KR20070085439A - 인플루엔자 м2 단백질에 대한 인간 모노클로날 항체 및그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents
인플루엔자 м2 단백질에 대한 인간 모노클로날 항체 및그의 제조 및 사용 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인플루엔자 M2 단백질에 결합하는 인간, 인간화 및 키메라 모노클로날 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상이한 아미노산 서열을 갖는 인플루엔자 M2 단백질에 결합하는 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다. 특히, 상기 항체는 치료, 진단, M2 또는 인플루엔자 바이러스의 정제 및 단리, 및 샘플 또는 대상체내 M2 또는 인플루엔자 바이러스 존재의 동정에 있어서 유용하다.
인플루엔자 M2 단백질, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 모노클로날 항체, 하위서열
Description
<관련 출원>
본 출원은 2004년 12월 6일 출원된 미국 출원 제60/633,846호 및 2005년 10월 6일 출원된 미국 출원 제60/724,198호를 우선권으로 주장하며, 이들 출원은 본원에 참고로 명백히 포함된다.
본 발명은 항체, 보다 구체적으로는 인플루엔자 바이러스 M2 단백질에 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 및 키메라 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체, 보다 구체적으로는 최소 결합 서열이 
인 인간, 인간화 및 키메라 항체에 관한 것이다.
인플루엔자 A형 또는 B형 바이러스는 모든 국가에서 거의 매년마다 유행성 질병을 일으키며, 선진국에서 주요한 사망 원인이다. 미국에서, 유행성 인플루엔자는 약 20％의 사람들에게서 병을 유발시킬 수 있으며, 연간 평균 20,000명의 사망 및 114,000명의 입원과 관련된다. 인플루엔자의 제어를 위한 현재의 전략은 불 활성화된 전체 바이러스 또는 서브유닛 백신을 매년 백신접종하는 것이다.
인플루엔자 백신은 인플루엔자 감염에 대한 보호 효과를 갖는다고 입증되어 있다. 그러나, 매년 발생하는 인플루엔자 바이러스의 항원성 변이체로 인해 동시대에 순환하는 바이러스 종에 대한 감시가 필요하다. 몇몇 경우에는, 새로운 변이체 종를 예측하는 것이 어렵기 때문에 백신을 시기 적절하게 생산하지 못하였다 (Frace et al., Vaccine 17:2237 (1999)). 최근, 범유행성 조류 인플루엔자는 동아시아에서 H5N1과 같은 조류 인플루엔자 바이러스의 출현으로 인해 심각한 위협이 되고 있다. 현재 이용가능한 백신은 조류 바이러스에 효과가 없을 수 있다 (Lipatov et al., J. Virology 78:8951 (2004); Osterholm et al., N Engl. Med. 352:1839 (2005)). 현재의 백신이 가진 세번째 문제는 면역계가 손상된 특정 개체군, 예를 들어 미숙아, 노인, AIDS 및 이식 환자에서 효과가 없다는 것이다.
조류 바이러스에 대한 백신이 아직 없기 때문에, 전세계 국가들은 전세계적으로 유행할 가능성이 있는 인플루엔자에 대처하기 위해 항-인플루엔자 약물 타미플루(Tamiflu) (뉴라미니다제 억제제)를 비축하려고 노력 중이다. 이 약물은 현재 공급이 부족하다. 최근, 약물 내성인 조류 바이러스가 베트남의 14세 소녀에게서 발견되었다. 인간 인플루엔자에서도 타미플루에 대한 내성이 발견된 적이 있다 (Mai Le et al., Nature 437:1108 (2005)). 타미플루는 지금까지의 가장 효과적인 항-인플루엔자 약물이기 때문에, 탈락된 바이러스가 다른 사람에게 전달된다면 문제가 될 수 있다. 타미플루에 대한 또다른 우려는, 타미플루가 성인에서 현대의 인플루엔자 종으로의 경증 감염으로부터 회복을 앞당길 수 있음에도 불구하고 중증 의 조류 인플루엔자에 대해 유효할 것인지가 불분명하다는 것이다.
헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA)는 항체 생산을 자극하는 2가지 주요 항원이다. 이들 두 단백질의 빈번한 항원성 변이로 인해, 이들은 치료용 항체 약물의 개발을 위한 최적의 표적이 되지 못한다. A형 인플루엔자 바이러스의 제3의 막횡단 단백질인 기질 단백질 2 (M2)는 바이러스-감염된 세포에 의해 풍부하게 발현되며, 이는 바이러스 복제를 위해 필수적인 막횡단 양성자 유입을 제공하는 것으로 추정된다 (Ciampor et al., Virus Research 22:247 (1992); Grambas and Hay, Virology 190:11 (1992); Sugrue et al., EMBO Journal 9:3469 (1990)). HA 및 NA와는 달리, M2는 보존되며, 인플루엔자 환자에서의 항체 기반 수동 면역요법 개발을 위한 표적을 제공할 수 있다 (Ito et al., J Virology 65:5491 (1991); Slepushkin et al., Vaccine 13:1399 (1995); Neirynck et al., Nature Med. 5:1157 (1999)).
발명의 개요
인플루엔자 감염의 예방 및 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 조성물은 A/PR/8/34, A/HK/1/68 및 다른 종/단리물로부터의 인플루엔자 기질 단백질 2 (M2 단백질)를 인식하며 다양한 인플루엔자 A 종/단리물 및 아형에 대한 넓은 반응성을 갖는 완전한 인간, 인간화 및 키메라 (예컨대, 인간/마우스 키메라) 모노클로날 항체를 포함한다. 상기 방법은 인플루엔자에 대한 접촉, 노출 또는 감염 전이나 후에, 인플루엔자 기질 단백질 2 (M2 단백질)에 결합하는 인간, 인간화 및 키메라 (예컨대, 인간/마우스 키메라) 모노클로날 항체 (항-M2 항체)로의 수동 면 역화를 포함한다.
인간 모노클로날 항-M2 항체는, 동물이 인플루엔자 A로 감염되기 전이나 후에 상기 항체를 투여하는 경우, A/PR/8/34 인플루엔자 A 바이러스 (A/HK/1/68 및 A/PR/8/34)의 치명적인 공격으로부터 마우스를 보호할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 복제는 생체내에서 극적으로 억제되었다. 인간 항-M2 항체는 매우 다양한 M2 서열에 결합할 수 있는 넓은 항원 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 예를 들어, 한 예시적인 항체는 잠재적으로 광역적/유행성인 조류 인플루엔자 단리물로부터의 변이체를 비롯한 대부분의 M2 서열 변이체에 결합한다. M2 변이체 펩티드에 대한 넓은 특이성을 갖는 이러한 인간, 인간화 및 키메라 항-M2 모노클로날 항체는 다양한 인플루엔자 열(train)/단리물 및 아형에 대해 유용하다.
그러므로, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 단백질 M2에 결합하는 인간, 인간화 및 키메라 항-M2 모노클로날 항체, 인간, 인간화 및 키메라 항-M2 모노클로날 항체를 포함하는 조성물, 예를 들어 인간, 인간화 및 키메라 항-M2 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 항체를 함유하는 키트를 제공한다. 본 발명의 인간, 인간화 및 키메라 항-M2 모노클로날 항체는 감염 이전 (예방) 또는 감염 이후에 (치료) 인플루엔자에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체에서의 인플루엔자의 치료; 바이러스 역가 측정을 비롯한 인플루엔자의 검출 및 진단; 전체 바이러스 또는 M2 단백질의 정제 또는 단리를 비롯한 정제/단리; 및 다른 분석 시스템에 유용하다. 따라서, 본 발명은 치료 (예, 인플루엔자 감염의 치료) 및 비치료적 적용, 예를 들어 진단 (샘플에서 인플루엔자 또는 M2 단백질의 양 검출 또는 측정) 및 정제 (인플루엔자 바이러스 또는 M2 단백질의 정제 또는 단리)에서 항체를 사용하는 방법을 또한 제공한다.
한 실시양태에서, M2 세포외 도메인 (또한 본원에서 상호교환적으로 M2 엑토도메인 (M2e)이라고 언급되고 사용됨)의 적어도 일부와 특이적으로 결합하는 인간 항체가 제공된다. 특정 측면에서, 세포외/엑토-도메인은 아미노산 서열 
, 그의 하위서열 또는 그의 아미노산 변이체 (예컨대, 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 부가)를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 다른 측면에서, 세포외/엑토-도메인은
로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 서열이다. 추가의 측면에서, 상기 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (73.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된다.
본 발명의 항체는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 이들의 혼합물을 포함하며, 이는 IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, 및 이들의 임의의 이소형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중 어느 것일 수 있다. 모노클로날 항체의 경우, 예시적인 항체 군은 IgG이다. IgG의 아군으로는 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 포함된다. 항체는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄 (예컨대, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열의 성숙 부분)를 갖는 원형 인간, 인간화 및 키메라 이뮤노글로불린 분자, 및 M2에 특이적으로 결합하는 모(parental) 원형 항체의 기능 (M2 결합 특이성, M2 결합 친화성, 또는 항-인플루엔자 바이러스 활성) 중 적어도 일부를 보유하는 중쇄 또는 경쇄의 하위서열/단편을 포함한다. 하위서열은 모 원형 인간, 인간화 및 키메라 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 특이성, 결합 친화성 또는 항-인플루엔자 바이러스 활성을 가질 수 있다.
예시적인 하위서열로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, 단쇄 Fvs (scFv), 디술피드-연결된 Fvs (sdFv) 및 VL 또는 VH, 또는 원형 이뮤노글로불린의 다른 M2 단백질 결합 단편이 포함된다. 그러므로, 본 발명의 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으 로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 생산된 항체의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
항체는 추가로 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 특이성, 친화성, 또는 항-인플루엔자 바이러스 활성을 갖는 인간, 인간화 및 키메라 항체를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체가 결합하는 M2 변이체 서열 중 적어도 하나에 결합한다. 추가의 구체적인 실시양태에서, 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스 에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체가 결합하는 M2 변이체 서열 중 적어도 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25개 또는 그 이상에 결합하거나 약하게 결합한다. 추가의 구체적인 실시양태에서, 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체가 결합하는 M2 변이체 서열 중 적어도 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25개 또는 그 이상에 결합하거나 약하게 결합하지만, 항-M2 항체 L66, N547, C40G1 또는 14C2 항체가 결합하는 M2 서열에는 결합하지 않거나 단지 약하게만 결합한다.
추가의 실시양태에서, 친화성 또는 항-인플루엔자 바이러스 활성은 기준 항체보다 약 5 내지 1000 배 크거나 작다. 따라서, 예를 들어, 기준 항체의 Kd가 10-9 M인 경우, 본 발명의 항체는 Kd가 10-9 M보다 5 내지 1000 배 크거나 작은 항체를 포함한다. 따라서, 한 측면에서, 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체보다 약 5 배 내지 1000 배 크거나 작은 결합 친화성을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 항체는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 따라서, 한 측면에서, 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 측면에서, 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체가 결합하는 에피토프에 결합한다. 또다른 측면에서, 항체는 임의의 M2 아미노산 서열, 예를 들어,
내의 에피토프에 결합한다.
본 발명의 항체는 추가로 M2 단백질의 최소 결합 서열에 결합하는 인간, 인간화 및 키메라 항체를 포함한다. 다양한 측면에서, 항체는 
내의 최소 결합 서열에 결합한다. 구체적인 측면에서, 항체 결합에 대한 최소 결합 서열은 
이다. 추가의 측면에서, 인간 M2 항체에 대한 최소 결합 서열은 
와 동일하거나 실질적으로 동일하다. 추가의 측면에서, 인간 M2 항체는 
인 최소 결합 서열에 결합한다. 추가의 측면은
중 임의의 것 내에 존재하는 최소 결합 서열에 결합하는 M2 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 추가로 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 세포주 (예, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산되는 예시적인 항체로서의 기능 또는 활성, 예를 들어, 시험관내 또는 생체내 바이러스 감염을 억제하거나 시험관내 또는 생체내 세포 (예, MDCK 세포)의 M2 결합을 억제하는 활성을 갖는 인간, 인간화 및 키메라 항체를 포함한다. 다양한 측면에서, 항체는 세포 기반 ELISA 분석 으로 측정했을 때, MDCK 세포의 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는 EC50이 2.0 내지 3.0 ㎍/ml 미만, 1.0 내지 2.0 ㎍/ml 미만, 0.5 내지 1.0 ㎍/ml 미만, 0.1 내지 0.5 ㎍/ml 미만 또는 0.1 ㎍/ml 미만 (예, 0.05 내지 0.1 ㎍/ml)이다. 추가의 측면에서, 항체는 세포 기반 ELISA 분석으로 측정했을 때, MDCK 세포에 대한 M2 결합을 억제하는 EC50이 2.0 내지 3.0 ㎍/ml 미만, 1.0 내지 2.0 ㎍/ml 미만, 0.5 내지 1.0 ㎍/ml 미만, 0.1 내지 0.5 ㎍/ml 미만 또는 0.1 ㎍/ml 미만 (예, 0.05 내지 0.1 ㎍/ml)이다. 추가의 측면에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스, 예를 들어 A/PR/8/34 (H1N1) 또는 A/HK/1/68 (H3N2) 종/단리물, 또는 기타 아형, 예를 들어 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 또는 H5N3이다.
본 발명의 항체는 여러 인플루엔자 바이러스 (예컨대, 종/단리물 또는 아형) 상에 임의로 존재할 수 있는, 여러 아미노산 서열 (예컨대, M2의 여러 세포외/엑토-도메인 서열, 즉 Me)을 갖는 2종 이상의 M2 단백질에 결합하는 인간, 인간화 및 키메라 항체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 M2 세포외/엑토-도메인 서열 (M2e)의 적어도 일부에 결합한다. 구체적인 측면에서, M2e 서열은 아미노산 서열 
, 그의 하위서열 또는 그의 아미노산 변이체 (예컨대, 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 부가), 예를 들어 
를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 다른 구체적인 측면에서, M2e 서열은
로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 올리고머화 도메인 (예, 류신 지퍼 모티프)의 공유적 부착을 통해 또는 가교결합제 (예, 화학적 가교결합제)를 통해 올리고머가 형성되도록 수식한 것들을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체는 다량체(multimer) 형태, 예를 들어 이량체, 삼량체, 사량체 또는 더 높은 차수의 인간, 인간화 및 키메라 항체 올리고머를 포함한다. 전형적으로 이러한 항체 다량체는 단량체 항체에 비해 M2에 대한 증가된 친화성을 나타낸다.
본 발명의 항체는 M2에 결합하는 항체에 독특한 기능 또는 활성을 부여하는 하나 이상의 이종 도메인을 추가로 포함한다. 하나 이상의 아미노산이 상기 항체와 다른 경우 (즉, 이들이 천연 항체의 일부가 아닌 경우) 항체는 아미노산 이종 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 도메인은 결합 단백질 (예, 수용체 또는 리간드 결합), 효소 활성, 약물, 항바이러스제, 독소, 면역조절제, 검출가능한 잔기 또는 태그를 포함한다. 한 측면에서, 결합 단백질은 인플루엔자 단백질 M2에 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체와 상이한 결합 특이성 또는 친화성을 갖는 항체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 다중특이적 및 다관능성 항체 (예, 이중특이적 및 이관능성 항체, 예를 들어 각각 2가지 이상의 항원에 결합하거나 또는 2개 이상의 기능 또는 활성을 갖는 항체)를 추가로 제공한다.
본 발명의 항체는 하나 이상의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형에 임의로 존재하는 인플루엔자 단백질 M2에 결합할 수 있다. 따라서, 항체는 M2 또는 인플루엔자 바이러스 감염성, 복제, 증식, 역가, 인플루엔자와 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성, 또는 인플루엔자 바이러스 감염의 감수성에 대한 하나 이상의 효과, 즉 항-인플루엔자 바이러스 활성을 갖는다.
한 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체는 하나 이상의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형에 의한 시험관내 또는 생체내 세포 감염을 억제하거나 시험관내 또는 생체내 세포의 인플루엔자 결합을 억제한다. 다른 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체는 하나 이상의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형의 인플루엔자 바이러스 역가 또는 인플루엔자 바이러스 단백질의 양을 감소시킨다. 또다른 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체는 하나 이상의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형의 인플루엔자 바이러스 역가 또는 인플루엔자 바이러스 단백질의 양 의 증가를 억제하거나 방지한다. 또다른 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체는 대상체를 하나 이상의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형에 의한 감염으로부터 보호하거나 또는 상기 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시킨다. 추가의 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체는 하나 이상의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형에 의한 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증 (예를 들어, 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염, 귀 통증 또는 사망)의 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성을 감소시킨다. 다양한 측면에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 전신 투여 (예, 정맥내 주사, 피하 주사, 정맥내 주입, 근육내 주사)하거나, 또는 대상체의 점막 조직으로 국소 투여 (예, 비도(nasal passage), 부비동(sinuses), 인후, 후두, 식도, 귀 또는 이도(ear canal)) 또는 폐로 국소 투여한다. 다양한 측면에서, 인플루엔자는 인플루엔자 A이고, 인플루엔자 A 종는 A/PR/8/34 (H1N1) 또는 A/HK/1/68 (H3N2) 종/단리물, 또는 아형, 예를 들어 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 또는 H5N3으로부터 선택된다.
본 발명의 인간, 인간화 및 키메라 항체를 발현시키는 숙주 세포가 또한 제공된다. 이러한 세포로는 본 발명의 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 발현시키는 박테리아, 효모, 식물, 동물 (예컨대, 포유동물 세포, 예를 들어 하이브리도마 세포주 및 CHO 세포주), 및 비인간 동물 및 식물과 같은 전체 생물을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 숙주 세포를 사용하여 항체를 생산할 수 있고, 이를 그 후에 임의로 단리하거나 정제할 수 있다.
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 (그의 하위서열/단편 및 변이체 포함)이 추가로 제공된다. 구체적인 실시양태에서, 핵산은 실시예 1에 기재된 바와 같은 중쇄 서열 또는 경쇄 서열 (예컨대, 서열 34, 35 및 37), 및 그의 하위서열 (예컨대, 가변 중쇄 또는 경쇄 서열)을 코딩한다. 핵산은 용액, 세포 또는 임의의 생물에서 핵산의 클로닝 또는 다른 유전적 조작을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터를 포함한다. 그러므로, 핵산을 사용하여 시험관내 또는 생체내 세포에서 용액 중의 항체를 생산할 수 있고 (예컨대, 시험관내 번역), 이를 그 후에 임의로 단리하거나 정제할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체를 포함하는 배합 조성물이 제공된다. 한 실시양태에서, 조성물은 인플루엔자 M2 단백질 및 항바이러스제에 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 인플루엔자 M2 단백질에 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 및 인플루엔자 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증 (예, 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염, 귀 통증 또는 사망)을 억제하는 물질을 포함한다.
본 발명의 항체 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 한 실시양태에서, 담체는 전신적으로, 지엽적으로 또는 대상체의 점막 조직 (예, 비도, 부비동, 인후, 후두, 식도) 또는 폐로 국소적으로 투여하 는 데 있어서 적합하다.
하나 이상의 본 발명의 항체를 포함하는 키트가 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형에 의한 대상체의 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 치료 (예방적 또는 치료적)하거나, 억제하거나, 예방하거나, 이에 대한 감수성을 감소시키거나 또는 상기 증상 또는 합병증의 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성을 감소시키기 위한 지침서를 포함한다. 다른 실시양태에서, 키트는 제품, 예를 들어 에어로졸, 스프레이 또는 스퀴즈 보틀(squeeze bottle) 또는 대상체로의 흡입 또는 비측 투여에 적합한 다른 전달 수단을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 키트 또는 제품은 항바이러스제 (예, 항체 또는 약물) 또는 인플루엔자 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 억제하는 물질을 포함한다.
대상체의 인플루엔자 감염을 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 이 방법은 인플루엔자 M2에 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 상기 대상체의 인플루엔자 감염을 치료하기에 유효한 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 다양한 측면에서, 항체는 대상체의 감염과 실질적으로 동시에 또는 대상체의 감염 후에 (즉, 치료적 처치) 투여한다. 다른 측면에서, 항체는 치료 이점을 제공한다. 다양한 측면에서, 치료 이점은 인플루엔자 감염의 하나 이상의 증상 또는 합병증의 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성, 하나 이상의 인플루엔자 종의 바이러스 역가, 바이러스 복제 또는 바이러스 단백질의 양을 감소시키거나 경감시키는 것을 포함한다. 감소 또는 경감될 수 있는 인플루엔자 감염의 증 상 또는 합병증으로는 예를 들어 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염, 귀 통증 또는 사망을 들 수 있다. 또다른 측면에서, 치료 이점은 인플루엔자 감염으로부터 대상체의 회복을 촉진시키거나 앞당기는 것을 포함한다.
하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 대상체의 감염을 억제하는 방법이 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 이 방법은 대상체에게 인플루엔자 M2에 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를, 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 대상체의 감염을 억제하거나 또는 상기 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키는 데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 다양한 측면에서, 항체는 대상체의 감염 이전에 (예방), 대상체의 감염과 실질적으로 동시에 또는 대상체의 감염 이후에 투여한다. 다른 측면에서, 항체는 치료 이점을 제공한다. 다양한 측면에서, 치료 이점은 인플루엔자 감염의 하나 이상의 증상 또는 합병증 (예, 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염, 귀 통증 또는 사망)의 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성, 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물의 바이러스 역가 또는 바이러스 단백질의 양, 또는 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키거나 또는 경감시키는 것을 포함한다.
대상체에서 인플루엔자 바이러스 역가, 바이러스 복제, 바이러스 증식 또는 인플루엔자 바이러스 단백질의 양의 증가를 방지하는 방법이 추가로 제공된다. 한 실시양태에서, 이 방법은 대상체에게 인플루엔자 M2에 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 상기 대상체에서 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물의 인플루엔자 바이러스 역가, 바이러스 복제 또는 인플루엔자 바이러스 단백질 양의 증가를 방지하는 데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.
또한, 하나 이상의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형에 의한 감염으로부터 대상체를 보호하거나 또는 상기 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키는 방법, 즉 예방적 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 이 방법은 대상체에게 인플루엔자 M2에 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를, 하나 이상의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형에 의한 감염으로부터 상기 대상체를 보호하거나 또는 상기 감염에 대한 상기 대상체의 감수성을 감소시키는 데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 이러한 보호는 인플루엔자 감염 또는 인플루엔자 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증 (예, 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염, 귀 통증 또는 사망)을 감소시키거나 경감시키는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은, 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체의 결합 특이성 또는 결합 친화성을 갖는 항체를 사용해서 실시할 수 있다. 항체는 대상체에 투여하기에 앞 서서 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제 내에 포함시킬 수 있다. 대상체에 투여하는 방법은 전신적, 지엽적 또는 국소적 전달을 포함한다.
치료/예방, 진단/검출 및 정제/단리를 비롯한 본 발명의 방법은 임의의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형 또는 이들 종/단리물 또는 아형의 조합물에 적용할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 인플루엔자는 인플루엔자 A이고, 인플루엔자 A는 A/PR/8/34 (H1N1) 또는 A/HK/1/68 (H3N2) 종/단리물, 또는 기타 아형, 예를 들어 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3으로부터 선택된다.
인간 M2 항체의 제조 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 M2 또는 그의 면역원성 하위서열/단편을 인간 이뮤노글로불린을 발현할 수 있는 동물 (예컨대, 비인간 동물)에게 투여하는 단계; 인간 M2 항체를 발현하는 동물을 스크리닝하는 단계; 인간 M2 항체를 생산하는 동물을 선별하는 단계; 인간 M2 항체를 생산하는 동물로부터 항체를 단리하는 단계; 및 인간 M2 항체가 M2에 결합하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 M2 또는 그의 면역원성 하위서열/단편을 인간 이뮤노글로불린을 발현할 수 있는 동물 (예컨대, 비인간 동물)에게 투여하는 단계; 인간 M2 항체를 발현하는 동물을 스크리닝하는 단계; 인간 M2 항체를 생산하는 동물을 선별하는 단계; 인간 M2 항체를 생산하는 동물로부터 비장 세포를 단리하는 단계; 비장 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산하는 단계; 및 인간 M2 항체를 발현하는 하이브리도마를 스크리닝하는 단계 를 포함한다. 다양한 측면에서, M2 또는 그의 면역원성 하위서열/단편은 M2 세포외/엑토-도메인 (M2e)를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 추가의 측면에서, M2e는 
과 동일하거나 실질적으로 동일한 인간 M2 항체에 대한 최소 결합 서열을 포함한다. 추가의 측면에서, M2e는 
인 최소 결합 서열을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 상기 방법은 인간 M2 항체를 생산하는 동물 (예컨대, 비인간 동물) 또는 세포를 제공하는 단계; 및 상기 동물 또는 세포로부터 항체를 단리하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 인간 M2 항체를 생산하는 동물 (예컨대, 비인간 동물) 또는 세포를 제공하는 단계; 인간 M2 항체를 생산하는 동물로부터 비장 세포를 단리하는 단계; 비장 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산하는 단계; 및 인간 M2 항체를 발현하는 하이브리도마를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 다양한 측면에서, 상기 동물 또는 세포는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 13일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 생산된 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 특이성 또는 결합 친화성 또는 항-인플루엔자 바이러스 활성을 갖는 항체를 발현한다. 추가의 측면에서, 상기 동물 또는 세포는 
과 동일하거나 실질적으로 동일한 최소 결합 서열을 포함하는 M2 세포외 도메인에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 발현한다. 추가의 측면 에서, 상기 동물 또는 세포는 
인 최소 결합 서열을 포함하는 M2 세포외 도메인에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 발현한다. 추가의 측면에서, 상기 동물 또는 세포는
중 임의의 것 내에 포함되는 최소 결합 서열에 결합하는 항체를 발현한다.
도 1은 A/PR/8/34 감염된 세포의 표면 상의 M2에 대한 항체 번호 Z3G1의 결합이 가용성 M2 펩티드에 의해 특이적으로 억제되지만 비관련 단백질인 BSA에 의해서는 그렇지 않음을 나타낸다. A/PR/8/34 감염된 MDCK 세포에 대한 항체의 결합은 ELISA에 의해 측정하였다.
도 2는 M2 항체 Z3G1 (100 ㎍, 30 ㎍ 또는 10 ㎍/마우스), 또는 이소형 대조군 항체 (HSA)를 마우스 당 100 ㎍으로 투여하여 동물이 인플루엔자 바이러스 감염 으로 인해 사망하지 않도록 예방적으로 보호하는 것을 나타낸다. 치사량의 A/HK/1/68로 감염시키기 하루 전에 Z3G1 또는 HSA를 투여하였다. 감염 후 제1일 내지 제23일에 생존율을 측정하였다.
도 3은 감염된 동물의 폐에서 바이러스가 복제하는 것을 억제하는 데 있어서 M2 항체 Z3G1의 투여에 따른 예방적 효과를 나타낸다. 치사량 미만의 A/HK1/68을 투여하기 하루 전에 Z3G1 또는 HSA (이소형 대조군)를 마우스 당 30 ㎍으로 투여하였다. 지정된 시점에서의 플라크 검정에 의해 폐의 바이러스 역가를 측정하였다.
도 4는 항-M2 항체 Z3G1, L66, N547 및 C40G1의 보체 의존성 세포독성 (CDC) 활성을 대조군 항체 (HSA)와 비교하여 나타낸다.
도 5는 항-M2 항체 Z3G1, L66, N547 및 C40G1의 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성을 대조군 항체 (HSA)와 비교하여 나타낸다.
도 6은 M2 항체 Z3G1이 NK 고갈된 마우스를 치사량의 A/HK/1/68의 공격으로부터 보호하는 것을 나타낸다. 치사량의 A/HK/1/68로 감염시키기 하루 전에 NK 세포 고갈된 (NK) 또는 고갈되지 않은 (NK+) 마우스에게 항-M2 항체 Z3G1 또는 이소형 대조군 항체 (HSA)를 마우스 당 100 ㎍의 투여량으로 투여하였다. 감염 후 제1일부터 제23일까지 생존율을 관찰하였다.
도 7은 치료 요법에서 M2 항체 Z3G1이 마우스를 치사량의 A/HK/1/68의 공격으로부터 보호하는 것을 나타낸다. 치사량의 A/HK/1/68을 감염시킨 다음날 마우스에게 항-M2 항체 Z3G1을 마우스 당 200 ㎍, 100 ㎍ 또는 30 ㎍의 투여량으로 또는 이소형 대조군 항체 (HSA)를 마우스 당 200 ㎍의 투여량으로 투여하였다. 감염 후 제1일부터 제23일까지 생존율을 관찰하였다.
본 발명은 적어도 부분적으로는 인간, 인간화 및 키메라 항-M2 모노클로날 항체를 기초로 한다. 본 발명의 여러 항체들은 다양한 인플루엔자 A 바이러스 종를 기초로 하는 다양한 M2 세포외 도메인 서열에 대해 넓은 반응성을 갖는다. 예방 (바이러스 감염 이전) 및 치료 (바이러스 감염 이후) 마우스 인플루엔자 모델 둘 다에 본 발명의 인간 항-M2 모노클로날 항체를 수동으로 전달하여 인플루엔자A/HK/1/68의 치사량 공격으로부터 상기 동물을 보호하였다. 따라서, 본 발명의 항체는 넓은 범위의 인플루엔자 종 또는 단리물을 처리하는 데 있어서 유용하다. 또한, 본 발명의 인간 항체는 반복 투여하더라도 과민증을 유발할 가능성이 적으며, 보다 오랜 기간 동안 대상체 (예, 인간)의 체내에 잔류할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라, 인플루엔자 M2 단백질과 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 및 키메라 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 인플루엔자 단백질 M2 세포외/엑토-도메인 M2e에 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체가 제공된다. 특정 측면에서, M2e는 아미노산 서열 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (서열 2), 그의 일부 또는 그의 아미노산 변이체 (예, 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 부가), 예를 들어 SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD (서열 3)을 포함한다. 특정 측면에서, M2e는
로부터 선택된 아미노산 치환을 갖는다.
용어 "항체"는 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인인 VH 및 VL을 통해 다른 분자 (항원)과 결합하는 단백질을 의미한다. "항체"는 임의의 폴리클로날 또는 모노클로날 이뮤노글로불린 분자, 예를 들어 IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, 및 이들의 임의의 아군, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등을 의미한다. 또한, 용어 "항체"는 달리 기술하지 않는다면 이뮤노글로불린 분자의 기능성 단편 또는 하위서열, 예를 들어 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, Fd, scFv 및 sdFv를 의미한다.
용어 "M2 항체" 또는 "항-M2 항체"는 인플루엔자 M2 단백질, 예를 들면 M2 세포외/엑토-도메인 M2e에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 의미한다. 특이적 결합은 M2 단백질에 존재하는 에피토프에 대해 선택적인 결합이다. 즉, M2 이외의 단백질과의 결합은, 이러한 다른 단백질이 M2 항체에 의해 인식되도록 M2 단백질에서와 유사하거나 또는 동일한 에피토프 또는 최소의 결합 서열을 갖지 않는다면, M2의 검출을 유의하게 방해하지 않는 결합이다. 당업계에 공지된 분석법을 이용해서 선택적 결합을 비선택적 결합과 구별할 수 있다.
본 발명의 조성물 (예컨대, 항체, 수식된 형태, 하위서열, 이를 코딩하는 핵산 등)에 대한 수식어로서 사용되는 경우에 용어 "단리된"은, 본 발명의 조성물이 사람 수작업에 의해 제조되거나 또는 적어도 일부는 그의 자연 발생적인 생체내 환경으로부터 분리됨을 의미한다. 일반적으로, 단리된 조성물은 본래 예를 들면, 하나 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 세포막과 통상적으로 회합하는 하나 이상의 물질들을 실질적으로 함유하지 않는다. 용어 "단리된"은 다른 물리적인 형태, 예를 들면 폴리펩티드 다량체, 번역후 수식 (예컨대, 인산화, 글리코실화) 또는 유도체화된 형태를 배제하지 않는다.
"단리된" 조성물, 예를 들면 항체는 그가 본래 전형적으로 회합하는 물질들의 대부분 또는 전부가 없는 경우에 "실질적으로 순수한" 것일 수도 있다. 따라서, 실질적으로 순수한 단리된 항체는 수백만의 다른 서열 중에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 게놈 또는 cDNA 라이브러리에서 항체 라이브러리 또는 핵산의 항체를 포함하지 않는다. "실질적으로 순수한" 분자를 하나 이상의 다른 분자와 조합할 수 있다. 따라서, "실질적으로 순수한"은 조성물의 조합을 배제하지 않는다.
본 발명의 예시적인 M2 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 13일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA 5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 13일 기탁)로 표시된다. 예시적인 중쇄 서열 및 경쇄 서열은 실시예 1 (예컨대, 서열 34, 35 및 37)에 기재된 아미노산 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체와 관련하여 사용되는 경우에 용어 "모노클로날"은 임의의 진핵, 원핵 또는 파아지 클론을 비롯한 단일 클론을 기초로 하거나, 그로부터 얻어지거나 또는 그로부터 유도된 항체를 의미한다. 따라서, "모노클로날" 항체는 본원에서 구조적으로 정의되며, 그를 제조하는 방법은 기재하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체, 예를 들어 번호 Z3G1, N547, L66 및 C40G1을 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포주 (예, CHO)에 대해 제공된 구체적인 명칭, 숫자 또는 다른 표시는 항체를 지칭하는 데 사용될 수도 있다.
항체와 관련하여 사용되는 경우에 용어 "인간"은 항체의 아미노산 서열이 완전히 인간 서열임을 의미한다. 본원에서 "인간 M2 항체" 또는 "인간 항-M2 항체"는 인간 이뮤노글로불린 아미노산 서열, 즉 M2에 특이적으로 결합하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 즉, 항체 아미노산의 전체가 인간 서열이거나 또는 인간 항체에 존재한다. 따라서, 예를 들어, 비인간 항체는 비인간 아미노산 잔기를 인간 항체에 존재하는 아미노산 잔기로 치환함으로써 완전히 인간 항체로 만들 수 있다. 인간 항체에 존재하는 아미노산 잔기, CDR 영역 맵(map) 및 인간 항체 컨센서스 잔기는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ([Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed. US Department of Health and Human Services. Public Health Service (1987)]; 및 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 186:651 (1987)] 참조). 22개의 공지된 인간 VH III 서열의 조사를 기초로 하는 인간 VH 하위그룹 III의 컨센서스 서열 및 30개의 공지된 인간 카파 I 서열의 조사를 기초로 하는 인간 VL 카파-쇄 하위그룹 I의 컨센서스 서열은 문헌 [Padlan Mol. Immunol. 31:169 (1994); and Padlan Mol. Immunol. 28:489 (1991)]에 기재되어 있다. 따라서, 인간 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 임의의 다른 인간 항체에 존재하는 하나 이상의 아미노산으로 치환된 항체를 포함한다.
항체와 관련하여 사용되는 경우에 용어 "인간화"는, 항체의 아미노산 서열이 수용자(acceptor) 인간 이뮤노글로불린 분자에서 목적하는 항원 (예, M2)과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결정 영역 (CDR)의 비인간 아미노산 잔기 (예, 마우스, 래트, 염소, 토끼 등) 및 이러한 CDR을 플랭킹하는 아미노산 잔기인 Fv 프레임워크 영역 (FR)에서 하나 이상의 인간 아미노산 잔기를 가짐을 의미한다. 이뮤노글로불린의 인간 프레임워크 영역 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체할 수 있다. 따라서, 인간 프레임워크 영역의 잔기를 비인간 CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환하여, 예를 들어 항원 친화성 또는 특이성을 변화, 일반적으로는 향상시킬 수 있다. 또한, 인간화 항체는 인간 항체에도 존재하지 않고 공여자 CDR 또는 프레임워크 서열에도 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체 또는 공여자 비인간 항체에 존재하지 않는 특정 위치에서의 프레임워크 치환은 이러한 위치에서 인간 항체의 결합 친화성 또는 특이성을 향상시킬 것으로 예상할 수 있다. 분자 모델링을 기초로 하는 항체 프레임워크 및 CDR 치환은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링하여 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 동정하고, 서열 비교에 의해 특정 위치에서 통상적이지 않은 프레임워크 잔기를 동정한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호, 및 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)] 참조). 당업계에서 "영장류화된" 것으로 언급된 항체는, 수용자 인간 이뮤노글로불린 분자 및 프레임워크 영역 아미노산 잔기가 임의의 인간 잔기 이외에도 임의의 영장류 (예, 원숭이, 긴팔원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 마카크) 아미노산 잔기일 수 있음을 제외하면, 본원에 사용된 바와 같은 "인간화"의 의미내에 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체와 관련해서 사용되는 경우에 용어 "키메라" 및 그의 문법상 변형어는, 항체의 아미노산 서열이 2가지 이상의 상이한 종들로부터 유도되거나, 수득 또는 단리되거나, 또는 이들 종을 기초로 하는 하나 이상의 부위를 함유함을 의미한다. 즉, 예를 들어, 항체의 일부는 인간 서열 (예, 불변 영역)일 수 있으며, 항체의 다른 일부는 비인간 서열 (예, 쥐과동물 중쇄 또는 경쇄 가변 영역)일 수 있다. 따라서, 키메라 항체는 항체의 여러 부위들이 상이한 종에서 기원하는 분자이다. 인간화 항체와는 달리, 키메라 항체는 항체의 임의의 영역에서 상이한 종 서열을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "M2," "M2 단백질," "M2 서열" 및 "M2 도메인"은 자연 발생적이거나 또는 인공적으로 제조된 임의의 인플루엔자 바이러스 종 또는 단리물로부터 단리되거나, 이러한 종 또는 단리물을 기초로 하거나 또는 상기 종 또는 단리물에 존재하는 M2 단백질 서열의 전부 또는 일부 (예, 세포외 도메인과 같은 하위서열)를 의미한다. 따라서, M2 등과 같은 용어는, 바이러스 생활환 동안에 돌연변이에 의해 생성되거나 또는 선택적 압력 (예, 약물 요법, 숙주 세포 향성 또는 감염성의 확대 등)에 반응하여 생성된 자연 발생적인 M2 서열 변이체, 및 재조합적으로 또는 합성에 의해 제조된 M2 서열을 포함한다. M2e는 M2 서열의 세포외 부분 또는 "엑토도메인"을 지칭하는 데 사용된다.
용어 "M2 펩티드"는 전장 M2 단백질의 세포외 아미노산 서열 또는 엑토도메인 M2e를 지칭한다. 예시적인 M2e는 서열 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (서열 2)로 이루어진다. 부가의 예시적인 M2e 서열은
로 이루어진다.
본원에 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명의 M2 항체는 자연 발생적인 항체에서와 같이 각각 전장인 카파 또는 람다 경쇄 서열, 그의 혼합물 (즉, 카파 및 람다 쇄 서열의 융합물), 및 그의 하위서열/단편을 갖는 항체를 포함한다. 자연 발생적인 항체 분자는 2개의 카파 및 2개의 람다 경쇄를 함유한다. 카파 및 람다 경쇄 사이의 주요한 차이는 불변 영역의 서열에 있다.
본 발명의 M2 항체는 임의의 항체 군 또는 아군에 속할 수 있다. IgG에 대한 예시적인 아군으로는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 있다. 본 발명의 항체로는 인플루엔자 A의 유효한 치료 또는 예방적 처치 (즉, 인플루엔자 A 감염된 세포 또는 인플루엔자 A 바이러스의 사멸)를 위한 것으로 예상되는 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 보체-매개 세포독성 (CDC) 활성의 각각 또는 둘 다를 갖는 항체를 들 수 있다. IgG 아군 IgG1의 예시적인 M2 항체 (Z3G1, ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)는 ADCC 및 CDC 활성을 둘 다 나타낸다 (예를 들면, 실시예 5 참조).
본 발명의 M2 항체는 본원에 예시된 M2 항체의 결합 특이성을 갖는 항체, 예컨대 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA 5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 항체의 결합 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 한 측면에서, M2 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 또는 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 중 (H) 또는 경 (L) 쇄 서열, 또는 이들의 하위서열을 가지며, 단 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄 서열, 또는 하위서열은 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 또는 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)의 결합 특이성을 갖는다.
항체와 관련해서 사용되는 경우에 용어 "결합 특이성"은, 항체가 관련 항체와 동일한 항원성 에피토프의 전부 또는 일부와 특이적으로 결합함을 의미한다. 따라서, 번호 Z3G1로 표시되는 항체의 결합 특이성을 갖는 M2 항체는 번호 Z3G1로 표시되는 M2 항체와 동일한 에피토프의 전부 또는 일부와 특이적으로 결합한다. 따라서, 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체와 동일한 에피토프 또는 동일한 에피토프의 일부에 결합하는 항체가 제공된다.
항원성 에피토프의 부분은 에피토프의 하위서열 또는 일부를 의미한다. 예를 들어, 에피토프가 8개의 인접 아미노산을 포함하는 경우, 에피토프의 하위서열, 즉 에피토프의 부분은 상기 아미노산 서열 8개로 된 에피토프내의 7개 이하의 아미노산일 수 있다. 또한, 에피토프가 비인접 아미노산 서열, 예를 들어 서로 인접하지 않지만 단백질 폴딩으로 인해 에피토프를 형성하는 아미노산 5개로 된 서열 및 아미노산 8개로 된 서열을 포함하는 경우, 에피토프의 하위서열, 즉 에피토프의 부분은 상기 5 아미노산 서열 또는 8 아미노산 서열 단독일 수 있다.
본원에 예시된 M2 항체와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)의 결합과 경쟁한다. 본원에 예시된 M2 항체의 결합 특이성을 갖는 본 발명의 항체는 경쟁적 결합을 측정하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 본원에 개시된 면역분석법에 의해 특성화할 수 있다. 이러한 항체의 결합 친화성이 예시된 항체와 다를 수 있기 때문에 (즉, 더 크거나 더 작은 친화성을 가짐), 항체는 M2에 대한 결합에 있어서 경쟁하는 능력이 다를 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 결합을 95％ 이상, 90％ 이상, 85％ 이상, 80％ 이상, 75％ 이상, 70％ 이상, 65％ 이상, 60％ 이상, 55％ 이상, 50％ 이상, 45％ 이상, 40％ 이상, 35％ 이상 또는 30％ 이상, 또는 그보다 작게 경쟁적으로 억제한다.
특정 실시양태에서, 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체가 결합하는 M2 변이체 서열의 하나 이상에 결합한다. 추가의 특정 실시양태에서, 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 항체는, 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체가 결합하는 M2 변이체 서열의 적어도 5 내지 10개, 10 내지 15개, 15 내지 20개, 20 내지 25개 또는 그 이상과 결합하거나 또는 약하게 결합한다. 다른 특정 실시양태에서, 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 항체는, 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산된 항체가 결합하는 M2 변이체 서열의 적어도 10 내지 15개, 15 내지 20개, 20 내지 25개 또는 그 이상과 결합하거나 또는 약하게 결합하지만, 항-M2 항체 L66, N547, C40G1 또는 14C2 항체가 결합하는 M2 서열에는 결합하지 않거나 또는 단지 약하게만 결합한다.
에피토프는 통상적으로 짧은 아미노산 서열이며, 예를 들어 아미노산 약 5개 내지 15개 길이이다. 에피토프는 실시예 3에 기술된 바와 같이 동정될 수 있다. 또한, 에피토프를 동정하는 체계적인 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제4,708,871호에 기재되어 있다. 요컨대, M2 항원 (예, M2e)으로부터 유도된 오버랩핑 올리고펩티드 세트를 합성하여 핀들로 이루어진 고상 어레이에 결합시킬 수 있는데, 올리고펩티드는 각각의 핀에 대해 특이적이다. 핀들로 이루어진 어레이는 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어 항-M2 모노클로날 항체와의 결합에 있어서 96개의 올리고펩티드 모두를 동시에 분석할 수 있게끔 한다. 또는, 에피토프 맵핑에 있어서 시판되는 것으로는 파아지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키트 (New England BioLabs)가 있다. 이러한 방법들을 이용해서 연속적인 아미노산들의 가능한 모든 서브세트에 대한 결합 친화성을 측정함으로써 특정 항체가 결합하는 에피토프를 동정할 수 있다. 또한, 에피토프 길이 펩티드 서열을 사용해서 펩티드 서열과 결합하는 항체가 얻어지는 동물을 면역화하는 경우에 추정에 의해 에피토프를 동정할 수도 있다. 또한, 연속 에피토프는 당업계에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 비에피토프(BEPITOPE) [Odorico et al., J. Mol. Recognit. 16:20 (2003)]를 사용해서 예측할 수도 있다.
Z3G1에 대한 M2e의 예시적인 에피토프는 아미노산 서열, LLTEVETPIR (서열 1)의 범위 내이다. 또한, Z3G1에 대한 예시적인 에피토프는 아미노산 서열,
의 범위 내이다.
본원에 사용된 바와 같이, M2 펩티드와 관련하여 사용되는 경우에 용어 "최소 결합 서열"은 항-M2 항체와 M2 펩티드의 결합에 최소한 요구되는 M2 펩티드의 연속 아미노산 서열 (예컨대, 서열 1)을 의미한다. 최소 결합 서열은, N-말단이 절단된 M2 펩티드 및 C-말단이 절단된 M2 펩티드로 이루어진 다양한 펩티드를 생성시키고 실시예 3에 기술된 방법을 기초로 상기 펩티드에 대한 항체 결합을 측정함으로써 측정된다. 따라서, 최소 결합 서열은 항체와 펩티드의 결합에 최소한 요구되는 M2 펩티드 내의 서열의 N-말단 및 C-말단 경계를 나타낸다. 실시예 3에 개시된 바와 같이, Z3G1에 대한 예시적인 최소 결합 서열로는 LLTEVETPIR (서열 1)이 있다.
최소 결합 서열 (MBS)은 M2 항체 파라토프가 결합하며 항-M2 항체 결합을 매개하는 데 충분한 에피토프의 전체 또는 일부를 함유한다. 에피토프는 항체 결합을 매개하는, 최소 결합 서열 내의 3 내지 4개 또는 그 이상의 연속 또는 비연속 아미노산 서열을 함유한다.
용어 "동일한 최소 결합 서열"은 항체의 최소 결합 서열이 기준 항체의 것과 동일함을 의미한다. 따라서, Z3G1로 표시되는 항체와 동일한 최소 결합 서열을 갖는 M2 항체는 Z3G1로 표시되는 M2 항체와 동일한 최소 결합 서열에 특이적으로 결합한다. 용어 "실질적으로 동일한 최소 결합 서열" 및 그의 문법상 유사어는 기준 항체의 최소 결합 서열과 비교해서 N-말단 및/또는 C-말단에서 단일 아미노산 부가 또는 결실을 갖는 항체의 최소 결합 서열을 의미한다. 따라서, Z3G1로 표시되는 항체와 실질적으로 동일한 최소 결합 서열을 갖는 M2 항체는 Z3G1로 표시되는 M2 항체에 대한 최소 결합 서열과 비교해서 N-말단 및/또는 C-말단에서 단일 아미노산 부가 또는 결실을 갖는 최소 결합 서열에 특이적으로 결합한다.
동일하거나 실질적으로 동일한 최소 결합 서열에 결합하는 항체의 비제한적 예로서, Z3G1에 대한 최소 결합 서열은 LLTEVETPIR (서열 1)이다. 따라서, Z3G1과 동일한 최소 결합 서열을 갖는 항체는 LLTEVETPIR (서열 1) 최소 결합 서열을 가질 것이다. Z3G1의 실질적으로 동일한 최소 결합 서열은 예를 들면 LTEVETPI (서열 27), LLTEVETPI (서열 28), SLLTEVETPIR (서열 29), LLTEVETPIRN (서열 30), LTEVETPIR (서열 31) 등일 수 있다. 따라서, Z3G1과 실질적으로 동일한 최소 결합 서열에 결합하는 항체는 예를 들면, LTEVETPI (서열 27), LLTEVETPI (서열 28), SLLTEVETPIR (서열 29), LLTEVETPIRN (서열 30), LTEVETPIR (서열 31) 등의 어느 하나에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 예시된 항-M2 항체인 Z3G1과 동일하거나 실질적으로 동일한 최소 결합 서열을 갖는 항체를 제공한다.
다른 항-M2 항체와 동일한 또는 실질적으로 동일한 최소 결합 서열을 갖는 항-M2 항체를 얻기 위해, 항체와 M2 펩티드의 결합에 있어서 경쟁하는 항체를 통상의 경쟁 결합 검정을 이용해서 스크리닝한다. 기준 항체와 동일한 또는 실질적으로 동일한 최소 결합 서열을 갖는 스크리닝된 항체는 실시예 3에 기술된 바와 같이 선별한다. 비제한적 예로서 Z3G1의 경우에는 제1 단계에서, 경쟁 결합 검정을 이용해서 항-M2 항체 중에서 M2 펩티드에 대한 결합에서 Z3G1과 경쟁하는 항체를 스크리닝한다. 제2 단계에서, M2에 대한 결합에서 Z3G1과 경쟁하는 항체는 Z3G1과 동일한 또는 실질적으로 동일한 최소 결합 서열, 즉 LLTEVETPIR (서열 1) 최소 결합 서열, 또는 실질적으로 동일한 최소 결합 서열, 예를 들면, LTEVETPI (서열 27), LLTEVETPI (서열 28), SLLTEVETPIR (서열 29), LLTEVETPIRN (서열 30), LTEVETPIR (서열 31) 등에 결합하는 능력에 대하여 선별된다.
또한, 본 발명의 M2 항체는 본원에 예시된 M2 항체와 동일한 결합 친화성 및 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 인간, 인간화 및 키메라 항체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 M2 항체는 기준 항체에 비해 2 내지 5 배, 5 내지 10 배, 10 내지 100 배, 100 내지 1000 배 또는 1000 내지 10,000 배 크거나 작은 친화성 또는 이러한 범위 내의 임의의 수치 값 또는 값들의 범위를 가질 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서 본 발명은 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 항체와 동일한 결합 친화성 및 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 M2 항체를 제공하며, 단 이들의 중쇄 또는 경쇄 서열, 또는 하위서열은 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)의 결합 특이성을 갖는다.
결합 친화성은 결합 (Ka) 및 해리 (Kd) 속도에 의해 결정할 수 있다. 평형 친화성 상수 K는 Ka/Kd의 비이다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체 결합 친화성과 관련하여 사용되는 경우에 용어 "동일한"은 해리 상수 (Kd)가 기준 항체의 약 1 내지 100 배 (기준 항체보다 1 내지 100 배 더 큰 친화성 또는 1 내지 100 배 더 작은 친화성, 또는 이러한 범위 내의 임의의 수치 값 또는 값들의 범위) 이내임을 의미한다. 항체 결합 친화성과 관련하여 사용되는 경우에 용어 "실질적으로 동일한"은 해리 상수 (Kd)가 기준 항체의 약 5 내지 5000 배 (기준 항체보다 5 내지 5000 배 더 큰 친화성 또는 5 내지 5000 배 더 작은 친화성) 이내임을 의미한다. 결합 상수 (Ka)와 관련하여 사용되는 경우에 용어 "동일한"은 기준 항체의 약 1 내지 100 배 이내 (기준 항체보다 1 내지 100 배 더 크거나 또는 1 내지 100 배 더 작은 결합 상수 Ka)임을 의미한다. 결합 상수 (Ka)와 관련하여 사용되는 경우에 용어 "실질적으로 동일한"은 결합 상수가 기준 항체의 결합 상수 Ka보다 약 5 내지 5000 배 더 크거나 또는 더 작음 (기준 항체보다 5 내지 5000 배 더 크거나 또는 5 내지 5000 배 더 작은 기준 항체)을 의미한다.
적어도 일부의 결합 친화성이란, 항체가 더 작은 친화성을 갖는 경우, 예컨대 1 내지 3 배, 1 내지 5 배, 2 내지 5 배, 5 내지 10 배, 5 내지 15 배, 10 내지 15 배, 15 내지 20 배, 20 내지 25 배, 25 내지 30 배, 30 내지 50 배, 50 내지 100 배, 100 내지 500 배 500 내지 1000 배, 1000 내지 5000 배 작거나 또는 이보다 더 작거나 (예컨대, Kd), 또는 이러한 범위 내의 임의의 수치 값 또는 값들의 범위일 수 있다. 적어도 일부의 결합 친화성이란, 항체가 더 큰 친화성을 갖는 경우, 예컨대 1 내지 3 배, 1 내지 5 배, 2 내지 5 배, 5 내지 10 배, 5 내지 15 배, 10 내지 15 배, 15 내지 20 배, 20 내지 25 배, 25 내지 30 배, 30 내지 50 배, 50 내지 100 배, 100 내지 500 배 500 내지 1000 배, 1000 내지 5000 배 더 크거나 또는 이보다 더 크거나 (예컨대, Kd), 또는 이러한 범위 내의 임의의 수치 값 또는 값들의 범위일 수 있다.
결합 (Ka) 및 해리 (Kd) 속도는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) ([Rich and Myszka, Curr. Opin. Biotechnol. 11:54 (2000)]; [Englebienne, Analyst. 123:1599 (1998)])을 이용해서 측정할 수 있다. 결합 속도의 실시간 검출 및 모니터링을 위한 장치 및 방법은 공지되어 있으며 시판된다 ([BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Sweden]; 및 [Malmqvist, Biochem. Soc. Trans. 27:335 (1999)]). 본원에 기재된 예시적인 항체에 대한 Kd 값은 A/PR/8/34 또는 A/HK/1/68 감염된 MDCK 세포의 표면에서 M2 항원 상의 결합 부위의 절반 (50％)을 포화시키는데 필요한 항체 농도로서 정의된다.
본 발명에 포함된 추가의 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)로으로 표시되는 항체의 결합 특이성, 및 5 x 1O-2 M, 10-2 M, 5 x 1O-3 M, 10-3 M, 5 x 1O-4 M, 10-4 M, 5 x 1O-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 1O-6 M, 5 x 1O-7 M, 10-7 M, 5 x 1O-8 M, 1O-8 M, 5 x 1O-9 M, 10-9 M, 5 x 1O-10 M, 1O-10 M, 5 x 1O-11 M, 10-11 M, 5 x 1O-12 M, 10-12 M, 5 x 1O-13 M, 10-13 M, 5 x 1O-14 M, 1O-14 M, 5 x 1O-15 M, 및 1O-15 M 미만의 해리 상수 (Kd)를 갖는 M2에 대한 결합 친화성을 갖는다. 본 발명에 추가로 포함된 항체는 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 2004년 3월 11일 기탁, 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 항체가 결합하는 에피토프에 결합한다. 다른 추가의 항체는 세포 기반 ELISA 분석으로 측정했을 때, MDCK 세포의 인플루엔자 A 바이러스 감염을 억제하는 EC50이 2.0 내지 3.0 ㎍/ml 미만, 1.0 내지 2.0 ㎍/ml 미만, 0.5 내지 1.0 ㎍/ml 미만, 0.1 내지 0.5 ㎍/ml 미만 또는 0.1 ㎍/ml 미만 (예컨대, 0.05 내지 0.1 ㎍/ml)이다.
본 발명의 인간 M2 항체는 본원에 예시된 M2 항체의 하나 이상의 항-인플루엔자 활성의 적어도 일부 (예컨대, 세포 시험관내 또는 생체내 인플루엔자 바이러스 감염의 억제, 인플루엔자 바이러스 증식 또는 복제의 억제, 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 감소, 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 감수성의 감소, 인플루엔자 바이러스 감염으로부터의 회복 촉진 등)를 갖는 항체를 포함한다. 따라서, 추가의 실시양태에서 본 발명은 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 또는 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 항체의 하나 이상의 항-인플루엔자 활성의 적어도 일부를 갖는 M2 항체를 제공한다.
항체와 관련 항체를 비교하는 데 사용되는 경우에 용어 "활성"은, 이 항체가 관련 항체로서의 활성, 예를 들어 결합 친화성 (예, Kd), 결합 특이성 또는 항-인플루엔자 활성의 적어도 일부를 가짐을 의미한다. 따라서, Z3G1로 표시되는 M2 항체의 활성을 갖는 항체는 Z3G1로 표시되는 M2 항체의 하나 이상의 활성의 적어도 일부를 갖는다. 용어 "적어도 일부"는 항체가 적은 활성을 가질 수 있지만, 이 항체가 관련 M2 항체의 활성의 적어도 측정가능한 또는 검출가능한 양, 예를 들어 M2에 대한 결합 친화성의 적어도 일부, 적어도 부분적인 항-인플루엔자 활성 등을 보유함을 의미한다. 본원에 예시된 M2 항체의 하나 이상의 항-인플루엔자 활성의 적어도 일부를 갖는 본 발명의 인간 M2 항체는 기준 항체, 예를 들면 본원에 예시된 M2 항체보다 더 큰 활성을 가질 수도 있다.
예시된 인간 M2 항체의 활성을 갖는 항체는 본원에 개시되어 있거나 또는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 동정할 수 있다. 예를 들면, 코팅 항원으로서 플레이트-결합된 M2 펩티드를 사용하는 결합 분석 (ELISA), 바이러스 감염된 MDCK 세포 상의 M2 단백질에 대한 결합 분석 (세포 기반 ELISA), 및 M2 펩티드 (M2e)를 갖는 바이러스 감염된 MDCK 세포 상의 M2 (M2 세포외 부위)에 결합하는 항체의 특이적 억제를 이용한다. 추가의 분석으로는 인플루엔자 바이러스를 사용하는 시험관내 세포 감염성 분석 [Zebedee et al. J Virology 62:2762 (1988)] 및 실시예 1, 3 및 4에 기재된 생체내 동물 분석을 들 수 있다.
인간 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제조하는 방법은 본원에 개시되어 있으며, 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이, 단백질의 혼합물, KLH 또는 BSA에 접합된 M2 펩티드 및 M2SG 펩티드를 사용해서 인간 트랜스염색체 KM 마우스(상표명) (WO 02/43478) 또는 HAC 마우스 (WO 02/092812)를 면역화하였다. KM 마우스(상표명) 또는 HAC 마우스는 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현시킨다. 통상의 하이브리도마 기술을 이용하여, M2 항원에 대한 고(high) 반응자였던 면역화된 마우스로부터 비장세포를 단리하고, 골수종 세포와 융합시켰다. 번호 Z3G1로 표시되는 모노클로날 항체를 얻었는데, 이들은 M2 펩티드 및(또는) M2-BSA 접합체와는 반응하였지만, BSA 또는 KLH 운반체와는 결합하지 않았다. 인간 항체의 제조를 위한 기술의 개요는 문헌 [Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65 (1995)]에 기재되어 있다. 내생성 이뮤노글로불린을 발현시키지 않는 하나 이상의 인간 이뮤노글로불린 유전자 (카파 또는 람다)를 갖는 유전자변환 동물은 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호에 기재되어 있다. 인간 폴리클로날 항체 및 인간 모노클로날 항체를 제조하는 추가의 방법은 문헌 (예를 들어, [Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol. 20:889 (2002)]; WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 제5,413,923호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 동 제5,569,825호; 동 제5,661,016호; 동 제5,545,806호; 동 제5,814,318호; 동 제5,885,793호; 동 제5,916,771호; 및 동 제5,939,598호 참조)에 기재되어 있다.
M2 모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파아지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합을 비롯한 다른 기술을 이용해서 쉽게 생성시킬 수도 있다 (미국 특허 제4,902,614호, 동 제4,543,439호 및 동 제4,411,993호 참조; 또한, 문헌 ([Monoclonal Antibodies, Hvbridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.), 1980] 및 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)] 참조). 본 발명의 방법에 추가로 이용할 수 있는 적합한 기술로는 M2 친화성 정제, 비변성 겔 정제, 단백질 A 컬럼 상 HPLC 또는 RP-HPLC 정제, 또는 이들 기술의 임의의 조합 등을 들 수 있다. 항체 이소형은 ELISA 분석을 이용해서 결정할 수 있으며, 예를 들어 인간 Ig는 마우스 Ig-흡착된 항-인간 Ig를 사용해서 동정할 수 있다.
항체는, 예를 들어 CDR-그래프팅(EP 239,400; W0 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 동 제5,530,101호; 및 동 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 리서피싱(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596; [Padlan, Molecular Immunol. 28:489 (1991)]; [Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994)]; [Roguska. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91:969 (1994)]), 및 체인 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 제5,565,332호)를 비롯해서 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용해서 인간화할 수 있다. 이미 인간 컨센서스 서열 ([Padlan Mol. Immunol. 31:169 (1994)]; 및 [Padlan Mol. Immunol. 28:489 (1991)])을 사용해서 항체를 인간화한 바 있다 ([Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)]; 및 [Presta et al. J. Immunol. 151:2623 (1993)]).
키메라 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ([Morrison, Science 229:1202 (1985)]; [Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986)]; [Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191]; 및 미국 특허 제5,807,715호; 동 제4,816,567호; 및 동 제4,816,397호). 하나의 종의 항체로부터의 가변 도메인이 다른 종의 가변 도메인으로 치환된 키메라 항체는 예를 들어 문헌 ([Munro, Nature 312:597 (1984)]; [Neuberger et al., Nature 312:604 (1984)]; [Sharon et al., Nature 309:364 (1984)]; [Morrison et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)]; [Boulianne et al., Nature 312:643 (1984)]; [Capon et al., Nature 337:525 (1989)]; 및 [Traunecker et al., Nature 339:68 (1989)])에 기재되어 있다.
항체를 제조하는 데 적합한 M2 단백질은 당업계에 공지된 다양한 표준 단백질 정제 또는 재조합 발현 기술들 중 어떤 것에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, M2는 표준 펩티드 합성 기술, 예를 들어 고상 합성에 의해 제조할 수 있다. 이 단백질의 일부는 발현 또는 합성된 M2의 정제를 용이하게 하기 위해 T7 태그 또는 폴리히스티딘 서열과 같은 아미노산 서열을 함유할 수 있다. M2는 세포에서 발현될 수 있으며, 세포에 의해 제조된 단백질은 정제할 수 있다. M2 단백질은 재조합 방법에 의해 더 큰 단백질의 일부로서 발현될 수도 있다.
면역 반응을 발생시키는데 적합한 M2의 형태는 전장 M2의 펩티드 하위서열, 예를 들면 M2e (예, 통상적으로 아미노산 4개 내지 5개, 또는 그 이상의 길이임)을 포함할 수 있다. M2의 다른 형태는 M2 함유 제제 또는 추출물, 부분적으로 정제된 M2, 및 M2를 발현시키는 세포 또는 바이러스, 또는 이러한 발현성 세포 또는 바이러스의 제제를 포함한다.
면역화할 수 있는 동물로는 마우스, 토끼, 래트, 양, 소 또는 수송아지(steer), 염소 또는 기니 피그를 들 수 있는데, 이러한 동물들은 인간 IgG 유전자 로커스(locus)를 포함하도록 유전적으로 수식된 것들을 포함한다. 따라서, 이러한 동물들을 이용해서 본 발명에 따라 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 또한, 면역 반응을 증가시키기 위해, M2를 다른 단백질, 예를 들어 난알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 티로글로불린 및 파상풍 독소와 연결하거나, 또는 프로인트(Freund's) 완전 또는 불완전 보조제 등의 보조제와 혼합할 수 있다. 초기 및 이후의 임의의 면역화는 복강내, 근육내, 안내 또는 피하 경로를 통한 것일 수 있다. 이후의 면역화는 M2 항원 제제와 동일한 농도 또는 상이한 농도에서 규칙적인 간격 또는 불규칙한 간격으로 수행할 수 있다.
따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 항-인플루엔자 활성을 갖는, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염, 복제, 증식 또는 역가를 억제하거나, 바이러스 복제, 증식 또는 역가의 증가를 억제하거나, 인플루엔자 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성, 또는 감염에 대한 감수성을 감소시키거나, 또는 다양한 인플루엔자 바이러스 종 또는 단리물에 대해 넓은 반응성을 갖는 항체를 비롯한 인간 M2 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 M2 또는 그의 면역원성 단편을 인간 이뮤노글로불린을 발현시킬 수 있는 동물 (예, 마우스, 소 또는 수송아지)에게 투여하는 단계, 인간 M2 항체를 발현시키는 동물을 스크리닝하는 단계, 인간 M2 항체를 생성시키는 동물을 선별하는 단계, 인간 M2 항체를 생산하는 동물로부터 항체를 단리하는 단계, 및 인간 M2 항체가 M2에 결합하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 인간 M2 또는 그의 면역원성 단편을 인간 이뮤노글로불린을 발현시킬 수 있는 동물 (예, 마우스, 소 또는 수송아지)에게 투여하는 단계, 인간 M2 항체를 생산하는 마우스로부터 비장 세포를 단리하는 단계, 비장 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조하는 단계, 및 하이브리도마를 항-인플루엔자 활성을 갖는 인간 M2 항체의 발현에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함한다.
본 발명은 수식된 인간 M2 항체를 추가로 제공한다. 수식의 예로는 항체의 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 들 수 있으며, 단 수식된 항체는 비수식된 M2 항체의 활성, 예를 들어 결합 친화성, 특이성 또는 항-인플루엔자 활성 등의 전부 또는 적어도 일부를 갖는다.
수식의 특정 예는 본 발명의 항체가, 예를 들어 중쇄 불변 영역의 치환에 의해 상이한 이소형 또는 아군을 갖도록 변형된 경우이다 (예를 들어, 실시예 2 참조). IgG3에서 IgG1까지의 M2 항체 Z3의 Ig 아군의 수식은 항-인플루엔자 활성을 향상시킨다. 따라서, 수식은 항체로부터 아미노산 서열의 작은 영역 및 큰 영역을 결실시키고, 결실된 영역을, 서열 길이가 결실된 영역보다 길던지 짧던지 간에 다른 아미노산 서열로 치환하는 것을 포함한다.
본 발명에 포함된 M2 항체의 추가의 수식은 항체 유도체, 즉 임의의 형태를 갖는 분자가 항체와 공유결합 부착하는 것이다. 항체 유도체의 구체적인 예로는 글리코실화된 항체, 아세틸화된 항체, 인산화된 항체, 아미드화된 항체, 포르밀화된 항체, 유비퀴틴화된 항체, 보호기/차단기에 의해 유도체화된 항체, 및 수많은 화학적 수식 중 어떤 것에 의해 수식된 항체를 들 수 있다.
자연 발생적인 L-아미노산이 D-형태의 아미노산으로 치환된다는 것을 제외하면, 아미노산 치환은 동일한 아미노산으로 수행될 수 있다. 따라서, 수식은 L-아미노산을 치환하는 하나 이상의 D-아미노산, 또는 L-아미노산을 치환하는 D-아미노산의 혼합물을 포함한다. 추가로 수식은 구조적 및 기능적 유사체, 예를 들면 합성 또는 비천연 아미노산 또는 아미노산 유사체 및 유도체화된 형태를 갖는 펩티드모방체를 포함한다.
수식은 시클릭 구조, 예를 들면 분자의 아미노 및 카르복시-말단 사이의 말단-대-말단 아미드 결합, 또는 분자내 또는 분자간 디술피드 결합을 포함한다. 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩티드를 수식할 수 있으며, 예컨대 번역 후에 수식하여, 예를 들면 슈가 잔기, 포스페이트기, 유비퀴틴, 지방산, 지질 등을 포함하도록 할 수 있다.
수식은 기준 조성물의 활성 또는 기능 (예컨대, M2에 대한 특이적 결합)을 포함한다. 변화된 특성, 예를 들면 증가된 결합 친화성을 갖는 수식된 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용해서 생산할 수 있다. 예를 들면, 친화성 성숙화 기술을 이용해서 항체 결합 친화성을 개선시킬 수 있다 (US 2004/0162413 A1; 미국 특허 제6,656,467호, 동 제6,531,580호, 동 제6,590,079호 및 동 제5,955,358호; [Fiedler et al., Protein Eng. 15:931 (2002)]; [Pancook et al., Hybrid. Hybridomics 20:383 (2001)]; [Daugherty et al., Protein Eng. 11:825 (1998)]; [Wu et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6037 (1998)]; 및 [Osbourn et al., Immunotechnology 2:181 (1996)]).
수식된 단백질은 아미노산 치환, 부가 또는 결실 (예컨대, 1 내지 3개, 3 내지 5개, 5 내지 10개 또는 그 이상의 잔기)을 가질 수 있다. 특정한 비제한적 예에서, 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
아미노산 치환은 보존적이거나 비보존적일 수 있으며, 항체의 불변 영역 또는 가변 영역에서 행해질 수 있다. 불변 영역 또는 가변 영역에서의 하나 또는 몇몇 보존적 아미노산 치환은 허용될 수 있다. 초가변 영역 내의 여러 아미노산의 비보존적 치환은 결합 활성, 특이성 또는 항체 기능 또는 활성에 영향을 줄 수 있다.
영역 변이능(mutability) 분석을 이용해서 CDR 및 FR 도메인에서 특정 치환물의 영향을 예측할 수 있다 [Shapiro et al., J Immunol. 163:259 (1999)]. 요컨대, 서열 비교는 Ig 인트론 DNA 내에 위치한 디- 및 트리-뉴클레오티드 서열들 중에서 변이능의 분류체계를 나타내며, 이로써 더 변할 수 있거나 또는 덜 변할 수 있는 영역을 예측한다. 정량적 구조-활성 관계 (QSAR)를 이용해서 항체 인식 도메인, 따라서 리간드 결합에 관여하는 아미노산의 특성을 확인할 수 있다. 달리 말하면, QSAR을 기초로 하는 예상 모델을 이용해서 돌연변이의 효과를 예측할 수 있다. 예를 들면, 항체와 그의 항원과의 상호작용에서의 결합 및 해리 속도에 대한 돌연변이의 효과를 이용해서 반응속도 (Ka 및 Kd) 상수 둘 다에 대한 정량적 예측 모델을 구성하며, 즉 이를 이용해서 항체에 대한 다른 돌연변이의 효과를 예측할 수 있다 [De Genst et al., J Biol. Chem. 277:29897 (2002)].
비치환된 항체의 결합 활성, 특이성 또는 항체 기능 또는 활성의 적어도 일부를 보유하는 항체를 동정하기 위해, 치환 효과를 검정할 수 있다. 예를 들면, 결합 활성 또는 특이성, 또는 항-인플루엔자 활성에 대하여 초가변 영역 내의 아미노산 치환을 검정할 수 있다. 치환된 항체가 기준 항체 (예컨대, 비수식된 인간 M2 항체)의 결합 친화성, 결합 특이성, 또는 항-인플루엔자 활성의 적어도 일부를 보유하기만 한다면, 아미노산 치환을 갖는 상기 항체가 포함된다.
"보존적 치환"은 하나의 아미노산을 생물학적으로, 화학적으로 또는 구조적으로 유사한 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 생물학적으로 유사한이란 치환이 생물학적 활성에 적합한 것, 예컨대 M2에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 구조적으로 유사한이란 아미노산이 유사한 길이를 갖는 측쇄를 갖는 것 (예, 알라닌, 글리신 및 세린), 또는 유사한 크기를 갖는 측쇄를 갖는 것을 의미한다. 화학적 유사성이란 잔기가 동일한 전하를 갖거나 또는 둘 다 친수성 또는 소수성인 것을 의미한다. 특정한 비제한적 예로는 하나의 소수성 잔기, 예를 들면 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌을 다른 것으로 치환하는 것, 또는 하나의 극성 잔기를 다른 것으로 치환하는 것, 예를 들면 아르기닌을 세린으로 치환하는 것, 아스파르트산을 글루탐산으로 치환하는 것, 또는 글루타민을 아스파라긴으로 치환하는 것, 및 세린을 쓰레오닌으로 치환하는 것을 들 수 있다.
수식된 항체는 번호 Z3G1로 표시되는 모노클로날 항체의 서열과 50 내지 100％, 또는 50％, 60％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 동일성은 단백질의 한정된 부위 (영역 또는 도메인) 상에서 나타날 수 있다.
용어 "동일성" 및 그의 문법상 유사어는 언급된 둘 이상의 존재가 동일한 것을 의미한다. 따라서, 항체 서열들이 동일한 경우, 이들 서열은 동일한 아미노산 서열을 갖는다. "동일성이 있는 부위, 영역 또는 도메인"은 언급된 둘 이상의 존재의 일부가 동일한 것을 의미한다. 따라서, 두 개의 항체 서열이 하나 이상의 서열 영역에서 동일한 경우, 상기 항체 서열은 그러한 영역에서 동일성을 공유한다. 용어 "실질적인 동일성"은 동일성이 구조적으로 또는 기능적으로 유의함을 의미한다. 즉, 분자가 상이하더라도, 구조적으로 동일하거나 또는 하나 이상의 동일한 기능 (예컨대, M2에 대한 특이적 결합)을 갖도록 동일성이 존재한다.
구조적으로 및 기능적으로 관련된 단백질 사이에서의 서열 보존량의 변화로 인해, 실질적인 동일성에 관한 서열 동일성의 양은 단백질, 영역, 및 이 영역의 임의의 기능에 따라 달라질 것이다. 실질적인 동일성을 갖는 단백질의 경우에 서열 동일성은 30％와 같이 작을 수 있지만, 기준 서열에 대한 동일성은 전형적으로는 더 많이, 예컨대 50％, 60％, 75％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％로 존재한다. 핵산 서열의 경우, 전형적으로는 50％ 또는 그보다 많은 서열 동일성이 실질적인 상동성을 구성하지만, 또한 비교 영역 및 그의 기능 (존재하는 경우)에 따라 달라질 수 있다.
당업계에 공지된 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘을 이용해서 두 서열 사이의 동일성 정도를 확인할 수 있다. ％ 서열 동일성 (상동성)을 계산하는 이러한 알고리즘은 일반적으로 비교 영역에서의 서열 갭 및 미스매치를 설명한다. 예를 들면, BLAST (예컨대, BLAST 2.0) 검색 알고리즘 (예컨대, NCBI를 통해 공개적으로 이용할 수 있는 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)])는 다음과 같은 예시적인 검색 파라미터를 갖는다: 미스매치 -2; 갭 오픈 5; 갭 연장 2. 폴리펩티드 서열 비교에서는, 전형적으로 BLASTP 알고리즘을 점수부여(scoring) 매트릭스, 예를 들면 PAM 100, PAM 250, BLOSUM 62 또는 BLOSUM 50와 함께 사용한다. 또한, FASTA (예컨대, FASTA2 및 FASTA3) 및 SSEARCH 서열 비교 프로그램을 사용해서 동일성의 정도를 정량한다 ([Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]; [Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185 (2000)]; 및 [Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)]). 또한, 들로네(Delaunay)-기초의 위상기하학적 맵핑을 이용하여 단백질의 구조적 유사성을 정량하기 위한 프로그램이 개발되었다 [Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)].
본 발명의 인간 모노클로날 M2 항체는 본원에 기재된 바와 같은 하위서열 (예, 단편) 및 수식된 형태 (예, 서열 변이체)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 M2 항체 하위서열은 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일쇄 Fv (scFv), 단일쇄 항체, 디술피드-연결된 Fv (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인 단편을 포함한다. 특정 측면에서, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일쇄 Fv (scFv), 단일쇄 항체, 디술피드-연결된 Fv (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인 하위서열은 동일한 결합 친화성, 실질적으로 동일한 결합 친화성, 동일한 결합 특이성, 또는 하나 이상의 항-인플루엔자 활성, 예를 들어 관련 M2 항체 (예, 전장 또는 비수식된 M2 항체)로서 시험관내 또는 생체내에서 세포의 인플루엔자 감염을 억제하는 효능을 갖는다. 개별적인 M2-결합 항체 하위서열을 조합할 수 있다. 예를 들면, 링커 서열에 의해 VL 또는 VH 하위서열의 조합을 연결시켜 VL-VH 키메라를 형성시킬 수 있다. 링커 서열에 의해 단일쇄 Fvs (scFv) 하위서열의 조합을 연결하여 scFv-scFv 키메라를 형성시킬 수 있다. 단일쇄 항체를 비롯한 M2-결합 항체 하위서열은 가변 영역(들)만을 포함하거나 또는 이들 영역(들)을 다른 하위서열의 전부 또는 일부와 함께 포함하거나, 상기 영역(들)을 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인 중 하나 이상의 전부 또는 일부와 함께 포함한다. 또한, 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의의 조합의 항원-결합 하위서열이 포함된다.
본 발명의 M2 항체 하위서열 (예, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, sdFv 및 VL 또는 VH)은 항체의 단백질분해성 가수분해, 예를 들어 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 항체를 언급하는 경우에 용어 "기능성 하위서열" 및 "기능성 단편"은 원형 관련 항체로서 하나 이상의 기능 또는 활성의 적어도 일부를 보유하는 항체의 일부를 의미한다.
펩신을 사용한 효소적 절단에 의해 제조되는 항체 단편은 F(ab')2로 표시되는 5S 단편을 제공한다. 티올 환원제를 사용해서 이러한 단편을 추가로 절단하여 3.5S Fab' 1가 단편을 제조할 수 있다. 펩신을 사용하는 효소적 절단으로 2가지 1가 Fab' 단편 및 Fc 단편을 직접 제조한다 (예를 들어, 미국 특허 제4,036,945호 및 동 제4,331,647호; 및 문헌 [Edelman et al. Methods in Enzymol. 1:422 (1967)] 참조). 또한, 항체를 절단하는 다른 방법, 예를 들어 중쇄를 분리하여 1가 경쇄-중쇄 단편을 형성시키는 방법, 단편을 추가로 절단하는 방법, 또는 다른 효소적 또는 화학적 방법을 이용할 수도 있다. 유전자 기술로는 M2 항체 유전자의 전부 또는 일부를 Cos 세포 또는 이. 콜라이와 같은 숙주 세포내로 발현시키는 기술을 들 수 있다. 재조합 숙주 세포는 원형 또는 단일 항체 쇄, 예를 들어 scFv를 합성한다 (예를 들어, 문헌 [Whitlow et al., In: Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991)]; [Bird et al., Science 242:423 (1988)]; 미국 특허 제4,946,778호) 참조). 단일쇄 Fv 및 항체는 문헌 (미국 특허 제4,946,778호 및 동 제5,258,498호; [Huston et al., Methods Enzymol. 203:46 (1991)]; [Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995 (1993)]; 및 [Skerra et al., Science 240:1038 (1988)])에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
본 발명에 포함된 M2 항체의 추가의 수식은 항체 부가/삽입이다. 예를 들면, 부가는 항체에 대한 임의의 유형의 분자의 공유적 또는 비공유적 부착일 수 있다. 항체 부가의 구체적인 예로는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 포르밀화, 유비퀴틴화, 및 보호/차단 기에 의한 유도체화 및 임의의 다수의 화학적 수식을 들 수 있다.
부가는 서열에 공유적으로 부착된 기준 천연 (야생형) 서열에는 일반적으로 존재하지 않는 하나 이상의 분자를 갖는 아미노산 서열인 융합 (키메라) 폴리펩티드 서열을 추가로 포함한다. 특정 예로는 다중특이적 항체를 생산하는 다른 항체의 아미노산 서열이 있다.
아미노산이 부가된 수식된 M2 항체의 다른 특정 예로는 제2 이종 서열, 즉 이종 기능성 도메인을 부착하여 항체에 상이한 기능 또는 상보적 기능을 부여하는 예가 있다. 예를 들어, 아미노산 태그, 예를 들어 T7 또는 폴리히스티딘을 부착시켜 M2 또는 인플루엔자 바이러스의 정제 또는 검출을 용이하게 할 수 있다. 또 다른 예는 항바이러스제를 M2 항체에 부착시켜 인플루엔자로 감염된 세포를 표적화함으로써 바이러스를 사멸시키고, 증식을 억제하고, 복제를 억제하는 것 등이다. 따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 M2 항체, 및 도메인이 항체에 상이한 기능을 부여하는 이종 도메인, 즉 이종 기능성 도메인을 제공한다.
이종 기능성 도메인은 아미노산 잔기로 한정되지 않는다. 따라서, 이종 기능성 도메인은 상이한 유형의 작거나 큰 다양한 기능성 잔기들 중 어떤 것으로 구성될 수 있다. 이러한 잔기로는 핵산, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 작은 유기 화합물, 예를 들어 약물 (예, 항바이러스제), 금속 (금, 은) 등을 들 수 있다.
링커 서열을 항체 서열과 이종 기능성 도메인 사이에 삽입시켜 이들 2개의 존재가 적어도 부분적으로는 구별되는 기능 또는 활성을 유지하도록 할 수 있다. 링커 서열은 가요성 형태, 정렬된 2차 구조 형성능 부재, 또는 각 도메인을 촉진시키거나 그와 상호작용할 수 있는 소수성 또는 하전된 특성을 포함하는 하나 이상의 특성을 가질 수 있다. 가요성 단백질 영역에 통상적으로 존재하는 아미노산으로는 Gly, Asn 및 Ser을 들 수 있다. 또한, 거의 중성인 다른 아미노산, 예를 들어 Thr 및 Ala를 링커 서열에서 사용할 수도 있다. 링커 서열의 길이는 융합 단백질의 기능 또는 활성에 유의한 영향을 주지 않으면서 변화시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,087,329호 참조). 추가로, 링커는 화학적 잔기 및 접합제(conjugating agent), 예를 들면 술포-숙신이미딜 유도체 (술포-SMCC, 술포-SMPB), 디숙신이미딜 수베레이트 (DSS), 디숙신이미딜 글루타레이트 (DSG) 및 디숙신이미딜 타르트레이트 (DST)를 포함한다.
이종 기능성 도메인의 추가의 예는 검출가능한 표지이다. 따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 검출가능하게 표지된 인간 M2 항체를 제공한다.
검출가능한 표지의 구체적인 예로는 형광발색단(fluorophore), 발색단(chromophore), 방사성 동위원소 (예, S35, p32, I125), 전자-밀집(electron-dense) 시약, 효소, 리간드 및 수용체를 들 수 있다. 효소는 통상적으로 그의 활성에 의해 검출된다. 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)과 같은 기질을 정량가능한 청색 안료로 전환시키는 능력에 의해 검출하는 것이 일반적이다. 리간드는 비오틴 등의 다른 분자에 결합할 수 있는데, 이는 아비딘 또는 스트렙타비딘, 및 단백질 A에 결합할 수 있는 IgG에 결합할 수 있다.
M2 항체는 2개 이상의 변화, 수식 또는 표지를 가질 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 비오틴과 연결시켜 그의 존재를 아비딘과 함께 검출할 수 있을 뿐만 아니라, I125로 표지하여 그가 검출가능한 신호를 제공하도록 할 수 있다. 다른 변경 및 가능성은 당업계의 통상의 기술을 가진 사람에게는 극히 자명할 것이며, 본 발명의 범위내인 것으로 고려된다.
추가로, 본 발명은 수식된 형태, 하위서열, 단편, 키메라 등을 비롯하여 본 발명의 인간 M2 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 특정 실시양태에서, 핵산은 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 원형 또는 단일쇄 M2 항체를 코딩한다. 추가의 실시양태에서, 핵산은 실시예 1에 기재된 원형 또는 단일 쇄 (서열 34, 35 및 37)를 코딩한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환 가능하며, 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 비롯한 모든 형태의 핵산을 언급하기 위해 사용된다. 핵산은 이중 또는 단일 스트랜드이거나, 또는 삼중, 선형 또는 원형일 수 있다. 핵산으로는 게놈 DNA, cDNA 및 안티센스를 들 수 있다. RNA 핵산은 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA, tRNA 또는 안티센스일 수 있다. 본 발명의 핵산은 자연 발생적인 핵산, 합성 핵산, 및 뉴클레오티드 유사체 및 유도체를 포함한다. 이러한 변화된 또는 수식된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 뉴클레아제 내성을 제공하는 유사체를 포함한다.
핵산은 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 번호 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 또는 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 중의 어느 것의 하위서열은 하나 이상의 항-인플루엔자 활성을 갖는 단백질을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 핵산은 실시예 1 (서열 32, 33 및 36)에 기재된 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 핵산은 실시예 1 (서열 34, 35 및 37)에 기재된 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 코딩한다.
유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)의 결과로서, 핵산은 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 및 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)을 코딩하는 서열, 및 본원에 기재된 그의 하위서열 및 수식된 형태에 대해 축퇴성인 서열을 포함한다.
핵산은 잘 알려진 다양한 표준 클로닝 및 화학적 합성 방법들 중 임의의 것을 이용해서 제조할 수 있으며, 부위-지정 돌연변이유발법 또는 당업자에게 공지된 다른 재조합 기술에 의해 의도적으로 변화시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 순도는 서열분석 및 겔 전기영동 등을 통해 측정할 수 있다.
본 발명의 핵산은, 핵산 발현이 본원에서 "발현 카세트"로 언급되는 "발현 조절 요소"에 의해 영향받거나 조절되는 핵산 구조물에 삽입시킬 수 있다. 용어 "발현 조절 요소"는 이 요소가 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하거나 발현에 영향을 주는 하나 이상의 핵산 서열 요소를 의미한다. 발현 조절 요소는, 경우에 따라, 단백질-코딩 유전자의 앞쪽에 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 유전자 사일렌서(silencer), 개시 코돈 (예, ATG) 등을 포함할 수 있다.
핵산 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 요소는 핵산 서열의 전사, 및 경우에 따라 그의 번역을 조절한다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 언급된 성분들이 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병렬 배치를 의미한다. 통상적으로, 발현 조절 요소는 유전자의 5' 또는 3' 말단에 병렬 배치되지만, 인트론성일 수도 있다.
발현 조절 요소는 전사를 구성적으로 활성화하며, 유도가능하거나 (즉, 활성화를 위한 외부 신호를 필요로 함), 또는 탈억제가능한 (즉, 전사를 종결하는 신호를 필요로 함; 신호가 더 이상 존재하지 않는 경우, 전사는 활성화되거나 또는 "탈억제됨") 요소를 포함한다. 또한, 본 발명의 발현 카세트에는 유전자 발현을 특정 세포-유형 또는 조직에 대해 조절가능하게 만드는데 충분한 조절 요소 (즉, 조직-특이적 조절 요소)가 포함된다. 통상적으로, 이러한 요소는 코딩 서열의 상류 또는 하류 (즉, 5' 및 3')에 위치한다. 프로모터는 일반적으로 코딩 서열의 5'에 위치한다. 재조합 DNA 또는 합성 기술에 의해 제조된 프로모터를 사용해서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 전사를 제공할 수 있다. "프로모터"는 전사를 지시하는 데 충분한 최소 서열 요소를 의미한다.
본 발명의 핵산은 숙주 세포로의 증식, 및 원한다면 이후의 유전적 조작을 위해 플라스미드내에 삽입할 수 있다. 플라스미드는 숙주 세포에서 안정하게 증식할 수 있는 핵산이며, 플라스미드는 발현 조절 요소를 임의로 함유하여 숙주 세포에서 M2 항체를 코딩하는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 본원에서 벡터는 플라스미드와 동의어로 사용되며, 숙주 세포에서 발현을 위한 발현 조절 요소를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 플라스미드 및 벡터는 적어도 세포의 증식을 위한 복제 기점 및 프로모터를 함유한다. 따라서, 플라스미드 및 벡터는 예를 들어 M2 항체 코딩 핵산의 유전적 조작, M2 항체 또는 안티센스 제조, 및 숙주 세포 또는 생물체에서 M2 항체의 발현에 유용하다.
항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하거나 또는 전장 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 하이브리도마로부터 단리할 수 있다. 단리된 핵산은 적합한 발현 벡터내에 삽입할 수 있으며, 재조합 M2 항체의 제조를 위해 배양할 수 있는 효모 또는 CHO 세포 등의 적합한 숙주 세포내에 도입할 수 있다.
박테리아 시스템 프로모터는 T7 및 유도가능한 프로모터, 예를 들어 박테리오파아지 λ의 pL, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 및 테트라사이클린 반응성 프로모터를 포함한다. 곤충 세포 시스템 프로모터는 구성적이거나 또는 유도가능한 프로모터 (예, 엑디손(ecdysone))를 포함한다. 포유동물 세포의 구성적 프로모터로는 SV40, RSV, 소 파필로마 바이러스 (BPV) 및 다른 바이러스 프로모터, 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유도된 유도가능한 프로모터 (예, 메탈로티오네인 IIA 프로모터; 열 충격 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유도된 유도가능한 프로모터 (예, 아데노바이러스 후기(late) 프로모터; 유도가능한 마우스 유방 종양 바이러스의 말단의 긴 반복부)를 들 수 있다. 또는, 레트로바이러스 게놈을 유전적으로 수식하여 적절한 숙주 세포에서 M2 항체의 발현을 도입 및 지시할 수 있다.
발현 시스템은 생체내 사용을 위해 설계된 벡터를 추가로 포함한다. 구체적인 비제한적 예로는 아데노바이러스 벡터 (미국 특허 제5,700,470호 및 동 제5,731,172호), 아데노-관련 벡터 (미국 특허 제5,604,090호), 단순 포진 바이러스 벡터 (미국 특허 제5,501,979호), 레트로바이러스 벡터 (미국 특허 제5,624,820호, 동 제5,693,508호 및 동 제5,674,703호), BPV 벡터 (미국 특허 제5,719,054호) 및 CMV 벡터 (미국 특허 제5,561,063호)를 들 수 있다.
효모 벡터는 구성적 및 유도가능한 프로모터를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology Vol. 2, Ch. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988]; [Grant et al. Methods in Enzymology, 153:516 (1987), eds. Wu & Grossman]; [Bitter Methods in Enzymology. 152:673 (1987), eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N. Y.]; 및 [Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II] 참조). 구성적 효모 프로모터, 예를 들어 ADH 또는 LEU2 또는 유도가능한 프로모터, 예를 들어 GAL을 사용할 수 있다 [R. Rothstein In: DNA Cloning. A Practical Approach, Vol.11, Ch.3, ed. D. M. Glover, IRL Press, Wash., D. C., 1986]. 예를 들어 상동 재조합을 통해 외래 핵산 서열의 효모 염색체로의 통합을 촉진시키는 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 삽입된 폴리뉴클레오티드가 보다 통상의 벡터에 대해 너무 긴 (예를 들어, 약 12 kb 초과인) 경우에는 효모 인공 염색체 (YAC)를 통상적으로 사용한다.
인간 M2 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 다양한 측면에서, 진핵 세포는 효모 또는 포유동물 (예, 인간, 영장류 등) 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 증식, 전사될 수 있는 핵산이 도입되거나 또는 코딩된 M2 항체가 발현되는 세포이다. 이 용어는 또한 숙주 세포의 임의의 자손 또는 서브클론을 포함한다. 자손 세포 및 서브클론은 모 세포와 동일할 필요는 없는데, 그 이유는 복제 및 증식 동안 일어나는 돌연변이가 있을 수 있기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 세포는 본 발명의 숙주 세포인 것으로 고려된다.
숙주 세포는 미생물, 예를 들어 박테리아 및 효모; 및 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 재조합 박테리오파아지 핵산, 플라스미드 핵산 또는 코스미드 핵산 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 및 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스)로 감염된 동물 세포 시스템, 또는 안정한 발현을 위해 조작된 형질전환된 동물 세포가 제공된다.
또한, 발현 벡터는 선택적 압력에 대한 내성을 부여하는 선택가능한 마커 또는 동정가능한 마커 (예, β-갈락토시다제)를 함유함으로써 벡터를 보유하는 세포가 선별, 성장 및 확장되게끔 한다. 또는, 선택가능한 마커는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제1 벡터와 함께 숙주 세포를 공동형질감염시키는 제2 벡터상에 있을 수 있다.
선별 시스템은 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 사용될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자 [Wigler et al., Cell 11:223 (1977)], 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자 [Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)], 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [Lowy et al., Cell 22:817 (1980)] 유전자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 항-대사산물 내성은 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr [O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)]; 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt 유전자 [Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:2072 (1981)]; 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 유전자 [Colberre-Garapin et al., J.Mol. Biol. 150:1 (1981)]; 퓨로마이신; 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 히그로마이신 유전자 [Santerre et al., Gene 30:147 (1984)]에 대한 선별을 기초로 하여 사용될 수 있다. 추가의 선택가능한 유전자로는 세포가 트립토판 대신 인돌을 사용할 수 있도록 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 사용할 수 있도록 하는 hisD [Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)]; 및 오르니틴 데카르복실라제 저해제인 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO에 대한 내성을 부여하는 ODC (오르니틴 데카르복실라제)[McConlogue (1987) In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory]를 들 수 있다.
대상체의 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는 방법은 상기 대상체에게 인플루엔자 M2 단백질과 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 대상체의 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하기에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 항체는 대상체의 감염 이전에, 즉 예방적으로 투여하거나, 실질적으로 감염과 동시에 투여하거나, 또는 감염 이후에, 즉 치료 처치로 투여할 수 있다.
본 발명의 방법은 대상체에게 치료 이점을 제공하는 것, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성을 감소시키거나 경감시키는 것, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 종 또는 단리물의 바이러스 역가, 바이러스 복제, 바이러스 증식 또는 바이러스 단백질의 양을 감소시키거나 억제하는 것, 또는 증상을 안정화시키는 것 (즉, 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 증상 또는 합병증의 악화 또는 감염의 진행을 방지하거나 억제함)을 포함한다. 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성을 감소 또는 경감시킬 수 있는 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 증상 또는 합병증으로는 예를 들어 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염 또는 귀 통증을 들 수 있다. 치료 이점은 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키는 것 또는 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 대상체의 회복을 앞당기거나 촉진시키는 것을 포함할 수도 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대상체에게 인플루엔자 바이러스 M2에 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를, 대상체의 바이러스 감염을 억제하거나 또는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 종/단리물 또는 아형에 의한 대상체의 감수성을 감소시키는 데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 다양한 측면에서, 항체는 대상체의 감염 이전에 (예방), 실질적으로 감염과 동시에 또는 감염 이후에 (치료) 투여한다. 항체는, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염의 하나 이상의 증상 또는 합병증 (예를 들어 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염 또는 귀 통증)의 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 종/단리물 또는 아형의 바이러스 역가 또는 바이러스 단백질의 양, 또는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 종/단리물 또는 아형에 의한 대상체의 감수성을 감소시키거나 또는 경감시키는 것을 포함하는 치료 이점을 제공할 수 있다.
따라서, 치료 이점 및 이에 따라 대상체에서 인플루엔자 바이러스 역가, 바이러스 복제, 바이러스 증식 또는 인플루엔자 바이러스 단백질 양의 증가를 방지하거나 또는 억제하는 방법이 추가로 제공된다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 대상체에게 인플루엔자 M2에 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 상기 대상체에서 인플루엔자 바이러스 역가, 바이러스 복제 또는 하나 이상의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형의 인플루엔자 바이러스 단백질의 양의 증가를 방지하기에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.
하나 이상의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형에 의한 감염으로부터 대상체를 보호하고, 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키며, 감염으로부터 대상체의 회복을 앞당기거나 촉진시키는 방법이 추가로 제공된다. 한 실시양태에서, 이 방법은 대상체에게 인플루엔자 M2에 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 종/단리물 또는 아형에 의한 바이러스 감염으로부터 대상체를 보호하거나, 상기 바이러스 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키거나, 또는 상기 바이러스 감염으로부터 대상체의 회복을 앞당기거나 촉진시키는 데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 또는 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 세포주 (예, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 제조되는 항체의 결합 특이성 또는 그와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 임의의 항체를 사용해서 실시할 수 있다. 본 발명의 방법은 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁) 또는 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 11일 기탁)으로 표시되는 항체가 결합하는 동일한 에피토프 또는 동일하거나 실질적으로 동일한 최소 결합 서열을 인식하는 임의의 항체를 사용해서 실시할 수 있다.
치료, 진단 및 정제/단리 방법을 비롯한 본 발명의 방법은 임의의 인플루엔자 종/단리물 또는 아형, 또는 종/단리물 또는 아형의 조합물에 대해 적용할 수 있다. 인플루엔자 종의 구체적인 비제한적 예로는 A/PR/8/34 또는 A/HK/8/68, 또는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3으로부터 선택되는 다른 종들이 있다.
본 발명의 인간, 인간화 및 키메라 M2 항체는 단독으로 사용하거나, 또는 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염, 복제, 증식을 억제하거나 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성을 감소시키는 항-인플루엔자 활성을 갖는 치료제와 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 조합의 예로는 시험관내 또는 생체내에서 세포의 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는 데 있어서 상이한 결합 특이성, 결합 친화성 또는 효능을 갖는 2종 이상의 상이한 M2 항체를 함유하는 푸울링된 모노클로날 또는 푸울링된 폴리클로날 항체를 들 수 있다. 따라서, M2 항체를 포함하는 조합 조성물, 및 이러한 조성물을 본 발명의 방법에 따라 사용하는 방법이 제공된다.
인플루엔자 또는 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 질환 도는 합병증을 치료하는 것을 포함하는 본 발명의 방법에 의해 대상체의 증상을 개선하거나, 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성을 감소시키거나, 또는 증상을 나타내는 환자의 위험을 감소시키거나 또는 감염, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 감수성을 줄일 수 있다. 따라서, 개선은 바이러스 증식, 복제 또는 역가, 또는 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 증상 또는 합병증의 감소 또는 경감의 하나 이상을 포함한다. 또한, 개선은 인플루엔자 바이러스에 감염되었거나 감염될 위험이 있는 대상체 또는 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 증상 또는 합병증을 치료하는 데 사용되는 항바이러스 약물 또는 다른 물질의 투여 빈도 또는 투여량을 줄이거나 이러한 요구를 제거하는 것을 포함한다.
이러한 개선에서 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 임의의 또는 모든 증상 또는 합병증을 완전히 제거할 필요는 없다. 오히려, 치료는 임의의 객관적 또는 주관적인 측정가능하거나 검출가능한 항-인플루엔자 바이러스 효과 또는 개선일 수 있다. 따라서, 임상적으로 만족스런 최종 목적은, 대상체의 증상 또는 그와 관련된 증상 또는 합병증의 부분적 감소 또는 개선 증가, 또는 단기간 또는 장기간 동안 (수시간, 수일, 수주, 수개월 등) 증상의 악화 또는 진행의 억제 (하나 이상의 증상 또는 합병증이 안정화됨)가 있는 경우에 달성된다.
개선이라는 바람직한 결과, 예를 들면 인플루엔자 바이러스에 대하여 본원에 기재된 바와 같은 객관적 또는 주관적인 이점을 제공하는 대상체의 예방 또는 치료 처치를 위한 본 발명의 방법에서, 항체를 충분량 또는 유효량으로 투여할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "충분량" 또는 "유효량"이란 주어진 대상체에서 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료와 함께 단일 또는 다중 투여로 임의의 측정가능한 또는 검출가능한 정도로 또는 임의의 지속기간 동안 (예컨대, 수분, 수시간, 수일, 수개월, 수년, 또는 치유 기간 동안) 장기간 또는 단기간의 검출가능한 반응, 바람직한 결과 또는 유리한 효과를 제공하는 양을 말한다.
충분량 또는 유효량은 단일 투여로 제공될 수 있지만 그럴 필요는 없으며, 단독으로 또는 다른 화합물, 물질, 치료 또는 치료 요법과의 조합으로 투여될 수 있지만 그럴 필요는 없다. 또한, 주어진 대상체에서 효과적이거나 충분하게 할 목적으로 충분량 또는 유효량을 초과하여 벗어나는 추가의 투여량, 양 또는 지속기간, 또는 추가의 약물, 물질, 치료 또는 치료 요법을 포함시킬 수 있기 때문에, 충분량 또는 유효량은 제2의 화합물, 물질, 치료 또는 치료 요법 없이 단일 또는 다중 투여로 제공되는 경우에 충분하거나 효과적일 필요는 없다. 추가로, 충분량 또는 유효량은 예방적 또는 치료적 처치를 받은 각각의 대상체 및 모든 대상체에서 효과적일 필요가 없으며 주어진 군 또는 집단에서 처치받은 대상체의 대다수에서도 효과적일 필요가 없다. 충분량 또는 유효량은 특정 대상체에서의 충분함 또는 유효함을 의미하는 것이지, 군 또는 일반적인 집단에서의 충분함 또는 유효함을 의미하는 것은 아니다. 이러한 방법에서 전형적인 것으로, 몇몇 대상체는 처치 방법에 대해 더 크거나 더 작은 반응을 나타낼 것이다.
치료에 적절한 대상체로는 인플루엔자 바이러스 감염에 걸려있거나 또는 그럴 위험이 있는 대상체들이 포함된다. 표적 대상체로는 또한, 인플루엔자 관련 증상 또는 합병증의 발병 위험이 있는 대상체들이 포함된다. 따라서, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스 감염 또는 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 합병증의 위험이 있는 대상체의 치료에 적용할 수 있다. 따라서, 예방 방법이 포함된다.
"예방" 및 그의 문법상 유사어는, 대상체에 대한 접촉, 투여 또는 생체내 전달을 인플루엔자 감염 (또는 관련 증상)의 징후 또는 발병에 앞서 수행함으로써 인플루엔자 감염 증상의 발생 가능성 또는 감수성을 제거, 방지, 억제, 감소 또는 경감시킬 수 있도록 하는 본 발명에 따른 방법을 의미한다. 예방을 위한 표적 대상체는 본원에 기재되어 있으며 당업계에 공지된 바와 같이 인플루엔자 감염의 위험 (가능성 또는 감수성)이 높을 수 있다.
치료에 적절한 위험 대상체로는, 인플루엔자 바이러스를 보유하는 다른 대상체에 노출된 대상체, 또는 바이러스 감염성 또는 세포 향성, 면역학적 감수성 (예, 면역력이 약화된 대상체) 또는 환경 인자의 변화로 인해 인플루엔자 바이러스 감염이 증가된 대상체를 들 수 있다. 따라서, 치료에 적절한 위험 대상체로는, 야생의 조류에서 또는 조류가 인플루엔자의 운반체로 감염될 수 있거나 감염되지 않을 수 있는 농업 환경 (예, 가금류 농장)에서 조류에 노출되거나 그럴 위험이 있는 대상체를 들 수 있다.
M2 항체는 본원의 방법에 따라 단일 투여 또는 다중 투여, 예를 들어 1일, 1주, 1달 또는 1년, 또는 약 1주 내지 10주 동안 1회 이상, 또는 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 , 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성을 감소시키기 위해 적절하게 투여할 수 있다. 투여량은 치료가 예방 또는 치료 목적인지의 여부, 치료할 관련 질환 또는 합병증의 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성, 치료가 지시되는 인플루엔자 단리물/종 또는 아형의 유형, 원하는 임상 목적, 기존 치료 또는 동시 치료, 대상체의 전체적인 건강, 연령, 성별 또는 인종, 및 당업자에 의해 평가되는 다른 인자들에 따라 달라질 수 있다. 당업자라면 예방 또는 치료 이점을 위한 충분량을 제공하는 데 필요한 투여량 및 시점에 영향을 줄 수 있는 인자들을 판단할 수 있을 것이다.
전형적으로 치료 처치의 경우, 대상체가 인플루엔자에 노출되거나 그와 접촉한 후 24 내지 72 시간 이내에 또는 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상의 발생 후 24 내지 48 시간 이내에, M2 항체가 투여될 것이다. 예방적 처치의 경우, 인플루엔자에 대한 노출 또는 그와 접촉한 다음 0 내지 4 주 이내, 예컨대 2 내지 3 주 이내에 M2 항체를 투여할 수 있다. 투여량은 경험적으로 결정되거나, 동물 질환 모델을 이용하여 결정하거나 또는 임의로는 인간 임상 실험을 이용해서 결정할 수 있다. 초기 연구 투여량은 본원에 기재된 동물 연구를 토대로 할 수 있는데, 체중이 약 30 그램인 마우스의 경우, 투여되는 양은 약 10 내지 1000 ㎍/동물의 범위이다. 대상체의 질량에 따라 투여량을 조절할 수 있으며, 예를 들면 약 10 내지 50 ㎍/kg, 50 내지 100 ㎍/kg, 100 내지 500 ㎍/kg, 500 내지 1,000 ㎍/kg, 1 내지 5 mg/kg, 5 내지 10 mg/kg, 10 내지 20 mg/kg, 20 내지 50 mg/kg, 또는 그보다 많은 양으로, 1시간, 1일, 1주, 1개월 또는 1년에 2회, 3회, 4회 또는 그보다 많은 횟수로 투여한다.
감염 상태 또는 처치 또는 요법의 임의의 부작용에 의해 정해지는 것으로서 투여량, 빈도 또는 지속기간을 일정하게 증가시키거나 또는 감소시킬 수 있다. 또한, 충분하고 유효하며 따라서 유리한 것으로 고려된 투여량, 빈도 또는 지속기간은 다른 처치 또는 치료 요법 또는 프로토콜의 사용을 감소시키는 것이다.
용어 "대상체"는 동물, 전형적으로는 포유동물, 예를 들어 비인간 영장류 (원숭이, 긴팔원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 마카크), 가축 동물 (개 및 고양이), 농장 동물 (가금류, 예를 들면 닭 및 오리, 말, 소, 염소, 양, 돼지), 실험 동물 (마우스, 래트, 토끼, 기니 피그) 및 인간을 의미한다. 대상체로는 동물 질병 모델, 예를 들어 본원에 예시된 인플루엔자 감염의 마우스 모델을 들 수 있다.
수식된 형태, 그의 변이체 및 하위서열/단편을 비롯한 본 발명의 M2 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 M2 항체를 코딩하는 핵산을 제약 조성물내에 혼입시킬 수 있다. 이러한 제약 조성물은 생체내 또는 생체외에서 대상체에게 투여하는 데 유용하다.
항체는 대상체에게 투여하기에 앞서서 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제에 포함시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제약상 허용가능한" 및 "생리학적으로 허용가능한"은 투여, 생체내 전달 또는 접촉의 하나 이상의 경로에 적합한 생리학적으로 허용가능한 제제, 기체, 액체 또는 고체, 또는 이들의 혼합물을 의미한다. 이러한 제제는 약제 투여 또는 생체내 접촉 또는 전달에 적합한 용매 (수성 또는 비수성), 용액 (수성 또는 비수성), 에멀젼 (예, 수중유 또는 유중수), 현탁액, 시럽, 엘릭서, 분산 및 현탁 매질, 코팅, 등장성 및 흡수 촉진 또는 지연 물질을 포함한다. 수성 및 비수성 용매, 용액 및 현탁액은 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 이러한 제약상 허용가능한 담체는 정제 (코팅되거나 비코팅됨), 캡슐 (경질 또는 연질), 마이크로비드, 분말, 과립 및 결정을 포함한다. 보조 활성 화합물 (예, 보존제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항진균제)을 조성물내에 포함시킬 수도 있다.
제약 조성물은 특정 투여 경로에 적합하게끔 제제화할 수 있다. 따라서, 제약 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 조성물을 임의로 제제화시킬 수 있는, 접촉 또는 생체내 전달을 위한 투여 경로의 예로는 호흡기계 (비강, 흡입, 호흡, 삽관, 폐내 점적주입), 경구, 협측, 폐내, 직장, 자궁내, 피내(intradermal), 국소, 피부, 비경구, 설하, 피하, 혈관내, 척수내, 동맥내, 강내, 경피, 이온삼투, 안내, 눈, 광학, 정맥내, 근육내, 선내, 기관내, 림프절내가 있다.
비강 및 점적주입 제제는 전형적으로 활성 성분 (화합물 또는 물질)의 수용액을 임의로 하나 이상의 보존제 또는 등장화제와 함께 포함한다. 이러한 제제는 전형적으로 비강 점막에 적합한 pH 및 등장 상태로 조정된다. 용매는 오로지 물만을 포함할 수 있거나, 물과 하나 이상의 다른 성분 (예컨대, 에탄올)의 혼합물일 수 있다. 전형적으로, 에탄올은 최대 약 70 내지 75 부피％까지이다. 나머지 부피는 다양한 비율의 물 또는 하나 이상의 다른 용매로 이루어질 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제제로는 활성 화합물의 수용액 및 비수용액, 현탁액 또는 에멀젼이 있으며, 제제는 전형적으로 멸균이고 의도된 수용자의 혈액과 등장성일 수 있다. 비제한적인 예로는 물, 염수, 덱스트로스, 프룩토스, 에탄올, 동물, 식물성유 또는 합성유가 있다.
경점막 또는 경피 투여 (예컨대, 국소 접촉)를 위하여, 침투제를 제약 조성물에 포함시킬 수 있다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여의 경우에는 세제, 담즙산염 및 푸시드산 유도체를 들 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 성분을 일반적으로 당업계에 알려진 바와 같은 에어로졸, 스프레이, 연고, 고약(salve), 겔 또는 크림으로 제제화할 수 있다. 피부와의 접촉을 위한 제약 조성물로는 전형적으로 연고, 크림, 로션, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일이 있다. 사용될 수 있는 담체로는 바세린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 알콜, 경피 증진제, 및 이들의 조합이 있다.
공용매 및 보조제를 제제에 첨가할 수 있다. 비제한적인 예시적 공용매는 히드록실기 또는 다른 극성기, 예를 들어, 알콜, 예컨대 이소프로필 알콜; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 글리콜 에테르; 글리세롤; 폴리옥시에틸렌 알콜 및 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르를 포함한다. 보조제로는 예를 들어, 계면활성제 예컨대, 대두 레시틴 및 올레산; 소르비탄 에스테르, 예컨대 소르비탄 트리올레에이트; 및 폴리비닐피롤리돈이 있다.
추가의 활성 화합물 (예컨대, 보존제, 항산화제, 살균제 및 정균제를 비롯한 항미생물제, 예컨대 항균제, 항바이러스제 및 항진균제)이 조성물에 혼입될 수도 있다. 따라서, 제약 조성물은 보존제, 항산화제 및 항미생물제를 포함할 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 억제하거나 활성 성분의 안정성을 증가시켜 제약 제제의 저장 기간을 연장시키는 데 사용될 수 있다. 적합한 보존제는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, EDTA, EGTA, 염화벤잘코늄 또는 벤조산 또는 벤조에이트, 예컨대 벤조산나트륨이 포함된다. 항산화제로는 예를 들어, 아스코르브산, 비타민 A, 비타민 E, 토코페롤, 및 유사한 비타민 또는 프로비타민이 포함된다.
항미생물성 물질 또는 화합물은 직접적으로 또는 간접적으로 병원성 또는 비병원성 미생물에 의한 오염, 또는 병원성 또는 비병원성 미생물의 성장, 감염, 복제, 증식, 생식을 억제하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 정지시키거나, 제거하거나, 저지하거나, 억압하거나 예방한다. 항미생물제의 부류로는 항균제, 항바이러스제, 항진균제 및 구충제가 있다. 항미생물제로는 미생물을 죽이거나 파괴하는 물질 및 화합물 (살균제), 미생물에 의한 오염, 또는 미생물의 성장, 감염, 복제, 증식, 생식을 억제하는 물질 및 화합물 (정균제)이 포함된다.
항균제 (항생제)의 예로는 페니실린 (예컨대, 페니실린 G, 암피실린, 메티실린, 옥사실린 및 아목시실린), 세팔로스포린 (예컨대, 세파드록실, 세포라니드, 세포탁심 및 세프트리악손), 테트라사이클린 (예컨대, 독시사이클린, 클로르테트라사이클린, 미노사이클린 및 테트라사이클린), 아미노글리코시드 (예컨대, 아미카신, 겐타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 스트렙토마이신, 네틸마이신, 파로모마이신 및 토브라마이신), 마크롤라이드 (예컨대, 아지트로마이신, 클라리트로마이신 및 에리트로마이신), 플루오로퀴놀론 (예컨대, 시프로플록사신, 로메플록사신 및 노르플록사신), 및 다른 항생제, 예를 들어 클로람페니콜, 클린다마이신, 사이클로세린, 이소니아지드, 리팜핀, 반코마이신, 아즈트레오남, 클라불란산, 이미페넴, 폴리믹신, 박시트라신, 암포테리신 및 니스타틴이 있다.
항바이러스제의 특정 비제한적 부류로는 역전사효소 억제제; 프로테아제 억제제; 티미딘 키나제 억제제; 당 또는 당단백질 합성 억제제; 구조 단백질 합성 억제제; 뉴클레오시드 유사체; 및 바이러스 성숙 억제제가 있다. 항바이러스제의 특정 비제한적 예로는 네비라핀, 델라비르딘, 에파비렌즈, 사퀴나비르, 리토나비르, 인디나비르, 넬피나비르, 암프레나비르, 지도부딘 (AZT), 스타부딘 (d4T), 라미부딘 (3TC), 디다노신 (DDI), 잘시타빈 (ddC), 아바카비르, 아시클로비르, 펜시클로비르, 발라시클로비르, 간시클로비르, 1-D-리보푸라노실-1,2,4-트리아졸-3-카르복사미드, 9->2-히드록시-에톡시 메틸구아닌, 아다만탄아민, 5-요오도-2'-데옥시우리딘, 트리플루오로티미딘, 인터페론 및 아데닌 아라비노시드가 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 제약 제제 및 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; and Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315) 참조).
항체 및 그의 제약 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여 형태 (캡슐제, 트로키제, 카세제, 로젠지제 또는 정제)로 패키지화할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 "단위 투여 형태"는 치료할 대상체에 대해 단위 투여량으로 적합한, 물리적으로 구별되는 단위를 의미하는데, 각 단위는 원하는 효과 (예컨대, 예방 또는 치료 효과)를 나타내도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 하나 이상의 투여량으로 투여되는 경우 임의로 제약 담체 (부형제, 희석제, 비히클 또는 충전제)와 함께 함유한다. 또한, 단위 투여 형태로는 예를 들어, 앰플 및 바이알이 포함되며, 동결-건조 또는 동결건조 상태의 조성물; 예를 들어, 생체내 투여 또는 전달 전에 첨가될 수 있는 멸균 액체 담체를 포함할 수 있다. 단위 투여 형태로는 추가로 예를 들어, 내부에 배치된 액체 조성물을 갖는 앰플 및 바이알이 포함된다. 단위 투여 형태로는 추가로 경피 투여용 조성물, 예컨대 단기간 또는 장기간 동안 의도된 수용자의 표피와 접촉시 유지되도록 채택된 "패치"가 포함된다. 개별 단위 투여 형태는 다중-용량 키트 또는 용기에 포함될 수 있다. 제약 제제는 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단일 또는 다중 단위 투여 형태로 패키지화할 수 있다.
본 발명은 적합한 패키지 물질로 패키지화된, M2 항체, M2 항체를 코딩하는 핵산 및 그의 제약 제제를 포함하는 키트를 제공한다. 전형적으로, 이러한 키트는 성분들에 대한 설명 및 키트내 성분들의 시험관내, 생체내 또는 생체외 사용하기 위한 지침서를 포함하는 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 키트는 이 성분들의 집합물, 예를 들어 둘 이상의 인간 M2 항체만을 함유하거나 또는 이 항체를 항바이러스제 또는 약물과 함께 함유한다.
용어 "패키지 물질"은 키트의 성분들을 보유하는 물리적 구조를 의미한다. 패키지 물질은 성분들을 멸균 상태로 유지할 수 있으며, 이러한 목적에 통상적으로 사용되는 물질 (예, 종이, 골판지, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플, 바이알, 튜브 등)로 제조될 수 있다.
본 발명의 키트는 라벨 또는 삽입물을 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 "인쇄물", 예컨대 종이 또는 판지(cardboard), 또는 성분, 키트 또는 패키지 물질 (예컨대, 박스)에 고정되거나 별개로 존재하는 인쇄물 상에, 또는 키트 성분을 함유하는 앰플, 튜브 또는 바이알에 부착된 표지상에 존재할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 컴퓨터 판독가능한 매체, 예컨대 디스크 (예컨대, 플로피 디스켓, 하드 디스크, ZIP 디스크), 광학 디스크, 예컨대 CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자기 테이프 또는 전기 저장 매체, 예컨대 RAM 및 ROM 및 이들의 하이브리드, 예컨대 자기/광학 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리 테이프 카드에 추가로 포함시킬 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 포함된 하나 이상의 성분의 식별 정보, 투여량, 작용 기전, 약물동력학 및 약력학을 비롯한 활성 성분(들)의 임상 약리학을 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조자 정보, 로트 번호, 제조자 위치 및 제조 일자를 나타내는 정보를 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 키트 성분이 사용될 수 있는 상태, 장애 또는 질병에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 방법, 또는 치료 프로토콜 또는 치료 요법에서 하나 이상의 키트 성분의 사용에 대한 임상의 또는 대상체를 위한 지침서를 포함할 수 있다. 지침서는 투여량, 빈도 또는 기간, 및 본원에 기재된 임의의 방법, 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 수행하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 지침서의 예로는 본원에 기술되어 있거나 당업계에 공지된 바와 같은 인플루엔자 감염을 치료하기 위한 지침서가 있다. 따라서, 본 발명의 키트는 치료, 검출, 모니터링 또는 진단 방법을 비롯해서 본원에 기재된 본 발명의 방법들 중 어떤 것을 실시하기 위한 라벨 또는 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 키트는 본원에 기재된 하나 이상의 항-인플루엔자 활성을 갖는 인간 M2 항체를, 본 발명의 치료 방법에서 상기 항체를 투여하기 위한 지침서와 함께 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 성분이 제공할 수 있는 임의의 이점, 예컨대 예방 또는 치료 이점에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 잠재적인 유해한 부작용에 대한 정보, 예컨대 특정 조성물을 사용하는 데 적절할 수 있는 상황에 대한 대상체 또는 임상의에게의 경고를 포함할 수 있다. 또한, 유해한 부작용은 대상체가 상기 조성물과 부적합할 수 있는 하나 이상의 다른 약제를 투여받았거나 투여받을 예정이거나 현재 투여받고 있는 경우에, 또는 대상체가 상기 조성물과 부적합할 수 있는 다른 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 받았거나 받을 예정이거나 현재 받고 있는 경우에 발생할 수 있으므로, 지침서는 이러한 부적합성에 대한 정보를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 인간, 인간화 또는 키메라 M2 항체를 함유하는 제약 제제 중 성장 배지 (예컨대, M2 항체를 생산하는 세포주를 위한 성장 배지), 완충제, 또는 보존제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 키트의 각 성분은 개별 용기내에 포함될 수 있으며, 다양한 용기들은 모두 단일 패키지내에 있을 수 있다. 본 발명의 키트는 냉각 저장을 위해 설계될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 인간, 인간화 또는 키메라 M2 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포)를 함유하도록 설계될 수 있다. 키트내 세포는 세포를 사용할 준비가 될 때까지 적절한 저장 조건하에 유지할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 하이브리도마 또는 다른 세포를 포함하는 키트는 세포가 해동 및 성장될 수 있도록 적절한 세포 저장 배지 (예, 조직 배양 배지, 예를 들어 DMEM, α-MEM 등 중에서 10-20％ DMSO)를 함유할 수 있다.
본 발명의 인간, 인간화 및 키메라 M2 항체는 M2 폴리펩티드를 단리, 검출 또는 정제하는데 유용하다. 이러한 방법은 (용액 중에서, 고상에서, 시험관내 또는 생체내에서, 또는 원형 세포 또는 유기체내에서) M2를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 M2 항체와 결합 허용 조건하에 접촉시키는 단계 및 M2의 존재를 검출하거나 또는 결합된 M2 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 시험 샘플에서 M2 또는 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 이 방법은 M2 또는 인플루엔자 바이러스를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 샘플을 인간 M2 항체와 샘플 중 M2의 검출 허용 조건하에 접촉시키는 단계 및 M2가 시험 샘플내에 존재하는지를 결정하는 단계를 포함한다. M2 또는 인플루엔자 바이러스의 검출은 통상의 방법, 예를 들어 면역침전법, 웨스턴 블롯팅, 면역조직화학적 염색 또는 유동세포계수법 및 ELISA에 의해 수행할 수 있다.
M2 및 인플루엔자 바이러스 검출 방법은 M2 및 인플루엔자 바이러스를 검출하는 진단 프로토콜에서 유용하다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 수준이 증가하거나 감소하는 것이 인플루엔자 감염의 발생 또는 퇴화와 관련이 있는 경우, 본 발명의 항체를 사용해서 M2 또는 인플루엔자 바이러스에서 어떤 증가 또는 감소를 검출할 수 있다. 또한, M2 또는 인플루엔자 바이러스 수준을 감소시키는 치료 요법 이후에 M2 또는 인플루엔자 바이러스의 수준을 모니터링하는 것이 필요한 경우, 본 발명의 항체를 사용해서 장시간 또는 단시간의 기간 동안 치료 이전, 치료 동안 또는 치료 이후에 M2 또는 인플루엔자 바이러스 수준의 상기 증가 또는 감소를 검출할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 대상체의 시험 샘플 (생물학적 유체, 세포, 또는 조직 또는 기관 샘플, 예를 들어 생체조직 절편을 함유함)에서 M2 또는 인플루엔자 바이러스의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 이 방법은 대상체로부터 얻은 M2 또는 인플루엔자 바이러스를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 샘플을 인간 M2 또는 인플루엔자 바이러스 항체와 M2 또는 인플루엔자 바이러스의 검출 허용 조건하에 접촉시키는 단계 및 M2 또는 인플루엔자 바이러스가 상기 대상체로부터의 시험 샘플에 존재하는지를 결정하는 단계를 포함한다.
또한, 인간, 인간화 및 키메라 M2 항체를 사용해서 진단에서 M2 또는 인플루엔자 바이러스의 존재를 모니터링하거나 또는 대상체의 치료 이후에 대상체에서 M2의 생체내 수준을 측정할 수도 있다. 예를 들어, M2 또는 인플루엔자 바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 객담(sputum)을, 상기 기술한 바와 같이, 결합 발생을 허용하는 조건하에 인큐베이션하여 M2 또는 인플루엔자 바이러스의 존재를 검출한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용할 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 본원에 기재되어 있다.
본원에 인용된 모든 출원, 간행물, 특허문헌 및 다른 참고문헌, 진뱅크 (GenBank) 인용 및 ATCC 인용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 모순되는 경우에, 정의를 포함하는 명세서가 기준이 된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 표현되지 않는다면 복수 형태를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "M2 항체"가 가리키는 것은 복수개의 상기 항체를 포함하며, "항-인플루엔자 활성 또는 기능"이 가리키는 것은 하나 이상의 활성 또는 기능을 가리키는 것을 포함하는 등이다.
본원에 사용된 바와 같이, 모든 수치 또는 수적 범위는 명백하게 다른 기재가 없다면 상기 범위 내의 정수 및 그 값의 분수를 포함하거나 범위 내의 정수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 90 내지 100％의 범위는 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 95％, 97％ 등, 뿐만 아니라 91.1％, 91.2％, 91.3％, 91.4％, 91.5％ 등, 92.1％, 92.2％, 92.3％, 92.4％, 92.5％ 등을 포함한다.
일반적으로, 본 발명은 수많은 실시양태를 기재하기 위하여 단정적인 언어를 사용하여 개시되어 있다. 또한, 본 발명은 구체적으로 특정 대상, 예컨대 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 절차, 검정 또는 분석이 전체 또는 부분적으로 제외된 실시양태를 포함한다. 따라서, 본 발명이 포함하지 않는 것에 대하여 본 발명이 일반적으로 표현되지 않았다 하더라도, 본 발명에 명백히 포함되지 않는 측면이 본원에 개시된다.
본 발명의 다수의 실시양태가 기재되어 있다. 그렇지만, 본 발명의 범주 또는 범위를 벗어남이 없이 다양한 변형을 수행할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 하기 실시예는 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 설명하기 위한 것이며 이를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예는 여러가지 재료 및 방법을 기재한다.
펩티드 합성 및 펩티드-BSA 접합체의 생성: M2 (서열 2, 표 4) 및 M2SG (서열 3, 표 4) 펩티드는 에이 앤드 에이 랩스 엘엘씨(A & A Labs LLC) (San Diego, CA)에서 합성하였다. 각 펩티드의 순도는 HPLC에 의해 95％ 초과인 것으로 결정되었다. 서열 2 (M2)로 기재한 서열은 많은 인플루엔자 A 바이러스 종에 존재하는 인플루엔자 바이러스 기질 M2 단백질의 세포외 23-아미노산 펩티드의 전형적인 서열이다. 이들 2종의 펩티드를 EDC 접합 키트 (PIERCE Biotechnology, Inc., Rockford, IL)를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 소 혈청 알부민 (BSA, Sigma, St. Louis, MO)에 접합시켰다. BSA-접합된 M2 및 M2SG 펩티드를 마우스의 면역화에 사용하였다.
인간 항-M2 항체의 에피토프 결정 및 결합 특이성 연구에 사용된 펩티드의 아미노산 서열은 표 4 및 표 7에 기재하였다. 결합 특이성 분석에 사용한 M2 돌연변이 펩티드 유사체는 진뱅크 데이타베이스에 들어 있는, 돌연변이 인플루엔자 A 바이러스 종에서 동정된 M2 돌연변이 단백질의 서열 정보를 기초로 하여 설계된 것이었다. M2 유사체 펩티드 및 말단절단형 M2 펩티드는 에이 앤드 에이 랩스 엘엘씨 (San Diego, CA)에서 합성하였다.
마우스: 인간 이뮤노글로불린 영역을 함유하는 인간 염색체 단편을 보유하는 인간 트랜스-염색체 마우스 (WO 02/43478, WO 02/092812, 문헌 [Ishida and Lonberg, IBC's 11th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2000)]; 및 [Kataoka, S. IBC's 13th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2002)])는 기린 브레웨리 컴퍼니, 엘티디.(Kirin Brewery Co., Ltd.) (일본 소재)에서 구하였다. C57BL/6J 마우스는 미국 메인주 바 하버에 소재하는 잭슨 래버러토리스(Jackson Laboratories)로부터 구입하였다.
면역화: M2-BSA 및 M2SG-BSA (PBS (인산염 완충 염수, GIBCO BRL, Rockville, MD) 중 1:1 비율)를 동일 부피의 완전 프로인트(Freund's) 보조제 (CFA) (Sigma, St. Louis, MO)와 혼합하여 에멀젼을 제조하였다. 마우스를 CFA 중 혼합물 20 ㎍으로 피하 면역화하고, 제21일에 불완전 프로인트 보조제 (IFA) (Sigma, St. Louis, MO) 중 M2-BSA와 M2SG-BSA의 동량 혼합물로 피하 부스팅(boosting)한 후에 제42일에는 RIBI (Corixa, Hamilton, MT)로 3차 복강내 주사를 실시하였다. 융합 3일 전에는 M2 펩티드 10 ㎍을 보조제 없이 마지막으로 복강내 및 정맥내 주사하였다.
ELISA: 항체 역가와 항체 특이성 및 또한 하이브리도마에 의한 항체 생성을 ELISA로 결정하였다. 요컨대, M2-BSA 또는 M2 펩티드 50 ㎕를 96-웰 평면 바닥 플레이트 (Nunc, Denmark) 상에 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 1시간 동안 탄산염 완충액 (pH 9.6)을 사용해서 1 ㎍/ml의 농도로 코팅하였다. PBS/0.1％ 트윈(Tween) 20으로 2회 세척한 후, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 PBS/1％ BSA (Sigma, St. Louis, MO)로 차단하고, 항체 또는 혈청을 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 4회 세척한 후, 희석된 HRP 접합된 염소 항-인간 이뮤노글로불린 감마 쇄 특이적 항체 (Jackson Immunoresearch Laboratory, West Grove, PA)를 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 4회 세척한 다음, TMB 기질 용액 (DAKO, CA)을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 450 nm에서의 광학 밀도를 마이크로플레이트 판독기에 의해 측정하였다.
이소형 ELISA: 하이브리도마에 의해 생성된 항체의 이소형을 ELISA에 의해 결정하였다. 요컨대, M2-BSA 또는 M2 펩티드 50 ㎕를 96-웰 평면 바닥 플레이트 (Nunc, Denmark) 상에 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 1시간 동안 탄산염 완충액 (pH 9.6)을 사용해서 1 ㎍/ml의 농도로 코팅하였다. PBS/0.1％ 트윈 20으로 2회 세척한 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS/1％ BSA (Sigma, St. Louis, MO)로 차단하고, 항체를 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3회 세척한 후, 희석된 HRP-접합된 마우스 항-인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중쇄 검출 항체 (Zymed, San Francisco, CA)의 각각을 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3회 세척한 다음, TMB 기질 용액 (DAKO, CA)을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 450 nm에서의 광학 밀도를 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다.
인플루엔자 A 바이러스-감염된 세포 기반 ELISA: MDCK 세포 (마딘-다르비 (Madin-Darby) 개과동물 신장 상피 세포; ATCC, Rockville, MD)를 96-웰 평면 바닥 플레이트 (Falcon®)에, 1％ 비필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 술페이트, 1 mM 피루브산나트륨 (cMEM) (InVitrogen, Carlsbad, CA)를 함유하는 MEM ml 당 1.5×105개 세포 및 웰 당 150 ㎕로 플레이팅 하고, 7％ CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, 주기적으로 소용돌이를 일으키면서(swirling) 실온에서 30분 동안 10배의 TCID50 인플루엔자 A 바이러스 (A/PR/8/34 또는 A/HK/1/68; ATCC, Rockville, MD) 30 ㎕로 감염시켰다. 감염 후, 플레이트를 PBS로 1회 세척하고, 최소 필수 배지 (Invitrogen Corp, CA) 중 1 ㎍/ml 트립신 (TPCK-처리, Worthington, Biochem. Corp.) 150 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 27시간 동안 인큐베이션하였다. 감염 후, 세포 단층을 PBS/1％ FCS (GIBCO BRL, Rockville, MD)로 3회 세척하고, 실온에서 30분 동안 PBS/1％ BSA/ 5％ FCS로 차단하였다. 항체를 희석하여 50 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 4회 세척한 다음, HRP 접합된 토끼 항-인간 이뮤노글로불린 감마 쇄 항체 (DAKO, Denmark)를 1:3000으로 희석하고, 50 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 5회 세척한 다음, 1 mM 레바미솔(Levamisole) 용액 (Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA)을 함유하는 TMB 기질 (DAKO, Denmark) 100 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 상등액 50 ㎕를, 100 ㎕ 중단(stop) 용액 (1 N H2SO4)을 함유하는 새로운 96-웰 플레이트 (Nunc, Denmark)로 옮기고, 450 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 각 항체의 EC50을 선행 문헌 (Sette et al. Nature 328:395 (1987))에 기술된 바와 같이 계산하였다. 해리 상수 (Kd)는 A/PR/8/34 또는 A/HK/1/68 감염된 MDCK 세포의 표면 상의 M2 항원 상의 결합 부위의 1/2 (50％)를 포화시키는데 필요한 항체 농도로서 결정하였다.
인플루엔자 A 바이러스 감염된 세포 기반 ELISA에서의 펩티드 경쟁: 바이러스-감염된 MDCK 세포를 상기와 같이 제조하였다. M2 펩티드 및 항-M2 항체를 혼합하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 펩티드 및 항체의 혼합물 50 ㎕를 세포에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 4회 세척한 다음, HRP 접합된 토끼 항-인간 이뮤노글로불린 감마 쇄 항체 (DAKO, Denmark)를 1:3000으로 희석하고, 50 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 5회 세척한 다음, 1 mM 레바미솔 용액 (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)을 함유하는 TMB 기질 (DAKO, Denmark) 100 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 상등액 50 ㎕를, 100 ㎕의 중단 용액 (1 N H2SO4)을 함유하는 새로운 96-웰 플레이트 (Nunc, Denmark)로 옮기고, 450 nm에서의 광학 밀도를 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다.
하이브리도마 제조: 모노클로날 항체의 제조를 위해 가장 높은 항체 역가를 갖는 마우스를 선별하였다. 비장을 수획하고, 50％ PEG (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용해서 단일 세포 현탁액을 골수종 세포주 (SP2/O-Ag14) (ATCC, Rockville, MD)에 3:1의 비율로 융합시켰다. 융합물을 96-웰 플레이트상에 최적 밀도로 플레이팅하고, 37℃의 인큐베이터에서 5％ CO2 하의 완전 RPMI-10 배지 (10％ FCS, 1％ 비필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 50 μM 2-ME, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 술페이트를 함유하는 RPMI 1640)에서 배양하였다. 각 융합물에 대한 대략 2000 하이브리도마가 성장하는 웰을 ELISA에 의해 스크리닝하였다. M2 펩티드와의 결합에 대해 양성인 세포를 24 웰 플레이트로 옮기고, 제한 희석 4 라운드를 수행하여 모노클로날 항체를 얻었다. 추가로, 항-M2 모노클로날 항체는 인플루엔자 A 바이러스 감염된 세포 기반 ELISA에 의해 확인하였다.
항체 정제: 항체 정제에 있어서, 하이브리도마를 하이브리도마-SFM (GIBCO BRL, Rockville, MD) 함유 인테그라(Integra) 시스템 (INTEGRA Bioscience, Inc. Ijamsville, MD)에서 배양하였다. 단백질 A-세파로스 패스트 플로우 겔 (Sepharose Fast Flow Gel)(Amersham Pharmacia Cat#17-0618-02, Uppsala, Sweden)을 사용해서 인간 모노클로날 항체를 배양 배지로부터 정제하였다. 요컨대, 컬럼 용량에 대한 적정량의 항체를 함유하는 조건화 배지를 0.22 ㎛ 디스크 필터 (Minisarto-plus, Sartorius Cat#17822, Gettingen, Germany)로 여과하고, 인산염 완충 염수 (PBS)로 평형화된 2.0 ml 단백질 A-세파로스 패스트 플로우 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 40 ml 초과의 PBS로 세척하고, 항체를 0.1 M Gly-HCl (pH 3.6), 0.15 M NaCl로 용출시켰다. 용출 완충액의 처음 1.0 ml를 통과시킨 다음, 3개의 각 용출 분액을 튜브 당 5.0 ml의 부피로 모으고, 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 250 ㎕로 즉시 중화시켰다. 모든 조건화 배지가 처리될 때까지 이러한 정제 과정을 반복하였다. 인간 IgG-특이적 ELISA로 항체 농도를 결정하고, 항체를 함유하는 모든 분액을 푸울링하고, 원심분리 농축기 (Vivaspin 20, 30,000MWCO: Sartorius Cat#VS2022, Gettingen, Germany)로 농축시켰다.
발열물질(pyrogen)을 제거하기 위해, 농축된 샘플을 20 mM 인산나트륨 (pH 6.6)으로 완충액-교환하고, 동일한 완충액으로 평형화된 0.5 ml SP-세파로스 HP 컬럼 (Amersham Pharmacia, Cat#17-1087-01, Uppsala, Sweden)상에 로딩하였다. SP-세파로스 HP 컬럼에 일렬로 연결된 2 ml Q-세파로스 패스트 플로우 컬럼 (Amersham Pharmacia, Cat#17-0510-01, Uppsala, Sweden)을 통해 샘플을 제1 통과시킴으로써 발열물질을 제거하였다. 적용 후, Q-세파로스 패스트 플로우 컬럼을 제거하고, 항체를 0 내지 0.5 M 범위의 염화나트륨 선형 농도구배로 용출시켰다. 항체를 280 nm에서 검출하고, 항체 함유 분액을 푸울링하였다. 샘플을 원심분리 농축기로 농축하고, NAP25 탈염(desalting) 컬럼 (Amersham Pharmacia, Cat#17-0852-02, Uppsala, Sweden)을 사용해서 PBS로 완충액-교환하였다. 항체 농도를 인간 IgG 특이적 ELISA에 의해 정량하였다. 샘플의 발열물질 수준은 리물루스 아메보사이트(Limulus Amebocyte) 용해물 (LAL) 분석 (Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth, MA)에 따르면 단백질 0.13 EU/mg 미만인 것으로 결정되었다.
인간 항-M2 항체(Z3) 유전자의 단리: Z3 항체 (이소형: IgG3)를 생산하는 배양된 하이브리도마 세포 (113Z-3)를 원심분리에 의해 수획하였다. 제조업체의 지시에 따라 RNeasy 키트 (QIAGEN Inc., Valencia, CA)을 사용해서 총 RNA (140 ㎍)을 이들 세포로부터 정제하였다. 공급원으로서 하이브리도마 세포의 총 RNA로부터의 이뮤노글로불린 유전자의 가변 영역에 대한 cDNA의 클로닝을 위해 SMART RACE cDNA 증폭 키트 (Clontech Co., Ltd., Palo Alto, CA)를 사용했다. 요컨대, 제1 스트랜드 cDNA를 역전사효소에 의해 RNA 2 ㎍으로부터 제조하였다. 이러한 cDNA를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에서 템플레이트로 사용해서 리더 서열 (각각, HV 및 LV)을 함유하는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역의 일부를 증폭시켰다. 반응물은 다음과 같았다: 2.5 U KOD-플러스-DNA 폴리머라제 (TOYOBO, Tokyo, Japan); 한쪽 사이드에 대한 0.2 μM 프라이머(Primer) (중쇄의 경우 IgG1p, 경쇄의 경우 LCR276, 표 2 참조); 다른쪽 사이드에 대한 1X 유니버설 프라이머 믹스 A (SMART RACE 키드에 부착된 UMP 프라이머 믹스 A); 200 μM의 각 dNTP 혼합물; 1 mM MgSO4; KOD-플러스-완충액 (최종 농도는 1x임); 및 cDNA 템플레이트.
열순환 프로그램은 94℃에서 5분에 이어서, 94℃에서 5초 및 68℃에서 10초와 72℃에서 3분 연장의 30 사이클이었다. 에탄올 침전 및 이후의 아가로스 겔 전기영동 후에 증폭된 DNA 단편을 수집하여 QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen Co., Ltd., Germany)로 정제하였다. HV 및 LV의 정제된 DNA 단편을 제로 평활 TOPO PCR 클로닝 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 PCR 4 평활-TOPO 벡터에 통합하고, 각각의 구조물 플라스미드로 이. 콜라이(E. coli)를 형질전환시킨 다음, 클로닝하였다. 구조물 플라스미드 중 각 삽입물 (HV 및 LV)의 뉴클레오티드 서열을 특이적 프라이머 (HV: M13F, M13R 및 hh-4, LV: M13F, M13R 및 LCR88, 표 2 참조)로 분석하였다.
8개의 독립적 클론으로부터의 HV 및 LV 둘다의 뉴클레오티드 서열은 각각 완전히 일치하였다. LV로부터 얻은 서열에 기초하여 올리고뉴클레오티드 프라이머, Z3LP5BGL 및 Z3LP3ERI (표 2)를 설계하였다. 가변 및 불변 영역 둘다를 포함하는 전장 ORF (LVC)를 코딩하는 경쇄 cDNA 서열을, KOD-플러스-DNA 폴리머라제와 함께 템플레이트로서 제1-가닥 cDNA, 프라이머로서 Z3LP5BGL 및 Z3LP3ERI를 사용하여 PCR에 의해 얻었다. HV 및 LV의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 하기에 나타내었다.
Z3 중쇄 가변 영역 (HV)의 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (개시 코돈 (ATG)으로부터 가변 영역의 말단부로)-
Z3 경쇄 가변 및 불변 영역 (LVC)의 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (개시 코돈 (ATG)으로부터 불변 영역의 말단부로 (밑줄))-
Z3 중쇄 가변 영역 (HV)의 cDNA의 아미노산 서열 (리더 서열 (진하게) 및 가변 영역)-
Z3 경쇄 가변 및 불변 영역 (LVC)의 cDNA의 아미노산 서열 (리더 서열 (진하게), 가변 영역 및 불변 영역 (밑줄))-
이소형 변화된 인간 항-M2 항체 (Z3-IgG1 유형)의 발현 벡터의 생성: IgG1 이소형-스위치된(switched) Z3 항체 (원래의 이소형은 IgG3이었음)의 발현 벡터를 제조하였다. 요컨대, 각각 5'-BglII 및 3'-EcoRJ 제한 효소 민감성 상부 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머, Z3LP5BGL 및 Z3LP3ERI (표 2)를 PCR에 의해 경쇄 (LVC)의 전장을 증폭시켜 설계하였다. KOD-플러스- DNA 폴리머라제와 함께 템플레이트로서 제1-가닥 cDNA, 프라이머로서 Z3LP5BGL 및 Z3LP3ERI를 사용하여 PCR을 수행하였다. BglII 및 EcoRI에 의한 PCR 생성물의 절단 후, 718-bp 단편을 BglII 및 EcoRI에 의해 예비절단된 발현 벡터 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, N5KG1-Val Lark (N5KG1의 수식된 벡터, 미국 특허 제6,001,358호)) (8.6 킬로베이스 크기의 DNA 단편)에 서브클로닝하였다. 단리된 구조 (N5L3G1-Z3_LF)의 삽입물의 뉴클레오티드 서열을 분석하고, 경쇄 (LVC)의 전장 ORF의 존재를 확인하였다. 삽입물 (LVC)의 DNA 서열은 Z3 (LV)의 경쇄 가변 영역 서열 및 인간 람다 이뮤노글로불린 경쇄 불변 영역, IGLC3 (진뱅크 관리 번호 NG_000002: 염색체 22에 존재하는 호모 사피엔스 이뮤노글로불린 람다 유전자좌)과 일치하였다.
제2 단계로서, HV를 다음과 같이 N5L3G1-Z3_LF DNA 벡터에 삽입하였다: DNA 벡터를 2가지 DNA 제한 효소인 NheI 및 SalI로 절단한 후에 탈인산화하였다. 9.2 킬로베이스 크기의 DNA 단편 (단편 A)을 단리하였다. 경쇄 구조물과 유사하게, HV의 PCR용 프라이머 세트가 HV의 양쪽 사이드에서 제한 효소에 대한 민감한 영역을 갖도록 설계하였다. 프라이머는 Z3HP5SAL 및 Z3HP3NHE (표 2)이며, HV의 구조물 플라스미드를 템플레이트로서 사용하였다. HV의 정제된 PCR-증폭 생성물을 pGEM(등록상표)-T 이지 벡터 시스템에 서브클로닝하였다. 서브클로닝된 구조물내 삽입물의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 플라스미드 DNA를 2종의 제한 효소인 NheI 및 SalI로 절단하고, 0.44 킬로베이스 크기의 DNA 삽입물 (단편 B)을 단리하 고, 아가로스 겔 전기영동 후에 정제하였다.
T4 DNA 리가제를 사용해서 2개의 DNA 단편인 A 및 B를 라이게이션하고, 라이게이션된 구조물 (N5LG1_M2_Z3)을 전기천공으로 이. 콜라이 ΔH5 종에 넣어 형질전환체를 생성시켰다. 양성인 이. 콜라이 형질전환체를 선별하였다. 발현 벡터를 정제하고, 특이적 프라이머 (서열 46 내지 49, 표 2)를 이용하여 LVC 및 HV 영역 둘다의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 이 과정 동안 돌연변이는 도입되지 않았다.
Z3G1의 중쇄의 전장 ORF의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 아래 예시한다. Z3G1의 경쇄의 전장 ORF의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 상기 예시한 Z3의 LVC의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열과 동일하다.
Z3G1 중쇄 가변 및 불변 영역의 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (개시 코돈 (ATG)으로부터 불변 영역의 말단부로(밑줄))-
Z3G1 중쇄 가변 및 불변 영역의 cDNA의 아미노산 서열 (리더 서열 (진하게), 가변 영역 및 불변 영역 (밑줄))-
CHO 세포로부터 재조합 인간 항-M2 항체의 제조: 재조합 항체의 제조를 위해, 항-M2 항체를 함유하는 N5LG1_M2_Z3 벡터를 차이니스 햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC #CRL-9096)의 숙주 세포 dhfr-결핍 종으로 전기천공하고, 재조합 항체를 형질감염된 세포의 상등액으로부터 단리하였다. 요컨대, 10 ㎍의 정제된 DNA 발현 벡터인 N5LG1_M2_Z3을 DNA 제한 효소인 AscI로 선형화하고, 상기 DNA를 바이오 래드(Bio Rad) 전기천공기 (350 V, 500 μF)를 사용하여 4×106개의 CHO 세포로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 96-웰 배양 플레이트에 시딩(seeding)하고, DNA 벡터를 함유하는 CHO 세포의 선별을 위해 제네티신(Geneticin)(Gibco-BRL)을 함유하는 배양 배지에서 세포를 배양하였다. 여러 안정적인 형질감염체 종을 선별한 후, 고수율의 인간 IgG 생산자를 ELISA로 스크리닝하고, 재조합 항체의 제조에 사용하였다.
재조합 항체 단백질의 단리 및 정제: 재조합 항체를 발현하는 CHO 세포를, 5％ CO2, 37℃ 인큐베이터에서 2 mM 글루타민, 100 단위/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 히포크산틴 및 티미딘 (HT) 보충물 (1:100) (Invitrogen)로 보충된 혈청-무함유 Ex-Cell 325-PE 배지 (JRH Bioscience, Co., Ltd.)를 사용해서 배양하였다. 배양 상등액 20 리터를 사용해서 항체 단백질을 다음과 같이 정제하였다: 상등액을 MabSelect 단백질 A 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech, Co., Ltd.)에 첨가하였다. 항체의 단백질 A로의 흡착을 위해, 인산염 완충 염수 (PBS)를 사용하고, 용출을 위해 20 mM 시트르산나트륨 완충액 및 50 mM 염화나트륨 (pH 2.7)을 사용했다. 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.0)을 첨가하여 용출 분액의 pH를 5.5로 조정하였다. 1.5 부피의 Milli-Q 등급 물 (Millipore, Bedford, MA)을 첨가함으로써 로딩 물질의 전도성을 < 4 ms/cm으로 조정한 후, 0.5 ml SP-세파로스 HP 컬럼 (Amersham Pharmacia, Cat#17-1087-01, Uppsala, Sweden)에 일렬로 연결된 2 ml Q-세파로스 패스트 플로우 컬럼 (Amersham Pharmacia, Cat#17-0510-01, Uppsala, Sweden)을 통해 샘플을 제1 통과시켰다. 상기 단계 후, Q-세파로스 패스트 플로우 컬럼을 제거하고, 항체를 PBS로 용출시켰다.
정제된 항체를 슈퍼 컵(Super Cup) 100 캡슐 막 필터 (0.22 ㎛ 직경의 공극 크기)를 사용해서 여과함으로써 멸균하였다. 정제된 항체의 농도는 280 nm에서 분광광도법에 의해 측정하였으며, 여기서 1 mg/ml의 단백질은 280 nm에서 1.4 OD를 나타냈다. 재조합 Z3G1 항체 (41 mg)를 20 리터의 CHO 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 샘플의 발열물질 수준은 리물루스 아메보사이트 용해물 (LAL) 분석, 발열세포 단일 시험 (SEIKAGAKU Corp., Tokyo, Japan)에 따르면 단백질 0.1 EU/mg 미만인 것으로 결정되었다.
바이러스 단리 및 역가 측정: 바이러스 단리를 위해, 감염된 마우스 폐를 감염 후 수일에 제거하고, 액체 질소에서 동결시키고, 미리 무게측정된 튜브에서 무게를 측정하였다. 튜브 무게를 감산하여 실제 폐 무게를 계산하고, PBS를 무게 (그램) 대 부피 (ml)의 1:10 비율로 첨가한 후, Fisher TissueMiser (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)를 사용하여 균질화하였다. 샘플을 센트라 GP8R 원심분리기 (International Equipment Company, Needham Heights, MA)로 5분 동안 3000 rpm에서 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하였다. 비리온을 함유하는 상등액을 분취하고 액체 질소에서 동결시켰다. 바이러스를 -80℃에 저장하였다.
플라크 분석에 의해 바이러스 역가를 측정하였다. 요컨대, 6-웰 평면 바닥 플레이트 중의 전면 MDCK 세포 단층을 주기적으로 소용돌이를 일으키면서 30분 동안 총 부피 lOO ㎕의 PBS 중 바이러스의 10배 희석액으로 감염시켰다. 단층을 PBS로 1회 세척하고, 1％ 비필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 술페이트, 1 mM 피루브산나트륨 (GIBCO BRL, Rockville, MD) 및 트립신 (TPCK-처리, Worthington, Biochem. Corp., Lakewood, NJ) 1 ㎍/ml을 함유하는, 46℃로 예열해 둔 MEM 중 0.9％의 초고순도 아가로스 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 덮었다. 세포를 37℃, 5％ CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 감염후 제3일에는 플라크가 관찰되었고, 10％ 포름알데히드 용액 중 0.1％ 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 플라크의 수를 계수하였다.
실시예 2
본 실시예는 인간 및 키메라 M2 모노클로날 항체의 제조 및 특성화를 기술한다. 본 실시예는 또한 항-M2 인간 모노클로날 항체 Z3G1이 폭넓은 M2 결합 스펙트럼을 가지며 높은 친화성 결합을 할 수 있다는 것을 지시하는 데이타를 기재한다.
재조합 기술을 이용하여 Z3의 이소형을 Z3 Fab를 갖는 IgG1로 전환시키고 재조합 IgG1 타입 Z3 (Z3G1)의 CHO 발현 시스템을 적용하였다. Z3G1 항체 생성에 이용된 방법은 실시예 1에 기재한 바와 같다.
원래의 Z3과 유사한 방식으로, Z3G1은 M2 펩티드 및 M2-BSA 접합체에는 특이적으로 결합하지만 BSA, KLH (면역화를 위한 운반체) 또는 mGAD (마우스 글루탐산 데카르복실라제 유래의 합성의 비관련 펩티드, 아미노산 246 내지 266)에는 결합하지 않는다.
| mAbs | M2 펩티드* | 감염된 세포상의 M2** | BSA | OVA | KLH | mGAD*** |
| C40G1 | + | + | - | - | - | - |
| L66 | + | + | - | - | - | - |
| N547 | + | + | - | - | - | - |
| Z3G1 | + | + | - | - | - | - |
*: M2 단백질의 가장 공통적인 세포외 부분; 상기 서열은 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (서열 1)임.
**: A/PR/8/34 및 A/HK/1/68 감염된 MDCK 세포상에 발현된 M2.
***: 마우스 GAD에서 246번 내지 266번 위치로부터 유래된 합성 펩티드.
+: 양성은 OD450 nm에서 대조군 항체 또는 항체가 없는 경우보다 2배 초과로 더 높은 것으로 정의됨.
Z3G1의 결합 특이성은 세포 기반 ELISA를 통해 추가로 확인하였다. Z3G1은 인플루엔자 바이러스로 감염된 MDCK 세포상에서 발현된 M2 단백질의 세포외/엑토-도메인(M2e)을 인식한다 (표 2). 또한, 바이러스 감염된 세포와의 Z3G1 항체 결합은 M2 펩티드가 첨가되는 경우에 특이적으로 억제된다 (도 1). 따라서, Z3G1은 M2 펩티드에 특이적이고, 또한 인플루엔자 A 바이러스로 감염된 MDCK 세포의 표면상에서 발현된 M2 단백질에도 특이적이다. 세포 기반 ELISA로 결정할 때, Z3G1의 결합 친화성은 상대적으로 더 낮은 Kd 값으로 반영되는 바와 같이 다른 3가지 인간 모노클로날 항-M2 항체 (C40G1, N547 및 L66)보다 약간 더 높았다 (표 3).
| Abs | 아군 | 경쇄 사용 | Kd (x10-9M)* PR8 감염됨 | Kd (x10-9M)* HK1 감염됨 |
| Z3G1 | IgG1 | 람다 | 0.497±0.030 | 0.488±0.070 |
| C40G1 | IgG1 | 카파 | 0.519±0.033 | 0.542±0.063 |
| N547 | IgG1 | 람다 | 1.047±0.165 | 1.219±0.061 |
| L66 | IgG1 | 람다 | 0.563±0.099 | 0.531±0.048 |
표 3에서 2가지 바이러스 종, 즉 A/PR/8/34 및 A/PR/1/68의 M2 서열의 세포외/엑토-도메인은 하나의 아미노산에서 차이가 있는데, A/PR/8/34 종에서 M2의 세포외 부분의 위치 20에서 아스파르트산이 글리신으로 치환된 것이다. A/HK/1/68에서 유래된 서열은 M2e라고 지칭되어 왔고, 대개의 인플루엔자 종이 이것을 공유한다 [Neirynck et al., Nature Med. 5:1157 (1999)].
Z3G1 항체는 상기 바이러스 종 둘다로 감염된 MDCK 세포상에서 발현된 M2e 단백질을 인식한다 (표 3). 이러한 결론은 표 5에 예시된 펩티드 ELISA 데이타에 의해 뒷받침된다 (+ M2 및 M2G와의 Z3G1 항체 결합. M2 및 M2G의 서열에 대하여는 표 4 참조). 이러한 결과는 Z3이 이들 2가지 상이한 바이러스 종으로 감염된 MDCK 세포상에서 발현된 M2 및 M2G 단백질을 둘다 인식함을 지시한다.
항체 번호 Z3G1, N547, L66, C40G1의 반응성은 비슷한 수준이었으며, Z3G1이 약간 더 우수한 결합 친화성 (Kd)을 보였다 (표 3). 예상한 바와 같이, 이소형 매치된 비관련 인간 항-HSA 항체 (항-인간 혈청 알부민)는 어떠한 반응성도 나타내지 않았다 (도 1).
밑줄친 진한 글자체는 서열 2의 M2 서열과 비교한 돌연변이 영역임.
항-M2 항체의 돌연변이체 M2 펩티드와의 결합 활성은, 인플루엔자 A 바이러스에서 보고된 25가지 상이한 M2 펩티드 (서열 2 내지 26, 표 4)를 사용하는 ELISA 분석으로 분석하였다. 인간 항-M2 항체 번호 Z3G1, C40G1, L66, N547 및 마우스 14C2 항체 (Affinity Bioreagents, Golden, CO)를 연구에 사용하였다.
표 5의 결과는 Z3G1이 거의 모든 M2 돌연변이 (M2GHTGKS 및 M2PHTGS는 제외함)에 결합하며, 또한 야생형 M2 펩티드에도 결합한다는 것을 지시한다. 이것은 심지어 야생형 M2 펩티드와 6개 아미노산 위치에서 상이한 M2LTGEKS의 경우에도 마찬가지였다. L66 및 N547은 M2 돌연변이 M2P, M2LGS 및 M2FG에 비해 상대적으로 감소된 결합을 보였고, Z3G1은 M2P, M2LGS 및 M2FG 각각에 결합하였다. 추가로, C40G1 및 14C2는 M2LGS, M2LTKGS, M2HTGEKS, M2KTGEKS, M2LTGS, M2TGEK, M2LTGEKS 및 M2TGE에 결합하지 않거나 또는 감소된 결합 활성을 나타냈으나, Z3G1 항체는 이들 변이체/돌연변이체 M2 펩티드 모두에 결합하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Z3G1이 상이한 M2 돌연변이 펩티드에 높은 친화성으로 결합하는 것을 입증하며, Z3G1이 L66, N547 및 C40G1보다 넓은 범위의 결합 M2e 서열을 가짐을 지시한다. 따라서, Z3G1 항체는 상이한 M2 서열을 갖는 인플루엔자 A 바이러스의 각종 종/단리물 및 아형을 치료하는데 유용할 수 있다.
* 야생형 M2 펩티드 (서열 1)와의 결합에 대하여 비교한 백분율(％)
<10％: -
10-50％: W (약함)
>50％: +.
** 14C2는 M2 펩티드에 대한 시판 마우스 모노클로날 항체임.
| 조류 인플루엔자 | 년도 | 아형 | M2 변이체 | Z3G1 | L66 | N547 | C40G1 | 14C2 |
| 홍콩 | 1997 | H5N1 | M2DLTGS | + | W | + | + | W |
| M2LTKGS | + | + | + | - | - | |||
| M2LTGS | + | + | + | - | - | |||
| 홍콩 | 1999 | H9N2 | M2LTGEKS | + | + | + | W | - |
| 동남아시아 | 2004/2005 | H5N1 | M2TES | + | + | + | + | W |
표 4 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 최근 발생한 조류 인플루엔자 A 종의 M2e 서열은 http://www.flu.lanl.gov/의 미국 질병 통제 센터(The Center for Disease Control (CDC)) 인플루엔자 A 데이타베이스에서 얻은 것이다. M2DLTGS, M2LTKGS 및 M2LTGS 서열은 1997년에 인간에게 전세계적인 위협으로 나타났던 조류 H5N1 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래되고, M2LTGEKS 및 M2TES는 1999년과 2004년 각각에 발생한 조류 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래한다. 이들 종 3가지 모두가 고도로 병원성이며 인간에서 높은 사망률을 초래한다 ([Suzuki, Biol. Pharm. Bull. 28:399 (2005)], [Katz, Avian Dis. 47(3 suppl):914 (2003)]. 이러한 잠재적인 전세계적 감염을 치료할 수 있는 인간 항체를 동정하기 위해서, 인간 항-M2 항체 번호 Z3G1, L66, N547 및 C40Gl을 대상으로 이들 5가지 M2e 변이체 펩티드에 대한 결합에 관하여 연구하였다 (표 6).
표 6에 나타난 바와 같이, Z3G1 및 N547은 5가지 모든 M2e 변이체 펩티드 뿐만 아니라 야생형 M2 펩티드에도 결합한다. L66은 M2DLTGS을 제외한 대개의 변이체에 잘 결합하였다. 그러나, C40G1은 M2LTKGS와 M2LTGS에는 결합하지 않았고, M2LTGEKS에는 단지 약하게만 결합하였다. 참조로, 마우스 모노클로날 항-M2 항체인 14C2는 M2DLTGS와 M2TES에만 약하게 결합하였고, M2LTKGS, M2LTGS 및 M2LTGEKS에는 결합하지 않았다.
이러한 결과는 Z3G1 뿐만 아니라 L66 및 N547 역시 전세계적인 H5N1 및 H9N2 위협 및 다른 잠재적인 조류 인플루엔자 발생을 치료하는 강력한 전략을 제공할 수 있음을 지시한다. 이러한 결과는 또한 Z3G1 뿐만 아니라 L66 및 N547 역시 인플루엔자 A 종에서 발견되는 광범위한 범위의 M2e 펩티드에 결합할 수 있음을 지시한다. CDC 인플루엔자 A 데이타베이스에 대한 추가 분석은, 인간 인플루엔자와 조류 인플루엔자 사이에 특정 M2e 서열이 우세함을 지시하였다. 야생형 M2 (서열 2)는 인간 인플루엔자 A 종에서 우세하게 발현되는 반면, M2TES는 일반적으로 조류 종에서 발현되었다. Z3G1, L66, N547 및 C40G1가 M2TES에 결합할 수 있었기 때문에, 이들 인간 항-M2 항체는 대부분의 조류 인플루엔자 종/단리물 및 아형에 대한 잠재적인 치료 약물일 수 있다.
실시예 3
본 실시예는 Z3G1에 의해 인식되는 항원 결정자를 지시하는 데이타를 포함하며, 상기 항원 결정자는 인간 항-M2 모노클로날 항체인 L66, N547 및 C40G1에 의해 인식되는 항원 결정자와는 다르다. M2 N-말단 및 C-말단의 말단절단(truncation)을 갖는 각종 펩티드를 이용하여, 항체의 최소 결합 서열을 맵핑(mapping)하였다 (표 7 및 표 8). 각 항체의 에피토프는 상기 최소 결합 서열 내에 존재한다.
상기 데이타는 N547의 항원 결정자 (즉, 에피토프)는 아미노산 서열 LLTEVETPIRNEWGC (서열 52) 내에 존재하고, L66에 의해 인식되는 에피토프는 아미노산 서열 SLLTEVETPIRNEWGC (서열 53) 내에 존재하며, C40G1에 의해 인식되는 에피토프는 아미노산 서열 TPIRNE (서열 54) 내에 존재함을 지시한다.
N-말단의 12-아미노산 펩티드 (NM12, 서열 69)는, ELISA로 관찰할 때 C40G1, L66 및 N547에 결합하지 않거나 불량하게 결합하는 것으로 나타났다 (표 7). 이와는 달리, Z3G1은 NM12에 잘 결합하였다. M16 (16-mer)에는 양성 결합하지만 추가의 말단절단형에는 음성 결합하는 일련의 N-말단의 펩티드를 이용한 추가의 연구는 Z3G1이 N-말단으로부터의 1개 아미노산 (즉, 위치 1의 세린) 결실은 허용한다는 것을 지시한다.
Z3G1은 NM11에 대하여는 유의한 결합을 나타낸 반면, 상기 항체는 NM1O에는 검출가능하게 결합하지 않았다. 종합하면, Z3G1 항체의 최소 결합 서열은 LLTEVETPIR (서열 1)로 결정되었는데, 이는 Z3G1에 의해 인식되는 에피토프가 서열 LLTEVETPIR (서열 1) 내에 존재함을 지시한다. 상기 데이타는 또한 항체 Z3G1이 N547, L66 및 C40G1 항체의 에피토프와는 상이한 에피토프를 인식함을 지시한다.
실시예 4
본 실시예는 인플루엔자 바이러스 감염 이전에 본 발명의 M2 모노클로날 항체를 투여하는 것이 이후의 치사 수준의 바이러스 감염에 대하여 동물을 보호함을 지시하는 여러가지 동물 연구를 기재한다.
마우스에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염 모델에서 (바이러스 감염 이전의) 예방 처치를 위한 항-M2 모노클로날 항체의 생체내 효능:
동물에서 항-M2 인간 모노클로날 항체의 효능을 평가하기 위해서, 항체 번호 Z3G1을 마우스 1 마리 당 100 ㎍, 30 ㎍ 및 10 ㎍의 투여량으로 암컷 C57BL/6J 마우스 (생후 6주 내지 8주령)에게 복강내 투여하였다. 항체 투여 후 제1일에, 마취된 마우스 (아버틴(Avertin) (1:1 (w/v)의 2,2,2-트리브로모에탄올:tert-아밀알콜, Sigma, St. Louis, MO) 15 ㎕/g)에게 치사량의 인플루엔자 A/HK/1/68 (CDC, Atlanta, GA) 30 ㎕ (MLD50의 3.2배)를 비강내 투여하여 감염시켰다. 대조군으로는, KM 마우스TM (기린 브레웨리 컴퍼니, 엘티디., 일본 소재)로부터 생성된 이소형 매치된 인간 모노클로날 항-HSA IgG1 항체를 마우스 1 마리 당 100 ㎍으로 사용하였다. 23일 동안 마우스의 생존 여부를 매일 관찰하였다. 이후, 생존 마우스를 희생시키고, 폐를 적출하여 조직학적 분석을 수행하였다.
항-M2 항체 번호 Z3G1로 처치된 마우스는 마우스 1 마리 당 10 ㎍의 낮은 투여량에서도 유의하게 보호되었다 (도 2). 10 마리의 마우스 중 10 마리 (100％)가 관찰 기간 23일 동안 내내 생존하였다. 이와는 달리, 대조군에서는 마우스 10 마리 중 9 마리 (90％)가 감염 후 22일 이내에 사망하였다 (도 2).
마우스 인플루엔자 A 바이러스 감염 모델에서의 플라크 분석으로 결정된, Z3G1에 의한 바이러스 복제의 생체내 억제:
마취된 암컷 C57BL/6J 마우스 (생후 6주 내지 8주령)에게 치사량보다 적은 투여량의 인플루엔자 A/HK/1/68 (CDC, Atlanta, GA) 30 ㎕를 비강내 투여하여 감염시켰다. 마취는 상기 기술된 바와 같이 아버틴을 사용해서 수행하였다. 제2일, 제5일, 제7일, 제9일, 제11일에 감염된 마우스의 폐를 적출하여 플라크 분석으로 바이러스 역가를 결정하였다. 인플루엔자 바이러스의 예방적 치료에 대한 항-M2 모노클로날 항체의 효능을 결정하기 위해, 바이러스 감염 1일 전에 Z3G1 30 ㎍를 투여하였다. 이소형-매치된 항-HSA IgG1 항체를 대조군으로 사용하였다.
도 3의 결과는 Z3G1로 처치된 마우스에서는 감염후 제2일에 바이러스가 검출가능하지 않음을 지시한다. 이와는 달리, 이소형 대조군 (HSA)으로 처치된 마우스에서는 감염후 제2일에 폐에서 바이러스 1 g 당 3.95×104 pfu가 관찰되었다. Z3G1로 처치된 마우스에서는 감염후 제5일에 폐 1 g 당 바이러스가 212 pfu로 존재하였다. 이와는 달리, 대조군 (HSA)으로 처치된 마우스에서는 감염후 제5일에 바이러스 역가가 폐 1 g 당 45×104 pfu로 증가하였다. 따라서, Z3G1 처치에 의해 바이러스 역가가 약 1,000배 내지 10,000배 감소하였다. 감염후 제7일에, 바이러스 역가는 떨어졌고 감염후 제11일에는 상기 바이러스가 실제로 제거되었는데, 이는 바이러스가 숙주의 적응성 면역에 기초하여 제거된 것이라 여겨진다. 상기 데이타는 항-M2 항체 Z3G1가 생체내 인플루엔자 바이러스 복제를 효과적으로 억제함을 입증한다.
실시예 5
본 실시예는 본 발명의 M2 모노클로날 항체가 보체 의존성 세포독성 및 항체 의존성 세포-매개 세포독성을 가짐을 지시하는 연구를 기재한다.
항-M2 항체의 보체 의존성 세포독성 (CDC) 활성:
M2 단백질은 감염된 세포 표면상에서 고도로 발현되기 때문에, 인플루엔자 A 감염으로부터 숙주를 보호하기 위한 항-M2 항체의 메카니즘 중 하나는 보체를 활성화시키는 것이며, 이것은 옵소닌작용을 증대시키고 감염된 세포를 용해시켜서 바이러스를 사멸시키고 생체내 바이러스 증식을 예방한다. 따라서, 항-M2 항체를 인플루엔자 A 바이러스 감염된 세포에 대한 보체 의존성 세포독성에 대하여 시험간내 연구하였다.
MDCK 세포를 96-웰 평면 바닥 플레이트 (Falcon®)에 20 mM L-글루타민, 10 mM 피루브산나트륨, 1000 단위/ml Pen-Strep, MEM 비타민 용액, MEM 이글(Eagle) 비필수 아미노산 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 함유하고 10％ 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충된 완전 최소 필수 배지(complete Minumum Essential Media (cMEM)) 중에서 1 ml 당 2.5×105개 세포 및 웰 당 150 ㎕로 플레이팅하고, 7％ CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, 주기적으로 소용돌이를 일으키면서 실온에서 30분 동안 웰 당 10배의 TCID50 인플루엔자 A 바이러스 (A/PR/8/34; ATCC, Rockville, MD) 30 ㎕로 감염시켰다. 감염 후, 플레이트를 PBS로 1회 세척하고, cMEM 중 1 ㎍/ml 트립신 (TPCK-처리, Worthington, Biochem. Corp.) 150 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 7％ CO2, 37℃에서 26시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 단층을 최소 필수 배지 (MEM)로 3회 세척하였다. 항체를 차단 완충액 (세포 기재의 ELISA에 사용한 것과 동일한 완충액) 중에서 원하는 농도로 희석하여 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에는 웰을 MEM으로 1회 세척하였다. 이어서, MEM 1 ml 중에서 재구성되고 추가로 1:10으로 희석한 로우 톡스 엠 래빗 보체(Low Tox M Rabbit Complements) (Cedarlane Lab Limited - Accurate, Hornby, Ontario, CANADA) 100 ㎕를 세포에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포 단층을 MEM으로 3회 세척하고, 셀타이터(Celltiter) 96® AQueous 원 용액 세포 증식 분석 (Promega, Madison, WI)을 제조업체의 지시에 따라 이용하여 살아있는 세포수를 결정하였다. 살아있는 세포수가 더 많을 수록 495 nm에서의 광학 밀도는 더 높다.
도 4에 나타난 바와 같이, 세포를 세정제 (트리톤(Triton) X-1OO)로 용해시켰을 때의 광학 밀도는 0.2 미만이었다. 이것을 최대 사멸을 나타내는 양성 대조군으로 간주하였다. 이소형 대조군 인간 항체 (HSA)는 어떠한 농도에서도 인플루엔자 A 바이러스로 감염된 MDCK 세포를 용해시키지 못했다. 이와는 달리, 상기 연구에서의 모든 인간 항-M2 항체 (Z3G1, L66, N547 및 C40G1)는 바이러스 감염된 MDCK 세포를 투여량 의존적 방식으로 용해시켰다. 모든 항체가 1 ㎍/ml에서 세포를 용해시켰고, 최대 사멸에 가까운 용해 효과는 10 ㎍/ml의 투여량에서 관찰되었다.
항-M2 항체의 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성:
항-M2 항체가 결합된 인플루엔자 A 바이러스-감염된 세포는 천연 킬러 세포 (NK 세포)라고 불리는 특화된 비-T, 비-B 림프양 세포에 의해 사멸될 수 있다. NK 세포에 의한 항체-결합된 표적 세포의 파괴는 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)이라 불리며, 항-M2 항체가 인플루엔자 A 바이러스 감염으로부터 숙주를 보호할 수 있는 또다른 메카니즘이다.
MDCK 세포를 96-웰 평면 바닥 플레이트 (Falcon®)에 10％ FBS를 함유하는 cMEM 1 ml 당 0.25×105개 세포 및 웰 당 150 ㎕로 플레이팅하고, 7％ CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, 주기적으로 소용돌이를 일으키면서 실온에서 30분 동안 웰 당 10배의 TCID50 인플루엔자 A 바이러스 (A/PR/8/34; ATCC, Rockville, MD) 30 ㎕로 감염시켰다. 감염 후, 플레이트를 PBS로 1회 세척하고, cMEM 중 1 ㎍/ml 트립신 (TPCK-처리, Worthington, Biochem. Corp.) 150 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 7％ CO2, 37℃에서 22시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 단층을 차단 완충액으로 3회 세척하였다. 항체를 차단 완충액 중 5 ㎍/ml로 웰 당 50 ㎕씩 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에는 웰을 차단 완충액으로 1회 세척하고, MACS 정제 시스템 (Miltenyi Biotec, Inc., Auburn, CA)을 제조업체의 지시에 따라 사용하여 정상적인 인간 말초혈로부터의 NK 세포를 정제하였다. RPMI 1640 (페놀 레드 없음) (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 함유하는 10％ 낮은 Ig FCS 1 ml 당 인간 IL-2 200 ng와 함께 예비인큐베이션한 NK 세포를 여러가지 세포수로 웰에 첨가하였다. 사이토톡스(CytoTox) 96® 비방사능 세포독성 분석 시스템 (Promega, Madison, WI)을 제조업체의 지시에 따라 사용하여 세포 용해율을 결정하였다.
상기 연구에서의 모든 인간 항-M2 항체 Z3G1, L66, N547 및 C40G1은 0.5 x 105개 NK 세포가 존재하는 경우에 바이러스 감염된 MDCK 세포를 약 50％ 용해시킬 수 있다. 이와는 달리, IgG1 이소형 대조군 항체 (HSA)를 사용한 경우에는 단지 25％의 용해가 관찰되었다. 대조군에서 항체-코팅되지 않은 표적 세포 용해의 이러한 25％는 활성화된 NK 세포가 바이러스 감염된 세포 및 비자가 세포, 예컨대 MDCK 세포를 용해시킬 수 있기 때문에 관찰된 것임에 유의해야 한다. 그럼에도 불구하고, 상기 용해율은 표적 세포가 항-M2 항체와 결합할 때 50％로 증대될 수 있다. 따라서, 상기한 4가지 인간 항-M2 항체 모두가 ADCC 활성을 보유하였다.
실시예 6
본 실시예는 항-M2 인간 모노클로날 항체 Z3G1의 예방 활성 및 치료 활성을 입증하는 연구를 포함한다. 본 실시예는 또한 원숭이에서 항-M2 인간 모노클로날 항체 Z3G1는 어떠한 독성도 거의 없음을 지시하는 연구를 포함한다.
NK 세포가 고갈된 (면역저하된) 동물에서 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 항-M2 인간 모노클로날 항체 Z3G1의 생체내 예방 효과
NK 세포 고갈: NK 세포를 고갈시키기 위해서, C57BL/6J 마우스에게 NK 세포에서 특이적으로 발현된다고 알려져 있는 NK1.1 항원에 대한 마우스 모노클로날 IgG2a 항체인 PK136 (ATCC, Manassas, VA) 100 ㎍를 처치하였다. 이소형 매치된 항체 (클론 C44, ATCC)를 대조군으로 사용하였다. 상기 항체는 감염전 제2일과 제5일 및 감염후 제1일과 제4일에 처치하였다. 항-NKl.1 항체 또는 대조군 항체의 3회 주사 후, 각 군에서 마우스 1 마리씩을 희생시키고, 림프절, 비장 및 말초혈을 수집하였다. 적혈구 세포 용해 완충액 (Sigma, St Louis, MO)으로 적혈구 세포를 용해한 후에 단일 세포 현탁액을 제조하고, 항-Fc 수용체 항체 (클론 2.4G2, eBioscience)로 20분 동안 차단한 후에 DX5 FITC 및 CD3 PE (eBioscience, San Diego, CA) 또는 적절한 이소형 대조군으로 빙상에서 45분 동안 염색하였다. 2％ FCS, 10 mM EDTA, 0.05％ NaN3을 함유하는 PBS로 2회 세척하고 PBS로 1회 세척한 후, 세포를 4％ 파라포름알데히드로 30분 동안 고정시킨 후에 유동 세포계측법으로 분석하였다. DX5는 마우스에서 NK 세포 마커이다. 현탁액 중의 세포 총수에 대한 DX5 양성 세포의 수를 기초로 하여 각 조직에 존재하는 NK 세포의 백분율(％)을 계산하였다.
NK 세포가 고갈된 마우스에서 인플루엔자 A 감염의 항-M2 항체 처치: 바이러스 감염 1일 전에 항-M2 항체 Z3G1을 마우스 1 마리 당 100 ㎍의 투여량으로 복강내 투여하였다. 대조군으로는, 이소형 매치된 인간 모노클로날 항-인간 혈청 알부민 (HSA) IgG1 항체를 마우스 1 마리 당 100 ㎍으로 투여하였다. 바이러스 감염을 위해서 마우스를 아버틴 (1:1 (w/v)의 2,2,2-트리브로모에탄올 및 tert-아밀알콜, Sigma, St. Louis, MO) 15 ㎕/g로 마취시키고, 치사량 (MLD50의 3.2배)의 인플루엔자 A/HK/1/68 (CDC, Atlanta, GA) 30 ㎕를 비강내 투여하였다. 이어서, 23일 동안 마우스의 생존 여부를 매일 관찰하였다.
하기 표 9에 나타낸 바와 같이, NK 세포의 백분율(％)은 항-NK1.1 항체로 처치된 마우스에서 분석된 3가지 조직 모두에서 이소형 대조군 항체로 처치된 마우스에 비해 감소되었다. NK 세포를 대표하는 DX5 양성 세포는, 림프절에서는 0.93％에서 0.02％로 감소하였고, 비장에서는 1.74％에서 0.52％로 감소하였으며, 말초혈에서는 3.45％에서 0.75％로 감소하였다. 이러한 결과는 항-NK1.1 항체 처치로 인해 NK 세포가 효율적으로 고갈되었음을 나타낸다.
| 림프절 (％) | 비장 (％) | 말초혈 (％) | |
| 이소형 대조군 항체로 처치된 마우스 | 0.93 | 1.74 | 3.45 |
| 항-NK1.1 항체로 처치된 마우스 | 0.02 | 0.52 | 0.75 |
NK-고갈된 마우스에서 인플루엔자 A 감염에 대한 항-M2 항체 Z3G1의 보호 효과
마우스 1 마리 당 100 ㎍의 항-M2 항체 Z3G1은 NK 세포가 고갈된 조건 (Z3G1/NK-) 또는 고갈되지 않은 조건 (Z3G1/NK+)에서 A/HK/1/68 감염으로부터 마우스를 보호한 반면에, 이소형 대조군 항-HSA 항체는 NK 세포가 고갈되었는지 또는 고갈되지 않았는지의 여부와 상관없이 바이러스 감염으로부터 마우스를 보호하지 않았다 (도 6, HSA/NK- 및 HSA/NK+). Z3G1/NK- 및 Z3G1/NK+ 군에서는 23일의 관찰 기간 동안에 각각 7 마리 마우스 중 6 마리 및 8 마리 마우스 중 6 마리가 생존하였다. 이들 2가지 군 사이에 통계적 차이는 관찰되지 않았다 (p>0.05, 카플란 마이어(Kaplan Meier) 생존 분석에 의함). 이와는 달리, HSA/NK- 및 HSA/NK+ 군에서는 각각 8 마리 마우스 중 1 마리 및 8 마리 마우스 중 0 마리가 생존하였다. Z3G1로 처치된 군과 항-HSA로 처치된 군 사이에서 감염된 마우스의 시간 경과에 따른 생존율 변화는 NK가 고갈된 조건 및 고갈되지 않은 조건 둘다에서 통계적으로 유의하였다 (p<O.OO1).
M2 HBc라 명명된 HBc (B형 간염 바이러스 코어 입자)에 커플링된 M2 세포외 부분으로 구성된 백신의 효과에 대한 보고가 있었다 [Jegerlehner, et al., J. Immunol. 172:5598 (2004)]. 상기 문헌의 저자들은 NK 세포가 고갈된 조건에서는 감염에 대한 백신 효과가 줄어든다고 보고하였다. 추가로, 이들 저자들은 NK 세포가 고갈되면 M2-HBc로 백신화된 마우스에서 얻은 혈청의 수동 전달은 치사 수준의 인플루엔자 A 감염으로부터 마우스를 보호하지 못한다고 보고하였다. 이러한 결과는 인플루엔자 A 감염에 대한 M2-HBc 백신의 보호 효과가 주로 NK 세포에 의해 매개됨을 지시한다. 이와는 달리, 항-M2 항체 Z3G1은 NK 세포가 고갈된 조건이라 하더라도 치사 수준의 인플루엔자 A 감염으로부터 마우스를 효과적으로 보호하였다. 이러한 결과는 항-M2 인간 모노클로날 항체 Z3G1이 면역저하된 대상체, 예컨대 NK 세포 기능이 손상될 수 있는 암 환자에서 효과적일 수 있음을 지시한다. 이러한 결과는 또한 항-M2 항체 Z3G1을 사용한 수동 면역요법이 인플루엔자 A 감염에 대하여 상기 백신에 비해 더 우수한 보호를 제공할 수 있음을 지시한다.
마우스에서 인플루엔자 A 감염에 대한 항-M2 항체 Z3G1의 치료 효과
마취된 마우스 (15 ㎕/g의 아버틴 (1:1 (w/v)의 2,2,2-트리브로모에탄올 및 tert-아밀알콜)) (Sigma, St. Louis, MO)를 치사량의 인플루엔자 A/HK/1/68 (CDC, Atlanta, GA) 30 ㎕ (MLD50의 3.2배)로 비강내 감염시켰다. 바이러스 감염 후 제1일에는 Z3G1을 마우스 1 마리 당 200 ㎍, 100 ㎍ 및 30 ㎍의 투여량으로 암컷 C57BL/6J 마우스 (생후 6주 내지 8주령)에게 복강내 투여하였다. 대조군으로는, 이소형 매치된 인간 모노클로날 항-HSA IgG1 항체를 마우스 1 마리 당 200 ㎍으로 투여하였다. 23일 동안 마우스의 생존 여부를 매일 관찰하였다.
데이타는 도 7에 나타내었다. 대조군 항-HSA IgG1 군에서는 감염후 제11일에 8 마리 마우스 중 7 마리가 사망하였다. 이와는 달리, 마우스 1 마리 당 Z3G1 200 ㎍을 처치한 군에서는 감염후 제11일에 8 마리 마우스 중 7 마리가 생존하였고, 제23일에는 8 마리 마우스 중 4 마리가 생존하였다. 대조군과 마우스 1 마리 당 Z3G1 200 ㎍을 처치한 군 사이에서 시간 경과에 따른 생존율 변화는 통계적으로 유의하였다 (p<0.02, 카플란 마이어 생존 분석에 의함). 마우스 1 마리 당 100 ㎍의 투여량에서는 제11일과 제23일에 각각 8 마리 마우스 중 7 마리 및 8 마리 마우스 중 3 마리가 살아있었지만, 이 차이는 대조군에 비하여 통계적으로 유의하지 않았다 (p=0.068).
마우스 1 마리 당 30 ㎍의 투여량에서는 제11일과 제23일에 각각 8 마리 마우스 중 3 마리 및 8 마리 마우스 중 1 마리가 살아있었고, 처치군에서 대조군과 비교되는 보호는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 항-M2 항체 Z3G1이 인플루엔자 감염 후에 투여된다 하더라도 항체는 인플루엔자 A 감염에 대한 치료 효과를 갖는다는 것을 지시한다.
필리핀 원숭이(Cynomolgus Monkey)에서 단일 투여량의 Z3G1의 독성 연구
Z3G1의 독성을 평가하기 위해서, 상기 항체를 필리핀 원숭이 2 마리에게 30 mg/kg의 단일 투여량으로 대략 45 분에 걸친 정맥내 주입으로 투여하였다. 3주 동안 동물 연구를 실시한 후에 이들을 부검하였다. 대조군으로는, 비히클인 PBS를 원숭이 2마리에게 투여하였다 . 30 mg/kg의 Z3G1 처치는 예를 들어 음식물 섭취 및 체중 등의 임상적 관찰결과를 대조군에 비해 의미있게 변화시키지 않았다. 상기 항체는 혈액학적 파라미터 및 혈청의 화학적 성질에 특이적인 효과를 갖지 않았는데, 이는 임상적 병리상태에서도 의미있는 변화는 없음을 지시한다. 종합하면, 예를 들어 혈청의 화학적 성질, 혈액학적 성질, 음식물 섭취, 체중, 전반적인 병리상태 또는 조직병리학적 상태 등과 같은 시험된 파라미터를 기초로 할 때 30 mg/kg의 Z3G1를 필리핀 원숭이에게 단일 정맥내 처치한 것은 주목할 만한 독성을 전혀 나타내지 않았다. Z3G1은 내성이 우수하다고(well tolerated) 여겨진다.
SEQUENCE LISTING
<110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA
KATO, Shinichiro
WANG, Rongfang
<120> HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO INFLUENZA M2 PROTEIN AND METHODS OF MAKING AND USING SAME
<130> PH-2791-PCT
<140> PCT/IB2005/004146
<141> 2005-12-05
<150> 60/633,846
<151> 2004-12-06
<150> 60/724,198
<151> 2005-10-06
<160> 75
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 1
Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg
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<212> PRT
<213> Influenza virus
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<213> Influenza virus
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<213> Influenza virus
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<213> Influenza virus
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<213> Influenza virus
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<213> Influenza virus
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Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Lys Gly Trp Glu Cys
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Ser Leu Leu Thr Gly Val Glu Thr His Thr Arg Asn Gly Trp Gly Cys
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Ser Leu Leu Pro Glu Val Glu Thr His Thr Arg Asn Gly Trp Gly Cys
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Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile
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Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile
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Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg
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Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn
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<213> Influenza virus
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Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg
1 5
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc ccactcccag 60
gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120
tgcaaggctt ctggttacac ctttaccagc tatggtatca gctgggtgcg acaggcccct 180
ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc agcgcttaca atggtaacac aaactatgca 240
cagaagctcc agggcagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg 300
gagctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag ggcagcagct 360
ggcggatact tccagcactg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc a 411
<210> 33
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
atggccagct tccctctcct cctcaccctc ctcactcact gtgcagggtc ctgggcccag 60
tctgtgctga ctcagccacc ctcagcgtct gggacccccg ggcagagggt caccatctct 120
tgttctggaa gcaactccaa catcggaagt aaaactgtaa actggtacca gcagctccca 180
ggaacggccc ccaaactcct catctctagt aataatcagc ggccctcagg ggtccctgac 240
cgattctctg gctccaagtc tggcacctca gcctccctgg ccatcagtgg gctccagtct 300
gaggatgagg ctgattatta ctgtgcagca tgggatgaca gcctgaatgg tgtggtattc 360
ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt cagcccaagg ctgccccctc ggtcactctg 420
ttcccaccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 480
gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 540
ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac 600
ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacaaaagct acagctgcca ggtcacgcat 660
gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttcatag 708
<210> 34
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Phe Gln His Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 35
<211> 235
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr
20 25 30
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile
35 40 45
Gly Ser Lys Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Ser Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
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Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
100 105 110
Asp Ser Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
115 120 125
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
165 170 175
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
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Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
195 200 205
Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
210 215 220
Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230 235
<210> 36
<211> 1404
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc ccactcccag 60
gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120
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gagctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag ggcagcagct 360
ggcggatact tccagcactg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 420
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380
ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404
<210> 37
<211> 467
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Phe Gln His Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 38
tcttgtccac cttggtgttg ctgggcttgt g 31
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 39
ggggccactg tcttctccac ggtgctc 27
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 40
ggtgccaggg ggaagaccga tgg 23
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 41
cacggctccc gggtagaagt cact 24
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 42
gtaaaacgac ggccagtg 18
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 43
caggaaacag ctatgac 17
<210> 44
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 44
agagagagag gtcgacccac catggactgg acctggagca tcctttt 47
<210> 45
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 45
gagagagagg ctagctgagg agacggtgac cagggtg 37
<210> 46
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 46
agagagagag atctcaccat ggccagcttc cctctcctcc t 41
<210> 47
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 47
agagagagag gaattcctat gaacattctg taggggccac tgtc 44
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 48
ggtacgtgaa ccgtcagatc gcctgga 27
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 49
tctatataag cagagctggg tacgtcc 27
<210> 50
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 50
tgcacgccgc tggtcagggc gcctgagttc c 31
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 51
tctcataagt gacttctacc cgggagc 27
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 52
Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1 5 10 15
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 53
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1 5 10 15
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 54
Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1 5
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 55
Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg
1 5 10 15
<210> 56
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<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 56
Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg
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<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 57
Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg
1 5 10
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<212> PRT
<213> Influenza virus
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Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser
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Asp
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<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 59
Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 60
Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
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<212> PRT
<213> Influenza virus
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Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
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<213> Influenza virus
<400> 62
Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
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<213> Influenza virus
<400> 63
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1 5 10
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 64
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1 5 10 15
Arg
<210> 65
<211> 16
<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 65
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1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 66
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<212> PRT
<213> Influenza virus
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<213> Influenza virus
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<213> Influenza virus
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<213> Influenza virus
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<213> Influenza virus
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<212> PRT
<213> Influenza virus
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<213> Influenza virus
<400> 73
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<211> 15
<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 74
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<213> Influenza virus
<400> 75
Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1 5 10
1
PCT/IB2005/004146
600187316v1
Claims (142)
- 인플루엔자 A 바이러스 단백질 M2 세포외 도메인 중의 에피토프에 특이적으로 결합하며, ATCC PTA-5967로서 기탁된 CHO 세포 또는 ATCC PTA-5968로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체가 특이적으로 결합하는 에피토프에 결합하는 단리된 항체.
- (삭제)
- 제1항에 있어서, 아미노산 서열내의 에피토프에 결합하는 항체.
- 제1항에 있어서, ATCC PTA-5967로서 기탁된 CHO 세포 또는 ATCC PTA-5968로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체가 특이적으로 결합하는 것과 동일한 결합 특이성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, ATCC PTA-5967로서 기탁된 CHO 세포 또는 ATCC PTA-5968로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체가 특이적으로 결합하는 것과 동일한 최소 결합 서열을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서,인 최소 결합 서열에 결합하는 항체.
- 제1항에 있어서, 항체 결합에 대한 최소 결합 서열이인 항체.
- 제1항에 있어서, ATCC PTA-5968로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, ATCC PTA 5967로서 기탁된 CHO 세포에 의해 생산되는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
- 제9항에 있어서, 실시예 1에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열의 성숙 부분 및 실시예 1에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열의 성숙 부분을 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, ATCC PTA 5967로서 기탁된 CHO 세포에 의해 생산되는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 및 불변 영역 서열을 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, ATCC PTA-5968로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 및 불변 영역 서열을 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, 실시예 1에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 및 불변 영역 서열의 성숙 부분 및 실시예 1에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 및 불변 영역 서열의 성숙 부분을 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 및 인간 IgG4로부터 선택된 아군인 항체.
- 제14항에 있어서, 항체의 아군이 인간 IgG1인 항체.
- 제1항에 있어서, ATCC PTA-5968로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체가 결합하는 M2 펩티드의 최소 결합 서열에 결합하거나, ATCC PTA-5968로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체가 결합하는 것과 실질적으로 동일한 M2 펩티드의 최소 결합 서열에 결합하는 항체.
- 제1항에 있어서, ATCC PTA-5967로서 기탁된 CHO 세포에 의해 생산되는 항체가 특이적으로 결합하는 M2 펩티드의 최소 결합 서열에 결합하거나, ATCC PTA-5967로서 기탁된 CHO 세포에 의해 생산되는 항체가 특이적으로 결합하는 것과 실질적으로 동일한 M2 펩티드의 최소 결합 서열에 결합하는 항체.
- 제1항에 있어서, 세포외 도메인이
로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 항체. - 제1항에 있어서,
로부터 선택된 M2 세포외 도메인 서열 중 18개 이상의 서열에 결합하는 항체. - 제1항에 있어서, 상이한 아미노산 서열을 갖는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 M2 세포외 도메인에 결합하는 항체.
- 제1항에 있어서, 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 13일 기탁) 또는 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 13일 기탁)로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산되는 항체가 결합하는 M2 변이체 서열 중 적어도 2 내지 5개, 5 내지 10개, 10 내지 15개, 15 내지 20개, 20 내지 25개 또는 그 이상에 결합하거나 약하게 결합하는 항체.
- 제1항에 있어서, 번호 Z3G1 (ATCC 기탁 번호 PTA-5967; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 13일 기탁) 또는 번호 Z3G3 (Z3.16.25.1) (ATCC 기탁 번호 PTA-5968; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2004년 3월 13일 기탁)로 표시되는 세포주 (예컨대, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 생산되는 항체가 결합하는 M2 변이체 서열 중 적어도 2 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25개 또는 그 이상에 결합하거나 약하게 결합하지만, 항-M2 항체 L66, N547, C40G1 또는 14C2 항체가 결합하는 M2 서열에는 결합하지 않거나 단지 약하게만 결합하는 항체.
- 제22항에 있어서, M2 세포외 도메인 서열이
로부터 선택되는 것인 항체. - 제22항에 있어서, M2 세포외 도메인 중 2개 이상의 서열에 대한 항체 결합이 M2 펩티드에 결합하는 양의 적어도 20 내지 50％ 또는 그 이상인 항체.
- 제1항에 있어서, 검출가능한 보체 의존성 세포독성 활성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, 검출가능한 항체 의존성 세포-매개 세포독성 활성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, IgG, IgA, IgM, IgE, 및 IgD 이소형으로부터 선택된 것인 항체.
- 제27항에 있어서, IgG 이소형이 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된 것인 항체.
- 제1항에 있어서, ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체.
- 제1항에 있어서, ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, 결합 친화성이 ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 약 5 내지 5000배 이내인 항체.
- 제1항에 있어서, ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로 서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체가 결합하는 것과 실질적으로 동일한 M2 펩티드의 최소 결합 서열에 결합하는 항체.
- 제32항에 있어서, M2 펩티드가의 아미노산 서열로 이루어진 것인 항체.
- 제1항에 있어서, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 인플루엔자 바이러스 감염, 인플루엔자 바이러스 증식 또는 인플루엔자 바이러스 복제를 억제하는 항체.
- 제1항에 있어서, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 인플루엔자 바이러스 결합을 억제하는 항체.
- 제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 역가의 증가를 억제하거나, 인플루엔자 바이러스 역가를 감소시키거나, 인플루엔자 바이러스 복제 또는 증식을 감소시키거나, 대상체에서의 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 감소시키는 항체.
- 제1항에 있어서, 대상체가 인플루엔자 바이러스에 노출되거나 인플루엔자 바이러스로 감염된 후에, 인플루엔자 바이러스 역가의 증가를 억제하거나, 인플루엔자 바이러스 역가를 감소시키거나, 인플루엔자 바이러스 복제 또는 증식을 감소시 키거나, 대상체에서의 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 감소시키는 항체.
- 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 증상 또는 합병증이 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염, 귀 통증 및 사망으로부터 선택되는 것인 항체.
- 제36항 또는 제37항에 있어서, ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 결합 특이성 또는 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, 대상체의 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하며, ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 특이성 또는 결합 친화성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키는 항체.
- 제41항에 있어서, ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로 서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 결합 특이성 또는 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 단백질 M2가 인간 또는 조류 인플루엔자 A 바이러스인 항체.
- 제43항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스가 A/PR/8/34 (H1N1), A/HK/1/68 (H3N2), A/HK/1/68 (H3N2), A/HK/156/97, A/터키/VA/158512/02, 및 A/베트남/1196/04로부터 선택되거나, H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3 아형으로부터 선택된 종 또는 단리물인 항체.
- 제1항에 있어서, 세포 기반 ELISA 분석으로 측정했을 때, MDCK 세포의 인플루엔자 A 바이러스 감염을 억제하는 EC50이 2.0 내지 3.0 ㎍/ml 미만, 1.0 내지 2.0 ㎍/ml 미만, 0.5 내지 1.0 ㎍/ml 미만, 0.1 내지 0.5 ㎍/ml 미만 또는 0.1 ㎍/ml 미만인 항체.
- 제1항에 있어서, 세포 기반 ELISA 분석으로 측정했을 때, MDCK 세포의 인플 루엔자 A 바이러스 감염을 억제하는 EC50이 0.05 내지 0.1 ㎍/ml 미만인 항체.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스가 A/PR/8/34 (H1N1), A/HK/1/68 (H3N2), A/HK/1/68 (H3N2), A/HK/156/97, A/터키/VA/158512/02, 및 A/베트남/1196/04로부터 선택되거나, H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3 아형으로부터 선택된 종 또는 단리물인 항체.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 결합 특이성 또는 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, 세포 기반 ELISA 분석으로 측정했을 때, MDCK 세포로의 M2 결합 억제에 대한 EC50이 2.0 내지 3.0 ㎍/ml 미만, 1.0 내지 2.0 ㎍/ml 미만, 0.5 내지 1.0 ㎍/ml 미만, 0.1 내지 0.5 ㎍/ml 미만 또는 0.1 ㎍/ml 미만인 항체.
- 제1항에 있어서, 세포 기반 ELISA 분석으로 측정했을 때, MDCK 세포에 대한 M2 결합을 억제하는 EC50이 0.05 내지 0.1 ㎍/ml 미만인 항체.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 결합 특이성 또는 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체와 동일한 에피토프를 인식하는 항체.
- 제1항에 있어서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 상이한 인플루엔자 바이러스 종 또는 단리물 또는 아형에 특이적으로 결합하는 항체.
- 제53항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 종 또는 단리물 또는 아형이 상이한 M2 세포외 도메인 서열을 갖는 것인 항체.
- 제53항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 종 또는 단리물 또는 아형이
로부터 선택된 M2 세포외 도메인 서열을 갖는 것인 항체. - 제53항에 있어서, 각각의 종 또는 단리물이
로부터 선택된 M2 세포외 도메인 서열을 갖는 것인 다수의 인플루엔자 바이 러스 종 또는 단리물에 결합하는 항체. - 제1항의 항체의 아미노산 하위서열.
- 제57항에 있어서, 제1항의 항체의 결합 특이성 또는 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 아미노산 하위서열.
- 제57항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VH 및 VL), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, scFv 및 sdFv로부터 선택되는 아미노산 하위서열.
- 제1항에 있어서, 항체 다량체(multimer)를 포함하는 항체.
- 제1항 또는 제57항에 있어서, 하나 이상의 이종 도메인을 추가로 포함하는 항체 또는 아미노산 하위서열.
- 제61항에 있어서, 이종 도메인이 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 하위서열.
- 제61항에 있어서, 이종 도메인이 결합 단백질, 효소 활성, 약물, 항바이러스 제, 독소, 면역조절제, 검출가능한 잔기 또는 태그를 포함하는 것인 항체 또는 하위서열.
- 제1항에 있어서, 이중특이적 또는 이관능성인 항체.
- 제1항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 람다 경쇄를 코딩하는 유전자좌를 갖는 비인간 동물에 의해 생산되는 항체.
- 제65항에 있어서, 비인간 동물이 포유동물을 포함하는 것인 항체.
- 제66항에 있어서, 포유동물이 내생 이뮤노글로불린을 발현하지 않는 것인 항체.
- 제65항에 있어서, 비인간 동물이 마우스를 포함하는 것인 항체.
- 제68항에 있어서, 마우스가 내생 이뮤노글로불린을 발현하지 않는 것인 항체.
- 제65항에 있어서, M2 단백질 서열의 N-말단측의 아미노산 잔기 1 내지 24번 이내에 포함된 에피토프에 결합하는 항체.
- 제65항에 있어서, M2 단백질 서열의 N-말단측의 아미노산 잔기 2 내지 12번 이내에 포함된 에피토프에 결합하는 항체.
- 제65항에 있어서, ATCC PTA-5968로서 기탁된 하이브리도마 또는 ATCC PTA-5967로서 기탁된 CHO 세포에 의해 생산되는 항체가 결합하는 M2 펩티드의 최소 결합 서열에 결합하는 항체
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 하위서열을 발현하는 숙주 세포.
- 제73항에 있어서, 항체가 ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 결합 특이성 또는 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 것인 숙주 세포.
- 제73항에 있어서, 세포가 박테리아, 효모, 식물 또는 동물인 숙주 세포.
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 하위서열을 발현하는 비인간 유전자변환 동물 또는 식물.
- ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체를 코딩하는 핵산.
- 제77항에 있어서, 벡터를 추가로 포함하는 핵산.
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 하위서열 및 항바이러스제를 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 하위서열 및 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 억제하는 물질을 포함하는 조성물.
- 제80항에 있어서, 상기 증상 또는 합병증이 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염, 귀 통증 및 사망으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 하위서열 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 하위서열 및 하나 이상의 인 플루엔자 바이러스 종 또는 단리물에 의한 대상체의 감염을 치료하거나, 억제하거나, 예방하거나 또는 상기 감염의 감수성을 감소시키기 위한 지침서를 포함하는 키트.
- 제83항에 있어서, 항체를 점막 조직으로 전달하기 위한 제품을 추가로 포함하는 키트.
- 제83항에 있어서, 상기 제품이 대상체의 흡입 또는 대상체로의 비측 투여에 적합한 흡입기, 에어로졸, 스프레이 또는 스퀴즈 보틀(squeeze bottle)을 포함하는 것인 키트.
- 제83항에 있어서, 상기 점막 조직이 비도(nasal passage), 부비동, 입, 인후, 후두 또는 폐를 포함하는 것인 키트.
- 제83항에 있어서, 항바이러스제를 추가로 포함하는 키트.
- 제83항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 억제하는 물질을 추가로 포함하는 키트.
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 하위서열을 대상체의 인플루 엔자 바이러스 감염을 치료하기에 유효한 양으로 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는 방법.
- 제89항에 있어서, 항체를 대상체의 인플루엔자 바이러스 감염 이전에, 감염과 실질적으로 동시에 또는 감염 이후에 투여하는 것인 방법.
- 제89항에 있어서, 대상체가 면역저하된 상태인 방법.
- 제89항에 있어서, 투여가 치료 이점을 제공하는 것인 방법.
- 제92항에 있어서, 상기 치료 이점이 대상체에서 인플루엔자 바이러스 역가의 증가를 억제하거나, 인플루엔자 바이러스 역가를 감소시키거나, 인플루엔자 바이러스 복제의 증가를 억제하거나, 인플루엔자 바이러스 복제를 감소시키거나, 인플루엔자 바이러스 증식의 증가를 억제하거나, 인플루엔자 바이러스 증식을 감소시키거나, 또는 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 진행, 중증도, 빈도, 지속기간 또는 가능성을 감소시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제93항에 있어서, 상기 증상 또는 합병증이 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염, 귀 통증 및 사망으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제92항에 있어서, 상기 치료 이점이 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 대상체의 회복을 촉진시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- (삭제)
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- 제89항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 인간 또는 조류 인플루엔자 바이러스인 방법.
- 제89항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 A/PR/8/34, A/HK/1/68, A/HK/1/68, A/HK/156/97, A/터키/VA/158512/02, A/베트남/1196/04, 또는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3 아형으로부터 선택된 종 또는 단리물인 방법.
- 제89항에 있어서, 항체가인 최소 결합 서열에 결합하는 것인 방법.
- (삭제)
- (삭제)
- (삭제)
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 하위서열을 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 종 또는 단리물에 의한 대상체의 감염을 억제하기에 유효한 양으로 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 종 또는 단리물에 의한 대상체의 감염을 억제하는 방법.
- 제106항에 있어서, 대상체가 투여시에 인플루엔자 바이러스로 감염되지 않은 상태인 방법.
- 제106항에 있어서, 대상체가 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 나타내지 않는 상태인 방법.
- 제106항에 있어서, 대상체가 인플루엔자에 노출되거나 인플루엔자와 접촉하였으나, 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 나타내지 않는 상태인 방법.
- 제106항에 있어서, 항체를 대상체의 인플루엔자 바이러스 감염 이전에, 감염과 실질적으로 동시에 또는 감염 이후에 투여하는 것인 방법.
- 제106항에 있어서, 대상체가 면역저하된 상태인 방법.
- 제106항에 있어서, 상기 투여가 치료 또는 예방 이점을 제공하는 것인 방법.
- 제112항에 있어서, 상기 이점이 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 대상체를 보호하는 것 또는 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키는 것을 포함하는 것인 방법.
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- 제106항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 종 또는 단리물이 인간 또는 조류 인플루엔자 바이러스인 방법.
- 제106항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 종 또는 단리물이 A/PR/8/34, A/HK/1/68, A/HK/1/68, A/HK/156/97, A/터키/VA/158512/02, A/베트남/1196/04, 또는 H1N15 H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3 아형으로부터 선택된 것인 방법.
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- 제106항에 있어서, 항체가 서열 32, 33 및 36에 기재된 핵산 서열 또는 서열 32, 33 및 36에 기재된 핵산에 대해 축퇴성(degenerate)인 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제106항에 있어서, 항체가 서열 34, 35 및 37에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열을 포함하는 것인 방법.
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- 서열 34, 35 및 37에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열을 코딩하는 핵산.
- 서열 32, 33 및 36에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 및 불변 영역 서열 또는 경쇄 가변 및 불변 영역 서열을 코딩하는 핵산.
- a) 서로 상이한 아미노산 서열을 가진 2개 이상의 M2 펩티드 또는 서로 상이한 아미노산 서열을 가진 2개의 M2 펩티드의 면역원성 단편을, 인간 이뮤노글로불 린을 발현할 수 있는 동물에게 투여하는 단계;b) 인간 M2 항체를 발현하는 동물을 스크리닝하는 단계;c) 인간 M2 항체를 생산하는 동물을 선별하는 단계;d) 인간 M2 항체를 생산하는 동물로부터 항체를 단리하는 단계; 및e) 인간 M2 항체가 M2에 결합하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제56항, 제60항 내지 제72항 중 어느 한 항의 인간 M2 항체의 제조 방법.
- a) 서로 상이한 아미노산 서열을 가진 2개 이상의 M2 펩티드, 또는 서로 상이한 아미노산 서열을 가진 2개의 M2 펩티드의 면역원성 단편을, 인간 이뮤노글로불린을 발현할 수 있는 동물에게 투여하는 단계;b) 인간 M2 항체를 발현하는 동물을 스크리닝하는 단계;c) 인간 M2 항체를 생산하는 동물을 선별하는 단계;d) 인간 M2 항체를 생산하는 동물로부터 비장 세포를 단리하는 단계;e) 비장 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산하는 단계; 및f) 인간 M2 항체를 발현하는 하이브리도마를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제56항, 제60항 내지 제72항 중 어느 한 항의 인간 M2 항체의 제조 방법.
- a) M2 단백질 내에 포함된 펩티드 서열을, 인간 이뮤노글로불린 람다 경쇄를 코딩하는 유전자좌를 가진 비인간 동물에게 투여하는 단계;b) 인간 M2 항체를 발현하는 비인간 동물을 스크리닝하는 단계;c) 인간 M2 항체를 생산하는 비인간 동물을 선별하는 단계;d) 인간 M2 항체를 생산하는 비인간 동물로부터 비장 세포를 단리하는 단계;e) 비장 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산하는 단계; 및f) 인간 M2 항체를 발현하는 하이브리도마를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제56항, 제60항 내지 제72항 중 어느 한 항의 인간 M2 항체의 제조 방법.
- 제130항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, M2 펩티드가 M2 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제130항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 M2 항체에 대한 최소 결합 서열이과 동일하거나 실질적으로 동일한 것인 방법.
- 제130항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 M2 항체가인 최소 결합 서열에 결합하는 것인 방법.
- 제130항 또는 제131항에 있어서, 동물이 비인간 동물인 방법.
- a) 인간 M2 항체를 생산하는 ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마를 제공하는 단계; 및b) 상기 CHO 세포주 또는 하이브리도마로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제56항, 제60항 내지 제72항 중 어느 한 항의 인간 M2 항체의 제조 방법.
- a) ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 결합 특이성을 갖는 인간 M2 항체를 생산하는 동물을 제공하는 단계;b) 인간 M2 항체를 생산하는 동물로부터 비장 세포를 단리하는 단계;c) 비장 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산하는 단계; 및d) ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 결합 특이성을 갖는 인간 M2 항체를 발현하는 하이브리도마를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제56항, 제60항 내지 제72항 중 어느 한 항의 인간 M2 항체의 제조 방법.
- 제137항 또는 제138항에 있어서, 상기 동물 또는 세포가 비인간 동물 또는 세포인 방법.
- 제137항 또는 제138항에 있어서, 상기 동물 또는 세포가 ATCC 기탁 번호 PTA-5967 또는 ATCC 기탁 번호 PTA 5968로서 기탁된 CHO 세포주 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 항체를 발현하는 것인 방법.
- 제137항 또는 제138항에 있어서, 인간 M2 항체에 대한 최소 결합 서열이과 동일하거나 실질적으로 동일한 것인 방법.
- 제137항 또는 제138항에 있어서, 인간 M2 항체가인 최소 결합 서열에 결합하는 것인 방법.
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