CN102978713B - 一种白血病单链抗体库及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种白血病噬菌体单链抗体库，以噬菌粒pCANTAB-5E为载体，库容达到1.5×109，经DNA测序证明其多样性良好。从该全人源白血病单链抗体库中，通过噬菌体展示技术，以特定的白血病相关抗原为靶标，经过多轮淘筛，可以方便地获得白血病细胞特异的全人源单链抗体。本发明提供的抗体库的库容量大，多样性良好；包含全套人类单链抗体的组合；单链抗体由重链可变区VH和轻链可变区VL通过连接肽(GGGGS)3连接而成，且含有完整的抗原结合部位。所述方法可操作性强，库容量大，可方便地筛选出对白血病特异的全人源单链抗体，这些全人源单链抗体可制备为靶向药物，用于白血病的治疗。
Description
技术领域
本发明属基因工程，涉及一种全人源白血病单链抗体库和其构建方法，及其在制备白血病抗体药物中的应用。
背景技术
自和Milstein创立淋巴细胞杂交瘤技术至今，单克隆抗体在肿瘤的诊断和治疗领域得到了广泛的应用。第一代应用于人类疾病治疗的主要是鼠源性单抗，但是鼠单抗的主要缺点是引起人体免疫反应，人体产生的人抗鼠抗体使其很快清除，不能很好的发挥其生物学功能，因此在临床应用中受到限制；第二代抗体是在鼠单抗基础上，通过基因重组形成了嵌合式抗体和人源化抗体，但两者应用于人体依旧存在免疫原性问题；目前，人们正致力于第三代抗体即全人源性单克隆抗体的研究，主要采用噬菌体展示技术（phage display）结合基因工程技术，由此产生的多株人源性单克隆抗体已经成功地应用于临床疾病的治疗。特别是在肿瘤治疗领域，迄今为止，美国FDA已经批准了12种单克隆抗体药物上市，成为全球生物制药领域的热点。
噬菌体展示技术最初由Smith于1985年创建，噬菌体作为一种表达载体将多肽展示于病毒外壳。基本原理是将外源DNA插入到丝状噬菌体的基因组DNA中，使外源DNA编码的肽段得以表达并伸展到噬菌体表面。通过采用与固定配体相互作用的亲和筛选方法，可以富集得到能表达某种特异肽序列的噬菌体。噬菌体（phage）和噬菌粒（phagemid）都可作为表达载体来展示抗体或其他蛋白。噬菌粒携带表达gⅢ外壳的基因、克隆位点及噬菌体包装信号，并由辅助噬菌体（如M13KO7或VCS-M13）提供完成包装所需的结构蛋白。含有完整噬菌体基因组的丝状噬菌体常用来构建肽库，而噬菌粒能够展示大量重组蛋白，更易于产生可溶性蛋白，同时自身不易受异源基因影响，因此在噬菌体抗体库构建中占据主导地位。
抗体片段是首次在噬菌体表面成功展示的蛋白质。1990年，McCafferty等采用PCR方法扩增出完整的抗体可变区基因，将多样性可变区基因组装到表达载体内，转化宿主细胞，并最终表达到噬菌体表面，从而得到多样性噬菌体抗体集合，即噬菌体抗体库。噬菌体展示抗体技术可以制备全人源的抗体，是将抗体基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，从而使异源分子展示于噬菌体表面。主要特点是将特定的分子的基因型和表达型同时出现在一个噬菌体颗粒内，通过DNA测序可以获得特定展示抗体片段的基因序列信息，并可用特定的靶抗原筛选出特异性的噬菌体抗体；在此基础上，可以通过基因工程的方法，在大肠杆菌表达可以得到大量表达的抗体。
噬菌体抗体库技术模拟了人类B细胞的分化成熟过程，首先通过分子生物学手段将人类抗体的重链和轻链等功能基因连接起来，插入噬菌体载体上，使其展示在噬菌体表面。目前，最受关注的噬菌体展示的抗体分子，主要包括抗体结合片段(fragment antigen binding,Fab)、单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)等。相对于完整的抗体分子，Fab和scFv等小分子片段结构简单（不存在Fc段），组织穿透率高，并且能够在原核生物中高效表达。其中scFv是目前报导最多的一种小分子抗体，是由抗体识别抗原的可变区Fv段组成。scFv由重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过连接区（linker）连接而成。所加的linker很重要，必须不影响scFv的构象。将scFv基因克隆在丝状噬菌体载体pIII基因先导序列和pIII基因之间，以融合蛋白的形式被导入细菌膜间隙，并组装成scFv，在加入辅助噬菌体M13K07后，scFv以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面。pCANTAB-5E载体的特点是，在scFv基因后面含有一段编码Tag尾肽(E-Tag)的序列，在E-Tag后面有一个琥珀(Amber)终止密码，位于scFv基因与pIII基因之间，在抑制性细菌TG1中，这种琥珀密码子只有20%有效，所以在蛋白翻译过程中可以被通读而形成scFv-pIII融合蛋白；而在非抑制性菌株中，如HB2151，此终止子被识别，同时scFv基因在pIII基因前终止，形成独立的抗体蛋白，滞留于细胞膜间隙，并在长时间培养后释放于培养液中，形成可溶性表达。再用特定的肿瘤相关抗原，通过“吸附-洗脱-扩增”的淘筛过程（panning），可筛选出特异性单链抗体。
发明内容
本发明目的是提供一种白血病单链抗体库，即噬菌体单链抗体库，含有全套人类抗体重链可变区VH和轻链可变区VL(包括V κ和Vλ)，及中间连接区linker序列为(GGGGS)3，有完整的抗原结合部位，以噬菌粒pCANTAB-5E为载体，库容达到1.5×109。经DNA序列分析后证明其多样性良好，并且可以通过感染宿主（大肠细菌TG1）进行大量扩增和再生。利用特定的白血病细胞的靶抗原，可以通过噬菌体展示的方法，方便地筛选出白血病特异的单链抗体，进而用于白血病的靶向治疗。
本发明的另一个目的是提供一种白血病单链抗体库的构建方法，通过以下技术方案实现：
（1）总RNA提取和cDNA的合成：取白血病患者的血液，分离淋巴细胞，用裂解液裂解淋巴细胞，提取细胞总RNA，经逆转录PCR (RT-PCR)逆转录为cDNA。这一步中，我们直接采用人类的淋巴细胞作为抗体基因的来源，可以获得全人源的单链抗体，可以避免其它动物来源抗体作为药物在人类使用中的免疫原性和过敏反应；同时，因为采用了多种白血病患者的样本，提高了单链抗体库的多样性。
（2）用PCR方法扩增抗体重链和轻链可变区基因：根据人类抗体基因序列，分别设计PCR扩增抗体重链、轻链可变区所需的特定引物，共32条，引物序列如SEQ ID NO.1-32所示；以步骤（1）获得的cDNA为模板，用PCR方法扩增可变区基因VH和VL(包括V κ和Vλ)。这一步中，我们设计的引物包含了不同免疫球蛋白家族的抗体类型，使之可以克隆人类全套VH和VL基因。
（3）单链抗体(scFv)基因片段的组装和全长扩增：设计含有由四个甘氨酸和一个丝氨酸组成的重复3次的连接肽（linker）序列和酶切位点SfiI、NotI的引物，所述连接肽和酶切位点SfiI、NotI的引物序列如SEQ ID NO.33-64所示，在上述扩增的重链(VH)和轻链（VL)可变区基因的基础上，再经重叠PCR（SOE-PCR）获得scFv基因。在这一步中，我们使用的linker序列很重要，其结构不会影响scFv的构象，有利于其活性发挥。
（4）重组噬菌粒的构建：分别用SfiI、NotI双酶切scFv基因片段，将其插入噬菌粒载体pCANTAB-5E，构建重组噬菌粒（见图1），转化感受态E.coli TGl，经辅助噬菌体M13K07超感染，获得单次的噬菌体抗体库；经重复转化后，获得全人源白血病单链抗体库（噬菌体单链抗体库），库容达到1.5×109。在这一步中，我们采用了重复转化的策略，即制备足够量的重组噬菌粒，经过100多次的转化E.coli TG，并采用电转化的方式大大提高转化的效率，得到较大库容量的单链抗体库。
（5）单链抗体库的多样性分析：随机挑取多个单克隆菌，测定插入区scFv基因的DNA序列，经ClustaIW序列比对软件分析其序列的相似性，判断单链抗体库的多样性分析；证明其多样性良好。
本发明的再一个目的是提供所述全人源白血病单链抗体库在在制备白血病抗体药物中的应用，通过以下步骤实现：用白血病相关抗原（如CD33胞外区蛋白CD33-ECD）作为靶抗原，用噬菌体展示的方法，筛选上述全人源白血病单链抗体库，经过四轮“吸附-洗脱-扩增”的淘筛过程，筛选出抗白血病的特异性单链抗体，制备白血病抗体药物。经免疫荧光法证明，筛选出来的单链抗体可以与CD33阳性的白血病细胞特异结合，并能有效地抑制CD33阳性的白血病细胞的生长，从而可以用于白血病的靶向治疗。
总之，本发明构建了一种独特的全人源白血病单链抗体库，可以用于筛选与白血病细胞特异结合的单链抗体，这类特异识别和结合肿瘤细胞的单链抗体本身或者经过结构改造后，可作为靶向药物用于白血病的治疗。
本发明的特点是：
（1）本发明提供的全人源白血病单链抗体库，库容量大，多样性良好；以噬菌粒pCANTAB-5E为载体，包含全套人类单链抗体的组合；单链抗体由重链可变区VH和轻链可变区VL通过连接肽(GGGGS)3连接而成，且含有完整的抗原结合部位。
（2）本发明提供的构建全人源白血病单链抗体库的技术，从白血病人血液出发，设计32条特异的引物，主要利用RT-PCR、SOE-PCR等分子生物学技术结合噬菌体展示技术，通过重复电转化，可以获得全人源单链抗体库；技术可操作性强，库容量大。
（3）本发明的全人源白血病单链抗体库，因为以噬菌粒为载体，通过感染大肠杆菌而扩增并将单链抗体展示在噬菌体表面，从而可以用特定的白血病相关抗原作为靶标，可方便地筛选出对白血病特异的全人源单链抗体，这些全人源单链抗体可作为靶向药物，用于白血病的治疗。
附图说明
图1、重组载体pCANTAB-5E的构建图。
图2、总RNA电泳检测结果。
图3、PCR扩增重链可变区VH基因。
图4、PCR扩增轻链可变区Vλ基因。
图5、PCR扩增轻链可变区Vκ基因。
图6、PCR二次扩增轻链可变区VH基因。
图7、PCR二次扩增重链可变区Vλ基因。
图8、PCR二次扩增轻链可变区Vκ基因。
图9、SOE-PCR扩增scFv基因。
图10、细胞免疫荧光分析结果。
图11、单链抗体对白血病细胞的特异杀伤作用。
具体实施方式
本发明结合以下实施例及附图作进一步说明。
实施例1：白血病人淋巴细胞总RNA的提取和cDNA的合成
实验方法：
（1）分离白血病人血淋巴细胞：取白血病病人志愿者血液，采用TAKARA公司的淋巴细胞分离液，每份按照下列方法分别分离外周血淋巴细胞：
①取白血病病人外周血1~2ml，加入等体积PBS稀释；
②取无菌15m1离心管，加入淋巴细胞分离液，使分离液：PBS：外周血=1：1：1，小心将稀释后的血液加到分离液上面，开始时要尽量贴近液面，慢慢滴加；
③置于低速水平离心机，2500rpm，常温，离心20min，离心过程中升速和降速都要缓慢，以免混层；
④轻轻取出，可见管中呈现四层，从上至下分别为：血浆层(黄色)，淋巴细胞层(白色)，分离液层(无色)和红细胞层(红色)，用一次性吸管轻轻吸取淋巴细胞层，于1.5ml EP管，约取400μ1/管；
⑤用PBS缓冲液等比例稀释，2500rpm，常温离心10min，备用。
（2）TRIZOL法提取细胞总RNA采用Invotrigen公司的TRIZOL试剂进行如下操作：
①上述分离得到的人外周血淋巴细胞，经计数后，按每毫升裂解液裂解5×106个细胞的量，每1.5ml的EP管中加1ml TRIZOL溶液，用移液枪将细胞沉淀吹打散，振荡器稍微震荡，至混合液基本澄清，室温静置5min；
②每管加入200μl氯仿，用力摇晃试管15~30s，30°C下孵育2～3min；
③用12000×g，4°C，离心15min，离心后混合物呈三层：上层无色的水相，中间层和下层红色的苯酚-氯仿层；
④吸取上层水相(约500-600μl)转入新的1.5ml EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，沉淀RNA；
⑤用12000×g，4°C，离心10min；
⑥弃去上清，用1ml 75％的乙醇(临用前十分钟内用DEPC水配制，置冰浴)洗涤RNA沉淀；
⑦2-8°C下，不超过7500×g的离心力离心5min；
⑧尽量弃去上清，倒置于吸水纸上，自然晾干(但不能完全干燥)，用10~20μl DEPC水溶解；
⑨取2μl RNA做1%琼脂糖凝胶电泳检测。该步骤后，将用于逆转录成cDNA。
（3）cDNA链的合成：①在1.5ml RNase-free PCR管中加入如下混合液：
②将上述RNase-free PCR管于65°C保温5min后置冰上急冷，简易离心数秒；
③继续在上述RNase-free PCR管中加入如下混合液：
轻柔混匀，简易离心数秒；
④在PCR仪上按以下反应条件逆转录：
42°C 60min
70°C 15min
4°C holding
反应产物置于-20°C保存，-80°C可长期保存。
实验结果：以白血病志愿者外周血为材料，分离淋巴细胞后，抽提总RNA，将抽提出的总RNA取2μl，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，染色后在紫外灯下观察，并拍照，结果见图2。图2中，共2个测试样品，可见三条明显的条带，分别为核糖体5S、18S和28S RNA，说明总RNA抽提正常，无降解。
逆转录合成的cDNA包含了人全部抗体基因，为白血病单链抗体基因的克隆准备了起始材料。
实施例2：用PCR方法扩增抗体重链和轻链可变区基因
实验方法：
（1）引物设计：
根据GenBank中人类抗体基因序列，分别设计PCR扩增抗体重链、轻链可变区所需的引物(见表1)，共32条（序列如SEQ ID NO.1-32所示），委托上海生工生物工程有限公司合成。
表1.人免疫球蛋白可变区基因PCR扩增引物
注：B=C,G;K=G,T;M=A,C;R=A,G;S=G,C;W=A,T;Y=C,T
（2)用PCR方法扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)：
①在PCR管中依次加入以下试剂：
②另取一PCR管，用无菌双蒸水代替cDNA模板，其他试剂相同，为空白对照管；
③将上述混合液轻柔混匀，短暂离心数秒后置于PCR仪，设置如下反应参数：
④PCR反应完成后，每管分别取出5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定条带位置；
⑤PCR产物用10×DNA上样缓冲液混合，全部上样，电泳后切胶回收目的条带；用酶标仪测纯化PCR产物的浓度，-20°C保存。
实验结果：以cDNA为模板，分别将VH、Vλ和Vκ的多对引物混合后使用，设置55°C-65°C之间的6个温度梯度，进行PCR扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果见图3、图4和图5，M-为DNA分子量标准品，第1个通道为55°C，第6个通道为65°C，中间各差2°C的温度梯度；紫外光下均可在300bp-400bp之间看到明显的条带，VH为380bp左右，Vλ和Vκ在320bp左右，与预期相符。
实施例3：单链抗体(scFv)基因片段的组装和全长扩增
实验方法：
1)连接区（linker）和带限制性酶切位点引物的设计
将分开扩增的VH基因片段和VL基因片段中间通过一段linker序列连接起来，形成scFv基因。本实验linker参照(GGGGS)3的方案设计VH和VL可变区引物，5’端分别加上SfiI和NotI的酶切位点和数个保护碱基，3’端分别加上linker序列(见表2，序列如SEQ ID NO.33-64所示)。
表2.带连接区和限制性酶切位点的引物表
注：①linker序列和酶切位点用斜体下划线标出；②表中：B=C,G;K=G,T;M=A,C;R=A,G;S=G,C;W=A,T;Y=C,T
2)PCR扩增引入部分linker序列和酶切位点序列的VH和VL片段
分别测定纯化的VH和VL的DNA浓度，配制以下两个反应体系，分别扩增引入部分linker序列和酶切位点序列的VH和VL基因：
①VH基因linker序列和酶切位点序列的引入：
②VL基因linker序列和酶切位点序列的引入：
③由于不同的引物退火温度会有一定差异，因此，实验中将各组引物混合后使用温度梯度的方法，保证各条引物均能得到扩增。混合物轻柔混匀，短暂离心数秒，置于PCR仪，设置如下反应参数：
将上述PCR反应物分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收、纯化，测定DNA的浓度，-20°C保存。
3)VH和VL片段的组装和scFv片段的全长扩增
用SOE-PCR，将VH和VL片段连接成scFv：
①在无菌的PCR管中配制如下反应液：
②轻柔混匀，短暂离心后置于PCR仪，设置如下反应参数：
③取出PCR管，再加入如下试剂：
VHback-SfiI(10μM) 1μl
VLback-NotI(10μM) 1μl
10×PCR缓冲液(含Mg2+) 0.2μl
④置回PCR仪，设置如下反应参数：
⑤PCR反应完成后，每管分别取5μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，鉴定条带位置。
⑥将PCR产物全部上样，电泳后切胶回收目的条带，测纯化PCR产物浓度，-20°C保存。实验结果：将第一步PCR产物切胶回收后，进行第二部PCR，引入酶切位点SfiI和NotI。同样，分别将VH、Vλ和Vκ的多对引物混合后使用，设置60°C-70°C之间的6个温度梯度，进行PCR扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果分别见图6、图7和图8，M-为DNA分子量标准品，第2通道为60°C，第6通道为70°C，中间各差2°C的温度梯度；紫外光下均可在400bp左右位置看到明显的条带，其中，VH为430bp左右，Vλ和Vκ在370bp左右，与预期相符。
回收第二步PCR产物，扩增VH和VL基因，做SOE-PCR将VH和VL基因通过linker连接成完整scFv基因并扩增，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳；结果见图9，其中M-为DNA分子量标准，1-为样品，在紫外光下可在800bp位置看到明显的条带，与预期相符。
实验结果解释：linker序列和酶切位点已经装入VH和VL片段，通过SOE-PCR，将VH和VL片段连接成单链抗体（scFv）基因片段。
实施例4：scFv基因片段和载体DNA的连接、转化和单链抗体库的建立
实验方法：
1）scFv基因片段和载体DNA的双酶切
①限制性内切酶Sfi I的酶切反应：
分别用纯化的PCR产物和质粒小量制备的噬菌粒pCANTAB-5E载体（购自Pharmacia公司）配制两个反应体系：
分别轻柔混匀，短暂离心后置于PCR仪，50°C，3h。
②反应结束后，短暂离心，以DNA片段回收试剂盒回收，再进行限制性内切酶NotI消化；
③限制性内切酶NotI的酶切反应：
分别用回收的经sfiI酶切后的scFv片段和载体DNA配制两个反应体系：
分别轻柔混匀，短暂离心后置于PCR仪，37°C，3h。
④反应结束后，将酶切产物全部上样电泳，切胶回收载体DNA大片段，DNA片段回收试剂盒回收scFv基因，分别测定纯化后DNA的浓度。
2）scFv基因插入噬菌粒载体pCANTAB-5E的连接
将上述酶切并纯化后的scFv基因和载体DNA，进行连接反应。
①配制如下反应体系(scFv：载体的摩尔比=3:1-10:1)：
设置阴性对照管，加双蒸水代替scFv基因片段，轻柔混匀。
②将两管同时置于PCR仪，22°C连接30min。
3）连接产物转化E.coli TGl得到单链抗体库
①按分子克隆手册，制备电转感受态E.coil TGl（Stratagene公司购买）；
②取新制备12~24h之内或-80°C保存的电转感受态E.coil TGl，加入5μl连接产物，冰浴30min；
③将混合物转入预冷的电转杯，用吸水纸擦干电转杯外壁的冷凝水，使用1550V电压进行点电击；
④立即加入950μl、37°C预热的SOB液体培养基，取出后，150rpm，37°C培养1h以复苏细菌；
⑤每管取10μl，稀释至10-4、10-5、10-6、10-7，分别涂SOB-Amp-G平板，30°C培养过夜，以计算库容；
⑥其余菌液离心浓缩后，每个平板涂布100μl，30°C培养过夜；
⑦次日，观察转化结果，通过计算菌落数来初步估算库容。再2×YT液体培养基将菌落洗下，加无菌甘油(终浓度15％)，混匀后-80°C保存；
⑧共电转化100次，计算总库容。
实验结果及其分析：
经过100次转化，共获得库容为1.5×109的全人源噬菌体单链抗体库。
实施例5：全人源白血病单链抗体库的多样性分析
实验方法：随机挑取20株单克隆菌，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行插入区域的DNA序列测定。
实验结果：DNA序列测定分析可知插入率>99%，其中9株可以正确通读，经ClustaIW序列比对软件分析，比对结果见表3。
表3.ClustaIW序列比对分析结果
实验结果分析：随机挑取的克隆之间的DNA序列不同，证明该抗体库的多样性良好。
实施例6：从噬菌体抗体库中筛选全人源单链抗体
实验方法：使用白血病相关抗原CD33胞外区蛋白（CD33-ECD）筛选上述全人源白血病单链抗体库。用Na2CO3/NaHCO3将抗原稀释后，加入96孔ELISA板，4℃包被过夜。次日，封闭液封闭1h，加入噬菌体抗体库，37℃孵育2h。TBS洗涤（第一轮5遍，第二轮10遍，第三、四轮10遍）。用甘氨酸-盐酸（pH 2.2）洗脱并收集噬菌体，Tris-HCl中和至pH 7.0，侵染对数期E.coli TG1，37℃静置20min，取10μl测滴度。其余转至20ml 2×YT-A-G，37℃振摇培养至OD600nm达到0.5，然后加入辅助噬菌体,37℃振摇1h，离心，沉淀重悬于200ml2×YT-AK，30℃振摇过夜，次日，收集噬菌体。经过四轮淘筛后，测定筛选的效率，得到105倍的富集。最后一轮得到的克隆20个，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行scFv区域的DNA序列测定并进行单链抗体序列的结构分析。
实验结果及其分析：将获得的DNA序列，取能够正确通读的阅读框序列，输入VBASE2数据库（http://www.vbase2.org/），分析得到单链抗体序列分析结果（见表4）。结果表明，筛选得到的单链抗体的重链和轻链分别来自不同的人类基因；3号和4号完全相同，其重链和轻链分别来自于人humIGHV172和人humIGKV115；1号的重链为人humIGHV199，其轻链与3号和4号轻链来源相同；6号和7号轻链来源相同均为人humIGLV169，其余均来自不同的人类抗体基因家族。说明以上述人源单链抗体库为来源，用噬菌体展示的方法，经过特定靶抗原的筛选，可以获得特定的全人源单链抗体，可以用于抗体药物的开发。
表4.噬菌体单链抗体基因序列来源分析
实施例7：单链抗体与白血病细胞的特异结合作用分析
实验方法：将上述第四轮获得的3号噬菌体，经过噬菌体扩增后，进行免疫荧光实验，检测3号噬菌体展示的单链抗体与白血病细胞的结合特异性。
①取生长状态良好的白血病细胞株HL-60（靶抗原CD33阳性）和Jurkat（CD33阴性对照细胞）各3ml于6孔细胞培养板；
②分别加入1.5×1010噬菌体单链抗体（3号），混匀后37°C孵育3h；
③将细胞移至5ml EP管，用PBS洗涤两次，用1%BSA37°C封闭30min；
④分别加入100μl 1%BSA稀释后的一抗RabbitAnti-6×His tag antibody，4°C，孵育过夜；
⑤PBS洗涤两遍，5min/次，加入稀释后的二抗Goat anti-rabbit IgG-FITC conjugated，37°C，孵育1h；
⑥PBS洗涤两遍，5min/次，加20μl PBS重悬，滴一滴于干净载玻片，加盖玻片后，荧光显微镜下观察，并拍照。
实验结果及其分析：实验结果见图10，其中：（A）为HL-60细胞，（B）为Jurkat细胞。结果表明明，经免疫荧光检测，可见白血病HL-60细胞（靶抗原CD33阳性）呈现明显的绿色荧光，而对CD33阴性的Jurkat细胞无明显绿色荧光。说明用靶抗原从上述噬菌体抗体库中筛选得到的单链抗体可以与肿瘤细胞特异结合。
实施例8：单链抗体对白血病细胞的特异杀伤作用
实验方法：1）单链抗体在大肠杆菌中的表达和纯化取3号噬菌体，用PCR方法扩增单链抗体DNA片段，用Xho Ⅰ和Nde Ⅰ双酶切后克隆进入表达载体pET30a(+)，转化大肠杆菌BL21；重组菌株培养，加入IPTG至终浓度为0.5mM，在30℃条件下诱导表达5h,超声破碎后，经过12000rpm/10min离心，取上清过Ni柱进行纯化，用含100mM咪唑的平衡缓冲液洗脱目的蛋白，获得电泳纯单链抗体，用BCA法测定蛋白质浓度。
2）细胞毒性测定选用CD33阳性的髓系白血病细胞株HL-60和Kasumi-1，以及CD33阴性的白血病细胞Jurkat，在37℃和5%CO2的条件下培养至对数期；将细胞培养悬液离心，弃上清，收集细胞；用细胞培养液重悬细胞，并以5.0×103-1.0×104cells/孔的密度接种于96孔细胞培养板，在37℃和5%CO2的条件下培养24h；加入不同浓度的单链抗体scFv，孵育72h，每孔设3个复孔，以只加PBS的细胞做阴性对照；加cck-8溶液，37℃孵育1h；在470nm波长下测定吸光度值，并计算细胞在不同浓度的scFv作用下的生长抑制率。
实验结果：见图11，该单链抗体scFv可对HL-60和Kasumi-1细胞产生抑制作用，其中高浓度单链抗体scFv（0.25mg/ml）对Kasumi-1细胞的抑制作用达到50.2%，对HL-60细胞达到30.5%；中浓度单链抗体（0.12mg/ml）对Kasumi-1细胞的抑制作用达到34.0%，对HL-60细胞达到20.4%；低浓度单链抗体scFv（0.06mg/ml）对Kasumi-1细胞的抑制作用达到23.4%，对HL-60细胞达到16.6%；而对Jurkat细胞没有明显抑制作用。
结果说明：从该噬菌体抗体库中筛选得到的特异单链抗体可对CD33阳性的白血病HL-60和Kasumi-1细胞产生明显的生长抑制作用，而对CD33阴性的Jurkat细胞无抑制作用，表明该单链抗体具有靶向抗肿瘤作用。
综上所述，我们通过设计特定的引物，利用PT-PCR方法结合噬菌体展示技术，成功构建了库容为1.5×109的全人源白血病单链抗体库，该单链抗体库多样性良好。从该噬菌体单链抗体库中，可以经筛选获得特异的全人源单链抗体，可作为靶向药物用于白血病的治疗。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的部分参考文献：
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<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 重链VH4back引物
<400> 1
CAGGTGCAGC TGCAGGAGTC SG 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 重链VH5back 引物
<400> 2
CAGGTACAGC TGCAGCAGTC A 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>重链 VH6back 引物
<400> 31
CAGGTGCAGC TACAGCAGTG GG 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 重链VH10back 引物
<400> 4
GAGGTGCAGC TGKTGGAGWC Y 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 重链VH12back 引物
<400> 5
CAGGTCCAGC TKGTRCAGTC TGG 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 重链VH14back 引物
<400> 6
CAGRTCACCT TGAAGGAGTC TG 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 重链VH22back 引物
<400> 7
CAGGTGCAGC TGGTGSARTC TGG 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VL1back引物
<400> 8
CAGTCTGTSB TGACGCAGCC GCC 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VL3back引物
<400> 9
TCCTATGWGC TGACWCAGCC AC 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VL3/8back引物
<400> 10
TCCTATGAGC TGAYRCAGCY ACC 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VL4back引物
<400> 11
CAGCCTGTGC TGACTCARYC 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VL7/8back引物
<400> 12
CAGDCTGTGG TGACYCAGGA GCC 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VL9back引物
<400> 13
CAGCCWGKGC TGACTCAGCC MCC 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VL11back引物
<400> 41
TCCTCTGAGC TGASTCAGGA SCC 23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VL13back引物
<400> 15
CAGTCTGYYC TGAYTCAGCC T 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VL15back引物
<400> 16
AATTTTATGC TGACTCAGCC CC 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VK1back引物
<400> 17
GACATCCRGD TGACCCAGTC TCC 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VK2back引物
<400> 18
GAAATTGTRW TGACRCAGTC TCC 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VK9back引物
<400> 19
GATATTGTGM TGACBCAGWC TCC 23
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VK12back引物
<400> 20
GAAACGACAC TCACGCAGTC TC 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 重链VH1/2for引物
<400> 21
TGAGGAGACR GTGACCAGGG TG 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 重链VH3for引物
<400> 22
TGAAGAGACG GTGACCATTG T 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 重链VH4/5for引物
<400> 23
TGAGGAGACG GTGACCAGGG TT 22
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 重链VH6for引物
<400> 24
TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCC 23
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> IgMfor引物
<400> 25
GGTTGGGGCG GATGCACTCC 20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> IgGfor引物
<400> 26
SGATGGGCCC TTGGTGGARG C21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VL1/2for引物
<400> 27
TAGGACGGTS ASCTTGGTCC 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VL7for引物
<400> 28
GAGGACGGTC AGCTGGGTGC 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VK1for引物
<400> 29
TTTGATTTCC ACCTTGGTCC 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VK2/4for引物
<400> 30
TTTGATCTCC ASCTTGGTCC 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VK3for引物
<400> 31
TTTGATATCC ACTTTGGTCC 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 轻链VK5for引物
<400> 32
TTTAA TCTCC AGTCG TGTCC 20
<210> 33
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VH4back-sfiI
<400> 33
GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGGTGC AGCTGSWGSA GTCWGG 56
<210> 34
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VH5back-sfiI
<400> 34
GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGGTAC AGCTGCAGCA GTCA 54
<210> 35
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VH6back-sfiI
<400> 35
ATATGTGTGC CAGAGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGGTGC AGCTACAGCA GTGGG 55
<210> 36
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VH10Back-sifI
<400> 36
ATATGTGTGC CAGAGGCCCA GCCGGCCATG GCCGAGGTGC AGCTGKTGGA GWCY 54
<210> 37
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VH12Back-sifI
<400> 37
ATATGTGTGC CAGAGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGGTCC AGCTKGTRCA GTCTGG 56
<210> 38
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VH14back-sfiI
<400> 38
ATATGTGTGC CAGAGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGRTCA CCTTGAAGGA GTCTG 55
<210> 39
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VH22back-sfiI
<400> 39
ATATGTGTGCC AGAGGCCCAG CCGGCCATGG CCCAGGTGCA GCTGGTGSAR TCTGG 55
<210> 40
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VH1/2for-linker
<400> 40
GGAGCCGCCG CCGCCAGAAC CACCACCACC TGAGGAGACG GTGACCAGGG TKC 53
<210> 41
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VH3for-linker
<400> 41
GGAGCCGCCG CCGCCAGATC CTCCACCACC TGAAGAGACG TGACCATTG T 51
<210> 42
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VH4/5For-linker
<400> 42
GGAGCCGCCG CCGCCAGATC CACCACCACC TGAGGAGACG GTGACCAGGG TT 52
<210> 43
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VH6for-linker
<400> 43
GGAGCCGCCG CCGCCAGAAC CTCCTCCTCC TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCC 53
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物IgMfor-linker
<400> 44
GGAGCCGCCG CCGCCAGATC CACCACCACC GGTTGGGGCG GATGCACTCC 50
<210> 45
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物IgGfor-linker
<400> 45
GGAGCCGCCG CCGCCAGATC CACCACCACC SGATGGGCCC TTGGTGGARG C 51
<210> 46
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VL1back-linker
<400> 46
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCT CAGTCTGTSB TGACGCAGCC GCC 53
<210> 47
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VL3back-linker
<400> 47
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCT TCCTATGWGC TGACWCAGCC AC 52
<210> 48
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VL3/8back-linker
<400> 48
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCT TCCTATGAGC TGAYRCAGCY ACC 53
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VL4back-linker
<400> 49
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCT CAGCCTGTGC TGACTCARYC 50
<210> 50
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VL7/8back-linker
<400> 50
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCT CAGDCTGTGG TGACYCAGGA GCC 53
<210> 51
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VL9back-linker
<400> 51
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCT CAGCCWGKGC TGACTCAGCC MCC 53
<210> 52
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VL11back-linker
<400> 52
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCT CCTCTGAGCT GASTCAGGAS CC 52
<210> 53
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VL13back-linker
<400> 53
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCT CAGTCTGYYC TGAYTCAGCC T 51
<210> 54
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VL15back-linker
<400> 54
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCT AATTTTATGC TGACTCAGCC CC 52
<210> 55
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VL1/2for-notI
<400> 55
ACGTAGTTTA TGATCTGCGG CCGCTAGGAC GGTSASCTTG GTCC 44
<210> 56
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VL7for-notI
<400> 56
ACGTAGTTTA TGATCTGCGG CCGCGAGGAC GGTCAGCTGG GTGC 44
<210> 57
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物Vk1Back-Linker
<400> 57
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCC GACATCCRGD TGACCCAGTC TCC 53
<210> 58
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物Vk2Back-Linker
<400> 58
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCC GAAATTGTRW TGACRCAGTC TCC 53
<210> 59
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VK9back-linker
<400> 59
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCC GATATTGTGM TGACBCAGWC TCC 53
<210> 60
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VK12back-linker
<400> 60
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGATCC GAAACGACAC TCACGCAGTC TC 52
<210> 61
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物Vk1for-notI
<400> 61
ACGTCGTTCT TGTTCTGCGG CCGCTTTGAT TTCCACCTTG GTCC 44
<210> 62
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物VK2/4for-notI
<400> 62
GAGTCATTCT CGACTTGCGG CCGCTTTGAT CTCCASCTTG GTCC 44
<210> 63
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物Vk3for-notI
<400> 63
ACGTCGTTCA TGTTCTGCGG CCGCTTTGAT ATCCACTTTG GTCC 44
<210> 64
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 带连接区和限制性酶切位点的引物Vk5for-notI
<400> 64
GTGTAGTTCA TGATCTGCGG CCGCTTTAAT CTCCAGTCGT GTCC 44
Claims (2)
1.一种白血病单链抗体库，其特征在于：该抗体库含有全套人类抗体重链可变区VH和轻链可变区VL，及中间连接区linker序列为(GGGGS)3，有完整的抗原结合部位，以噬菌粒pCANTAB-5E为载体，库容达到1.5×109；所述抗体库通过以下步骤实现：
（1）总RNA提取和cDNA的合成：取白血病患者的血液，分离淋巴细胞，用裂解液裂解淋巴细胞，提取细胞总RNA，经逆转录PCR逆转录为cDNA；
（2）用PCR方法扩增抗体重链和轻链可变区基因：根据人类抗体基因序列，分别设计PCR扩增抗体重链、轻链可变区所需的特定引物，共32条，序列如SEQ ID NO.1-32所示；以步骤（1）获得的cDNA为模板，用PCR方法扩增可变区基因VH和VL，包括Vκ和Vλ；
（3）单链抗体scFv基因片段的组装和全长扩增：设计含有由四个甘氨酸和一个丝氨酸组成的重复3次的连接肽序列和酶切位点SfiI、NotI 的引物，在上述扩增的重链VH和轻链VL可变区基因的基础上，再经重叠PCR获得scFv基因；
（4）重组噬菌粒的构建：分别用SfiI、NotI双酶切scFv基因片段，将其插入噬菌粒载体pCANTAB-5E，构建重组噬菌粒，转化感受态E. coli TGl，经辅助噬菌体M13K07超感染，获得单次的噬菌体抗体库，经重复转化后，获得全人源白血病单链抗体库，库容达到1.5×109；
（5）单链抗体库的多样性分析：随机挑取多个单克隆菌，测定插入区scFv基因的DNA序列，经ClustaIW序列比对软件分析其序列的相似性，判断单链抗体库的多样性分析，证明其多样性良好；
其中构建抗体库的步骤（3）所述连接肽序列和酶切位点SfiI、NotI 的引物序列如SEQ ID NO.33-64所示。
2.根据权利要求1所述的一种白血病单链抗体库在制备白血病抗体药物中的应用，其特征在于通过以下步骤实现：用白血病相关抗原作为靶抗原，用噬菌体展示的方法，筛选全人源白血病单链抗体库，经过四轮“吸附-洗脱-扩增”的淘筛过程，筛选出抗白血病的特异性单链抗体，制备白血病抗体药物。
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| CN1293206A (zh) * | 2000-09-29 | 2001-05-02 | 杨丽娟 | 抗人胃癌单链抗体及其应用 |
| CN101210241A (zh) * | 2006-12-27 | 2008-07-02 | 陕西超英生物科技有限公司 | 一种噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法 |
-
2012
- 2012-11-23 CN CN201210484448.6A patent/CN102978713B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1293206A (zh) * | 2000-09-29 | 2001-05-02 | 杨丽娟 | 抗人胃癌单链抗体及其应用 |
| CN101210241A (zh) * | 2006-12-27 | 2008-07-02 | 陕西超英生物科技有限公司 | 一种噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 单克隆抗体药物与血液系统恶性肿瘤的治疗;范娜娜等;《中国细胞生物学学报》;20111231;第33卷(第9期);1015-1021 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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