CN114934096A - 用于实施免疫组库测序的组合物及试剂盒和测序方法 - Google Patents

Abstract

一种用于实施免疫组库测序的组合物，包括如SEQ ID NO:1所示逆转录引物，含有如SEQ ID NO:17所示序列的链置换引物，第一PCR引物对，用于装在Tn5转座酶的核酸：如SEQ ID NO:3所示接头Tn‑A和SEQ ID NO:4所示的嵌合端；以及第二PCR引物对。本发明的核酸组合物适用于以短读长测序平台对全长适应性免疫组库进行测序，只需要构建一个文库即可利用短读长的测序数据组装出完整的BCR和TCR全长序列，有效降低测序的成本，进一步提高测序的通量，提高测序效率。

Description

用于实施免疫组库测序的组合物及试剂盒和测序方法

技术领域

本发明涉及一种用于测序的核酸组合物，特别涉及一种适应性免疫组测序的核酸组合物，以及测序试剂盒，和以短读长测序平台对全长适应性免疫组库进行测序的方法。

背景技术

适应性免疫是机体针对特异性抗原刺激产生的免疫应答。其存在使机体无需每时每刻都保持消耗巨大的免疫应激状态。适应性免疫系统的多样性，也保证生物体能应对自然环境中复杂且多变的风险。在此过程中，T淋巴细胞和B淋巴细胞及其表面分子T细胞受体(TCR)，B细胞受体(BCR，BCR的分泌形式即为抗体。)是机体执行适应性免疫的分子基础。

检测TCR和BCR序列的适应性免疫受体库测序(Adaptive Immune ReceptorRepertoire sequencing,AIRR-seq)是研究免疫系统动力学的常用方法。目前已有众多的适应性免疫受体库测序方法被开发。适应性免疫组测序一般以免疫细胞中的RNA为建库材料。但实际操作中，通常首选获得的往往是外周血的全血。全血中含有大量的红细胞和少量的免疫细胞，进行适应性免疫组测序之前需要先用密度梯度离心法先获得免疫细胞。之后还需要从免疫细胞中提取RNA，才能开始进行建库。整个操作较为复杂，且成本较高。

此外，包含完整信息的BCR和TCR全长序列超过了600bp，而目前主流的高通量测序主要是基于短读长的测序方案。双端测序PE150最多只能测通200bp～250bp的短DNA片段，而对于扩增出来的全长片段，如：孙涛等人通过5’RACE扩增BCR和TCR全长为600-700bp(CN107058484A)，只能检测DNA片段两端的序列，这样无法获得CDR3区域的完整信息。而若采用双端测序PE300技术，不仅成本昂贵，而且通量较低。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于实施免疫组库测序的组合物，降低现有测序方法的复杂性，提高便捷性。

本发明的另一个目的在于提供一种用于实施免疫组库测序的组合物，有效降低测序的成本。

本发明的再一个目的在于提供一种用于实施免疫组库测序的组合物，进一步提高测序的通量，提高测序效率。

本发明的又一个目的在于提供一种试剂盒，用于以短读长测序平台对全长适应性免疫组库进行测序。

本发明的第五个目的在于提供一种适应性免疫组库测序方法，以短读长测序平台对全长适应性免疫组库进行测序，有效降低测序的成本，进一步提高测序的通量，提高测序效率。

高通量测序建库的主要过程是在双链DNA的两端加上可以被测序仪识别的接头序列。Tn5是一种转座酶，转座酶和两种等摩尔的测序接头构成一个完整的转座子。不同于传统的末端修复和连接建库法，使用Tn5转座子，能够在一步反应中，快速的将双链DNA片段化，并将测序接头插入靶基因中，形成带有接头的DNA片段。其产物经扩增后可以用于高通量测序。

一种用于实施免疫组库测序的组合物，包括

逆转录引物，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

链置换引物，含有如SEQ ID NO:17所示核酸序列，以及随机序列标签；

第一PCR引物对，上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物选自于SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:14之一种或几种；

用于装在Tn5转座酶的核酸，如SEQ ID NO:3所示接头Tn-A，以及SEQ ID NO:4所示的嵌合端(Mosaic End,ME)；

第二PCR引物对，含SEQ ID NO:15所示的上游引物，含SEQ ID NO:16下游引物。

本发明的用于实施免疫组库测序的组合物，在链置换引物3’末端含有3～5个RNA的G和锁核苷修饰的G，如：但不限于rGrGLNAG。

本发明的用于实施免疫组库测序的组合物，随机序列标签长度8bp-20bp。

本发明的用于实施免疫组库测序的组合物，链置换引物如下：

acacgacgctcttccgatct-nnnnnnnn-rgrglnag，其5’端还设置Biotin。其中，nnnnnnnn表示随机序列标签。

本发明的用于实施免疫组库测序的组合物，用于第二PCR引物的上游引物为：

aatgatacggcgaccaccgagatctacac-8bp barcode-tcgtcggcagcgtcagatgt。

本发明的用于实施免疫组库测序的组合物，用于第二PCR引物的下游引物为：

caagcagaagacggcatacgagat-8bp barcode-gtctcgtgggctcggagatg。

另一种用于实施免疫组库测序的组合物中，用于装在Tn5转座酶的核酸还包括如SEQ ID NO:5所示的接头Tn-B。

将本发明的核酸组合物按如下方法，实施以短读长测序平台对全长适应性免疫组库进行测序。

一种适应性免疫组库测序方法，包括如下步骤：

先制备逆转录模板；

然后，在逆转录模板中加入逆转录引物和链置换引物，进行逆转录反应，获得逆转录反应产物；

接着，以所得的逆转录反应产物为模板，以第一PCR引物对进行第一次PCR反应，其中上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物选自于SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:14之一种或几种，取得PCR产物；

之后，将用于装在Tn5转座酶的核酸预先退火，等比例混合，再与Tn5转座酶混匀，制备装载测序接头的Tn5转座酶，形成装载接头的Tn5转座酶后，加入纯化的PCR产物，将PCR产物片段化(如：55℃，10分钟～30分钟进行打断)；

最后，以片段化PCR产物为模板，进行第二次PCR反应，获得扩增文库，纯化并分选获得300-700bp的DNA片段，定量后作为模板上机测序，且测序产物可以组装为全长序列。

另一种测序方法的实施方式，先用4％多聚甲醛固定液加入的体积为外周血体积的一倍，25℃孵育15分钟以实施逆转录模板的制备。

另一种测序方法的实施方式，在加入固定液后，再加入裂解液为含0.1％的Triton-100的无RNA酶PBS，其加入体积为外周血的10倍，于72℃，裂解20分钟。

另一种测序方法的实施方式，裂解后，使用非固定角转子的离心机，500g离心5分钟，收集的细胞沉淀经2次无RNA酶PBS清洗后的沉淀物，可以直接用作逆转录模板。

另一种测序方法的实施方式，逆转录条件为：60℃，3分钟；42℃，90分钟；以及80℃，10分钟。

另一种测序方法的实施方式，第一次PCR反应条件为：95℃变性5分钟后，依次于95℃，30秒；于60℃，15秒；以及于72℃，60秒为一个循环，循环25次后，再于72℃，10分钟。

另一种测序方法的实施方式，第二次PCR反应条件为：95℃变性5分钟后，依次于95℃，30秒；于60℃，15秒；以及于72℃，60秒为一个循环，循环25次后，再于72℃，10分钟。

本发明提供的各种测序方法还可以适用于其他测序平台，分别为454测序平台、Itron测序平台、华大的CG测序平台，只需要将所需的测序平台特定序列替换为不同的常规测序平台所使用的与之对应的常规序列即可。

将本发明的核酸组合物与操作说明书制成试剂盒，以短读长测序平台对全长适应性免疫组库进行测序，有效降低测序的成本，进一步提高测序的通量，提高测序效率。说明书上记载具体的实施方法，包括：

逆转录模板制备：收集待测试的外周血，加入终浓度1-10倍体积的固定液(4％多聚甲醛)，10～40℃孵育5～60分钟；接着加入1～20倍体积的裂解液(0.1％的Triton-100的无RNA酶PBS)，25～42℃孵育5-40分钟；然后300～2000g离心3～10分钟，收集细胞沉淀，清洗2-3次，得到细胞沉淀用作逆转录模板。

逆转录反应：在逆转录模板中加入逆转录引物和链置换引物，进行逆转录反应，逆转录条件为：50～60℃，3～10分钟，然后37～42℃，30～120分钟，再70～80℃，10～20分钟。

第一次PCR条件为：94～98℃变性5～10min，然后依次于94～98℃，20～60秒；于55～60℃，5～15秒；于68-72℃，30～120秒为一次循环，循环25-35次后，再于68-72℃，5-10分钟，得到PCR产物。

第二次PCR反应条件为：94～98℃变性5-10分钟后，依次于94～98℃，20-60秒；于55～60℃，5-15秒；以及于68～72℃，30～120秒为一个循环，循环25-35次后，再于68～72℃，5～10分钟。

产物纯化：可通过磁珠纯化的手段对PCR产物实施纯化。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明的核酸组合物适用于5’RACE扩增BCR和TCR全长，600～700bp，降低了文库扩增的难度，并减少了扩增偏好对最终文库多样性的影响。

本发明的核酸组合物在逆转录产物的5’端引入了UMI序列，降低最终序列的组装难度，提高组装的精确度。

本发明的核酸组合物使得在使用Tn5转座酶时，其携带的两个接头序列是相同的。加入这种Tn5转座酶片段化获得的DNA内部序列，其两端带有互补序列，因此在扩增时易于形成茎环结构，而不容易被非特异性扩增。此外，只需要构建一个文库即可利用短读长的测序数据组装出完整的BCR和TCR全长序列。

本发明提供的方法以准备逆转录模板，可保留细胞结构的完整性。在逆转录反应时，残留的细胞膜形成了一个个反应小室。而每个反应小室中物质浓度更加均匀，这有效的增加了逆转录反应的效率。

本发明提供的方法无需复杂的RNA提取流程，也无需使用特殊的细胞裂解液。使用简单的方法直接获取逆转录模板，极大的降低了样品保存难度和建库成本，同时也方便后续进行自动化操作。

附图说明

图1为本发明测序方法的原理图示，其中图1a为以逆转录反应产物为模板，实施第一次PCR反应得到产物的示意图，图1b为以Tn5转座酶片段化PCR产物进行第二次PCR反应获得扩增文库的示意图；

图2为第一次PCR产物的电泳结果；

图3为第二次PCR产物的电泳结果。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本实施例的测序方法可以参见图1a和图1b，其中图1a为以逆转录反应产物为模板，实施第一次PCR反应得到产物的示意图，图1b为以Tn5转座酶片段化PCR产物进行第二次PCR反应获得扩增文库的示意图。

本实施例以人外周血IgG重链免疫组建库作为示例说明本发明的技术方案。实施例中，所称的“室温”是指常规的室内温度，一般为15～30℃。

先按如下方法制备逆转录模板：

1.将EDTA抗凝全血样本放置在室温，使温度达到平衡；

2.取1ml抗凝血，放入15ml离心管，加入4％的多聚甲醛0.65ml，混匀后，室温10min；

3.加入10ml含0.1％Triton X-100的PBST，37℃10min；

4.800g，离心3min，弃上清；

5.加入1ml PBS，混合，转入1.5ml无酶离心管；

6.800g，离心4min，丢弃上清；

7.重复清洗一次；

8.丢弃上清，沉淀作为逆转录模板。

再按如下步骤实施逆转录，制取逆转录反应产物：

9.加入1μl 10μM逆转录引物：ttttttttttttttttttttttttttttttvn；

10.加入逆转录酶1μl(购自苏州近岸蛋白)；

11.加入1μl RNA酶抑制剂(购自苏州近岸蛋白)；

12.加入2μl 10mM dNTP；

13.加入4μl 5×逆转录buffer；

14.加入1μl 10μM链置换引物如下：biotin-acacgacgctcttccgatct-nnnnnnnn-rgrglnag；

15.用去离子水补足20μl，混匀；

16.于60℃，3分钟；42℃，90分钟；以及80℃，10分钟；

接着，按如下步骤实施第一次PCR反应

22.加入10μl 5×KAPA HiFi Buffer

23.加入2μl 10mM dNTP Mix

24.加入10μl逆转录产物

25.加入1μl 10μM重链恒定区扩增引物

26.加入1μl 10μM链置换引物扩增引物

27.加入1μl KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase

28.用去离子水补足50μl，混匀

29.依次于95℃，5min；于95℃，30秒；于60℃，15秒；以及于72℃，60秒为一个循环，循环28次后，再于72℃10min，与DL2000 DNA Marker同步电泳检测，结果参见图2。由上至下DL2000 DNA Marker示出的DNA条带分别为：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp。

然后，按如下步骤对PCR产物进行Tn5打断：

30.先将Tn5A(gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag)和ME(ctgtctcttatacacatct)引物使用TE缓冲液稀释到100μM，各取5μl，混匀后，加热到95℃加热，置于室温缓慢降温；

31.取2μl第30步的产物，10μlTn5转座酶，8μl 100％甘油混合，室温反应1小时，产物冻存于-20℃备用；

32.在PCR产物中加入50μl纯化磁珠(yeasen)，混匀，室温放置5min后，放置在磁力架上，至液体澄清，弃掉上清；加入1ml 70％乙醇，放置在磁力架上，至液体澄清，弃上清；再次加入1ml 70％乙醇，放置在磁力架上，至液体澄清，弃上清；加入20μl ddH₂O，混匀，室温放置2min后，放置在磁力架上，取上清，即得到纯化的PCR产物；

33.取5μl PCR产物，加入4μl 5×Tn5反应buffer；

33.加入第31步产物，即预装载的Tn5转座酶1μl；

34.用去离子水补足20μl，混匀；

35.55度10min，完成PCR产物的片段化流程。

之后，按如下步骤实施第二次PCR反应

36.在打断体系中，加入25μl 2×PCR mix(近岸蛋白)

37.加入2.5μl，10μM扩增引物1(aatgatacggcgaccaccgagatctacac-8bp barcode-tcgtcggcagcgtcagatgt)和2.5μl，10μM扩增引物2(caagcagaagacggcatacgagat-8bpbarcode-gtctcgtgggctcggagatg)；

38.混匀后按以下条件进行PCR反应，95℃，5min；95℃，30秒；60℃，15秒；72℃，60秒为一个循环，循环28次后；再于72℃10min，与DL2000 DNA Marker同步电泳检测，参见图3。

最后，上机检测和数据分析

39.在PCR产物中加入50μl纯化磁珠(yeasen)，混匀，室温放置5min后，放置在磁力架上，至液体澄清，弃掉上清；加入1ml 70％乙醇，放置在磁力架上，至液体澄清，弃上清；再次加入1ml 70％乙醇，放置在磁力架上，至液体澄清，弃上清；加入20μl ddH₂O，混匀，室温放置2min后，放置在磁力架上，取上清，即得到纯化的PCR产物。进行Illumina上机测序。

40.使用以上方法，得到以下结果：去掉重复序列和质量较低序列后，共有4718048对高质量序列(即去掉重复测到的序列和质量未达到Q20序列后所得到的具有唯一特征的序列)。

41.将得到的高质量序列使用软件mixCR进行比对，3708724对reads可以比对到人类IgG重链。占比78.61％。

42.组装后，结果显示大于40个reads的克隆，可以组装成完整的1个全长IgG重链。可见，本实施例测序所得序列不仅可以高效比对到参考基因组，而且可以将PE150的reads组装为600-700bp全长IgG序列。目前直接检测600-700bp的片段必须使用三代测序，而三代测序的成本是二代测序的100倍以上。

与现有AIRR测序方法比对率大约30-40％相比，本实施例的方案的比对率提高至超过70％，提高了测序效率。测序的整个流程无需分离白细胞和提取RNA，降低了建库成本。整个建库流程约10小时即可完成(另有手工操作时间约2小时)，而常规建库流程需要约2天，建库效率提高了约4倍。

Claims (10)

1.一种用于实施免疫组库测序的组合物，其特征在于包括：

逆转录引物，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

链置换引物，含有如SEQ ID NO:17所示核酸序列，以及随机序列标签；

第一PCR引物对，上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物选自于SEQ ID NO:6～SEQ IDNO:14之一种或几种；

用于装在Tn5转座酶的核酸，如SEQ ID NO:3所示接头Tn-A，以及SEQ ID NO:4所示的嵌合端；

第二PCR引物对，含SEQ ID NO:15所示的上游引物，含SEQ ID NO:16下游引物。

2.根据权利要求1所述的用于实施免疫组库测序的组合物，其特征在于所述的链置换引物3’末端含有3～5个修饰的G。

3.根据权利要求1所述的用于实施免疫组库测序的组合物，其特征在于所述的acacgacgctcttccgatct-nnnnnnnn-rgrglnag，其中，nnnnnnnn表示随机序列标签。

4.根据权利要求1所述的用于实施免疫组库测序的组合物，其特征在于第二PCR引物的上游引物为：aatgatacggcgaccaccgagatctacac-8bp barcode-tcgtcggcagcgtcagatgt。

5.根据权利要求1所述的用于实施免疫组库测序的组合物，其特征在于第二PCR引物的下游引物为：caagcagaagacggcatacgagat-8bp barcode-gtctcgtgggctcggagatg。

6.根据权利要求1所述的用于实施免疫组库测序的组合物，其特征在于还包括如SEQID NO:5所示的接头Tn-B。

7.根据权利要求1～6之一所述的用于实施免疫组库测序的组合物用于以短读长测序平台对全长适应性免疫组库进行测序。

8.一种用于实施免疫组库测序的试剂盒，其特征在于包括权利要求1～6之一所述的组合物。

9.根据权利要求8所述的用于实施免疫组库测序的试剂盒，其特征在于还包括说明书，其上记载的实施测序的方法包括：

逆转录模板制备：收集待测试的外周血，加入终浓度1-10倍体积的固定液，10～40℃孵育5～60分钟；接着加入1～20倍体积的裂解液，25～42℃孵育5-40分钟；然后300～2000g离心3～10分钟，收集细胞沉淀，清洗2-3次，得到细胞沉淀用作逆转录模板；

逆转录反应：在逆转录模板中加入逆转录引物和链置换引物，进行逆转录反应，逆转录条件为：50～60℃，3～10分钟，然后37～42℃，30～120分钟，再70～80℃，10～20分钟；

第一次PCR条件为：94～98℃变性5～10min，然后依次于94～98℃，20～60秒；于55～60℃，5～15秒；于68-72℃，30～120秒为一次循环，循环25-35次后，再于68-72℃，5-10分钟，得到PCR产物；

第二次PCR反应条件为：94～98℃变性5-10分钟后，依次于94～98℃，20-60秒；于55～60℃，5-15秒；以及于68～72℃，30～120秒为一个循环，循环25-35次后，再于68～72℃，5～10分钟；

产物纯化：可通过磁珠纯化的手段对PCR产物实施纯化。

10.一种以权利要求1～6之一所述的组合物实施适应性免疫组库测序方法，其特征在于包括如下步骤：

先采用4％多聚甲醛固定液加入的体积为外周血体积的一倍，25℃孵育15分钟，再加入裂解液为含0.1％的Triton-100的无RNA酶PBS，其加入体积为外周血的10倍，于72℃，裂解20分钟以制备逆转录模板；

然后，在逆转录模板中加入逆转录引物和链置换引物，进行逆转录反应，获得逆转录反应产物；

接着，以所得的逆转录反应产物为模板，以第一PCR引物对进行第一次PCR反应，其中上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物选自于SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:14之一种或几种，取得PCR产物；

之后，将用于装在Tn5转座酶的核酸预先退火，等比例混合，再与Tn5转座酶混匀，制备装载测序接头的Tn5转座酶，形成装载接头的Tn5转座酶后，加入纯化的PCR产物，将PCR产物片段化；

最后，以片段化PCR产物为模板，进行第二次PCR反应，获得扩增文库，纯化并分选获得300-700bp的DNA片段，定量后作为模板上机测序，经测序产物可以组装为全长序列。

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