CN110662770A

CN110662770A - 结合凝血因子ix和凝血因子x的双特异性抗体

Info

Publication number: CN110662770A
Application number: CN201780084392.6A
Authority: CN
Inventors: R·T·皮特斯; N·莱克萨; B·R·皮尔斯; J·库曼; M·阿里曼; A·古德曼
Original assignee: Bioveradevi Treatment Co Ltd
Current assignee: Bioveradevi Treatment Co Ltd; Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date: 2016-11-23
Filing date: 2017-11-22
Publication date: 2020-01-07
Also published as: CO2019006500A2; JP2019535325A; AU2017363309A1; CR20190297A; MX2019005772A; BR112019010349A2; IL266749A; KR20190080949A; DOP2019000127A; WO2018098363A2; JP7227146B2; CL2019001372A1; TN2019000164A1; JP2023058589A; WO2018098363A3; CA3044574A1; TW201819417A; EP3545002A2; PH12019501126A1; US20230192896A1

Abstract

本公开提供选择性结合特定形式凝血因子的抗体，特别是，特异性结合活化因子IX(FIXa)的抗体，其中所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分在FIXa和因子IX酶原(FIXz)存在下优先结合FIXa；以及特异性结合因子X酶原(FXz)的抗体，其中所述抗FXz抗体或其抗原结合部分在FXz和活化因子X(FXa)存在下优先结合FXz。还提供包含例如抗FIXa抗体或其抗原结合部分和/或抗FXz抗体或其抗原结合部分的双特异性分子(例如抗体)。本公开还提供编码所公开的抗体和双特异性分子的组合物、载体、细胞、药物组合物和诊断组合物、药盒、制造方法、使用方法以及免疫缀合物。

Description

结合凝血因子IX和凝血因子X的双特异性抗体

先前提交的申请的引用

本申请要求2016年11月23日提交的美国临时申请号62/425,921、2017年1月31日提交的美国临时申请号62/452,809、2017年7月7日提交的美国临时申请号62/529,805和2017年11月16日提交的美国临时申请号62/587,284的权益，所述专利以引用的方式整体并入本文中。

经由EFS-WEB以电子方式提交的序列表的引用

与本申请一起提交的以电子方式提交的序列表(名称：SA9_453_SL.txt；大小：1,154,440字符；并且创建日期：2019年5月23日)的内容以引用的方式整体并入本文中。

背景技术

技术领域

本申请尤其涉及优先结合活化凝血因子IX或凝血因子X酶原的抗体，以及包含模拟活化因子VIII辅因子的两种特异性的双特异性分子。

背景技术

血友病A为由因子VIII(FVIII)基因突变引起的严重X染色体连锁隐性病症。FVIII参与固有凝血途径，并且FVIII缺乏导致血液凝固不良，或完全不凝固。FVIII缺乏症，又称为血友病A，为最常见的出血性病症之一，并且约10,000位男性中有一位患病(Stonebraker等人(2012)Haemophilia 18(3):e91-4)。血友病A具有通过因子FVIII血浆水平所定义的三个严重程度度等级：1％或更低(“重度”)、2至5％(“中度”)和6至30％(“轻度”)(White等人(2001)Thromb.Haemost.85:560)。在所述病症的重度形式中，第一次出血通常在5至6个月龄时出现，而在中度形式中，第一次出血延迟直到约1至2岁时才出现。出血可以自发地出现，或在微小外伤之后出现。在所有血友病A患者中有约一半被归类为患有所述疾病的重度形式。这些患者在儿童期早期开始经历严重出血，并且在以后生命中经历自发或过量出血的频繁发作。出血通常在关节和肌肉中发生，并且在没有适当治疗的情况下，反复出血可导致不可逆的出血性关节病变(Manco-Johnson等人(2007)N.Engl.J.Med.357(6):535-44)。

血友病A治疗的主要目标为维持FVIII血浆水平>1％，从而降低出血风险。为实现此目的，常常静脉内施用重组或来源于血浆的FVIII作为预防疗法。然而，血友病A的这种目前的治疗标准很难，具有若干缺点，并且对患者和其家庭带来相当大的生理和精神负担。

FVIII治疗的最常见阻碍为产生针对FVIII的同种抗体，其充当FVIII抑制剂。有多达30％的重度患者产生此类同种抗体，并且一旦产生，使用FVIII治疗正在发生的出血的有效性便受到限制(Kempton和White(2009)Blood 113(1):11-7)。在此类情况下，使用另选的绕过剂来控制出血。然而，这些剂通常具有较短的半衰期并且并不总是有效。此外，由于血浆半衰期短(在成人体内平均约12小时，并且在儿童体内甚至更短)，所以需要频繁施用FVIII。此类方案可能很难实现，特别是在幼儿中。由于可用的治疗伴随并发症和副作用，所以没有最佳并且有效治疗血友病的单一治疗。因此，仍需要解决用FVIII治疗血友病A的缺点的新颖并且有效的治疗。

发明内容

本公开提供一种特异性结合活化因子IX(FIXa)的分离抗体或其抗原结合部分(“抗FIXa抗体或其抗原结合部分”)，其中所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分在FIXa和因子IX酶原(FIXz)的存在下优先结合FIXa。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXa的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXz的结合亲和力。本公开还提供一种分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其结合FIXa的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXz的结合亲和力。在一些方面中，如通过生物膜层干涉(Bio-Layer Interferometry，BLI)测定所测定，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分以约100nM或更低、约90nM或更低、约80nM或更低、约70nM或更低、约60nM或更低、约50nM或更低、约40nM或更低、约30nM或更低、约20nM或更低、约10nM或更低、约8nM或更低、约6nM或更低、约4nM或更低、约2nM或更低、约1nM或更低的K_D结合FIXa。在一些方面中，FIXa为游离FIXa、因子X活化酶(tenase)复合物中的FIXa或共价连接至EGR-CMK的FIXa(FIXa-SM)。在一些方面中，FIXz包含不可活化因子IX(FIXn)。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3A、图3B和图3C中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3A、图3B和图3C中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些方面中，此类参考抗体选自BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-882、BIIB-9-460、BIIB-9-433以及其任何组合。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分相较于游离FIXa或FIXz优先结合FIXa-SM并且/或者结合FIXa-SM的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合游离FIXa或FIXz的结合亲和力。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3A中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3A中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些方面中，此类参考抗体选自BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-460以及其任何组合。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分相较于FIXa-SM或FIXz优先结合游离FIXa，和/或其结合FIXa的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXa-SM或FIXz的结合亲和力合亲和力结合FIXa。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3B中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3B中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分相较于FIXz优先结合游离FIXa或FIXa-SM并且/或者其结合游离FIXa或FIXa-SM的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXz的结合亲和力。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3C中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3C中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些方面中，此类参考抗体选自BIIB-9-882、BIIB-9-433以及其任何组合。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图3A、图3B和图3C中的VHCDR3组成的组的VH CDR3或具有一个或两个突变的VH CDR3。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含ARDX₁X₂X₃X₄X₅X₆YYX₇MDV(SEQ ID NO:753)，其中X₁为V或G，X₂为G或V，X₃为G或R，X₄为Y或V，X₅为A或S，X₆为G或D，X₇为G或不存在。在一些方面中，所述CDR3包含ARDVGGYAGYYGMDV(SEQ ID NO:905(BIIB-9-484)、1335、1336)、ARDISTDGESSLYYYMDV(SEQ ID NO:901，BIIB-9-460)、ARGPTDSSGYLDMDV(SEQID NO:1186，BIIB-9-882)或ARDGPRVSDYY MDV(SEQ ID NO:912，BIIB-9-619)。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图3A、图3B和图3C中的VH CDR1组成的组的VH CDR1或具有一个或两个突变的VH CDR1。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图3A、图3B和图3C中的VH CDR2组成的组的VH CDR2或具有一个或两个突变的VHCDR2。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图3A、图3B和图3C中的VL CDR1组成的组的VL CDR1或具有一个或两个突变的VL CDR1。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图3A、图3B和图3C中的VL CDR2组成的组的VL CDR2或具有一个或两个突变的VL CDR2。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VLCDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图3A、图3B和图3C中的VL CDR3组成的组的VLCDR3或具有一个或两个突变的VL CDR3。

本公开还提供一种特异性结合FIXa的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR1、CDR2和CDR3以及所述VLCDR1、CDR2和CDR3分别包含图3A、图3B和图3C的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ IDNO:815、860和905的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:950、995和1040的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-9-484)。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:809、SEQ ID NO:854和SEQ ID NO:899的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:944、SEQ ID NO:989和SEQ ID NO:1034的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-440)。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1102、SEQ ID NO:1144和SEQ ID NO:1186的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1228、SEQ ID NO:1270和SEQ ID NO:1312的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-882)。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:811、SEQ ID NO:856和SEQ ID NO:901的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:946、SEQ ID NO:991和SEQ ID NO:1036的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3序列(BIIB-9-460)。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1108、SEQ ID NO:1150和SEQ ID NO:1192的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1234、SEQ ID NO:1276和SEQ ID NO:1318的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3序列(BIIB-9-433)。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:822、SEQ ID NO:867和SEQ ID NO:912的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:957、SEQ ID NO:1002和SEQ ID NO:1047的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-619)。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQID NO:843、SEQ ID NO:888和SEQ ID NO:933的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:995和SEQ ID NO:1040的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列；或者(ii)所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:844、SEQ ID NO:889和SEQ ID NO:934的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:995和SEQ ID NO:1040的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(BIIB-9-1335和BIIB-9-1336)。所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179和181。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365和367。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH来源于种系序列VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.7、VH1-46.9、VH1-69.9、VH3-07.0、VH3-21.0、VH3-21.2、VH3-23.0、VH3-23.1、VH4-31.0、VH4-34.0、VH4-39.0、VH4-39.2、VH4-39.3、VH4-39.5、VH4-39.6、VH4-39.8、VH4-59.6、VH4-0B.4或VH4-0B.6。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VL来源于种系序列VK1-05.0、VK1-05.6、VK1-05.9、VK1-05.21、VK1-12.0、VK1-12.3、VK1-33.0、VK1-33.1、VK1-33.2、VK1-33.8、VK1-33.10、VK1-39.0、VK1-39.6、VK2-28.0、VK2-28.1、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.10、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.6、VK3-15.8、VK3-15.11、VK3-15.20、VK3-15.26、VK3-20.0、VK3-20.4、VK3-20.5、VK3-20.8或VK4-01.0。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中(a1)VH和VL分别包含SEQID NO:31和221(BIIB-9-484)；(a2)VH和VL分别包含SEQ ID NO:19和209(BIIB-9-440)；(a3)VH和VL分别包含SEQ ID NO:115和301(BIIB-9-882)；(a4)VH和VL分别包含SEQ ID NO:23和213(BIIB-9-460)；(a5)VH和VL分别包含SEQ ID NO:127和313(BIIB-9-433)；(a6)VH和VL分别包含SEQ ID NO:45和235(BIIB-9-619)；(a7)VH和VL分别包含SEQ ID NO:185和371(BIIB-9-578)；(a8)VH和VL分别包含SEQ ID NO:87和221(BIIB-9-1335)；或(a9)VH和VL分别包含SEQ ID NO:89和221(BIIB-9-1336)。

本公开还提供一种特异性结合FIXz的分离抗体或其抗原结合部分(“抗FIXz抗体或其抗原结合部分”)，其中所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分在游离FIXa或FIXa-SM的存在下优先结合FIXz，并且/或者所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分结合FIXz的结合亲和力高于所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分结合游离FIXa或FIXa-SM的结合亲和力。在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分与选自由图3D中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分与选自由图3D中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些方面中，此类参考抗体为BIIB-9-578。在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图3D中的VH CDR3组成的组的VH CDR3或具有一个或两个突变的VH CDR3。在一些方面中，所述CDR3包含ARDKYQDYSFDI(SEQ ID NO:1355，BIIB-9-578)。在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图3D中的VH CDR1组成的组的VH CDR1或具有一个或两个突变的VH CDR1。在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图3D中的VH CDR2组成的组的VHCDR2或具有一个或两个突变的VH CDR2。在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图3D中的VL CDR1组成的组的VL CDR1或具有一个或两个突变的VL CDR1。在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图3D中的VL CDR2组成的组的VL CDR2或具有一个或两个突变的VL CDR2。在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含VLCDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图3D中的VL CDR3组成的组的VL CDR3或具有一个或两个突变的VL CDR3。在一些方面中，所述抗FIX抗体选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体组成的组。在一些方面中，所述抗FIX抗体为IgG4抗体。在一些方面中，所述抗FIX抗体包含无效应物IgG4Fc。在一些方面中，所述抗FIX抗体或其抗原结合部分包含重链恒定区。在一些方面中，所述抗FIX抗体为人抗体、工程化抗体或人源化抗体。在一些方面中，所述抗FIX抗原结合部分包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。

本公开还提供一种双特异性分子，其包含与具有第二结合特异性的分子连接的本文所公开的抗FIX抗体或其抗原结合部分。还提供一种核酸，其编码本文所公开的抗FIX抗体或其抗原结合部分或包含本文所公开的抗FIX抗体或其抗原结合部分的双特异性分子的重链和/或轻链可变区。还提供一种表达载体，其包含本文所公开的编码核酸分子。还提供一种用本文所公开的表达载体转化的细胞。本公开还提供一种免疫缀合物，其包含与剂连接的本文所公开的任何抗体或其抗原结合部分或本文所公开的双特异性分子。本公开还提供一种组合物，其包含(i)本文所公开的抗体或其抗原结合部分、本文所公开的双特异性分子或本文所公开的免疫缀合物，和(ii)载剂。还提供一种药盒，其包含(i)本文所公开的抗体或其抗原结合部分、本文所公开的双特异性分子或本文所公开的免疫缀合物，和(ii)使用说明书。

本公开还提供一种制备抗FIX抗体或其抗原结合部分的方法，其包括在细胞中表达所述抗体或其抗原结合部分并且从所述细胞分离出所述抗体或其抗原结合部分。还提供一种测量有需要的受试者体内活化FIX的水平的方法，其包括使本文所公开的抗FIXa抗体或其抗原结合部分与从所述受试者获得的样品在合适的条件下接触并且测量所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与所述样品中的FIXa的结合。在一些方面中，所述样品为血液或血清。

本公开提供一种特异性结合因子X酶原(FXz)的分离抗体或其抗原结合部分(“抗FXz抗体或其抗原结合部分”)，其中所述抗FXz抗体或其抗原结合部分在FXz和活化因子X(FXa)的存在下优先结合FXz。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分结合FXz的结合亲和力高于所述抗体或其抗原结合部分结合FXa的结合亲和力。还提供一种分离抗FXz抗体或其抗原结合部分，其结合FXz的结合亲和力高于所述抗体或其抗原结合部分结合FXa的结合亲和力。在一些方面中，如通过BLI所测量，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分以约100nM或更低、约90nM或更低、约80nM或更低、约70nM或更低、约60nM或更低、约50nM或更低、约40nM或更低、约30nM或更低、约20nM或更低、约10nM或更低、约9nM或更低、约8nM或更低、约7nM或更低、约6nM或更低、约5nM或更低、约4nM或更低、约3nM或更低、约2nM或更低、约1nM或更低的K_D结合FXz。在一些方面中，所述FXa为游离FXa或共价连接至EGR-CMK的FXa(FIXa-SM)。在一些方面中，FXz包含不可活化因子X(FXn)。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分与选自由图12A和图12B中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分与选自由图12A和图12B中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分与选自由以下组成的组的参考抗体结合相同表位：BIIB-12-915、BIIB-12-917、BIIB-12-932以及其任何组合。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图12A和图12B中的VH CDR3组成的组的VH CDR3或具有一个或两个突变的VH CDR3。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含ARX₁X₂X₃RX₄X₅X₆X₇FDX₈(SEQ ID NO:766)，其中X₁为G或L，X₂为R或G，X₃为F或Y，X₄为P或G，X₅为R或A，X₆为G或S，X₇为R或A，并且X₈为Y或I。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含ARGRFRPRGRFDY(SEQ ID NO:1575，BIIB-12-917)、ARLGYRGASAFDI(SEQ ID NO:1589，BIIB-12-932)或ARVGGGYANP(SEQ ID NO:1573，BIIB-12-915)。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图12A和图12B中的VH CDR1组成的组的VH CDR1或具有一个或两个突变的VH CDR1。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图12A和图12B中的VH CDR2组成的组的VH CDR2或具有一个或两个突变的VH CDR2。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VLCDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图12A和图12B中的VL CDR1组成的组的VLCDR1或具有一个或两个突变的VL CDR1。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图12A和图12B中的VL CDR2组成的组的VL CDR2或具有一个或两个突变的VL CDR2。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图12A和图12B中的VL CDR3组成的组的VL CDR3或具有一个或两个突变的VL CDR3。

本公开还提供一种特异性结合FXz的分离抗体或其抗原结合部分，其包含VHCDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR1、CDR2和CDR3以及所述VLCDR1、CDR2和CDR3分别包含图12A和图12B的VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1393、1483或1573的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1663、1753或1843的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-12-915)。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1395、1485或1575的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1665、1755或1845的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-12-917)。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1409、1499或1589的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1679、1769或1859的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3序列(BIIB-12-932)。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553和555。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:565、567、569、571、573、575、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741和743。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH来源于种系序列VH1-18.0、VH1-18.1、VH1-18.8、VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.6、VH1-46.7、VH1-46.8、VH1-46.9、VH3-21.0、VH3-23.0、VH3-23.2、VH3-23.6、VH3-30.0、VH4-31.5、VH4-39.0、VH4-39.5、VH4-0B.4或VH5-51.1。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VL来源于种系序列VK1-05.6、VK1-05.12、VK1-12.0、VK1-12.4、VK1-12.7、VK1-12.10、VK1-12.15、VK1-39.0、VK1-39.3、VK1-39.15、VK2-28.0、VK2-28.1、VK2-28.5、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.8、VK3-15.10、VK3-20.0、VK3-20.1、VK3-20.4、VK3-20.5、VK4-01.0、VK4-01.4、VK4-01.20。在一些方面中，所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中(b1)VH和VL分别包含SEQ ID NO:423和611(BIIB-12-915)；(b2)VH和VL分别包含SEQ ID NO:427和615(BIIB-12-917)；或(b3)VH和VL分别包含SEQ ID NO:455和643(BIIB-12-932)。

本发明还提供一种特异性结合活化因子X(FXa)的分离抗体或其抗原结合部分(“抗FXa抗体或其抗原结合部分”)，其中所述抗FXa抗体或其抗原结合部分在FXz和FXa的存在下优先结合FXa并且/或者结合FXa的结合亲和力高于所述抗体或其抗原结合部分结合FXz的结合亲和力。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分与选自由图12C中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分与选自由图12C中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分与选自由BIIB-12-925组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图12C中的VH CDR3组成的组的VH CDR3或具有一个或两个突变的VH CDR3。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含AKGPRYYWYSWYFDL(SEQ ID NO:1919，BIIB-12-925)。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VHCDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图12C中的VH CDR1组成的组的VH CDR1或具有一个或两个突变的VH CDR1。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VHCDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图12C中的VH CDR2组成的组的VH CDR2或具有一个或两个突变的VH CDR2。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VLCDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图12C中的VL CDR1组成的组的VL CDR1或具有一个或两个突变的VL CDR1。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VLCDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图12C中的VL CDR2组成的组的VL CDR2或具有一个或两个突变的VL CDR2。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VLCDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图12C中的VL CDR3组成的组的VL CDR3或具有一个或两个突变的VL CDR3。

本公开还提供一种特异性结合FXa的分离抗体或其抗原结合部分，其包含VHCDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR1、CDR2和CDR3以及所述VLCDR1、CDR2和CDR3分别包含图12C的VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1911、1915或1919的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1923、1927或1931的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3序列(BIIB-12-925)。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:559和747(BIIB-12-925)。在一些方面中，所述抗FX抗体或其抗原结合部分选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体组成的组。在一些方面中，所述抗FX抗体或其抗原结合部分为IgG4抗体。在一些方面中，所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含无效应物IgG4Fc。在一些方面中，所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含重链恒定区。在一些方面中，所述抗FX抗体为人抗体、工程化抗体或人源化抗体。在一些方面中，其抗原结合部分包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。本公开还提供一种双特异性分子，其包含与具有第二结合特异性的分子连接的本文所公开的抗FX抗体。还提供一种核酸，其编码本文所公开的抗FX抗体或其抗原结合部分或包含本文所公开的抗FX抗体或其抗原结合部分的双特异性分子的重链和/或轻链可变区。还提供一种包含所述核酸分子的表达载体。还提供一种用所述表达载体转化的细胞。还提供一种免疫缀合物，其包含与剂连接的所述抗体或其抗原结合部分或所述双特异性分子。还提供一种组合物，其包含(i)所述抗体或其抗原结合部分，或所述双特异性分子，或所述免疫缀合物，和(ii)载剂。还提供一种药盒，其包含(i)所述抗体或其抗原结合部分，或所述双特异性分子，或所述免疫缀合物，和(ii)使用说明书。还提供一种制备抗FX抗体或其抗原结合部分的方法，其包括在细胞中表达所述抗体或其抗原结合部分并且从所述细胞分离出所述抗体或其抗原结合部分。

本公开还提供一种测量有需要的受试者体内的酶原FX(FXz)的方法，其包括使本文所公开的抗FX抗体或其抗原结合部分与从所述受试者获得的样品在合适的条件下接触并且测量所述抗FX抗体或其抗原结合部分与所述样品中FXz的结合。在一些方面中，所述样品为来自所述受试者的血液或血清。本公开还提供一种双特异性分子，其包含(i)本文所公开的抗FIX抗体或其抗原结合部分，和(ii)本文所公开的抗FX抗体或其抗原结合部分。在一些方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体交叉竞争，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3A、图3B、图3C和图3D中的抗FIX抗体组成的组的抗FIX抗体的VH和VL，以及选自由图12A、图12B和图12C中的抗FX抗体组成的组的抗FX抗体的VH和VL。在一些方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体结合相同表位，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3A、图3B、图3C和图3D中的抗FIX抗体组成的组的抗FIX抗体的VH和VL，以及选自由图12A、图12B和图12C中的抗FX抗体组成的组的抗FX抗体的VH和VL。在本文所公开的双特异性分子的一些方面中，(i)抗FIX抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VLCDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR1、CDR2和CDR3以及所述VL CDR1、CDR2和CDR3选自由图16A、图16B、图16C和图16D中的抗FIX(BIIB-9)抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3组成的组；并且(ii)抗FX抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR1、CDR2和CDR3以及所述VL CDR1、CDR2和CDR3选自由图16A、图16B、图16C和图16D中的抗FX(BIIB-12)抗体的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3组成的组。在本文所公开的双特异性分子的一些方面中，(a)抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有(a1)分别包含SEQ ID NO:815、860或905的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:950、995或1040的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-484)；(a2)分别包含SEQ ID NO:822、867和912的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:957、1002和1047的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-9-619)；(a3)分别包含SEQ ID NO:1347、1351和1355的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1359、1363和1367的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-9-578)；(a4)分别包含SEQ ID NO:843、888和933的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQID NO:978、1023和1068的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-9-1335)；或(a5)分别包含SEQID NO:844、889和934的VH CDR1、CDR2和CDR3序列；和/或分别包含SEQ ID NO:979、1024和1069的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-9-1336)；并且(b)抗FX抗体或其抗原结合部分包含有(b1)分别包含SEQ ID NO:1393、1483和1573的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1663、1753和1843的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-12-915)；(b2)分别包含SEQ ID NO:1395、1485和1575的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1665、1755和1845的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-12-917)；(b3)分别包含SEQ ID NO:1911、1915和1919的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1923、1927和1931的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-12-925)；(b4)分别包含SEQ ID NO:1409、1499和1589的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1679、1769和1859的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-12-932)；或(b5)分别包含SEQ ID NO:1433、1523和1613的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1703、1793和1883的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-12-1306)。在本文所公开的双特异性分子的一些方面中，(a)抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有(a1)分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；(a2)分别包含SEQID NO:45和235的VH和VL(BIIB-9-619)；(a3)分别包含SEQ ID NO:185和371的VH和VL(BIIB-9-578)；(a4)分别包含SEQ ID NO:87和221的VH和VL(BIIB-9-1335)；或(a5)分别包含SEQ ID NO:89和221的VH和VL(BIIB-9-1336)；并且(b)抗FX抗体或其抗原结合部分包含有(b1)分别包含SEQ ID NO:423和611的VH和VL(BIIB-12-915)；(b2)分别包含SEQ ID NO:427和615的VH和VL(BIIB-12-917)；(b3)分别包含SEQ ID NO:559和747的VH和VL(BIIB-12-925)；(b4)分别包含SEQ ID NO:455和643的VH和VL(BIIB-12-932)；或(b5)分别包含SEQ IDNO:503和691的VH和VL(BIIB-12-1306)。在本文所公开的双特异性分子的一些方面中，(i)抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；并且抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:423和611的VH和VL(BIIB-12-915)；或者(ii)抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；并且抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:427和615的VH和VL(BIIB-12-917)；或者(iii)抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；并且抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ IDNO:559和747的VH和VL(BIIB-12-925)；或者(iv)抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；并且抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:455和643的VH和VL(BIIB-12-932)；或者(v)抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:185和371的VH和VL(BIIB-9-578)；并且抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:423和611的VH和VL(BIIB-12-915)；或者(vi)抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:185和371的VH和VL(BIIB-9-578)；并且抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:427和615的VH和VL(BIIB-12-917)；或者(vii)抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:45和235的VH和VL(BIIB-9-619)；并且抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:427和615的VH和VL(BIIB-12-917)；或者(viii)抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:45和235的VH和VL(BIIB-9-619)；并且抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ IDNO:559和747的VH和VL(BIIB-12-925)。在一些方面中，所述双特异性分子在至少一种活化因子VIII(FVIIIa)活性测定中在功能上模拟FVIIIa辅因子。在一些方面中，所述FVIIIa活性测定选自显色FXa产生测定、一期凝血测定或其组合。在一些方面中，所述FVIIIa活性实现在相同测定中另外通过FVIII实现的活性的至少10％、20％、30％、35％、40％、45％50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。在一些方面中，所述双特异性分子能够在活体外或活体内由凝血酶原产生凝血酶、由纤维蛋白原产生纤维蛋白和/或产生纤维蛋白凝块。在一些方面中，如通过BLI所测定，所述双特异性分子同时结合FIXa和FX两者。在一些方面中，所述双特异性分子属于IgG同种型。在一些方面中，所述IgG同种型属于IgG1亚类。在一些方面中，所述IgG同种型属于IgG4亚类。在一些方面中，所述双特异性分子具有双特异性IgG形式并且选自由表2中的抗体组成的组。在一些方面中，所述双特异性分子具有双特异性异二聚体形式。在一些方面中，所述双特异性分子包含两条不同重链和两条不同轻链。在一些方面中，所述双特异性分子包含两条相同轻链和两条不同重链。在一些方面中，所述双特异性分子能够控制或降低患有血友病的受试者出血发作的发生率。在一些方面中，所述双特异性分子能够维持患有血友病的受试者的体内稳态。在一些方面中，所述双特异性分子能够向患有血友病的受试者提供常规预防。在一些方面中，所述受试者已产生或预期会产生针对因子VIII的中和抗体。

本公开还提供一种免疫缀合物，其包含与剂例如治疗剂连接的本文所公开的双特异性分子。还提供一种组合物，其包含(i)本文所公开的双特异性分子或包含所述双特异性分子的免疫缀合物，和(ii)载剂。还提供一种药盒，其包含(i)本文所公开的双特异性分子或包含所述双特异性分子的免疫缀合物，和(ii)使用说明书。还提供一种编码本文所公开的双特异性分子的核酸序列。还提供包含所述核酸的载体和包含所述载体的宿主细胞。在一些方面中，所述宿主细胞为原核细胞、真核细胞、原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞、Sf9细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞、CHO细胞、HEK细胞或COS细胞。还提供一种产生本文所公开的双特异性分子的方法，其包括在允许表达所述双特异性分子的条件下培养本文所公开的宿主细胞。在一些方面中，本文所公开的产生双特异性分子的方法还还包括使用增强异二聚化的条件。

本公开还提供一种促进有需要的受试者体内FX活化的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所公开的双特异性分子，或本文所公开的包含或编码本文所公开的双特异性分子的免疫缀合物、组合物、核酸、载体或宿主细胞。

本公开还提供一种降低有需要的受试者出血发作的频率或程度的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的双特异性分子，或本文所公开的包含或编码本文所公开的双特异性分子的免疫缀合物、组合物、核酸、载体或宿主细胞。在一些方面中，所述受试者已经产生或有倾向产生针对因子VIII(“FVIII”)的抑制剂。在一些方面中，所述针对FVIII的抑制剂为针对FVIII的中和抗体。在一些方面中，所述出血发作由关节积血、肌肉出血、口腔出血、大量出血、肌肉中大量出血、口腔大量出血、外伤、外伤性头痛、胃肠出血、颅内大量出血、腹内大量出血、胸内大量出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙中出血、腹膜后间隙中出血、髂腰肌鞘中出血或其任何组合引起。

本公开还提供一种治疗有需要的受试者的凝血病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的双特异性分子，或本文所公开的包含或编码本文所公开的双特异性分子的免疫缀合物、组合物、核酸、载体或宿主细胞。在一些方面中，所述凝血病症为血友病A或血友病B。在一些方面中，所述受试者为人受试者。在一些方面中，所述受试者正在经历或曾经历FVIII替代疗法。在一些方面中，双特异性分子与血友病疗法组合施用。在一些方面中，所述血友病疗法为FVIII替代疗法。在一些方面中，双特异性分子、免疫缀合物、组合物、核酸、载体或宿主细胞在施用血友病疗法之前、期间或之后施用。在一些方面中，双特异性分子、免疫缀合物、组合物、核酸、载体或宿主细胞为静脉内或皮下施用。在一些方面中，施用双特异性分子、免疫缀合物、组合物、核酸、载体或宿主细胞使突破性出血发作、自发性出血发作或急性出血的频率降低。在一些方面中，施用双特异性分子、免疫缀合物、组合物、核酸、载体或宿主细胞使年化出血率降低5％、10％、20％、30％或50％。

本公开还提供一种与BIIB-9-1336结合相同表位的抗FIXa抗体或其抗原结合部分。还提供一种结合与BIIB-9-1336表位重叠的表位的抗FIXa抗体或其抗原结合部分。

本公开还提供一种抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其结合包含至少一个位于FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号位置(i)91与101、(ii)125与128、(iii)165与179或(iv)232与241之间的氨基酸的表位区。还提供一种抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其结合包含FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240和K241中的至少一个的表位。在一些方面中，所述表位包含FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基N93、R165、N178和R233。在其他方面中，所述表位包含FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240和K241。在一些方面中，所述表位不包含FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基N100、K132、Y137、R170、T172、F174、T175、H185、E202和G205中的至少一个。在一些方面中，所述表位不包含FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基N100、K132、Y137、R170、T172、F174、T175、H185、E202和G205。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXa轻链(SEQ ID NO:756)中至少一个氨基酸残基。在一些方面中，所述FIXa轻链(SEQ ID NO:756)中的氨基酸残基为K100。在一些方面中，所述表位与FVIIIa与FIXa的结合位点重叠。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与FVIIIa交叉竞争结合FIXa。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分阻断FVIIIa与FIXa的结合。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中(i)所述VH CDR1包含选自由表7中的VH CDR1组成的组的VH CDR1或具有一个或两个突变的VH CDR1；并且/或者(ii)所述VHCDR2包含选自由表7中的VH CDR2组成的组的VH CDR2或具有一个或两个突变的VH CDR2；并且/或者(iii)所述VH CDR3包含选自由表7中的VH CDR3组成的组的VH CDR3或具有一个或两个突变的VH CDR3；并且/或者(iv)所述VL CDR1包含选自由表7中的VL CDR1组成的组的VL CDR1或具有一个或两个突变的VL CDR1；并且/或者(v)所述VL CDR2包含选自由表7中的VL CDR2组成的组的VL CDR2或具有一个或两个突变的VL CDR2；并且/或者(vi)所述VLCDR3包含选自由表7中的VL CDR3组成的组的VL CDR3或具有一个或两个突变的VL CDR3。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR3包含氨基酸序列ARDX₁GGYAGYYGMDV(SEQ ID NO:2196)，其中X₁为L或V。在一些方面中，(i)所述VH CDR1包含氨基酸序列FTFX₁SX₂X₃MX₄(SEQ ID NO:2194)，其中X₁为S、G或E，X₂为Y或F，X₃为S、E、G或D，并且X₄为N、V、A或T；并且/或者(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列X₅ISX₆X₇X₈X₉X₁₀IYYADSVKG(SEQ ID NO:2195)，其中X₅为S、A、Y或G，X₆为S或A，X₇为S、A或G，X₈为S、G或D，X₉为S、T或G，并且X₁₀为Y或T。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中VL CDR3包含氨基酸序列QQYANFPYT(SEQ ID NO:2168)。在一些方面中，(i)所述VL CDR1包含氨基酸序列QASQDIANYLN(SEQ ID NO:2212)；并且/或者(ii)所述VL CDR2包含氨基酸序列DASNLET(SEQ ID NO:2142)。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含：(i)VH CDR1、CDR2和CDR3，其中VH CDR1选自SEQ ID NO:2038至2047，VH CDR2选自SEQID NO:2064至2073并且VH CDR3选自SEQ ID NO:2090至2099；并且/或者(ii)VL CDR1、CDR2和CDR3，其中VL CDR1选自SEQ ID NO:2116至2125，VL CDR2选自SEQ ID NO:2142至2151并且VL CDR3选自SEQ ID NO:2168至2177。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR3包含氨基酸序列X₁RDVX₂GYAGX₃YGMDV(SEQ ID NO:2198)，其中X₁为A或V，X₂为G或S，并且X₃为Y或F。在一些方面中，(i)所述VH CDR1包含氨基酸序列FTFGSYDMN(SEQ ID NO:2048)；并且/或者(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列SISX₁X₂X₃SYIX₄YAX₅SVKG(SEQ ID NO:2197)，其中X₁为S或D，X₂为G或S，X₃为E或A，X₄为Y或A，并且X₅为E或D。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VL CDR3包含氨基酸序列X₁QYAX₂FPYT(SEQ ID NO:2201)，其中X₁为Q或S，并且X₂为N或R。在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中(i)所述VL CDR1包含氨基酸序列X₁AX₂X₃X₄IX₅X₆YLN(SEQ ID NO:2199)，其中X₁为Q、G或E，X₂为S或N，X₃为Q或E，X₄为D或Y，X₅为A或S，X₆为N或D；并且/或者(ii)所述VL CDR2包含氨基酸序列DAX₇NLX₈X₉(SEQ ID NO:2200)，其中X₇为S或A，X₈为E、H或Q，并且X₉为T或Y。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含：(i)VH CDR1、CDR2和CDR3，其中VH CDR1选自SEQ ID NO:2048至2052，VH CDR2选自SEQID NO:2074至2078并且VH CDR3选自SEQ ID NO:2100至2104；和/或(ii)VL CDR1、CDR2和CDR3，其中VL CDR1选自SEQ ID NO:2126至2130，VL CDR2选自SEQ ID NO:2152至2156并且VL CDR3选自SEQ ID NO:2178至2182。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR3包含氨基酸序列ARDGPX₁X₂X₃DYYMDV(SEQ ID NO:2204)，其中X₁为R或Q，X₂为V、D、L或E，并且X₃为S或V。在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中(i)所述VH CDR1包含氨基酸序列YTFX₁X₂YX₃MH(SEQ ID NO:2202)，其中X₁为T或H，X₂为S、G或H，并且X₃为Y或P；并且/或者(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列X₄INPSX₅GX₆TX₇YAQKFQG(SEQ ID NO:2203)，其中X₄为I或S，X₅为G或R，X₆为S或R，并且X₇为S或E。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中VL CDR3包含氨基酸序列QQRDNWPFT(SEQ ID NO:2213)。在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中(i)所述VL CDR1包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:2214)；并且/或者(ii)所述VL CDR2包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:2215)。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含：(i)VH CDR1、CDR2和CDR3，其中VH CDR1选自SEQ ID NO:2053至2057，VH CDR2选自SEQID NO:2079至2083并且VH CDR3选自SEQ ID NO:2105至2109；和/或(ii)VL CDR1、CDR2和CDR3，其中VL CDR1选自SEQ ID NO:2131至2135，VL CDR2选自SEQ ID NO:2157至2161并且VL CDR3选自SEQ ID NO:2183至2187。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR3包含氨基酸序列ARDKYQDYSX₁DI(SEQ ID NO:2207)，其中X₁为F或V。在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中(i)所述VH CDR1包含氨基酸序列GSIX₁SX₂X₃YX₄WX₅(SEQ ID NO:2205)，其中X₁为S或A，X₂为S、T、G或V，X₃为S或A，X₄为Y或A，并且X₅为G、V、N或S；并且/或者(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列X₆IX₇X₈X₉GX₁₀TX₁₁YNPSLKS(SEQ ID NO:2206)，其中X₆为S或Y，X₇为S、Y、R、T或Q，X₈为Y、G、P或A，X₉为S或Q，X₁₀为S或K，并且X₁₁为Y或Q。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中VL CDR3包含氨基酸序列QQANFLPFT(SEQ ID NO:2188)。在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中(i)所述VL CDR1包含氨基酸序列RASQGIDSWLA(SEQ ID NO:2136)；并且/或者(ii)所述VL CDR2包含氨基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO:2162)。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含：(i)VH CDR1、CDR2和CDR3，其中VH CDR1选自SEQ ID NO:2058至2063，VH CDR2选自SEQID NO:2084至2089并且VH CDR3选自SEQ ID NO:2110至2115；和/或(ii)VL CDR1、CDR2和CDR3，其中VL CDR1选自SEQ ID NO:2136至2141，VL CDR2选自SEQ ID NO:2162至2167并且VL CDR3选自SEQ ID NO:2188至2193。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中(i)所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:1935、1939、1943、1947、1951、1955、1959、1963、1967、1971、1975、1979、1983、1987、1991、1995、1999、2003、2007、2011、2015、2019、2023、2027、2031和2035；并且/或者(ii)所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:1937、1941、1945、1949、1953、1957、1961、1965、1969、1973、1977、1981、1985、1989、1993、1997、2001、2005、2009、2013、2017、2021、2025、2029、2033和2037。

在一些方面中，本文所公开的特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中(a1)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1935和1937(BIIB-9-3595)；(a2)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1939和1941(BIIB-9-3601)；(a3)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1943和1945(BIIB-9-3604)；(a4)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1947和1949(BIIB-9-3617)；(a5)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1951和1953(BIIB-9-3618)；(a6)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1955和1957(BIIB-9-3621)；(a7)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1959和1961(BIIB-9-3647)；(a8)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1963和1965(BIIB-9-3649)；(a9)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1967和1969(BIIB-9-3650)；(a10)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1971和1973(BIIB-9-3654)；(a11)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1975和1977(BIIB-9-3753)；(a12)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1979和1981(BIIB-9-3754)；(a13)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1983和1985(BIIB-9-3756)；(a14)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1987和1989(BIIB-9-3764)；(a15)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1991和1993(BIIB-9-3766)；(a16)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1995和1997(BIIB-9-3707)；(a17)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1999和2001(BIIB-9-3709)；(a18)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2003和2005(BIIB-9-3720)；(a19)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2007和2009(BIIB-9-3727)；(a20)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2011和2013(BIIB-9-3745)；(a21)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2015和2017(BIIB-9-3780)；(a22)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2019和2021(BIIB-9-3675)；(a23)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2023和2025(BIIB-9-3681)；(a24)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2027和2029(BIIB-9-3684)；(a25)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2031和2033(BIIB-9-3698)；或者(a26)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2035和2037(BIIB-9-3704)。

实施方案

实施方案1.一种特异性结合活化因子IX(FIXa)的分离抗体或其抗原结合部分(“抗FIXa抗体或其抗原结合部分”)，其中所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分在FIXa和因子IX酶原(FIXz)的存在下优先结合FIXa。

实施方案2.如实施方案1所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其结合FIXa的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXz的结合亲和力。

实施方案3.一种分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其结合FIXa的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXz的结合亲和力。

实施方案4.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，如通过生物膜层干涉(BLI)测定所测定，其以约100nM或更低、约90nM或更低、约80nM或更低、约70nM或更低、约60nM或更低、约50nM或更低、约40nM或更低、约30nM或更低、约20nM或更低、约10nM或更低、约1nM或更低的K_D结合FIXa。

实施方案5.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述FIXa为游离FIXa、因子X活化酶复合物中的FIXa或共价连接至EGR-CMK的FIXa(FIXa-SM)。

实施方案6.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述FIXz包含不可活化因子IX(FIXn)。

实施方案7.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由图3A、图3B和图3C中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。

实施方案8.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由图3A、图3B和图3C中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。

实施方案9.如实施方案7或8所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述参考抗体选自BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-882、BIIB-9-460、BIIB-9-433以及其任何组合。

实施方案10.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其相较于游离FIXa或FIXz优先结合FIXa-SM，并且/或者结合FIXa-SM的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合游离FIXa或FIXz的结合亲和力。

实施方案11.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由图3A中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。

实施方案12.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由图3A中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。

实施方案13.如实施方案11或12所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述参考抗体选自BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-460以及其任何组合。

实施方案14.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其相较于FIXa-SM或FIXz优先结合游离FIXa，并且/或者结合游离FIXa的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXa-SM或FIXz的结合亲和力。

实施方案15.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由图3B中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。

实施方案16.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由图3B中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。

实施方案17.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其相较于FIXz优先结合游离FIXa或FIXa-SM，并且/或者其结合游离FIXa或FIXa-SM的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXz的结合亲和力。

实施方案18.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由图3C中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。

实施方案19.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由图3C中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。

实施方案20.如实施方案18或19所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述参考抗体选自BIIB-9-882、BIIB-9-433以及其任何组合。

实施方案21.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图3A、图3B和图3C中的VH CDR3组成的组的VH CDR3或具有一个或两个突变的VH CDR3。

实施方案22.如实施方案1至21中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含ARDX₁X₂X₃X₄X₅X₆YYX₇MDV(SEQ ID NO:753)，其中X₁为V或G，X₂为G或V，X₃为G或R，X₄为Y或V，X₅为A或S，X₆为G或D，X₇为G或不存在。

实施方案23.如实施方案22所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述CDR3包含ARDVGGYAGYYGMDV(SEQ ID NO:905，BIIB-9-484、1335、1336)、ARDISTDGESSLYYYMDV(SEQ ID NO:901，BIIB-9-460)、ARGPTDSSGYLDMDV(SEQ ID NO:1186，BIIB-9-882)或ARDGPRVSDYY MDV(SEQ ID NO:912，BIIB-9-619)。

实施方案24.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图3A、图3B和图3C中的VH CDR1组成的组的VH CDR1或具有一个或两个突变的VH CDR1。

实施方案25.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图3A、图3B和图3C中的VH CDR2组成的组的VH CDR2或具有一个或两个突变的VH CDR2。

实施方案26.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图3A、图3B和图3C中的VL CDR1组成的组的VL CDR1或具有一个或两个突变的VL CDR1。

实施方案27.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图3A、图3B和图3C中的VL CDR2组成的组的VL CDR2或具有一个或两个突变的VL CDR2。

实施方案28.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图3A、图3B和图3C中的VL CDR3组成的组的VL CDR3或具有一个或两个突变的VL CDR3。

实施方案29.一种特异性结合FIXa的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR1、CDR2和CDR3以及所述VLCDR1、CDR2和CDR3分别包含图3A、图3B和图3C的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3。

实施方案30.如实施方案29所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:815、860和905的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:950、995和1040的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-9-484)。

实施方案31.如实施方案29所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中

(a1)所述抗体包含有分别包含SEQ ID NO:809、SEQ ID NO:854和SEQ ID NO:899的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:944、SEQ ID NO:989和SEQ ID NO:1034的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-440)；

(a2)所述抗体包含有分别包含SEQ ID NO:1102、SEQ ID NO:1144和SEQ ID NO:1186的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1228、SEQ ID NO:1270和SEQID NO:1312的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-882)；

(a3)所述抗体包含有分别包含SEQ ID NO:811、SEQ ID NO:856和SEQ ID NO:901的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:946、SEQ ID NO:991和SEQ ID NO:1036的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-460)；或

(a4)所述抗体包含有分别包含SEQ ID NO:1108、SEQ ID NO:1150和SEQ ID NO:1192的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1234、SEQ ID NO:1276和SEQID NO:1318的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-433)。

实施方案32.如实施方案29所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含有分别包含SEQ ID NO:822、SEQ ID NO:867和SEQ ID NO:912的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:957、SEQ ID NO:1002和SEQ ID NO:1047的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-619)。

实施方案33.如实施方案29所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中(i)所述抗体包含有分别包含SEQ ID NO:843、SEQ ID NO:888和SEQ ID NO:933的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:995和SEQ ID NO:1040的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3序列；或者(ii)所述抗体包含有分别包含SEQ ID NO:844、SEQ ID NO:889和SEQ ID NO:934的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:995和SEQ ID NO:1040的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(BIIB-9-1335和BIIB-9-1336)。

实施方案34.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179和181。

实施方案35.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365和367。

实施方案36.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH来源于种系序列VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.7、VH1-46.9、VH1-69.9、VH3-07.0、VH3-21.0、VH3-21.2、VH3-23.0、VH3-23.1、VH4-31.0、VH4-34.0、VH4-39.0、VH4-39.2、VH4-39.3、VH4-39.5、VH4-39.6、VH4-39.8、VH4-59.6、VH4-0B.4或VH4-0B.6。

实施方案37.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VL来源于种系序列VK1-05.0、VK1-05.6、VK1-05.9、VK1-05.21、VK1-12.0、VK1-12.3、VK1-33.0、VK1-33.1、VK1-33.2、VK1-33.8、VK1-33.10、VK1-39.0、VK1-39.6、VK2-28.0、VK2-28.1、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.10、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.6、VK3-15.8、VK3-15.11、VK3-15.20、VK3-15.26、VK3-20.0、VK3-20.4、VK3-20.5、VK3-20.8或VK4-01.0。

实施方案38.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中

(a1)VH和VL分别包含SEQ ID NO:31和221(BIIB-9-484)；

(a2)VH和VL分别包含SEQ ID NO:19和209(BIIB-9-440)；

(a3)VH和VL分别包含SEQ ID NO:115和301(BIIB-9-882)；

(a4)VH和VL分别包含SEQ ID NO:23和213(BIIB-9-460)；

(a5)VH和VL分别包含SEQ ID NO:127和313(BIIB-9-433)；

(a6)VH和VL分别包含SEQ ID NO:45和235(BIIB-9-619)；

(a7)VH和VL分别包含SEQ ID NO:185和371(BIIB-9-578)；

(a8)VH和VL分别包含SEQ ID NO:87和221(BIIB-9-1335)；或

(a9)VH和VL分别包含SEQ ID NO:89和221(BIIB-9-1336)。

实施方案39.一种特异性结合FIXz的分离抗体或其抗原结合部分(“抗FIXz抗体或其抗原结合部分”)，其中所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分在游离FIXa或FIXa-SM的存在下优先结合FIXz，并且/或者所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分结合FIXz的结合亲和力高于所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分结合游离FIXa或FIXa-SM的结合亲和力。

实施方案40.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXz抗体或其抗原结合部分，其与选自由图3D中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。

实施方案41.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXz抗体或其抗原结合部分，其与选自由图3D中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。

实施方案42.如实施方案40或41所述的抗FIXz抗体或其抗原结合部分，其中所述参考抗体为BIIB-9-578。

实施方案43.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXz抗体或其抗原结合部分，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图3D中的VH CDR3组成的组的VH CDR3或具有一个或两个突变的VH CDR3。

实施方案44.如实施方案43所述的抗FIXz抗体或其抗原结合部分，其中所述CDR3包含ARDKYQDYSFDI(SEQ ID NO:1355，BIIB-9-578)。

实施方案45.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXz抗体或其抗原结合部分，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图3D中的VH CDR1组成的组的VH CDR1或具有一个或两个突变的VH CDR1。

实施方案46.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXz抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图3D中的VH CDR2组成的组的VH CDR2或具有一个或两个突变的VH CDR2。

实施方案47.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXz抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图3D中的VL CDR1组成的组的VL CDR1或具有一个或两个突变的VL CDR1。

实施方案48.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXz抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图3D中的VL CDR2组成的组的VL CDR2或具有一个或两个突变的VL CDR2。

实施方案49.如前述实施方案中任一项所述的抗FIXz抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图3D中的VL CDR3组成的组的VL CDR3或具有一个或两个突变的VL CDR3。

实施方案50.如前述实施方案和实施方案169至204中任一项所述的抗FIX抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体选自由以下组成的组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。

实施方案51.如实施方案50所述的抗FIX抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体为IgG4抗体。

实施方案52.如实施方案50所述的抗FIX抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含无效应物IgG4Fc。

实施方案53.如前述实施方案和实施方案169至204中任一项所述的抗FIX抗体或其抗原结合部分，其包含重链恒定区。

实施方案54.如前述实施方案和实施方案169至204中任一项所述的抗FIX抗体，其中所述抗体为人抗体、工程化抗体或人源化抗体。

实施方案55.如前述实施方案和实施方案169至204中任一项所述的抗FIX抗原结合部分，其中所述其抗原结合部分包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。

实施方案56.一种双特异性分子，其包含与具有第二结合特异性的分子连接的如前述实施方案和实施方案169至204中任一项所述的抗FIX抗体或其抗原结合部分。

实施方案57.一种核酸，其编码如实施方案1-55和实施方案169至204中任一项所述的抗FIX抗体或其抗原结合部分或如实施方案56所述的双特异性分子的重链和/或轻链可变区。

实施方案58.一种表达载体，其包含如实施方案57所述的核酸分子。

实施方案59.一种用如实施方案58所述的表达载体转化的细胞。

实施方案60.一种免疫缀合物，其包含与剂连接的如实施方案1至55和实施方案169至204中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或如实施方案所述56的双特异性分子。

实施方案61.一种组合物，其包含如实施方案1至55和实施方案169至204中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、如实施方案56所述的双特异性分子或如实施方案60所述的免疫缀合物，和载剂。

实施方案62.一种药盒，其包含如实施方案1至55和实施方案169至204中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、如实施方案56所述的双特异性分子或如实施方案60所述的免疫缀合物，和使用说明书。

实施方案63.一种制备抗FIX抗体或其抗原结合部分的方法，其包括在如实施方案59所述的细胞中表达所述抗体或其抗原结合部分，以及从所述细胞分离出所述抗体或其抗原结合部分。

实施方案64.一种测量有需要的受试者体内活化FIX的水平的方法，其包括使如实施方案1至55和实施方案169至204中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分与自所述受试者获得的样品在合适的条件下接触，以及测量所述样品中所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与FIXa的结合。

实施方案65.如实施方案64所述的方法，其中所述样品为血液或血清。

实施方案66.一种特异性结合因子X酶原(FXz)的分离抗体或其抗原结合部分(“抗FXz抗体或其抗原结合部分”)，其中所述抗FXz抗体或其抗原结合部分在FXz和活化因子X(FXa)的存在下优先结合FXz。

实施方案67.如实施方案66所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其合FXz的结合亲和力高于所述抗体或其抗原结合部分结合FXa的结合亲和力。

实施方案68.一种分离抗FXz抗体或其抗原结合部分，其结合FXz的结合亲和力高于所述抗体或其抗原结合部分结合FXa的结合亲和力。

实施方案69.如实施方案66至68中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，如通过BLI所测量，其以约100nM或更低、约90nM或更低、约80nM或更低、约70nM或更低、约60nM或更低、约50nM或更低、约40nM或更低、约30nM或更低、约20nM或更低、约10nM或更低、约1nM或更低的KD结合FXz。

实施方案70.如实施方案66至69中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其中所述FXa为游离FXa或共价连接至EGR-CMK的FXa(FIXa-SM)。

实施方案71.如实施方案66至70中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其中所述FXz包含不可活化因子X(FXn)。

实施方案72.如实施方案66至71中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其与选自由图12A和图12B中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。

实施方案73.如实施方案66至72中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其与选自由图12A和图12B中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。

实施方案74.如实施方案73所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其与选自由以下组成的组的参考抗体结合相同表位：BIIB-12-915、BIIB-12-917、BIIB-12-932以及其任何组合。

实施方案75.如实施方案66至74中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图12A和图12B中的VH CDR3组成的组的VHCDR3或具有一个或两个突变的VH CDR3。

实施方案76.如实施方案66至75中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含ARX₁X₂X₃RX₄X₅X₆X₇FDX₈(SEQ ID NO:766)，其中X₁为G或L，X₂为R或G，X₃为F或Y，X₄为P或G，X₅为R或A，X₆为G或S，X₇为R或A，并且X₈为Y或I。

实施方案77.如实施方案66至76中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含ARGRFRPRGRFDY(SEQ ID NO:1575，BIIB-12-917)、ARLGYRGASAFDI(SEQ ID NO:1589，BIIB-12-932)或ARVGGGYANP(SEQ ID NO:1573，BIIB-12-915)。

实施方案78.如实施方案66至77中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图12A和图12B中的VH CDR1组成的组的VH CDR1或具有一个或两个突变的VH CDR1。

实施方案79.如实施方案66至78中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图12A和图12B中的VH CDR2组成的组的VH CDR2或具有一个或两个突变的VH CDR2。

实施方案80.如实施方案66至79中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图12A和图12B中的VL CDR1组成的组的VL CDR1或具有一个或两个突变的VL CDR1。

实施方案81.如实施方案66至80中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图12A和图12B中的VL CDR2组成的组的VL CDR2或具有一个或两个突变的VL CDR2。

实施方案82.如实施方案66至81中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图12A和图12B中的VL CDR3组成的组的VL CDR3或具有一个或两个突变的VL CDR3。

实施方案83.一种特异性结合FXz的分离抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR1、CDR2和CDR3以及所述VL CDR1、CDR2和CDR3分别包含图12A和图12B的VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3。

实施方案84.如实施方案83所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含有分别包含SEQ ID NO:1393、1483或1573的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1663、1753或1843的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-12-915)。

实施方案85.如实施方案83所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含有分别包含SEQ ID NO:1395、1485或1575的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1665、1755或1845的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-12-917)。

实施方案86.如实施方案83所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含有分别包含SEQ ID NO:1409、1499或1589的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1679、1769或1859的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-12-932)。

实施方案87.如实施方案66至86中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553和555。

实施方案88.如实施方案66至87中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:565、567、569、571、573、575、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741和743。

实施方案89.如实施方案66至88中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH来源于种系序列VH1-18.0、VH1-18.1、VH1-18.8、VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.6、VH1-46.7、VH1-46.8、VH1-46.9、VH3-21.0、VH3-23.0、VH3-23.2、VH3-23.6、VH3-30.0、VH4-31.5、VH4-39.0、VH4-39.5、VH4-0B.4或VH5-51.1。

实施方案90.如实施方案66至89中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VL来源于种系序列VK1-05.6、VK1-05.12、VK1-12.0、VK1-12.4、VK1-12.7、VK1-12.10、VK1-12.15、VK1-39.0、VK1-39.3、VK1-39.15、VK2-28.0、VK2-28.1、VK2-28.5、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.8、VK3-15.10、VK3-20.0、VK3-20.1、VK3-20.4、VK3-20.5、VK4-01.0、VK4-01.4、VK4-01.20。

实施方案91.如实施方案66至90中任一项所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中

(b1)VH和VL分别包含SEQ ID NO:423和611(BIIB-12-915)；

(b2)VH和VL分别包含SEQ ID NO:427和615(BIIB-12-917)；或者

(b3)VH和VL分别包含SEQ ID NO:455和643(BIIB-12-932)。

实施方案92.一种特异性结合活化因子X(FXa)的分离抗体或其抗原结合部分(“抗FXa抗体或其抗原结合部分”)，其中所述抗FXa抗体或其抗原结合部分在FXz和FXa的存在下优先结合FXa，并且/或者结合FXa的结合亲和力高于所述抗体或其抗原结合部分结合FXz的结合亲和力。

实施方案93.如实施方案92所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由图12C中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。

实施方案94.如实施方案92或93所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由图12C中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。

实施方案95.如实施方案94所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由BIIB-12-925组成的组的参考抗体结合相同表位。

实施方案96.如实施方案92至95中任一项所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图12C中的VH CDR3组成的组的VH CDR3或具有一个或两个突变的VH CDR3。

实施方案97.如实施方案92至96中任一项所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含AKGPRYYWYSWYFDL(SEQ ID NO:1919，BIIB-12-925)。

实施方案98.如实施方案92至97中任一项所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图12C中的VH CDR1组成的组的VHCDR1或具有一个或两个突变的VH CDR1。

实施方案99.如实施方案92至98中任一项所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图12C中的VH CDR2组成的组的VHCDR2或具有一个或两个突变的VH CDR2。

实施方案100.如实施方案92至99中任一项所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自由图12C中的VL CDR1组成的组的VLCDR1或具有一个或两个突变的VL CDR1。

实施方案101.如实施方案92至100中任一项所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2包含选自由图12C中的VL CDR2组成的组的VLCDR2或具有一个或两个突变的VL CDR2。

实施方案102.如实施方案92至101中任一项所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3包含选自由图12C中的VL CDR3组成的组的VLCDR3或具有一个或两个突变的VL CDR3。

实施方案103.一种特异性结合FXa的分离抗体或其抗原结合部分，其包含VHCDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR1、CDR2和CDR3以及所述VLCDR1、CDR2和CDR3分别包含图12C的VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3。

实施方案104.如实施方案103所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含有分别包含SEQ ID NO:1911、1915或1919的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1923、1927或1931的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-12-925)。

实施方案105.如实施方案92至104中任一项所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH和VL分别包含EQ ID NO:559和747(BIIB-12-925)。

实施方案106.如实施方案66至105中任一项所述的抗FX抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体选自由以下组成的组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。

实施方案107.如实施方案106所述的抗FX抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体为IgG4抗体。

实施方案108.如实施方案106所述的抗FX抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含无效应物IgG4Fc。

实施方案109.如实施方案66至108中任一项所述的抗FX抗体或其抗原结合部分，其包含重链恒定区。

实施方案110.如实施方案66至109中任一项所述的抗FX抗体，其中所述抗体为人抗体、工程化抗体或人源化抗体。

实施方案111.如实施方案66至110中任一项所述的其抗FX抗原结合部分，其中所述其抗原结合部分包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。

实施方案112.一种双特异性分子，其包含与具有第二结合特异性的分子连接的如实施方案66至111中任一项所述的抗FX抗体。

实施方案113.一种核酸，其编码如实施方案66至111中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或如实施方案112的双特异性分子的重链和/或轻链可变区。

实施方案114.一种表达载体，其包含如实施方案113所述的核酸分子。

实施方案115.一种用如实施方案114所述的表达载体转化的细胞。

实施方案116.一种免疫缀合物，其包含与剂连接的如实施方案66至111中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，或如实施方案112所述的双特异性分子。

实施方案117.一种组合物，其包含如实施方案66-111中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，或如实施方案112所述的双特异性分子，或如实施方案116所述的免疫缀合物，和载剂。

实施方案118.一种药盒，其包含如实施方案66-111中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，或如实施方案112所述的双特异性分子，或如实施方案116所述的免疫缀合物，和使用说明书。

实施方案119.一种制备抗FX抗体或其抗原结合部分的方法，其包括在如实施方案115所述的细胞中表达所述抗体或其抗原结合部分，以及自所述细胞分离出所述抗体或其抗原结合部分。

实施方案120.一种测量有需要的受试者体内的酶原FX(FXz)的方法，其包括使如实施方案66至111中任一项所述的抗FX抗体或其抗原结合部分与自所述受试者获得的样品在合适的条件下接触，以及测量所述抗FX抗体或其抗原结合部分与所述样品中FXz的结合。

实施方案121.如实施方案120所述的方法，其中所述样品为来自所述受试者的血液或血清。

实施方案122.一种双特异性分子，其包含如实施方案1至55和实施方案169至204中任一项所述的抗FIX抗体或其抗原结合部分和(ii)如实施方案66至111中任一项所述的抗FX抗体或其抗原结合部分。

实施方案123.如实施方案122所述的双特异性分子，其与参考双特异性抗体交叉竞争，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3A、图3B、图3C和图3D中的抗FIX抗体组成的组的抗FIX抗体的VH和VL，以及选自由图12A、图12B和图12C中的抗FX抗体组成的组的抗FX抗体的VH和VL。

实施方案124.如实施方案122或123所述的双特异性分子，其与参考双特异性抗体结合相同表位，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3A、图3B、图3C和图3D中的抗FIX抗体组成的组的抗FIX抗体的VH和VL，以及选自由图12A、图12B和图12C中的抗FX抗体组成的组的抗FX抗体的VH和VL。

实施方案125.如实施方案122至124中任一项所述的双特异性分子，其中

(i)所述抗FIX抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR1、CDR2和CDR3以及所述VL CDR1、CDR2和CDR3选自由图16A、图16B、图16C和图16D中的抗FIX(BIIB-9)抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3组成的组；并且

(ii)所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR1、CDR2和CDR3以及所述VL CDR1、CDR2和CDR3选自由图16A、图16B、图16C和图16D中的抗FX(BIIB-12)抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3组成的组。

实施方案126.如实施方案122至124中任一项所述的双特异性分子，其中

(a)所述抗FIX抗体或其抗原结合部分包含：

(a1)分别包含SEQ ID NO:815、860或905的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:950、995或1040的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-484)；

(a2)分别包含SEQ ID NO:822、867和912的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:957、1002和1047的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-9-619)；

(a3)分别包含SEQ ID NO:1347、1351和1355的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1359、1363和1367的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-9-578)；

(a4)分别包含SEQ ID NO:843、888和933的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:978、1023和1068的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-9-1335)；或

(a5)分别包含SEQ ID NO:844、889和934的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:979、1024和1069的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-9-1336)；并且

(b)所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含：

(b1)分别包含SEQ ID NO:1393、1483和1573的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1663、1753和1843的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-12-915)；

(b2)分别包含SEQ ID NO:1395、1485和1575的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1665、1755和1845的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-12-917)；

(b3)分别包含SEQ ID NO:1911、1915和1919的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1923、1927和1931的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-12-925)；

(b4)分别包含SEQ ID NO:1409、1499和1589的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1679、1769和1859的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-12-932)；或

(b5)分别包含SEQ ID NO:1433、1523和1613的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1703、1793和1883的VL CDR1、CDR2和CDR3序列(BIIB-12-1306)。

实施方案127.如实施方案122至124中任一项所述的双特异性分子，其中

(a)所述抗FIX抗体或其抗原结合部分包含：

(a1)分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；

(a2)分别包含SEQ ID NO:45和235的VH和VL(BIIB-9-619)；

(a3)分别包含SEQ ID NO:185和371的VH和VL(BIIB-9-578)；

(a4)分别包含SEQ ID NO:87和221的VH和VL(BIIB-9-1335)；或

(a5)分别包含SEQ ID NO:89和221的VH和VL(BIIB-9-1336)；和

(b)抗FX抗体或其抗原结合部分包含：

(b1)分别包含SEQ ID NO:423和611的VH和VL(BIIB-12-915)；

(b2)分别包含SEQ ID NO:427和615的VH和VL(BIIB-12-917)；

(b3)分别包含SEQ ID NO:559和747的VH和VL(BIIB-12-925)；

(b4)分别包含SEQ ID NO:455和643的VH和VL(BIIB-12-932)；或

(b5)分别包含SEQ ID NO:503和691的VH和VL(BIIB-12-1306)。

实施方案128.如实施方案122至127中任一项所述的双特异性分子，

(i)其中所述抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；并且所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:423和611的VH和VL(BIIB-12-915)；

(ii)其中所述抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；并且所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:427和615的VH和VL(BIIB-12-917)；

(iii)其中所述抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；并且所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:559和747的VH和VL(BIIB-12-925)；

(iv)其中所述抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；并且所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:455和643的VH和VL(BIIB-12-932)；

(v)其中所述抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:185和371的VH和VL(BIIB-9-578)；并且所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:423和611的VH和VL(BIIB-12-915)；

(vi)其中所述抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:185和371的VH和VL(BIIB-9-578)；并且所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:427和615的VH和VL(BIIB-12-917)；

(vii)其中所述抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:45和235的VH和VL(BIIB-9-619)；并且所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:427和615的VH和VL(BIIB-12-917)；或(viii)其中所述抗FIX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:45和235的VH和VL(BIIB-9-619)；并且所述抗FX抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:559和747的VH和VL(BIIB-12-925)。

实施方案129.如实施方案122至128中任一项所述的双特异性分子，其在至少一种活化因子VIII(FVIIIa)活性测定中在功能上模拟FVIIIa辅因子。

实施方案130.如实施方案129所述的双特异性分子，其中所述FVIIIa活性测定选自显色FXa产生测定、一期凝血测定或其组合。

实施方案131.如实施方案129或130所述的双特异性分子，其中所述FVIIIa活性达到在相同测定中通过FVIII另外达到的活性的至少10％、20％、30％、35％、40％、45％50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。

实施方案132.如实施方案122至131中任一项所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子能够在活体外或活体内由凝血酶原产生凝血酶、由纤维蛋白原产生纤维蛋白，和/或产生纤维蛋白凝块。

实施方案133.如实施方案122至132中任一项所述的双特异性分子，其中如通过BLI所测定，所述双特异性分子同时结合FIXa和FX两者。

实施方案134.如实施方案122至133中任一项所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子属于IgG同种型。

实施方案135.如实施方案134所述的双特异性分子，其中IgG同种型为属于IgG1亚类。

实施方案136.如实施方案134所述的双特异性分子，其中IgG同种型属于IgG4亚类。

实施方案137.如实施方案122至136中任一项所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子具有双特异性IgG形式并且选自由表2中的抗体组成的组。

实施方案138.如实施方案137所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子具有双特异性异二聚体形式。

实施方案139.如实施方案122至138中任一项所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子包含两条不同重链和两条不同轻链。

实施方案140.如实施方案122至138中任一项所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子包含两条相同轻链和两条不同重链。

实施方案141.如实施方案122至140中任一项所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子能够控制或降低患有血友病的受试者出血发作的发生率。

实施方案142.如实施方案122至140中任一项所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子能够维持患有血友病的受试者的体内稳态。

实施方案143.如实施方案122至140中任一项所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子能够对患有血友病的受试者提供常规预防。

实施方案144.如实施方案122至143中任一项所述的双特异性分子，其中所述受试者已经产生或预期会产生针对因子VIII的中和抗体。

实施方案145.一种免疫缀合物，其包含与剂连接的如实施方案122至144中任一项所述的双特异性分子。

实施方案146.一种组合物，其包含如实施方案122至144中任一项所述的双特异性分子或如实施方案145所述的免疫缀合物，和载剂。

实施方案147.一种药盒，其包含如实施方案122至144中任一项所述的双特异性分子或如实施方案145所述的免疫缀合物，和使用说明书。

实施方案148.一种核酸序列，其编码如实施方案122至144中任一项所述的双特异性分子。

实施方案149.一种载体，其包含如实施方案148所述的核酸。

实施方案150.一种宿主细胞，其包含如实施方案149所述的载体。

实施方案151.如实施方案150所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核细胞、真核细胞、原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞、Sf9细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞、CHO细胞、HEK细胞或COS细胞。

实施方案152.一种产生双特异性分子的方法，其包括在允许表达所述双特异性分子的条件下培养如实施方案150所述的宿主细胞。

实施方案153.一种产生如实施方案122至144中任一项所述的双特异性分子的方法，还包括其还包括增强异二聚化的条件。

实施方案154.一种促进有需要的受试者体内FX活化的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如实施方案122至144中任一项所述的双特异性分子、如实施方案145所述的免疫缀合物、如实施方案146所述的组合物、如实施方案148所述的核酸、如实施方案149所述的载体或如实施方案150所述的宿主细胞。

实施方案155.一种降低有需要的受试者的出血发作的频率或程度的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如实施方案122至144中任一项所述的双特异性分子、如实施方案145所述的免疫缀合物、如实施方案146所述的组合物、如实施方案148所述的核酸、如实施方案149所述的载体或如实施方案150所述的宿主细胞。

实施方案156.如实施方案155所述的方法，其中所述受试者已经产生或有倾向产生针对因子VIII(“FVIII”)的抑制剂。

实施方案157.如实施方案156所述的方法，其中所述针对FVIII的抑制剂为针对FVIII的中和抗体。

实施方案158.如实施方案155至157中任一项所述的方法，其中所述出血发作为由关节积血、肌肉出血、口腔出血、大量出血、肌肉中大量出血、口腔大量出血、外伤、外伤性头痛、胃肠出血、颅内大量出血、腹内大量出血、胸内大量出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙中出血、腹膜后隙中出血、髂腰肌鞘中出血或其任何组合引起。

实施方案159.一种治疗有需要的受试者的凝血病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如实施方案122至144中任一项所述的双特异性分子、如实施方案145所述的免疫缀合物、如实施方案146所述的组合物、如实施方案148所述的核酸、如实施方案149所述的载体或如实施方案150所述的宿主细胞。

实施方案160.如实施方案159所述的方法，其中所述凝血病症为血友病A或血友病B。

实施方案161.如实施方案154至160中任一项所述的方法，其中所述受试者为人受试者。

实施方案162.如实施方案154至160中任一项所述的方法，其中所述受试者正经历或曾经历FVIII替代疗法。

实施方案163.如实施方案154至162中任一项所述的方法，其中所述双特异性分子与血友病疗法组合施用。

实施方案164.如实施方案163所述的方法，其中所述血友病疗法为FVIII替代疗法。

实施方案165.如实施方案163或164所述的方法，其中所述双特异性分子在施用所述血友病疗法之前、期间或之后施用。

实施方案166.如实施方案154至165中任一项所述的方法，其中所述双特异性分子为静脉内或皮下施用。

实施方案167.如实施方案154至166中任一项所述的方法，其中施用所述双特异性分子使突破性出血发作、自发性出血发作或急性出血的频率降低。

实施方案168.如实施方案167所述的方法，其中施用所述双特异性分子使年化出血率降低5％、10％、20％、30％或50％。

实施方案169.一种抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其与BIIB-9-1336结合相同表位。

实施方案170.一种抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其结合与BIIB-9-1336表位重叠的表位。

实施方案171.一种抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其结合包含至少一个位于FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号位置(i)91与101、(ii)125与128、(iii)165与179或(iv)232与241之间的氨基酸的表位区。

实施方案172.一种抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其结合包含FIXa重链序列的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240和K241中的至少一个的表位。

实施方案173.如实施方案171或172所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述表位包含FIXa重链序列的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基N93、R165、N178和R233。

实施方案174.如实施方案171至173所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述表位包含FIXa重链序列的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240和K241。

实施方案175.如实施方案171至174所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述表位不包含FIXa重链序列的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基N100、K132、Y137、R170、T172、F174、T175、H185、E202和G205中的至少一个。

实施方案176.如实施方案171至175所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述表位不包含FIXa重链序列的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基N100、K132、Y137、R170、T172、F174、T175、H185、E202和G205。

实施方案177.如实施方案171至176所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其结合FIXa轻链(SEQ ID NO:756)中的至少一个氨基酸残基。

实施方案178.如实施方案177所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述FIXa轻链(SEQ ID NO:756)中的所述氨基酸残基为K100。

实施方案179.如实施方案169至178中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述表位与FVIIIa与FIXa的结合位点重叠。

实施方案180.如实施方案169至179中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其与FVIIIa交叉竞争结合FIXa。

实施方案181.如实施方案169至180中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分阻断FVIIIa与FIXa的结合。

实施方案182.如实施方案1至12中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其特异性结合FIXa，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中

(i)所述VH CDR1包含选自由表7中的VH CDR1组成的组的VH CDR1或具有一个或两个突变的VH CDR1；并且/或者

(ii)所述VH CDR2包含选自由表7中的VH CDR2组成的组的VH CDR2或具有一个或两个突变的VH CDR2；并且/或者

(iii)所述VH CDR3包含选自由表7中的VH CDR3组成的组的VH CDR3或具有一个或两个突变的VH CDR3；并且/或者

(iv)所述VL CDR1包含选自由表7中的VL CDR1组成的组的VL CDR1或具有一个或两个突变的VL CDR1；并且/或者

(v)所述VL CDR2包含选自由表7中的VL CDR2组成的组的VL CDR2或具有一个或两个突变的VL CDR2；并且/或者

(vi)所述VL CDR3包含选自由表7中的VL CDR3组成的组的VL CDR3或具有一个或两个突变的VL CDR3。

实施方案183.如实施方案182所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其特异性结合FIXa，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR3包含氨基酸序列ARDX₁GGYAGYYGMDV(SEQ ID NO:2196)，其中X₁为L或V。

实施方案184.如实施方案183所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中

(i)所述VH CDR1包含氨基酸序列FTFX₁SX₂X₃MX₄(SEQ ID NO:2194)，其中X₁为S、G或E，X₂为Y或F，X₃为S、E、G或D，并且X₄为N、V、A或T；并且/或者

(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列X₅ISX₆X₇X₈X₉X₁₀IYYADSVKG(SEQ ID NO:2195)，其中X₅为S、A、Y或G，X₆为S或A，X₇为S、A或G，X₈为S、G或D，X₉为S、T或G，并且X₁₀为Y或T。

实施方案185.如实施方案182至184中任一项所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中VL CDR3包含氨基酸序列QQYANFPYT(SEQ ID NO:2168)。

实施方案186.如实施方案185所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中

(i)VL CDR1包含氨基酸序列QASQDIANYLN(SEQ ID NO:2212)；并且/或者

(ii)VL CDR2包含氨基酸序列DASNLET(SEQ ID NO:2142)。

实施方案187.如实施方案182所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含：VHCDR1、CDR2和CDR3，其包含选自SEQ ID NO:2038至2047的VH CDR1、选自SEQ ID NO:2064至2073的VH CDR2和选自SEQ ID NO:2090至2099的VH CDR3；和/或VL CDR1、CDR2和CDR3，其包含选自SEQ ID NO:2116至2125的VL CDR1、选自SEQ ID NO:2142至2151的VL CDR2和选自SEQ ID NO:2168至2177的VL CDR3。

实施方案188.如实施方案182所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其特异性结合FIXa，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR3包含氨基酸序列X₁RDVX₂GYAGX₃YGMDV(SEQ ID NO:2198)，其中X₁为A或V，X₂为G或S，并且X₃为Y或F。

实施方案189.如实施方案188所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中

(i)所述VH CDR1包含氨基酸序列FTFGSYDMN(SEQ ID NO:2048)；并且/或者

(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列SISX₁X₂X₃SYIX₄YAX₅SVKG(SE Q ID NO:2197)，其中X₁为S或D，X₂为G或S，X₃为E或A，X₄为Y或A，并且X₅为E或D。

实施方案190.如实施方案182、188或189中任一项所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其特异性结合FIXa，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VL CDR3包含氨基酸序列X₁QYAX₂FPYT(SEQ ID NO:2201)，其中X₁为Q或S，并且X₂为N或R。

实施方案191.如实施方案190所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中

(i)所述VL CDR1包含氨基酸序列X₁AX₂X₃X₄IX₅X₆YLN(SEQ ID NO:2199)，其中X₁为Q、G或E，X₂为S或N，X₃为Q或E，X₄为D或Y，X₅为A或S，X₆为N或D；并且/或者

(ii)所述VL CDR2包含氨基酸序列DAX₇NLX₈X₉(SEQ ID NO:2200)，其中X₇为S或A，X₈为E、H或Q，并且X₉为T或Y。

实施方案192.如实施方案182所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含：VHCDR1、CDR2和CDR3，其包含选自SEQ ID NO:2048至2052的VH CDR1、选自SEQ ID NO:2074至2078的VH CDR2和选自SEQ ID NO:2100至2104的VH CDR3；和/或VL CDR1、CDR2和CDR3，其包含选自SEQ ID NO:2126至2130的VL CDR1、选自SEQ ID NO:2152至2156的VL CDR2和选自SEQ ID NO:2178至2182的VL CDR3。

实施方案193.如实施方案182所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其特异性结合FIXa，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR3包含氨基酸序列ARDGPX₁X₂X₃DYYMDV(SEQ ID NO:2204)，其中X₁为R或Q，X₂为V、D、L或E，并且X₃为S或V。

实施方案194.如实施方案193所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中

(i)所述VH CDR1包含氨基酸序列YTFX₁X₂YX₃MH(SEQ ID NO:2202)，其中X₁为T或H，X₂为S、G或H，并且X₃为Y或P；并且/或者(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列X₄INPSX₅GX₆TX₇YAQKFQG(SEQ ID NO:2203)，其中X₄为I或S，X₅为G或R，X₆为S或R，并且X₇为S或E。

实施方案195.如实施方案182、193或194中任一项所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其特异性结合FIXa，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VL CDR3包含氨基酸序列QQRDNWPFT(SEQ ID NO:2213)。

实施方案196.如实施方案195所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中

(i)所述VL CDR1包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:2214)；并且/或者

(ii)所述VL CDR2包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:2215)。

实施方案197.如实施方案182所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含：VH CDR1、CDR2和CDR3，其包含选自SEQ ID NO:2053至2057的VH CDR1、选自SEQ ID NO:2079至2083的VH CDR2和选自SEQ ID NO:2105至2109的VHCDR3；和/或VL CDR1、CDR2和CDR3，其包含选自SEQ ID NO:2131至2135的VL CDR1、选自SEQID NO:2157至2161的VL CDR2和选自SEQ ID NO:2183至2187的VL CDR3。

实施方案198.如实施方案182所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其特异性结合FIXa，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VH CDR3包含氨基酸序列ARDKYQDYSX₁DI(SEQ ID NO:2207)，其中X₁为F或V。

实施方案199.如实施方案198所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中

(i)所述VH CDR1包含氨基酸序列GSIX₁SX₂X₃YX₄WX₅(SEQ ID NO:2205)，其中X₁为S或A，X₂为S、T、G或V，X₃为S或A，X₄为Y或A，并且X₅为G、V、N或S；并且/或者

(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列X₆IX₇X₈X₉GX₁₀TX₁₁YNPSLKS(SEQ ID NO:2206)，其中X₆为S或Y，X₇为S、Y、R、T或Q，X₈为Y、G、P或A，X₉为S或Q，X₁₀为S或K，并且X₁₁为Y或Q。

实施方案200.如实施方案182、198或199所述的分离抗FIXa抗体，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VL CDR3包含氨基酸序列QQANFLPFT(SEQ ID NO:2188)。

实施方案201.如实施方案200所述的分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中

(i)所述VL CDR1包含氨基酸序列RASQGIDSWLA(SEQ ID NO:2136)；并且/或者

(ii)所述VL CDR2包含氨基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO:2162)。

实施方案202.如实施方案182所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含：VH CDR1、CDR2和CDR3，其包含选自SEQ ID NO:2058至2063的VH CDR1、选自SEQ ID NO:2084至2089的VH CDR2和选自SEQ ID NO:2110至2115的VHCDR3；和/或VL CDR1、CDR2和CDR3，其包含选自SEQ ID NO:2136至2141的VL CDR1、选自SEQID NO:2162至2167的VL CDR2和选自SEQ ID NO:2188至2193的VL CDR3。

实施方案203.如实施方案182至202中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中

(i)所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:1935、1939、1943、1947、1951、1955、1959、1963、1967、1971、1975、1979、1983、1987、1991、1995、1999、2003、2007、2011、2015、2019、2023、2027、2031和2035；并且/或者

(ii)所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:1937、1941、1945、1949、1953、1957、1961、1965、1969、1973、1977、1981、1985、1989、1993、1997、2001、2005、2009、2013、2017、2021、2025、2029、2033和2037。

实施方案204.如实施方案182至203中任一项所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中

(a1)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1935和1937(BIIB-9-3595)；

(a2)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1939和1941(BIIB-9-3601)；

(a3)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1943和1945(BIIB-9-3604)；

(a4)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1947和1949(BIIB-9-3617)；

(a5)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1951和1953(BIIB-9-3618)；

(a6)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1955和1957(BIIB-9-3621)；

(a7)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1959和1961(BIIB-9-3647)；

(a8)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1963和1965(BIIB-9-3649)；

(a9)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1967和1969(BIIB-9-3650)；

(a10)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1971和1973(BIIB-9-3654)；

(a11)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1975和1977(BIIB-9-3753)；

(a12)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1979和1981(BIIB-9-3754)；

(a13)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1983和1985(BIIB-9-3756)；

(a14)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1987和1989(BIIB-9-3764)；

(a15)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1991和1993(BIIB-9-3766)；

(a16)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1995和1997(BIIB-9-3707)；

(a17)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1999和2001(BIIB-9-3709)；

(a18)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2003和2005(BIIB-9-3720)；

(a19)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2007和2009(BIIB-9-3727)；

(a20)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2011和2013(BIIB-9-3745)；

(a21)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2015和2017(BIIB-9-3780)；

(a22)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2019和2021(BIIB-9-3675)；

(a23)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2023和2025(BIIB-9-3681)；

(a24)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2027和2029(BIIB-9-3684)；

(a25)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2031和2033(BIIB-9-3698)；或者

(a26)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2035和2037(BIIB-9-3704)。

附图说明

图1A为在存在和不存在在活性位点中结合的底物模拟物(FIXa+EGR-CMK)(分别为游离FIXa和FIXa-SM)的情况下FIX酶原和活化FIX的结构域组织的示意性表示。图1B为在存在和不存在在活性位点中结合的底物模拟物(FIXa+EGR-CMK)的情况下FX酶原和活化FX的结构域组织的示意性表示。在此表示中，HC为FIX、FIXa、FX或FXa的重链。LC为FIX、FIXa、FX或FXa的轻链。

图2显示在本文所述的某些实施方案中抗体产生、抗体表征和功能表征的示意性表示。

图3A至图3D描绘通过图2中所述的抗体产生方法发现的本文所公开的95种抗FIX抗体。提供了所述抗体VH和VL的种系序列、CDR长度、CDR氨基酸序列和SEQ ID NO。VH和VL的全序列提供于表4中。每个CDR序列的SEQ ID编号表示于表4中。图3A至图3C呈现相较于FIX酶原(例如不可活化FIX)，优先结合活化凝血因子IX(FIXa)(例如游离FIXa和/或被EGR-CMK或LTR-CMK共价修饰的FIXa(FIXa-SM))的抗体。特别地，图3A列出了相较于游离FIXa或FIXa酶原(例如不可活化FIX)，优先结合FIXa-SM的抗体(第I类)。图3A按出现次序全部分别以SEQ ID NO 800-844、845-889和890-934的形式公开H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列。图3A按出现次序全部分别以SEQ ID NO 935-979、980-1024、和1025-1069的形式公开L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列。图3B列出了相较于FIXa-SM或FIX酶原(例如不可活化FIX)，优先结合游离FIXa的抗体(第II类)。图3B按出现次序全部分别以SEQ ID NO 1070-1073、1074-1077和1078-1081的形式公开H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列。图3B按出现次序全部分别以SEQ IDNO 1082-1085、1086-1089和1090-1093的形式公开L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列。图3C列出了结合FIXa-SM或游离FIXa，但不明显结合FIX酶原(例如不可活化FIX)的抗体(第III类)。图3C按出现次序全部分别以SEQ ID NO 1094-1135、1136-1177和1178-1219的形式公开H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列。图3C按出现次序全部分别以SEQ ID NO 1220-1261、1262-1303和1304-1345的形式公开L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列。图3D列出了相较于游离FIXa或FIXa-SM，优先结合FIX酶原(例如不可活化FIX)的抗体(第IV类)。图3D按出现次序全部分别以SEQ ID NO 1346-1349、1350-1353和1354-1357的形式公开H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列。图3D按出现次序全部分别以SEQ ID NO 1358-1361、1362-1365和1366-1369的形式公开L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列。

图4A和图4B显示了通过生物膜层干涉法(BLI)测量的传感器缔合IgG与指定抗原FIX酶原(例如不可活化FIX)(Haematologic Technologies,Inc.,Essex Junction,VT,USA)或FIXa(Haematologic Technologies,Inc.,Essex Junction,VT,USA)的结合。每个抗体的最大BLI反应(nm)绘制在y轴上。

图5为呈现如通过ForteBio Data Analysis 9.0软件中所提供的1:1拟合算法测定的每个所列抗体与游离FIXa的表观单价亲和力值(K_D)的表。

图6A至图6E描绘了通过BLI的传感器缔合IgG与指定抗原(游离FIXa或FIX酶原(例如不可活化FIX))的结合的测量值。图6A显示抗体BIIB-9-484(VH：SEQ ID NO:31；VL：SEQID NO:221)的结合的测量值。图6B显示抗体BIIB-9-440(VH：SEQ ID NO:19；VL：SEQ ID NO:209)的结合的测量值。图6C显示抗体BIIB-9-882(VH：SEQ ID NO:115；VL：SEQ ID NO:301)的结合的测量值。图6D显示抗体BIIB-9-460(VH：SEQ ID NO:23；VL：SEQ ID NO:213)的结合的测量值。图6E显示抗体BIIB-9-433(VH：SEQ ID NO:127；VL：SEQ ID NO:313)的结合的测量值。各曲线显示缔合和解离随时间变化的BLI反应(nm)。图6F描绘如通过ForteBio DataAnalysis 9.0软件中所提供的1:1拟合算法所测定的图6A至图6E中所描述的每个所列抗体(即，BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-882、BIIB-9-460和BIIB-9-433)与分别FIX酶原(例如不可活化FIX)和游离FIXa的表观单价亲和力(K_D)的表。

图7显示通过BLI的传感器缔合IgG与指定抗原游离FIXa(HaematologicTechnologies,Inc.,Essex Junction,VT,USA)或FIXa-SM(例如FIXa+EGR-CMK(Haematologic Technologies,Inc.,Essex Junction,VT,USA))的结合的测量值。每个抗体的最大BLI反应(nm)绘制在y轴上。

图8A至图8E展现通过BLI的传感器缔合IgG与指定抗原(FIXa-SM例如FIXa+EGF-CMK，和游离FIXa)的结合的测量值。图8A显示抗体BIIB-9-484(VH：SEQ ID NO:31；VL：SEQID NO:221)的结合的测量值。图8B显示抗体BIIB-9-440(VH：SEQ ID NO:19；VL：SEQ ID NO:209)的结合的测量值。图8C显示抗体BIIB-9-882(VH：SEQ ID NO:115；VL：SEQ ID NO:301)的结合的测量值。图8D显示抗体BIIB-9-460(VH：SEQ ID NO:23；VL：SEQ ID NO:213)的结合的测量值。图8E显示抗体BIIB-9-433(VH：SEQ ID NO:127；VL：SEQ ID NO:313)的结合的测量值。提供的曲线显示缔合和解离随时间的变化的BLI反应(nm)。图8F描绘如通过ForteBioData Analysis 9.0软件中所提供的1:1拟合算法所测定的每个所列抗体(即，BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-882、BIIB-9-460和BIIB-9-433)与(i)游离FIXa或(ii)FIXa-SM(例如FIXa+EGR-CMK)的表观单价亲和力(K_D)的表。

图9A至图9D展示通过BLI的所列传感器缔合IgG与指定抗原FIXn(不可活化FIX)、游离FIXa或FXa-SM(例如FIXa+EGR-CMK)(全部获自Haematologic Technologies,Inc.,Essex Junction,VT,USA)的结合随时间的变化的测量值。最大BLI反应(nm)提供于每个传感图上。图9A显示第I类中的代表性抗体(图3A)例如抗体BIIB-9-484和抗体BIIB-9-460(VH：SEQ ID NO:23；VL：SEQ ID NO:213)的结合的测量值。图9B显示第II类中的代表性抗体(图3B)例如抗体BIIB-9-416(VH：SEQ ID NO:93；VL：SEQ ID NO:279)和抗体BIIB-9-885(VH：SEQ ID NO:97；VL：SEQ ID NO:283)的结合的测量值。图9C显示第III类中的代表性抗体(图3C)例如抗体BIIB-9-1287(VH：SEQ ID NO:181；VL：SEQ ID NO:367)的结合的测量值。图9D显示第IV类中的代表性抗体(图3D)例如抗体BIIB-9-397(VH：SEQ ID NO:183；VL：SEQID NO:369)的结合的测量值。

图10显示列出本文所公开的95种抗体以及基于如通过BLI结合测定所测定的抗原结合特征指定的其类别的表。使用实施例中所定义的测定参数，当抗体展现超过另一抗体0.1或更大的与一种抗原的BLI反应差异时，对所述抗体指定各类别。第I类抗体对应于图3A中的抗体。第II类抗体对应于图3B中的抗体。第III类抗体对应于图3C中的抗体。第IV类抗体对应于图3D中的抗体。

图11显示列出如通过AC-SINS针对自相互作用倾向进行筛选所测定的每个指定抗体的最大波长(nm)的表。阈值540nm是基于内部对照设定的，其中超过阈值的抗体以黑色阴影显示(指示有可能自相互作用)。

图12A至图12C为列出通过抗体产生过程所发现的本文所公开的94种抗体的表。提供了所述94种抗体各自的VH和VL的种系序列、CDR长度、CDR氨基酸序列和SEQ ID NO。每个抗体的完整VH和VL序列呈现于表4中。图12A和图12B呈现相较于活化凝血因子FX(FXa)(例如被EGR-CMK或LTR-CMK共价修饰的FXa(FXa-SM))，优先结合FX酶原(例如不可活化FX)的抗体(第V类)。图12A按出现次序全部分别以SEQ ID NO 1370-1414、1460-1504和1550-1594的形式公开H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列。图12A按出现次序全部分别以SEQ ID NO 1640-1684、1730-1774和1820-1864的形式公开L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列。图12B按出现次序全部分别以SEQ ID NO 1415-1459、1505-1549和1595-1639的形式公开H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列。图12B按出现次序全部分别以SEQ ID NO 1685-1729、1775-1819和1865-1909的形式公开L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列。图12C呈现相较于FX酶原(例如不可活化FX)，优先结合活化凝血因子FX(FXa)(例如被EGR-CMK或LTR-CMK共价修饰的FXa(FXa-SM))的抗体(第VI类)。图12C按出现次序全部分别以SEQ ID NO 1910-1913、1914-1917和1918-1921的形式公开H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列。图12C按出现次序全部分别以SEQ ID NO 1922-1925、1926-1929和1930-1933的形式公开L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列。

图13A和图13B描绘通过BLI的传感器缔合IgG与指定抗原FX酶原或FXa-SM(例如FXa+EGR-CMK)的结合的测量值。每个抗体的最大BLI反应(nm)绘制在y轴上。

图14显示如通过ForteBio Data Analysis 9.0软件中所提供的1:1拟合算法测定的每个所列抗体与FX酶原的以M为单位的表观单价亲和力(K_D)的表。

图15显示如通过AC-SINS针对自相互作用倾向筛选所测定的每个指定抗体的最大波长(nm)的表。540nm的阈值是基于内对照设定的。超过阈值的抗体以黑色阴影显示，指示有可能自相互作用。

图16A至图16D显示在显色因子Xa产生测定中鉴别为能够替代FVIIIa样功能的202种双特异性抗体。所述202种双特异性抗体被分为四组，并且这四组对应于各子图。图16A显示第一组双特异性抗体(202种中的1-51)的FXa显色底物裂解速率。图16B显示第二组双特异性抗体(202种中的52-102)的FXa显色底物裂解速率。图16C显示第三组双特异性抗体(202种中的103-152)的FXa显色底物裂解速率。图16D显示第四组双特异性抗体(202种中的153-202)的FXa显色底物裂解速率。在每一情形中，在不存在双特异性抗体的情况下的平均基线速率由虚线指示。

图17描绘以IgG4形式的一小组双特异性抗体的FXa显色底物裂解速率。在不存在双特异性抗体的情况下的平均基线速率由虚线指示。

图18说明在三个代表性双特异性抗体存在下FXa显色底物裂解的动力学。相较于基线对照(其中未添加抗体至反应混合物中)，BIIB-9-484/BIIIB-12-915、BIIB-9-619/BIIB-12-925和BIIB-9-578/BIIB-12-917能够增加FXa显色底物裂解的速率，如通过OD随时间增加所指示。

图19说明在一期凝血测定中BIIB-9-484/BIIB-12-917、BIIB-9-484/BIIB-12-915和BIIB-9-484/BIIB-12-1306在缺乏FVIII的血浆中替代FVIIIa的功能的能力(如通过凝血时间减少所指示)。显示不具有双特异性抗体的缺乏FVIII的血浆以用于比较。

图20显示在一期凝血测定中双特异性抗体BIIB-9-484/BIIB-12-917在缺乏FVIII的血浆中替代FVIIIa功能的能力取决于双特异性形式。同二聚体BIIB-9-484、同二聚体BIIB-12-917和所述两种同二聚体的混合物不能替代FVIIIa样功能。显示不具有抗体的缺乏FVIII的血浆以用于比较。

图21展现使用浸试即读(dip and read)抗生蛋白链菌素生物传感器评估每个靶抗原与指定双特异性抗体的共结合的BLI结合测定。传感图绘制出随时间变化的BLI反应(nm)，其中每一阶段实验以黑色竖线隔开。在特定阶段反应的增加指示蛋白质装载。

图22A列出BIIB-9-484以及两个亲和力成熟子代BIIB-9-1335和BIIB-9-1336的CDR序列。提供了通过BIIB-9-484、BIIB-9-1335、BIIB-9-1336的VH区段的MAFFT(v7.205)进行的CLUSTAL形式多序列比对。氨基酸保守程度指示在比对上方(“*”＝相同；“:”＝较强保守性；“.”＝较差保守性)，并且各条指示在比对下方。VH和VL CDR加下划线。在VH-CDR1前的序列为框架区(FR)1；在VH-CDR1之后并且在VH-CDR2之前的序列为FR2；在VH-CDR2之后并且在VH-CDR3之前的序列为FR3；并且在VH-CDR3之后的序列为FR4。在VL-CDR1前的序列为框架区(FR)1；在VL-CDR1之后并且在VL-CDR2之前的序列为FR2；在VL-CDR2之后并且在VL-CDR3之前的序列为FR3；并且在VL-CDR3之后的序列为FR4。图22A按出现次序全部分别以SEQ IDNO 843、844和815，SEQ ID NO 888、889和860以及SEQ ID NO 933、934和905的形式公开H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列。图22A按出现次序全部分别以SEQ ID NO 978、979和950，SEQID NO 1023、1024和995以及SEQ ID NO 1068、1069和1040的形式公开L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列。图22A还按出现次序分别公开SEQ ID NO 37、87、89、221、2210和2211。图22B至图22D分别显示游离FIXa与BIIB-9-484、BIIB-9-1335和BIIB-9-1336的BLI结合特征。

图23显示在具有FVIIIa样活性的双特异性抗体情况下，增加抗FIXa臂的亲和力在一期凝血测定中产生较高活性。此实例在以上曲线中示出，其中具有高亲和力抗FIXa臂的双特异性抗体(BIIB-9-1335/BIIB-12-917和BIIB-9-1336/BIIB-12-917)显示的凝血时间相较于具有较低亲和力抗FIXa臂的双特异性抗体(BIIB-9-484/BIIB-12-917)进一步减少。

图24A显示艾美赛珠单抗(emicizumab)(ACE910)序列同一性双特异性抗体(“艾美赛珠单抗生物类似药”)与FIX酶原、活化FIX、FX酶原和活化FX的结合亲和力(即，分别为1μM、1μM、1μM和1μM)。图24B显示双特异性分子(BS-027125)与FIX酶原、活化FIX、FX酶原和活化FX的结合亲和力(即，分别为8nM、2nM、20nM和未检出)。

图25显示FVIII(倒三角形)、BS-025FIXa同二聚体(大菱形)、BS-027FX同二聚体(小菱形)、BS-027025同二聚体混合物(三角形)和BS-027025双特异性抗体(正方形)在各种浓度(IU/mL或μM)下的凝血时间(秒)。

图26显示通过BS-027125(正方形)、BS-027125FIXa同二聚体(三角形)和BS-027125FX同二聚体(圆形)的FVIII活性(FVIII当量％)。FVIII活性是通过一期凝血测定测量的。

图27显示通过显色因子Xa(FXa)产生测定测量的通过rFVIII(大圆形)、BS-027125(正方形)、BS-027125FIXa同二聚体(三角形)、BS-027125FX同二聚体(倒三角形)和BS-027125(无PL)(小圆形)的nM FXa产生。

图28A显示BS-027125的凝血酶产生测定的结果。左图显示滞后时间(分钟)，并且右图显示峰值。

图28B显示由rFVIII(左图)和BS-027125(右图)产生的凝血酶的量。

图29显示在rFVIII、艾美赛珠单抗生物类似药或BS-027125存在下用PC/PS(80％/20％)或PC/PE/PS(40％/40％/20％)磷脂囊泡产生的nM FXa(上图)以及由PC/PE/PS磷脂囊泡相对于由PC/PS磷脂囊泡产生的活性的倍数变化(下图)。

图30显示在rFVIII、艾美赛珠单抗生物类似药和BS-027125存在下PC/PE/PS磷脂上的凝血酶产生测定的结果。上图显示滞后时间(分钟)；中间图显示峰值凝血酶(nM)；并且下图显示内源性凝血酶潜能(ETP)(nM*min)。

图31A、图31B、图31C和图31D显示如通过生物膜层干涉法所测定的47种不同抗FIXa抗体相互的表位分箱。图31A和图31B分别显示非竞争性和竞争性结合物的Octet谱。图31C概述测试的47x47相互作用以及所述抗体对是否引起竞争性或非竞争性结合。深灰色方形指示交叉阻断的抗体对，表明其属于同一组。中灰色的方形指示未交叉阻断的抗体对，表明其属于不同组。白色方形指示单向冲突并且浅灰色方形指示无法分析到数据的抗体。图31D显示在图31C中测定的分箱网络的节点分析。两种抗体在所述图上越靠近，其分箱谱越类似。

图32A显示使用生物膜层干涉法，在存在和不存在钙的情况下BIIB-9-484与FIXa的结合谱。虚线指示缔合期结束并且解离期开始。

图32B显示使用生物膜层干涉法，在存在和不存在钙的情况下BIIB-9-1336与FIXa的结合谱。虚线指示缔合期结束并且解离期开始。

图33A显示由单独FIXa(250nM)或在递增浓度的两种不同抗FIXa抗体(BIIB-9-1336和BIIB-9-579)或抗FX抗体对照(BIIB-12-917)存在下的底物裂解速率。测试的BIIB-9-1336是以同二聚体、二价抗体(“BIIB-9-1336”)的形式、以单臂抗体(“单臂BIIB-9-1336”)的形式和与BIIB-12-917呈双特异性构造(“BIIB-9-1336/BIIB-12-917”)。底物裂解速率以mOD/分钟表示并且抗体的递增量是关于FIXa-Ab复合物的浓度(nM)表示。

图33B显示在一组BIIB-9-484、BIIB-9-1336、BIIB-9-619和BIIB-9-578抗体存在下针对500nM FIXa所见的FIXa酰胺水解活性的倍数增加。

图33C显示在存在或不存在饱和量的BIIB-9-1336的情况下，在不同底物浓度内通过FIXa的底物裂解速率。

图33D显示在存在和不存在BIIB-9-1336的情况下FIXa的K_M和V_max。

图34A和图34B显示在存在或不存在抗FIXa抗体的情况下FIXa的ATIII抑制速率。图34A显示在75kDa处对应于ATIII-FIXa复合物的谱带的出现。复合物形成速率指示FIXa的ATIII抑制并且在BIIB-9-1335和BIIB-9-1336存在下增加。图34B显示在不同时间点定量和绘制的ATIII-FIXa复合物形成的谱带强度。

图35为以两种取向显示的以与EGF2的复合物形式的BIIB-9-1336的Fab区和FIXa的丝氨酸蛋白酶结构域的晶体结构的草图表示。

图36显示以表面表示的FIXa的丝氨酸蛋白酶结构域，其中BIIB-9-1336(1336表位)和FVIIIa(FVIIIa表位)的表位被绘制于表面上。FIXa上的BIIB-9-1336表位和FIXa上的FVIIIa表位被涂黑。所述两个表位之间共有的残基以白色画出轮廓。

图37列出FIXa重链中构成BIIB-9-1336和FVIIIa表位并且对应于图36中突出显示的残基的特定氨基酸残基。所述两个表位之间共有的残基加下划线并且以粗体显示。括号中所显示的残基在图36中未示出，因为其与公开的报道不符。氨基酸残基的编号基于胰凝乳蛋白酶原编号。BIIB-9-1336还接触FIXa轻链中的一个残基并且由星号指示。FVIIIa的轻链接触未列出。

图38A显示通过生物膜层干涉法测定的BIIB-12-917与一组FX变体的结合，所述FX变体包括野生型因子X酶原、野生型活化FX、保留活化肽的活化FX、缺乏活化肽的酶原FX以及FIX活化肽被FX活化肽置换的嵌合FIX构建体。虚线指示缔合期结束并且解离期开始。

图38B显示以上提及的每个FX变体的草图表示。+和-符号指示是否结合BIIB-12-917。此等数据显示BIIB-12-917的表位在FX的活化肽区域中。

具体实施方式

本公开提供优先结合特定形式凝血因子的抗体。特别是，本公开提供特异性结合FIX的抗体和其抗原结合部分(例如在FIXa和因子IX酶原(FIXz)的存在下优先结合活化因子IX(FIXa)的抗体和其抗原结合部分)。本公开还提供在FXz和FXa的存在下特异性并且优先结合FX(FX酶原(FXz))的抗体和其抗原结合部分。

还提供包含本文所公开的任一种抗FIX抗体或其抗原结合部分和本文所公开的任一种抗FX抗体或其抗原结合部分的双特异性分子(例如抗体)。这些双特异性抗体可同时结合FIX和FX并且模拟凝血因子VIIIa的功能。

本公开还提供例如包含本文所公开的结合分子例如抗体的组合物(例如药物组合物或诊断组合物)、编码本文所公开的结合分子的核酸和载体、包含编码本文所公开的结合分子的核酸的细胞、制备方法、治疗和诊断方法、免疫缀合物以及药盒。

本文所提供的标题并不是对本公开各方面的限制，所述方面可通过参照说明书全文来限定。因此，以下将定义的术语通过参照说明书全文更完整地定义。在详细描述本发明之前，应了解，本发明不限于特定组成或方法步骤，因此可以有所变化。

I.定义

为了使本公开更容易理解，先定义某些术语。如本申请中所使用，除非本文另外明确提供，否则以下每个术语应当具有以下陈述的含义。其他定义将在本申请通篇进行陈述。

本发明包括群组中仅一个成员存在于、用于或以其他方式涉及给定产物或方法的实施方案。本发明包括超过一个或所有群组成员存在于、用于或以其他方式涉及给定产物或方法的实施方案。

在本说明书和所附权利要求中，除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述”包括多个参照物。术语“一个(种)”以及术语“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。在某些方面中，术语“一个(种)”意指“单个(种)”。在其他方面中，术语“一个(种)”包括“两个(种)或更多个(种)”或“多个(种)”。

此外，在本文中使用时将“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一者以及具有或不具有另一者的具体公开。因此，如本文中在诸如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所涉及领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary ofCell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；和Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的一般解释。

当在本文中以语言“包含”描述各方面时，还提供以术语“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他相似方面。

单位、前缀和符号均以其国际单位制(Système International de Unites，SI)可接受的形式表示。数字范围包括界定所述范围的数字在内。在陈述值的范围时，应了解，还特定地公开在所述范围的所述上限与下限之间的每一中间整数值和其每一分数，以及所述值之间的每一子范围。任一范围的上限和下限可以独立地包括或不包括在所述范围中，并且包括任一限值、不包括限值和包括两个限值的每一范围还涵盖在本发明内。在明确陈述一值时，应了解，与所述值数量或量大致相同的值也在本发明的范围内。在公开组合时，所述组合中各要素的每一子组合还特定地公开并且在本发明的范围内。相反地，在个别地公开不同要素或要素群组时，还公开其组合。在公开本发明的任一要素被公开为具有多个替代物时，还特此公开每一替代物单独地排除或与其他替代物以任何组合形式排除的本发明的实例；发明的超过一个要素可具有此类排除，并且特此公开具有此类排除的要素的所有组合。

核苷酸为以其通常公认的单字母代码提及。除非另外指示，否则核酸自左至右以5'至3'取向书写。核苷酸在本文中以IUPAC-IUB生物化学命名委员会(BiochemicalNomenclature Commission)所推荐的其通常已知的单字母符号提及。因此，A表示腺嘌呤，C表示胞嘧啶，G表示鸟嘌呤，T表示胸腺嘧啶，U表示尿嘧啶。

氨基酸在本文中以其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会所推荐的单字母符号提及。除非另外指明，否则氨基酸序列自左至右以氨基至羧基取向书写。

约：如本说明书通篇和权利要求结合数字值使用的术语“约”表示本领域的技术人员熟悉并且接受的准确度区间。一般来说，这种准确度区间为±10％。

在给定范围的情况下，终点包括在内。此外，除非另外指示或自上下文和本领域的普通技术人员的理解另外显而易见，以范围表示的值在本发明的不同实施方案中可呈现所述范围内的任何特定值或子范围，除非上下文另外明确规定，否则精确到所述范围下限单位的十分之一。

以组合施用：如本文所使用，术语“以组合施用”、“组合施用”或“组合疗法”意指，两种或更多种剂，例如本文所公开的结合分子，和第二剂，同时或在一定时间间隔内向受试者施用，使得每一剂对患者的作用可存在重叠。在一个实施方案中，所述剂彼此间隔约60分钟、30分钟、15分钟、10分钟、5分钟或1分钟施用。在一些实施方案中，所述剂的施用间隔足够接近以使得获得组合(例如协同)作用。

亲和力：术语“亲和力”是指结合分子(例如抗体)结合抗原以将抗原和结合分子的平衡转移向存在由其结合所形成的复合物。因此，当抗原和结合分子以相对相等浓度组合时，具有高亲和力的结合分子将结合可用抗原以将平衡转移向高浓度的所得复合物。本公开的结合分子(例如抗体)或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以其与抗原的结合亲和力描述或说明。结合分子(例如抗体)对抗原的亲和力可使用任何适合方法以实验方式测定。(参见例如，Berzofsky等人,“Antibody-Antigen Interactions,”In FundamentalImmunology,Paul,W.E.编,Raven Press:New York,N.Y.(1984)；Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company:New York,N.Y.(1992)；和本文中描述的方法)。

当在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量时，特定结合分子-抗原相互作用的亲和力测量值可有所变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如K_D、K_a、K_d)的测量值优选用结合分子和抗原的标准化溶液，和标准化缓冲液进行。

结合分子(例如抗体)的“高亲和力”是指至少约1×10⁷升/摩尔、或至少约1×10⁸升/摩尔、或至少约1×10⁹升/摩尔、或至少约1×10¹⁰升/摩尔、或至少约1×10¹¹升/摩尔、或至少约1×10¹²升/摩尔、或至少约1×10¹³升/摩尔或至少约1×10¹⁴升/摩尔或更高的平衡缔合常数(K_aff)。“高亲和力”结合可因抗体同种型而不同。

K_D，平衡解离常数，为还用于描述抗体亲和力的术语并且为K_aff的倒数。K_D由k_d与k_a的比率(即，k_d/k_a)获得并且以摩尔浓度(M)表示。抗体的K_D值可使用本领域中充分确立的方法测定。用于测定抗体的K_D的可用方法包括生物膜层干涉(BLI)测定、表面电浆共振、生物传感器系统诸如系统或流动式细胞测量术和Scatchard分析。当使用K_D时，术语抗体的“高亲和力”是指小于约1×10^-7M、或小于约1×10^-8M、或小于约1×10^-9M、或小于约1×10^-10M、或小于约1×10^-11M、或小于约1×10^-12M、或小于约1×10¹³M、小于约1×10^-14M或更低的平衡解离常数(K_D)。

氨基酸取代：术语“氨基酸取代”是指亲本或参考序列(例如野生型序列)中存在的氨基酸残基被另一氨基酸残基置换。可例如经由化学肽合成或通过本领域中已知的重组方法取代亲本或参考序列(例如野生型多肽序列)中的氨基酸。因此，提及“在X位的取代”是指在X位存在的氨基酸被另选的氨基酸残基取代。在一些方面中，取代模式可根据模式AnY描述，其中A为对应于在n位天然或初始存在的氨基酸的单字母代码，并且Y为取代氨基酸残基。在其他方面中，取代模式可根据模式An(YZ)描述，其中A为对应于取代在n位天然或最初存在的氨基酸的氨基酸残基的单字母代码，并且Y和Z为可置换A的另选的取代氨基酸残基。

在本公开的上下文中，取代(甚至当将其称为氨基酸取代时)在核酸水平上进行，即，用另选的氨基酸残基取代氨基酸残基通过将编码第一氨基酸的密码子用编码第二氨基酸的密码子取代来进行。

亲和力成熟：术语“亲和力成熟”是指结合分子(例如抗体)已经历亲和力成熟，亲和力成熟为使结合分子(例如抗体)对靶抗原的亲和力增加的过程。因此，亲和力成熟抗体为在一个或多个CDR中具有一种或多种变化的抗体，与不具有那些变化的亲本抗体相比，所述一种或多种变化使所述抗体对抗原的亲和力改善。示例性亲和力成熟抗体将对靶抗原具有纳摩尔浓度或甚至皮摩尔浓度的亲和力。

根据本文所公开的本发明的各种实施方案，为了产生亲和力成熟抗体，可采用本领域中可用的制备和/或使用亲和力成熟文库的任一种或多种方法。示例性亲和力成熟方法包括随机诱变、细菌致突变菌株传代、定点诱变、突变热点靶向、简约诱变(parsimoniousmutagenesis)、抗体改组、轻链改组、重链改组、CDR1和/或CDR1诱变，以及产生和使用可用于实施根据本文所公开的本发明的各种实施方案的方法和用途的亲和力成熟文库的方法，包括例如，以下公开的方法：Prassler等人(2009)；Immunotherapy,第1卷(4),第571-583页；Sheedy等人(2007),Biotechnol.Adv.,第25卷(4),第333-352页；WO2012/009568；WO2009/036379；WO2010/105256；US2002/0177170；WO2003/074679，其均以引用的方式整体并入本文中。Marks等人(1992)BioTechnology 10:779-783描述通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变描述于Barbas等人(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813；Schier等人(1995)Gene 169:147-155；Yelton等人(1995)J.Immunol.155:1994-2004；Jackson等人(1995)J.Immunol.154(7):3310-9；和Hawkins等人(1992)J.Mol.Biol.226:889-896中。在选择性诱变位置、接触或高突变位置处突变而具有活性增强的氨基酸残基描述于美国专利号6,914,128中。

动物：如本文所使用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物为哺乳动物(例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼和蠕虫。在一些实施方案中，动物为转基因动物、基因工程化动物或克隆。

抗体：术语“抗体”和“免疫球蛋白”(缩写“Ig”)在本文中可互换使用并且指代特异性结合特定抗原或与特定抗原免疫反应的包含至少一个免疫球蛋白结构域的分子。及其组合所述术语包括完整抗体和其任何抗原结合部分或单一链以及其组合(例如双特异性抗体)。

典型的抗体至少包含通过二硫键互连的两条重链(“HC”)和两条轻链(“L”)。

每一“重链”包含“重链可变区”(本文缩写为“VH”)和“重链恒定区”(本文缩写为“CH”)。未修饰抗体中的重链恒定区包含三个恒定结构域，即CH1、CH2和CH3。

每一“轻链”包含“轻链可变区”(本文缩写为“VL”)和“轻链恒定区”。未修饰抗体中的轻链恒定区包含一个恒定结构域，即“CL”。VH和VL区可进一步细分成称为互补决定区(“CDR”)的高变区，其中散布有更为保守的区域，称为“框架区”(“FW)。

每一VH和VL由自氨基末端至羧基末端按以下次序排列的三个CDR和四个FW构成：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。本公开提供VH和VL序列以及对应于CDR1、CDR2和CDR3的子序列。因此，本领域的技术人员应了解，同样公开了FW1、FW2、FW3和FW4的序列。对于特定VH，FW1为在VH的N末端与VH-CDR1的N末端之间的子序列，FW2为在VH-CDR1的C末端与VH-CDR2的N末端之间的子序列，FW3为在VH-CDR2的C末端与VH-CDR3的N末端之间的子序列，并且FW4为在VH-CDR3的C末端与VH的C末端之间的子序列。类似地，对于特定VL，FW1为在VL的N末端与VL-CDR1的N末端之间的子序列，FW2为在VL-CDR1的C末端与VL-CDR2的N末端之间的子序列，FW3为在VL-CDR2的C末端与VL-CDR3的N末端之间的子序列，并且FW4为在VL-CDR3的C末端与VL的C末端之间的子序列。

重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的宿主组织或因子的结合。示例性本发明抗体包括典型抗体、scFv及其组合，其中例如，scFv共价连接(例如经由肽键或经由化学接头)至典型抗体的重链和/或轻链的N末端，或插入典型抗体的重链和/或轻链中。

如本文所使用，术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链可变片段(scFv)、二硫键稳定的scFv、由至少两个完整抗体和/或其抗原结合部分产生的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰免疫球蛋白分子，只要所述抗体展现所需生物活性即可。

基于分别称为α、δ、ε、γ和μ的重链恒定结构域的身分，抗体可属于五个主要免疫球蛋白类别(同种型)中的任一个：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其子类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。免疫球蛋白的不同类别具有不同并且熟知的次单元结构和三维构型。抗体可为裸抗体或缀合至其他分子诸如治疗剂或诊断剂以形成免疫缀合物。

有至少两种测定CDR的技术：(1)基于跨物种序列可变性的方法(即，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版,1991,NationalInstitutes of Health,Bethesda Md.))；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。此外，有时在本领域中使用这两种方法的组合测定CDR。当提到可变结构域中的残基时，一般使用Kabat编号系统(大致轻链残基1-107和重链残基1-113)(例如Kabat等人,Sequences of ImmunologicalInterest.第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。

短语“如Kabat中的氨基酸位置编号”、“Kabat位置”及其语法变化形式是指Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中用于编辑抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这种编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FW或CDR的缩短或插入的较少或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以在H2的残基52之后包括单一氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)并且在重链FW残基82之后包括插入残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。参见表1。

表1

可以通过将抗体序列同源区与“标准”Kabat编号序列比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。而Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号规则编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化(这是因为Kabat编号方案在H35A和H35B处有插入；如果不存在35A和35B，那么所述环在32处结束；如果仅存在35A，那么所述环在33处结束；如果同时存在35A和35B，那么所述环在34处结束)。AbM高变区表示Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。

IMGT(ImMunoGeneTics)还提供包括CDR在内的免疫球蛋白可变区的编号系统。参见例如，Lefranc,M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.27:55-77(2003)，其以引用的方式并入本文中。IMGT编号系统基于超过5,000个序列的比对、结构数据和高变环的表征，并且能够容易地比较所有物种的可变区和CDR区。根据IMGT编号方案，VH-CDR1在26至35位处，VH-CDR2在51至57位处，VH-CDR3在93至102位处，VL-CDR1在27至32位处，VL-CDR2在50至52位处，并且VL-CDR3在89至97位处。

对于本发明中论述的所有重链恒定区氨基酸位置，编号根据最先在Edelman等人,1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1):78-85中所描述的EU索引，所述EU索引描述了骨髓瘤蛋白质EU的氨基酸序列，其为首个测序的人IgG1。Edelman等人的EU索引还陈述于Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,United StatesPublic Health Service,National Institutes of Health,Bethesda中。因此，短语“如Kabat中所陈述的EU索引”或“Kabat的EU索引”和“根据如Kabat中所陈述的EU索引的位置……”以及其语法变化形式是指基于如Kabat 1991中所陈述的Edelman等人的人IgG1EU抗体的残基编号系统。

用于可变结构域(重链和轻链可变结构域)和轻链恒定区氨基酸序列的编号系统为Kabat 1991中所陈述的编号系统。

如本文所使用，Fc区包括包含抗体恒定区但不包含第一恒定区免疫球蛋白结构域的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的后两个恒定区免疫球蛋白结构域，和IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及在Cγ1与Cγ2之间的铰链。

尽管Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区通常定义为包含残基C226或P230至其羧基末端，其中编号根据如在Kabat中所陈述的EU索引。Fc可以指分离的所述区域，或处于抗体、抗体片段或Fc融合蛋白环境中的所述区域。

在抗体恒定区内的多个不同位置观察到多态性(例如，Fc位置，包括但不限于位置270、272、312、315、356和358，如通过如Kabat中所陈述的EU索引所编号)，并且因此在所提供的序列与现有技术中的序列之间可能存在微小差异。人免疫球蛋白的多态性形式已得到充分表征。目前，已知18种Gm同种异型：G1m(1、2、3、17)或G1m(a、x、f、z)、G2m(23)或G2m(n)、G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m(b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5)。参见Lefranc等人,The human IgG subclasses:molecular analysis ofstructure,function and regulation.Pergamon,Oxford,第43-78页(1990)；Lefranc等人(1979)Hum.Genet.:50,199-211。明确地说，预期本发明的抗体可并入任何免疫球蛋白基因的任何同种异型、异种型或单倍型，并且不限于本文所提供的序列的同种异型、异种型或单倍型。

抗体结合位点：术语“抗体结合位点”是指抗原(例如FIXa或FXz)中包含与互补抗体特异性结合的连续或不连续的位点(即，表位)的区域。因此，抗体结合位点可含有抗原中在表位外并且可决定诸如结合亲和力和/或稳定性的特性，或影响诸如抗原酶活性或二聚化的特性的另外区域。因此，即使两种抗体结合抗原内的同一表位，但如果所述抗体分子与表位外的氨基酸建立不同分子间接触，那么认为所述抗体结合不同抗体结合位点。

抗原结合部分：如本文所使用，术语“抗原结合部分”可与“抗原结合片段”互换使用并且指完整抗体中能够特异性结合与完整抗体相同的表位的部分。特别地，其是指完整抗体中包含完整抗体的一个或多个CDR的一个或多个部分。本领域中已知抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段执行。抗体片段的实例包括但不限于，Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

抗原结合分子：术语“抗原结合分子”和“结合分子”在本公开中可互换使用并且涵盖如本文所定义的抗体，以及包含本文所公开的抗体的至少一个CDR并且能够结合相同表位的其他分子实体。例如，术语包括基于III型纤连蛋白结构域(单抗体)的支架、移植有一个或多个CDR的其他支架系统(例如肌腱蛋白)、适体等的抗体模拟物。在一些方面中，抗原结合分子可为双特异性的，即“双特异性结合分子”或“双特异性分子”。

大约：如本文所使用，术语“大约”当用于一个或多个感兴趣的值时，是指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，除非另外说明或自上下文另外显而易见，否则术语“大约”是指在所述参考值的任一方向(大于或小于)的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低范围内的值范围(所述数字将超过可能值的100％的情形除外)。

与……相关：如本文关于疾病所用，术语“与……相关”意指所讨论的症状、测量值、特征或状态与所述疾病的诊断、发展、存在或进展关联。相关可能但未必与疾病呈因果关系。

当关于两个或更多个部分使用时，术语“与……缔合”、“缀合”、“连接”、“附接”和“栓系”在用于两个或更多个部分时意指所述部分彼此直接或经由一个或多个充当连接剂的另外的部分以物理方式缔合或连接，由此形成足够稳定的结构，使得所述部分在所述结构的使用条件例如生理条件下保持物理缔合。“缔合”未必严格通过直接共价化学键合进行。其还可表明足够稳定以使“缔合”的实体保持物理缔合的基于离子键或氢键或杂交的连接。

结合亲和力：“结合亲和力”一般是指一个分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所使用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力一般可由解离常数(K_D)表示。可以通过本领域中已知的常用方法(包括本文所述的方法)测量亲和力。低亲和力抗体一般结合抗原较慢并且往往易于解离，而高亲和力抗体一般结合抗原较快并且往往保持结合较长时间。本领域中已知多种测量结合亲和力的方法，其中任一种均可用于本公开的目的。

术语“较高结合亲和力”或“较大亲和力”当用于本发明的任何抗体时是指关于参考抗体增加(如例如通过K_D测量)的结合亲和力。在一些实施方案中，参考抗体为不是亲和力成熟的相应抗体。在一些实施方案中，参考抗体为具有相同特异性的另一抗体(例如对于本文所公开的抗FIXa，参考抗体可为本领域中已知的另一抗FIX或抗FIXa抗体)。在一些实施方案中，增加的结合亲和力可例如比参考抗体对相同凝血因子(例如FIX或FX)、所述因子的某一形式(例如FIXa或FXz)或抗原结合位点(例如表位)的结合亲和力高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些实施方案中，增加的结合亲和力可比参考抗体对相同凝血因子(例如FIX或FX)、所述因子的某一形式(例如FIXa或FXz)或抗原结合位点(例如表位)的结合亲和力高例如至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。

结合：术语“结合”是指两个分子例如抗体与抗原之间的物理相互作用。

(i)结合特异性：术语“特异性”是指结合分子(例如抗体)相对于不同抗原位点优先结合一个抗原位点(例如表位)的能力并且未必暗示高亲和力。术语“结合特异性”和“特异性”可互换使用并且可指代(i)结合分子的特定部分和(ii)结合分子特异性结合(参见以下“特异性结合”的定义)特定表位的能力。例如，在一些实施方案中，本文所公开的双特异性抗体包含两种结合特异性，即，与例如FIXa的第一结合特异性和与例如FXz的第二结合特异性(在此情形中，“结合特异性”决定簇诸如双特异性抗体结合特定抗原决定簇的特定区域将等同于“结合结构域”)。

(ii)特异性结合：当存在抗原与结合分子(例如抗体)之间的特异性相互作用的免疫反应时，所述结合分子“特异性结合”。术语“特异性结合”意指产生的抗体通过其可变区结合抗原。术语“非特异性结合”意指产生的抗体未特异性结合抗原但出于某种原因通过非特异性方式结合抗原。作为一个实例，抗体将通过抗体分子的Fc部分非特异性结合Fc受体。作为另一实例，某些抗体可无意地与抗原交叉反应，而所述抗体并不是针对所述抗原所产生。

(iii)优先结合：如果结合分子(例如抗体)与其结合其他物质相比以较高亲和力、亲合力、更容易和/或更长持续时间结合，那么其“优先结合”抗原。例如，优先结合FIXa表位的抗体为与其结合其他FIXa表位或非FIXa表位相比以较高亲和力、亲合力、更容易和/或持续时间更长结合此表位的抗体。例如，如果在活化FIX和FIX酶原的存在下，超过50％、60％、70％、80％、90％或95％的抗FIX抗体结合FIXa，那么相对于FIXz，所述抗FIXa抗体优先结合FIXa。通过阅读此定义还应理解，例如，优先结合第一靶的抗体(或部分或表位)可以优先或不优先结合第二靶。因此，“优先结合”未必需要(但其可以包括)独占性结合。因此，在一些方面中，“优先结合”可为“独占性结合”。为了举例说明这些概念，如果50％的抗FIX特异性结合FIX酶原并且50％特异性结合FIXa，那么这种结合将为“非选择性”或“非优先的”。如果不到50％的抗FIX结合FIX酶原并且超过50％结合FXa，那么所述抗FIX将“优先结合”FIXa。如果抗FIX不结合FIX酶原并且仅结合FIXa，那么所述抗FIX将“独占性结合”FIXa。

生物样品：如本文所使用，术语“生物样品”是指自受试者、细胞系、组织培养物或可能包含有包含本文所公开的结合分子所特异性识别的抗原的分子的其他来源获得的任何样品。在一些方面中，生物样品为血液样品或来源于血液样品的样品(例如血浆)。本领域中已知用于自哺乳动物获得组织活检体和体液的方法。

双特异性抗体：“双特异性抗体”为“双特异性分子”或“双特异性结合分子”的特定形式。术语“双特异性抗体”意指能够通过两个不同抗原结合位点结合至少两个抗原决定簇(例如表位)的抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体能够同时结合两个抗原决定簇(例如表位)。在一些实施方案中，双特异性抗体结合其结合臂(一对重链/轻链)之一上的一个抗原(或表位)并且结合其第二结合臂(一对不同的重链/轻链)上的不同抗原(或表位)。在一些实施方案中，双特异性抗体可具有两个截然不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列方面)，并且对于其结合的每一抗原而言为单价的。双特异性抗体包括例如由四源杂交瘤技术(Milstein和Cuello(1983)Nature 305(5934):537-40)、通过两种不同单克隆抗体的化学缀合(Staerz等人(1985)Nature 314(6012):628-31)或通过结入孔或在Fc区中引入突变的类似方法(Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(14):6444-6448)所产生的抗体。

近期，已例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域开发出多种重组双特异性抗体形式(参见Kontermann RE,mAbs 4:2,(2012)1-16)。可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此置换的双特异性抗体描述于WO2009080251和WO2009080252中。

称为‘结入孔’的防止错配副产物问题的方法的目的是通过将突变引入CH3结构域中改变接触界面来迫使两条不同抗体的重链配对。一条链上的大体积氨基酸被具有较短侧链的氨基酸置换而产生‘孔’。相反，将具有较大侧链的氨基酸引入其他CH3结构域中以产生‘结’。通过共表达这两条重链(和两条相同轻链，所述轻链必须适于两条重链)，观察到异二聚体形成(‘结入孔’)相对于同二聚体形成(‘孔-孔’或‘结-结’)的高产率(Ridgway JB,Presta LG,Carter P；和WO1996027011)。可通过使用噬菌体展示方法重组两个CH3结构域的相互作用表面并且引入二硫桥以使异二聚体稳定来进一步增加异二聚体的百分比(Merchant A.M等人,Nature Biotech 16(1998)677-681；Aτwell S,Ridgway JB,WellsJA,Carter P.,J Mol Biol 270(1997)26-35)。用于结入孔技术的新方法描述于例如EP1870459A1中。Xie,Z.等人,J Immunol Methods 286(2005)95-101提及使用scFv与针对FC部分的结入孔技术的组合的双特异性抗体形式。

已利用抗体的模块结构产生超过60种不同的双特异性抗体形式。参见Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67:95-106，其以引用的方式整体并入本文中。因此，在一些方面中，双特异性抗体形式选自crossMab、DAF(双重作用Fab)(二合一)、DAF(四合一)、DutaMab、DT-IgG、LC共享结入孔、结入孔组装体、电荷对(Charge pair)、Fab臂交换、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y(利用亮氨酸拉链诱导两个HC异二聚化的双特异性抗体)、Fcab、Kλ-body、正交Fab、DVD-IgG(双可变结构域IgG)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG(四合一)、纳米抗体、纳米抗体-HSA、BiTE(双特异性T细胞接合子)、双功能抗体、双重亲和力再靶向(dual-affinity-retargeting，DART)、串联抗体(TandAb)、scDiabody、scDiabody-CH3、三功能抗体、微抗体、微型抗体、TriBi微型抗体、scFv-CH3KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-ScFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HC Ab、scDiabody-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、内抗体、对接锁定、ImmTAC、HSAbody、scDiabody-HSA、串联scFv-毒素、IgG-IgG、Cov-X-Body和scFv1-PEG-scFV2。

在一些方面中，双特异性抗体为不对称(例如异二聚体)抗体，其包含链A和链B，其中

(i)链A包含T336W突变，并且链B包含T366W、L368A和Y407V突变(结入孔形式)；

(ii)链A包含F405L突变，并且链B包含K409R突变(duobody形式)；

(iii)链A包含T350V、L351Y、F405A和Y407V突变，并且链B包含T350V、T366L、K392L和T394W突变(azymetric形式)；

(iv)链A包含K409D和K392D突变，并且链B包含D399K和E356K突变(电荷对形式)；

(v)链A包含D221E、P228E和L368E突变，并且链B包含D221R、P228R和K409R突变(电荷对形式)；

(vi)链A包含S364H和F405A突变，并且链B包含Y349T和T394F突变(HA-TF形式)；或

(vii)链A包含IgG/A嵌合体，并且链B还包含IgG/A嵌合体(SEEDbody形式)。

在一些方面中，双特异性抗体为通过将轻链或重链的氨基或羧基末端与另外抗原结合单元附接而工程化成具有双特异性的单特异性抗体。这些另外抗原结合单元的替代选择包括单结构域抗体(未配对VL或VH)、配对的抗体可变结构域(例如Fv或scFv)或工程化蛋白质支架。在一些方面中，本发明的双特意性分子包含双特异性抗体片段。本领域中已知缺乏一些或全部双特异性抗体恒定结构域的多种双特异性片段形式。在一些方面中，本发明的双特异性分子为双特异性融合蛋白，例如ImmTAC(连接至亲和力成熟的受体的scFv)。在其他方面中，所述双特异性分子为双特异性抗体缀合物。

双特异性分子：参见以上“抗原结合分子”/“结合分子”的定义。

嵌合抗体：术语“嵌合抗体”及其语法变化形式是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。通常，轻链和重链的可变区对应于来源于一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性和/或亲和力，和/或能力的抗体可变区，而恒定区与来源于另一物种(通常为人)的抗体中的序列同源以避免在所述物种中引起免疫反应。

互补决定区：术语“互补决定区”或“CDR”是指H(重)链或L(轻)链的可变区含有能够特异性结合抗原靶的氨基酸序列。这些CDR区引起抗体对特定抗原决定簇结构的基础特异性。此类区域还被称为“高变区”。参见以上“抗体”的定义。

保守氨基酸取代：“保守氨基酸取代”为氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸或谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被来自相同侧链家族的另一氨基酸置换，那么认为所述氨基酸取代为保守取代。在另一方面中，可将一连串氨基酸用侧链家族成员的顺序和/或组成不同的结构上相似的氨基酸串保守地置换。

非保守氨基酸取代包括以下取代，其中(i)具有正电性侧链的残基(例如Arg、His或Lys)取代负电性残基(例如Glu或Asp)或被负电性残基取代；(ii)亲水性残基(例如Ser或Thr)取代疏水性残基(例如Ala、Leu、Ile、Phe或Val)或被疏水性残基取代；(iii)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其他残基或被任何其他残基取代；或(iv)具有大体积疏水性或芳族侧链的残基(例如Val、His、Ile或Trp)取代具有较小侧链(例如Ala或Ser)或无侧链(例如Gly)的残基或被所述残基取代。

普通技术人员还可容易地鉴别其他氨基酸取代。例如，对于氨基酸丙氨酸，可由D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸中的任一种进行取代。对于赖氨酸，置换可为D-赖氨酸、精氨酸、D-精氨酸、高精氨酸、甲硫氨酸、D-甲硫氨酸、鸟氨酸或D-鸟氨酸中的任一种。一般而言，预期可诱导分离多肽的特性改变的功能重要区中的取代为以下取代，其中(i)极性残基例如丝氨酸或苏氨酸取代疏水性残基例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸(或被疏水性残基取代)；(ii)半胱氨酸残基取代任何其他残基(或被任何其他残基取代)；(iii)具有正电性侧链的残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代具有负电性侧链的残基例如谷氨酸或天冬氨酸(或被具有负电性侧链的残基取代)；或者(iv)具有大体积侧链的残基例如苯丙氨酸取代不具有此类侧链的残基例如甘氨酸(或被不具有此类侧链的残基取代)。前述非保守性取代中的一个可改变蛋白质的功能特性的可能性还与针对蛋白质功能重要区的取代位置相关：一些非保守取代因此可能对生物特性具有极少影响或不具有影响。

保守：如本文所使用，术语“保守”是指多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基分别为在所比较的两个或更多个序列的相同位置未发生改变的核苷酸或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸为在相关序列间的保守性比在所述序列别处出现的核苷酸或氨基酸高的核苷酸或氨基酸。

在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此100％相同，那么认为所述序列“完全保守”或“相同”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同或至少95％相同，那么认为所述序列“高度保守”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此约70％相同、约80％相同、约90％相同、约95％、约98％或约99％相同，那么认为所述序列“高度保守”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此至少30％相同、至少40％相同、至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同或至少95％相同，那么认为所述序列“保守”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此约30％相同、约40％相同、约50％相同、约60％相同、约70％相同、约80％相同、约90％相同、约95％相同、约98％相同或约99％相同，那么认为所述序列“保守”。序列保守性可适用于多核苷酸或多肽的整个长度或可适用于其一部分、一个区域或一个特征。

交叉竞争：如本文关于结合分子(例如抗体)所使用的术语“竞争”或“交叉竞争”意指第一结合分子(例如第一抗体或其抗原结合部分)以与第二结合分子(例如第二抗体或其抗原结合部分)的结合足够类似的方式结合表位，使得在第二结合分子的存在下第一结合分子与其同源表位的结合结果相较于在第二结合分子不存在下第一结合分子的结合明显减少。第二结合分子与其表位的结合在第一结合分子的存在下也明显减少的替代情况可以是但未必是此情形。即，第一结合分子可以抑制第二结合分子与其表位的结合，而不存在第二分子抑制第一结合分子与其相应表位的结合。然而，在每一结合分子明显抑制另一结合分子与其同源表位结合的情况下，无论达到相同程度、较高程度抑或较低程度，均认为所述结合分子彼此“交叉竞争”结合其相应表位。本发明涵盖竞争结合分子和交叉竞争结合分子。

如果结合分子(例如抗体)交叉竞争使得仅一种抗体可在给定时间点结合表位，即，一个结合分子阻止另一结合分子的结合或调节作用，那么认为所述结合分子“结合相同表位”或“包含相同结合位点”或具有“基本上相同的结合”特征。

本文中的竞争意指如通过竞争ELISA分析或通过ForteBio分析(例如，如实施例部分中所描述)所测定的高出至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的相对抑制。设定较高的相对抑制阈值作为在特定情形中合适竞争水平的标准可为合乎需要的。因此，有可能设定竞争性结合的标准，其中检测到至少约40％、或至少约45％、或至少约50％、或至少约55％、或至少约60％、或至少约65％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％或甚至约100％的相对抑制作用，则认为抗体具有足够竞争性。

有效量：如本文所使用，术语剂(例如治疗剂诸如抗体)的“有效量”是指足以实现有益或所需结果例如临床结果的量，并且因此“有效量”取决于其应用的环境。例如，在施用治疗出血的治疗剂的情况下，剂的有效量为例如相较于在不施用所述剂的情况下获得的反应，足以减轻或减少出血发生的量。术语“有效量”可与“有效剂量”、“治疗有效量”或“治疗有效剂量”互换使用。

效应功能：抗体的“效应功能”为结合补体蛋白的能力，所述能力可以在称为补体依赖性细胞毒性(CDC)的过程中帮助溶解靶抗原例如细胞病原体。Fc区的另一效应活性为结合免疫细胞，或具有触发其他免疫作用的能力的所谓效应细胞的表面上的Fc受体(例如FcγR)。可以例如通过使用不含Fc区的抗体片段(诸如Fab、F(ab')2或单链Fv(scFv))；通过移除连接至Fc区中特定残基的糖(去糖基化抗体)；或通过采用来自IgG4抗体的Fc区(“无效应物IgG4Fc”)代替IgG1的Fc区，来避免抗体的效应功能。众所周知，IgG4抗体的特征在于具有比IgG1低的补体活化和抗体依赖性细胞的细胞毒性的水平。

工程化抗体：如本文所使用，当本发明的实施方案被设计成具有与起始点、野生型或天然分子不同的特征或特性(无论是结构还是化学方面)时，其为“工程化的”。就这一点而言，“工程化抗体”为例如已进行取代/突变以改良亲和力、血浆半衰期等的抗体，所述抗体的形式已(例如通过产生scFv或双特异性抗体)进行修饰，或所述抗体已经历亲和力成熟。

表位：如本文所使用，术语“表位”是指能够结合结合分子例如抗体的抗原蛋白决定簇(例如FIXa或FXz的氨基酸子序列)。表位通常由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成并且通常具有特定三维结构特征以及荷质比特征。抗体或结合分子中识别表位的部分被称为互补位。基于结构和与互补位的相互作用，蛋白质抗原的表位被分成两类，即构象表位和线性表位。构象表位由抗原氨基酸序列的不连续区段构成。这些表位基于抗原的3-D表面特征和形状或三级结构而与互补位相互作用。相比之下，线性表位基于其一级结构而与互补位相互作用。线性表位由抗原的连续氨基酸序列形成。

表达载体：“表达载体”为当引入适当宿主细胞中时可转录并且翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常是指包含可用于得到所需表达产物的表达载体的合适宿主细胞。根据本发明的抗体(例如双特异性抗体)优选地通过重组手段产生。此类方法为现有技术状态中广泛所知的并且包括在原核和真核细胞中进行蛋白质表达，随后分离抗体多肽以及通常纯化至药学上可接受的纯度。

种系序列：如本文所使用，术语“种系序列”是指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。任何合适的未重排免疫球蛋白来源均可使用。术语“种系”是指在抗体暴露于抗原之前的V、D和J微型基因(minigene)的序列。重排的“V区”描述由V、D和J(对于重链)或V与J微型基因(对于轻链)之间的重排事件产生的遗传元件。“抗体V区”是指由V、D和J元件编码的多肽区。抗体V区由重排的V、D和J微型基因编码。术语“V(D)J重组”是指将V、D或J微型基因重组到另一V、D或J微型基因的任何方法。V区可为全长抗体的一部分、Fab、scFv或抗体的任何其他衍生物(参见以下抗体的定义)。“种系V区”是指在显著诱变事件之前重排V、D和J微型基因的序列。种系V区可以在V-D、D-J或V-J微型基因的接合处具有随机插入或缺失。非种系V区(或“成熟”V区)将与微型基因的种系序列相差通常超过5个残基(不包括接合处缺失或插入)。

同源性：如本文所使用，术语“同源性”是指聚合物分子之间例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。一般而言，术语“同源性”暗示两个分子之间的进化关系。因此，同源的两个分子将具有共同的进化祖先。在本发明的上下文中，术语同源性涵盖同一性和相似性。

在一些实施方案中，如果聚合物分子中至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的单体相同(完全相同的单体)或类似(保守取代)，那么认为所述分子彼此“同源”。术语“同源”必然指代至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。

人抗体：术语“人抗体”意指人产生的抗体，或使用本领域中已知的任何技术(例如在培养细胞中重组表达，或在转基因动物中表达)制备的具有对应于人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。因此，术语人抗体还涵盖具有对应于最初由人产生的抗体的氨基酸序列(或其工程化变体或衍生物)但在非人系统中表达(例如由化学合成产生；在微生物、哺乳动物或昆虫细胞中重组表达；或在动物受试者中表达)的抗体。因此，由人受试者或由人细胞(例如表达重组抗体或其片段的杂交瘤或细胞系)获得并且随后在动物例如小鼠中表达的抗体被视为人抗体。人抗体的这种定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体诸如像包含鼠类轻链和人重链多肽的抗体。

人源化抗体：术语“人源化抗体”是指被工程化成含有最小非人(例如鼠类)序列的来源于非人(例如鼠类)免疫球蛋白的抗体。通常，人源化抗体为来自CDR的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的CDR的残基置换的人免疫球蛋白(Jones等人,1986,Nature,321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等人,1988,Science,239:1534-1536)。在一些情况下，人免疫球蛋白的FW残基被来自具有所需特异性和/或亲和力和/或能力的非人物种的抗体中的相应残基置换。

人源化抗体可通过取代FW区中和/或经置换非人残基内的其他残基进行进一步修饰以精制并优化抗体特异性、亲和力和/或能力。一般而言，人源化抗体将包含至少一个并且通常两个或三个可变结构域的基本上全部，所述结构域含有所有或基本上所有的与非人免疫球蛋白对应的CDR区，而所有或基本上所有的FW区为人免疫球蛋白共同序列的FW区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白恒定区或结构域的至少一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利号5,225,539或5,639,641中。

同一性：如本文所使用，术语“同一性”是指聚合物分子之间例如多肽分子或多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间的总体单体保守性。在无任何其他限定词的情况下，术语“相同”，例如蛋白质A与蛋白质B相同，表明序列100％相同(100％序列同一性)。将两个序列描述为例如“70％相同”等同于描述其具有例如“70％序列同一性”。

两个多核苷酸序列的同一性百分比的计算例如可以通过比对所述两个序列以实现最佳比较目的进行(例如可以在第一和第二核酸序列中的一个或两个中引入空位以实现最佳比对，并且可以忽略不相同的序列以实现比较目的)。在某些实施方案中，出于比较目的进行比对的序列的长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。接着，比较在相应核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的一位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，那么所述分子在所述位置处相同。两个序列之间的同一性百分比随所述序列所共有的相同位置的数量而变化，需考虑出于最佳比对两个序列而需要引入的空位的数量和每个空位的长度。序列比较和两个序列之间的同一性百分比的测定可使用数学算法实现。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)与尿嘧啶(U)可以视为等同的。

合适的软件程序可自各种来源获得，并且用于比对蛋白质和核苷酸序列。一种适于测定序列同一性百分比的程序为bl2seq，其为可自美国政府的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适的程序为例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其为生物信息程序的EMBOSS套件的部分，并且还可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa自欧洲生物信息研究所(EuropeanBioinformatics Institute，EBI)获得。

序列比对可使用本领域中已知的方法，诸如MAFFT、Clustal(ClustalW、Clustal X或Clustal Omega)、MUSCLE等进行。

与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域可各自具有其自身的序列同一性百分比。应注意，序列同一性百分比值为舍入至最接近的十分位。例如，80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入至80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入至80.2。还应注意，长度值将始终为整数。

在某些方面中，将第一氨基酸序列(或核酸序列)与第二氨基酸序列(或核酸序列)的同一性百分比(％ID)计算为％ID＝100×(Y/Z)，其中Y为在第一与第二序列比对(如通过目测检查或特定序列比对程序所比对)中评为相同匹配的氨基酸残基(或核碱基)的数量并且Z为第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度比第二序列长，那么第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。

本领域的技术人员将理解，产生用于计算序列同一性百分比的序列比对不限于仅仅通过原始序列数据进行的二元序列-序列比较。还应理解，序列比对可通过整合序列数据与异源来源的数据产生，所述异质来源的数据诸如结构数据(例如结晶蛋白结构)、功能数据(例如突变位置)或系统发育数据。整合异源数据以产生多重序列比对的合适程序为T-Coffee，其获自www.tcoffee.org并且可替代地获自例如EBI。还应了解，用于计算序列同一性百分比的最终比对可自动或手动策划。

免疫缀合物：如本文所使用，术语“免疫缀合物”是指包含结合分子(例如抗FIXa、抗FXz或双特异性抗FIXa/抗FXz)和以化学方式缀合至所述结合分子的一个或多个部分例如治疗部分或诊断部分的化合物。一般而言，免疫缀合物由以下通式定义：A-(L-M)n，其中A为结合分子(例如抗体)，L为可选接头，并且M为异源部分，其可为例如治疗剂、可检测标记等，并且n为整数。免疫缀合物还可通过颠倒次序的所述通式定义。在一些方面中，免疫缀合物为“抗体-药物缀合物”(“ADC”)。在本公开的上下文中，术语“免疫缀合物”不限于化学或酶缀合物分子。如本公开中所使用，术语“免疫缀合物”还包括基因融合物。

分离的：如本文所使用，术语“分离的”是指已与其所缔合的至少一些组分(无论在自然界还是在实验环境中)分离的物质或实体(例如多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或呈自然界中未发现的形式的组合物)。分离的物质(例如核苷酸序列或蛋白质序列)可关于与其缔合的物质而具有不同水平的纯度。

分离的物质和/或实体可与至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少95％或更高百分比的最初其所缔合的其他组分分离。

在一些实施方案中，分离的剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯。

如本文所使用，如果一种物质基本上不含其他组分，那么其为“纯”的。术语“基本上分离”意指化合物基本上从形成或检测其的环境分离。部分分离可包括例如富含本公开化合物的组合物。基本上分离可包括含有至少约30重量％、至少约35重量％、至少约40重量％、至少约45重量％、至少约50重量％、至少约55重量％、至少约60重量％、至少约65重量％、至少约70重量％、至少约75重量％、至少约80重量％、至少约85重量％、至少约90重量％、至少约95重量％、至少约97重量％或至少约99重量％的本公开化合物或其盐的组合物。

“分离的”本文所公开的多核苷酸(例如抗体)、载体、多肽、细胞或任何组合物为呈自然界中未发现的形式的多核苷酸(例如抗体)、载体、多肽、细胞或组合物。分离的多核苷酸、载体、多肽或组合物包括纯化至使其不再呈其在自然界中所发现的形式的程度的多核苷酸、载体、多肽或组合物。在一些方面中，分离的多核苷酸、载体、多肽或组合物为基本上纯的。

模拟FVIIIa活性：本文所公开的结合分子“模拟FVIIIa活性”的能力，即，模拟活化因子VIII的活性的能力，可根据本领域中已知的不同方法测量。一种此类方法为如本说明书实施例部分中所描述的显色测定。在一个方面中，如果观察到的FXa底物裂解速率比在不添加结合分子(例如双特异性抗体)情况下的平均基础速率高至少三个标准偏差，那么认为本文所公开的结合分子(例如双特异性抗体)“模拟FVIIIa活性”。另一示例性方法为活化部分凝血活酶时间(aPTT)测定。术语‘活化部分凝血活酶时间(APTT)’得自所述测试的最初形式(1953年创造)，其中仅控制所述测试的磷脂浓度(与磷脂和表面活化物浓度相对)并且名称‘部分凝血活酶’为在磷脂制备时应用，其加速凝血但不校正血友病血浆延长的凝血时间。术语‘部分’基本上意指磷脂存在但不是组织因子。aPTT还称为：高岭土-脑磷脂凝固时间(KCCT)或高岭土部分凝血活酶时间(Partial Thromboplastin Time with Kaolin，PTTK)。其他有用方法包括一期(OS)凝血测定，所述测定改编自上述传统aPTT测定。一期凝血测定使用缺乏FVIII的血浆和稀释的测试样品，并且可定量FVIII活性。参见实施例4。相比之下，aPTT测定使用样品血浆以及aPTT试剂和钙并且报告凝血时间。

单克隆抗体：“单克隆抗体”是指单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合所涉及的同质抗体群。这与通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相对。术语“单克隆抗体”涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链可变片段(scFv)、包含抗体部分的融合蛋白以及包含抗原识别位点的任何其他修饰免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以多种方式，包括但不限于，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物(例如在转基因小鼠中表达人抗体)制备的此类抗体。

突变：在本公开的内容中，认为术语“突变”与以上所定义的“氨基酸取代”(有时简称为“取代”)为可互换的。在一些方面中，术语突变是指编码抗体种系基因的核酸中通过化学、酶或任何其他手段进行的任何核苷酸的缺失、插入或取代，由此使所得多肽的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基改变。在一些方面中，本文所公开的核酸序列中的突变引起氨基酸取代。在其他方面中，本文所公开的核酸序列中的密码子突变不引起氨基酸取代，其中所得密码子为同义密码子。因此，在一些方面中，本文所公开的核酸序列可通过引入一个或多个同义密码子改变进行密码子优化。此类密码子优化可例如(i)提高重组蛋白质表达中的蛋白质产率；或(ii)改善编码本文所公开的结合分子的mRNA或DNA的稳定性、半衰期或其他所需特性，其中将此类mRNA或DNA施用给有需要的受试者。

患者：如本文所使用，“患者”是指可能寻求或有治疗需求、需要治疗、正接受治疗、将接受治疗的受试者，或正由经过训练的专业人员针对特定疾病或病况进行护理的受试者。

药物组合物：术语“药物组合物”是指呈允许活性成分(例如本文所公开的结合分子，诸如抗体)的生物活性有效的形式并且不含对将施用组合物的受试者产生不可接受的毒性的其他组分的制剂。此类组合物可为无菌的。

药学上可接受：短语“药学上可接受”在本文中用于指在合理医学判断范围内、适于与人和动物组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的效益/风险比相符的化合物、材料、组合物和/或剂型。一般而言，联邦或州政府的管理机构批准(或美国药典或其他普遍公认的药典中所列)用于动物并且更特别地，用于人表明所述化合物、材料、组合物和/或剂型为药学上可接受的。普遍认为安全用于治疗目的的化合物、材料、组合物和/或剂型为“治疗可接受的”。普遍认为安全用于诊断目的的化合物、材料、组合物和/或剂型为“诊断可接受的”。

药学上可接受的赋形剂：如本文所使用，短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物外的任何成分(例如能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)并且其具有对患者大体上无毒并且不会使患者发炎的特性。赋形剂可包括例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包覆剂、压缩助剂、崩解剂、染料(着色剂)、缓和剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包覆剂、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷墨水、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂以及水合用水。示例性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸二钙、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮(crospovidone)、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶凝淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、视黄醇棕榈酸酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟基乙酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。

普遍认为安全用于治疗目的的赋形剂为“治疗可接受的赋形剂”。普遍认为安全用于诊断目的的赋形剂为“诊断可接受的赋形剂”。

药学上可接受的盐：本公开还包括本文所述化合物的药学上可接受的盐。如本文所使用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中通过将现有酸或碱部分转化其盐形式(例如通过使游离碱性基团与合适有机酸反应)来改变母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基诸如胺的无机或有机酸盐；酸性残基诸如羧酸的碱金属或有机盐；等等。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、乙酸、己二酸盐、褐藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴化物、盐酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁盐等等；以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可由含有碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法合成。一般而言，此类盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中，或在所述两者的混合物中反应来制备；一般使用非水性介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适盐的清单见于Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,MackPublishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(eds.),Wiley-VCH,2008；以及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)，其各自以引用的方式整体并入本文中。

药学上可接受的溶剂合物：如本文所使用，术语“药学上可接受的溶剂合物”意指在晶格中掺入合适溶剂分子的本发明的化合物。合适溶剂在所施用的剂量下为生理学上可耐受的。例如，可通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液结晶、再结晶或沉淀来制备溶剂合物。合适溶剂的实例为乙醇、水(例如一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N'-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苯甲酯等等。当水作为溶剂时，溶剂合物被称为“水合物”。

药代动力学：如本文所使用，“药代动力学”是指分子或化合物的一种或多种特性，因为其涉及决定施用活生物体的物质的命运。药代动力学分为若干区域，包括吸收、分配、代谢和排泄的程度和速率。此通常称为ADME，其中：(A)吸收(Absorption)为物质进入血液循环的过程；(D)分配(Distribution)为物质在整个体液和组织中分散或散布；(M)代谢(Metabolism)(或生物转化)为母体化合物成为子代代谢物的不可逆转化；和(E)排泄(Excretion)(或去除)是指物质自身体去除。在极少情况下，一些药物不可逆地积累于身体组织中。

多核苷酸：如本文所使用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物的聚合物。此术语是指分子的一级结构。因此，所述术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。其还包括例如通过烷基化和/或通过戴帽修饰以及未修饰形式的多核苷酸。更特别地，术语“多核苷酸”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA、siRNA和mRNA(无论是剪接抑或未剪接的)、呈嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其他类型的多核苷酸，以及含有非核苷酸主链的其他聚合物，例如聚酰胺(例如肽核酸“PNA”)和聚吗啉基聚合物，和其他合成序列特异性核酸聚合物，前提是所述聚合物含有的核碱基呈如在DNA和RNA中所见的允许碱基配对和碱基堆积的构型。在特定方面中，多核苷酸包含mRNA。在其他方面中，mRNA为合成mRNA。在一些方面中，合成mRNA包含至少一个非天然核碱基。在一些方面中，某一类别的所有核碱基均被非天然核碱基置换(例如本文所公开的多核苷酸中的所有尿苷可被非天然核碱基例如5-甲氧基尿苷置换)。在一些方面中，多核苷酸(例如合成RNA或合成DNA)仅包含天然核碱基，即，在合成DNA情况下的A、C、T和U；或在合成RNA情况下的A、C、T和U。

本领域的技术人员应理解，本文所公开的密码子谱中的T碱基存在于DNA中，而T碱基在相应RNA中将被U碱基置换。例如，本文所公开的呈DNA形式的密码子-核苷酸序列例如载体或活体外翻译(IVT)模板的T碱基将被转录成其相应转录mRNA中的U碱基。就这一点而言，认为密码子优化的DNA序列(包含T)及其相应RNA序列(包含U)为本发明的密码子优化的核苷酸序列。本领域的技术人员还应了解，可通过用非天然碱基置换一个或多个碱基产生等效密码子谱。因此，例如TTC密码子(DNA谱)将对应于UUC密码子(RNA谱)，UUC密码子又将对应于ΨΨC密码子(RNA谱，其中U被假尿苷置换)。

标准A-T和G-C碱基对在允许胸苷的N3-H和C4-氧基分别与腺苷的N1和C6-NH₂之间以及胞苷的C2-氧基、N3和C4-NH₂分别与鸟苷的C2-NH₂、N'-H和C6-氧基之间形成氢键的条件下形成。因此，例如，鸟苷(2-氨基-6-氧基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)可被修饰以形成异鸟苷(2-氧基-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。此类修饰使核苷碱基不再与胞嘧啶有效形成标准碱基配对。不过，修饰胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧基-4-氨基-嘧啶)形成异胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧基-嘧啶)使得修饰核苷酸不能与鸟苷有效碱基配对，而是与异鸟苷形成碱基配对(颁予Collins等人的美国专利号5,681,702)。异胞嘧啶可得自Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)；异胞苷可通过Switzer等人(1993)Biochemistry32:10489-10496和其中引用的参考文献所描述的方法制备；2'-脱氧-5-甲基-异胞苷可通过Tor等人(1993)J.Am.Chem.Soc.115:4461-4467和其中引用的参考文献所描述的方法制备；并且异鸟嘌呤核苷酸可使用Switzer等人,1993,同上文和Mantsch等人(1993)Biochem.14:5593-5601所描述的方法，或通过颁予Collins等人的美国专利号5,780,610中所描述的方法制备。其他非天然碱基对可通过Piccirilli等人(1990)Nature 343:33-37中关于合成2,6-二氨基嘧啶及其补体(1-甲基吡唑并[4,3]嘧啶-5,7-(4H,6H)-二酮)所描述的方法合成。已知其他形成独特碱基对的此类修饰核苷酸单元，诸如Leach等人(1992)J.Am.Chem.Soc.114:3675-3683和Switzer等人,同上文中所描述的修饰核苷酸单元。

多肽：术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指具有任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可包含修饰氨基酸。所述术语还涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。在所述定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸，诸如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、D-氨基酸和肌氨酸)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。

如本文所使用，所述术语是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、前述的同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和其他等效物、变体和类似物。多肽可为单一多肽或者可为多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。其还可包含单链或多链多肽。最常见的二硫键联存在于多链多肽中。术语多肽还可适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。在一些实施方案中，“肽”的长度可小于或等于50个氨基酸，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。

防止：如本文所使用，术语“防止”是指部分或完全延迟疾病、病症和/或病状的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或病状的进展；和/或降低发展与所述疾病、病症和/或病状有关的病变的风险。

预防性：如本文所使用，“预防性”是指治疗或操作过程用于防止疾病或病状的发作，或者防止或延迟与出血发作(例如血友病)有关的症状。

预防治疗：如本文所使用，“预防治疗”是指维持健康状况并且防止或延迟出血发作的发生，或者防止或延迟与疾病或病状有关的症状所采取的措施。

重组：“重组”多肽或蛋白质是指经由重组DNA技术产生的多肽或蛋白质。出于本发明的目的，在工程化宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被视为分离的，已通过任何合适技术进行分离、部分分离或者部分地或基本上纯化的天然或重组多肽也被视为分离的。本文所公开的多肽可使用本领域中已知的方法重组产生。替代地，本文所公开的蛋白质和肽可为化学合成的。

相似性：如本文所使用，术语“相似性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合分子之间相似性百分比的计算可以与同一性百分比计算相同的方式进行，除了如本领域中所理解，相似性百分比的计算考虑保守取代。

受试者：“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指希望诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人、家畜、农畜、动物园动物、运动动物、宠物，诸如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛；灵长类动物，诸如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物，诸如狗和狼；猫科动物，诸如猫、狮子和虎；马科动物，诸如马、驴和斑马；熊、食用动物诸如奶牛、猪和绵羊；有蹄类动物，诸如鹿和长颈鹿；啮齿动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。在某些实施方案中，哺乳动物为人受试者。在其他实施方案中，受试者为人患者。在一特定实施方案中，受试者为可用于本文所描述的方法中的人患者或其细胞，无论是在活体内、活体外抑或离体的。

基本上：如本文所使用，术语“基本上”是指展现感兴趣的特征或特性的总体或近似总体的范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员应了解，生物和化学现象若发生的话，很少达到完成和/或进行完全或者实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕捉许多生物和化学现象中固有的完全性的潜在缺乏。

基本上相等：如本文关于剂量间的时间差异所使用，所述术语意指+/-2％。

基本上同时：如本文所使用并且当涉及多个剂量时，所述术语意指在2秒内。

罹患：“罹患”疾病、病症和/或病状的个体被诊断患有所述疾病、病症和/或病状或展现所述疾病、病症和/或病状的一种或多种症状。

易患：“易患”疾病、病症和/或病状的个体尚未被诊断患有所述疾病、病症和/或病状和/或可能未展现所述疾病、病症和/或病状的症状，但有发展疾病或其症状的倾向。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状(例如癌症)的个体的特征在于以下中的一项或多项：(1)与发展所述疾病、病症和/或病状有关的基因突变；(2)与发展所述疾病、病症和/或病状有关的基因多态性；(3)与所述疾病、病症和/或病状有关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性增加或降低；(4)与发展所述疾病、病症和/或病状有关的习惯和/或生活方式；(5)所述疾病、病症和/或病状的家族史；和(6)暴露于和/或感染与发展所述疾病、病症和/或病状有关的微生物。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体将发展所述疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体将不发展所述疾病、病症和/或病状。

治疗剂：术语“治疗剂”或“剂”是指当施用给受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引起所需生物和/或药理学作用的分子实体。例如，在一些实施方案中，本文所公开的双特异性抗体可为治疗剂。在一些实施方案中，剂为作为组合疗法的一部分与至少一种本文所公开的抗体共施用的另一分子(例如凝血因子、辅因子等)。

治疗有效量：如本文所使用，术语“治疗有效量”意指当施用给罹患或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者时，足以治疗所述感染、疾病、病症和/或病状，改善其症状，诊断、防止和/或延迟其发作而递送的剂的量(例如核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)。

治疗有效结果：如本文所使用，术语“治疗有效结果”意指在罹患或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者中足以治疗所述感染、疾病、病症和/或病状，改善其症状、诊断、防止和/或延迟其发作的结果。

治疗、治疗方法、疗法：如本文所使用，术语“治疗”或“治疗方法”或“疗法”或其语法变化形式是指部分或完全地减轻、改良、改善、缓解出血疾病、病症或病状，例如血友病的一种或多种症状或特征，延迟其发作，抑制其进展，降低其严重程度和/或减少其发生。例如，“治疗”出血病症可指防止出血，降低出血发作频率和/或严重程度等。治疗方法可施用给未展现疾病、病症和/或病状的病征的受试者和/或仅展现疾病、病症和/或病状的早期病征的受试者以达到降低发展与所述疾病、病症和/或病状有关的病变的风险的目的。

载体：“载体”为将插入的核酸分子转移至宿主细胞中和/或宿主细胞之间的核酸分子，特别是自复制核酸分子。所述术语包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中(例如染色体整合)的载体、主要用于DNA或RNA复制的复制载体，和用于转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。在一些方面中，编码本文所公开的结合分子的核酸(DNA或RNA，诸如mRNA)的施用和/或表达可在活体外(例如在重组蛋白质产生期间)发生，而在其他情况下，其可在活体内发生(例如将mRNA施用给受试者)或离体发生(例如将DNA或RNA引入自体或异体细胞中以施用给有需要的受试者)。还包括提供超过一种上述功能的载体。

II.抗FIX和抗FX结合分子

本公开提供结合因子IX和因子X的抗体，以及其抗原结合部分。这些抗体能够优先结合这些凝血因子的特定功能形式。例如，在一些实施方案中，所公开的针对FIX的抗体优先结合活化FIX(FIXa)，例如游离FIXa或在活性位点中共价连接至底物模拟物的FIXa(FXa+EGR-CMK)。在其他实施方案中，相对于游离FIXa或FIX酶原，所公开的抗体优先结合FIXa-SM。在其他实施方案中，相对于FIXa-SM或FIX酶原，所公开的抗体优先结合游离FIXa。相比之下，在一些实施方案中，相对于活化FX(FXa)，所公开的针对FX的抗体优先结合FX酶原(FXz)。此优先结合对于产生包含抗FIXa部分和抗FXz部分的双特异性分子至关重要，所述双特异性分子可特异性并且同时结合FIXa和FXz。因子VIII为FIXa的辅因子，其在Ca²⁺和磷脂存在下与FX形成复合物，由此将FX转化成活化FXa。因此，在FIXa与FXz之间抗体介导的复合物的形成模拟FVIIIa的作用。

在又其他实施方案中，相对于游离FIXa或FIXa-SM，一些所公开的抗体优先结合FIX酶原(“抗FIXz抗体”)。因此，可使用抗FIXz抗体产生包含抗FIXz抗体和抗FX抗体(例如抗FXz抗体或抗FXa抗体)的双特异性分子。

在某些实施方案中，相对于FXz，一些所公开的抗FX抗体优先结合FXa(“抗FXa抗体”)。可使用抗FXa抗体产生包含抗FXa抗体和抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)的双特异性分子。

因此，在FIX与FX之间抗体介导的复合物的形成可用于回避FVIII替代疗法，特别是用于已产生针对FVIII的抗体或有产生针对FVIII的抗体的风险的受试者。

本公开还提供结合FX(FXz和/或FXa)和FIX(FIXz和/或FIXa)的双特异性结合分子。在一个实施方案中，所述双特异性结合分子可为抗FIXa抗体或抗FIXz抗体中的任一种与抗FXa抗体或抗FXz抗体中的任一种的组合。在一些实施方案中，所述双特异性结合分子特异性结合FXz、FIXz和FIXa，但不可检测地结合FXa。在某些实施方案中，所述双特异性结合分子以不同结合亲和力(例如K_D)结合FIXz、FIXa和FXz。在其他实施方案中，所述双特异性结合分子以小于1μM的K_D结合FIXz、FIXa和FXz中的每一个(例如分别为8nM、2nM或20nM)。

(a)抗FIXa结合分子

本公开提供相对于FIX酶原，优先结合活化FIX(FIXa)的抗FIX结合分子，例如抗FIX抗体或包含其抗原结合部分的分子。

因子IX(FIX)为由肝脏肝细胞以前原酶原形式合成，其合成需要广泛翻译后修饰。前原酶原在其氨基末端含有前体肽(疏水性信号肽)，其将正在生长的多肽转运至内质网的内腔中。一旦进入ER内部，此信号肽即被信号肽酶裂解。原肽充当维生素K依赖性羧化酶(γ-谷氨酰基羧化酶)的识别元件，所述羧化酶将12个谷氨酸残基修饰成γ-羧基谷氨酰基(Gla)残基。这些残基为通过Ca2+依赖性结合与阴离子性磷脂表面缔合所需的。

以下提供前原FIX酶原的氨基酸序列(信号序列加下划线(1-28)；原肽序列(29-46)加粗)：

在信号肽和原肽裂解之后，FIX呈酶原形式。因此，FIX酶原以415个氨基酸的单链多肽形式循环。参见Vysotchin等人,J.Biol.Chem.268:8436(1993)。在一个实施方案中，FIX酶原为SEQ ID NO:764的氨基酸47至461。在另一实施方案中，FIX酶原为SEQ ID NO:764的氨基酸47至461，其中氨基酸残基180为丙氨酸而不是精氨酸(即，不可活化FIX)。

FIX的酶原由FXIa或由组织因子/FVIIa复合物活化。最先在Arg191(成熟FIX序列中的Arg145)处裂解，产生无活性FIX-α。其次在Arg226(成熟FIX序列中的Arg180)处裂解，移除FIX活化肽的35个氨基酸并且产生催化活性分子FIXa-β。所述未与FVIIIa缔合的催化活性FIXa在本文中又称为游离FIXa。由此产生的异二聚体由Cys178-Cys335处的二硫桥保持。丝氨酸蛋白酶含有His267、Asp315和Ser411的催化三联体。在Arg226处裂解后，Val227可与Asp410形成盐桥，此为活性丝氨酸蛋白酶特有的。在一个实施方案中，游离FIXa由SEQID NO:764的氨基酸47至191和SEQ ID NO:764的氨基酸227至461组成，其中SEQ ID NO:764的氨基酸178与氨基酸335形成二硫键。

然而，已知游离FIXa的活性类似于FIX酶原的活性。与辅因子FVIIIa形成复合物表示活化的第二关键阶段，之后，固有的X酶复合物达到约200,000倍的活性增强，所述活性对生理学底物FX具有严格特异性并且局限于活化血小板的表面(van Dieijen等人,J BiolChem.1981年4月10日；256(7):3433-42)。低分子量促效剂，包括Ca2+有助于此巨分子活化(Mathur等人,Biol.Chem.,272(1997),第23418–23426页)。若干条证据表明，Ca2+结合伴随构象重排(Bajaj等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(1992),第152–156页,Enfield和Thompson,Blood,64(1984),第821–831页)。可通过将底物模拟物(例如Glu-Gly-Arg-氯甲基酮(EGR-CMK))共价附接至FIXa的活性位点(FXa+EGR-CMK，又称为FIXa-SM)来模拟所述因子X活化酶复合物中的超活性FIXa。因此，FIXa-SM可用作区别相较于游离FIXa，优先结合超活性FIXa(呈因子X活化酶复合物形式)的抗体或其抗原结合部分的重要工具。

三肽氯甲基酮在本领域中一般被公认为底物模拟物，并且所述三肽序列表示被特定酶裂解的天然底物序列，并且CMK部分由于与活性位点丝氨酸反应而将此三肽不可逆锁定于活性位点中。结果是，如果将酶结合底物模拟物，那么此应呈现底物结合形式，即，真实的活性构象。参见Brandsteter等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(21):9796-80；和Hopfner等人,(1999)Structure 7(8):989-96。

术语“FIX酶原”在本文中可与“FIXz”、“FIX前体”、“未活化FIX”、“非活化FIX”或“非活化FIX前体”互换使用。在一个实施方案中，FIX酶原(FIXz)包括非活化FIX前体，其中活化肽(例如表示为SEQ ID NO:764(成熟序列编号)的氨基酸146至180的35个氨基酸的活化肽)未从所述前体裂解。FIX酶原可包括任何天然存在或工程化变体。FIX酶原的非限制性实例显示于SEQ ID NO:764中。在另一实施方案中，FIX酶原为不可活化FIX(FIXn)，其在因子XIa，即活化血浆凝血活酶先质存在下被工程化成无活性。不可活化FIX的实例可为在180位(成熟序列编号)带有精氨酸到丙氨酸的突变，由此防止其活化并使因子IX维持酶原形式(FIXz)的FIX。FIX酶原可任选含有信号肽和/或原肽。

术语“活化FIX”在本文中可与“FIXa”互换使用。在一个实施方案中，活化FIX为野生型、天然存在的FIXa(在本文中又称为“野生型FIXa”)。在另一实施方案中，FIXa包含非天然存在的FIXa，例如FIXa构象变体。例如，FIXa可为FIXa-SM，其为设计成具有与结合底物FX的野生型、天然存在的FIXa相同的构象。在一特定实施方案中，FIXa-SM为具有底物模拟物共价结合活性位点的活化FIX，其意图模拟活化FIX的活性最强的构象。

FIX酶原和FIXa可包括FIX变体。在一个实施方案中，FIX变体已被克隆，如美国专利号4,770,999和7,700,734中所描述，并且编码人因子IX的cDNA已经分离，表征并且经克隆至表达载体中(参见例如，Choo等人,Nature 299:178-180(1982)；Fair等人,Blood 64:194-204(1984)；和Kurachi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.79:6461-6464(1982))。一个特定FIX变体为由Simioni等人,2009表征的R338L FIX(Padua)变体，其包含功能获得性突变，所述突变与Padua变体活性相对于天然FIX有近8倍增加相关。FIX变体还可包括具有一个或多个保守氨基酸取代的任何FIX多肽，所述一个或多个取代不影响FIX多肽的FIX活性。

因此，本公开提供一种特异性结合活化因子IX(FIXa)(例如游离FIXa或FIXa-SM)的抗体(例如分离抗体)或其抗原结合部分，其中所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分在FIXa和FIX酶原存在下优先结合FIXa(“抗FIXa抗体或其抗原结合部分”)。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXa的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXz的结合亲和力。在一个实施方案中，结合亲和力以K_D表示。

本公开还提供一种分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其结合FIXa的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXz的结合亲和力。在一些方面中，如通过生物膜层干涉(BLI)测定所测定，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分以约100nM或更低(例如1nM至100nM或0.1nM至100nM)、约95nM或更低、约90nM或更低、约85nM或更低、约80nM或更低、约75nM或更低、约70nM或更低、约65nM或更低、约60nM或更低、约55nM或更低、约50nM或更低、约45nM或更低、约40nM或更低、约35nM或更低、约30nM或更低、约25nM或更低、约20nM或更低、约15nM或更低、约10nM或更低、约5nM或更低，或约1nM或更低的K_D结合FIXa。在其他实施方案中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分以约10nM或更低、约9nM或更低、约8nM或更低、约7nM或更低、约6nM或更低、约5nM或更低、约4nM或更低、约3nM或更低、约2nM或更低、约1nM或更低、约0.5nM或更低、约0.2nM或更低、约0.1nM或更低，或约0.05nM或更低的K_D结合FIXa。在又其他实施方案中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分以1nM至100nM、1nM至90nM、1nM至80nM、1nM至70nM、1nM至60nM、1nM至50nM、1nM至40nM、1nM至30nM、1nM至20nM、1nM至10nM、0.1nM至100nM、0.1nM至90nM、0.1nM至80nM、0.1nM至70nM、0.1nM至60nM、0.1nM至50nM、0.1nM至40nM、0.1nM至30nM、0.1nM至20nM、0.1nM至10nM，或0.1nM至1nM的K_D结合FIXa。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3A、3B和/或3C中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3A、3B和/或3C中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些方面中，参考抗体选自BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-882、BIIB-9-460、BIIB-9-433及其任何组合。

在其他方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分可进一步分为三类：

第I类：相对于游离FIXa或FIXz，优先结合FIXa-SM的抗FIXa抗体或其抗原结合部分(图3A抗体)；

第II类：相对于FIXa-SM或FIXz，优先结合游离FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分(图3B抗体)；以及

第III类：近似等同地结合游离FIXa和FIXa-SM但与FIXz不明显缔合的抗FIXa抗体或其抗原结合部分(图3C抗体)。

在一些实施方案中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3A中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在其他实施方案中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3A中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些实施方案中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3B中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在其他实施方案中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3B中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些实施方案中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3C中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在其他实施方案中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3C中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3包含

(i)与选自由图3A中的VH CDR3序列组成的组的VH CDR3序列相同的VH CDR3序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3A中的VH CDR3序列组成的组的VHCDR3序列相同的VH CDR3序列。

在其他方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3包含

(i)与选自由图3B中的VH CDR3序列组成的组的VH CDR3序列相同的VH CDR3序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3B中的VH CDR3序列组成的组的VHCDR3序列相同的VH CDR3序列。

(i)与选自由图3C中的VH CDR3序列组成的组的VH CDR3序列相同的VH CDR3序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3C中的VH CDR3序列组成的组的VHCDR3序列相同的VH CDR3序列。

在一些方面中，氨基酸取代为保守氨基酸取代。在其他方面中，氨基酸取代为回复突变。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3序列包含氨基酸序列ARDX₁X₂X₃X₄X₅X₆YYX₇MDV(SEQ ID NO:753)，其中X₁为V或G，X₂为G或V，X₃为G或R，X₄为Y或V，X₅为A或S，X₆为G或D，X₇为G或不存在。

本领域的技术人员应了解，当在共同序列中的一个位置描述为“无”或“不存在”时，所述不存在不表示多肽链断裂。这些术语仅反映如在多序列比对中所观察到的氨基酸链中插入和缺失的发生情况。因此，当比对两个序列以产生共同序列，并且其中之一含有氨基酸插入时，所述不含插入的序列将在所述位置处具有一个“不存在”(“无”)的氨基酸。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中所述VH CDR3序列包含选自以下的氨基酸序列：ARDVGGYAGYYGMDV(SEQ ID NO:905；BIIB-9-484、BIIB-9-1335和BIIB-9-1336的VH CDR3)、ARDISTDGESSLYYYMDV(SEQ ID NO:901；BIIB-9-460)、ARGPTDSSGYLDMDV(SEQ ID NO:1186；BIIB-9-882)、ARSPRHKVRGPNWFDP(SEQ ID NO:899；BIIB-9-440)或ARDGPRVSDYYMDV(SEQ ID NO:912；BIIB-9-619)。在一些方面中，本文所公开的VH CDR3序列可包含1、2或3个氨基酸取代。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR1序列包含

(i)与选自由图3A中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3A中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列。

(i)与选自由图3B中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3B中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列。

(i)与选自由图3C中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3C中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR2序列包含

(i)与选自由图3A中所公开的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3A中所公开的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列。

(i)与选自由图3B中所公开的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3B中所公开的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列。

(i)与选自由图3C中所公开的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3C中所公开的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR1序列包含

(i)与选自由图3A中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3A中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列。

(i)与选自由图3B中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3B中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列。

(i)与选自由图3C中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3C中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR2序列包含

(i)与选自由图3A中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3A中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列。

(i)与选自由图3B中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3B中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列。

(i)与选自由图3C中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3C中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR3序列包含

(i)与选自由图3A中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3A中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列。

(i)与选自由图3B中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3B中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列。

(i)与选自由图3C中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3C中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列。

本公开还提供一种特异性结合FIXa的分离抗体或其抗原结合部分，其包含VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3以及所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3包含选自由图3A中的以下抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：BIIB-9-605、BIIB-9-475、BIIB-9-477、BIIB-9-479、BIIB-9-480、BIIB-9-558、BIIB-9-414、BIIB-9-415、BIIB-9-425、BIIB-9-440、BIIB-9-452、BIIB-9-460、BIIB-9-461、BIIB-9-465、BIIB-9-564、BIIB-9-484、BIIB-9-469、BIIB-9-566、BIIB-9-567、BIIB-9-569、BIIB-9-588、BIIB-9-611、BIIB-9-619、BIIB-9-626、BIIB-9-883、BIIB-9-419、BIIB-9-451、BIIB-9-473、BIIB-9-565、BIIB-9-573,BIIB-9-579、BIIB-9-581、BIIB-9-582、BIIB-9-585、BIIB-9-587、BIIB-9-590、BIIB-9-592、BIIB-9-606、BIIB-9-608BIIB-9-616、BIIB-9-621、BIIB-9-622、BIIB-9-627、BIIB-9-1335和BIIB-9-1336。

在一些实施方案中，本公开包括特异性结合FIXa的分离抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3以及所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3包含选自由图3B中的以下抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：BIIB-9-408、BIIB-9-416、BIIB-9-629或BIIB-9-885。

在其他实施方案中，本公开提供一种特异性结合FIXa的分离抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3以及所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3包含选自由图3C中的以下抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：BIIB-9-607、BIIB-9-471、BIIB-9-472、BIIB-9-439、BIIB-9-446、BIIB-9-568、BIIB-9-615、BIIB-9-628、BIIB-9-882、BIIB-9-884、BIIB-9-886、BIIB-9-887、BIIB-9-888、BIIB-9-889、BIIB-9-433、BIIB-9-445、BIIB-9-470、BIIB-9-625、BIIB-9-1264、BIIB-9-1265、BIIB-9-1266、BIIB-9-1267、BIIB-9-1268、BIIB-9-1269、BIIB-9-1270、BIIB-9-1271、BIIB-9-1272、BIIB-9-1273、BIIB-9-1274、BIIB-9-1275、BIIB-9-1276、BIIB-9-1277、BIIB-9-1278、BIIB-9-1279、BIIB-9-1280、BIIB-9-1281、BIIB-9-1282、BIIB-9-1283、BIIB-9-1284、BIIB-9-1285、BIIB-9-1286和BIIB-9-1287。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:800-844、SEQ ID NO:845-889和SEQ ID NO:890-934的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列(第I类抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:935-979、SEQ ID NO:980-1024和SEQ IDNO:1025-1069的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(第I类抗体的VL CDR)。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1070-1073、SEQ ID NO:1074-1077和SEQ ID NO:1078-1081的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列(第II类抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:1082-1085、SEQ ID NO:1086-1089和SEQ ID NO:1090-1093的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(第II类抗体的VL CDR)。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1094-1135、SEQ ID NO:1136-1177和SEQ ID NO:1178-1219的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列(第III类抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:1220-1261、SEQ ID NO:1262-1303和SEQ ID NO:1304-1345的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(第III类抗体的VL CDR)。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:815、SEQ ID NO:860和SEQ ID NO:905的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列(BIIB-9-484抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:995和SEQ ID NO:1040的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-484抗体的VL CDR)。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:843、SEQ ID NO:888和SEQ ID NO:933的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列(BIIB-9-1335抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:995和SEQ ID NO:1040的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-1335抗体的VL CDR)。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:844、SEQ ID NO:889和SEQ ID NO:934的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列(BIIB-9-1336抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:995和SEQ ID NO:1040的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-1336抗体的VL CDR)。

在其他方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分与抗体BIIB-9-484、BIIB-9-1335和BIIB-9-1336交叉竞争，和/或与抗体BIIB-9-484、BIIB-9-1335和BIIB-9-1336结合相同表位。在某些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VH CDR3包含ARDVGGYAGYYGMDV(SEQ ID NO:905，BIIB-9-484VH CDR3)；VH CDR2包含SISSX₁X₂SYIYYAX₃SVKG(SEQ ID NO:754)，其中X₁为S、G或任何保守取代，X₂为S、E或任何保守取代，并且X₃为D、E或任何保守取代；VH CDR1包含FTFX₄SYX₅MX₆(SEQ ID NO:755)，其中X₄为S、G或任何保守取代，X₅为D、S或任何保守取代，并且X₆为H、N或任何保守取代。抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含针对VH CDR1的SEQ ID NO:815、针对VH CDR2的SEQ ID NO:860和针对VH CDR3的SEQ ID NO:905。(BIIB-9-484VH CDR)

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含

(a1)分别包含SEQ ID NO:809、SEQ ID NO:854和SEQ ID NO:899的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3序列(BIIB-9-440抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:944、SEQ IDNO:989和SEQ ID NO:1034的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-440抗体的VL CDR)；

(a2)分别包含SEQ ID NO:1102、SEQ ID NO:1144和SEQ ID NO:1186的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3序列(BIIB-9-882抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:1228、SEQ IDNO:1270和SEQ ID NO:1312的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-882抗体的VLCDR)；

(a3)分别包含SEQ ID NO:811、SEQ ID NO:856和SEQ ID NO:901的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3序列(BIIB-9-460抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:946、SEQ IDNO:991和SEQ ID NO:1036的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-460抗体的VL CDR)；或

(a4)分别包含SEQ ID NO:1108、SEQ ID NO:1150和SEQ ID NO:1192的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3序列(BIIB-9-433抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:1234、SEQ IDNO:1276和SEQ ID NO:1318的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-433抗体的VLCDR)；

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包括分别包含SEQ ID NO:822、SEQ ID NO:867和SEQ ID NO:912的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列(BIIB-9-619抗体的VHCDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:957、SEQ ID NO:1002和SEQ ID NO:1047的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-619抗体的VL CDR)。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含

(i)分别包含SEQ ID NO:843、SEQ ID NO:888和SEQ ID NO:933的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3序列(BIIB-9-1335抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:950、SEQ IDNO:995和SEQ ID NO:1040的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-1335抗体的VLCDR)；或

(ii)分别包含SEQ ID NO:844、SEQ ID NO:889和SEQ ID NO:934的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3序列(BIIB-9-1336抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:950、SEQ IDNO:995和SEQ ID NO:1040的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-1336抗体的VLCDR)。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH，其中所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179和181(对于第I类抗体，SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87和89；对于第II类抗体，SEQ ID NO:91、93、95和97；和对于第III类抗体，SEQ ID NO:99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179和181)。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL，其中所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365和367(对于第I类抗体，SEQ ID NO:191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273和275；对于第II类抗体，SEQ ID NO:277、279、281和283；和对于第III类抗体，SEQ ID NO:285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365和367)。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中

(i)所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179和181(对于第I类抗体，SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87和89；对于第II类抗体，SEQ IDNO:91、93、95和97；和对于第III类抗体，SEQ ID NO:99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179和181)；并且

(ii)所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365和367(对于第I类抗体，SEQ ID NO:191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273和275；对于第II类抗体，SEQ ID NO:277、279、281和283；和对于第III类抗体，SEQ ID NO:285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365和367)。

在某些方面中，抗FIXa抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。在一些实施方案中，抗FIXa抗体的VH序列可来源于V、D或J种系序列中的任一种，并且/或者抗FIXa抗体的VL序列可来源于κ或λ种系序列中的任一种。

如本文所展示，已制备出对FIXa具有特异性的人抗体，其包含作为人种系基因的产物或来源于人种系基因的重链可变区。因此，本文提供分离FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含作为选自由以下组成的组的人VH种系基因的产物或来源于所述人VH种系基因的重链可变区：VH1-18、VH1-46、VH3-21、VH3-30、VH4-31、VH4-39、VH4-0B、VH5-51以及其任何组合。在特定实施方案中，VH种系基因选自由以下组成的组：VH1-18.0、VH1-18.1、VH1-18.8、VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.6、VH1-46.7、VH1-46.8、VH1-46.9、VH3-21.0、VH3-23.0、VH3-23.2、VH3-23.6、VH3-30.0、VH4-31.5、VH4-39.0、VH4-39.5、VH4-0B.4、VH5-51.1以及其任何组合。

在其他方面中，本文提供分离FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含作为选自由以下组成的组的人VL种系基因的产物或来源于所述人VL种系基因的重链可变区：VK1-05、VK1-12、VK1-39、VK2-28、VK3-11、VK3-15、VK3-20、VK4-01以及其任何组合。在特定实施方案中，所述VL种系基因选自由以下组成的组：VK1-05.6、VK1-05.12、VK1-12.0、VK1-12.4、VK1-12.7、VK1-12.10、VK1-12.15、VK1-39.0、VK1-39.3、VK1-39.15、VK2-28.0、VK2-28.1、VK2-28.5、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.8、VK3-15.10、VK3-20.0、VK3-20.1、VK3-20.4、VK3-20.5、VK4-01.0、VK4-01.4、VK4-01.20以及其任何组合。

本文所描述的抗体包括包含作为以上所列人种系VH基因之一的产物或来源于所述基因的重链可变区，并且还包含作为以上所列人种系VK基因之一的产物或来源于所述基因的轻链可变区，如图中所示。

如本文所使用，如果人抗体的可变区获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统，那么所述抗体包含作为特定种系序列的“产物”或“来源于”特定种系序列的重链和轻链可变区。所述系统包括以感兴趣的抗原使带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠免疫，或以感兴趣的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因库。因此，作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“来源于”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可通过将所述人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较并且选择序列最接近(即，最大同一性百分比)所述人抗体的序列的人种系免疫球蛋白序列来鉴别。作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“来源于”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与所述种系序列相比可含有氨基酸差异，此归因于例如天然存在的体细胞突变或有意引入的定点突变。然而，当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠类种系序列)进行比较时，所选人抗体通常与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性，并且含有将人抗体鉴别为属于人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体的氨基酸序列可与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95％，或甚至是至少96％、97％、98％或99％相同。通常，来源于特定人种系序列的人抗体将展示与人种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体可展示与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸的差异。

(a1)VH包含与SEQ ID NO:31至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:221至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列(分别为BIIB-9-484的VH和VL)；

(a2)VH包含与SEQ ID NO:19至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:209至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列(分别为BIIB-9-440的VH和VL)；

(a3)VH包含与SEQ ID NO:115至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:301至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列(分别为BIIB-9-882的VH和VL)；

(a4)VH包含与SEQ ID NO:23至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:213至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列(分别为BIIB-9-460的VH和VL)；

(a5)VH包含与SEQ ID NO:127至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:313至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列(分别为BIIB-9-433的VH和VL)；

(a6)VH包含与SEQ ID NO:45至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:235至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列(分别为BIIB-9-619的VH和VL)；

(a7)VH包含与SEQ ID NO:87至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:221至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列(分别为BIIB-9-1335的VH和VL)；或

(a8)VH包含与SEQ ID NO:89至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:221至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列(分别为BIIB-9-1336的VH和VL)。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分与BIIB-9-1336结合相同表位。在其他方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合与BIIB-9-1336的表位重叠的表位。在一些实施方案中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合包含至少一个位于FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号位置91与101、125与128、165与179或232与241之间的氨基酸的表位区(分别对应于SEQ ID NO:758中的位置76至88、112至115、153至167和222至231)。

如本文所使用，短语“胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基”及其语法变化形式是指通过与丝氨酸蛋白酶胰凝乳蛋白酶原的同源性描述FIX中的某些氨基酸。在本公开中，在丝氨酸蛋白酶结构域内的胰凝乳蛋白酶原编号根据Hopfner等人(EMBO J.1997；16:6626-35)使用。对于本公开，仅在本文中明确指示时才使用胰凝乳蛋白酶原编号。所公开的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基与SEQ ID NO:758中氨基酸位置之间的对应性提供于下表中：

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合包含以下FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基中的至少一个的表位：H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240和K241(分别对应于SEQ ID NO:758中的位置H76、H77、N78、H88、D112、K113、E114、Y115、R153、Y165、N166、N167、S222、R223、Y224、V225、N226、W227、E230和K231)。在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个选自由FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基组成的组的氨基酸残基的表位：H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240和K241(分别对应于SEQ ID NO:758中的位置H76、H77、N78、H88、D112、K113、E114、Y115、R153、Y165、N166、N167、S222、R223、Y224、V225、N226、W227、E230和K231)。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合包含以下FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基的表位：H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240和K241(分别对应于SEQ ID NO:758中的位置H76、H77、N78、H88、D112、K113、E114、Y115、R153、Y165、N166、N167、S222、R223、Y224、V225、N226、W227、E230和K231)。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合由以下FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基组成的表位：H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240和K241(分别对应于SEQ IDNO:758中的位置H76、H77、N78、H88、D112、K113、E114、Y115、R153、Y165、N166、N167、S222、R223、Y224、V225、N226、W227、E230和K231)。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合包含FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基N93、R165、N178和R233(分别对应于SEQ ID NO:758中的位置N78、R153、N166和R223)的表位。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合不包含以下至少一个FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基的表位：N100、K132、Y137、R170、T172、F174、T175、H185、E202和G205(分别对应于SEQ ID NO:758中的位置N87、K121、Y126、R158、T160、F162、T163、H174、E192和G195)。在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合不包含以下FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基的表位：N100、K132、Y137、R170、T172、F174、T175、H185、E202和G205(分别对应于SEQ ID NO:758中的位置N87、K121、Y126、R158、T160、F162、T163、H174、E192和G195)。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合包含FIXa轻链(SEQ IDNO:756)中的至少一个氨基酸残基的表位。在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分所结合的FIXa轻链(SEQ ID NO:756)中的表位为K100。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合的表位包含以下FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基：H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240和K241(分别对应于SEQ ID NO:758中的位置H76、H77、N78、H88、D112、K113、E114、Y115、R153、Y165、N166、N167、S222、R223、Y224、V225、N226、W227、E230和K231)；和FIXa轻链序列(SEQ ID NO:756)的氨基酸残基K100。在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合的表位由以下FIXa重链序列中的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基：H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240和K241(分别对应于SEQ ID NO:758中的位置H76、H77、N78、H88、D112、K113、E114、Y115、R153、Y165、N166、N167、S222、R223、Y224、V225、N226、W227、E230和K231)；和FIXa轻链序列(SEQ ID NO:756)的氨基酸残基K100组成。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合的表位与FVIIIa与FIXa的结合位点重叠。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与FVIIIa交叉竞争结合FIXa。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分阻断FVIIIa与FIXa的结合。

在一些方面中，特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述VH CDR1序列包含选自由表7中所公开的VH CDR1序列组成的组的VH CDR1序列，或具有一个或两个突变的表7中所公开的VH CDR1序列。

在一些方面中，特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述VH CDR2序列包含选自由表7中所公开的VH CDR2序列组成的组的VH CDR2序列，或具有一个或两个突变的表7中所公开的VH CDR2序列。

在一些方面中，特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述VH CDR3序列包含选自由表7中所公开的VH CDR3序列组成的组的VH CDR3序列，或具有一个或两个突变的表7中所公开的VH CDR3序列。

在一些方面中，特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述VL CDR1序列包含选自由表7中所公开的VL CDR1序列组成的组的VL CDR1序列，或具有一个或两个突变的表7中所公开的VL CDR1序列。

在一些方面中，特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述VL CDR2序列包含选自由表7中所公开的VL CDR2序列组成的组的VL CDR2序列，或具有一个或两个突变的表7中所公开的VL CDR2序列。

在一些方面中，特异性结合FIXa的抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述VL CDR3序列包含选自由表7中所公开的VL CDR3序列组成的组的VL CDR3序列，或具有一个或两个突变的表7中所公开的VL CDR3序列。

在一些方面中，分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及VL CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及所述VL CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含表7中所公开的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及VL CDR1、CDR2和CDR3序列。

在一些方面中，分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、CDR2和CDR3，其中

(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列X₅ISX₆X₇X₈X₉X₁₀IYYADSVKG(SEQ ID NO:2195)，其中X₅为S、A、Y或G，X₆为S或A，X₇为S、A或G，X₈为S、G或D，X₉为S、T或G，并且X₁₀为Y或T；并且/或者

(iii)所述VH CDR3包含氨基酸序列ARDX₁₁GGYAGYYGMDV(SEQ ID NO:2196)，其中X₁₁为L或V。

在一些方面中，分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中

(i)所述VL CDR1包含氨基酸序列QASQDIANYLN(SEQ ID NO:2212)；并且/或者

(ii)所述VL CDR2包含氨基酸序列DASNLET(SEQ ID NO:2142)；并且/或者

(iii)所述VL CDR3包含氨基酸序列QQYANFPYT(SEQ ID NO:2168)。

(iii)所述VH CDR3包含氨基酸序列ARDX₁₁GGYAGYYGMDV(SEQ ID NO:2196)，其中X₁₁为L或V；并且

还包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中VL CDR1包含氨基酸序列QASQDIANYLN(SEQ IDNO:2212)；并且/或者VL CDR2包含氨基酸序列DASNLET(SEQ ID NO:2142)；并且/或者VLCDR3包含氨基酸序列QQYANFPYT(SEQ ID NO:2168)。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含：VH CDR1、CDR2和CDR3序列，其包含选自SEQ ID NO:2038至2047的VH CDR1、选自SEQ ID NO:2064至2073的VH CDR2和选自SEQ ID NO:2090至2099的VH CDR3；和/或VL CDR1、CDR2和CDR3序列，其包含选自SEQ IDNO:2116至2125的VL CDR1、选自SEQ ID NO:2142至2151的VL CDR2和选自SEQ ID NO:2168至2177的VL CDR3。

(i)所述VH CDR1包含氨基酸序列FTFGSYDMN(SEQ ID NO:2048)；并且/或者

(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列SISX₁X₂X₃SYIX₄YAX₅SVKG(SEQ ID NO:2197)，其中X₁为S或D，X₂为G或S，X₃为E或A，X₄为Y或A，并且X₅为E或D；并且/或者

(iii)所述VH CDR3包含氨基酸序列X₆RDVX₇GYAGX₈YGMDV(SEQ ID NO:2198)，其中X₆为A或V，X₇为G或S，并且X₈为Y或F。

(ii)所述VL CDR2包含氨基酸序列DAX₇NLX₈X₉(SEQ ID NO:2200)，其中X₇为S或A，X₈为E、H或Q，并且X₉为T或Y；并且/或者

(iii)所述VL CDR3包含氨基酸序列X₁₀QYAX₁₁FPYT(SEQ ID NO:2201)，其中X₁₀为Q或S，并且X₁₁为N或R。

(i)所述VH CDR1包含氨基酸序列FTFGSYDMN(SEQ ID NO:2048)；并且/或者

(iii)所述VH CDR3包含氨基酸序列X₆RDVX₇GYAGX₈YGMDV(SEQ ID NO:2198)，其中X₆为A或V，X₇为G或S，并且X₈为Y或F；并且

还包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中

(iv)所述VL CDR1包含氨基酸序列X₁AX₂X₃X₄IX₅X₆YLN(SEQ ID NO:2199)，其中X₁为Q、G或E，X₂为S或N，X₃为Q或E，X₄为D或Y，X₅为A或S，X₆为N或D；并且/或者

(v)所述VL CDR2包含氨基酸序列DAX₇NLX₈X₉(SEQ ID NO:2200)，其中X₇为S或A，X₈为E、H或Q，并且X₉为T或Y；并且/或者

(vi)所述VL CDR3包含氨基酸序列X₁₀QYAX₁₁FPYT(SEQ ID NO:2201)，其中X₁₀为Q或S，并且X₁₁为N或R。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含：VH CDR1、CDR2和CDR3序列，其包含选自SEQ ID NO:2048至2052的VH CDR1、选自SEQ ID NO:2074至2078的VH CDR2和选自SEQ ID NO:2100至2104的VH CDR3；和/或VL CDR1、CDR2和CDR3序列，其包含选自SEQ IDNO:2126至2130的VL CDR1、选自SEQ ID NO:2152至2156的VL CDR2和选自SEQ ID NO:2178至2182的VL CDR3。

(i)所述VH CDR1包含氨基酸序列YTFX₁X₂YX₃MH(SEQ ID NO:2202)，其中X₁为T或H，X₂为S、G或H，并且X₃为Y或P；并且/或者(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列X₄INPSX₅GX₆TX₇YAQKFQG(SEQ ID NO:2203)，其中X₄为I或S，X₅为G或R，X₆为S或R，并且X₇为S或E；并且/或者

(iii)所述VH CDR3包含氨基酸序列ARDGPX₈X₉X₁₀DYYMDV(SEQ ID NO:2204)，其中X₈为R或Q，X₉为V、D、L或E，并且X₁₀为S或V。

在一些方面中，分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VL CDR1包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:2214)；并且/或者所述VL CDR2包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:2215)；并且/或者(iii)所述VL CDR3包含氨基酸序列QQRDNWPFT(SEQ ID NO:2213)。

(iii)所述VH CDR3包含氨基酸序列ARDGPX₈X₉X₁₀DYYMDV(SEQ ID NO:2204)，其中X₈为R或Q，X₉为V、D、L或E，并且X₁₀为S或V；并且

还包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VL CDR1包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQID NO:2214)；并且/或者所述VL CDR2包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:2215)；并且/或者(iii)所述VL CDR3包含氨基酸序列QQRDNWPFT(SEQ ID NO:2213)。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含：VH CDR1、CDR2和CDR3序列，其包含选自SEQ ID NO:2053至2057的VH CDR1、选自SEQ ID NO:2079至2083的VH CDR2和选自SEQ ID NO:2105至2109的VH CDR3；和/或VL CDR1、CDR2和CDR3序列，其包含选自SEQ IDNO:2131至2135的VL CDR1、选自SEQ ID NO:2157至2161的VL CDR2和选自SEQ ID NO:2183至2187的VL CDR3。

(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列X₆IX₇X₈X₉GX₁₀TX₁₁YNPSLKS(SEQ ID NO:2206)，其中X₆为S或Y，X₇为S、Y、R、T或Q，X₈为Y、G、P或A，X₉为S或Q，X₁₀为S或K，并且X₁₁为Y或Q；并且/或者

(iii)所述VH CDR3包含氨基酸序列ARDKYQDYSX₁₂DI，其中X₁₂为F或V(SEQ ID NO:2207)。

在一些方面中，分离抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VL CDR1包含氨基酸序列RASQGIDSWLA(SEQ ID NO:2136)；并且/或者所述VL CDR2包含氨基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO:2162)；并且/或者所述VL CDR3包含氨基酸序列QQANFLPFT(SEQ ID NO:2188)。

(ii)所述VH CDR2包含氨基酸序列X₆IX₇X₈X₉GX₁₀TX₁₁YNPSLKS(SE Q ID NO:2206)，其中X₆为S或Y，X₇为S、Y、R、T或Q，X₈为Y、G、P或A，X₉为S或Q，X₁₀为S或K，并且X₁₁为Y或Q；并且/或者

(iii)所述VH CDR3包含氨基酸序列ARDKYQDYSX₁₂DI(SEQ ID NO:2207)，其中X₁₂为F或V；并且

还包含VL CDR1、CDR2和CDR3，其中所述VL CDR1包含氨基酸序列RASQGIDSWLA(SEQID NO:2136)；并且/或者所述VL CDR2包含氨基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO:2162)；并且/或者所述VL CDR3包含氨基酸序列QQANFLPFT(SEQ ID NO:2188)。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含：VH CDR1、CDR2和CDR3序列，其包含选自SEQ ID NO:2058至2063的VH CDR1、选自SEQ ID NO:2084至2089的VH CDR2和选自SEQ ID NO:2110至2115的VH CDR3；和/或VL CDR1、CDR2和CDR3序列，其包含选自SEQ IDNO:2136至2141的VL CDR1、选自SEQ ID NO:2162至2167的VL CDR2和选自SEQ ID NO:2188至2193的VL CDR3。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:1935、1939、1943、1947、1951、1955、1959、1963、1967、1971、1975、1979、1983、1987、1991、1995、1999、2003、2007、2011、2015、2019、2023、2027、2031和2035。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:1937、1941、1945、1949、1953、1957、1961、1965、1969、1973、1977、1981、1985、1989、1993、1997、2001、2005、2009、2013、2017、2021、2025、2029、2033和2037。

在一些方面中，抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH包含与SEQID NO:89至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列并且所述VL包含与SEQ ID NO:221至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列(分别为BIIB-9-1336的VH和VL)。

(a1)VH包含与SEQ ID NO:1935至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1937至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a2)VH包含与SEQ ID NO:1939至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1941至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a3)VH包含与SEQ ID NO:1943至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1945至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a4)VH包含与SEQ ID NO:1947至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1949至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a5)VH包含与SEQ ID NO:1951至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1953至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a6)VH包含与SEQ ID NO:1955至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1957至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a7)VH包含与SEQ ID NO:1959至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1961至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a8)VH包含与SEQ ID NO:1963至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1965至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a9)VH包含与SEQ ID NO:1967至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1969至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a10)VH包含与SEQ ID NO:1971至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1973至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a11)VH包含与SEQ ID NO:1975至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1977至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a12)VH包含与SEQ ID NO:1979至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1981至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a13)VH包含与SEQ ID NO:1983至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1985至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a14)VH包含与SEQ ID NO:1987至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1989至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a15)VH包含与SEQ ID NO:1991至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1993至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a16)VH包含与SEQ ID NO:1995至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:1997至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a17)VH包含与SEQ ID NO:1999至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:2001至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a18)VH包含与SEQ ID NO:2003至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:2005至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a19)VH包含与SEQ ID NO:2007至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:2009至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a20)VH包含与SEQ ID NO:2011至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:2013至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a21)VH包含与SEQ ID NO:2015至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:2017至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a22)VH包含与SEQ ID NO:2019至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:2021至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a23)VH包含与SEQ ID NO:2023至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:2025至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a24)VH包含与SEQ ID NO:2027至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:2029至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

(a25)VH包含与SEQ ID NO:2031至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:2033至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；或

(a26)VH包含与SEQ ID NO:2035至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:2037至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

(a1)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1935和1937(BIIB-9-3595)；

(a2)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1939和1941(BIIB-9-3601)；

(a3)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1943和1945(BIIB-9-3604)；

(a4)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1947和1949(BIIB-9-3617)；

(a5)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1951和1953(BIIB-9-3618)；

(a6)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1955和1957(BIIB-9-3621)；

(a7)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1959和1961(BIIB-9-3647)；

(a8)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1963和1965(BIIB-9-3649)；

(a9)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1967和1969(BIIB-9-3650)；

(a10)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1971和1973(BIIB-9-3654)；

(a11)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1975和1977(BIIB-9-3753)；

(a12)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1979和1981(BIIB-9-3754)；

(a13)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1983和1985(BIIB-9-3756)；

(a14)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1987和1989(BIIB-9-3764)；

(a15)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1991和1993(BIIB-9-3766)；

(a16)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1995和1997(BIIB-9-3707)；

(a17)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:1999和2001(BIIB-9-3709)；

(a18)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2003和2005(BIIB-9-3720)；

(a19)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2007和2009(BIIB-9-3727)；

(a20)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2011和2013(BIIB-9-3745)；

(a21)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2015和2017(BIIB-9-3780)；

(a22)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2019和2021(BIIB-9-3675)；

(a23)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2023和2025(BIIB-9-3681)；

(a24)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2027和2029(BIIB-9-3684)；

(a25)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2031和2033(BIIB-9-3698)；或

(a26)所述VH和所述VL分别包含SEQ ID NO:2035和2037(BIIB-9-3704)。

在一些方面中，本文所公开的抗FIXa抗体(例如BIIB-9-484)与FIXa的结合为钙依赖性的。在其他方面中，本文所公开的抗FIXa抗体与FIXa的结合不依赖于钙。在又其他方面中，本文所公开的抗FIXa抗体(例如BIIB-9-1336)与FIXa的结合为部分钙依赖性的。

在一些方面中，本文所公开的抗FIXa抗体，例如BIIB-9-1336，可增加FIXa的酰胺溶解活性。在一些方面中，本文所公开的抗FIXa抗体(例如BIIB-9-1336，或包含BIIB-9-1336的双特异性抗体)可增加FIXa的底物裂解(例如ADG299)速率。在一些方面中，本文所公开的抗FIXa抗体例如BIIB-9-1336与FIXa的结合可使FIXa的酰胺溶解活性增加至少2倍、至少3倍或至少4倍。在一些方面中，本文所公开的抗FIXa抗体例如BIIB-9-1336与FIXa的结合可使FIXa的酰胺溶解活性增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少120％、至少140％、至少160％、至少180％、至少200％、至少220％、至少240％、至少260％、至少280％、至少300％、至少320％、至少340％、至少360％、至少380％、至少400％、至少420％、至少440％、至少460％、至少480％或至少500％。

本公开提供一种增加FIXa的酰胺溶解活性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用此处所公开的抗FIXa抗体例如BIIB-9-1336或包含BIIB-9-1336的双特异性抗体。

在一些方面中，本文所公开的抗FIXa抗体可增加抗凝血酶III(ATIII)的FIXa抑制速率。在一些方面中，本文所公开的抗FIXa抗体(例如BIIB-9-1336或包含BIIB-9-1336的双特异性抗体)可增加ATIII的FIXa抑制速率。在一些方面中，使ATIII的FIXa抑制速率增加至少2倍、至少3倍或至少4倍。在其他方面中，本文所公开的抗FIXa抗体例如BIIB-9-1336与FIXa的结合可使ATIII的FIXa抑制速率增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少120％、至少140％、至少160％、至少180％、至少200％、至少220％、至少240％、至少260％、至少280％、至少300％、至少320％、至少340％、至少360％、至少380％或至少400％。

本公开提供一种增加ATIII的FIXa抑制速率的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用此处所公开的抗FIXa抗体例如BIIB-9-1336或包含BIIB-9-1336的双特异性抗体。

(b)抗FIXz结合分子

因此，本公开提供一种特异性结合FIX酶原(FIXz)的抗体(例如分离抗体)或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分在FIXa和FIXz的存在下优先结合FIXz(“抗FIXz抗体或其抗原结合部分”)。

在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分结合FIXz的结合亲和力高于所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分结合FIXa(例如游离FIXa或FIXa-SM)的结合亲和力。

本公开还提供一种分离抗FIXz抗体或其抗原结合部分，其结合FIXz的结合亲和力高于所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分结合FIXa的结合亲和力。在一些方面中，如通过生物膜层干涉(BLI)测定所测定，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分以约100nM或更低、约95nM或更低、约90nM或更低、约85nM或更低、约80nM或更低、约75nM或更低、约70nM或更低、约65nM或更低、约60nM或更低、约55nM或更低、约50nM或更低、约45nM或更低、约40nM或更低、约35nM或更低、约30nM或更低、约25nM或更低、约20nM或更低、约15nM或更低、约10nM或更低、约5nM或更低，或约1nM或更低的K_D结合FIXz。在其他实施方案中，抗FIXz抗体或其抗原结合部分以约10nM或更低、约9nM或更低、约8nM或更低、约7nM或更低、约6nM或更低、约5nM或更低、约4nM或更低、约3nM或更低、约2nM或更低、约1nM或更低、约0.5nM或更低、约0.2nM或更低、约0.1nM或更低，或约0.05nM或更低的K_D结合FIXz。

在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分与选自由图3D中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与选自由图3D中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些方面中，所述参考抗体为BIIB-9-578。

在其他方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分还可被称为第IV类：相对于游离FIXa或FIXa-SM，优先结合FIXz的抗FIXz抗体或其抗原结合部分(图3D抗体)。

在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3包含

(i)与选自由图3D中的VH CDR3序列组成的组的VH CDR3序列相同的VH CDR3序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3D中的VH CDR3序列组成的组的VHCDR3序列相同的VH CDR3序列。

在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3序列包含选自ARDKYQDYSFDI(SEQ ID NO:1355；BIIB-9-578)的氨基酸序列。在一些方面中，本文所公开的VH CDR3序列可包含1、2或3个氨基酸取代。

在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3包含SEQ ID NO:1355(BIIB-9-578)并且所述VH CDR1序列包含

(i)与选自由图3D中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3D中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列。

在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3包含SEQ ID NO:1355(BIIB-9-578)并且所述VH CDR2序列包含

(i)与选自由图3D中所公开的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3D中所公开的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列。

在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分还包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR1序列包含

(i)与选自由图3D中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3D中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列。

在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分还包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR2序列包含

(i)与选自由图3D中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3D中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分还包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR3序列包含

(i)与选自由图3D中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图3D中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列。

本公开还提供一种优先结合FIXz的分离抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3包含选自由图3D中的以下抗体组成的组的抗FIXz抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：BIIB-9-397、BIIB-9-578、BIIB-9-631和BIIB-9-612。

在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1346-1349、SEQ ID NO:1350-1353和SEQ ID NO:1354-1357的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列(第IV类抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:1358-1361、SEQ ID NO:1362-1365和SEQ ID NO:1366-1369的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(第IV类抗体的VL CDR)。

在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1347、SEQ ID NO:1351和SEQ ID NO:1355的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列(BIIB-9-578抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:1359、SEQ ID NO:1363和SEQ ID NO:1367的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-9-578抗体的VL CDR)。

在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含VH，其中所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:183、185、187和189。

在一些方面中，所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含VL，其中所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:369、371、373和375。

在一些方面中，抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中

(i)所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:183、185、187和189；并且

(ii)所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:369、371、373和375。

在某些实施方案中，抗FIXz抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。在一些实施方案中，抗FIXz抗体的VH序列可来源于V、D或J种系序列中的任一种，并且/或者抗FIXz抗体的VL序列可来源于κ或λ种系序列中的任一种。

如本文所展示，已制备出对FIXz具有特异性的人抗体，其包含作为人种系基因的产物或来源于人种系基因的重链可变区。因此，本文提供分离FIXz抗体或其抗原结合部分，其包含作为选自由以下组成的组的人VH种系基因的产物或来源于所述人VH种系基因的重链可变区：VH1-18、VH1-46、VH3-21、VH3-30、VH4-31、VH4-39、VH4-0B、VH5-51以及其任何组合。在特定实施方案中，VH种系基因选自由以下组成的组：VH1-18.0、VH1-18.1、VH1-18.8、VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.6、VH1-46.7、VH1-46.8、VH1-46.9、VH3-21.0、VH3-23.0、VH3-23.2、VH3-23.6、VH3-30.0、VH4-31.5、VH4-39.0、VH4-39.5、VH4-0B.4、VH5-51.1以及其任何组合。

在其他实施方案中，本文提供分离FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含作为选自由以下组成的组的人VL种系基因的产物或来源于所述人VL种系基因的重链可变区：VK1-05、VK1-12、VK1-39、VK2-28、VK3-11、VK3-15、VK3-20、VK4-01以及其任何组合。在特定实施方案中，所述VL种系基因选自由以下组成的组：VK1-05.6、VK1-05.12、VK1-12.0、VK1-12.4、VK1-12.7、VK1-12.10、VK1-12.15、VK1-39.0、VK1-39.3、VK1-39.15、VK2-28.0、VK2-28.1、VK2-28.5、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.8、VK3-15.10、VK3-20.0、VK3-20.1、VK3-20.4、VK3-20.5、VK4-01.0、VK4-01.4、VK4-01.20以及其任何组合。

在一些方面中，抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH包含与SEQID NO:185至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列并且所述VL包含与SEQ ID NO:371至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列(分别为BIIB-9-578抗体的VH和VL)。

(c)抗FXz结合分子

本公开还提供特异性结合FX的抗FX结合分子例如抗FX抗体或包含其FX结合片段的分子。在本公开的一些方面中，所公开的抗FX结合分子例如抗FX抗体或包含其FX结合片段的分子优先结合FX酶原(FXz)(在本公开通篇称为“抗FXz抗体”)。

因子X为分子量为58.5kDa的维生素K依赖性糖蛋白，其由肝细胞以酶原形式分泌至血浆中。最初，因子X以由总计488个氨基酸组成的带有信号肽的前原肽形式产生。以下提供FX酶原(FXz)的氨基酸序列(信号序列(1-23)加下划线并且原肽(24-40)加粗)：

信号肽在输出至内质网中期间由信号肽酶裂解去除。在成熟N末端链的N末端处的前11个谷氨酸残基处发生γ羧基化之后，原肽序列被裂解去除。下一加工步骤为在Arg182与Ser183之间裂解。此加工步骤还同时引起三肽Arg180-Lys181-Arg182的缺失。由此得到的分泌因子X酶原由在Cys172与Cys342之间经由二硫桥共价连接的含139个氨基酸的N末端轻链(M,16,200)(即，SEQ ID NO:765的氨基酸41至179)与含306个氨基酸的C末端重链(M,42,000)(即，SEQ ID NO:765的氨基酸183至488)组成。其他翻译后加工步骤包括Asp103的β-羟基化以及N型和O型糖基化。

FX酶原可在其重链中由因子IXa在Arg234与Ile235(对应于SEQ ID NO:765)之间裂解并在释放活化肽后，因此变得活化。

术语“FX酶原”在本文中可与“FXz”、“FX前体”、“未活化FX”、“非活化FX”或“非活化FX前体”互换使用。在一个实施方案中，FX酶原(FIXz)包括非活化FX前体，其中活化肽(例如表示为SEQ ID NO:765的氨基酸183至234(成熟序列编号)的52个氨基酸的活化肽)未从所述前体裂解。FIX酶原可包括任何天然存在或工程化变体。FX酶原的非限制性实例显示于SEQ ID NO:765中。在另一实施方案中，FX酶原为不可活化FX(FXn)，其在因子FIXa的存在下被工程化为无活性。不可活化FX的实例可为在194位(成熟序列编号)带有精氨酸到丙氨酸的突变，由此防止其活化并使因子X维持酶原形式(FXz)的FX。FX酶原可任选含有信号肽和/或原肽。

术语“活化FX”在本文中可与“FXa”互换使用。在一个实施方案中，活化FX为野生型、天然存在的FXa(在本文中又称为“野生型FXa”)。在另一实施方案中，FXa包含非天然存在的FXa，例如FXa构象变体。例如，FXa可为FXa-SM，其被设计成具有与底物结合的FXa类似的构象。在一特定实施方案中，FXa-SM为带有共价结合活性位点的底物模拟物的活化FX。

本公开提供一种特异性结合FXz的抗体(例如分离抗体)或其抗原结合部分，其中所述抗FX抗体或其抗原结合部分在FXz和FXa的存在下优先结合FXz。在一个实施方案中，所述FXa为共价连接至底物模拟物(即，Glu-Gly-Arg-氯甲基酮(EGR-CMK))的FXa。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分结合FXz的结合亲和力高于所述抗体或其抗原结合部分结合FXa的结合亲和力。本公开还提供一种分离抗FX抗体或其抗原结合部分，其结合FXz的结合亲和力高于所述抗体或其抗原结合部分结合FXa的结合亲和力。

在一些方面中，如通过BLI测定所测定，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分以约100nM或更低、约95nM或更低、约90nM或更低、约85nM或更低、约80nM或更低、约75nM或更低、约70nM或更低、约65nM或更低、约60nM或更低、约55nM或更低、约50nM或更低、约45nM或更低、约40nM或更低、约35nM或更低、约30nM或更低、约25nM或更低、约20nM或更低、约15nM或更低、约10nM或更低、约5nM或更低，或约1nM或更低的K_D结合FXz。

在其他实施方案中，抗FXz抗体或其抗原结合部分以约10nM或更低、约9nM或更低、约8nM或更低、约7nM或更低、约6nM或更低、约5nM或更低、约4nM或更低、约3nM或更低、约2nM或更低、约1nM或更低、约0.5nM或更低、约0.2nM或更低、约0.1nM或更低，或约0.05nM或更低的K_D结合FXz。在又其他实施方案中，抗FXz抗体或其抗原结合部分以1nM至100nM、1nM至90nM、1nM至80nM、1nM至70nM、1nM至60nM、1nM至50nM、1nM至40nM、1nM至30nM、1nM至20nM、1nM至10nM、0.1nM至100nM、0.1nM至90nM、0.1nM至80nM、0.1nM至70nM、0.1nM至60nM、0.1nM至50nM、0.1nM至40nM、0.1nM至30nM、0.1nM至20nM、0.1nM至10nM，或0.1nM至1nM的K_D结合FXz。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分与选自由图12A和图12B中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分与选自由图12A和图12B中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分与选自由以下组成的组的参考抗体结合相同表位：BIIB-12-915、BIIB-12-917、BIIB-12-932以及其任何组合。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分结合与本文所公开的任何抗FXz抗体或其抗原结合部分的抗原结合位点基本上相同的抗原结合位点(例如表位)。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分结合与本文所公开的抗FXz抗体或其抗原结合部分的抗原结合位点(例如表位)重叠的抗原结合位点(例如表位)。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3序列包含

(i)与选自由图12A或图12B中的VH CDR3序列组成的组的VH CDR3序列相同的VHCDR3序列；或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图12A或图12B中的VH CDR3序列组成的组的VH CDR3序列相同的VH CDR3序列。

在一些方面中，氨基酸取代为保守氨基酸取代或回复突变。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3序列包含氨基酸序列ARX₁X₂X₃RX₄X₅X₆X₇FDX₈(SEQ ID NO:766)，其中X₁为G或L，X₂为R或G，X₃为F或Y，X₄为P或G，X₅为R或A，X₆为G或S，X₇为R或A，并且X₈为Y或I。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3序列由或基本上由氨基酸序列ARX₁X₂X₃RX₄X₅X₆X₇FDX₈(SEQ ID NO:766)组成，其中X₁为G或L，X₂为R或G，X₃为F或Y，X₄为P或G，X₅为R或A，X₆为G或S，X₇为R或A，并且X₈为Y或I。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3序列包含选自以下的氨基酸序列：ARGRFRPRGRFDY(SEQ ID NO:1575，BIIB-12-917)、ARLGYRGASAFDI(SEQ ID NO:1589，BIIB-12-932)或ARVGGGYANP(SEQID NO:1573，BIIB-12-915)。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR1序列包含

(i)与选自由图12A或图12B中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VHCDR1序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图12A或图12B中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR2序列包含

(i)与选自由图12A或图12B中所公开的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VHCDR2序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图12A或图12B中所公开的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR1序列包含

(i)与选自由图12A或图12B中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VLCDR1序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图12A或图12B中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR2序列包含

(i)与选自由图12A或图12B中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图12A或图12B中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR3序列包含

(i)与选自由图12A或图12B中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VLCDR3序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图12A或图12B中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR3序列由或基本上由以下组成

本公开还提供一种特异性结合FXz的分离抗体或其抗原结合部分，其包含VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3以及所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3包含选自由以下组成的组的抗FXz抗体的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：BIIB-12-891、BIIB-12-892、BIIB-12-893、BIIB-12-895、BIIB-12-896、BIIB-12-897、BIIB-12-898、BIIB-12-899、BIIB-12-900、BIIB-12-901、BIIB-12-902、BIIB-12-903、BIIB-12-904、BIIB-12-905、BIIB-12-906、BIIB-12-907、BIIB-12-908、BIIB-12-909、BIIB-12-910、BIIB-12-911、BIIB-12-912、BIIB-12-913、BIIB-12-914、BIIB-12-915、BIIB-12-916、BIIB-12-917、BIIB-12-918、BIIB-12-919、BIIB-12-920、BIIB-12-921、BIIB-12-922、BIIB-12-923、BIIB-12-924、BIIB-12-926、BIIB-12-927、BIIB-12-928、BIIB-12-929、BIIB-12-930、BIIB-12-931、BIIB-12-932、BIIB-12-933、BIIB-12-934、BIIB-12-935、BIIB-12-936、BIIB-12-937、BIIB-12-1288、BIIB-12-1289、BIIB-12-1290、BIIB-12-1291、BIIB-12-1292、BIIB-12-1293、BIIB-12-1294、BIIB-12-1295、BIIB-12-1296、BIIB-12-1297、BIIB-12-1298、BIIB-12-1299、BIIB-12-1300、BIIB-12-1301、BIIB-12-1302、BIIB-12-1303、BIIB-12-1304、BIIB-12-1305、BIIB-12-1306、BIIB-12-1307、BIIB-12-1308、BIIB-12-1309、BIIB-12-1310、BIIB-12-1311、BIIB-12-1312、BIIB-12-1313、BIIB-12-1314、BIIB-12-1315、BIIB-12-1316、BIIB-12-1317、BIIB-12-1318、BIIB-12-1319、BIIB-12-1322、BIIB-12-1323、BIIB-12-1324、BIIB-12-1325、BIIB-12-1326、BIIB-12-1327、BIIB-12-1328、BIIB-12-1329、BIIB-12-1330、BIIB-12-1331、BIIB-12-1332,BIIB-12-1333或BIIB-12-1334。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1393、SEQ ID NO:1483和SEQ ID NO:1573的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列(BIIB-12-915抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:1663、SEQ ID NO:1753和SEQ ID NO:1843的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-12-915抗体的VL CDR)。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1395、SEQ ID NO:1485和SEQ ID NO:1575的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列(BIIB-12-917抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:1665、SEQ ID NO:1755和SEQ ID NO:1845的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-12-917抗体的VL CDR)。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1409、SEQ ID NO:1499和SEQ ID NO:1589的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列(BIIB-12-932抗体的VH CDR)，和/或分别包含SEQ ID NO:1679、SEQ ID NO:1769和SEQ ID NO:1859的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列(BIIB-12-932抗体的VL CDR)。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553和555。

在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:565、567、569、571、573、575、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741和743。

在一些方面中，抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中

(i)所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553和555；并且

(ii)所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：565、567、569、571、573、575、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741和743。

在某些实施方案中，抗FIXa抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。在一些实施方案中，抗FIXa抗体的VH序列可来源于V、D或J种系序列中的任一种，并且/或者抗FIXa抗体的VL序列可来源于κ或λ种系序列中的任一种。

如本文所展示，已制备出对FIXa具有特异性的人抗体，其包含作为人种系基因的产物或来源于人种系基因的重链可变区。因此，提供一种抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH来源于种系序列VH1-18、VH1-46、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH4-31、VH4-39、VH4-0B或VH5-51。在一些方面中，抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VL来源于种系序列VK1-05、VK1-12、VK1-39、VK2-28、VK3-11、VK3-15、VK3-20或VK4-01。在一些方面中，所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH来源于种系序列VH1-18.0、VH1-18.1、VH1-18.8、VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.6、VH1-46.7、VH1-46.8、VH1-46.9、VH3-21.0、VH3-23.0、VH3-23.2、VH3-23.6、VH3-30.0、VH4-31.5、VH4-39.0、VH4-39.5、VH4-0B.4或VH5-51.1，并且所述VL来源于种系序列VK1-05.6、VK1-05.12、VK1-12.0、VK1-12.4、VK1-12.7、VK1-12.10、VK1-12.15、VK1-39.0、VK1-39.3、VK1-39.15、VK2-28.0、VK2-28.1、VK2-28.5、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.8、VK3-15.10、VK3-20.0、VK3-20.1、VK3-20.4、VK3-20.5、VK4-01.0、VK4-01.4、VK4-01.20。在一些方面中，所述VH和/或所述VL来源于其经过亲和力优化的对应种系。

本文所描述的抗体包括包含作为以上所列人种系VH基因的一的产物或来源于所述基因的重链可变区，并且还包含作为以上所列人种系VK基因的一的产物或来源于所述基因的轻链可变区的抗体，如图中所示。

如本文所使用，如果人抗体的可变区获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统，那么所述抗体包含作为特定种系序列的“产物”或“来源于”特定种系序列的重链和轻链可变区。所述系统包括以感兴趣的抗原使带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠免疫，或以感兴趣的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因库。因此，作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“来源于”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可通过将所述人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并且选择序列最接近(即，最大同一性百分比)所述人抗体的序列的人种系免疫球蛋白序列来鉴别。作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“来源于”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体因为例如天然存在的体细胞突变或有意引入的定点突变而与所述种系序列相比可含有氨基酸差异。然而，当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠类种系序列)进行比较时，所选人抗体通常与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性，并且含有将人抗体鉴别为属于人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体的氨基酸序列可与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95％，或甚至是至少96％、97％、98％或99％相同。通常，来源于特定人种系序列的人抗体将展示与人种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体可展示与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸的差异。

在一些方面中，抗FXz抗体或其抗原结合部分包含至少一个VH，其中所述VH包含选自SEQ ID NO:423、427或455的序列，由所述序列组成或基本上由所述序列组成。

在一些方面中，抗FXz抗体或其抗原结合部分包含至少一个VL，其中所述VL包含选自SEQ ID NO:611、615或643的序列，由所述序列组成或基本上由所述序列组成。

在一些方面中，抗FXz抗体或其抗原结合部分包含至少一个VH和至少一个VL，其中

(i)至少一个VH包含选自SEQ ID NO:423、427或455的序列，由所述序列组成或基本上由所述序列组成；并且

(ii)至少一个VL包含选自SEQ ID NO:611、615或643的序列，由所述序列组成或基本上由所述序列组成。

在一些方面中，抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中

(b1)VH和VL分别包含SEQ ID NO:423和611，由所述序列组成或基本上由所述序列组成；

(b2)VH和VL分别包含SEQ ID NO:427和615，由所述序列组成或基本上由所述序列组成；或

(b3)VH和VL分别包含SEQ ID NO:455和643，由所述序列组成或基本上由所述序列组成。

在一些方面中，抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH包含与SEQID NO:423至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列并且VL包含与SEQ ID NO:611至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些方面中，抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH包含与SEQID NO:427至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列并且VL包含与SEQ ID NO:615至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些方面中，抗FXz抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH包含与SEQID NO:455至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列并且VL包含与SEQ ID NO:643至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

在某些方面中，本发明的抗FXz抗体或其抗原结合部分不可检测地结合FXa。在其他方面中，本公开的双特异性分子包含特异性结合FXz并且不可检测地结合FXa的抗FXz抗体或其抗原结合部分，以及特异性结合FIXz和FIXa两者的抗FIX抗体。

(d)抗FXa结合分子

本公开提供一种特异性结合活化因子X(FXa)的抗体(例如分离抗体)或其抗原结合部分，其中所述抗FX抗体或其抗原结合部分在FXz和FXa的存在下优先结合FXa。在一个实施方案中，所述FXa为共价连接至底物模拟物(即，EGR-CMK)的FXa。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分结合FXa的结合亲和力高于所述抗体或其抗原结合部分结合FXz的结合亲和力。本公开还提供一种分离抗FX抗体或其抗原结合部分，其结合FXa的结合亲和力高于所述抗体或其抗原结合部分结合FXz的结合亲和力。

在一些方面中，如通过BLI测定所测定，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分以约100nM或更低、约95nM或更低、约90nM或更低、约85nM或更低、约80nM或更低、约75nM或更低、约70nM或更低、约65nM或更低、约60nM或更低、约55nM或更低、约50nM或更低、约45nM或更低、约40nM或更低、约35nM或更低、约30nM或更低、约25nM或更低、约20nM或更低、约15nM或更低、约10nM或更低、约5nM或更低，或约1nM或更低的K_D结合FXa。

在其他实施方案中，抗FXa抗体或其抗原结合部分以约10nM或更低、约9nM或更低、约8nM或更低、约7nM或更低、约6nM或更低、约5nM或更低、约4nM或更低、约3nM或更低、约2nM或更低、约1nM或更低、约0.5nM或更低、约0.2nM或更低、约0.1nM或更低，或约0.05nM或更低的K_D结合FXa。在又其他实施方案中，抗FXa抗体或其抗原结合部分以1nM至100nM、1nM至90nM、1nM至80nM、1nM至70nM、1nM至60nM、1nM至50nM、1nM至40nM、1nM至30nM、1nM至20nM、1nM至10nM、0.1nM至100nM、0.1nM至90nM、0.1nM至80nM、0.1nM至70nM、0.1nM至60nM、0.1nM至50nM、0.1nM至40nM、0.1nM至30nM、0.1nM至20nM、0.1nM至10nM，或0.1nM至1nM的K_D结合FXa。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分与选自由图12C中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分与选自由图12C中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分与参考抗体即BIIB-12-925结合相同表位。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分结合与本文所公开的任何抗FXa抗体或其抗原结合部分的抗原结合位点基本上相同的抗原结合位点(例如表位)。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分结合与本文所公开的抗FXa抗体或其抗原结合部分的抗原结合位点(例如表位)重叠的抗原结合位点(例如表位)。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3序列包含

(i)与选自由图12C中的VH CDR3序列组成的组的VH CDR3序列相同的VH CDR3，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图12C中的VH CDR3序列组成的组的VHCDR3序列相同的VH CDR3序列。

在一些方面中，氨基酸取代为保守氨基酸取代或回复突变。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR3序列包含如(SEQ ID NO:1919；BIIB-12-925)所陈述的氨基酸序列。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR1序列包含

(i)与选自由图12C中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图12C中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，其中所述VH CDR2序列包含

(i)与选自由图12C中所公开的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图12C中所公开的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR1序列包含

(i)与选自由图12C中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图12C中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR2序列包含

(i)与选自由图12C中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图12C中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR3序列包含

(i)与选自由图12C中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列，或

(ii)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由图12C中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中所述VL CDR3序列由或基本上由以下组成：

本公开还提供一种特异性结合FXa的分离抗体或其抗原结合部分，其包含VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3以及所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3包含选自由以下组成的组的抗FXa抗体的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：BIIB-12-894、BIIB-12-925、BIIB-12-1320或BIIB-12-1321。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:1911、SEQ ID NO:1915和SEQ ID NO:1919的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1923、SEQ ID NO:1927和SEQ ID NO:1931的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:557、559、561和563。

在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:745、747、749和751。

在一些方面中，抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中

(i)所述VH包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:557、559、561和563；并且

(ii)所述VL包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:745、747、749和751。

在某些实施方案中，抗FIXa抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。在一些实施方案中，抗FXa抗体的VH序列可来源于V、D或J种系序列中的任一种，和/或抗FXa抗体的VL序列可来源于κ或λ种系序列中的任一种。

如本文所展示，已制备出对FXa具有特异性的人抗体，其包含作为人种系基因的产物或来源于人种系基因的重链可变区。因此，提供一种抗FXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH来源于种系序列VH1-18、VH1-46、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH4-31、VH4-39、VH4-0B或VH5-51。在一些方面中，抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VL来源于种系序列VK1-05、VK1-12、VK1-39、VK2-28、VK3-11、VK3-15、VK3-20或VK4-01。在一些方面中，所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH来源于种系序列VH1-18.0、VH1-18.1、VH1-18.8、VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.6、VH1-46.7、VH1-46.8、VH1-46.9、VH3-21.0、VH3-23.0、VH3-23.2、VH3-23.6、VH3-30.0、VH4-31.5、VH4-39.0、VH4-39.5、VH4-0B.4或VH5-51.1，并且所述VL来源于种系序列VK1-05.6、VK1-05.12、VK1-12.0、VK1-12.4、VK1-12.7、VK1-12.10、VK1-12.15、VK1-39.0、VK1-39.3、VK1-39.15、VK2-28.0、VK2-28.1、VK2-28.5、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.8、VK3-15.10、VK3-20.0、VK3-20.1、VK3-20.4、VK3-20.5、VK4-01.0、VK4-01.4、VK4-01.20。在一些方面中，所述VH和/或所述VL来源于其经由亲和力优化的对应种系。

在一些方面中，抗FXa抗体或其抗原结合部分包含VH和VL，其中所述VH包含与SEQID NO:559至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列并且VL包含与SEQ ID NO:747至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

(e)共同方面

本公开的某些方面关于本文所公开的抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)和抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)，其包含本文所公开的VH和VL CDR序列，又含有来自本文所公开的抗体的不同框架序列。可从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或已出版文献获得此等框架序列。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“VBase”人种系序列数据库(可见于互连网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat,E.A.等人,1991Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson,I.M.等人,(1992)“The Repertoire of Human Germline VH SequencesReveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops”Mol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等人,(1994)“A Directory of Human Germ-lineVH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage”Eur.J Immunol.24:827-836中；所述文献各自的内容以引用的方式清楚地并入本文中。

用于本文所描述的抗体中的示例性框架序列为结构与本文所描述的抗体所使用的框架序列类似的框架序列。VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、CDR2和CDR3序列可移植至与得到框架序列的种系免疫球蛋白基因中所见的序列具有相同序列的框架区上，或者CDR序列可移植至与种系序列相比含有一个或多个突变的框架区上。例如，已发现在某些情形中，使框架区内的残基突变以保持或增强抗体的抗原结合能力为有益的(参见例如，颁予Queen等人的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。

本文所描述的工程化抗体包括已对VH和/或VL内的框架残基进行修饰例如以改良抗体特性的抗体。通常，进行所述框架修饰以降低所述抗体的免疫原性。例如，一种方法为使一个或多个框架残基“回复突变”成相应种系序列。更具体而言，已经历体细胞突变的抗体可含有与由得到所述抗体的种系序列不同的框架残基。所述残基可通过将抗体框架序列与得到所述抗体的种系序列相比较来鉴别。为了使框架区序列恢复成其种系构型，可通过例如定点诱变或PCR介导的诱变使体细胞突变“回复突变”成种系序列。还意图涵盖所述“回复突变”的抗体。另一类框架修饰包含使所述框架区内，或甚至使一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以去除T细胞表位，由此降低所述抗体的潜在免疫原性。此方法还称为“去免疫”，并且进一步详细描述于Carr等人的美国专利公开号20030153043中。

另一类可变区修饰为使VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变以由此改良感兴趣的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入一个或多个突变，并且对抗体结合或其他感兴趣的功能特性的影响可以如本文中所描述和实施例中所提供的活体外或活体内测定来评估。在一些实施方案中，引入保守修饰(如上文所论述)。所述突变可为氨基酸取代、增加或缺失。此外，通常CDR区内不超过1个、2个、3个、4个或5个残基被改变。

在一些方面中，抗体CDR中的甲硫氨酸残基可被氧化，引起潜在化学降解并且由此降低抗体的效力。因此，还提供重链和/或轻链CDR中的一个或多个甲硫氨酸残基被未经历氧化降解的氨基酸残基置换的抗FIX/FX抗体。在一个实施方案中，本文所公开的抗体的CDR中的甲硫氨酸残基被未经历氧化降解的氨基酸残基置换。类似地，可从任何抗体，特别是CDR中移除脱酰胺位点。

在某些方面中，本文所公开的抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)和抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)中的任一种可为IgG。在一些方面中，所述IgG为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。在一些方面中，本文所公开的抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)和抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)中的任一种为IgG4抗体。在一些方面中，本文所公开的抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)和抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)包含无效应物IgG4Fc。

在一些方面中，抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)的重链恒定区或其片段为IgG恒定区。在一些方面中，IgG恒定区或其片段为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。在一些方面中，抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)包含有包含轻链恒定区(LC)的VL，其中所述LC恒定区为κ恒定区。在一些方面中，抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)包含有包含轻链恒定区(LC)的VL，其中所述LC恒定区为λ恒定区。

在一些方面中，抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)包含重链恒定区(CH)。在一些方面中，抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)包含CH1结构域、CH2结构域或CH3结构域。

在一些方面中，其FIX或FX抗原结合部分包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在其他方面中，其FIX或FX抗原结合部分包含Fd、scFv、二硫键稳定的scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgG CH2、微型抗体、F(ab')₃、四链抗体、三链抗体、双链抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb²、(scFv)₂或scFv-Fc。

在一些方面中，本文所公开的抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)为单特异性的。在其他方面中，所述抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)为双特异性、三特异性、四特异性的等等。在其他方面中，所述抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)为多特异性的。在一些方面中，所述抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)为单价、二价、三价、四价的等等。在又其他方面中，所述抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)为多价的。在特定方面中，所述抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)为二价的，例如包含若干特异性抗原结合位点的抗体。在特定方面中，所述抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)为双特异性的，即，所述分子可特异性结合两种不同抗原(例如在相同或不同分子上的两个不同表位)。在一些特定方面中，所述抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)为二价并且双特异性的，例如包含能够结合两种不同抗原(例如在相同或不同分子上的两个不同表位)的四个双结合位点的抗体。

在一些方面中，本文所公开的抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)或抗FX抗体(例如抗FXa抗体或抗FXz抗体)为人抗体、工程化抗体、嵌合抗体、人源化抗体或优化抗体。在一些方面中，所述优化抗体为亲和力优化的抗体。在一些方面中，所述抗体的所需物理化学或功能特性，例如延长的血浆半衰期、较少聚集、热稳定性等已得到优化。

III.双特异性抗FIXa/抗FXz结合分子

本公开还提供包含抗FIX特异性(例如本文所公开的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，或本文所公开的抗FIXz抗体或其抗原结合部分)与具有第二结合特异性的分子相连接的双特异性分子。还提供包含抗FX特异性(例如本文所公开的抗FXz抗体或其抗原结合部分，或本文所公开的抗FXa抗体或其抗原结合部分)与具有第二结合特异性的分子相连接的双特异性分子。还提供一种双特异性分子，其包含(i)抗FIX特异性(例如本文所公开的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，或本文所公开的抗FIXz抗体或其抗原结合部分)以及(ii)抗FXz特异性(例如本文所公开的抗FXz抗体或其抗原结合部分，或本文所公开的抗FXa抗体或其抗原结合部分)。本文所公开的双特异性分子不局限于具有免疫球蛋白架构或由抗体例如通过重排结构域得到的结构的双特异性分子。本文所公开的双特异性分子还包含上面移植有本文所公开的CDR或其组合的分子支架(例如纤连蛋白III或肌腱蛋白-C支架)。

在一些方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体交叉竞争，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3A中的抗FIXa抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH和VL，以及选自由图12A和图12B中的抗FX抗体组成的组的抗FXz抗体的VH和VL。在其他方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体交叉竞争，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3B中的抗FIXa抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH和VL，以及选自由图12A和图12B中的抗FXz抗体组成的组的抗FXz抗体的VH和VL。在一些方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体交叉竞争，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3C中的抗FIXa抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH和VL，以及选自由图12A和图12B中的抗FXz抗体组成的组的抗FXz抗体的VH和VL。

在某些方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体交叉竞争，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3D中的抗FIXz抗体组成的组的抗FIXz抗体的VH和VL，以及选自由图12A和图12B中的抗FXz抗体组成的组的抗FXz抗体的VH和VL。

本公开的其他方面还提供与参考双特异性抗体交叉竞争的双特异性分子，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3A中的抗FIXa抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH和VL，以及选自由图12C中的抗FXa抗体组成的组的抗FXa抗体的VH和VL。在一些实施方案中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体交叉竞争，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3B中的抗FIXa抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH和VL，以及选自由图12C中的抗FXa抗体组成的组的抗FXa抗体的VH和VL。在其他实施方案中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体交叉竞争，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3C中的抗FIXa抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH和VL，以及选自由图12C中的抗FXa抗体组成的组的抗FXa抗体的VH和VL。在又其他实施方案中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体交叉竞争，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3D中的抗FIXz抗体组成的组的抗FIXz抗体的VH和VL，以及选自由图12C中的抗FXa抗体组成的组的抗FXa抗体的VH和VL。

在一些方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体结合相同表位，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3A中的抗FIXa抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH和VL，以及选自由图12A和图12B中的抗FXz抗体组成的组的抗FXz抗体的VH和VL。在其他方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体结合相同表位，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3B中的抗FIXa抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH和VL，以及选自由图12A和图12B中的抗FXz抗体组成的组的抗FXz抗体的VH和VL。在又其他方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体结合相同表位，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3C中的抗FIXa抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH和VL，以及选自由图12A和图12B中的抗FXz抗体组成的组的抗FXz抗体的VH和VL。

在一些其他方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体结合相同表位，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3D中的抗FIXz抗体组成的组的抗FIXz抗体的VH和VL，以及选自由图12A和图12B中的抗FXz抗体组成的组的抗FXz抗体的VH和VL。在又其他方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体结合相同表位，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3D中的抗FIXz抗体组成的组的抗FIXz抗体的VH和VL，以及选自由图12C中的抗FXa抗体组成的组的抗FXa抗体的VH和VL。

在一些方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体结合相同表位，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3A中的抗FIXa抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH和VL，以及选自由图12C中的抗FXa抗体组成的组的抗FXa抗体的VH和VL。在一些方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体结合相同表位，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3B中的抗FIXa抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH和VL，以及选自由图12C中的抗FXa抗体组成的组的抗FXa抗体的VH和VL。在其他方面中，所述双特异性分子与参考双特异性抗体结合相同表位，其中所述参考双特异性抗体包含选自由图3C中的抗FIXa抗体组成的组的抗FIXa抗体的VH和VL，以及选自由图12C中的抗FXa抗体组成的组的抗FXa抗体的VH和VL。

在一些方面中，所述双特异性分子包含

(i)抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3选自由图3A、3B、3C和3D中的抗FIXa(BIIB-9)抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(例如图15A、15B、15C和15D的CDR)组成的组；和

(ii)抗FX抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3选自由图12A和12B中的抗FX(BIIB-12)抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(例如图15A、15B、15C和15D的CDR)组成的组。

在一些方面中，所述双特异性分子包含

(a)抗FIX抗体或其抗原结合部分，其包含：

(a1)分别包含SEQ ID NO:815、860或905的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:950、995或1040的VL CDR1、CDR2和CDR3序列；(BIIB-9-484)

(a2)分别包含SEQ ID NO:822、867或912的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:957、1002或1047的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列；(BIIB-9-619)

(a3)分别包含SEQ ID NO:1347、1351或1355的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1359、1363或1367的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列；(BIIB-9-578)

(a4)分别包含SEQ ID NO:843、888或933的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:978、1023或1068的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列；(BIIB-9-1335)或

(a5)分别包含SEQ ID NO:844、889或934的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:979、1024或1069的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列；(BIIB-9-1336)和

(b)抗FX抗体或其抗原结合部分，其包含：

(b1)分别包含SEQ ID NO:1393、1483或1573的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1663、1753或1843的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列；(BIIB-12-915)

(b2)分别包含SEQ ID NO:1395、1485或1575的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1665、1755或1845的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列；(BIIB-12-917)

(b3)分别包含SEQ ID NO:1911、1915或1919的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1923、1927或1931的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列；(BIIB-12-925)

(b4)分别包含SEQ ID NO:1409、1499或1589的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1679、1769或1859的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列；(BIIB-12-932)或

(b5)分别包含SEQ ID NO:1433、1523或1613的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO:1703、1793或1883的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。(BIIB-12-1306)

在一些方面中，所述双特异性分子包含

(a)抗FIX抗体或其抗原结合部分，其包含：

(a1)分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL；(BIIB-9-484)

(a2)分别包含SEQ ID NO:45和235的VH和VL；(BIIB-9-619)

(a3)分别包含SEQ ID NO:185和371的VH和VL；(BIIB-9-578)

(a4)分别包含SEQ ID NO:87和221的VH和VL；(BIIB-9-1335)或

(a5)分别包含SEQ ID NO:89和221的VH和VL；(BIIB-9-1336)

(b)抗FX抗体或其抗原结合部分，其包含：

(b1)分别包含SEQ ID NO:423和611的VH和VL；(BIIB-12-915)

(b2)分别包含SEQ ID NO:427和615的VH和VL；(BIIB-12-917)

(b3)分别包含SEQ ID NO:559和747的VH和VL；(BIIB-12-925)

(b4)分别包含SEQ ID NO:455和643的VH和VL；(BIIB-12-932)或

(b5)分别包含SEQ ID NO:503和691的VH和VL。(BIIB-12-1306)

在一些方面中，双特异性分子包含抗FIX抗体或其抗原结合部分(即，抗FIXa或抗FIXz抗体或其抗原结合部分)和抗FX抗体或其抗原结合部分(即，抗FXz或抗FXa抗体或其抗原结合部分)，其中

(i)所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；并且所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:423和611的VH和VL(BIIB-12-915)；

(ii)所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；并且所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:427和615的VH和VL(BIIB-12-917)；

(iii)所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；并且所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:559和747的VH和VL(BIIB-12-925)；

(iv)所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:31和221的VH和VL(BIIB-9-484)；并且所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:455和643的VH和VL(BIIB-12-932)；或

(v)所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:185和371的VH和VL(BIIB-9-578)；并且所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:423和611的VH和VL(BIIB-12-915)；

(vi)所述抗FIXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:185和371的VH和VL(BIIB-9-578)；并且所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:427和615的VH和VL(BIIB-12-917)；

(vii)所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:45和235的VH和VL(BIIB-9-619)；并且所述抗FXz抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:427和615的VH和VL(BIIB-12-917)；或

(viii)所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:45和235的VH和VL(BIIB-9-619)；并且所述抗FXa抗体或其抗原结合部分包含有分别包含SEQ ID NO:559和747的VH和VL(BIIB-12-925)。

在一些方面中，双特异性分子包含抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH包含与表6中所公开的VH序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列并且VL包含与表6中所公开的VL序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些方面中，双特异性分子包含抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中所述VH CDR1序列包含

(iii)与选自由表7中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列，或

(iv)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由表7中所公开的VH CDR1序列组成的组的序列相同的VH CDR1序列。

在一些方面中，双特异性分子包含抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中所述VH CDR2序列包含

(iii)与选自由表7中的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列，或

(iv)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由表7中的VH CDR2序列组成的组的序列相同的VH CDR2序列。

在一些方面中，双特异性分子包含抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中所述VH CDR3序列包含

(iii)与选自由表7中所公开的VH CDR3序列组成的组的序列相同的VH CDR3序列，或

(iv)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由表7中所公开的VH CDR3序列组成的组的序列相同的VH CDR3序列。

在一些方面中，双特异性分子包含抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VL CDR1序列包含

(v)与选自由表7中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列，或

(vi)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由表7中所公开的VL CDR1序列组成的组的序列相同的VL CDR1序列。

在一些方面中，双特异性分子包含抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VL CDR2序列包含

(v)与选自由表7中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列，或

(vi)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由表7中的VL CDR2序列组成的组的序列相同的VL CDR2序列。

在一些方面中，双特异性分子包含抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VL CDR3序列包含

(v)与选自由表7中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列，或

(vi)除1、2或3个氨基酸取代外与选自由表7中所公开的VL CDR3序列组成的组的序列相同的VL CDR3序列。

在一些方面中，所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分包含选自表7中所示的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。

本公开的一些方面关于特异性结合FIX和FX并且接着在至少一种活化因子VIII(FVIIIa)活性测定中在功能上模拟FVIIIa辅因子的双特异性分子。在一些方面中，所述FVIIIa活性测定选自显色FXa产生测定、一期凝血测定或其组合。本公开的一特定方面包括一种双特异性分子，其相对于游离FIXa或FIX酶原，优先结合FIXa(例如因子X活化酶复合物中的FIXa，例如FIXa-SM)并且相对于FXa(例如FXa-SM)，优先结合FX酶原并且模拟活化因子VIII辅因子活性。

在一些实施方案中，所述FVIIIa活性达到在相同测定中FVIII另外所达到的活性的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约105％、至少约110％、至少约115％、至少约120％、至少约125％、至少约130％、至少约135％、至少约140％、至少约145％、至少约150％、至少约155％、至少约160％、至少约165％、至少约170％、至少约175％、至少约180％、至少约185％、至少约190％、至少约195％或至少约200％。

在其他实施方案中，所述双特异性分子能够在活体外或活体内由凝血酶原产生凝血酶、由纤维蛋白原产生纤维蛋白，和/或产生纤维蛋白凝块。在一些实施方案中，如通过BLI所测定，所述双特异性分子同时结合FIXa和FX两者。

在一些方面中，双特异性分子包含抗FIX抗体或其抗原结合部分(即，抗FIXa或抗FIXz抗体或其抗原结合部分)和抗FX抗体或其抗原结合部分(即，抗FXz或抗FXa抗体或其抗原结合部分)，其中如在FXa产生测定中所测量，所述双特异性分子在无磷脂存在下显示活性的明显损失。在一些方面中，双特异性分子包含抗FIXa抗体或其抗原结合部分(即，抗FIXa或抗FIXz抗体或其抗原结合部分)和抗FX抗体或其抗原结合部分(即，抗FXz或抗FXa抗体或其抗原结合部分)。在一些方面中，在FXa产生测定中不存在磷脂使活性相对于在磷脂存在下所测量的活性损失至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。在一些方面中，相较于以引用的方式整体并入本文中的美国专利号8,062,635中所公开的参考双特异性抗体(例如艾美赛珠单抗，ACE910)的不依赖于磷脂的活性，所述双特异性分子显示极小的不依赖于磷脂的活性。在一些方面中，在FXa产生测定中，在无磷脂存在下，本文所公开的双特异性分子显示的活性为所观察到的美国专利号8,062,635中所公开的参考双特异性抗体(例如艾美赛珠单抗，ACE910)的活性的不到约20％、不到约15％、不到约10％或不到约5％。

在一些方面中，在以因子XIa触发的凝血酶产生测定中，本文所公开的双特异性分子在所测试的合成磷脂囊泡由磷脂酰丝氨酸(PS)/磷脂酰乙醇胺(PE)/磷脂酰胆碱(PC)(20％/40％/40％)构成时显示的活性高于在所测试的合成磷脂囊泡由PS/PC(20％/80％)构成时的活性。在一些方面中，在以因子XIa触发的凝血酶产生测定中，本文所公开的双特异性分子在含PE的磷脂囊泡(例如PS/PE/PC 20％/40％/40％)存在下的活性比在相同实验条件下在不含PE的囊泡(例如PS/PC 20％/80％)存在下所观察到的活性高至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％或至少约300％。

在一些方面中，支持本公开双特异性分子的峰值活性的磷脂浓度高于支持rFVIII的峰值活性的磷脂浓度。

在一些方面中，所述双特异性分子属于IgG同种型。在一些方面中，所述IgG同种型属于IgG1亚类。在一些方面中，所述IgG同种型属于IgG4亚类。

在一些方面中，所述双特异性分子具有双特异性IgG形式并且选自由表2中的双特异性抗体组成的组。在一些方面中，所述双特异性分子具有双特异性异二聚体形式。

在一些方面中，所述双特异性分子包含两条不同重链和两条不同轻链。在一些方面中，所述双特异性分子包含两条相同轻链和两条不同重链。

在一些方面中，所述双特异性分子能够控制或降低患有血友病的受试者出血发作的发生率。在一些方面中，所述双特异性分子能够维持患有血友病的受试者的体内稳态。

在一些方面中，所述双特异性分子能够向患有血友病的受试者提供常规预防。在一些方面中，所述受试者已产生或预期会产生针对因子VIII的中和抗体。

在一些方面中，本文所公开的双特异性分子(例如抗体)为对至少两个不同位点具有结合特异性并且可呈任何形式的(单克隆)双特异性抗体。近期已开发出多种重组抗体形式，例如二价、三价或四价双特异性抗体。实例包括IgG抗体形式与单链结构域的融合物(有关不同形式，参见例如Coloma,M.J.等人,Nature Biotech 15(1997),159-163；WO 2001/077342；Morrison,S.L.,Nature Biotech 25(2007),1233-1234；Holliger.P.等人,NatureBiotech.23(2005),1 126-1 136；Fischer,N.和Leger,O.,Pathobiology 74(2007),3-14；Shen,J.等人,J.Immunol.Methods 318(2007),65-74；Wu,C等人,Nature Biotech.25(2007),1290-1297)。

本文的双特异性抗体或片段还包括根据以下中所公开的方法制造的二价、三价或四价双特异性抗体：WO2009/080251；WO2009/080252；WO2009/080253；WO2009/080254；WO2010/112193；WO2010/115589；WO2010/136172；WO2010/145792；WO2010/145793；和WO2011/117330，皆以引用的方式整体并入本文中。

在一些方面中，本文所公开的双特异性分子例如抗体包含Fd、scFv、二硫键稳定的scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgG-CH2、微型抗体、F(ab')₃、四链抗体、三链抗体、双链抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb²、(scFv)₂或scFv-Fc。

本文所公开的双特异性抗体可为双特异性的，甚至是在存在超过两个结合结构域(即，所述抗体为三价或多价的)的情况下亦然。双特异性抗体包括例如多价单链抗体、双链抗体和三链抗体，以及具有经由一个或多个肽接头连接至其他抗原结合结构域(例如单链Fv、VH结构域和/或VL结构域、Fab或(Fab)2)的全长抗体的恒定结构域结构的抗体。所述抗体可为来自单一物种的全长抗体，或为嵌合抗体或人源化抗体。对于具有超过两个抗原结合结构域的抗体而言，一些结合结构域可为相同的，只要蛋白质具有针对两种不同抗原的结合结构域即可。

如本申请内所使用，术语“价态”表示抗体分子中指定数量结合结构域的存在。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”表示在抗体分子中分别存在两个结合结构域、四个结合结构域和六个结合结构域。本文所公开的双特异性抗体为至少“二价”的并且可为“三价”或“多价”(例如“四价”或“六价”)的。在一些方面中，根据本发明的双特异性抗体为二价、三价或四价的。

用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))，WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))；和“结入孔”工程化(参见例如，美国专利号5,731,168；美国公开号2011/0287009)。多特异性抗体也可以通过以下方式制备：工程化静电转向作用以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；使两种或更多种抗体或片段交联(参见例如，美国专利号4,676,980，和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链或卷曲螺旋制造双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO201 1/034605)；使用弗林蛋白酶(furin)裂解单一VH/VL单元中CL结构域与VH结构域之间的栓系(参见例如，WO2013/119966和WO2013/055958)；使用“双链抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如，Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；使用免疫球蛋白结构域交换制备双特异性抗体(参见例如WO2009/080251)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如，Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)中所述。

在本公开的上下文中，双特异性结合分子可涉及包含两个抗体源性结合结构域的抗体分子，其中一个结合结构域可为scFv。所述结合结构域之一由能够特异性结合第一靶分子(例如FIXa)/与第一靶分子(例如FIXa)相互作用的抗体、抗体片段或其衍生物的可变区(或其部分)组成。第二结合结构域由能够特异性结合第二靶分子(例如FXz)/与第二靶分子(例如FXz)相互作用的抗体、抗体片段或其衍生物的可变区(或其部分)组成。

双特异性抗体分子中的两个结构域/区域优选彼此共价连接。此连接可直接实现，例如结构域1[对第一(人)靶分子例如FIXa具有特异性]-结构域2[对第二(人)靶分子例如FXz具有特异性]或反之亦然。在其他方面中，此连接可通过另外的多肽接头序列实现，[结构域l]-[接头序列]-[结构域2]。

在使用接头的情况下，此接头在本公开的情形中具有足以确保第一和第二结构域各自可彼此独立地保持其不同结合特异性的长度和序列。在本公开的情形中，所述另外的多肽接头序列还可为抗体本身的片段，其可例如为Fc部分或者抗体的一个或多个恒定结构域。

在本公开的情形中，结合结构域1还可为抗体臂1的一部分并且结合结构域2还可为抗体臂2的一部分，或反之亦然，其中所述两个抗体臂经由界面连接。抗体臂1由能够特异性结合(人)靶分子1/与(人)靶分子1相互作用的抗体、抗体片段或其衍生物的可变区(或其部分)组成。抗体臂2由能够特异性结合(人)靶分子2/与(人)靶分子2相互作用的抗体、抗体片段或其衍生物的可变区(或其部分)组成。

“界面”包含第一抗体臂中与第二抗体臂的界面中的一个或多个“接触”氨基酸残基(或其他非氨基酸基团)相互作用的接触氨基酸残基(或其他非氨基酸基团，诸如碳水化合物基团)。优选界面为免疫球蛋白的结构域，诸如抗体重链的恒定结构域(或其区域)，其中经由界面的结合/相互作用实现两个抗体臂的异二聚化。参见例如，Ridgway等人(1996)Protein Eng.9:617-621；国际公开号WO 96/027011；Merchant等人(1998)NatureBiotech.16:677-681；Atwell等人(1997)J.Mol.Biol.270:26-35；欧洲专利申请EP1870459Al；和国际公开号WO2007/147901、WO2009/089004和WO 2010/129304，皆以引用的方式整体并入本文中。

根据本公开使用的双特异性抗体分子可使用本领域中已知的常规技术，例如通过使用单独或组合的一个或多个氨基酸缺失、一个或多个插入、一个或多个取代、一个或多个添加和/或一个或多个重组和/或本领域中已知的任何一个或多个其他修饰进一步修饰。用于在免疫球蛋白链的氨基酸序列的潜在DNA序列中引入此类修饰的方法为本领域的技术人员熟知的，参见例如Sambrook(1989),见以上引述。所述Ig源性结构域的片段或衍生物确定(多)肽，所述(多)肽为以上抗体分子的一部分和/或通过化学/生物化学或分子生物学方法进行修饰。相应方法为本领域中已知的并且尤其描述于实验室手册中(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual:Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版(1989)和第3版(2001)；Gerhardt等人,Methods for General and MolecularBacteriology ASM Press(1994)；Lefkovits,Immunology Methods Manual:TheComprehensive Sourcebook of Techniques；Academic Press(1997)；Golemis,Protein-Protein Interactions:A Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor LaboratoryPress(2002))。

本文所公开的双特异性分子可包含例如以下组分中的一种或多种：

(i)“单链Fv”或“scFv”：具有抗体VH和VL结构域的抗体片段，其中所述结构域为以单一多肽链形式存在。一般而言，scFv多肽还包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，所述接头使sFv能够形成抗原结合所希望的结构。所描述的有关产生单链抗体的技术描述于例如Pluckhun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Rosenburg and Moore编,Springer-Verlag,N.Y.113(1994),269-315中。

(ii)“Fab片段”：包含一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链无法与另一重链分子形成二硫键。

(iii)“Fab'片段”：含有一条轻链以及一条重链的一部分，所述重链的一部分含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1与CH2结构域之间的区域，由此可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键，从而形成F(ab')₂分子。

(iv)“F(ab')₂片段”：含有两条轻链以及两条重链，所述两条重链含有在CH1与CH2结构域之间的恒定区的一部分，由此在所述两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')₂片段是由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab'片段构成。“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。

应注意的是，本文所公开的双特异性分子除本文所定义的第一(Ig源性)结构域和(Ig源性)第二结构域外，还可包含一个或多个另外的结构域，例如用于分离和/或制备重组产生的构建体。

IV.抗体恒定区

本文所述的呈单特异性、双特异性或多特异性分子的抗FIX可变区(例如抗FIXa可变区或抗FIXz可变区)和/或抗FX可变区(例如抗FXa可变区或抗FXz可变区)可连接(例如共价连接或融合)至Fc，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc，其可属于任何同种异型或异种型，例如对于IgGl：Glm、Glml(a)、Glm2(x)、Glm3(f)、Glml7(z)；对于IgG2：G2m、G2m23(n)；对于IgG3：G3m、G3m21(gl)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(bl)、G3ml3(b3)、G3ml4(b4)、G3ml0(b5)、G3ml5(s)、G3ml6(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)；和对于K：Km、Kml、Km2、Km3(参见例如，Jefferies等人(2009)mAbs 1:1)。

在某些实施方案中，本文所描述的抗FIX或抗FX可变区连接至结合于一种或多种活化Fc受体(Fcγl、Fcγlla或Fcγllla)的Fc并且因此刺激ADCC。在某些实施方案中，本文所描述的抗FIX或抗FX可变区连接至无效应物或主要无效应物Fc，例如IgG2或IgG4。

本文所描述的抗FIX或抗FX可变区可连接至非天然存在的Fc区，例如无效应物Fc或与一种或多种活化Fc受体(Fcγl、Fcγlla或Fcγllla)的结合增强的Fc。

一般而言，本文所描述的可变区可连接至包含一个或多个修饰的Fc，通常以改变抗体的一种或多种功能特性，诸如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。此外，本文所描述的抗体可被化学修饰(例如，可将一个或多个化学部分连接至抗体)或被修饰以改变其糖基化、改变抗体的一种或多种功能特性。以下进一步详细描述此等实施方案中的每一个。Fc区中的残基编号为Kabat的EU索引的编号。

Fc区涵盖来源于免疫球蛋白优选人免疫球蛋白的恒定区，包括恒定区的片段、类似物、变体、突变体或衍生物。合适免疫球蛋白包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4和其他类别，诸如IgA、IgD、IgE和IgM。免疫球蛋白的恒定区定义为与免疫球蛋白C末端区域同源的天然存在或合成产生的多肽，并且可包括单独或组合的CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域或CH4结构域。

免疫球蛋白恒定区负责许多重要的抗体功能，包括Fc受体(FcR)结合和补体固定。重链恒定区有五个主要类别，归类为IgA、IgG、IgD、IgE、IgM，各自具有由同种型指定的特征性效应功能。例如，IgG分成称为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的四个亚类。Ig分子与多种类别的细胞受体相互作用。例如，IgG分子与对IgG类别抗体具有特异性的三类Fcγ受体(FcγR)，即FcγRI、FcγRII和FcγRIII相互作用。据报告，IgG与FcγR受体结合的重要序列位于CH2和CH3结构域中。抗体的血清半衰期受所述抗体结合Fc受体(FcR)的能力影响。

在某些实施方案中，Fc区为变体Fc区，例如相对于亲本Fc序列(例如随后被修饰以产生变体的未修饰Fc多肽)被修饰(例如通过氨基酸取代、缺失和/或插入)以提供所需结构特征和/或生物活性的Fc序列。

例如，可在Fc区中进行修饰以便产生Fc变体，所述Fc变体相对于亲本Fc(a)具有增加或降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；(b)增加或降低的补体介导的细胞毒性(CDC)；(c)具有增加或降低的对Clq的亲和力；和/或(d)具有增加或降低的对Fc受体的亲和力。此类Fc区变体一般将在Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。组合氨基酸修饰被认为特别合乎需要。例如，变体Fc区可在其中，例如本文所标识的特定Fc区位置包括两个、三个、四个、五个等取代。

变体Fc区还可包含序列改变，其中二硫键形成所涉及的氨基酸被移除或被其他氨基酸置换。此类移除可避免与用于产生本文所描述的抗体的宿主细胞中存在的其他含半胱氨酸蛋白质反应。甚至在移除半胱氨酸残基时，单链Fc结构域仍能形成二聚体Fc结构域，所述结构域非共价地保持在一起。在其他实施方案中，Fc区可被修饰以使其与所选宿主细胞更相容。例如，可移除典型原生Fc区N末端附近的PA序列，所述序列可由大肠杆菌中的消化酶诸如脯氨酸亚氨基肽酶识别。在其他实施方案中，可移除Fc结构域内的一个或多个糖基化位点。通常被糖基化(例如天冬酰胺)的残基可赋予细胞毒性反应。此类残基可缺失或被未糖基化残基(例如丙氨酸)取代。在其他实施方案中，可从Fc区移除与补体相互作用所涉及的位点，诸如Clq结合位点。例如，可缺失或取代人IgGl的EKK序列。在某些实施方案中，可移除影响与Fc受体的结合的位点，优选除补救受体结合位点外的位点。在其他实施方案中，Fc区可被修饰以移除ADCC位点。ADCC位点为本领域中已知的；有关IgGl中的ADCC位点，参见例如Molec.Immunol.29(5):633-9(1992)。变体Fc结构域的具体实例公开于例如WO 97/34631和WO 96/32478中。

在一个实施方案中，Fc的铰链区被修饰以使所述铰链区中的半胱氨酸残基数改变，例如增加或减少。此方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利号5,677,425中。Fc铰链区中的半胱氨酸残基数被改变以例如促进轻链和重链的组装或者增加或降低抗体的稳定性。在一个实施方案中，抗体的Fc铰链区被突变以减少抗体的生物半衰期。更具体地说，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区以使得所述抗体所具有的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合相对于原生Fc-铰链结构域SpA结合削弱。此方法进一步详细描述于Ward等人的美国专利号6,165,745中。

在又其他实施方案中，Fc区通过以不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基而改变以改变抗体的一个或多个效应功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以用不同氨基酸残基置换以使抗体对效应配体的亲和力改变但保持亲本抗体的抗原结合能力。相关亲和力改变的效应配体可为例如Fc受体或补体的CI组分。此方法进一步详细描述于Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中。

在另一实例中，可以用不同氨基酸残基置换选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸以使抗体具有改变的Clq结合和/或减弱或消除的补体依赖细胞毒性(CDC)。此方法进一步详细描述于Idusogie等人的美国专利号6,194,551中。

在另一实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，由此改变抗体固定补体的能力。此方法进一步描述于Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中。

在又另一实例中，可通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和/或增加对Fcγ受体的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。示例性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D和332E。示例性变体包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T和267E/268F7324T。用于增强FcγR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于取代298A、333A、334A、326A、2471、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、3051和396L。所述和其他修饰评述于Strohl,2009,Current Opinion inBiotechnology 20:685-691中。

增加与Fcγ受体的结合的Fc修饰包括在Fc区中以下氨基酸位置中的任一处或多处的氨基酸修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、3338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc区中残基的编号为如Kabat(WO00/42072)中的EU索引的编号。

可对Fc进行的其他Fc修饰为用于减少或消除与FcγR和/或补体蛋白的结合，由此减少或消除Fc介导的效应功能诸如ADCC、ADCP和CDC的修饰。示例性修饰包括但不限于在位置234、235、236、237、267、269、325和328处的取代、插入和缺失，其中编号根据EU索引。示例性取代包括但不限于234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L和328R，其中编号根据EU索引。Fc变体可包含236R/328R。用于减少FcyR和补体相互作用的其他修饰包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P和234V，以及通过突变或酶方式或通过在不使蛋白质糖基化的生物体诸如细菌中产生来移除297位的糖基化。所述和其他修饰评述于Strohl,2009,Current Opinion inBiotechnology 20:685-691中。

任选地，Fc区可在本领域的技术人员已知的另外和/或另选的位置处包含非天然存在的氨基酸残基(参见例如，美国专利号5,624,821、6,277,375、6,737,056、6,194,551、7,317,091、8,101,720；PCX专利公布WO 00/42072、WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/074455、WO 04/099249、WO 04/063351、WO05/070963、WO 05/040217、WO 05/092925和WO 06/0201 14)。

还可使用增强对抑制性受体FcγRllb的亲和力的Fc变体。此类变体可提供具有与FcγRllb⁺细胞，包括例如B细胞和单核细胞相关的免疫调节活性的Fc融合蛋白。在一个实施方案中，相对于一种或多种活化受体，Fc变体提供对FcγRllb选择性增强的亲和力。根据EU索引，用于改变与FcγRllb的结合的修饰在选自由以下组成的组的位置处包括一个或多个修饰：234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332。用于增强FcγRllb亲和力的示例性取代包括但不限于234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。示例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。用于增强与FcyRllb的结合的其他Fc变体包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E和267E/328F。

Fc区对其配体的亲和力和结合特性可通过本领域中已知的多种活体外测定方法(基于生物化学或免疫学的方法)测定，包括但不限于平衡法(例如酶联免疫吸附剂测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如BIACORE分析)和其他方法，诸如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如凝胶过滤)。此等和其他方法可利用在所检查的一种或多种组分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。有关结合亲和力和动力学的详细描述可见于Paul,W.E.编,Fundamental immunology,第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其集中在抗体-免疫原相互作用。

在某些实施方案中，抗体被修饰以增加其生物半衰期。多种方法可行。例如，此可通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力实现。例如，如美国专利号6,277,375中所描述，以下残基中的一个或多个可被突变：252、254、256、433、435、436。具体示例性取代包括以下中的一个或多个：T252L、T254S和/或T256F。替代地，为了增加生物半衰期，抗体的CH1或CL区内可被改变以含有从IgG的Fc区CH2结构域的两个环获得的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。增加与FcRn的结合和/或改良药代动力学特性的其他示例性变体包括在位置259、308、428和434处的取代，包括例如2591、308F、428L、428M、434S、4341 1.434F、434Y和434X1。增加Fc与FcRn的结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216；Hinton等人,2006Journal of Immunology 176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人,Journal of Biological Chemistry,2001,276(9):6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、4331、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等人,Journal of Immunology,2002,169:5171-5180；Dall'Acqua等人,2006,Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)。用于调节FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等人,2010,J Immunol,182:7663-7671中。在某些实施方案中，可使用具有特定生物特征的混合IgG同种型。例如，IgG1/IgG3混合变体可通过用IgG3中两种同种型不同的位置处的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG1位置来构建。因此，可构建出包含一个或多个取代例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R和436F的混合变体IgG抗体。在本文所描述的其他实施方案中，IgG1/IgG2混合变体可通过用IgG1中两种同种型不同的位置处的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG2位置来构建。因此，可以构建出包含一个或多个取代例如以下氨基酸取代中的一个或多个的混合变体IgG抗体：233E、234L、235L、-236G(涉及在236位处插入甘氨酸)和321h。

此外，已定位人IgG1上FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点并描述具有改良结合的变体(参见Shields,R.L.等人，(2001)J.Biol.Chen.276:6591-6604)。显示在位置256、290、298、333、334和339处的特定突变改良与FcγRIII的结合。另外，显示以下组合突变体改良FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A，显示其展现增强的FcγRIIIa结合和ADCC活性(Shields等人,2001)。已鉴别出与FcγRIIIa的结合有较强增强的其他IgGl变体，包括具有S239D/I332E和S239D/I332E/A330L突变的变体，其显示对FcγRIIIa的亲和力的最大增加、FcγRIIb结合减小和在食蟹猕猴中较强的细胞毒性活性(Lazar等人,2006)。在抗体诸如阿伦单抗(alemtuzumab)(CD52特异性)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HER2/neu特异性)、利妥昔单抗(rituximab)(CD20特异性)和西妥昔单抗(cetuximab)(EGFR特异性)中引入所述三个突变转变成活体外大幅增强的ADCC活性，并且S239D/I332E变体在猴中显示增强的耗尽B细胞的能力(Lazar等人,2006)。此外，已鉴别出含有L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L突变的IgGl突变体，所述突变体在B细胞恶性疾病和乳癌模型中于表达人FcγRIIIa的转基因小鼠中展现增强的与FcγRIIIa的结合和同时增强的ADCC活性(Stavenhagen等人,2007；Nordstrom等人,2011)。可以使用的其他Fc突变体包括S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L和M428L/N434S。

在某些实施方案中，所选Fc具有减少的与FcγR的结合。具有减少的FcγR结合的示例性Fc例如IgGl Fc包含以下三个氨基酸取代：L234A、L235E和G237A。

在某些实施方案中，所选Fc具有减少的补体固定。具有减少的补体固定的示例性Fc例如IgGl Fc包含以下两个氨基酸取代：A330S和P331S。

在某些实施方案中，所选Fc基本上不具有效应功能，即，其具有减少的与FcγR的结合和减少的补体固定。示例性无效应物Fc例如IgGl Fc包含以下五个突变：L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。

当使用IgG4恒定结构域时，通常优选包括取代S228P，所述取代模拟IgGl中的铰链序列并由此使IgG4分子稳定。

应注意，在某些方面中，本文所公开的结合分子可被工程化以将CH3结构域与对应修饰抗体或其片段的铰链区直接融合。在其他构建体中，可将肽间隔区插入铰链区与修饰CH2和/或CH3结构域之间。例如，可表达相容构建体，其中CH2结构域已缺失并且剩余CH3结构域(修饰或未修饰)用5-20个氨基酸的间隔区接合至铰链区。可添加此类间隔区以例如确保恒定结构域的调控元件保持游离并且可接近状态或使铰链区保持柔性。然而，应注意，在一些情况下，氨基酸间隔区可证实具有免疫原性并且引起针对构建体的不想要的免疫反应。因此，在某些方面中，添加至构建体中的任何间隔区将为相对非免疫原性的，或甚至完全遗漏的，由此维持修饰抗体所需的生物化学特性。

除缺失整个恒定区结构域外，应理解本文所公开的结合分子可由数个或甚至单个氨基酸的部分缺失或取代来提供。例如，在CH2结构域所选区域中的单一氨基酸突变可足以大体上减少Fc结合并且由此增加肿瘤定位。此外，如以上间接提到的，所公开的结合分子的恒定区可通过一个或多个氨基酸的突变或取代进行修饰以增强所得构建体的特征。就这一点而言，可破坏由保守结合位点所提供的活性(例如Fc结合)，同时大体上维持修饰抗体或其抗原结合片段的构型和免疫原性特征。某些方面可包含在恒定区中添加一个或多个氨基酸以增强所需特征，诸如降低效应功能，或提供更多治疗剂或诊断剂连接。在此等方面中，可插入或复制来源于所选恒定区结构域的特定序列。

在又一实施方案中，抗体的糖基化被修饰。例如，可制备去糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。糖基化可被改变以例如增加抗体对抗原的亲和力。可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖化位点实现所述碳水化合物修饰。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，其消除一个或多个可变区框架糖基化位点以由此消除那个位点处的糖基化。所述去糖化可增加抗体对抗原的亲和力。此方法进一步详细描述于Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。

可通过使一个或多个氨基酸残基(例如糖基化氨基酸残基或相邻氨基酸残基)突变成另一残基例如N297A、S298G、T299A或其任何组合来防止恒定区N297的糖基化。

另外或替代地，可制备糖基化类型改变的抗体，诸如岩藻糖基残基量减少的低岩藻糖基化抗体或二分GlcNac结构增加的抗体。已证实，所述变化的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。所述碳水化合物修饰可通过例如在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞在本领域中有描述并且可用作宿主细胞，在所述宿主细胞中表达本文所描述的重组抗体，由此产生糖基化改变的抗体。例如，Hanai等人的EP 1,176,195描述具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，所述基因编码岩藻糖基转移酶以使得在所述细胞系中表达的抗体展现低岩藻糖基化。Presta的PCT公布WO 03/035835描述变体CHO细胞系，即Led 3细胞，所述细胞中岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力减弱，还使得在所述宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖基化(还参见Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342描述工程化成表达糖蛋白改变的糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII))以使得在工程化细胞系中表达的抗体展现二分GlcNac结构的增加，由此使所述抗体的ADCC活性增加的细胞系(还参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。

本文描述的抗体的另一修饰为聚乙二醇化。抗体可被聚乙二醇化以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，通常使所述抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)诸如PEG的反应性酯或醛衍生物在使一个或多个PEG基团附接至所述抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，经由与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。如本文中所使用，术语“聚乙二醇”意欲涵盖用于使其他蛋白质衍生化的任何形式的PEG，诸如单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或单芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体为去糖基化的抗体。用于使蛋白质聚乙二醇化的方法为本领域中已知的并且可应用于本文所描述的抗体。参见例如Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。

V.免疫缀合物和融合蛋白

本公开还提供包含本文所公开的结合分子(例如抗体)中的任一种(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的免疫缀合物。在一个方面中，免疫缀合物包含连接至剂的本文所公开的抗体或抗原结合部分。在一特定方面中，免疫缀合物包含连接至剂(例如治疗剂或诊断剂)的本文所公开的双特异性分子。

因此，本公开提供基于本文所公开的抗FIX、基于本文所公开的抗FX或基于本文所公开的双特异性抗体例如包括抗FIX特异性和抗FX特异性的双特异性抗体的免疫缀合物。

在一些方面中，免疫缀合物包含与至少一种治疗剂或诊断剂缀合的本文所公开的结合分子中的任一种(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)。在一些方面中，免疫缀合物还包含至少一个任选的间隔区，所述间隔区可夹在本文所公开的结合分子(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的多肽链中的侧链或氨基酸与治疗部分或诊断部分之间。在一些方面中，所述至少一个间隔区为肽间隔区。在其他方面中，所述至少一个间隔区为非肽间隔区。在一些方面中，间隔区不稳定，诸如酸不稳定性间隔区(例如肼)。在其他方面中，间隔区为酶可裂解肽，例如可裂解二肽。在一些方面中，间隔区为不可裂解的(水解稳定的)，例如硫醚间隔区或受阻二硫化物间隔区。

在一些方面中，免疫缀合物包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个治疗或诊断部分。在一些方面中，所有治疗或诊断部分均相同。在一些方面中，至少一个治疗或诊断部分不同于其余治疗或诊断部分。在一些方面中，所有治疗或诊断部分均不同。在一些方面中，所有间隔区(例如肽和/或非肽间隔区)均相同。在一些方面中，至少一个间隔区不同于其余间隔区。在又其他方面中，所有间隔区均不同。

在一些方面中，每一治疗或诊断部分以化学方式缀合至本文所公开的结合分子(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的Fc区中特定位置的氨基酸侧链。

在一些方面中，Fc区中的特定位置选自由以下组成的组：239、248、254、258、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、435、440、441、442、443、446、在239位与240位之间的插入及其组合，其中氨基酸位置编号根据如Kabat中所陈述的EU索引。

在一些方面中，缀合治疗或诊断部分的氨基酸的侧链为硫氢基侧链，例如半胱氨酸氨基酸的硫氢基。在一些方面中，至少一个治疗或诊断部分以化学方式缀合至位于本文所公开的结合分子(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的Fc区外的位置处的氨基酸的侧链。

在一些方面中，所有治疗或诊断部分均以化学方式缀合至位于本文所公开的结合分子(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的Fc区外的位置处的氨基酸的侧链。在一些方面中，使用本领域中所知的重组技术将至少一个治疗或诊断部分以遗传方式并入本文所公开的结合分子(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的多肽链中。

在一些实施方案中，本文所公开的免疫缀合物可包含使本文所公开的抗体或结合分子靶向损伤部位的部分。在一个特定实施方案中，使所述抗体或结合分子靶向损伤部位的部分包含血小板靶向部分，例如血小板靶向部分。

本文所公开的免疫缀合物包含至少一个被衍生化或连接(例如以化学方式或重组方式)至另一分子(例如肽、小药物分子、可检测分子等)的本文所公开的结合分子(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)。一般而言，本文所公开的结合分子(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)被衍生化以使其与特定抗原结合位点(例如FIXa上的表位和/或FXz上的表位)的结合不受例如化学或酶衍生化、基因融合或标记的不良影响。

因此，预期本公开的结合分子包括本文所公开的结合分子(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的完整和修饰形式。例如，本文所公开的结合分子(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或其抗原结合部分可功能性连接(通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他分子实体，诸如医药剂、检测剂和/或可介导本文所公开的结合分子(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)与另一分子(诸如抗生蛋白链菌素核心区或聚组氨酸标签)的缔合的蛋白质或肽。

可通过将两个或更多个分子实体例如本文所公开的结合分子(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)与治疗部分交联来产生一种类型的衍生化分子。合适交联剂包括异双官能性即具有由适当间隔区(例如间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)分隔的两个不同反应性基团；或同双官能性(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)的交联剂。此类交联剂可得自例如Pierce Chemical Company,Rockford,II。另外的双官能偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯、亚胺基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双官能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐(dimethyl adipimidate HCL))、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮鎓衍生物(诸如双(对重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。

另一类衍生化分子可通过并入可检测标记产生。有用检测剂包括荧光化合物(例如荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧化物磷光体和类似物)、可用于检测的酶(例如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和类似物)、由第二报告子识别的表位(例如亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在一些方面中，可检测标记可用至少一个间隔区臂附接。间隔区臂可具有各种长度以减小潜在空间位阻。

本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)还可用放射性标记进行标记，例如用于诊断目的。本文所公开的结合分子还可用化学基团例如聚合物诸如聚乙二醇(PEG)、甲基、乙基或碳水化合物基团衍生化。所述基团可用于改良结合分子(例如本文所公开的抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的生物特征，诸如增加血清半衰期或增加组织结合。

VI.核酸、表达载体和细胞

本公开还提供编码本文所公开的结合分子例如本文所公开的抗体或结合分子中的任一种的核酸。在一些方面中，所述核酸编码本文所公开的抗体的重链和/或轻链可变区，或其抗原结合部分，或本文所公开的双特异性或多特异性分子(例如抗体)。本公开的多核苷酸可呈RNA形式或呈DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可为双链或单链的，并且如果为单链，那么可为编码链或非编码(反义)链。在某些方面中，DNA为cDNA，用于产生非天然存在的重组抗体。在一些方面中，RNA为mRNA，其可在施用给有需要的受试者之后表达此处所公开的结合分子。在一些方面中，可在活体内表达mRNA。还可在活体外或离体表达mRNA。在一些方面中，编码本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的mRNA可被化学修饰，例如以包括修饰核苷间键联(例如硫代磷酸酯)或修饰碱基(例如假尿苷、硫代尿苷等)。

在某些方面中，分离出多核苷酸。在某些方面中，多核苷酸为大体上纯的。在某些方面中，多核苷酸包含与有助于例如宿主细胞表达和分泌多肽的多核苷酸(天然或异源)(例如充当分泌序列以控制细胞中多肽转运之前导序列)在同一阅读框中融合的成熟多肽的编码序列。具有前导序列的多肽为前体蛋白并且可具有由宿主细胞裂解以形成多肽的成熟形式的前导序列。多核苷酸还可编码结合分子原蛋白，所述原蛋白为成熟蛋白加另外的氨基酸残基例如5'氨基酸残基。在某些方面中，使多核苷酸改变以针对某些宿主细胞优化密码子使用。

在某些方面中，多核苷酸包含与允许例如纯化所编码多肽的异源标记物序列在同一阅读框中融合的成熟结合分子例如本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或其抗原结合片段的编码序列。

例如，在细菌宿主的情况下，标记物序列可为例如由pQE-9载体提供的六组氨酸(His6)标签(SEQ ID NO:2208)，以允许纯化出与所述标记物融合的成熟多肽。在其他方面中，当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时，标记物序列可为例如来源于流感血球凝集素蛋白的血球凝集素(HA)标签。

本公开进一步涉及所描述的编码例如本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的片段、类似物和衍生物的多核苷酸的变体。所述多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中含有变化。在一些方面中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码多肽的特性或活性的变化。在一些方面中，由于基因密码的简并性，核苷酸变体由沉默取代产生。多核苷酸变体的产生可出于多种原因，例如针对特定宿主优化密码子表达(将人mRNA中的密码子变成细菌宿主诸如大肠杆菌中优选的密码子)。

在一些方面中，编码本文所公开的结合分子或其抗原结合片段的DNA序列可通过化学合成例如使用寡核苷酸合成仪来构建。此类寡核苷酸可基于所需多肽的氨基酸序列并且选择有利于在宿主细胞中产生感兴趣的重组多肽的密码子来设计。可应用标准方法合成编码感兴趣的分离多肽的分离多核苷酸序列。例如，可使用完整氨基酸序列构建回译基因。另外，可合成含有编码特定分离多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可合成编码所需多肽各部分的若干小寡核苷酸，并且接着连接。个别寡核苷酸通常含有5'或3'突出用于互补组装。

还提供一种表达载体或表达载体组合，其包含一个或多个本文所公开的核酸分子。一旦组装(通过合成、定点诱变或另一方法)，即将编码特定感兴趣的分离多肽的多核苷酸序列插入表达载体中并可操作地连接至适于在所需宿主中表达蛋白质的表达控制序列。正确组装可例如通过核苷酸测序、限制性定位和在合适宿主中表达生物活性多肽来证实。如本领域中所熟知的，为了在宿主中获得转染基因的高水平表达，所述基因必须可操作地连接至在所选表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。

在某些方面中，使用重组表达载体扩增并表达编码本文所公开的结合分子的DNA。重组表达载体为可复制DNA构建体，其具有编码例如本文所公开的结合分子或其抗原结合片段的多肽链的合成或cDNA源性DNA片段，所述DNA片段可操作地连接至来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的适合转录或翻译调控元件。

转录单元一般包含以下的组装物：(1)在基因表达中具有调控作用的一个或多个基因元件，例如转录启动子或增强子；(2)转录成mRNA并且翻译成蛋白质的结构或编码序列；和(3)适当转录和翻译起始和终止序列，如下文所详述。所述调控元件可包括用以控制转录的操作子序列。

可另外并入通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力和有利于识别转化株的选择基因。DNA区当彼此功能相关时为可操作地连接。例如，如果信号肽(分泌型前导序列)的DNA表达为参与多肽分泌的前体蛋白，那么其可操作地连接至所述多肽的DNA；如果启动子控制编码序列的转录，那么其可操作地连接至所述序列；或如果核糖体结合位点定位成允许翻译，那么其可操作地连接至编码序列。意欲用于酵母表达系统中的结构元件包括使宿主细胞能够细胞外分泌翻译的蛋白质的前导序列。替代地，在无前导序列或转运序列的情况下表达重组蛋白时，其可包括N末端甲硫氨酸残基。所述残基可任选地随后自表达的重组蛋白裂解，以提供最终产物。

表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可采用多种表达宿主/载体组合。可用于真核宿主的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质体，诸如来自大肠杆菌的质体，包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物；较广宿主范围的质体，诸如M13和丝状单链DNA噬菌体。

本公开还提供包含一个或多个本文所公开的核酸，或一个或多个本文所公开的表达载体的细胞。在一些方面中，用一种或多种本文所公开的表达载体转化细胞。在一些方面中，细胞为用于重组表达的宿主细胞。例如，在一些方面中，宿主细胞为原核细胞、真核细胞、原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞、Sf9细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞、CHO细胞、HEK细胞或COS细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高级真核细胞包括确定的哺乳动物来源的细胞系。还可采用无细胞翻译系统。适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体描述于Pouwels等人(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)中，其相关公开内容特此以引用的方式并入。有关蛋白质制造包括抗体制造的方法的额外信息可见于例如美国公布号2008/0187954；美国专利号6,413,746和6,660,501；以及国际专利公布号WO 04009823中，其各自特此以全文引用的方式并入。

由于重组蛋白质一般为正确折叠，被适当修饰并且有完整功能，所以可在哺乳动物细胞中表达此类蛋白质。合适哺乳动物宿主细胞系的实例包括HEK-293和HEK-293T、Gluzman(Cell 23:175,1981)所描述的猴肾细胞COS-7系以及其他细胞系包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、NSO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包含不转录元件，诸如复制起点、连接至待表达基因的合适启动子和增强子，以及其他5'或3'侧接不转录序列，和5'或3'不翻译序列，诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点，以及转录终止序列。Luckow和Summers,BioTechnology 6:47(1988)评述用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统。

由转化宿主产生的本文所公开的结合分子或其抗原结合片段可根据任何合适的方法纯化。此类标准方法包括例如色谱法(例如离子交换色谱、亲和色谱和定尺寸管柱色谱法)、离心、差示溶解度法或通过任何其他标准蛋白质纯化技术。亲和标签诸如六组氨酸(SEQ ID NO:2208)、麦芽糖结合结构域、流感病毒衣壳序列、谷胱甘肽-S-转移酶等可以附接至所述蛋白质以便通过穿过适当亲和管柱容易地纯化。分离蛋白质还可使用例如蛋白水解、核磁共振或X射线结晶学以物理方式表征。

例如，首先，可使用可商购的蛋白质浓缩过滤器例如

或Millipore

超滤单元浓缩来自系统的上清液，所述系统将重组蛋白分泌至培养基中。在浓缩步骤之后，可将浓缩物施加至合适纯化基质。替代地，可采用阴离子交换树脂，例如具有侧接二乙氨基乙基(DEAE)的基质或底物。所述基质可为丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或常用于蛋白质纯化中的其他类型。替代地，可采用阳离子交换步骤。

合适阳离子交换剂包括包含磺基丙基或羧甲基的各种不溶基质。最后，可采用一个或多个逆相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤进一步纯化本文所公开的结合分子或其抗原结合部分，所述步骤采用疏水性RP-HPLC介质例如具有侧接甲基或其他脂族基团的硅胶。还可采用以各种组合的形式的前述纯化步骤中有一些或全部以提供同源重组蛋白。

可以例如通过最初自细胞块提取，随后一个或多个浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤，分离出在细菌培养物中产生的本文所公开的重组结合分子或其抗原结合部分。高效液相色谱法(HPLC)可以用于最后的纯化步骤。用于表达重组蛋白的微生物细胞可以通过任何便利方法破坏，包括冷冻-解冻循环、超声处理、机械破坏或使用细胞溶解剂。

本领域中已知用于纯化抗体和其他蛋白质的方法包括例如美国专利公布号US20080312425、US20080177048和US20090187005中所述的方法，各案特此以全文引用的方式并入。

VII.制备和表征方法

本公开还提供制备本文所公开的结合分子例如抗体的方法。在一些方面中，制备本文所公开的(i)抗FIX抗体或其抗原结合部分、(ii)抗FX抗体或其抗原结合部分或(iii)双特异性分子的方法包括在细胞(例如宿主细胞)中表达抗体、其抗原结合部分或双特异性分子，并且从细胞分离所述抗体、其抗原结合部分或双特异性分子。

本公开提供一种制备双特异性分子的方法，其包括在允许表达所述双特异性分子的条件下培养本文所公开的宿主细胞。还提供一种制备本文所公开的双特异性分子的方法，所述方法还包括增进异二聚化的条件。

可根据本领域中已知的方法制备本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)。例如，可使用杂交瘤方法，诸如Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495所描述的方法，产生本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)。

使用杂交瘤方法，如上文所述对小鼠、仓鼠或其他适当宿主动物进行免疫以引起淋巴细胞产生将特异性结合免疫抗原的抗体。还可在活体外使淋巴细胞免疫。在免疫后，分离淋巴细胞，并使用例如聚乙二醇使其与合适骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞，接着可自未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选出杂交瘤细胞。接着，可使用标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986)通过活体外培养，或在活体内以动物体内的腹水肿瘤形式繁殖杂交瘤，如通过免疫沉淀法、免疫印迹法或通过活体外结合测定(例如放射免疫测定(RIA)；酶联免疫吸附剂测定(ELISA))所测定，所述杂交瘤产生特异性针对所选抗原的单克隆抗体。接着，可如以上关于多克隆抗体所描述，自培养基或腹水纯化出单克隆抗体。

还可如美国专利号4,816,567所描述，使用重组DNA方法制备本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)。编码单克隆抗体的多核苷酸为诸如使用特异性扩增编码所述抗体重链和轻链的寡核苷酸引物，通过RT-PCR从成熟B细胞或杂交瘤分离，并且其序列使用常规程序测定。接着，将分离的编码重链和轻链的多核苷酸克隆至合适表达载体中，当将其转染至宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中时，所述宿主细胞产生单克隆抗体。

同样，可如所描述(McCafferty等人,Nature 348:552-554(1990)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)；和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991))，从表达所需物种的CDR的噬菌体展示文库分离重组单克隆抗体或包含所需物种的抗原结合片段的分子。

编码本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的一种或多种多核苷酸可通过多种不同方式，使用重组DNA技术进一步修饰以产生另选的结合分子。在一些方面中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域可取代(1)例如人抗体的所述区域以产生嵌合抗体，或(2)非免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。在一些方面中，将恒定区截短或移除以产生所需的单克隆抗体的抗体片段。可使用可变区的定点或高密度诱变以优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。

在某些方面中，本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)为人抗体或其抗原结合片段。人抗体可使用本领域中已知的各种技术直接制备。可产生在活体外免疫或从免疫个体分离永生化人B淋巴细胞，所述淋巴细胞产生针对靶抗原的抗体(参见例如，Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,第77页(1985)；Boemer等人,J.Immunol.147:86-95(1991)；和美国专利第5,750,373号)。接着，可制备一个或多个编码永生化B淋巴细胞中的抗体的cDNA并将其插入表达载体和/或异源宿主细胞中以表达所述抗体的非天然存在的重组形式。

另外，本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)可选自噬菌体文库，其中所述噬菌体文库表达呈与异源噬菌体蛋白的融合蛋白形式的人抗体或其片段，如例如Vaughan等人,Nat.Biotech.14:309-314(1996)；Sheets等人,Proc.Natl.Acad.Sci.95:6157-6162(1998)；Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；以及Marks等人,J.Mol.Biol.222:581(1991))中所描述。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术还描述于美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484和7,264,963中，其各自以全文引用的方式并入。

亲和力成熟策略和链改组策略(Marks等人,BioTechnology 10:779-783(1992)，以全文引用的方式并入)为本领域中已知的并且可用于产生高亲和力人抗体或其抗原结合片段。

在一些方面中，本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)可为人源化抗体。还可使用用于工程化、人源化或表面重塑非人或人抗体的方法并且其为本领域中熟知的。人源化、表面重塑或类似工程化抗体可具有一个或多个来自非人来源例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其他哺乳动物的氨基酸残基。所述非人氨基酸残基被通常称为“输入”残基，所述残基通常从已知人序列的“输入”可变结构域、恒定结构域或其他结构域获得。如本领域所知，此类输入序列可用于降低免疫原性或减小、增强或改良结合、亲和力、缔合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或任何其他合适特征。一般而言，CDR残基直接并且最充分地参与影响与特定抗原结合位点(例如表位)的结合。因此，非人或人CDR序列的一部分或全部得以保持，同时可变区和恒定区的非人序列可被人或其他氨基酸置换。在某些方面中，将人CDR插入非人抗体支架中以制备在动物模型系统中具有降低的免疫原性的抗体，例如“鼠化”抗体。

在一些方面中，本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)可被人源化、表面重塑或工程化而保持对抗原结合位点(例如表位)的高亲和力和其他有利的生物特性。为达到此目标，可任选地通过使用亲本序列、工程化序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列与各种概念性人源化和工程化产物的方法来制备人源化(例如人)、工程化或表面重塑的结合分子。三维免疫球蛋白模型为常用的并且为本领域的技术人员所熟悉的。

可用计算机程序说明并展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查所述展示允许分析所述残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可以自共同序列和输入序列中选出框架残基并组合，以获得所需抗体特征，诸如增加对一种或多种靶抗原的亲和力。

本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的人源化、表面重塑或工程化可使用任何已知方法诸如但不限于以下所描述的方法进行：Jones等人,Nature 321:522(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323(1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534(1988)),Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia andLesk,J.Mol.Biol.196:901(1987)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.151:2623(1993)；美国专利号5,639,641、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539、4,816,567、7,557,189、7,538,195和7,342,110；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430和EP229246，其各自以引用的方式完整并入本文中，包括其中引用的参考文献。

在某些方面中，提供从本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)获得的抗体片段。已知用于产生抗体片段的各种技术。传统上，经由蛋白水解消化完整抗体得到所述片段(参见例如，Morimoto等人,J.Biochem.Biophy.Methods 24:107-117(1993)；和Brennan等人,Science,229:81(1985))。

在某些方面中，重组产生抗体片段。Fab、Fv和scFv抗体片段均可在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达并且由其分泌，由此能够产生大量所述片段。还可从以上讨论的抗体噬菌体文库分离所述抗体片段。如美国专利号5,641,870中所述，抗体片段还可为线性抗体。用于产生抗体片段的其他技术将为熟练技术人员显而易知的。

可采用产生对与本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)相同的一个或多个表位具有特异性的单链抗体的技术。此外，还可采用构建Fab表达文库的方法(参见例如，Huse等人,Science 246:1275-1281(1989))以允许快速并且有效地鉴别对FIX和/或FX，或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所需特异性的单克隆Fab片段。可通过本领域中的技术制备抗体片段，包括但不限于：(a)通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab')₂片段；(b)通过还原F(ab')₂片段的二硫桥产生的Fab片段；(c)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段；和(d)Fv片段。

可通过本领域中已知的任何方法测定本文所公开的结合分子和其抗原结合部分、其变体或衍生物的免疫特异性结合。可使用的免疫测定包括但不限于使用诸如蛋白质印迹法的技术进行的竞争性和非竞争性测定系统、放射免疫测定、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定等。此类测定为常规的并且为本领域中熟知的(参见例如，Ausubel等人编(1994)Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.,NY)第1卷，以引用的方式整体并入本文中)。

给定的一组本文所公开的结合分子、其抗原结合部分、其变体或衍生物的结合活性可根据熟知方法测定。本领域的技术人员通过采用常规实验将能够确定用于每次测定的可操作并且最佳的测定条件。

适于测定本文所公开的结合分子或其抗原结合部分的结合特征的方法和剂为本领域中已知的和/或可商购的。设计用于此类动力学分析的设备和软件为可商购的(例如

BIAevaluation软件，GE Healthcare；KinExa软件,SapidyneInstruments)。

除非另外指示，否则本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其属于本领域的技能。所述技术在文献中有完整解释。参见例如，Sambrook等人编(1989)Molecular Cloning A LaboratoryManual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人编(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY)；D.N.Glover编(1985)DNA Cloning,第I和II卷；Gait编(1984)OligonucleotideSynthesis；Mullis等人,美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编(1984)Nucleic AcidHybridization；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning；thetreatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller和Calos编(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(Cold Spring HarborLaboratory)；Wu等人编,Methods In Enzymology,第154和155卷；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell编(1986)Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,(1986)；和Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)。

抗体工程化的一般原理陈述于Borrebaeck编(1995)Antibody Engineering(第2版；Oxford Univ.Press)中。蛋白质工程化的一般原理陈述于Rickwood等人编(1995)Protein Engineering,A Practical Approach(IRL Press at Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.)中。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理陈述于：Nisonoff(1984)MolecularImmunology(第2版；Sinauer Associates,Sunderland,Mass.)；和Steward(1984)Antibodies,Their Structure and Function(Chapman and Hall,New York,N.Y.)。另外，本领域中已知并且未具体描述的免疫学标准方法一般遵循Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons,New York；Stites等人编(1994)Basic and ClinicalImmunology(第8版；Appleton&Lange,Norwalk,Conn.)以及Mishell和Shiigi(编)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(W.H.Freeman and Co.,NY)中所述。

陈述免疫学一般原理的标准参考著作包括Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York；Klein(1982)J.,Immunology:The Science of Self-NonselfDiscrimination(John Wiley&Sons,NY)；Kennett等人编(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(Plenum Press,NY)；Campbell(1984)“Monoclonal Antibody Technology”,Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology,Burden等人编(Elsevier,Amsterdam)；Goldsby等人编(2000)Kuby Immunology(第4版；H.Freemand&Co.)；Roitt等人(2001)Immunology(第6版；London:Mosby)；Abbas等人(2005)Cellular and Molecular Immunology(第5版；Elsevier HealthSciences Division)；Kontermann和Dubel(2001)Antibody Engineering(SpringerVerlag)；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Press)；Lewin(2003)Genes VIII(Prentice Hall 2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer(Cold Spring Harbor Press)。

VIII.药物组合物

本公开还提供药物组合物，其包含例如(i)本文所公开的抗体或其抗原结合部分、本文所公开的双特异性分子(例如双特异性抗体)或本文所公开的免疫缀合物，和(ii)载剂。

特别地，本公开提供药物组合物(例如治疗或诊断性组合物)，其包含

(1)至少一种选自由以下组成的组的治疗或诊断活性组分：

(i)本文所公开的结合分子，例如抗FIX抗体或其抗原结合部分、抗FX抗体或其抗原结合部分、包含抗FIX特异性和/或抗FX特异性的双特异性分子；

(ii)其衍生物，例如免疫缀合物、融合蛋白或带有赋予本文所公开的结合分子所需特性(例如较长血浆半衰期)的异源部分的衍生物；

(iii)编码(i)的结合分子和/或(ii)的衍生物的多核苷酸；

(iv)包含(iii)的多核苷酸的载体；

(v)包含(iii)的多核苷酸或(iv)的载体的细胞；或，

(vi)其组合；和，

(2)一种或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂。

本文所公开的药物组合物合适于兽医用途或人医药用途。本文所公开的药物组合物通常包含一种或多种本文所述的治疗或诊断活性组分以及一种或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂。药物组合物的形式(例如干粉、液体制剂等)和所用赋形剂、稀释剂和/或载剂将取决于所述组合物的预定用途、治疗或诊断用途和施用模式。

包含本文所述的治疗或诊断活性组分的药物组合物用于但不限于诊断、检测或监测病症；预防、治疗、管理或缓解病症或者其一种或多种症状；和/或研究。

对于治疗用途，药物组合物可作为包括药学上可接受的载剂的无菌药物组合物的一部分提供。此药物组合物可呈任何合适形式(取决于将其施用给患者所需的方法)。施用方法为本领域的普通技术人员已知的。所述药物组合物可通过多种途径诸如口服、透皮、皮下、鼻内、静脉内、肌肉内、肿瘤内、鞘内、表面或局部施用给患者。在任何给定情况下，最合适的施用途径将取决于特定治疗或诊断活性组分、受试者以及疾病的性质和严重程度和受试者的身体状况。通常，药物组合物将皮下施用。

药物组合物可便利地以每剂含有预定量本文所述的治疗或诊断活性组分的单位剂型提供。单位剂量中所包含的治疗或诊断活性组分的量将取决于所治疗或诊断的疾病，以及本领域中熟知的其他因素。所述单位剂量可呈含有适于单次施用的量的治疗或诊断活性组分的冻干的干粉形式，或呈液体形式。干粉单位剂型可包装于带有注射器、适量稀释剂和/或可用于施用的其他组分的药盒中。呈液体形式的单位剂量宜以预填充适于单次施用的量的治疗或诊断活性组分的注射器形式提供。

药物组合物还可以含有适于多次施用的量的治疗或诊断活性组分的散装形式提供。

药物组合物还可与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。

可通过将具有所需纯度的本文所述的治疗或诊断活性组分与本领域中常用的任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(全部在本文中称为“载剂”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等张剂、非离子清洁剂、抗氧化剂和其他各种添加剂混合来制备药物组合物以冻干制剂或水溶液形式储存。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版(Osol编,1980)和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版(Allen,LoydV.Jr.编辑,2012)。所述添加剂应当在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。

用于皮内或皮下应用的溶液或悬浮液通常包括以下组分中的一种或多种：无菌稀释剂，诸如注射用水、生理盐水溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的剂，诸如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠调节pH。此类制剂可以封装于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适于注射的药物组合物包括无菌水性溶液或分散液，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适载剂包括生理盐水、抑菌水、CremophorEL(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲生理盐水。在所有情形中，所述组合物均必须为无菌的并且流动性应当达到易于注射的程度。其必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载剂可以为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)和其合适混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过利用包衣剂，诸如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需粒度和通过利用表面活性剂来维持流动性。

可添加防腐剂以阻止微生物生长，并且添加量可在约0.2％-1％(w/v)范围内。适用于本公开的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、苯扎卤铵(benzalconium halide)(例如苯扎氯铵、苯扎溴铵和苯扎碘铵)、氯化六羟季铵和对羟基苯甲酸烷酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可添加等张剂，有时称为“稳定剂”，以确保本公开的液体组合物的张力，并且包括多羟基糖醇，例如三羟基或更高级糖醇，诸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。

稳定剂是指功能范围从增量剂至溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附至容器壁的添加剂的一大类赋形剂。典型稳定剂可为多羟基糖醇(如以上列举)；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯基丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等等，包括环醇，诸如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如具有10个或更少残基的肽)；蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖；和三糖，棉子糖；和多糖，诸如葡聚糖。

缓冲剂有助于将pH保持在使蛋白质稳定的范围内。其可以多种浓度存在，但通常以在约2mM至约50mM范围内的浓度存在。

适用于本公开的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，诸如柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、延胡索酸缓冲剂(例如延胡索酸-延胡索酸一钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸一钠-延胡索酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲剂(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，还可使用磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐诸如Tris。

其他各种赋形剂包括增量剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。

IX.治疗和诊断方法

本公开还提供治疗和诊断方法，其包括使用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。

(a)治疗用途

在一个方面中，可使用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)预防、治疗或逆转凝血或出血病症。在另一方面中，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。受试者可为哺乳动物，诸如但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、家畜诸如但不限于牛、马、绵羊、猪、山羊、猫、狗、仓鼠、驴。在一个方面中，受试者为人。

在各种方面中，凝血或出血病症由缺乏凝血因子引起。本领域的技术人员应理解凝血或出血病症的类型与缺乏凝血因子有关。在一些方面中，凝血或出血病症可为血友病或温韦伯氏病(von Willebrand disease)。在另一方面中，凝血或出血病症为血友病A或获得性血友病。在一特定方面中，凝血或出血病症为血友病A。在另一方面中，凝血或出血病症为获得性血友病，其中受试者不再产生FVIII。

在各种方面中，可向患有轻度血友病A、中度血友病A或重度血友病A的受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。在另一方面中，可向血浆因子水平为6％至30％、2％至5％或1％或更低的受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。

在一些方面中，可向患有血友病A或怀疑患有血友病A(当在受试者身上出现外部伤口时)的受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。在另一方面中，可向患有血友病A或在受试者身上存在外部伤口的怀疑患有血友病A的受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。在另一方面中，可向具有外部伤口的受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)，直至伤口愈合。在一些方面中，伤口可包括但不限于擦伤、撕裂伤、刺伤或撕脱伤。

在一些方面中，可在手术、严重损伤或牙科操作之前、期间或之后，向患有血友病A或怀疑患有血友病A的受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。

在一些方面中，可向患有血友病A或怀疑患有血友病A并且已经历自发出血的受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。在另一方面中，可向患有血友病A或怀疑患有血友病A并且已在一周内经历一次、两次或更多次出血的受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。

在各种方面中，可向患有或怀疑患有血友病A的各种年龄群的受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。在一些方面中，可向患有或怀疑患有血友病A的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17岁儿童施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。在另一方面中，可向患有或怀疑患有血友病A的婴儿施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。

在又另一方面中，可向患有或怀疑患有血友病A的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月大的婴儿受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。

在一些方面中，在第一次出血发作之前的早期阶段向受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)。

在其他方面中，在第一次出血发作之前施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的其他组合物(例如核酸、载体、细胞)防止将来再出血和关节损伤的发生。

在一些实施方案中，向受试者施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)或本公开的另一组合物(例如核酸、载体、细胞)可具有后续效应，但不限于止血、减轻疼痛和改善活动性。

还提供促进有需要的受试者的FX活化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所公开的抗体、双特异性分子、免疫缀合物、药物组合物、核酸(例如DNA或mRNA)、载体或细胞(例如宿主细胞)或其组合。

还提供一种降低有需要的受试者的出血发作的频率或程度的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所公开的抗体、双特异性分子、免疫缀合物、药物组合物、核酸(例如DNA或mRNA)、载体或细胞(例如宿主细胞)或其组合。

在一些方面中，所述受试者已经产生，有倾向产生并且有风险产生针对因子VIII(“FVIII”)的抑制剂。在一些方面中，所述针对FVIII的抑制剂为针对FVIII的中和抗体。在一些方面中，受试者正经历用FVIII的治疗，或为用FVIII治疗例如FVIII替代疗法的候选者。

在一些方面中，所述出血发作由关节积血、肌肉出血、口腔出血、大量出血、肌肉中大量出血、口腔大量出血、外伤、外伤性头痛、胃肠出血、颅内大量出血、腹内大量出血、胸内大量出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙中出血、腹膜后隙中出血、髂腰肌鞘中出血或其任何组合引起。

本公开还提供一种治疗有需要的受试者的凝血病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所公开的双特异性分子、免疫缀合物、药物组合物、核酸(例如DNA或mRNA)、载体或细胞(例如宿主细胞)或其组合。

在一些方面中，所述凝血病症为血友病A或血友病B。在一些方面中，所述受试者为人受试者。

在一些方面中，所述受试者正在经历或已历FVIII替代疗法。在一些方面中，与血友病疗法组合施用双特异性分子。在一些方面中，所述血友病疗法为FVIII替代疗法。在一些方面中，在施用血友病疗法之前、期间或之后施用双特异性分子。在一些方面中，静脉内或皮下施用所述双特异性分子。

在一些方面中，施用双特异性分子使突破性出血发作、自发性出血发作或急性出血的频率降低。在一些方面中，施用所述双特异性分子使年平均出血率降低5％、10％、20％、30％或50％。

可通过适于待治疗病状的任何途径施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)。通常，本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)为肠胃外施用，即，输注、皮下、肌肉内、静脉内或皮内施用。在一些方面中，皮下施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)。

在某些方面中，间歇地或不连续地施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)。在各种方面中，经由注射诸如皮下注射施用的本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)的剂量水平在每千克体重约0.0001mg至约100mg的范围内。

在一些方面中，施用本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)直至存在疾病进展或不可接受的毒性。

(b)诊断用途

本公开还提供可用于诊断特征在于凝血因子诸如FIX和FX的表达异常或缺乏的疾病的诊断方法。在一些方面中，诊断涉及测量来自个体的组织或体液中FIX(例如FIXa)和/或FX(例如FXz)的表达水平，并且将所测量的表达水平与正常组织或体液中FIX(例如FIXa)和/或FX(例如FXz)的标准表达水平相比较，由此表达水平相较于标准水平增加或降低指示病症。

可使用本公开的结合分子及其抗原结合片段、变体和衍生物，使用本领域的技术人员已知的经典免疫组织学方法测定FIX(例如FIXa)和/或FX(例如FXz)(参见例如，Jalkanen等人,J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；Jalkanen等人,J.Cell Biol.105:3087-3096(1987))。

可用于检测FIX(例如FIXa)和/或FX(例如FXz)蛋白质表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、免疫沉淀或蛋白质印迹法。合适的测定在本文别处有更详细地描述。

短语测定FIX(例如FIXa)或FX(例如FXz)多肽的表达水平是指直接(例如通过测定或估计绝对蛋白质水平)或相对地(例如通过与第二生物样品中疾病相关多肽水平)定性或定量地测量或估计第一生物样品中的FIX(例如FIXa)或FX(例如FXz)多肽水平。

可测量或估计第一生物样品中的FIX(例如FIXa)或FX(例如FXz)多肽表达水平并与标准FIX(例如FIXa)或FX(例如FXz)多肽水平相比较，所述标准为从未患所述病症的个体获得的第二生物样品取得或通过对未患所述病症的个体群的水平求平均值测定。如本领域中所了解，一旦已知“标准”FIX(例如FIXa)或FX(例如FXz)多肽水平，即可反复使用其作为比较标准。

本公开提供一种测量有需要的受试者体内活化FIX的水平的方法，其包括使本文所公开的抗FIXa抗体或其抗原结合部分与自所述受试者获得的样品在合适条件下接触，并且测量所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分与所述样品中的FIXa的结合。

在一个实施方案中，可使用第I类抗FIXa抗体或其抗原结合部分以相较于游离FIXa或FIX酶原测量因子X活化酶复合物中的活化FIX的水平。在另一实施方案中，可使用第IV类抗FIXz抗体或其抗原结合部分以相较于游离FIXa或因子X活化酶复合物中的FIXa测量FIX酶原的水平。在其他实施方案中，可使用第II类抗FIXa抗体或其抗原结合部分以相较于因子X活化酶复合物中的FIXa或FIX酶原测量游离FIX的水平。在一些实施方案中，可使用第III类抗FIXa抗体或其抗原结合部分以相较于FIX酶原测量活化FIX(即，游离FIXa和因子X活化酶复合物中的FIXa)的水平。

还提供一种测量有需要的受试者体内的酶原FX(FXz)的方法，其包括使第V类抗FXz抗体或其抗原结合部分与自所述受试者获得的样品在合适条件下接触，并且测量所述抗FX抗体或其抗原结合部分与所述样品中FXz的结合。在其他实施方案中，可使用第VI类抗FXa抗体或其抗原结合部分以相较于FX酶原测量活化FX的水平。在一些方面中，所述样品为血液或血清。

X.组合治疗

本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体、抗FX抗体或双特异性抗FIX/抗FX抗体)可作为唯一活性剂施用或还可与一种或多种可用于治疗各种疾病的其他药剂或治疗剂组合例如作为组合疗法施用。例如，所述其他剂可为本领域公认为可用于治疗由本文提供的双特异性抗体所治疗的疾病或病状的治疗剂。所述组合还可包括超过一种其他剂，例如两种或三种其他剂。

在某些实施方案中，所述其他药剂或治疗剂为常规用于治疗凝血或出血病症的剂。本领域的技术人员将了解常规治疗剂。在一些实施方案中，所述其他治疗剂为血友病治疗剂。示例性血友病治疗剂包括但不限于因子浓缩物替代疗法。在特定实施方案中，辅因子替代疗法为FVIII替代疗法。本领域的技术人员应了解，替代疗法可为血浆源性和/或重组FVIII替代品。在一些实施方案中，FVIII替代疗法为重组FVIII。在另一实施方案中，FVIII替代疗法为血浆源性FVIII。在各种实施方案中，所述其他药剂或治疗剂可包括例如乙酸去氨加压素、防凝块药物(例如抗纤维蛋白溶解剂)或纤维蛋白密封剂。

在某些实施方案中，所述其他药剂或治疗剂可在施用本文所述的抗体之前、期间或之后施用给受试者。在各种实施方案中，所述其他药剂或治疗剂和本文所提供的抗体可按相同给药方案施用。在一些实施方案中，所述其他药剂或治疗剂与本文所述的抗体同时施用。

在各种实施方案中，所述其他药剂或治疗剂为预防性或按需施用的。在另一实施方案中，所述其他药剂或治疗剂为作为主要治疗施用的。在其他实施方案中，所述其他药剂或治疗剂为作为次要治疗施用的。

在一些实施方案中，当本文所公开的结合分子(例如抗FIX抗体和抗FX抗体、双特异性抗FIX/抗FX抗体或免疫缀合物)与标准护理一起或作为标准护理的辅助施用时，利用本文所公开的结合分子的治疗可在开始标准疗法之前，例如在开始标准疗法之前一天、数天、一周、数周、一个月或甚至数月起始。

XI.药盒

本公开还提供可用于执行本文所述的方法的药盒，所述药盒包含本文所公开的结合分子或其抗原结合部分。在某些方面中，药盒包含(i)本文所公开的抗体、双特异性分子、免疫缀合物、药物组合物、核酸(例如DNA或mRNA)、载体或细胞(例如宿主细胞)或其组合；和(ii)使用说明书。在一些方面中，药盒在一个或多个容器中包含本文所公开的抗体、双特异性分子、免疫缀合物、药物组合物、核酸(例如DNA或mRNA)、载体或细胞(例如宿主细胞)或其组合。

在一些方面中，药盒含有执行检测测定所需和/或足够执行检测测定的所有组分，包括所有对照物、有关执行测定的指导以及用于分析并呈现结果的任何必要软件。

本领域的技术人员将易于认识到，本文所公开的抗体、双特异性分子(例如双特异性抗体)、免疫缀合物、药物组合物、核酸(例如DNA或mRNA)、载体或细胞(例如宿主细胞)或其组合可容易地并入本领域中熟知的确定药盒形式的一中。

实施例

实施例1

相较于FIX优先结合FIXa的抗体的产生

抗体选择和抗体产生的设计：从人抗体Adimab酵母文库(ADIMAB,7Lucent Drive,Lebanon,NH 03766)中选择一系列针对人活化FIX的人抗体。抗体选择使用三种不同的因子IX变体来进行：

(i)“不可活化FIX”(还缩写为FIXn)，其是这样的因子IX，其在180位(成熟序列编号)携带有精氨酸到丙氨酸的突变，由此防止因子IX活化并使因子IX维持酶原形式(FIXz)；

(ii)“游离FIXa”，其呈活化FIX形式并且据认为在未结合因子X活化酶复合物中的FVIIIa时呈活化FIX的构象；以及

(iii)“FIXa-SM”，其呈具有共价结合活性位点的底物模拟物(例如L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，即EGR-CMK)的活化FIX形式，其意图模拟活化FIX的活性最强的构象。

FIX酶原(例如不可活化FIX)、游离活化FIX和FIXa-SM(例如因子IXa+EGR-CMK)的示意图显示于图1A中。

在每一情形中，FIX序列之后为在分子C末端的GS接头和生物素化标签。当在生物素存在下与生物素连接酶BirA共表达时，所得FIX分子将携带有单一生物素标记以允许用Adimab展示文库进行选择。

使不可活化FIX在生物素存在下与BirA一起重组表达并且根据本领域中已知的方法进行纯化。游离FIXa在生物素存在下也与BirA共表达，游离FIXa是由非活化前体(FIX酶原)的表达产生的，所述非活化前体(FIX酶原)是以与不可活化FIX相同的方式进行纯化的。然后，通过在钙存在下，以1:500摩尔比添加重组凝血因子XIa使非活化FIX前体活化，并且随后根据本领域中已知的方法，通过尺寸排阻色谱法进行纯化。

向游离FIXa中添加三肽氯甲基酮(即，EGR-CMK)导致所述肽或底物模拟物和FIXa活性位点的共价连接。尽管与肽的不可逆连接中和FIXa活性，但所述复合物被认为模拟了FIXa的底物结合或活性最强构象。为产生具有共价结合活性位点的底物模拟物的活化因子IX(即，FIXa-SM)，将游离FIXa与5倍摩尔过量的肽一起在钙和30％乙二醇存在下培育六小时。通过尺寸排阻色谱法或透析移除过量的肽并通过质谱法证实活性位点的饱和。

上述实施例中使用的FIX蛋白质是根据本领域中已知的方法重组产生的。凝血因子的序列为：不可活化FIX(SEQ ID NO:773)、游离FIXa(SEQ ID NO:764的47至191和SEQ IDNO:764的氨基酸227至461)并且FIXa-SM为(具有共价结合活性位点的EGR-CMK的SEQ IDNO:764的47至191和SEQ ID NO:764的氨基酸227至461)，如表4中所示。

根据本领域中已知的方法，将所有FIX蛋白质缓冲液更换为含有5mM CaCl₂作为添加剂的Tris缓冲生理盐水。

产生一组针对FIXa的抗体，其能够相对于FIX以与FVIIIa类似的方式优先与FIXa缔合，如所述。为了产生这些类别的抗体，根据美国公布号2010/0056386和2009/0181855中所公开的方法筛选Adimab表达文库，每一篇均以引用的方式整体并入本文中。参见例如，Van Deventer和Wittrup(2014)Methods Mol.Biol.1319:3-36；Chao等人(2006),NatureProtocols 1(2):755-768；Feldhaus等人(2003)Nature Biotechnology 21(2):163-170；Boder和Wittrup(1997)Nature Biotechnology 15(6):553-557，它们均以引用的方式整体并入本文中。

在对被靶向的抗原游离FIXa和/或FIXa-SM施加数轮反复的正向选择压力并对不可活化FIX施加数轮反复的负向选择压力之后，使用本领域中已知的技术对集落进行测序以鉴别独特克隆。在抗体选择之后，使这些选择性抗体中的658种抗体表达并根据标准方法，在蛋白质A树脂上从酵母中进行纯化。随后，此时通过生物膜层干涉法(BLI)对所述658种抗体进行再次筛选，以确定它们是否相对于不可活化FIX优先结合至游离FIXa和/或模拟物结合的FIXa。

除非另外说明，否则本文所公开的BLI实验中的所有抗原均购自HaematologicTechnologies,Inc.(HTI,57River Road,Essex Junction,VT,USA)：FIXz(目录号HCIX-0040)、游离FIXa(目录号HCIXA-0050)和FIXa-SM(目录号HCIXA-EGR)。所有BLI实验均使用OctetRed94、Ocetet QK384或Octet HTX系统。关于抗体和抗原浓度以及各个步骤的温育时间的所有方法均基于制造商的推荐。基线步骤为60秒。将抗体以在100-200nM或10-15ug/mL范围内的浓度装载至抗人IgG定量探针上，保持180秒。抗原浓度在10-250nM范围内并且抗原与载有抗体的探针的缔合在90-180秒范围内。解离步骤在单独缓冲液中进行90至180秒。所有BLI实验均用包含100-200nM NaCl、25-50mM Tris pH 7.4-8.0或25-50mM Hepes pH7.4-8.0、存在或不存在0.1％BSA、存在或不存在2.5-5mM CaCl2的缓冲液中进行。有关具体实验的其他详情在以下实施例中给出。各种抗体与特定抗原的相对结合一般以“反应”或自缔合期开始至结束时纳米位移的变化报告。抗原结合反应取决于在装载期间装载至探针上的抗体量。因此，如果装载至探针上的抗体量相同并且抗原浓度和缔合期时长相同，那么所述反应是相当的。在其他情况下，可以使用ForteBio数据分析软件计算K_D。在所有情况下，均证实所述抗原与抗人IgG AHQ探针缺乏非特异性结合。

用于鉴定优先结合游离FIXa和FIXa-SM的抗体的实验类选概述示出于图2中。类选方案的详情提供于下面的“结合靶抗原的抗体的表征”和“针对生物物理特性的抗体的筛选”部分中。

所述另外的抗体类选产生可优先结合游离FIXa和/或FIXa-SM的一组93种抗体。下面提供了可变区的氨基酸和核酸序列。所述93种抗体的VH和VL的种系序列和CDR序列示出于图3A、3B、3C和图3D中(BIIB-9-1335和BIIB-9-1336除外，它们是通过下面实施例5中所示的方法获得的)。

对结合靶抗原FIXa的抗体的表征：为了鉴定在我们的初步选择中发现的抗体中相较于不可活化FIX优先结合游离FIXa的抗体，使用BLI，以单价测定格式，用150nM抗体，使用抗人IgG定量(AHQ)浸试即读生物传感器(Pall ForteBio:目录号18-5005)筛选从酵母Adimab文库中纯化的658种抗体。BLI是根据标准程序，在OctetRed94或Octet HTX系统上执行的。简单地说，在补充有5mM CaCl₂和0.1％牛血清白蛋白(TBSFCa)的Tris缓冲生理盐水中平衡生物传感器。接着将板转移至仪器。在仪器上执行浸泡步骤，并在TBSFCa中温育生物传感器60秒。接着，将生物传感器转移至含有代表性IgG(150nM在TBSFCa中)的孔中，保持180秒。之后，在TBSFCa中温育生物传感器60秒以确立基线。接着，将生物传感器转移至含有所需抗原(100nM在TBSFCa中)的孔中并温育90秒。最后，将传感器转移至单独的TBSFCa中，温育90秒。

在针对游离FIXa特异性的初步酵母文库选择中鉴定的658种抗体中，几乎所有抗体对游离FIXa的近似结合亲和力都大于对不可活化FIX的近似结合亲和力。在BLI测定中，有四种抗体(即，BIIB-9-397、BIIB-9-578、BIIB-9-612和BIIB-9-631)对不可活化FIX的亲和力大于对游离FIXa的亲和力。

针对选择中鉴定的93种抗体中的每一种，绘制在抗原缔合期之后100nM游离FIXa或不可活化FIX的最大反应值(nm)(图4A和图4B)。

对于如通过BLI所测量的对游离FIXa的结合亲和力高于对不可活化FIX的结合亲和力的抗体，其可能例如由于与人FIXa上的FIXa特有的表位或FIXa上的与FIX酶原上的相应表位明显不同的表位选择性结合而优先结合游离FIXa。换句话说，抗体与FIXa的优先结合可能例如是由与FIX酶原中缺乏的表位的结合驱动，或者是由对相同表位或其变体(例如重叠表位或构象不同的表位)的较高结合亲和力驱动。

图5示出如通过ForteBio Data Analysis 9.0软件中提供的1:1拟合算法所确定的每种所列抗体对游离FIXa的表观单价亲和力(K_D)的表格。

所分析抗体的选定子集的BLI结合曲线提供于图6A至图6E中。如通过BLI所测定的一组选定的抗体测试品对游离FIXa或不可活化FIX的近似单价亲和力列于图6F中。

预计优先识别活性较强的FIXa构象(即，FXa-SM)的双特异性抗体的活性将高于优先结合游离FIXa的抗体。

如图7中所示，根据制造商的程序，在OctetRed94或Octet HTX系统上，在利用150nM抗体的BLI单价结合测定中，进一步评估对游离FIXa的结合亲和力高于对不可活化FIX的结合亲和力的93种抗体的子集，以确定它们与100nM游离FIXa和与100nM FIXa-SM的结合。简单地说，在TBSFCa中平衡抗人IgG定量(AHQ)浸试即读生物传感器(Pall Fortebio:目录号18-5005)。接着将板转移至仪器。在仪器上执行浸泡步骤，并在TBSFCa中温育生物传感器60秒。接着，将生物传感器转移至含有代表性IgG(150nM在TBSFCa中)的孔中，保持180秒。之后，在TBSFCa中温育生物传感器60秒以确定基线。接着，将生物传感器转移至含有所需抗原(100nM在TBSFCa中)的孔中并温育90秒。最后，将传感器转移至单独的TBSFCa中，温育90秒。

观察到许多抗体与FIXa-SM的结合大于与游离FIXa的结合。有关针对与每个靶抗原缔合的BLI结合曲线的代表性实施例提供于图8A至图8E中。图8F中的表列出根据ForteBio Data Analysis 9.0软件中提供的拟合算法所测试的抗体对每个靶抗原的表观亲和力。

从意欲说明在选择中发现的抗体的特异性的BLI实验鉴别出四类抗体：

第I类：相较于游离FIXa或不可活化FIX，抗体优先结合FIXa-SM。此类别的实例有BIIB-9-460和BIIB-9-484，如图9A中所示；

第II类：相较于FIXa-SM或不可活化FIX，抗体优先结合游离FIXa，以BIIB-9-885和BIIB-9-416为代表(图9B)；

第III类：抗体近似相等地结合FIXa-SM或游离FIXa，但不与不可活化FIX明显缔合。BIIB-9-1287用作此类别的实例(图9C)；以及

第IV类：相较于游离FIXa或FIXa-SM，抗体优先结合不可活化FIX(图9D)。BIIB-9-397用作此类别的实例。

列出本文所公开的所有抗FIX抗体(例如抗FIXa抗体或抗FIXz抗体)的类别分配的表提供于图10中。

针对生物物理特性的抗体筛选：通过亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱法(affinity capture self-interaction nanoparticle spectroscopy，AC-SINS)检查93种抗FIX抗体，所述亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱法是一种微浓缩纳米粒子表面上的靶抗体以评估自缔合的测定。根据文献中所描述的方法进行AC-SINS筛选以鉴定相对于对等物具有较差生物物理特性(例如自聚集)的抗体。参见例如，Liu等人(2014)MAbs.6(2):483-92；和Wu等人(2015)Protein Engineering,Design and Selection 28:403-414，二者均以引用的方式整体并入本文中。将100μl体积初始浓度为40μg/ml的每种抗体捕获于金纳米粒子的表面上并在室温下温育两小时。在温育后，测定在一系列波长范围内的吸光度。在抗体自缔合的情况下，粒子间距离减小，使得最大吸光度的波长变大。相较于生物物理特性的内标，超过540nm的最大波长指示抗体有自相互作用的倾向。列出如通过AC-SINS所测定的93种抗FIX抗体的最大波长计算值的表示出于图11中。

实施例2

相较于FXa优先结合FX的抗体的产生

抗体选择和抗体产生的设计：为了获得相较于活化因子X(FXa)选择性结合FX酶原(例如不可活化因子X(FX))的抗体，使用三种不同因子X变体自酵母Adimab人抗体文库选择抗体：

(i)“不可活化因子X”(“FXn”)，其为在194位(成熟序列编号)带有精氨酸到丙氨酸的突变，由此防止其活化并使FX维持酶原形式的FX。此为用于BLI实验的FXz(酶原FX)。如下文所描述，产生FXn并且内部生物素化；

(ii)“游离FX”(“FXa”)，其为不含任何底物模拟物的一种形式的活化FX并且据信呈野生型活化FX构象(HTI，目录号HCXA-0060)；以及

(iii)“FXa-SM”，其呈具有共价结合活性位点的底物模拟物(例如EGR-CMK)的活化因子X形式(HTI，目录号HCXA-EGR)。在一些情况下，底物模拟物被生物素化(BEGR-CMK)并且共价结合活性位点(HTI，目录号HCXA-BEGR)。

FX酶原、游离FXa和FXa-SM(因子Xa+EGR-CMK)的示意图显示于图1B中。

不可活化FX序列之后为在分子C末端的GS接头和生物素化标签。当在生物素存在下与生物素连接酶BirA共表达时，所得FX分子带有单一生物素标记以允许用Adimab展示文库选择。

不可活化FX在生物素存在下与BirA一起重组表达并且根据本领域中已知的方法进行纯化。

与FIXa的情形相同，具有序列EGR的三肽氯甲基酮(即，EGR-CKM)可共价修饰FXa的活性位点，模拟底物结合的FXa构象。

出于阴性选择的目的，游离FXa(HTI，目录号HCXA-0060)和人FXa-SM(HTI，目录号HCXA-EGR和HCXA-BEGR)购自Haematologic Technologies Incorporated(HTI)。

根据本领域中已知的方法，将所有FX蛋白质(无论是室内制造的还是购买的)缓冲液更换为以5mM CaCl₂作为添加剂的Tris缓冲生理盐水。在本公开中，描述一组针对不可活化FX产生的抗体，所述抗体展示的与不可活化FX的结合大于与FXa(例如游离FXa或FXa模拟物)的结合(以与FVIIIa类似的方式)。

与在以上所公开的抗FIX抗体情况下相同，根据美国公布号20100056386和20090181855中所公开的方法，筛选Adimab表达文库。在数轮反复的针对靶抗原FX即不可活化FX的阳性选择压力以及针对游离FXa或FXa-SM的阴性选择压力之后，使用本领域中已知的技术对集落进行测序以鉴别独特克隆。在抗体选择之后，使超过800种抗体表达并根据标准方法，在蛋白质A树脂上自酵母纯化。用于鉴别选择性结合不可活化FX的抗体的实验类选概述于图2中。

有关类选方案第二步骤的详情提供于标题为“结合靶抗原因子X(FX)的抗体的表征”和“针对生物物理特性的抗体的筛选”部分中，参见下文。抗体类选的第二步骤产生一组94种针对FXn的抗体，其相较于活性FXa(例如野生型FXa或FXa-SM)，可优先结合FXn。可变区的氨基酸和核酸序列提供于上文。有关94种抗体中每一种的种系和CDR序列的表描绘于图12A、图12B和图12C中。

结合靶抗原因子X(FX)的抗体的表征：为了进一步确定所发现的抗体中显示与FX酶原的结合高于与FXa-SM的结合的抗体，使用生物膜层干涉法(BLI)，以单价测定形式，用200nM抗体筛选自酵母纯化的超过800种抗体。不可活化FX和FXa-SM获自HTI。游离FXa和FXa-SM在结合实验中的表现相同，并且可互换使用；因此未显示游离FXa的结果。由于针对游离FXa所呈现的数据与FXa-SM对应，所以使用FXa-SM的观察结果同样适用于游离FXa。

BLI是根据标准程序，在OctetRed94或Octet HTX系统上执行的。简单地说，在TBSFCa中平衡抗人IgG Quantitation(AHQ)浸试即读生物传感器(Pall Fortebio:目录号18-5005)。接着将板转移至仪器。在仪器上执行浸泡步骤，并在TBSFCa中温育生物传感器60秒。接着，将生物传感器转移至含有代表性IgG(200nM在TBSFCa中)的孔，保持180秒。之后，在TBSFCa中温育生物传感器60秒以确定基线。接着，将生物传感器转移至含有所需抗原(200nM在TBSFCa中)的孔并缔合90秒。最后，将传感器转移至单独TBSFCa，温育90秒。针对在选择中所鉴别的94种抗体中的每一个，绘制在缔合期后针对200nM FXn或FXa-SM的最大反应值(nm)。在针对FXn特异性的选择中所鉴别的抗体几乎全部显示对FX的结合亲和力大于对共价修饰FXa的结合亲和力(图13)。

仅BIIB-12-894、BIIB-12-925、BIIB-12-1320和BIIB-12-1321对FXa-SM展示较强结合。预期相较于活化FX(例如游离FXa或FXa-SM)优先结合FXn的抗体相较于FXa优先结合FX酶原。因此，抗FIXn抗体还可被称为抗FXz抗体。图14包括的表列出了根据ForteBio DataAnalysis 9.0软件中所提供的拟合算法得到的测试抗体对FXn的表观亲和力。

针对生物物理特性的抗体的筛选：如针对以上公开的抗FIXa抗体所描述，通过亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱法(AC-SINS)检查94种抗FXz抗体。根据文献中所描述的方法进行AC-SINS筛选以鉴别关于对等物具有较差生物物理特性(例如自缔合倾向)的抗体。参见例如Liu等人(2014)MAbs6(2):483-92。将100μl体积初始浓度为40μg/ml的抗体捕获于金纳米粒子的表面上并在室温下温育两小时。在温育后，测定在一系列波长范围内的吸光度。在抗体自缔合的情况下，粒子间距离减小，使得较高波长具有最大吸光度。相较于生物物理特性的内标，超过540nm的最大波长指示抗体有自相互作用的倾向。图15包括的表列出了如通过AC-SINS所测定的94种抗FXz抗体的最大波长计算值。

实例3

双特异性抗体的构建和在显色测定中FVIIIa样活性的评价

由实施例1和2中所述的个别抗体产生由两个不同Fab臂组成的双特异性抗体，所述Fab臂之一相较于FIX酶原优先结合活化FIX(“FXa”)(第I、II和III类抗体)并且第二Fab臂相较于FXa优先结合FX酶原(第V类抗体)。产生另外的双特异性抗体，所述抗体由相较于FIXa优先结合FIX酶原的第一Fab臂(第IV类抗体)和相较于FXa优先结合FXz(第V类抗体)或相较于FXz优先结合FXa的第二Fab臂(第VI类抗体)组成。还产生其他双特异性抗体，所述抗体由相较于FIXz优先结合FIXa的第一Fab臂(第I、II和III类抗体)和相较于FXz优先结合FXa的第二Fab臂(第VI类抗体)组成。

所公开的双特异性抗体可使用本领域中已知的方法产生，无需过多实验。参见例如，Kontermann和Brinkmann(2015)Drug Discovery Today 20:838-847和其中引用的参考文献；Spies等人(2015)Molecular Immunology 67:95-106和其中引用的参考文献；Byrne等人(2013)Trends in Biotechnology 31:621-632和其中引用的参考文献；Strop等人(2012)J.Mol.Biol.420:204-219和其中引用的参考文献；其全部以引用的方式整体并入本文中。还参见以引用的方式整体并入本文中参考文献。

双特异性抗体由两条不同重链和两条不同轻链，或两条不同重链和一条共同轻链以IgG1样形式组成。在另一小组中，所述双特异性抗体属于IgG4亚类。先在显色测定中并且其次在基于血浆的凝血测定中针对替代FVIIIa活性的能力(即，模拟FVIIIa的能力)筛选所述双特异性抗体。

测定缓冲液、磷脂、CaCl₂和FXa显色底物S-2765作为Chomogenix Coatest SP因子VIII试剂盒(目录号K824086)的一部分购自Diapharma。使用1X测定缓冲液制剂稀释所有蛋白质。在室温下，将每个双特异性抗体(25μL)与20μL稀释至750nM的FX(HTI，目录号HCX-0050)、20μL稀释至75nM的FIXa(HTI，目录号HCIXA-0050)和10μL磷脂混合。5分钟后，添加25μL CaCl₂。

又10分钟后，添加50μL底物S-2765并且每15秒在Biotek Synergy2板读取器中读取在405nM下的吸光度，持续一小时。通过每条吸光度曲线的线性部分的OD 405nM随时间的变化测定初始速率。在无FVIIIa存在下，hFIXa为仅产生少量FXa的低活性酶，如通过在405nM下的OD随时间的变化(mOD/分钟)所测量，引起基线水平的FXa底物裂解。在FXa产生测定中，在添加双特异性抗体之后，FXa底物裂解速率增加指示所述双特异性抗体能够促进FIXa对FX的活化作用(由此替代FVIIIa样功能)。使用此方法，鉴别出202种抗体，所述抗体模拟FVIIIa活性，即，其FXa底物裂解速率比未添加双特异性抗体情况下的平均基线速率(5.88mOD/分钟)高至少三个标准偏差。

图16A至图16D中显示在无双特异性抗体存在下OD随时间的变化(基线)，以及针对3种不同双特异性抗体的OD随时间的变化：BIIB-9-484/BIIB-12-915、BIIB-9-619/BIIB-12-925和BIIB-9-578/BIIB-12-917，所述抗体能够替代FVIIIa样功能。

能够替代FVIIIa样功能的全部202种IgG1双特异性抗体的速率显示于图16A至图16D中。呈IgG4-铰链形式的一小组所述抗体的速率显示于图17中。

表2.示例性双特异性抗体

实施例4

在基于血浆的凝血测定中双特异性抗体的评估

在一期血浆凝固测定中，进一步测试在显色测定中能够替代和/或模拟FVIIIa活性的双特异性抗体的替代FVIIIa样活性的能力。仅选择在上述显色测定中展示最大活性的那些双特异性抗体用于此研究。

将不同浓度的双特异性抗体(5μL)与50μL不含FVIII的血浆(Siemens)混合60秒。为活化反应，将50μL肌动蛋白FSL鞣花酸添加至反应混合物中，保持240秒，随后添加50μLCaCl₂。使用Sysmex CA-1500系统(Siemens)，通过光学检测来测量凝固时间，保持300秒。在双特异性抗体存在下凝固时间减少，明确地说凝固时间减少至基线以下达到约126秒和指示凝固时间减少的剂量反应被认为指示所述抗体能够替代FVIIIa功能并促进凝块形成。

图19显示三种此类双特异性抗体的实例：BIIB-9-484/BIIB-12-917、BII B-9-484/BIIB-12-915和BIIB-9-484/BIIB-12-1306。为了显示FVIIIa样活性是由抗体的双特异性形式引起的，利用单独抗FIXa和抗FX同二聚体，或同二聚体混合群进行相同实验，与双特异性抗体进行比较。BIIB-9-484和BII B-12-917对的结果显示于图20中。

为了确保在FXa产生和基于血浆的凝血测定中所观察的双特异性活性涉及每个靶抗原的同时缔合，在ForteBio HTX系统上，使用抗生蛋白链菌素浸试即读生物传感器(PallForteBio；目录号18-5021)进行基于BLI的实验。在补充有0.1％牛血清白蛋白和5mM CaCl₂的Tris缓冲生理盐水(在图21中称为缓冲液)中温育之后，接着将生物传感器与内部制备的生物素化FIXa-SM一起温育。随后，将生物传感器转移至含有100nM BIIB-9-484/BIIB-12-917的孔。最后，将所述生物传感器与200nM未生物素化的FX(非活化因子X)一起温育。如本文的公开内容中所说明，图21中作为实例呈现的双特异性BIIB-9-484/BIIB-12-917能够与每个靶抗原缔合。此结果支持并且符合所观察到的其功能活性。

实施例5

双特异性活性的工程化和优化

为了确定是否可通过工程化抗体:抗原相互作用改善双特异性活性，对BIIB-9-484VH的CDR1和CDR2区进行修饰以将氨基酸多样性引入种系序列中。接着将具有10⁶种BIIB-9-484序列衍生物的文库引入Adimab平台中。

为了鉴别相对于不可活化FIX，对FIXa(即，游离FXa)和FIXa-SM的亲和力提高的衍生物，根据以引用的方式整体并入本文中的美国公布号20100056386和20090181855中所公开的方法，对表达文库进行数轮反复的针对较高亲和力克隆施加选择压力而进行的选择。还参见Van Deventer和Wittrup(2014)Methods Mol.Biol.1319:3-36；Chao等人(2006),Nature Protocols 1(2):755-768；Feldhaus等人(2003)Nature Biotechnology 21(2):163-170；Boder和Wittrup(1997)Nature Biotechnology 15(6):553-557，其全部以引用的方式整体并入本文中。

随后，根据本领域中已知的方法，对集落进行测序以鉴别独特衍生物。此程序鉴别出至少76种独特VH序列。使76种抗体表达并且根据本领域中的标准程序，通过蛋白质A纯化自酵母纯化。

接着，此时使用BLI，以单价测定形式利用200nM抗体针对与靶抗原游离FIXa(HTI)或FIXa-SM(HTI)的结合的改善再筛选来自亲本BIIB-9-484的76种独特衍生物抗体。BLI是根据制造商的程序，在Octet HTX系统上进行的。简单地说，在TBSFCa中平衡抗人IgGQuantitation(AHQ)浸试即读生物传感器(Pall Fortebio:目录号18-5005)。接着将板转移至仪器。在仪器上执行浸泡步骤，并在TBSFCa中温育生物传感器60秒。接着，将生物传感器转移至含有代表性IgG(100nM在TBSFCa中)的孔，保持180秒。之后，在TBSFCa中温育生物传感器60秒以确定基线。接着，将生物传感器转移至含有所需抗原(10nM在TBSFCa中)的孔并缔合90-180秒。最后，将传感器转移至单独TBSFCa，温育180秒。

至少两种BIIB-9-484衍生物(分别命名为BIIB-9-1335和BIIB-9-1336)展示在10nM抗体的浓度下与靶抗原的结合相对于亲本抗体明显改善。与BIIB-9-484重链CDR1和CDR2区的偏差标注于图22A中。公开了所述两种衍生物的BLI结合曲线，展现所观察到的与靶抗原(即，游离FIXa)的较强结合(图22B至图22D)。下文提供BIIB-9-484、BIIB-9-1335和BIIB-9-1336的修饰VH区的氨基酸和核酸序列。

通过在一期凝血测定中比较每个双特异性抗体(含有亲本抗FIXa臂或具有恒定抗FX臂的亲和力成熟抗FIXa臂)替代FVIIIa活性的能力来测试增加双特异性抗体抗FIXa臂的亲和力的影响。如实施例4中所解释进行实验。一个此类实例显示于图23中，其中双特异性抗体(BIIB-12-917)的抗FX臂与BIIB-9-484抗FIXa臂，或与抗FIXa臂的亲和力成熟子代(BIIB-9-1335和BIIB-9-1336)配对(图23)。含有亲和力成熟抗FIXa臂相对于含有亲本抗FIXa臂的双特异性抗体凝固时间的进一步降低指示，增加抗FIXa臂的亲和力引起所得双特异性抗体的活性增加。

实施例6

有关针对FVIII的FVIIIa模拟性双特异性抗体用于血友病A治疗的基准分析

使用多种活性测定，将参考双特异性抗体(bsAb)和本公开的双特异性抗体BS-027125与重组FVIII(rFVIII)进行比较。bsAb BS-027125包含BIIB-9-1336和BIIB-12-917。参考双特异性抗体具有与ACE910/艾美赛珠单抗(“艾美赛珠单抗生物类似药”)相同的序列；ACE910为结合活化因子IX和因子X并且模拟因子VIII(FVIII)的辅因子功能的重组人源化双特异性抗体。ACE910公开于美国专利号8,062,635中，其以引用的方式并入本文中。艾美赛珠单抗生物类似药和BS-027125分别描绘于图24A和图24B中。艾美赛珠单抗生物类似药结合因子IX酶原、因子IXa、因子X酶原和因子Xa中的每一个，K_d为约1μM(图24A)。BS-027125也结合因子IX酶原(K_D＝8nM)、因子IXa(K_D＝2nM)和因子X酶原(K_D＝20nM)，但不结合因子Xa(图24B)。因此，相较于艾美赛珠单抗生物类似药，BS-027125对活化因子IX和/或因子X酶原具有较高亲和力和较大特异性。

如上文所公开，使用Adimab活体外酵母呈递平台，利用基于FACS的选择随后进行亲和力成熟来设计BS-027125。通过将使用Adimab鉴别的>200种对FIXa具有特异性的独特抗体和>250种对FX具有特异性的独特抗体设计成bsAb形式来产生初始bsAb池。BS-027125的亲本抗体BS-027025在此初始bsAb池中具有最高FVIIIa样活性，在一期凝血测定中维持显著活性。如图25中所描绘，BS-027025在所述测定中显著缩短凝固时间，接近重组因子VIII的活性。如表3中所示，BS-027025结合因子XI酶原(K_D＝370nM)、因子IXa(K_D＝67nM)、因子IXa-LTR(K_D＝10.5nM)和因子X酶原(K_D＝20nM)，但不结合因子IXa。

表3.

BS-027025的抗FIXa臂的亲和力成熟产生bsAb BS-027125。增加抗FIXa臂的亲和力(BS-025到BS-125)使所得双特异性抗体的FXa产生速率增加，特别是当与BS-027或BS-007组分配对形成双特异性抗体时。(数据未显示)进一步测试指示，如通过一期凝血测定所测定，BS-027125实现约90％的FVIIIa样活性(图26)。

通过显色因子Xa(FXa)产生测定(图27)、用因子XIa触发的凝血酶产生测定(图28A和图28B)和用肌动蛋白FSL触发的活化部分凝血活酶时间(aPTT)(图26)测量BS-027125、其对应二价同二聚体和rFVIII的活性。

尽管参考bsAb在所有测定中均具有较高活性，但其达到峰值活性的浓度在各测定之间完全不同。BS-027125也在所有测定中展示活性，并且在aPTT中具有高活性。对于所述两种bsAb，在凝血酶产生测定中的滞后时间和峰高度与rFVIII活性的不同水平相关。两种参考bsAb二价同二聚体在若干测定中均展现显著活性，但仅BS-027125FIXa二价同二聚体在FXa产生测定中保持适度活性。如所预期，在FXa产生测定中，rFVIII在无磷脂存在下失去所有活性。BS-027125还显示极低的不依赖于磷脂的活性。相比之下，参考bsAb在无磷脂存在下具有非常显著的活性。

实施例7

磷脂组成对双特异性FVIIIa模拟抗体活性的影响

作为因子X活化酶复合物的一部分，活化因子VIII(FVIIIa)结合细胞膜上暴露的磷脂酰丝氨酸(PS)并与活化因子IXa和因子X组装在一起。已显示，FVIIIa优先结合含有PS(磷脂酰丝氨酸)和磷脂酰乙醇胺(PE)的磷脂。已显示，磷脂酰胆碱(PC)磷脂囊泡中磷脂酰乙醇胺(PE)的存在减少获得最佳凝血因子活性所需的PS的量，而仅由PS和PC构成的囊泡需要较高水平的PS来实现最佳活性。近期，已开发出FVIIIa模拟性双特异性抗体(艾美赛珠单抗)作为在存在和不存在抑制剂的情况下针对血友病A患者的潜在治疗方法。相对于艾美赛珠单抗，FVIII模拟性双特异性抗体BS-027125具有改良的靶特异性。鉴于磷脂组成影响因子X活化酶活性并且抗体不直接结合磷脂，所以尚不清楚FVIIIa模拟抗体是否将显示类似的磷脂偏好。

比较不同的磷脂组成和浓度对实施例6中所示的参考bsAb、本公开的双特异性抗体BS-027125和重组FVIII(rFVIII)的活性的影响。

通过用因子XIa触发的凝血酶产生测定评估参考bsAb、BS-027125和rFVIII的促凝血活性。如Mui B等人,Methods Enzymol,2003中所述，通过挤出来制备单层磷脂囊泡。所测试的合成磷脂囊泡由PS(磷脂酰丝氨酸)/PE(磷脂酰乙醇胺)/PC(磷脂酰胆碱)(20％/40％/40％)或PS/PC(20％/80％)构成。

如所预期，在含PE的磷脂上rFVIII活性高约2.5倍并且当为极限或极大过量时，在两种磷脂上活性均丧失。值得注意的是，尽管在两种磷脂上参考bsAb活性类似，但在含PE的磷脂上BS-027125的活性高约3倍。参考bsAb和BS-027125的支持峰值活性的磷脂浓度比rFVIII高。所述结果表明，参考bsAb和BS-027125经由不同机制起作用。

对于rFVIII和BS-027125，在含PE的磷脂上活性增加的趋势在FXa产生测定与凝血酶产生测定之间得以保持。参见图29。不过Emi-bsim的活性在FXa产生中增加，但在凝血酶产生中不增加。参见图30。rFVIII与FVIIIa模拟性双特异性抗体在不同磷脂表面上不同的相对活性使所述分子之间的直接比较变得复杂，并突显出在基准分析FVIIIa模拟性双特异性抗体对于rFVIII的活性时测定设计的影响。所述数据进一步表明Emi-bsim与BS-027125之间作用机制的差异。

实施例8

抗FIXa抗体的表位分箱

为了确定各种抗FIXa抗体对是否结合独特位点，遵循制造商的说明书，使用生物膜层干涉法，在Octet HTX系统上进行分箱实验。简单地说，在TBSFCa中平衡抗人IgGQuantitation(AHQ)浸试即读生物传感器(Pall Fortebio:目录号18-5005)，保持60秒。随后，在180秒内将第一抗体(200nM在TBSFCa中)装载至生物传感器尖端上，随后在单独缓冲液中执行基线步骤，保持60秒。

用非特异性IgG阻断保留在探针上的任何游离结合位点，保持180秒，随后在单独缓冲液中进行另一基线步骤，保持60秒。接下来，使FIXa+SM(100nM在TBSFCa中)结合载有抗FIXa抗体的探针，保持90秒。最后，使第一抗体与FIXa+SM的复合物暴露于第二抗FIXa抗体(200nM在TBSFCa中)。

信号的进一步增加指示，抗体1和抗体2可同时结合抗原，并且其为非竞争性的，意味着其不在同一组中(图31A)。然而，如果未观察到信号进一步增加，那么此指示抗体1和抗体2可能不同时结合抗原并且因此认为其竞争，意味着其在同一组中(图31B)。

如果仅在一个方向上(即，抗体1-抗原-抗体2对比抗体2-抗原-抗体1)观察到抗体1与2的同时结合，那么认为此为单向冲突。

选择一小组48种抗体进行此分析并且结果概述于图31C中。少数抗体由于数据收集误差或由于给定抗体不结合FIXa+SM(例如，因为其对FIXa具有特异性)而结束分析。

对分箱网络进行节点分析以提供每个FIXa抗体在其分箱特征方面的接近程度的视觉呈现(图31D)。大多数抗体彼此非常接近地群集，但存在少数不同组。BIIB-9-484看来在独特组中。

实施例9

BIIB-9-484和BIIB-9-1336的钙依赖性结合

由于BIIB-9-484的独特分箱特征，研究此抗体以及亲和力成熟子代BIIB-9-1336的其他特性。由于包括FIXa在内的许多凝血因子的活性和结合特性均依赖于钙，所以首先使用生物层干涉法(BLI)，测试所述两种抗体的结合是否受钙存在或不存在影响。

使用Octet QK384系统，在HBS中平衡抗人IgG Quantitation(AHQ)浸试即读生物传感器(Pall Fortebio:目录号18-5005)，保持60秒，随后进行180秒将10ug/mL抗体装载至探针上的步骤。在HBS中的60秒基线步骤之后，使载有抗体的探针暴露于含200nM FIXa的HBS或具有5mM CaCl2的HBS，保持180秒，随后在单独HBS或含5mM CaCl2的HBS中进行解离步骤，保持180秒。

图32A和图32B中所示的结合数据指示，BIIB-9-484和BIIB-9-1336与FIXa的结合均为钙依赖性的。BIIB-9-484完全依赖于钙的存在，而在无钙存在下，BIIB-9-1336与FIXa的结合显著较低，但仍可测量。

实施例10

BIIB-9-1336对FIXa的蛋白水解活性的影响

为了确定BIIB-9-1336是否影响FIXa的酶功能，将不同量的抗体与含250nM FIXa的TBSCa一起温育5分钟。随后，添加肽底物ADG299达到0.8mM的最终浓度并且通过OD随时间的变化测量FIXa的底物裂解速率(图33A)。

为了比较，还测试另一抗FIXa抗体BIIB-9-579以及作为阴性对照物的抗FX抗体BIIB-12-917影响FIXa的酰胺水解活性的能力。BIIB-9-1336能够使FIXa的底物裂解速率增加3倍，而BIIB-9-579和BIIB-12-917没有影响。

此活性与BIIB-9-1336的同二聚体性质无关，因为仅含一个BIIB-9-1336臂的单臂并且双特异性抗体显示相同的3倍速率增加。由于BIIB-9-1336为BIIB-9-484的子代并且归于同一独特组中，所以继续测试所述组中其他抗体增加FIXa的酰胺水解活性的能力。使用与上述相同的测定设置，不过使用500nM FIXa，测试来自BIIB-9-484/1336组的15种抗体以及来自属于不同组的BIIB-9-619和BIIB-9-578的另外11种子代抗体。

在所述抗体存在下FIXa的酰胺水解活性的倍数增加显示于图33B中，并且指示增加FIXa的酰胺水解活性的能力为来自BIIB-9-484/BIIB-9-1336组的抗体特有的，在测试条件下达到最高5倍增加。接下来，测定在存在和不存在BIIB-9-1336下FIXa对ADG299的动力学参数KM和Vmax。此处将500nM FIXa与1000nM BIIB-9-1336一起在TBSCa加33％乙二醇中温育。底物ADG299的浓度从10mM至0.078mM变化。添加BIIB-9-1336使KM从4.4mM降低至3.4mM并且使Vmax从500mOD/min增加至588mOD/min(图33C和图33D)。

BIIB-9-1336/BIIB-12-917和单臂BIIB-9-1336使酰胺水解活性增加至与同二聚体二价BIIB-9-1336类似的程度的能力指示，此活性是由一个BIIB-9-1336臂与FIXa之间的单价相互作用引起的。

实施例11

BIIB-9-1336对ATIII抑制FIXa的影响

抗凝血酶III为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂并且导致在ATIII与FIXa活性位点丝氨酸之间不可逆键的形成。因此，抑制机制依赖于FIXa活性位点的反应性。由于BIIB-9-1336能够增加FIXa的酰胺水解活性，所以显然其应当还增加ATIII抑制FIXa的速率。为了测试此观点，在存在或不存在1500nM BIIB-9-1336或BIIB-9-1335下，在TBSCa中温育500nM FIXa与5000nM ATIII，BIIB-9-1335为在BIIB-9-484的亲和力成熟期间所鉴别的另一抗FIXa抗体。在1、30、60和120分钟时取出样品并与非还原性SDS上样缓冲液混合并在4-20％BioRad无染色剂凝胶上跑胶(图34A)。

在接近75kDa分子量标记物处出现的谱带指示形成ATIII-FIXa复合物。对相对谱带强度定量并随时间推移绘图(图34B)并且显示BIIB-9-1335和BIIB-9-1336能够使ATIII抑制FIXa的速率增加约3倍。

实施例12

FIXa上BIIB-9-1336表位的表征

为了进一步了解BIIB-9-484和BIIB-9-1336与FIXa的相互作用，试图确定所述抗体的确切表位。为此，首先使用标准方法克隆、表达和纯化每一所述抗体的单独Fab部分。随后，在含钙缓冲液中，将每一Fab与FIXa以1.5:1摩尔比混合并使用尺寸排阻色谱法从过量Fab中纯化出所得复合物。

使用蒸气扩散方法，在可商购的结晶筛选器上筛选所得1:1复合物。尽管两种复合物均产生晶体，但只有BIIB-9-1336复合物晶体产生高质量衍射数据。使用标准方法，通过分子置换解析所得到的在BIIB-9-1336Fab与FIXa之间的结构，并且显示于图35中。

FIXa上构成BIIB-9-1336表位的残基在图36中以黑色显示，并且为了比较，还显示出FIXa上构成FVIIIa结合位点的残基。所述相同残基在图37的表中列出。

所述数据揭露，BIIB-9-1336和FVIIIa在FIXa上共有重叠表位。共有残基在图36中以白色绘出并且在图37中加下划线并且以粗体显示。

实施例13

FX上BIIB-12-917表位的表征

由于BIIB-12-917在与BIIB-9-484或BIIB-9-1336配对时形成具有高FVIIIa样活性的高产双特异性抗体，所以尝试表征在FX上BIIB-12-917的表位。使用BLI，测试BIIB-12-917与一组不同的重组FX变体包括野生型酶原FX(FXz)、野生型活化FX(FXa)、保持活化肽的活化FX(FXa+AP)、不含活化肽的酶原FX(FX-AP)和含有来自FX的活化肽的酶原FIX(FIX+FXAP)的结合。所述变体的示意性表示提供于图38B中。

使用Octet QK384，在HBSCa中平衡抗人IgG Quantitation(AHQ)浸试即读，保持60秒，随后进行180秒将15ug/mL抗体装载至探针上的步骤。在HBSCa中的60秒基线步骤之后，使载有抗体的探针暴露于含250nM每一FX变体的HBSCa，保持300秒，随后在HBSCa中进行解离步骤，保持180秒。图38A中的结合数据显示，BIIB-12-917结合含有FX活化肽的所有构建体，但不结合不含活化肽的构建体。因此，BIIB-12-917的表位在FX活化肽内。

实施例14

新抗FIXa抗体

通过将氨基酸多样性引入CDR H1和CDR H2；或CDR H3；或CDR L1、CDR L2和CDRL3；或其组合中，产生衍生自BIIB-9-484、BIIB-9-1336、BIIB-9-578或BIIB-9-619的一系列抗体。使用实施例1和5中所述的方法，从所述文库鉴别出具有增加的FIXa特异性和/或亲和力的抗体。所述抗体的VH和VL结构域序列以及其CDR提供于下表6和7中。

实施例15

在人源化小鼠血友病A模型中双特异性抗体的药代动力学和药效学

在人源化小鼠血友病A模型中进行双特异性抗体的临床前药代动力学评估。使用胚胎干细胞基因靶向，经由同源重组将人FIX和人FX基因分别敲入每个对应的小鼠基因座中。随后，通过CRISPR/Cas9技术编辑人FIX基因敲入小鼠的FVIII基因以产生FVIII基因敲除种。在人FIX基因敲入种与人FX基因敲入种之间的杂交育种将产生关于人FIX和人FX为纯合型的小鼠(FIX-X-KI)。此小鼠模型可用于建立血栓形成模型，诸如下腔静脉停滞模型或颈动脉氯化铁损伤模型。在缺乏小鼠FVIII基因的人FIX基因敲入种与人FX基因敲入种之间的杂交育种将产生关于人FIX、人FX为纯合型并且缺乏FVIII的小鼠(FIX-X-KI/FVIII-def)。此小鼠模型可用于建立止血模型，诸如断尾模型和尾静脉横断模型。

在所述实验中，向FIX-X-KI/FVIII-def小鼠给药一系列量的双特异性抗体、对照抗体、rFVIII和/或分流疗法诸如rFVIIa或活化凝血酶原复合物浓缩物(aPCC)。根据分子并且根据时间点向各组小鼠给药。在给药后的每个时间点，对小鼠实施安乐死并收集血液。一部分血液用于旋转血栓弹性检测(rotational thromboelastometry，ROTEM)或其他基于活性的测定，并且其余血液被处理成血浆以通过ELISA测定双特异性抗体的循环水平。

实施例16

在人源化小鼠血友病A模型中双特异性抗体的功效

利用断尾出血模型测定双特异性抗体的急性功效，在所述模型中，切除尾尖并且如先前所描述(Dumont等人,2012,Blood,119(13):3024-3030)测量给药了一系列量的双特异性抗体、对照抗体、rFVIII和/或分流疗法诸如rFVIIa或aPCC的FIX-X-KI/FVIII-def小鼠的总失血量。如先前所描述(Pan等人,2009,Blood,114(13):2802-2811)，利用尾静脉横断模型测定双特异性抗体的长期功效。简单地说，向FIX-FX-KI/FVIII-def小鼠给药一系列量的双特异性抗体、对照抗体、rFVIII和/或分流疗法诸如rFVIIa或aPCC，并在给药后24小时，将其麻醉并进行尾静脉横断。记录下出血时间并将小鼠放回笼中，保持最多24小时，此时评估其再出血情况、总体反应性、活动性和存活率百分比。

实施例17

在人源化小鼠模型中双特异性抗体的安全性评估

使用血栓形成模型评估双特异性抗体的潜在促血栓形成特性。建立下腔静脉停滞模型(Aleman等人,2014,J Clin Invest,124(8):3590-3600)或颈动脉氯化铁损伤模型(Machlus等人,2011,Blood,117(18):4953-4963)。简单地说，对于下腔静脉模型，将FIX-FX-KI小鼠麻醉，给药一系列量的双特异性抗体、对照抗体、rFVIII和/或分流疗法诸如rFVIIa或aPCC，并进行无菌剖腹术以完全结扎下腔静脉。24小时后，对小鼠实施安乐死并测量血栓重量。对于颈动脉氯化铁损伤模型，将FIX-FX-KI小鼠麻醉并给药一系列量的双特异性抗体、对照抗体、rFVIII和/或分流疗法诸如rFVIIa或aPCC。用10％氯化铁溶液损伤颈动脉。通过Doppler超声监测血流变化并记录下颈动脉闭塞的时间。

实施例18

在食蟹猕猴中双特异性抗体的药代动力学和药效学

如所描述(Dumont等人,2015,Thromb Res,136(6):1266-1272)，还在食蟹猕猴中进行双特异性抗体的药代动力学和药效学评估。简单地说，将开发获得性血友病A模型，诸如Muto等人,2014,Blood,124(20):3165-3171中所描述。向患血友病的猴给药一系列量的双特异性抗体、对照抗体、rFVIII和/或分流疗法诸如rFVIIa或aPCC。在给药后的一系列时间点，收集血液样品。一部分血液将用于ROTEM分析或其他基于活性的测定，并且其余血液将被处理成血浆以通过ELISA测定双特异性抗体的循环水平。

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应理解，具体实施方式部分但不是发明内容和摘要部分意欲用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可陈述一个或多个但不是如本发明人所预期的本发明的全部示例性实施方案，并且因此不意欲以任何方式限制本发明和所附权利要求。

以上已藉助于说明指定功能和及关系的实施方式的功能建立区块描述本发明。为便于描述，所述功能建立区块的边界在本文中是任意界定的。可界定替代边界，只要适当执行指定功能及其关系即可。

特定实施方案的前文描述将充分地揭示本发明的一般特性，以使得其他人通过应用本领域中的知识，在无过多实验并且不背离本发明的一般概念的情况下，可轻易地针对各种应用对此类特定实施方案进行修改和/或改编。因此，基于本文所呈现的教导和指导，此类改编和修改意欲在所公开的实施方案的含义和等效内容范围内。应了解，本文的措辞或术语是出于描述而非限制的目的的，由此本说明书的术语或措辞应由本领域的技术人员根据教导和指导进行解释。

本发明的宽度和范围不应受上述任何示例性实施方案限制，而应当仅根据以下权利要求及其等效内容界定。

在本申请案通篇引用的所有引用的参考文献(包括文献参考、专利、专利申请和网页)的内容以及其中引用的参考文献均出于任何目的以全文引用的方式清楚地并入本文中。

表4.序列

表5.CDR的SEQ ID NO名称

表6：实施例14子代抗体的序列

(aa)＝氨基酸序列；(nt)＝核苷酸序列

表7：实施例14子代抗体的CDR

Claims

1.一种特异性结合活化因子IX(FIXa)的分离抗体或其抗原结合部分(“抗FIXa抗体或其抗原结合部分”)，其中所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分在FIXa和因子IX酶原(FIXz)存在下优先结合FIXa，或其中所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXa的结合亲和力高于所述抗FIXa抗体或其抗原结合部分结合FIXz的结合亲和力。

2.如权利要求1所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由图3A、图3B和图3C中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争或与所述参考抗体结合相同表位。

3.如权利要求3所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其中所述表位包含FIXa重链序列的胰凝乳蛋白酶原编号的氨基酸残基H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240和K241，或其组合。

4.如权利要求1至3所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中(i)所述VH CDR1包含选自由图3A、图3B和图3C中的VH CDR1，SEQ ID NO:2058至2063组成的组的VH CDR1或具有一个或两个突变的VH CDR1；并且/或者(ii)所述VH CDR2包含选自由图3A、图3B和图3C中的VH CDR2，SEQ ID NO:2084至2089组成的组的VH CDR2或具有一个或两个突变的VH CDR2；并且/或者(iii)所述VH CDR3包含选自由图3A、图3B和图3C中的VH CDR3，SEQ ID NO:2084至2089组成的组的VH CDR3或具有一个或两个突变的VHCDR3；并且/或者其中(iv)所述VL CDR1包含选自由图3A、图3B和图3C中的VL CDR1，SEQ IDNO:2136至2141组成的组的VL CDR1或具有一个或两个突变的VL CDR1；并且/或者(v)所述VL CDR2包含选自由图3A、图3B和图3C中的VL CDR2，SEQ ID NO:2162至2167组成的组的VLCDR2或具有一个或两个突变的VL CDR2；并且/或者(vi)所述VL CDR3包含选自由图3A、图3B和图3C中的VL CDR3，SEQ ID NO:2188至2193组成的组的VL CDR3或具有一个或两个突变的VL CDR3。

5.如权利要求1至4所述的抗FIXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中(a1)VH和VL分别包含SEQ ID NO:31和221(BIIB-9-484)；(a2)VH和VL分别包含SEQ ID NO:19和209(BIIB-9-440)；(a3)VH和VL分别包含SEQ ID NO:115和301(BIIB-9-882)；(a4)VH和VL分别包含SEQ ID NO:23和213(BIIB-9-460)；(a5)VH和VL分别包含SEQ ID NO:127和313(BIIB-9-433)；(a6)VH和VL分别包含SEQ ID NO:45和235(BIIB-9-619)；(a7)VH和VL分别包含SEQID NO:185和371(BIIB-9-578)；(a8)VH和VL分别包含SEQ ID NO:87和221(BIIB-9-1335)；或者(a9)VH和VL分别包含SEQ ID NO:89和221(BIIB-9-1336)。

6.一种特异性结合因子X酶原(FXz)的分离抗体或其抗原结合部分(“抗FXz抗体或其抗原结合部分”)，其中所述抗FXz抗体或其抗原结合部分在FXz和活化因子X(FXa)存在下优先结合FXz。

7.如权利要求6所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其与选自由图12A和图12B中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争或与所述参考抗体结合相同表位。

8.如权利要求6或权利要求7所述的抗FXz抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中(b1)VH和VL分别包含SEQ ID NO:423和611(BIIB-12-915)；(b2)VH和VL分别包含SEQ IDNO:427和615(BIIB-12-917)；或者(b3)VH和VL分别包含SEQ ID NO:455和643(BIIB-12-932)。

9.一种特异性结合活化因子X(FXa)的分离抗体或其抗原结合部分(“抗FXa抗体或其抗原结合部分”)，其中所述抗FXa抗体或其抗原结合部分在FXz和FXa存在下优先结合FXa，并且/或者结合FXa的结合亲和力高于所述抗体或其抗原结合部分结合FXz的结合亲和力。

10.如权利要求9所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其与选自由图12C中的抗体组成的组的参考抗体交叉竞争，或与选自由图12C中的抗体组成的组的参考抗体结合相同表位。

11.如权利要求9或权利要求10所述的抗FXa抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:559和747(BIIB-12-925)。

12.一种双特异性分子，其包含如权利要求1至5中任一项所述的抗FIX抗体或其抗原结合部分和/或(ii)如权利要求6至11项中任一项所述的抗FX抗体或其抗原结合部分。

13.一种核酸，其编码如权利要求1至12中任一项所述的抗体。

14.一种药物组合物，其包含如权利要求1至12中任一项所述的抗体和如权利要求13所述的核酸，以及药学上可接受的载剂。

15.如权利要求1至12中任一项所述的抗体、如权利要求13所述的核酸或如权利要求14所述的药物组合物，其用于治疗。