JP2019526618A - 抗体ファージディスプレイライブラリー - Google Patents

Abstract

本発明は、ナイーブ抗体ファージディスプレイライブラリー（ＡＰＤＬ）、その抗体ファージディスプレイライブラリーを製造する方法、及びその抗体ファージディスプレイライブラリーから可溶なＦａｂとして製造可能な抗体を取得する方法を開示する。

Description

本発明は、バイオテクノロジーの分野に関係する。特に、本発明は、大きな抗体ファージディスプレイライブラリー、そのライブラリーに到達するための方法、及びそのライブラリーを介して抗原特異的なＦａｂを製造する方法に関する。

非ヒト宿主種を免疫して血清からポリクローナル抗体を生成するか、又はハイブリドーマ技術によってモノクローナル抗体を生成することによって、抗体の発見が可能になった（Kohler G and Milstein C, 1975）。しかし、免疫化による抗体発見のプロセスは、免疫化の生物学における不確実性に依存し、そして完全長の非ヒトＩｇＧしか得られない。更に、そのような非ヒトＩｇＧは、ヒト免疫系によって異物として認識され、抗種抗体をもたらす。抗原認識げっ歯類可変ドメインをヒト定常ドメインに移植する技術（−ｘｉｍａｂ）又はげっ歯類由来の相補性決定領域をヒト可変領域フレームワークに移植する技術（−ｚｕｍａｂ）、並びにヒトＩｇ遺伝子座のためのマウストランスジェニックの技術によって、抗種抗体生成の問題が軽減された。それにも関わらず、このヒト抗体産生方法は、特にヒトとげっ歯類との間でアミノ酸配列が高度に保存されている毒性抗原又はタンパク質標的である場合は、好ましくない。

この技術に代わるものとして、抗体ファージディスプレイライブラリー（ＡＰＤＬ）がある。抗体ファージディスプレイは、抗原特異的抗体の産生のために用いることができる技術である。ＡＰＤＬの初期の参考文献の１つは、ファージディスプレイの概念を最初に記載したGeorge P Smith（1985）に関する。ＡＰＤＬはインビトロ組換抗体合成技術を用い、この技術は、免疫グロブリン遺伝子セグメントのクローニングに依拠し、抗体のライブラリーが作製される。この技術では、抗体遺伝子又は遺伝子フラグメントをファージ遺伝子に融合させ、それによって抗体遺伝子が発現し、タンパク質をコーティングする融合物としてファージ表面上に表示されることが可能になる。

発現されたレパートリーをすべて表示してヒト抗体の大きなレパートリーを生成する能力によって、標的分子に対するバイオパニングの後に所望の特異性を有する個々の抗体の選択が可能になる。この技術を用いることで、インビトロ及びインビボの診断又はヒト疾患の免疫療法のための所望の結合親和性及び特異性を得るテーラーメイド抗体を合成し、選択することができる。この技術は、特にヒトタンパク質に相同なタンパク質のような困難な抗原に対する抗体の製造のために、免疫化の従来の抗体製造方法がしばしば失敗する分野のために有用である。

ファージディスプレイに一般的に用いられる抗体フォーマットは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）及びフラグメント抗体結合（Ｆａｂ）フラグメントを含む。ｓｃＦｖは、短い柔軟なリンカーを介して単一のポリペプチド鎖に融合した抗体分子の重鎖及び軽鎖のＶ領域を含む一価構造である。各Ｆａｂは単一の抗原結合部位を表示し、ジスルフィド結合によってＣ末端で互いに結合したＦｄ鎖（Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１−ヒンジフラグメント）及び軽鎖（Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ）からなる。

先行技術はある種のｓｃＦｖライブラリー及び合成ライブラリーを開示する。例えば、ＷＯ１９９２／００１０４７Ａ１はｓｃＦｖフォーマットの抗体ライブラリーを開示する。ｓｃＦｖフォーマットでファージミドベクターｐＨＥＮ１中にクローニングされたナイーブなヒトＩｇＭ供給源から構築された１０^７及び２×１０^７ｃｆｕのサイズ、並びにナイーブヒトＩｇＧ供給源からの５×１０^７ｃｆｕのライブラリーが開示される。アンバーサプレッサー宿主ＨＢ２１５１に形質転換されたファージミドベクターからのｓｃＦｖ及びＦａｂ抗体フラグメントの分泌、並びにポリクローナル抗体又はタグ特異的抗体を用いたウェスタンでのそれらの検出が開示される。しかし、ＷＯ１９９２／００１０４７Ａ１は、細菌培養物からのそのような分泌されたｓｃＦｖ又はＦａｂが目的の抗原に結合できるか否かに関しては開示していない。

ＵＳ６７９４１２８Ｂ２は、７．０×１０^９メンバーのｓｃＦｖファージ抗体ライブラリーを開示する。更に、ファージＥＬＩＳＡによる抗原上のライブラリーの選択及びバインダー（ｂｉｎｄｅｒ）の確認を開示する。しかし、そのような抗原特異的ＥＬＩＳＡについてスクリーニングされたサンプル数と対応するヒット数との間には著しい差があるようである。更に、ヒットしたものを、同種の抗原を認識することができる水溶性ｓｃＦｖに変換する割合は非常に低い。

ＵＳ６６９６２４８Ｂ１は、ヒト免疫グロブリンレパートリーのコンセンサス配列に基づく完全な合成ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬ）を開示する。用いられるフォーマットはｓｃＦｖフォーマットであり、１０^７と１０^８以上のメンバーの間で変化するライブラリーのサイズである。ＵＳ６６９６２４８は、精製ｓｃＦｖの５〜１０ｍｇ／ｌの収量を記載しているが、そのｓｃＦｖの親和性は記載されていない。

ＵＳ２００５／０１１９４５５Ａ１は、（ｉ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、（ｉｉ）ジッパードメインを有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖｚｉｐ）、（ｉｉｉ）Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ）、及び（ｉｖ）マイナーコートタンパク質（ｇＩＩＩ）のＣ末端ドメインにジッパードメインが融合したＦａｂフラグメント（Ｆａｂｚｉｐ）を開示している。更に、ポリペプチドは融合タンパク質としてウイルス粒子の表面上に発現され、その表面上で重鎖可変ドメインがウイルスのコートタンパク質の一部に融合する。ＵＳ２００５／０１１９４５５は更に、ｓｃＦｖフォーマットで１０^１１のポリペプチド配列又は抗体可変配列の表示を記載する。Ｌ３／Ｈ３の多様性を有するＦ（ａｂ’）_２ライブラリーの構築、並びにＨ１／Ｈ２／Ｈ３の多様性を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２ライブラリーの構築の両方がまた開示されている。しかし、そのようなライブラリーに到達する方法は提供されておらず、また、ライブラリーのサイズも本公報に記載されていない。

ＵＳ２００５／０１６４１８０Ａ１は、発現を増強するためにＣＤＲ領域で変異したＶ_Ｈ部分を有するヒトモノクローナル抗体ＢＴ３２／４６に由来するｄＡＢ（単一重鎖ドメイン抗体フラグメント）ファージライブラリーを生成する方法を開示する。この明細書には、２．４×１０^１０ｃｆｕのライブラリーサイズが開示されている。

ＫＲ２００９／１００９６１３９２は、フレームワークとしてＶ_Ｈ３−２３／Ｖ_Ｌｌｇ遺伝子及びファージディスプレイベクターｐＦＤＶを用いて、抗体ファージ表面ディスプレイライブラリーを作製する方法を開示する。切断されたサブライブラリーとｐＦＤＶベクターとの間のＳｆｉＩ部位での連続重合によって、ＡＥ（２．１×１０^９ｃｆｕ）、ＢＥ（２．７×１０^９ｃｆｕ）、ＣＦ（１．１×１０^９ｃｆｕ）及びＤＦ（１．７×１０^９ｃｆｕ）のサブライブラリーからなるｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーを得た。ＥＬＩＳＡを実施してヒットを示すための複数ラウンドのパニングからの株ＥＲ２５３７の単一コロニーからのペリプラズムのホウ酸抽出物は開示されている。しかし、そのヒットに対するスコア比及び親和性の推定は開示されていない。

ＵＳ２００９／００５４２５４Ａ１は、Ｂ細胞のサブセットからＲＮＡを単離することによって免疫グロブリンライブラリーを作製する方法を提供する。同公報は、以下の工程ａ）〜ｆ）を含む、免疫グロブリンライブラリーを作製する方法を開示する。ａ）本質的にＩｇＭメモリーＢ起源のＢ細胞のサブセットを単離すること、ｂ）このＢ細胞のサブセットからＲＮＡを単離すること、ｃ）単離したＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること、ｄ）ｃＤＮＡの免疫グロブリン配列を増幅すること、ｅ）増幅された免疫グロブリン配列をベクターに挿入すること、及びｆ）宿主細胞を増幅された配列を含むベクターで形質転換して免疫グロブリンライブラリーを得ること。開示されたフォーマットはｓｃＦｖ及びＦａｂの両方であるが、開示されたライブラリーのサイズはｓｃＦｖフォーマット（１０^７ｃｆｕ）についてのみである。

ＵＳ２０１１／２３６３７２Ａ１は、ｓｃＦｖフォーマットの合成抗体ライブラリーを開示する。この明細書は、全ライブラリーサイズが１０^９個の個々のクローンより大きいことを開示しており、そのうちの約８０％が細菌の上清中にｓｃＦｖを分泌することができると決定された。

したがって、先行技術は主として、ｓｃＦｖフォーマットで抗体ファージディスプレイライブラリーを製造する方法に関する。しかし、これらの方法は、Ｆａｂフォーマットの超大型のナイーブライブラリーを開示していない。抗体ファージディスプレイライブラリーを作製するためにＦａｂフォーマットを使用することは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）のような他のフォーマットのファージディスプレイと比較すると、一定の利点を提供する。Ｆａｂファージディスプレイライブラリーの利点は、そのようなライブラリーからの抗原選択Ｆａｂが水に溶解したタンパク質として高い安定性を有することである。対照的に、一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）フォーマットの抗体は、凝集体を形成する傾向があり、より長い期間で比較的不安定である（Weidner KM et al., 1992; Holliger P et al., 1993; Kortt et al., 1997; Quintero-Hernandez V et al., 2007）。更に、ｓｃＦｖは、対応するＦａｂフラグメントと比較して１桁低い親和性を示し得る。

ある先行技術はナイーブヒトＦａｂライブラリーを開示する。例えば、ＥＰ２０６７７８８Ａ２は、４．３×１０^１０個の個々のクローンを有するナイーブヒトＦａｂライブラリーを開示する。ＥＰ２０６７７８８Ａ２は更に、ペリプラズム抽出物を用いて抗原特異的ヒットをスコアリングすることを開示する。ただし、ペリプラズム抽出からのヒットスクリーニングのために引用された方法は、ｓｃＦｖではなくＦａｂのペリプラズム抽出を可能にするようには設計されていない。

入手可能な引用文献から、小さいサイズ（１０^８〜１０^９クローン）のライブラリーを得ることは容易であるが、哺乳動物の免疫多様性の理論的限界（１０^１４並べ替え）であるサイズのライブラリーを得ることは全く容易ではないことは明らかである。更に、組換え抗体のアセンブリ及び発見プロセスに固有の欠陥、並びに非組換型（野生型）ファージ、又は組換ファージに対する部分的な組換ファージ（寄生虫ファージ）を増殖させる傾向があるファージの生物学的性質のために、偽陽性又はバインダーが全く生じない可能性は非常に高いままである。したがって、本発明はこの欠点を克服するために導かれた。

ライブラリーのフォーマットに関わらず、抗体ライブラリーからバインダーを選択するためにバイオパニングを使用することができる。バイオパニングは、ポリスチレン等の固体表面に純粋な抗原を固定化し、又は純粋な抗原をビオチン化してストレプトアビジンコートポリスチレン表面に固定化し、続いて様々なフォーマットのＦｖドメインを提示するファージに曝露することによって、インビトロで行うことができる。バイオパニングはまた、ストレプトアビジンコート磁性マイクロビーズ上のビオチン化抗原をキャプチャーし、続いて様々なフォーマットのＦｖドメインを提示するファージに曝露することによって、インビトロで行うことができる。後者のアプローチは液相でパニングを実行することができるという利点を有し、反応平衡及び動力学を支配する法則が遥かに確信的に適用され、望ましい親和性及び熱力学的特性を有するバインダーが引き出される。バイオパニングはまた、生細胞の表面若しくは内部に存在する標的抗原に対して、又は脂質二重層中で安定化された細胞表面受容体等の抗原に対して行うことができる。

バイオパニングのプロセスにおいて、所与の抗原に対する特異的バインダーの数は、ファージ集団中に存在するすべての非特異的バインダー（バックグラウンド）のごくわずかな割合である。それゆえ、バックグラウンドから特異的結合亜集団を濃縮するためには、何回かのラウンドのパニングが必要である。更に、各ラウンドのパニングでキャプチャーされたごく一部の特定のバインダーは、次ラウンドのパニングを行うことができるようにするために、Ｆ^＋宿主での形質導入によるこれらバインダーの増幅を必要とする。しかし、これらの増幅サイクルは、成長の利点を有する任意のゲノム（ファージ複製ｏｒｉを有する）を増殖させる可能性を有する。オープンリーディングフレーム内により短いゲノム又は翻訳終止コドンを含むファージはそのような利点を有するようである。この生物学的事実は、特にほとんどのファージが初めから尾が無い（ｂａｌｄ）、ファージミドライブラリーに由来するファージの場合には、真正のバインダーの回収及び分析を複雑にする可能性がある。

先行技術で論じられている様々なバイオパニング方法は、ファージクローンを標的抗原とインキュベートし、続いて標的抗原に結合したファージを様々な溶出戦略で回収することを含む。更に、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン及びＳＰＲによる親和性評価のための方法が先行技術に開示されているが、所望の製造可能性特性を有する標的抗原に対する抗体の最適な収量を得るための的確な方法は開示されていない。

したがって、多様な既存の抗体ファージディスプレイライブラリー及びそれらの製造方法が、それらの主要な目的としての多様性キャプチャーと共に、モノクローナルリードの同定又は製造可能性の側面に固有の問題にほとんど又は全く注意を払わずに、記載されている。それ故、大きな抗体ファージディスプレイライブラリー及びそれらから再現可能に、確信的に、迅速に抗体を製造する方法を開発する必要がある。本発明は、商業的に実行可能であり、短期間で製造することができる、大きく高度に多様な抗体ファージディスプレイライブラリーを製造する方法を提供する。本発明は、大きな抗体ファージディスプレイライブラリーを作製する新規な方法、並びに確立されたバイオテクノロジーのツールを用いた製造に適したそのライブラリーからの抗体の回収を提供する。

ＷＯ１９９２／００１０４７Ａ１ ＵＳ６７９４１２８Ｂ２ ＵＳ６６９６２４８Ｂ１ ＵＳ２００５／０１１９４５５Ａ１ ＵＳ２００５／０１６４１８０Ａ１ ＫＲ２００９／１００９６１３９２ ＵＳ２００９／００５４２５４Ａ１ ＵＳ２０１１／２３６３７２Ａ１ ＥＰ２０６７７８８Ａ２

本発明の課題は、治療目的及び診断目的としての使用のための大きな抗体ファージディスプレイライブラリーを作製することである。

本発明は、５．３８×１０^１０〜２．５５×１０^１１（１．２６×１０^１１）ｃｆｕのκライブラリー及び７．３３×１０^１０〜３．５９×１０^１１（１．７９×１０^１１）ｃｆｕのλライブラリーを含む、８．８６×１０^１０〜９．１３×１０^１１（３．０６×１０^１１）ｃｆｕの範囲のサイズを有するナイーブ抗体ファージディスプレイライブラリー（ＡＰＤＬ）を開示する。

本発明は、免疫レパートリーのキャプチャーが以下の工程を含む、ＡＰＤＬを製造する方法：
ｉ）ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成、
ｉｉ）配列番号１〜２３及び４２〜５４を含むプライマーを用いたＶ_Ｌ（λ及びκ）ドメイン及びＶ_Ｈドメインの増幅、
ｉｉｉ）配列番号２４〜２６を用い、そして配列番号２７〜３１を含むプライマーを用いたＣドメインの増幅、
ｉｖ）配列番号３０、３２、３５〜３７及び５５を含むプライマーを用い、それぞれ工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）から得られたＶ_κドメイン及びＣ_κドメイン並びにＶ_λドメイン及びＣ_λドメインの融合による軽鎖のオーバーラップＰＣＲ、
ｖ）配列番号２８及び３３を含むプライマーを用い、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）から得られたＶ_Ｈ及びＣ_Ｈ１の融合物から得られた重鎖のオーバーラップＰＣＲ、
ｖｉ）Ｆａｂを得るための、配列番号３２、３４、３５〜３７及び５５を含むプライマーを用い、工程（ｉｖ）及び工程（ｖ）からそれぞれ得られた軽鎖及び重鎖のオーバーラップＰＣＲ、
ｖｉｉ）各工程でアンプリコンを精製すること、を開示する。

本発明はまた、以下の工程を所定の順序で含む、抗体ファージディスプレイライブラリーから可溶性Ｆａｂとして製造可能な抗体を得る方法：
ｉ）標的特異的パニング、
ｉｉ）ペリプラズムの定量的ＥＬＩＳＡ（ｑＥＬＩＳＡ）、
ｉｉｉ）動力学的ランク付け、
ｉｖ）バイオアッセイ、
ｖ）製造可能性の評価、
これらの結果、動力学的ランク付けの後に得られた抗体において期待される９０％を超える遺伝子型相関の表現型となること、を開示する。

図１は、単離されたＰＢＭＣから抽出された全ＲＮＡの品質の確認を表す。 図２は、Ｓｓｏ Ｆａｓｔ Ｅｖａｇｒｅｅｎにおける可変及び定常遺伝子増幅を示す。パネルＡ及びＢは、それぞれ増幅曲線及び融解曲線のピークを示す。パネルＣのレーン２、３及び４は、それぞれ定常遺伝子プライマー、すなわち配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３０、及び配列番号２７／配列番号２８を用いたテンプレートとしてのλ、κ及び重鎖定常合成遺伝子のＰＣＲ生成物（２０ｎｇ／２５μｌ反応）を含む。レーン５、６及び７は、それぞれλ、κ及び重鎖可変プライマー、すなわち配列番号１４／配列番号２３、配列番号９／配列番号１３、及び配列番号１／配列番号７を用いたテンプレートとしてのｃＤＮＡのＰＣＲ生成物（２０ｎｇ／２５μｌ反応）を含む。レーン１は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓからの１ｋｂプラスＤＮＡマーカーを含む。ＰＣＲ生成物を、０．０１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ中でキャストした１．２％ゲル上で、５Ｖ／ｃｍで９０分間泳動させた。 図３は、最適化されたＰＣＲ緩衝液とＤＮＡポリメラーゼとの組合せを用いたヒト抗体可変遺伝子の増幅性の試験を示す。９４℃で５分間の予熱後、９４℃で１５秒間の変性工程、７２℃で４５秒間の同時アニーリング及び伸長工程、続いて７２℃で１０分間の伸長及びニックシール工程の反応を３０回サイクルした。パネルＡ：重鎖Ｖ遺伝子；レーン３、５、７、９、１１及び１３は、リバースプライマー配列番号７を用いた６つのフォワードプライマー（配列番号１〜６）からの生成物を含む。レーン２、４、６、８、１０及び１２は、それらのそれぞれのネガティブコントロール（テンプレートなし）を含む。レーン１５、１７、１９、２１、２３及び２５は、リバースプライマー配列番号８を用いた同じフォワードプライマーセットからの生成物を含む。レーン１４、１６、１８、２０、２２及び２４は、それらのそれぞれのネガティブコントロール（テンプレートなし）を含む。パネルＢ：κＶ遺伝子；レーン３、５、７及び９は、リバースプライマー配列番号１３を用いた４つのκフォワードプライマー（配列番号９〜１２）からの生成物を含む。レーン２、４、６及び８はそれらのそれぞれのネガティブコントロール（テンプレートなし）を含む。レーン１０は空であった。パネルＣ：λＶ遺伝子；レーン３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９は、リバースプライマー配列番号２３を用いた９つのフォワードプライマー（配列番号１４〜２２）からの生成物を含む。レーン２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８は、それぞれのネガティブコントロール（テンプレートなし）を含む。レーン１は１ｋｂプラスＤＮＡマーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む。すべてのＰＣＲ生成物を、０．０１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ中でキャストした１．２％ゲル上で、５Ｖ／ｃｍで９０分間泳動させた。 図４は、全てのＶ_λプライマー対の最適化された増幅条件の再試験を示す。全ての増幅は、Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＳ及びＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ緩衝液を用いて実施した。プライマー対は、リバースプライマー配列番号２３を用いた配列番号１４〜２２である。投入ｃＤＮＡは反応５０μｌ当たり５０ｎｇであった。９４℃で５分間の予熱後、９４℃で１５秒間の変性工程、７２℃で４５秒間の同時アニーリング及び伸長工程、続いて７２℃で１０分間の伸長及びニックシール工程の反応を３０回サイクルした。偶数番号のレーンは、リバースプライマー配列番号２３を用いたそれぞれのレーン上に記載のＶ_λフォワードプライマーに由来する生成物を含む。奇数番号のレーンはそれぞれのネガティブコントロール（テンプレートなし）を含む。ＭはＦｅｒｍｅｎｔａｓからのＧｅｎｅｒｕｌｅｒ １ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。すべてのＰＣＲ生成物を、０．０１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ中でキャストした１．２％ゲル上で、５Ｖ／ｃｍで９０分間泳動させた。 図５は、全てのＶ_κプライマーによる増幅を示す。パネルＡの反応は、Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＳ及びＰｆｕ緩衝液を用いて増幅した。レーン２及び４は、リバースプライマー配列番号１３を用いたそれぞれプライマー配列番号９及び１０からの生成物を含む。レーン１及び３は、それらのそれぞれのネガティブコントロール（テンプレートなし）を含む。パネルＢ及びＣは、配列番号１１及び１２によるより良好な増幅を得るための酵素−緩衝液マトリックスを示す。ＰＣＲ ＥｘｔｅｎｄｅｒポリメラーゼＢｌｅｎｄを用いて両方のパネルの反応を増幅した。パネルＢは配列番号１１による増幅を示し、パネルＣは配列番号１２による増幅を示し、両方ともリバースプライマー配列番号１３と対をなした。９５℃で５分間の予熱後、９４℃で１５秒間の変性工程、６０℃で３０秒間のアニーリング工程、７２℃で３０秒間の伸長工程、続いて７２℃で１０分間の伸長及びニックシール工程の反応を３０回サイクルした。レーン２、４、６及び８は、それぞれＡｄｖａｎｔａｇｅ ２緩衝液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＳＡ緩衝液、ＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ緩衝液、及びＴｕｎｉｎｇ緩衝液を用いるＰＣＲ生成物を含む。レーン１、３、５及び７は、それぞれのネガティブコントロール（テンプレートなし）を含む。投入ｃＤＮＡは全てのパネルで反応５０μｌ当たり５０ｎｇであった。ＭはＦｅｒｍｅｎｔａｓからのＧｅｎｅｒｕｌｅｒ １ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。すべてのＰＣＲ生成物を、０．０１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ中でキャストした１．２％ゲル上で、５Ｖ／ｃｍで９０分間泳動させた。 図６は、全てのＳｃｒｉｐｐｓ Ｖ_Ｈプライマー対を用い、最適化されたＰＣＲ緩衝液及びＤＮＡポリメラーゼの組合せを用いたＶ_Ｈ遺伝子の増幅の試験を示す。上のパネルはＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＳＡ緩衝液中で行われた反応を示し、下のパネルはＴｕｎｉｎｇ緩衝液中で行われた反応を示す。用いた酵素は全ての反応についてＰｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＳポリメラーゼであった。レーン１〜１２は、リバースプライマー配列番号７を用いた６つ全てのＶ_Ｈセンスプライマー（配列番号１〜６）を含む。レーン１３〜２４は、リバースプライマー配列番号８を用いた６つ全てのＶ_Ｈセンスプライマーを含む。反応５０μｌ当たりの投入ｃＤＮＡ量は５０ｎｇであった。偶数番号のウェルは、上記のそれぞれのプライマーからの生成物を含む。奇数番号のウェルはそれぞれのネガティブコントロール（テンプレートなし）を含む。ＭはＦｅｒｍｅｎｔａｓからのＧｅｎｅｒｕｌｅｒ １ｋｂプラスＤＮＡラダーである。 図７は、全ての定常ドメインプライマー（Ｃ_κ、Ｃ_λ、Ｃ_Ｈ）の増幅を確認するための最適化された酵素−緩衝液マトリックスの適用を示す。全ての反応は、Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＳポリメラーゼ及びＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ緩衝液を用いて増幅された。入力ＤＮＡ濃度は５０μｌの反応当り５０ｎｇであった。レーン１は、プライマー対の配列番号２９／配列番号３０を用いて増幅されたテンプレートとしての配列番号２６に由来する生成物を含む。レーン２は、プライマー対の配列番号３１／配列番号３０を用いて増幅されたテンプレートとしての配列番号２５に由来する生成物を含む。レーン３は、プライマー対の配列番号２７／配列番号２８を用いて増幅されたテンプレートとしての配列番号２４に由来する生成物を含む。ＭはＦｅｒｍｅｎｔａｓからのＧｅｎｅｒｕｌｅｒ １ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。すべてのＰＣＲ生成物を、０．０１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ中でキャストした１．２％ゲル上で、５Ｖ／ｃｍで９０分間泳動させた。 図８は、Ｖ_λＣ_λの第１のオーバーラップＰＣＲを改善するための投入ＤＮＡ濃度対様々なポリメラーゼ濃度のマトリックスを示す。Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼ及びＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＳＡ緩衝液を用いて、すべての反応を実施した。投入ＤＮＡは、反応５０μｌ当たり精製されたＶ_λ及びＣ_λ生成物に対して等モルであった。プライマー対は、配列番号３２／配列番号３０であった。パネルＡ、Ｂ及びＣは、それぞれ１０、２５及び５０ｎｇの投入ＤＮＡの結果を示す。偶数番号のレーンは、それぞれのレーンの上に記載された酵素濃度（０．２５×、０．５×、０．７５×及び１×）からの生成物を含む。奇数番号のレーンは、それぞれのネガティブコントロール（テンプレートなし）を含む。ＭはＧｅｎｅｒｕｌｅｒ １ｋｂプラスＤＮＡマーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）である。 図９は、Ｖ_ＨＣ_Ｈ１の第１のオーバーラップ生成物の最適化のための酵素緩衝液のマトリックスを示す。パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦは、それぞれＡｄｖａｎｔａｇｅ ２緩衝液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＳＡ緩衝液、Ｅｘａｃｔポリメラーゼ緩衝液、ＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ緩衝液、Ｔｕｎｉｎｇ緩衝液、及びＶｅｎｔ緩衝液におけるＰＣＲ生成物を示す。Ｖ_ＨＣ_Ｈ１オーバーラップのためのプライマー対は、配列番号３３／配列番号２８である。Ｖ_Ｈのための投入ＤＮＡ濃度は５０ｎｇであり、等モル量のＣ_Ｈ１をオーバーラップ反応に使用した。レーン２、４、６、８、１０、１２及び１４は、それぞれＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼ、Ｅｘａｃｔポリメラーゼ、Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＳ酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ、ＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、及びＤｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼに由来する生成物を含む。レーン１、３、５、７、９、１１及び１３は、それぞれのネガティブコントロール（テンプレートなし）を含む。ＭはＦｅｒｍｅｎｔａｓからのＧｅｎｅｒｕｌｅｒ １ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。 図１０は、最終Ｆａｂ生成物の増幅のための酵素緩衝液のマトリックスを用いたＳＯＥ ＰＣＲメガプライマー戦略を示す。プライマーを各５０ｎｇの第１のオーバーラップ生成物に添加せずに、最初の１５サイクルを実施した。１５サイクルの後、プライマー対の配列番号３２及び配列番号３４を追加して更に３０サイクルを行った。パネルＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、それぞれＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＳＡ緩衝液、Ｅｘｐａｎｄ ＬＴ緩衝液、ＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ緩衝液、及びＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液における増幅を示す。レーン２、４、６及び８は、それぞれＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼＭｉｘ、Ｅｘｐａｎｄ ＬＴポリメラーゼ、ＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ酵素、及びＤｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼを使用して得られた増幅生成物を示す。レーン１、３、５及び７は、それぞれネガティブコントロール（テンプレートなし）を含む。ＭはＦｅｒｍｅｎｔａｓからのＧｅｎｅｒｕｌｅｒ １ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。 図１１は、最終Ｆａｂ生成物の増幅のための酵素緩衝液のマトリックスを用いた２工程ＰＣＲ戦略を示す。プライマー対は、それぞれ５０ｎｇの第１のオーバーラップ生成物を有する配列番号３２及び配列番号３４であった。パネルＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、それぞれＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＳＡ緩衝液、Ｅｘｐａｎｄ ＬＴ緩衝液、ＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ緩衝液、及びＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液における増幅を示す。レーン２、４、６及び８は、それぞれＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼＭｉｘ、Ｅｘｐａｎｄ ＬＴポリメラーゼ、ＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ酵素、及びＤｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼから由来する増幅生成物を示す。レーン１、３、５及び７は、それぞれネガティブコントロール（テンプレートなし）を含む。ＭはＦｅｒｍｅｎｔａｓからのＧｅｎｅｒｕｌｅｒ １ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。 図１２は、ｐＣＯＭＢ３ＸＳＳの環状プラスミドマップを示す。 図１３は、ｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターのＳｆｉＩ消化を示す。パネルＡは、バンド切断前のＳｆｉＩで消化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクター及びスタッファーフラグメントを示す。パネルＢは、所望のバンドが切断された後の同じゲルを示す。レーン２は、切断されていないｐＣＯＭＢ３ＸＳＳを含む。レーン４〜１５はＳｆｉＩで消化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳを含む。上側のバンドは３．３ｋｂのベクター骨格である。下側のバンドは１．６ｋｂのスタッファーフラグメントである。１０Ｕ／μｇのＳｆｉＩ酵素を用いて５０℃で一晩消化した。ＭはＦｅｒｍｅｎｔａｓからの１ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。 図１４Ａは、連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）混合物の熱不活性化の効果を示す。パネルＡは、熱不活性化なしの１：０．３５連結混合物からの形質転換体の数を示す。パネルＢは、熱不活性化処理を伴う同じ１：０．３５連結混合物についての形質転換体の数を示す。形質転換のために、ＴＧ１細胞２５μｌ当たり、未処理又は熱不活性化の連結混合物のいずれかからのストレート（未希釈）の１μｌをエレクトロポレーションし、エレクトロポレーション後に１、１０及び１００μｌの培養物を蒔いた。便宜上、１：０．３５連結比についてのみ、データを示す。他の２つの連結比（１：１及び１：３．５）もまた同じ傾向であるが、より濃い固まりにもつれた（ｍａｔｔｅｄ）成長を伴う。 図１４Ｂは、ベクターのバックグラウンドの計算を示す。パネルＡは、インサートなしで１４０ｎｇのベクターのみを添加したベクターコントロール連結を示す。パネルＢは、１：１の熱不活性化連結混合物のプレートを示す。１μｌのプレーティング体積についてのみ、データが示されている。 図１５は、ＳｆｉＩ消化によるＴＯＰＯ−Ｆａｂクローンの確認を示す。全ての反応はそれぞれのＴＯＰＯ−Ｆａｂクローンからのミニプレッププラスミド１μｇを含む。２０μｌの反応において、ＤＮＡ１μｇ当たり５ＵのＳｆｉＩを含むＮＥＢ緩衝液４中で消化を行った。レーンの上の数字はそれぞれのクローン番号を示す。サンプルを、０．１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む１×ＴＢＥ中の１％の分析グレードのアガロースゲル中、５Ｖ／ｃｍで１．５時間泳動させた。Ｍは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓからの１ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。矢印は、ＳｆｉＩ消化後に放出された１．５ｋｂのＦａｂバンドを示す。 図１６は、連結可能なＳｆｉＩ末端を有するＦａｂを放出するための自己環化の概念を説明する概略図を示す。 図１７は、自己連結戦略による直鎖状ＦａｂのＳｆｉＩ消化を示す。用いたＦａｂは、ＴＯＰＯ−Ｆａｂクローンから単離したプラスミドから増幅した単一型のものであった。レーン２、３及び４は、ＰＣＲ増幅Ｆａｂ生成物、自己連結後のＦａｂ及びＳｆｉＩ消化後のＦａｂのそれぞれ１μｇを含む。生成物を、０．１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ中で調製した１％アガロースゲル上で分析し、５Ｖ／ｃｍで１．５時間泳動させた。Ｍは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓからの１ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。左側の数字は塩基対のマーカーサイズを示す。 図１８は、単一のＦａｂ集団に対する第１の自己連結試験の結果を示す。パネルＡはベクターコントロールプレートを示す。パネルＢは自己連結Ｆａｂのものを示す。パネルＣはスタッファーコントロールである。１μｌのプレーティング体積からのプレートが示される。 図１９は、多様なＦａｂ集団に対する自己連結試験の結果を示す。パネルＡはベクターコントロールプレートを示す。パネルＢは自己連結戦略によって調製されたλＦａｂプールを示す。パネルＣはスタッファーコントロールプレートを示す。 図２０は、自己連結ライブラリークローンの特徴付けを示す。パネルＡはκ自己連結クローンのＰＣＲ増幅を示す。パネルＢはλ自己連結クローンのＰＣＲ増幅を示す。各レーンに１０μｌのＰＣＲ生成物をロードした。パネルＣはκ自己連結クローンのＳｆｉＩ消化パターンを示す。パネルＤはλ自己連結クローンのＳｆｉＩ消化パターンを示す。パネルＣ及びＤのすべてのレーンは、それぞれのクローンから単離された１μｇのＳｆｉＩ消化されたプラスミドＤＮＡを含む。レーンの上の数字はクローン番号を示す。分析は、０．１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ中で調製した１％アガロースゲル上で行い、５Ｖ／ｃｍで１．５時間泳動させた。ＭはＦｅｒｍｅｎｔａｓからの１ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。左側の数字は塩基対のマーカーサイズを示す。 図２１は、κ及びλＦａｂクローンのＢｓｔＮＩ分析を示す。全てのレーンは４０μｌのＢｓｔＮＩ消化反応を含む。上部パネルはκＦａｂのフィンガープリントを示し、下部パネルはλＦａｂのフィンガープリントを示す。画像は、１×ＴＢＥ中でキャストし、４Ｖ／ｃｍで３時間泳動させた臭化エチジウム染色された３％アガロースゲルを表す。レーンの上の数字はそれぞれのクローン番号を示す。Ｍは１ｋｂプラスＤＮＡマーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）である。左側の数字は塩基対のマーカーサイズを示す。 図２２は、配列決定された全てのλＦａｂのＣｌｕｓｔａｌＷ報告を示す。λＦａｂのヌクレオチド配列をｐＣＯＭＢ３ＸＳＳと比較して、ＳｆｉＩの存在及び５’末端及び３’末端の両方における完全性を検証した。 図２３は、単位体積当たりのＤＮＡ濃度の増加、及びＰＥＧ８０００の使用によって自己連結法を改善するプロセスを示す。レーン２はリン酸化されたＦａｂプールのみを含む。レーン４、５及び６は１６℃で１６時間のインキュベーション後の連結混合物のサンプルを含む。等量（２μｇ）の全てを視覚的比較のためにロードした。レーン４は標準の８３ｎｇ／μｌの連結反応からのサンプルを含む。レーン５は６％ＰＥＧを補充した標準反応を含む。レーン６は２００ｎｇ／μｌのＤＮＡを含有し、６％ＰＥＧを補充した連結反応のサンプルである。レーン１と３は空である。ＭはＦｅｒｍｅｎｔａｓからの１ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。左側の数字は塩基対のマーカーサイズを示す。左側のパネルは、０．１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む１×ＴＢＥ中で調製され、５Ｖ／ｃｍで１．５時間泳動させた１％アガロースゲルの落射蛍光画像を示す。右の画像は同じものの写真ネガである。 図２４Ａは、細胞対ＤＮＡの比のタイトレーション実験の写真による証拠を示す。１：２５０００希釈からのプレートが示されている。 図２４Ｂは、表３７に列挙された細胞対ＤＮＡの比のタイトレーション実験のグラフを表す。 図２５は、最終の大きなＦａｂライブラリー作製のための直鎖状Ｆａｂの自己連結を示す。パネルＡ及びＢはそれぞれκＦａｂ及びλＦａｂの落射蛍光画像を示す。パネルＣはλＦａｂゲル（パネルＢ）の写真ネガである。レーン２は５００ｎｇのＦａｂプールを単独で含む。レーン４は１６℃で１６時間のインキュベーション後のＦａｂ自己連結混合物の１μｇのサンプルを含む。レーン６はＳｆｉＩで消化され塩精製され自己連結された連結混合物を含む。レーン３と５は空である。ＭはＦｅｒｍｅｎｔａｓからの１ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。左側の数字は塩基対のマーカーサイズを示す。サンプルを、０．１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ中で調製した１％アガロースゲル中で５Ｖ／ｃｍで１．５時間泳動させた。 図２６は、２つの最終オーバーラッププライマー、配列番号３２及び配列番号３４の配列及び対アラインメントを示す。上部パネルは、配列番号と共にプライマー配列及び方向を示す。Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ又はＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１テンプレートに整列する部分は太字である。突出部分は通常のフォントである。配列番号３２中のＳｆｉＩ及びＳａｃＩ部位はイタリックである。下のパネルは、６６．７％の類似性指数でＭａｒｔｉｎｅｚ−Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いた２つの配列の対アラインメントを示す。 図２７は、ＰＣＲで組み立てられたκＦａｂプールの従来のＳｆｉＩ消化を示す。ＳｆｉＩで消化されたすべてのＰＣＲオーバーラップ生成物を、１×ＳＹＢＲ ｓａｆｅ（商標）を含有する１×ＴＡＥ中でキャストされた１．２％ゲル上で、５Ｖ／ｃｍで９０分間泳動させた。上部パネルは泳動後のこれらのゲルの画像を示し、下部パネルはＳｆｉＩ消化されたＦａｂプールの１．５ｋｂバンドを切り出した後の同じゲルを示す。最終Ｆａｂアセンブリのために使用されたプライマーは、アニーリング部位の突出部分５’の長さと共に、各列の上部に示される。 図２８は、ｐＳＳＹ１（配列番号３８）の環状プラスミドマップを示す。 図２９は、可変遺伝子増幅を試験することによる調製されたｃＤＮＡの品質の検証を示す。この図は、全Ｖ_κフォワードプライマー（配列番号４２〜４５）と対になったＶ_κ特異的リバースプライマー（配列番号１３）による試験増幅を示し、また全Ｖ_λフォワードプライマー（配列番号４６〜５４）と対になったＶ_λリバースプライマー（配列番号２３）による試験増幅を示す。ゲルの上の数字はそれぞれのフォワードプライマーの配列番号を示す。生成物を、０．１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ中で調製した１．２％アガロースゲル上で分析し、５Ｖ／ｃｍで１．５時間泳動させた。ＭはＦｅｒｍｅｎｔａｓからの１ｋｂプラスＤＮＡマーカーである。 図３０は、超大型ライブラリーのＶファミリーの適用範囲を示す。 図３１は、ファージ形質導入体クローンからのコロニーＰＣＲによるファージライブラリーの品質の確認を示す。ベクター骨格プライマーを用いて、ランダムに選択されたクローンの希釈培養物からＦａｂインサートをＰＣＲ増幅した。生成物を、０．１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ中で調製した１％アガロースゲル上で分析し、５Ｖ／ｃｍで１．５時間泳動させた。 図３２は、（標的抗原に対する３回目のラウンドのパニングされたプールからの）Ｐ０４クローンのＢｓｔＮＩフィンガープリントを示す。消化物を３％アガロースゲル上で泳動させて制限パターンを分析した。バンドのパターンの間のコントラストを向上させるために、反転モードのアガロースゲルを示す。生成物を、同じ緩衝液中で調製された３％アガロースゲル中に０．１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ緩衝液中で６Ｖ／ｃｍで２．５時間泳動させた。レーンの上の数字はそれぞれの反復パターンクローンを示す。左側の数字はそれぞれのＤＮＡマーカーの位置をｂｐで示す。 図３３は、Ｆａｂのペリプラズムウェスタンを示す。ペリプラズム抽出物のウェスタンブロットを、実施例２６及び２７に記載のようにしてパニングキャンペーンから得て、ＨＲＰ結合ウサギポリクローナルＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃３０９−０３６−００３）でプローブした。矢印は、推定された約５０ｋＤａのＦａｂヘテロダイマーを示す。＊は、推定された２３又は２７ｋＤａのモノマー（軽鎖又は重鎖）を示す。上部のボックスは、これらのクローンが属するＶ_Ｌ／Ｖ_Ｈファミリーと共にクローン番号を示す。各画像の左端に沿った数字は、ｋＤａ単位のマーカーの分子量を表す（Ｐｒｅ-ｓｔａｉｎｅｄ Ａｌｌ-Ｂｌｕｅ ＳＤＳ-ＰＡＧＥマーカー；ＢｉｏＲａｄ）。 図３４はファージプールＥＬＩＳＡを示す。パネルＡは、ナイーブライブラリー、ラウンド１及びラウンド２の溶液パニング溶出液に由来するファージプール間の同時比較を示す。ラウンド１でファージを５００ｎＭのビオチン化抗原と室温で１時間インキュベートし、続いてラウンド２で同じインキュベーション条件下、様々な濃度の同じ抗原とインキュベートした。黒い棒は、Ｐｏｌｙｓｏｒｐウェルに固定化された標的抗原に対する反応性を示す。灰色の棒は、同様のウェルに固定化されたヒト血清アルブミン（ＨｓＳＡ）に対する同じプールの反応性を示す。抗原特異的ウェルにおけるより高い反応性は、２回目のラウンドによる抗原特異的バインダーの濃縮を示唆するが、餌（ｂａｉｔ）用量依存的な濃縮は見られない。パネルＢは、ラウンド２でファージが抗原と共に室温で１６時間インキュベートされたことを除いて、パネルＡと同じナイーブライブラリー、ラウンド１及びラウンド２の溶液パニング溶出液に由来するファージプール間の同じ同時比較を示す。ラウンド２からのより長いインキュベーション条件下、餌用量依存性は明らかである。パネルＣは、ラウンド２で様々な期間で１００ｍＭの非ビオチン化抗原を添加する前に、ファージが１０ｎＭビオチン化抗原と共に室温で１時間インキュベートされたことを除いて、パネルＡ及びＢと同じナイーブライブラリー、ラウンド１及びラウンド２の溶液パニング溶出液から得られたファージプール間の同じ同時比較を示す。２時間にわたる濃縮の持続は、そのようなプール中の高親和性（遅い解離）バインダーの存在を示唆する。 図３５は抗原特異的ＥＬＩＳＡを示す。このスクリーンショットには、４枚の９６ウェルプレートが示されている。奇数番号のウェルは２μｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンでコーティングした。偶数番号のウェルは同量の標的抗原でコーティングした。モノクローナル組換体から本文中に記載されているように調製された全細胞抽出物を、希釈の一方のアリコートを奇数番号のウェルにピペットで移し、他方のアリコートを対の偶数番号のウェルにピペットで移して、これらのプレコートされたウェル中、最適化希釈でデュプリケートでインキュベートした。結合したＦａｂをヒトＦａｂ特異的ポリクローナル血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃３０９−０３６−００３）を用いて検出した。対になった非特異的抗原よりも少なくとも２倍の抗原特異的反応性を示すクローンを、強調表示し、太字で表示する。 図３６は、ペリプラズムゲートを示す。画像は、溶液パニングキャンペーンからの３０個のペリプラズム抽出物のウェスタンブロットの合成写真である。ＨＲＰ結合ウサギポリクローナルＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃３０９−０３６−００３）でブロットをプローブした。矢印は、推定された約５０ｋＤａのＦａｂヘテロダイマー、及び推定された２３又は２７ｋＤａのモノマー（軽鎖又は重鎖）を示す。レーンの上のラベルはクローン番号を示す。各画像の左端に沿った数字は、ｋＤａ単位のマーカーの分子量を表す（Ｐｒｅ-ｓｔａｉｎｅｄ Ａｌｌ-Ｂｌｕｅ ＳＤＳ-ＰＡＧＥマーカー；ＢｉｏＲａｄ）。 図３７は、Ｆａｂヒット同定のためのポリクローナル検出抗体の混同する特性を示す。 図３８は、修正されたペリプラズムゲートを示す。画像は、実施例３０における溶液パニングキャンペーンからの３３個のペリプラスム抽出物のウェスタンブロットの合成写真である。ＨＲＰ結合マウスモノクローナル抗ＨＡ ＩｇＧ（クローン３Ｆ１０；Ｒｏｃｈｅ）でブロットをプローブした。矢印は、推定された約５０ｋＤａのＦａｂヘテロダイマー及び推定された２３又は２７ｋＤａのモノマー（軽鎖又は重鎖）を示す。レーンの上のラベルはクローン番号を示す。各画像の左端に沿った数字は、ｋＤａ単位のマーカーの分子量を表す（Ｐｒｅ-ｓｔａｉｎｅｄ Ａｌｌ-Ｂｌｕｅ ＳＤＳ-ＰＡＧＥマーカー；ＢｉｏＲａｄ）。 図３９は、ウェスタンによるペリプラズムのサブタイプの決定を示す。画像は、実施例３０における溶液パニングキャンペーンからの１６個のペリプラスム抽出物のウェスタンブロットの合成写真である。ＨＲＰ結合抗κ又は抗λモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）でブロットをプローブした。矢印は、推定された約５０ｋＤａのＦａｂヘテロダイマー、及び推定された２３又は２７ｋＤａのモノマー（軽鎖又は重鎖）を示す。レーンの上のラベルはクローン番号を示す。各画像の左端に沿った数字は、ｋＤａ単位のマーカーの分子量を表す（Ｐｒｅ-ｓｔａｉｎｅｄ Ａｌｌ-Ｂｌｕｅ ＳＤＳ-ＰＡＧＥマーカー；ＢｉｏＲａｄ）。 図４０は、インフレーム対オフフレームクローン実験を示す。３つの意図的にタンデムインフレームのクローン対３つの意図的にオフフレーム（ＨＣ内）のクローンからのペリプラズム抽出物についての、非還元条件下で抗λ（パネルａ）、抗κ（パネルｂ）、抗Ｃ_Ｈ１（パネルｃ）、及びＨＲＰ結合抗Ｈｕ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント抗体（パネルｄ）でプローブしたウェスタン分析。 図４１は、真のヒットから偽りのＦａｂタンパク質ヒットを排除するためのチェインスイッチ表現型の決定の概念を示す。 図４２は、Ｆａｂチェインスイッチ定量的ＥＬＩＳＡからの近似曲線（ｆｉｔｔｅｄ ｃｕｒｖｅ）及びバックプレディクトの例を示す。パネルＡは、Ｘ軸上の入力標準の質量対Ｙ軸上の産出Ａ_４５０値についての４パラメーター近似曲線を示す。パネルＢは、Ｆ検定からの確率スコアによって示されるフィットパラメーターの推定値とフィットの良好性を示す。パネルＣは、投入Ｆａｂ濃度、生のＡ_４５０値、及び近似曲線からのバックプレディクトされた濃度を示す。 図４３は、ｑＥＬＩＳＡによるインフレームクローン及びオフフレームクローンの識別を示す。パネルＡはＡ_４５０値を示す。パネルＢは同じデータを産出が視覚化されやすいように棒グラフとして示す。パネルＣはこの実験の近似標準曲線を示す。パネルＤは４−ＰＬフィットパラメーター及び適合度を示す。 図４４は、様々なＳＰＲ Ｆａｂキャプチャー表面から可能な最大応答単位のまとめを示す。組換標準ヒトＦａｂ又はＰＰＥ−Ｆａｂを用いて、ＧＬＣ、ＧＬＭ又はＮＬＣチップ上でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、実験を行った。流れる緩衝液は、２０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、又は０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳであった。それぞれのチップ上に垂直に、キャプチャー抗体、すなわちポリクローナル抗Ｆａｂ、抗Ｈｉｓ、抗ＨＡ又は２価抗Ｃ_Ｈ１／抗λ若しくは抗Ｃ_Ｈ１／抗κの１：１混合物を固定化した。１：２〜１：１０希釈の試験Ｆａｂ及び５μｇ／ｍｌの標準Ｆａｂを、１８０秒〜３００秒間、２５μｌ／分の流速でそれぞれの水平チャネル上にキャプチャーさせた。必要に応じて、キャプチャーレベルを上げるために２回の連続的なキャプチャーを行い、表面を１８秒間、１００μｌ／分でのＨ_３ＰＯ_４注入によって安定化させた。センサーグラムを適切に参照し、Ｆａｂキャプチャーレベルを記録した。二価の抗Ｆａｂ抗体は、残りの抗体（７０〜６００ＲＵ）と比較して最大Ｆａｂキャプチャーレベル（８００〜２０００ＲＵ）をもたらした。 図４５は、ベバシズマブの精製されたＦａｂ’フラグメントとのＶＥＧＦ_１６５の相互作用のＳＰＲに基づく動力学的分析を示す。リガンドとしてのベバシズマブの精製されたＦａｂ’フラグメント及び分析物としてのＶＥＧＦ_１６５を用いて、Ｆａｂキャプチャー方法を検証した。流れる緩衝液は、生理食塩水／０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０又は０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０のいずれかを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４であった。パネルＡは、キャプチャー表面への分析物（ＶＥＧＦ_１６５）の非特異的結合（ＮＳＢ）の不具合の対策のためのＳＰＲプロファイルを示す。流れる緩衝液及びサンプル緩衝液中のＴｗｅｅｎ−２０及び塩の濃度を上げると、ＮＳＢが劇的に減少した。パネルＢは、Ｆａｂ’フラグメントの異なるキャプチャーレベルでの結合曲線をそれぞれの残差プロットと共に示す。パネルＣは、各キャプチャーレベルで得られた動力学的値（ｋ_ａ、Ｋ_ｄ及びＫ_Ｄ）と他の関連パラメーターを示す。 図４６は、粗ペリプラズム抽出物中に存在する発現されたＢｅｖａｃｉｚｕＦａｂとのＶＥＧＦ_１６５の相互作用のＳＰＲに基づく動力学的分析を表す。Ｆａｂキャプチャー方法は、リガンドとしてペリプラズムで発現されたＦａｂフォーマットのＢｅｖａｃｉｚｕＦａｂと、分析物としてＶＥＧＦ_１６５を使用して検証された。図４５に記載された最適化条件を使用した。パネルＡはＢｅｖａｃｉｚｕＦａｂの結合曲線を示す。パネルＢはそれぞれの残差プロットを示す。パネルＣは、各キャプチャーレベルでの対応する動力学的値（ｋ_ａ、ｋ_ｄ及びＫ_Ｄ）及びその他の関連パラメーターを示す（図４５，パネルＣと比較）。ＰＰＥ−Ｆａｂ ＬＢ及びＰＰＥ−Ｆａｂ ＭＭは、異なる培地中で増殖させたＢｅｖａｃｉｚｕＦａｂのペリプラズム抽出物を指す。 図４７は、Ｆａｂライブラリーからの抗体発見の漏斗を示す。 図４８は、ｂ−ＴＮＦαの純度及び品質の確認を示す。サンプルを９０℃で５分間加熱し、各々５μｇの還元タンパク質及び非還元タンパク質を４〜１５％のポリアクリルアミドゲルで１５０Ｖで４０分間電気泳動させた。右の画像は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で２時間染色した後、水：メタノール：酢酸（５０：４０：１０）で２時間脱染したゲルを示す。ＭはＢｉｏｒａｄ製のＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥマーカーである。ＮＲは非還元のものであり、Ｒは還元のものである。ウェスタンブロッティングのために、１００ｎＭ（５０ｎｇ）及び３０ｎＭ（約１６ｎｇ）の還元タンパク質サンプルを、先と同様にして調製し、電気泳動させ、１００Ｖで１．５時間、ニトロセルロース膜に移した。ブロットをＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中の３％ＢＳＡ中で１時間、遮断し、３％ＢＳＡ中、１：４００００希釈のストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ＃Ｐ０３９７）で１時間プローブした。Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ基質（Ｂｉｏｒａｄ ＃１７０−５０６０）を用いて、ブロットを発色させた。得られたウェスタンブロットの画像（左）を、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて記録した。 図４９は、チェインスイッチｑＥＬＩＳＡを用いた抗ＴＮＦα可溶性Ｆａｂスクリーニングの代表的なデータを示す。上のパネルはクローン番号４８１〜５７６のＴＮＦαキャンペーンのプレート６のレイアウトを示す。中央のパネルはλ検出抗体を用いた標準曲線及びＡ_４５０値を示す。下のパネルはκ検出抗体を用いた標準曲線及びＡ_４５０値を示す。黒色は高発現クローンを示し、濃い灰色は中程度の発現クローンを示し、薄い灰色は低発現クローンを示す。 図５０は、５００ｎＭの分析物濃度における抗ＴＮＦαのＳＰＲ陽性クローンの動力学的スクリーニングプロファイルを示す。ニュートラアビジンコート（ＮＬＣ）チップ上でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（ＢｉｏＲａｄ）を用いて実験を行った。流れる緩衝液は、０．５Ｍの塩及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む２０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４であった。キャプチャー抗体は、ビオチン化二価抗Ｃ_Ｈ１／抗λ抗体及び抗Ｃ_Ｈ１／抗κ抗体の１：１混合物であった。この混合物を３つの異なる濃度（１０、３及び１μｇ／ｍｌ）で、デュプリケートで、１つは試験面として、他方はＮＬＣチップ上のそれぞれのキャプチャー濃度についての参照面として垂直に固定化した。試験Ｆａｂの１：１０希釈液を、３００秒間、２５μｌ／分の流速でそれぞれの水平チャネル上にキャプチャーした。キャプチャー表面を飽和させるために２〜３回の連続的なキャプチャーを行った。１つの水平チャネルは、参照表面が正確に試験表面を模倣するように、非特異的（非ＴＮＦαバインダー）な市販ヒトＦａｂを用いて表面を飽和させた参照チャネルとしてささげられた。分析物の注入前に、流れる緩衝液を６０秒間、１００μｌ／分で連続して３回注入することでベースラインを安定化させた。１回目の緩衝液の注入後、システムを５分間休止させ、続いて残りの２回の注入を行った。これによって、シグナルが迅速に安定化された。５００ｎＭの分析物（ｓＴＮＦα）を１２０秒間（２分間）、２５μｌ／分で水平に注入し、続いて３００秒間（５分間）解離させた。グリシンｐＨ２．０を６０秒間、用いて表面を再生させ、続いて２回目の注入を３０秒間行った。センサーグラムを適切に参照し、ラングミュア１：１フィッティングモデルを用いて分析した。得られた親和定数値（ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ）、並びにＲ_ｍａｘ及びχ^２のような他の関連パラメーターを記録した。 図５１は、１０個の抗ＴＮＦα ＳＰＲ陽性クローンの設計の概略図及びエピトープの棚入れ（ｂｉｎｎｉｎｇ）の結果を示す。最初の実験では、５つのＦａｂ、すなわちｂＴ１、ｂＴ１６、ｂＴ３８、ｂＴ５９及びｂＴ７５をそれぞれＮＬＣチップの水平チャネル１〜５に固定化した。試験Ｆａｂを３００秒間、２５μｌ／分で３回連続して注入することにより表面を飽和させた。次に、分析物（ｓＴＮＦα）を垂直方向に注入して、これらのＦａｂと相互作用させ、それぞれの標的エピトープを遮断させた。最後に、同じ５つのＦａｂを、再度、これらの表面上に、今度は相互作用パターンを見るために垂直に流した。次の５つのクローン、すなわちｂＴ７６、ｂＴ７７、ｂＴ８４、ｂＴ８６及びｂＴ８８の組を用いて、同様に第２の実験を行った。第３及び最後の実験では、前の２組の５つのクローンを互いに同様に試験した。「ｖ」マーク（チェックマーク）は陽性のＳＰＲ応答を示し、「Ｘ」マークは陰性のＳＰＲ応答を示す。各実験概略図の下の表は、クローンのそれぞれの組合せについて生成された棚を示す。 図５２は、抗ＴＮＦαモノクローナルＦａｂ ｂＴ１、ｂＴ５９及びｂＴ８８のＳＰＲプロファイル及びパラメーターの要約図を示す。ビオチン化二価抗Ｃ_Ｈ１／抗κ及び抗Ｃ_Ｈ１／抗λキャプチャー抗体を３つの異なる濃度（１０、３及び１μｇ／ｍｌ）で、デュプリケートで、１つは試験面として、他方はＮＬＣチップ上のそれぞれのキャプチャー濃度についての参照面として垂直に固定化した。試験Ｆａｂの１：１０希釈液を、３００秒間、２５μｌ／分の流速で３つの垂直チャネル（Ｌ１、Ｌ３及びＬ５）上にキャプチャーした。キャプチャー表面を飽和させるために２〜３回の連続的なキャプチャーを行った。試験表面を正確に模倣するために、非特異的（非ＴＮＦαバインダー）な市販ヒトＦａｂを用いて参照表面（Ｌ２、Ｌ４及びＬ６）を飽和させた。分析物の注入前に、流れる緩衝液を６０秒間、１００μｌ／分で連続して３回注入することでベースラインを安定化させた。１回目の緩衝液の注入後、システムを１０分間休止させ、続いて残りの２回の注入を行った。これによって、シグナルが迅速に安定化された。ｂＴ１について１０ｎＭ〜０．６２５ｎＭの範囲の、ｂＴ５９及びｂＴ８８について１０００ｐＭ〜６２．５ｐＭの範囲の５つの濃度（交互の希釈）のｓＴＮＦαを、９００秒間（１５分間）、２５μｌ／分で水平に注入し、続いて９００秒間（１５分間）、分離した。グリシンｐＨ２．０を６０秒間、用いて表面を再生させ、続いて２回目の注入を３０秒間行った。データ分析のために、最後の３つの濃度を考慮した。すなわち、ｂＴ１について２．５ｎＭ〜０．６２５ｎＭであり、ｂＴ５９及びｂＴ８８については、使用した範囲は２５０ｐＭ〜６２．５ｐＭであった。センサーグラムを適切に参照し、ラングミュア１：１フィッティングモデルを用いて分析した。得られた親和定数値（ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ）、並びにＲ_ｍａｘ及びχ^２のような他の関連パラメーターを必要に応じて記録した。 図５３は、ＰｆＲｈ５の純度及び品質の確認を示す。サンプルを９０℃で５分間加熱し、各々２μｇの還元タンパク質及び非還元タンパク質を４〜１５％のポリアクリルアミドゲルで１５０Ｖで４０分間電気泳動させた。ゲルを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で２時間染色した後、水：メタノール：酢酸（５０：４０：１０）で２時間脱染した。Ｍは、Ｂｉｏｒａｄ製のＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥマーカーである。ＮＲは非還元であり、Ｒは還元である。 図５４は、チェインスイッチｑＥＬＩＳＡを用いた抗ＰｆＲｈ５可溶性Ｆａｂスクリーニングの代表的なデータを示す。上のパネルはクローン番号１９３〜２８８のＰｆＲｈ５キャンペーンのプレート１１のレイアウトを示す。中央のパネルはλ検出抗体を用いた標準曲線及びＡ_４５０値を示す。下のパネルはκ検出抗体を用いた標準曲線及びＡ_４５０値を示す。黒色は高発現クローンを示し、濃い灰色は中程度の発現クローンを示し、薄い灰色は低発現クローンを示す。 図５５は、５００ｎＭの分析物濃度における抗ＰｆＲｈ５のＳＰＲ陽性クローンの動力学的スクリーニングプロファイルを示す。ビオチン化二価抗Ｃ_Ｈ１／抗κキャプチャー抗体をＬ１〜Ｌ３チャネルに３μｇ／ｍｌで固定し、同様に抗Ｃ_Ｈ１／抗λをＮＬＣチップのＬ４〜Ｌ６チャネルに垂直方向に固定した。５つの試験Ｆａｂのセットの１：５希釈液を、一度に３００秒間、２５μｌ／分の流速で水平方向にキャプチャーさせた。キャプチャー表面を飽和させるために２回の連続したキャプチャーを行った。試験表面を正確に模倣するために、非特異的（非ＰｆＲｈ５バインダー）な市販ヒトＦａｂを用いて、参照表面（第６の水平チャネル）を飽和させた。分析物の注入前に、流れる緩衝液を６０秒間、１００μｌ／分で連続して３回注入することでベースラインを安定化させた。１回目の緩衝液の注入後、システムを５分間休止させ、続いて残りの２回の注入を行った。これによって、シグナルが迅速に安定化された。単一濃度の５００ｎＭのＲｆＲｈ５を１２０秒間（２分間）、２５μｌ／分で６つの水平チャネルすべてに水平方向に注入し、続いて３００秒間（５分間）解離させた。グリシンｐＨ２．０を６０秒間、用いて表面を再生させ、続いて２回目の注入を３０秒間行った。センサーグラムを適切に参照し、ラングミュア１：１フィッティングモデルを用いて分析した。 図５６は、抗ＰｆＲｈ５モノクローナルＦａｂのＳＰＲプロファイルの要約図及びパラメーターを示す。ビオチン化二価抗Ｃ_Ｈ１／抗λキャプチャー抗体をＬ１〜Ｌ３に３μｇ／ｍｌで固定し、同様に抗Ｃ_Ｈ１／抗κをＮＬＣチップのＬ４〜Ｌ６チャネルに垂直方向に固定した。試験Ｆａｂの１：５希釈物を、４つの垂直チャンネル上、λクローンについてはＬ１及びＬ２、κクローンについてはチャネルＬ３及びＬ４に、３００秒間、２５μｌ／分の流速でキャプチャーさせた。キャプチャー表面を飽和させるために２回の連続したキャプチャーを行った。試験表面を正確に模倣するために、非特異的（非ＰｆＲｈ５バインダー）な市販ヒトＦａｂを使用して参照表面（Ｌ３及びＬ６）を飽和させた。分析物の注入前に、流れる緩衝液を６０秒間、１００μｌ／分で連続して３回注入することでベースラインを安定化させた。１回目の緩衝液の注入後、システムを１０分間休止させ、続いて残りの２回の注入を行った。これによって、シグナルが迅速に安定化された。５００ｎＭ〜３１．２５ｎＭの範囲の５つの濃度（交互の希釈）のＰｆＲｈ５を６００秒間（１０分）、水平方向に注入した。標的抗原に結合したＦａｂの解離は、流れる緩衝液を用いて９００秒間（１５分間）行った。グリシンｐＨ２．０を６０秒間、用いて表面を再生させ、続いて２回目の注入を３０秒間行った。データ分析のために、センサーグラムを適切に参照し、ラングミュア１：１フィッティングモデルを用いて分析した。必要に応じて、得られた親和定数値（ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ）を記録した。 図５７は、ＰｆＣＳＰの純度及び品質の確認を示す。サンプルを９０℃で５分間加熱し、各々５μｇの還元タンパク質及び非還元タンパク質を４〜１５％のポリアクリルアミドゲルで１５０Ｖで４０分間電気泳動させた。ゲルを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で２時間染色した後、水：メタノール：酢酸（５０：４０：１０）で２時間脱染した。Ｍは、Ｂｉｏｒａｄ製のＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥマーカーである。ＮＲは非還元のものであり、Ｒは還元のものである。 図５８は、チェインスイッチｑＥＬＩＳＡを用いた抗ＰｆＣＳＰ可溶性Ｆａｂスクリーニングの代表的データを示す。上のパネルは、クローン番号２８９〜３８４までのＰｆＣＳＰキャンペーンのプレート８のレイアウトを示す。中央パネルはλ検出抗体を用いた標準曲線及びＡ_４５０値を示す。下パネルはκ検出抗体を用いた標準曲線及びＡ_４５０値を示す。黒色は高発現クローンを示し、濃い灰色は中程度の発現クローンを示し、薄い灰色は低発現クローンを示す。 図５９は、５００ｎＭの分析物濃度での抗ＰｆＣＳＰのＳＰＲ陽性クローンの動力学的スクリーニングプロファイル（２つの部分：図５９Ａ及び図５９Ｂとして示す）を示す。ビオチン化二価抗Ｃ_Ｈ１／抗κ及び抗Ｃ_Ｈ１／抗λキャプチャー抗体の１：１混合物を３つの異なる濃度（１０、３及び１μｇ／ｍｌ）で、デュプリケートで垂直に固定化した。５つの試験Ｆａｂのセットの１：５希釈物を、一度に３００秒間、２５μｌ／分の流速で水平方向にキャプチャーさせた。キャプチャー表面を飽和させるために２回の連続したキャプチャーを行った。試験表面を正確に模倣するために、非特異的（非ＰｆＣＳＰバインダー）な市販ヒトＦａｂを使用して参照表面（第６の水平チャネル）を飽和させた。分析物の注入前に、流れる緩衝液を６０秒間、１００μｌ／分で連続して３回注入することでベースラインを安定化させた。１回目の緩衝液の注入後、システムを５分間休止させ、続いて残りの２回の注入を行った。これによって、シグナルが迅速に安定化された。５００ｎＭの単一濃度を１２０秒間（２分間）、２５μｌ／分で６つの水平チャネルすべてに水平に注入し、続いて３００秒間（５分間）解離させた。グリシンｐＨ２．０を６０秒間、用いて表面を再生させ、続いて２回目の注入を３０秒間行った。センサーグラムを適切に参照し、ラングミュア１：１フィッティングモデルを用いて分析した。 図５９は、５００ｎＭの分析物濃度での抗ＰｆＣＳＰのＳＰＲ陽性クローンの動力学的スクリーニングプロファイル（２つの部分：図５９Ａ及び図５９Ｂとして示す）を示す。ビオチン化二価抗Ｃ_Ｈ１／抗κ及び抗Ｃ_Ｈ１／抗λキャプチャー抗体の１：１混合物を３つの異なる濃度（１０、３及び１μｇ／ｍｌ）で、デュプリケートで垂直に固定化した。５つの試験Ｆａｂのセットの１：５希釈物を、一度に３００秒間、２５μｌ／分の流速で水平方向にキャプチャーさせた。キャプチャー表面を飽和させるために２回の連続したキャプチャーを行った。試験表面を正確に模倣するために、非特異的（非ＰｆＣＳＰバインダー）な市販ヒトＦａｂを使用して参照表面（第６の水平チャネル）を飽和させた。分析物の注入前に、流れる緩衝液を６０秒間、１００μｌ／分で連続して３回注入することでベースラインを安定化させた。１回目の緩衝液の注入後、システムを５分間休止させ、続いて残りの２回の注入を行った。これによって、シグナルが迅速に安定化された。５００ｎＭの単一濃度を１２０秒間（２分間）、２５μｌ／分で６つの水平チャネルすべてに水平に注入し、続いて３００秒間（５分間）解離させた。グリシンｐＨ２．０を６０秒間、用いて表面を再生させ、続いて２回目の注入を３０秒間行った。センサーグラムを適切に参照し、ラングミュア１：１フィッティングモデルを用いて分析した。 図６０は、抗ＰｆＣＳＰモノクローナルＦａｂのＳＰＲプロファイルの要約図及びパラメーターを示す。ビオチン化二価抗Ｃ_Ｈ１／抗κ及び抗Ｃ_Ｈ１／抗λキャプチャー抗体の１：１混合物を、垂直方向にＮＬＣチップ上に３つの異なる濃度（１０、３及び１μｇ／ｍｌ）で、デュプリケートで固定化した。試験Ｆａｂの１：５希釈物を３００秒間、２５μｌ／分の流速で５つの垂直チャネル（Ｌ１〜Ｌ５）上にキャプチャーさせた。キャプチャー表面を飽和させるために２〜３回の連続したキャプチャーを行った。試験表面を正確に模倣するために、非特異的（非ＰｆＣＳＰバインダー）な市販ヒトＦａｂを使用して参照表面（Ｌ６）を飽和させた。分析物の注入前に、流れる緩衝液を６０秒間、１００μｌ／分で連続して３回注入することでベースラインを安定化させた。１回目の緩衝液の注入後、システムを５分間休止させ、続いて残りの２回の注入を行った。これによって、シグナルが迅速に安定化された。５００ｎＭ〜３１．２５ｎＭの範囲の５つの濃度（交互の希釈）のＰｆＣＳＰを６００秒間（１０分間）、水平方向に注入した。標的抗原に結合するＦａｂの解離は、流れる緩衝液を用いて９００秒間（１５分間）行った。グリシンｐＨ２．０を６０秒間、用いて表面を再生させ、続いて２回目の注入を３０秒間行った。データ分析のために、センサーグラムを適切に参照し、ラングミュア１：１フィッティングモデルを用いて分析した。必要に応じて、得られた親和定数値（ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ）を記録した。

本発明は、大きな抗体ファージディスプレイライブラリー、抗体ファージディスプレイライブラリーを製造する方法、及び様々な抗原をスクリーニングして該抗原に対する製造可能な抗体を得る方法を開示する。

本発明は、標的に対して高い親和性及び高い特異性で結合化合物を同定する機会を著しく増大させる、Ｆａｂフォーマットの大きく多様なライブラリーを開示する。更に、本発明は、最小限の配列操作で標的特異的可溶性Ｆａｂの容易な単離を提供する。本発明におけるＦａｂは、検出、製造、及び更に臨床的又は診断的目的のための使用がより容易である生成物として、大腸菌のペリプラズム中で自己折畳みタンパク質として発現される。パニングにライブラリーを構築する方法及びリードモノクローナルの同定が数週間で行われ得るため、本発明は、速度及び費用対効果の利点を提供する。したがって、本発明は、製造可能な抗体を得るための高忠実度の製造方法であり、種々の抗原をスクリーニングして、制御された方式でその抗体を得る方法を確立する。

本発明は、ファージ上に提示された抗体フラグメントの大きなレパートリーから始まる一連の段階的評価として準備された製造のための事前設定された重要な品質属性と一致する抗体発見の方法を開示する。この方法は以下の実施例で例示され議論される。本発明の利点は、ファージで表示された抗体フラグメントを含む。また、本発明の利点は、抗体フラグメントをディスプレイのためにも使用し、特に水溶性タンパク質としてのハイスループットフォーマットで段階的評価の同じ厳格な要件に従う、酵母ディスプレイ又は細菌ディスプレイ等の他のインビボディスプレイシステムに拡張することが可能である。

抗体発見におけるＣＱＡ
産業用抗体発見及び製造は、プロセス全体を通してタンパク質生成物のモニタリングを必要とする（Alt N et al., 2016; Kepert JF et al., 2016）。言い換えれば、治療用標的として予め定義された、結合性、活性化、アゴニスト又は接合の表現型（Labrijn AF et al., 2008に概説）は、タンパク質部分に割り当て可能であるべきである。それによって、その表現型の要因である重要な品質属性（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ Ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ：ＣＱＡ）を可能な限り早く定義することができる。その定義は、通常、標的に対する親和性と特異性の評価、及び共通の目的としての生物学的機能性を含み、生産性、凝集傾向、熱力学的安定性（Thiagarajan G et al., 2016）及び潜在的免疫原性（Hai S-H et al., 2009. Immunogenicity screening using in silico methods: Correlation between T-Cell epitope content and clinical immunogenicity of monoclonal antibodies. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic）の追加の評価を含んでもよい。これらの全ては、水に溶解したタンパク質としての抗体の挙動に直接帰属できる性質であるか、又はその構造的特徴に固有である。したがって、そのような初期段階でＣＱＡを定義する目的は、標的表現型と観察された表現型の間、及び観察された表現型とその基礎となる遺伝子型の間のミスマッチに内在するリスクを、できる限り早く軽減することである。本発明は、ナイーブヒトファージディスプレイライブラリープラットフォームから発見された抗体についてこの目的をいかに達成するかを説明する。

治療用又は診断用抗体の使用は、抗体を発見するために利用可能なフォーマットに非常に依存してきた。歴史的には、抗体発見は、非ヒト宿主種を免疫して血清からポリクローナル抗体を生成させる（von Behring EA and Kitasato S, 1890）か、又はハイブリドーマ技術でモノクローナル抗体を生成させる（Kohler G and Milstein C, 1975）ことによって可能になった。したがって、免疫化による抗体発見のプロセスは、免疫化の生物学における不確実性に依存しており、全長の非ヒトＩｇＧのみをもたらす。その非ヒトＩｇＧは、ヒトの免疫系によって異物であると認識され、繰り返し使用後に治療上の利益を中和する抗種抗体をもたらす（Chester KA and Hawkins RE, 1995; Glennie MJ and Johnson PWM, 2000）ため、通常ヒトへの使用には適さない。したがって、非ヒト免疫経路で生成された抗体は、ヒト定常ドメイン上に抗原を認識する可変ドメインを移植する技術（−ｘｉｍａｂ；Liu AY et al., 1987）又はヒト可変領域フレームワーク上に相補性決定領域を移植する技術（−ｚｕｍａｂ；Jones PT et al., 1986; Carter P et al., 1992）が産業界の先駆者によって開発された時まで、長年、研究又は診断用試薬としてのみ有用に存続していた。ヒトＩｇ遺伝子座についてトランスジェニックなマウスの使用（Bruggemann M and Taussig MJ, 1997; Green LL, 1999; Lonberg N, 2008; Dechiara TM et al., 2009）は、今日、免疫化から治療用モノクローナル抗体を生成するための非ヒトＩｇ起源の問題を迂回した。この技術に由来するいくつかの抗体が市販されている（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ，別名Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ，別名Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）、Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ，別名Ｉｌａｒｉｓ（登録商標）、Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ，別名Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標）、Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ，別名Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）、及びＤｅｎｏｓｕｍａｂ，別名Ｘｇｅｖａ／Ｐｒｏｌｉａ（登録商標））。それにも関わらず、このヒト抗体生産方法は、特にヒトとげっ歯類の間でアミノ酸配列が高度に保存されている毒性抗原又はタンパク質標的に関する場合は、免疫化の不確実性の影響を受けやすいままである（Frenzel A et al., 2016）。

全長ＩｇＧは、Ｆｃドメインでコードされた特徴により、血中循環の長い半減期、又は免疫エフェクター細胞を参画させる能力、又はその両方という組み込みの利点を有し、したがって、多くの治療シナリオにおける設計による構造的なＣＱＡの利点を有する。そのようなＩｇＧは分泌タンパク質として発見されるので、表現型の性質のタンパク質自体への帰属及びそのようなタンパク質へのＣＱＡの割り当てが簡単であるという事実に、更なる利点が埋め込まれている。表現型をその基礎となる遺伝子型に結び付けることは、製造の恒常性のために重要な知識であり、日常的にハイブリドーマによって分泌される抗体（Bradbury A, 2010. Cloning hybridoma cDNA by RACE. In: Antibody Engineering; Vol. 1）についても技術的に実行可能である。しかし、それは日常的な使用のためにインビボで多数のＢ細胞によって分泌されたポリクローナル種（Meijer PJ et al., 2006; Tiller T et al., 2008）のための手ごわい技術的挑戦のままである。

インビボ又はインビトロで抗体フラグメントを提示することができるシステムの出現によって、免疫化の変動（抗原毒性、抗原相同性、応答の欠如）を迂回することが可能になり、発見のためのフォーマットはもはや全長ＩｇＧのみに限定されない。これらのシステムは、本質的にＩｇタンパク質構造に固有のモジュール性並びにそれらのゲノム起源を利用して免疫グロブリン遺伝子の抗原認識要素をインビトロで様々な形態で組換えする組換ＤＮＡ技術の力に依存する。そのような遺伝子の供給源は、天然又は合成のものであり得る。原核生物又は真核生物起源の宿主細胞におけるこれらの多様なＶドメイン置換の適切なキャプチャー並びにその後の発現及び提示の際に、これらの組換フォーマットはインビトロで抗原に結合することができ、そのようなバインダーを単離し、配列決定して、結合表現型を有限の遺伝子型に割り当てることができる。したがって、表現型と遺伝子型を容易に関連付けることができるため、全体のＣＱＡをタンパク質としてバインダーに割り当てることができる。本明細書中に記載された実施例は、ファージディスプレイから抗体を得ることに関連する場合、そのような割り当ては自明ではなく、発明される必要があることを証明している。

本発明は、免疫グロブリンフラグメントを大腸菌のペリプラズム中の分泌タンパク質として発見することができる方法を開示し、表現型品質のタンパク質それ自体への帰属を可能にする。本発明は、表現型をその基礎となる遺伝子型に結び付け、製造の恒常性にとって重要な知識である。
本発明はまた、以下の工程を所定の順序で含む、抗体ファージディスプレイライブラリーから可溶性Ｆａｂとして製造可能な抗体を得る方法：
ｉ）標的特異的パニング、
ｉｉ）ペリプラズムのｑＥＬＩＳＡ、
ｉｉｉ）動力学的ランク付け、
ｉｖ）バイオアッセイ、
ｖ）製造可能性の評価、
これらの結果、得られた抗体において期待される９０％を超える遺伝子型相関の表現型となること、を開示する。

ファージディスプレイ技術は、以下の５つ（ａ）〜（ｅ）の重要な考えに基づいている。（ａ）バクテリオファージは、宿主細菌に形質導入された時、異種ペプチド又はそのコートタンパク質に融合したポリペプチドを発現することができる。（ｂ）多数のそのペプチド又はポリペプチドが与えられると、選択されたコートタンパク質上にこれらすべての変異体を表示する組換ファージのライブラリーを作製することができる。（ｃ）そのファージライブラリーを、インビトロで標的分子に結合（認識）する能力について集団としてスクリーニングすることができる。（ｄ）金粉から砂を洗い流すこと（パニング）に似たプロセスで非バインダーを洗い流すことによって、非バインダーからバインダーを分離することができる。（ｅ）単離されたバインダーを、ゲノム中にコード化された変異体の配列について分析することができる。その概念化（Smith GP, 1985）以来、この技術は、抗体発見、エピトープマッピング、タンパク質相互作用部位マッピング、酵素基質発見及び分子進化を含む様々な調査にとって非常に貴重であることが証明されている（Burton DR, 1995; Azzazy HM and Highsmith WE, 2002に概説）。

本発明は、抗体ファージディスプレイライブラリーから抗体を得る方法であって、
パニングが、固体相又は溶液相で４〜３７℃の範囲の様々な温度で１時間〜１６時間の範囲の様々な長さの時間で行われる方法を開示する。
固体相のパニングが以下の工程を含むことができる：
ｉ）荷電ポリスチレン等の固体表面上の所与の抗原についての最大コーティング濃度を最適化すること、
ｉｉ）ファージミドライブラリーをファージフォーマットに変換すること、
ｉｉｉ）選択された表面を工程（ｉ）で決定された最適濃度の抗原でコーティングし、続いてタンパク質分子又は非タンパク質分子で遮断して非特異的部位を遮断すること、
ｉｖ）工程（ｉｉ）で得られたファージプールを、遮断されていないポリスチレン表面に予め吸着させ、プラスチックのバインダー（ｐｌａｓｔｉｃ ｂｉｎｄｅｒ）を除去すること、
ｖ）規定された時間、工程（ｉｖ）からの予め吸着されたファージを、工程（ｉｉｉ）からの固定化された標的抗原とインキュベーションすること、
ｖｉ）複数ラウンドの洗浄を行って、工程（ｖ）からの結合されていないファージを除去すること、
ｖｉｉ）トリプシン消化で工程（ｖ）からの結合されたファージを溶出させ、ファージ力価を得るために、アンバーサプレッサー宿主並びに非アンバーサプレッサー宿主に同時に形質導入すること、
ｖｉｉｉ）次ラウンドのパニングのためにアンバーサプレッサー宿主に形質導入することによって、工程（ｖｉｉ）からの溶出したファージを増幅させること、
ｉｘ）減少した抗原濃度を用いて次ラウンドのパニングを実施し、工程（ｉｉｉ）〜工程（ｖｉｉｉ）を繰り返して、標的特異的な抗体集団を濃縮すること、
ｘ）工程（ｖｉｉ）〜工程（ｉｘ）を繰り返すこと、
ｘｉ）標的特異的ＥＬＩＳＡを用いる複数ラウンドのパニングを通して、濃縮された結合について、工程（ｖｉｉ）及び（ｘ）からの溶出したファージを評価すること。

溶液相のパニングが以下の工程を含むことができる：
ｘｉｉ）ビオチン対タンパク質のモル比が１０未満、好ましくは１〜５を達成するように、所与の抗原の最適ビオチン化のための反応条件を最適化すること、
ｘｉｉｉ）ファージミドライブラリーをファージフォーマットに変換すること、
ｘｉｖ）工程（ｘｉｉｉ）で得られたファージをタンパク質分子又は非タンパク質分で遮断して非特異的部位を遮断して、一定時間非特異的部位を遮断し、同時にストレプトアビジンビーズを洗浄し、続いてビーズをタンパク質分子又は非タンパク質分子で遮断して非特異的部位を遮断すること、
ｘｖ）工程（ｘｉｖ）からの遮断されたファージを、可溶性標的ビオチン化抗原（工程（ｘｉｉ））と規定の期間、インキュベーションすること、
ｘｖｉ）工程（ｘｖ）で得られたファージ−抗原複合体を、予め遮断されたストレプトアビジンビーズとインキュベーションすること、
ｘｖｉｉ）工程（ｘｖｉ）の抗原−ファージ結合体に結合したビーズの複数ラウンドの洗浄をして、結合されていないファージを除去すること、
ｘｖｉｉｉ）ＤＴＴ消化又はトリプシン消化で工程（ｘｖｉ）の結合されたファージを溶出させ、ファージ力価を得るために、アンバーサプレッサー宿主並びに非アンバーサプレッサー宿主に同時に形質導入すること、
ｘｉｘ）次ラウンドのパニングのためにアンバーサプレッサー宿主に形質導入することによって、工程（ｘｖｉｉｉ）からの溶出したファージを増幅させること、
ｘｘ）減少した抗原濃度を用いて次ラウンドのパニングを実施し、工程（ｘｉｖ）〜工程（ｘｖｉｉｉ）を繰り返して、標的特異的な抗体集団を濃縮すること、
ｘｘｉ）工程（ｘｉｘ）〜工程（ｘｘ）を繰り返すこと、
ｘｘｉｉ）標的特異的ＥＬＩＳＡを用いる複数ラウンドのパニングを通して、濃縮された結合について、工程（ｘｖｉｉｉ）及び工程（ｘｘｉ）からの溶出したファージを評価すること。

ファージディスプレイ技術内に埋め込まれた非常に重要な概念は、組換ファージ内の結合している表現型のコードされた遺伝子型への物理的連結である。対照的に、ｃＤＮＡ発現ライブラリーは多数のポリペプチドをコードすることもできるが、集団ベースのスクリーニング後の特定のクローンの表現型は、クローンの並行マスターセットに対して行われる別個の調査工程後、そのコードされた遺伝子型のみにリンクできる（hybridization with radiolabeled probe and colony picking, for example; Sambrook J and Russell DW, 2001a. Preparation of cDNA libraries and gene identification. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 2）。したがって、ファージディスプレイライブラリーから得ることができる速度及びスループットは、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングと比較して、比較にならないほどより速くより高い。

しかし、抗体をタンパク質として評価することに関連する場合、「発見した実在物をタンパク質として評価しなければならない」との産業上の主張がｃＤＮＡライブラリーと同様に利点又は不利なレベルにするため、ディスプレイ技術は原則としてその力を失う。更に、今日、タンパク質の変異集団の個体の評価に用いることができ、かつ抗体発見のために日常的にハイブリドーマからの分泌されたＩｇＧに適用されるハイスループット（Hay FC and Westwood OMR, 2002. Preparation of human B-cell hybridoma. In: Practical Immunology）は、ファージで表示された抗体に適用することはできない。ファージディスプレイ技術によるハイスループットに対する主な障害は、あらゆる結合表現型の評価を始める前に、増殖している細菌培養物を感染性ファージで形質導入し、次いでファージから細菌を遠心分離し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介による沈殿の第２工程によって濃縮させ、その後、洗浄を繰り返して、細菌汚染を除去することを含んで、増幅されたファージを収集する必要があることである。このプロセスを対照するために、ハイブリドーマを９６ウェルプレート中で培養し、遠心分離して上清を集めることができ、それを結合する表現型について直接評価することができる（Green LL, 1999）。

二次的ではあるが重大な障害は、設計上、ファージで表示された抗体がはるかに大きいファージ粒子にＮ末端又はＣ末端で結合しているという事実に基づいている。いくつかの報告（Lou J et al., 2001; Chowdhury PS, 2002. Targeting random mutations to hotspots in antibody variable domains for affinity improvement. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols; Pavoni E et al., 2007）に記載されているように、発見された抗体フラグメントに対するそのような大きな「タグ」の存在は、結合の基本的表現型に影響を与えることが最も確実に予測できる。ファージの生物学の本来備わる制限は、（ａ）抗体フラグメントを全く表示せず（Winter G et al., 1994; Azzazy HM and Highsmith WE, 2002; Hust M et al., 2009. Antibody phage display. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic）、（ｂ）組換ゲノムの予想サイズと比較してサイズが短く（de Bruin R et al., 1999; Lowe D and Vaughan TJ, 2009. Human antibody repertoire libraries; In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic）、及び（ｃ）抗体を表示する組換体のみを増幅するという実験目的とは対照的に、最大の増殖の利点を有する（de Bruin R et al., 1999; Loset GA et al., 2005; Lowe D and Vaughan TJ, 2009. Human antibody repertoire libraries; In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic）、大多数のクローンの増殖をもたらす。これらの本来備わる誤りは、遺伝子型−表現型の結合の原理から予想されるように、標的抗原に対するモノクローナルファージの結合能力が同じクローンから産生されるタンパク質抗体の結合能力によって反映されない状況をもたらし得る（Vaughan TJ et al., 1996; Chowdhury PS, 2002. Targeting random mutations to hotspots in antibody variable domains for affinity improvement. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols；ＵＳ６７９４１２８；Pavoni E et al., 2007）。本明細書に記載された実施例は、そのような現象を非常に詳細に記載しており、そのプロセスの落とし穴を認識し、したがって、それらを回避することができる発明方法を必要とする。

ファージ−抗体融合によって示される結合する表現型が、ファージタグを除いて発現される場合にタンパク質として抗体によって反映されないかもしれないとの危険性を軽減する一般的な方法は、バインダーのゲノムが発現可能なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を表すかを調べることにより、通常、シークエンシング（Buckler DR et al., 2008）によって達成される。自動化の大きな進歩にも関わらず、そのようなアプローチは、クローン評価において非常に貴重であるが、依然として労働集約的であり、ハイスループット方法として解釈することはできない。更に、配列決定それ自体は、抗体ＯＲＦが発現可能であるかどうかを保証するものではない。どの種類の抗体ＯＲＦが細菌及び哺乳動物細胞において発現可能であり得るかについての規則が提案されており（Ewert S et al., 2004; Rothlisberger D et al., 2005）、今日、合成抗体ライブラリーはそれらの成功のためのそのような規則に依存している（Knappik A et al., 2000; Rothe C et al., 2008; Prassler J et al., 2011; Tiller T et al., 2013）。ナイーブ又は免疫ファージディスプレイライブラリーを表すＶドメインの無作為な組合せから誘導されたバインダーには、そのような決定論的規則は明らかに不可能である。したがって、本発明は、ハイブリドーマ培養物から分泌されたＩｇＧのハイスループット評価に似た、細菌から分泌されたタンパク質としての抗体フラグメントの評価を可能にする方法を開示する。本明細書に記載されるそのような方法は、ハイスループットを可能にすることにおける要因のうちの１つである。特定の先行技術は、そのような方法を開示している（Winter G et al., 1994., Kirsch M et al., 2005; Loset GA et al., 2005; Petropoulos K, 2012. Phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols; Rader C, 2012a. Selection of human Fab libraries by phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols）。しかし、これらの方法は、このアプローチから予想される遺伝子型−表現型解離の更なる解決を示唆していない。したがって、本明細書に記載された実施例は、観察された表現型を基礎となる遺伝子型に割り当てる能力を維持しながら、まとめてスクリーニングするときにファージディスプレイ技術の本質的な力（表現型が遺伝子型に連結）を利用し続けるが、各クローンの表現型をスクリーニング（表現型が遺伝子型に連結しない）するときにタンパク質として抗体を分析する生化学的原理を用いる、新規段階的評価システムを説明する。

本発明の方法は、他の要因やプロセスの中でも、ファージによって提示され得るが水中で単離されたタンパク質としても安定である抗体のフォーマット、及びタンパク質などの形態でを分泌する宿主細菌の能力に関する理論及び方法を検討及び確立することによって目的を達成する。タンパク質としてのｓｃＦｖは、水性環境にある場合、Ｆａｂと比較して一般に安定性が低く、より凝集しやすいことが知られている（Weidner KM et al., 1992; Holliger P et al., 1993; Kortt AA et al., 1997; Quintero-Hernandez V et al., 2007）。慎重な研究は、これがＶ_ＬドメインとＶ_Ｈドメインの所与の組み合わせによって導かれる副現象（Rothlisberger D et al., 2005）、及び強化された熱力学的安定性よりもＦａｂの展開速度が本質的により遅いという事実（Honegger A, 2008）であることを示唆している。ＦａｂはｓｃＦｖよりも高い本質的な安定性を有するので、本発明は前記ライブラリーの構築のためのＦａｂの使用を開示する。Ｆａｂ又はペグ化Ｆａｂは治療組織体として直接役立つことができるので、Ｆａｂの使用は更に有利であり、これは発見と製造の間の時間を短縮することにおける利益を考慮するときに好ましい。対照的に、ｓｃＦｖは、血液循環における寿命が短い（Chames P et al., 2009）ために診断用又は複合治療薬としてしか機能することができず、したがって、一般に代替治療用途のために再フォーマットする必要がある。それ故、発見と製造との間の速度の損失はかなりのものになり得る。更に、Ｆａｂの構造要素を考慮すると、Ｆａｂ内のＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ界面（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）によって作り出されるパラトープ（結合表面）は天然のタンパク質相互作用ドメインであるが、ｓｃＦｖ内のＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ界面によって作り出されるパラトープはリンカーの長さによって制限され、それ故、人工的である（Kortt AA et al., 1997）。したがって、特定の抗原に対するＦａｂによって示される親和性は、天然のＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ界面によって推進され、一方、非天然界面によってｓｃＦｖによって示される親和性は、候補ｓｃＦｖのＦａｂ又はＩｇＧフォーマットへの再フォーマット中に予測不可能な結果をもたらし得る。一方、治療用ＩｇＧフォーマットへのＦａｂの再フォーマットは、実際には安定性の向上から恩恵を受けるであろう（Casadevall A and Janda A, 2012）。

宿主細菌がタンパク質としてこれらの安定な形態を分泌することを可能にするために、本発明は、ペリプラズム空間を用いてファージ製造をさせるファージディスプレイ技術に固有の設計を有利に利用する（Webster R, 2001. Filamentous phage biology. In: Phage Display: A Laboratory Manual）。本発明は、抗体フラグメントについて組み換えて増殖する細菌からのペリプラズム抽出物を、Ｆａｂの存在、非存在及び相対収量について試験し、本方法の忠実度を損なうことなくハイスループットを可能にする、ハイブリドーマ様のスクリーニングを開示する。発現されたｓｃＦｖの定性分析のためのペリプラズムのウェスタンの適用は、先行技術において報告されている（Loset GA et al., 2005; Eisenhardt SU and Peter K, 2010. Phage display and subtractive selection on cells. In: Antibody Engineering; Vol. 1）。しかし、本出願は、パニングされたＦａｂディスプレイライブラリーからタンパク質としてＦａｂをスクリーニングするためのそのような方法を初めて開示する。このアプローチはまた、２つの異なるシストロン（軽鎖及び重鎖）に対する２つの異なるペリプラズムリーダーの標準Ｆａｂ設計が実際にペリプラズムで発現されるヘテロダイマーＦａｂタンパク質をもたらしたかどうかの決定的な検証を可能にする。したがって、このアプローチの利点は、早期の発見段階で、合理的な検出レベルで存在する機能的Ｆａｂタンパク質を得て、低い検出レベルにあるクローンを拒絶することに、注意及び努力を集中させることである。しかし、大腸菌のペリプラズム中で可溶性タンパク質としてヒトＦａｂを発現させるこのアプローチは、低収量を引き起こし得る（Better M et al., 1993; Humphreys DP, 2003）。低収量の直接の原因としては、ペリプラズム中のミスフォールディング（Skerra A and Pluckthun A, 1991; Humphreys DP, 2003）や、そのミスフォールディングされたポリペプチド、特に軽鎖を消化することができるペリプラズムのプロテアーゼの存在が挙げられる（Chen C et al。 2004）。ミスフォールディングの遠位の原因は、ホスト種とゲスト種との間の差次的なコドン使用頻度の組込み制限、及びファミリー特異的なＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ界面の安定特性を含み得る（Ewert S et al., 2004, Tiller T et al., 2013）。

合成ライブラリー構築のために、又は下流の目的で複数グラムのタンパク質を作製するために、大腸菌のペリプラズム中のＦａｂ又はＦａｂ’の収量を増加させるための特定の方法が利用可能であるが、先行技術中のその方法の多くはある程度の制限を有する（Humphreys DP and Bowering L, 2009. Production of antibody Fab' fragments in E. coli. In: therapeutic Monoclonal Antibodies: from Bench to Clinic；ＵＳ８０６２８６５；Tiller T et al., 2013）。また、初期の発見段階で、ナイーブなライブラリーからタンパク質として数百のＦａｂをスクリーニングするために適用できるものは存在しない。本発明は、増強された化学発光に基づくウェスタン（１〜３ｐｇ／バンド）についての検出限界で、ペリプラズム中にヘテロダイマーＦａｂを産生しないクローンを排除するための最初の表現型のスクリーニングとしての評価を初めて開示する。したがって、本発明は、時間及び費用の点で有利に利益を得、いくつかの抗原特異的バインダーを失う可能性があるとしても、発現が不十分なクローンを取り扱う必要性の欠点を克服する。このゲートのもう１つの利点は、抗ヒトκ及びλ特異的抗体を用いた同時免疫ブロッティングによってこれらのペリプラズムのヒットの型を検出することができ、したがって、混合されたκ及びλライブラリーを用いてパニングを行うときにこれらのクローンを配列決定する必要性を回避できることである。

本発明は、抗原特異的Ｆａｂタンパク質バインダーを高い忠実度で得ることにおける制限を克服するための方法及びプロトコールの最適セットに到達するための方法／プロセスを開示する。上記の最初のアプローチの限界は、ペリプラズムに存在するとして発見され、ヘテロダイマーであると仮定された抗体が、多くの場合、実際には軽鎖又は重鎖のホモダイマーであるということであった。ＥＬＩＳＡ開発のための２部位（２−ｓｉｔｅ）概念（Harlow E and Lane D, 1988. Immunoassays. In: Antibodies: A Laboratory Manual; Lawson ADG et al., 1997）を利用して、ヘテロダイマーのＦａｂを製造しそうなクローンを同定することによって前記制限が克服された。本明細書に含まれる実施例は、本出願が基礎的な２部位概念を拡張させて、新規なチェイン−スイッチ（ｃｈａｉｎ−ｓｗｉｔｃｈ）ＥＬＩＳＡシステムを開発し、それによって、ヘテロダイマーＦａｂを産生するクローンからホモダイマーＦａｂを産生するクローンを区別することができるだけでなく、Ｆａｂ量／体積の観点で定量的に収量を推定する非常に決定的な目的を達成することができることを説明する。この画期的な改善は、ウェスタンによる定性的評価の初期システムからの大きな前進であり、本出願の発明的な長所の１つを示す。

本発明は、ペリプラズムのｑＥＬＩＳＡが以下の工程を含む、パニングされた抗体ファージディスプレイライブラリーから抗体を得る方法：
ｉ）溶出液タイトレーションプレートから単一の細菌コロニーからの可溶性Ｆａｂを得ること、
ｉｉ）９６ウェル荷電ポリスチレンプレートの表面を重鎖に対するキャプチャー抗体でコーティングすること、
ｉｉｉ）工程（ｉ）からの可溶性Ｆａｂを、工程（ｉｉ）からのコーティングさされた表面上にキャプチャーすること、
ｉｖ）軽鎖特異的抗体を用いることで軽鎖を検出し、全長のタンデムインフレームのヘテロダイマーの可溶性Ｆａｂを同定すること、を開示する。

更に、パニングキャンペーンからのバインダーのプールからの有望なバインダークローンを９６ウェルプレートで増殖させることができ、したがってその培養物が誘導されてペリプラズム中にＦａｂを産生し（Kontermann RE, 2010. Immunotube selections. In: Antibody Engineering; Vol. 1; Hust M and Mersmann M, 2010. Phage display and selection in microtitre plates. In: Antibody Engineering; Vol. 1; Petropoulos K, 2012. Phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols）、ペリプラズムがインサイチュで簡単な溶解によって収集され（ＷＯ０１／９４５８５；Humphreys DP and Bowering L, 2009. Production of antibody Fab' fragments in E. coli. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic）、上清がハイブリドーマ培養上清と同様の９６ウェルフォーマットでタンパク質としてのＦａｂの評価のために回収されるために、ＥＬＩＳＡフォーマットでのＦａｂタンパク質の評価の開発によって、ハイスループットがすぐに可能になる。これらのマスターカルチャーのレプリカはグリセロール保存液として凍結保存する（Petropoulos K, 2012. Phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols; Protocol: Use of Glycerol Stocks and Preparation of Transfection-Quality Plasmid DNA; Broad Institute, Boston, MA, 2015）ことができ、望ましいタンパク質特性を有するクローンを最も容易に再増殖及び調査することができる。これらの工程のいずれもファージディスプレイの更なる関与を必要としない。

本発明は、可溶性Ｆａｂを得ることが以下のステップを含む、パニングされた抗体ファージディスプレイライブラリーから可溶性Ｆａｂを得る方法：
ｉ）非アンバーサプレッサー宿主の力価プレートから単一クローンを選び、３７℃及び２５０ｒｐｍで一晩増殖させるために９６ウェルディープウェルプレートで液体培養させること、
ｉｉ）一晩培養物を１０倍希釈し、工程（ｉ）と同一の条件下で対数期まで増殖させること、
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の対数期の培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３０℃及び２５０ｒｐｍで一晩増殖させること、
ｉｖ）９６ウェルプレート中で工程（ｉｉｉ）の培養物を遠心分離して、誘導された細胞をペレット化すること、
ｖ）同じ９６ウェルプレート中、３０℃で一晩ゆっくり振盪しながら、緩衝液中で高濃度のＥＤＴＡを用いることで、工程（ｉｖ）のペレット化された細胞をペリプラズムの抽出をすること、
ｖｉ）遠心分離して、スフェロプラスト及び細胞片から離れて、工程（ｖ）の拡散されたペリプラズムの画分を単離すること、を開示する。

従来技術は、溶液パニングキャンペーンからバインダープールを得た後の可溶性タンパク質としてのモノクローナルＦａｂの特定のハイスループットスクリーニングを開示している（Petropoulos K, 2012. Phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols; Rader C, 2012a. Selection of human Fab libraries by phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols）。しかし、Petropoulos K, 2012によって記載されたプロトコールの主な欠点は、可溶性Ｆａｂとしてスクリーニングする前に、有望なモノクローナルバインダーのファージミドＤＮＡをプールとして発現ベクターに再クローニングすることを必要とすることである。そのような要求は、確かに速度の著しい減速、更にサブクローニング過程の間にバインダーを失う可能性をもたらす。更に、このプロトコールは、細胞質画分からペリプラズム画分を単離するための努力をしていない。これは、Ｆａｂのペリプラズムの転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）特性を検証することができない限りにおいて不利である。最後に、先行技術のプロトコールは、検出のために抗Ｆａｂポリクローナル抗体を用いるが、Ｆａｂの収量を定量しない。対照的に、本出願の発明は、（ａ）重鎖及びｇＩＩＩの間のアンバー終止コドンの利点と、非アンバーサプレッサーホストの使用とを取ることで、バインダープールの再クローニングを必要とせず（参照、本明細書のｐＳＳＹ１の節）、（ｂ）ペリプラズム画分を残りの大腸菌画分から分離することを可能にする穏やかなペリプラズム単離法を利用し、（ｃ）ヘテロダイマーＦａｂのみを明確に能力に適するか、及び定量するためにチェインスイッチ概念を用いる。

Rader C, 2012aに記載されているプロトコールは、ポリスチレンプレート上に軽鎖ポリクローナル抗体を固定化し、その抗体上に粗Ｆａｂ調製物をキャプチャーし、重鎖Ｃ末端タグで検出することによる２部位ＥＬＩＳＡの概念を使用する。しかし、このプロセスは定量的アッセイに開発されていない。上記の通り、このプロセスは、低いスループット（３２クローンのサンプリングに１４ｍｌの試験管を使用）であり、実際にペリプラズムのタンパク質が濃縮された画分を単離する可能性が低い誘導培養の単純遠心分離から単離されたＦａｂ−ｐＩＩＩ融合物をサンプリングする。対照的に、本明細書に例示される本発明は、（ａ）記載されているもの（Petropoulos K, 2012. Phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols）と非常に類似したハイスループット培養、誘導及び保存方法を使用し、（ｂ）重鎖及びｇＩＩＩの間のアンバー終止コドンの利点、及びｐＩＩＩなしでＦａｂを産生するための非アンバーサプレッサー宿主の使用を取り（参照，本明細書のｐＳＳＹ１の節）、（ｃ）ペリプラズム画分を残りの大腸菌画分から分離することを可能にする穏やかなペリプラズム単離方法を使用するように注意し、（ｄ）ｐＩＩＩ融合なしでヘテロダイマーＦａｂのみを明確に能力に適するか、及び定量するためにチェインスイッチ概念を用いる。

本出願は更に、表面が、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）又はＰｏｌｙＳｏｒｐ（商標）等の荷電ポリスチレンの表面であってよく、又はアビジン、ストレプトアビジン若しくはニュートラアビジンでコーティングされてよく、好ましくはＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）の表面が２０〜１００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度のストレプトアビジンでコーティングされている、抗体ファージディスプレイライブラリーから抗体を得る方法を開示する。

キャプチャー抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）；Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント）、又はＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ｂｉｏｔｉｎ Ａｎｔｉ−ＩｇＧ−Ｃ_Ｈ１ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを含む群から選択され、好ましくは１０００〜１００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌの濃度のビオチン化抗Ｃ_Ｈ１抗体である。

軽鎖特異的抗体が、ヤギ抗ヒトλＬＣ特異的ペルオキシダーゼコンジュゲート、ヤギ抗ヒトκＬＣ特異的ペルオキシダーゼコンジュゲート、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）_２−ＨＲＰ、マウス抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート、マウス抗ヒトκ軽鎖モノクローナル、及びウサギ抗ヒトκ鎖モノクローナルを含む群から選択され、好ましくは抗λについては１〜２００００、最も好ましくは１：１００００の希釈範囲、及び抗κについては１：２０００の希釈範囲である。

本明細書に記載される定量的なチェインスイッチＥＬＩＳＡの開発は、一連の業界標準の評価方法−ハイスループット抗体発見のための動力学的スクリーニング又は親和性ランク付けに直接連結することを可能にする（Schraml M and Biehl M, 2012. Kinetic screening in the antibody development process. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols; Drake AW and Papalia GA, 2012. Biophysical considerations for development of antibody-based therapeutics. In: Development of Antibody-based Therapeutics）。親和性ランク付けの実際的な理由は、文献に記載されている（Tabrizi MA. 2012. Considerations in establishing affinity design goals for development of antibody-based therapeutics. In: Development of Antibody-based Therapeutics）。それは、管理可能な費用で最大の治療上の利益（効力）に必要とされる抗体用量の最良の予測因子の１つである。より高い親和性の抗体は、一般に、主として抗原濃度及びインビボでの代謝回転によって決定されるより高い効力をもたらす。早い発見段階でそれらの動力学的パラメーターに関して抗体をランク付けする能力によって、本発明の方法はこの側面でファージディスプレイシステムの能力をハイブリドーマシステムの能力と一致させることができる。動力学的ランク付けの他の利点は、ハイスループット及び熱力学的安定性の評価の可能性である（Schraml M and von Proff L, 2012. Temperature-dependent antibody kinetics as a tool in antibody lead selection. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols）。これは、しばしば抗体製造の非常に重要な関心事である、タンパク質凝集の予測因子（Thiagarajan G et al., 2016）である。

競合ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴を用いて、親和性ランク付けを行うことができる。競合ＥＬＩＳＡには、検出ハンドルとして使用できる標識抗原が必要である。この追加の、そしてしばしば達成が困難な要件のために、そのようなアッセイは、今日、データ生成の初期の方法よりもむしろバリデーションのためにより多く用いられている。対照的に、ＳＰＲはラベルフリーの方法であり、ソフトウェアとハードウェアの継続的な改善に伴って、今日、抗体親和性データを生成するための最適な方法になった。動力学的分析に望ましいＳＰＲ表面は、ＦａｂのＦｖ表面（パラトープ）がＳＰＲフローセル中で流れる水層（抗原を伴うか伴わない）に面するようにＦａｂが配向されるところである。これは、配向された方式で粗Ｆａｂ候補の定量的キャプチャーを可能にし、動力学的ランク付けを可能にする表面を必要とする。全長ＩｇＧのそのような配向された表面は、文献に十分に記載されている（Canziani GA et al., 2004; Schraml M and Biehl M, 2012. Kinetic screening in the antibody development process. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols）。しかし、Ｆａｂ（定義によりＦｃドメインを欠く）については、そのような文献は実際にはまばらである（Leonard P et al., 2007）。したがって、パイオニアは、抗原それ自体をＳＰＲチップの表面に固定化して動力学的パラメーターを決定する以外に選択肢はなかった（de Haard HJ et al., 1999; Steukers M et al., 2006）。そのようなアプローチは、興味深いエピトープをマスキングするという明確な可能性を伴う直接ＥＬＩＳＡを模倣する。詳細なプロトコールは先行技術では利用できないが、Ｆａｂについてもそのような配向された表面の作製を可能にする新しい試薬が現在市販されている。本発明は、いくつかのそのような表面を研究し、本明細書に実施例を示す。

本発明は、動力学的ランク付けが以下の工程を含む、抗体ファージディスプレイライブラリーから抗体を得る方法：
ｉ）５０ｍｌの個々の培養物中のｑＥＬＩＳＡ陽性クローンから可溶性Ｆａｂを得ること、
ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＦａｂを１×ＰＢＳに対して透析すること、
ｉｉｉ）動力学的分析のために、生理的な強度及びｐＨの流れる緩衝液を使用すること、
ここで、緩衝液は、０．１〜１．０Ｍ、好ましくは０．２５〜０．７５Ｍ、より好ましくは０．４〜０．６ＭのＮａＣｌ又はＫＣｌの濃度、及び０．００５〜０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０濃度を含むリン酸塩又はＨＥＰＥＳ、より好ましくはリン酸塩であることができ、
ｉｖ）ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）チップ固定化表面を選択すること、
ここで、この表面は、荷電デキストラン、荷電アルギン酸塩、荷電デキストラン又は荷電アルギン酸塩の上にコーティングされたニッケルニトリロテトラ酢酸、又は荷電デキストラン又は荷電アルギン酸塩の上にコーティングされたストレプトアビジン若しくはニュートラアビジンであることができ、
ｖ）工程（ｉｖ）のＳＰＲ表面のために固定化化学を選択し、
ここで、その化学は、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）及びスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を用いたアミンカップリング、１０ｍＭの硫酸ニッケルを用いたＮｉ^２＋荷電、又はストレプトアビジン−ビオチン認識化学であることができ、
ｖｉ）工程（ｖ）からのチップ表面上に抗Ｆａｂキャプチャー抗体を固定化すること、
ここで、キャプチャー抗体は、抗Ｆａｂ ＩｇＧ、抗Ｈｉｓ、抗ＨＡ等の抗タグ抗体、ビオチン化抗Ｃ_Ｈ１、又はビオチン化二価抗Ｃ_Ｈ１／抗Ｃ_λ、又はビオチン化抗Ｃ_Ｈ１／抗Ｃ_κ、又はビオチン化二価抗Ｃ_Ｈ１／抗Ｃ_λとビオチン化抗Ｃ_Ｈ１／抗Ｃ_κの両方の５０：５０混合物を含むことができ、
ｖｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた粗ペリプラズムＦａｂを、工程（ｖｉ）からのチップのキャプチャー抗体でコーティングされた表面上にキャプチャーすること、
ｖｉｉｉ）２〜１５分間の中間休止時間で、チップ表面上に１〜３回のラウンドの流れる緩衝液の注入で信号を安定化すること、
ｉｘ）分析物の最適濃度で工程（ｖｉｉ）のキャプチャーされたＦａｂに対する分析物の応答を試験して、標的抗原バインダーと非バインダーとを区別すること、
ｘ）再生試薬を用いてＦａｂ−分析物複合体を除去して、表面を次ラウンドのスクリーニングに再使用すること、
ここで、再生剤は、２Ｍ ＭｇＣｌ_２、０．８５％Ｈ_３ＰＯ_４、５０ｍＭ ＮａＯＨ又は１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０を含むことができる、を開示する。

先行する段落で説明したＦａｂ発見のための方法の組み合わせは、２つの目的を達成する。１つ目は、ファージライブラリーからの抗体発見への製造可能性の概念の拡張が最初の段階から可能になるということである。このような系から発見されたＦａｂは、計画的ではなくゲーティングシステムを適用できる収量の範囲で、計画的にペリプラズム中に発現される定量可能なヘテロダイマー分子として、自信を持って評価できる。２つ目は、ＳＰＲチップ上の粗Ｆａｂキャプチャーのための一貫した方法の確立によって、チップ上のキャプチャーされたＦａｂ自体への標的抗原の結合を調べること、すなわちポリスチレン表面に抗原が固定化された直接／間接ＥＬＩＳＡによって通常行われる機能が可能になる。後者のアプローチは、前記の興味深く関連性のあるエピトープを隠すことができる。言い換えれば、本発明のＳＰＲチップ上の新規な粗Ｆａｂキャプチャーシステムは、エラーを起こしやすい抗原特異的ＥＬＩＳＡを迂回するだけでなく、抗原を認識するＦａｂについて動力学的パラメーターを直接得て、したがって、発見に必要な時間を短縮することも可能にするとの点で、二重に有利である。本明細書に含まれる実施例は、このようにして評価されたＦａｂが真の遺伝子型でもあること、すなわち、ペリプラズム抽出物上のチェインスイッチＥＬＩＳＡとオンチップの動力学的ランク付け（表現型の決定）の組合せが、事後配列分析（遺伝子型の決定）によって決定されるタンデムのインフレームの軽鎖−重鎖Ｆａｂ構造中の完全なＯＲＦを有するクローンのみを発見することを示す。

抗体の供給源としての超大型ナイーブファージディスプレイライブラリーの作製
前節で記載された段階的評価システムは、Ｆａｂが、安定性の理由から抗体発見のための好ましいフォーマットであり、ハイスループット方式でタンパク質として首尾よく評価され得ることを示唆する。この設計決定は、ファージ増幅の制約、大腸菌における発現の乏しさ、並びに段階的評価プロセス自体によって課される厳格さのために、多数の有望なバインダーが失われるという真実、したがって、その損失を補償するために超大型Ｆａｂライブラリーが作製され、ディスプレイ方法による抗原認識のために利用可能にされるとの必要性に、加えられた。

大きなライブラリーを作製するための最初の理論的根拠は、治療範囲（サブｎＭ〜ｐＭの範囲のＫ_Ｄ）で抗体を回収するために可能な限り多くの多様なＶドメインの組合せをキャプチャーすることである。したがって、基礎となる仮定は各組換クローンが異なるＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ組合せを表すこと（Hoogenboom HR et al., 1991; Waterhouse P et al., 1993）であるから、ライブラリーサイズはこの多様性を表す。この仮定は、非常に多数のクローンを配列決定しないで検証するのは困難である。常習的な切断酵素（ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＯＩ、ＡｌｕＩ等）でプラスミドＤＮＡを消化し、アガロースゲル上で消化を実行し、得られたフィンガープリントを研究することは、多様性、しかし最も確実には配列情報の弱い代用品を評価するために慣例的である。サンガーシーケンシングは、長いフラグメント長を読み取る能力があるため、ｓｃＦｖ又はＦａｂフォーマットに埋め込まれたＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈペアリングの読み取りに非常に適している。しかし、サンプル調製、シーケンシング及び分析のスループットによって、数百以上のクローンについてサンガーシーケンシングを実行することができない。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、この問題を解決するために適用された（Geyer CR et al., 2012. Recombinant antibodies and in vitro selection technologies. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols; Glanville J et al., 2015）。しかし、読み取り長さの制限によって、ＮＧＳは１０^６個を超えるクローンについてｓｃＦｖライブラリーのＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈペアを明白に読み取ることができない。したがって、少なくとも１回のラウンドのパニングの後にライブラリーの多様性が減少した後に、この手順は、バインダーを濃縮するためにより成功している（Ravn U et al., 2013; Glanville J et al., 2015）。読み取り長の制限は、Ｖ_Ｌ−Ｖ_Ｈペア以外に軽鎖及び重鎖カセットのタンデムインフレームの性質を確認する必要がある場合、現在、ＦａｂライブラリーがＮＧＳによる検証に適していないことを意味する。複雑なライブラリーの地図を構築するための短い読み取りデータの新規のアセンブリにおける最近の開発（Cho N et al., 2015）は、この問題を解決するかもしれない。この検証の問題に関わらず、最大のパラトープカバレッジの基本原理は、免疫から得ることがほぼ不可能である自己抗原を含むほとんどすべての抗原に対する抗体を見つけるファージディスプレイライブラリーの能力にとって重要である。更に、ライブラリーのサイズとバインダーの親和性との間にはほぼ直線状の相関関係が存在し、ライブラリーが大きいほど、治療用範囲の抗体を見つける可能性が高い（Hust M et al., 2009. Antibody phage display. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic; Lowe D and Vaughan TJ, 2009. Human antibody repertoire libraries; In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic）。したがって、大きなライブラリーを作製することは、この点からも有利である。

超大型ナイーブライブラリーを構築する際、本発明及び本明細書で利用される方法は、サイズ、迅速なスループット及び経済的利点を確保しながら、ライブラリーの多様性とバランスをとる。

本発明は、５．３８×１０^１０〜２．５５×１０^１１（１．２６×１０^１１）ｃｆｕのκライブラリー及び７．３３×１０^１０〜３．５９×１０^１１（１．７９×１０^１１）ｃｆｕのλライブラリーを含む、８．８６×１０^１０〜９．１３×１０^１１（３．０６×１０^１１）ｃｆｕの範囲のサイズを有するナイーブ抗体ファージディスプレイライブラリー（ＡＰＤＬ）を開示する。

以前に、従来技術の欠点を克服するために、代替的なディスプレイシステムを構築することによるいくつかの試みがなされてきた。代替的なディスプレイシステムは、酵母ディスプレイ（Boder ET and Wittrup KD, 1997; Weaver-Feldhaus JM et al., 2004）、細菌ディスプレイ（van Blarcom TJ and Harvey BR, 2009. Bacterial display of antibodies. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic）及び哺乳動物ディスプレイ（Tomimatsu K et al., 2013; Horlick RA et al., 2013）を含むインビボシステムと、リボソームディスプレイ（Hanes J and Pluckthun A, 1997）、ＤＮＡディスプレイ（Sumida T et al., 2009）、ｍＲＮＡディスプレイ（Roberts RW and Szostak JW, 1997）及びビーズディスプレイ（Diamante L et al., 2013）を含むインビトロシステムとに分類することができる。インビボシステムは通常、細胞表面タンパク質上に発現された抗体フォーマット（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）を固定して、表現型−遺伝子型の連結を維持することに依存している。同様に、インビトロシステムは、リンカーを介して転写ユニットをアンカー（リボソーム、ピューロマイシン又はポリスチレンビーズ）に固定して、表現型−遺伝子型の連結を維持する。しかし、ファージディスプレイシステムと同様に、インビボシステムは、ライブラリーサイズが、通常１０^９の変異体を超えることを可能にしない形質転換効率によって制限され、したがって、ナイーブ免疫レパートリーをキャプチャーするためのそれらの有用性を制限する。対照的に、インビトロシステムは１０^１２〜１０^１４の変異体を表示することができるが、操作の困難性及び計画的にヘテロダイマータンパク質を製造することができないことの両方によって制限される（唯一の例外は最適化が困難なＤＮＡディスプレイシステムである）。したがって、これらのシステムは、親Ｆａｂテンプレートの親和性の成熟等の候補タンパク質の分子進化が望まれるシナリオにおいて最も有用である。したがって、ファージディスプレイライブラリーは、それらの単純さ、頑強さ、及び複数の治療用又は診断用抗体の発見における実績のために、所与の抗原を認識する能力を有するＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ組合せの初回通過回収のための選択方法として残っている（Hust M et al., 2009. Antibody phage display. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic; Lowe D and Vaughan TJ, 2009. Human antibody repertoire libraries; In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic）。

ファージディスプレイライブラリーは、ファージ又はファージミドベクターバックボーンのいずれかの上に作製することができ、結果として利点及び不利点が生じる（Scott JK and CF Barbas III. 2001. Phage-display vectors. In: Phage Display: A Laboratory Manual）。ファージミドは、真の親和性による選択を可能にする抗体フラグメントの一価の表示のため、及び大腸菌における形質転換効率がファージベクターと比較して遥かに優れているという事実のための両方に好ましい。それにも関わらず、この優れた効率でさえ、インサートフラグメントに連結された制限消化プラスミドベクターに対して通常達成可能な最大形質転換効率、約１０^９ｃｆｕ／μｇによって制限される。対照的に、スーパーコイルプラスミド調製物について達成可能な最大効率は、少なくとも１桁（ｌｏｇ）高い（１０^１０ｃｆｕ／μｇ；Hoogenboom HR et al., 1991; Sambrook J and Russell DW. 2001b. The Hanahan method for preparation and transformation of competent E. coli: High efficiency transformation. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 1）。しかし、上記のように、形質転換効率のこれらの制限は、ライブラリーを作製するために大腸菌においてキャプチャーできるランダムＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ置換の数を制限し、それ故、抗体の集団に２段階で、又は２つの独立した同時に形質転換されたカセットで大きなライブラリーを作製させ、Ｖ_ＬとＶ_Ｈの両方の多様性のキャプチャーを確実にした（Waterhouse P et al., 1993; Griffiths AD et al., 1994; de Haard HJ et al., 1999; Ostermeier M and Benkovic SJ, 2000; Hoet RM et al., 2005）。したがって、これらの制限をより高くすることができれば、大きなＦａｂ−ファージディスプレイライブラリーを構築するのに有利である。本明細書中に提示される実施例は、これらの制限を超えることが実際に可能であり、唯一の制限が１リットルの細菌培養物中に存在し得る最大大腸菌数（１０^１２／Ｌ；Hoogenboom HR et al., 1991）である１つの工程で大きなＦａｂファージディスプレイライブラリーを構築するために適用され得ることを示す。

本発明は、ウルトラコンピテントセル５０μｌ当たり２５〜４００ｎｇ、好ましくは１００〜３５０ｎｇ、より好ましくは２００〜３００ｎｇのＤＮＡ対細胞体積比で、形質転換が実施される、ＡＰＤＬを製造する方法を開示する。

本発明は更に、０．１、０．２、０．４ｃｍ、好ましくは０．２ｃｍの電極間距離のキュベット中で、１５００〜３５００ボルト、好ましくは２５００〜３２００ボルトの範囲の電圧で、１０〜３０μＦ、好ましくは２０〜２８μＦの範囲の静電容量で、１００〜４００オーム、好ましくは２５０〜３５０オームの抵抗で、形質転換が実施される、ＡＰＤＬを製造する方法を開示する。宿主は、ＴＧ１、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ、及びＥＲ２５３７を含む群から選択されるアンバーサプレッサーｔ−ＲＮＡコード宿主、好ましくは超高なコンピテンス（４×１０^４ｃｆｕ／μｇ）のＴＧ１である。

本発明は、より高い形質転換効率細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎから入手）の使用を開示する。それ故、本発明は、Ｆａｂインサートフラグメントに連結された制限消化ファージミドベクターのより高い形質転換効率を報告する。この有利な利用によって、本発明は、より少ない数の形質変換を利用して本明細書に記載される大きなナイーブライブラリーに到達することができる。

本発明はまた、ベクター及びインサートの連結の形質転換効率がＤＮＡの品質及び連結の適合性に依存することを開示する。ＤＮＡの品質の問題は以前に焦点を当てて改善されてきた（Martineau P, 2010. Synthetic antibody libraries. In: Antibody Engineering; Rader C, 2012b. Generation of human Fab libraries by phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols）が、連結の適合性の問題は未だ改善がなされていない。詳しく述べると、ほとんどの抗体クローニングフォーマットはカセットクローニングアプローチを使用し、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ又はＣ_Ｈ１フラグメントがＰＣＲに基づく増幅、融合、Ｖドメイン内でほとんど切断されない酵素での制限消化、及びベクターへの連結のためにモジュール的に処理される（Persic L et al., 1997）。本発明は、ＰＣＲ増幅され融合されたフラグメントの集団の制限消化後に生成された突出末端がベクター中の適合性のある突出末端との最少数のミスマッチを有するときに最高の形質転換効率が得られることを開示する。エレクトロポレーションによるより高い形質転換効率を達成するための連結混合物からの塩除去の重要性などの他の改良が記載されている（Chowdhury PS, 2002. Targeting random mutations to hotspots in antibody variable domains for affinity improvement. In: Methods in Molecular Biology, vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols）。本発明は、実施例でミクロ濃縮器による限外濾過を使用して同様の有益な効果を示す（de Haard HJW, 2002. Construction of large naive Fab libraries. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols; Green MR and Sambrook J, 2012a. Concentrating and desalting nucleic acids with microconcentrators. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 1）。有用性を有利に改善する、キャプチャーされたＦａｂの有望な翻訳可能性を増加させるためのこれらのフラグメントの高い忠実度の増幅及びシームレスな融合の有益な効果もまた、本出願に開示されている。

本発明は、キャプチャーされた免疫レパートリーをベクター中に表示することが、以下の工程を含む、ＡＰＤＬを製造する方法：
ｉ）ファージミドベクター中にＦａｂを連結すること、
ｉｉ）連結された混合物で適切な宿主を形質転換すること、を開示する。

本発明は、配列番号３２及び３４を使用して得られるＦａｂレパートリーの連結が、以下の工程によって行われる、ＡＰＤＬを製造する方法：
ｉ）１１〜３７℃で、好ましくは１１℃で、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ特性を用いてＦａｂを平滑末端化し、３７℃で１〜１．５時間、好ましくは１．５時間、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて平滑末端化されたＦａｂの５’末端をリン酸化すること、
ｉｉ）４〜１６℃の温度範囲で、好ましくは１６℃で１６時間、続いて２５℃で１時間、１．５〜９％ｗ／ｖ、好ましくは４〜７％ｗ／ｖ、より好ましくは６％ｗ／ｖの範囲の最終％で、分子量６０００〜３２０００ダルトン、好ましくは８０００ダルトンのポリエチレングリコールを含む群から選択される添加剤の存在下、５０〜４００ｎｇ／μｌ、好ましくは２００ｎｇ／μｌの濃度範囲の全ＤＮＡと共に、工程（ｉ）で得られたＦａｂを自己連結させること、
ｉｉｉ）５０℃で１６時間、工程（ｉｉ）からの自己連結されたＦａｂ集団を３２Ｕ／μｇのＳｆｉＩで制限消化して、突出末端を有する直鎖状Ｆａｂを放出させ、続いてアガロースゲルで精製すること、
ｉｖ）１６℃の温度で１６時間、続いて３７℃で１時間、工程（ｉｉｉ）で得られた直鎖状Ｆａｂを、ｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターに突出末端で連結させ、７０℃で１５分間熱不活性化すること、を開示する。

本発明は更に、配列番号３４及び３５〜３７を用いて得られたＦａｂレパートリーのｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターへの連結が、以下の工程によって行われる、ＡＰＤＬを製造する方法：
ｉ）５０℃で１６時間、直鎖状Ｆａｂ集団を３２Ｕ／μｇのＳｆｉＩで制限消化して、突出末端を有する直鎖状Ｆａｂを放出させ、続いてアガロースゲルで精製すること、
ｉｉ）１６℃の温度で１６時間、続いて３７℃で１時間、工程（ｉ）で得られた直鎖状Ｆａｂを、突出末端で連結させ、７０℃で１５分間熱不活性化すること、
を開示する。

本発明は、配列番号３４及び５５を用いて得られたＦａｂレパートリーのｐＳＳＹ１ベクターへの連結が、以下の工程によって行われる、ＡＰＤＬを製造する方法：
ｉ）５０℃で１６時間、直鎖状Ｆａｂ集団を３２Ｕ／μｇのＳｆｉＩで制限消化して、突出末端を有する直鎖状Ｆａｂを放出させ、続いてアガロースゲルで精製すること、
ｉｉ）１６℃の温度で１６時間、続いて３７℃で１時間、工程（ｉ）で得られた直鎖状Ｆａｂを、突出末端で連結させ、７０℃で１５分間熱不活性化すること、を開示する。

本発明はまた、効率を少しも低下させることなく、固定量の高形質転換効率のＴＧ１細胞中に形質転換することができる最大量のＤＮＡを開示する（参照，実施例）。ライブラリー構築がサイズと形質転換の効率との間の妥協点であることは自明と思われるが、最適なサイズ、多様性及び費用のバランスを取るライブラリーは現在のところ先行技術には見出されていない。本出願は、タイトレーションの原理を利用することによってそのような数を開示する。本明細書に含まれる実施例は、この決定によって、変換の数を劇的に減少させることにおいて本明細書に記載の本発明の方法が可能になったことを示す。そのような減少によって、比較的少量の連結ＤＮＡと遥かに短いターンアラウンド時間とを伴う、非常に大きなライブラリーサイズがもたらされた。ライブラリーの作製速度の向上は、生物防御的なシナリオで病原体特異的抗体を迅速に発見するために免疫ライブラリーを作製する必要がある場合に有利になる。同様に、試薬使用における大幅なコスト削減が、ＰＣＲ増幅され融合された少量のＤＮＡを用いることで達成され得る。本発明は、変換の数を減らし、それによって時間と費用の利益を伴って、サイズを大きくする方法を開示する。本明細書に示されるライブラリー及びライブラリーに到達する方法のいくつかの利点の一つである。

本発明において、１工程の形質変換で１５〜１６０μｇの連結ＤＮＡ、好ましくは２０〜１００μｇ、より好ましくは４０〜５０μｇの連結ＤＮＡからＡＰＤＬが得られる。本発明は、１工程の形質変換で１０〜７０μｇの得られた連結ＤＮＡ、好ましくは２０〜５０μｇ、より好ましくは２５〜３０μｇの連結ＤＮＡからＡＰＤＬが得られる、κサブタイプのＡＰＤＬを製造する方法を開示する。本発明は、１工程の形質変換で５〜６０μｇの工程１５〜２０で得られた連結ＤＮＡ、好ましくは８〜５０μｇ、より好ましくは１０〜２０μｇの連結ＤＮＡからＡＰＤＬが得られる、λサブタイプのＡＰＤＬを製造する方法を開示する。

本発明は、κＡＰＤＬが１．９２×１０^９〜１．９８×１０^１０ｃｆｕ／μｇの効率で得られ、λＡＰＤＬが１．９２×１０^９〜９．１×１０^９ｃｆｕ／μｇの効率で得られる、ＡＰＤＬを製造する方法を開示する。

新規なファージミドディスプレイベクター：ｐＳＳＹ１
本発明は、超大型ライブラリーを作製するための新規ファージミドベクター（ｐＳＳＹ１；配列番号３８及び図２８）を開示する。実施例に示すように、非効率的な連結のために超大型ライブラリーを作製することができなかった親ベクターｐＣＯＭＢ３ＸＳＳに内在する欠陥（図１２；Barbas CF III et al., 1991; Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual）があるために、このベクターの作製が必要とされた。本発明は、親ベクターの設計意図に基づくベクターの再設計を開示するが、この努力はまた、全配列に大きな変化を導入し、本明細書の実施例に記載される著しい利点を提供した。このプラスミドの更なる特徴、及びｐＣＯＭＢ３ＸＳＳとの類似点と非類似点は、実施例２４に示されている。

ＰＣＲ増幅並びにＶ及びＣ遺伝子の融合による組換抗体の製造
本発明は、コンビナトリアルヒト免疫グロブリンレパートリーを作製し、その後のファージミドディスプレイベクターｐＳＳＹ１を用いてクローニング及び表示させるための、ヒトＶ遺伝子の高忠実度の増幅及びそれらのヒトＣ遺伝子との融合のためのＰＣＲ条件の最適化セットを設計及び利用する。この目的のために、先行技術（Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual）に記載される３５個のプライマーのセットを利用し、続いてｐＳＳＹ１ベクターへの効率的な連結を可能にするために改変された。本発明は、前記の３５個のプライマーの増幅及びそれに続くｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターへのそれらの連結のための新規方法を開示する。本発明はまた、改変プライマー及びそれらの増幅並びにその後の新規ベクターｐＳＳＹ１への連結を開示する。

組換抗体の生成は、免疫グロブリンがインビボでどのように組み立てられるかに固有のモジュール性に依存する。手短に言えば、免疫グロブリン分子の軽鎖及び重鎖の両方とも、類似する５’−３’エキソン−イントロン様式で染色体内のそれらのそれぞれの遺伝子群（遺伝子座）に由来するＮ末端からＣ末端の方向に可変（Ｖ）領域、ヒンジ（Ｈ）領域及び定常（Ｃ）領域から構成される。これらの遺伝子群の染色体位置は異なる。ヒト重鎖遺伝子座は第１４染色体（ＩＧＨ遺伝子座；１４ｑ３２．３３）上にあり、ヒト軽鎖遺伝子座は第２染色体（κ又はＩＧＫ遺伝子座；２ｐ１１．２）及び第２２染色体（λ又はＩＧＬ遺伝子座；２２ｑ１．２）上にある。各遺伝子座は複数の遺伝子を含むことができ、全ヒトＩｇ遺伝子の総数は３７１〜４２２の範囲であると推定されている。重鎖のレパートリーの多様性は、最初に生殖細胞系列のＶ、多様性（Ｄ）エクソン及び接合部（Ｊ）エクソンの組換えによって生じるが、軽鎖のレパートリーの多様性は、最初に生殖系列のＶ及びＪエクソンの組換えによって生じる。３つの更なる機構が免疫グロブリン鎖の多様性に寄与している。１つ目の機構は、Ｎ多様性（Ｎはヌクレオチド）と呼ばれ、Ｖ−Ｄ−Ｊ接合部で末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によってランダムにヌクレオチドが欠失及び／又は付加されて、生殖細胞系のＤＮＡにコードされない領域が生じる。２つ目の機構は、体細胞超変異（ＳＨＭ）と呼ばれ、これは特にＶ−Ｄ−Ｊの再構成遺伝子に影響を及ぼし、活性化誘導シチジンデアミナーゼ−ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ−ＤＮＡポリメラーゼΗ（ｅｔａ）酵素複合体、又はエラーを起こしやすいＲＮＡで管理される（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＤＮＡポリメラーゼのいずれかによって制御されると考えられる。機構に関わらず、最終結果は「ホットスポット」でのヌクレオチドの変化であり、それによって生殖細胞系のコードと異なり、一般的に標的抗原に対する親和性の改善がもたらされる。３つ目の機構は、クラススイッチと呼ばれ、重鎖の再配置されたＶ−Ｄ−Ｊの群を様々なヒンジエクソン及び定常エクソンに結合させる。クラススイッチは免疫グロブリンの抗原認識能力に影響を及ぼさないが、分子に最終的な機能性を提供する定常領域への免疫エフェクター細胞の特異な相互作用を可能にする。

免疫グロブリン遺伝子は、Ｂ系統（Ｂ−ｌｉｎｋａｇｅ）由来の細胞でのみ発現され、最初に膜結合受容体として、その後免疫グロブリンタンパク質として分泌される。Ｂ細胞の軽鎖と重鎖の組合せに含まれる可能性がある、組換え、ＳＨＭ又はクラススイッチの種類は、そのライフサイクルの段階に依存する。したがって、組み換え抗体の生成のための免疫組織の供給源は、プロジェクトの目的に依存する。ナイーブなライブラリーを構築するには、生殖細胞系列の最小限の再配置を受け、好ましくはＮ付加又はＳＨＭがないＢ細胞を採取する必要がある。対照的に、免疫ライブラリーを構築するには、親和性成熟Ｖ−Ｄ−Ｊ又はＶ−Ｊの組合せを回収するために優先的にＳＨＭを受けたＢ細胞を採取する必要がある。人体の異なる区画は、それらのライフサイクルの異なる段階のＢ細胞を包み込むので、適切な組織採取のために注意を払わなければならない（Dobson CL et al., 2012. Naive antibody libraries from natural repertoires. In: Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery）。本明細書に記載の通り、本発明に記載の超大型ナイーブＦａｂライブラリーは、ヒト末梢血単核球細胞集団、扁桃及び骨髄から採取されたＢ細胞を用いる。

本発明は、以下の工程を含む、ＡＰＤＬを製造する方法：
ｉ）Ｆａｂを得るための免疫レパートリーのキャプチャー、
ｉｉ）上記のキャプチャーされた免疫レパートリーを適切なベクター中に表示すること、を開示する。

本発明は更に、免疫レパートリーのキャプチャーが以下の工程を含む、ＡＰＤＬを製造する方法：
ｉ）ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成、
ｉｉ）配列番号１〜２３及び４２〜５４を含むプライマーを用いたＶ_Ｌ（λ及びκ）ドメイン及びＶ_Ｈドメインの増幅、
ｉｉｉ）配列番号２４〜２６を用い、そして配列番号２７〜３１を含むプライマーを用いたＣドメインの増幅、
ｉｖ）配列番号３０、３２、３５〜３７及び５５を含むプライマーを用い、それぞれ工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）から得られたＶ_κドメイン及びＣ_κドメイン並びにＶ_λドメイン及びＣ_λドメインの融合による軽鎖のオーバーラップＰＣＲ、
ｖ）配列番号２８及び３３を含むプライマーを用い、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）から得られたＶ_Ｈ及びＣ_Ｈ１の融合物から得られた重鎖のオーバーラップＰＣＲ、
ｖｉ）Ｆａｂを得るための、配列番号３２、３４、３５〜３７及び５５を含むプライマーを用い、工程（ｉｖ）及び工程（ｖ）からそれぞれ得られた軽鎖及び重鎖のオーバーラップＰＣＲ、
ｖｉｉ）各工程でアンプリコンを精製すること、を開示する。

対照的に、合成又は半合成ライブラリーは、インビトロ合成の後、可変ドメインのコア抗原認識アミノ酸（相補性決定領域又はＣＤＲ）がサブクローニングされた可変天然ドメインの固定された天然Ｉｇテンプレート又は固定された合成フレームワーク領域に依存する。

天然の供給源からの組換抗体の生成は、標的Ｂ細胞集団のトランスクリプトーム（ｍＲＮＡ）を採取し、次いでそれを逆転写して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製した後に開始される。次いで、ドメイン特異的プライマーを用いて、ＰＣＲによってｃＤＮＡテンプレートからサブタイプ特異的（κ又はλ）Ｖ遺伝子レパートリーを増幅する。次いで、１つのサブタイプの増幅されたＶドメインをインビトロで反対側のサブタイプと無作為に対形成させて、多数のパラトープを作り出すことが可能になる。リコンビナーゼ又はＤＮＡポリメラーゼに基づく更なるインビトロ操作は、Ｈ領域又はＣ領域を結合させて、表示されることができるＩｇフラグメント又は全長Ｉｇを作製することを可能にする。明らかなように、Ｖドメイン特異的増幅及びランダム対合は、固有のパラトープ情報を破壊する。ある程度、これは、組換抗体生成の設計目標の１つに意図的であり、自己抗原を認識できるか、又は標的抗原に対して非常に高い親和性を有することができる新しいパラトープを生成する。そのようなパラトープは通常インビボで選択解除され、したがって、Ｂ細胞免疫レパートリーには見い出されない（Foote J and Eisen HN, 1995; Hai S-H et al., 2009. Immunogenicity screening using in silico methods: Correlation between T-Cell epitope content and clinical immunogenicity of monoclonal antibodies. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic）。しかし、いくつかの適用には、パラトープの情報を取得することが重要である。その目的のために、連鎖されたＰＣＲの系が記載されている（Meijer PJ et al., 2006）。

設計意図がパラトープをそのままの形でキャプチャーすることであるか、又はＶドメインを無作為に再結合することであるかに関わらず、Ｖドメインを特異的に増幅するためにＰＣＲプライマーが必要である。対立遺伝子変異を更にコードするＶ遺伝子ファミリーの多様性によって、及びナイーブライブラリー又は免疫ライブラリーを作製することを望むかどうかに応じてＶ−Ｄ−Ｊ又はＶ−Ｊの組合せの特定のクラスをキャプチャーする必要があるという事実によって、抗体ファージディスプレイライブラリーを作製するために、思慮深いプライマーセットが設計され、首尾よく使用されている（Marks JD et al., 1991; de Boer M et al., 1994; Sblattero D and Bradbury A, 1998）。すべてのそのようなプライマーは、特定の位置に縮重ヌクレオチドを組み込み、抗体データベース（http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html；http://www.vbase2.org/；http://www.imgt.org/）で利用可能な配列に示されるように、それらの位置でアミノ酸の変動に適応させている。本発明は、Ｓｃｒｉｐｐｓグループによって記載されたプライマーセット（Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual）を利用する方法を開示する。これらのプライマーの設計に用いられる設計意図及び方法は、利用可能である（Burton DR, 2001. Overview: Amplification of antibody genes. In: Phage Display: A Laboratory Manual）。

先行技術に記載された初期のプライマーがレシピエントファージミドディスプレイベクターｐＣＯＭＢ３ＸＳＳに進んだ際、これらのプライマーによって増幅されたＶドメインの効率的なカセットクローニングを可能にしなかったことから、本発明はまた、新規プライマーのセットを開示する。この再設計はプライマーの制限末端を含んだ。特に、再設計は、すべてのＶ_κ及びＶ_λフォワードプライマー並びに最終的なオーバーラップフォワードプライマーに構築されたＳｆｉＩ部位のコアペンタヌクレオチド配列を変更することを含んだ。更なる再設計は、最終のオーバーラップフォワードプライマーとオーバーラップリバースプライマーとの間の相同性の低下を含んだ。本明細書中に例示されるように、これらの設計変更は、増幅されたＦａｂの新しいファージミドディスプレイベクターｐＳＳＹ１への高効率な連結のために極めて重要であった。先に記載し、また本明細書中に例示した通り、本明細書中に記載されたパラメーターで制御された高効率形質転換と組み合わせた高効率な連結によって、初めて単一工程の形質転換で１０^１１ｃｆｕを超えるＦａｂファージディスプレイライブラリーを作製することができる。

ＰＣＲプライマー単独はそれ自体では、テンプレート、特にＶドメインでコードされるもののような多数の変異をコードするテンプレートの忠実度の高い増幅を保証するには十分ではない。長い間、Ｔａｑポリメラーゼが唯一の利用可能な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであったためもあって、先行技術はその使用を主に開示している。しかし、Ｔａｑポリメラーゼはかなり高いエラー率を有し（Tindall KR and Kunkel TA, 1988; Gelfand DH and White TJ, 1990）、Ｖドメイン又はＶＣ融合に終止コドンの導入及びフレームシフトをもたらす（Lowe D and Vaughan TJ, 2009. Human antibody repertoire libraries; In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic; Azzazy HM and Highsmith WE, 2002に概説）。この問題を認識して、最近の当技術分野の実践者は、ＬＡ−ＰＣＲの原理（Barnes WM, 1994）に基づいて、熱安定性ポリメラーゼＢｌｅｎｄを使用している（Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual; Rader C, 2012b. Generation of human Fab libraries by phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols）。しかし、これはまだすべてのＶドメインの増幅を保証するものではない（Loset GA et al., 2005; Rader C, 2012b. Generation of human Fab libraries by phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols）。Ｔａｑ又はＴａｑブレンドが使用されるかどうかに関わらず、ほとんどすべての実践者は、縮重プライマーが最大に増幅することを可能にするために控えめなアニーリング温度（約５６℃）を使用した（Marks JD et al., 1991; de Boer M et al., 1994; Sblattero D and Bradbury A, 1998; Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual; Rader C, 2012b. Generation of human Fab libraries by phage display. In: Methods in Molecular Biology Vol. 901: Antibody Methods and Protocols）。本明細書中に例示される通り、本発明者らのテンプレートの詳細な分析は、特に、全てのフォワードＶドメインプライマーがアニールするように設計され、先行技術に記載されたＳｃｒｉｐｐｓプライマーを含む第１フレームワーク（ＦＲ１）領域において、大部分のヒトＶ_Ｈ及びＶ_λファミリー遺伝子がそれらのアンプリコン長の大部分についてＧＣリッチであることを示唆する。対照的に、Ｖ_κファミリー遺伝子は、ＦＲ１領域を含む、それらのアンプリコンの長さの大部分について平均ＧＣ含量（約５０％）を有するが、ＧＣリッチストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）はこれらの遺伝子ファミリー内にも存在する。本発明は、広範な実験を通して、プライマー設計の正確さに関わらず、先行技術で示唆されたＤＮＡポリメラーゼの組合せも低いアニーリング温度も、そのようなテンプレートからの効率的な増幅には適切ではないことを開示する。本明細書に例示されるように、そのようなＧＣに富む領域を介して増幅するという現在の標準に従う特定の緩衝液−ポリメラーゼの組み合わせが設計された（Green MR and Sambrook J. 2012b. PCR amplification of GC-Rich Templates. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 1）。更に、得られた超大型ライブラリーからの限られた数のクローンの分析によって、この発明的な戦略から多様性が喪失されておらず、ライブラリーは詳細分析によって決定される３つの試験された抗原のそれぞれに対して異なるバインダー配列を作り出すことができたことが示された。大部分の公表されたデータとは対照的に、これらのバインダーの全てはまた、１０^〜４〜１０^〜５ｓ^−１の範囲のオフレイト（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）で動力学的に安定であった。これは、この発明的な増幅システムが、高い忠実度及び効率でナイーブＢ細胞免疫レパートリーの所望の多様性をキャプチャーしたことを示唆する。これらの原理を説明する実施例を本明細書に提示する。

本出願は、可変λドメインの増幅が、配列番号１４〜２３及び４６〜５４を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む２工程のＰＣＲで行われる、ＡＰＤＬを製造する方法：
ｉ）水溶液中のｃＤＮＡテンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
ｉｉ）工程（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの変性テンプレートを６５〜７２℃の温度でアニーリング及び伸長を同時にさせて、可変λドメインを得て、多様なＶ_λレパートリーのキャプチャーをもたらすこと、を開示する。

可変κリバースプライマーのためのＴ_ｍが異なるという事実を考慮して、２工程のＰＣＲは更に３工程のＰＣＲに最適化された。可変κドメインの増幅が、配列番号９〜１３及び４２〜４５を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む３工程のＰＣＲで行われる：
ｉ）水溶液中のｃＤＮＡテンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
ｉｉ）工程（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
ｉｉｉ）プライマーを５５〜７０℃の温度範囲で工程（ｉｉ）からの変性テンプレートにアニーリングすること、
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）からのアニーリングされたテンプレート上で６５〜７２℃の温度でプライマーを伸長させて、可変κドメインを得て、多様なＶ_κレパートリーのキャプチャーをもたらすこと。

本出願は、可変重鎖ドメインの増幅が、配列番号１〜８を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む３工程のＰＣＲで行われる、ＡＰＤＬを製造する方法：
ｉ）水溶液中のｃＤＮＡテンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
ｉｉ）工程（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
ｉｉｉ）プライマーを５５〜７０℃の温度範囲で工程（ｉｉ）からの変性テンプレートにアニーリングすること、
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）からのアニーリングされたテンプレート上で６５〜７２℃の温度でプライマーを伸長させて、可変重鎖ドメインを得て、多様なＶ_Ｈレパートリーのキャプチャーをもたらすこと、を開示する。

Ｃドメインテンプレートがプラスミドベース（合成構築物）であり、プライマーによってスキャンされハイブリダイズされる標的塩基対に関してそれほど複雑でないことを考慮して、本発明は、増幅のための３工程ＰＣＲ（Ｃ_Ｈ１ドメイン）及び２工程ＰＣＲ（Ｃ_κ及びＣ_λ）の両方を開示する。

本出願は、Ｃ_Ｈ１ドメインの増幅が、配列番号２７〜２８を含むプライマー並びに配列番号２４及び３９を含むテンプレートを用い、そして以下の工程を含む３工程のＰＣＲで行われる、ＡＰＤＬを製造する方法：
ｉ）水溶液中の合成Ｃ_Ｈ１ドメインテンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
ｉｉ）工程（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
ｉｉｉ）プライマーを５５〜７０℃の温度範囲で工程（ｉｉ）からの変性テンプレートにアニーリングすること、
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）からのアニーリングされたテンプレート上で６５〜７２℃の温度でプライマーを伸長させて、定常重鎖ドメインを得ること、を開示する。

本出願は、Ｃ_κドメイン及びＣ_λドメインの増幅が、配列番号２９〜３１を含むプライマー並びに配列番号２５〜２６及び４０〜４１を含むテンプレートを用い、そして以下の工程を含む２工程のＰＣＲで行われる、ＡＰＤＬを製造する方法：
ｉ）水溶液中の合成Ｃ_κドメイン及びＣ_λドメイン、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
ｉｉ）工程（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの変性テンプレートを６５〜７２℃の温度でアニーリング及び伸長を同時にさせて、定常κ及びλドメインを得ること、を開示する。

ＡＰＤＬを産生するためのＶ_κドメイン及びＣ_κドメイン並びにＶ_λドメイン及びＣ_λドメインの融合が、配列番号３０、３２、３５〜３７及び５５を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む２工程のＰＣＲで行われる：
ｉ）水溶液中のそれぞれ軽鎖可変及び定常遺伝子テンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
ｉｉ）工程（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの変性テンプレートを６５〜７２℃の温度でアニーリング及び伸長を同時にさせて、λ及びκ軽鎖レパートリーを得ること。

ＡＰＤＬを製造するためのＶ_Ｈドメイン及びＣ_Ｈ１ドメインの融合は、配列番号２８及び３３を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む３工程のＰＣＲで行われる：
ｉ）水溶液中のそれぞれ重鎖可変及び定常遺伝子テンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
ｉｉ）工程（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
ｉｉｉ）プライマーを５５〜７０℃の温度範囲で工程（ｉｉ）からの変性テンプレートにアニーリングすること、
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）からのアニーリングされたテンプレート上で６５〜７２℃の温度でプライマーを伸長させて、重鎖ドメインを得ること。

上記の工程で得られた軽鎖及び重鎖の融合は、最適な酵素及び緩衝液の組成物を用いて２工程又は３工程のＰＣＲで実施された。ＡＰＤＬを製造するための軽鎖及び重鎖の融合ＰＣＲ（ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ）は、配列番号３２、３４、３５〜３７及び５５を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む２工程のＰＣＲで行われる：
ｉ）水溶液中の軽鎖及び重鎖レパートリー、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
ｉｉ）工程（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの変性テンプレートを６５〜７２℃の温度でアニーリング及び伸長を同時にさせて、λ及びκＦａｂレパートリーを得ること。

あるいは、ＡＰＤＬを製造するための軽鎖及び重鎖の融合ＰＣＲは、配列番号３２、３４、３５〜３７及び５５を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む３工程のＰＣＲで行われる：
ｉ）水溶液中の軽鎖及び重鎖レパートリー、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
ｉｉ）工程（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
ｉｉｉ）プライマーを５５〜７０℃の温度範囲で工程（ｉｉ）からの変性テンプレートにアニーリングすること、
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）からのアニーリングされたテンプレート上で６５〜７２℃の温度でプライマーを伸長させて、λ及びκＦａｂレパートリーを得ること。

本出願は更に、緩衝液が、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ緩衝液、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＰＣＲ緩衝液、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液２、Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液３、Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液４、Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液、ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ緩衝液、Ｅｘａｃｔ（商標）ポリメラーゼ緩衝液、ＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ緩衝液、Ｔｕｎｉｎｇ緩衝液、Ｖｅｎｔ（登録商標）緩衝液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２緩衝液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ ＳＡ緩衝液を含む群から選択され、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素が、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄ（商標）ＬＴ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＢｌｅｎｄ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼＢｌｅｎｄ、Ｅｘａｃｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ及びＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ ＤＮＡポリメラーゼＭｉｘを含む群から選択される、ＡＰＤＬの製造方法を開示する。

本発明をサポートする実施例を以下に記載する。以下の実施例は本発明の説明のために示されるものであり、したがって、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

実施例１
ＲＮＡの単離とｃＤＮＡ合成
ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）とを組み合わせた方法を用いて、ヒトＰＢＭＣから全ＲＮＡを単離した。新たに採取したＰＢＭＣをＴＲＩｚｏｌ中で超音波処理し、溶解物を−８０℃で保存した。溶解物を０．２体積のクロロホルムで抽出して、核酸画分を水層中に単離した。水層を直ちに７０％エタノールと混合し、その後ＲＮｅａｓｙキットの説明書に従った。ＲＮＡを２６０ｎｍで定量し、中性のｐＨでアガロースゲル電気泳動により品質を確認した。図１は、臭化エチジウム染色ゲルの画像を示し、ゲノムＤＮＡが混入していない、特徴的な２８Ｓ及び１６Ｓバンドを有する高品質の完全なＲＮＡの存在を示す。

この全ＲＮＡ調製物から調製されたｃＤＮＡは、Ｖドメインの増幅を可能にする。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩファーストストランドｃＤＮＡ合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用い、オリゴｄＴ_１８とランダムヘキサマープライマーとの混合物を用いて、この全ＲＮＡ調製物から、ｃＤＮＡを合成した。反応２０μｇ当り１μｇのＲＮＡを添加し、この反応を２０回繰り返した。反応の完了後に反応をプールした。プールしたｃＤＮＡを水に溶解し、フェノールクロロホルム抽出で精製し、エタノールで沈殿させた。フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿後に、ピコグリーン（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）法及びリボグリーン（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ）法の両方で、ｃＤＮＡの収量は推定した。表１は、２つの染料によって推定された収量の違いの例を示す。

実施例２
Ｖドメインの増幅
合成されたｃＤＮＡからヒト免疫グロブリンファミリーのＶ_Ｌ、Ｖ_Ｈ及びＪ領域を増幅するために、２３個のプライマーのセット（配列番号１〜２３）を用いた。しかし、推奨されるＰＣＲ条件（Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual）を適用したが、いかなるアンプリコンも生成されなかった。高速ＰＣＲ増幅条件を用いた非常に効率的なリアルタイムＰＣＲカクテル（図２）を用いてアンプリコンを作製した。ＰＣＲ反応を以下のプロトコール：９５℃で３０秒間の高温開始、続いて９５℃で５秒間の変性、５８℃で５秒間のアニーリング、プレート読み取り、７２℃で３０秒間の伸長の４０サイクル、続いて、０．５℃刻みで６５℃と９５℃の間のアンプリコンの融解曲線分析と同時プレート読み取りでサイクルさせた。その結果を図２に示す。

本発明は、ＩＭＧＴデータベース（Lefranc M-P., 2001）で入手可能な配列情報に基づいて、３０ヌクレオチドウィンドウで全てのヒト可変遺伝子ファミリーのＧＣ含有量を分析する。表２Ａ〜表２Ｃは、全てのＶファミリーのＧＣ含有量の平均％は５０％に近いが、ほとんどのＶ_Ｈ及びＶ_λファミリー並びに少数のＶ_κファミリーは多くのストレッチで、特に最初の２つの３０ｎｔウィンドウで６０〜７０％のＧＣ含有量を有することを示す。後者の範囲（ｓｐａｎ）は、フォワードＶドメイン増幅プライマーがアニールするように設計されているＦＲ１領域を包含する。

図２及び表２Ａ〜Ｃからのデータに基づいて、本発明は、異なる緩衝液、及び高い忠実度のＴａｑポリメラーゼと校正（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ）ポリメラーゼとのブレンドの使用を開示する。このブレンドは組み合わせて長いプライマーを用いる複雑なｃＤＮＡテンプレートの増幅に適している。更に、本発明は、先行技術に記載されている条件（Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual）の代わりに、より長い変性及びアニーリング／伸長の組合せのサイクルを用いる２工程ＰＣＲ、又はより高いアニーリング温度を伴う３工程ＰＣＲを利用する。Ｖ_λプライマーセット（配列番号２３と対になった配列番号１４）の実験において、標的アンプリコンがＶ_λドメインについて得られたことが観察された。これらの条件に基づいて、それらのゲノム起源に関係なく、類似の熱力学的特性を有する全てのＶドメインプライマー（配列番号１〜２３）について実験を行った。図３は、前記条件が大部分のＶ_λドメインに最適であるが、κ及び重鎖可変ドメインには適さないことを示す。

実施例３
最適化されたＶ _λ ドメインの増幅
図３に基づいて、９個のＶ_λプライマー対のうち８個が良好な増幅を提供したことが注目され得る。配列番号２３を用いて増幅できなかったフォワードプライマーは配列番号１９であった（図３）。全てのプライマーを増幅するために、反応当たりの投入ｃＤＮＡを２０ｎｇから５０ｎｇに増やすことで条件の更なる最適化を行った。ＰＣＲ反応は、図３に設定した条件を用いて実施した。図４に示した結果は、残りのＶ_λ特異的プライマー対と共に、プライマーセットの配列番号２３／配列番号１９からのＶ_λ遺伝子の増幅を示す。

実施例４
最適化されたＶ _ｋ ドメインの増幅
図３に基づいて、異なるプロトコールを用い、κ特異的プライマー（配列番号９〜１３）を用いてＶ_κドメインを増幅する必要があることが理解される。κリバースプライマー（配列番号１３）のためのＴ_ｍは、７２℃未満である７０．６℃であることが観察された。２工程ＰＣＲにはあまりも適していなかったため、３工程サイクリングプロトコールで、代表的なプライマー対として配列番号９／配列番号１３を用いてＶ_κ増幅を行った。この実験ではＰｆｕ ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＳ酵素を用い、Ｒ×Ｃ設計は一連のＰＣＲ緩衝液と４つの異なるＴ_ａ温度（５６．２℃、６０．７℃、６７．３℃、７０℃）を含んだ。増幅緩衝液がＰｆｕ緩衝液であり、増幅酵素がＰｆｕ ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＳ酵素である場合、このプライマー対からの最適な増幅が約６０℃のアニーリング温度で得られた。

同様の３工程ＰＣＲ条件を残りのκプライマー対（代表的な対を含めて全部で４つ）に適用した場合、全てが予想されたサイズのアンプリコンを生成した。具体的には、９５℃で５分間の予熱後、９４℃で１５秒間の変性工程、６０℃で３０秒間のアニーリング工程、７２℃で３０秒間の伸長工程、続いて７２℃で１０分間の伸長及びニックシール工程の反応を３０回サイクルした。しかし、プライマー対の配列番号９／配列番号１３、及び配列番号１０／配列番号１３は、他の２つの対の配列番号１１／配列番号１３、及び配列番号１２／配列番号１３と比較すると、より効率的に増幅した（図５，パネルＡ）。

代替的に、本発明は、プライマー対の配列番号１１／配列番号１３、及び配列番号１２／配列番号１３を用いて、増幅緩衝液がＴｕｎｉｎｇ緩衝液であり、増幅酵素がＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ Ｂｌｅｎｄである、Ｖ_κ遺伝子の最適の増幅が得られる更なるプロトコール（図５，パネルＢ及びＣ）も提供する。

実施例５
最適化されたＶ _Ｈ ドメインの増幅
図３に基づいて、異なるプロトコールを用い、ファミリー特異的プライマー（配列番号１〜９）を用いてＶ_Ｈドメインを増幅する必要があることが理解される。Ｖ_Ｈドメインの特定の収量を得るために、ＰＣＲ緩衝液のＲ×Ｃ設計を３つの異なるアニーリング温度（５６℃、６０℃及び６８℃）で、Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＳポリメラーゼを用いる３工程ＰＣＲプロトコールで行った。代表的なプライマー対は配列番号５／配列番号８であった。試験した緩衝液のいずれを用いても３つの温度の全てで増幅が可能であったが、緩衝液は収量又は特異性において異なっていた。

最良の条件によって、両方の緩衝液、すなわちＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＳＡ緩衝液とＴｕｎｉｎｇ緩衝液を用い、Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＳ酵素を用いて残りのすべてのＶ_Ｈ対を増幅することができた。具体的には、９５℃で５分間の予熱後、９４℃で１５秒間の変性工程、６８℃で３０秒間のアニーリング工程、７２℃で３０秒間の伸長工程、続いて７２℃で１０分間の伸長及びニックシール工程の反応を３０回サイクルした。結果を図６に示す。

実施例６
最適化されたＣドメインの増幅
Ｃドメイン特異的プライマー（配列番号２７〜３１）は、Ｖドメイン特異的プライマー（配列番号１〜２３）と比較すると短く、非アニーリング突出部分（平坦なプライマー）を有さないことが観察された。本発明はまた、プラスミド（合成構築物；配列番号２４〜２６）に基づき、したがってＶドメイン特異的プライマーと比較してプライマーによるスキャン及びハイブリダイズされる標的塩基対に関してそれほど複雑でないＣドメインテンプレートの使用を開示する。

本発明の側面において、ＭｇＣｌ_２及びＴ_ａタイトレーションを用いて、これらの増幅に最適な条件を決定した。ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ緩衝液とＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼの組合せをそのタイトレーションに用いた。具体的には、９５℃で５分間の予熱後、９４℃で１５秒間の変性工程、７２℃で３０秒間の同時アニーリング及び伸長工程、続いて７２℃で１０分間の伸長及びニックシール工程の反応を３０回サイクルした。このアプローチによって、全てのＣドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｋ及びＣ_Ｌ）を豊富に増幅することができた。

本発明の別の側面において、Ｃドメインは、Ｐｆｕ ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＳポリメラーゼ及びＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ緩衝液の組合せを用いて増幅された。具体的には、９５℃で５分間の予熱後、９５℃で３０秒間の変性工程、６５℃で３０秒間のアニーリング工程、７２℃で３０秒間の伸長工程、続いて７２℃で１０分間の伸長及びニックシール工程の、テンプレートとして配列番号２４を含む反応を３０回サイクルした。同様に、９５℃で５分間の予熱後、９５℃で３０秒間の変性工程、７２℃で３０秒間の同時アニーリング及び伸長工程、続いて７２℃で１０分間の伸長及びニックシール工程の、テンプレートとして配列番号２５又は２６を含む反応を３０回サイクルした。図７は、Ｃドメインアンプリコンを大量に生産する際のこのアプローチの有用性を示す。

実施例７
Ｖ _λ ドメインとＣ _λ ドメインの第１のオーバーラップアセンブリ
明白に十分な量でＶ_λとＣ_λの融合を融合させ増幅させるために、図５に例示されるＲ×Ｃ酵素対緩衝液の設計を使用した。等モル濃度のオーバーラップする生成物を、表３Ａ及び表３Ｂに設定される酵素−緩衝液の組合せ及びＰＣＲパラメーターを用いて試験した。

Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼＢｌｅｎｄによって、著しい非特異的な増幅なしに２つの緩衝液中で正しいサイズのＰＣＲアンプリコンを増幅することができた。増幅の特異性は、表４Ａ及び表４Ｂに記載される代替的なプロトコールを使用することで高めることができる。

実施した実験は、サイクル数は減らさずに伸長時間を減らすことで、非特異性が著しく減少することを示す。増幅の特異性は、表５Ａ及び表５Ｂに記載される代替的なプロトコールを使用することで更に高めることができる。

図８は、より低い投入ＤＮＡ濃度（２５ｎｇ）とポリメラーゼ濃度（０．５×）の組合せによって、所望のＰＣＲ生成物（７５０〜８００ｂｐ）が強く豊富に増幅され、非特異的増幅がごく僅かであったことを示す。Ｖ_κ−Ｃ_κ融合のためのプライマー対はＶ_λ−Ｃ_λについてのもの（配列番号３２／配列番号３０）と全く同じであるため、したがって、Ｖ_λ−Ｃ_λのために最適化した条件と同じ条件をＶ_κ−Ｃ_κ融合に用いた。この戦略は最初の試みで機能し、それ以上の最適化は必要ではなかった。

実施例８
Ｖ _Ｈ ドメインとＣ _Ｈ １ドメインの第１のオーバーラップアセンブリ
表６Ａ及び表６Ｂに記載のプロトコールを用いてＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１増幅を行った。

試験された全ての組合せによって、Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１の所望の７５０〜８００ｂｐオーバーラップ生成物を増幅することができる。表７Ａ及び表７Ｂに記載された代替的なプロトコールを用いることによって、増幅の特異性をより更に増大させることができる。

図９は、高い忠実度のＶｅｎｔポリメラーゼとＥｘａｃｔポリメラーゼ緩衝液の組合せ（パネルＣ，レーン１２）が、スミアリングと非特異性を最小限にして所望の強いバンドを示すことを示す。

実施例９
Ｆａｂ作製のためのＶ _Ｌ ―Ｃ _Ｌ ドメイン及びＶ _Ｈ -Ｃ _Ｈ １ドメインの第２のオーバーラップアセンブリ
Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌテンプレート及びＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１テンプレートの融合を、配列番号３２／配列番号３４のプライマー対を用いて表８Ａ及び表８Ｂに記載の通りに行った。この実験では、Ｖ_λＣ_λ増幅生成物のみをＶ_ＨＣ_Ｈ１増幅生成物との融合のために用いた。

明らかな温度依存性の傾向なしに、標的バンドの非常に近くにスミアリング及び非特異的生成物を伴う、非常に少量の所望の第２のオーバーラップ生成物（１．５ｋｂ）が形成された。最も強い増幅は６５．９℃、続いて７２℃で観察された。代替的なプロトコール（表９Ａ及び表９Ｂ）では、Ｅｘｐａｎｄ ＬＴポリメラーゼをＴ_ａタイトレーションフォーマットで用いた。

Ｅｘｐａｎｄ ＬＴ酵素Ｂｌｅｎｄは、それ自身の緩衝液又はＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ緩衝液のいずれか中でＶ_λＣ_λ−Ｖ_ＨＣ_Ｈ１テンプレートを融合することに成功した。しかし、融合生成物は曖昧であり、そして１．５ｋｂのオーバーラップ生成物と共に、スミアリング及び非特異的バンドが、試験された全てのアニーリング温度で明らかでもあった。

増幅の特異性を向上させるために、Ｅｘｐａｎｄ ＬＴポリメラーゼを、５６℃の固定Ｔ_ａで代替的なプロトコール（表１０Ａ及び１０Ｂ）でいくつかのＰＣＲ緩衝液を用いて更に試験した。

Ｅｘｐａｎｄ ＬＴは試験された８つの緩衝液のすべてで所望の生成物を増幅することができたが、高分子量のスミアリングがすべての緩衝液で共通していた。Ｖ_ＬＣ_Ｌ−Ｖ_ＨＣ_Ｈ１融合の特異性を改善するために、３つの戦略が設計された（Higuchi R et al., 1988, Horton RM et al., 1989, Sarkar G and Sommer SS, 1990, Warrens AN et al., 1997, Heckman KL and Pease LR, 2007）。非対称ＳＯＥ−ＰＣＲの戦略Ａ（Warrens AN et al., 1997）が表１１Ａ及び表１１Ｂのように実行された。

１５サイクル後、８μｌの各Ｖ_λＣ_λ及びＶ_ＨＣ_Ｈ１のＰＣＲ反応をオーバーラップテンプレートとして用い、オーバーラップ反応のために酵素緩衝液マトリックスを実施した（表１１Ｃ）。具体的には、９５℃で５分間の予熱後、９５℃で３０秒間の変性工程、５６℃で３０秒間のアニーリング工程、７２℃で３分間の伸長工程、続いて７２℃で１０分間の伸長及びニックシール工程の反応を３０回サイクルした。記載された非対称ＰＣＲプロトコール（Warrens AN et al., 1997）は、１．５ｋｂの所望の生成物を形成しなかった。

中間のメガプライマー形成の戦略Ｂ（Sarkar G and Sommer SS, 1990）を実行するために、フォワードプライマー又はリバースプライマーを添加せずに、それぞれ５０ｎｇのＶ_λＣ_λ及びＶ_ＨＣ_Ｈ１を５０μｌの反応に混合した。その後、表１２の通り、ＰＣＲ反応を実施した。フォワードプライマー及びリバースプライマー（配列番号３２／配列番号３４）を添加し、同じ３工程の条件下（表１２）で反応を３０回繰り返した（図１０）。

図１０は、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼを除く他の全ての酵素−緩衝液の組合せによって、所望の１．５ｋｂの生成物を形成することができ、選択される方法が、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＳＡ緩衝液を用いるＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ酵素であり得ることを示す。戦略Ｃを実行するには、酵素−緩衝液Ｒ×Ｃ設計フォーマットで７２℃で２工程ＰＣＲプロトコール（表１３）を行う。

図１１は、この戦略によって、明白な１．５ｋｂのＦａｂフラグメントが、実質的に減少したスミアリングと共にもたらされたことを示す。したがって、戦略Ｃの場合、最良の条件はＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＳＡ緩衝液を用いるＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ酵素である。

実施例１０
ベクターの調製
この目的のために、緩衝液Ｍ（Ｒｏｃｈｅ）中で合計６０μgのベクター（３反応試験管；２０μｇ／１００μｌ反応）をＳｆｉＩ（１０Ｕ／μｇベクター）で一晩、５０℃で消化することによって、十分な量のｐＣＯＭＢ３ＸＳＳ（実験室で再作製；図１２）ベクター骨格を調製した。反応混合物をプールし、フェノール化し、エタノール沈殿し、ＴＥに溶解した。ＳｆｉＩで消化されたベクターを、臭化エチジウムを含まない０．８％調製用ゲルのウェルにロードした。ゲルを５Ｖ／ｃｍで２．５時間泳動させた。臭化エチジウム染色の後、約３．３ｋｂのｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクター骨格を、ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キットを用いてゲル抽出及び精製した（図１３）。同時に、ＳｆｉＩ消化後にベクターから放出された約１．６ｋｂのスタッファーもまた単離し、ゲル精製した（図１３）。ベクター骨格とスタッファーの両方を試験連結に用い、連結効率を最適化し、ベクターの品質を確認した。

図１３は、一晩過剰消化した後でさえも、かなりの量のベクターを消化することができず、消化パターンにスミアリングがあることを示す。ｐＣＯＭＢ３ＸＳＳ中の２つのＳｆｉＩ部位を詳細に調べると、この理由は、両者（5’-GGCCcaggcGGCC-3’と5’-GGCCaggccGGCC-3’）がｄｃｍメチルトランスフェラーゼ感受性（認識部位に下線を引く）であるため、これらの部位でのプラスミドのヘミメチル化された性質による可能性があることが示唆される。ｄａｍ⁻／ｄｃｍ⁻大腸菌株の使用は、シトシンメチル化の減少とＳｆｉＩによる消化の改善とに有用であり得る。そのような株の例にＩＮＶ１１０及びＥＲ２９２５が含まれる。

実施例１１
試験連結及びライブラリーサイズ計算
ＳｆｉＩを用いた制限消化後にベクターから放出された１．６ｋｂのスタッファーフラグメントを用いて試験連結を行った（参照，図１２及び図１３）。この試験の基礎となる理論的根拠は、１．６ｋｂスタッファーフラグメントに最適化された連結条件が、同様の大きさの（約１．５ｋｂ）Ｆａｂフラグメントに、その最適化を無駄にすることなく、直接適用できることである。

第１ラウンドの試験連結において、最適のベクター：インサートの連結比のためのタイトレーションを実施した。半対数ステップ（１：０．３５、１：１及び１：３．５のベクター：インサートのモル比）で、一定質量の１４０ｎｇのＳｆｉＩで消化されたベクター（３８６ｆｍｏｌ）を、適切なモル比のＳｆｉＩで消化されたスタッファー及びＦａｂと連結した。連結のために、連結混合物１０μｌ当たり１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを用い、連結混合物を１６℃で一晩インキュベートした。ベクター単独（自己連結）のコントロールを、ベクターの品質を確認し、またバックグラウンドを計算するために含めた。

連結比の最適化と共に、連結混合物の熱不活性化が形質転換の効率に及ぼす影響も試験した。この目的のために、各１０μｌの連結混合物の半分を７０℃で１５分間熱不活性化した。残りの５μｌをそのまま使用した。非加熱及び加熱処理の連結混合物の両方の形質転換をエレクトロポレーションによって行った。エレクトロポレーション及び形質転換細胞の回収は、製造元のプロトコール（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を用いて行った。形質転換培養物を３７℃及び２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する９０ｍｍ ＬＢプレート上にそれぞれ１、１０及び１００μｌを広げた。プレートを３７℃のインキュベーター中で一晩インキュベートした。

連結混合物の熱不活性化の効果を最初に比較した。図１４Ａから、エレクトロポレーション前の連結混合物の熱不活性化は、エレクトロコンピテントＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用した場合の形質転換効率に劇的な影響を与えることが明らかである。熱不活性化形質転換では、非加熱連結混合物を用いて行われた形質転換と比較してコロニー数が数倍高かった。熱不活化サンプルのみからの結果を、最適な連結比を決定するために更に検討した。ベクターのバックグラウンドを計算するために、熱不活性化された１：１比の連結混合物をベクター単独プレートと比較した（図１４Ｂ；表１４）。

計算されたベクターのバックグラウンドは１．８％であり（表１４）、これは十分に品質の確認の推奨範囲内であると考えられた（Andris-Widhopf J et al., 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. In: Phage Display: A Laboratory Manual）。表１４はまた、熱処理された連結反応が典型的なベル形のプロファイルに従い、１：１の比で最大数のコロニーを与え、したがって最適な連結比とみなすことができることを示している。したがって、この段階で計算されたライブラリーサイズ（効率）は、形質転換ベクター１μｇ当たり１．０７×１０^８であった。

この第１ラウンドの形質転換から、熱不活性化が効率を改善し、１：１のベクター：インサートの比が最適であることが結論付けられた。本発明は、形質転換前に連結混合物を希釈することで効率を更に高めることができることを開示する。熱不活性化の結果を再確認するために、熱不活性化及び天然の両方の１：１混合物を用いて本実験を行った。

この実験を実施するために、２μｌの連結混合物を３８μｌの水と混合することで、１：１連結混合物を１：２０に希釈した。次いで、１、３、５、７及び１０μｌの希釈された連結混合物を前述のようにして形質転換した。エレクトロポレーション中の異なる体積の影響を回避するために、（もしあれば）すべての希釈アリコートの体積を水で１０μｌにした。次いで、１、１０及び１００μｌの形質転換体を９０ｍｍ ＬＢ＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）のプレートに前述のようにして蒔いた。

本発明は、希釈された連結物からサンプリングされた体積の増加に付随して、形質転換体数が増加することを開示する。しかし、この増加は２工程のみ以内（１〜３μ１）にその最大値に達し、その後、形質転換は阻害されないがプラトーに留まる（表１５）。

表１５は更に、連結混合物を希釈した後、ベクターのバックグラウンドが１．８％から０．２３％に減少することを示す。このバックグラウンドの減少は、ライブラリー効率の６倍の増加に寄与する（形質転換体積として希釈された１：１の比の３μｌを考慮する場合、ベクター１μｇ当たり１．０７×１０^８から６×１０^８ｃｆｕに増加；表１５と表１４との比較）。

実施例１２
前記の免疫グロブリン又は軽鎖と重鎖の両方を含むフラグメントの異なるドメインのＳｆｉＩで消化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳへの連結
スタッファーコントロールを用いて、最適化された条件（熱不活性化及び連結混合物の希釈）に従って、Ｆａｂ試験連結を実施した（実施例１１）。実施例９に示された最適なプロトコールによって、Ｆａｂを調製した。連結混合物を７０℃で１５分間熱不活性化し、２μｌの連結混合物を３８μｌの水と混合することで１：２０に希釈した。３μｌの連結混合物を２５μｌのＴＧ１エレクトロコンピテント細胞中に形質転換した。培養物を２５０ｒｐｍ及び３７℃で１時間インキュベートした。１、１０及び１００μｌの培養物を１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢプレートに蒔いた。プレートを３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートした。この実験からのコロニー数を表１６に示す。

連結混合物中のベクターの量（５０ｎｇ）を変え、ベクターに対するインサートのモル比を変えて（１：１、１：３及び１：１０のベクター：インサートの比；参照，表１７）、更なる実験を行った。

表１６及び表１７から、大きな抗体ライブラリーの形成をもたらすには、Ｆａｂについての連結効率が最適ではなかったことが分かる。

実施例１３
ＳｆｉＩで消化したｐＣＯＭＢ３ＸＳＳ調製物中のスーパーコイル／未切断プラスミドの汚染
ＳｆｉＩで消化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳへのＰＣＲ増幅されたＦａｂの低い連結効率の原因となる因子を調べた。Ｆａｂ連結プレートからのコロニーを、Ｆａｂフラグメントの存在について調べた。ＳｆｉＩ消化後、４８個のコロニーを１．５ｋｂバンドの存在についてそれらのプラスミドＤＮＡについて分析した。

アガロースゲル分析は、４８個のうち４６個のクローンが約１．５ｋｂのバンドに対して陽性であることを示した。ベクター特異的プライマーを用いて、約１．５ｋｂのインサートを有する陽性クローンを配列決定した。４６個全てのクローンの配列がファージディスプレイベクター（ｐＣＯＭＢ３ＸＳＳ）の１．６ｋｂスタッファーフラグメントと同一であることが観察され、これらの組換体中にベクターが単独で存在することを示した。

スーパーコイルベクターはその固有の性質のために不完全にしか消化されないと推測された。したがって、アガロースゲル上の単一種のベクターバンドは、ＳｆｉＩ消化された３．３ｋｂのベクターバンドとスーパーコイルの残基の両方を含み、形質転換の間に後者の種が優勢になる。したがって、最初にスタッファーフラグメント内で切断することによってベクターを直鎖状にした。それによって、アガロースゲル上で分離したときに直鎖状ＤＮＡが５ｋｂの位置に移動し、スーパーコイル位置が３．３ｋｂであり、ゲル中で分離が可能になる。最良の結果を得るためには、２回のラウンドのＳａｃＩ消化が好ましい。

この三重消化（ＳａｃＩ−ＳｆｉＩ−ＳａｃＩ）されたベクターを用いて、Ｆａｂの作製、ＳｆｉＩ消化及び連結の完全なサイクルを、ベクターのみ及びスタッファーコントロールと共に行った。ベクターバックグラウンドが０．０２％まで減少した。スタッファーも３×１０^８／μｇの効率で連結したが、やはりＦａｂの場合、効率は低かった。

実施例１４
ベクター連結の成功への障壁としてのＦａｂの不正確な末端
Ｆａｂの連結効率を改善するために、ＰＣＲで増幅されたＦａｂの５’末端及び３’末端のＳｆｉＩ認識配列を、配列決定によって更に調べた。この目的のために、キット（ＴＯＰＯ−ＴＡ ４．０ ｋｉｔ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に含まれるキットとベクターを用いて、ＳｆｉＩ消化せずに実施例９に従って調製したプールしたＦａｂフラグメントのアリコートをトポイソメラーゼＩ媒介連結によってクローニングした。ＬＢ−カルベニシリンプレートから２４個のクローンを取り上げ、プラスミドＤＮＡを小スケールで調製した。プラスミドをＳｆｉＩで消化すると、２４個のうち１５個（６２．５％）がＳｆｉＩの放出を示した（図１５）。８個のクローンの配列決定は、両端に完全なＳｆｉＩ配列を有するクローン（ｃ１、ｃ３、ｃ４、ｃ８−表１８）もまた制限消化後に１．５ｋｂのＦａｂバンドを放出することを示した（図１５）。したがって、この実験から、プールされたＦａｂフラグメントの５個のうちの１個（２０％）が５’末端又は３’末端のいずれかに不正確なＳｆｉＩを含むと推測されるかもしれない。

実施例１５
Ｔｏｐｏベクターから放出されたＦａｂは再連結可能
図１５は、ＳｆｉＩ部位がいずれの末端とも完全であるという条件で、ＦａｂフラグメントがスーパーコイルＴＯＰＯベクターから首尾よく放出され得ることを非常に明確にした。更に、本発明は、ＴＯＰＯベクターから放出されたＦａｂフラグメントが再び（Ｆａｂ陽性クローンからの）ＳｆｉＩで消化されたＴＯＰＯベクターに、又は三重消化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターに連結できるかどうかを調べた。

単一のＦａｂ陽性クローンからのＳｆｉＩで放出されたフラグメントを、各々１４０ｎｇの三重消化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクター及びＳｆｉＩで消化されゲル精製されたｐＣＲＴＯＰＯ４ベクターと１０μｌの反応で連結した。ベクターのみのコントロールは、ＴＯＰＯ及びｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターの両方について維持された。スタッファー連結コントロールは、ｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターについてのみ用いられた。ｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターと連結するとき、リン酸化型及び脱リン酸化型の両方のベクターを使用した（表１９ではＣＩＰ及び非ＣＩＰと表示）。

ＴＯＰＯ放出されたＦａｂが再度、ＳｆｉＩで消化されたｐＣＲＴＯＰＯ４ベクター及びｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターと再連結する結果を表１９に示す。このデータは、スタッファーフラグメントについて達成される効率と同様の効率で、ＴＯＰＯ放出されたＦａｂが再度、親ベクター（ｐＣＲ−ＴＯＰＯ４）及び三重消化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターにうまく再連結することができることを明らかに示す。

したがって、本発明は、効率的なＳｆｉＩ消化を可能にするスーパーコイル形態のＦａｂの使用、及びＦａｂの高効率の連結を得るためのＳｆｉＩの最適な使用を、初めて開示する。

実施例１６
ＳｆｉＩ消化を促進するための自己連結によるＦａｂの環状化
Ｆａｂの連結効率を改善するために、本発明は、直鎖状Ｆａｂフラグメントを自己連結することによってスーパーコイルＦａｂを作製するアプローチを開示する。自己連結後、単一の直鎖状Ｆａｂが環状になることができ、又は複数の直鎖状Ｆａｂが互いに連結して直鎖状コンカテマーを形成することができる。後者はそのままとしてもよく、又は更に連結させてスーパーコイルプラスミドを模倣するより大きな環状分子を形成させることができ、それはＳｆｉＩのためのより適切な基質であろう。その概念を図１６に示す。

１０μｇの平滑末端のＦａｂをＰｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＳポリメラーゼを用いて生成させ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと共に３７℃で２時間インキュベートすることによりリン酸化した。キナーゼ反応物を６５℃で２０分間熱不活性化させ、フェノール化及びエタノール沈殿を行った。次いで、タンパク質又は塩の混入物を含まないリン酸化Ｆａｂ（２．５μｇ）を、３０μｌの反応中、ＤＮＡ１μｇ当たり２単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加して１６℃で一晩自己連結させた。自己連結された環状又はコンカテマーのＦａｂを、次にフェノール化、続いてエタノール沈殿によって精製し、ピコグリーンアッセイで定量した。

１μｇの自己連結されたＦａｂのアリコートをアガロースゲル分析用に保存し、残りを水浴中５０℃で一晩ＳｆｉＩ消化（１６Ｕ／μｇ）に供した。消化後、消化物のアリコートを、元の連結されていないＰＣＲ生成物及び先に保存された連結されたＦａｂのアリコートと共に、アガロースゲル分析に用いた。図１７は、１．５ｋｂのＦａｂ生成物の消滅を同時に伴って３ｋｂ以上の範囲のスミアリングと共に首尾良い自己連結を示す。図１７はまた、ＳｆｉＩ消化後の直鎖状Ｆａｂフラグメントの効率的な放出を示す。

１．５ｋｂのＳｆｉＩで消化された自己連結されたＦａｂバンドを、ＱｉａＱｕｉｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍＢＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてゲル精製した。ピコグリーンによる定量化の後、Ｆａｂ調製物を１４０ｎｇの脱リン酸化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターに約１：２のモル比で連結した。連結は１６℃で一晩行った。連結混合物を７０℃で１５分間熱不活性化し、２μｌの熱不活性化された連結混合物を３８μｌの水と混合して１：２０に希釈した。実施例１１に示すように、３μｌの連結混合物を２５μｌのＴＧ１エレクトロコンピテント細胞に形質転換した。一晩インキュベートした後、各プレート上にコロニーが観察された。１μｌのプレーティング体積は、十分に単離されたコロニーを示し、効率計算のために考慮された（図１８）。一方、１０及び１００μｌのプレーティング体積のプレートは、それぞれ密集し、濃い固まりにもつれた増殖を示した。

ゼロベクターバックグラウンドと共に、自己連結され、ＳｆｉＩ消化されたＦａｂは、ベクター１μｇ当り３．７×１０^８クローンの効率を示し（表２０）、したがって実施例１２よりも３桁、効率が増加した（表１６と表１７の比較）。自己環化の効率は、実施例１７において多様なＦａｂプールで更に説明される。

実施例１７
ＳｆｉＩ消化を促進するための自己連結によるＦａｂプールの環状化
κＦａｂプールをオーバーラップＰＣＲで調製し、実施例９に示したようにゲル精製した。Ｆａｂのための最終オーバーラップＰＣＲは、「Ａ」突出部分を生成するＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ酵素混合物で最適化されるため、Ｔ４ポリメラーゼによる平滑化の更なる工程をＦａｂ連結の前に加えた。平滑化Ｆａｂは、自己連結の前にフェノール化及びエタノール沈殿によって、汚染タンパク質及び塩を含まないようにした。自己連結、ＳｆｉＩ消化、ベクター連結及び形質転換の手順は、実施例１６と同様に実施した。この研究の結果を表２１に示す。

表２１の結果は、自己連結の戦略がプールされたＦａｂについても同様に働くが、効率が低下することを示す（単一集団のＦａｂと比較して１桁低い；表２０と表２１の比較）。しかし、以前に３．７×１０^８／μｇのＤＮＡ効率を示した同じ単一集団のＦａｂコントロールもまた、この実験で０．５桁減少した効率以上を示した。これを考慮すると、自己連結されたκプールの真の連結効率は５．６倍高かった（２．１×１０^８／μｇベクターＤＮＡ）。

同様に、λＦａｂプールをオーバーラップＰＣＲで調製し、実施例９に示されるようにゲル精製した。λＦａｂプールの形質変換の結果を図１９に示す。効率データを表２２に示す。

自己連結の要約を表２３に示す。これは、本発明の大きなナイーブライブラリーを作製するのに必要とされる連結効率を説明する。

実施例１８
自己連結され、ＳｆｉＩ消化されたＦａｂプールへのｐＣＯＭＢ３ＸＳＳ連結からの組換クローンの分析
２４個のクローン（κ及びλのそれぞれ１２個）の全部を最初に選び、プラスミドＤＮＡを小スケールで抽出した。Ｆａｂの同一性を確認するために、表２４に示すように、２工程ＰＣＲプロトコールを使用して、テンプレートとしてのプラスミドＤＮＡ及び配列番号３２／配列番号３４のＦａｂ末端特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った。その増幅のために、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ酵素を１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含むＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ緩衝液と組み合わせて用いた。

同時に、プラスミドＤＮＡサンプルをＳｆｉＩで消化した。クローンがＦａｂ陽性であれば、１．５ｋｂのバンドが両方の分析から予想される。１２個のκクローン及び１２個のλクローンのすべては、Ｆａｂ特異的ＰＣＲ増幅（図２０，パネルＡ及びＢ）及びＳｆｉＩ放出（図２０，パネルＣ及びＤ）に陽性であることが観察された。

１２個のクローンのすべてがＦａｂ陽性であることを確認した後、κ及びλの連結プレートのための別の３６個の各々のクローンを更に分析して、パーセント及び多様性の問題に答えた。したがって、κ及びλのＦａｂの合計４８個の各々のクローンを、表２４に示す２工程ＰＣＲプロトコールを用いて、Ｆａｂ特異的プライマーの配列番号３２／配列番号３４を用いてＦａｂの存在についてＰＣＲで分析した。各５０μｌのＰＣＲ反応からの１０μｌをアガロースゲル分析に使用した。その結果、９６個のクローンの全てがＦａｂインサートに対して陽性であり、明確な１．５ｋｂのバンドを示すことが説明される。

次に、４８個のすべてのクローンをＢｓｔＮＩフィンガープリントにかけた。この分析を行うために、各５０μｌのＰＣＲ反応からの残りの４０μｌをＢｓｔＮＩ消化にかけた。消化混合物を表２５に示す。

各消化混合物からの４０μ１を３％アガロースゲル上で分析した。図２１は、κクローン及びλクローンのいずれもいかなる反復パターンも示さず、各クローンが異なることを示す。

各ライブラリーからの４８個のすべてのクローンを、２つの骨格特異的ベクター、２つのｐｅｌＢ隣接領域特異的プライマー、及び１つのＣ_Ｈ１特異的プライマーを用いてジデオキシ配列決定にかけた。各クローンのＦａｂ配列を、配列クロマトグラムからのコンティグ構築のアルゴリズム、及び異常な塩基の信号の視覚的検証に従って分析した。次いで、コンティグに、５’末端及び３’末端のＳｆｉＩ部位、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１ドメイン等の標識、並びに開始から終止コドンまでの個々の軽鎖及び重鎖の完全性について手動で注釈を付けた。図２２は、すべてのλクローンの両端にある完全なＳｆｉＩ部位の検証を説明する例である。

手動分析の結果及び注釈を表２６及び表２７に要約する。これらの表によれば、新規な自己連結法によって調製されたκ又はλのＦａｂライブラリーのいずれかからのクローンの約８０％が全長翻訳可能なＦａｂである。

全クローンのＶ_Ｌドメイン及びＶ_Ｈドメインの配列を、生殖系細胞系ファミリー、フレームワーク及びＣＤＲに関する詳細な注釈、並びに参照ヒト配列アミノ酸と比較したアミノ酸の相違のために、ＩＭＧＴデータベースに提示した。この分析（表２８）は、それぞれＶ_Ｈ（ＶＨ６）及びＶ_λ（ＶＬ１０）の１つのファミリーを除いて、他のすべてのファミリーがこれらのクローンに表されること（表２８）を示した。これらの欠けているファミリーは他のファミリーと比較してより少ない変異体によって表されるので、そのようなファミリーに属するクローンはそれらの希少性及びこの配列データセットにおける低いサンプリング数のために見逃された可能性がある。すべてのＶ_Ｈドメインの４６％がＶＨ４ファミリーに属し、２４％がＶＨ３に属し、他のファミリー（ＶＨ１、ＶＨ２及びＶＨ５）は５〜１８％の範囲であった。同様に、Ｖ_κの５ファミリー及びＶ_λの８ファミリーが表された。κファミリーでは、クローンの５０％がＶＫ３ファミリーに属し、３０％がＶＫ１ファミリーに属していた。他のファミリーの割合は２．５〜１０％であった。λファミリーでは、ＶＬ１は３３％であり、ＶＬ２は３１％であり、残りのファミリー（ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８及びＶＬ９）は３〜１３％の範囲内であった。

ＩＭＧＴデータベースからの残りの注釈は、配列決定されたクローンのサブセットについて表２９〜表３１に要約される。すべてのクローンの９７％が、終止コドンのないＶドメインを有しており、したがって機能的である。これは驚くべき数であり、我々の増幅戦略が機能的ＩｇのｍＲＮＡの忠実なキャプチャーをもたらすことを示唆する。

実施例１９
自己循環プロセスの改善と回収の計算
図１７のデータは、ＳｆｉＩで消化されたＦａｂを自己連結された直鎖状Ｆａｂから調製した場合、認識可能な割合の未連結のＦａｂが残ることを示す。最初に作製されたプロトコールでは、この未消化のＦａｂ集団は、アガロースゲル分画の間に、遊離された（ＳｆｉＩで消化され連結可能な）Ｆａｂと一緒に持ち越される（図１７）。この未消化のＦａｂ集団は、ライブラリーの効率を低下させるだけでなく、連結可能なＦａｂの割合を希釈すると思われる。直鎖状Ｆａｂの自己環化の最適化プロセスは、本明細書中、以下に示される。

アプローチ１：連結するＤＮＡを密集させることで自己連結（スミア形成）を改善する
実施例１６及び１７のようにＦａｂを連結した。連結反応２０μｌ中に約８３ｎｇ／μｌのＤＮＡを用いた。濃度を２００ｎｇ／μｌに増加させることで、直鎖状Ｆａｂの密集を試みた。両方の濃度のＦａｂを、反応当たり６％の最終濃度の分子密集剤ＰＥＧ８０００の存在下及び非存在下で自己連結させた（Green MR and Sambrook J, 2012c. Cloning in plasmid vectors: Blunt end cloning; In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol.1）。連結反応物を１６℃で一晩インキュベートし、アガロースゲル分析の前に有機抽出によって精製した（図２３）。
図２３から明らかなように、ＰＥＧ８０００の存在及び単位体積当たりのＤＮＡ濃度の増加は、残存する１．５ｋｂの未連結Ｆａｂの量の減少によって示されるように、自己連結を著しく改善した。

アプローチ２：ゲル精製及びＨＭＷスミア集団の消化による１００％連結可能なＦａｂの取得
ＳｆｉＩ消化された連結可能なＦａｂ調製物から連結不可Ｆａｂを回避するための別のアプローチは、高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡスミアのみをゲル抽出し（参照，図２３の四角で囲った領域）、したがってＳｆｉＩ消化前の１．５ｋｂバンドを除くことである。アガロースゲルからのＨＭＷスミアの回収は、以下の様々な方法で行われた。
ａ．標準的なＱＩＡＥＸＩＩプロトコール（アガロースゲル片の単位ｇ当たり３体積のＱＸ１）を用いるスミアのゲル抽出。
ｂ．修正ＱＩＡＥＸＩＩプロトコールを用いるスミアのゲル抽出（de Haard HJW, 2002. Construction of large naive Fab libraries. In: Methods in Molecular Biology, vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols；アガロースゲル片の単位ｇ当たり３０体積のＱＸ１、及びＤＮＡ５μｇ当たり１００μｌのビーズ）。
ｃ．電気泳動溶出法によるゲル抽出（Sambrook J and Russell DW, 2001c. Recovery of DNA from agarose gels: electroelution in dialysis bags; In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 1）。
ｄ．ゲル抽出無し。ゲル抽出の代わりに、Ｎａｎｏｓｅｐ（Ｐａｌｌ）又はＭｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）スピンフィルターを用いて、自己連結混合物を水で洗浄及び緩衝液交換し、ＳｆｉＩで直接消化すること。

実験ａ〜ｄを実行するために、実施例９に従って、ＰＣＲ ＥｘｔｅｎｄｅｒポリメラーゼＢｌｅｎｄを用いて合計７５μｇのＦａｂを作製した。平滑化及びリン酸化の後、約２３μｇのＦａｂを回収した。これらのプロセスの間、特にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによる平滑化の後の回収の際、常に大きな損失があった。しかし、最終のＳＯＥ ＰＣＲ工程でＦａｂを作製するために用いられる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ又は混合物が平滑末端を生成しない場合は、平滑化は直鎖状Ｆａｂフラグメントの自己連結に必須である。自己連結プロトコールに従って２３μｇのＦａｂを連結し、３つの異なる分取用ミニゲルに均一に（約５．６μｇ／ゲル）ロードし、実験ａ〜ｃを実行した。５．６μｇの第４のアリコートは実験ｄのために保存した。

それぞれ５．６μｇから始めて、回収量は、ピコグリーンアッセイを用いて測定して、それぞれ２３０ｎｇ（４．１％：標準ＱＩＡＥＸ ＩＩプロトコール）、１８０ｎｇ（３．２％：修正ＱＩＡＥＸ ＩＩプロトコール）、９００ｎｇ（１６％：電気泳動溶出法）、及び４．６μｇ（約８２％：スピンフィルターのみで緩衝液交換）であった。これらのＨＭＷのスメア化されたＦａｂのＳｆｉＩ消化パターンを確認するために、方法ａ〜ｃから回収された材料を、プールし、緩衝液Ｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）中で、１６Ｕ／μｇのＳｆｉＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて５０℃で一晩消化した。同様に、実験ｄから回収されたＦａｂ（約４．６μｇ）を３つの部分（それぞれ１．５μｇ）に分けた。１つの部分は、自己連結を確認するためにそのまま保持し、他の２つの部分は、緩衝液Ｍ（Ｒｏｃｈｅ）中で、Ｆａｂ１μｇ当たり１６Ｕ及び３２ＵのＳｆｉＩを用いて５０℃で一晩消化した。１．５ｋｂのＦａｂバンドがゲル抽出又は単純な緩衝液交換を通して得られたかどうかに関わらず、ＳｆｉＩはＨＭＷスメアから明確に１．５ｋｂのＦａｂバンドを放出することができた。

ＳＯＥ ＰＣＲ ＦａｂプールからのＰＣＲで増幅されたＦａｂ ５０μｇから再び開始する最適化の第２ラウンドにて、大きなライブラリーを作製する前に、各工程での正確な収量を計算した（表３２）。

実施例２０
ウルトラコンピテントＴＧ１細胞におけるエレクトロポレーションのパラメーター
２×（５×１０^８）＝１０^９クローンの標的ライブラリーサイズに達するために、本発明は、スーパーコイルプラスミドコントロールで２桁高い形質転換効率を有するエレクトロコンピテント細胞（すなわち、４〜５×１０^１０ｃｆｕ／μｇ；Ｌｕｃｉｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を利用する。

ｐＵＣコントロール（１０ｐｇ／２５μｌのＴＧ１細胞；１８００Ｖ、２５μｌ、６００Ωに設定されたエレクトロポレーションパルス）を用いて、１ｍｍギャップキュベット中、トリプリケートで形質転換を実施した。そのような細胞についてのｐＵＣ制御に関して報告された製品文献（≧４×１０^１０ｃｌｕ／μｇ）とは異なって、効率は１〜１．６×１０^１０ｃｌｕ／μｇのＤＮＡの範囲であった（表３３）。本発明は、新しいＴＧ１細胞が１ｍｍギャップキュベット中で好ましい１０^１０ｃｆｕ／μｇスケールの効率を有し、大スケールのＦａｂライブラリー作製に使用され得ると結論する。

１ｍｍギャップキュベットは、４０μｌの推奨最大充填体積のみを有し、それ故、大きなライブラリーの作製に用いるには余りにも面倒であるため、本発明は２倍大きい体積の２ｍｍキュベットで同じ細胞の効率を調べる。このスケーラビリティの問題は、最適化を１ｍｍキュベットから２ｍｍキュベットに変更したときに過去の結果との間で再現性と適合性を理解するために非常に重要であった。

この実験を実行するために、電圧、静電容量及び抵抗を変えることによって２ｍｍキュベットについて異なるエレクトロポレーションプロトコールを試験して最適なパラメーターを見つけた。利用可能なエレクトロポレーター（Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ，ＢｉｏＲａｄ）中の２ｍｍキュベット用に２つのプリセットプロトコール：ａ）２５００Ｖ，２５μＦ，２００Ω、及びｂ）３０００Ｖ，２５μＦ，２００Ωが提案される。もう１つのプロトコールは、１ｍｍから２ｍｍのキュベットの変更のためにパラメーターを比例的に増加させることで設計された。最初の変更の試みは、増加した細胞の質量を補償するためのアンペア数の比例的増加と共に、電極プレート間の２倍の距離を補償するために電圧を２倍にすることであろう。この電気穿孔器は３６００Ｖ条件を設定することができないため、３０００Ｖ，２５μＦ及び３００Ωの設定を行った。上記のプロトコールを用いて、細胞５０μｌ当たり２０ｐｇのｐＵＣ１９プラスミドをエレクトロポレーションした。

与えられたロットのＴＧ１細胞の効率が約１×１０^１０／μｇのＤＮＡのままであることが観察された（表３４）。最適化が１ｍｍから２ｍｍ間隔のＢｉｏＲａｄキュベットで直線的にスケーラブルであると結論付けられた。したがって、特に明記しない限り、この時点からのすべての最適化は、２ｍｍキュベット内でプロトコール３０００Ｖ，２５μＦ，３００Ωで行われた。

実施例２１
ウルトラコンピテントＴＧ１細胞における形質転換のパラメーター
試験連結及びエレクトロポレーションのための最適化された手順（参照，表１５）に従って、形質転換当たり２．２ｎｇ（それぞれ１．１ｎｇのベクター及びＦａｂ）に相当する２５μｌのＴＧ１細胞当たり、３μｌの熱不活化され１：２０希釈された連結混合物を形質転換する必要がある。したがって、ベクターＤＮＡの１０^９／μｇのライブラリーサイズに達するためには、約１０００の個々の形質転換を行うことが必要である。本発明は、以下に示されるように、沈殿又は緩衝液交換による塩の除去による、及び連結された全投入ＤＮＡの量に対するＴＧ１細胞の固定体積の飽和点の正確なタイトレーションによる、形質転換数の減少を開示する。

実施例２１ａ
形質転換効率に対する連結混合物の塩除去の効果
この実験には、スタッファー−ｐＣＯＭＢ３ＸＳＳ連結物を使用した。２２個の連結反応のすべてを設定し（１４０ｎｇベクター＋１４０ｎｇスタッファー／２０μｌ反応）、約６μｇの連結ＤＮＡ混合物を得た。直鎖状にされたベクター及びスタッファーＤＮＡの混合物を４５℃で５分間加熱し、直ちに氷上で冷却し、保証されていない接着性の末端連結を防止するためにリガーゼ緩衝液及びリガーゼ酵素を添加した。１６℃で一晩連結した後、連結物を７０℃で１５分間熱不活性化した。６μｇの連結プールを２つの部分（各３μｇ）に分けた。１つの部分はエタノール沈殿による塩除去に供した。２つ目の部分はＭｉｃｒｏｃｏｎ ＤＮＡ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗスピンフィルターを用いた塩除去に供した。スーパーコイルｐＣＯＭＢ３ＸＳＳプラスミド単独を陽性コントロールとし、連結混合物に添加し、スタッファーｐＣＯＭＢ３ＸＳＳ連結物と全く同じ方法で処理した。実験手順及び細胞が予想通りに機能していることを確認するため、スーパーコイルｐＵＣ１９コントロールも含めた。この実験を実施しながら、各工程における投入ＤＮＡ量及び回収量を記録した（表３５）。

エタノール沈殿又はＭｉｃｒｏｃｏｎスピンフィルターで洗浄したＤＮＡを、２ｍｍ ＢｉｏＲａｄキュベット中、ＴＧ１細胞５０μｌごとに４．４ｎｇ（全ＤＮＡ）の量で形質転換した。形質転換細胞を９５０μｌのＲｅｃｏｖｅｒｙ緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中で再生させ、２、５及び１０μｌを、２％グルコース及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する９０ｍｍ ＬＢ寒天プレート上に蒔いた。表３６に効率の計算を示す。

スーパーコイルｐＵＣコントロールには約１０^１０μｇの効率が繰り返された。Ｍｉｃｒｏｃｏｎスピンフィルターで精製されたサンプルはエタノール沈殿されたサンプルよりわずかに良い効率を与えた。Ｍｉｃｒｏｃｏｎスピンフィルターで精製されたサンプルのスタッファー−ｐＣＯＭＢ３ＸＳＳ連結についてのみ、プレーティングデータを示す。

表３６は、０．２％未満のベクターバックグラウンドと共に密集した増殖によって示されるように、スタッファーが２．８９×１０^９／μｇのベクターの形質転換効率で首尾よく連結することを説明する。表３６から、多数の形質変換を導く、希釈（１：２０）による連結混合物からの塩の除去は、連結ＤＮＡの９０％を超える回収量、及び単純な希釈と同等又はそれ以上の形質転換効率を伴うＭｉｃｒｏｃｏｎスピンフィルター装置を用いた塩除去による方法として置き換えることができると結論付けることもできる。

実施例２１ｂ
１０ ^１０ ｃｆｕ／μｇ以上の効率のＴＧ１細胞を形質転換するための最適な細胞対ＤＮＡの比
１０^９クローンのライブラリーサイズに達するために形質転換の数を減らすための他の可能なアプローチは、効率を低下させることなく、ＴＧ１細胞の固定量（５０μｌ）に形質転換できるＤＮＡの最大量を見つけることである。実施例２１ａの記載と正確に同様にして、１８個のすべての標準連結反応、すなわち１４０ｎｇのベクター＋１４０ｎｇのスタッファー＝２８０ｎｇの全ＤＮＡをそれぞれ含む２０μｌの反応を設定して、約５μｇの連結ＤＮＡを得た。全ての反応をプールし、Ｍｉｃｒｏｃｏｎスピンフィルターを用いてプールされた連結混合物を洗浄した後、約３．５μｇの連結ＤＮＡを回収した。実施例２１ａで設定したプロトコールに従って合計４．４ｎｇ（ベクター＋インサート）から開始して、ＴＧ１細胞５０μｌ当たり以下の量：６．２５、１２．５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、４００及び８００ｎｇのＤＮＡを形質転換した。形質転換された細胞を９５０μｌのＲｅｃｏｖｅｒｙ緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中で再生させ、１：１０００、１：５０００、１：２５０００及び１：５００００希釈物からのそれぞれ１００μｌを２％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する９０ｍｍ ＬＢ寒天プレート上に蒔いた。１：１０００００希釈は、４００及び８００ｎｇサンプルについてのみ行われた。図２４Ａは、この連結からの形質転換されるたプレートを示し、表３７は、計数され、処理されたデータを示す。

投入ＤＮＡ質量対コロニー数のデータのグラフ分析（表３７）は、直線フィットが不良であることを示した（０．７６９のＲ^２；図２４Ｂ，パネルＡ）が、非直線フィット（二次多項式）が遥かに良好であることが証明された（０．９２２のＲ^２；図２４Ｂ、パネルＢ）。非直線フィットは、投入ＤＮＡ質量に対するコロニー数の依存性が直線的ではないこと、及び非直線近似曲線（ｆｉｔｔｅｄ ｃｕｒｖｅ）の漸近線が飽和点であることを明らかに示唆している。本発明はまた、全体的なフィット（図２４Ｂ，パネルＣ）よりも遥かに優れ、２つの個々のフィットの交点を飽和点と見なす「決定係数」（Ｒ^２）を有する２つの個々の直線フィットに分割する図２４Ｂ（分割回帰；Jones RH and Mollitoris BA, 1984; Kuchenhoff H, 1996）に設定される代替的なグラフィカルアプローチを開示する。この値は、ＴＧ１細胞５０μｌ当たり約２７２ｎｇの全連結ＤＮＡである。

本発明はまた、細胞体積の増加に関して形質転換効率の効果を調べる。４００ｎｇの投入ＤＮＡを同じ２ｍｍキュベット中でＴＧ１細胞１００μｌについて形質転換した。２００〜４００ｎｇの投入ＤＮＡ質量の比例的増加によって、効率を調べた。データに基づいて、体積の増加と共に効率が半分（９．１３×１０^８ｃｆｕ／μｇ）に減少すると結論付けることができる。

実施例２２
自己環状化プロトコールによる大きなファージミドライブラリーの作製
ＣＴＬ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ，クリーブランド，オハイオ州，米国）からの特徴付けられたＰＢＭＣを使用し、実施例１に詳述された以下の工程によって、１２人のドナーのプールからＲＮＡを単離した。実施例１の詳述に従って、ｃＤＮＡを調製した。調製されたｃＤＮＡの品質を試験するために、反応５０μｌ当たり５０ｎｇのテンプレートを有するプールされたｃＤＮＡ上で、Ｖ_Ｈ、Ｖ_κ及びＶ_λドメインにそれぞれ特異的な１つのプライマー対を用いた。実施例３〜５に記載された最適のＰＣＲサイクリングプロトコールを使用することで、このｃＤＮＡ調製物からそれぞれのＶファミリーを明確に増幅させた。

この結果に基づいて、ＲＮＡサンプルをこの時点（約９００μｇ）でプールし、等分し、−８０℃で保存した。ヒトＰＢＭＣのプールされた全ＲＮＡからの特大のｃＤＮＡ調製のために、反応当たり１μｇの総ＲＮＡを有する１２０個の反応物を集めた。リボグリーン法によって収量を推定した。１３．６μｇのｃＤＮＡの総収量（表３８）を、ＣＴＬからの特徴付けされていないＰＢＭＣから先に調製した４．２μｇのｃＤＮＡ（３人のドナー；表１）と一緒にプールした。

実施例３〜９に記載の方法を用いて、最終のκ及びλＦａｂフラグメントを作製するためのＰＣＲ増幅を実施した。

自己連結プロセスについての回収チャート（表３２及び表３５）に基づいて、それぞれ５μｇの最終の連結可能なκ及びλＦａｂを作製するには、１００μｇの各々の型のＦａｂで自己連結プロセスを開始することが必要であると計算された。等モル量のＶ及びＣ遺伝子を用いて、第１のオーバーラップ（ＳＯＥ）ＰＣＲを行った。各々の軽鎖について合計５０個のＳＯＥ反応を、各々の重鎖について合計１００個のＳＯＥ反応を、設定した。ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キットによる最終の収量は、Ｖ_λＣ_λについて２７μｇ、Ｖ_κＣ_κについて３１μg、及びＶ_ＨＣ_Ｈ１について５３μｇであった。等モル量のＶ_ＬＣ_Ｌ及びＶ_ＨＣ_Ｈ１アンプリコンを用いて、第２のオーバーラップ（ＳＯＥ）ＰＣＲを同様に行った。κ鎖及びλ鎖についてそれぞれ合計５００個のＰＣＲを実施した。ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キットによる最終の収量は、λＦａｂが９６μｇ、κＦａｂが９９μｇであった。

平滑化及びキナーゼ処理の後、サンプルを約５００ｎｇ／μｌに調整し、１Ｕ／μｇのＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて反応１５μｌ当たり３．０μｇのＦａｂを連結した。１５μｌの反応体積中の最終の濃度が２００ｎｇ／μｌに達するようにＤＮＡ濃度を調整した。実施例１９に示すように、ＰＥＧ８０００を６％の最終濃度まで添加した。反応物をＰＣＲブロック中、１６℃で１４〜１６時間インキュベートした。一晩インキュベートした後、連結を更に室温で１時間行い、更なるプロセスを行った。

自己連結されたＦａｂ（スミア）のアリコート（１〜２μｇ）を分析用に保存した。残りの連結反応をプールし、最初にフェノール化で精製し、次にＭｉｃｒｏｃｏｎスピンフィルターを用いて３回のラウンドの水との緩衝液交換に供した。ＮａｎｏＶｕｅ（ＧＥ）を用いて、Ａ_２６０／Ａ_２８０の比率が確認され、通常１．７〜１．９の範囲であった。ピコグリーンアッセイを用いて、実際のｄｓＤＮＡ濃度を測定した。無塩及び無タンパク質の自己連結された高分子量（ＨＭＷ）のＦａｂスミアを、ＳｆｉＩを用いる１．５ｋｂ Ｆａｂの放出に供した。Ｆａｂ １μｇ当たり３２ＵのＳｆｉＩ（Ｒｏｃｈｅ）を、緩衝液Ｍ（Ｒｏｃｈｅ）中に添加し、５０℃で一晩インキュベートした。ＳｆｉＩ放出されたＦａｂのアリコート（１〜２μｇ）をアガロースゲル分析のために保存し、残りをカラムベースのゲル抽出を用いてゲル精製した。

分析用ゲル（図２５）は、９０％を超える直鎖状ＦａｂがＨＭＷスミアの形成に関与し、同様のパーセンテージが１．５ｋｂのＳｆｉＩ放出を示したことを示す。したがって、全プロセスが９０％を超えるＳｆｉＩ連結可能なＦａｂを含有するＦａｂプールの生成に成功したことが結論付けられた。表３９は、各工程での出発材料に対する連結可能なＦａｂ作製量及びパーセント回収量を提供する。ＳｆｉＩ消化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターとの連結のために、約３．４μｇのκＦａｂ及び約４．６５μｇのλＦａｂを最終的に調製した。

１４０ｎｇのＳｆｉＩ消化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターを、１Ｕ／μｇのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、２０μｌの反応中、１４０ｎｇのＳｆｉＩ消化されたＦａｂ（ベクター：インサートのモル比１：２）と連結させ、１６℃で一晩インキュベートした。約３．４μｇのκＦａｂ及び約４．６５μｇのλＦａｂのすべてを連結させるために、前節に詳細に記載されているようにして必要な数の連結を設定した。一晩（１６時間）インキュベートした後、連結混合物を７０℃で１５分間熱不活性化し、一緒にプールした。κＦａｂ及びλＦａｂを別々に処理した。Ｍｉｃｒｏｃｏｎスピンフィルターを用いて、プールを塩除去及び水との３回の緩衝液交換に供した。ＮａｎｏＶｕｅを用いてＡ_２６０／Ａ_２８０の比が確認され、１．７〜１．９の範囲であった。ピコグリーンアッセイを用いて、実際のｄｓＤＮＡ濃度を測定した。塩除去の後、連結された材料の全回収量は、κ及びλ連結について、それぞれ５．２μｇ及び６．５μｇ（ベクター＋Ｆａｂ）であった。

効率の低下前に、最適化されたエレクトロポレーションパラメーターを用いて、２ｍｍ間隔のＢｉｏＲａｄキュベット中で、５０μｌのＴＧ１細胞当たり最大の２７２ｎｇの精製連結ＤＮＡ（ベクター＋インサート）をエレクトロポレーションすることができるという推定（表３７，図２４Ｂ）に基づいて、それに応じてライブラリー形質転換が設定された。κライブラリー（５１６６ｎｇ，ベクター＋Ｆａｂ）を作製するために、合計２０回の形質転換を２セットで実施（１０回の形質転換／セット）し、その結果、κについて２つのサブライブラリーが得られた。これは、５０μｌ細胞当たり約２５８ｎｇのＤＮＡ（１２９ｎｇの連結されたベクター）を形質転換することと同等であった。培養物を３７℃及び２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。１０回の形質転換後に生成された１０ｍｌの培養物（セット１）を１５ｍｌに希釈し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び２％のグルコースを含有する合計５枚の大きなＬＢ寒天プレート（２４５×２４５ｍｍ）上に３ｍｌ／プレートの量で広げた。したがって、κライブラリーを合計１０個のプレートに蒔いた（セット１及び２；κサブライブラリー００１及び００２；参照，表４０）。各サブライブラリーの５０μｌのアリコートを、サブライブラリーの形質転換効率を計算するために取っておいた。

同様に、λライブラリー（６５００ｎｇ，ベクター＋Ｆａｂ）を作製するために、合計３０回の形質転換を３セットで実施（１０回の形質転換／セット）し、この結果、λについて１５個の大きなプレート及び３個のサブライブラリーが得られた（セット３〜５；λサブライブラリー００１、００２及び００３；参照，表４０）。これは、５０μｌ細胞当たり約２１６ｎｇのＤＮＡ（１０８ｎｇの連結されたベクター）を形質転換することと同等であった。各サブライブラリーの５０μｌのアリコートを、サブライブラリーの形質転換効率を計算するために再び取っておいた。

１μｇ当たりの形質転換効率を計算するために、各κ及びλサブライブラリーから保存された５０μｌのアリコートを、Ｒｅｃｏｖｅｒｙ培地中で１：１０００、１：５０００、１：２５０００、１：５００００及び１：１０００００に希釈した。１００μｌの各希釈液を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び２％のグルコースを含有する９０ｍｍ ＬＢ寒天プレート上にトリプリケートでプレーティングした。３７℃で一晩インキュベートした後、大きなライブラリープレート上に濃い固まりにもつれた増殖が観察され、効率プレートは十分に単離されたコロニーを示した。それぞれの形質転換効率及びライブラリーサイズの要約結果を表４０に示す。

各大きなプレートからの菌叢を、５ｍｌのＬＢ＋１％グルコースブロス中に滅菌スクレーパーを用いて掻き取った（掻き取り用に４ｍｌ＋リンス用に１ｍｌ）。各サブライブラリーから掻き取った培養物を単一の試験管にプールし、次いで等体積の保存培地（６５％のグリセロール，１００ｍＭのトリス，ｐＨ８．０，２５ｍＭ ＭｇＳＯ_４）を加え、５０μｌのアリコートを保存して各サブライブラリーのｃｆｕ／ｍｌを計算した。細菌懸濁液を将来の研究に適した大きさに等分し、個々のサブライブラリーとして−８０℃で保存した。κの２つのサブライブラリーを、ＨｓＮκＦａｂ００１及びＨｓＮκＦａｂ００２と呼び、ここでＨｓはホモサピエンスを表し、そしてＮはナイーブを表す。同様に、λＦａｂの３つのサブライブラリーを作製し、ＨｓＮλＦａｂ００１、ＨｓＮλＦａｂ００２及びＨｓＮλＦａｂ００３と呼んだ。

個々のサブライブラリーのｃｆｕ／ｍｌを計算するために、対数（ｌｏｇ）希釈法を用いた。保存したアリコート２０μｌを１８０μｌのＬＢ培地と混合して１０^−１希釈液を得た。最終体積２００μｌの１０^−１０希釈に達するまで、この保存液から対数希釈液を調製した。最後の４つの希釈物（１０^−７、１０^−８、１０^−９及び１０^−１０）からのそれぞれ１００μｌを、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び２％のグルコースを含有するＬＢプレートにプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、コロニー数を数えた。得られたｃｆｕ／ｍｌは０．６７５〜１．８２×１０^１０ｃｆｕ／ｍｌの範囲であった。

ライブラリーの品質を評価するために、自己連結戦略によって作製された限られた数のκ及びλクローンを分析した。全部で９６個のクローン（κ及びλのそれぞれ４８個）を選び、プラスミドＤＮＡを小スケールで抽出した。Ｆａｂの同一性を確認するために、テンプレートとしてのプラスミドＤＮＡ及びＦａｂ末端特異的プライマー（配列番号３２／配列番号３４）を用いてＰＣＲを行った。κクローン及びλサブタイプのそれぞれ４８個のクローンすべてが、Ｆａｂ特異的ＰＣＲ増幅について陽性（１００％陽性）であった。９６個全てのクローンがＦａｂ陽性であることを確認した後、ＰＣＲ生成物を多様性分析のためにＢｓｔＮＩフィンガープリント法に供した。κクローン及びλクローンはいずれも反復パターンを示さず、各クローンは異なっていた。

各ライブラリーからのクローンのサンプルセットを、実施例１８に記載された同じ５セットのプライマーを用いてジデオキシ配列決定に供した。配列クロマトグラムからのコンティグ構築のアルゴリズム、及び異常塩基の信号の視覚的検証に従って、各クローンのＦａｂ配列を分析した。次いで、５’末端及び３’末端のＳｆｉＩ部位、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１ドメイン等の標識、並びに開始コドンから終止コドンまでの個々の軽鎖及び重鎖の完全性について、手動でコンティグに注釈を付けた。手動分析の結果及び注釈を表４１に要約する。入手可能なデータに基づくと、新規自己連結法によって調製されたκライブラリー又はλライブラリーのいずれかからのクローンの約８０％が、全長翻訳可能Ｆａｂである。

すべてのクローンのＶ_Ｌドメイン及びＶ_Ｈドメインの配列も、生殖細胞系ファミリー、フレームワーク及びＣＤＲに関する詳細な注釈、並びに参照ヒト配列と比較したアミノ酸の相違についてＩＭＧＴデータベースに提出した。ファミリーの適用範囲の結果を表４２に示す。ＩＭＧＴデータベースからの残りの注釈は、配列決定されたクローンのサブセットについて表４３及び表４４に要約されている。分析された全クローンの８３〜９３％が、終止コドンのないＶドメインを有し、それゆえ機能的であった。

実施例２３
ベクター連結の成功への障壁に関する更なる研究
より大きなナイーブ抗体ファージディスプレイライブラリーを得るために、本発明はまた、代替的な方法及びプロトコールを本明細書に開示する。臭化エチジウムと同様にｄｓＤＮＡインターカレーター性色素でもあるＳＹＢＲ ｓａｆｅ（商標）は合成ｓｃＦｖライブラリーの連結効率を改善することが報告されている（Martineau P, 2010. Synthetic antibody libraries. In: Antibody Engineering, Vol. 1）。理論的根拠は、臭化エチジウム染色したゲルを紫外線にさらすとＤＮＡが損傷し、そのためにクローニング効率が低下することである。先行技術に設定されているこの考えを試験するために、実施例１３に示すように、２０μｇのｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターをＳａｃＩ−ＳｆｉＩ−ＳａｃＩで３回消化した。ゲル当たり１０μｇの消化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクター生成物を、２つの異なる１×ＴＡＥ中にキャストされた１％低融点アガロースゲル上で、５Ｖ／ｃｍで９０分間泳動させた。ゲル＃１を０．０１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色し、ゲル＃２をＭｉｌｌｉ−Ｑ水中の１：１００００希釈のＳＹＢＲ ｓａｆｅ（商標）で染色した。両方のゲルを、暗い実験室領域で穏やかに振盪しながら２０分間染色した。両方のゲルからのベクター骨格（約３．３ｋｂ）及びスタッファー（約１．７ｋｂ）を切り出し、ＱｉａＱｕｉｋキットを用いて精製した。ヌクレアーゼを含まない水にＤＮＡフラグメントを溶出させ、ピコグリーンアッセイで定量した。実施例１１に記載と同様にして、適切な実験コントロールを行って、それぞれのベクター及びスタッファーの連結並びにＴＧ１細胞への形質転換を行った。表４５は、Ｍａｒｔｉｎｅａｕ（2010; Synthetic antibody libraries. In: Antibody Engineering; Vol. 1）に従う方法を用いることで、連結／形質転換の効率がＴＧ１細胞において少なくとも３倍増加し得ることを示す。

図１７、２３及び２５は、ＳｆｉＩで消化した後に、自己環状化されたスミアの大部分が約１．５ｋｂの連結可能なＦａｂ分子に変換していないことを示す。これは、所与のＰＣＲ増幅集団中の全てのＦａｂ分子が消化可能な／正確なＳｆｉＩの末端を有するわけではないことを示す。表１８に示されたデータもこの事実（２０％のＴＯＰＯクローンされたＦａｂのＤＮＡ配列中の不正確なＳｆｉＩの末端）を説明する。ＤＮＡ配列中の不正確なＳｆｉＩの末端は、配列番号３２及び配列番号３４である最終Ｆａｂ増幅のために使用されるフォワード及びリバースプライマーの固有の性質に由来する。図２６は、これらのプライマーの配列及びそれらに対する対となるアラインメントを示す。

図２６に基づいて、（ａ）いずれかのプライマーの５’末端の最初の１８ヌクレオチドが同一であり、（ｂ）全体として、リバースプライマー（配列番号３４）の３９ヌクレオチドのうち３０（７６．９％）がフォワードプライマー（配列番号３２）と同一であることが、注目される。最後のオーバーラップアセンブリの間に、Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ及びＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１テンプレートは既にこれら２つのプライマーのアニーリング部位を含むことが、更に注目される。したがって、２回目のサイクル後（すなわち、最初の二本鎖平滑テンプレートの形成後）、ＰＣＲ反応において、いずれかのプライマーの５’末端が、新たに生成されたテンプレート上に誤った方向でアニールし得ることは、想像できないわけではない。表４６に示すように、ＰＣＲの最初の数サイクルで、４つの異なるアンプリコンの組み合わせが生じうる。

表４６に基づくと、あり得る結論として、２５〜３０サイクルの標準的なＰＣＲ反応における増幅の指数関数的性質のために、正しく増幅された生成物の２５％よりも誤って増幅された生成物の７５％が優勢となることである。その結果、表１８並びに図１７、２３及び２５に示すデータとなり得る。

本発明は、異なる長さの５’突出部分（配列番号３５〜３７）と共に、元のリバースプライマー（配列番号３２）と非相同である最終Ｆａｂ融合物のための代替的なフォワード増幅プライマーを開示する。これらの新規プライマーの後者の側面を設計するための概念は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓの年次カタログ（New England Biolabs Product Catalog and Technical Reference, 2007）の「Cleavage Close To 5’ends」との題名の表に見出すことができる。これらの新しく設計されたフォワードプライマーの配列番号３４に対するアラインメントは２０〜３６％の同一性のみを示し、元の対と計算された７７％の同一性とは対照的であった。本明細書に記載のプライマー対を試験して、Ｖ_κ−Ｃ_κ及びＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１プールを融合されたＦａｂに組み立て、次いでＦａｂプールをＳｆｉＩで消化した（図２７）。

ゲル抽出されたＳｆｉＩ消化されたＦａｂプールを、３回消化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳに連結した。連結混合物を実施例２１及び２２に記載した方法を用いて高効率ＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換した。結果を表４７に示す。

試験Ｆａｂプールの形質転換効率の検討（表４７の平均効率の欄）は、配列番号３６／配列番号３４の対によって増幅された試験Ｆａｂプールが最良の形質転換効率を示し、これはスタッファーコントロールの形質転換効率（表４７の下線を引いた値）に非常に近いことを示す。増幅プライマーの相同性と形質転換効率とは、負の相関があるように思われ、相同性が高いほど、形質転換の効率は低い。相同性が同一である場合（配列番号３５及び配列番号３６−両方とも配列番号３４と２０％相同である）、４ｂｐの５’突出部分を有するもの（配列番号３６）は１ｂｐの突出部分を有するもの（配列番号３５）よりも良好に働く。表４５に示される形質転換効率は、実施例１２に詳述される希釈された連結混合物で得られ、実施例２１に示される精製された連結混合物サンプルと比較して２〜３倍効率が低いことは、注目されるべきである。本明細書中に開示される方法は、本明細書中に示される大きなナイーブ抗体ファージディスプレイライブラリーを達成することを可能にする。

実施例２４
ｐＣＯＭＢ３ＸＳＳよりも明らかに改善された新しいファージベクター：ｐＳＳＹ１
図１３は、ＳｆｉＩによるプラスミドｐＣＯＭＢ３ＸＳＳの消化が不完全であることを示す。実施例１０は、このような挙動の理論的根拠が、５’部位及び３’部位のｄｃｍメチルトランスフェラーゼ感受性ペンタヌクレオチドコアにあり、ｄｃｍ^＋宿主をプラスミド増殖に用いる場合にこれらの部位をヘミメチル化されたままにすることを指摘する。この問題が市販のｄａｍ⁻／ｄｃｍ⁻大腸菌株の使用によって軽減することができるが、実施例１３は更に、そのようなプラスミド調製物を日常的なＦａｂ連結のために使用することの実際上の困難性を説明する。ｐＣＯＭＢ３ＸＳＳプラスミドの詳細な検討は、以下に列挙される更なる設計上の問題を明らかにする（ヌクレオチドの位置は、Ｂａｒｂａｓ研究室のサイトで利用可能なものと同一である，参照，http://www.scripps.edu/barbas/content/pcomb_images/pcomb_images_files/pComb_Text_Files/pComb3XSS.txt）：
１．軽鎖及び重鎖のスタッファーの両方は、それらが大腸菌内で翻訳可能であるように設計される。
２．軽鎖スタッファーの場合、これがＯｍｐＡペリプラズムリーダーを含む５５アミノ酸のタンパク質を産生することが予測される。
３．重鎖スタッファーの場合、これがＮ末端のｐｅｌＢペリプラズムリーダー及びＣ末端のバクテリオファージｆｄ遺伝子ＩＩＩのＣＴＤ（Ｃ末端ドメイン）と共に、大腸菌チオレドキシン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ１０４２４．１；ｎｔｌ５８４−１９４０）を含む３５１アミノ酸のタンパク質を産生することが予測される。
４．軽鎖スタッファーは、Ｆａｂ様クローンの一部（ｎｔ５２７−９７７：ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ６０８２６５のＶＨフラグメントと同一、及びｎｔ９３０−１４６９：ＧｅｎＢａｎｋ λクローンＬ２２１５７．１と同一）を含む。
５．６×Ｈｉｓタグが赤血球凝集素（ＨＡ）タグの内部にあり、一般的な固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）フォーマットに基づく検出及び／又は精製が困難な場合がある。

上記の欠点を改善するために、本発明は、（ａ）５’及び３’ＳｆｉＩ部位のペンタヌクレオチドコア中に、ｄａｍ又はｄｃｍメチルトランスフェラーゼでメチル化されたシトシンであることできるヌクレオチドを有さず、（ｂ）ＯｍｐＡ又はｐｅｌＢリーダーの開始コドンを用いて翻訳することができず、したがって増殖中のプラスミドの安定性を高め、適切な制限消化とそれに続くアガロースゲル上での分析によってＦａｂインサートと親クローンを区別することを可能にする、非原核生物起源のスタッファーを有し、及び（ｃ）ＨＡタグが６×Ｈｉｓタグの内部にあり、候補Ｆａｂへの標準的なＩＭＡＣプロトコールの適用の間に起こり得る障害を回避する、新規ベクターの設計を開示する。Ｖ_Ｌドメイン内での切断の可能性が低い制限フラグメントとして、Ｖ_Ｌ／Ｖ_Ｈ又は軽鎖／重鎖ドメインシャフリングを可能にするもの等の他の望ましい特徴（Persic L et al., 1991）は、抗体クローニング技術の実践者には明らかであろう。配列番号３８はこのベクター（ｐＳＳＹ１）の完全な配列を提供し、図２８は環状プラスミド形態の地図を示す。

新しいベクターｐＳＳＹ１は、コピー数、プラスミド／ファージ複製Ｏｒｉ、抗生物質マーカー、及びｐＣＯＭＢ３ＸＳＳとしてのｆｄｇＩＩＩのＣＴＤの使用において同一である。しかし、ファージディスプレイ及びタンパク質発現の両方のためにより良く使用できるようにする。表４８は、ゼロベクターバックグラウンドを達成するためにはｐＣＯＭＢ３ＸＳＳを２回の制限消化（ＳａｃＩ−ＳｆｉＩ）することが必要であるが、ｐＳＳＹ１がＳｆｉＩの単一の消化で同じことを達成することを示す。これは、このプラスミド中の２つのＳｆｉＩ部位のペンタヌクレオチドコアを変えることの有益な効果を明らかに示す。更に、この表はまた、ＳｆｉＩ消化されたｐＳＳＹ１ベクターが、スタッファー再連結試験において二重消化されたｐＣＯＭＢ３ＸＳＳベクターと同様に効率的であることを説明する。

実施例２５
ｐＳＳＹｌ骨格上の超大型ライブラリーの構築
ＣＴＬ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．，オハイオ州クリーブランド，米国）からの特徴付けられたＰＢＭＣを用いて１５人のドナーのプールからＲＮＡを単離し、それぞれ１人のドナーからの骨髄、脾臓及び扁桃の市販のＲＮＡ（ＡＭＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）と共にプールした。

ＲＮＡ調製物を４０：２０：２０：２０（ＰＢＭＣ：骨髄：脾臓：扁桃）に混合し、実施例１に詳述したようにこのプールしたサンプルからｃＤＮＡを調製した。調製したｃＤＮＡの品質を試験するために、Ｖ_Ｈ、Ｖ_κ及びＶ_λドメインのそれぞれに特異的な新しいプライマー対を、反応５０μｌ当たり５０ｎｇのテンプレートと共に、プールしたｃＤＮＡ上で使用した。得られたアンプリコンは最小の非特異的増幅を伴う正しいサイズのもの（図２９）であり、ｃＤＮＡの品質が許容されうることを示唆している。ヒトＰＢＭＣ、脾臓、骨髄及び扁桃のプールされた全ＲＮＡからの特大のｃＤＮＡ調製のために、１３０の反応物を、反応当たり１μｇの全ＲＮＡで集めた。リボグリーン法で収量を推定した。 ｃＤＮＡの総収量は２６．７μｇであった。

最終κ及びλＦａｂフラグメントを作製するために、先に記載した方法（参照，実施例３〜９）を用いてＰＣＲ増幅を行った。導入された変更は、（ａ）実施例２４に示されるようにｄｃｍメチルトランスフェラーゼ（配列番号３９）によってメチル化されない３’ＳｆｉＩ部位をＣ_Ｈ１テンプレートに含めること、（ｂ）ｐＳＳＹ１（配列番号４０〜４１）の軽鎖と重鎖のスタッファーの間の遺伝子間配列に匹敵する３’配列を有するＣ_κ及びＣ_λテンプレートを使用すること、（ｃ）ｄｃｍメチルトランスフェラーゼ（配列番号４２〜５４；図２８）によってメチル化されないであろう全てのＶドメインフォワードプライマー中に５’ＳｆｉＩ部位を含めること、及び（ｄ）実施例２３に例示されたように、必要に応じてｐＳＳＹ１ベクターに最終オーバーラップフォワードプライマー（配列番号５５）を使用すること、であった。

新しいプライマーから得られた効率に（表４７）基づいて、各々２０μｇの最終連結可能なκ及びλＦａｂを生成させるために、１００μｇの各々の型のＦａｂがプロセスの開始に必要であると推定された。等モル量のＶ及びＣ遺伝子を用いて、第１のオーバーラップ（ＳＯＥ）ＰＣＲを行った。各軽鎖について合計１００のＳＯＥ反応及び重鎖について２００のＳＯＥ反応を設定した。ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出後の最終収量は、ピコグリーンアッセイにより測定したところ、Ｖ_λＣ_λが２７μｇ、Ｖ_κＣ_κが３８．５μｇ、及びＶ_ＨＣ_Ｈ１が９３．４μｇであった。等モル量のＶ_ＬＣ_Ｌ及びＶ_ＨＣ_Ｈ１アンプリコンを用いて、第２のオーバーラップ（ＳＯＥ）ＰＣＲを同様に行った。κ鎖及びλ鎖についてそれぞれ合計７７５のＰＣＲを行った。ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出後の最終収量は、ピコグリーンアッセイにより測定したところ、それぞれλＦａｂが９６μｇ、κＦａｂが９８．５μｇであった。

κ及びλＦａｂの両方を別々にＳｆｉＩ消化に供した。Ｆａｂ１μｇ当たり３２ＵのＳｆｉＩを緩衝液Ｍ（Ｒｏｃｈｅ）に添加し、５０℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キットを用いて、消化されたＦａｂをゲル精製し、ＤＮＡをヌクレアーゼの無い水に溶出させた。Ｆａｂをピコグリーンアッセイにより定量し、最終収量はそれぞれκが約１７．２μｇ、及びλが約１７．５μｇであった。ＮａｎｏＶｕｅを使用してＡ_２６０／Ａ_２８０の比が確認され、１．７〜１．９の範囲であった。実施例１０に示すように、一晩のＳｆｉＩ消化によってｐＳＳＹ１ベクターを調製した。

１Ｕ／μｇのＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、２０μｌの反応で、１４０ｎｇのＳｆｉＩ消化されたｐＳＳＹ１ベクターを１４０ｎｇのＳｆｉＩ消化されたＦａｂ（ベクター：インサートのモル比１：２）と連結させ、１６℃で一晩インキュベートした。合計約１７．２μｇのκ及び約１７．５μｇのλＦａｂを連結させるために、先の実施例に十分に記載したように必要な数の連結を設定した。一晩（１６時間）インキュベートした後、連結混合物を３７℃で１時間ニックシールし、続いて７０℃で１５分間熱不活性化し、一緒にプールした。κ及びλＦａｂを別々に処理した。プールを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎスピンフィルターを用いる、塩除去及び３回の水との緩衝液交換に供した。ＮａｎｏＶｕｅを使用してＡ_２６０／Ａ_２８０の比が確認され、１．７〜１．９の範囲であった。実際のｄｓＤＮＡ濃度は、ピコグリーンアッセイを用いて測定した。塩除去後、連結された材料の全回収量は、κ及びλの連結について、それぞれ２８及び１８．１５μｇ（ベクター＋Ｆａｂ）であった。

表３７及び図２４Ｂに基づいて、実施例２０に記載されたエレクトロポレーションパラメーターを用いて、２ｍｍ間隔のＢｉｏＲａｄキュベット中で、５０μｌのＴＧ１細胞当たり最大の２７２ｎｇの精製連結ＤＮＡ（ベクター＋インサート）をエレクトロポレーションすることができると推定される。κライブラリー（２６３８４ｎｇ、ベクター＋Ｆａｂ）を作製するために、合計９７回の形質転換を８セットで実施（１２〜１３回の形質転換／セット）し、その結果、κについて８個のサブライブラリーが得られた。１セット当たり１２〜１３回の形質転換後に生成された約１２ｍｌの培養物を１２５ｍｌのコーニングフラスコに移し、３７℃及び２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。そのような各セットからの形質転換培養物を、５μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び２％のグルコースを含有する７枚の大きなＬＢ寒天プレート（２４５ｍｍ×２４５ｍｍ）上に約１．５ｍｌ／プレートの量で広げた。したがって、κライブラリーを合計６２個のプレートに蒔いた（κサブライブラリー００１〜００８；参照，表４９）。各サブライブラリーの５０μｌのアリコートを、サブライブラリーの形質転換効率を計算するために取っておいた。

同様に、λライブラリー（１８０３３ｎｇ，ベクター＋Ｆａｂ）を作製するために、合計６６回の形質転換を６セットで実施（７〜１３回の形質転換／セット）し、この結果、λについて３９個の大きなプレート及び６個のサブライブラリーが得られた（λサブライブラリー００１．１−００６．１；参照，表４９）。各サブライブラリーの５０μｌのアリコートを、サブライブラリーの形質転換効率を計算するために再び取っておいた。

１μｇ当たりの形質転換効率を計算するために、各κ及びλサブライブラリーからのこれらの５０μｌのアリコートをＲｅｃｏｖｅｒｙ培地（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中で１：２５０００、１：１０００００、１：５０００００及び１：８０００００に希釈した。１００μｌの各希釈液を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び２％のグルコースを含有する９０ｍｍ ＬＢ寒天プレート上にトリプリケートでプレーティングした。３７℃で一晩インキュベートした後、大きなライブラリープレート上で濃い固まりにもつれた増殖が観察され、効率プレートは十分に単離されたコロニーを示した。それぞれの形質転換効率及びライブラリーサイズの要約結果を表４９に示す。

各大きなプレートからの菌叢を、５ｍｌのＬＢ＋１％グルコースブロス中で滅菌スクレーパーを用いて掻き取った（掻き取り用に３ｍｌ＋リンス用２ｍｌ）。各サブライブラリーから掻き取った培養物を単一の試験管にプールし、次いで等体積の保存培地を加え、５０μｌのアリコートを保存して各サブライブラリーのｃｆｕ／ｍｌを計算した。細菌懸濁液を将来の研究に適したサイズに分け、個々のサブライブラリーとして−８０℃で保存した。κの８つのサブライブラリーを、ＨｓＮ３ｋＦａｂ００１〜ＨｓＮ３ｋＦａｂ００８と呼び、ここでＨｓはホモサピエンスを表し、そしてＮはナイーブを表す。同様に、６つのサブライブラリーをλＦａｂのために作製し、ＨｓＮ２ＬＦａｂ００１．１〜ＨｓＮ２ＬＦａｂ００６．１と呼んだ。

個々のサブライブラリーのｃｆｕ／ｍｌを計算するために、対数希釈法を用いた。保存したアリコート２０μｌを１８０μｌのＬＢ培地と混合して１０^−１希釈液を得た。最終体積２００μｌで１０^−１希釈に達するまで、この保存液から対数希釈液を調製した。最後の４つの希釈物（１０^−７、１０^−８、１０^−９及び１０^−１０）からのそれぞれ１００μｌを、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び２％のグルコースを含有するＬＢプレートにプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、コロニー数を数えた。得られたｃｆｕ／ｍｌは０．６３〜５．４×１０^１０ｃｆｕ／ｍｌの範囲であった。

全部で９６個のクローン（κ及びλのそれぞれ４８個）を選び、プラスミドＤＮＡを小スケールで抽出した。Ｆａｂの同一性を確認するために、テンプレートとしてのプラスミドＤＮＡ及びベクター骨格特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った。いずれかのライブラリーからのクローンのほとんどがＦａｂ陽性（κについて９７％、λについて１００％）であることを確認した後、多様性分析のために、ＰＣＲ生成物をＢｓｔＮＩフィンガープリントに供した。ＢｓｔＮＩフィンガープリントは、κクローン及びλクローンはいずれも反復パターンを示さず、各クローンは異なっていた。

各ライブラリーからの９６個のクローンを、実施例１８に記載された同じ２つのベクター骨格特異的プライマー及び１つのＣ_Ｈ１特異的プライマーを用いてジデオキシ配列決定に供した。しかし、２つのｐｅｌＢ隣接領域特異的プライマーを、κクローンについてはＣ_κ特異的フォワード及びリバースシークエンシングプライマーに、λクローンについてはＣ_λ特異的フォワード及びリバースシークエンシングプライマーに置き換えた。配列クロマトグラムからのコンティグ構築の日常的なアルゴリズム、及び異常塩基の信号の視覚的検証に従って、各クローンのＦａｂ配列を分析した。次いで、５’末端及び３’末端のＳｆｉＩ部位、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１ドメイン等の標識、並びに開始コドンから終止コドンまでの個々の軽鎖及び重鎖の完全性について、手動でコンティグに注釈を付けた。手動分析の結果及び注釈を表５０に要約する。

すべての「良好な」クローン（すなわち、ＬＣとＨＣの両方がインフレームであるクローン）のＶ_Ｌドメイン及びＶ_Ｈドメインの配列も、生殖細胞系ファミリー、フレームワーク及びＣＤＲに関する詳細な注釈についてＩＭＧＴデータベースに提出した。ファミリーの適用範囲の要約結果を図３０に示す。表５１〜表５３はクローンのサブセットについてのＩＭＧＴデータベースからの残りの注釈を含む。

この分析は、それぞれＶ_Ｈ（ＶＨ６、ＶＨ７）及びＶ_λ（ＶＬ９、ＶＬ１０）の２つのファミリー並びにＶ_κ（ＶＫ５）の１つのファミリーを除いて、他のすべてのファミリーがこれらのクローンにおいて表されること（図２９）を示した。これらのファミリーは他のファミリーと比較してより少ない変異体によって表されるので、そのようなファミリーに属するクローンはそれらの希少性及びこの配列データセットにおける低いサンプリング数のために見逃されている可能性がある。すべてのＶ_Ｈドメインの４４．１％がＶＨ４ファミリーに属し、１９．７％がＶＨ３に属し、他のファミリー（ＶＨ１、ＶＨ２及びＶＨ５）は５〜１７％の範囲であった。同様に、Ｖ_κの４ファミリー及びＶ_λの８ファミリーが表された。κファミリーでは、クローンの５１．９％がＶＫ３ファミリーに属し、３１．５％がＶＫ１ファミリーに属していた。他のファミリーの割合は５〜１３％でした。λファミリーでは、ＶＬ１は５４．８％であり、ＶＬ３は１１％であり、残りのファミリー（ＶＬ２、ＶＬ４、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８及びＶＬ９）は０〜１０％の範囲内であった。

実施例２６
ファージ変換と固相パニング
実施例２２で得られ、表４０に示される合計３．４×１０^９ｃｆｕのナイーブヒトファージミドライブラリーの細菌からファージへの調製的大スケールの変換のために、５つのサブライブラリーのそれぞれの１０倍過剰の細菌細胞を所定量の培養液に接種して、最終ＯＤ_６００約０．１を得た。ライブラリーサイズの一次接種物としての１０倍過剰の細胞を選択し、保存されたライブラリーの独立した形質転換体の各々から完全な代表（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を得た。５つのサブライブラリー（表４０）のそれぞれを独立して４００ｍｌの培地に接種した。接種された一次ライブラリー培養物を０．５のＯＤ_６００まで増殖させ、ＶＣＳＭ１３を用いて感染に使用した。抗体フラグメント−ｐＩＩＩ融合ポリペプチド（Thie et al., 2008）の溶解度に好都合な低温で、一晩培養物（体積約４０００ｍｌ）中でファージを増殖させるために、感染培養物を最終的に１０倍に希釈した。２回の連続した遠心分離によって一晩培養からのファージを得た。ファージディスプレイライブラリーの効率的なスクリーニングには、高純度の投入ファージが必要である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）による二重沈殿を用いてファージを精製した。ファージ力価に関するファージの収量は、（ａ）適切な希釈で大腸菌ＴＧ１細胞を感染させることで形質導入単位又はコロニー形成単位（ｃｆｕ）として、及び（ｂ）以下の実験式（Bonnycastle LLC et al., 2001. General phage methods. In: Phage Display: A Laboratory Manual）：
ファージ／ｍｌ＝ＯＤ_２６０×希釈係数×２２．１４×１０^１０
を用いることで、決定された。
１つのバッチからの５つのサブライブラリーの各々からの総ファージ収量は、２〜４×１０^１４ｃｆｕの範囲内であると決定された。これらのライブラリー保存ファージを−８０℃で１〜２×１０^１３／ｍｌで保存した。無作為に選択された１２個のクローンのコロニーＰＣＲによって、変換されたライブラリーを全長のＦａｂ（約１．５ｋｂ）の存在について調べた。

図３１は前記ライブラリーのファージフォーマットへの変換の結果を示す。その結果から、変換後、短長のクローンが存在する（最大約２０％）ことが明らかである。増幅後及びパニング中に大部分の短長のクローンを除去するために、好ましくはより少ない数のパニングで、全長クローンの高いパーセントを得るために、本明細書中、以下に示す新規戦略の作成が必要とされた。

固相パニング中に超大型ｓｃＦｖライブラリーから短長のクローンを除去する方法が記載されている（de Bruin R et al., 1999）。de Bruin R et al., 1999に記載されている方法を本明細書で調べた。２セットの１２×８ウェルＰｏｌｙＳｏｌｐストリップ（Ｎｕｎｃ）を９６ウェルフレーム（２ＰｏｌｙＳｏｌｐ９６ウェルプレート）上に配置した。プレート１は、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中、１０μｇ／ｍｌの餌抗原で１時間、３７℃でコーティングした。プレート２は、コーティング緩衝液（炭酸−重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６）のみを添加した「コート無しコントロール」として用いた。インキュベーション後、プレート１及び２のウェルを１×ＴＢＳ中２％ＢＳＡで１時間、３７℃で遮断した。１×１０^１２ｐｆｕ／ｍｌの混合κ及びλファージをプレート１と２のすべてのウェルに移し、３７℃で２時間インキュベートした。１×ＴＢＳＴで１５回洗浄し、続いて１×ＴＢＳで１０回洗浄することによって、プレート１及び２から未結合ファージを除去した。全ての洗浄はマイクロプレート洗浄機（ＢｉｏＲａｄ Ｍｏｄｅｌ ＰＷ−４０）で行った。洗浄後、記載された段階溶出法（de Bruin R et al., 1999）を使用した。１０分間のプレインキュベーションの後、１０分間のインキュベーションの後に３７℃で４回の連続溶出を行った。各工程からの溶出されたファージの力価は、アリコートを大腸菌に形質導入することによって計算した（ＴＧ１株；表５４）。

形質導入体のサンプルを、インサートのサイズを推定するためにコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。この分析は、トリエチルアミンとの異なる長さのインキュベーション後に短長のＦａｂの割合のわずかな減少を示した。更に、配列決定は、完全長Ｆａｂのほとんどがインフレーム終止コドンの存在のために翻訳可能ではないことを示した。

実施例２７
短長のクローンの存在に関わらない、パニングの明らかな成功
表５４の個々の時点からのすべての溶出液は、次の２ラウンドでパニングに進められた。餌抗原濃度は、２回目のラウンドで５μｇ／ｍｌに、３回目のラウンドで２μｇ／ｍｌに減少させた。ファージ溶出液力価を、各ラウンドのパニングでモニターし、ＴＧ１形質導入によってファージミドフォーマットに変換し、グリセロール保存液として保存した。各回のパニングの前に、これらのグリセロール保存液をＶＣＳＭ１３形質導入によってファージフォーマットに変換した（増幅された）。２回目及び３回目のラウンドからのこれらの増幅された溶出液プールから餌特異的ファージＥＬＩＳＡを行った。この目的のために、実施例２６に記載されているように、８ウェルＰｏｌｙＳｏｒｐストリップ（Ｎｕｎｃ）を９６ウェルフレーム上に配置し、餌抗原でコーティングした。抗原コーティングを行わない平行なセットのストリップも準備した。平均開始力価２×１０^１２／ｍｌ及び最終力価２．６×１０^９／ｍｌのそれぞれ１００μｌのファージプールをそれぞれのウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＴＢＳＴを用いて３回洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ結合抗ｇＶＩＩＩ検出抗体を１ウェル当たり１：５０００希釈で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴで３回、続いてＴＢＳで３回洗浄することによって、未結合の検出抗体を除去した。次いで、ウェル当たり１００μｌのＴＭＢ基質を添加し、暗所で２０分間インキュベートした。２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させ、発生した色を４５０ｎｍで読み取った。表５５で強調表示されているＡ_４５０値は、０．５に近いＡ_４５０を与えるそれぞれの第２ラウンドファージプール（Ｐ０３）の力価を表し、この力価は、コート無しのコントロール読み取り値、すなわち０．０６より約１０倍高い。このデータは、２回目のラウンドのパニング後のファージが、ライブラリークローンに対して抗原反応性について濃縮されていることを示す（バックグラウンドのＡ_４５０値に対して１０倍の値を有するライブラリープールからの力価をパニングプールからの力価と比較）。

新たに調製したＰ０３（ラウンド２のパニング）及びＰ０４（ラウンド３のパニング）ファージプールの抗−抗原ＥＬＩＳＡを同時に行った。しかし、前のラウンドと比較したとき、Ｐ０４ファージではＥＬＩＳＡ反応性の濃縮がなく、パニングプロセスが飽和点に達したことを示唆する。この結論はまた、Ｐ０４由来の全長クローン（１０２クローン）のＢｓｔＮＩフィンガープリントによっても支持された。この目的のために、コロニーＰＣＲの実行からのＰＣＲ生成物のアリコートを各クローンのサンプルとして使用した。この分析は、反復フィンガープリントを有する多数のクローンを明確に示し、標的抗原に対する明白に本物のバインダーのパニング及び発見の成功を示す（図３２）。

ラウンド２及び３のパニングからモノクローナルバインダーを単離するために、ラウンド２からの５７６個の個々のクローン（ファージミド）及びラウンド３からの２８８個の個々のクローンを取り上げ、コロニーＰＣＲで分析した。これらの全長クローンのうちの２０個のクローンをＶＣＳＭ１３形質導入によってファージフォーマットに変換した。ファージ調製物を前記と同様にして餌抗原に対するそれらのＥＬＩＳＡ反応性について試験した。表５６は、これら全てがＥＬＩＳＡ反応性であることを示す。

しかし、実施例１８に詳述した通り、抗原ＥＬＩＳＡ陽性クローンを５つのプライマーを用いて配列決定したとき、それらの全てオフフレームであった。インフレームバインダークローンに到達するためには多数のクローンのスクリーニングが必要である。

実施例２８
Ｆａｂはペリプラスム抽出物中、ウェスタンで検出され得る
本発明はまた、この段階で配列決定することなく、インフレームバインダークローンに到達するための代替的な解決策を開示する。したがって、本発明は、モノクローナル抗原バインダーをファージ融合物としてではなく、非サプレッサー株で発現される可溶性Ｆａｂとしてスクリーニングする。この戦略は、ｐＣＯＭＢ３ＸＳＳ又はｐＳＳＹ１ベクター中のｇＩＩＩのタグとＣＴＤとの間に配置されたアンバー終止コドンを利用する。このアンバー終止コドンは、ｓｕｐＥ又はｓｕｐＦ株ではＧｌｎ又はＰｈｅ残基として読まれるが、非スプレッサー株では翻訳終止コドンとして読まれる（Hoogenboom HR et al., 1991）。図３３は、抗ヒト軽鎖及び重鎖特異的血清が、免疫ブロッティング後のパニングキャンペーンから得られたモノクローナルのペリプラズム抽出物中の約５０ｋＤａのバンドを認識できることを示す。

モノクローナルヒットのペリプラズム中に約５０ｋＤａのバンドが存在することは、それらの設計通りの標的にされたＦａｂの発現を示している（軽鎖及び重鎖の両方のリーダー配列はペリプラズム的に標的にされるように設計されている）。更に、この手順は、個々のクローン形質導入及びＥＬＩＳＡ前のファージへの再フォーマット化と比較してより高いスループットを可能にする。この実施例に示された概念は、新規のスクリーニング手順の設計を可能にし、それは後の実施例において更に説明される。

実施例２９
一連のゲートとしてのヒットセレクション
短いクローン及びオフフレームクローンに関する実施例２６、２７及び２８からの証拠に基づいて、短いクローン及びオフフレームクローンを排除するために一連のゲートが考えられた。本発明は、全長クローンを発現させるために、また図３３に記載したように、非サプレッサー細胞からのペリプラズム抽出物のウェスタンブロット上で約５０ｋＤａの免疫反応性バンドを検出することによってオフフレームクローンを排除するために、コロニーＰＣＲ及び非アンバーサプレッサー株を利用する方法を開示する。親和性ランク付けとそれに続くバイオアッセイ検証もまた、停止条件と同様に考えられた。

実施例３０
パニングキャンペーンのためのビオチン化抗原への論理ゲートの適用とその結果
実施例２９に記載の概念は、本明細書では、モデルビオチン化抗原を用いて溶液パニング（Chames P and Baty D. 2010. Phage display and selection on biotinylated antigens. In: Antibody Engineering; Vol. 1）によって試験される。合計３．０６×１０^１１ｃｆｕのナイーブヒトファージミドライブラリー（実施例２５，表４９）の細菌からファージへの調製的な大スケールの変換のために、最終ＯＤ_６００約０．１を得るのに十分な量（約８００ｍｌ）の培地に接種するため、各１４個のサブライブラリーの２〜１０倍過剰の細菌細胞を標的とした。合理的な培養体積内で０．１のＯＤ_６００を維持しながら１０倍過剰に達することは、超大型ライブラリーにとってしばしば困難であり、３．３倍過剰が以前に使用された（Schwimmer et al., 2013）。表５７は、ライブラリーの代表の３倍がサンプリングされたことを示す。

接種した一次ライブラリー培養物を０．５のＯＤ_６００まで増殖させ、ＶＣＳＭ１３を用いて感染に使用した。低温で終夜培養物（５００ｍｌ；サブライブラリー当たり１×２Ｌフラスコ）中でファージを増殖させるために、感染された培養物を最終的に１０倍希釈し、実施例２６に記載の通り、収穫した。１回の変換ラウンドからの１４個のサブライブラリーの各々からのファージ収量は０．２〜２×１０^１５ｐｆｕの範囲であった。

溶液相でモデルビオチン化抗原をパニングするために、上記ライブラリー保存ファージを新たに使用した（Chames P and Baty D. 2010. Phage display and selection on biotinylated antigens. In: Antibody Engineering; Vol. 1）。簡単に説明すると、５００ｎＭのビオチン化抗原を３×１０^１３ｐｆｕの予め遮断されたライブラリーファージ（１００×ライブラリーを表す）と共に１時間インキュベートし、２００μｌのＭ２８０ストレプトアビジンでコートされたビーズを洗浄し、同様にリン酸緩衝食塩水中の２％ミルクで予備遮断した（１×ＰＢＳ）。１００倍モル過剰の非ビオチン化抗原の存在下又は非存在下で抗原−抗体平衡を模倣するために、異なる時間、予め遮断されたファージをビーズとインキュベートした。次にＴｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ中で繰り返し洗浄し、２００μｌの５０ｍＭ ＤＴＴに溶出させた。溶出されたファージを水で希釈し、適量の１０×ＰＢＳを添加することで直ちにｐＨ７．４にした。溶出されたファージをＴＧ１細胞中の形質導入によってタイトレーションし、次のラウンドのパニングの前に同じ宿主中で増幅させた。実施例２７に記載の通り、その増幅ファージからファージプールＥＬＩＳＡを行い、各ラウンドにおけるバインダープールの濃縮度を決定した。図３４は、平衡又は競合モデルのいずれか（Hawkins RE et al., 1992）に従うことで、餌用量依存性及びラウンドのパニングにわたる濃縮の両方が観察されることを示す。

ラウンド２及び３のパニングからモノクローナルバインダーを単離するために、１５３６個の個々のファージミドをコードする組換体を取り上げ、コロニーＰＣＲで分析した。１１６２個の全長クローンを１０ｍｌの培養で増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで一晩誘導してＦａｂを発現させた。全細胞溶解物をＰｏｐＣｕｌｔｕｒｅ（商標）試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｅｒｃｋ）で調製し、モデル抗原がＰｏｌｙＳｏｒｐプレートにコートされ、抗原結合ＦａｂがＨＲＰ結合ポリクローナルＦａｂで検出される間接ＥＬＩＳＡで試験した。図３５は、そのようなバインダーの検出例を示す。

２８２個のＥＬＩＳＡ陽性モノクローナルを、前記のように１０ｍｌの培養体積で再度発現させ、ペリプラズム抽出物を記載のように調製した（Humphreys DP and Bowering L, 2009. Production of antibody Fab' fragments in E. coli. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic）。これらの抽出物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上にブロットし、抗ヒトＦａｂ特異的ポリクローナル血清でプローブして、発現されたＦａｂがペリプラズム中で明らかに検出可能であるクローンを同定した。図３６は、そのような「ペリプラズムゲート」の部分図を示す。表５８は、このパニングキャンペーンに適用されたゲート手順（実施例２９）の概要を示す。

これらのペリプラズムヒットのサブセットを配列決定すると、すべての配列決定されたクローンは、重鎖のＡＴＧの１００ｂｐ以内に終止コドンを示す。これはゲート手順の根底にある仮定がオフフレームクローンを排除するのに不十分であることを示す。

実施例３１
チェインスイッチの概念
実施例３０は、ペリプラズムスクリーニング中に三重のゲートされたクローンのサブセットから得られたウェスタンシグナルが、非還元ゲル上のポリクローナル抗体の使用に基づいており、約５０ｋＤａのバンドがＬＣ−ＨＣヘテロダイマー（約２３ｋＤａのＬＣ±約２７ｋＤａのＨＣ；望ましい表現型）、ＬＣ−ＬＣ又はＨＣ−ＨＣホモダイマー（約２３ｋＤａのＬＣ＋約２３ｋＤａのＬＣ、又は約２７ｋＤａのＨＣ＋約２７ｋＤａのＨＣ；望まない表現型；図３７）の両方から由来し得ることを示す。本発明は、約５０ｋＤａのダイマーの一部としてＨＣ又はＬＣを明確に検出することができる抗体を利用する。２つの異なる軽鎖特異的な（κ及びλ）、及び２つの異なる重鎖Ｃ末端タグ特異的な（ポリヒスチジン及び赤血球凝集素）抗体に対して、ウェスタンが最適化された。表５８に示す単離された抗原ＥＬＩＳＡ反応性ヒットへの反復適用のために赤血球凝集素特異的ｍＡｂを選択した。

図３８は、図３６で使用したポリクローナル血清を置き換えるためのこの抗体の適用を示す。図３９は、ペリプラズムヒットを抗κ又は抗λ抗体でサブタイプ化するためのκ及びλ特異的抗体の適用を示す。２つの図を比較すると、サブタイプ化はほとんどの場合、完全に働くものの、抗重鎖スクリーニングで観察されたヒットが抗軽鎖スクリーニングで表示されないことが時々あるため、確実というわけではないことが示される（図３８と図３９の間のクローン２４、３２、１５７、１６１、２０３及び２５３のシグナルを比較）。更に、サブタイプ化は、モノマーバンドのみにおける軽鎖シグナルの存在も示す（図３９のクローン１６２、２５４、２７４、２７５、２７６及び２８１）。これらの重鎖−軽鎖二重陽性ペリプラズムヒットのサブセットを配列決定すると、全てではないが大部分の配列決定されたクローンは再び重鎖のＡＴＧの１００ｂｐ以内に終止コドンを示した。

抗体がインフレームクローンとオフフレームクローンとを区別できるかどうかを調べるために、抗λ、抗κ、抗Ｃ_Ｈ１及び抗Ｈｕ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）_２抗体でプローブした非還元ウェスタンで、３つの意図的にタンデムインフレームクローン対３つの意図的にオフフレーム（ＨＣ）クローンからペリプラズム抽出物を試験した。これらのクローンはいかなる特定の抗原に対しても反応性ではなかったが、それらのペリプラズム抽出物がＨＲＰ結合抗Ｈｕ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントでプローブしたとき、非還元ＳＤＳゲルで約５０ｋＤａのダイマーを示すという唯一の特徴（図４０，パネルｄ）を有し、親ライブラリーから選択されたか、又はスクリーニングプロセスから捨てられたものである。この分析は、κ又はλ鎖特異的抗体はインフレーム又はオフフレームクローンを区別することができなかったが、抗Ｃ_Ｈ１抗体は明らかに区別することができたこと（図４０，パネルｃ）を示した。

このデータに基づいて、「真の」ＬＣ−ＨＣヘテロダイマーを識別することができる抗Ｃ_Ｈ１抗体の明確な能力（図４０，パネルｃ）と同時に「真の」ＬＣ−ＨＣヘテロダイマーを識別することができない抗ＬＣ抗体の無能力（図４０，パネルａ及びｂ）は、任意の１つのサブタイプ特異的抗体を単独で使用することによるヘテロダイマーＦａｂクローンの検出を制限する。したがって、本発明は、そのようなチェインスイッチによってクローンの遺伝子型を推定するためにＬＣ又はＨＣに特異的な検出抗体を連続的に交換する新規な方法（図４１）を開示する。

検出抗体を連続的に交換する方法では、異なるゲート順序の策定が可能であった。選択培地プレートから取り上げたファージ形質導入「モノクローナル」大腸菌コロニーを最初にＰＣＲフィルターに通して１．５ｋｂのインサートを有するクローンを同定し、次いで、インサート陽性クローンを誘導してペリプラズムから抽出されるＦａｂを産生する。抗Ｃ_Ｈ１抗体でプローブされたこれらの抽出物のウェスタンブロットによって、ペリプラズム中、検出可能なレベル（１〜３ｐｇ／バンド）でＬＣ−ＨＣヘテロダイマー又はＨＣ−ＨＣホモダイマーのいずれかを産生するクローンの識別が可能になる。次のステップでは、ヘテロダイマー又はホモダイマーを含むこれらのペリプラズム抽出物を、ポリスチレンウェルに固定化された標的抗原と結合させ、ＬＣ特異的検出抗体で検出する。したがって、このチェインスイッチは、ペリプラズムに実際に転位した抗原結合ＬＣ−ＨＣヘテロダイマー（望ましい属性を有するクローン）のみを検出し、抗原結合ＨＣ−ＨＣホモダイマー（望まないクローン）は全く検出されず、除外される。したがって、組み合わせアプローチは、検出可能な程度にペリプラズムに転位したヘテロダイマーＦａｂへのクローンの抗原特異的ＥＬＩＳＡ反応性を明確に割り当て、Ｆａｂが抽出されたクローンの「真の」遺伝子型を反映する。

実施例３２
定量的ＥＬＩＳＡの開発に適用されたチェインスイッチの理論
実施例３１に示されたチェインスイッチＥＬＩＳＡの概念の開発は、Ｆａｂ定量化ＥＬＩＳＡの開発を可能にする。このシステムでは、ペリプラズムＦａｂは、Ｃ_Ｈ１特異的抗体を用いてそれらの重鎖を通してキャプチャーされ、軽鎖特異的（抗κ又は抗λ）抗体で検出される。使用されたヒトＦａｂ標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄｓ）は市販される。最適化された結合及び洗浄条件は、良好なダイナミックレンジ及びアッセイ直線性を可能にする。図４２は、ヒトＦａｂ標準物質からの近似曲線の例を示す。

実施例３３
オフフレームクローンの検出に適用された定量的ＥＬＩＳＡ
実施例３２に示されたチェインスイッチＥＬＩＳＡは、オフフレームクローンから測定可能なシグナルを生成する。本発明はまた、インフレームクローンからのＦａｂのみを検出するように改変されたＥＬＩＳＡを開示する。本発明は、図４０に示された概念によるインフレームクローン及びオフフレームクローンの検出を開示する。更に、本発明は、ペリプラズムから抽出されたＦａｂ中のＣ_Ｈ１エピトープとの最大の相互作用のためにＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈパラトープをプレート表面に対して９０°で配向させるストレプトアビジン表面上のキャプチャーＦａｂの固定化を開示する。結果を図４３に示す。

実施例３４
表面プラズモン共鳴によるＦａｂの動力学的ランク付け
本発明は、いくつかのＳＰＲチップ表面を調査し、抗Ｃ_Ｈ１／抗Ｃ_κ又は抗Ｃ_Ｈ１／抗Ｃ_λキャプチャーのための二重ヘッドを有する二価抗体（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）；Ｈｕｍａｎ Ｆａｂ−κ ｏｒ Ｆａｂ−λ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を開示する。図４４は、パイロット実験において、それがペリプラズム抽出物からヒトＦａｂ又はランダムインフレームＦａｂの市販の標準混合物、著しく多い他のキャプチャー抗体を、キャプチャーすることができたことを示す。更に、表面は、キャプチャーＦａｂの著しい浸出なしに繰り返し使用することができた。

本発明は、キャプチャー表面を最適化するための既知の抗体−リガンド対の使用を開示する。この目的のために、全長のベバシズマブ（ＩｇＧ）の社内の精製調製物をパパインで消化した。得られたＦａｂ’フラグメントを、アフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組合せを用いてＦｃフラグメントから精製した。短い２工程の最適化の後、このＦａｂ’フラグメントは、高親和性Ｆａｂに予想される動力学的パラメーターでＶＥＧＦ_１６５に結合することが示され得る（図４５）。

本発明はまた、ベバシズマブＩｇＧのＦａｂ部分が粗ペリプラズム抽出物として表面及びリガンドに提示されている場合に同様の動力学的パラメーターが観察されるかどうかを調べる。図４６は、ドメイン交換された「ＢｅｖａｃｉｚｕＦａｂ」の粗ペリプラズム抽出物がベバシズマブの精製Ｆａｂフラグメントで観察される非常に類似した動力学的パラメーターを有することを示す。

実施例３５
一連の改訂ゲートとしてのヒットセレクション
実施例３３〜３４に基づいて、本発明は、ファージ生物学に固有の短いクローン及びオフフレームクローンの問題を回避し、表現型決定で基礎となる遺伝子型情報の高い忠実度を維持しながら、抗原結合能、動力学的安定性等の表現型の評価のためにファージＦａｂ融合をＦａｂタンパク質で置き換える、自動ハイスループットを含むハイスループットに適しており、そして多大な労力と誤りがちな操作を伴わずにヒット間の迅速で有意義な比較を可能にする、新しい一連のゲート（図４７）を開示する。

実施例３６
抗ＴＮＦαバインダーを見つけるための段階的評価プロセスの適用
ヒト可溶性ＴＮＦα（ｓＴＮＦα；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１３７５）は、モノマー型の１７．５ｋＤａタンパク質であり、したがって、１μｇ／ｍｌのｓＴＮＦα溶液は５７．１ｎＭに相当する。この質量−モル変換は、各ラウンドのパニング中の投入餌濃度を決定するために考慮された。Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの市販のビオチン化体のヒトＴＮＦα（ｂ−ＴＮＦα）（Ｃａｔ＃ＴＮＡ−Ｈ８２１Ｒ，Ｌｏｔ＃ＢＬ２７１Ｒ−６５ＨＳ１−ＢＱ）をパニングに使用した。ｐＨ７．４のＰＢＳ中の凍結乾燥粉末２００μｇを２ｍｌの滅菌水に溶解し、５７０ｎＭに相当する最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌを得た。用いたビオチン化化学はＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンであり、製造業者はＴＮＦα１モル当たり１〜３個のビオチンタグを主張した。ｐＳＳＹ１中に産生されたＦａｂのｇＩＩＩタンパク質と重鎖との間のトリプシン切断部位の存在によって、そのようなビオチン化された抗原に結合したファージの溶出が可能になる。

ｂ−ＴＮＦαの品質を、クマシー染色及びＳＤＳ−ＰＡＡゲルのウェスタンブロッティングで調べたところ、許容できることが分かった（図４８）。ビオチンタグの数は、Ｑｕａｎｔｉ^＊ Ｔａｇ（商標）ビオチンキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｃａｔ＃ＢＤＫ２０００）を用いて確認した。ビオチンタグの数は約４．７ｍｏｌ／ｍｏｌ ｓＴＮＦαであった。

パニング１ラウンド当たり２００μ１のビーズ（Ｍ２８０，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いる。ｂ−ＴＮＦαのビーズ飽和濃度を調べた。このプロセスは、投入抗原が利用可能なビーズ結合表面積に最適であるように、２００μｌのビーズのビーズ表面を飽和させるのに必要とされるｂ−ＴＮＦαの最適濃度を決定することを含む。前もって２％Ｍ−ＰＢＳ中で１時間、遮断した固定量のビーズ（４０μｌ）を様々な濃度のｂ−ＴＮＦα（６０、８０、１００、１２０ｎＭ）と共に一定時間（１時間）インキュベートすることによって、それを決定した。フロースルー（ＦＴ）を更なる分析のために保存し、ビーズを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＤＰＢＳで８回、及びＴｗｅｅｎ−２０を全く含まない１×ＤＰＢＳを用いて２回洗浄した。３０μｌの荷物（ｌｏａｄ）、ＦＴ及びビーズを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードし、ウェスタンブロッティングにかけた。

１００ｎＭのｂ−ＴＮＦαは、６０及び８０ｎＭと比較してフロースルー中により多くのタンパク質を示したことが観察された。これは、ｂ−ＴＮＦαの飽和濃度が４０μｌビーズについて８０ｎＭであることを示す。したがって、２００μｌのＭ２８０ビーズ体積の飽和濃度として、４００ｎＭのｂ−ＴＮＦαを使用されるべきであることが決定された。

実施例３０に記載と同様にして３．０６×１０^１１ｃｆｕライブラリーを変換することによって抗体ファージを作製した（表４９）。１回目のラウンドのパニングでは、１００倍の過剰ライブラリーファージ（約３×１０^１３ｐｆｕ）を５ｍｌのプロテインＬｏｂｉｎｄド試験管（エッペンドルフ）に移し、チューブローテーター上、１５ｒｐｍで２ｍｌの２％ＭＰＢＳ中で１時間、遮断した。並行して、２００μｌのストレプトアビジンビーズ（Ｍ２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を２ｍｌの１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回洗浄し、次いでファージについて記載したように２％ＭＰＢＳ中で遮断のために保存した。次いで、予め遮断されたファージを混合し、４００ｎＭのｂ−ＴＮＦαと１時間、Ｈｕｌａミキサー上、１５ｒｐｍでインキュベートした。ビーズの遮断が完了した後、磁石（ＤｙｎａＭａｇ−５；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてビーズを試験管の側壁に分離することによって、遮断溶液を捨てた。抗原−ファージ抗体複合体を、ストレプトアビジンビーズ上で、両方を混合し、室温で１時間インキュベートすることでキャプチャーした。４μｌの１００％Ｔｗｅｅｎ−２０を２ｍｌの混合物に添加して０．２％の最終Ｔｗｅｅｎ濃度を得た。磁石を用いてビーズ−Ａｇ−Ａｂ複合体を試験管の側壁に引き寄せ、未結合ファージを捨てた。ビーズ複合体を２Ｍ−ＰＢＳＴ（２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む２％スキムミルク）を用いて８回洗浄し、続いて１×ＰＢＳで２回洗浄した。最後の洗浄の前に、ビーズ複合体を新しい試験管に移し、磁石によってビーズを試験管の壁に引き寄せた。断続的に指で軽くたたくことで３０分間、２００μｇの１０μｇ／ｍｌのトリプシンを用いて、抗原結合ファージを溶出した。磁石を用いて、抗原特異的ファージを含む溶出液を混合物から除去し、新しい試験管に移した。溶出液の体積を１×ＰＢＳを用いて２ｍｌにし、４０μｌを溶出液力価の推定のために別々に等分した。

次のパニングラウンドのために溶出液をファージ増幅にかけた。増幅のために、溶出工程の２時間前に接種した１０００倍過剰（２〜１０ｍｌ）の対数期（０．５のＯＤ_６００）のＴＧ１細胞と混合した。３７℃で振盪せずに３０分間、ファージを細胞に感染させ、次いで抗生物質なしで２５０ｒｐｍで１時間更にインキュベートした。１時間後、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む９０ｍｌの２×ＹＴ培地で、細胞（１０ｍｌ）を１：１０に希釈し、３７℃及び２５０ｒｐｍで更に１〜２時間増殖させた。ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ感染を１：２０の比率で３０分間、３７℃で振盪せずに行った。ヘルパーファージ感染細胞を更に２５０ｒｐｍで同じ温度で３０分間増殖させた。最後に、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを１００ｍｌの培養物に添加し、３０℃及び２５０ｒｐｍで一晩（１６時間）インキュベートした。翌日、実施例２６に記載と同様にして、増幅されたファージをＰＥＧ沈殿させた。

溶出液の力価推定は、ＴＧ１細胞及びＴｏｐ１０Ｆ’細胞で同時に行われた。後者の目的は、スクリーニングのための可溶性Ｆａｂを得ることであった（Kontermann RE, 2010. Immunotube selections. In: Antibody Engineering; Vol. 1）。増幅ファージは、１０^−９〜１０^−１０希釈のＴＧ１中でのみタイトレーションされた。タイトレーションのために、２０μｌのラウンド１のファージ溶出液を、滅菌９６ウェルプレートのウェル中、１８０μｌのＬＢ培地と混合し、１０^−１希釈のファージを得た。同様に、ファージの対数スケール希釈を１０^−４希釈まで行った。増幅されたファージの力価推定のために、希釈は１０^−１１まで行われた。１００μｌの最後の３つのファージ希釈物を、新鮮な９６ウェルプレート中、１００μｌの対数期（０．５のＯＤ_６００）のＴＧ１細胞又はＴｏｐ１０Ｆ’細胞の培養物と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。３つ全ての希釈物の１００μｌのファージ感染培養物を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、コロニー数を記録し、溶出液の力価を推定した。

パニングラウンド２、３及び４を、ラウンド間で投入ファージを一定（１０^１２ｐｆｕ）に保つが、連続する各工程ごとにｂ−ＴＮＦα濃度を１桁減少させることで行った。表５９は、４回のラウンドすべての溶出液力価データを示す。増幅ファージに関する力価データは、１．４〜６．０×１０^１３ｐｆｕの範囲であった。

力価データは、パニングラウンドにわたって溶出液力価が餌濃度の減少に比例して減少することを開示する。３回のラウンド全てからの増幅ファージの収量はかなり類似していた。４回目のラウンドの後にプロセスが停止したため、ラウンド４のファージは増幅されず、それ故、ファージの力価の値は入手できなかった。

クローンをモノクローナル可溶性Ｆａｂフォーマットでスクリーニングし、細菌粗ペリプラズム抽出物（ＰＰＥ）として回収した。クローンの供給源は、パニングの各ラウンド中に生成されたＴｏｐ１０Ｆ’タイタープレートであった。全てのプロセスは、９６ウェルフォーマットでハイスループット様式で行われた。抗ＴＮＦαモノクローナルＦａｂクローンのマスタープレートを調製するために、滅菌爪楊枝を用いてＴｏｐ１０Ｆタイタープレートから単一のウェル分離コロニーを取り上げ、滅菌９６ウェルプレート中の２％のグルコース及び１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する１５０μｌのＬＢ培地に接種した。ラウンド３及びラウンド４のプレートから合計９６０クローン（１０プレート×９６）を接種した。プレートをＢｒｅａｔｈｅ−ｓｅａｌ（登録商標）で密封し、抗原名、パニングラウンド、日付などで適切にラベルを貼り、一晩（１６時間）３７℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートした。

可溶性Ｆａｂの発現のために、各クローンの一晩培養物からの５０μｌを、滅菌９６ディープウェルプレート中の０．１％のグルコース及び１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する４５０μｌのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）にマルチチャンネルピペットを用いて移した。プレートをＢｒｅａｔｈｅ−ｓｅａｌ（登録商標）で密封し、ＯＤ_６００が０．５〜０．７に達するまで３７℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートした。残りの１００μｌの一晩培養物に、３３μｌの４５％ＬＢ−グリセロールを添加し、混合し、プレートをグリセロール保存液（マスタープレート）として−８０℃で保存した。

培養が対数期に達した後に、ディープウェルプレート中で１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによって誘導を行った。ＩＰＴＧの添加後、プレートをＢｒｅａｔｈｅ−ｓｅａｌ（登録商標）で再密封し、３０℃でび２５０ｒｐｍで一晩（１６時間）誘導した。一晩誘導した培養物を、９６ウェルスウィングアウトプレートバケット中、４℃及び４０００ｒｐｍで３０分間ペレット化した。プレートを注意深く反転させてペーパータオル上で軽くたたくことで上清を捨てた。

ペリプラズムＦａｂの抽出のために、１００μｌのペリプラズム抽出緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，プロテアーゼインヒビターカクテル）を各ペレットにマルチチャンネルピペットを用いて添加し、均一に再懸濁するために穏やかに混合した。プレートを密封し、３０℃及び１５０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。一晩抽出した後、プレートをスウィングアウトした９６ウェルプレートバケット中、４℃で３０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清は可溶性モノクローナルＦａｂを含有するペリプラズム抽出物（ＰＰＥ）である。ＰＰＥを適切にラベルを貼った滅菌９６ウェルプレートに移し、分析まで４℃で保存した。

全長のインフレームリードのみを選択するために、実施例３３に記載したように、クローンをκ及びλ検出抗体を用いてチェインスイッチ定量的ＥＬＩＳＡにかけた。パニング前にκ及びλライブラリーは混合されたため、各ＰＰＥ抽出物の並行セットをκ及びλ特異的抗体を用いて試験した。ｑＥＬＩＳＡを行うために、必要な数のプレートを、０．５％のゼラチンを含有する１×ＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌのビオチン化ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ａ８５４９）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、それらを、自動９６ウェルプレート洗浄機を使用して、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。ストレプトアビジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｃａｔ＃２１１３５）を、１ウェル当たり１００μｌを添加することでビオチン化ＢＳＡ上にキャプチャーし、３０℃及び１５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。前記の通り、３回洗浄することで過剰のストレプトアビジンを除去した。１００μｌのビオチン化抗Ｃ_Ｈ１キャプチャー抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；Ｃａｔ＃７１０３２０２５００）をストレプトアビジン表面上にコーティングし、３０℃で１時間インキュベートした。１００μＭのビオチンを含有する２００μｌの１〜２％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いてウェルを１時間遮断した。遮断の間、κ及びλのそれぞれの遮断溶液中、市販の標準的なヒトＦａｂ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ；Ｃａｔ＃８５５９０９）を１００ｎｇ／ｍｌ〜１．５６ｎｇ／ｍｌの範囲で用いて、標準物質を調製した。前記の通り、３回洗浄することで遮断剤を除去し、１００μｌのＰＰＥ及びＦａｂ標準物質を添加することで抗Ｃ_Ｈ１抗体上で粗ペリプラズムＦａｂをキャプチャーし、プレートを３０℃で１時間インキュベートした。前記の通り、３回洗浄することで未結合のＦａｂを除去した。１：２０００希釈のＨＲＰ結合抗κ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃ＳＡＢ３７０１４１４）及び１：１００００希釈の抗λ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃Ａ５１７５）をそれぞれの遮断溶液中で調製された抗体と共に用いて、キャプチャーされたＦａｂを検出した。ウェル当たり１００μｌの各抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、その後、１００μｌのＴＭＢ基質を添加し、３７℃で２０〜３０分間インキュベートすることで、発色させた。１００μｌの２Ｍ硫酸を添加することで反応を停止させ、プレートを４５０ｎＭで読み取った。読み取り値を記録し、非線形回帰曲線を用いて標準グラフをプロットした。

図４９は、チェインスイッチｑＥＬＩＳＡを用いた抗ＴＮＦα可溶性Ｆａｂスクリーニングのためのプレート６の代表的なデータを示す。ｑＥＬＩＳＡ陽性クローンを、高（黒網掛けの細胞）表示、中（濃灰色網掛けの細胞）表示及び低（薄い灰色網掛けの細胞）表示に分類した。各カテゴリーのカットオフ値は、方法の検討中にインフレームクローン及びオフフレームクローンのセットを取ることにで経験的に決定された（実施例３３）。

ｑＥＬＩＳＡでスクリーニングされた９６０クローンから、１０８クローンがλ陽性であり、３７３クローンがκ陽性であった。動力学的ランク付けのためにクローンを選択する際、より高い優先順位付けは、それぞれ高い表示に与えられ、続いて中程度の表示及び低い表示がそれに続く。

チェインスイッチｑＥＬＩＳＡは、オフフレームＦａｂの排除を確実にし、完全長インフレームクローンのみを選択するが、それらが標的抗原に対して結合するかどうかを宣言することはできない。標的特異的結合は、抗原特異的ＥＬＩＳＡによって確立することができる。本明細書に記載の方法は、このＥＬＩＳＡ工程を省き、ＳＰＲに基づく方法を用いてクローンを直接スクリーニングする。動力学的ランク付けは、ＥＬＩＳＡより確かに有利である。それは、動力学的ランク付けが、最終的な親和性（Ｋ_Ｄ）値と共に貴重な動力学的パラメーター（ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ）を提供し、また他のものよりも良好な解離速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）を有するクローンのみを選択し、したがって治療又は診断適用を確実にすることができるからである。

この考察に基づいて、１００個のクローンを取り上げ、記載のように体積及び容器を９６ウェルシステムに調整することで、それらのＰＰＥを５０ｍｌスケールで生成させた。ＰＰＥを滅菌１５ｍｌ試験管に移し、４℃で保存した。ＳＰＲ試験を実施する前に、１００ｍＭのトリスを含有する抽出緩衝液を除去することが不可欠であった。そのような高い緩衝塩濃度は、流れる緩衝液及びサンプル緩衝液としてのＰＢＳを用いたＳＰＲ研究中に著しいバルク効果（ｂｕｌｋ ｅｆｆｅｃｔ）をもたらし得る。したがって、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）の存在下、１０ｍｌ体積のタンジェンシャルフローシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１０ｋＤａカットオフ）を用いて、すべてのＰＰＥを１×ＰＢＳに緩衝液交換した。透析液の体積を更に１／４に減らして、所与の全ＯＤ_６００の元の培養体積の全１００倍の圧縮が得られた。緩衝液交換ＰＰＥを滅菌１．５又は２．０ｍｌの試験管に移し、使用まで−２０℃で保存した。

単一の濃度（５００ｎＭ）のｓＴＮＦα（社内で細菌的に製造された生成物）を用いて、１００個のｑＥＬＩＳＡ陽性クローンの第一ラウンドの親和性順位付けを行った。最初のラウンドのスクリーニングからのＳＰＲ陽性クローンを、分析物用量タイトレーションで慎重に分析し、信頼できる動力学的値を得た。前の段落に記載されているようにして、５０ｍｌスケールで抽出された粗ＰＰＥを用いて、すべての研究を行った。図５０は、動力学的スクリーニングプロファイルと、単一分析物濃度（５００ｎＭ）を用いたＴＮＦαのＳＰＲ陽性クローンについてのそれぞれの暫定的動力学的パラメーターとを示す。

１００個のｑＥＬＩＳＡ陽性ヒット中の１０個（１０％）のクローンはＳＰＲ陽性であった。用量タイトレーションを用いた慎重な分析を行う前に、全てのＳＰＲ陽性クローンを実施例２５に記載した５つのプライマーで配列決定し、全てが全長タンデム軽鎖−重鎖インフレームクローンであること（表６０）が分かった。このデータは、この実施例に示されたゲートシステムが特許請求されている（請求項２８）ように１００％絶対確実であることを示す。更に、これらの１０個の抗ＴＮＦαヒットは、エピトープビニングと呼ばれるプロセス（Abdiche et al., 2009）によるそれらのエピトープ特異性に従って分類された。この方法で、全ての利用可能なＳＰＲヒットを互いに試験することができ、エピトープ特異的な棚に分類することができる。各棚からのただ１つの代表的クローンが更なる研究のために進められる。図５１に示すように、１０個の抗ＴＮＦαクローンをＲ×Ｃ方法で５個セットで注射した。

図５１から明らかなように、１０個の抗ＴＮＦαクローンは３つのエピトープ特異的な棚に分類することができる。最初の棚は２つのクローン、すなわちｂＴ１及びｂＴ８６が含まれる。第２の棚は７つのクローン、すなわちｂＴ１６、ｂＴ３８、ｂＴ５９、ｂＴ７５、ｂＴ７６、ｂＴ７７、及びｂＴ８４を含む。第３の棚は１つのクローン、すなわちｂＴ８８が含む。表６０は、抗ＴＮＦαＦａｂのデータの棚を要約する。各棚の１つの代表的クローンを更なる研究のために進められた。次の工程は、分析物用量タイトレーションによってこれら３つのクローンを注意深く分析して、信頼性のある動力学的パラメーター（ｋ_ａ及びｋ_ｄ）及び親和性値（Ｋ_Ｄ）を得ることであった。

図５２は、３つすべてのクローンのＳＰＲプロファイル及びパラメーターの概要を示す。全ての関連するＳＰＲパラメーター（Ｒ_ｍａｘ，χ^２）は範囲内に入ることが、図５２から明らかである。ｂＴ１の親和性値（Ｋ_Ｄ）は１１．３ｎＭ、ｂＴ５９は１２．９ｎＭ、ｂＴ８８は１３．８ｐＭであった。

実施例３７
抗ＰｆＲｈ５バインダーを見つけるための段階的評価プロセスの適用
熱帯熱マラリア原虫網状赤血球結合タンパク質ホモログ５（ＰｆＲｈ５；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ８ＩＦＭ５）は５９．８ｋＤａのタンパク質であり、したがって、１μｇ／ｍｌのＰｆＲｈ５の溶液は１６．７ｎＭに相当する。この質量−モル変換は、各ラウンドのパニング中の投入餌濃度を決定するために考慮された。この研究のために社内で調製したＰｆＲｈ５を用いた。

タンパク質の品質を、ＳＤＳ−ＰＡＡゲルのクマシー染色で調べたところ、許容できることが分かった（図５３）。実施例３０に記載の通り、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を精製抗原のビオチン化に用いた。Ｑｕａｎｔｉ^＊ Ｔａｇ（商標）ビオチンキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｃａｔ＃ＢＤＫ２０００）を用いてビオチンタグの数を推定したところ、２．２２（約２）ｍｏｌ／ｍｏｌのＰｆＣＳＰであると決定された。

実施例３０に記載の通り、３．０６×１０^１１ｃｆｕライブラリー（表４９）を変換することで抗体ファージを作製した。ｂ−ＰｆＲｈ５の溶液パニングのために、Ｍ２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いた。４回のラウンドのパニング、溶出及び力価評価を、実施例３６に記載と同様に、ただし以下の２つの変更（ａ）と（ｂ）を加えて行った。（ａ）５００ｎＭのｂ−ＰｆＲｈ５を開始餌濃度として用い、４回目のラウンドの５００ｐＭまで各回ごと１桁減少した濃度を用いた。（ｂ）溶出を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の５０ｍＭのＤＴＴを用いて３０分間行った。表６１は、４ラウンドすべての溶出液力価データを示す。増幅ファージの力価は０．１５〜１．９×１０^１３ｐｆｕの範囲であった。４回目のラウンドの後にパニングプロセスが停止したため、ラウンド４のファージは増幅されなかった。

各々３回目及び４回目のラウンドのパニングからの１９２個のクローンをそれぞれ更なるスクリーニングのために進めた。したがって、合計３８４個のクローンを９６ウェルプレートで発現させ、実施例３６に記載のようにチェインスイッチＥＬＩＳＡを用いて全長クローンについてスクリーニングした。図５４は、チェインスイッチｑＥＬＩＳＡを用いた抗ＰｆＲｈ５可溶性Ｆａｂスクリーニングのためのプレート１１の代表的なデータを示す。陽性クローンを、高（黒網掛けの細胞）表示、中（濃灰色網掛けの細胞）表示及び低（薄い灰色網掛けの細胞）表示に分類した。

ｑＥＬＩＳＡは、８６クローンがλ陽性であり、６５クローンがκ陽性であることを示した。動力学的ランク付けのためにクローンを選択する際、クローン優先順位付けを実施例３６に記載のようにして行った。１００個のクローン（κ及びλｑＥＬＩＳＡ陽性からそれぞれ５０個）を動力学的スクリーニングのために取り上げた。５０ｍｌスケールの発現、ペリプラズム抽出及び緩衝液交換を実施例３６に記載のようにして行った。１００個のｑＥＬＩＳＡ陽性クローンの第１のラウンドの親和性ランク付けを、単一濃度（５００ｎＭ）のＰｆＲｈ５を用いて行った。１００個のｑＥＬＩＳＡ陽性ヒット中の１２個（１２％）のクローンがＳＰＲ陽性であった（図５５）。

用量タイトレーションを用いた慎重な分析を行う前に、全てのＳＰＲ陽性クローンを実施例２５に記載された５つのプライマーで配列決定した。２クローンは、コンティグを構築するのに十分には正確に配列決定することができなかった。読み取ることができた１０個のクローンのうち、全てが全長タンデム軽鎖−重鎖インフレームクローンである（表６２）ことが分かった。このデータは、この実施例に示されたゲートシステムが特許請求されている（請求項２８）ように１００％絶対確実であることを示す。

各配列棚からの１つの代表的クローンを取って、図５６に設定した分析物用量タイトレーションによって信頼性のある動力学的パラメーター（ｋ_ａ及びｋ_ｄ）及び親和性値（Ｋ_Ｄ）を得た。最高の親和性値（Ｋ_Ｄ）がｂＲ２８（０．８１ｎＭ）で観察された。

実施例３８
抗ＰｆＣＳＰバインダーを見つけるための段階的評価プロセスの適用
熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ；ＰｆＣＳＰ；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ７Ｋ７４０＿ＰＬＡＦ７）は４２．５ｋＤａのタンパク質であり、したがって、１μｇ／ｍｌのＰｆＣＳＰの溶液は２３．５ｎＭに相当する。この質量−モル変換は、各ラウンドのパニング中の投入餌濃度を決定するために考慮された。精製ＰｆＣＳＰは社内で入手可能であった。

タンパク質の品質をＳＤＳ−ＰＡＡゲルのクマシー染色で調べたところ、許容できることが分かった（図５７）。ＰｆＣＳＰはそのようなゲル上で計算された分子量よりも高い分子量で泳動することが知られている（Plassmeyer ML et al., 2009）。タンパク質の品質はパニングに許容可能であった。タンパク質をビオチン化するために、実施例３０に記載の通り、スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン化学を用いられ、これによってＤＴＴで抗原に結合したファージの溶出が可能になった。Ｑｕａｎｔｉ^＊ Ｔａｇ（商標）ビオチンキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｃａｔ＃ＢＤＫ２０００）を用いてビオチンタグの数を推定したところ、３．６５（約４）ｍｏｌ／ｍｏｌのＰｆＣＳＰであると決定された。

実施例３０に記載の通り、３．０６×１０^１１ｃｆｕライブラリー（表４９）を変換することで抗体ファージを作製した。ｂ−ＰｆＣＳＰの溶液パニングのために、Ｍ２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いた。４回のラウンドのパニング、溶出及び力価評価を、実施例３６に記載と同様に、ただし以下の２つの変更（ａ）と（ｂ）を加えて行った。（ａ）５００ｎＭのｂ−ＰｆＣＳＰを開始餌濃度として用い、４回目のラウンドの５００ｐＭまで各回ごと１桁減少した濃度を用いた。（ｂ）溶出を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の５０ｍＭのＤＴＴを用いて３０分間行った。表６３は、４ラウンドすべての溶出液力価データを示す。増幅ファージの力価は、１．１〜９．２×１０^１２ｐｆｕの範囲であった。

表６３は、溶出力価がパニングラウンドにわたって餌濃度の減少に比例して増加したことを明らかにし、これはパニング成功の典型的な兆候と考えられる（McCafferty J. 1996. Phage display: Factors affecting panning efficiency. In: Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual; Kontermann RE, 2010. Immunotube selections. In: Antibody Engineering; Vol. 1）。３回全てからの増幅ファージの収量はかなり類似していた。４回目のラウンの後、プロセスが停止したため、ラウンド４のファージは増幅されなかった。

実施例３６に記載のように、クローンをモノクローナル可溶性Ｆａｂフォーマットでスクリーニングし、細菌粗ペリプラズム抽出物として回収した。図５８は、チェインスイッチｑＥＬＩＳＡを用いた抗ＰｆＣＳＰ可溶性Ｆａｂスクリーニングのためのプレート８の代表的なデータを示す。陽性クローンを実施例３６に記載のように分類した。

ｑＥＬＩＳＡでスクリーニングされた３８４個のクローン中、２０１個のクローンがλ陽性であり、１０５個のクローンがκ陽性であった。動力学的ランク付けのためにクローンを選択する際、クローン優先順位付けを実施例３６に記載のようにして行った。１００個のクローン（κ及びλｑＥＬＩＳＡ陽性からそれぞれ５０個）を動力学的スクリーニングのために取り上げた。５０ｍｌスケールの発現、ペリプラズム抽出及び緩衝液交換を実施例３６に記載のように行った。１００個のｑＥＬＩＳＡ陽性クローンの第１のラウンドの親和性ランク付けを、単一濃度（５００ｎＭ）のＰｆＣＳＰを用いて行った。図５９に示されるように、１００個のクローン中の８７個がこの低解像度スクリーニングからＳＰＲ陽性であった。

用量タイトレーションを用いた慎重な分析を行う前に、全てのＳＰＲ陽性クローンを２つのプライマーで配列決定して、可変軽鎖及び重鎖を決定した。８０個のクローンが配列読み取り可能であり、そのうち７５個のクローンが同一の配列を有し、残りの５個（ｂＣ５２、ｂＣ５４、ｂＣ６１、ｂＣ７１及びｂＣ７２）が独特の配列を有していた。ｂＣ３（７５個のクローンの主要な群を代表する一つ）、ｂＣ５２、ｂＣ５４、ｂＣ６１、ｂＣ７１及びｂＣ７２の完全配列を、コードされた配列のタンデムＬＣ−ＨＣ構造を決定するために、実施例２５に記載された５つのプライマーを用いてジデオキシ配列決定によって得た。５個のクローンが全長インフレーム（ｂＣ３、ｂＣ５２、ｂＣ６１、ｂＣ７１及びｂＣ７２）であり、１個のクローン（ｂＣ５４）は可変重鎖に終止コドンを有していた。このデータは、実施例３５に示されたゲートシステムがＰｆＣＳＰの場合は約８３％確実である（表６４）ことを示す。

これらの５つのクローンを、それらの配列の特有性及び表６５に示すデータに従って、更に５つの棚に分類した。

全長インフレームクローンを前に進め、分析物用量タイトレーションによって信頼性のある動力学的パラメーター（ｋ_ａ及びｋ_ｄ）及び親和性値（Ｋ_Ｄ）を得た。図６０は、５つ全てのクローンのＳＰＲプロファイル及びパラメーターの要約図を示す。

ヒトｓＴＮＦα及び熱帯熱マラリア原虫供給源由来の抗原のための抗体発見プロセスの実施例は、本明細書に記載の抗体発見漏斗アプローチと組合せた超大型ナイーブ抗体ファージディスプレイライブラリーが、サブナノモル及びピコモルの範囲のＫ_Ｄ値のヒットで証明されているように、親和性の成熟の必要なしにライブラリーから直接に治療用グレードの抗体を生成できることを意味する。このプロセスは、４回連続のラウンドのパニングの開始から水溶性タンパク質としての抗原特異的Ｆａｂの動力学的パラメーターの確立までの間に約４〜５週間かかるため、このプロセスは迅速でもある。後者の特性は、抗体製造のためのＣＱＡを適用することができる前に最も重要な仮定である。したがって、本明細書に例示される方法は、ファージ−Ｆｖ融合物の表現型決定等の中間段階の関与なしに、また従来技術に記載された発現分析のために再クローニングすることでファージフォーマットからプラスミドフォーマットに変換する必要性なしに、ファージディスプレイライブラリーから発見された抗体の直接製造可能性評価に寄与する。

＜参考文献＞
［１］Abdiche YN, Malashock DS, Pinkerton A, Pons J. (2009) Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem 386: 172-180.
［２］Alt N, Zhang TY, Motchnik P, Taticek R, Quarmby V, Schlothauer T, Beck H, Emrich T, Harris RJ. (2016) Determination of critical quality attributes for monoclonal antibodies: using quality by design principles. Biologicals 44:291-305.
［３］Andris-Widhopf J, Steinberger P, Fuller R, Rader C, and Barbas CF, III. (2001). Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences. Chapter 9 in: Phage Display: A Laboratory Manual; (eds. Carlos F. Barbas III, Dennis R. Burton, Jamie K. Scott and Gregg J. Silverman); Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; pp 9.1 to 9.113.
［４］Authors unknown (2007-2008) Cleavage close to the end of DNA fragments (linearized vectors); Appendix item 10 in New England Biolabs Product Catalog and Technical Reference; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA.
［５］Authors Unknown. (2015) Protocol: Use of Glycerol Stocks and Preparation of Transfection-Quality Plasmid DNA; Broad Institute, Boston, MA.

［６］Azzazy HM, Highsmith WE. (2002) Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clin. Biochem 35:425-445.
［７］Barbas CF III, Kang AS, Lerner RA, Benkovic SJ. (1991) Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: The gene III site. P Natl Acad Sci USA 88:7978-7982.
［８］Barnes WM. (1994) PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. P Natl Acad Sci USA 91:2216-2220.
［９］Better M, Chang CP, Robinson RR, Horwitz AH. (1988) Escherichia coli secretion of an active chimeric antibody fragment. Science 240:1041-1043.
［１０］Boder ET, Wittrup KD. (1997) Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol 15:553-557.

［１１］Bonnycastle LLC, Menendez A, Scott JK (2001) General phage methods; Chapter 15 in Phage Display: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; pp 15.1-15.30.
［１２］Bradbury A. (2010) Cloning hybridoma cDNA by RACE. Chapter 2 in: Antibody Engineering; Volume 1; (eds. R. Kontermann and S. Dubel); Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg; pp 15-20.
［１３］Bruggemann M, Taussig MJ. (1997) Production of human antibody repertoires in transgenic mice. Curr Opin Biotechnol 8:455-458.
［１４］Buckler DR, Park A, Viswanathan M, Hoet RM, Ladner RC. (2008) Screening isolates from antibody phage-display libraries. Drug Discov Today 13:318-24. doi: 10.1016/j.drudis.2007.10.012.
［１５］Burton DR. (1995) Phage display. Immunotechnology 1:87-94.

［１６］Burton DR. (2001). Overview: Amplification of antibody genes. Chapter 7 in: Phage Display: A Laboratory Manual; (eds. Carlos F. Barbas III, Dennis R. Burton, Jamie K. Scott and Gregg J. Silverman); Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; pp 7.1-7.4.
［１７］Canziani GA, Klakamp S, Myszka DG. (2004) Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem 325:301-307.
［１８］Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JB, Henner D, Wong WL, Rowland AM, Kotts C, Carver ME, Shepard HM. (1992) Humanization of an anti-p185^HER2 antibody for human cancer therapy. P Natl Acad Sci USA 89:4285-4289.
［１９］Casadevall A, Janda A. (2012) Immunoglobulin isotype influences affinity and specificity. P Natl Acad Sci USA 109:12272-12273. doi: 10.1073/pnas.1209750109.
［２０］Chames P, Van Regenmortel M, Weiss E, Baty D. (2009) Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol 157:220-33. doi: 10.1111/j.1476-5381.2009.00190.x.

［２１］Chames, P and Baty, D. (2010) Phage display and selections on biotinylated antigens; Chapter 11 in: Antibody Engineering, Volume 1 (eds. Roland E Kontermann and Stefan Dubel); Springer-Verlag, Berlin Heidelberg; pp 151-164.
［２２］Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM. (2004) High-level accumulation of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli requires a triple-mutant (degP prc spr) host strain. Biotechnol Bioeng 85:463-474.
［２３］Chester KA, Hawkins RE. (1995) Clinical issues in antibody design. Trends Biotechnol 13:294-300. DOI: 10.1016/S0167-7799(00)88968-4.
［２４］Cho N, Hwang B, Yoon JK, Park S, Lee J, Seo HN, Lee J, Huh S, Chung J, Bang D. (2015) De novo assembly and next-generation sequencing to analyse full-length gene variants from codon-barcoded libraries. Nat Commun 6:8351. doi: 10.1038/ncomms9351.
［２５］Chowdhury PS. (2002) Targeting random mutations to hotspots in antibody variable domains for affnity improvement. Chapter 24 in: Methods in Molecular Biology, vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (eds. Philippa M. O’Brien and Robert Aitken); Humana Press Inc., Totowa, NJ; pp 269-285.

［２６］de Boer M, Chang SY, Eichinger G, Wong HC. (1994) Design and analysis of PCR primers for the amplification and cloning of human immunoglobulin Fab fragments. Hum Antibodies Hybridomas 5:57-64.
［２７］de Bruin R, Spelt K, Mol J, Koes R, Quattrocchio F. (1999) Selection of high-affinity phage antibodies from phage display libraries. Nat Biotechnol 17:397-399.
［２８］de Haard HJ, van Neer N, Reurs A, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P, de Bruine AP, Arends JW, Hoogenboom HR. (1999) A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. J Biol Chem 274:18218-18230.
［２９］de Haard, HJW (2002) Construction of large naive Fab libraries; Chapter 5 in Methods in Molecular Biology, vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (eds. Philippa M. O’Brien and Robert Aitken); Humana Press, Totowa, NJ; pp 87-100.
［３０］Dechiara TM, Poueymirou WT, Auerbach W, Frendewey D, Yancopoulos GD, Valenzuela DM. (2009) VelociMouse: fully ES cell-derived F0-generation mice obtained from the injection of ES cells into eight-cell-stage embryos. Methods Mol Biol 530:311-324. doi: 10.1007/978-1-59745-471-1_16.

［３１］Diamante L, Gatti-Lafranconi P, Schaerli Y, Hollfelder F. (2013) In vitro affnity screening of protein and peptide binders by megavalent bead surface display. Protein Eng Des Sel 26:713-724.
［３２］Dobson CL, Minter RR, Hart-Shorrock CP. (2012) Naive antibody libraries from natural repertoires. Chapter 17 in: Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery (eds. Sachdev S Sidhu and Clarence Ronald Geyer), 2nd Ed. CRC Press, Boca Raton, FL; pp 455-493.
［３３］Drake AW, Papalia GA. (2012) Biophysical considerations for development of antibody-based therapeutics. Chapter 5 in: Development of antibody-based therapeutics (eds. Mohmmad A. Tabrizi, Gadi G. Bornstein and Scott L. Klakamp); Springer Science + Business Media, New York, NY; pp 95-139.
［３４］Eisenhardt SU, Peter K (2010) Phage display and subtractive selection on cells. Chapter 12 in: Antibody Engineering; Volume 1; (eds. Roland E Kontermann and Stefan Dubel); Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg; pp 165-181.
［３５］Ewert S, Honegger A, Pluckthun A. (2004) Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering. Methods 34:184-199. DOI: 10.1016/j.ymeth.2004.04.007.

［３６］Foote J, Eisen HN. (1995) Kinetic and affinity limits on antibodies produced during immune responses. P Natl Acad Sci USA 92:1254-1256.
［３７］Frenzel A, Schirrmann T, Hust M. (2016) Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. mAbs 8:1177-1194. DOI: 10.1080/19420862.2016.1212149.
［３８］Gelfand DH, White TJ. (1990) Thermostable DNA polymerases. Chapter 16 in: PCR protocols: A guide to methods and applications. (eds. Michael J. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky, and Thomas J. White); Academic Press, Inc.; San Diego, CA; pp 129-141.
［３９］Geyer CR, McCafferty J, Dubel S, Bradbury ARM, Sidhu SS. (2012) Recombinant antibodies and in vitro selection technologies. Chapter 2 in: Antibody Methods and Protocols (eds. Gabriele Proetzel and Hilmer Ebersbach); Method Mol Biol 901:11-32. DOI 10.1007/978-1-61779-931-0_2.
［４０］Glanville J, D’Angelo S, Khan TA, Reddy ST, Naranjo L, Ferrara F, Bradbury AR. (2015) Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol 33:146-160. doi: 10.1016/j.sbi.2015.09.001.

［４１］Glennie MJ, Johnson PWM. (2000) Clinical trials of antibody therapy. Immunol Today 21:403-410.
［４２］Green LL. (1999) Antibody engineering via genetic engineering of the mouse: XenoMouse strains are a vehicle for the facile generation of therapeutic human monoclonal antibodies. J Immunol Methods 231:11-23.
［４３］Green MR, Sambrook J. (2012a) Concentrating and desalting nucleic acids with microconcentrators. Protocol 6 of Chapter 1 in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 1 (eds. Michael R Green and Joseph Sambrook); 4th Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; pp 28-29.
［４４］Green MR, Sambrook J. (2012b) PCR amplification of GC-Rich Templates. Protocol 4 of Chapter 7 in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 1 (eds. Michael R Green and Joseph Sambrook); 4th Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; pp 484-489.
［４５］Green MR, Sambrook J (2012c) Cloning in plasmid vectors: Blunt end cloning; Protocol 6 of Chapter 3 in Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 4th Ed.; Vol. 1 (eds. Michael R Green and Joseph Sambrook); Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; pp 186-188.

［４６］Griffiths AD, Williams SC, Hartley O, Tomlinson IM, Waterhouse P, Crosby WL, Kontermann RE, Jones PT, Low NM, Allison TJ, Prospero TD, Hoogenboom HR, Nissim A, Cox JPL, Harrison JL, Zaccolo M, Gherardi E, Winter G. (1994) Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires. EMBO J 13:3245-3260.
［４７］Hai S-H, McMurry JA, Knopf PM, Martin W, de Groot AS (2009) Immunogenicity screening using in silico methods: Correlation between T-Cell epitope Content and clinical immunogenicity of monoclonal antibodies. Chapter 22 in: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (ed. Zhiqiang An); John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ; pp 417-437.
［４８］Hanes J, Pluckthun A. (1997) In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. P Natl Acad Sci USA 94:4937-4942.
［４９］Harlow E, Lane D. (1988) Immunoassays. Chapter 14 in Antibodies: A Laboratory Manual (eds. Ed Harlow and David Lane); Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; pp 553-612.
［５０］Hawkins RE, Russell SJ, Winter G. (1992) Selection of phage antibodies by binding affinity: Mimicking affinity maturation. J Mol Biol 226:889-896.

［５１］Hay FC, Westwood OMR. (2002) Preparation of human B-cell hybridoma. Section 2.8.2. of Chapter 1 : Isolation and structure of immunoglobulins in: Practical Immunology; 4th Ed. (eds. Frank C. Hay and Olwyn M.R. Westwood); Blackwell Science Ltd; Oxford, UK; pp 58-59.
［５２］Heckman KL, Pease LR. (2007) Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Nat Protocols 2:924-932.
［５３］Higuchi R, Krummell B, Saiki RK. (1988). A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucl Acids Res 16:7351-7367.
［５４］Hoet RM, Cohen EH, Kent RB, Rookey K, Schoonbroodt S, Hogan S, Rem L, Frans N, Daukandt M, Pieters H, van Hegelsom R, Neer NC, Nastri HG, Rondon IJ, Leeds JA, Hufton SE, Huang L, Kashin I, Devlin M, Kuang G, Steukers M, Viswanathan M, Nixon AE, Sexton DJ, Hoogenboom HR, Ladner RC. (2005) Generation of high-affinity human antibodies by combining donor-derived and synthetic complementarity-determining-region diversity. Nat Biotechnol 23:344-448. DOI: 10.1038/nbt1067.
［５５］Holliger P, Prospero T, Winter G. (1993) "Diabodies": Small bivalent and bispecific antibody fragments. P Natl Acad Sci 90:6444-6448.

［５６］Honegger A. (2008) Engineering antibodies for stability and efficient folding. Handb Exp Pharmacol Vol. 181; pp 47-68. DOI: 10.1007/978-3-540-73259-4_3.
［５７］Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G. (1991) Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucl Acids Res 19:4133-4137.
［５８］Horlick RA, Macomber JL, Bowers PM, Neben TY, Tomlinson GL, Krapf IP, Dalton JL, Verdino P, King DJ. (2013) Simultaneous surface display and secretion of proteins from mammalian cells facilitate efficient in vitro selection and maturation of antibodies. J Biol Chem 288:19861-19869.
［５９］Horton RM, Hunt HD, Ho SN, Pullen JK, Pease LR. (1989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77:61-68.
［６０］Humphreys DP. (2003) Production of antibodies and antibody fragments in Escherichia coli and a comparison of their functions, uses and modification. Curr Opin Drug Disc 6:188-196.

［６１］Humphreys DP, Bowering L. (2009) Production of antibody Fab' fragments in E. coli. Chapter 27 in: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (ed. Zhiqiang An); John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ; pp 589-622.
［６２］Hust M, Thie H, Schirrmann, Dubel S. (2009) Antibody phage display; Chapter 8 in: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (ed. Zhiqiang An); John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ; pp 191-211.
［６３］Hust M, Mersmann M. (2010) Phage display and selection in microtitre plates. Chapter 10 in : Antibody Engineering; Volume 1; (eds. Roland E Kontermann and Stefan Dubel); Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg; pp 139-149.
［６４］Jones RH, Mollitoris BA (1984) A statistical method for determining the breakpoint of two lines; Anal Biochem 141:287-290.
［６５］Jones PT, Dear PH, Foote J, Neuberger M, Winter G. (1986) Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 321:522-525.

［６６］Kepert JF, Cromwell M, Engler N, Finkler C, Gellermann G, Gennaro L, Harris R, Iverson R, Kelley B, Krummen L, McKnight N, Motchnik P, Schnaible V, Taticek R. (2016) Establishing a control system using QbD principles. Biologicals 44: 319-331.
［６７］Kirsch M, Zaman M, Meier D, Dubel S, Hust M. (2005) Parameters affecting the display of antibodies on phage. J Immunol Methods 301:173-185.
［６８］Knappik A, Ge L, Honegger A, Pack P, Fischer M, Wellnhofer G, Hoess A, Wolle J, Pluckthun A, Virnekas B. (2000) Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides. J Mol Biol 296:57-86. DOI: 10.1006/jmbi.1999.3444.
［６９］Kohler G, Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495-497.
［７０］Kontermann RE. (2010) Immunotube selections. Chapter 9 in : Antibody Engineering; Volume 1; (eds. Roland E Kontermann and Stefan Dubel); Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg; pp 127-137.

［７１］Kortt AA, Lah M, Oddie GW, Gruen CL, Burns JE, Pearce LA, Atwell JL, McCoy AJ, Howlett GJ, Metzger DW, Webster RG, Hudson PJ. (1997) Single-chain Fv fragments of anti-neuraminidase antibody NC10 containing five- and ten-residue linkers form dimers and with zero-residue linker a trimer. Protein Eng 10:423-433.
［７２］Kuchenhoff H (1996) An exact algorithm for estimating breakpoints in segmented generalized linear models; Sonderforschungsbereich 386: Paper 27; 1-12.
［７３］Labrijn AF, Aalberse RC, Schuurman J. (2008) When binding is enough: nonactivating antibody formats. Curr Opin Immunol 20:479-485. doi: 10.1016/j.coi.2008.05.010.
［７４］Lawson ADG, Chaplin LC, Lang V, Sehdev M, Spitali M, Popplewell A, Weir N, King DJ. (1997) Two-site assays for measuring recombinant antibody quality. BIA J 1:23.
［７５］Lefranc M-P. (2001) IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucl Acids Res 29:207-209.

［７６］Leonard P, Safsten P, Hearty S, McDonell B, Finlay W, O’Kennedy R. (2007) High throughput ranking of recombinant avian scFv antibody fragments from crude lysates using Biacore A100. J Immunol Methods 323:172-179.
［７７］Liu AY, Robinson RR, Murray ED Jr, Ledbetter JA, Hellstrom I, Hellstrom KE. (1987) Production of a mouse-human chimeric monoclonal antibody to CD20 with potent Fc-dependent biologic activity. J Immunol 139:3521-3526.
［７８］Lonberg N. (2008) Fully human antibodies from transgenic mouse and phage display platforms. Curr Opin Immunol 20:450-459. doi: 10.1016/j.coi.2008.06.004.
［７９］Loset GA, Lobersli I, Kavlie A, Stacy JE, Borgen T, Kausmally L, Hvattum E, Simonsen B, Hovda MB, Brekke OH. (2005) Construction, evaluation and refinement of a large human antibody phage library based on the IgD and IgM variable gene repertoire. J Immunol Methods 299:47-62. DOI: 10.1016/j.jim.2005.01.014.
［８０］Lou J, Marzari R, Verzillo V, Ferrero F, Pak D, Sheng M, Yang C, Sblattero D, Bradbury A. (2001) Antibodies in haystacks: how selection strategy influences the outcome of selection from molecular diversity libraries. J Immunol Methods 253:233-242.

［８１］Lowe D, Vaughan TJ (2009) Human antibody repertoire libraries; Chapter 7 in: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (ed. Zhiqiang An); John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ; pp 169-188.
［８２］Marks JD, Tristem M, Karpas A, Winter G. (1991) Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes. Eur J Immunol 21:985-991.
［８３］Martineau P. (2010) Synthetic antibody libraries. Chapter 6 in : Antibody Engineering; Volume 1; (eds. Roland E Kontermann and Stefan Dubel); Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg; pp 85-97.
［８４］McCafferty J. (1996) Phage display: Factors affecting panning efficiency. Chapter 15 in: Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual; (eds. Brian K. Kay, Jill Winter, John McCafferty); Academic Press Inc., San Diego, CA; pp 261-276.
［８５］Meijer PJ, Andersen PS, Haahr Hansen M, Steinaa L, Jensen A, Lantto J, Oleksiewicz MB, Tengbjerg K, Poulsen TR, Coljee VW, Bregenholt S, Haurum JS, Nielsen LS. (2006) Isolation of human antibody repertoires with preservation of the natural heavy and light chain pairing. J Mol Biol 358:764-772. DOI: 10.1016/j.jmb.2006.02.040.

［８６］Ostermeier M, Benkovic SJ. (2000) A two-phagemid system for the creation of non-phage displayed antibody libraries approaching one trillion members. J Immunol Methods 237:175-186.
［８７］Pavoni E, Monteriu G, Cianfriglia M, Minenkova O. (2007) New display vector reduces biological bias for expression of antibodies in E. coli. Gene 391:120-129. DOI: 10.1016/j.gene.2006.12.009.
［８８］Persic L, Roberts A, Wilton J, Cattaneo A, Bradbury A, Hoogenboom HR. (1997) An integrated vector system for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage display libraries. Gene 187:9-18.
［８９］Petropoulos K. (2012) Phage display. Chapter 3 in: Antibody Methods and Protocols (eds. Gabriele Proetzel and Hilmer Ebersbach); Methods Mol Biol 901:33-51. doi: 10.1007/978-1-61779-931-0_3.
［９０］Plassmeyer ML, Reiter K, Shimp RL Jr, Kotova S, Smith PD, Hurt DE, House B, Zou X, Zhang Y, Hickman M, Uchime O, Herrera R, Nguyen V, Glen J, Lebowitz J, Jin AJ, Miller LH, MacDonald NJ, Wu Y, Narum DL. (2009) Structure of the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein, a leading malaria vaccine candidate. J Biol Chem 284:26951-26963. doi: 10.1074/jbc.M109.013706.

［９１］Prassler J, Thiel S, Pracht C, Polzer A, Peters S, Bauer M, Norenberg S, Stark Y, Kolln J, Popp A, Urlinger S, Enzelberger M. (2011) HuCAL PLATINUM, a synthetic Fab library optimized for sequence diversity and superior performance in mammalian expression systems. J Mol Biol 413:261-278. doi: 10.1016/j.jmb.2011.08.012.
［９２］Quintero-Hernandez V, Juarez-Gonzalez VR, Ortiz-Leon M, Sanchez R, Possani LD, Becerril B. (2007) The change of the scFv into the Fab format improves the stability and in vivo toxin neutralization capacity of recombinant antibodies. Mol Immunol 44:1307-1315.
［９３］Rader C. (2012a) Selection of human Fab libraries by phage display. Chapter 5 in: Antibody Methods and Protocols (eds. Gabriele Proetzel and Hilmer Ebersbach); Methods Mol Biol. 901:81-99. doi: 10.1007/978-1-61779-931-0_5.
［９４］Rader C. (2012b) Generation of human Fab libraries for phage display. Chapter 4 in: Antibody Methods and Protocols (eds. Gabriele Proetzel and Hilmer Ebersbach); Methods Mol Biol. 901:53-79. doi: 10.1007/978-1-61779-931-0_5.
［９５］Ravn U, Didelot G, Venet S, Ng KT, Gueneau F, Rousseau F, Calloud S, Kosco-Vilbois M, Fischer N. (2013) Deep sequencing of phage display libraries to support antibody discovery. Methods 60:99-110. doi: 10.1016/j.ymeth.2013.03.001.

［９６］Roberts RW, Szostak JW. (1997) RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. P Natl Acad Sci USA 94:12297-12302.
［９７］Rothe C, Urlinger S, Lohning C, Prassler J, Stark Y, Jager U, Hubner B, Bardroff M, Pradel I, Boss M, Bittlingmaier R, Bataa T, Frisch C, Brocks B, Honegger A, Urban M. (2008) The human combinatorial antibody library HuCAL GOLD combines diversification of all six CDRs according to the natural immune system with a novel display method for efficient selection of high-affinity antibodies. J Mol Biol 376:1182-1200. doi: 10.1016/j.jmb.2007.12.018.
［９８］Rothlisberger D, Honegger A, Pluckthun A. (2005) Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. J Mol Biol 347:773-789. DOI: 10.1016/j.jmb.2005.01.053.
［９９］Sambrook J, Russell DW. (2001a) Preparation of cDNA libraries and gene identification. Chapter 11 in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 2 (eds. Joseph Sambrook and David W. Russell); 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; pp 11.1-11.133.
［１００］Sambrook J, Russell DW. (2001b) The Hanahan method for preparation and transformation of competent E. coli: High efficiency transformation. Protocol 23 of Chapter 1 in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 1 (eds. Joseph Sambrook and David W. Russell); 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; pp 1.105-1.111.

［１０１］Sambrook J and Russell DW (2001c) Recovery of DNA from agarose gels: electroelution in dialysis bags; Protocol 4 of Chapter 5 in Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Vol. 1 (eds. Joseph Sambrook and David W. Russell); 3rd Ed; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; pp 5.23-5.25.
［１０２］Sarkar G, Sommer SS. (1990). The "megaprimer" method of site-directed mutagenesis. Biotechniques 8:404-407.
［１０３］Sblattero D, Bradbury A. (1998) A defenitive set of oligonucleotide primers for amplifying human V regions. Immunotechnology 3:271-278.
［１０４］Schraml M, Biehl M. (2012) Kinetic screening in the antibody development process. Chapter 11 in: Antibody Methods and Protocols (eds. Gabriele Proetzel and Hilmer Ebersbach); Method Mol Biol 901:171-181. DOI 10.1007/978-1-61779-931-0_11.
［１０５］Schraml M, von Proff L. (2012) Temperature-dependent antibody kinetics as a tool in antibody lead selection. Chapter 12 in: Antibody Methods and Protocols (eds. Gabriele Proetzel and Hilmer Ebersbach); Method Mol Biol 901:183-194. DOI 10.1007/978-1-61779-931-0_12.

［１０６］Schwimmer LJ, Huang B, Giang H, Cotter RL, Chemla-Vogel DS, Dy FV, Tam EM, Zhang F, Toy P, Bohmann DJ, Watson SR, Beaber JW, Reddy N, Kuan HF, Bedinger DH, Rondon IJ. (2013) Discovery of diverse and functional antibodies from large human repertoire antibody libraries. J Immunol Methods 391:60-71. doi: 10.1016/j.jim.2013.02.010.
［１０７］Scott JK, CF Barbas III. (2001). Phage-display vectors. Chapter 2 in: Phage Display: A Laboratory Manual; (eds. Carlos F. Barbas III, Dennis R. Burton, Jamie K. Scott and Gregg J. Silverman); Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; pp 2.1 to 2.19.
［１０８］Skerra A, Pluckthun A. (1991) Secretion and in vivo folding of the Fab fragment of the antibody McPC603 in Escherichia coli: influence of disulphides and cis-prolines. Protein Eng 4:971-979.
［１０９］Smith GP. (1985) Filamentous fusion phage: Novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228:1315-1317.
［１１０］Steukers M, Schaus J-M, van Gool R, Hoyoux A, Richalet P, Sexton DJ, Nixon AE, Vanhove M. (2006) Rapid kinetic-based screening of Fab fragments. J Immunol Methods 310:126-135.

［１１１］Sumida T, Doi N, Yanagawa H. (2009) Bicistronic DNA display for in vitro selection of Fab fragments. Nucl Acids Res 37(22):e147. doi:10.1093/nar/gkp776.
［１１２］Tabrizi MA. (2012) Considerations in establishing affinity design goals for development of antibody-based therapeutics. Chapter 6 in: Development of antibody-based therapeutics (eds. Mohmmad A. Tabrizi, Gadi G. Bornstein and Scott L. Klakamp); Springer, New York, NY; pp 141-151.
［１１３］Thiagarajan G, Semple A, James JK, Cheung JK, Shameem M. (2016) A comparison of biophysical characterization techniques in predicting monoclonal antibody stability. mAbs 8:1088-1097. doi: 10.1080/19420862.2016.1189048.
［１１４］Thie H, Schirrmann T, Paschke M, Dubel S, Hust M. (2008) SRP and Sec pathway leader peptides for antibody phage display and antibody fragment production in E. coli. N Biotechnol. 25:49-54. doi: 10.1016/j.nbt.2008.01.001.
［１１５］Tiller T, Meffre E, Yurasov S, Tsuiji M, Nussenzweig MC, Wardemann H. (2008) Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods 329:112-124. DOI: 10.1016/j.jim.2007.09.017.

［１１６］Tiller T, Schuster I, Deppe D, Siegers K, Strohner R, Herrmann T, Berenguer M, Poujol D, Stehle J, Stark Y, Hesling M, Daubert D, Felderer K, Kaden S, Kolln J, Enzelberger M, Urlinger S. (2013) A fully synthetic human Fab antibody library based on fixed VH/VL framework pairings with favorable biophysical properties. mAbs 5:445-470. doi: 10.4161/mabs.24218.
［１１７］Tindall KR, Kunkel TA. (1988) Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. Biochemistry 27:6008-6013.
［１１８］Tomimatsu K, Matsumoto SE, Tanaka H, Yamashita M, Nakanishi H, Teruya K, Kazuno S, Kinjo T, Hamasaki T, Kusumoto K, Kabayama S, Katakura Y, Shirahata S. (2013) A rapid screening and production method using a novel mammalian cell display to isolate human monoclonal antibodies. Biochem Biophys Res Commun 441:59-64. doi: 10.1016/j.bbrc.2013.10.007.
［１１９］van Blarcom TJ, Harvey BR. (2009) Bacterial display of antibodies. Chapter 11 in: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (ed. Zhiqiang An); John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ; pp 255-281.
［１２０］Vaughan TJ, Williams AJ, Pritchard K, Osbourn JK, Pope AR, Earnshaw JC, McCafferty J, Hodits RA, Wilton J, Johnson KS. (1996) Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nat Biotechnol 14:309-314.

［１２１］von Behring EA, Kitasato S. (1890) Ueber das Zustandekommen der Diphtherie-Immunitat und der Tetanus-Immunitat bei Thieren. Deutsch Med. Wochenschr 49:1113-1114.
［１２２］Warrens AN, Jones MD, Lechler RI. (1997) Splicing by overlap extension by PCR using asymmetric amplification: an improved technique for the generation of hybrid proteins of immunological interest. Gene 186:29-35.
［１２３］Waterhouse P, Griffiths AD, Johnson KS, Winter G. (1993) Combinatorial infection and in vivo recombination: a strategy for making large phage antibody repertoires. Nucl Acids Res 21:2265-2266.
［１２４］Weaver-Feldhaus JM, Lou J, Coleman JR, Siegel RW, Marks JD, Feldhaus MJ. (2004) Yeast mating for combinatorial Fab library generation and surface display. FEBS Lett 564:24-34.
［１２５］Webster R. (2001). Filamentous phage biology. Chapter 1 in: Phage Display: A Laboratory Manual; (eds. Carlos F. Barbas III, Dennis R. Burton, Jamie K. Scott and Gregg J. Silverman); Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; pp 1.1-1.37.

［１２６］Weidner KM, Denzin LK, Voss EW, Jr. (1992) Molecular stabilization effects of interactions between anti-metatype antibodies and liganded antibody. J Biol Chem 267:10281-10288.
［１２７］Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, Hoogenboom HR. (1994) Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol 12:433-455.

Claims (36)

1. ５．３８×１０^１０〜２．５５×１０^１１（１．２６×１０^１１）ｃｆｕのκライブラリー及び７．３３×１０^１０〜３．５９×１０^１１（１．７９×１０^１１）ｃｆｕのλライブラリーを含む、８．８６×１０^１０〜９．１３×１０^１１（３．０６×１０^１１）ｃｆｕの範囲のサイズを有するナイーブ抗体ファージディスプレイライブラリー（ＡＰＤＬ）。
2. 以下の工程を含む、請求項１に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
   ｉ）Ｆａｂを得るための免疫レパートリーのキャプチャー、
   ｉｉ）工程２（ｉ）でキャプチャーされた免疫レパートリーを適切なベクター中に表示すること。
3. 前記免疫レパートリーのキャプチャーが以下の工程を含む、請求項２（ｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
   ｉ）ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成、
   ｉｉ）配列番号１〜２３及び４２〜５４を含むプライマーを用いたＶ_Ｌ（λ及びκ）ドメイン及びＶ_Ｈドメインの増幅、
   ｉｉｉ）配列番号２４〜２６を用い、そして配列番号２７〜３１を含むプライマーを用いたＣドメインの増幅、
   ｉｖ）配列番号３０、３２、３５〜３７及び５５を含むプライマーを用い、それぞれ工程３（ｉｉ）及び工程３（ｉｉｉ）から得られたＶ_κドメイン及びＣ_κドメイン並びにＶ_λドメイン及びＣ_λドメインの融合による軽鎖のオーバーラップＰＣＲ、
   ｖ）配列番号２８及び３３を含むプライマーを用い、工程３（ｉｉ）及び工程３（ｉｉｉ）から得られたＶ_Ｈ及びＣ_Ｈ１の融合物から得られた重鎖のオーバーラップＰＣＲ、
   ｖｉ）Ｆａｂを得るための、配列番号３２、３４、３５〜３７及び５５を含むプライマーを用い、工程３（ｉｖ）及び工程３（ｖ）からそれぞれ得られた軽鎖及び重鎖のオーバーラップＰＣＲ、
   ｖｉｉ）各工程でアンプリコンを精製すること。
4. 可変λドメインの増幅が、配列番号１４〜２３及び４６〜５４を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む２工程のＰＣＲで行われる、請求項３（ｉｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
   ｉ）水溶液中のｃＤＮＡテンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
   ｉｉ）工程４（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
   ｉｉｉ）工程４（ｉｉ）からの変性テンプレートを６５〜７２℃の温度でアニーリング及び伸長を同時にさせて、可変λドメインを得て、多様なＶ_λレパートリーのキャプチャーをもたらすこと。
5. 可変κドメインの増幅が、配列番号９〜１３及び４２〜４５を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む３工程のＰＣＲで行われる、請求項３（ｉｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
   ｉ）水溶液中のｃＤＮＡテンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
   ｉｉ）工程５（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
   ｉｉｉ）プライマーを５５〜７０℃の温度範囲で工程５（ｉｉ）からの変性テンプレートにアニーリングすること、
   ｉｖ）工程５（ｉｉｉ）からのアニーリングされたテンプレートを６５〜７２℃の温度でプライマーを伸長させて、可変κドメインを得て、多様なＶ_κレパートリーのキャプチャーをもたらすこと。
6. 可変重鎖ドメインの増幅が、配列番号１〜８を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む３工程のＰＣＲで行われる、請求項３（ｉｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
   ｉ）水溶液中のｃＤＮＡテンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
   ｉｉ）工程６（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
   ｉｉｉ）プライマーを５５〜７０℃の温度範囲で工程６（ｉｉ）からの変性テンプレートにアニーリングすること、
   ｉｖ）工程６（ｉｉｉ）からのアニーリングされたテンプレート上で６５〜７２℃の温度でプライマーを伸長させて、可変重鎖ドメインを得て、多様なＶ_Ｈレパートリーのキャプチャーをもたらすこと。
7. Ｃ_Ｈ１ドメインの増幅が、配列番号２７〜２８を含むプライマー並びに配列番号２４及び３９を含むテンプレートを用い、そして以下の工程を含む３工程のＰＣＲで行われる、請求項３（ｉｉｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
   ｉ）水溶液中の合成Ｃ_Ｈ１ドメインテンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
   ｉｉ）工程７（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
   ｉｉｉ）プライマーを５５〜７０℃の温度範囲で工程７（ｉｉ）からの変性テンプレートにアニーリングすること、
   ｉｖ）工程７（ｉｉｉ）からのアニーリングされたテンプレート上で６５〜７２℃の温度でプライマーを伸長させて、定常重鎖ドメインを得ること。
8. Ｃ_κドメイン及びＣ_λドメインの増幅が、配列番号２９〜３１を含むプライマー並びに配列番号２５〜２６及び４０〜４１を含むテンプレートを用い、そして以下の工程を含む２工程のＰＣＲで行われる、請求項３（ｉｉｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
   ｉ）水溶液中の合成Ｃ_κドメイン及びＣ_λドメイン、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
   ｉｉ）工程８（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
   ｉｉｉ）工程８（ｉｉ）からの変性テンプレートを６５〜７２℃の温度でアニーリング及び伸長を同時にさせて、定常κ及びλドメインを得ること。
9. Ｖ_κドメイン及びＣ_κドメイン並びにＶ_λドメイン及びＣ_λドメインの融合が、配列番号３０、３２、３５〜３７及び５５を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む２工程のＰＣＲで行われる、請求項３（ｉｖ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
   ｉ）水溶液中のそれぞれ請求項４〜５及び８からの軽鎖可変及び定常遺伝子テンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
   ｉｉ）工程９（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
   ｉｉｉ）工程９（ｉｉ）からの変性テンプレートを６５〜７２℃の温度でアニーリング及び伸長を同時にさせて、λ及びκ軽鎖レパートリーを得ること。
10. Ｖ_Ｈドメイン及びＣ_Ｈ１ドメインの融合が、配列番号２８及び３３を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む３工程のＰＣＲで行われる、請求項３（ｖ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
    ｉ）水溶液中のそれぞれ請求項６及び７からの重鎖可変及び定常遺伝子テンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
    ｉｉ）工程１０（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
    ｉｉｉ）プライマーを５５〜７０℃の温度範囲で工程１０（ｉｉ）からの変性テンプレートにアニーリングすること、
    ｉｖ）工程１０（ｉｉｉ）からのアニーリングされたテンプレート上で６５〜７２℃の温度でプライマーを伸長させて、重鎖ドメインを得ること。
11. 軽鎖及び重鎖の融合ＰＣＲが、配列番号３２、３４、３５〜３７及び５５を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む２工程のＰＣＲで行われる、請求項３（ｖｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
    ｉ）水溶液中の請求項９〜１０からの軽鎖及び重鎖レパートリー、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
    ｉｉ）工程１１（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
    ｉｉｉ）工程１１（ｉｉ）からの変性テンプレートを６５〜７２℃の温度でアニーリング及び伸長を同時にさせて、λ及びκＦａｂレパートリーを得ること。
12. 軽鎖及び重鎖の融合ＰＣＲが、配列番号３２、３４、３５〜３７及び５５を含むプライマーを用い、そして以下の工程を含む３工程のＰＣＲで行われる、請求項３（ｖｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
    ｉ）水溶液中の工程９〜１０で得られた軽鎖及び重鎖レパートリー、ポリメラーゼ酵素、プライマー、緩衝液及びｄＮＴＰ混合物の混合物を得ること、
    ｉｉ）工程１２（ｉ）の混合物を９０〜９６℃の温度範囲にして、テンプレートを変性させること、
    ｉｉｉ）プライマーを５５〜７０℃の温度範囲で工程１２（ｉｉ）からの変性テンプレートにアニーリングすること、
    ｉｖ）工程１２（ｉｉｉ）からのアニーリングされたテンプレート上で６５〜７２℃の温度でプライマーを伸長させて、λ及びκＦａｂレパートリーを得ること。
13. 緩衝液が、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ緩衝液、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＰＣＲ緩衝液、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液２、Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液３、Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液４、Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液、ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ緩衝液、Ｅｘａｃｔ（商標）ポリメラーゼ緩衝液、ＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ緩衝液、Ｔｕｎｉｎｇ緩衝液、Ｖｅｎｔ（登録商標）緩衝液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２緩衝液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ ＳＡ緩衝液を含む群から選択され、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素が、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄ（商標）ＬＴ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＢｌｅｎｄ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼＢｌｅｎｄ、Ｅｘａｃｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ及びＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ ＤＮＡポリメラーゼＭｉｘを含む群から選択される、請求項５〜１２に記載のＡＰＤＬの製造方法。
14. 請求項５〜１３のキャプチャーされた免疫レパートリーをベクター中に表示することが、以下の工程を含む、請求項２（ｉｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
    ｉ）ファージミドベクター中にＦａｂを連結すること、
    ｉｉ）連結された混合物で適切な宿主を形質転換すること。
15. 配列番号３２及び３４を使用して得られるＦａｂレパートリーの連結が、以下の工程によって行われる、請求項１４（ｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
    ｉ）１１〜３７℃で、好ましくは１１℃で、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ特性を用いてＦａｂを平滑末端化し、３７℃で１〜１．５時間、好ましくは１．５時間、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて平滑末端化されたＦａｂの５’末端をリン酸化すること、
    ｉｉ）４〜１６℃の温度範囲で、好ましくは１６℃で１６時間、続いて２５℃で１時間、１．５〜９％ｗ／ｖ、好ましくは４〜７％ｗ／ｖ、より好ましくは６％ｗ／ｖの範囲の最終％で、分子量６０００〜３２０００ダルトン、好ましくは８０００ダルトンのポリエチレングリコールを含む群から選択される添加剤の存在下、５０〜４００ｎｇ／μｌ、好ましくは２００ｎｇ／μｌの濃度範囲の全ＤＮＡと共に、工程１５（ｉ）で得られたＦａｂを自己連結させること、
    ｉｉｉ）５０℃で１６時間、工程１５（ｉｉ）からの自己連結されたＦａｂ集団を３２Ｕ／μｇのＳｆｉＩで制限消化して、突出末端を有する直鎖状Ｆａｂを放出させ、続いてアガロースゲルで精製すること、
    ｉｖ）１６℃の温度で１６時間、続いて３７℃で１時間、工程１５（ｉｉｉ）で得られた直鎖状Ｆａｂを、突出末端で連結させ、７０℃で１５分間熱不活性化すること。
16. ベクターがｐＣＯＭＢ３ＸＳＳ（図１２）である、請求項１５に記載のＡＰＤＬを製造する方法。
17. 配列番号３４及び３５〜３７を用いて得られたＦａｂレパートリーの連結が、以下の工程によって行われる、請求項１４（ｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
    ｉ）５０℃で１６時間、直鎖状Ｆａｂ集団を３２Ｕ／μｇのＳｆｉＩで制限消化して、突出末端を有する直鎖状Ｆａｂを放出させ、続いてアガロースゲルで精製すること、
    ｉｉ）１６℃の温度で１６時間、続いて３７℃で１時間、工程１７（ｉ）で得られた直鎖状Ｆａｂを、突出末端で連結させ、７０℃で１５分間熱不活性化すること。
18. ベクターがｐＣＯＭＢ３ＸＳＳ（図１２）である、請求項１７に記載のＡＰＤＬを製造する方法。
19. 配列番号３４及び５５を用いて得られたＦａｂレパートリーの連結が、以下の工程によって行われる、請求項１４（ｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法：
    ｉ）５０℃で１６時間、直鎖状Ｆａｂ集団を３２Ｕ／μｇのＳｆｉＩで制限消化して、突出末端を有する直鎖状Ｆａｂを放出させ、続いてアガロースゲルで精製すること、
    ｉｉ）１６℃の温度で１６時間、続いて３７℃で１時間、工程１９（ｉ）で得られた直鎖状Ｆａｂを、突出末端で連結させ、７０℃で１５分間熱不活性化すること。
20. 前記ベクターがｐＳＳＹ１（配列番号３８；図２８）である、請求項１９に記載のＡＰＤＬの製造方法。
21. ウルトラコンピテントセル５０μｌ当たり２５〜４００ｎｇ、好ましくは１００〜３５０ｎｇ、より好ましくは２００〜３００ｎｇのＤＮＡ対細胞体積比で、形質転換が実施される、請求項１４（ｉｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法。
22. ０．１、０．２、０．４ｃｍ、好ましくは０．２ｃｍの電極間距離のキュベット中で、１５００〜３５００ボルト、好ましくは２５００〜３２００ボルトの範囲の電圧で、１０〜３０μＦ、好ましくは２０〜２８μＦの範囲の静電容量で、１００〜４００オーム、好ましくは２５０〜３５０オームの抵抗で、形質転換が実施される、請求項１４（ｉｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法。
23. 宿主が、ＴＧ１、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ、及びＥＲ２５３７を含む群から選択されるアンバーサプレッサーｔ−ＲＮＡコード宿主、好ましくは超高なコンピテンス（４×１０^４ｃｆｕ／μｇ）のＴＧ１である、請求項１４（ｉｉ）に記載のＡＰＤＬを製造する方法。
24. １工程の形質変換で請求項１５〜２３で得られた１５〜１６０μｇの連結ＤＮＡ、好ましくは２０〜１００μｇ、より好ましくは４０〜５０μｇの連結ＤＮＡからＡＰＤＬが得られる、請求項１に記載のＡＰＤＬを製造する方法。
25. １工程の形質変換で請求項１５〜２３で得られた１０〜７０μｇの連結ＤＮＡ、好ましくは２０〜５０μｇ、より好ましくは２５〜３０μｇの連結ＤＮＡからＡＰＤＬが得られる、請求項１に記載のκサブタイプのＡＰＤＬを製造する方法。
26. １工程の形質変換で請求項１５〜２３で得られた５〜６０μｇの連結ＤＮＡ、好ましくは８〜５０μｇ、より好ましくは１０〜２０μｇの連結ＤＮＡからＡＰＤＬが得られる、請求項１に記載のλサブタイプのＡＰＤＬを製造する方法。
27. κＡＰＤＬが１．９２×１０^９〜１．９８×１０^１０ｃｆｕ／μｇの効率で得られ、λＡＰＤＬが１．９２×１０^９〜９．１×１０^９ｃｆｕ／μｇの効率で得られる、請求項１に記載のＡＰＤＬを製造する方法。
28. 以下の工程を所定の順序で含む、請求項１に記載の抗体ファージディスプレイライブラリーから可溶性Ｆａｂとして製造可能な抗体を得る方法：
    ｉ）標的特異的パニング、
    ｉｉ）ペリプラズムの定量的ＥＬＩＳＡ（ｑＥＬＩＳＡ）、
    ｉｉｉ）動力学的ランク付け、
    ｉｖ）バイオアッセイ、
    ｖ）製造可能性の評価、
    これらの結果、工程２８（ｉｉｉ）で得られた抗体において期待される９０％を超える遺伝子型相関の表現型となること。
29. 請求項２８（ｉ）に記載の抗体ファージディスプレイライブラリーから抗体を得る方法であって、
    パニングが、固体相又は溶液相で４〜３７℃の範囲の様々な温度で１時間〜１６時間の範囲の様々な長さの時間で行われ、
    固体相のパニングが以下の工程を含むことができ：
    ｉ）荷電ポリスチレン等の固体表面上の所与の抗原についての最大コーティング濃度を最適化すること、
    ｉｉ）（請求項２４〜２７で得られた）ファージミドライブラリーをファージフォーマットに変換すること、
    ｉｉｉ）選択された表面を工程２９（ｉ）で決定された最適濃度の抗原でコーティングし、続いてタンパク質分子又は非タンパク質分子で遮断して非特異的部位を遮断すること、
    ｉｖ）工程２９（ｉｉ）で得られたファージプールを、遮断されていないポリスチレン表面に予め吸着させ、プラスチックのバインダーを除去すること、
    ｖ）規定された時間、工程２９（ｉｖ）からの予め吸着されたファージを、工程２９（ｉｉｉ）からの固定化された標的抗原とインキュベーションすること、
    ｖｉ）複数ラウンドの洗浄を行って、工程２９（ｖ）からの結合されていないファージを除去すること、
    ｖｉｉ）トリプシン消化で工程２９（ｖ）からの結合されたファージを溶出させ、ファージ力価を得るために、アンバーサプレッサー宿主並びに非アンバーサプレッサー宿主に同時に形質導入すること、
    ｖｉｉｉ）次ラウンドのパニングのためにアンバーサプレッサー宿主に形質導入することによって、工程２９（ｖｉｉ）からの溶出したファージを増幅させること、
    ｉｘ）減少した抗原濃度を用いて次ラウンドのパニングを実施し、工程２９（ｉｉｉ）〜工程２９（ｖｉｉｉ）を繰り返して、標的特異的な抗体集団を濃縮すること、
    ｘ）工程２９（ｖｉｉ）〜工程２９（ｉｘ）を繰り返すこと、
    ｘｉ）標的特異的ＥＬＩＳＡを用いる複数ラウンドのパニングを通して、濃縮された結合について、工程２９（ｖｉｉ）及び２９（ｘ）からの溶出したファージを評価すること、
    溶液相のパニングが以下の工程を含むことができる方法：
    ｘｉｉ）ビオチン対タンパク質のモル比が１０未満、好ましくは１〜５を達成するように、所与の抗原の最適ビオチン化のための反応条件を最適化すること、
    ｘｉｉｉ）（請求項２１〜２７で得られた）ファージミドライブラリーをファージフォーマットに変換すること、
    ｘｉｖ）工程２９（ｘｉｉｉ）で得られたファージをタンパク質分子又は非タンパク質分で遮断して非特異的部位を遮断して、一定時間非特異的部位を遮断し、同時にストレプトアビジンビーズを洗浄し、続いてビーズをタンパク質分子又は非タンパク質分子で遮断して非特異的部位を遮断すること、
    ｘｖ）工程２９（ｘｉｖ）からの遮断されたファージを、工程２９（ｘｉｉ）からの可溶性標的ビオチン化抗原と規定の期間、インキュベーションすること、
    ｘｖｉ）工程２９（ｘｖ）で得られたファージ−抗原複合体を、予め遮断されたストレプトアビジンビーズとインキュベーションすること、
    ｘｖｉｉ）工程２９（ｘｖｉ）の抗原−ファージ結合体に結合したビーズの複数ラウンドの洗浄をして、工程２９（ｖ）からの結合されていないファージを除去すること、
    ｘｖｉｉｉ）ＤＴＴ消化又はトリプシン消化で工程２９（ｘｖｉ）の結合されたファージを溶出させ、ファージ力価を得るために、アンバーサプレッサー宿主並びに非アンバーサプレッサー宿主に同時に形質導入すること、
    ｘｉｘ）次ラウンドのパニングのためにアンバーサプレッサー宿主に形質導入することによって、工程２９（ｘｖｉｉｉ）からの溶出したファージを増幅させること、
    ｘｘ）減少した抗原濃度を用いて次ラウンドのパニングを実施し、工程２９（ｘｉｖ）〜工程２９（ｘｖｉｉｉ）を繰り返して、標的特異的な抗体集団を濃縮すること、
    ｘｘｉ）工程２９（ｘｉｘ）〜工程２９（ｘｘ）を繰り返すこと、
    ｘｘｉｉ）標的特異的ＥＬＩＳＡを用いる複数ラウンドのパニングを通して、濃縮された結合について、工程２９（ｘｖｉｉｉ）及び工程２９（ｘｘｉ）からの溶出したファージを評価すること。
30. ペリプラズムの定量的ＥＬＩＳＡが以下の工程を含む、請求項２８（ｉｉ）に記載のパニングされた抗体ファージディスプレイライブラリーから抗体を得る方法：
    ｉ）溶出液タイトレーションプレートから単一の細菌コロニーからの可溶性Ｆａｂを得ること、
    ｉｉ）９６ウェル荷電ポリスチレンプレートの表面を重鎖に対するキャプチャー抗体でコーティングすること、
    ｉｉｉ）工程３０（ｉ）からの可溶性Ｆａｂを、工程３０（ｉｉ）からのコーティングさされた表面上にキャプチャーすること、
    ｉｖ）軽鎖特異的抗体を用いることで軽鎖を検出し、全長のタンデムインフレームのヘテロダイマーの可溶性Ｆａｂを同定すること。
31. 可溶性Ｆａｂを得ることが以下のステップを含む、請求項３０（ｉ）に記載のパニングされた抗体ファージディスプレイライブラリーから可溶性Ｆａｂを得る方法：
    ｉ）非アンバーサプレッサー宿主（請求項２９（ｖｉｉ）及び２９（ｘｖｉｉｉ））の力価プレートから単一クローンを選び、３７℃及び２５０ｒｐｍで一晩増殖させるために９６ウェルディープウェルプレートで液体培養させること、
    ｉｉ）一晩培養物を１０倍希釈し、工程３１（ｉ）と同一の条件下で対数期まで増殖させること、
    ｉｉｉ）工程３１（ｉｉ）の対数期の培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３０℃及び２５０ｒｐｍで一晩増殖させること、
    ｉｖ）９６ウェルプレート中で工程３１（ｉｉｉ）の培養物を遠心分離して、誘導された細胞をペレット化すること、
    ｖ）同じ９６ウェルプレート中、３０℃で一晩ゆっくり振盪しながら、緩衝液中で高濃度のＥＤＴＡを用いることで、工程３１（ｉｖ）のペレット化された細胞をペリプラズムの抽出をすること、
    ｖｉ）遠心分離して、スフェロプラスト及び細胞片から離れて、工程３１（ｖ）の拡散されたペリプラズムの画分を単離すること。
32. 表面が、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）又はＰｏｌｙＳｏｒｐ（商標）等の荷電ポリスチレンの表面であってよく、又はアビジン、ストレプトアビジン若しくはニュートラアビジンでコーティングされてよく、好ましくはＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）の表面が２０〜１００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度のストレプトアビジンでコーティングされている、請求項３０（ｉｉ）に記載の抗体ファージディスプレイライブラリーから抗体を得る方法。
33. キャプチャー抗体が、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）；Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント）、又はＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ｂｉｏｔｉｎ Ａｎｔｉ−ＩｇＧ−Ｃ_Ｈ１ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを含む群から選択され、好ましくは１０００〜１００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌの濃度のビオチン化抗Ｃ_Ｈ１抗体である、請求項３０（ｉｉｉ）に記載の抗体ファージディスプレイライブラリーから抗体を得る方法。
34. 軽鎖特異的抗体が、ヤギ抗ヒトλＬＣ特異的ペルオキシダーゼコンジュゲート、ヤギ抗ヒトκＬＣ特異的ペルオキシダーゼコンジュゲート、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）_２−ＨＲＰ、マウス抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート、マウス抗ヒトκ軽鎖モノクローナル、及びウサギ抗ヒトκ鎖モノクローナルを含む群から選択され、好ましくは抗λについては１〜２００００、最も好ましくは１：１００００の希釈範囲、及び抗κについては１：２０００の希釈範囲である、請求項３０（ｉｖ）に記載の抗体ファージディスプレイライブラリーから抗体を得る方法。
35. 動力学的ランク付けが以下の工程を含む、請求項２８（ｉｉｉ）に記載の抗体ファージディスプレイライブラリーから抗体を得る方法：
    ｉ）５０ｍｌの個々の培養物中の定量的ＥＬＩＳＡ陽性クローン（請求項３０〜３４で得られる）から可溶性Ｆａｂを得ること、
    ｉｉ）工程３５（ｉ）で得られたＦａｂを１×ＰＢＳに対して透析すること、
    ｉｉｉ）動力学的分析のために、生理的な強度及びｐＨの流れる緩衝液を使用すること、
    ここで、緩衝液は、０．１〜１．０Ｍ、好ましくは０．２５〜０．７５Ｍ、より好ましくは０．４〜０．６ＭのＮａＣｌ又はＫＣｌの濃度、及び０．００５〜０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０濃度を含むリン酸塩又はＨＥＰＥＳ、より好ましくはリン酸塩であることができ、
    ｉｖ）ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）チップ固定化表面を選択すること、
    ここで、この表面は、荷電デキストラン、荷電アルギン酸塩、荷電デキストラン又は荷電アルギン酸塩の上にコーティングされたニッケルニトリロテトラ酢酸、又は荷電デキストラン又は荷電アルギン酸塩の上にコーティングされたストレプトアビジン若しくはニュートラアビジンであることができ、
    ｖ）工程３５（ｉｖ）のＳＰＲ表面のために固定化化学を選択し、
    ここで、その化学は、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）及びスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を用いたアミンカップリング、１０ｍＭの硫酸ニッケルを用いたＮｉ^２＋荷電、又はストレプトアビジン−ビオチン認識化学であることができ、
    ｖｉ）工程３５（ｖ）からのチップ表面上に抗Ｆａｂキャプチャー抗体を固定化すること、
    ここで、キャプチャー抗体は、抗Ｆａｂ ＩｇＧ、抗Ｈｉｓ、抗ＨＡ等の抗タグ抗体、ビオチン化抗Ｃ_Ｈ１、又はビオチン化二価抗Ｃ_Ｈ１／抗Ｃ_λ、又はビオチン化抗Ｃ_Ｈ１／抗Ｃ_κ、又はビオチン化二価抗Ｃ_Ｈ１／抗Ｃ_λとビオチン化抗Ｃ_Ｈ１／抗Ｃ_κの両方の５０：５０混合物を含むことができ、
    ｖｉｉ）工程３５（ｉｉ）から得られた粗ペリプラズムＦａｂを、工程３５（ｖｉ）からのチップのキャプチャー抗体でコーティングされた表面上にキャプチャーすること、
    ｖｉｉｉ）２〜１５分間の中間休止時間で、チップ表面上に１〜３回のラウンドの流れる緩衝液の注入で信号を安定化すること、
    ｉｘ）分析物の最適濃度で工程３５（ｖｉｉ）のキャプチャーされたＦａｂに対する分析物の応答を試験して、標的抗原バインダーと非バインダーとを区別すること、
    ｘ）再生試薬を用いてＦａｂ−分析物複合体を除去して、表面を次ラウンドのスクリーニングに再使用すること、
    ここで、再生剤は、２Ｍ ＭｇＣｌ_２、０．８５％Ｈ_３ＰＯ_４、５０ｍＭ ＮａＯＨ又は１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０を含むことができる。
36. 診断目的及び治療目的、並びにインビトロアッセイのための抗体を取得するための、請求項１に記載のＡＰＤＬの使用。