - (a) 500nM의 b-PfRh5를 출발 유인 농도로서 사용하며 네 번째 라운드에 대해 500pM까지 되도록 각 라운드에서 일 로그 감소시키고 (b) 용출을 30min 동안 탄산염 완충액 pH 8.5 중의 50mM DTT를 사용하여 수행하였다. 표 61은 모든 4 라운드에 대한 용출물 역가 데이터를 보여준다. 증폭된 파지의 역가는 0.15-1.9 x 1013 pfu에 이르렀다. 패닝 과정이 네 번째 라운드 후 중단되었기 때문에 라운드 4 파지는 증폭되지 않았다.
Figure 112019007425361-pct00073
3rd 및 4th 라운드의 패닝으로부터 각각 192개 클론을 추가의 스크리닝을 위해 채택하였다. 총 384개 클론이 이렇게 하여 96-웰 플레이트에서 발현되었으며 실시예 36에 예시된 바와 같이 연쇄 스위치 ELISA를 사용하여 전장 클론에 대해 스크리닝하였다. 도 54는 연쇄 스위치 qELISA를 사용한 항-Rh5 가용성 Fab 스크리닝을 위한 플레이트 11의 대표적인 데이터를 보여준다. 양성 클론을 고(흑색 셀), 중(짙은 회색 셀) 및 저(옅은 회색 셀) 발현자로 분류하였다.
qELISA에서는 86개 클론은 람다 양성인 반면 65개 클론은 카파 양성인 것으로 나타났다. 동적 순위매김을 위해 클론을 선택하는 동안, 클론을 실시예 36에 기술된 바와 같이 우선순위를 매겼다. 100개 클론(카파 및 람다 qELISA 양성으로부터 각각 50개)을 동적 스크리닝을 위해 선발하였다. 50ml 규모 발현, 주변세포질 추출 및 완충액 교환을 실시예 36에 기술된 바와 같이 수행하였다. 100개 qELISA 양성 클론의 첫 번째 라운드 친화도 순위매김은 단일 농도(500nM)의 PfRh5를 사용하여 수행하였다. 100개 (12%) qELISA 양성 히트 중 12개 클론이 SPR 양성이었다(도 55).
용량 적정을 사용한 주의깊은 분석을 수행하기 전에, 모든 SPR 양성 클론을 실시예 25에 기술된 바와 같이 5개의 프라이머로 서열분석하였다. 2개의 클론은 콘틱을 세우기에 충분할 정도로 정확하게 서열분석할 수 없었다. 판독될 수 있는 10개 클론 중, 모두가 전장 탠덤 경쇄-중쇄 인-프레임 클론인 것으로 밝혀졌다(표 62). 이러한 데이터는 당해 실시예에 예시된 바와 같은 게이팅 시스템이 청구된 바와 같이(제28항) 100% 실패할 염려가 없음을 나타낸다.
Figure 112019007425361-pct00074
각각의 서열 빈으로부터의 하나의 대표적인 클론을 도 56에 도시된 바와 같이 분석물 용량 적정에 의해 신뢰할 수 있는 동적 파라미터(k a 및 k d ) 및 친화도 값(KD)을 생성하기 위해 채택하였다. 가장 높은 친화도 값(KD)이 bR28에 대해 관찰되었다(0.81 nM).
실시예 38
항- Pf CSP 바인더를 찾기 위한 단계화된 평가 공정의 적용
열대 열 말라리아 원충(Plasmodium falciparum) CSP(PfCSP; Uniprot Q7K740_PLAF7)는 42.5kDa 단백질이며 따라서, 1㎍/ml의 PfCSP의 용액은 23.5nM에 상응한다. 이러한 질량-몰 전환은 각 라운드의 패닝 동안 투입 유인 농도를 결정하기 위해 고려되었다. 정제된 PfCSP는 내부 이용 가능하였다.
단백질의 품질을 SDS-PAA 겔의 Coomassie 염색에 의해 확인하였으며 허용 가능한 것으로 밝혀졌다(도 57). PfCSP는 이러한 겔 상의 계산된 분자량보다 더 높은 분자량에서 작동하는 것으로 알려져 있다(Plassmeyer ML et al., 2009). 단백질의 품질은 패닝을 위해 허용 가능하였다. 단백질을 비오티닐화시키기 위해, 설포-NHS-SS-비오틴 화학을 실시예 30에 예시된 바와 같이 사용하였으며, 이것은 DTT에 의해 항원에 결합된 파지의 용출을 가능하게 한다. Quanti*Tag™ 비오틴 키트(Vector Labs, Cat# BDK 2000)를 사용하여 비오틴 태그의 수를 추정하였으며 3.65(~4) mol/mol의 PfCSP인 것으로 결정되었다.
항체 파지는 실시예 30에 기술된 바와 같이 3.06 x 1011 cfu 라이브러리를 전환시킴으로써 생성하였다(표 49). b-PfCSP의 솔루션 패닝을 위해, M280 Dynabead를 사용하였다. 4 라운드의 패닝, 용출 및 역가 추정을 두 가지를 변화시키면서 실시예 36에 기재된 바와 같이 수행하였다 - (a) 500nM의 PfCSP를 출발 유인 농도로서 사용하며 네 번째 라운드에 대해 500pM까지 되도록 각 라운드에서 일 로그 감소시키고 (b) 용출을 30min 동안 탄산염 완충액 pH 8.5 중의 50mM DTT를 사용하여 수행하였다. 표 63은 모든 4 라운드에 대한 용출물 역가 데이터를 보여준다. 증폭된 파지의 역가는 1.1-9.2 x 1012 pfu에 이르렀다.
Figure 112019007425361-pct00075
표 63은 용출물 역기가 패닝 라운드에 걸쳐 유인 농도의 감소에 따라 비례적으로 증가한다는 것을 보여 주었으며, 이것은 성공적인 패닝의 전형적인 신호로 간주된다(McCafferty J. 1996. Phage display: Factors affecting panning efficiency. In: Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual; Kontermann RE, 2010. Immunotube selections. In: Antibody Engineering; Vol. 1). 모든 세 가지 라운드로부터의 증폭된 파지의 수율은 상당히 유사하였다. 과정이 네 번째 라운드 후 중단되었기 때문에 라운드 4 파지는 증폭되지 않았다.
클론을 실시예 36에 기술된 바와 같이 단클론 가용성 Fab 포맷으로 스크리닝하였으며 박테리아성 조제 주변세포질 추출물로서 수확하였다. 도 58은 연쇄 스위치 qELISA를 사용한 항-PfCSP 가용성 Fab 스크리닝에 대한 플레이트 8의 대표적인 데이터를 보여준다. 양성 클론을 실시예 36에 기술된 바와 같이 분류하였다.
qELISA에 의해 스크리닝된 384개 클론 중, 201개 클론은 람다 양성인 반면 105개 클론은 카파 양성이었다. 동적 순위매김을 위해 클론을 선택하는 동안, 클론을 실시예 36에 기술된 바와 같이 우선순위를 매겼다. 100개 클론(카파 및 람다 qELISA 양성으로부터 각각 50개)을 동적 스크리닝을 위해 선발하였다. 50ml 규모 발현, 주변세포질 추출 및 완충액 교환을 실시예 36에 기술된 바와 같이 수행하였다. 100개 qELISA 양성 클론의 첫 번째 라운드 친화도 순위매김은 단일 농도(500nM)의 PfCSP를 사용하여 수행하였다. 도 59에 도시된 바와 같이, 이러한 저-해상도 스크리닝으로부터 100개 클론 중 87개는 SPR 양성이었다.
용량 적정을 사용한 주의깊은 분석을 수행하기 전에, 모든 SPR 양성 클론을 두 개의 프라이머로 서열분석하여 가변 경쇄 및 중쇄를 결정하였다. 80개 클론은 판독 가능한 서열이었으며, 이들 중 75개 클론은 동일한 서열을 가졌고 나머지 다섯 개(bC52, bC54, bC61, bC71 및 bC72)는 고유 서열을 가졌다. bC3(75개 클론의 주요 클러스터를 대표하는 것), bC52, bC54, bC61, bC71 및 bC72의 완전 서열은 암호화된 Fab의 탠덤 LC-HC 구조를 결정하기 위해 실시예 25에 기술된 바와 같은 다섯 개 프라이머로의 디데옥시 서열분석에 의해 수득하였다. 5개 클론은 전장 인-프레임(bC3, bC52, bC61, bC71 및 bC72)인 반면 하나의 클론(bC54)은 가변 중쇄에 종결 코돈을 가졌다. 이러한 데이터는 실시예 35에 예시된 바와 같은 게이팅 시스템이 PfCSP의 경우에 ~83% 실패할 염려가 없음을 나타낸다(표 64).
Figure 112019007425361-pct00076
이러한 다섯 개 클론을 이들의 서열에 있어서의 특이성에 따라 다섯 가지 빈으로 분류하였으며 데이터가 표 65에 나타내어져 있다.
Figure 112019007425361-pct00077
주석: bC3*은 75개 클론을 함유하는 주 클러스터를 대표하는 것이다.
전장 인-프레임 클론을 분석물 용량 적정에 의해 신뢰할 수 있는 동적 파라미터(k a 및 k d ) 및 친화도 값(KD)을 생성하기 위해 채택하였다. 도 60은 모든 다섯 개 클론의 SPR 프로파일 및 파라미터의 요약도를 보여준다.
열대 열 말라리아 원충(Plasmodium falciparum) 기원으로부터의 항원 및 인간 sTNFα에 대한 항체 발견 과정의 실시예는 본원에 기술된 항체 발견 펀넬 접근법과 조합된 초대형 나이브 항체 파지 디스플레이 라이브러리는 히트의 나노몰 이하 및 피코몰 범위의 KD 값에 의해 입증되는 바와 같이 친화도 성숙을 필요로 하지 않으면서 라이브러리로부터 직접적으로 치료 등급 항체를 생성할 수 있음을 나타낸다. 4회 연속 라운드의 패닝을 개시하여 수-용해된 단백질로서의 항원-특이 Fab의 동적 파라미터를 확립하는 사이에 약 4-5주가 소모되기 때문에 과정은 또한 신속하다. 따라서, 후자의 특성이 항체 제조를 위한 CQA가 적용될 수 있기 전 가장 중요한 가정이기 때문에, 본원에 예시된 바와 같은 과정은 파지-Fv 융합체로서의 표현형분석과 같은 중간 단계를 수반하지 않고서 및 선행 기술에 제시된 바와 같은 발현 분석을 위한 재-클로닝에 의해 파지 포맷을 플라스미드 포맷으로 전환시킬 필요 없이 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 발견된 항체의 직접적인 제조능 평가에 도움이 된다.
참조 문헌
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Claims (36)

  1. 3.06×1011 내지 9.13×1011 cfu 범위의 크기를 갖는 Fab 포맷의 나이브 항체 파지 디스플레이 라이브러리(APDL)를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은:
    i) 다음 단계를 포함하는 면역 레퍼토리(immune repertoire)를 포획하는 단계; 및
    a. RNA 단리 및 cDNA 합성;
    b. 서열번호 1-23 및 42-54로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하는 VL(람다 및 카파) 및 VH 도메인의 증폭;
    c. 서열번호 24-26으로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 주형 및 서열번호 27-31로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하는 C 도메인의 증폭;
    d. 서열번호 30, 35-37 및 55로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하는, 단계 b 및 c로부터 각각 수득된 Vκ 및 Cκ 도메인과 Vλ 및 Cλ 도메인의 융합에 의한 경쇄의 중첩 PCR;
    e. 서열번호 28 및 33으로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하는, 단계 b 및 c로부터 수득된 VH 및 CH1의 융합으로부터 수득된 중쇄의 중첩 PCR;
    f. 서열번호 34-37 및 55로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하는, Fab을 수득하기 위해 단계 d 및 e로부터 각각 수득된 경쇄 및 중쇄의 중첩 PCR; 및
    g. 각 단계에서의 앰플리콘(amplicon)의 정제;
    ii) 서열번호 38로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 벡터 pSSY1에 단계 i)의 포획된 면역 레퍼토리를 디스플레이하는 단계를 포함하고;
    여기서 APDL이 1.26×1011 내지 2.55×1011 cfu의 카파 라이브러리 및 1.79×1011 내지 3.59×1011 cfu의 람다 라이브러리를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 가변 람다 도메인의 증폭이 서열번호 14-23 및 46-54로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하고, 다음 단계를 포함하는 2-단계 PCR로 수행되는, 방법:
    i) 수용액 중에 cDNA 주형, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스(mix)의 혼합물을 수득하는 단계;
    ii) 단계 i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계; 및
    iii) 다양한 Vλ 레퍼토리 포획을 생성하도록 65 내지 72℃의 온도에서 단계 ii)로부터의 변성된 주형을 동시에 어닐링 및 연장시켜 가변 람다 도메인을 수득하는 단계.
  3. 제1항에 있어서, 가변 카파 도메인의 증폭이 서열번호 9-13 및 42-45로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하고, 다음 단계를 포함하는 3-단계 PCR로 수행되는, 방법:
    i) 수용액 중에 cDNA 주형, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
    ii) 단계 i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
    iii) 단계 ii)로부터의 변성된 주형에 프라이머를 55 내지 70℃의 온도 범위에서 어닐링시키는 단계; 및
    iv) 다양한 Vκ 레퍼토리 포획을 초래하도록 65 내지 72℃의 온도에서 단계 iii)으로부터의 어닐링된 주형 상에 프라이머를 연장시켜 가변 카파 도메인을 수득하는 단계.
  4. 제1항에 있어서, 가변 중쇄 도메인의 증폭이 서열 번호 1-8로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하고, 다음 단계를 포함하는 3-단계 PCR로 수행되는, 방법:
    i) 수용액 중에 cDNA 주형, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
    ii) 단계 i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
    iii) 단계 ii)로부터의 변성된 주형에 프라이머를 55 내지 70℃의 온도 범위에서 어닐링시키는 단계; 및
    iv) 다양한 VH 레퍼토리 포획을 초래하도록 65 내지 72℃의 온도에서 단계 iii)으로부터의 어닐링된 주형 상에 프라이머를 연장시켜 가변 중쇄 도메인을 수득하는 단계.
  5. 제1항에 있어서, CH1 도메인의 증폭이 서열번호 27-28로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 24 및 39로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 주형을 사용하고, 다음 단계를 포함하는 3-단계 PCR로 수행되는, 방법:
    i) 수용액 중에 합성 CH1-도메인 주형, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
    ii) 단계 i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
    iii) 단계 ii)로부터의 변성된 주형에 프라이머를 55 내지 70℃의 온도 범위에서 어닐링시키는 단계; 및
    iv) 65 내지 72℃의 온도에서 단계 iii)으로부터의 어닐링된 주형 상에 프라이머를 연장시켜 불변 중쇄 도메인을 수득하는 단계.
  6. 제1항에 있어서, Cκ 및 Cλ 도메인의 증폭이 서열번호 29-31로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 25, 26, 40, 및 41로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 주형을 사용하고, 다음 단계를 포함하는 2-단계 PCR로 수행되는, 방법:
    i) 수용액 중에 합성 Cκ 및 Cλ 도메인, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
    ii) 단계 i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계; 및
    iii) 65 내지 72℃의 온도에서 단계 ii)로부터의 변성된 주형을 동시에 어닐링 및 연장시켜 불변 카파 및 람다 도메인을 수득하는 단계.
  7. 제1항에 있어서, Vκ 및 Cκ 도메인 및 Vλ 및 Cλ 도메인의 융합이 서열번호 30, 35-37, 및 55로 제시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하고, 다음 단계를 포함하는 2-단계 PCR로 수행되는, 방법:
    i) 수용액 중의 제2항 및 제3항으로부터의 경쇄 가변 유전자 주형 및 제6항으로부터의 불변 유전자 주형, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
    ii) 단계 i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계; 및
    iii) 65 내지 72℃의 온도에서 단계 ii)로부터의 변성된 주형을 동시에 어닐링 및 연장시켜 람다 및 카파 경쇄 레퍼토리를 수득하는 단계.
  8. 제1항에 있어서, VH 및 CH1 도메인의 융합이 서열번호 28 및 33으로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하고, 다음 단계를 포함하는 3-단계 PCR로 수행되는, 방법:
    i) 수용액 중에 각각 제4항으로부터의 중쇄 가변 유전자 주형 및 제5항으로부터의 불변 유전자 주형, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
    ii) 단계 i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
    iii) 단계 ii)로부터의 변성된 주형에 프라이머를 55 내지 70℃의 온도 범위에서 어닐링시키는 단계; 및
    iv) 68 내지 72℃의 온도에서 단계 iii)으로부터의 어닐링된 주형 상에 프라이머를 연장시켜 중쇄 레퍼토리를 수득하는 단계.
  9. 제1항에 있어서, 경쇄 및 중쇄의 융합 PCR이 서열번호 34, 37 및 55로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하고, 다음 단계를 포함하는 2-단계 PCR로 수행되는, 방법:
    i) 수용액 중에 제7항에서 수득된 경쇄 레퍼토리 및 제8항으로부터의 중쇄 레퍼토리, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
    ii) 단계 i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계; 및
    iii) 65 내지 72℃의 온도에서 단계 ii)로부터의 변성된 주형을 동시에 어닐링 및 연장시켜 람다 및 카파 Fab 레퍼토리를 수득하는 단계.
  10. 제1항에 있어서, 경쇄 및 중쇄의 융합 PCR이 서열번호 34-37 및 55로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하고, 다음 단계를 포함하는 3-단계 PCR로 수행되는, 방법:
    i) 수용액 중에 제7항에서 수득된 경쇄 레퍼토리 및 제8항에서 수득된 중쇄 레퍼토리, 폴리머라제 효소, 프라이머, 완충액 및 dNTP 믹스의 혼합물을 수득하는 단계;
    ii) 단계 i)의 혼합물을 90 내지 96℃의 온도 범위에 적용하여 주형을 변성시키는 단계;
    iii) 단계 ii)로부터의 변성된 주형에 프라이머를 55 내지 70℃의 온도 범위에서 어닐링시키는 단계; 및
    iv) 65 내지 72℃의 온도에서 단계 iii)으로부터의 어닐링된 주형 상에 프라이머를 연장시켜 람다 및 카파 Fab 레퍼토리를 수득하는 단계.
  11. 제1항에 있어서, 벡터 내 포획된 면역 레퍼토리의 디스플레이가 다음 단계를 포함하는, 방법:
    i) Fab를 선형 파지미드 벡터에 결찰시키는(ligating) 단계; 및
    ii) 결찰된 혼합물을 숙주 내로 형질전환시키는 단계.
  12. 제11항에 있어서, 서열번호 34-37로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 프라이머를 사용하여 수득된 Fab 레퍼토리의 파지미드 벡터 내 결찰이 다음에 의해 수행되는, 방법:
    i) 점착성 말단을 갖는 선형 Fab를 방출하기 위해 50℃에서 16시간 동안 32 U/μg SfiI로 단계 ii)로부터의 자가-결찰된 Fab 집단의 제한 소화(restriction digestion)에 이은 아가로스 겔 정제; 및
    ii) 16℃의 온도에서 16시간 동안에 이은 37℃에서 1시간 동안 파지미드 벡터 내에 단계 iii)으로부터 수득된 선형 Fab의 점착성 말단 결찰 및 70℃에서 15분간의 열-불활성화.
  13. 제11항에 있어서, 형질전환이 0.1, 0.2, 0.4 cm 전극간 간격의 큐벳(cuvette) 중에서 2500 내지 3200 volts 범위의 전압, 20 μF 내지 28 μF 범위의 정전용량 및 250 ohms 내지 350 ohms의 저항에서 50 μl의 초수용(ultracompetent) 세포 당 200 내지 300 ng의 DNA 대 세포 용적 비로 수행되는, 방법.
  14. 제11항에 있어서, 숙주가 초고 수용성(ultrahigh competence)(4×1010 cfu/μg)의 TG1로부터 선택되는 숙주를 암호화하는 호박 코돈 억제자(amber suppressor) t-RNA인, 방법.
  15. 제1항에 있어서, APDL이 제13항 또는 제14항에 따른 단일 단계의 형질전환에서 제12항에서 수득되는 40 내지 50 μg의 결찰된 DNA로부터 수득되고, 여기서 카파 서브타입이 단일 단계의 형질전환에서 1.92×109 내지 1.98×1010 cfu/μg의 효율로 25 μg 내지 30 μg의 결찰된 DNA로부터 수득되고, 람다 서브타입이 단일 단계의 형질전환에서 1.92×109 내지 9.1×109 cfu/μg 의 효율로 10 μg 내지 20 μg의 결찰된 DNA로부터 수득되는, 방법.
  16. 제1항에 개시된 방법으로부터 생성된, 3.06×1011 내지 9.13×1011 cfu 범위의 크기를 갖는 Fab 포맷의 나이브 항체 디스플레이 라이브러리(APDL)로서, 1.26×1011 내지 2.55 x 1011 cfu의 카파 라이브러리 및 1.79×1011 내지 3.59×1011 cfu의 람다 라이브러리를 포함하는, 나이브 항체 디스플레이 라이브러리.
  17. 제16항에 청구된 나이브 항체 디스플레이 라이브러리로부터 정의된 순서로 제조가능한 항체를 가용성 Fab로서 수득하는 방법으로서, 상기 정의된 순서가:
    i) 풍부한(enriched) 바인더 집단을 수득하기 위한 표적 특이적 패닝(panning) 단계;
    ii) 주변세포질 정량적 ELISA(qELISA) 단계;
    iii) 동적 순위매김(kinetic ranking) 단계;
    iv) 생물검정(bioassay) 단계; 및
    v) 제조능 평가 단계를 포함하고,
    그로써 단계 iii)에서 수득된 항체에서 >90%의 표현형 대 예상 유전자형 상관도를 초래하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 주변세포질 정량적 ELISA가 다음 단계를 포함하는, 방법:
    i) 비-호박 코돈 억제자 숙주의 역가 플레이트로부터 단일 클론의 선발(picking)에 이어 37℃ 및 250 rpm에서 밤새 성장을 위해 96-웰 딥웰 플레이트에서 액체 배양하고 밤새 배양물을 10배 희석한 후 1 mM IPTG로 대수기(log phase)로의 성장을 허용하고, 30℃ 및 250 rpm에서 밤새 성장하게 한 후 96-웰 플레이트에서 배양물을 원심분리하여 유도된 세포를 펠렛화하고, 완충액-현탁된 세포를 동일한 96-웰 플레이트에서 30℃에서 밤새 서서히 진탕시키면서 완충액 중의 고농도 EDTA를 사용하여 펠렛화된 세포를 주변세포질 추출하고, 마지막으로 원심분리하여 단계 v)에서 확산된 주변세포질 분획을 스페로플라스트 및 세포 파괴물로부터 분리함으로써 용출물 역가 플레이트로부터의 풍부한 바인더 집단의 단일 박테리아 콜로니로부터 가용성 Fab을 수득하는 단계;
    ii) 96-웰 충전된 폴리스티렌 플레이트의 표면을 중쇄에 대한 포획 항체로 코팅하거나; 또는 상기 표면을 아비딘 또는 스트렙트아비딘 또는 뉴트라비딘으로 코팅하거나, 상기 표면을 20 내지 100 ㎍/ml 범위의 농도로 스트렙트아비딘으로 코팅하거나, 또는 상기 표면을 100 ㎍/ml의 농도로 스트렙트아비딘으로 코팅하는 단계;
    iii) 단계 ii)의 코팅된 표면 상에 단계 i)로부터의 가용성 Fab를 포획하는 단계로, 포획 항체가 100-1000 ng/ml 농도의 염소 항-인간 IgG(염소 항-인간 IgG (H+L); F(ab')2 단편), 포획 선택 비오틴 항-IgG-CH1 접합체, 및 비오티닐화 항-CH1 항체를 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 단계; 및
    iv) 경쇄 특이적 항체의 사용에 의해 경쇄를 검출하여 전장(full length), 탠덤 인-프레임(tandem in-frame), 이형이량체성, 가용성 Fab를 동정하는 단계로, 경쇄 특이적 항체가 항-람다의 경우 1 내지 10000 및 항-카파의 경우 1 내지 2000 범위의 희석도에서 염소 항-인간 람다 LC 특이적 퍼옥시다제 접합체, 염소 항-인간 카파 LC 특이적 퍼옥시다제 접합체, 염소 항-인간 F(ab')2-HRP, 마우스 항-인간 카파 경쇄 퍼옥시다제 접합체, 마우스 항-인간 카파 경쇄 단클론 및 토끼 항-인간 카파 쇄 단클론을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 단계.
  19. 제17항에 있어서, 동적 순위매김이 다음 단계를 포함하는, 방법:
    i) 50 ml 개별 배양에서 제18항에 청구된 정량적 ELISA 양성 클론으로부터 가용성 Fab를 수득하는 단계;
    ii) 단계 i)로부터 수득된 Fab를 1× PBS에 대해 투석하는 단계;
    iii) 동역학 분석을 위해 생리학적 강도 및 pH의 작용 완충액(running buffer)을 사용하는 단계로, 완충액이 인산염, HEPES, 또는 0.25 내지 0.75 M의 NaCl 또는 KCl 및 0.005 내지 0.05%의 Tween-20 농도를 함유하는 인산염일 수 있는, 단계;
    iv) SPR(표면 플라즈몬 공명) 칩 고정화 표면을 선택하는 단계로, 이러한 표면이 하전된 덱스트란, 하전된 알기네이트, 하전된 덱스트란 또는 알기네이트 표면 상에 코팅된 니켈 니트릴로테트라아세트산, 또는 하전된 덱스트란 또는 알기네이트 표면 상에 코팅된 스트렙트아비딘 또는 뉴트라비딘으로부터 선택될 수 있는, 단계;
    v) 단계 i)에서의 SPR 표면을 위한 고정화 화학(immobilization chemistry)을 선택하는 단계로, 고정화 화학이 EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드) 및 설포-NHS(N-하이드록시석신이미드)를 사용한 아민 커플링, 10 mM 황산니켈을 사용한 Ni2+ 충전, 또는 스트렙트아비딘-비오틴 인지 화학을 포함하는, 단계;
    vi) 단계 v)로부터의 칩 표면 상에 항-Fab 포획 항체를 고정화시키는 단계로, 포획 항체가 항-Fab IgG, 항-태그 항체, 항-His, 항-HA, 비오티닐화 항-CH1, 비오티닐화 이가 항-CH1/항-Cλ, 비오티닐화 항-CH1/항-Cκ, 및 비오티닐화 이가 항-CH1/항-Cλ 및 비오티닐화 항-CH1/항-Cκ 둘 다의 50:50 혼합물을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 단계;
    vii) 단계 vi)로부터의 칩의 포획 항체-코팅된 표면 상에 단계 ii)로부터 수득된 조제(crude) 주변세포질 Fab를 포획하는 단계;
    viii) 2-15분의 중간 정지(intermediate pause)를 가지면서 칩 표면에 걸친 1-3 차례의 작용 완충액 주사에 의해 신호를 안정화시키는 단계;
    ix) 단계 viii)의 포획된 Fab에 대한 분석물 반응을 시험하여 표적 항원 바인더와 비-바인더를 구별하는 단계; 및
    x) 다음 차례의 스크리닝에 재-사용될 표면에 대해 재생 시약을 사용하여 Fab-분석물 복합체를 제거하는 단계로, 재생 시약이 2 M MgCl2, 0.85% H3PO4, 50 mM NaOH 또는 10 mM 글리신(pH 2.0)을 포함할 수 있는, 단계.
  20. 제1항에 청구된 방법으로부터 생성된, 3.06×1011 내지 9.13×1011 cfu 범위의 크기를 갖는 Fab 포맷의 나이브 항체 파지 디스플레이 라이브러리(APDL)를 사용하여, 진단적 및 치료적 목적 및 시험관 내 검정을 위한 항체를 수득하는 방법으로서, APDL이 1.26×1011 내지 2.55×1011 cfu의 카파 라이브러리 및 1.79×1011 내지 3.59×1011 cfu의 람다 라이브러리를 포함하는, 방법.
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