CN108473985A - 用于减少接头-二聚体形成的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本教导涉及用于减少接头‑二聚体形成的方法,特别是当制备用于随后扩增和/或测序的目的核酸时。还描述了用于实施某些公开的方法的试剂盒。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年11月17日提交的,题为“用于减少接头-二聚体形成的方法和试剂盒”的美国临时申请序列号62/256,662的权益,该临时申请以引用的形式全文纳入本文中。
关于联邦资助研究的声明
本研究部分在NSF II期资助号1431020的政府支持下进行。政府可对要求保护的发明享有一定权利。
技术领域
本教导通常涉及核酸测序领域,特别涉及减少接头二聚体形成。更特别地,本教导涉及改进包含小RNA分子的测序文库的产生。
背景技术
使用下一代测序技术的小RNA测序(sRNA-seq)对于诸如癌症、干细胞生物学和表观遗传基因调控的领域中的小RNA序型分析和发现而言是非常宝贵的。sRNA-seq文库制备在历史上具有三个主要的缺陷:严重偏差,需要基于凝胶的纯化,以及缺少低输入方案。减少接头-二聚体产物的形成是成功产生这些文库的关键方面。
需要通过凝胶(通常通过PAGE凝胶)来纯化最终的小RNA测序文库,这是由于文库制备的PCR步骤之后接头-二聚体分子与包含插入片段的分子在尺寸上的小差异。在典型的DNA或RNA文库制备中,包含插入片段的分子比接头-二聚体分子至少长100bp,因此可使用固相可逆性固定化(SPRI)磁珠将包含插入片段的分子除去。然而,由于在小RNA文库中包含插入片段的分子仅比接头-二聚体分子长约20bp,SPRI尺寸选择不可行,必须进行基于凝胶的选择。对基于凝胶的尺寸选择的需求严重限制了小RNA文库制备的通量和自动化潜力,因为只有有限数目的文库可在单一凝胶上进行电泳,并且这是不适于自动化的劳动密集型过程。
缺少sRNA-seq的低输入方案也与接头-二聚体形成有关。小RNA测序在某种程度上的独特之处在于,额外的PCR循环导致可忽略的偏差;因此理论上它应该可以通过使用多个PCR循环来产生低输入小RNA文库。然而,文库中存在的接头-二聚体也会被大量扩增,这最终产生其中接头-二聚体产物极其丰富的文库,使得难以分离包含插入片段的产物,并且获得其中仅有非常少的读段是有用的测序数据。已开发了许多方法来减少小RNA文库制备中接头-二聚体的形成,但遗憾的是,这些方法都无法有效地将接头-二聚体形成减少到这样的程度,即使得无凝胶或低输入小RNA文库的制备成为可能。
目前有多种方法用于减少接头-二聚体产物。在这些方法之一中,在第一连接步骤之后互补寡核苷酸退火至3’接头,这将过量的3’接头从单链DNA转化为双链DNA。双链DNA对于随后反应中使用的T4RNA连接酶1酶而言是较差的底物,使得接头-二聚体产物的形成减少。
sRNA文库构建的传统方法已证明具有严重的偏差,导致最终的测序结果不能准确地代表起始材料中小RNA的相对丰度。该偏差可通过使用在连接接合处具有随机化碱基的寡核苷酸接头而大大减小。然而,当使用具有随机化末端的接头时,互补寡核苷酸杂交策略无法良好发挥作用以减少接头-二聚体形成。因此,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行的中间连接产物的纯化通常用于sRNA文库制备方案,该方案利用具有随机化末端的接头。通过PAGE进行的产物纯化具有许多缺点,因此开发了无凝胶、接头-二聚体减少策略。该策略需要使用与异丙醇和SPRI珠结合的专用试剂,以在第一连接步骤之后耗尽过量的3’接头,从而减少最终文库中接头-二聚体的形成。然而,应当注意的是,该策略和使用常规(含有非随机化末端的)接头的策略通常都未能有效地减少接头-二聚体形成到这样的水平,即通过PAGE进行的最终纯化可被基于SPRI的方法替代。
因此,在某些分子生物学技术中需要用于减少接头-二聚体产物形成的方法,包括产生核酸测序文库。例如但不限于,用于RNA(包括小RNA)的下一代测序的RNA文库。
发明内容
所公开的教导提供了接头-二聚体减少的双重法(dual approach),从而允许无凝胶或低输入小RNA文库制备。所述接头-二聚体减少的双重法包括首先通过基于磁珠的方法来耗尽未连接的3’接头,然后用酶法使任何残余的3’未连接的接头失活。这种过量的未连接的3’接头的耗尽和失活的结合使接头-二聚体形成显著减少,允许无凝胶或低输入文库制备。
用于减少接头-二聚体形成的某些方法实施方案包括:将核酸样品、至少一种3’接头和至少一种第一连接酶合并以形成第一反应组合物;在适于产生第一连接产物的条件下孵育所述第一反应组合物,以形成第二反应组合物,其包含第一连接产物和至少一些未连接的3’接头;将至少一种包含逆转录引发位点的寡核苷酸与第二反应组合物合并以形成第三反应组合物;在适于至少一些所述寡核苷酸退火至至少一些第一反应产物和至少一些未连接的3’接头的条件下孵育所述第三反应组合物,以形成包含单链5’悬垂部分的3’接头-寡核苷酸双链体;将至少一种DNA聚合酶与所述第三反应组合物合并,并且在适于所述聚合酶将至少一些包含单链5’悬垂部分的3’接头-寡核苷酸双链体转化为双链的接头-寡核苷酸双链体的条件下孵育;添加至少一种第二连接酶和至少一种5’接头到包含双链的接头-寡核苷酸双链体和第一连接产物的所述第三反应组合物中,并且在适于形成至少一些第二连接产物的条件下孵育,从而减少至少一些5’接头-3’接头-二聚体形成。
用于减少接头-二聚体形成的某些方法实施方案包括:将包含靶核酸的样品、至少一种退火至包含逆转录引发位点的寡核苷酸的3’接头和至少一种第一连接酶合并以形成第一反应组合物,其中与所述寡核苷酸退火的3’接头包含单链的5’悬垂部分;在适于产生第一连接产物的条件下孵育第一反应组合物,以形成第二反应组合物,其包含第一连接产物和至少一些退火至寡核苷酸的未连接的3’接头;在适于产生第一连接产物的条件下孵育第一反应组合物,以形成第二反应组合物,其包含第一连接产物和至少一些退火至寡核苷酸的未连接的3’接头;将至少一种DNA聚合酶与第二反应组合物合并,并且在适于所述聚合酶将至少一些退火至寡核苷酸的3’接头的单链5’悬垂部分转化为缺少悬垂部分的双链的接头-寡核苷酸双链体的条件下孵育;以及将至少一种第二连接酶和至少一种5’接头与包含双链的接头-寡核苷酸双链体和第一连接产物的第二反应组合物合并,并在适于形成至少一些第二连接产物的条件下孵育,从而减少接头-二聚体形成。
附图说明
通过以下说明书、所附权利要求和附图,将更好地理解本教导的这些和其他特征和优势。技术人员将理解,下文描述的图仅用于说明的目的。所述图不意欲以任何方式限制所公开的教导的范围。
图1示意性地描绘了用于减少接头-二聚体形成的某些示例性方法。
图2示意性地描绘了用于将过量的3’接头转化为平端的dsDNA的示例性末端补平实施方案。
图3示意性地描绘了本教导的示例性sRNA-seq文库构建方案的概述,包括具有随机化末端的接头。
图4A-4B描绘了可以用无凝胶尺寸选择清除(图4A)或PAGE尺寸选择和清除(图4B)来进行尺寸选择的样品的示例性PAGE图像,如某些示例性技术中所述的。
图5描绘了使用在用Gold染色的、在6%TBE-PAGE凝胶上分析的示例性方法,产生的多种反应组合物。泳道1和2为使用示例性末端补平方法(“有末端补平”)产生的小RNA文库的技术重复,泳道3和4为未使用本教导的末端补平方法(“无末端补平”)产生的小RNA文库的技术重复;泳道M含有碱基对梯度标准。
图6描绘了使用在用Gold染色的、在6%TBE-PAGE凝胶上分析的示例性方法,产生的多种反应组合物的技术重复。泳道1-4描绘了在3’连接步骤之前将RT引物退火至3’接头而制备的小RNA文库,泳道5-8描绘了在3’连接步骤之后将RT引物退火至3’接头而制备的小RNA文库。泳道1、2、5和6描绘了使用了示例性末端补平方法的文库;泳道3、4、7和8描绘了未使用无末端补平方法的文库;标记为M的泳道含有碱基对梯度标准(+EF:本教导的示例性末端补平方法用于产生这些样品;-EF:对于这些样品,未使用末端补平技术;退火前:使用前,与3’接头退火的寡核苷酸/RT引物;退火后:3’接头连接之后添加到反应组合物的寡核苷酸)。
图7描绘了使用在用Gold染色的、在6%TBE-PAGE凝胶上分析的示例性方法,产生的多种反应组合物的技术重复。泳道1和2描绘了使用示例性末端补平方法产生的文库,所述方法包括公开的过量的3’接头去除技术的一个实施方案。泳道3和4描绘了使用公开的末端补平方法的一个实施方案而非过量的3’接头去除技术产生的文库;泳道M含有碱基对梯度标准。此图中所示的全部文库均使用与基于Ion Torrent的测序相容的接头和引物来构建。
具体实施方式
应理解,上文的一般描述和以下详细描述仅为说明性和示例性的,并且不意欲限制所公开的教导的范围。本文使用的章节标题仅用于组织性目的,不应理解为限制所公开的教导的主题。
在上文的发明内容、详细描述、附图,以及下文的权利要求中,提及本教导的特定特征(包括方法步骤)。应理解,本说明书中的公开内容包括这些特定特征的可能的组合。例如,当特定特征被公开于本教导的特定实施方案或特定权利要求的上下文中时,该特征还可与其他特定实施方案组合使用和/或在其他实施方案的上下文中使用(到可能的程度),并且通常来说在本教导中。
当提及包括两个或多个合并步骤的方法时,定义的步骤可以以任何次序进行或同时进行(除非上下文排除了这种可能性),并且所述方法包括在所定义的步骤的任一个之前、在两个所定义的步骤之间或在全部所定义的步骤之后进行的一个或多个其他步骤(除非上下文排除了这种可能性)。
在本说明书中,某些美国专利、美国专利申请和其他文件可以通过引用的方式纳入。然而,这些美国专利、美国专利申请和其他材料的文本仅以引用的方式纳入到这样的程度,即所述文本与本说明书中所示的描述和附图之间不存在冲突。如果出现这类冲突,则任何以引用的方式纳入的美国专利、美国专利申请和其他材料中的冲突材料特别地不以引用的方式纳入本说明书。
定义
如本文所用,术语“包括(comprising)”(其与“包含(including)”同义)以及各自的同源词(例如包括(comprise)、包括(comprises)、包含(include)和包含(includes))是包含性的或开放式的,并且不排除额外的未记载的组分、要素或方法步骤,即其他组分、步骤等是任选地存在的。例如但不限于,“包括”组分A、B和C的项目(article)可由组分A、B和C组成(即仅含有组分A、B和C);或所述项目不仅含有组分A、B和C,还含有一个或多个额外的组分。
本教导的“寡核苷酸”意指可作为逆转录引物(RT引物)的结合位点或RT引物结合位点的互补物的核酸分子。本教导的寡核苷酸可具有不同的长度。
术语如“随机化碱基”、“随机化核苷酸”、“随机碱基”和“随机核苷酸”指与被设计以与靶或所需的核苷酸序列特异性杂交的序列不同,使用随机序列产生的核酸序列。在某些实施方案中,多个不同的寡核苷酸包含相同的核心序列(即目的序列的互补物),但是包含不同的随机化末端。例如但不限于,一系列具有核心序列(其为本教导的寡核苷酸序列的至少一部分的互补物)、但是具有不同的5’随机化末端(1至25个核苷酸)的3’接头。在某些实施方案中,随机化碱基存在于3’接头的5’端,5’接头的3’端,或二者同时。
本文使用的术语“小RNA”指本领域已知的多种RNA种类,通常长度为15-45个核苷酸。小RNA的实例包括微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)和细菌小RNA。
图1提供了本教导的某些示例性方法的示意性概述。靶核酸1与适合的3’接头2结合,所述3’接头2在5’端包含随机核苷酸(用NNNN表示)(图1,3’接头连接)。在适合的连接酶存在下并且在适合的条件下,形成第一连接产物,还称为3’连接产物(均包含3’接头,所述接头包含连接至靶核酸1的随机5’核苷酸2)。将包含适于结合逆转录引物3的序列的寡核苷酸添加到包括第一连接产物和未连接的3’接头2的反应组合物中,并且在适于寡核苷酸3与第一连接产物退火的条件下孵育(图1,RT引物杂交)。形成的双链体包括:第一连接产物-引物双链体,其包含单链和双链部分5;和接头-寡核苷酸双链体——包含单链的5’悬垂4的主要的双链复合物。在至少一种适合的聚合酶存在下和适合的条件下,发生末端补平,导致形成双链复合物6,其在聚合酶“末端补平”所述主要的双链复合物(包含单链的5’悬垂4)的5’悬垂时产生(图1,末端补平;图2)。接下来,在它们的3’端7包含随机核苷酸(表示为NNNN)的5’接头与包含第一连接产物的反应组合物合并,所述第一连接产物已被末端补平5a和双链的及末端补平的接头-寡核苷酸双链体6,并且在适合的连接酶存在下和适于形成第二连接产物8(均包含5’接头、靶核酸和具有退火的寡核苷酸的3’接头)的条件下(图1,5’接头连接)。
在某些实施方案中,无核酸酶的水中的总RNA用于使用某些公开的方法和试剂盒来制备sRNA文库。该RNA与至少一种在5’端包含随机核苷酸的预腺苷酰化的ssDNA 3’接头、反应缓冲剂和截短的T4 DNA连接酶2酶的混合物合并,并在适于所述接头连接至小RNA分子3’端的条件下孵育。使用SPRI磁珠和异丙醇的组合来获得反应混合物中的核酸,并且在无核酸酶的水中洗脱产物。接下来,至少一种包含RT引物结合位点的ssDNA寡核苷酸的混合物退火至过量的3’接头(其未连接至小RNA分子)和已经连接至小RNA分子的3’接头。该寡核苷酸与过量的3’接头的退火使得形成具有5’垂悬的双链DNA分子(参见图1中4;图2)。添加缓冲剂、dNTP和适合的DNA聚合酶(例如T4 DNA聚合酶),并且在适于聚合的条件下孵育所述反应混合物,使用3’接头的随机碱基作为模板,在寡核苷酸的3’端发生DNA聚合(示意地描绘于图1末端补平;图2)。之后在适于使T4 DNA聚合酶失活的条件下孵育反应混合物。然后添加5’连接反应的典型组分,包括ssRNA 5’接头、缓冲剂、ATP和T4 RNA连接酶1,然后在适于RNA连接的条件下孵育反应混合物,使5’接头连接到小RNA分子的5’端。然而,被末端补平过程转化为平端dsDNA的过量的3’接头(例如图1中的6),对于至少一种第二连接酶(例如T4RNA连接酶1)而言是较差的底物,使得与未使用本教导的方法获得的结果相比接头-二聚体形成显著减少。文库制备方法可根据多种sRNA-seq文库制备方案来完成,包括例如逆转录、PCR扩增和凝胶纯化或其他尺寸选择方案,包括图3中的示意性描述。
根据某些公开的方法,末端补平技术与用于除去过量的3’接头的技术(例如,如NEXTFLEX小RNA测序试剂盒(Bioo Scientific)中所提供的)结合,以进一步减少接头-二聚体产物的形成。
在一些实施方案中,在3’连接反应之前、期间或之后,寡核苷酸退火至3’接头。
在一些实施方案中,3’接头的随机化部分(图1中示意地表示为NNNN)的长度可以为1-25个核苷酸;5’接头的随机化部分(图1中示意地表示为NNNN)的长度可以为1-25个核苷酸;或3’接头和5’接头的随机化部分可以为1-25个核苷酸。
在一些实施方案中,寡核苷酸与3’接头的非随机化部分的长度可以不同。在某些实施方案中,3’接头在其5’端包含活化的腺苷酰化(rApp),在其3’端包含双脱氧核苷酸,或在其5’端包含活化的腺苷酰化(rApp)并且在其3’端包含双脱氧核苷酸。在某些实施方案中,3’接头在其5’端包含4个内部紧靠活化的腺苷酰化(rApp)的随机核苷酸(5'rAppNNNN-),5’接头在其3’端包含4个随机核苷酸。在某些实施方案中,5’接头包含RNA。在某些实施方案中,RT引物包含条形码序列。在某些实施方案中,使用多种不同的RT引物,其中所述RT引物包含不同的条形码序列以促进多路测序,例如但不限于低水平多路测序。
在一些实施方案中,寡核苷酸可含有5’悬垂区。
本教导的某些方法和试剂盒包括至少一种DNA聚合酶。本领域技术人员将理解,多种不耐热的和热稳定的原核和真核DNA聚合酶,以及许多病毒DNA聚合酶适用于所公开的方法和试剂盒。示例性的DNA聚合酶包括T4 DNA聚合酶、Taq聚合酶、人DNA聚合酶α、莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV RT)和大肠杆菌(E.coli)DNAPol I(包括Klenow片段)。
本教导的某些方法和试剂盒包括至少一种第一连接酶和至少一种第二连接酶。在某些实施方案中,第一连接酶和第二连接酶是相同的,例如,添加到某些方法实施方案的单独步骤中的T4 RNA连接酶1的两个等分试样。本领域技术人员将理解,多种不耐热的和热稳定的原核和真核连接酶,以及许多病毒DNA连接酶适用于所公开的方法和试剂盒。用于某些所公开的方法和试剂盒的示例性连接酶包括T4 RNA连接酶1、热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)热稳定的RNA连接酶、CircLigaseTMRNA连接酶(Epicentre,Madison,WI)、T4 RNA连接酶2(包括其截短突变体和点突变体)、真核tRNA连接酶、大肠杆菌RNA连接酶RtcB和T4 DNA连接酶。
根据某些实施方案,3’连接之前至少一些寡核苷酸和至少一些3’接头被退火。在某些实施方案中,将这些预退火的复合物贮存备用。
某些示例性技术
使用高质量起始材料获得最好的结果。使用降解的RNA可导致低产率或缺少测序输出数据。本发明人推荐在1-2%琼脂糖凝胶上对总RNA进行电泳或使用Agilent生物分析仪来检查其完整性。高质量的总RNA制备物应当具有28S条带,其强度为核糖体RNA的18S条带的2倍。在低浓度下,小RNA难以在凝胶上检测;然而,可使用Agilent生物分析仪小RNA测定来检测小RNA。对于低输入文库制备,本发明人推荐用无核酸酶的水来稀释NEXTFLEXTM3’4N腺苷酰化的接头和NEXTFLEXTM5’4N接头1/2至1/4。
表1.根据本教导的某些实施方案,以下信息可能会有所帮助。
样品输入 | 接头稀释 | PCR循环 | 无凝胶的尺寸选择 |
2μg-200ng | 无 | 12-18 | + |
200ng-50ng | 1/2-1/4 | 16-22 | +/- |
50ng-5ng | 1/4-1/8 | 22-25 | - |
出于说明目的,以下示例性技术可使用NEXTFLEXTM小RNA-Seq试剂盒v3来进行。本领域技术人员将理解,这些示例性技术的原理是广泛适用的,并且用于实施这些方法的适合的试剂和组分可获自多个商业来源。
3'NEXTFLEXTM4N腺苷酰化的接头连接。使用前使50%PEG升温最高至室温。对于每种样品,在无核酸酶的96孔板中于冰上合并以下试剂:_μL RNA+_μL无核酸酶的水=10.5μL。70℃下加热2分钟,之后立即置于冰上。在冰上孵育2-5分钟。对于每种样品,在无核酸酶的96孔板中于冰上合并以下试剂:10.5μL RNA(在无核酸酶的水中)、5μL 50%PEG、1μL 3’NEXTFLEX 4N腺苷酰化的接头(可使用最高达1/4稀释)、2μL AIR连接酶缓冲剂、0.5μLRNase抑制剂和1μL AIR连接酶。通过吸液充分混合直至均一。在热循环仪中于22℃下孵育2小时。对于至2’O-甲基化的小RNA(例如植物中发现的那些)的连接,于16℃下孵育过夜。立即进行下一步的过量的3’接头去除技术。
过量的3’接头去除。向每种样品中添加20μL接头耗尽溶液并通过吸液管充分混合。添加40μL NEXTFLEXTM清除珠并通过吸液管充分混合。添加60μL异丙醇并通过吸液管充分混合。孵育5分钟。将反应组合物放置在磁场附近5分钟或直至组合物变得澄清。移除并弃去上清液。添加180μL新鲜制备的80%乙醇,孵育30秒并除去全部上清液。重复该步骤,总共2次乙醇清洗。重点:一直使用新鲜制备的80%乙醇,并且不长时间使用80%乙醇来孵育珠团(bead pellet)。孵育样品3分钟。1分钟之后,除去可在孔底部收集的全部残余液体。从磁场取出组合物,并且通过上下吸液将珠团重新悬浮于22μL重悬缓冲剂中。确保小珠完全重新悬浮。孵育2分钟。将反应组合物放置在磁场附近3分钟或直至组合物变得澄清。转移20μL上清液至新孔。添加20μL接头耗尽溶液并通过吸液管充分混合。添加40μL NEXTFLEX清除珠并通过吸液管充分混合。添加60μL异丙醇并通过吸液管充分混合。孵育5分钟。将反应组合物放置在磁场附近5分钟或直至组合物变得澄清。移除并弃去上清液。添加180μL新鲜制备的80%乙醇,孵育30秒,除去全部上清液。重复该步骤,总共2次乙醇清洗。重点:一直使用新鲜制备的80%乙醇,并且不长时间使用80%乙醇来孵育珠团。孵育样品3分钟。1分钟之后,除去可在孔底部收集的全部残余液体。从磁场取出组合物,并且通过吸液将珠团重新悬浮于13μL无核酸酶的水中。确保小珠完全重新悬浮。孵育2分钟。将反应组合物放置在磁场附近3分钟或直至组合物变得澄清。转移11.5μL上清液至新孔。进行末端补平技术或将所述组合物在-20℃下贮存过夜,然后在开始(proceeding)之前在冰上解冻组合物。在本申请通篇中,提及将反应组合物放置在磁场附近或从磁场取出反应组合物和类似的技术。应理解,组合物可被转移到磁场或从磁场附近移出,或磁场可被转移到组合物附近或从组合物附近移出。
过量的接头失活(末端补平)。对于每种样品,在无核酸酶的96孔PCR板中于冰上合并以下试剂:11.5μL纯化的3’NEXTFLEXTM4N腺苷酰化的接头连接的RNA(来自之前的过量3’接头去除技术)、1.5μL接头失活试剂1、0.5μL接头失活试剂2和0.5μL接头失活酶(总体积14μL)。通过吸液充分混合,然后在12℃下孵育15分钟,在50℃下孵育20分钟,放置于4℃下。
5’NEXTFLEXTM4N接头连接。每次反应在70℃下加热1.5μL 5’NEXTFLEX 4N接头2分钟,之后立即置于冰上。对于每种样品,在无核酸酶的96孔PCR板中于冰上合并以下试剂:14μL纯化的3’NEXTFLEXTM4N腺苷酰化的接头连接的RNA(来自之前步骤)、4.5μL 50%PEG、1.5μL 5’NEXTFLEXTM4N接头(可使用最高达1/4稀释)、1.5μL AIR连接酶缓冲剂、1.5μL ATP、0.5μL RNA抑制剂、1.5μL RNA连接酶1(总体积25μL)。通过吸液充分混合,在热循环仪中于20℃下孵育,然后进行下一步。或者,可在-20℃下将样品贮存过夜。
逆转录-第一链合成。对于每种样品,在无核酸酶的96孔PCR板中合并以下试剂:25μL 5’和3’NEXTFLEXTM接头连接的RNA、5μL无核酸酶的水、4μL 10X M-MuLV缓冲剂(使用之前涡旋以溶解沉淀物)、4μL dNTP和2μL M-MuLV逆转录酶(总体积40μL)。通过吸液充分混合。42℃下孵育30分钟,90℃下孵育10分钟,之后进行下一步。
小珠清除。向每种样品中添加20μL NEXTFLEXTM清除珠并通过吸液管充分混合。添加22μL异丙醇并通过吸液管充分混合。孵育5分钟。将反应组合物放置在磁场附近5分钟或直至组合物变得澄清。转移75μL上清液至新孔。所述上清液含有cDNA产物。注意不要将小珠与澄清的上清液一起转移。将组合物从磁场移出,添加10μL接头耗尽溶液并通过吸液管充分混合。添加20μL NEXTFLEXTM清除珠并通过吸液管充分混合。将溶液放置在磁场附近5分钟或直至溶液变得澄清。移除并弃去上清液。添加180μL新鲜制备的80%乙醇,孵育30秒,然后移除全部上清液。重复该步骤,总共2次乙醇清洗。孵育样品3分钟。1分钟之后,除去可在孔底部收集的全部残余液体。将板从磁场移出,并通过上下吸液重新悬浮珠团于20μL无核酸酶的水中。确保小珠完全重新悬浮。孵育2分钟。将板放置在磁场附近3分钟或直至组合物变得澄清。转移18μL上清液至新孔并进行PCR扩增。或者,可将样品于-20℃下贮存过夜。在开始(proceeding)之前应当在冰上融化冷冻样品。
PCR扩增。对于每种样品,在无核酸酶的96孔板中于冰上合并以下试剂:18μL纯化的第一链合成产物、1μL EXTFLEXTM通用引物、1μL EXTFLEXTM条形码引物和5μL EXTFLEXTM小RNA PCR Master混合物。将板放置在热循环仪中,加热至超过80℃,并加热至95℃,持续2分钟;95℃持续20秒、60℃持续30秒、72℃持续15秒,12-25个循环;然后72℃持续2分钟。然后对PCR扩增产物进行尺寸选择。
寡核苷酸序列:
示例性条形码索引区序列:CGTGAT,ACATCG,GCCTAA,TGGTCA,CAGTGT,ATTGGC,GATCTG,TCAAGT,CTGATC,AAGCTA,GTAGCC,TACAAG,TTGACT,GGAACT,TGACAT,GGACGG,CTCTAC,GCGGAC,TTTCAC,GGCCAC,GGAAAC,CGTACG,CCACTC,GCTACC,ATCAGT,GCTCAT,AGGAAT,CTTTTG,TAGTTG,CCGGTG,ATCGTG,TGAGTG,CGCCTG,GCCATG,AAAATG,TGTTGG,ATTCCG,AGCTAG,GTATAG,TCTGAG,GTCGTC,CGATTA,GCTGTA,ATTATA,GAATGA,TCGGGA,CTTCGA和TGCCGA。
确定使用哪种尺寸选择方法。通常,可使用200ng-2μg总RNA起始材料和18个或更少的PCR循环来实现无凝胶的文库制备。当使用少于200ng总RNA起始材料和最多达25个PCR循环时,基于PAGE的尺寸选择将是必要的。然而,根据细胞/组织类型和使用的提取方法,总RNA的小RNA级分可变化很大,因此使用者的职责是确定最佳输入量和PCR循环数。PCR之后,可通过TBE-PAGE凝胶、Agilent生物分析仪HS DNA测定或类似的技术来分析产物。对于通过PAGE凝胶进行的分析,本发明人推荐混合5μL PCR产物与1μL NEXTFLEX上样染料,并且与5μL即时上样低分子量梯度(Ready to Load Low MW Ladder)并排在6%TBE-PAGE凝胶上进行电泳,并且用SYBR Gold或溴化乙锭染色。对于通过生物分析仪进行的分析,本发明人推荐对用无核酸酶的水稀释1/4的1μL PCR产物进行电泳。生物分析仪软件可能不会准确鉴定峰尺寸,因此还推荐对用miRNA对照产生的文库进行电泳以帮助鉴定约150bp的峰。约150bp的强条带的存在表明成功的文库制备,缺少约130bp的条带表明可使用无凝胶的尺寸选择。参见表2。
表2.
无凝胶的尺寸选择&清除。确保全部样品的体积为25μL。如果少于25μL,则添加无核酸酶的水以使总体积最高达到25μL。添加32.5μL NEXTFLEXTM清除珠并通过吸液充分混合。孵育5分钟。将样品放置在磁场附近5分钟或直到溶液变得澄清。转移52.5μL上清液至新孔。上清液含有扩增产物。注意不要将小珠与澄清的上清液一起转移。将样品从磁场移出。添加30μL NEXTFLEXTM清除珠到每种样品并通过吸液管充分混合。孵育5分钟。将样品放置在磁场附近5分钟或直到溶液变得澄清。移除并弃去上清液。添加180μL新鲜制备的80%乙醇,孵育30秒,并除去全部上清液。重复该步骤,总共2次乙醇清洗。孵育样品3分钟。1分钟之后,除去可在孔底部收集的全部残余液体。将板从磁场移出,并通过上下吸液将珠团重新悬浮于13.5μL重悬缓冲剂中。确保小珠完全重新悬浮。孵育2分钟。将样品放置在磁场附近3分钟或直到溶液变得澄清。转移12μL上清液至新孔或无污染的(clean)的微离心管。这是你的测序文库。通过生物分析仪高灵敏度DNA测定(Agilent)来检查最终文库的尺寸分布,并通过Qubit dsDNA HS测定(Life Technologies)来检查浓度。
PAGE尺寸选择&清除。添加5μL NEXTFLEXTM6X凝胶上样染料至每种PCR产物并充分混合。将纯化的PCR产物上样到6%TBE-PAGE凝胶。本发明人推荐在用相同条形码引物制备的样品之间留出1-2个泳道以避免交叉污染。可将用不同条形码制备的并且共同测序的样品在相邻的泳道中进行电泳。在相邻的泳道中,加样10μL即时上样低分子量梯度。在200V下用IX TBE缓冲剂对凝胶进行电泳,直到下部的染料条带接近凝胶底部(0.5-1cm)。应当对凝胶进行电泳约30分钟。电泳时间可根据各个实验而变化。从玻璃板中小心地将凝胶移出,并根据制造商说明,用核酸染料(例如Gold(Invitrogen))染色。在UV透照仪或其他凝胶记录仪器上显像凝胶条带。使用无污染的剃刀切下约150bp的条带并放置到无污染的1.7mL管中。不要切下约130bp的条带;这是接头-二聚体产物(参见图4)。200bp处的梯度条带的强度是其他条带的2倍,可用于定向。简单地离心含有凝胶切片的微离心管以将凝胶切片收集在管底部。用一次性的研杵充分压碎凝胶切片。将研杵留在管中。向每个管中添加300μL洗脱缓冲剂,然后移走研杵,确保尽可能多的凝胶已被从研杵上冲洗下来。在室温下使凝胶片浸泡至少2小时或过夜,同时搅拌。孵育时间不要比过夜更长。脉冲离心(pulsespin)管以从壁和盖上收集全部洗脱物。小心地将洗脱物(包含压碎的凝胶)转移到Spin-X离心管(Sigma)的顶部。切下P1000尖端的末端可有助于转移更大的凝胶片。在16,000x g下离心Spin-X管2分钟。弃掉离心滤器。向每个管中添加50μL EXTFLEX清除珠和350μL异丙醇并充分混合。室温下孵育10分钟。在该孵育期间搅拌可提高回收效率。脉冲离心管以从管的壁和盖上收集溶液并且沉淀小珠。将样品放置在磁场附近2分钟或直到溶液变得澄清。小心地移除并弃掉液体。添加950μL 80%乙醇,孵育30秒,然后除去全部上清液。重复该步骤,总共2次乙醇清洗。干燥样品3分钟。1分钟之后,除去可在管底部收集的全部残余液体。将板从磁场移出,并通过上下吸液将珠团重新悬浮于13μL重悬缓冲剂中。确保小珠完全重新悬浮并再水合。孵育2分钟。将样品放置在磁场附近3分钟,或直到溶液变得澄清。转移12μL上清液到无污染的1.7mL管。这是你的测序文库。通过生物分析仪高灵敏度DNA测定(Agilent)来检查最终文库的尺寸分布,并通过Qubit dsDNA HS测定(Life Technologies)来检查浓度。
某些示例性实施方案
实施例1.示例性sRNA-seq文库的构建。在一个示例性方法实施方案中,根据制造商的说明,使用NEXTFLEXTM小RNA测序试剂盒v2,由人脑总RNA(Ambion,cat.#AM7962)制备sRNA-seq文库,指出的除外。对于根据某些公开的方法制备的sRNA-seq文库,在使用NEXTFLEXTM珠除去过量的3’接头之后,回收11.5μL含有3’连接产物的无核酸酶水的上清液。向每个上清液中加入1.5μL NE缓冲剂2.1(500mM NaCl、100mM Tris-HCl、100mM MgCl2、1ng/ml BSA,pH 7.9)、0.5μL 6.25μM dNTP和0.5μL T4 DNA聚合酶(Enzymatics,Cat.#P7080L),并在12℃下孵育15分钟,之后在50℃下孵育20分钟。之后对NEXTFLEXTM小RNA测序试剂盒v2方案进行以下修改:1)在5’接头连接步骤中,样品并非在70℃下加热2分钟。相反,将5’4N接头在70℃下单独地加热2分钟,之后添加到反应中。2)在5’接头连接步骤中,添加4.5μL 50%PEG而非3.5μL。3)在逆转录步骤中,添加5μL无核酸酶的水而非8μL。4)为了比较不同条件的产率和接头-二聚体含量,将25μL PCR反应物中的5μL在6%TBE-PAGE凝胶上电泳,用Gold染色,并在UV透照仪上显像。
实施例2.末端补平在减少接头-二聚体中的有效性。为了证明所公开的末端补平方法的有效性,如实施例1中所述,使用或不使用所述的末端补平方法,从100ng人脑总RNA制备sRNA-seq文库,并通过TBE-PAGE分析(图5)。泳道1和2为使用所提出的末端补平方法产生的小RNA文库的技术重复,泳道3和4为未使用末端补平方法产生的小RNA文库的技术重复;泳道M含有碱基对梯度标准。结果证明,所述方法不仅有效地减少了接头-二聚体,还出乎意料地提高了含有插入片段的产物的产率。
实施例3.3’连接之前退火RT引物的有效性。
如实施例1中所述,使用预退火的寡核苷酸-3’接头双链体或使用3’连接之后退火的寡核苷酸,将3’接头预退火至寡核苷酸并从100ng人脑总RNA制备文库。对于图6,泳道1-4描绘了3’连接步骤之前寡核苷酸退火至3’接头(“预退火”)而制备的小RNA文库;泳道5-8描绘了3’连接步骤之后寡核苷酸退火至3’接头(“后退火”)而制备的小RNA文库。泳道1、2、5和6描绘了根据本教导制备的文库;而泳道3、4、7和8中描绘的文库描绘了未使用本教导的末端补平技术而制备的文库;标记为M的泳道含有碱基对梯度标准。结果证明,预退火3’接头和寡核苷酸并未显著影响3’接头退火至小RNA分子的有效性或所述方法在减少接头-二聚体形成中的有效性。
实施例4.与其他接头-二聚体减少策略组合
为了评估某些所公开的方法在与过量接头去除技术结合时是否甚至更有效地减少接头-二聚体,本发明人检验了包括接头-二聚体减少技术(接头耗尽清除(ADC,也称为过量3’接头去除,如上文所述以及也用于EXTFLEXTM小RNA测序试剂盒(Bioo Scientific)))的示例性方法实施方案。ADC方案包括将样品与异丙醇、SPRI珠和耗尽溶液混合。该方法允许耗尽未连接的接头,同时保留更大的连接产物,并且通常连续进行两次。图7示出按照NEXTFLEXTM试剂盒方案,单独使用ADC方法[ADC(-)末端补平]或与本教导的示例性末端补平方法结合的ADC方法[ADC(+)末端补平],使用从500ng人脑总RNA制备的文库获得的结果。
使用与基于Ion Torrent的测序平台相容的接头和引物来构建图7中所示的全部文库。这些结果表明,包括末端补平的某些所公开的方法和ADC技术的结合相比于包括ADC技术但是不包括末端补平的方法,更有效地消耗了接头-二聚体产物。应当注意的是,使用不同的3’和5’接头以及RT和PCR引物来进行本实验,产生与图5和6中的那些尺寸不同的所需的产物和接头-二聚体产物。
实施例5.使用具有不同的3’接头序列的示例性方法。所述方法应当起作用,不管3’接头的“固定”部分的序列是什么,因此为了检验这一点,本发明人使用与Illumina测序平台或Life Technologies Ion Torrent平台相容的接头,将该方法用于sRNA-seq文库构建。图7说明,除其他事项外,在某些示例性方法实施方案中,不管使用的接头序列是什么,末端补平与ADC技术的结合大大减少了sRNA-seq文库中接头-二聚体的形成。使用与基于Ion Torrent的测序相容的接头和引物来构建图7中所示的全部文库。图7的泳道1和2描绘了使用方法实施方案产生的文库,所述实施方案包括与ADC技术结合的末端补平技术(ADC(+)末端补平)。图7的泳道3和4描绘了使用方法实施方案产生的文库,所述实施方案包括末端补平技术但是不包括ADC技术(ADC(-)末端补平);泳道M含有碱基对梯度标准。因此,如果所需接头序列随着测序技术发展而变化,本教导仍可用于减少接头-二聚体形成。
某些示例性试剂盒
在某些实施方案中,提供了试剂盒以促进各种所公开的方法的表现。试剂盒通过将用于实施某些方法的两种或多种试剂和/或组分组合在一起来促进某些方法实施方案的表现。试剂盒可含有预先测定的单位量的试剂以最小化终端用户的测量需求。试剂盒还可包括用于实施一种或多种所公开的方法的说明。在某些实施方案中,至少一些试剂盒组分被优化以彼此共同发挥作用。通常,可提供固体、液体或凝胶形式的试剂盒试剂。
某些试剂盒实施方案包括:至少一种3’接头,其在5’端包含1-25个随机碱基;至少一种寡核苷酸,其与3’接头的至少一部分互补;至少一种5’接头,其在3’端具有1-25个随机碱基;T4 RNA连接酶2和T4 RNA连接酶1。某些试剂盒实施方案还包括DNA聚合酶、T4连接酶1、T4连接酶2或DNA聚合酶、T4连接酶1和T4连接酶2。在某些试剂盒实施方案中,DNA聚合酶包括T4 DNA聚合酶。
尽管已经通过各种应用、方法和试剂盒来描述了所公开的教导,但是应理解,可进行多种变化和改进,而不偏离本文的教导。提供上述实施例以更好地举例说明本教导,并且不意欲限制本文教导的范围。此外,本领域技术人员随后可进行其多种目前无法预见或意料之外的替代、修改、变化或改进,其也意欲包含在以下权利要求中。可根据以下权利要求来进一步理解本教导的某些方面。
Claims (21)
1.一种用于减少接头-二聚体形成的方法,其包括:
将包含靶核酸的样品、至少一种3’接头和至少一种第一连接酶合并以形成第一反应组合物;
在适于产生第一连接产物的条件下孵育所述第一反应组合物,以形成第二反应组合物,其包括第一连接产物和至少一些未连接的3’接头;
将至少一种包含逆转录引发位点的寡核苷酸与所述第二反应组合物合并,以形成第三反应组合物;
在适于至少一些寡核苷酸与至少一些所述第一反应产物和至少一些所述未连接的3’接头退火的条件下,孵育所述第三反应组合物,以形成包含单链5’悬垂部分的3’接头-寡核苷酸双链体;
将至少一种DNA聚合酶与所述第三反应组合物合并,并在适于所述聚合酶将至少一些包含单链5’悬垂部分的3’接头-寡核苷酸双链体转化为双链的接头-寡核苷酸双链体的条件下孵育;和
将至少一种第二连接酶和至少一种5’接头与包括双链的接头-寡核苷酸双链体和第一连接产物的第三反应组合物合并,并且在适于形成至少一些第二连接产物的条件下孵育,从而减少接头-二聚体形成。
2.权利要求1的方法,其中所述第一连接酶包括T4RNA连接酶2或截短的T4RNA连接酶2;所述DNA聚合酶包括T4DNA聚合酶;所述第二连接酶包括T4RNA连接酶1或热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)RNA连接酶。
3.权利要求1的方法,其中在所述3’接头连接至靶核酸之前、期间或之后,所述寡核苷酸退火至所述3’接头。
4.权利要求1的方法,其中所述3’接头在5’端包含1-25个随机化碱基。
5.权利要求1的方法,其中所述5’接头在3’端包含1-25个随机化碱基。
6.权利要求1的方法,其中至少一种靶核酸包括至少一种小RNA种类。
7.权利要求1的方法,其还包括将至少一种逆转录酶与所述第二连接产物合并以产生双链的第二连接产物。
8.权利要求7的方法,其还包括扩增至少一些双链的第二连接产物以产生扩增产物。
9.权利要求8的方法,其中所述扩增包括聚合酶链式反应
(PCR)。
10.权利要求8的方法,其还包括通过尺寸分离至少一些所述扩增产物。
11.一种用于减少接头-二聚体形成的方法,其包括:
将包含靶核酸的样品、至少一种退火至包含逆转录引物结合位点的寡核苷酸的3’接头和至少一种第一连接酶合并,以形成第一反应组合物,其中退火至所述寡核苷酸的所述3’接头包含单链的5’悬垂部分;
在适于产生第一连接产物的条件下孵育所述第一反应组合物,以形成第二反应组合物,其包括第一连接产物和至少一些退火至寡核苷酸的未连接的3’接头;
将至少一种DNA聚合酶与所述第二反应组合物合并,并且在适于聚合酶将退火至所述寡核苷酸的3’接头的至少一些单链5’悬垂部分转化为缺少悬垂部分的双链的接头-寡核苷酸双链体的条件下孵育;和
将至少一种第二连接酶和至少一种5’接头与包括双链的接头-寡核苷酸双链体和第一连接产物的第二反应组合物合并,并且在适于形成至少一些第二连接产物的条件下孵育,从而减少接头-二聚体形成。
12.权利要求11的方法,其中所述第一连接酶包括T4RNA连接酶2或截短的T4RNA连接酶2;所述DNA聚合酶包括T4DNA聚合酶;所述第二连接酶包括T4RNA连接酶1或热自养甲烷杆菌RNA连接酶。
13.权利要求11的方法,其中所述3’接头在5’端包含1-25个随机化碱基。
14.权利要求11的方法,其中所述5’接头在3’端包含1-25个随机化碱基。
15.权利要求11的方法,其中至少一种靶核酸包括至少一种小RNA种类。
16.权利要求11的方法,其还包括将至少一种逆转录酶与所述第二连接产物合并以产生双链的第二连接产物。
17.权利要求16的方法,其还包括扩增至少一些双链的第二连接产物以产生扩增产物。
18.权利要求17的方法,其中所述扩增包括聚合酶链式反应(PCR)。
19.一种试剂盒,其包括至少一种在5’端包含1-25个随机化碱基的3’接头、至少一种与所述3’接头的至少一部分互补的寡核苷酸以及至少一种在3’端具有1-25个随机化碱基的5’接头。
20.权利要求19的试剂盒,其还包括DNA聚合酶、至少一种连接酶,或DNA聚合酶和至少一种连接酶。
21.权利要求20的试剂盒,其中所述至少一种连接酶包括以下中的至少一种:T4RNA连接酶2、T4RNA连接酶1或热自养甲烷杆菌RNA连接酶。
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