CN117363606A - 一种获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法 - Google Patents

一种获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法。具体地，本发明的获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法，包括步骤：提取人PBMC的总RNA，以总RNA为模板反转录合成cDNA，以cDNA为模板多次PCR扩增，随后酶切获得线性化载体片段、抗体基因片段，连接片段获得连接产物，导入用于噬菌体展示的宿主细胞获得全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库，随后对文库进行淘选和单克隆ELISA。本发明方法获得的文库阳性率高、多样性好、库容大。

Description

一种获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法。
背景技术
噬菌体展示技术于1985年由George P.Smith通过将外源基因插入到丝状噬菌体的基因组中、使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示到噬菌体的表面而创建。Gregory P.Winter建立了一个噬菌体库，利用该库开发出了全人源抗体的药物-靶向人肿瘤坏死因子α的阿达木单抗(修美乐)。该药2003年首次在美国上市场，是全球第一个从噬菌体展示技术得到的上市抗体药物。2018年，诺贝尔化学奖授予在噬菌体展示技术方面做出贡献George P.Smith和Gregory P.Winter。
自噬菌体展示技术发现以来，该技术不断发展，在抗体发现包括抗体亲和力成熟方面得到广泛应用。2018年9月3日，EMA批准赛诺菲纳米抗体药物Cablivi(Caplacizumab)用于治疗成人获得性血栓性血小板紫癜(aTTP)，Cablivi成为首个上市的单域抗体药物。2021年11月，由康宁杰瑞开发的靶向PD-L1的单域抗体-恩沃利单抗在中国获批上市，成为全球第二款上市的单域抗体药物，也成为全球第一款皮下注射抗体药物。
双特异抗体是近年兴起的新技术，它可以发挥两种抗体不同作用机制的协同效应因而效果比单特异抗体更强。目前双特异抗体的发现采取先筛选单特异抗体，然后再构建成双特异抗体的路线。构建出的双特异抗体中单个抗体的结合性能会发生改变、同时在实际操作过程中存在双特异抗体分子不稳定以及产量的问题，需要大量筛选，所涉及到的构型上百种，从单特异抗体出发构建双特异抗体无异于重新开发抗体。本专利构建双抗体结合域噬菌体展示文库，从该文库直接筛选双特异抗体是一种全新的双特异抗体发现思路，不仅免去了重新构建双特异抗体的过程而工作量大大降低，而且利用该思路筛选的抗体，因不稳定的、表达量差的双特异抗体在筛选过程中被筛除，因而抗体成药性好。
如上所述，现在双特异抗体发现工作量大，还面临成药性的问题。本方法可以在早期筛选过程中直接消除其不足。
发明内容
本发明的目的就是提供一种获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法。
在本发明第一方面，提供了一种获得双特异抗体的噬菌体展示库的构建方法，所述的双特异性抗体为双特异性的全人源单域抗体，
所述方法包括以下步骤：
(a)提取人PBMC的总RNA；
(b)以所述总RNA为模板，通过反转录，合成cDNA；
(c)以所述cDNA为模板，用第一引物集进行第一轮PCR扩增，从而获得第一轮扩增产物；其中，第一引物集包括SEQ ID No:1～43所示的正向引物和SEQ ID No:44-47所示的反向引物；
(d)以第一轮扩增产物为模板，用第二引物集进行第二轮PCR扩增，从而获得第二轮扩增产物；其中，第二引物集包括SEQ ID No:48～90所示的第一抗体可变区正向引物，SEQ ID No:91-94所示的第一抗体可变区反向引物，SEQ ID No:95～137所示的第二抗体可变区正向引物，和SEQ ID No:138～141所示的第二抗体可变区反向引物；
(e)以第二轮扩增产物为模板，用第三引物集进行第三轮PCR扩增，从而获得第三轮扩增产物；其中，第三引物集包括SEQ ID No:142～184所示的正向引物，SEQ ID No:185～188所示的反向引物；
(f)将用于构建文库的载体和所述第三轮扩增产物用限制性内切酶I和限制性内切酶II进行酶切，获得经酶切的线性化的载体片段和线性化的抗体基因片段；
(g)将所述经酶切的线性化的载体片段和线性化的抗体基因片段进行连接反应，从而获得连接产物；
(h)将所述连接产物导入用于噬菌体展示的宿主细胞，从而获得所述的双特异性的全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库。
在另一优选例中，所述的用于噬菌体展示的宿主细胞包括大肠杆菌。
在另一优选例中，所述步骤(a)包括：
(a1)人PBMC的分离
采集抗凝血，分离获得PBMC；
(a2)总RNA的提取
取所述PBMC，提取总RNA。
在另一优选例中，所述步骤(b)包括：cDNA的合成，即，以步骤(a2)提取的PBMC总RNA为模板，反转录合成cDNA；
在另一优选例中，步骤(c)中还包括：对第一轮PCR扩增产物进行核酸电泳检测。
在另一优选例中，步骤(d)中还包括：对第二轮PCR扩增产物进行核酸电泳检测。
在另一优选例中，所述的用于构建文库的载体包括：pCOMB3。
在另一优选例中，步骤(h)中还包括测定多样性：取阳性克隆，进行噬菌粒测序并分析序列多样性。
在另一优选例中，步骤(i)中还包括：
(i1)宿主菌TG1活化；
(i2)磁珠洗涤及封闭；
(i3)抗原结合；
(i4)库封闭；
(i5)噬菌体结合；
(i6)洗涤；
(i7)洗脱；
(i8)测滴度；
(i9)噬菌体扩增；
(i10)噬菌体沉淀；
(i11)重复步骤(i2)～(i10)两或三次，获得结合力强的噬菌体展示抗体。
在另一优选例中，步骤(c)所述的第一轮PCR扩增，其反应体系为：ddH2O13.6μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，10×buffer 2μL，cDNA 0.8μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，Ex Taq 0.08μL，总体积20μL。
在另一优选例中，步骤(c)所述的第一轮PCR扩增，其反应程序为：94℃4min，98℃10s，59℃40s，72℃50s，72℃10min，扩增循环25次。
在另一优选例中，步骤(d)所述的第二轮PCR扩增，其反应体系为：10×buffer2.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，第一轮扩增回收产物15ng，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，ExTaq 0.1μL，ddH2O补足至总体积25μL。
在另一优选例中，步骤(d)所述的第二轮PCR扩增，其反应程序为：94℃4min，98℃10s，59℃40s，72℃50s，72℃10min，扩增循环15次。
在另一优选例中，步骤(e)所述的第三轮PCR扩增，其反应体系为：10×buffer2.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，第二轮扩增回收产物15ng，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，ExTaq 0.1μL，ddH2O补足至总体积25μL。
在另一优选例中，步骤(e)所述的第三轮PCR扩增，其反应程序为：94℃4min，98℃10s，59℃40s，72℃50s，72℃10min，扩增循环15次。
在本发明的第二方面，提供了一种双特异抗体的噬菌体展示库，所述双特异抗体的噬菌体展示库是用如本发明第一方面所述的方法构建的。
在另一优选例中，所述文库的阳性率为≥80％，较佳地，≥90％。
在另一优选例中，所述文库的抗体序列多样性为≥90％，较佳地，≥95％。
在另一优选例中，所述文库的库容为≥1×108pfu，较佳地，≥5×108pfu。
在本发明的第三方面，提供了一种淘选双特异抗体的方法，包括步骤：
(S1)提供本发明第二方面所述的双特异抗体的噬菌体展示库；
(S2)利用抗原A1和抗原A2，对所述抗体文库进行淘选，从而获得针对抗原A1和抗原A2的双特异抗体。
在另一优选例中，在步骤(S2)中，包括以下子步骤：
(S2a)在第一轮抗体文库淘选时，将两种抗原(A1和A2)同时加入，
(S2b)在第二轮筛选过程中，只用单个抗原A1进行筛选；
(S2c)在第三轮筛选过程中，只用单个抗原A2进行筛选；
(即两个抗原A1和A2在这二轮中被交替使用，进行筛选)。由于在第二、三轮筛选过程中，每轮只用单个抗原进行筛选且两个抗原交替使用，这样可以把只结合一个抗原的抗体筛除，所有同时结合两个抗原的抗体全部保留。
在另一优选例中，所述方法还包括：
(S3)对于上一步骤获得的双特异性抗体，通过ELISA检测其与抗原A1和抗原A2的结合性能。
在本发明的第四方面，提供了一种引物集，所述引物集为SEQ ID No:1～188所示的引物序列。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为显示RNA提取的部分total RNA非变性电泳检测；两排样品共48个RNA，每泳道3条带分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。Marker为DNA Marker，从上到下依次为2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。
图2为显示抗体基因第一轮扩增的部分抗体可变区基因扩增产物电泳图；两排样品共24个样品，因第一轮扩增区有抗体基因CH1区，故大小约为700bp(因抗体基因不同大小不同)；DNA Marker从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。
图3为显示抗体基因第二轮扩增的部分抗体可变区基因扩增产物电泳图；两排样品共24个样品，目标条带大小约为410bp(因抗体基因不同大小不同)；DNA Marker从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。
图4为显示抗体基因第三轮扩增(拼接抗体基因并加酶切点)，部分两条抗体可变区基因拼接为一条基因链同时加入酶切位点的扩增产物电泳图；共24个样品，目标条带大小约为750bp(因抗体基因不同大小不同)；DNA Marker从上到下依次为2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。
图5为显示pCOMB3载体酶切电泳图；DNA Marker从上到下依次为6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2500bp、2000bp和1500bp。
图6为显示两个抗体可变区基因拼接基因单克隆PCR鉴定电泳图；四排样品共96个克隆，目标条带大小约为930bp(因抗体基因不同大小不同)；DNA Marker从上到下依次为2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。
图7为显示阳性克隆中抗体序列同源性分析。
图8为显示单克隆噬菌体ELISA结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，通过大量筛选，首次构建了一种基于全人源抗体基因的单域抗体文库。具体地，本发明人采用特定的引物，扩增获得全人源抗体基因并拼接形成双特异性的单域抗体构建物，将所述构建物与载体片段连接后，导入用于噬菌体展示的宿主细胞，从而获得所述的双特异性的全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库。本发明方法获得的于双特异性的全人源抗体基因的单域抗体文库具有阳性率高、多样性好、库容大等优点。在此基础上完成了本发明。
双特异抗体的噬菌体展示库
本发明首次提供了一种双结合域抗体(即双特异性抗体)的展示文库及其淘选方法，其中双结合域抗体的每个单特异性抗体元件均为人源的单域抗体元件。其示意图如下所示：
VHH1 Linker VHH2
如本文所用，术语“本发明抗体文库”、“本发明的双特异抗体的噬菌体展示库”、“本发明的单域抗体文库”等可互换使用，指采用本发明第二方面中所述的双结合域抗体(即双特异性抗体)的噬菌体展示抗体文库。本发明文库是采用特定的引物集，通过本发明第一方面中所述的构建方法制备的。
一种优选的本发明文库是基于噬菌体的文库。优选的，本发明文库是基于M13噬菌体的文库。
M13噬菌体外壳含有衣壳蛋白pIII。将抗体基因与pIII蛋白基因融合，当噬菌体感染大肠杆菌后，在子代噬菌体组装过程中，抗体被pIII蛋白带至外壳上，从大肠杆菌中分泌出来子代噬菌体表面存在与pIII蛋白融合的抗体，从而实现抗体展示。
M13噬菌体对大肠杆菌的感染为溶源性，不裂解大肠杆菌，其基因组可以复制出的单链DNA形式稳定存在于大肠杆菌，因而可以随着大肠杆菌的增殖而增殖其基因组。利用M13噬菌体上这一特性相关元件改造质粒，构建成噬菌粒载体，用于抗体展示，可以方便的进行单克隆和测序，从而获得单克隆抗体。
构建方法
本发明还提供了用于构建本发明文库的方法。
典型地，本发明的构建方法如本发明第一方面中所述。
包括步骤：
(a)提取人PBMC的总RNA；
(b)以所述总RNA为模板，通过反转录，合成cDNA；
(c)以所述cDNA为模板，用第一引物集进行第一轮PCR扩增，从而获得第一轮扩增产物；其中，第一引物集包括SEQ ID No:1～43所示的正向引物和SEQ ID No:44-47所示的反向引物；
(d)以第一轮扩增产物为模板，用第二引物集进行第二轮PCR扩增，从而获得第二轮扩增产物；其中，第二引物集包括SEQ ID No:48～90所示的第一抗体可变区正向引物，SEQ ID No:91-94所示的第一抗体可变区反向引物，SEQ ID No:95～137所示的第二抗体可变区正向引物，和SEQ ID No:138～141所示的第二抗体可变区反向引物；
(e)以第二轮扩增产物为模板，用第三引物集进行第三轮PCR扩增，从而获得第三轮扩增产物；其中，第三引物集包括SEQ ID No:142～184所示的正向引物，SEQ ID No:185～188所示的反向引物；
(f)将用于构建文库的载体和所述第三轮扩增产物用限制性内切酶I和限制性内切酶II进行酶切，获得经酶切的线性化的载体片段和线性化的抗体基因片段；
(g)将所述经酶切的线性化的载体片段和线性化的抗体基因片段进行连接反应，从而获得连接产物；
(h)将所述连接产物导入用于噬菌体展示的宿主细胞，从而获得所述的双特异性的全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库。
淘选方法
在本发明中，本发明人还开发了一种新颖的双特异抗体筛选(或淘选)方法，该方法包括步骤：
首先，在第一轮抗体文库淘选时，将两种抗原(A1和A2)同时加入，这样所获得的噬菌体展示抗体包括只结合单一抗原A1的抗体、只结合单一抗原A2的抗体、和同时结合两种抗原(A1和A2)的抗体。若只用其中一个抗原则大部分同时结合两个抗原的抗体被丢掉，保留下来的极少量的同时结合两个抗原的抗体是很难筛选到或者性能合适的很难筛选到。
其次，在第二轮筛选过程中，只用单个抗原A1进行筛选；在第三轮筛选过程中，只用单个抗原A2进行筛选；(即两个抗原A1和A2在这二轮中被交替使用，进行筛选)。由于在第二、三轮筛选过程中，每轮只用单个抗原进行筛选且两个抗原交替使用，这样可以把只结合一个抗原的抗体筛除，所有同时结合两个抗原的抗体全部保留。
结果表明，基于本发明的双结合域抗体展示文库以及优选的淘选方法，可高效地获得数量多、性能合适的双特异性抗体(即可同时结合两个抗原的抗体)。
本发明的主要优点
(a)直接获得双特异性抗体，改变了以往先获得单特异抗体，再构建成双特异抗体，最后再筛选的双特异抗体获得方法，大大加快实验进程。加之一旦文库建成，可以很容易运用于其它靶点，工作量更加节省。
(b)本发明中，两个抗体可变区均来源于全部的B细胞群，种类丰富，而传统先筛选单特异抗体再构建成双特异抗体的方法，只能选择有限的单特异抗体进行构建。
(c)获得的双特异抗体溶解性和/或稳定性好、表达量相对较高，溶解性和/或稳定性差、表达量低的抗体会被自然去除。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1、PBMC分离
1)取2ml样本密度分离液(购自天津灏洋，货号：LTS1077)，加入10ml离心管管底。
2)2ml全血缓慢加到分离液上，750g离心20min，分离出白膜层。
3)吸管插到白膜层，吸取白膜层至50ml离心管中，边吸边移动吸管，保证尽可能吸到白膜层而少吸取分离液。
4)加入PBS至45ml，颠倒离心管数次，混匀。
5)1500g离心7min，吸去上清。重复步骤4)和5)。
6)倒掉PBS，利用微量残液，弹动管底充分分散PBMC。
7)加入2ml TRIzol，轻缓抽吸数次至细胞完全裂解。
实施例2、RNA提取
1)加入0.3mL氯仿，摇匀后室温静置分层。
2)4℃下12000rpm离心10min。
3)转移上层水相于新的1.5ml离心管中，加入0.8倍体积预冷异丙醇混匀，4℃沉淀30min。
4)4℃下12000rpm离心10min。
5)弃上清，加入1.5mL 70％乙醇洗涤沉淀，将洗液吸除干净，室温干燥5min。
6)加入20μL无RNA酶去离子水，吹吸使RNA沉淀充分溶解。
7)将总RNA加到1.5％argarose胶孔中，1×TAE电泳缓冲液中快速电泳分离。
电泳结果如图1所示，三个条带清淅，RNA完整无降解。
实施例3、反转录
1)按以下顺序加入反应物
模板RNA 3μg
oligo(dT)18引物 1μL
无核酸酶的去离子水 补至12μL
2)70℃孵育5min，立即于冰上冷却。
3)按以下顺序加入反应物
4)42℃孵育40min，结束后-70℃保存。
实施例4、抗体基因第一轮扩增(抗体重链可变区基因扩增)及胶回收
1)按以下顺序加入反应物
抗体基因第一轮扩增引物正向引物(SEQ ID No:1～43)：
LibF1(SEQ ID No:1)CAGGTGCAGCTGGTGCAG
LibF2(SEQ ID No:2)CAAATGCAGCTGGTGCAGT
LibF3(SEQ ID No:3)GAGGTCCAGCTGGTACAGTCT
LibF4(SEQ ID No:4)CGGGTCACCTTGAGGGAG
LibF5(SEQ ID No:5)GAGGTGCAGCTGGTGAAGT
LibF6(SEQ ID No:6)GAGGTTCAGCTGGTGCAGT
LibF7(SEQ ID No:7)GAGGTGCAGCTGGTGGAG
LibF8(SEQ ID No:8)CAGGTGCAGCTACAGCAGT
LibF9(SEQ ID No:9)CAGGTACAGCTGGTGCAGTC
LibF10(SEQ ID No:10)CAGGTCCAGCTTGTGCAGT
LibF11(SEQ ID No:11)GAGGTACAACTGGTGGAGTCT
LibF12(SEQ ID No:12)CAGATCACCTTGAAGGAGTC
LibF13(SEQ ID No:13)CAGGTTCAGCTGGTGCAGT
LibF14(SEQ ID No:14)CAGGTACAGCTGCAGGAGTC
LibF15(SEQ ID No:15)CAGGTACAGCTGGTGGAGTCT
LibF16(SEQ ID No:16)CAGGTGCAGCTACAGGAGTC
LibF17(SEQ ID No:17)CAGCTGCAGCTGCAGGAGT
LibF18(SEQ ID No:18)GAGGTGCAGCTGGTGGAG
LibF19(SEQ ID No:19)CAGGTGCAGCTGCAGGAC
LibF20(SEQ ID No:20)CAGGTGCAGCTGTTGGAG
LibF21(SEQ ID No:21)CGGCTGCAGCTGCAGGAGT
LibF22(SEQ ID No:22)GAGGTGCAGCTGGTGCAG
LibF23(SEQ ID No:23)GAGACGCAGCTGGTGGAGT
LibF24(SEQ ID No:24)CAGATGCAGCTGGTGCAG
LibF25(SEQ ID No:25)CAGGTACAGCTGATGCAGTC
LibF26(SEQ ID No:26)CAGGTGCAGCTGGTGCAAT
LibF27(SEQ ID No:27)CAGGTCCAGCTGGTGCAG
LibF28(SEQ ID No:28)GAGGTGCATCTGGTGGAGT
LibF29(SEQ ID No:29)CAGGTGCAGCTACAACAGTG
LibF30(SEQ ID No:30)GAAGTGCAGCTGGTGCAGT
LibF31(SEQ ID No:31)CAGGTGCAGCTGGTGGAG
LibF32(SEQ ID No:32)GAGGTGCAGCTGGTAGAGTC
LibF33(SEQ ID No:33)CAGGTACAGCTGCAGCAGT
LibF34(SEQ ID No:34)GAGGTGCAGCTGTTGGAGTC
LibF35(SEQ ID No:35)CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTG
LibF36(SEQ ID No:36)GAGATGCAGCTGGTGGAGTC
LibF37(SEQ ID No:37)CAGGTCACCTTGAAGGAGTCT
LibF38(SEQ ID No:38)CAGGTCCAGCTGGTGCAA
LibF39(SEQ ID No:39)CAGGTCACCTTGAGGGAGTC
LibF40(SEQ ID No:40)GAAGTGCAGCTGGTGGAG
LibF41(SEQ ID No:41)CAGGTGCAGCTGCAGGAG
LibF42(SEQ ID No:42)CAGGTGCGGCTGCAGGAG
LibF43(SEQ ID No:43)CAGGTGCAGCTGGTGGA
抗体基因第一轮扩增引物反向引物(SEQ ID No:44～47)：
LibR6(SEQ ID No:44)TGGAAGAGGCACGTTCTTTTC
LibR7(SEQ ID No:45)ACTCTCTTGTCCACCTTGGTG
LibR8(SEQ ID No:46)ACTTTCTTGTCCACCTTGGTG
LibR9(SEQ ID No:47)ACTGTCTTGTCCACCTTGGTG、
2)按以下程序运行PCR扩增
94℃，4min→98℃，10s→59℃，40s→72℃，50s→72℃，10min扩增循环25次
3)将扩增产物加到1％argarose胶孔中，1×TAE电泳缓冲液中电泳分离。
4)切取目标抗体重链可变区基因条带，按试剂盒说明回收抗体基因片段(Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit，货号：D2500)。
电泳结果如图2所示，所有样品均有扩增，700bp目标条带清淅，杂带微弱或没有但有引物二聚体。
实施例5、抗体基因第二轮扩增(两个抗体重链可变区基因加拼接用接头)及胶回收
1)按以下顺序加入反应物
抗体基因第二轮扩增第一抗体可变区正向引物(SEQ ID No:48～90)：
LibF50(SEQ ID No:48)CAGGTGCAGCTGGTGCAG
LibF51(SEQ ID No:49)CAAATGCAGCTGGTGCAGT
LibF52(SEQ ID No:50)GAGGTCCAGCTGGTACAGTCT
LibF53(SEQ ID No:51)CGGGTCACCTTGAGGGAG
LibF54(SEQ ID No:52)GAGGTGCAGCTGGTGAAGT
LibF55(SEQ ID No:53)GAGGTTCAGCTGGTGCAGT
LibF56(SEQ ID No:54)GAGGTGCAGCTGGTGGAG
LibF57(SEQ ID No:55)CAGGTGCAGCTACAGCAGT
LibF58(SEQ ID No:56)CAGGTACAGCTGGTGCAGTC
LibF59(SEQ ID No:57)CAGGTCCAGCTTGTGCAGT
LibF60(SEQ ID No:58)GAGGTACAACTGGTGGAGTCT
LibF61(SEQ ID No:59)CAGATCACCTTGAAGGAGTC
LibF62(SEQ ID No:60)CAGGTTCAGCTGGTGCAGT
LibF63(SEQ ID No:61)CAGGTACAGCTGCAGGAGTC
LibF64(SEQ ID No:62)CAGGTACAGCTGGTGGAGTCT
LibF65(SEQ ID No:63)CAGGTGCAGCTACAGGAGTC
LibF66(SEQ ID No:64)CAGCTGCAGCTGCAGGAGT
LibF67(SEQ ID No:65)GAGGTGCAGCTGGTGGAG
LibF68(SEQ ID No:66)CAGGTGCAGCTGCAGGAC
LibF69(SEQ ID No:67)CAGGTGCAGCTGTTGGAG
LibF70(SEQ ID No:68)CGGCTGCAGCTGCAGGAGT
LibF71(SEQ ID No:69)GAGGTGCAGCTGGTGCAG
LibF72(SEQ ID No:70)GAGACGCAGCTGGTGGAGT
LibF73(SEQ ID No:71)CAGATGCAGCTGGTGCAG
LibF74(SEQ ID No:72)CAGGTACAGCTGATGCAGTC
LibF75(SEQ ID No:73)CAGGTGCAGCTGGTGCAAT
LibF76(SEQ ID No:74)CAGGTCCAGCTGGTGCAG
LibF77(SEQ ID No:75)GAGGTGCATCTGGTGGAGT
LibF78(SEQ ID No:76)CAGGTGCAGCTACAACAGTG
LibF79(SEQ ID No:77)GAAGTGCAGCTGGTGCAGT
LibF80(SEQ ID No:78)CAGGTGCAGCTGGTGGAG
LibF81(SEQ ID No:79)GAGGTGCAGCTGGTAGAGTC
LibF82(SEQ ID No:80)CAGGTACAGCTGCAGCAGT
LibF83(SEQ ID No:81)GAGGTGCAGCTGTTGGAGTC
LibF84(SEQ ID No:82)CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTG
LibF85(SEQ ID No:83)GAGATGCAGCTGGTGGAGTC
LibF86(SEQ ID No:84)CAGGTCACCTTGAAGGAGTCT
LibF87(SEQ ID No:85)CAGGTCCAGCTGGTGCAA
LibF88(SEQ ID No:86)CAGGTCACCTTGAGGGAGTC
LibF89(SEQ ID No:87)GAAGTGCAGCTGGTGGAG
LibF90(SEQ ID No:88)CAGGTGCAGCTGCAGGAG
LibF91(SEQ ID No:89)CAGGTGCGGCTGCAGGAG
LibF92(SEQ ID No:90)CAGGTGCAGCTGGTGGA
抗体基因第二轮扩增第一抗体可变区反向引物(SEQ ID No:91～94)：
LibR11(SEQ ID No:91)
agagccacctccgcctgaaccgccaccaccTGAGGAGACGGTGACCAG
LibR12(SEQ ID No:92)
agagccacctccgcctgaaccgccaccaccTGAGGAGACAGTGACCAGGG
LibR13(SEQ ID No:93)
agagccacctccgcctgaaccgccaccaccTGAAGAGACGGTGACCATTGT
LibR14(SEQ ID No:94)
agagccacctccgcctgaaccgccaccaccTGAGGAGACGGTGACCGT
注：小写为linker编码区
抗体基因第二轮扩增第二抗体可变区正向引物(SEQ ID No:95～137)：
LibF101(SEQ ID No:95)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTGCAGCTGGTGCAG
LibF102(SEQ ID No:96)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAAATGCAGCTGGTGCAGT
LibF103(SEQ ID No:97)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAGGTCCAGCTGGTACAGTCT
LibF104(SEQ ID No:98)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCGGGTCACCTTGAGGGAG
LibF105(SEQ ID No:99)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAGGTGCAGCTGGTGAAGT
LibF106(SEQ ID No:100)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAGGTTCAGCTGGTGCAGT
LibF107(SEQ ID No:101)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAGGTGCAGCTGGTGGAG
LibF108(SEQ ID No:102)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTGCAGCTACAGCAGT
LibF109(SEQ ID No:103)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTACAGCTGGTGCAGTC
LibF110(SEQ ID No:104)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTCCAGCTTGTGCAGT
LibF111(SEQ ID No:105)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAGGTACAACTGGTGGAGTCT
LibF112(SEQ ID No:106)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGATCACCTTGAAGGAGTC
LibF113(SEQ ID No:107)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTTCAGCTGGTGCAGT
LibF114(SEQ ID No:108)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTACAGCTGCAGGAGTC
LibF115(SEQ ID No:109)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTACAGCTGGTGGAGTCT
LibF116(SEQ ID No:110)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTGCAGCTACAGGAGTC
LibF117(SEQ ID No:111)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGCTGCAGCTGCAGGAGT
LibF118(SEQ ID No:112)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAGGTGCAGCTGGTGGAG
LibF119(SEQ ID No:113)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTGCAGCTGCAGGAC
LibF120(SEQ ID No:114)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTGCAGCTGTTGGAG
LibF121(SEQ ID No:115)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCGGCTGCAGCTGCAGGAGT
LibF122(SEQ ID No:116)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAGGTGCAGCTGGTGCAG
LibF123(SEQ ID No:117)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAGACGCAGCTGGTGGAGT
LibF124(SEQ ID No:118)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGATGCAGCTGGTGCAG
LibF125(SEQ ID No:119)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTACAGCTGATGCAGTC
LibF126(SEQ ID No:120)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTGCAGCTGGTGCAAT
LibF127(SEQ ID No:121)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTCCAGCTGGTGCAG
LibF128(SEQ ID No:122)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAGGTGCATCTGGTGGAGT
LibF129(SEQ ID No:123)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTGCAGCTACAACAGTG
LibF130(SEQ ID No:124)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAAGTGCAGCTGGTGCAGT
LibF131(SEQ ID No:125)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTGCAGCTGGTGGAG
LibF132(SEQ ID No:126)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAGGTGCAGCTGGTAGAGTC
LibF133(SEQ ID No:127)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTACAGCTGCAGCAGT
LibF134(SEQ ID No:128)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAGGTGCAGCTGTTGGAGTC
LibF135(SEQ ID No:129)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTCCAGCTGGTACAGTCTG
LibF136(SEQ ID No:130)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAGATGCAGCTGGTGGAGTC
LibF137(SEQ ID No:131)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTCACCTTGAAGGAGTCT
LibF138(SEQ ID No:132)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTCCAGCTGGTGCAA
LibF139(SEQ ID No:133)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTCACCTTGAGGGAGTC
LibF140(SEQ ID No:134)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgGAAGTGCAGCTGGTGGAG
LibF141(SEQ ID No:135)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTGCAGCTGCAGGAG
LibF142(SEQ ID No:136)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTGCGGCTGCAGGAG
LibF143(SEQ ID No:137)
tcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgCAGGTGCAGCTGGTGGA
注：小写为linker编码区
抗体基因第二轮扩增第二抗体可变区反向引物(SEQ ID No:138～141)：
LibR16(SEQ ID No:138)TGAGGAGACGGTGACCAG
LibR17(SEQ ID No:139)TGAGGAGACAGTGACCAGGG
LibR18(SEQ ID No:140)TGAAGAGACGGTGACCATTGT
LibR19(SEQ ID No:141)TGAGGAGACGGTGACCGT
2)按以下程序运行PCR扩增
94℃，4min→98℃，10s→59℃，40s→72℃，50s→72℃，10min扩增循环15次
3)将扩增产物加到1％argarose胶孔中，1×TAE电泳缓冲液中电泳分离。
4)切取目标抗体重链可变区基因条带，按试剂盒说明回收抗体基因片段(Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit，货号：D2500)。
电泳结果如图3所示，所有样品均扩增出目的条带，扩增强度不同，目标条带清淅，杂带微弱或没有。
实施例6、抗体基因第三轮扩增(两个抗体重链可变区基因通过linker拼接)及胶回收
1)按以下顺序加入反应物
抗体基因第三轮扩增引物正向引物(SEQ ID No:142～184)：
LibF151(SEQ ID No:142)X9-ATGCCCAGGTTCAGCTGGTGCAGT
LibF152(SEQ ID No:143)X9-ATGCCGAAGTGCAGCTGGTGCAGT
LibF153(SEQ ID No:144)X9-ATGCCGAGATGCAGCTGGTGGAG
LibF154(SEQ ID No:145)X9-ATGCCCAGGTCCAGCTGGTGCAG
LibF155(SEQ ID No:146)X9-ATGCCGAGGTGCAGCTGGTGGA
LibF156(SEQ ID No:147)X9-ATGCCCAGGTCCAGCTGGTACAGTC
LibF157(SEQ ID No:148)X9-ATGCCCAGGTACAGCTGGTGCAGTC
LibF158(SEQ ID No:149)X9-ATGCCCAGATCACCTTGAAGGAGTCTG
LibF159(SEQ ID No:150)X9-ATGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGT
LibF160(SEQ ID No:151)X9-ATGCCGAGGTTCAGCTGGTGCAGTC
LibF161(SEQ ID No:152)X9-ATGCCCAAATGCAGCTGGTGCAGT
LibF162(SEQ ID No:153)X9-ATGCCCAGATGCAGCTGGTGCAG
LibF163(SEQ ID No:154)X9-ATGCCCAGGTCCAGCTGGTGCAAT
LibF164(SEQ ID No:155)X9-ATGCCCAGGTCCAGCTTGTGCAGT
LibF165(SEQ ID No:156)X9-ATGCCCAGGTACAGCTGATGCAGTCT
LibF166(SEQ ID No:157)X9-ATGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTC
LibF167(SEQ ID No:158)X9-ATGCCGAGGTCCAGCTGGTACAGTCTG
LibF168(SEQ ID No:159)X9-ATGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAAT
LibF169(SEQ ID No:160)X9-ATGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAG
LibF170(SEQ ID No:161)X9-ATGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAC
LibF171(SEQ ID No:162)X9-ATGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGT
LibF172(SEQ ID No:163)X9-ATGCCGAAGTGCAGCTGGTGGAGTC
LibF173(SEQ ID No:164)X9-ATGCCGAGACGCAGCTGGTGGAGT
LibF174(SEQ ID No:165)X9-ATGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGA
LibF175(SEQ ID No:166)X9-ATGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGT
LibF176(SEQ ID No:167)X9-ATGCCCAGGTACAGCTGGTGGAGTC
LibF177(SEQ ID No:168)X9-ATGCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGT
LibF178(SEQ ID No:169)X9-ATGCCCAGGTGCGGCTGCAGGAG
LibF179(SEQ ID No:170)X9-CATGCCCAGGTGCAGCTGGTGGA
LibF180(SEQ ID No:171)X9-ATGCCGAGGTACAACTGGTGGAGTCT
LibF181(SEQ ID No:172)X9-ATGCCCAGGTGCAGCTACAACAGTG
LibF182(SEQ ID No:173)X9-ATGCCCAGGTCACCTTGAAGGAGTCTG
LibF183(SEQ ID No:174)X9-ATGCCGAGGTGCAGCTGGTAGAGTCT
LibF184(SEQ ID No:175)X9-ATGCCCGGGTCACCTTGAGGGAGT
LibF185(SEQ ID No:176)X9-ATGCCGAGGTGCATCTGGTGGAGT
LibF186(SEQ ID No:177)X9-ATGCCCAGGTACAGCTGCAGGAG
LibF187(SEQ ID No:178)X9-ATGCCCGGCTGCAGCTGCAGGAGT
LibF188(SEQ ID No:179)X9-ATGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTC
LibF189(SEQ ID No:180)X9-ATGCCCAGGTGCAGCTACAGGAGT
LibF190(SEQ ID No:181)X9-ATGCCCAGGTCACCTTGAGGGAGTC
LibF191(SEQ ID No:182)X9-ATGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAG
LibF192(SEQ ID No:183)X9-CATGCCGAGGTGCAGCTGGTGAAG
LibF193(SEQ ID No:184)X9-ATGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG
注：X9-表示9个核苷酸的限制性内切酶I及其保护碱基。限制性内切酶I可以是AgeI、ApaI、AscI、BamHI、BglII、BsiI、ClaI、CspI、EcoRI、FseI、HindIII、KpnI、MfeI、MluI、NcoI、NheI、NotI、PacI、PmeI、PauI、SacI、SauI、SphI、VspI、XbaI、XhoI中的一个。
抗体基因第三轮扩增反向引物(SEQ ID No:185～188)：
LibR21(SEQ ID No:185)Y9-TGAGGAGACGGTGACCAG
LibR22(SEQ ID No:186)Y9-TGAGGAGACAGTGACCAGGG
LibR23(SEQ ID No:187)Y9-TGAAGAGACGGTGACCATTGT
LibR23(SEQ ID No:188)Y9-TGAGGAGACGGTGACCGT
注：Y9-表示9个核苷酸的限制性内切酶II及其保护碱基。限制性内切酶II可以是AgeI、ApaI、AscI、BamHI、BglII、BsiI、ClaI、CspI、EcoRI、FseI、HindIII、KpnI、MfeI、MluI、NcoI、NheI、NotI、PacI、PmeI、PauI、SacI、SauI、SphI、VspI、XbaI、XhoI中的一个。
2)按以下程序运行PCR扩增
94℃，4min→98℃，10s→59℃，40s→72℃，60s→72℃，10min扩增循环15次
3)将扩增产物加到1％argarose胶孔中，1×TAE电泳缓冲液中电泳分离。
4)切取目标抗体重链可变区基因条带，按试剂盒说明回收抗体基因片段(Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit，货号：D2500)。
电泳结果如图4所示，所有样品均扩增出750bp左右的目的条带，扩增强度不同，但有较多杂带，这些杂带在切胶纯化回收过程中会除掉，不影响文库构建。
实施例7、抗体重链可变区基因及载体酶切及回收
1)酶切
按以下体系配制限制内切酶I的酶切体系
在以上体系中补加以下成分
2)酶切产物纯化
对于酶切后的抗体基因，采用离心吸附柱进行PCR产物直接纯化(Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit，货号：D2500)；对于酶切后的抗体基因，采用离心吸附柱进行胶回收纯化(Omega公司E.Z.N.A./>Gel Extraction Kit，货号：D2500)。按试剂盒说明书进行操作。
电泳结果如图5所示，载体已被切开，大小与预期的5000bp相符，酶切成功。
实施例8、连接反应及纯化
1)连接反应
混匀后16℃孵育过夜
2)纯化
采用离心吸附柱进行PCR产物直接纯化(Omega公司E.Z.N.A.Gel ExtractionKit，货号：D2500)，按试剂盒说明书进行操作。
实施例9、感受态制备、转化及涂板
1)制备Mini Agar固体培养基
称取1.1g Agar，加入70ml超纯水，121℃湿热灭菌20min，取出摇匀。待温度降至50-60℃时，加入磷酸氢二钠至60mM、磷酸二氢钾至17mM、氯化钠至8mM、氯化铵至18mM、氯化钙至0.1mM、硫酸镁至2mM、维生素B1至1mM、葡萄糖至2％(W/V)，终体积为100ml。摇匀，倒入无菌培养皿中凝固。
2)蘸取TG1种子菌，在Mini Agar固体培养基上划线，37℃培养2天至单克隆出现。
3)从Mini Agar平板上挑取TG1单克隆，接种至10ml LDM液体培养基中，37℃下220rpm振荡培养过夜。次日取6ml菌液接种至600ml液体培养基中，37℃下220rpm振荡培养至OD600＝0.7。
4)将菌液转入1000ml无菌离心管中，4℃下4000rpm离心10min，弃上清液。用600ml冰上预冷的湿热灭菌超纯水于冰上充分振荡重悬菌体沉淀，如此重复洗涤两次。用6ml冰上预冷的湿热灭菌的10％甘油(超纯水配制)，于冰上充分振荡重悬菌体沉淀，于冰上按200μL/支分装至1.5ml无菌EP管中。
5)取5μL纯化后的连接产物(即噬菌粒)，于冰上加入到感受态TG1中，转入冰上预冷的2mm电击杯中，冰浴10min。设置电击仪(哈佛仪器公司，Harvard Apparatus)电压为2.5kV对感受态细胞进行转化。电击后立即转入SOC培养基中，37℃下，180rpm振荡培养1h。对菌液进行梯度稀释，涂2YT培养基平板。倒置平板，于37℃下过夜培养，获得单克隆。
6)挑取单克隆，接种到200μL的2YT液体培养基中，于37℃下200rpm振荡培养过夜。
7)取菌液，用LD4F和LD3-R进行PCR扩增鉴定。
LD4F：GTTAGCTCACTCATTAGGCACC(SEQ ID No:189)
LD3-R：GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG(SEQ ID No:190)
8)取阳性克隆，进行噬菌粒测序并分析序列多样性。
电泳结果如图6所示，有4个克隆有非抗体基因，无非特异扩增外，其余均为正确的阳性克隆，阳性率为92/96＝95.8％。
阳性克隆中抗体序列同源性分析的结果如图7所示，从鉴定为阳性的克隆中随机取30个克隆进行测序，除1个克隆测序列失败外，其余29个克隆均获得序列。以圆形系统发育进化树展示抗体序列的同源性大小，其中粗体数字代表不同的抗体序列，分支的结点上的数字代表自展值。同源性越大，抗体序列越相似，进化树上的末端分支越短。若两个序列的末端分枝消失仅剩结点竖线，表明这两个抗体序列完全一致；反之分枝末端长度差异越大，表明分枝上的抗体因进化而出现的时间相差更远，在序列上表现为序列差异越大。可以看出，这些序列均处于同源性大小不同的多个分支上，无末端分枝消失仅剩结点竖线的序列，所有分析的序列互不相同，故多样性为29/29＝100％，展示库中抗体序列多样性好。
下表展示所构建的抗体文库的质量指标
阳性率 多样性 正确率 库容
95.8％ 100％ 100％ 1×109pfu
实施例10、抗体文库淘选
1)宿主菌TG1活化：制备mini agar培养基平板，划线法过夜培养TG1于37℃培养箱。
2)磁珠洗涤及封闭：吸取50μL磁珠(购自Invitrogen)，置于磁力架上，吸附后吸去液体，1ml PBS重悬、洗涤两次，用1ml 1.5％脱脂奶粉+1.5％BSA的封闭剂(第二轮、第三轮淘选时封闭剂浓度逐渐增加)封闭1小时，去除液体。
3)抗原结合：用1ml PBS(pH7.2-7.4)将蛋白A和蛋白B稀释至工作浓度16μg/ml(均购自Acro Biosystem，以后各轮淘选时抗原浓度逐渐降低)，用该既含有蛋白A又含有蛋白B的PBS溶液重悬磁珠，旋转孵育1小时。
4)库封闭：与抗原结合至磁珠同步，取1011pfu噬菌体病毒颗粒(来自于原始抗体文库或淘选扩增产物)，用1ml 1.0％脱脂奶粉+1.0％BSA的封闭剂旋转孵育1小时。
5)噬菌体结合：将磁珠置于磁力架上，去除液体。将封闭后的库加入磁珠，重悬并旋转孵育1小时，去除液体。
6)洗涤：用1ml PBST[0.01M PBS(pH7.4),0.1％Tween-20(第二、三轮Tween-20浓度分别用0.2％、0.3％)]洗涤，再用0.01M PBS(pH7.4)洗涤。
7)洗脱：吸去液体，用300μL 0.2M甘氨酸-盐酸(pH2.2)洗脱10分钟，加入20μL中和液[1M Tris-Cl(pH9.0)]混匀，暂时保存于4℃。
8)测滴度：取2μL、0.2μL(原液用2×YT培养基稀释10倍后取2μL)、0.02μL(原液用2×YT培养基稀释100倍后取2μL)洗脱液，与0.2ml对数中期(OD600＝0.5)的TG1混匀，室温孵育30分钟，均匀涂于2×YT-GA100[含2％葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素]平板上，37℃过夜培养，计数约50个克隆的平板上的克隆数，根据稀释倍数计算滴度。
9)噬菌体扩增：在淘选进行的同时，挑取mini agar平板上的TG1单克隆，接种于10ml 2×YT培养液中，37℃下，250rpm振荡培养至对数中期(OD600＝0.5)。加入200μL淘选获得的洗脱产物，37℃孵育30分钟。加入辅助噬菌体M13KO7，37℃再孵育30分钟，37℃下，250rpm振荡培养1小时。离心去上清，用20ml含工作浓度100μg/ml氨苄青霉素和工作浓度50μg/ml卡那霉素的2×YT重悬，30℃，220rpm振荡培养过夜。
10)噬菌体沉淀：10000rpm离心15分钟去除菌体，上清中加入1/5体积的2.5MNaCl/20％PEG8000，冰浴2小时。10000rpm离心10分钟得到噬菌体沉淀，将残液去除干净，加入0.2ml 0.01M PBS(pH7.4)液重悬沉淀，如上文测滴度。
11)重复步骤2)-10)两或三次，获得结合力强的噬菌体展示抗体。其中进行第3)步操作时用含工作浓度10μg/ml的蛋白A的1ml PBS溶液，旋转孵育1小时。而在下一次重复2)-10)时，第3)步则改为10μg/ml的蛋白B的1ml PBS溶液，旋转孵育1小时。
实施例11、单克隆ELISA
1)0.3μg/ml链霉亲和素4℃过夜包被酶标板，2％BSA/PBS封闭液处理2h，并用PBS洗涤3次。
2)其中部分酶标板按每孔100μL加入工作浓度1μg/ml蛋白A的PBS溶液，部分酶标板按每孔100μL加入工作浓度1μg/ml蛋白B的PBS溶液，部分酶标板按每孔100μL加入PBS溶液。37℃孵育1h，去除液体，并用PBS洗涤3次。
3)从2×YT-GA100平板上挑取的单克隆菌落，振荡培养至对数中期，加入辅助噬菌体M13KO7，37℃孵育30分钟。37℃，220rpm振荡培养1小时，4000rpm离心15分钟。用400μL含工作浓度100μg/ml氨苄青霉素和工作浓度50μg/ml卡那霉素的2×YT重悬，30℃，220rpm振荡培养过夜。4000rpm离心15分钟，沉淀菌体。
4)取50μL 4％BSA/PBS加入到酶标板中，同时取50μL噬菌体上清，混匀，孵育1小时。
5)去除液体，0.1％PBST洗5次，PBS洗3次，去除液体。
6)将HRP标记抗M13噬菌体抗体(购自北京义翘神州)用2％BSA稀释3000倍，取100μL加入到酶标板中，孵育1小时，去除液体，0.1％PBST洗3次，拍干残液。
7)加入100μL TMB显色液，37℃孵育10min或至蓝色充分显现，加入100μL1M硫酸终止反应，在酶标仪上读取OD450。
单克隆噬菌体ELISA结果如图8所示，最终淘选获得的噬菌体经单克隆化后大量繁殖，去除宿主菌，上清做为噬菌体抗体粗液进行ELISA检测。结果表明，这些单克隆与蛋白A或B的结合能力不同，有些单克隆与蛋白A结合强于蛋白B，有些单克隆与蛋白B结合强于蛋白A，少量单克隆为实验误差与二者结合均弱。
下表为OD450原始读值和实验组/PBS比值
表1 OD450原始读值
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表2实验组OD450/PBS组
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种获得双特异抗体的噬菌体展示库的构建方法，其特征在于，所述的双特异性抗体为双特异性的全人源单域抗体，
所述方法包括以下步骤：
(a)提取人PBMC的总RNA；
(b)以所述总RNA为模板，通过反转录，合成cDNA；
(c)以所述cDNA为模板，用第一引物集进行第一轮PCR扩增，从而获得第一轮扩增产物；其中，第一引物集包括SEQ ID No:1～43所示的正向引物和SEQ ID No:44-47所示的反向引物；
(d)以第一轮扩增产物为模板，用第二引物集进行第二轮PCR扩增，从而获得第二轮扩增产物；其中，第二引物集包括SEQ ID No:48～90所示的第一抗体可变区正向引物，SEQ IDNo:91-94所示的第一抗体可变区反向引物，SEQ ID No:95～137所示的第二抗体可变区正向引物，和SEQ ID No:138～141所示的第二抗体可变区反向引物；
(e)以第二轮扩增产物为模板，用第三引物集进行第三轮PCR扩增，从而获得第三轮扩增产物；其中，第三引物集包括SEQ ID No:142～184所示的正向引物，SEQ ID No:185～188所示的反向引物；
(f)将用于构建文库的载体和所述第三轮扩增产物用限制性内切酶I和限制性内切酶II进行酶切，获得经酶切的线性化的载体片段和线性化的抗体基因片段；
(g)将所述经酶切的线性化的载体片段和线性化的抗体基因片段进行连接反应，从而获得连接产物；
(h)将所述连接产物导入用于噬菌体展示的宿主细胞，从而获得所述的双特异性的全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库。
2.如权利要求1所述的一种获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法，其特征在于，步骤(c)所述的第一轮PCR扩增，其反应体系为：ddH2O 13.6μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，10×buffer 2μL，cDNA 0.8μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，Ex Taq 0.08μL，总体积20μL。
3.如权利要求1所述的一种获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法，其特征在于，步骤(c)所述的第一轮PCR扩增，其反应程序为：94℃4min，98℃10s，59℃40s，72℃50s，72℃10min，扩增循环25次。
4.如权利要求1所述的一种获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法，其特征在于，步骤(d)所述的第二轮PCR扩增，其反应体系为：10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，第一轮扩增回收产物15ng，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，Ex Taq 0.1μL，ddH2O补足至总体积25μL。
5.如权利要求1所述的一种获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法，其特征在于，步骤(d)所述的第二轮PCR扩增，其反应程序为：94℃4min，98℃10s，59℃40s，72℃50s，72℃10min，扩增循环15次。
6.如权利要求1所述的一种获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法，其特征在于，步骤(e)所述的第三轮PCR扩增，其反应体系为：10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，第二轮扩增回收产物15ng，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，Ex Taq 0.1μL，ddH2O补足至总体积25μL。
7.如权利要求1所述的一种获得双特异抗体的噬菌体展示库淘选方法，其特征在于，步骤(e)所述的第三轮PCR扩增，其反应程序为：94℃4min，98℃10s，59℃40s，72℃50s，72℃10min，扩增循环15次。
8.一种双特异抗体的噬菌体展示库，其特征在于，所述双特异抗体的噬菌体展示库是用如权利要求1～7中任一项所述的方法构建的。
9.一种淘选双特异抗体的方法，其特征在于，包括步骤：
(S1)提供权利要求8所述的双特异抗体的噬菌体展示库；
(S2)利用抗原A1和抗原A2，对所述抗体文库进行淘选，从而获得针对抗原A1和抗原A2的双特异抗体。
10.一种引物集，所述引物集为SEQ ID No:1～188所示的引物序列。
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