TW201345925A - 新穎抗ｓｉｇｌｅｃ－１５抗體 - Google Patents

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Yoshiharu Hiruma
Jun Hasegawa
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Daiichi Sankyo Co Ltd
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Abstract

本發明之課題係提供一種用於治療及/或預防骨代謝異常之醫藥組成物，其係以在破骨細胞中高度表現之基因所編碼之蛋白質為標的。本發明之解決手段為提供一種包含抗體之醫藥組成物，該抗體具有特異地識別人類Siglec-15，並抑制破骨細胞之形成之活性。

Description

新穎抗SIGLEC-15抗體
本發明係關於作為骨代謝異常之治療及/或預防藥之有用物質，及骨代謝異常之治療及/或預防方法。
已知骨，為了本身之形態變化及維持血中鈣濃度，係經常重複形成及吸收而進行重建之動態器官。在正常之骨中，藉由骨母細胞之骨形成與藉由破骨細胞之骨吸收係呈平衡關係，使骨量保持恆定。另一方面，若骨形成與骨吸收之平衡關係崩潰，則造成骨質疏鬆症等骨代謝異常(例如，參照非專利文獻1及2)。
就調節骨代謝之因子而言，多種全身性激素或局部性細胞激素被報告，藉由此等因子之共同作用以實行骨之形成及維持(例如，參照非專利文獻1及3)。就隨年齡增加之骨組織變化而言，雖然骨質疏鬆症之發病廣為人知，但其致病機轉分歧，涵蓋性激素之分泌降低或其受體異常、骨局部之細胞激素表現變動、老化基因之表現、破骨細胞或骨母細胞之分化或功能不全等，難以解釋成是隨年齡增加之單純生理現象。原發性骨質疏鬆症雖可大致分類為因雌激素(estrogen)之分泌降低而 引起之停經後骨質疏鬆症，及隨年齡增加出現之老人性骨質疏鬆症，然而為了致病機轉之解明及治療藥開發，必須對於骨吸收及骨形成之調節機制展開基礎的研究。
破骨細胞為來自造血幹細胞之多核細胞，藉由在與骨之接著面釋放氯離子及氫離子，將細胞與骨之接著面的間隙酸性化，同時分泌為酸性蛋白酶之組織蛋白酶K(cathepsin K)等(例如，參照非專利文獻4)。其結果，引起磷酸鈣之分解、酸性蛋白酶之活性化及骨基質蛋白質之分解，而進行骨吸收。
已明白破骨細胞之前驅細胞，受到在骨表面之骨母細胞/基質細胞之細胞膜上所表現之RANKL(NF-κB配體之受體活化因子(receptor activator of NF-κB ligand))之刺激，而分化為破骨細胞(例如，參照非專利文獻5及6)。RANKL為骨母細胞/基質細胞所產生之膜蛋白質，已明白其之表現係由骨吸收因子調節，以及RANKL可誘導破骨細胞之前驅細胞分化為成熟多核破骨細胞等(例如，參照非專利文獻5及7)。再者，發現剔除RANKL基因之小鼠將引發類骨質石化症之病態，此可證明RANKL為生理上之破骨細胞分化誘導因子(例如，參照非專利文獻8)。
就意圖治療骨代謝疾病或縮短治療期間之醫藥品而言，可使用雙膦酸鹽(bisphosphonate)、活性型維生素D3、抑鈣素(calcitonin)及其衍生物、雌二醇(estradiol)等之激素、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑(selective estrogen receptor modulators))、異丙黃酮 (ipriflavone)、維生素K2(四烯甲萘醌)、PTH及鈣製劑等。然而，此等藥劑在治療結果方面未必均令人滿意，故期待開發治療效果更高之藥劑。
免疫系細胞之細胞膜上被含唾液酸之糖鏈等多種糖鏈高度地覆蓋，並可藉由各種糖鏈結合蛋白質來識別。唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins，以下稱為「Siglecs」)係屬可識別含唾液酸之糖鏈並可與之結合的I型膜蛋白家族。Siglecs多表現在免疫系細胞之細胞膜上，雖被認為能識別同樣存在於免疫系細胞之細胞膜上之唾液酸，調節細胞間之相互作用、細胞功能，並參與免疫反應(例如，參照非專利文獻9)，但生理功能不明之Siglecs分子亦多。Siglec-15(唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素15)係新近被報導屬於Siglecs之分子(例如，參照非專利文獻10)，與被稱為CD33L3(CD33 molecule-like 3)之分子相同。已明瞭該分子在從魚類進化至人類之過程中保存度高，且在人類脾臟及淋巴結中之樹狀細胞/巨噬細胞系之細胞中高度表現。又，使用唾液酸探針進行之結合試驗的結果明示人類Siglec-15與Neu5Acα2-6GalNAc結合，小鼠Siglec-15進一步與Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc結合等(例如，參照非專利文獻10)。至最近為止，Siglec-15之生理性角色雖不明，然而據報導伴隨破骨細胞之分化、成熟，Siglec-15之表現亢進，若藉由RNA干擾，則可使Siglec-15之表現降低，抑制破骨細胞之分化(例如，參照專利文獻1)。再者，關於抗Siglec-15抗體在破骨細胞 分化方面之作用，最先係在專利文獻2(於2009年4月16日公開)及專利文獻3(於2010年10月14日公開)中被明示。再者，在專利文獻4中雖揭示抑制破骨細胞之分化之抗體，不過探索展現更強作用之抗體仍在持續進行中。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第WO07/093042號小冊子
[專利文獻2]國際公開第WO09/048072號小冊子
[專利文獻3]國際公開第WO10/117011號小冊子
[專利文獻4]國際公開第WO11/041894號小冊子
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Endocrinological Review, (1992) 13, p66-80
[非專利文獻2]Principles of Bone Biology, Academic Press, New York, (1996) p87-102
[非專利文獻3]Endocrinological Review, (1996)17, p308-332
[非專利文獻4]American Journal of Physiology, (1991)260, C1315-C1324
[非專利文獻5]Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998)95, p3597-3602、
[非專利文獻6]Cell, (1998)93, p165-176
[非專利文獻7]Journal of Bone and Mineral Research, (1998)23, S222
[非專利文獻8]Nature, (1999)397, p315-323
[非專利文獻9]Nature Reviews Immunology, (2007)7, p255-266
[非專利文獻10]Glycobiology, (2007)17, p838-846
本發明之目的係提供可阻礙在骨質疏鬆症、關節風濕症、癌之骨轉移等中出現各種骨代謝異常時特異性地表現之基因、破骨細胞之分化成熟及活性的物質，以及提供骨代謝異常之治療及/或預防劑。
本發明人等，以探索具有骨代謝異常之治療及/或預防效果之物質為目的，針對破骨細胞之分化、成熟及活化之機制(mechanism)之解明進行研究，結果發現伴隨破骨細胞之分化、成熟，Siglec-15基因之表現上升。又，本發明人等發現藉由與Siglec-15特異性地結合之抗體可抑制破骨細胞之分化。再者，發明人等將所得到之大鼠抗小鼠Siglec-15抗體進行人類化(humarized)，於是完成本發明。
亦即，本發明包含以下之發明：
(1)一種抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為：重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2、CDRH3之可變區域，該CDRH1包含序列編號31所示之胺基酸序列，該CDRH2包含序列編號32所示之胺基酸序列，該CDRH3包 含序列編號33所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中1至3個之胺基酸被取代之胺基酸序列；及輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2、CDRL3之可變區域，該CDRL1包含序列編號34所示之胺基酸序列、該CDRL2包含序列編號35所示之胺基酸序列、該CDRL3包含序列編號36所示之胺基酸序列。
(2)一種抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為：重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2、CDRH3之可變區域，該CDRH1包含序列編號31所示之胺基酸序列，該CDRH2包含序列編號32所示之胺基酸序列，該CDRH3包含序列編號33所示之胺基酸序列或序列編號49所示之胺基酸序列；及輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2、CDRL3之可變區域，該CDRL1包含序列編號34所示之胺基酸序列，該CDRL2包含序列編號35所示之胺基酸序列，該CDRL3包含序列編號36所示之胺基酸序列。
(3)如(1)或(2)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號2所示之胺基酸序列之第1至121號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號4所示之胺基酸序列之第1至109號之胺基酸殘基。
(4)如(1)至(3)記載之抗體之抗原結合片段，其係選自包含Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv之群組。
(5)如(1)至(3)記載之抗體，其係scFv。
(6)如(1)至(4)之任一項記載之抗體或該抗體之抗原 結合片段，其係嵌合抗體。
(7)如(6)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號8所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號10所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
(8)如(1)、(2)或(4)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其係被人類化。
(9)如(6)或(8)記載之抗體，其中重鏈含有人類免疫球蛋白G2重鏈之恆定區域，輕鏈含有人類免疫球蛋白κ輕鏈之恆定區域。
(10)一種抗體或該抗體之抗原結合片段，其係可抑制破骨細胞之形成及/或破骨細胞所引起之骨吸收的抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為含有：(a)選自包含以下之胺基酸序列之群組的重鏈可變區域序列：a1)包含序列編號12所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a3)包含序列編號16所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a4)包含序列編號18所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a5)包含序列編號20所示之胺基酸序列之第20至140 號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a6)包含序列編號22所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a7)包含序列編號38所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a8)包含序列編號40所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a9)包含序列編號42所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a10)包含序列編號44所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a11)具有與選自a1)至a10)之任一種胺基酸序列至少95%之同源性的胺基酸序列；a12)具有與選自a1)至a10)之任一種胺基酸序列至少99%之同源性的胺基酸序列；a13)在選自a1)至a10)之任一種胺基酸序列中1至數個之胺基酸殘基被取代、缺失或附加的胺基酸序列；及(b)選自包含以下之胺基酸序列之群組的輕鏈可變區域序列：b1)包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列編號26所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列編號28所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b4)包含序列編號30所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b5)包含序列編號46所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b6)包含序列編號48所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b7)具有與選自b1)至a6)之任一種胺基酸序列至少95%之同源性的胺基酸序列；b8)具有與選自b1)至b6)之任一種胺基酸序列至少99%之同源性的胺基酸序列；b9)在選自b1)至b6)之任一種胺基酸序列中1至數個之胺基酸殘基被取代、缺失或附加的胺基酸序列。
(11)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
(12)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其為含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號26所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
(13)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至 140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號28所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
(14)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號38所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號48所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
(15)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號40所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號46所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
(16)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號42所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
(17)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號44所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
(18)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號14之胺基酸序列所示之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈 序列包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
(19)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號26所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
(20)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號28所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
(21)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號38所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號48所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
(22)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號40所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號46所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
(23)如(10)記載之抗體或該抗體之功能性片段，其包含重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號42所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序 列包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
(24)如(10)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號44所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
(25)一種抗體，其係在如(11)至(24)之任一項記載之抗體中，含有重鏈且該重鏈於羧基末端側之1至數個胺基酸已缺失者。
(26)一種醫藥組成物，其特徵為含有如(1)至(25)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段之至少任一種。
(27)如(26)記載之醫藥組成物，其係骨代謝異常之治療及/或預防劑。
(28)一種骨代謝異常之治療及/或預防用醫藥組成物，其特徵為含有(1)至(25)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段之至少任一種；以及選自包含雙膦酸鹽、活性型維生素D3、抑鈣素及其衍生物、雌二醇等之激素、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑)、異丙黃酮、維生素K2(四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺激素(parathyroid hormone))、非類固醇性抗發炎藥、可溶性TNF受體、抗TNFα抗體或該抗體之抗原結合片段、抗PTHrP(副甲狀腺激素-相關蛋白質(parathyroid hormone-related protein))抗體或該抗體之抗原結合片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體之抗原結合片段、抗RANKL抗體或該 抗體之抗原結合片段、及OCIF(破骨細胞生成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor))之群組之至少任一種。
(29)如(27)或(28)記載之醫藥組成物，其中骨代謝異常係選自包含骨質疏鬆症、伴隨關節風濕症之骨破壞、癌性高鈣血症、多發性骨髓瘤或伴隨癌之骨轉移之骨破壞、巨細胞瘤、骨量減少、齒根膜炎所造成之齒喪失、人工關節周圍之骨溶解、慢性骨髓炎中之骨破壞、骨佩吉特氏病、腎性骨營養不良症、及骨形成不全症。
(30)如(29)記載之醫藥組成物，其中骨代謝異常係骨質疏鬆症、伴隨關節風濕症之骨破壞、或伴隨癌之骨轉移之骨破壞。
(31)如(30)記載之醫藥組成物，其中骨代謝異常係骨質疏鬆症。
(32)如(31)記載之醫藥組成物，其中骨質疏鬆症係停經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、因使用類固醇或免疫抑制劑等治療用藥劑而引起之續發性骨質疏鬆症、或伴隨關節風濕症之骨質疏鬆症。
(33)一種骨代謝異常之治療及/或預防方法，其特徵為給與在(1)至(25)中所記載之抗體、該抗體之抗原結合片段、或在(27)或(28)中所記載之醫藥組成物之至少任一種。
(34)一種骨代謝異常之治療及/或預防方法，其特徵為同時或先後給與在(1)至(25)中所記載之抗體、該抗體之抗原結合片段、或在(28)中所記載之醫藥組成物之至 少任一種；以及選自包含雙膦酸鹽、活性型維生素D3、抑鈣素及其衍生物、雌二醇等之激素、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑)、異丙黃酮、維生素K2(四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺激素)、非類固醇性抗發炎藥、可溶性TNF受體、抗TNFα抗體或該抗體之抗原結合片段、抗PTHrP(副甲狀腺激素-相關蛋白質)抗體或該抗體之抗原結合片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體之抗原結合片段、抗RANKL抗體或該抗體之抗原結合片段、及OCIF(破骨細胞生成抑制因子)之群組之至少任一種。
(35)一種如(33)或(34)記載之治療及/或預防方法，其中 骨代謝異常係骨質疏鬆症、伴隨關節風濕症之骨破壞、或伴隨癌之骨轉移之骨破壞。
(36)如(35)記載之治療及/或預防方法，其中骨代謝異常係骨質疏鬆症。
(37)如(36)記載之治療及/或預防方法，其中骨質疏鬆症係停經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、因使用類固醇或免疫抑制劑等治療用藥劑而引起之續發性骨質疏鬆症、或伴隨關節風濕症之骨質疏鬆症。
(38)一種聚核苷酸，其係編碼在(1)至(25)之任一項中所記載之抗體。
(39)如(38)記載之聚核苷酸，其含有：包含序列編號1所示之核苷酸序列之第1至363號之核苷酸的核苷酸序列以及包含序列編號3所示之核苷酸序列之第1至327號 之核苷酸的核苷酸序列。
(40)如(39)記載之聚核苷酸，其含有：包含序列編號7所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸的核苷酸序列以及包含序列編號9所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸的核苷酸序列。
(41)如(38)記載之聚核苷酸，其含有：(a)選自包含以下核苷酸序列之群組的聚核苷酸：a1)包含序列編號11所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a2)包含序列編號13所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a3)包含序列編號15所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a4)包含序列編號17所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a5)包含序列編號19所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a6)包含序列編號21所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a7)包含序列編號37所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a8)包含序列編號39所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a9)包含序列編號41所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a10)包含序列編號43所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a11)具有與選自a1)至a10)之任一種核苷酸序列至少95%之同源性的胺基酸序列；a12)具有與選自a1)至a10)之任一種核苷酸序列至少99%之同源性的胺基酸序列；a13)與包含和選自a1)至a10)之任一種核苷酸序列互補之核苷酸序列的聚核苷酸於嚴苛條件下可雜交之聚核苷酸所保有的核苷酸序列；a14)在選自a1)至a10)之任一種核苷酸序列中，1至數個胺基酸被取代、缺失或附加的核苷酸序列；及(b)選自包含以下核苷酸序列之群組的聚核苷酸：b1)包含序列編號23所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列；b2)包含序列編號25所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列；b3)包含序列編號27所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列；b4)包含序列編號28所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列；b5)包含序列編號45所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列；b6)包含序列編號47所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列；b7)與選自b1)至b6)之任一種核苷酸序列具有至少 95%之同源性的胺基酸序列；b8)與選自b1)至b6)之任一種核苷酸序列具有至少99%之同源性的胺基酸序列；b9)與包含和選自b1)至b6)之任一種核苷酸序列互補之核苷酸序列的聚核苷酸在嚴苛條件下可雜交之聚核苷酸所保有的核苷酸序列；b10)在選自b1)至b6)之任一種核苷酸序列中，1至數個核苷酸被取代、缺失或附加的核苷酸序列。
(42)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號13所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號23所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(43)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號13所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號25所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(44)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號13所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號27所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(45)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號37所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成 之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號47所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(46)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號39所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號45所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(47)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號41所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸及包含由序列編號23所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(48)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號43所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸及包含由序列編號23所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(49)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號13所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸及包含由序列編號23所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(50)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號13所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成 之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號25所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(51)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號13所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號27所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(52)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號37所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸及包含由序列編號47所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(53)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號39所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號45所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(54)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號41所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號23所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(55)如(41)記載之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號43所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成 之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號23所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
(56)一種載體，其含有如(38)至(55)記載之任一種聚核苷酸。
(57)一種轉形宿主細胞，其含有如(38)至(55)記載之任一種聚核苷酸。
(58)一種轉形宿主細胞，其含有如(56)記載之載體。
(59)一種如(1)至(25)之任一項記載之抗體之生產方法，其包含培養如(57)或(58)記載之宿主細胞，並從培養產物精製抗體之步驟。
若依照本發明，可得到以破骨細胞之分化成熟、及骨吸收活性之阻礙作為作用機制之骨代謝異常的治療劑及/或預防劑。
第1圖為顯示被選殖之大鼠#24A3重鏈可變區域之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第2圖為顯示被選殖之大鼠#24A3輕鏈可變區域之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第3圖為顯示人類嵌合#24A3抗體重鏈之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第4圖為顯示人類嵌合#24A3抗體輕鏈之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第5圖為顯示h#24A3-H1之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第6圖為顯示h#24A3-H2之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第7圖為顯示h#24A3-H3之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第8圖為顯示h#24A3-H4之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第9圖為顯示h#24A3-H5之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第10圖為顯示h#24A3-H6之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第11圖為顯示h#24A3-L1之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第12圖為顯示h#24A3-L2之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第13圖為顯示h#24A3-L3之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第14圖為顯示h#24A3-L4之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第15圖為顯示大鼠#24A3抗體之各CDR序列之胺基酸序列之圖。
第16圖為顯示藉由大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類嵌合抗體抑制人類正常破骨細胞之分化之圖(N=6)。
第17圖為顯示h#24A3-H2b之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第18圖為顯示h#24A3-H2c之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第19圖為顯示h#24A3-H2d之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第20圖為顯示h#24A3-H2e之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第21圖為顯示h#24A3-L2b之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第22圖為顯示h#24A3-L3b之核苷酸序列、及胺基酸序列之圖。
第23圖為顯示藉由大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體抑制人類正常破骨細胞之分化之圖(N=6)。
第24圖為測定h#24A3-H2d/L1抗體之熱安定性之溫度記錄圖。
第25圖為測定h#24A3-H2e/L1抗體之熱安定性之溫度記錄圖。
第26圖為測定h#24A3-H2b/L3b抗體之熱安定性之溫度記錄圖。
第27圖為測定h#24A3-H2c/L2b抗體之熱安定性之溫度記錄圖。
[實施發明之形態]
在本說明書中，所謂「基因」之詞不只包含DNA，亦包含mRNA、cDNA及cRNA。
在本說明書中，所謂「聚核苷酸」之詞係以與核酸相同之意義來使用，亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。
在本說明書中，「多肽」與「蛋白質」在使用上無區別。
在本說明書中，「RNA部分」意指含有RNA之部分(fraction)。
在本說明書中，「細胞」亦包含動物個體內之細胞、培養細胞。
在本說明書中，「Siglec-15」係以與Siglec-15蛋白質相同之意義來使用。
在本說明書中，「破骨細胞之形成」係以與「破骨細胞之分化」或「破骨細胞之成熟」相同之意義來使用。
本說明書中之「抗體之抗原結合片段」亦被稱為「抗體之功能性片段」，意指具有與抗原結合之活性之抗體之部分片段，包含Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、雙體抗體(diabody)、線狀抗體、及由抗體片段所形成之多特異性抗體等。又，於還原條件下處理F(ab’)2而得之抗體之可變區域之一價片段Fab’亦包含於抗體之抗原結合片段中。但是，只要具有與抗原結合之能力，並不限定於此等分子。又，在此等抗原結合片段中，不僅包含將抗體蛋白質之全長分子以適當酵素處理者，亦包含以基 因工程法所改變之抗體基因在適當之宿主細胞中所產生的蛋白質。
本說明書中之「抗原決定部位(epitope)」，意指特定之抗Siglec-15抗體所結合之Siglec-15之部分肽或部分立體構造。為前述Siglec-15之部分肽的抗原決定部位，可藉由免疫檢定法等本技術領域者所熟知之方法來決定，例如，可依照以下之方法來進行。製作Siglec-15之各種部分構造。當製作部分構造時，可使用周知之寡肽合成技術。例如，藉由使用本技術周知之基因重組技術製作從Siglec-15之C末端或N末端以適當長度依序縮短之一連串多肽後，探討抗體對此等多肽之反應性，決定大概之識別部位後，進一步合成短肽，並檢討與此等肽之反應性，可決定抗原決定部位。又，特定之Siglec-15抗體所結合之Siglec-15之部分立體構造，即抗原決定部位，可藉由利用X射線結晶構造分析，特定出與前述抗體所鄰接之Siglec-15之胺基酸殘基而決定。若第二之抗Siglec-15抗體可結合在第一之抗Siglec-15抗體所結合之部分肽或部分立體構造上，則可判定第一之抗體與第二之抗體具有共通的抗原決定部位。又，藉由確認第二之抗Siglec-15抗體會與對第一之抗Siglec-15抗體競爭與Siglec-15之結合(亦即，第二之抗體妨礙第一之抗體與Siglec-15之結合)，即使無法決定具體的抗原決定部位之序列或結構，但仍可判定第一之抗體及第二之抗體具有共通之抗原決定部位。再者，在第一之抗體與第二之抗體結合於共通之抗原決定部位，且第一之抗體具有抗原 之中和活性等特殊效果的情況，可期待第二之抗體亦具有同樣之活性。
已知在抗體分子之重鏈及輕鏈分別有3處互補性決定區域(CDR：complemetarity determining region)。互補性決定區域亦稱為超可變區域(hypervariable domain)，係在抗體之重鏈及輕鏈之可變區域內，一次構造之變異性特高的部位，在重鏈及輕鏈之多肽鏈的一次構造上，分別分離為3處。在本說明書中，關於抗體之互補性決定區域，重鏈之互補性決定區域，從重鏈胺基酸序列之胺基末端側，依次標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3；輕鏈之互補性決定區域，從輕鏈胺基酸序列之胺基末端側，依次標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等部位在立體構造上相互接近，決定對於所結合之抗原之特異性。
在本發明中，所謂「於嚴苛條件下雜交」意指在市售之雜交溶液：ExpressHyb雜交溶液(Clontech公司製)中，於68℃雜交；或者使用固定有DNA之過濾器，在藉由「於0.7-1.0M之NaCl存在下，於68℃進行雜交後，使用0.1-2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度SSC係包含150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)，於68℃洗淨」而可鑑定之條件，或與此同等之條件下雜交。
在本說明書中，於記載「1至數個」及「1或數個」之情況中的「數個」表示2至10個。較佳為10個以下、5或6個以下、或者2或3個。
1.Siglec-15
根據本發明人等，發現Siglec-15基因於巨細胞瘤中特異地表現。又，本發明人等亦發現Siglec-15基因在來自單核球之細胞株分化為破骨細胞時，表現量增加。
本發明所使用之Siglec-15，可從人類、人類以外之哺乳動物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、兔、豬、羊、牛、猴等)或雞之單核球細胞或骨髓細胞直接精製而使用，或者可調製上述細胞之細胞膜部分而使用，又，將Siglec-15於活體內合成，或藉由基因操作使宿主細胞產生而得到。基因操作，具體而言，將Siglec-15 cDNA納入可表現之載體後，在含有轉錄及轉譯所必要之酵素、基質及能量物質之溶液中合成，或者藉由使其他原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形，使Siglec-15表現，可得到該蛋白質。
人類Siglec-15之cDNA之核苷酸序列係在GenBank中以登錄編號：NM_213602登錄。小鼠Siglec-15之cDNA之核苷酸序列係在GenBank中以登錄編號：XM_884636登錄。再者，Siglec-15被稱為CD33類抗原3(CD33 antigen-like 3)、CD33類分子3(CD33 molecule-like 3)、類CD333(CD33-like 3)或CD33L3，此等全部表示相同分子。
Siglec-15之cDNA，可例如藉由以表現Siglec-15之cDNA的cDNA庫作為模板，使用特異性地增幅Siglec-15之cDNA的引子，進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」)(Saiki,R.K.,et al.,Science,(1988)239,487-49)，所謂PCR法而取得。
再者，可與包含編碼人類或小鼠之Siglec-15之核苷酸序列互補之核苷酸序列的聚核苷酸於嚴苛條件下雜交，且編碼與Siglec-15具有同等生物活性之蛋白質的聚核苷酸，亦包含於Siglec-15之cDNA中。再者，從人類或小鼠Siglec-15基因座所轉錄之剪接變異體(splicing variant)或在嚴苛條件下雜交於此等之聚核苷酸，且該聚核苷酸編碼具有與Siglec-15同等之生物活性之蛋白質者，亦包含於Siglec-15之cDNA中。
又，包含人類或小鼠之Siglec-15之胺基酸序列，或從此等序列排除信號序列之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被取代、缺失、或附加而成之胺基酸序列，並具有與Siglec-15同等生物活性的蛋白質，亦包含於Siglec-15中。再者，包含從人類或小鼠Siglec-15基因座轉錄之剪接變異體所編碼之胺基酸序列或該胺基酸序列中，1或數個胺基酸被取代、缺失、或附加而成之胺基酸序列，並具有與Siglec-15同等生物活性的蛋白質，亦包含於Siglec-15中。
2.骨代謝異常之檢測
對於Siglec-15基因，進行人類各種骨組織檢體群中之基因之表現量的解析時，發現在巨細胞瘤(Giant cell tumor；GCT)中表現量有意義地增加，巨細胞瘤係會出現多個類破骨細胞之多核巨細胞的骨腫瘤，就臨床上所見而言，其特徵為骨溶解性之骨破壞(Bullough et al.,Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition,pp17.6-17.8,Lippincott Williams & Wilkins Publishers(1992))。
又，亦發現Siglec-15基因在來自單核球之細胞株分化為破骨細胞時，表現量增加。
因此，研判Siglec-15參與骨吸收亢進之人類病症如GCT。亦即，藉由測定Siglec-15基因及/或Siglec-15在各細胞、及/或各組織中之表現量，可以判定伴隨Siglec-15過剩表現之骨代謝異常狀態。再者，在本說明書中之骨代謝異常係以實質之骨喪失為特徵之障礙，具體而言，可列舉骨質疏鬆症(停經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、因使用類固醇或免疫抑制劑等治療用藥劑而引起之續發性骨質疏鬆症、伴隨關節風濕症之骨質疏鬆症)、伴隨關節風濕症之骨破壞、癌性高鈣血症、多發性骨髓瘤或伴隨癌之骨轉移之骨破壞、巨細胞瘤、骨量減少、齒根膜炎所造成之齒喪失、人工關節周圍之骨溶解、慢性骨髓炎中之骨破壞、骨佩吉特氏病、腎性骨營養不良症、骨形成不全症等，然而不以此等為限。
在本發明中，成為調查Siglec-15基因及/或Siglec-15之表現量之對象的「檢體」，意指從受驗者或臨床檢體等所得到之骨髓、骨、前列腺、睪丸、陰莖、膀胱、腎臟、口腔、咽、唇、舌、牙齦、鼻咽、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臟、膽囊、胰臟、鼻、肺、軟組織、皮膚、乳房、子宮、卵巢、腦、甲狀腺、淋巴結、肌肉、脂肪組織等之組織、血液、體液或排泄物等之試料，不過在本發明中，以血液或骨髓為更佳。
關於已知與破骨細胞之分化有關聯之RANKL，製作基因剔除小鼠，並解析在RANKL之功能失 去之情況的表現型(Young-Yun Kong,et.al.,Nature(1999)397,p.315-323)。關於Siglec-15，亦同樣地可藉由製作基因剔除小鼠，解析在Siglec-15之功能喪失之情況的表現型。
3.抗Siglec-15抗體之製造
本發明之針對Siglec-15之抗體，可藉由使用一般方法，將Siglec-15或選自Siglec-15之胺基酸序列之任何多肽使動物免疫，採取並精製生物體內所產生之抗體而得到。作為抗原之Siglec-15之生物種類不限定人類，亦可用來自小鼠、大鼠等人類以外之動物的Siglec-15使動物免疫。在此種情況，藉由試驗結合於所取得之異種Siglec-15上之抗體與人類Siglec-15之交叉反應性，可篩選能適用於人類疾病之抗體。
又，依照周知之方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980))，藉由使產生抗-Siglec-15抗體之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合，建立融合瘤，亦可得到單株抗體。此種方法之具體例，記載於國際公開第WO09/48072號小冊子(2009年4月16日公開)及第WO10/117011號小冊子(2010年10月14日公開)。然而，取得單株抗體之方法，係在先前已確立之領域中，並不限於前述之具體例。
再者，作為抗原之Siglec-15，可藉由基因操作使宿主細胞產生Siglec-15基因而得到。具體而言，只要製作可表現Siglec-15基因之載體，將其導入宿主細胞 中，使該基因表現，並將所表現之Siglec-15精製即可。
就此種方式所建立之融合瘤株之例子而言，可列舉本說明書記載之融合瘤#24A3。再者，在本說明書中，將融合瘤#24A3所產生之抗體記載為「#24A3抗體」或簡稱為「#24A3」。又，在本說明書中，關於#24A3抗體以外之抗體，亦以同樣之方法記載抗體名稱。含有#24A3抗體之重鏈可變區域之部分片段，具有包含序列表之序列編號2之第1至121號之胺基酸殘基的胺基酸序列。又，含有#24A3抗體之輕鏈可變區域序列之部分片段，具有包含序列表之序列編號4之第1至109號之胺基酸殘基的胺基酸序列。
本發明之抗體，除上述對抗Siglec-15之單株抗體外，亦包含以使對人類之異種抗原性降低等為目的，經人為方式改變之基因重組型抗體，例如，嵌合(chimeric)抗體、人類化(humanized)抗體、人類抗體等。對於此等抗體，可使用已知之方法製造。
就嵌合抗體而言，可列舉抗體之可變區域與恆定區域互為異種之抗體，例如將來自小鼠或大鼠之抗體的可變區域，接合於來自人類之恆定區域的嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。就來自大鼠抗小鼠抗體#24A3之嵌合抗體之一例而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈的抗體，該重鏈具有包含序列表之序列編號8之第20至466號之胺基酸殘基之胺基酸序列，該輕鏈具有包含序列編號10之第21至234號之胺基酸殘基之胺基酸序列。
就人類化抗體而言，可列舉只將互補性決定區域(CDR；complementarity determining region)納入來自人類之抗體而成之抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)，或藉由CDR移植法，在CDR之序列之外，亦將一部分框架(framework)之胺基酸殘基移植至人類抗體而成之抗體(國際公開第WO90/07861號小冊子)。
就來自#24A3抗體之人類化抗體而言，只要保持#24A3之全部6種CDR序列，且維持抑制破骨細胞形成之活性，將包含於本發明之抗體中。再者，#24A3抗體之重鏈可變區域保有包含序列編號31所示之胺基酸序列之CDRH1(RYDVS)、包含序列編號32所示之胺基酸序列之CDRH2(VIHPGSGGTGYNEKFKA)、及包含序列編號33所示之胺基酸序列之CDRH3(RGLNSGYWFFDF)。又，#24A3抗體之輕鏈可變區域保有包含序列編號34所示之胺基酸序列之CDRL1(KASQNVGSNVD)、包含序列編號35所示之胺基酸序列之CDRL2(ESTNRYT)、及包含序列編號36所示之胺基酸序列之CDRL3(MQSNFFPFT)。此等CDR之胺基酸序列亦記載於第15圖中。
又，將各CDR中之1至3個胺基酸殘基進一步取代為其他胺基酸殘基之CDR改變人類化抗體，只要具有抑制破骨細胞形成之活性，將包含於本發明之抗體中。就CDRH3中之胺基酸取代例而言，可列舉：序列編號33所示之胺基酸序列中，取代1個胺基酸而得之CDRH3。較佳者為包含序列編號49所示之胺基酸序列之CDRH3(RGLNKGYWFFDF)。其CDR之胺基酸序列，亦記 載於第15圖中。
就大鼠抗體#24A3之人類化抗體之實例而言，可列舉下述重鏈與輕鏈之組合，該重鏈含有重鏈可變區域，該重鏈可變區域包含由序列表之序列編號12之第20至140號之胺基酸殘基、序列編號14之第20至140號之胺基酸殘基、序列編號16之第20至140號之胺基酸殘基、序列編號18之第20至140號之胺基酸殘基、序列編號20之第20至140號之胺基酸殘基、序列編號22之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列，包含由序列編號38之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列、包含由序列編號40之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列、包含由序列編號42之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列、或者包含由序列編號44之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列；該輕鏈含有輕鏈可變區域，該輕鏈可變區域包含由序列編號24之第21至129號之胺基酸殘基、序列編號26之第21至129號之胺基酸殘基、序列編號28之第21至129號之胺基酸殘基、序列編號30之第21至129號之胺基酸殘基、序列編號46之第21至129號之胺基酸殘基、或序列編號48之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列。
就較佳組合而言，可列舉：包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號12之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號24之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及 輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號12之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號26之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號12之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號28之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號14之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號24之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含序列編號14之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含序列編號26之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號14之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號28之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號16之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號24之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號 16之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號26之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號16之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號28之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號18之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號24之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號18之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號26之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號18之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號28之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號20之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號24之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號20之第20至140號之胺基酸 殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號26之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號20之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號28之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；或者包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號22之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號30之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域。
就更佳組合而言，可列舉：包含具有由序列編號12之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號24之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號12之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號26之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號12之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號28之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號14之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號24之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號14之第20至466號之胺基酸殘基所構成之 胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號26之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號14之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號28之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號16之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號24之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號16之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號26之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號16之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號28之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號18之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號24之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號18之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號26之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號18之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號28之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號20之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號24之第21至 234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號20之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號26之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號20之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號28之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體，或包含具有由序列編號22之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號30之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體。
就進一步更佳之組合而言，可列舉：包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號14之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號24之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號14之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號26之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號14之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號28之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列 編號38之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號48之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號40之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號46之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號42之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號24之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域；或者包含重鏈及輕鏈之抗體，且該重鏈含有包含由序列編號44之第20至140號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的重鏈可變區域，該輕鏈含有包含由序列編號24之第21至129號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列的輕鏈可變區域。
就最佳組合而言，可列舉：包含具有由序列編號14之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號24之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號14之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號26之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號14之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號28之第21至234號之胺 基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號38之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號48之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號40之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號46之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號42之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號24之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體；包含具有由序列編號44之第20至466號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之重鏈及具有由序列編號24之第21至234號之胺基酸殘基所構成之胺基酸序列之輕鏈的抗體。
就本發明之抗體而言，可進一步列舉人類抗體。抗Siglec-15人類抗體，意指只具有來自人類染色體之抗體基因序列的人類抗體。抗Siglec-15人類抗體，可藉由使用產生人類抗體之小鼠的方法(參照Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133-143,；Kuroiwa,Y.et.al.,Nucl.Acids Res.(1998)26,p.3447-3448；Yoshida,H.et.al.,Animal Cell Technology：Basic and pplied Aspects vol.10,p.69-73(Kitagawa,Y.,Matsuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers,1999.；Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727等。)而取得，該產生人類抗體之小鼠具有人類染色體片段，該人類染色體片段含有人類抗 體之重鏈及輕鏈之基因。
此種產生人類抗體之小鼠，具體而言，可藉由製作基因剔除動物及基因轉殖(transgenic)動物，並使此等動物彼此交配而作出基因重組動物，其中該基因重組動物係內在性免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座受到破壞，代之以經由酵母人工染色體(yeast artificial chromosome，YAC)載體等之轉介而導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座者。
又，可藉由基因重組技術，以分別編碼此種人類抗體之重鏈及輕鏈的cDNA(以含有該等cDNA之載體為較佳)轉形真核細胞，培養可產生基因重組人類單株抗體的轉形細胞，然後從培養上清液中得到該抗體。其中，就宿主而言，可使用例如真核細胞，以CHO細胞、淋巴球或骨髓瘤等之哺乳動物細胞為較佳。
又，亦已知以噬菌體顯現法(phage display)從人類抗體庫篩選而取得人類抗體的方法(參照Wormstone,I.M.et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308；Carmen,S.t.al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203；Siriwardena,D.et.al.,Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431等)。
例如，將人類抗體之可變區域作成單鏈抗體(scFv)，使其於噬菌體表面表現，然後選擇結合於抗原之噬菌體的噬菌體表現法(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。解析藉由結合於抗原所選擇之噬 菌體的基因，藉此決定編碼結合於抗原之人類抗體之可變區域的DNA序列。若明瞭結合於抗原之scFv的DNA序列，將可藉由製作具有該序列之表現載體，導入適當之宿主，使其表現，而取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。
上述之抗體，可藉由實施例3或實施例10所示之方法等，評價對抗原之結合性，而選取較佳之抗體。就比較抗體之性質時之其他指標之一例而言，可列舉抗體之安定性。示差掃描熱量分析(DSC)為可快速且正確測定熱變性中點(Tm)之方法，熱變性中點為蛋白質之相對構造安定性之良好指標。藉由使用DSC測定Tm值，並比較該值，可比較熱安定性之差異。已知抗體之保存安定性，與抗體之熱安定性展現某種程度之相關性(Lori Burton,et.al.,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273)，以熱安定性為指標，可選取較佳抗體。就用於選取抗體之其他指標而言，可列舉：在適當宿主細胞中之產量高，及在水溶液中之凝集性低。例如，由於產量最高之抗體未必顯示最高的熱安定性，必須根據以上所述之指標作綜合判斷，選取對人類給與最適合之抗體。
又，亦已知將抗體之重鏈及輕鏈的全長序列，使用適當之連接子連結，取得單鏈免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)的方法(Lee,H-S,et.al.,Molecular Immunology(1999)36,p.61-71；Shirrmann,T.et.al.,mAbs(2010),2,(1)p.1-4)。此種單鏈免疫球蛋白可藉由二聚體化而保持與原本為四聚體之抗體類似的結構及活性。又，本發明之抗體，亦可為具有單一之重鏈可變區域，而不具有輕鏈序列的抗體。此種抗體被稱為單域抗體(single domain antibody：sdAb)或奈米體(nanobody)，實際上據報導以駱駝或美洲駝來觀察，其可保持抗原結合能力(Muyldemans S.et.al.,Protein Eng.(1994)7(9),1129-35,Hamers-Casterman C.et.al.,Nature(1993)363(6428)446-8)。上述之抗體，亦可被解釋為本發明之抗體之抗原結合片段的一種。
又，藉由調節結合於本發明抗體之糖鏈修飾，可增強抗體依存性細胞障礙活性。就抗體之糖鏈修飾的調節技術而言，雖然已知WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140等，不過不限於此等。
在將抗體基因單離後，導入適當宿主而製作抗體之情況中，可使用適當的宿主與表現載體之組合。就抗體基因之具體例而言，可列舉：由編碼本說明書所記載之抗體之重鏈序列的基因與編碼輕鏈序列的基因組合而成者。將宿主細胞轉形時，可將重鏈序列基因及輕鏈序列基因插入同一表現載體，亦可插入個別之表現載體。使用真核細胞作為宿主之情況，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。就動物細胞而言，可列舉(1)哺乳類細胞，例如，為猴細胞之COS細胞(Gluzman,Y.Cell (1981)23,p.175-182，ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞，ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)。又，在使用原核細胞之情況，可列舉如：大腸菌、枯草菌。將為目的之抗體基因藉由轉形導入此等細胞中，並藉由將所轉形之細胞於身體中培養，可得到抗體。在以上之培養法中，有時產量會隨抗體之序列而異，以產量作為指標，可從具有同等結合活性之抗體中篩選容易生產者作為醫藥。
就本發明之抗體的同型(isotype)而言，並無限制，可列舉如：IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE等，但較佳可列舉IgG或IgM，更佳可列舉IgG1或IgG2。
又，本發明之抗體亦可為具有抗體之抗原結合部位的抗體之抗原結合片段或其修飾物。藉由將抗體用木瓜酶、胃蛋白酶等蛋白質分解酵素處理，或將抗體基因依照基因工程手法改變，使其於適當培養細胞中表現，可得到該抗體之片段。此種抗體片段中，將可保持抗體全長分子所具有之功能全部或一部分的片段稱為抗體之抗原結合片段。就抗體之功能而言，一般可列舉抗原結合活性、中和抗原活性之活性、增強抗原活性之活性、抗體依存性細胞障礙活性、補體依存性細胞傷害活性及補體依存性細胞性細胞傷害活性。本發明中抗體之抗原結合片段所保持之功能，為針對Siglec-15之結合活 性，較佳為抑制破骨細胞之形成的活性，更佳為抑制破骨細胞之細胞融合過程的活性。
例如，就抗體之片段而言，可列舉Fab、F(ab’)2、Fv、或將重鏈及輕鏈之Fv以適當連接子連結而成之單鏈Fv(scFv)、雙體抗體(diabodies)、線狀抗體、及由抗體片段所形成之多特異性抗體等。又，將F(ab’)2於還原條件下處理而得之抗體之可變區域之一價片段，即Fab’，亦包含於抗體之片段中。
再者，本發明之抗體亦可為對於至少2種相異抗原具有特異性之多特異性抗體。雖然此種分子通常為與2種抗原結合者(亦即，雙重特異性抗體(bispecific antibody))，不過本發明中之「多特異性抗體」係包含對於2種以上(例如，3種)之抗原具有特異性之抗體。
本發明之多特異性抗體，可為包含全長之抗體、或為此種抗體之片段(例如，F(ab’)2二重特異性抗體)。二重特異性抗體可使2種抗體之重鏈及輕鏈(HL對)結合而製作，亦可藉由使產生相異之單株抗體的融合瘤融合，製成產生二重特異性抗體之融合細胞而製作(Millstein et.al.,Nature(1983)305,p.537-539)。
本發明之抗體亦可為單鏈抗體(亦被記載為scFv)。單鏈抗體可藉由將抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域以多肽之連接子連結而得(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113(Rosenberg 及Moore編，Springer Verlag,New York,p.269-315(1994)、Nature Biotechnology(2005),23,p.1126-1136) 。又，亦可將2個scFv以多肽連接子連結而製成之BiscFv片段作為雙重特異性抗體使用。
製作單鏈抗體之方法為此技術領域中所周知(例如，參照美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。該scFv中，重鏈可變區域及輕鏈可變區域，可經由不會形成共軛(conjugate)之連接子，較佳為以多肽連接子進行連結(Huston,J.S.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85,p.5879-5883)。scFv中之重鏈可變區域及輕鏈可變區域，可來自同一抗體，亦可來自個別之抗體。就連結可變區域之多肽連接子而言，可使用例如包含12~19殘基之任何單鏈肽。
編碼scFv之DNA可藉由下述方法得到：在編碼前述抗體之重鏈或重鏈可變區域之DNA及編碼輕鏈或輕鏈可變區域之DNA之中，將此等序列之全部或編碼所期望之胺基酸序列之DNA部分作為模板，並使用規定其兩端之引子對，藉由PCR法來增幅，繼而，進一步將編碼多肽連接子部分之DNA，與規定該DNA之兩端各與重鏈、輕鏈連結之引子對組合，進行增幅。
又，一旦製成編碼scFv之DNA，則可依照一般方法得到含有此等之表現載體、及藉由該表現載體所轉形之宿主，又，藉由使用該宿主，可依照一般方法得到scFv。此等抗體片段，可藉由與前述同樣之方式取得基因，使其表現，並藉由宿主使其產生。
本發明之抗體亦可為經多量化，而提高對於 抗原之親和性者。就多量化之抗體而言，可為1種抗體，亦可為能識別同一抗原之複數個抗原決定部位的複數個抗體。就將抗體進行多量化之方法而言，可列舉IgG CH3結構域與2個scFv之結合、與抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)之結合、螺旋-轉角-螺旋基序(helix-turn-helix motif)之導入等。
本發明之抗體係胺基酸序列相異之複數種抗Siglec-15抗體之混合物，可為多株抗體。就多株抗體之一例而言，可列舉CDR相異之複數種抗體之混合物。就此種多株抗體而言，可使用：培養產生相異抗體之細胞混合物，從該培養物所精製之抗體(參照WO2004/061104號)。
本發明之抗體可為與上述之抗體之重鏈及/或輕鏈比較，具有80%至99%相同性之抗體。藉由將與上述重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列呈現高同源性之序列加以組合，可選擇具有與上述各抗體同等之抗原結合能力、破骨再形成抑制作用及/或破骨細胞引起之骨吸收之抑制作用的抗體。此種同源性，一般為80%以上之同源性，較佳為90%以上之同源性，更佳為95%以上之同源性，最佳為99%以上之同源性。又，藉由將在重鏈及/或輕鏈之胺基酸序列中之1至數個胺基酸殘基取代、缺失及/或附加而得之胺基酸序列加以組合，可選擇具有與上述各抗體同等之各種作用的抗體。所取代、缺失及/或附加之胺基酸殘基之數目，一般為10個胺基酸殘基以下，較佳為5至6個胺基酸殘基以下，更佳為2至3個胺基酸殘基 以下，最佳為1個胺基酸殘基。
再者，已知在哺乳類培養細胞中所生產之抗體之重鏈之羧基末端的離胺酸殘基缺失者(Journal of Chromatography A,705：129-134(1995))，又，同樣地，已知重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸2個胺基酸殘基係缺失，並將位於新羧基末端之脯胺酸殘基醯胺化者(Analytical Biochemistry,360：75-83(2007))。然而，此等重鏈序列之缺失及修飾不會影響抗體之抗原結合能力及效應物功能(補體之活性化或抗體依存性細胞障礙作用等)。因此，本發明中亦包含接受此修飾之抗體，可列舉在重鏈羧基末端中缺失1或2個胺基酸之缺失變異體、及將該缺失變異體醯胺化者(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)等。但是，在保持抗原結合能力及效應物功能之範圍，本發明相關之抗體之重鏈羧基末端的缺失變異體，並不限定於上述種類。構成本發明相關之抗體的2股重鏈，只要為完全長及選自包含上述缺失變異體之群的重鏈任何一種即可，亦可為將任何二種組合者。各缺失變異體之量比，雖可受到產生本發明相關之抗體之哺乳類培養細胞之種類及培養條件的影響，然而就本發明相關之抗體之主成分而言，可列舉於2股重鏈之雙方，缺失羧基末端之1個胺基酸殘基的情況。
二種胺基酸序列間之同源性，可藉由使用Blast algorithm version 2.2.2(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schäffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J. Lipman(1997)，「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)之預設參數(default parameter)而決定。Blast algorithm亦可藉由進入網站www.ncbi.nlm.nih.gov/blast而使用。再者，藉由上述之Blast algorithm，可計算Identity(相同性，或Identities)及Positivity(陽性率，或Positivities)2種百分比值。前者為求出同源性時，在二胺基酸序列間胺基酸殘基為一致時之值，後者則係在考慮化學結構類似之胺基酸殘基下之數值。在本說明書中，以在胺基酸殘基一致之情況所具有之Identity(相同性)之值，作為同源性之值。
就抗體之修飾物而言，亦可使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合之抗體。
本發明之抗體，亦可為此等抗體與其他藥劑所進一步形成之配對物(免疫配對物)。就此種抗體之例而言，可列舉該抗體與放射性物質或具有藥理作用之化合物結合之物(Nature Biotechnology(2005)23,p.1137-1146)。
所得到之抗體可精製至達到均一為止。關於抗、體之分離、精製，只要使用蛋白質通常所用之分離、精製方法即可。適當選擇、組合例如管柱層析、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、調製用聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等，可將抗體分離、精製(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et.al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，然而不以此等為限。
就層析而言，可列舉，親和力層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾層析、逆相層析、吸著層析等。
就此等層析而言，可使用HPLC或FPLC等之液體層析而進行。
就親和力層析所使用之管柱而言，可列舉蛋白質A管柱、蛋白質G管柱。
就例如蛋白質A管柱所使用之管柱而言，可列舉Hyper D,POROS,Sepharose F.F.(Pharmacia)等。又，亦可使用將抗原固定化之載劑，利用對抗原之結合性，將抗體精製。
4.含有抗Siglec-15抗體之醫藥
以在上述之「3.抗Siglec-15抗體之製造」項中記載之方法所得到之抗Siglec-15抗體中，可得到將Siglec-15之生物活性中和的抗體。此等將Siglec-15之生物活性中和的抗體，由於阻礙身體內之Siglec-15的生物活性，亦即，阻礙破骨細胞之分化及/或成熟，所以在醫藥方面，可使用作為起因於破骨細胞之分化及/或成熟異常之骨代謝異常的治療及/或預防劑。骨代謝異常亦可為以實質之骨喪失(骨量減少或骨溶解症)為特徵之任何障礙。一般而言，藉由抗Siglec-15抗體之治療及/或預防可適用於必須抑制骨吸收的情況。就抗Siglec-15抗體可治療及/ 或預防之骨代謝異常而言，可列舉：骨質疏鬆症(停經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、因類固醇或免疫抑制劑等治療用藥劑之使用所引起之續發性骨質疏鬆症、伴隨關節風濕症之骨質疏鬆症)、伴隨關節風濕症之骨破壞、癌性高鈣血症、多發性骨髓瘤或伴隨癌之骨轉移之骨破壞、巨細胞瘤、骨量減少、齒根膜炎所造成之齒喪失、人工關節周圍之骨溶解、慢性骨髓炎中之骨破壞、骨佩吉特氏病、腎性骨營養不良症、骨形成不全症等，不過只要為伴隨破骨細胞所引起之實質骨喪失的疾病即可，並不以此等為限。就可作為上述醫藥之抗Siglec-15抗體之例而言，可列舉依照「3.抗Siglec-15抗體之製造」記載之方法，從#24A3抗體所製作之嵌合抗體或人類化抗體。又，具有與#24A3抗體相同抗原決定部位之嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體亦可作為醫藥使用。某一抗Siglec-15抗體具有與#24A3抗體相同之抗原決定部位，可藉由觀察此等抗體是否共通地結合於Siglec-15之特定部分肽而確認。又，某一抗Siglec-15抗體與Siglec-15結合時，若與#24A3抗體競合，則可判定此等抗體具有共通之抗原決定部位。
在體外之抗Siglec-15抗體對於Siglec-15之生物活性的中和活性，可藉由，例如，對於過剩表現Siglec-15之細胞分化成破骨細胞的抑制活性來測定。例如，可在來自小鼠單核球之細胞株RAW264.7細胞或RAW264細胞中添加各種濃度之抗Siglec-15抗體，並測定其對於因RANKL或TNF-α刺激而分化成破骨細胞的抑制 活性。又，可在來自骨髓之初代培養細胞中添加各種濃度之抗Siglec-15抗體，並測定其對於因RANKL、TNF-α或活性型維生素D3刺激而分化成破骨細胞的抑制活性。再者，可在正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，可從三光純藥購入，型錄編號2T-110)中添加各種濃度之抗Siglec-15抗體，並測定其對於因RANKL及M-CSF刺激而分化成破骨細胞的抑制活性。此種破骨細胞之分化抑制效果，可以破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)活性之抑制作為指標來測定。又，以TRAP陽性多核破骨細胞之形成的抑制，即破骨細胞之細胞融合的抑制作為指標，亦可測定破骨細胞之分化抑制效果。再者，在使用來自大腿骨及/或脛骨之細胞的凹洞檢定(pit assay)(Takada et.al.,Bone and Mineral,(1992)17,347-359)實驗中，藉由於來自大腿骨及/或脛骨之細胞中添加各種濃度之抗Siglec-15抗體，並觀察象牙切片上之凹洞的形成，可測定在體外對於破骨細胞所引起之骨吸收的抑制活性。就在體外破骨細胞所引起之骨吸收之抑制活性的測定系統而言，亦可使用塗覆結合有銪之人類膠原的培養盤。在利用實驗動物之活體試驗中，抗Siglec-15抗體對於骨代謝異常的治療或預防效果，例如，可藉由將抗Siglec-15抗體給與至對骨質疏鬆症模式動物或過剩地表現Siglec-15之基因轉殖動物中，並測定破骨細胞之變化而確認。就前述之骨質疏鬆症模式動物而言，可列舉摘除卵巢之大鼠或摘除卵巢之猴。藉由將抗Siglec-15抗體給與至此等實驗動物後測定 骨密度或骨代謝標誌(marker)，可測定抗Siglec-15抗體所產生之骨吸收活性之抑制效果。就骨代謝標誌而言，可列舉：為骨吸收標誌之尿中去氧吡啶酚(deoxypyridinoline)、尿中第I型膠原之N-端肽(NTX)、尿中第I型膠原之C-端肽(CTX)、血中NTX、血中CTX、血中耐酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP5b))等，或為骨形成標誌之血中骨型鹼性磷酸酶(BAP)、血中骨鈣素(BGP)、第I型膠原蛋白原C-肽(Procollagen type I C-peptide(P1NP))等，然而並不限定於此等骨代謝標誌。
將此等方式所得到之中和Siglec-15之生物活性的抗體，在作為醫藥，尤其是以治療或預防骨質疏鬆症、伴隨關節風濕症之骨破壞、伴隨癌之骨轉移之骨破壞等骨代謝異常為目的之醫藥組成物上係為有用，或在作為此等疾病之免疫學診斷用抗體上係為有用。
在關節風濕症(RA)之治療中，伴隨疾病之發病而發生之骨喪失已成為重大課題。據報告指出破骨細胞在伴隨RA之骨喪失中扮演中心之角色。就RA中破骨細胞之誘導(分化、成熟)、活化以及骨破壞之原因而言，被認為最重要之細胞激素為RANKL及TNF-α(Romas E et al.,Bone 30,p340-346,2002)。藉著RANKL之誘餌受體(decoy receptor)，即OCIF/OPG，雖可抑制RANKL所誘導之破骨細胞形成，但無法抑制TNF-α所誘導之破骨細胞形成。另一方面，藉由本發明之抗Siglec-15抗體，對於RANKL所誘導之破骨細胞形成及TNF-α所誘導之破骨細 胞形成二者，皆能有效地抑制。因此，可以期待藉由本發明之抗Siglec-15抗體，可超越RANKL阻斷劑(OCIF/OPG、抗RANKL抗體等)，強力地抑制RA等中TNF-α所誘導之骨喪失及骨破壞。
抗Siglec-15抗體，對於骨代謝異常之治療或預防，其一例為單獨給與該抗體，或將其與至少一種其他骨疾病治療劑併用給與。另一例為將抗Siglec-15抗體與治療有效量之抗骨代謝異常治療藥劑併用給與。就可與抗Siglec-15抗體併用給與之其他治療劑而言，可列舉：雙膦酸鹽(例如阿倫膦酸(alendronate)、伊替膦酸(etidronate)、伊班膦酸(ibandronate)、因卡膦酸(incadronate)、帕米膦酸(pamidronate)、利塞膦酸(risedronate)、或唑來膦酸(zoledronate))、活性型維生素D3、抑鈣素及其衍生物、雌二醇等之激素、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑)、異丙黃酮、維生素K2(四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺激素)、非類固醇性抗發炎藥(例如，希樂葆(celecoxib)或偉克適(rofecoxib))、可溶性TNF受體(例如，恩博(etanercept))、抗TNFα抗體或該抗體之抗原結合片段(例如，英利昔單抗(infliximab))、抗PTHrP(副甲狀腺激素-相關蛋白質)抗體或該抗體之抗原結合片段、IL-1受體拮抗劑(例如阿那白滯素(anakinra))、抗IL-6受體抗體或該抗體之抗原結合片段(例如，托珠單抗(tocilizumab)、抗RANKL抗體或該抗體之抗原結合片段(例如，保骼麗(denosumab)、及OCIF(破骨細胞形成抑制因子))等，然而不以此等為限。以骨代 謝異常之狀態或以何種程度之治療及/或預防為目標時，亦可給與2、3或其以上種之其他治療劑，藉由將此等其他治療劑封入同一製劑中，可同時給與。藉由將其他治療劑與抗Siglec-15抗體封入同一製劑中，亦可同時給與。又，亦可將抗Siglec-15抗體與其他治療劑分別封入個別製劑中，同時給與。再者，可將其他藥劑及抗Siglec-15抗體前後地分別給與。亦即，可在給與其他治療劑後，再給與以抗Siglec-15抗體或該抗體之抗原結合片段作為有效成分之治療劑，或者亦可給與以抗Siglec-15抗體或該抗體之抗原結合片段作為有效成分之治療劑後，再給與其他治療劑。在為了基因治療而給與之情況，可將蛋白質性骨疾病治療劑之基因及抗Siglec-15抗體之基因插於個別或同一啟動子區域之下游，並導入個別或相同之載體。
藉由使骨疾病治療劑結合於抗Siglec-15抗體、或其片段，可製造M.C.Garnet在「Targeted drug conjugates：principles and progress」,Advanced Drug Delivery Reviews,(2001)53,171-216中所記載之標靶型藥物複合體。就其目的而言，除了抗體分子之外，任何抗體片段只要未完全消失破骨細胞之識別性，均可適用，例如，可列舉Fab、F(ab’)2、Fv等片段為例，在本發明中，亦同樣地可使用抗體及其片段。抗Siglec-15抗體或該抗體之片段與骨疾病治療劑之結合樣式，可為在M.C.Garnet「Targeted drug conjugates：principles and progress」,Advanced Drug Delivery Reviews,(2001)53,171-216 、G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press,California(1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123等中所記載之各種樣式。亦即，可列舉：抗Siglec-15抗體與骨疾病治療劑以化學方式直接結合或經由寡肽等間隔子(spacer)結合之樣式，或經由適當藥物載劑(carrier)結合之樣式。就藥物載劑之例而言，可列舉：脂質體或水溶性高分子。此等藥物載劑介在之樣式，更具體而言，可列舉以下之例子：抗體與骨疾病治療劑被包含於脂質體中，且該脂質體與抗體結合之樣式；以及骨疾病治療劑以化學方式直接，或經由寡肽等間隔子結合於水溶性高分子(分子量為約1000至10萬之化合物)中，且抗體結合於該水溶性高分子之樣式。抗體(或其片段)與骨疾病治療劑、脂質體及水溶性高分子等之藥物載劑之結合，可依照在G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press,California(1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123中所記載之方法等本技術領域者周知之方法而實施。骨疾病治療劑於脂質體內之包含，可依照D.D.Lasic「Liposomes：From Physics to Applications」,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam(1993)等記載之方法等之本技術領域者周知之方法而實施。骨疾病治療劑與水溶性高分子之結合，可依照在D.Putnam and J Kopecek「Polymer Coniugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123中所記載之方法等本技術領域者周知之方法而實施。抗體(或其片段)與蛋白質性骨疾病治療劑(或其片段)之複合體，除上述方法之外，可依照基因工程領域者周知之方法而製作。
本發明亦提供一種醫藥組成物，其含有治療及/或預防有效量之抗Siglec-15抗體及藥學上可容許之稀釋劑、載劑、可溶化劑、乳化劑、保存劑及/或補助劑。
本發明亦提供一種醫藥組成物，其含有治療及/或預防有效量之抗Siglec-15抗體及治療及/或預防有效量之至少一種的骨疾病治療劑，及藥學上可容許之稀釋劑、載劑、可溶化劑、乳化劑、保存劑及/或補助劑。就骨疾病治療劑而言，可列舉：雙膦酸鹽(例如阿倫膦酸、伊替膦酸、伊班膦酸、因卡膦酸、帕米膦酸、利塞膦酸、或唑來膦酸)、活性型維生素D3、抑鈣素及其衍生物、雌二醇等之激素、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑)、異丙黃酮(ipriflavone)、維生素K2(四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺激素)、非類固醇性抗發炎藥(例如，希樂葆或偉克適)、可溶性TNF受體(例如，恩博)、抗TNFα抗體或該抗體之抗原結合片段(例如，英利昔單抗)、抗PTHrP(副甲狀腺激素-相關蛋白質)抗體或該抗體之抗原結合片段、IL-1受體拮抗劑(例如阿那白滯素)、抗IL-6受體抗體或該抗體之抗原結合片段(例如，托珠單抗)、抗RANKL抗體或該抗體之抗原結合片段(例如，保骼麗、及 OCIF(破骨細胞形成抑制因子))等，然而不以此等為限。
在本發明之醫藥組成物中，就可容許之製劑中所使用之物質而言，以於給與量或給與濃度下，對於醫藥組成物之給與對象為非毒性者為較佳。
本發明之醫藥組成物可含有用於改變或保持pH、浸透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、緩釋率、吸收率、滲透率之製劑用物質。就製劑用物質而言，可列舉下列者，然而不以此等為限：甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類；抗菌劑；抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑；磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、三-鹽酸(Tris-HCl)溶液等之緩衝劑；甘露醇或甘胺酸等之填充劑；伸乙二胺四醋酸(EDTA)等之螯合劑；咖啡因、聚乙烯基吡咯啶、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精等之錯化劑；葡萄糖、甘露糖或糊精等之增量劑；單糖類、雙糖類等之其他碳水化物；著色劑；香味劑；稀釋劑；乳化劑或聚乙烯基吡咯啶等之親水聚合物；低分子量多肽；鹽形成對離子；苯札氯銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、對羥苯甲酸甲酯(methylparaben)、對羥苯甲酸丙酯、氯己啶(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等之防腐劑；甘油、丙烯‧二醇或聚乙二醇等之溶劑；甘露醇或山梨醇等之糖醇；懸浮劑；山梨醇酐酯、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等之聚山梨醇酯、聚乙二醇類(triton)、胺丁三醇(tromethamine)、卵磷酯或膽固 醇等之界面活性劑；蔗糖或山梨醇等之安定化增強劑；氯化鈉、氯化鉀或甘露醇‧山梨醇等之彈性增強劑；輸送劑；賦形劑；及/或藥學上之補助劑。此等製劑用物質之添加量，相對於抗Siglec-15抗體之重量而言，為0.01~100倍，尤其以0.1~10倍為佳。製劑中之較佳醫藥組成物之組成，可由本技術領域者依照適用疾病、適用給與途徑等而適當地決定。
醫藥組成物中之賦形劑或載劑可為液體，亦可為固體。適當的賦形劑或載劑，亦可為注射用水或生理食鹽水、人工腦脊髓液或通常用於非經口給與之其他物質。亦可將中性生理食鹽水或含有血清白蛋白之生理食鹽水使用於載劑。醫藥組成物中可含有pH7.0-8.5之Tris緩衝液、pH4.0-5.5之醋酸緩衝液、pH3.0-6.2之檸檬酸緩衝液。又，此等緩衝液中亦可含有山梨醇或其他化合物。本發明之醫藥組成物，可列舉：含有抗Siglec-15抗體之醫藥組成物及含有抗Siglec-15抗體及至少一種骨疾病治療劑之醫藥組成物，本發明之醫藥組成物可製成具有所選擇之組成及必要純度之藥劑，其可為凍結乾燥品或液體之形式。含有抗Siglec-15抗體之醫藥組成物，及含有抗Siglec-15抗體及至少一種骨代謝異常治療藥劑之醫藥組成物亦可藉由使用如蔗糖之適當賦形劑而成形為凍結乾燥品。
本發明之醫藥組成物可調製成非經口給與用，亦可調製成經口給與用而由消化管吸收。製劑之組成及濃度，可由給與方法來決定。由於本發明之醫藥組成 物所含之抗Siglec-15抗體對Siglec-15之親和性高，即對Siglec-15之解離常數(Kd值)低，即使減少對人類之給與量，仍可發揮藥效，所以可根據此結果來決定本發明之醫藥組成物對人類之給與量。給與量，當將人類抗Siglec-15抗體給與至人類時，只要每1~180日給與1次，每次約0.1~100mg/kg即可。
就本發明之醫藥組成物之形態而言，可列舉包含點滴之注射劑、栓劑、噴鼻劑、舌下劑、經皮膚吸收劑等。
[實施例]
以下，藉由實施例更具體地說明本發明，然而本發明並不以此等為限。再者，在下述實施例中，有關基因操作之各操作，只要未特別明示，皆係依照在「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，由Cold Spring Harbor Laboratory Press於1989年發刊)所記載之方法進行，或者在使用市售之試藥或套組之情況，依照市售品之指示書使用。
[實施例1]含有可溶型人類Siglec-15蛋白質之培養液的調製及精製
將人類Siglec-15之細胞外區域cDNA以PCR增幅，藉由納入pDNOR221載體(Invitrogen公司製)中，製作入門純系(entry clone)。從該入門純系重組成目標載體pDONM，而得到表現質體(可溶型人類Siglec-15/pDONM)，其中該pDONM係被設計成在插子之C末側附加有V5抗原決定部位及6×His標籤。將可溶型人類Siglec-15/ pDONM轉染入293-F細胞中，並於6~12% CO2濃度，37℃下攪拌培養96小時(4天)。回收培養液，藉由離心，調製成含有可溶型人類Siglec-15蛋白質之培養上清液。將所得到之培養上清，使用Ni-Sepharose HP管柱(Amersham Biosciences公司製)進行部分精製，繼而使用Resource Q管柱(Amersham Biosciences公司製)進行分劃。藉由SDS-聚丙烯醯胺電泳(還原條件下)及銀染色，進行可溶型人類Siglec-15蛋白質之檢測及純度檢定，結果確認在未吸附於Resource Q管柱之蛋白質部分中，分子量約35kDa之蛋白質(可溶型人類Siglec-15蛋白質)有效率地被精製濃縮。
[實施例2]產生大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之融合瘤之建立及精製抗體之調製
用在實施例1中所製作之精製可溶型人類Siglec-15蛋白質使大鼠免疫。藉由試驗採血，確認抗體價上升後使其安樂死，並摘出脾臟。細胞融合係依照一般的小鼠(大鼠)脾臟細胞與骨髓瘤細胞之融合法實施。藉由篩選，選取抗體價高之35純系，進一步進行1次、2次選殖操作。其結果，成功地建立抗體價高之融合瘤，即#24A3。將所建立之融合瘤以1×107細胞/小鼠之量移植至裸小鼠之腹腔內。移植後，在可充分見到腹水蓄積的時間點，抽取腹水，並精製IgG部分。藉由以上之操作，調製大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3。
[實施例3]大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3對於人類Siglec-15蛋白質之結合性評價
3-1)人類Siglec-15 V-set結構域之表現的精製
將編碼在人類Siglec-15 V-set結構域(包含NCBI蛋白資料庫之登錄編號NP_998767之胺基酸序列之第39至165號之胺基酸殘基的多肽)之N末端側連結有His標籤及因子Xa(FactorXa)之蛋白的DNA納入載體pDEST14(Invitrogen公司，型錄編號：11801-016)中。用該質體將大腸桿菌Rosetta-gamiB(DE3)(Novagen公司，型錄編號：71136-4)轉形，並以TB培養基(Invitrogen公司、型錄編號：22711-022)中培養。培養後，將經超音波震碎之菌體離心，將上清液用HisTrap HP管柱(GE Healthcare公司，型錄編號：17-5247-01)精製。然後，用因子Xa(NEW ENGLAND BioLabs公司，型錄編號P8010L)將His標籤切斷後，使用Mono S5/50 GL管柱(GE Healthcare公司，型錄編號：17-5168-01)，再者，Superdex 75 10/300管柱(GE Healthcare公司，型錄編號：17-5174-01)精製，然後藉由電泳將人類Siglec-15 V-set結構域精製至分子量為14kDa之單一帶(band)為止。
3-2)大鼠#32A3與人類Siglec-15 V-set結構域之解離常數的測定
大鼠#24A3抗體與人類Siglec-15 V-set結構域之解離常數測定，係使用Biacore T200(GE Healthcare Bioscience(股))，以抗體作為配位子進行固定化，測定為分析物之抗原。再者，就作為對照之抗體而言，係使用大鼠#32A1抗體。關於大鼠#32A1抗體，在國際公開第WO09/48072號小冊子及第WO10/117011號小冊子中記載 其之調製方法，以及重鏈及輕鏈之序列資料。再者，產生大鼠#32A1抗體之融合瘤#32A1係寄託於日本國獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄託中心(所在地：郵遞區號305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)，於2008年8月28日寄託，並賦予「抗-Siglec-15融合瘤#32A1」之名稱，受託編號為FERM BP-10999(BCRC960381)。
經由以胺偶合法固定於感測晶片CM5(GE Healthcare Bioscience(股))之抗小鼠IgG抗體(GE Healthcare Bioscience(股))中介，使約50RU之#32A1或#24A3抗體結合於感測晶片上。就運行緩衝液(running buffer)而言，使用HBS-EP+(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%界面活性劑P20)。在結合有抗體之晶片上，以90μl/分鐘之流速添加抗原之稀釋系列溶液(0.003-2nM)共計233秒，持續觀測3600秒之解離相。就再生溶液而言，係將3M之MgCl2以10μl/分鐘之流速添加30秒。數據之解析，係使用分析軟體(Biacore T200 Evaluation Software，version 1.0)之1：1結合模型，算出結合速度常數kon、解離速度常數koff及解離常數(KD；KD=koff/kon)。其結果，就KD值而言，#32A1為1.5E-10[M]、#24A3為7.0E-11[M]；#24A3與#32A1相比，具有約2倍強之親和性。
[實施例4]編碼大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之可變區域的cDNA之增幅及鹼基序列之解析
4-1)#24A3之重鏈及輕鏈之N末端胺基酸序列之鑑定 為鑑定#24A3之重鏈及輕鏈之N末端胺基酸序列，將於實施例2中所調製之#24A3用SDS-PAGE分離。將分離後之凝膠中之蛋白質轉印在Sequi-Blot PVDF膜(BIO-RAD公司)上，用洗淨緩衝液(25mM NaCl、10mM硼酸鈉緩衝液，pH8.0)洗淨後，於染色液(50%甲醇、20%醋酸、0.05%考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue))中浸漬5分鐘進行染色後，以90%甲醇脫色。切取PVDF膜上相當於可視化之重鏈(移動度小者之區帶)及輕鏈(移動度大者之區帶)之帶部分。相當於重鏈之帶，在少量之0.5%聚乙烯基吡咯烷酮/100mM醋酸溶液中，於37℃保溫30分鐘後，用水充分洗淨，繼而，使用Pfu焦麩胺酸胺基肽酶套組(Takara Bio股份有限公司)除去修飾N末端殘基，用水洗淨後風乾。使用Procise cLC蛋白質測序儀(sequencer)Model 492cLC(Applied Biosystems)，藉由自動埃德曼法(參照Edman et.al.(1967)Eur.J.Biochem.1,80)，鑑定各個之N末端胺基酸序列。其結果，相當於#24A3之重鏈之帶的N末端胺基酸序列為：VQLQQSGAELTKP，相當於輕鏈之帶之N末端胺基酸序列為：DIVMTQSPTSMSIS。
4-2)從產生#24A3之融合瘤之mRNA之調整
為了將含有#24A3之可變區域的cDNA增幅，使用mRNA單離套組(Roche Applied Science公司)，從產生#24A3之融合瘤調製mRNA。
4-3)cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成
cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成，係使用100ng 之在上述4-2)中所調製之mRNA，並使用SMARTer RACE cDNA增幅套組(Clontech公司)實施。
4-4)藉由5’-RACE PCR增幅含有#24A3之重鏈可變區域的cDNA及決定序列
就以PCR增幅#24A3之重鏈基因之可變區域的cDNA所用之引子而言，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE cDNA增幅套組)、及具有5’-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3’(RG2AR3)之序列的寡核苷酸。關於UPM，係使用附屬於SMARTer RACE cDNA增幅套組(Clontech公司)者，RG2AR3係從資料庫之大鼠重鏈(IgG2a)的恆定區域之序列設計。
藉由該引子之組合，及在上述4-3)中所合成之cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板之5’-RACE PCR，將含有#24A3之重鏈之可變區域的cDNA增幅。PCR係使用KOD-plus-(TOYOBO公司)作為聚合物酶，依照SMARTer RACE cDNA增幅套組(Clontech公司)之操作手冊，以隨附之PCR程式實施。
使用MinElute PCR純化套組(QIAGEN公司)精製含有經5’-RACE PCR增幅之重鏈可變區域的cDNA後，使用Zero Blunt TOPO PCR選殖套組(Invitrogen公司)進行選殖，並定序解析含有所選殖之重鏈可變區域的cDNA之核苷酸序列。
就定序(sequencing)引子而言，係使用依照資料庫之大鼠重鏈之恆定區域之序列來設計且具有序列 5’-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3’(RG2AR3)的寡核苷酸，及NUP(巢式通用引子A(Nested Universal Primer A)：附屬於SMARTer RACE cDNA增幅套組)。
定序(sequencing)解析係使用基因序列解析裝置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems」或「Applied Biosystems 3730xl Analyzer；Applied Biosystems」)來實施，定序反應係使用GeneAmp 9700(Applied Biosystems公司)。
將所決定之編碼#24A3之重鏈可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列表之序列編號1中，將胺基酸序列示於序列編號2中。序列編號1之核苷酸序列及序列編號2之胺基酸序列亦記載於第1圖中。
由核苷酸序列所決定之#24A3之重鏈可變區域的胺基酸序列，與在上述4-1)中所決定之N末端胺基酸序列一致。
4-5)藉由5’-RACE PCR增幅含有#24A3之輕鏈可變區域之cDNA及決定序列
就以PCR增幅#24A3之輕鏈基因之可變區域的cDNA所用之引子而言，係使用UPM(通用引子A混合物(Universal Primer A Mix)：附屬於SMARTer RACE cDNA增幅套組)及具有序列5’-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3’(RKR5)的寡核苷酸。UPM係使用SMARTer RACE cDNA增幅套組(Clontech公司)所附屬者，RKR3係依照資料庫之大鼠輕鏈之恆定區域之序列來設計。
藉由該引子組合，及以在上述4-3)中所合成之cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板之5’-RACE PCR，將含有#24A3之輕鏈可變區域的cDNA增幅。PCR係使用KOD-plus-(TOYOBO公司)作為聚合物酶，依照SMARTer RACE cDNA增幅套組(ClontechH公司)之操作手冊，以隨附之PCR程式實施。
使用MinElute PCR純化套組(QIAGEN公司)精製以5’-RACE PCR所增幅之含有輕鏈可變區域的cDNA後，使用Zero Blunt TOPO PCR選殖套組(Invitrogen公司)進行選殖，然後定序解析所選殖之含有輕鏈可變區域的cDNA之核苷酸序列。
就定序引子而言，使用依照資料庫之大鼠輕鏈之恆定區域之序列所設計之具有序列5’-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3’(RKR5)的寡核苷酸，及NUP(巢式通用引子A(Nested Universal Primer A)：附屬於SMARTer RACE cDNA增幅套組)。
定序解析係使用基因序列解析裝置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems」或「Applied Biosystems 3730xl Analyzer；Applied Biosystems」)來實施，定序反應係使用GeneAmp 9700(Applied Biosystems公司)。
將所決定之編碼#24A3之輕鏈可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列表之序列編號3中，將胺基酸序列示於序列編號4中。序列編號3之核苷酸序列及序列編號4之胺基酸序列亦記載於第2圖中。由核苷酸序列 所決定之#24A3之輕鏈可變區域的胺基酸序列，與在上述4-1)中所決定之N末端胺基酸序列一致。
[實施例5]大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類嵌合抗體基因表現構築物(contruct)之製作
5-1)嵌合及人類化輕鏈表現載體pCMA-LK之構築
使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech公司)，將質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)以限制酵素XbaI及PmeI消化所得到之約5.4kb之片段，與含有編碼序列編號5所示之人類κ鏈分泌信號及人類κ鏈恆定區域之核苷酸序列的DNA片段結合，製作pcDNA3.3/LK。
以pcDNA3.3/LK作為模板，用下述引子組進行PCR，將所得到之約3.8kb之片段磷酸化後，藉由自行連接(self-ligation)，構築在CMV啟動子之下游具有信號序列、選殖部位、及人類κ鏈恆定區域之嵌合及人類化輕鏈表現載體pCMA-LK。
引子組
5’-tataccgtcgacctctagctagagcttggc-3’(3.3-F1)
5’-gctatggcagggcctgccgccccgacgttg-3’(3.3-R1)
5-2)嵌合及人類化IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2之構築
使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech公司)，將pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而除去κ鏈分泌信號及人類κ鏈恆定區域之DNA片段，與含有編碼人類重鏈分泌信號及人類IgG2恆定區域之核苷酸序列的DNA片段( 序列編號6)結合，構築在CMV啟動子之下游具有信號序列、選殖部位、人類IgG2重鏈恆定區域之嵌合及人類化IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2。
5-3)人類嵌合#24A3輕鏈表現載體之構築
以含有實施例4)中所得到之#24A3之輕鏈可變區域的cDNA作為模板，藉由KOD-Plus-(TOYOBO公司)及下述之引子組，將含有編碼輕鏈之可變區域之cDNA的DNA片段增幅，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech公司)將上述DNA片段插入嵌合及人類化抗體輕鏈表現通用載體pCMA-LK以限制酵素BsiWI切斷之處，而構築成人類嵌合#24A3輕鏈表現載體。將所得到之表現載體命名為「pCMA-LK/#24A3」。所製作之人類嵌合#24A3輕鏈基因具有序列表之序列編號9所記載之核苷酸序列，並編碼序列表之序列編號10所記載之胺基酸序列。序列編號9之核苷酸序列中，包含第1至60號之核苷酸的序列、包含第61至387號之核苷酸的序列、包含第388至702號之核苷酸的序列分別編碼信號序列、輕鏈可變區域序列、輕鏈恆定區域序列。序列編號10之胺基酸編號1至20所示之胺基酸序列相當於分泌信號，序列編號21至129所示之胺基酸序列相當於輕鏈可變區域，再者胺基酸編號130至234所示之胺基酸序列相當於輕鏈恆定區域。序列編號9之核苷酸序列及序列編號10之胺基酸序列亦記載於第4圖中。
人類嵌合#24A3輕鏈用引子組
5’-GATCTCCGGCGCGTACGGCGACATTGTGATGACTCA GTCTCCCACATCC-3’(24A3L-F)
5’-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTGATCTCCAGCTTGATCCCAG-3’(24A3L-R)
5-4)人類嵌合#24A3重鏈表現載體之構築
以含有在實施例4)中所得到之#24A3重鏈可變區域的cDNA作為模板，用KOD-Plus-(TOYOBO公司)及下述之引子組將含有編碼重鏈可變區域的cDNA之DNA片段增幅，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech公司)將此等DNA片段插在嵌合及人類化IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2以限制酵素BlpI切斷之處，而構築成人類嵌合#24A3重鏈表現載體。將所得到之表現載體命名為「pCMA-G2/#24A3」。所製作之人類嵌合#24A3重鏈基因具有序列表之序列編號7所記載之核苷酸序列，並編碼序列表之序列編號8所記載之胺基酸序列。序列編號7之核苷酸序列中，包含第1至57號之核苷酸的序列、包含第58至420號之核苷酸的序列、包含第421至1398號之核苷酸的序列分別編碼信號序列、重鏈可變區域序列、重鏈恆定區域序列。序列編號8之胺基酸編號1至19所示之胺基酸序列相當於分泌信號，第20至140號所示之胺基酸序列相當於重鏈可變區域，再者胺基酸編號141至466所示之胺基酸序列相當於重鏈恆定區域。序列編號7之核苷酸序列及序列編號8之胺基酸序列亦記載於第3圖中。
人類嵌合#24A3重鏈用引子組
5’-CCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAG-3’(24A3H-F)
5’-CTTGGTGCTGGCTGAGCTCACAGTGACCAGGGTTCCTGGGCCCCAG-3’(24A3RR)
[實施例6]大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類嵌合抗體之調製
6-1)大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類嵌合抗體之生產
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)係依照操作手冊，進行繼代、培養。將對數增殖期之1.2×109個FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)種植於3L Fernbach Erlenmeyer燒瓶(CORNING公司)中，以FreeStyle293表現用培養基(Invitrogen公司)稀釋，調製為1.0×106細胞/ml後，於37℃，8%CO2恆溫箱內，以90rpm進行一小時振盪培養。將3.6mg之聚伸乙亞胺(Polyscience #24765)溶解於20ml之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中，繼而使用NucleoBond Xtra(TaKaRa公司)，將調製之H鏈表現載體(0.4mg)及L鏈表現載體(0.8mg)懸浮於20ml之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中。在20ml之聚伸乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液中，添加20ml之表現載體/Opti-Pro SFM混合液，穩定地攪拌，進一步放置5分鐘後，添加於FreeStyle 293F細胞中。將於37℃，8%CO2恆溫箱中以90rpm振盪培養7日所得到之培養上清液經由可拋棄式膠囊型過濾器(Disposable Capsule Filter)(Advantec #CCS-045-E1H)過濾。
將藉由pCMA-G2/#24A3與pCMA-LK/#24A3之組合所取得之大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3的 人類嵌合抗體命名為c#24A3。
6-2)大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類嵌合抗體之精製
從在上述6-1)中所得到之培養上清液，將抗體藉由rProteinA親和力層析(4-6℃下)及陶瓷羥磷灰石(ceramic hydroxyapatite)(室溫下)之2段步驟精製。rProteinA親和力層析精製後及陶瓷羥磷灰石(ceramic hydroxyapatite)精製後之緩衝液取代步驟皆係於4-6℃下實施。首先，將培養上清液施加於經PBS平衡化之MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司製，HiTrap管柱)。將培養液全部加入管柱後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱洗淨。繼而以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶出，並收集含有抗體之部分。藉由將該部分透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)取代為PBS後，將用5mM磷酸鈉/50mM MES/pH7.0之緩衝液稀釋5倍之抗體溶液，施加於經5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0之緩衝液平衡化之陶瓷羥磷灰石管柱(日本Bio-Rad，Bio-Scale CHT Type-I Hydroxyapatite Column)中。用氯化鈉實施直線性濃度梯度溶出，收集含有抗體之部分。將該部分藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，進行對HBSor(25mM組織胺/5%山梨醇，pH6.0)之緩衝液取代。最後，藉由離心超濾式濾器裝置(Centrifugal UF Filter Device)VIVASPIN20(分劃分子量UF10K，Sartorius公司，4℃下)濃縮，將IgG濃度調製成10mg/ml，形成精製樣本。
[實施例7]大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之設計
a)#24A3之人類化版本之設計
a)-i)#24A3之可變區域之分子模擬(modeling)
#24A3之可變區域之分子模擬，就同源性造型而言，可藉由一般周知之方法(Methods in Enzymology,203,121-153,(1991))而實施。將蛋白質資料銀行(Protein Data Bank)(Nuc.Acid Res.35,D301-D303(2007))所登錄之人類免疫球蛋白之可變區域之1次序列(可從X射線結晶構造取得所誘導之三次元構造)，與上文所決定之#24A3之可變區域比較。結果，12E8被選為在與#24A3之輕鏈之可變區域比對時同樣地為框架中有缺損之抗體之中，具有最高序列同源性者。又，2OSL被選為與#24A3之重鏈可變區域比對時，具有最高序列同源性者。框架區域之三次元構造，係藉由將對應於#24A3之輕鏈及重鏈之12E8及2OSL之座標加以組合，得到「框架模型」而製作。繼而，分別將有關CDR之代表性構形(conformation)納入框架模型中。
最後，為了得到#24A3之可變區域之可能分子模型，以能量之觀點，進行排除不利之原子間接觸用的能量計算。上述順序係使用市售之蛋白質立體構造解析程式DiscoveryStudio(Accelrys,Inc.)來進行。
a)-ii)對於人類化#24A3之胺基酸序列之設計
人類化#24A3抗體之構築係藉由CDR移植(CDR-grafting)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029- 10033(1989))等一般周知之方法進行。受體(acceptor)抗體係根據框架區域內之胺基酸同源性，選擇2種。將#24A3之框架區域之序列，與抗體之胺基酸序列之Kabat資料庫(Nuc.Acid Res.29,205-206(2001))之全部人類框架比較，結果，HuMc3抗體，由於與框架區域具有74%之序列同源性，所以被選擇作為受體。將HuMc3之框架區域之胺基酸殘基，與#24A3之胺基酸殘基對準，鑑定相異之胺基酸所使用之位置。此等殘基之位置，係使用上述所構築之#24A3之三次元模型來分析，而且應被移植在受體上之供體(donor)殘基係依照Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))所提供之基準來選擇。藉由將所選擇之幾個供體殘基移入受體抗體，如以下之實施例所記載之方式，構築成人類化#32A1序列。又，關於#24A3之各CDR中1至3個胺基酸殘基經其他胺基酸殘基取代之CDR改變人類化#24A3序列，亦如以下之實施例所記載之方式構築。
b)#24A3重鏈之人類化
b)-i)h#24A3-H1型重鏈：
伴隨將序列表之序列編號8所示之人類嵌合#24A3重鏈之胺基酸編號24(麩醯胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號30(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號31(蘇胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號35(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號39(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號43(蘇胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號49(脯胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號56(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號 57(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號59(精胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號63(丙胺酸)取代為甘胺酸，胺基酸編號67(異白胺酸)取代為甲硫胺酸，胺基酸編號86(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號87(丙胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號89(白胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號90(丙胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號91(纈胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號95(絲胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號99(苯丙胺酸)取代為酪胺酸，胺基酸編號101(麩醯胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號106(蘇胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號107(脯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號132(脯胺酸)取代為麩醯胺酸而設計之人類化#24A3重鏈被命名為「h#24A3-H1型重鏈」。
h#24A3-H1型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號12中。序列編號12之胺基酸序列中，包含第1至19號之胺基酸殘基之序列、包含第20至140號之胺基酸殘基之序列、包含第141至466號之胺基酸殘基之序列，分別相當於信號序列、重鏈可變區域、重鏈恆定區域。編碼序列編號12之胺基酸序列之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號11中。包含序列編號11之核苷酸序列之第1至57號之核苷酸之序列、包含第58至420號之核苷酸之序列、包含第421至1398號之核苷酸之序列，分別編碼信號序列、重鏈可變區域序列、重鏈恆定區域序列。序列編號11之核苷酸序列及序列編號12之胺基酸序列，亦記載於第5圖中。
b)-ii)h#24A3-H2型重鏈：
伴隨序列表之序列編號8所示之人類嵌合#24A3重鏈之胺基酸編號24(麩醯胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號30(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號31(蘇胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號35(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號39(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號43(蘇胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號56(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號57(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號59(精胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號63(丙胺酸)取代為甘胺酸，胺基酸編號67(異白胺酸)取代為甲硫胺酸，胺基酸編號86(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號87(丙胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號89(白胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號90(丙胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號91(纈胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號95(絲胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號99(苯丙胺酸)取代為酪胺酸，胺基酸編號101(麩醯胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號106(蘇胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號107(脯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號132(脯胺酸)取代為麩醯胺酸而設計之人類化#24A3重鏈被命名為「h#24A3-H2型重鏈」。
h#24A3-H2型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號14中。序列編號14之胺基酸序列中，包含第1至19號之胺基酸殘基的序列、包含第20至140號之胺基酸殘基的序列、包含第141至466號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、重鏈可變區域、重鏈恆定區域。編碼序列編號14之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號13中。包含序列編號13之核苷酸 序列之第1至57號之核苷酸的序列、包含第58至420號之核苷酸的序列、包含第421至1398號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、重鏈可變區域序列、重鏈恆定區域序列。序列編號13之核苷酸序列及序列編號14之胺基酸序列亦記載於第6圖中。
b)-iii)h#24A3-H3型重鏈：
伴隨序列表之序列編號8所示之人類嵌合#24A3重鏈之胺基酸編號24(麩醯胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號30(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號31(蘇胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號35(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號39(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號43(蘇胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號57(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號59(精胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號63(丙胺酸)取代為甘胺酸，胺基酸編號86(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號89(白胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號90(丙胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號95(絲胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號99(苯丙胺酸)取代為酪胺酸，胺基酸編號101(麩醯胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號106(蘇胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號107(脯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號132(脯胺酸)取代為麩醯胺酸而設計之人類化#24A3重鏈被命名為「h#24A3-H3型重鏈」。
h#24A3-H3型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號16中。序列編號16之胺基酸序列中，包含第1至19號之胺基酸殘基的序列、包含第20至140號之胺基酸殘基的序列、包含第141至466號之胺基酸殘基的 序列，分別相當於信號序列、重鏈可變區域、重鏈恆定區域。編碼序列編號16之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號15中。包含序列編號15之核苷酸序列之第1至57號之核苷酸的序列、包含第58至420號之核苷酸的序列、包含第421至1398號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、重鏈可變區域序列、重鏈恆定區域序列。序列編號15之核苷酸序列及序列編號16之胺基酸序列亦記載於第7圖中。
b)-iv)h#24A3-H4型重鏈：
伴隨序列表之序列編號8所示之人類嵌合#24A3重鏈之胺基酸編號24(麩醯胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號30(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號31(蘇胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號35(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號39(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號59(精胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號63(丙胺酸)取代為甘胺酸，胺基酸編號86(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號90(丙胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號95(絲胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號99(苯丙胺酸)取代為酪胺酸，胺基酸編號101(麩醯胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號106(蘇胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號107(脯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號132(脯胺酸)取代為麩醯胺酸而設計之人類化#24A3重鏈被命名為「h#24A3-H4型重鏈」。
h#24A3-H4型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號18中。序列編號18之胺基酸序列中，包含第1至19號之胺基酸殘基的序列、包含第20至140號之 胺基酸殘基的序列、包含第141至466號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、重鏈可變區域、重鏈恆定區域。編碼序列編號18之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號17中。包含序列編號17之核苷酸序列之第1至57號之核苷酸的序列、包含第58至420號之核苷酸的序列、包含第421至1398號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、重鏈可變區域序列、重鏈恆定區域序列。序列編號17之核苷酸序列及序列編號18之胺基酸序列亦記載於第8圖中。
b)-v)h#24A3-H5型重鏈：
伴隨序列表之序列編號8所示之人類嵌合#24A3重鏈之胺基酸編號24(麩醯胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號30(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號31(蘇胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號35(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號39(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號95(絲胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號99(苯丙胺酸)取代為酪胺酸，胺基酸編號101(麩醯胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號106(蘇胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號107(脯胺酸)取代為絲胺酸而設計之人類化#24A3重鏈被命名為「h#24A3-H5型重鏈」。
h#24A3-H5型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號20中。序列編號20之胺基酸序列中，包含第1至19號之胺基酸殘基的序列、包含第20至140號之胺基酸殘基的序列、包含第141至466號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、重鏈可變區域、重鏈恆定 區域。編碼序列編號20之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號19中。包含序列編號19之核苷酸序列之第1至57號之核苷酸的序列、包含第58至420號之核苷酸的序列、包含第421至1398號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、重鏈可變區域序列、重鏈恆定區域序列。序列編號19之核苷酸序列及序列編號20之胺基酸序列亦記載於第9圖中。
b)-vi)h#24A3-H6型重鏈：
伴隨序列表之序列編號8所示之人類嵌合#24A3重鏈之胺基酸編號24(麩醯胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號30(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號31(蘇胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號35(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號39(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號95(絲胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號101(麩醯胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號106(蘇胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號107(脯胺酸)取代為絲胺酸而設計之人類化#24A3重鏈被命名為「h#24A3-H6型重鏈」。
h#24A3-H6型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號22中。序列編號22之胺基酸序列中，包含第1至19號之胺基酸殘基的序列、包含第20至140號之胺基酸殘基的序列、包含第141至466號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、重鏈可變區域、重鏈恆定區域。編碼序列編號22之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號21中。包含序列編號21之核苷酸序列之第1至57號之核苷酸的序列、包含第58至420號之 核苷酸的序列、包含第421至1398號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、重鏈可變區域序列、重鏈恆定區域序列。序列編號21之核苷酸序列及序列編號22之胺基酸序列亦記載於第10圖中。
c)#24A3輕鏈之人類化
c)-i)h#24A3-L1型輕鏈：
伴隨序列表之序列編號10所示之人類嵌合#24A3輕鏈之胺基酸編號29(蘇胺酸)取代為天冬胺酸，胺基酸編號31(甲硫胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號32(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號33(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號35(纈胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號37(天冬胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號39(纈胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號41(甲硫胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號60(蘇胺酸)取代為脯胺酸，胺基酸編號63(絲胺酸)取代為脯胺酸，胺基酸編號83(蘇胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號93(苯丙胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號97(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號98(纈胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號103(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號120(絲胺酸)取代為麩醯胺酸，胺基酸編號122(異白胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號124(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號129(丙胺酸)取代為蘇胺酸而設計之人類化#24A3輕鏈被命名為「h#24A3-L1型輕鏈」。
h#24A3-L1型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號24中。序列編號24之胺基酸序列中，包 含第1至20號之胺基殘基的序列、第21至129號之胺基酸殘基的序列、包含第130至234號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、輕鏈可變區域、輕鏈恆定區域。編碼序列編號24之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號23。包含序列編號23之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸的序列、包含第61至387號之核苷酸的序列、包含第388至702號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、輕鏈可變區域序列、輕鏈恆定區域序列。序列編號23之核苷酸序列及序列編號24之胺基酸序列亦記載於第11圖中。
c)-ii)h#24A3-L2型輕鏈：
伴隨序列表之序列編號10所示之人類嵌合#24A3輕鏈之胺基酸編號29(蘇胺酸)取代為天冬胺酸，胺基酸編號31(甲硫胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號32(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號33(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號35(纈胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號37(天冬胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號39(纈胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號41(甲硫胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號60(蘇胺酸)取代為脯胺酸，胺基酸編號83(蘇胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號97(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號98(纈胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號103(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號120(絲胺酸)取代為麩醯胺酸，胺基酸編號122(異白胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號124(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號129(丙胺酸)取代為蘇胺酸而設計之人類化#24A3輕鏈被 命名為「h#24A3-L2型輕鏈」。
h#24A3-L2型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號26中。序列編號26之胺基酸序列中，包含第1至20號之胺基殘基的序列、包含第21至129號之胺基酸殘基的序列、包含第130至234號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、輕鏈可變區域、輕鏈恆定區域。編碼序列編號26之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號25中。包含序列編號25之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸的序列、包含第61至387號之核苷酸的序列、包含第388至702號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、輕鏈可變區域序列、輕鏈恆定區域序列。序列編號25之核苷酸序列及序列編號26之胺基酸序列亦記載於第12圖中。
c)-iii)h#24A3-L3型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號10所示之人類嵌合#24A3輕鏈之胺基酸編號29(蘇胺酸)取代為天冬胺酸，胺基酸編號31(甲硫胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號32(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號33(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號35(纈胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號37(天冬胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號39(纈胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號41(甲硫胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號60(蘇胺酸)取代為脯胺酸，胺基酸編號97(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號98(纈胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號103(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號120(絲胺酸)取代為麩醯胺酸，胺基酸編號122(異白胺 酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號124(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號129(丙胺酸)取代為蘇胺酸而設計之人類化#24A3輕鏈被命名為「h#24A3-L3型輕鏈」。
h#24A3-L3型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號28中。序列編號28之胺基酸序列中，包含第1至20號之胺基殘基的序列、包含第21至129號之胺基酸殘基的序列、包含第130至234號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、輕鏈可變區域、輕鏈恆定區域。編碼序列編號28之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號27中。包含序列編號27之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸的序列、包含第61至387號之核苷酸的序列、包含第388至702號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、輕鏈可變區域序列、輕鏈恆定區域序列。序列編號27之核苷酸序列及序列編號28之胺基酸序列亦記載於第13圖中。
c)-iv)h#24A3-L4型輕鏈：
伴隨序列表之序列編號10所示之人類嵌合#24A3輕鏈之胺基酸編號29(蘇胺酸)取代為天冬胺酸，胺基酸編號31(甲硫胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號32(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號33(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號35(纈胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號37(天冬胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號39(纈胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號41(甲硫胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號97(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號98(纈胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號103(白胺酸)取代為纈 胺酸，胺基酸編號122(異白胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號124(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號129(丙胺酸)取代為蘇胺酸而設計之人類化#24A3輕鏈被命名為「h#24A3-L4型輕鏈」。
h#24A3-L4型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號30。序列編號30之胺基酸序列中，包含第1至20號之胺基殘基的序列、包含第21至129號之胺基酸殘基的序列、包含第130至234號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、輕鏈可變區域、輕鏈恆定區域。編碼序列編號30之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號29中。包含序列編號29之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸的序列、包含第61至387號之核苷酸的序列、包含第388至702號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、輕鏈可變區域序列、輕鏈恆定區域序列。序列編號29之核苷酸序列及序列編號30之胺基酸序列亦記載於第14圖中。
d)h#24A3重鏈之人類化(其之2)
d)-i)h#24A3-H2b型重鏈：
伴隨序列表之序列編號8所示之人類嵌合#24A3重鏈之胺基酸編號24(麩醯胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號30(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號31(蘇胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號35(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號39(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號43(蘇胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號56(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號57(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號59( 精胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號63(丙胺酸)取代為甘胺酸，胺基酸編號67(異白胺酸)取代為甲硫胺酸，胺基酸編號86(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號87(丙胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號89(白胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號90(丙胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號91(纈胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號95(絲胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號99(苯丙胺酸)取代為酪胺酸，胺基酸編號101(麩醯胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號106(蘇胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號107(脯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號122(絲胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號132(脯胺酸)取代為麩醯胺酸而設計之人類化#24A3重鏈被命名為「h#24A3-H2b型重鏈」。
h#24A3-H2b型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號38中。序列編號38之胺基酸序列中，包含第1至19號之胺基酸殘基的序列、包含第20至140號之胺基酸殘基的序列、包含第141至466號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、重鏈可變區域、重鏈恆定區域。編碼序列編號38之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號37中。包含序列編號37之核苷酸序列之第1至57號之核苷酸的序列、包含第58至420號之核苷酸的序列、包含第421至1398號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、重鏈可變區域序列、重鏈恆定區域序列。序列編號37之核苷酸序列及序列編號38之胺基酸序列亦記載於第17圖中。
d)-ii)h#24A3-H2c型重鏈：
伴隨序列表之序列編號8所示之人類嵌合#24A3重鏈之胺基酸編號24(麩醯胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號30(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號31(蘇胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號35(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號39(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號43(蘇胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號56(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號57(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號59(精胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號63(丙胺酸)取代為甘胺酸，胺基酸編號86(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號87(丙胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號89(白胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號90(丙胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號91(纈胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號95(絲胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號99(苯丙胺酸)取代為酪胺酸，胺基酸編號101(麩醯胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號106(蘇胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號107(脯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號122(絲胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號132(脯胺酸)取代為麩醯胺酸而設計之人類化#24A3重鏈被命名為「h#24A3-H2c型重鏈」。
h#24A3-H2c型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號40中。序列編號40之胺基酸序列中，包含第1至19號之胺基酸殘基的序列、包含第20至140號之胺基酸殘基的序列、包含第141至466號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、重鏈可變區域、重鏈恆定區域。編碼序列編號40之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號39中。包含序列編號39之核苷 酸序列之第1至57號之核苷酸的序列、包含第58至420號之核苷酸的序列、包含第421至1398號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、重鏈可變區域序列、重鏈恆定區域序列。序列編號39之核苷酸序列及序列編號40之胺基酸序列亦記載於第18圖中。
d)-iii)h#24A3-H2d型重鏈：
伴隨序列表之序列編號8所示之人類嵌合#24A3重鏈之胺基酸編號24(麩醯胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號30(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號31(蘇胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號35(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號39(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號43(蘇胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號56(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號57(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號59(精胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號63(丙胺酸)取代為甘胺酸，胺基酸編號67(異白胺酸)取代為甲硫胺酸，胺基酸編號86(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號89(白胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號90(丙胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號91(纈胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號95(絲胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號99(苯丙胺酸)取代為酪胺酸，胺基酸編號101(麩醯胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號106(蘇胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號107(脯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號122(絲胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號132(脯胺酸)取代為麩醯胺酸而設計之人類化#24A3重鏈被命名為「h#24A3-H2d型重鏈」。
h#24A3-H2d型重鏈之胺基酸序列係記載於 序列表之序列編號42中。序列編號42之胺基酸序列中，包含第1至19號之胺基酸殘基的序列、包含第20至140號之胺基酸殘基的序列、包含第141至466號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、重鏈可變區域、重鏈恆定區域。編碼序列編號42之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號41中。序列編號41之核苷酸序列中，包含第1至57號之核苷酸的序列、包含第58至420號之核苷酸的序列、包含第421至1398號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、重鏈可變區域序列、重鏈恆定區域序列。序列編號41之核苷酸序列及序列編號42之胺基酸序列亦記載於第19圖中。
d)-iiii)h#24A3-H2e型重鏈：
伴隨序列表之序列編號8所示之人類嵌合#24A3重鏈之胺基酸編號24(麩醯胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號30(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號31(蘇胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號35(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號39(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號43(蘇胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號56(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號57(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號59(精胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號63(丙胺酸)取代為甘胺酸，胺基酸編號67(異白胺酸)取代為甲硫胺酸，胺基酸編號86(離胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號87(丙胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號89(白胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號90(丙胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號95(絲胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號99(苯丙胺酸)取代為 酪胺酸，胺基酸編號101(麩醯胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號106(蘇胺酸)取代為精胺酸，胺基酸編號107(脯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號122(絲胺酸)取代為離胺酸，胺基酸編號132(脯胺酸)取代為麩醯胺酸而設計之人類化#24A3重鏈被命名為「h#24A3-H2e型重鏈」。
h#24A3-H2e型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號44中。序列編號44之胺基酸序列中，包含第1至19號之胺基酸殘基的序列、包含第20至140號之胺基酸殘基的序列、包含第141至466號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、重鏈可變區域、重鏈恆定區域。編碼序列編號44之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號43中。序列編號43之核苷酸序列中，包含第1至57號之核苷酸的序列、包含第58至420號之核苷酸的序列、包含第421至1398號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、重鏈可變區域序列、重鏈恆定區域序列。序列編號43之核苷酸序列及序列編號44之胺基酸序列亦記載於第20圖中。
e)h#24A3輕鏈之人類化(其之2)
e)-i)h#24A3-L2b型輕鏈
伴隨序列表之序列編號10所示之人類嵌合#24A3輕鏈之胺基酸編號29(蘇胺酸)取代為天冬胺酸，胺基酸編號31(甲硫胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號32(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號33(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號35(纈胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號37(天冬胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號39(纈胺酸)取代為 丙胺酸，胺基酸編號41(甲硫胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號60(蘇胺酸)取代為脯胺酸，胺基酸編號83(蘇胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號93(苯丙胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號97(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號98(纈胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號103(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號120(絲胺酸)取代為麩醯胺酸，胺基酸編號122(異白胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號124(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號129(丙胺酸)取代為蘇胺酸而設計之人類化#24A3輕鏈被命名為「h#24A3-L2b型輕鏈」。
h#24A3-L2b型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號46中。序列編號46之胺基酸序列中，包含第1至20號之胺基殘基的序列、包含第21至129號之胺基酸殘基的序列、包含第130至234號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、輕鏈可變區域、輕鏈恆定區域。編碼序列編號46之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列編號45中。包含序列編號45之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸的序列、包含第61至387號之核苷酸的序列、包含第388至702號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、輕鏈可變區域序列、輕鏈恆定區域序列。序列編號45之核苷酸序列及序列編號46之胺基酸序列亦記載於第21圖中。
e)-ii)h#24A3-L3b型輕鏈
伴隨序列表之序列編號10所示之人類嵌合#24A3輕鏈之胺基酸編號29(蘇胺酸)取代為天冬胺酸，胺基酸編 號31(甲硫胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號32(絲胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號33(異白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號35(纈胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號37(天冬胺酸)取代為麩胺酸，胺基酸編號39(纈胺酸)取代為丙胺酸，胺基酸編號41(甲硫胺酸)取代為異白胺酸，胺基酸編號60(蘇胺酸)取代為脯胺酸，胺基酸編號93(苯丙胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號97(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸，胺基酸編號98(纈胺酸)取代為白胺酸，胺基酸編號103(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號120(絲胺酸)取代為麩醯胺酸，胺基酸編號122(異白胺酸)取代為蘇胺酸，胺基酸編號124(白胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號129(丙胺酸)取代為蘇胺酸而設計之人類化#24A3輕鏈被命名為「h#24A3-L3b型輕鏈」。
h#24A3-L3b型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號48中。包含序列編號48之胺基酸序列之第1至20號之胺基殘基的序列、包含第21至129號之胺基酸殘基的序列、包含第130至234號之胺基酸殘基的序列，分別相當於信號序列、輕鏈可變區域、輕鏈恆定區域。編碼序列編號48之胺基酸序列的核苷酸序列，係記載於序列表之序列編號47中。包含序列編號47之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸的序列、包含第61至387號之核苷酸的序列、包含第388至702號之核苷酸的序列，分別編碼信號序列、輕鏈可變區域序列、輕鏈恆定區域序列。序列編號47之核苷酸序列及序列編號48之胺基酸序列亦記載於第22圖中。
[實施例8]大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之表現載體的製作
8-1)大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之重鏈表現載體的構築
藉由合成含有編碼在實施例7-b)中所記載之大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之重鏈可變區域的基因的DNA(GENEART公司，人工基因合成服務)，並將其插入嵌合及人類化IgG2型重鏈表現通用載體(pCMA-G2)以限制酵素BlpI切斷之處，構築成大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之重鏈表現載體。
8-2)大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之輕鏈表現載體之構築
藉由合成含有編碼在實施例7-c)中所記載之大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之輕鏈可變區域的基因的DNA(GENEART公司、人工基因合成服務)，並插入嵌合及人類化輕鏈表現通用載體(pCMA-LK)以限制酵素BsiWI切斷之處，構築成大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之輕鏈表現載體。
8-3)大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之重鏈表現載體之構築(其之2)
8-3-1)h#24A3-H2b型重鏈表現載體之構築
以在8-1)中所製作之h#24A3-H2型重鏈表現載體作為模板，使用下述引子組及KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)，藉由導入變異，構築h#24A3-H2b型重 鏈表現載體。
引子組：
5’-AAGGGCTACTGGTTCTTCGACTTCTGGGGCCAG-3’(H2b-F)
5’-GTTCAGGCCCCGTCTGGCGCAGTAGTACAC-3’(H2b-R)
8-3-2)h#24A3-H2c型重鏈表現載體之構築
以在8-3-1)中所製作之h#24A3-H2b型重鏈表現載體作為模板，使用下述引子組及KOD-Plus-致突變套組(KOD-Plus-Mutagenesis Kit，TOYOBO公司)，藉由導入變異，構築成h#24A3-H2c型重鏈表現載體。
引子組：
5’-GGCGTGATCCACCCTGGCAGCGGCGGCACC-3’(H2c-F)
5’-GATCCATTCCAGTCCCTGGCCTGGGGCCTGG-3’(H2c-R)
8-3-3)h#24A3-H2d型重鏈表現載體之構築
以在8-3-1)中所製作之h#24A3-H2b型重鏈表現載體作為模板，使用下述引子組及KOD-Plus-致突變套組(TOYOBO公司)，藉由導入變異，構築h#24A3-H2d型重鏈表現載體。
引子組：
5’-ACCATCACCGCCGACACCAGCACCAGCACC-3’(H2d-F)
5’-GGCTCTGGCCTTGAACTTCTCGTTGTAGCCGG-3’(H2 d-R)
8-3-4)h#24A3-H2e型重鏈表現載體之構築
以在8-3-1)中所製作之h#24A3-H2b型重鏈表現載體作為模板，使用下述引子組及KOD-Plus-致突變套組(TOYOBO公司)，藉由導入變異，構築h#24A3-H2d型重鏈表現載體。
引子組：
5’-GACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAAC-3’(H2e-F)
5’-CACGGTGATGGTCACTCTGGCCTTGAACTTCTC-3’(H2e-R)
8-4)大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之輕鏈表現載體之構築(其之2)
8-4-1)h#24A3-L2b型輕鏈表現載體之構築
以在8-2)中所製作之h#24A3-L2型輕鏈表現載體作為模板，使用下述引子組及KOD-Plus-致突變套組(TOYOBO公司)，藉由導入變異，構築h#24A3-L2b型輕鏈表現載體。
引子組：
5’-CTGACCATCAGCAGTCTGCAGGCCGAGGACGTG-3’(L2b-F)
5’-GGTGAAGTCGGTGCCGGAGCCGCTGCCGCTG-3’(L2b-R)
8-4-2)h#24A3-L3b型輕鏈表現載體之構築
以在8-2)中所製作之h#24A3-L3型輕鏈表現載體作 為模板，使用下述引子組及KOD-Plus-致突變套組(TOYOBO公司)，藉由導入變異，構築h#24A3-L3b型輕鏈表現載體。
引子組：
5’-CTGACCATCAGCAGTCTGCAGGCCGAGGACGTG-3’(L2b-F)
5’-GGTGAAGTCGGTGCCGCTGCCGCTGCCTGT-3’(L3b-R)
[實施例9]大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之調製
9-1)大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之生產
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)可依照操作手冊，進行繼代、培養。將對數增殖期之1.2×109個FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)種植於3L Fernbach Erlenmeyer燒瓶(CORNING公司)中，並以FreeStyle293表現培養基(Invitrogen公司)稀釋，調製成1.0×106細胞/ml後，於37℃，8%CO2恆溫箱內，以90rpm振盪培養1小時。將3.6mg之聚伸乙亞胺(Polyscience #24765)溶解於20ml之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)，繼而將使用NucleoBond Xtra(TaKaRa公司)調製之重鏈表現載體(0.4mg)及輕鏈表現載體(0.8mg)懸浮於20ml之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中。在20ml之聚伸乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液中，添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液並穩定地攪拌，進一步放置5分鐘後，添加於 FreeStyle 293F細胞中。將在37℃，8%CO2恆溫箱中，以90rpm振盪培養7日所得到之培養上清液經可拋棄式膠囊型濾器(Advantec #CCS-045-E1H)過濾。
藉由將實施例8-1)、及8-3)中所製作之大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之重鏈表現載體，與實施例8-2)、及8-4)中所製作之大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之輕鏈表現載體加以組合，取得大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體。
9-2)大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之精製
從在上述9-1)中所得到之培養上清液，將抗體藉由rProteinA親和力層析(4-6℃下)及陶瓷羥磷灰石(室溫下)之2段步驟精製。rProteinA親和力層析精製後及陶瓷羥磷灰石精製後之緩衝液取代步驟係於4-6℃下實施。首先，將培養上清液施加於經PBS平衡化之MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司製，HiTrap管柱)中。培養液全部加入管柱後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱洗淨。繼而用2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶出，收集含有抗體之部分。將該部分藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)取代成PBS後，將以5mM磷酸鈉/50mM MES/pH7.0之緩衝液稀釋5倍之抗體溶液，施加於以5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0之緩衝液平衡化之陶瓷羥磷灰石管柱(日本Bio-Rad，Bio-Scale CHT Type-I Hydroxyapatite Column)中。實施 藉由氯化鈉進行之直線性濃度梯度溶出，收集含有抗體之部分。將該部分藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，進行對HBSor(25mM組織胺/5%山梨醇，pH6.0)之緩衝液取代。最後，藉由離心超濾過濾裝置VIVASPIN20(分劃分子量UF10K，Sartorius公司，4℃下)濃縮，將IgG濃度調製為20mg/ml，作為精製樣本。
再者，在本說明書中，將例如具有h#24A3-H1重鏈及h#24A3-L1輕鏈之抗體稱呼為「h#24A3-H1/L1」或「h#24A3-H1/L1抗體」。就藉由上述9-1)及9-2)之方法所調製之抗體之具體例而言，可列舉：h#24A3-H1/L1、h#24A3-H1/L2、h#24A3-H1/L3、h#24A3-H2/L1、h#24A3-H2/L2、h#24A3-H2/L3、h#24A3-H3/L1、h#24A3-H3/L2、h#24A3-H3/L3、h#24A3-H4/L1、h#24A3-H4/L2、h#24A3-H4/L3、h#24A3-H5/L1、h#24A3-H5/L2、h#24A3-H5/L3、h#24A3-H6/L4、h#24A3-H2b/L1、h#24A3-H2b/L2b、h#24A3-H2b/L3b、h#24A3-H2c/L1、h#24A3-H2c/L2b、h#24A3-H2c/L3b、h#24A3-H2d/L1、h#24A3-H2d/L2b、h#24A3-H2d/L3b、h#24A3-H2e/L1、h#24A3-H2e/L2b、及h#24A3-H2e/L3b。
[實施例10]大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之嵌合抗體及人類化抗體對小鼠Siglec-15蛋白質之結合性評價
10-1)嵌合抗體之結合性評價
人類嵌合#24A3抗體及人類Siglec-15 V-set結構域之解離常數測定，係使用Biacore T200(GE Healthcare Bioscience(股))，以抗體作為配位子而固定化，測定為分析物之抗原。再者，就作為對照之抗體而言，係使用人類嵌合#32A1抗體。關於人類嵌合#32A1抗體，在國際公開第WO10/117011號小冊子中記載有其之調製方法，以及重鏈及輕鏈之序列資料。經由以胺偶合法固定於感測器晶片CM5(GE Healthcare Bioscience(股))之抗人類IgG抗體(GE Healthcare Bioscience(股))中介，使約50RU之人類嵌合#24A3抗體或人類嵌合#32A1抗體結合於感測晶片上。就電泳緩衝液而言，係使用HBS-EP+(10mM HEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05%界面活性劑P20)。將抗原之稀釋系列溶液(0.003-2nM)以流速90μl/分鐘添加於結合有抗體之晶片上共計233秒，並持續觀察3600秒之解離相。就再生溶液而言，以流速10μl/分鐘添加3M MgCl2共計30秒。數據之解析係使用分析軟體(Biacore T200 Evaluation Software，version 1.0)之1：1結合模型，算出結合速度常數kon、解離速度常數koff及解離常數(KD；KD=koff/kon)。其結果，人類嵌合#24A3抗體之KD值為1.7E-11[M]，人類嵌合#32A1抗體之KD值為1.4E-10[M]。人類嵌合#24A3抗體具有與大鼠#24A3抗體同等以上之親和性。又，人類嵌合#32A1抗體具有與大鼠#32A1抗體同等之親和性。
10-2)人類化抗體之結合性評價
藉由與上述10-1)同樣之方法，評價大鼠抗人類 Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體對小鼠Siglec-15蛋白質之結合性。將其結果示於表1。
人類化#24A3抗體具有與人類嵌合#24A3抗體同等以上之親和性。
[實施例11]藉由大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之嵌合抗體及人類化抗體對人類正常破骨細胞之分化的影響
11-1)嵌合抗體對人類正常破骨細胞之分化的影響
酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)被認為係伴隨破骨細胞之分化而表現上升的標誌，且係從成熟之破骨細胞分泌。因此，藉由測定破骨細胞之培養上清液中之TRAP的活性，可於體外評價受驗物質對破骨細胞分化的影響。
將正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，從三光純藥購入，型 錄編號2T-110)依照隨附於細胞之規程(protocol)，以成為1×104細胞/孔之方式種植在96孔培養盤中。再者，培養基係使用添加有OPGM添加因子組(從三光純藥購入，型錄編號PT-9501)的破骨前驅細胞用基礎培養基(OPBM，從三光純藥購入，型錄編號PT-8201)，該OPGM添加因子組含有胎牛血清(最終濃度10%)、人類RANKL(最終濃度68.4ng/ml)及人類M-CSF(最終濃度33ng/ml)等。在該培養上清液中，將在實施例2中所取得之大鼠#24A3抗體及在實施例6中所調製之人類嵌合#24A3抗體，分別以使最終濃度成為4、20、100、500ng/ml之方式添加，並於CO2恆溫箱中培養5日。採取75μl之培養上清液，添加75μl之基質溶液(含有11mg/ml對硝苯磷酸及100mM酒石酸鈉的0.2M醋酸鈉緩衝液(pH5.0))，並於室溫培育30分鐘。添加50μl之2N氫氧化鈉溶液，使酵素反應停止，並測定405nm之吸光度，作為TRAP活性之指標(第16圖)。其結果，藉由人類嵌合#24A3抗體，TRAP活性被濃度依存地抑制於4ng/ml至500ng/ml之範圍，確認人類嵌合#24A3抗體可抑制人類破骨細胞之分化。又，由於該人類嵌合抗體之抑制作用，與原本大鼠#24A3抗體之抑制作用為同等以上，研判人類嵌合化並未使活性降低。
11-2)人類化抗體對於人類正常破骨細胞之分化的影響
大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之嵌合抗體及人類化抗體對於人類正常破骨細胞之分化的影響，可藉由上述11-1)記載之方法試驗。
將正常人類破骨前驅細胞，以成為1×104細胞/孔之方式種植於96孔培養盤中。再者，培養基中之人類RANKL，係以使最終濃度成為66ng/ml之方式調製。在該培養上清液中，將在實施例9中所取得之人類化#24A3抗體(h#24A3-H2d/L1、h#24A3-H2e/L1、h#24A3-H2b/L3b及h#24A3-H2c/L2b)及在實施例6中所調製之人類嵌合#24A3抗體，分別以使最終濃度成為4、20、100、500ng/ml之方式添加，並於CO2恆溫箱中培養6日。採取75μl之培養上清液，添加75μl之基質溶液(含有11mg/ml磷酸對-硝基苯酯及100mM酒石酸鈉之0.2M醋酸鈉緩衝液(pH5.0))，於室溫培育20分鐘。添加50μl之2N氫氧化鈉溶液，使酵素反應停止，測定於405nm之吸光度，作為TRAP活性之指標(第23圖)。其結果，h#24A3-H2d/L1、h#24A3-H2e/L1及h#24A3-H2b/L3b在20ng/ml至500ng/ml之範圍，或者h#24A3-H2c/L2b於4ng/ml至500ng/ml之範圍，可濃度依存地抑制TRAP活性。再者，由於此等抑制作用與人類嵌合#24A3抗體之抑制作用約略同等，因此認定人類化幾乎未造成活性之降低。從上述實驗，顯示人類化#24A3抗體可抑制人類破骨細胞之分化。
[實施例12]大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體對於人類正常破骨細胞之骨吸收活性的影響(體外生物活性評價)
已知破骨細胞藉由釋出組織蛋白酶K等蛋白酶，將為骨組織之構成成分的I型膠原分解。OsteoLyse檢定套組(Lonza公司製、型錄編號PA-1500)提供塗覆有與銪結合 之人類膠原的96孔培養盤(96-孔OsteoLyse細胞培養盤)，藉由測定在相同培養盤上培養破骨細胞時游離於上清液中之螢光膠原片段量，可於體外評價破骨細胞之骨吸收活性。大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體所產生之人類正常破骨細胞之骨吸收活性的抑制效果可依照以下所示之方法評價。
將正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，從三光純藥購入，型錄編號2T-110)，依照隨附於細胞之規程，以成為1×104細胞/孔之方式種植在96-孔OsteoLyse細胞培養盤上。再者，培養基係使用添加有OPGM添加因子組(從三光純藥購入，型錄編號PT-9501)的破骨前驅細胞用基礎培養基(OPBM，從三光純藥購入，型錄編號PT-8201)，該OPGM添加因子組含有胎牛血清(最終濃度10%)、人類RANKL(最終濃度63.8ng/ml)及人類M-CSF(最終濃度33ng/ml)等。在該培養上清液中，將實施例10中所調製之大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體，以使最終濃度成為0.8~500ng/ml之方式添加，並於CO2恆溫箱中培養3~7日。採取10μl之培養上清液，添加200μl之附屬於OsteoLyse檢定套組之螢光團釋出試劑(Fluorophore Releasing Reagent)，並使用螢光盤式分析儀(ARVO MX，PerkinElmer公司製)測定螢光強度(激發：340nm，發射：615nm)，藉此定量培養上清液中所釋出之游離螢光膠原片段量。
[實施例13]使用摘除卵巢之大鼠所進行之大
鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之生物學上評價
在實施例9中所取得之人類化抗體所顯示之對於摘除卵巢之大鼠之骨密度減少及骨吸收活性的抑制效果可藉由以下記載之方法進行評價。
a)動物實驗之規程
對12週齡雌性F344大鼠(從日本Charles River公司取得)施行兩側卵巢摘除，並分為溶劑給與組、大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體給與組。又，關於偽手術組亦設定為1組。關於給與抗體之組，係以0.1~30mg/kg之用量，從手術翌日起單次給與或反覆給與至皮下。在給與開始4週後，於絕食下進行24小時採尿，尿檢體於-80℃保存至測定為止。採尿結束後，使大鼠安樂死，摘出腰椎。
b)腰椎骨密度之測定
將摘出之腰椎所附之軟組織除去，並切出第4~6腰椎。使用骨密度測定裝置(DCS-600EX，Aloka公司製)測定骨密度，藉由與溶劑給與組、偽手術組比較，判定人類化抗體之效果。
c)尿中去氧吡啶酚(deoxypyridinoline)排泄量之測定
I型膠原交聯之各種代謝產物可敏銳地反映骨之代謝循環，尤其是骨吸收，其中，由於去氧吡啶酚主要局部存在於骨之膠原中，所以在作為骨吸收之指標係信賴性高。
將凍結保存之尿檢體融解，藉由離心操作使不溶物質沉澱，得到上清液。使用Osteolinks「DPD」(DS Pharma Biomedical公司製)測定該上清液中所含之去氧吡啶酚量。又，亦測定上清液中之肌酸酐(creatinine)含量，然後算出已施行肌酸酐補正的去氧吡啶酚量。藉由將所算出之去氧吡啶酚量與溶劑給與組、偽手術組比較，可判定人類化抗體之效果。
[實施例14]大鼠抗人類Siglec-15單株抗體#24A3之人類化抗體之熱安定性測定
使用示差掃描熱量分析儀(DSC)進行熱安定性之測定。使樣本以使濃度成為0.5mg/mL之方式溶解於HBSor緩衝液(調製25mM組織胺(pH6.0)於5%山梨醇)中，各以400μL作為試料溶液，使用於DSC測定。DSC測定條件如以下方式設定。亦即，將初期溫度設為20℃、最終溫度設為100℃，升溫速度設為200℃/1小時，過濾器時間設為2秒，反饋模式(feedback mode)設為Low。參照液係使用HBSor。全部DSC測定裝置皆係使用美國GE Healthcare Bioscience(股)製之VP-Capillary DSC Platform。將從試料溶液所得到之掃描曲線減去基線(baseline)(在試料槽室中填充參照溶液所得到之掃描曲線)，進行基線補正。繼而，使用從各樣本之分子量算出之莫耳濃度，進行濃度之校正。第24圖展現h#24A3-H2d/L1抗體之溫度記錄圖，第25圖展現h#24A3-H2e/L1抗體之溫度記錄圖，第26圖展現h#24A3-H2b/L3b抗體之溫度記錄圖，第27圖展現h#24A3-H2c/L2b抗體之溫度記錄圖。若以在各溫度記錄 圖中之最大波峰處出現波峰頂之溫度作為熱變性中點Tm，則h#24A3-H2d/L1抗體之Tm值為87.9℃，h#24A3-H2e/L1抗體之Tm值為89.3℃，h#24A3-H2b/L3b抗體之Tm值為88.9℃，h#24A3-H2c/L2b抗體之Tm值為91.0℃。
[產業上之可利用性]
本發明之嵌合或人類化抗Siglec-15抗體具有破骨細胞之分化或骨吸收活性的抑制能力，含有該抗Siglec-15抗體之醫藥組成物可成為骨代謝異常疾病之治療或預防劑。
[序列表免費文本]
序列編號1：編碼#24A3之重鏈之可變區域之cDNA的核苷酸序列
序列編號2：#24A3之重鏈之可變區域之胺基酸序列
序列編號3：編碼#24A3之輕鏈之可變區域之cDNA的核苷酸序列
序列編號4：#24A3之輕鏈之可變區域的胺基酸序列
序列編號5：編碼人類κ鏈分泌信號及人類κ鏈恆定區域之核苷酸序列
序列編號6：編碼人類重鏈分泌信號及人類IgG2恆定區域之核苷酸序列
序列編號7：人類嵌合#24A3抗體重鏈之核苷酸序列
序列編號8：人類嵌合#24A3抗體重鏈之胺基酸序列
序列編號9：人類嵌合#24A3抗體輕鏈之核苷酸序列
序列編號10：人類嵌合#24A3抗體輕鏈之胺基酸序列
序列編號11：h#24A3-H1之核苷酸序列
序列編號12：h#24A3-H1之胺基酸序列
序列編號13：h#24A3-H2之核苷酸序列
序列編號14：h#24A3-H2之胺基酸序列
序列編號15：h#24A3-H3之核苷酸序列
序列編號16：h#24A3-H3之胺基酸序列
序列編號17：h#24A3-H4之核苷酸序列
序列編號18：h#24A3-H4之胺基酸序列
序列編號19：h#24A3-H5之核苷酸序列
序列編號20：h#24A3-H5之胺基酸序列
序列編號21：h#24A3-H6之核苷酸序列
序列編號22：h#24A3-H6之胺基酸序列
序列編號23：h#24A3-L1之核苷酸序列
序列編號24：h#24A3-L1之胺基酸序列
序列編號25：h#24A3-L2之核苷酸序列
序列編號26：h#24A3-L2之胺基酸序列
序列編號27：h#24A3-L3之核苷酸序列
序列編號28：h#24A3-L3之胺基酸序列
序列編號29：h#24A3-L4之核苷酸序列
序列編號30：h#24A3-L4之胺基酸序列
序列編號31：#24A3抗體之CDRH1之胺基酸序列
序列編號32：#24A3抗體之CDRH2之胺基酸序列
序列編號33：#24A3抗體之CDRH3之胺基酸序列
序列編號34：#24A3抗體之CDRL1之胺基酸序列
序列編號35：#24A3抗體之CDRL2之胺基酸序列
序列編號36：#24A3抗體之CDRL3之胺基酸序列
序列編號37：h#24A3-H2b之核苷酸序列
序列編號38：h#24A3-H2b之胺基酸序列
序列編號39：h#24A3-H2c之核苷酸序列
序列編號40：h#24A3-H2c之胺基酸序列
序列編號41：h#24A3-H2d之核苷酸序列
序列編號42：h#24A3-H2d之胺基酸序列
序列編號43：h#24A3-H2e之核苷酸序列
序列編號44：h#24A3-H2e之胺基酸序列
序列編號45：h#24A3-L2b之核苷酸序列
序列編號46：h#24A3-L2b之胺基酸序列
序列編號47：h#24A3-L2c之核苷酸序列
序列編號48：h#24A3-L2c之胺基酸序列
序列編號49：#24A3抗體之變異CDRH3之胺基酸序列
<110> DAIICHI SANKYO COMPANY,LIMITED
<120> 新穎抗-Siglec-15抗體
<130> FP1309
<150> JP2012-078841
<151> 2012-03-30
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 363
<212> DNA
<213> 挪威鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221> CDS
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<220>
<223> 編碼人類κ鏈之信號及恆定區域之核苷酸
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 核苷酸coding signal and constant regions of human IgG2 chain
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<211> 1398
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 核苷酸coding heavy chain of chimeric #24A3
<220>
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<220>
<223> 合成構築體
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<212> DNA
<213> 人造序列
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<221> CDS
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<212> DNA
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<223> 合成構築體
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<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 編碼h#24A3-H6之核苷酸
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<213> 人造序列
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<223> 合成構築體
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<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 合成構築體
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<213> 人造序列
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<223> 編碼h#24A3-L2之核苷酸
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> 挪威鼠
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<211> 1398
<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 編碼h#24A3-H2b之核苷酸
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<212> PRT
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<223> 編碼h#24A3-H2c之核苷酸
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<221> CDS
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<212> PRT
<213> 人造序列
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<223> 合成構築體
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 編碼h#24A3-H2d之核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1398)
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<211> 466
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 42
<210> 43
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 編碼h#24A3-H2e之核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1398)
<400> 43
<210> 44
<211> 466
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 44
<210> 45
<211> 702
<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 編碼h#24A3-L2b之核苷酸
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<221> CDS
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<211> 234
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成構築體
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<223> 編碼h#24A3-L2c之核苷酸
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 48
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CDRH3 of #24A3
<400> 49

Claims (59)

  1. 一種抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為：重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2、CDRH3之可變區域，該CDRH1包含序列編號31所示之胺基酸序列，該CDRH2包含序列編號32所示之胺基酸序列，該CDRH3包含序列編號33所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中1至3個之胺基酸被取代之胺基酸序列；及輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2、CDRL3之可變區域，該CDRL1包含序列編號34所示之胺基酸序列，該CDRL2包含序列編號35所示之胺基酸序列，該CDRL3包含序列編號36所示之胺基酸序列。
  2. 一種抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為：重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2、CDRH3之可變區域，該CDRH1包含序列編號31所示之胺基酸序列，該CDRH2包含序列編號32所示之胺基酸序列，該CDRH3包含序列編號33所示之胺基酸序列或序列編號49所示之胺基酸序列；及輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2、CDRL3之可變區域，該CDRL1包含序列編號34所示之胺基酸序列，該CDRL2包含序列編號35所示之胺基酸序列，該CDRL3包含序列編號36所示之胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號2所示之胺基酸序列之第1至121號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列 包含序列編號4所示之胺基酸序列之第1至109號之胺基酸殘基。
  4. 如申請專利範圍第1至3項之抗體之抗原結合片段，其係選自包含Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv之群組。
  5. 如申請專利範圍第1至3項之抗體，其係scFv。
  6. 如申請專利範圍第1至4項之任一項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其係嵌合抗體。
  7. 如申請專利範圍第6項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號8所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含包含序列編號10所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
  8. 如申請專利範圍第1、2或4項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其被人類化。
  9. 如申請專利範圍第6或8項之抗體，其中重鏈含有人類免疫球蛋白G2重鏈之恆定區域；輕鏈含有人類免疫球蛋白κ輕鏈之恆定區域。
  10. 一種抗體或該抗體之抗原結合片段，其係可抑制破骨細胞之形成及/或破骨細胞所引起之骨吸收的抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為含有：(a)選自包含以下胺基酸序列之群組的重鏈可變區域序列：a1)包含序列編號12所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至 140號之胺基酸殘基胺基酸序列；a3)包含序列編號16所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a4)包含序列編號18所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a5)包含序列編號20所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a6)包含序列編號22所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a7)包含序列編號38所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a8)包含序列編號40所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a9)包含序列編號42所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a10)包含序列編號44所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a11)具有與選自a1)至a10)之任一種胺基酸序列至少95%之同源性的胺基酸序列；a12)具有與選自a1)至a10)之任一種胺基酸序列至少99%之同源性的胺基酸序列；a13)在選自a1)至a10)之任一種胺基酸序列中1至數個之胺基酸殘基被取代、缺失或附加的胺基酸序列；及(b)選自包含以下胺基酸序列之群組的輕鏈可變區 域序列：b1)包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列編號26所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列編號28所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b4)包含序列編號30所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b5)包含序列編號46所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b6)包含序列編號48所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b7)具有與選自b1)至a6)之任一種胺基酸序列至少95%之同源性的胺基酸序列；b8)具有與選自b1)至b6)之任一種胺基酸序列至少99%之同源性的胺基酸序列；b9)在選自b1)至b6)之任一種胺基酸序列中1至數個之胺基酸殘基被取代、缺失或附加的胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
  12. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號26所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
  13. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號28所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
  14. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號38所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號48所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
  15. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號40所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號46所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
  16. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片 段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號42所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
  17. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈可變區域序列及輕鏈可變區域序列，該重鏈可變區域序列包含序列編號44所示之胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基，該輕鏈可變區域序列包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基。
  18. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
  19. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號26所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
  20. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號14所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號28所示之胺基酸序列 之第21至234號之胺基酸殘基。
  21. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號38所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號48所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
  22. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號40所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號46所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
  23. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之功能性片段，其含有重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號42所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
  24. 如申請專利範圍第10項之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有重鏈序列及輕鏈序列，該重鏈序列包含序列編號44所示之胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基，該輕鏈序列包含序列編號24所示之胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基。
  25. 一種抗體，其係在如申請專利範圍第11至24項之任一項之抗體中，含有重鏈且該重鏈於羧基末端側之1至數個胺基酸已缺失者。
  26. 一種醫藥組成物，其特徵為含有如申請專利範圍第1至 25項之任一項之抗體或該抗體之抗原結合片段之至少任一種。
  27. 如申請專利範圍第26項之醫藥組成物，其係骨代謝異常之治療及/或預防劑。
  28. 一種骨代謝異常之治療及/或預防用醫藥組成物，其特徵為含有如申請專利範圍第1至25項之抗體或該抗體之抗原結合片段之至少任一種；以及選自包含雙膦酸鹽、活性型維生素D3、抑鈣素及其衍生物、雌二醇(estradiol)等之激素、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑(selective estrogen receptor modulators))、異丙黃酮(ipriflavone)、維生素K2(四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺激素(parathyroid hormone))、非類固醇性抗發炎藥、可溶性TNF受體、抗TNFα抗體或該抗體之抗原結合片段、抗PTHrP(副甲狀腺激素-相關蛋白質(parathyroid hormone-related protein))抗體或該抗體之抗原結合片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體之抗原結合片段、抗RANKL抗體或該抗體之抗原結合片段、及OCIF(破骨細胞生成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor))之群組之至少任一種。
  29. 如申請專利範圍第27或28項之醫藥組成物，其中骨代謝異常係選自包含骨質疏鬆症、伴隨關節風濕症之骨破壞、癌性高鈣血症、多發性骨髓瘤或伴隨癌之骨轉移之骨破壞、巨細胞瘤、骨量減少、齒根膜炎所造成之齒喪失、人工關節周圍之骨溶解、慢性骨髓炎中之 骨破壞、骨佩吉特氏病(paget’s disease)、腎性骨營養不良症、及骨形成不全症之群組。
  30. 如申請專利範圍第29項之醫藥組成物，其中骨代謝異常係骨質疏鬆症、伴隨關節風濕症之骨破壞、或伴隨癌之骨轉移之骨破壞。
  31. 如申請專利範圍第30項之醫藥組成物，其中骨代謝異常係骨質疏鬆症。
  32. 如申請專利範圍第31項之醫藥組成物，其中骨質疏鬆症係停經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、因使用類固醇或免疫抑制劑等治療用藥劑而引起之續發性骨質疏鬆症、或伴隨關節風濕症之骨質疏鬆症。
  33. 一種骨代謝異常之治療及/或預防方法，其特徵為給與如申請專利範圍第1至25項之抗體、該抗體之抗原結合片段、或如申請專利範圍第27或28項之醫藥組成物之至少任一種。
  34. 一種骨代謝異常之治療及/或預防方法，其特徵為同時或先後給與如申請專利範圍第1至25項之抗體、該抗體之抗原結合片段、或如申請專利範圍第27項之醫藥組成物之至少任一種；以及選自包含雙膦酸鹽、活性型維生素D3、抑鈣素及其衍生物、雌二醇(estradiol)等之激素、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑)、異丙黃酮、維生素K2(四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺激素)、非類固醇性抗發炎藥、可溶性TNF受體、抗TNFα抗體或該抗體之抗原結合片段、抗PTHrP(副甲狀腺激素-相關蛋白質)抗體或該抗體之抗原結合片段、IL-1受體 拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體之抗原結合片段、抗RANKL抗體或該抗體之抗原結合片段、及OCIF(破骨細胞生成抑制因子)之群組之至少任一種。
  35. 一種如申請專利範圍第33或34項之治療及/或預防方法，其中骨代謝異常係骨質疏鬆症、伴隨關節風濕症之骨破壞、或伴隨癌之骨轉移之骨破壞。
  36. 如申請專利範圍第35項之治療及/或預防方法，其中骨代謝異常係骨質疏鬆症。
  37. 如申請專利範圍第36項之治療及/或預防方法，其中骨質疏鬆症係停經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、因使用類固醇或免疫抑制劑等治療用藥劑而引起之續發性骨質疏鬆症、或伴隨關節風濕症之骨質疏鬆症。
  38. 一種聚核苷酸，其係編碼申請專利範圍第1至25項之任一項之抗體。
  39. 如申請專利範圍第38項之聚核苷酸，其含有：包含序列編號1所示之核苷酸序列之第1至363號之核苷酸的核苷酸序列以及包含序列編號3所示之核苷酸序列之第1至327號之核苷酸的核苷酸序列。
  40. 如申請專利範圍第39項之聚核苷酸，其含有：包含序列編號7所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸的核苷酸序列及包含序列編號9所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸的核苷酸序列。
  41. 如申請專利範圍第38項之聚核苷酸，其含有：(a)選自包含以下核苷酸序列之群組的聚核苷酸：a1)包含序列編號11所示之核苷酸序列之第58至 420號之核苷酸的核苷酸序列；a2)包含序列編號13所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a3)包含序列編號15所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a4)包含序列編號17所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a5)包含序列編號19所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a6)包含序列編號21所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a7)包含序列編號37所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a8)包含序列編號39所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a9)包含序列編號41所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a10)包含序列編號43所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列；a11)具有與選自a1)至a10)之任一種核苷酸序列至少95%之同源性的胺基酸序列；a12)具有與選自a1)至a10)之任一種核苷酸序列至少99%之同源性的胺基酸序列；a13)與包含與選自a1)至a10)之任一種核苷酸序列互補的核苷酸序列之聚核苷酸於嚴苛條件下可雜交之 聚核苷酸所保有的核苷酸序列；a14)在選自a1)至a10)之任一種核苷酸序列中，1至數個胺基酸殘基被取代、缺失或附加的核苷酸序列；及(b)選自包含以下核苷酸序列之群組的聚核苷酸：b1)包含序列編號23所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列；b2)包含序列編號25所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列；b3)包含序列編號27所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列；b4)包含序列編號28所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列；b5)包含序列編號45所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列；b6)包含序列編號47所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列；b7)與選自b1)至b6)之任一種核苷酸序列具有至少95%之同源性的胺基酸序列；b8)與選自b1)至b6)之任一種核苷酸序列具有至少99%之同源性的胺基酸序列；b9)與包含和選自b1)至b6)之任一種核苷酸序列互補之核苷酸序列的聚核苷酸在嚴苛條件下可雜交之聚核苷酸所保有的核苷酸序列；b10)在選自b1)至b6)之任一種核苷酸序列中，1至 數個核苷酸被取代、缺失或附加的核苷酸序列。
  42. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號13所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號23所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  43. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號13所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號25所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  44. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號13所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號27所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  45. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號37所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號47所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  46. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號39所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號45所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構 成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  47. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號41所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號23所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  48. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號43所示之核苷酸序列之第58至420號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號23所示之核苷酸序列之第61至387號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  49. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號13所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號23所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  50. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號13所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號25所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  51. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號13所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號27所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構 成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  52. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號37所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號47所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  53. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號39所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號45所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  54. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號41所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號23所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  55. 如申請專利範圍第41項之聚核苷酸，其含有：包含由序列編號43所示之核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸以及包含由序列編號23所示之核苷酸序列之第61至702號之核苷酸所構成之核苷酸序列的聚核苷酸。
  56. 一種載體，其含有如申請專利範圍第38至55項之任一種聚核苷酸。
  57. 一種轉形宿主細胞，其含有如申請專利範圍第38至55項之任一種聚核苷酸。
  58. 一種轉形宿主細胞，其含有如申請專利範圍第56項之載體。
  59. 一種如申請專利範圍第1至25項之任一項之抗體的生產方法，其包含培養如申請專利範圍第57或58項之宿主細胞，並從培養產物精製抗體之步驟。
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