JP2022527493A - クロマトグラフィー樹脂の疎水性を測定する方法 - Google Patents

クロマトグラフィー樹脂の疎水性を測定する方法 Download PDF

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Abstract

特定の実施態様において、本発明は、クロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを測定する方法を提供する。特定の実施態様において、本発明は、混合物から目的のタンパク質を精製するためのクロマトグラフィー樹脂の条件を選択する方法であって、ここで目的のタンパク質がクロマトグラフィーの間に凝集体をほとんどまたは全く形成しない、方法を提供する。特定の実施態様において、本発明は、混合物から目的のタンパク質を精製するための複数のクロマトグラフィー樹脂からクロマトグラフィー樹脂を選択する方法であって、ここで目的のタンパク質がクロマトグラフィーの間に凝集体をほとんどまたは全く形成しない、方法を提供する。

Description

関連出願に対する参照
本願は、２０１９年３月２９日付け出願の米国仮特許出願番号６２／８２６,２６０の優先権を主張するものであり、その内容のすべてが出典明示により本明細書に組み込まれる。
タンパク質の大規模で経済的な精製がバイオ医薬品の業界にとってますます重要な問題である。治療用タンパク質は、典型的には、そのタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えプラスミドから目的のタンパク質を発現するように遺伝子操作されている原核または真核生物の細胞株を用いて産生される。細胞に供給される成分、細胞の副生成物、および凝集した形態の該タンパク質の混合物から、所望のタンパク質を、例えばヒト治療薬として用いるのに十分な適切な純度まで分離することは、バイオ製剤の製造業者に大変な課題を課すこととなる。
従って、当該分野では、抗体などのタンパク質をベースとする治療薬の大規模な加工処理を促進するのに使用され得る、タンパク質の精製方法の改善に対して要求がある。
特定の実施態様において、本発明は、クロマトグラフィー樹脂の疎水性レベルを測定する方法であって、（ａ）フルオロフォアを金ナノ粒子（ＧＮＰ）と混合し、フルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を形成させ；（ｂ）そのフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子をクロマトグラフィー樹脂と溶液中で接触させ；（ｃ）上清を除去し、そのクロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄し；および（ｄ）該クロマトグラフィー樹脂の蛍光強度のレベルを定量化し、それによって該クロマトグラフィー樹脂の疎水性レベルを測定する、ことを含む、方法を提供する。
所望により、クロマトグラフィー樹脂は、イオン交換クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、およびミックスモードクロマトグラフィー樹脂から選択されてもよい。
所望により、フルオロフォアは、ボロン－ジピロメタン（boron-dipyrromethne；ＢＯＤＩＰＹ）色素、８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、４,４’－ジアニリノ－１,１’－ビナフチル－５,５’－ジスルホン酸（ビス－ＡＮＳ）、６－プロピオニル－２－（Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノ）ナフタレン（ＰＲＯＤＡＮ）、テトラフェニルエテン誘導体、およびニール・レッド（Nile Red）より選択されてもよい。好ましくは、フルオロフォアはボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素である。所望により、金ナノ粒子は、直径が５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍであってもよい。所望により、ＢＯＤＩＰＹは、ＢＯＩＤＰＹ・ＮＨＳ分子のＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）基をＧＮＰ表面に予め結合させた１級アミン基と架橋させることによってＧＮＰとコンジュゲートさせてもよい。あるいはまた、ＢＯＤＩＰＹは、ビオチンのストレプトアビジンとの連結；およびマレイミドのスルフヒドリルとの連結を含む、他の連結する化学的手段を用いてＧＮＰにコンジュゲートされてもよい。
特定の実施態様において、本発明は、混合物から目的のタンパク質を精製するためのクロマトグラフィー樹脂条件を選択し、ここで目的のタンパク質がクロマトグラフィー操作の間に凝集体をほとんど、または全く形成しない、方法であって、（ａ）フルオロフォアを金ナノ粒子（ＧＮＰ）と混合してフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を形成させ；（ｂ）そのフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を異なる条件下にてクロマトグラフィー樹脂と溶液中で接触させ；（ｃ）上清を除去し、そのクロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄し；（ｄ）（ｂ）での異なる条件からのクロマトグラフィー樹脂の蛍光強度のレベルを定量化し；（ｅ）異なる条件下でのクロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを測定し、ここで（ｄ）からの蛍光強度のレベルがクロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを示し；および（ｆ）クロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルが、目的のタンパク質のクロマトグラフィー精製の間に凝集体がほとんど、または全く形成されないまでに至る、クロマトグラフィー樹脂の条件を選択する、ことを含む、方法を提供する。
所望により、クロマトグラフィー樹脂は、イオン交換クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、およびミックスモードクロマトグラフィー樹脂より選択されてもよい。
所望により、フルオロフォアは、ボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素、８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、４,４’－ジアニリノ－１,１’－ビナフチル－５,５’－ジスルホン酸（ビス－ＡＮＳ）、６－プロピオニル－２－（Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノ）ナフタレン（ＰＲＯＤＡＮ）、テトラフェニルエテン誘導体、およびニール・レッドより選択されてもよい。好ましくは、フルオロフォアはボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素である。所望により、金ナノ粒子は直径が５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍであってもよい。所望により、ＢＯＤＩＰＹは、ＢＯＩＤＰＹ・ＮＨＳ分子のＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）基をＧＮＰ表面に予め結合させた１級アミン基と架橋させることによってＧＮＰとコンジュゲートさせてもよい。あるいはまた、ＢＯＤＩＰＹは、ビオチンのストレプトアビジンとの連結；およびマレイミドのスルフヒドリルとの連結を含む、他の連結する化学的手段を用いてＧＮＰにコンジュゲートされてもよい。
所望により、目的のタンパク質はモノクローナル抗体であってもよい。
所望により、混合物は、採取された細胞培養流体、細胞培養上清、および訓化細胞培養上清、細胞ライゼート、および清澄化されたバルクより選択されてもよい。例えば、細胞培養物は哺乳動物の細胞培養物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物）である。所望により、混合物はアフィニティークロマトグラフィーによって得られてもよい。
特定の実施態様において、本発明は、目的のタンパク質を混合物から精製するために複数のクロマトグラフィー樹脂からクロマトグラフィー樹脂を選択する方法であって、ここで目的のタンパク質がクロマトグラフィー操作の間に凝集体をほとんど、または全く形成せず、（ａ）フルオロフォアを金ナノ粒子（ＧＮＰ）と混合してフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を形成させ；（ｂ）そのフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を各クロマトグラフィー樹脂と溶液中で接触させ；（ｃ）上清を除去し、そのクロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄し；（ｄ）クロマトグラフィー樹脂の蛍光強度のレベルを定量し；（ｅ）クロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを測定し、ここで（ｄ）からの蛍光強度のレベルがクロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを示し；および（ｆ）目的のタンパク質のクロマトグラフィー精製の間に凝集体をほとんど、または全く形成しないまでに至る、疎水性レベルのクロマトグラフィー樹脂を選択する、ことを含む、方法を提供する。
所望により、クロマトグラフィー樹脂は、イオン交換クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、およびミックスモードクロマトグラフィー樹脂から選択されてもよい。
所望により、フルオロフォアは、ボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素、８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、４,４’－ジアニリノ－１,１’－ビナフチル－５,５’－ジスルホン酸（ビス－ＡＮＳ）、６－プロピオニル－２－（Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノ）ナフタレン（ＰＲＯＤＡＮ）、テトラフェニルエテン誘導体、およびニール・レッドより選択されてもよい。好ましくは、フルオロフォアはボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素である。所望により、金ナノ粒子は、直径が５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍであってもよい。所望により、ＢＯＤＩＰＹは、ＢＯＩＤＰＹ・ＮＨＳ分子のＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）基をＧＮＰ表面に予め結合させた１級アミン基と架橋させることによってＧＮＰとコンジュゲートさせてもよい。あるいはまた、ＢＯＤＩＰＹは、ビオチンのストレプトアビジンとの連結；およびマレイミドのスルフヒドリルとの連結を含む、他の連結する化学的手段を用いてＧＮＰにコンジュゲートされてもよい。
所望により、目的のタンパク質はモノクローナル抗体であってもよい。
所望により、混合物は、採取された細胞培養流体、細胞培養上清、および訓化細胞培養上清、細胞ライゼート、および清澄化されたバルクより選択されてもよい。例えば、細胞培養物は哺乳動物の細胞培養物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物）である。所望により、混合物はアフィニティークロマトグラフィーによって得られてもよい。
ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＮＨＳを金ナノ粒子（ＧＮＰ）に官能基導入（functionalizing）する、概略図を示す。 ＨＩＣ樹脂のＧＮＰ－ＢＯＤＩＰＹ方法による疎水性の順位を示す。 ＣＥＸ樹脂のＧＮＰ－ＢＯＤＩＰＹ方法による疎水性の順位を示す。 ＧＮＰ－ＢＯＤＩＰＹ方法による異なるベースマトリックス材料からの疎水性を示す。 様々な型の樹脂についてアクセス可能な疎水性に対するＧＮＰの大きさの影響を示す。 結合したｍＡｂ分子とアクセス可能な樹脂の疎水性表面の影響を示す。ｍＡｂ１はＩｇＧ１であり、ｍＡｂ２はＩｇＧ４である。プールＨＭＷとロードＨＭＷの割合は凝集形成を示す。割合が＞１とは、カラムでの凝集を示唆する。
特定の実施態様において、本発明は、（ａ）フルオロフォアを金ナノ粒子（ＧＮＰ）と混合し、フルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を形成させ；（ｂ）そのフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子をクロマトグラフィー樹脂と溶液中で接触させ；（ｃ）上清を除去し、そのクロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄し；および（ｄ）該クロマトグラフィー樹脂の蛍光強度のレベルを定量化し、それによって該クロマトグラフィー樹脂の疎水性レベルを測定する、ことを含む、クロマトグラフィー樹脂の疎水性レベルを測定する方法であって、（ｄ）からの蛍光強度のレベルがクロマトグラフィー樹脂の疎水性レベルを示す、方法を提供する。
所望により、クロマトグラフィー樹脂は、イオン交換クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、およびミックスモードクロマトグラフィー樹脂より選択されてもよい。
所望により、フルオロフォアは、ボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素、８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、４,４’－ジアニリノ－１,１’－ビナフチル－５,５’－ジスルホン酸（ビス－ＡＮＳ）、６－プロピオニル－２－（Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノ）ナフタレン（ＰＲＯＤＡＮ）、テトラフェニルエテン誘導体、およびニール・レッドより選択されてもよい。好ましくは、フルオロフォアはボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素である。所望により、金ナノ粒子は直径が５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍであってもよい。所望により、ＢＯＤＩＰＹは、ＢＯＩＤＰＹ・ＮＨＳ分子のＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）基をＧＮＰ表面に予め結合させた１級アミン基と架橋させることによってＧＮＰとコンジュゲートさせてもよい。あるいはまた、ＢＯＤＩＰＹは、ビオチンのストレプトアビジンとの連結；およびマレイミドのスルフヒドリルとの連結を含む、他の連結する化学的手段を用いてＧＮＰにコンジュゲートされてもよい。
特定の実施態様において、本発明は、目的のタンパク質を混合物から精製するためのクロマトグラフィー樹脂の条件を選択する方法であって、ここで目的のタンパク質がクロマトグラフィー操作の間に凝集体をほとんど、または全く形成せず、（ａ）フルオロフォアを金ナノ粒子（ＧＮＰ）と混合してフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を形成させ；（ｂ）そのフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子をクロマトグラフィー樹脂と異なる条件下にて溶液中で接触させ；（ｃ）上清を除去し、そのクロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄し；（ｄ）（ｂ）での異なる条件からのクロマトグラフィー樹脂の蛍光強度のレベルを定量化し；（ｅ）異なる条件下でのクロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを測定し、ここで（ｄ）からの蛍光強度のレベルがクロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを示し；および（ｆ）クロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルが、目的のタンパク質のクロマトグラフィー精製の間に凝集体がほとんど、または全く形成されないまでに至る、クロマトグラフィー樹脂の条件を選択する、ことを含む、方法を提供する。
所望により、クロマトグラフィー樹脂は、イオン交換クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、およびミックスモードクロマトグラフィー樹脂より選択されてもよい。
所望により、フルオロフォアは、ボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素、８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、４,４’－ジアニリノ－１,１’－ビナフチル－５,５’－ジスルホン酸（ビス－ＡＮＳ）、６－プロピオニル－２－（Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノ）ナフタレン（ＰＲＯＤＡＮ）、テトラフェニルエテン誘導体、およびニール・レッドより選択されてもよい。好ましくは、フルオロフォアはボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素である。所望により、金ナノ粒子は、直径が５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍであってもよい。所望により、ＢＯＤＩＰＹは、ＢＯＩＤＰＹ・ＮＨＳ分子のＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）基をＧＮＰ表面に予め結合させた１級アミンと架橋させることでＧＮＰにコンジュゲートされてもよい。あるいはまた、ＢＯＤＩＰＹは、ビオチンのストレプトアビジンとの連結；およびマレイミドのスルフヒドリルとの連結を含む、他の連結する化学的手段を用いてＧＮＰにコンジュゲートされてもよい。
所望により、目的のタンパク質はモノクローナル抗体であってもよい。
所望により、混合物は、採取された細胞培養流体、細胞培養上清、および訓化細胞培養上清、細胞ライゼート、および清澄化されたバルクより選択されてもよい。例えば、細胞培養物は哺乳動物の細胞培養物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物）である。所望により、混合物はアフィニティークロマトグラフィーによって得られてもよい。
特定の実施態様において、本発明は、目的のタンパク質を混合物から精製するために複数のクロマトグラフィー樹脂からクロマトグラフィー樹脂を選択する方法であって、ここで目的のタンパク質がクロマトグラフィー操作の間に凝集体をほとんど、または全く形成せず、（ａ）フルオロフォアを金ナノ粒子（ＧＮＰ）と混合してフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を形成させ；（ｂ）そのフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を各クロマトグラフィー樹脂と溶液中で接触させ；（ｃ）上清を除去し、そのクロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄し；（ｄ）クロマトグラフィー樹脂の蛍光強度のレベルを定量化し；（ｅ）クロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを測定し、ここで（ｄ）からの蛍光強度のレベルがクロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを示し；および（ｆ）目的のタンパク質のクロマトグラフィー精製の間に凝集体がほとんど、または全く形成されないまでに至る、疎水性レベルのクロマトグラフィー樹脂を選択する、ことを含む、方法を提供する。
所望により、クロマトグラフィー樹脂は、イオン交換クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、およびミックスモードクロマトグラフィー樹脂より選択されてもよい。
所望により、フルオロフォアは、ボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素、８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、４,４’－ジアニリノ－１,１’－ビナフチル－５,５’－ジスルホン酸（ビス－ＡＮＳ）、６－プロピオニル－２－（Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノ）ナフタレン（ＰＲＯＤＡＮ）、テトラフェニルエテン誘導体、およびニール・レッドより選択されてもよい。好ましくは、フルオロフォアは、ボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素である。所望により、金ナノ粒子は、直径が５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍであってもよい。所望により、ＢＯＤＩＰＹは、ＢＯＩＤＰＹ・ＮＨＳ分子のＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）基をＧＮＰ表面に予め結合させた１級アミンと架橋させることでＧＮＰにコンジュゲートされてもよい。あるいはまた、ＢＯＤＩＰＹは、ビオチンのストレプトアビジンとの連結；およびマレイミドのスルフヒドリルとの連結を含む、他の連結する化学的手段を用いてＧＮＰにコンジュゲートされてもよい。
所望により、目的のタンパク質はモノクローナル抗体であってもよい。
所望により、混合物は、採取された細胞培養流体、細胞培養上清、および訓化細胞培養上清、細胞ライゼート、および清澄化されたバルクより選択されてもよい。例えば、細胞培養物は哺乳動物の細胞培養物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物）である。所望により、混合物はアフィニティークロマトグラフィーによって得られてもよい。
Ｉ． 定義
本発明をさらに容易に理解することができるように、特定の用語をまず定義する。本願にて使用される場合、本明細書にて明示的に規定される場合を除き、次の各用語は以下に示される意味を有するものとする。さらなる定義は本明細書全体を通して記載される。
本明細書にて使用される場合、「目的のタンパク質」なる語は、精製が望ましい、混合物中に存在する、いずれのタンパク質（天然または組換えのいずれかのタンパク質）をも含む、その最も広範な意味で使用される。目的とするかかるタンパク質には、ホルモン、成長因子、サイトカイン、免疫グロブリン（例えば、抗体）、および免疫グロブリン様ドメイン含有分子（例えば、アンキリンまたはフィブロネクチンドメイン含有分子）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書にて使用される場合、「細胞培養物」は、液体培地にある細胞をいう。所望により、細胞培養物はバイオリアクターに含まれてもよい。細胞培養物中の細胞は、例えば、細菌、真菌、昆虫、哺乳類または植物を含む、いずれの生物からも由来し得る。特定の実施態様において、細胞培養物中の細胞は、目的のタンパク質（例えば、抗体）をコードする核酸を含有する発現構築物でトランスフェクトされた細胞を包含する。適切な流体培地には、例えば、栄養培地および非栄養培地が含まれる。特定の実施態様において、細胞培養物は、例えば、濾過または遠心分離による精製に供されていない、栄養培地中のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物を含む。
本明細書にて使用される場合、「清澄化されたバルク」なる語は、粒子状物質が実質的に除去された混合物をいう。清澄化されたバルクには、細胞培養物、あるいは細胞または細胞破片が、例えば、濾過または遠心分離により実質的に取り除かれている細胞ライゼートが含まれる。
本明細書にて使用される場合、「混合物」は、目的のタンパク質（精製されていることが望ましい）と、１または複数の汚染物質、すなわち、不純物とを含む。１の実施態様において、混合物は目的のタンパク質を（自然に、または組換え操作のいずれかにて）発現する宿主細胞または生物より産生される。かかる混合物には、例えば、細胞培養物、細胞ライゼート、および清澄化されたバルク（例えば、清澄化された細胞培養物の上清）が含まれる。
本明細書にて使用される場合、「分離する」および「精製する」なる語は互換的に使用され、目的のタンパク質（例えば、抗体）を含有する混合物からの汚染物質の選択的除去をいう。
本明細書にて使用される場合、「汚染物質」なる語はその最も広い意味で使用され、望ましくないいずれかの成分または化合物が混合物中にあることを含む。細胞培養物、細胞ライゼートまたは清澄化されたバルク（例えば、清澄化された細胞培養物の上清）では、汚染物質は、例えば、細胞培地に含まれる宿主細胞核酸（例えば、ＤＮＡ）および宿主細胞タンパク質を包含する。宿主細胞の汚染タンパク質には、限定されないが、宿主細胞によって自然にまたは組換え操作により産生されるもの、ならびに目的のタンパク質に関連するか、それから由来するタンパク質（例えば、タンパク質分解フラグメント）および他のプロセス関連の汚染物質が含まれる。特定の実施態様において、汚染沈殿物は、遠心分離、滅菌濾過、深層濾過、およびタンジェント流濾過などの当該分野にて認識される手段を用いて細胞培養物より分離される。
本明細書にて使用される場合、「遠心分離」は、工業および実験室の環境にて使用される遠心分離機で、不均一な混合物を沈降させるのに遠心力を用いることを含むプロセスである。このプロセスは２種の非混和性液体を分離するのに用いられる。例えば、本発明の方法にて、遠心分離は混合物から汚染沈殿物を取り除くのに使用され得る。例えば、本発明の方法において、遠心分離を用いて、限定されないが、細胞培養物または清澄化された細胞培養物の上清あるいはキャプチャーカラムで捕獲された溶出プールを含む、混合物から汚染沈殿物を取り除くことができる。
本明細書にて使用される場合、「滅菌濾過」は、膜フィルター、典型的には、微生物または小型粒子を効果的に取り除くのに孔径が０.２μｍであるフィルターを用いる、濾過方法である。例えば、本発明の方法では、滅菌濾過を用いて、限定されないが、細胞培養物または清澄化された細胞培養物の上清あるいはキャプチャーカラムで捕獲された溶出プールを含む、混合物から汚染沈殿物を取り除くことができる。
本明細書にて使用される場合、「深層濾過」は、深層フィルター、典型的には、孔径を一定の範囲とすることで、それが粒子をフィルターマトリックス内に保持するように設計することで特徴付けられる、フィルターを用いる濾過方法である。深層フィルターの能力は、典型的には、マトリックスの深さ、例えば、１０インチまたは２０インチによって、かくして固体では保持能によって限定される。例えば、本発明の方法では、深層濾過を用いて、限定されないが、細胞培養物または清澄化された細胞培養物の上清あるいはキャプチャーカラムで捕獲された溶出プールを含む、混合物から汚染沈殿物を取り除くことができる。
本明細書にて使用される場合、「クロマトグラフィー」なる語は、この方法の特定の緩衝条件下にて、ｐＩ、疎水性、大きさおよび構造などの溶質の特性により、その溶質を大なり小なり強く吸着するか、または保持する、吸着剤を介して混合物をパーコレートすることによって、混合物中の目的の溶質、例えば目的のタンパク質が、混合物中にて他の溶質から分離される、方法をいう。本発明の方法では、クロマトグラフィーを用いて、限定されないが、細胞培養物または清澄化された細胞培養物の上清あるいはキャプチャーカラムで捕獲された溶出プールを含む、混合物から汚染沈殿物を取り除いた後に汚染物質を除去し得る。
「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」なる語は、目的のイオン化可能な溶質（例えば、混合物中の目的のタンパク質）が、目的の溶質が混合物中の溶質の不純物または汚染物質よりも帯電した化合物と多かれ少なかれ非特異的に相互作用するように、ｐＨおよび導電性の適切な条件下で、固相イオン交換材料に（例えば、共有結合で）連結した反対に帯電のリガンドと相互作用する、クロマトグラフィー方法をいう。混合物中の汚染している溶質は、イオン交換材料のカラムより洗浄されるか、あるいは樹脂と結合するか、または目的の溶質よりも早く、または遅く樹脂より排除され得る。「イオン交換クロマトグラフィー」は、具体的には、カチオン交換およびアニオン交換クロマトグラフィーを包含する。
「イオン交換材料」なる語は、負に帯電している固相（すなわち、カチオン交換樹脂または膜）または正に帯電している固相（すなわち、アニオン交換樹脂または膜）をいう。１の実施態様において、１または複数の帯電したリガンド（または吸着剤）を、例えば、共有結合によって固相と結合させることにより帯電が供給され得る。あるいはまた、もしくは付加的に、帯電は（例えば、全体として負の電荷を有するシリカの場合のように）固相の固有の特性であり得る。
「カチオン交換樹脂」は、負に帯電した固相であって、該固相上を、またはそこを通過する水溶液中のカチオンと交換される遊離カチオンの固相をいう。カチオン交換樹脂を形成るのに適する固相に結合した負に帯電したいずれのリガンドも、例えば、カルボキシレート、スルホネートおよび下記の他のリガンドも使用され得る。市販のカチオン交換樹脂には、限定されないが、例えば、スルホネートをベースとする基を有するもの（例えば、MonoS、MiniS、Source 15Sおよび30S、SP Sepharose Fast FlowTM、SP Sepharose High Performance、Capto S（GE Healthcare社製）、Toyopearl SP-650SおよびSP-650M（Tosoh社製）、Macro-Prep High S（BioRad社製）、Ceramic HyperD S、Trisacryl MおよびLS SPならびにSpherodex LS SP（Pall Technologies社製））；スルホエチルをベースとする基を有するもの（例えば、Fractogel SE（EMD社製）、Poros S-10およびS-20（Thermo Fisher Scientific社製））；スルホプロピルをベースとする基を有するもの（例えば、TSK Gel SP 5PWおよびSP-5PW-HR（Tosoh社製）、Capto SP ImpRes（GE Healthcare社製）、POROS HS-20、HS 50、およびPOROS XS（Thermo Fisher Scientific社製））；スルホイソブチルをベースとする基を有するもの（例えば、Fractogel EMD SO3 －（EMD社製））；スルホキシエチルをベースとする基を有するもの（例えば、SE52、SE53およびExpress-Ion S（Whatman社製））、カルボキシメチルをベースとする基を有するもの（例えば、CM Sepharose Fast Flow（GE Healthcare社製）、Hydrocell CM（Biochrom Labs Inc.社製）、Macro-Prep CM（BioRad社製）、Ceramic HyperD CM、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM（Pall Technologies製）、Matrx Cellufine C 500およびC 200（Millipore社製）、CM52、CM32、CM23およびExpress -Ion C（Whatman社製）、Toyopearl CM-650S、CM-650MおよびCM-650C（Tosoh社製））；スルホン酸およびカルボン酸をベースとする基を有するもの（例えば、BAKERBOND Carboxy-Sulfon（J.T. Baker社製）；カルボン酸をベースとする基を有するもの（例えば、WP CBX（J.T Baker社製）、DOWEX MAC-3（Dow Liquid Separations社製）、Amberlite Weak Cation Exchangers、DOWEX Weak Cation Exchanger、およびDiaion Weak Cation Exchangers（Sigma-Aldrich社製）およびFractogel EMD COO-（EMD製））；スルホン酸をベースとする基を有するもの（例えば、Hydrocell SP（Biochrom Labs Inc.社製）、DOWEX Fine Mesh Strong Acid Cation Resin（Dow Liquid Separations社製）、UNOsphere S、WP Sulfonic（J. T. Baker社製）、Sartobind S膜（Sartorius社製）、Amberlite Strong Cation Exchangers、DOWEX Strong CationおよびDiaion Strong Cation Exchanger（Sigma-Aldrich社製））；およびオルトホスフェートをベースとする基を有するもの（例えば、P11（Whatman社製））が含まれる。
「アニオン交換樹脂」は、正に帯電している固相であって、それで該固相に結合した１または複数の正に帯電しているリガンドの固相をいう。四級アミノ基などの、アニオン交換樹脂を形成するのに適する該固相に結合した正に帯電しているいずれのリガンドも使用され得る。市販のアニオン交換樹脂には、DEAEセルロース、POROS PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50、およびPOROS XQ（Thermo Fisher Scientific社製）、Sartobind Q（Sartorius社製）、MonoQ、MiniQ、Source 15Qおよび30Q、Q、DEAEおよびANX Sepharose Fast Flow、Q Sepharose high Performance、Capto Q、QAE SEPHADEXTMおよびFAST Q SEPHAROSETM（GE Healthcare）、WP PEI、WP DEAM、WP QUAT（J.T. Baker社製）、Hydrocell DEAEおよびHydrocell QA（Biochrom Labs Inc.社製）、UNOsphere Q、Macro-Prep DEAEおよびMacro-Prep High Q（Biorad社製）、Ceramic HyperD Q、Ceramic HyperD DEAE、Trisacryl MおよびLS DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA Spherosil LS、QMA Spherosil MおよびMustang Q（Pall Technologies社製）、DOWEX Fine Mesh Strong Base Type IおよびType II Anion ResinsおよびDOWEX MONOSPHER E 77、Weak Base Anion（Dow Liquid Separations社製）、Intercept Q membrane、Matrex Cellufine A200、A500、Q500、およびQ800（Millipore社製）、Fractogel EMD TMAE、Fractogel EMD DEAE およびFractogel EMD DMAE（EMD社製）、Amberlite Weak Strong Anion Exchangers Type IおよびII、DOWEX WeakおよびStrong Anion Exchangers IおよびII、Diaion WeakおよびStrong Anion Exchangers Type IおよびII、Duolite（Sigma-Aldrich社製）、TSKゲルQおよびDEAE 5PWおよび5PW-HR、Toyopearl SuperQ-650S、650Mおよび650C、QAE-550Cおよび650S、DEAE-650Mおよび650C（Tosoh社製）、QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-Ion DおよびExpress-Ion Q（Whatman社製）、およびSartobind Q（Sartorius corporation、New York、USA）が含まれる。
「ミックスモードイオン交換樹脂」または「ミックスモード」は、カチオン性、アニオン性、および／または疎水性部分との共有結合で修飾されている固相をいう。ミックスモードイオン交換樹脂の例には、BAKERBOND ABXTM（J. T. Baker；Phillipsburg、NJ）、セラミックハイドロキシアパタイトタイプＩおよびＩＩならびにフルオリドハイドロキシアパタイト（BioRad；Hercules、CA）、MEPおよびMBI HyperCel（Pall Corporation；East Hills、NY）、Capto adhere、Capto MMCおよびCapto MMC ImpRes（GE Healthcare）が含まれる。
「疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂」は、メチル、エチル、フェニル、ブチル、ヘキシル、およびオクチルの化合物との共有結合で修飾されている固相をいう。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、疎水性の特性を用いてタンパク質を相互に分離する、分離技術である。この型のクロマトグラフィーでは、メチル、エチル、フェニル、ブチル、ヘキシル、およびオクチルなどの疎水性基が固定カラムと結合する。カラムを通過し、その表面に疎水性アミノ酸側鎖を有するタンパク質は、カラムの疎水性基と相互作用し、それと結合し得る。疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂の例として、（１）Butyl FF、Butyl HP、Octyl FF、Phenyl FF、Phenyl HP、Phenyl FF（フェニル基の結合量の高い（high sub））、Phenyl FF（フェニル基の結合量の低い（low sub））、Capto Phenyl ImpRes、Capto Phenyl（high sub）、Capto Octyl、Capto Butyl ImpRes、Capto Butyl（GE Healthcare、Uppsala、Sweden）；（２）Toyopearl Super Butyl-550C、Toyopearl Hexyl-650C、Butyl-650C、Phenyl-650C、Butyl 600 M、Phenyl-600M、PPG-600M、Butyl-650M、Phenyl-650M、Ether-650M、Butyl-650S、Phenyl-650S、Ether-650S、TSKgel Pheny-5PW、TSKgel Ether-5PW（Tosoh Bioscience、Tokyo、Japan）；（３）Macro-Prep -butyl、Macro-Prep-methyl（Bio-Rad）；（４）Sartobind Phenyl（Sartorius corporation、New York、USA）、および（５）POROS Ethyl、POROS Benzyl、POROS Benzyl Ultra（Thermo Fisher Scientific）が挙げられる。
ＩＩ． 目的のタンパク質
特定の態様において、本発明の方法は、目的のいずれかのタンパク質（製薬、診断、農薬、および／または商業的、実験的または他の用途において有用である、種々のいずれかの他の特性を有するタンパク質を含むが、これらに限定されない）を精製するのに用いられてもよい。加えて、目的のタンパク質はタンパク質治療剤とすることができる。特定の実施態様において、本発明の方法を用いて精製されるタンパク質は加工処理または修飾されてもよい。例えば、本発明に係る目的のタンパク質は糖鎖形成されてもよい。
かくして、本発明は、医薬的または商業的に関連する酵素、受容体、受容体融合タンパク質、抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）、抗体の抗原結合フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質、サイトカイン、ホルモン、調節因子、成長因子、凝固因子、または抗原結合剤などの任意の治療用タンパク質を産生するための細胞を培養するのに使用されてもよい。上記のタンパク質の列挙は、本質的に単なる例示であり、限定的な記載を意図するものではない。当業者は、他のタンパク質が本発明に従って産生され得ることを認識しており、かかるタンパク質を産生するのに本明細書に開示の方法を用い得ることを認識するであろう。
本発明の１の特定の実施態様において、本発明の方法を用いて精製されるタンパク質は抗体である。「抗体」なる語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメント、イムノアドへシンおよび抗体－イムノアドヘシンキメラを含む。
「抗体フラグメント」には、全長抗体の少なくとも一部と、典型的には、抗原結合領域またはその可変領域とが含まれる。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；一本鎖抗体分子；ダイアボディ；線形抗体；および遺伝子操作された抗体フラグメントより形成される多重特異性抗体が含まれる。
「モノクローナル抗体」なる語は、従来の意味で使用され、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在するかもしれない、自然に存在する可能性のある変異体を除き、同一であるように、実質的に均質な抗体の集団より得られる抗体をいう。モノクローナル抗体は極めて特異的であり、単一の抗原部位に対抗するように方向付けられる。このことは、モノクローナル抗体が抗原にある単一の抗原決定基に対抗するように方向付けられるのに対して、ポリクローナル抗体の調製物では、典型的には、抗原の異なる抗原決定基（エピトープ）に対抗するように方向付けられる可変抗体を含む点で対照的である。抗体を説明するにおいて、「モノクローナル」なる語は、抗体が、実質的に均質な抗体の集団より得られるものとしての特徴を示し、特定の任意の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にて使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature 256：495（1975）によって最初に記載された従来のハイブリドーマ技法を用いて産生され得るか、あるいは組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４,８１６,５６７）を用いて産生され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、Clacksonら、Nature 352：624-628（1991）；Marksら、J. Mol. Biol. 222：581-597（1991）；および米国特許第５,２２３,４０９号；第５,４０３,４８４号；第５,５７１,６９８号；第５,４２７,９０８号；第５,５８０,７１７号；第５,９６９,１０８号；第６,１７２,１９７号；第５,８８５,７９３号；第６,５２１,４０４号；第６,５４４,７３１号；第６,５５５,３１３号；第６,５８２,９１５号；および第６,５９３,０８１号）に記載の技法を用いてファージ抗体ライブラリーより単離され得る。
本明細書に記載のモノクローナル抗体は、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種より由来の抗体、あるいは特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体にある対応する配列と同一または相同であり、その一方で、鎖の残りの部分が、別の種より由来の抗体、あるいは別の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体にある対応する配列と同一または相同である、「キメラ」および「ヒト化」抗体を、ならびにかかる抗体のフラグメントを包含する（米国特許第４,８１６,５６７号；およびMorrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81：6851-6855（1984））。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒトイムノグロブリンより由来の最小限の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性およびキャパシティを有する、マウス、ラット、ウサギあるいはヒト以外の霊長類などの非ヒト種からの超可変領域の残基（ドナー抗体）と置き換えられている、ヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒトイムノグロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が非ヒトの対応する残基と置き換えられる。さらには、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体にて見られない残基を含み得る。これらの修飾は抗体の性能をさらに向上させるのになされる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループのすべて、または実質的にすべてが、非ヒトのイムノグロブリンのものに相当し、ＦＲ領域のすべて、または実質的にすべてが、ヒトイムノグロブリン配列のものである、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含むであろう。ヒト化抗体はまた、所望により、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒトイムノグロブリンの一部を含むであろう。さらに詳細には、Jonesら、Nature 321：522-525（1986）；Riechmannら、Nature 332：323-329（1988）；およびPresta、Curr. Op. Struct. Biol. 2：593-596（1992）を参照のこと。
キメラまたはヒト化抗体は、上記のように製造されたネズミモノクローナル抗体の配列に基づいて製造され得る。重鎖および軽鎖イムノグロブリンをコードするＤＮＡは、目的のネズミハイブリドーマから得られ、標準的な分子生物学技法を用いて、ネズミ以外（例えば、ヒト）のイムノグロブリン配列を含有するように遺伝子操作され得る。例えば、キメラ抗体を作製するのに、当該分野にて既知の方法を用いて、ネズミ可変領域をヒト定常領域に連結させ得る（例えば、Cabillyらの米国特許第４,８１６,５６７号を参照のこと）。ヒト化抗体を作製するのに、当該分野にて既知の方法を用いて、ネズミＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入し得る（例えば、Winterの米国特許第５,２２５,５３９号、およびQueenらの米国特許第５,５３０,１０１号； 第５,５８５,０８９参照；第５,６９３,７６２号および第６,１８０,３７０号を参照のこと）。
本明細書に記載のモノクローナル抗体にはまた、種々の供給源（例えば、ヒト患者の血液を含む）から単離され得るか、またはトランスジェニック動物を用いて組換え操作により製造される「ヒト」抗体が含まれる。そのようなトランスジェニック動物の例には、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロモソームを有するKM-Mouse（登録商標）（Medarex, Inc., Princeton, NJ）（ＷＯ ０２／４３４７８を参照のこと）、Xenomouse（登録商標）（Abgenix, Inc., Fremont , CA；例えば、米国特許第５,９３９,５９８号；第６,０７５,１８１号；第６,１１４,５９８号；第６,１５０,５８４号および第６,１６２,９６３号（Kucherlapatiら）に記載）、およびHuMAb-Mouse（登録商標）（Medarex, Inc.；例えば、Taylor, L.ら（1992）Nucleic Acids Research 20: 6287-6295；Chen, J.ら（1993）International Immunology 5: 647-656；Tuaillonら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724；Choiら（1993）Nature Genetics 4: 117-123；Chen, J.ら（1993）EMBO J. 12: 821-830；Tuaillonら（1994）J. Immunol. 152: 2912-2920；Taylor, L.ら（1994）International Immunology 6: 579-591；およびFishwild, D.ら（1996）Nature Biotechnology 14: 845-851、米国特許第５,５４５,８０６号；第５,５６９,８２５号；第５,６２５,１２６号；第５,６３３,４２５号；第５,７８９,６５０号；第５,８７７,３９７号；第５,６６１,０１６号；第５,８１４,３１８号；第５,８７４,２９９号；および第５,７７０,４２９号；第５,５４５,８０７号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ ９２／０３９１８、ＷＯ ９３／１２２２７、ＷＯ ９４／２５５８５、ＷＯ ９７／１３８５２、ＷＯ ９８／２４８８４およびＷＯ ９９／４５９６２、ＷＯ ０１／１４４２４（Kormanら）に記載）が含まれる。本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化の際にヒト抗体反応が形成され得るように、ヒト免疫細胞が再構成されたＳＣＩＤマウスを用いて製造され得る。かかるマウスは、例えば、米国特許第５,４７６,９９６号および第５,６９８,７６７号（Wilsonら）に記載される。
ＩＩＩ． 目的のタンパク質を含有する混合物
本発明の方法は、目的のタンパク質を含有するいずれの混合物にも適用され得る。１の実施態様において、該混合物は、精製されるべきタンパク質を（例えば、自然に、または遺伝子操作により）発現する生体細胞から得られるか、該細胞により産生される。所望により、細胞培養物中の細胞は、目的のタンパク質をコードする核酸を含有する発現構築物でトランスフェクトされた細胞を包含してもよい。タンパク質を産生するのに細胞を遺伝子操作する方法は当該分野にて周知である。例えば、Ausabelら編（1990）、Current Protocols in Molecular Biology（Wiley, New York）および米国特許第５,５３４,６１５号および第４,８１６,５６７号を参照のこと（その各々は、出典明示により本明細書に具体的に組み込まれる）。かかる方法は、タンパク質をコードし、それを生体宿主細胞にて発現させる、核酸を導入することを含む。これらの宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、あるいは好ましくは、培養にて増殖した動物細胞であり得る。細菌宿主細胞はイー・コリ（E. coli）細胞を包含するが、これに限定されない。適切なイー・コリ株の例には、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、および異種ＤＮＡを切断しない任意のイー・コリ株が含まれる。使用され得る真菌宿主細胞には、限定されないが、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびアスペルギルス（Aspergillus）細胞が含まれる。使用され得る昆虫細胞には、限定されないが、ボンビックス・コリ（Bombyx mori）、マメストラ・ドラッシカエ（Mamestra drassicae）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）、ドロソフィリア・メラノガステル（Drosophilia melanogaster）が含まれる。
多くの哺乳動物細胞株は目的のタンパク質を発現するのに適した宿主細胞である。哺乳動物宿主細胞株には、例えば、ＣＯＳ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＴＭ４、ＶＥＲＯ０７６、ＤＸＢ１１、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ－３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＭＭＴ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、ＣＨＯ、２９３Ｔ、Ａ４３１、３Ｔ３、ＣＶ－１、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２、Ｃｏｌｏ２０５、２９３、ＨｅＬａ、Ｌ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ－６０、ＦＲｈＬ－２、Ｕ９３７、ＨａＫ、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｒａｔ２、ＢａＦ３、３２Ｄ、ＦＤＣＰ－１、ＰＣ１２、Ｍ１ｘ、ネズミ骨髄腫（例えば、ＳＰ２／０およびＮＳ０）およびＣ２Ｃ１２細胞、ならびに形質転換された霊長類細胞株、ハイブリドーマ、正常な二倍体細胞、および初代組織および初代移植片のインビトロ培養物より由来の細胞株が含まれる。新しい動物細胞株は、当業者に周知の方法を用いて（例えば、形質転換、ウイルス感染、および／または選択によって）確立され得る。目的のタンパク質の発現能を有するいずれかの真核細胞が、開示された細胞培養方法にて使用されてもよい。多数の細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）などの商業的供給源から入手可能である。本発明の１の実施態様において、細胞培養は、例えば、大規模細胞培養はハイブリドーマ細胞を用いる。抗体を産生するハイブリドーマ細胞の構築は当該分野において周知である。本発明の１の実施態様において、細胞培養は、例えば、大規模細胞培養は、抗体などの目的のタンパク質を産生するのにＣＨＯ細胞を利用する（例えば、ＷＯ ９４／１１０２６）。種々の型のＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ－およびＣＨＯ－Ｓが当該分野にて知られている。
特定の実施態様において、本発明は、目的のタンパク質を細胞培養物から精製する前に、細胞培養の増殖する個々の条件をモニター観察することとする。細胞培養の条件をモニター観察することで、細胞培養が目的のタンパク質を適切なレベルで産生しているかどうかを決定することが可能である。例えば、特定の細胞培養条件をモニター観察するために、培養物の少量のアリコートを分析のために定期的に取り出す。モニター観察される細胞培養条件には、限定されないが、温度、ｐＨ、細胞密度、細胞生存率、積分生存細胞密度、乳酸塩のレベル、アンモニウムのレベル、浸透圧、およびタンパク質の発現の力価が含まれる。そのような条件／基準を測定するのに多数の技法が当業者に周知である。例えば、細胞密度は、血球計算盤、自動細胞計数装置（例えば、コールター（Coulter）カウンター、Beckman Coulter Inc., Fullerton, Calif.）、または細胞密度試験装置（例えば、CEDEX.RTM.、Innovatis, Malvern, Pa.）を用いて測定されてもよい。生存細胞密度は、培養サンプルをトリパンブルーで染色することによって測定されてもよい。乳酸塩およびアンモニウムレベルは、例えば、細胞培地中の鍵となる栄養素、代謝物、および気体をリアルタイムでオンラインでの測定を行う、BioProfile 400 Chemistry Analyzer（Nova Biomedical, Waltham, Mass.）を用いて測定されてもよい。細胞培養の浸透圧は、例えば、凝固点浸透圧計で測定され得る。ＨＰＬＣを用いて、例えば、乳酸塩、アンモニウム、またはタンパク質の発現のレベルを測定し得る。本発明の１の実施態様において、タンパク質の発現のレベルは、例えば、プロテインＡ ＨＰＬＣを用いることにより測定され得る。あるいはまた、タンパク質の発現のレベルは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色、ウェスタンブロット法、ブラッドフォードアッセイ、ローリーアッセイ、ビウレットアッセイ、およびＵＶ吸光などの標準的技法により測定され得る。所望により、本発明は、発現したタンパク質の翻訳後修飾（リン酸化および糖鎖形成を含む）をモニター観察することを包含し得る。
特定の実施態様において、本発明の方法は、目的のタンパク質（例えば、抗体）を高濃度で含有する混合物（例えば、細胞培養物、細胞ライゼートまたは清澄化されたバルク）から汚染物質を効果的に取り除くことを含む。例えば、目的のタンパク質の濃度は約０.５～約５０ｍｇ／ｍｌ（例えば、０.５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍｇ／ｍｌ）の範囲であり得る。
混合物の製造は、第１に、タンパク質を発現する方式に依存する。ある細胞系はタンパク質（例えば、抗体）をその細胞から周辺の増殖培地に直接分泌するが、別の系は抗体を細胞内に保持する。タンパク質が細胞内で産生される場合、細胞を、機械的せん断、浸透圧ショック、および酵素処理などの種々のいずれかの方法を用いて破壊し得る。その破壊により、細胞の中身がすべてホモジネート中に放出され、加えて遠心分離により、または濾過によって取り除かれ得る細胞より小さいフラグメントが産生される。タンパク質の産生を実行している間に、細胞の自然死および細胞内宿主細胞タンパク質の放出のため、同様の問題が、程度は低いが、タンパク質の直接的な放出で生じる。
１の実施態様において、例えば、清澄化されたバルクを製造するために、細胞または細胞破片を混合物より取り除く。本発明の方法は、いずれか適切な方法を利用して、細胞または細胞破片を除去し得る。タンパク質が細胞内で産生される場合、第１工程として、宿主細胞または溶解フラグメントのいずれかの粒子状の破片は、次に、本明細書に記載の方法に従って、精製に供せられる（すなわち、それから目的のタンパク質を精製する）混合物を製造するために、例えば、遠心分離または濾過工程により除去され得る。タンパク質が培地に分泌されるならば、目的のタンパク質がそこから精製される混合物を製造するために、組換え宿主細胞は、例えば、遠心分離、タンジェント流濾過または深層濾過により細胞培地から分離され得る。
もう一つ別の実施態様において、細胞培養物または細胞ライゼートは、第１に宿主細胞を除去することなく、直接使用される。実際、本発明の方法は、分泌されたタンパク質と、宿主細胞の懸濁液とを含む混合物を用いるのに特によく適している。
本発明を次に実施例を用いてさらに説明するが、これはさらなる限定として解釈されるべきではない。本願を通して引用されるすべての図面およびすべての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、その全体が出典明示により明示的に本明細書に組み込まれる。
実施例１
本明細書に記載の方法は、蛍光色素で機能性を付与した金ナノ粒子を用いてクロマトグラフィー樹脂の全疎水性を特徴付けるための技法を説明する。現在のところ、小さな球状モデルのタンパク質（例えば、リボヌクレアーゼＡ、リゾチーム）の保持時間の測定が、特に疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂では、吸着剤の疎水性を比較するための一般的な方法である（GE Healthcare, Certificate of Analysis of Phenyl Sepharose TM 6 Fast Flow（high sub）, Test and Limits: AS 45-6003-91 Ed. AG 3）。しかしながら、広範囲に及ぶ型のクロマトグラフィーについて、樹脂の疎水性を定量化するための一般的方法が不足したままであり、切望されている。表面の疎水性を測定するための蛍光色素が、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）樹脂の集中（lumped）疎水性を特徴付けるのに利用されてきた（Chen Z、Huang C、Chennamsetty N、Xu X、Li ZJ.、J Chromatogr A. 2016, 1460: 110-122）。使用される色素の大きさが小さいため（通常、＜１０００ダルトン）、疎水性樹脂の表面のプローブは、より大きな（通常、＞１０,０００ダルトン）生物製剤のタンパク質に等しくアクセスできない。加えて、蛍光色素の電荷特性もまた、樹脂の疎水性試験に影響を及ぼし、結果を複雑なものにし得る。そこで、本発明者らは、本方法において、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＮＨＳ（帯電していない疎水性を感知する蛍光色素）で金ナノ粒子（ＧＮＰ）に機能性を付与することにより、新たなプローブを製造した。ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは非極性（疎水性）環境において蛍光シグナルを発し（Dorh N、Zhu S、Dhungana KB、Pati R、Luo FT、Liu H、Tiwari A.、Sci Rep. 2015； 5: 18337）、それに対してＧＮＰは標的生体高分子（例えば、モノクローナル抗体、ｍＡｂ）の場合と同様の立体障害を提供する（Robertson J、Rizzello L、Avila-Olias M、Gaitzsch J、Contini C、Magon M、Renshaw S、およびBattagliab G、Sci Rep. 2016；6: 27494）。ＧＮＰ－ＢＯＤＩＰＹコンジュゲートは、ＢＯＩＤＰＹ ＦＬ ＮＨＳ分子のＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）基をＧＮＰ表面に予め結合させた一級アミン基と架橋させることで製造された。データは、新たなプローブが、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、アフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）およびミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭ）樹脂などの他の型の樹脂と同様の適用の可能性がある、ＨＩＣおよびＣＥＸ樹脂の全疎水性を定量化し得ることを示した。この方法はさらなる用途に最適化され得る。例えば、立体障害作用は、異なる大きさのＧＮＰを用いることで調整され、種々の標的分子のためにアクセス可能な樹脂表面の疎水性を測定し得る。
ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＮＨＳで金ナノ粒子（ＧＮＰ）に機能性を付与する模式図を図１に示す。
第１の実験にて、本出願人は、この方法がＨＩＣ樹脂の全疎水性を定量化し得ることを実証した。ＧＮＰ－ＢＯＤＩＰＹ方法による疎水性の順位（Hexyl-650C＞Butyl-650C＞Phenyl-650C）は樹脂販売業者が主張する順位とよく一致する。図２を参照のこと。
第２の実験にて、本出願人は、この方法がＣＥＸ樹脂の全疎水特性を定量化し得ることを実証した。ＧＮＰ－ＢＯＤＩＰＹ方法で様々な販売業者から入手したＣＥＸ樹脂の疎水性を順位付けた（POROS XS＞Fractogel SE＞Capto SP ImpRes）。図３を参照のこと。
第３の実験にて、本出願人は、この方法が異なるベースマトリックス材料で製造される樹脂（ＣＥＸおよびＨＩＣの両方）について特にその全疎水性を比較するのに使用されることを実証した。図４を参照のこと。
第４の実験にて、本出願人は、ＧＮＰの大きさ（すなわち、直径）が、立体障害作用およびそのクロマトグラフィー樹脂のアクセス可能な疎水性に対する影響を調べるための調整可能なパラメーターとして使用されることを実証した。図５を参照のこと。
次に、本出願人は、実際に有意性のある、以下の実験を行った。
Ａ． クロマトグラフィー方法の開発
このツールは、クロマトグラフィー（特に、ポリッシング（polishing）工程）方法の開発およびパラメータの最適化を容易にする。ＣＥＸ樹脂の疎水性は、治療用タンパク質（例えば、ｍＡｂ）の製品品質への影響を通して重要な役割を果たす。例えば、使用される樹脂および溶液の条件に応じて、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４ ｍＡｂは、バインド／エリュート（bind/elute）またはフロー／スルー（flow/through）モードのいずれかにて操作されるＣＥＸ工程にわたって高分子量（ＨＭＷ）凝集体を形成し得る。結合したＩｇＧ分子にアクセス可能な樹脂表面の疎水性が、ＣＥＸ工程でのｍＡｂの凝集傾向と良好な相関関係にあることが判明した。ここで開発されたツールは、最適なカラム性能および製品品質を獲得する、ＣＥＸ方法の開発と最適化を助成するのに使用され得る。
図６は結合したｍＡｂ分子にアクセス可能な樹脂の疎水性表面の影響を示す。ｍＡｂ１はＩｇＧ１であり、ｍＡｂ２はＩｇＧ４である。プールＨＭＷとロードＨＭＷとの割合は凝集形態を示す。割合＞１はカラムでの凝集を示唆する。
Ｂ． クロマトグラフィーの型に依存しない樹脂疎水性アッセイ
このアッセイでは、簡単な操作と、極めて少量の樹脂のサンプルを必要とする。それは、クロマトグラフィーの型（ＨＩＣ、ＣＥＸ、ＡＥＸ、ＭＭ、ＡＣ等）に関係なく、広範囲に及ぶ樹脂の疎水性を比較するのに用いることのできる、適切な感度を提示する。本明細書に記載の手順を用いると、樹脂の全疎水性は、６０分間の実行時間内に、約５０μＬの樹脂（沈降容量）を用いて定量化され得る。
樹脂疎水性を試験するプロトコルの一例を以下に示す。
１． ２５ｍＭ ＮａＡｃｅｔａｔｅ、ｐＨ５.５ バッファー中の５０％樹脂のスラリーで１００μＬを製造する；
２． ５μＬの１００μＬ ＧＮＰ－ＢＯＤＩＰＹストックを、沈降した樹脂１μＬに付き１０ｐｇ ＢＯＤＩＰＹを標的として添加する；
３． ２５ｍＭ ＮａＡｃｅｔａｔｅ、ｐＨ５.５ バッファーを最終の５００μＬまで添加する；
４． ３０分間にわたって反転して混合させ、５０００ｘｇで１分間にわたって遠心分離に付す；
５． 上清を除去し、１ｍＬの２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.５）を添加し、１０分間にわたって反転して混合させる；
６． ５０００ｘｇで３分間にわたって遠心分離に付し、上清を完全に取り除く；
７． ５０μＬの２５ｍＭ酢酸ナトリウムのバッファー（ｐＨ５.５）を該樹脂に添加する；
８． 樹脂のスラリーをユニ（Uni）キュベット（Unchained lab, カタログ番号：２０１－１００９）に移し、濾紙を用いて余分な液体を取り除く；
９． オリジナルな樹脂のスラリー（ＧＮＰ－ＢＯＤＩＰＹ不含）を負の対照として用いる；
１０． ユニキュベットをケミドック（ChemiDoc）ＸＲＳ＋（BioRad，カタログ番号：１７０８２６５）装置のプラットフォームに置く；
１１． イメージ・ラボ（Image Lab）ソフトウェア（BioRad，カタログ番号：１７０８２６５）を開き、フィルターとしてフルオロセインを選択する；
１２． ０.１～１.０秒間暴露することで蛍光強度のデータを得る；
１３． 各樹脂の正規化された蛍光強度（サンプルデータから負の対照データを差し引いた値）をプロットし、相対的疎水性を得る。
均等物
当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様の多数の均等物を、慣用的な実験を用いるだけで認識し、あるいは確認できるであろう。かかる均等物は以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。
出典明示による取り込み
本明細書にて引用される、すべての特許、係属中の特許出願、および他の刊行物は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる。

Claims (14)

  1. クロマトグラフィー樹脂の疎水性レベルを測定する方法であって、
    （ａ）フルオロフォアを金ナノ粒子（ＧＮＰ）と混合し、フルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を形成させ；
    （ｂ）そのフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子をクロマトグラフィー樹脂と溶液中で接触させ；
    （ｃ）上清を除去し、そのクロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄し；および
    （ｄ）クロマトグラフィー樹脂の蛍光強度のレベルを定量化する
    ことを含み、
    それによってクロマトグラフィー樹脂の疎水性レベルを測定し、ここで、（ｄ）からの蛍光強度のレベルがクロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを表す、ところの方法。
  2. クロマトグラフィー樹脂が、イオン交換クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、およびミックスモードクロマトグラフィー樹脂より選択される、請求項１に記載の方法。
  3. フルオロフォアが、ボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素、８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、４,４’－ジアニリノ－１,１’－ビナフチル－５,５’－ジスルホン酸（ビス－ＡＮＳ）、６－プロピオニル－２－（Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノ）ナフタレン（ＰＲＯＤＡＮ）、テトラフェニルエテン誘導体、およびニール・レッドより選択される、請求項１に記載の方法。
  4. フルオロフォアがボロン－ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）色素である、請求項３に記載の方法。
  5. 金ナノ粒子の直径が５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍである、請求項１に記載の方法。
  6. ＢＯＤＩＰＹが、ＢＯＩＤＰＹ・ＮＨＳ分子のＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）基をＧＮＰ表面に予め結合させた１級アミンと架橋させることでＧＮＰにコンジュゲートされる、請求項４に記載の方法。
  7. 混合物から目的のタンパク質を精製するためのクロマトグラフィー樹脂の条件を選択し、ここで目的のタンパク質がクロマトグラフィーの間に凝集体の形成をほとんど、または全くしない、方法であって、
    （ａ）フルオロフォアを金ナノ粒子（ＧＮＰ）と混合し、フルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を形成させ；
    （ｂ）そのフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を異なる条件下にてクロマトグラフィー樹脂と溶液中で接触させ；
    （ｃ）上清を除去し、そのクロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄し；
    （ｄ）（ｂ）での異なる条件からのクロマトグラフィー樹脂の蛍光強度のレベルを定量化し；
    （ｅ）異なる条件下でのクロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを測定し、ここで（ｄ）からの蛍光強度のレベルがクロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを示し；および
    （ｆ）クロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルが、目的のタンパク質をクロマトグラフィー精製する間に、凝集体がほとんど、または全く形成されないまでに至る、クロマトグラフィー樹脂の条件を選択する
    ことを含む、方法。
  8. 混合物から目的のタンパク質を精製するための、複数のクロマトグラフィー樹脂からクロマトグラフィー樹脂を選択し、ここで目的のタンパク質がクロマトグラフィーの間に凝集体の形成をほとんど、または全くしない、方法であって、
    （ａ）フルオロフォアを金ナノ粒子（ＧＮＰ）と混合し、フルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を形成させ；
    （ｂ）そのフルオロフォアのコンジュゲートした金ナノ粒子を各クロマトグラフィー樹脂と溶液中で接触させ；
    （ｃ）上清を除去し、そのクロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄し；
    （ｄ）クロマトグラフィー樹脂の蛍光強度のレベルを定量化し；
    （ｅ）クロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを測定し、ここで（ｄ）からの蛍光強度のレベルがクロマトグラフィー樹脂の疎水性のレベルを示し；および
    （ｆ）目的のタンパク質をクロマトグラフィー精製する間に、凝集体がほとんど、または全く形成されないまでに至る、疎水性のレベルを有する、クロマトグラフィー樹脂を選択する
    ことを含む、方法。
  9. 目的のタンパク質がモノクローナル抗体である、請求項７または８に記載の方法。
  10. クロマトグラフィーがカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）である、請求項７または８に記載の方法。
  11. 混合物がアフィニティークロマトグラフィーによって得られる、請求項７または８に記載の方法。
  12. 混合物が、採取された細胞培養流体、細胞培養上清、および訓化細胞培養上清、細胞ライゼート、および清澄化されたバルクより選択される、請求項７または８に記載の方法。
  13. 細胞培養物が哺乳動物細胞培養物である、請求項１２に記載の方法。
  14. 細胞培養物がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物である、請求項１３に記載の方法。
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