CN113646630A

CN113646630A - 测量色谱树脂的疏水性的方法

Info

Publication number: CN113646630A
Application number: CN202080025225.6A
Authority: CN
Inventors: 黄弨; J·J·佩里; 徐晅阔; S·高斯; 李正剑; W·金
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2021-11-12
Also published as: US20220042954A1; WO2020205469A1; EP3948262A1; KR20210144819A; JP2022527493A

Abstract

在某些实施方案中，本发明提供了一种测量色谱树脂的疏水性水平的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种选择用于从混合物中纯化目的蛋白的色谱树脂条件的方法，其中所述目的蛋白在色谱法过程中具有低的或没有聚集形成。在某些实施方案中，本发明提供了一种从多种色谱树脂中选择用于从混合物中纯化目的蛋白的色谱树脂的方法，其中所述目的蛋白在色谱法过程中具有低的或没有聚集形成。

Description

测量色谱树脂的疏水性的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年3月29日提交的美国临时申请号62/826,260的优先权权益，将其通过引用以其整体并入本文。

背景技术

蛋白质的大规模经济纯化是生物制药行业日益重要的问题。治疗性蛋白质典型地使用原核或真核细胞系产生，所述细胞系经工程改造以由含有编码目的蛋白的基因的重组质粒表达所述蛋白质。从供给于细胞的组分混合物、细胞副产物、和蛋白质的聚集体形式中分离出希望的蛋白质至足够的纯度(例如，足以用作人治疗剂)对生物制剂制造商提出了艰巨的挑战。

因此，本领域中需要改善的蛋白质纯化方法，其可以用于加速基于蛋白质的治疗剂(诸如抗体)的大规模加工。

发明内容

在某些实施方案中，本发明提供了一种测量色谱树脂的疏水性水平的方法，其包括：(a)将荧光团与金纳米颗粒(GNP)混合以形成荧光团缀合的金纳米颗粒；(b)使所述荧光团缀合的金纳米颗粒与色谱树脂在溶液中接触；(c)除去上清液，并且将所述色谱树脂用洗涤缓冲液洗涤；以及(d)量化所述色谱树脂的荧光强度水平，从而测量所述色谱树脂的疏水性水平，其中来自(d)的荧光强度水平指示色谱树脂的疏水性水平。

任选地，所述色谱树脂选自离子交换色谱树脂、疏水相互作用色谱树脂、亲和色谱树脂、和混合模式色谱树脂。

任选地，所述荧光团选自硼-联吡咯甲烷(BODIPY)染料、8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)、4,4’-二苯胺基-1,1’-联萘基-5,5’-二磺酸(Bis-ANS)、6-丙酰基-2-(N,N-二甲基氨基)萘(PRODAN)、四苯基乙烯衍生物、和尼罗红(Nile Red)。优选地，所述荧光团是硼-联吡咯甲烷(BODIPY)染料。任选地，所述金纳米颗粒具有5nm、10nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm的直径。任选地，通过将BOIDPY NHS分子的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)基团与预附接在GNP表面上的伯胺基团交联，将所述BODIPY与GNP缀合。可替代地，可以使用其他连接化学将BODIPY与GNP缀合，所述其他连接化学包括生物素-连接至-链霉亲和素；和马来酰亚胺-连接至-巯基。

在某些实施方案中，本发明提供了一种选择用于从混合物中纯化目的蛋白的色谱树脂条件的方法，其中所述目的蛋白在色谱法过程中具有低的或没有聚集形成，所述方法包括：(a)将荧光团与金纳米颗粒(GNP)混合以形成荧光团缀合的金纳米颗粒；(b)在不同条件下使所述荧光团缀合的金纳米颗粒与色谱树脂在溶液中接触；(c)除去上清液，并且将所述色谱树脂用洗涤缓冲液洗涤；(d)量化由(b)中的不同条件得到的所述色谱树脂的荧光强度水平；(e)测量在不同条件下所述色谱树脂的疏水性水平，其中来自(d)的荧光强度水平指示色谱树脂的疏水性水平；以及(f)选择其中所述色谱树脂的疏水性水平导致在所述目的蛋白的色谱纯化过程中低的或没有聚集形成的色谱树脂条件。

任选地，所述荧光团选自硼-联吡咯甲烷(BODIPY)染料、8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)、4,4’-二苯胺基-1,1’-联萘基-5,5’-二磺酸(Bis-ANS)、6-丙酰基-2-(N,N-二甲基氨基)萘(PRODAN)、四苯基乙烯衍生物、和尼罗红。优选地，所述荧光团是硼-联吡咯甲烷(BODIPY)染料。任选地，所述金纳米颗粒具有5nm、10nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm的直径。任选地，通过将BOIDPY NHS分子的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)基团与预附接在GNP表面上的伯胺基团交联，将所述BODIPY与GNP缀合。可替代地，可以使用其他连接化学将BODIPY与GNP缀合，所述其他连接化学包括生物素-连接至-链霉亲和素；和马来酰亚胺-连接至-巯基。

任选地，所述目的蛋白是单克隆抗体。

任选地，所述混合物选自收获的细胞培养液、细胞培养上清液、和经调理的细胞培养上清液、细胞裂解物、和澄清的本体。例如，细胞培养物是哺乳动物细胞培养物(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物)。任选地，所述混合物已通过亲和色谱法获得。

在某些实施方案中，本发明提供了一种从多种色谱树脂中选择用于从混合物中纯化目的蛋白的色谱树脂的方法，其中所述目的蛋白在色谱法过程中具有低的或没有聚集形成，所述方法包括：(a)将荧光团与金纳米颗粒(GNP)混合以形成荧光团缀合的金纳米颗粒；(b)使所述荧光团缀合的金纳米颗粒与每种色谱树脂在溶液中接触；(c)除去上清液，并且将所述色谱树脂用洗涤缓冲液洗涤；(d)量化所述色谱树脂的荧光强度水平；(e)测量所述色谱树脂的疏水性水平，其中来自(d)的荧光强度水平指示所述色谱树脂的疏水性水平；以及(f)选择具有导致在所述目的蛋白的色谱纯化过程中低的或没有聚集形成的疏水性水平的色谱树脂。

任选地，所述目的蛋白是单克隆抗体。

附图说明

图1示出了将BODIPY FL NHS功能化到金纳米颗粒(GNP)上的示意图。

图2示出了通过GNP-BODIPY方法得出的HIC树脂的疏水性排序。

图3示出了通过GNP-BODIPY方法得出的CEX树脂的疏水性排序。

图4示出了通过GNP-BODIPY方法得出的不同基础基质材料的疏水性。

图5示出了对于各种树脂类型，GNP尺寸对可及疏水性的影响。

图6示出了可及于结合的mAb分子的树脂疏水表面的影响。mAb1是IgG1，并且mAb2是IgG4。汇集物(pool)HMW与负载HMW的比率指示聚集形成。比率>1表明柱上聚集。

具体实施方式

任选地，所述目的蛋白是单克隆抗体。

I.定义

为了可以更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本申请中所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本申请进行阐述。

如本文所用，术语“目的蛋白”以其最广泛的意义使用，以包括存在于混合物中的希望纯化的任何蛋白质(天然的或重组的)。此类目的蛋白包括但不限于激素、生长因子、细胞因子、免疫球蛋白(例如，抗体)和含有免疫球蛋白样结构域的分子(例如，含有锚蛋白或纤连蛋白结构域的分子)。

如本文所用，“细胞培养物”是指液体培养基中的细胞。任选地，细胞培养物包含在生物反应器中。细胞培养物中的细胞可以来自任何生物体，包括例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物。在一个具体实施方案中，细胞培养物中的细胞包括用表达构建体转染的细胞，所述表达构建体含有编码目的蛋白(例如，抗体)的核酸。合适的液体培养基包括例如营养培养基和非营养培养基。在一个具体实施方案中，细胞培养物包括在营养培养基中的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，未经受通过例如过滤或离心进行的纯化。

如本文所用，术语“澄清的本体”是指已从其中基本去除颗粒物质的混合物。澄清的本体包含细胞培养物或细胞裂解物，其中已通过例如过滤或离心基本上去除细胞或细胞碎片。

如本文所用，“混合物”包含目的蛋白(希望纯化)和一种或多种污染物，即杂质。在一个实施方案中，混合物由表达目的蛋白(天然或重组地)的宿主细胞或生物体产生。此类混合物包括例如细胞培养物、细胞裂解物和澄清的本体(例如，澄清的细胞培养物上清液)。

如本文所用，术语“分离”和“纯化”可互换使用，并且是指从含有目的蛋白(例如，抗体)的混合物中选择性去除污染物。

如本文所用，术语“污染物”以其最广泛的意义使用，以覆盖混合物内的任何不希望的组分或化合物。在细胞培养物、细胞裂解物或澄清的本体(例如，澄清的细胞培养物上清液)中，污染物包括例如在细胞培养基中存在的宿主细胞核酸(例如，DNA)和宿主细胞蛋白质。宿主细胞污染物蛋白质包括但不限于由宿主细胞天然或重组产生的那些蛋白质以及与目的蛋白相关或由其衍生的蛋白质(例如，蛋白水解片段)和其他过程相关的污染物。在某些实施方案中，使用诸如离心、无菌过滤、深度过滤和切向流过滤等本领域认可的手段将污染物沉淀与细胞培养物分离。

如本文所用，“离心”是在工业和实验室环境中使用的涉及使用离心力以用离心机进行非均匀混合物的沉降的过程。此过程用于分离两种不混溶的液体。例如，在本发明的方法中，可以使用离心以从混合物中去除污染物沉淀，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清的细胞培养物上清液或捕获柱捕获的洗脱汇集物。

如本文所用，“无菌过滤”是使用膜过滤器的过滤方法，所述膜过滤器典型地是孔径为0.2μm以有效去除微生物或小颗粒的过滤器。例如，在本发明的方法中，无菌过滤可以用于从混合物中去除污染物沉淀，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清的细胞培养物上清液或捕获柱捕获的洗脱汇集物。

如本文所用，“深度过滤”是使用深度过滤器的过滤方法，所述深度过滤器的特征典型地在于它们的由于过滤器基质内的一系列孔径而保留颗粒的设计。深度过滤器的容量典型地由基质的深度(例如，10英寸或20英寸)并且因此对固体的容纳容量来定义。例如，在本发明的方法中，深度过滤可以用于从混合物中去除污染物沉淀，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清的细胞培养物上清液或捕获柱捕获的洗脱汇集物。

如本文所用，术语“色谱法”是指通过使混合物通过吸附剂渗滤而将混合物中的目的溶质(例如，目的蛋白)与混合物中的其他溶质分离的过程，所述吸附剂在过程的特定缓冲条件下由于溶质的特性诸如pI、疏水性、尺寸和结构而或多或少强烈地吸附或保留溶质。在本发明的方法中，色谱法可以用于在从混合物中去除沉淀后去除污染物，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清的细胞培养物上清液或捕获柱捕获的洗脱汇集物。

术语“离子交换”和“离子交换色谱法”是指这样的色谱过程，其中在适当的pH和电导率条件下，可电离的目的溶质(例如，混合物中的目的蛋白)与和固相离子交换材料连接(例如，通过共价附接)的带相反电荷的配体相互作用，使得目的溶质与带电荷化合物比混合物中的溶质杂质或污染物更多或更少地非特异性相互作用。混合物中的污染性溶质可以从离子交换材料的柱上洗去，或者与目的溶质相比，更快或更慢地与树脂结合或从树脂中排除。“离子交换色谱法”具体包括阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。

短语“离子交换材料”是指带负电荷的固相(即，阳离子交换树脂或膜)或带正电荷的固相(即，阴离子交换树脂或膜)。在一个实施方案中，可以通过将一种或多种带电荷的配体(或吸附剂)与固相附接(例如，通过共价连接)来提供电荷。可替代地或另外，电荷可以是固相的固有特性(例如，对于具有整体负电荷的二氧化硅的情况)。

“阳离子交换树脂”是指带负电荷的固相，并且其具有游离阳离子用于与经过或通过固相的水溶液中的阳离子进行交换。可以使用与适合于形成阳离子交换树脂的固相附接的任何带负电荷的配体，例如羧酸盐、磺酸盐和如下所述的其他配体。可商购的阳离子交换树脂包括但不限于例如具有基于磺酸盐的基团的那些(例如，MonoS、MiniS、Source 15S和30S、SP Sepharose Fast Flow^TM、高效SP Sepharose、来自GE Healthcare的Capto S、来自Tosoh的Toyopearl SP-650S和SP-650M、来自BioRad的Macro-Prep High S、CeramicHyperD S、Trisacryl M和LS SP和来自Pall Technologies的Spherodex LS SP)；具有基于磺乙基的基团的那些(例如，来自EMD的Fractogel SE、来自Thermo Fisher Scientific的Poros S-10和S-20)；具有基于磺丙基的基团的那些(例如，来自Tosoh的TSK Gel SP 5PW和SP-5PW-HR、来自GE Healthcare的Capto SP ImpRes、来自Thermo Fisher Scientific的POROS HS-20、HS 50和POROS XS)；具有基于磺异丁基的基团的那些(例如，来自EMD的Fractogel EMD SO₃ ^-)；具有基于磺氧基乙基的基团的那些(例如，来自Whatman的SE52、SE53和Express-Ion S)；具有基于羧甲基的基团的那些(例如，来自GE Healthcare的CMSepharose Fast Flow；来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell CM；来自BioRad的Macro-Prep CM；Ceramic HyperD CM；来自Pall Technologies的Trisacryl M CM、Trisacryl LSCM；来自Millipore的Matrx Cellufine C500和C200；来自Whatman的CM52、CM32、CM23和Express-Ion C；来自Tosoh的Toyopearl CM-650S、CM-650M和CM-650C)；具有基于磺酸和羧酸的基团的那些(例如，来自J.T.Baker的BAKERBOND Carboxy-Sulfon)；具有基于羧酸的基团的那些(例如，来自J.T Baker的WP CBX；来自Dow Liquid Separations的DOWEX MAC-3；来自Sigma-Aldrich的Amberlite弱阳离子交换剂、DOWEX弱阳离子交换剂和Diaion弱阳离子交换剂；和来自EMD的Fractogel EMD COO-)；具有基于磺酸的基团的那些(例如，来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell SP、来自Dow Liquid Separations的DOWEX细网强酸阳离子树脂、UNOsphere S、来自J.T.Baker的WP Sulfonic、来自Sartorius的Sartobind S膜、来自Sigma-Aldrich的Amberlite强阳离子交换剂、DOWEX强阳离子和Diaion强阳离子交换剂)；和具有基于正磷酸盐的基团的那些(例如，来自Whatman的P11)。

“阴离子交换树脂”是指带正电荷的固相，因此具有与其附接的一个或多个带正电荷的配体。可以使用与适合形成阴离子交换树脂的固相附接的任何带正电荷的配体，诸如季氨基，可商购的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素，来自Thermo Fisher Scientific的POROS PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50和POROS XQ，来自Sartorius的SartobindQ，MonoQ、MiniQ、Source 15Q和30Q、Q、DEAE和ANX Sepharose Fast Flow、高效QSepharose、Capto Q、QAE SEPHADEX^TM和FAST Q SEPHAROSE^TM(GE Healthcare)，来自J.T.Baker的WP PEI、WP DEAM、WP QUAT，来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell DEAE和Hydrocell QA，来自Biorad的UNOsphere Q、Macro-Prep DEAE和Macro-Prep High Q，Ceramic HyperD Q、ceramic HyperD DEAE、Trisacryl M和LS DEAE，来自PallTechnologies的Spherodex LS DEAE、QMA Spherosil LS、QMA Spherosil M和Mustang Q，来自Dow Liquid Separations的DOWEX细网强碱I型和II型阴离子树脂和DOWEX MONOSPHERE 77(弱碱阴离子)，Intercept Q membrane，来自Millipore的Matrex Cellufine A200、A500、Q500和Q800，来自EMD的Fractogel EMD TMAE、Fractogel EMD DEAE和Fractogel EMDDMAE，来自Sigma-Aldrich的Amberlite I型和II型弱强阴离子交换剂、DOWEX I型和II型弱和强阴离子交换剂、Diaion I型和II型弱和强阴离子交换剂、Duolite，来自Tosoh的TSKgel Q和DEAE 5PW和5PW-HR、Toyopearl SuperQ-650S、650M和650C、QAE-550C和650S、DEAE-650M和650C，来自Whatman的QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-Ion D和Express-Ion Q，以及Sartobind Q(Sartorius corporation，纽约，美国)。

“混合模式离子交换树脂”或“混合模式”是指用阳离子、阴离子和/或疏水部分共价修饰的固相。混合模式离子交换树脂的例子包括BAKERBOND ABX^TM(J.T.Baker；菲利普斯堡，新泽西州)；陶瓷羟磷灰石I型和II型和氟羟磷灰石(BioRad；赫拉克勒斯，加利福尼亚州)；MEP和MBI HyperCel(Pall Corporation；东山(East Hills)，纽约州)；Capto adhere、Capto MMC和Capto MMC ImpRes(GE Healthcare)。

“疏水相互作用色谱树脂”是指用甲基、醚、苯基、丁基、己基和辛基化学品共价修饰的固相。疏水相互作用色谱法是一种分离技术，其使用疏水性的特性将蛋白质彼此分离。在这种类型的色谱法中，疏水性基团诸如甲基、醚、苯基、丁基、己基和辛基与固定柱附接。通过在其表面上具有疏水性氨基酸侧链的柱的蛋白质能够与柱上的疏水性基团相互作用并且结合。疏水相互作用色谱树脂的例子包括：(1)丁基FF、丁基HP、辛基FF、苯基FF、苯基HP、苯基FF(high sub)、苯基FF(low sub)、Capto苯基ImpRes、Capto苯基(high sub)、Capto辛基、Capto丁基ImpRes、Capto丁基(GE Healthcare，乌普萨拉，瑞典)；(2)ToyopearlSuper丁基-550C、Toyopearl己基-650C、丁基-650C、苯基-650C、丁基600M、苯基-600M、PPG-600M、丁基-650M、苯基-650M、醚-650M、丁基-650S、苯基-650S、醚-650S、TSKgel苯基-5PW、TSKgel醚-5PW(Tosoh Bioscience，东京，日本)；(3)Macro-Prep-丁基、Macro-Prep-甲基(Bio-Rad)；(4)Sartobind苯基(Sartorius corporation，纽约，美国)；和(5)POROS乙基、POROS苄基、POROS苄基Ultra(Thermo Fisher Scientific)。

II.目的蛋白

在某些方面，本发明的方法可以用于纯化任何目的蛋白，包括但不限于具有制药、诊断、农业、和/或可用于商业、实验或其他应用的多种其他特性中的任一种的蛋白质。另外，目的蛋白可以是蛋白质治疗剂。在某些实施方案中，可以加工或修饰使用本发明方法纯化的蛋白质。例如，根据本发明的目的蛋白可以是糖基化的。

因此，本发明可以用于培养细胞以生产任何治疗性蛋白质，诸如药学或商业相关的酶、受体、受体融合蛋白、抗体(例如，单克隆或多克隆抗体)、抗体的抗原结合片段、Fc融合蛋白、细胞因子、激素、调节因子、生长因子、凝血/凝结因子、或抗原结合剂。以上列表的蛋白质在本质上仅是示例性的，并且不旨在作为限制性陈述。本领域普通技术人员将知道可以根据本发明生产其他蛋白质，并且将能够使用本文公开的方法来生产此类蛋白质。

在本发明的一个具体实施方案中，使用本发明方法纯化的蛋白质是抗体。术语“抗体”以最广泛的意义使用，以包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、抗体片段、免疫粘附素和抗体-免疫粘附素嵌合体。

“抗体片段”包括全长抗体的至少一部分并且典型地包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)₂和Fv片段；单链抗体分子；双抗体；线性抗体；以及由经工程改造的抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“单克隆抗体”在常规意义上使用，以指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，使得构成所述群体的个体抗体除了可能以少量存在的可能天然发生的突变外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。这与多克隆抗体制剂形成对比，多克隆抗体制剂典型地包括针对抗原的不同决定簇(表位)的不同抗体，而单克隆抗体则针对抗原上的单一决定簇。在描述抗体时，术语“单克隆”指示抗体的特征在于是从基本上同质的抗体群体中获得的，并且不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，在本发明中使用的单克隆抗体可以使用首先由Kohler等人,Nature 256:495(1975)描述的常规杂交瘤技术产生，或者它们可以使用重组DNA方法(参见，例如美国专利号4,816,567)来制造。也可以例如使用Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)；以及美国专利号5,223,409；5,403,484；5,571,698；5,427,908 5,580,717；5,969,108；6,172,197；5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；和6,593,081)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。

本文所述的单克隆抗体包括“嵌合”和“人源化”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述一条或多条链的其余部分与衍生自另一种物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们展现出希望的生物活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。非人(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基被来自非人物种(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的具有所希望的特异性、亲和力和能力的高变区残基(供体抗体)替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步精改抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个并且典型地两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环与非人免疫球蛋白的高变环对应，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。

嵌合或人源化抗体可以基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从感兴趣的鼠杂交瘤来获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以含有非鼠(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域中已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区(参见例如，Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域中已知的方法将鼠CDR区插入人框架中(参见例如，Winter的美国专利号5,225,539，以及Queen的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

本文所述的单克隆抗体还包括“人”抗体，其可以从各种来源(包括例如从人患者的血液)分离，或使用转基因动物重组制备。此类转基因动物的例子包括具有人重链转基因和人轻链转染色体的

(Medarex,Inc.，普林斯顿，美国新泽西州)(参见WO 02/43478)、

(Abgenix,Inc.，弗里蒙特，加利福尼亚州；描述于例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中)、以及

(Medarex,Inc.；描述于例如Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology5:647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等人(1994)International Immunology6:579-591；和Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851，美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；5,545,807；和PCT公开号WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962、Korman等人的WO 01/14424)。本发明的人单克隆抗体也可以使用SCID小鼠来制备，在所述SCID小鼠中人免疫细胞已经被重构，使得在免疫时可以产生人抗体反应。例如，Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中描述了此类小鼠。

III.含有目的蛋白的混合物

本发明的方法可以应用于含有目的蛋白的任何混合物。在一个实施方案中，混合物从表达有待纯化的蛋白质(例如，天然地或通过基因工程改造)的活细胞中获得或由其产生。任选地，细胞培养物中的细胞包括用表达构建体转染的细胞，所述表达构建体含有编码目的蛋白的核酸。基因工程改造细胞以产生蛋白质的方法是本领域熟知的。参见例如，Ausabel等人编辑(1990),Current Protocols in Molecular Biology(威利(Wiley)，纽约州)和美国专利号5,534,615和4,816,567，将其各自通过引用特定地并入本文。此类方法包括将编码蛋白质并且允许表达蛋白质的核酸引入活宿主细胞中。这些宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞或优选地在培养物中生长的动物细胞。细菌宿主细胞包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞。合适的大肠杆菌菌株的例子包括：HB101、DH5α、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539、以及不能切割外源DNA的任何大肠杆菌菌株。可以使用的真菌宿主细胞包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)和曲霉属(Aspergillus)细胞。可以使用的昆虫细胞包括但不限于家蚕(Bombyx mori)、木纹夜蛾(Mamestra drassicae)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophilia melanogaster)。

许多哺乳动物细胞系是用于表达目的蛋白的合适宿主细胞。哺乳动物宿主细胞系包括，例如，COS、PER.C6、TM4、VERO076、DXB11、MDCK、BRL-3A、W138、Hep G2、MMT、MRC 5、FS4、CHO、293T、A431、3T3、CV-1、C3H10T1/2、Colo205、293、HeLa、L细胞、BHK、HL-60、FRhL-2、U937、HaK、Jurkat细胞、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、M1x、鼠骨髓瘤(例如，SP2/0和NS0)和C2C12细胞，以及转化的灵长类动物细胞系、杂交瘤、正常二倍体细胞和源自原代组织和原代外植体的体外培养的细胞株。可以使用本领域技术人员熟知的方法(例如，通过转化、病毒感染和/或选择)建立新的动物细胞系。能够表达目的蛋白的任何真核细胞可以用于所公开的细胞培养方法。许多细胞系可从商业来源诸如美国模式培养物集存库(American TypeCulture Collection)(ATCC)获得。在本发明的一个实施方案中，细胞培养物，例如大规模细胞培养物，使用杂交瘤细胞。产生抗体的杂交瘤细胞的构建是本领域中熟知的。在本发明的一个实施方案中，细胞培养物，例如大规模细胞培养物，使用CHO细胞来产生目的蛋白，诸如抗体(参见例如，WO 94/11026)。本领域中已知多种类型的CHO细胞，例如CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DXB11、CHO/dhfr^-和CHO-S。

在某些实施方案中，本发明考虑，在从细胞培养物中纯化目的蛋白之前，监测生长细胞培养物的特定条件。监测细胞培养条件允许确定细胞培养物是否以足够的水平产生目的蛋白。例如，定期取出培养物的小等分试样进行分析，以便监测某些细胞培养条件。有待监测的细胞培养条件包括但不限于温度、pH、细胞密度、细胞活力、积分的活细胞密度、乳酸水平、铵水平、同渗重摩和表达的蛋白质的滴度。本领域技术人员熟知许多用于测量此类条件/标准的技术。例如，可以使用血细胞计数器、自动细胞计数装置(例如，库尔特计数器，Beckman Coulter Inc.，富勒顿，加利福尼亚州)或细胞密度检查(例如，CEDEX.RTM.，Innovatis，马尔文，宾夕法尼亚州)。可以通过用台盼蓝染色培养样品来确定活细胞密度。可以例如用BioProfile 400化学分析仪(Nova Biomedical，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)测量乳酸水平和铵水平，所述化学分析仪对细胞培养基中的关键营养素、代谢物和气体进行实时在线测量。细胞培养物的同渗重摩可以通过例如冰点渗透压计来测量。HPLC可以用于确定例如乳酸、铵或所表达的蛋白质的水平。在本发明的一个实施方案中，表达的蛋白质的水平可以通过使用例如蛋白A HPLC来确定。可替代地，可以通过标准技术(诸如SDS-PAGE凝胶的考马斯染色、蛋白质印迹、Bradford测定、Lowry测定、biuret测定和UV吸光度来确定表达的蛋白质的水平。任选地，本发明可以包括监测表达的蛋白质的翻译后修饰，包括磷酸化和糖基化。

在一个特定实施方案中，本发明的方法包括从含有高浓度目的蛋白(例如，抗体)的混合物(例如细胞培养物、细胞裂解物或澄清的本体)中有效去除污染物。例如，目的蛋白的浓度范围可以是从约0.5至约50mg/ml(例如，0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/ml)。

混合物的制备最初取决于蛋白质的表达方式。一些细胞系统直接将蛋白质(例如，抗体)从细胞分泌到周围的生长培养基中，而其他系统则将抗体保留在细胞内。对于细胞内产生的蛋白质，可以使用多种方法(诸如机械剪切、渗压震扰和酶处理)中的任何一种来破坏细胞。破坏使细胞的全部内容物释放到匀浆中，并且另外产生亚细胞碎片，所述碎片可以通过离心或过滤去除。在蛋白质生产运行的过程中，由于细胞的自然死亡和细胞内宿主细胞蛋白质的释放，直接分泌的蛋白质会出现类似的问题，尽管程度较轻。

在一个实施方案中，从混合物中去除细胞或细胞碎片，例如以制备澄清的本体。本发明的方法可以使用任何合适的方法来去除细胞或细胞碎片。如果蛋白质是在细胞内产生的，则作为第一步骤，可以通过例如离心或过滤步骤去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解的片段)，以便制备混合物，然后根据本文所述的方法使所述混合物经受纯化(即，从其中纯化目的蛋白)。如果蛋白质是分泌到培养基中的，则可以通过例如离心、切向流过滤或深度过滤将重组宿主细胞与细胞培养基分离，以便制备混合物，从其中纯化目的蛋白。

在另一个实施方案中，直接使用细胞培养物或细胞裂解物而无需首先去除宿主细胞。确实，本发明的方法特别好地适于使用包含分泌的蛋白质和宿主细胞悬浮液的混合物。

通过以下实施例进一步说明本公开文本，所述实施例不应被解释为进一步限制。将本申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用以其整体明确地并入本文。

实施例1

本文的方法描述了一种使用用荧光染料功能化的金纳米颗粒表征色谱树脂的整体疏水性的技术。目前，小球状模型蛋白(例如，核糖核酸酶A、溶菌酶)的保留时间测量是比较吸附剂的疏水性的标准方法，特别是对于疏水相互作用色谱(HIC)树脂(GE Healthcare,Certificate of Analysis of Phenyl Sepharose^TM6Fast Flow(high sub),测试和限制：AS 45-6003-91Ed.AG 3)。然而，对于宽范围的色谱类型，量化树脂疏水性的通用方法仍然缺乏并且是非常希望的。已使用用于测量表面疏水性的荧光染料来表征阳离子交换色谱(CEX)树脂的集总(lumped)疏水特性(Chen Z,Huang C,Chennamsetty N,Xu X,Li ZJ.JChromatogr A.2016,1460:110-122)。由于所使用的染料的尺寸小(通常<1000道尔顿)，被探测的疏水性树脂表面不同样接近较大的生物制剂蛋白质(通常>10,000道尔顿)。另外，荧光染料的电荷特性也可能影响树脂疏水性测试，并且使结果复杂化。因此，在这种方法中，我们通过将BODIPY FL NHS(不带电荷的疏水性感应荧光染料)功能化到金纳米颗粒(GNP)上来制备一种新探针。BODIPY FL在非极性(疏水性)环境中发射荧光信号(Dorh N,Zhu S,Dhungana KB,Pati R,Luo FT,Liu H,Tiwari A.Sci Rep.2015；5:18337.)，而GNP提供与目标生物大分子(例如，单克隆抗体，mAb)的空间位阻相似的空间位阻(Robertson J,Rizzello L,Avila-Olias M,Gaitzsch J,Contini C,MagońM,Renshaw S和Battagliab G,Sci Rep.2016；6:27494.)。通过将BOIDPY FL NHS分子的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)基团与预附接在GNP表面上的伯胺基团交联来制备GNP-BODIPY缀合物。数据显示，新探针能够量化HIC和CEX树脂的整体疏水性，HIC和CEX树脂具有与其他树脂类型诸如阴离子交换色谱法(AEX)、亲和色谱法(AC)和混合模式色谱法(MM)树脂类似的潜在应用。这种方法可以针对更多应用进行优化。例如，可以通过使用不同尺寸的GNP来调节空间位阻效应以测量针对各种目标分子的可及树脂表面疏水性。

图1示出了将BODIPY FL NHS功能化到金纳米颗粒(GNP)上的示意图。

在第一个实验中，申请人证明了此方法能够量化HIC树脂的整体疏水性。通过GNP-BODIPY方法得出的疏水性排序(己基-650C>丁基-650C>苯基-650C)与树脂供应商所声称的非常一致。参见图2。

在第二个实验中，申请人证明了此方法能够量化CEX树脂的整体疏水特性。GNP-BODIPY方法对来自不同供应商的CEX树脂(POROS XS>Fractogel SE>Capto SP ImpRes)的疏水性进行了排序。参见图3。

在第三个实验中，申请人证明了此方法用于比较对于由不同基础基质材料制成的树脂(CEX和HIC两者)的整体疏水特性。参见图4。

在第四个实验中，申请人证明了GNP尺寸(即，直径)用作可调节参数来探测空间位阻效应以及其对色谱树脂的可及疏水性的影响。参见图5。

接下来，申请人进行以下具有实用意义的实验。

A.色谱过程开发

此工具有助于色谱(尤其是精制步骤)过程开发和参数优化。CEX树脂的疏水特性通过影响治疗性蛋白质(例如，mAb)的产品质量而发挥关键作用。例如，取决于所使用的树脂和溶液条件，IgG1和IgG4 mAb可以在以结合/洗脱或流动/通过模式操作的CEX步骤中形成高分子量(HMW)聚集体。发现可及于结合的IgG分子的树脂表面疏水性与CEX步骤中的mAb聚集倾向具有良好的相关性。这里开发的工具可以用于帮助开发和优化CEX过程，其实现最佳的柱性能和产品质量。

B.独立于色谱类型的树脂疏水性测定

测定需要简单的程序和非常小的树脂样品量。它提供了足够的灵敏度，其可以用于比较宽范围的树脂的疏水特性，无论色谱类型如何(例如，HIC、CEX、AEX、MM、AC等)。使用此处所述的说明，可以在60分钟的运行时间内使用约50μL树脂(沉降体积)量化树脂的整体疏水性。

下面示出了树脂疏水性测试方案的例子。

1.用在25mM乙酸钠pH 5.5缓冲液中的50％树脂浆料制备100μL

2.添加将5μL的100μL GNP-BODIPY储备液至目标10pg BODIPY/μL沉降树脂

3.添加25mM乙酸钠pH 5.5缓冲液至最终500μL

4.翻转混合30min并且在5000x g下离心1min

5.去除上清液，并且添加1mL 25mM乙酸钠pH 5.5以翻转混合10min

6.在5000x g下离心3min，并且完全去除上清液

7.将50μL 25mM乙酸钠pH 5.5缓冲液添加到树脂中

8.将树脂浆料转移到Uni小池(Unchained lab，目录号：201-1009)中，并且使用滤纸去除多余的液体

9.使用原始树脂浆料(不含GNP-BODIPY)作为阴性对照

10.将Uni小池放置在ChemiDoc XRS+(BioRad，目录号：1708265)仪器的平台上

11.打开Image Lab软件(BioRad，目录号：1708265)并且选择荧光素作为筛选条件(filter)

12.通过暴露0.1至1.0秒获得荧光强度数据

13.绘制每种树脂的归一化荧光强度(样品数据减去阴性对照数据)以获得相对疏水性。

等效方案

仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的发明的特定实施方案的许多等效方案。此类等效方案旨在被所附权利要求涵盖。

通过引用并入

将本文提及的所有专利、未决专利申请和本文引用的其他出版物均通过引用以其整体特此并入。

Claims

1.一种测量色谱树脂的疏水性水平的方法，其包括：

a)将荧光团与金纳米颗粒(GNP)混合以形成荧光团缀合的金纳米颗粒；

b)使所述荧光团缀合的金纳米颗粒与色谱树脂在溶液中接触；

c)除去上清液，并且将所述色谱树脂用洗涤缓冲液洗涤；以及

d)量化所述色谱树脂的荧光强度水平，

从而测量所述色谱树脂的疏水性水平，其中来自(d)的荧光强度水平指示色谱树脂的疏水性水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述色谱树脂选自离子交换色谱树脂、疏水相互作用色谱树脂、亲和色谱树脂、和混合模式色谱树脂。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光团选自硼-联吡咯甲烷(BODIPY)染料、8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)、4,4’-二苯胺基-1,1’-联萘基-5,5’-二磺酸(Bis-ANS)、6-丙酰基-2-(N,N-二甲基氨基)萘(PRODAN)、四苯基乙烯衍生物、和尼罗红。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述荧光团是硼-联吡咯甲烷(BODIPY)染料。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述金纳米颗粒具有5nm、10nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm的直径。

6.根据权利要求4所述的方法，其中通过将BOIDPY NHS分子的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)基团与预附接在GNP表面上的伯胺基团交联，将所述BODIPY与GNP缀合。

7.一种选择用于从混合物中纯化目的蛋白的色谱树脂条件的方法，其中所述目的蛋白在色谱法过程中具有低的或没有聚集形成，所述方法包括：

b)在不同条件下使所述荧光团缀合的金纳米颗粒与色谱树脂在溶液中接触；

c)除去上清液，并且将所述色谱树脂用洗涤缓冲液洗涤；

d)量化由(b)中的不同条件得到的所述色谱树脂的荧光强度水平；

e)测量在不同条件下所述色谱树脂的疏水性水平，其中来自(d)的荧光强度水平指示色谱树脂的疏水性水平；以及

f)选择其中所述色谱树脂的疏水性水平导致在所述目的蛋白的色谱纯化过程中低的或没有聚集形成的色谱树脂条件。

8.一种从多种色谱树脂中选择用于从混合物中纯化目的蛋白的色谱树脂的方法，其中所述目的蛋白在色谱法过程中具有低的或没有聚集形成，所述方法包括：

b)使所述荧光团缀合的金纳米颗粒与每种色谱树脂在溶液中接触；

c)除去上清液，并且将所述色谱树脂用洗涤缓冲液洗涤；

d)量化所述色谱树脂的荧光强度水平；

e)测量所述色谱树脂的疏水性水平，其中来自(d)的荧光强度水平指示所述色谱树脂的疏水性水平；以及

f)选择具有导致在所述目的蛋白的色谱纯化过程中低的或没有聚集形成的疏水性水平的色谱树脂。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述目的蛋白是单克隆抗体。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述色谱法是阳离子交换色谱法(CEX)。

11.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述混合物已通过亲和色谱法获得。

12.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述混合物选自收获的细胞培养液、细胞培养上清液、和经调理的细胞培养上清液、细胞裂解物、和澄清的本体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞培养物是哺乳动物细胞培养物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞培养物是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。