JP2009502180A - 多糖シンターゼ - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(i)同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した(1,3;1,4)−β−D−グルカンレベル;
(ii)同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼのレベルおよび/または活性;
(iii)同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現
のうち、いずれか1以上を示す細胞を提供する。
(i)本発明の第8の態様に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉;および
(ii)任意により、1以上の他の穀粒を製粉することにより製造されたる穀粉
を含んでなる穀粉も提供する。
(i)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11のいずれかにより表されるヌクレオチド配列;
(ii)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11のいずれかにより表されるヌクレオチド配列に対して少なくとも50%同一なヌクレオチド配列;
(iii)低ストリンジェンシー、より好ましくは中程度のストリンジェンシーおよび最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11のいずれかにより表されるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列;
(iv)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12のいずれかにより表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(v)(i)〜(iv)のいずれか1つに記載のものの相補体であるヌクレオチド配列;
(vi)(i)〜(iv)のいずれか1つに記載のものの逆相補体であるヌクレオチド配列;
(vii)(i)〜(iv)のいずれか1つの断片
のうち、いずれか1以上を含む、単離された核酸分子も提供する。
(i)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12のいずれかにより表されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12のいずれかにより表されるアミノ酸配列に対して少なくとも50%の同一性を示すアミノ酸配列;
(iii)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11のいずれかにより表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列;ならびに/または
(iv)(i)、(ii)もしくは(iii)のいずれか1つの断片
のうち1以上を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
以下の説明は、特定の実施形態のみを説明することを目的とするが、上記の説明に関する限定であることを意図しないと理解されるべきである。
(i)本明細書において定義される(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸分子;ならびに
(ii)好ましくは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31および配列番号33のいずれかにより表されるヌクレオチド配列に対して少なくとも50%同一なヌクレオチド配列を含む、核酸分子;ならびに/または
(iii)好ましくは、ストリンジェントな条件下で、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31および配列番号33のいずれかにより表されるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子
を含むと理解されるべきである。
(i)ノックアウト構築物との相同組み換えによる細胞中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸のノックアウトまたはノックダウンを含む、細胞中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸の挿入突然変異(植物での標的遺伝子破壊の例としては、Terada他、Nat. Biotechnol. 20: 1030-1034, 2002を参照);
(ii)細胞中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸の転写後遺伝子抑制(PTGS)またはRNAi(PTSGおよびRNAiの総説については、Sharp, Genes Dev. 15(5): 485-490, 2001、およびHannon, Nature 418: 244-51, 2002を参照);
(iii)細胞中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸を標的とするアンチセンス構築物を有する細胞の形質転換(植物のアンチセンス抑制の例については、v van der Krol、他、Nature 333: 866-869、van der Krol、他、BioTechniques 6: 958-967、 およびvan der Krol、他、Gen. Genet. 220: 204-212を参照);
(iv)細胞中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸に方向付けられたコサプレッション構築物を有する細胞の形質転換(植物のコサプレッションの例については、van der Krol、他、Plant Cell 2(4): 291-299を参照);
(v)細胞中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸を標的とする二本鎖RNAをコードする構築物を有する細胞の形質転換(dsRNA介在遺伝子抑制の例については、Waterhouse、他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964, 1998を参照);および
(vi)細胞中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸を標的とするsiRNAまたはヘアピンRNAをコードする構築物を有する細胞の形質転換(siRNAまたはヘアピンRNA介在遺伝子の例については、Lu、他、Nucl. Acids Res. 32(21): e171、doi:10.1093/nar/gnh170, 2004を参照)
などの方法による細胞中での内在性(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸のノックアウトまたはノックダウンなどの方法を容易にする。
(i)同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した(1,3;1,4)−β−D−グルカンレベル;
(ii)同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼのレベルおよび/または活性;
(iii)同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現
のうち、いずれか1以上を示す細胞を提供する。
(i)本発明の第8の態様に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉;および
(ii)任意により、1以上の他の穀粒を製粉することにより製造される穀粉
を含んでなる穀粉も提供する。
(i)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11のいずれかにより表されるヌクレオチド配列;
(ii)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11のいずれかにより表されるヌクレオチド配列に対して少なくとも50%同一なヌクレオチド配列;
(iii)低ストリンジェンシー、より好ましくは中程度のストリンジェンシーおよび最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11のいずれかにより表されるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列;
(iv)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12のいずれかにより表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(v)(i)〜(iv)のいずれか1つに記載のものの相補体であるヌクレオチド配列;
(vi)(i)〜(iv)のいずれか1つに記載のものの逆相補体であるヌクレオチド配列;
(vii)(i)〜(vi)のいずれか1つの断片
のうち、いずれか1以上を含む、単離された核酸分子も提供する。
(i)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12のいずれかにより表されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12のいずれかにより表されるアミノ酸配列に対して少なくとも50%の同一性を示すアミノ酸配列;
(iii)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11のいずれかにより表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列;ならびに/または
(iv)(i)、(ii)もしくは(iii)のいずれか1つの断片
のうち1以上を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
オオムギ穀粒の(1,3;1,4)−β−D−グルカン含有量の自然変動による候補遺伝子の特定
比較マッピングの研究により、イネ科の種の染色体に沿う遺伝子順序の高レベルの保存があることが明らかにされてきたが、このレベルでのマクロな直線性から、遺伝子の存在または順序を必ずしも予測できるわけではない。それにもかかわらず、メガ塩基対レベルでの共直線性は、遺伝子のポジショナルクローニングのために、分子マーカーの開発のために、モデル生物種のシンテニー領域を基準とすることにより、1つの種における当該形質に影響を及ぼす候補遺伝子を特定するために不可欠である。したがって、このアプローチを、穀類の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼの候補遺伝子を特定するために採用した。
(i)植物組織
組織は、高湿度、光強度300umol/m/sおよび11/13時間の昼夜レジームのもと、日中28℃および夜間22℃の温度で成長させた、成熟させたイネ(Oryzae sativa cv Nippon Bare)から収集された。材料は、シャーレのなかで湿ったろ過紙上で28℃にて発芽させた成長5日目の苗からも収集された。
オオムギ (1,3;1,4)−β−D−グルカンのQTLに基づくマーカーのDNA配列は、GrainGenesデータベース(http://wheat.pw.usda.gov)から得た。Barley−Consensus2(Qi、他、Genome 39: 379-394, 1996)およびBarley−Consensus2003(Karakousis、他、Australian Journal of Agricultural Research 54: 1173-1185, 2003)マップも調査に含まれた。イネゲノム上のマーカーのシンテニーの染色体位置は、GRAMENEウェブサイト(http://www.gramene.org)BLASTN分析により判定された。シンテニー領域は、細胞壁多糖類の合成をコードする酵素の遺伝子注釈について調べられた。オオムギ第2H染色体上の(1,3;1,4)−β−D−グルカンのQTLピークに相当するイネ第7染色体上の領域について徹底的な分析を行い、さらに分析した結果、6個の同一箇所に位置するCslF遺伝子が同定された。
イネCslF遺伝子でのシロイヌナズナの形質転換
(1,3;1,4)−β−D−グルカン合成におけるイネOsCslF遺伝子の考えられる役割は、トランスジェニックシロイヌナズナ植物体でのゲイン・オブ・ファンクションにより試験された。シロイヌナズナ細胞壁は、(1,3;1,4)−β−D−グルカンを含んでおらず、シロイヌナズナゲノムは、既知のCslF遺伝子を含んでいない。したがって、イネOsCslF遺伝子を有するトランスジェニックシロイヌナズナの細胞壁での(1,3;1,4)−β−D−グルカンの沈着は、導入された遺伝子が(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードすることを示唆する。このアプローチは、(1,3;1,4)−β−D−グルカン合成に必要な任意の前駆体、中間体、補因子または補助酵素のシロイヌナズナ中の利用可能性を前提とし、これに依存している。
(i)植物
シロイヌナズナは、長い12/12時間の昼夜条件か、または短い8時間/16時間の昼夜条件で、栽培チャンバーで23℃にてシロイヌナズナ土壌ミックスで生育させた。トランスジェニック植物から収集した種を乾かし、清浄化し、2日間4℃で春化処理し、選択のための25mg/lのBialophosを含む固体MS培地に播種した。その中で残ったものを、第5葉期の時点で土壌に移植し、上記条件の下で、栽培室で栽培した。
バイナリーベクターpAJ22(図2)は、Andrew Jacobs博士(アデレード大学)より頂戴したものであり、pAMPAT−MCSバックボーン(登録番号AY436765)に基づいている。これは、pNOSターミネーター領域を有する二重35Sプロモーターを含むが、該プロモーターは本実施例では使用されないトリプルHAエピトープを組み込んでいる改変されたマルチクローニング部位により、分離されている。上記の通り増幅されたイネOsCslF cDNAに対応する完全長PCR産物は、TEASYベクター(Promega)にクローニングした。正しいサイズのインサートを担持するクローンを、適切な制限酵素(表2)およびTEASYバックボーンを二分割するための酵素で消化した。反応物を、アガロースゲル電気泳動法により分離し、CslF断片を切り出し、QIAquick(QIAGEN)ゲル抽出キットを製造元の説明書に従って使用して精製した。バイナリーベクターpAJ22は、対応する一対の制限酵素により消化され、CslF断片は、pAJ22ベクターにライゲーションした。プラスミドDNAを、QIAquickミニプレップキットを用いて陽性クローンから抽出し、インサートを、アプライドバイオシステムズ社製ABI3700キャピラリーシーケンサーでBigDye3.1化学(ABI)を用いて、配列決定した。確認済みインサートを含むプラスミドDNA調製物は、Mersereau、他 (Gene 90: 149, 1990)の方法を用いて、エレクトロポレーションを介してアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)cvGV3101に形質転換され、陽性コロニーを、25mg/lのリファンピシン、48mg/lのカルベリシニン、50mg/lのカナマイシンを含む培地で選択した。
シロイヌナズナ形質転換体は、CloughおよびBent(Plant J. 16: 735, 1998)の花浸漬法により作製した。
ゲノムDNAを、Qiagenミニプレッププラントキットを用いて若葉および花芽から抽出した。植物体ごとに約5μgのゲノムDNAを該当する制限酵素により消化し、1%のアガロースTAEゲルで分離した。DNAを、Highbond+メンブレンにトランスファーした。メンブレンにプレハイブリダイズおよびハイブリダイズを施し、プローブ断片を、Rediprimeラベリングキット(Amersham, High Wycome, UK)を製造元の説明書に従って用いて標識化した。
全てのRNA抽出およびcDNA合成は、Burton、他(Plant Physiol. 134: 224-236, 2004)に記載された通りに行った。適切な組織から得たcDNAのサンプルは、Elongase Taqポリメラーゼ(インビトロジェン社製)を用いて、PCRにより完全長CslF配列を増幅するために、鋳型として用いた。表2に挙げられたプライマーペアは、製造元が提案する標準的レシピに従い、PCR中で使用した。ジメチルスルホキシド(DMSO,5% v/v、Sigma, St Louis, MO, USA)を添加し、PCRを、94℃で30秒間、50℃〜58℃(個々のプライマーのTmによる)で30秒間、68℃で3分間を40サイクルとして実施した。プライマーは、表2に示した通り、増幅された断片をバイナリーベクターに対するクローニングを促進するための各末端の制限酵素部位を含んでいた。
対照遺伝子および特異的CslF遺伝子のプライマーペアを表3に示した通り使用した。希釈系列調製物用のPCR産物の原液は、イネまたはシロイヌナズナ組織のcDNAの成分のいずれかに由来するcDNAからPCRにより調製し、精製し、次にBurton、他(2004, 前記)に記載された通り、HPLCにより定量化した。7桁にわたる希釈系列は、以下の通り109コピー/μl原液から調製した。原液1マイクロリットルを99μlの水に加え、6つの1:10の段階希釈物を調製し、107コピー/μlから101コピー/μlにわたる合計7種類の溶液を作製した。7つの標準溶液のそれぞれについて3つずつの複製を、最低3つの鋳型を含まない対照とともに、各Q−PCR実験ごとに含めた。全ての遺伝子について、cDNAの1:20希釈液は、許容範囲の標準偏差を有する発現データを作成するには十分であった。各cDNAの3つの複製PCRを、各実験に含めた。全てのQ−PCR反応混合物は、CAS−1200ロボット(Corbett Robotics, Brisbane, Australia)で調製した。
トランスジェニックシロイヌナズナ株の免疫学的特徴
OsCslF転写産物レベルが最も高いトランスジェニックシロイヌナズナ株を、特に細胞壁中の(1,3;1,4)−β−D−グルカン沈着に関してさらに詳細な分析を行うために選択した。第1の例において、(1,3;1,4)−β−D−グルカンに特異的なモノクローナル抗体および電子顕微鏡法を含む免疫細胞化学的方法を、シロイヌナズナ株における多糖類の存在について、トランスジェニック株を選別するために使用した。使用した抗体は、セロオリゴ糖または(1→3)−β−D−グルカン、カロースとは結合しない。阻害研究により、(1,3;1,4)−β−D−オリゴグルコシドに対して比較的弱く結合することが示された。
(i)電子顕微鏡法のための形質転換したシロイヌナズナ葉の調製
シロイヌナズナ葉を、pH7.2のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の4%(v/v)のグルタールアルデヒド(EMグレード)で固定し、4℃で保存した。サンプルはPBS中で3回洗浄し、PBS中で2%の四酸化オスミウム中で室温にて1時間、後固定した。MilliQ水中で3回すすいだ後、サンプルをエタノール系列で脱水し、数日間をかけて徐々にLR White樹脂を浸潤させた。個々の葉を、未使用の樹脂が満たされたゼラチンカプセル中に入れ、65℃で一晩、重合させた。
シロイヌナズナ葉の切片(80nm)は、Leica UltracutRミクロトームで、ダイアモンドナイフを用いて作製し、100および200メッシュ、Formvarコーティング済ゴールドグリッドに回収した。超薄切片は、PBS中の1%ウシ血清アルブミン中で30分間ブロッキングし、その後、オオムギ(1,3;1,4)−β−D−グルカンに対して生起されたマウスのモノクローナル抗体(1:500に希釈;Biosupplies Australia, Parkville, VIC 3052, Australia)中、室温で1時間および4℃で一晩インキュベートした。グリッドを、PBS中で2回洗浄し、ブロッキングバッファー中で3回洗浄し、18nmのコロイド金−AffiniPureヤギ抗マウスIgG+IgM(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., PA, USA)中で1時間インキュベートした。全てのグリッドを、PBS中で2回洗浄し、MilliQ中で数回洗浄した後、2%の含水酢酸ウラニル中で染色し、続いてクエン酸鉛三重染色を施した。切片を、Philips BioTwin透過電子顕微鏡で観察し、Gatan Multiscan CCDカメラで撮像した。
オオムギのCslF配列の特定
入手できる場合、部分ESTオオムギ配列を、ガイドとしてイネのCslF配列を用いて、完全CslF配列に組み立てた。
イネおよびオオムギのCslF DNA配列およびアミノ酸配列のアライメント
イネおよびオオムギ両者のCslF配列のDNA配列およびアミノ酸配列のアライメントを行った。結果を図8に示す。
オオムギCslF遺伝子のマッピング
穀粒(1,3;1,4)−β−D−グルカン含有量に最大の影響を及ぼすQTLは、Adh8およびABG019マーカーの間のオオムギ第2H染色体上に位置し、マーカーは、Han、他(Theor. Appl. Genet. 91: 921, 1995)によるSteptoe×Morex倍加半数体(DH)においてマッピングされた通りである。
コムギ・オオムギ付加株(Islam、他、Heredity 46: 161-174 1981)の消化済みゲノムDNAのフィルターを、染色体レベルで遺伝子をマッピングするために使用した。オオムギDHマッピング集団Clipper×Saharaを、HvCslF遺伝子を精細にマッピングするために使用した(Karakousis、他、Aust. J. Ag. Res. 54: 1137-1140, 2003)。標準的方法を使うサザンハイブリダイゼーション分析のための、消化済みゲノムDNAフィルターの両方のセットは、Peter Langridge教授(Australian Centre for Plant Functional Genomics, University of Adelaide)から提供して頂いた。遺伝子座は、Map Manager QTXソフトウェア(Manly et al., Mammalian Genome 12: 930-932, 2001)を用いて位置決定した。
トランスジェニックオオムギ植物でのオオムギCslF遺伝子の過剰発現
(1,3;1,4)−β−D−グルカン合成でのオオムギCslF遺伝子ファミリーの個々のメンバーの役割を、強力な構成的プロモーターであるCaMV 35Sの制御下に遺伝子をGolden Promiseオオムギ植物のゲノムに挿入することにより調べた。オオムギ遺伝子CslF1、CslF4およびCslF6の完全cDNAは、表4に示したプライマーおよび高フィデリティーポリメラーゼを用いてPCRにより増幅し、配列決定して、PCR導入エラーを含まないことを確認した。PCR断片は、図11に示したバイナリーベクターpMDC32にクローニングした。
(i)バイナリーベクター構築
バイナリーベクターpMDC32は、マーク・カーティス博士、チューリッヒ大学(http://www.unizh.ch/botinst/Devo_Website/curtisvector/index_2.html)から頂戴したものであるが、ハイグロマイシン耐性遺伝子、および遺伝子過剰発現が望まれるオオムギ形質転換実験における使用に適したCaMV35Sプロモーターを有する、Gateway可能な(Invitrogen社)バイナリーベクターである(Curtis and Gossniklaus, Plant Phys 133: 462-469, 2003)。表4に示されたプライマーで増幅されたオオムギHvCslF cDNAに相当する完全長PCR生成物は、Applied Biosystems ABI3700キャピラリーシーケンサーでBigDye 3.1化学(ABI)を用いて配列決定された。正しいcDNAは、GatewayエントリーベクターpDENTR−Topo(Invitrogen社製)に再結合された。cDNAの向きは、制限酵素消化により確認し、次にエントリークローンを、デスティネーションベクターとしてpMDC32とのLR再結合反応(Invitrogen社)中で使用した。pMDC32への挿入の成功は、制限酵素消化により確認され、確認されたインサートを含むプラスミドDNA調製物で、Mersereau、他(Gene 90: 149, 1990)の方法を用いるエレクトロポレーションを介してアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)cvAGL0を形質転換し、陽性コロニーを、25mg/lのリファンピシンおよび25mg/lのカナマイシンを含む培地上で選択した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換実験は、Tingay、他(1997, 前記)により開発され、Matthews、他(2001, 前記)により改変された手法を用いて実施した。発育中の穂を、未成熟の胚芽が直径約1〜2mmになった時点で、温室で育てたドナー植物(cv. Golden Promise)から採取した。未成熟の胚芽を、表面消毒した穀粒から無菌的に切除し、胚盤は胚軸を取り除いて単離した。WanおよびLemauxのレシピに基づき(Plant Phys. 104: 37-48, 1994)、単離されたばかりの25個の胚盤を、切断面を上にして、カルス誘導培地の入った90mm×10mmのペトリ皿の中央において培養した。この培地は、MSマクロ栄養素(MurashigeおよびSkoog, Physiologia Plant. 15: 473-497, 1962)、30g/Lのマルトースを添加したFHGミクロ栄養素、1mg/Lのチアミン−HCI、0.25g/Lのミオイノシトール、1g/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/LのL−プロリン、10μMのCuSO4、2.5mg/Lのジカンバ(3,6−ジクロロ−o−アニス酸)から構成され、3.5g/LのPhytagel(商標)(Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA)により固形化した。アグロバクテリウム(Agrobacterium)懸濁液(50μl)を、胚盤上に分配し、ペトリ皿を45度の角度に傾けて、余分な細菌懸濁液を除いた。外植片を裏返し、ペトリ皿の端に培地の表面を片寄せた。胚盤は、カルス導入培地の新しいプレートに移動し、切断面を上にして22℃〜24℃の暗所で3日間培養した。共培養後、胚盤を95μMハイグロマイシンB(Becton Dickinson Biosciences, Palo Alto, CA, USA)を含む新しいカルス導入培地に移し、暗所で培養した。個々の胚盤の全カルスは、さらに6週間、二晩ごとに新しい選択培地へ移し換えた。カルス選択期間終了と同時に、各処理された胚盤から得られたカルスをシュート再生培地に移し換えた。この培地は、WanおよびLemaux(1994, 前記)のFHGレシピに基づいている。これは、FHGマクロ栄養素およびミクロ栄養素、1mg/Lチアミン−HCI、1mg/Lのベンジルアミノプリン、0.25g/Lのミオイノシトール、0.73g/LのL−グルタミン、62g/Lのマルトース、10μMのCuSO4、38μMハイグロマイシンBを含み、3.5g/LのPhytagel(商標)により固形化した。培養物は、22〜24℃で3週間から4週間光曝露(昼16時間/夜8時間の光周期)した。再生シュートを、カルスから切り離し、95μMハイグロマイシンBを添加したホルモン不含のカルス誘導培地が入った培養ボックス(Magenta Corporation, Chicago, IL, USA)に移し換えて、根形成を誘導した。活発に育っている組織培養で得た植物を土壌に定着させ、成熟させた(Singh、他、Plant Cell, Tissue and Organ Culture 49:121-127 1997)。全ての培地は、共培養後にアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の成長を阻害するために、150mg/LのTimentin(登録商標)(SmithKline Beecham, Pty. Ltd., Melbourne, Australia)を含んでいた。
トータルRNAは、TRIZOLを用いて、上記の通りMagentaボックスで成長している苗の葉から抽出し、cDNAを、Burton、他(Plant Phys 134: 224-236, 2004)に記載のように逆転写酵素Superscript III(Invitrogen社)を用いて合成した。
対照遺伝子のプライマーペア(Burton、他、2004, 前記)および特異的CslF遺伝子のプライマーペアは、表5に示した通り使用した。希釈系列の調製物用のPCR産物の原液は、オオムギ組織cDNAのいずれかの成分に由来するcDNAからPCRにより調製し、次にBurton、他(2004, 前記)により記載された通り、HPLCにより精製および定量化を行った。7桁にわたる希釈系列を、 以下の通り109コピー/μl原液から調製した:1μlの原液を99μlの水に加え、6つの1:10系列希釈液を調製して、107コピー/μlから101コピー/μlにわたる合計7つの溶液を作製した。各Q−PCR実験ごとに7つの標準溶液のそれぞれについて3つの複製を、最低3つの鋳型を含まない対照と共に含めた。すべての遺伝子について、cDNAの1:20の希釈物は、許容範囲の標準偏差を有する発現データを得るのに十分であった。各cDNAの3つの複製PCRを、各実験に含めた。全てのQ−PCR反応混合物は、CAS−1200ロボット(Corbett Robotics, Brisbane, Australia)で調製した。
光学顕微鏡のレベルでのトランスジェニックオオムギ株中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンの免疫学的検出
35Sプロモーターにより制御されるHvCslF1、HvCslF4またはHvCslF6転写産物レベルが最も高い、実施例7に記載のトランスジェニックオオムギ株は、細胞壁中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンの沈着に関してさらに分析するために、選択された。葉の切片は、(1,3;1,4)−β−D−グルカンに特異的なモノクローナル抗体を蛍光団コンジュゲート二次抗体により検出し、それを光学顕微鏡により観察する免疫学的方法を用いて、オオムギ株における多糖類の存在についてスクリーニングされた。内在性CslF遺伝子の発現により、(1,3;1,4)−β−D−グルカンは、葉などの栄養組織の細胞壁に通常沈着する。また、オオムギ苗の新生組織中でのその存在と分布は、TretheweyおよびHarris(New Phytologist 154: 347-358, 2002)によりTEMレベルで報告されている。対照葉切片における内在性(1,3;1,4)−β−D−グルカンの分布パターンを、オオムギCslF遺伝子を過剰発現するトランスジェニック葉のサンプルにより示されたパターンと対比させる。
(i)光学顕微鏡法のための形質転換したオオムギ葉の調製
オオムギ葉小片を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.2中の、0.25%(v/v)のグルタールアルデヒド、4%(v/v)パラホルムアルデヒド(EMグレード)および4%のスクロースで固定し、4℃で一晩保存した。サンプルは、PBS中で3回洗浄し、エタノール系列中で脱水し、ゆっくり数日間をかけてパラフィンを浸潤させた。ブロックをトリミングし、6μmに切片化した。
切片は、キシレン中で脱パラフィンし、100%、90%、70%のエタノール溶液により徐々に再水和させた。1×リン酸緩衝食塩水(PBS)により2回すすいだ後、残留アルデヒド基を不活性化するために、切片を20分間0.05Mグリシンとインキュベートした。切片を、非特異的結合を防ぐために、インキュベーションバッファー(1×PBS中、1%ウシ血清アルブミン(BSA))で2×10分間ブロッキングした。スライドの水気を切り、特異的一次抗体BG1(BioSupplies, Melbourne, Australia)を、1:50の希釈比率で添加し、湿チャンバーで1時間インキュベートした。未結合一次抗体を、インキュベーションバッファーで3×10分間すすいで除去し、二次抗体Alexa Fluor(登録商標)488ヤギ抗体マウスIgG(Molecular Probes, Eugene, USA)を添加した。スライドを、光を除くために、アルミホイルで包み、室温で2時間インキュベートした。未結合二次抗体は、インキュベーションバッファーで3×10分間すすぐことにより除去し、封入剤(90%グリセロール:10%水)を数滴載せ、切片にカバーガラスをかけた。対照では、一次抗体、二次抗体または両方の抗体のいずれかを除いた。DFC480CCDカメラを使い、フィルターD(UV、励起355〜425nm)またはフィルターI3(青、励起450〜490nm)の下で、Leica AS LMD顕微鏡で撮像した。示した全てのイメージは、蛍光強度を標準化するために、7秒の曝露時間で400×倍率で撮影した。
透過電子顕微鏡を用いたトランスジェニックオオムギ中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンの免疫学的検出
35Sプロモーターにより制御されるHvCslF1、4または6の転写産物レベルが最も高い、実施例7および8に記載のトランスジェニックオオムギ株は、細胞壁中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンの沈着に関し、さらに分析を行うために選択された。実施例3に記載の、(1,3;1,4)−β−D−グルカンに特異的なモノクローナル抗体および電子顕微鏡法を使用する免疫細胞化学的な方法を用いて、オオムギ株中の多糖の存在について葉の切片をスクリーニングした。内在性CslF遺伝子の発現により、(1,3;1,4)−β−D−グルカンは葉などの栄養組織の細胞壁に通常沈着する。また、オオムギ苗の新生組織中での存在と分布は、TretheweyおよびHarris(New Phytologist 154: 347-358, 2002)によって、TEMレベルで報告されている。光学顕微鏡レベルで対照材料中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンの分布を、実施例7でのオオムギCslF遺伝子を過剰発現する苗の葉切片に示されるものと比較した。特異的なモノクローナル抗体およびTEMを用いる同じ株のサブセットの繰り返し分析は、個々の細胞壁をより精密に試験することができるものであり、ここで説明する。
(i)電子顕微鏡法のための形質転換したオオムギ葉の調製
オオムギ苗葉の小片は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.2中の、0.25%(v/v)のグルタールアルデヒド、4%(v/v)パラホルムアルデヒド(EMグレード)および4%のスクロースで固定し、4℃で一晩保存した。MilliQ水中で3回洗浄した後、サンプルをエタノール系列中で脱水し、ゆっくり数日間をかけてLR White樹脂を浸潤させた。個々の葉の小片を、新しい樹脂を満たしたゼラチンカプセルに入れ、65℃で一晩重合させた。
オオムギ葉の切片(80nm)は、ダイヤモンドナイフを用いてLeica Ultracut Rミクロトームで作製し、100および200のメッシュ、Formvarコーティングしたゴールドグリッドに回収した。超薄断片は、PBS中1%ウシ血清アルブミンにて30分間ブロッキングし、続いてオオムギ(1,3;1,4)−β−D−グルカンに対して生起したマウスのモノクローナル抗体中(希釈率1:5000、Biosupplies Australia, Parkville, VIC 3052, Australia)で1時間室温および一晩4℃でインキュベートした。グリッドを、PBS中で2回洗浄し、3回ブロッキングバッファーで洗浄した後、18nmのコロイド金AffiniPureヤギ抗マウスIgG+IgM(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., PA, USA)中で1時間インキュベートした。全てのグリッドを、PBSで2回、MilliQ水で数回洗浄した後、Philips BioTwin透過電子顕微鏡で観察し、Gatan Multiscan CCDカメラで撮像した。
Claims (46)
- 細胞により生成される(1,3;1,4)−β−D−グルカンのレベルを制御する方法であって、該細胞中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼのレベルおよび/または活性を変化させるステップを含む、上記方法。
- 細胞中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼのレベルおよび/または活性を変化させる方法であって、該細胞中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現を変化させるステップを含む、上記方法。
- 細胞中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼのレベルおよび/または活性を変化させる方法であって、該細胞中のCslF遺伝子またはその機能的ホモログの発現を変化させるステップを含む、上記方法。
- (1,3;1,4)−β−D−グルカンの生成方法であって、単離された(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸で細胞を形質転換するステップ、および該細胞に該単離された核酸を発現させるステップを含む、上記方法。
- 前記細胞が植物細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が単子葉植物細胞である、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞が禾穀類植物細胞である、請求項5または6に記載の方法。
- 請求項4に記載の方法により生成された、(1,3;1,4)−β−D−グルカン。
- 以下のもの:
(i)同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した(1,3;1,4)−β−D−グルカンレベル;
(ii)同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼのレベルおよび/または活性;
(iii)同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現
のうち、いずれか1以上を示す細胞。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法により作製された、請求項9に記載の細胞。
- 植物細胞である、請求項9または10に記載の細胞。
- 単子葉植物細胞である、請求項11に記載の細胞。
- 禾穀類植物細胞である、請求項10または11に記載の細胞。
- 請求項9〜13のいずれか1項に記載の1以上の細胞を含んでなる、多細胞構造物。
- 植物全体、植物組織、植物器官、植物断片、植物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストから選択される、請求項14に記載の多細胞構造物。
- 禾穀類植物、またはその組織、器官もしくは断片である、請求項14または15に記載の多細胞構造物。
- 穀粒を含んでなる、請求項16に記載の多細胞構造物。
- 変化した(1,3;1,4)−β−D−グルカンレベルを示す穀粒であって、(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼの変化したレベルおよび/もしくは活性、および/または(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸分子の変化した発現を示す1以上の細胞を含んでなる、上記穀粒。
- 以下のもの:
(i)請求項17または18に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉;および
(ii)任意により、1以上の他の穀粒を製粉することにより製造される穀粉
を含んでなる穀粉。 - (1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする、単離された核酸分子。
- 配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11のいずれかにより表されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11のいずれかにより表されるヌクレオチド配列に対して少なくとも50%同一なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 低ストリンジェンシー条件下で請求項21に記載の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 中程度のストリンジェンシー条件下で請求項21に記載の核酸分子にハイブリダイズする、請求項23に記載の単離された核酸分子。
- 高ストリンジェンシー条件下で請求項21に記載の核酸分子にハイブリダイズする、請求項23または24に記載の単離された核酸分子。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12のいずれかにより表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項20〜26のいずれか1項に記載の単離された核酸分子のヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項20〜26のいずれか1項に記載の単離された核酸分子のヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項20〜28のいずれか1項に記載の単離された核酸分子のうちのいずれか1つの断片。
- 請求項20〜29のいずれか1項に記載の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物またはベクター。
- 請求項20〜29のいずれか1項に記載の単離された核酸分子または請求項30に記載の遺伝子構築物を含んでなる細胞。
- 植物細胞である、請求項31に記載の細胞。
- 単子葉植物細胞である、請求項32に記載の細胞。
- 禾穀類植物細胞である、請求項32または33に記載の細胞。
- 請求項31〜34のいずれか1項に記載の細胞のうち1以上を含んでなる、多細胞構造物。
- 植物全体、植物組織、植物器官、植物断片、植物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストから選択される、請求項35に記載の多細胞構造物。
- 禾穀類植物、またはその組織、器官もしくは断片である、請求項35または36に記載の多細胞構造物。
- 穀粒を含んでなる、請求項37に記載の多細胞構造物。
- (1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼタンパク質をコードするアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12のいずれかにより表されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12のいずれかにより表されるアミノ酸配列に対して少なくとも50%の同一性を示すアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11のいずれかにより表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 請求項39〜42のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドの断片。
- 請求項40〜43のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドまたはその断片であって、そのアミノ酸配列が(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする、上記ポリペプチドまたはその断片。
- 1以上の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼエピトープを含む、単離されたポリペプチド。
- 請求項39〜45のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドまたはその断片に対して生起された、抗体またはそのエプトープ結合性フラグメント。
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