TWI377212B - Human monoclonal antibodies to influenza m2 protein and methods of making and using same - Google Patents

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九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於抗體’更特定言之關於特異結合於流行性 感冒病毒M2蛋白質之人類、人源化及嵌合抗體。此外， 本發明係關於抗體，更特定言之關於其最小結合序列為 LLTEVETPIR(SEQIDN0:1)之人類、人源化及嵌合抗體。 【先前技術】 流行性感冒A型或B型病毒每年在所有國家中都會導致 疾病流行且在發達國家中乃死亡之一主要原因。在美國， 流行性感冒流行病可在約20〇/〇的人中導致疾病且每年有平 均20,000人死亡及1 14,000人住院治療與其相關。目前控制 ML行性感冒之朿略為每年接種滅活的全病毒疫苗或次單位 疫苗。 流行性感冒疫苗已證明具有保護不受流行性感冒感染之 作用。然而每年出現之流行性感冒病毒之抗原變異體使得 對同時期循環病毒株之監視成為必需。在某些情況中，預 測新穎變異病毒株之困難已阻礙疫苗之及時生產（Frace等 人，Vaccine 17:2237 (1999))。目前，由於在南亞出現如 H5N 1之禽類流行性感冒病毒，因此廣泛流行的禽類流行 性感冒已成為嚴重的威脅。目前可利用之疫苗對禽類病毒 無效（Lipatov等人，j. Virology 78:895 1 (2〇〇4) ; 等人，N Engl. Med. 352:1 839 (2005))。目前疫苗之第三個 問題為在某些免疫系統不全之人群（例如未成熟嬰兒、老 年人、AIDS及移植病患）中為無效。 105723.doc 由於未獲得抗禽類病毒之疫苗，因此全世界的國家目前 正試圖儲備抗流行性感冒的藥物(克流感(Tamiflu)，一種 神經胺糖酸酶抑舍丨高丨, 一 ^ "丨）以抵抗可能發生的全球流感廣泛流 行。該藥物目前供應不足。目前，在越南- 14歲小女孩體 發現耐藥f生禽類病毒。對克流感之耐受性同樣亦在人 類流行性感W中發現（Mai Le等人，Nature 437:1 108 (2005)) φ於克流感為目前最有效的抗流行性感冒藥物因 此若該流出之病4傳遞至其⑽人則彡可成為一大問題。關 於克流感之另一另人關注之處在於是否其可有效抵抗嚴重 的禽類流行性感冒仍不清楚，儘管其可加快成人自感染有 同時期的流行性感冒病毒株之輕度感染痊癒。 紅金球凝聚素（ΗΑ)及神經胺糠酸酶（ΝΑ)為刺激抗體產生 之兩種主要抗原。由於該等兩種蛋白質之頻繁抗原變異， 因此其並非代表開發治療性抗體藥物之最佳靶。Α型流行 性感冒病毒之第三種跨膜蛋白質（基質蛋白質2(M2))可藉 由感染病毒之細胞大量地表現，其中據信其提供專性跨膜 質子流用於病毒複製（Ciampor等人，Virus Research 22:247 (1992)，Grambas 及 Hay，Virology 190:11 (1992) ; Sugrue 等人，EMBO J. 9:3469 (1990))。與 HA 及 ΝΑ不同，M2 為 保守的且可代表開發針對流行性感冒病患之基於抗體之被 動免疫療法的乾（Ito等人，J. Virology 65:5491 (1991); Slepushkin等人，Vaccine 13:1399 (1995) ; Neirynck等人，
Nature Med. 5:1157 (1999))。 【發明内容】 I05723.doc 1377212 本發明提供用於預防及治療流行性感冒感染之組合物及 方法。組合物完全地包括人類、人源化及嵌合（例如人類/ 小鼠嵌合體）單株抗體’該等抗體自A/PR/8/34 ' A/HK/l/W 及其它病毒株/分離株識別流行性感冒基質蛋白質2(M2蛋 .白質）並具有抵抗不同流行性感冒A病毒株/分離株及亞型 之廣泛反應性。方法包括在接觸、曝露於或感染有流行性 感冒之前或之後以結合於流行性感冒基質蛋白質2(M2蛋白 | 貝）之人類、人源化及嵌合（例如人類/小鼠嵌合體）單株抗 ’體、抗M2抗體被動免疫。 备在動物-感染有流行性感冒A之前或之後投予抗體時， 人類單株杬M2抗體可保護小鼠不受致命的流行性感冒八病 毒（A/HK/1/68及A/PR/8/34)的激發。流行性感冒病毒複製 在活體内被引人注目地抑制。人類抗M2抗體包括可結合 於很多種M2序列之具有廣泛抗原特異性之抗體。例如， 不範性抗體結合於大多數M2序列變異體，包括來自潛 ^ 在廣泛流行/流行禽類流行性感冒分離株之變異體。該等 具有針對M2變異肽之廣泛特異性的人類、人源化及嵌合 • 抗_單株抗體適用於抵抗多種流行性感冒病毒株/分離株 及亞型。 :因此本發明提供結合於流行性感冒病毒蛋白質Μ2之人 類、人源化及嵌合抗叫株抗體、包括人類、人源化及 嵌合抗,2單株抗體之組合物如包括人類、人源化及嵌合 抗M2早株抗體之醫藥組合物及含有抗體之套組。本發明 之人類、人源化及嵌合抗M2單株抗體適用於患有流行性 105723.doc 1377212 感冒或處於患流行性感冒之風險中的病患在感染前（預防） 或感染後（治療）治療流行性感冒；流行性感冒偵測及診 斷，包括量測病毒滴度；純化/分離，包括純化或分離全 病毒或M2蛋白質；及其它檢定系統。因此本發明亦提供 在治療（例如治療流行性感冒感染）及非治療應用如診斷（偵 測或量測樣本中流行性感冒或M2蛋白質之數量）及純化（純 化或分離流行性感冒病毒或M2蛋白質）中使用該等抗體之 方法。
在一實施例中，提供特異結合於至少一部分M2細胞外 域（在本文中亦稱作或互換用作M2胞外域（M2e))之人類 抗體。在特定態樣中，細胞外/胞外域包括胺基酸序列 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID N0:2)、其子序 列或其胺基酸變異體（例如胺基酸取代、插入、缺失或 添加）或由其組成。在另一態樣中，細胞外/胞外域為包括 選自以下之胺基酸序列之序列或由選自以下之胺基酸序列
組成之序列：SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD(SEQ ID N0:3)、SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD(SEQ ID NO:4)、 SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID N0:5) SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID N0:6) SLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:7) SLLTEVETPIRKEWGCNCSDSSD(SEQ ID N0:8) SLLTEVETLIRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:9) SLLTEVETLTKNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:10) SLLTEVETPIRSEWGCRYNDSSD(SEQ ID N0:11) I05723.doc ⑧ 1377212
SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID SLLTEVETHTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID SLLTEVKTPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID SLLTEVETPTRDGWECKCSDSSD(SEQ ID SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID SLLTEVETPTRNGWECKCNDSSD(SEQ ID SLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD(SEQ ID SFLTEVETP-IRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID SLLTEVETPTRNGWECRCNDSSD(SEQ ID SLLTEVETPIRKGWECNCSDSSD(SEQ ID SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD(SEQ ID SLLTGVETHTRNGWGCKCSDSSD(SEQ ID SLLPEVETHTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:26)。在額
N0:12)、 N0:13)、 N0:14)、 N0.15)、 N0:16)、 N0:17)、 N0:18)、 N0:19)、 NO:20)、 N0:21) 、 NO:22)、 NO:23)、 NO:24) 、 NO:25)及 外態樣中，抗體係藉由表示為第Z3G1號（ATCC寄存號第 PTA-5 967號；寄存於2004年3月13日，美國菌種保藏中心 (American Type Culture Collection)，Manassas，VA， USA))及第 Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於2004年3月13日，美國菌種保藏中心， Manassas，VA，USA)之細胞株（例如融合瘤或CHO細胞株） 產生。 本發明之抗體包括多株及單株抗體及其混合物，其可為 任意IgG、IgA、IgM、IgE、IgD及其任意同型例如IgG!、 I05723.doc ⑧ gG2 IgG3或IgG4。在單株抗體情況中，抗體之—示範性 類別為IgG。IgG之亞類包括（例如）IgG|、IgG2、IgG3及 IgG4。抗體包括具有兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈⑼如 重鏈及^鏈可變區序列之成熟部分）的完整的人類、人源 化及嵌合免疫球蛋白分子以及保留特異結合Μ 2之親代完 整抗體之至少一部分功能(Μ2結合特異性、M2結合親和力 或抗流行性感冒病毒活性）的重鏈或輕鏈之子序列/片段。 子序列可具有與親代完整人類、人源化及嵌合抗體相同或 大體上相同之結合特異性、結合親和力或抗流行性感冒病 毒活性。- 不範性子序列包括Fab、Fab'、F(ab，）2、Fv、Fd、單鏈 Fvs(scFv)、二硫鍵接之Fvs(sdFv；^ 乂或％或完整免疫球 蛋白之其它M2蛋白質結合片段。因此本發明之抗體包括 藉由表示為第Z3G1號（ATCC寄存號第ΡΤΑ-5967號；寄存於 2004年3月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA， USA)及第 Z3G3 號（Z3.1 6,25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於2004年3月13日，美國菌種保藏中心， Manassas，VA ’ USA)之融合瘤或CHO細胞株產生的抗體 之重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列。 抗體進一步包括具有藉由表示為第Z3G1號（ATCC寄存號 第PTA-5967號；寄存於2004年3月13曰，美國菌種保藏中 心，Manassas，VA，USA)及第 Z3G3 號（Z3.16.25.1 )(ATCC 寄存號第PTA-5968號；寄存於2004年3月13曰，美國菌種 保藏中心，Manassas，VA，USA)之細胞株（例如融合瘤或 I05723.doc 1377212 CHO細胞株）產生的抗體之相同或大體上相同之結合特異 性、親和力或抗流行性感冒病毒活性的人類、人源化及嵌 合抗體。在一特定實施例中，具有與藉由表示為第Z3G1
號（ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13曰， 美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第Z3G3號 (Z3.16_25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004 年 3 月13日’美國囷種保藏中心’ Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）產生的抗體相同結合特異 性之抗體結合於藉由表示為第Z3G1號（ATCC寄存號第PTA-5 967號；寄-存於2004年3月13日’美國菌種保藏中心，
Manassas，VA，USA)及第 Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC 寄存
號第PTA-5968號；寄存於2004年3月13日，美國菌種保藏 中心，Manassas ’ VA，USA)之細胞株（例如融合瘤或CH〇 細胞株）產生的抗體與其結合之M2變異序列的至少一段。 在一額外特定實施例中，具有與藉由表示為第Z3G1號 (ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13曰，美 國函種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第Z3G3號 (Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004 年 3 月13日’美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）產生的抗體大體上相同之 結合特異性之抗體結合於或弱結合於藉由表示為第Z3G1 號（ATCC寄存號第pta_5967號；寄存於2004年3月13曰， 美國菌種保藏中心’ Manassas，VA，USA)及第Z3G3號 (Z3_16,25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004 年 3 I05723.doc 1377212
月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）產生的抗體與其結合之M2 變異序列的至少5至10、10至15、15至20、20至25或更多 段。在另一特定實施例中，具有與藉由表示為第Z3G1號 (ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13曰，美 國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第Z3G3號 (Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004 年 3 月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）所產生的抗體大體上相同 之結合特異性之抗體結合於或弱結合於藉由表示為第 Z3G1號（ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13 曰，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC寄存號第PTA-5968號；寄存於2004年 3月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）產生的抗體與其結合之M2 變異序列的至少10至15、15至20、20至25或更多段，但並 不結合於或僅弱結合於抗M2抗體L66、N547、C40G1或 14C2抗體與其結合之M2序列。 在額外實施例中，親和力或抗流行性感冒病毒活性在比 參照抗體高或低約5至1000倍之内。因此，當參照抗體具 有10_9 Μ之Kd時，例如，本發明之抗體包括Kd在比ΙΟ·9 Μ 高或低5至1000倍之内的抗體。因此，在一態樣中，抗體 具有在比藉由表示為第Z3G1號（ATCC寄存號第PTA-5967 號；寄存於2004年3月13日，美國菌種保藏中心， 105723.doc -12- ⑧ 1377212
Manassas，VA，USA)及第 Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC 寄存 號第PTA-5 968號；寄存於2004年3月13曰，美國菌種保藏 中心，Manassas，VA，USA)之細胞株（例如融合瘤或CHO 細胞株）產生的抗體高或低約5至1000倍之内的結合親和 力0
在另外實施例中，抗體結合於與參照抗體相同之抗原決 定部位。因此，在一態樣中，抗體結合於與藉由表示為第 Z3G1號（ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13 曰，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第Z3G3 號（Z3.16.25t1)(ATCC寄存號第PTA-5968號；寄存於2004年 3月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）產生的抗體相同之抗原決 定部位。在另一態樣中，抗體結合於藉由表示為第Z3G1 號（ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13曰， 美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第Z3G3號 (Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004 年 3 月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）產生的抗體與其結合之抗 原決定部位》在另一態樣中，抗體結合於在任意M2胺基 酸序列例如 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO:2) > SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD(SEQ ID NO:3) ' SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD(SEQ ID NO:4) 、 SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO:5) 、 SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID NO:6) 、 I05723.doc • 13 - ⑤ 1377212
SLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:7) SLLTEVETPIRKEWGCNCSDSSD(SEQ ID N0:8) SLLTEVETLIRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:9) SLLTEVETLTKNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:10) > SLLTEVETPIRSEWGCRYNDSSD(SEQ ID N0:11) > SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:12) SLLTEVETHTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:13) 、 SLLTEVKTPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:14) 、 SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:15) SLLTEVETP-TRDGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:16) 、 SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:17) SLLTEVETPTRNGWECKCNDSSD(SEQ ID N0:18) SLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:19) SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD(SEQ ID NO:20) > SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID N0:21) SLLTEVETPTRNGWECRCNDSSD(SEQ ID NO:22) SLLTEVETPIRKGWECNCSDSSD(SEQ ID NO:23) SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD(SEQ ID NO:24) SLLTGVETHTRNGWGCKCSDSSD(SEQ ID NO:25) SLLPEVETHTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:26) 及 LLTEVETPIR(SEQ ID N0:1)内之抗原決定部位。 本發明之抗體進一步包括結合於M2蛋白質之最小結合 序列之人類、人源化及嵌合抗體。在各種態樣中，抗體結 合於LLTEVETPIR(SEQ ID N0:1)内之最小結合序列。在特 I05723.doc -14 ⑤ 1377212 定態樣中，抗體結合之最小結合序列為lltevetpir(seq ID NO: 1)。在其他態樣中，人類M2抗體之最小結合序列與 LLTEVETPIR(SEQ ID ΝΟ:1)相同或大體上相同。在額外態 樣中，人類M2抗體結合於為LLTEVETPIR(SEQ ID ΝΟ:1)
的最小結合序列《額外態樣包 括結 合於任 意 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO:2) 、 SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD(SEQ ID NO:3) SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD(SEQ ID NO:4) SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO:5) SLLTEVETP-IRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID NO:6) SLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:7) SLLTEVETPIRKEWGCNCSDSSD(SEQ ID NO:8) SLLTEVETLIRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:9) SLLTEVETLTKNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:10) > SLLTEVETPIRSEWGCRYNDSSD(SEQ ID NO:ll) SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID NO:12) SLLTEVETHTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID NO:13) SLLTEVKTPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID NO:14) SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:15) SLLTEVETPTRDGWECKCSDSSD(SEQ ID NO:16) SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:17) SLLTEVETPTRNGWECKCNDSSD(SEQ ID NO:18) SLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID NO:19) > SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD(SEQ ID NO:20) 105723.doc 15 1377212
SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID SLLTEVETPTRNGWECRCNDSSD(SEQ ID SLLTEVETPIRKGWECNCSDSSD(SEQ ID SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD(SEQ ID SLLTGVETHTRNGWGCKCSDSSD(SEQ ID SLLPEVETHTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:26)内之最 小結合序列的M2抗體。本發明之抗體額外地包括具有如 藉由表示為第Z3G1號（ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於
2004年3月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA， USA)及第 Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於2004年3月13曰，美國菌種保藏中心，
N0:21)、 NO:22)、 NO:23)、 NO:24)、 NO:25)及
Manassas，VA，USA)之細胞株（例如融合瘤或CHO細胞株） 所產生的示範性抗體之功能或活性的人類、人源化及嵌合 抗體，例如具有抑制活體外或活體内病毒感染或抑制活體 外或活體内M2結合細胞（例如MDCK細胞）之能力的人類、 人源化及嵌合抗體。在各種態樣中，抗體具有如藉由基於 細胞之ELISA檢定所測定低於2.0至3.0、1.0至2.0、0.5至 1.0、0.1 至 0.5 或低於 0.1 pg/ml(例如 0_05 至 0_lpg/ml)之 EC50 以抑制MDCK細胞的流行性感冒病毒感染。在額外態樣 中’抗體具有如藉由基於細胞之ELISA檢定所測定低於2.0 至 3.0、1.0 至 2.0、0,5至 1,0、0,1 至 0.5 或低於0.1 pg/mi(例 如0.05至0.1pg/ml)之EC5Q以抑制M2結合於MDCK細胞。在 其他態樣中，流行性感冒病毒為流行性感冒A病毒，如 A/PR/8/34(HlNl)或 A/HK/1/68(H3N2)病毒株 / 分離株或其 I05723.doc 16- ⑤ 它亞型如 H1N1 、 H2N2 、 H3N2 、 H5N1 、 H9N2 、 H2N1 、 H4N6、H6N2、H7N2、H7N3、H4N8、H5N2、H2N3、 H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、H2N3、 H6N1、H13N6、H7N1、H11N1、H7N2 或 H5N3。
本發明之抗體進一步包括結合於兩種或兩種以上具有不 同胺基酸序列（例如具有不同M2之細胞外/胞外域序列，即 M2e)之M2蛋白質的人類、人源化及嵌合抗體，該等M2蛋 白質可視情況存在於不同流行性感冒病毒（例如病毒株/分 離株或亞型）上。在一實施例中，抗體結合於至少一部分 M2細胞外/胞外域序列（M2e)。在特定態樣中，M2e序列包 括胺基酸序列 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID N0:2)、其子序列或其胺基酸變異體（例如胺基酸取代、插 入、缺失或添加）如 SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD(SEQ ID N0:3)或由其組成。在其它特定態樣 中， M2e序列 包括 選自以下之胺基酸序列或由選自以下之 胺基 酸序列組 成： SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD(SEQ ID N0:3) SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD(SEQ ID N0:4) SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID N0:5) SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID N0:6) > SLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:7) SLLTEVETPIRKEWGCNCSDSSD(SEQ ID N0:8) 、 SLLTEVETLIRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:9) 、 SLLTEVETLTKNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:10) 、 SLLTEVETPIRSEWGCRYNDSSD(SEQ ID N0:11) I05723.doc 17 ⑧ 1377212
SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD(SEQ
SLLTEVETHTRNGWECKCSDSSD(SEQ
SLLTEVKTPTRNGWECKCSDSSD(SEQ
SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ
SLLTEVETPTRDGWECKCSDSSD(SEQ
SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD(SEQ
SLLTEVETPTRNGWECKCNDSSD(SEQ
SLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD(SEQ
SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD(SEQ
SFLTEVETP-IRNEWGCRCNGSSD(SEQ
SLLTEVETPTRNGWECRCNDSSD(SEQ
SLLTEVETPIRKGWECNCSDSSD(SEQ
SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD(SEQ
SLLTGVETHTRNGWGCKCSDSSD(SEQ
SLLPEVETHTRNGWGCRCSDSSD(SEQ
ID N0:12)、 ID N0:13)、 ID N0:14)、 ID N0:15)、 ID N0:16)、 ID N0:17)、 ID N0:18)、 ID N0:19)、 ID NO:20)、 ID N0:21)、 ID NO:22)、 ID NO:23)、 ID NO:24)、 ID NO:25)及 ID NO:26)。本發 明之抗體包括已（例如）通過寡聚化域（例如白胺酸拉鏈基 元）之共價連接或經由交聯劑（例如化學交聯劑）被修飾以形 成寡聚物之彼等抗體。因此，本發明之抗體包括多聚體形 式，例如二聚體、三聚體、四聚體或更高階之人類、人源 化及嵌合抗體寡聚物。該等抗體多聚體與單體抗體相比通 常表現增加之對M2之親和力（avidity)。 本發明之抗體進一步包括一或多種賦予結合M2之抗體 獨特功能或活性之不同域。當一 '或多種胺基酸不同於抗體 (即其並非天然抗體之一部分）時抗體包括胺基酸不同域。 I05723.doc ⑤ 1377212 在一實施例17 ’不同域包含結合蛋白暂 負（例如受體或配位 體結合）、酶活性、樂物、抗病毒劑、主 I素、免疫調節 劑、可偵測部分或標記β在—態 、·.σ合蛋白質包含具 有與特異結合於流行性感冒蛋白 又人類、人源化或 嵌合抗體不同的結合特異性或親和力 肌1 π又杭體。因此，本發 明進-步提供多特異性及多功能抗體（例如雙特里性及雜 功能抗體，如分別結合兩種或兩種以上抗原或分別具有兩 種或兩種以上功能或活性之抗體）。 本發明之抗體可結合於視情況在右於 .^ 月/凡仔在於—或多種流行性咸 冒病毒株/分離株或亞型上之流行性感冒蛋白質Μ2。因 此，該等抗體對M2或流行性感冒病毒傳染、複製、增 滴度' 與流行性感冒相關之一或多種症狀或併發症之 :展、嚴重度、頻率、持續時間或概率，或流行性感冒病 母感木之易感性具有一或多種作用，即抗流行性感冒病毒 活性。 貫知*例中，人類、人源化或嵌合抗體抑制活體外或 活體内矣。 、 、、九—I受一或多種流行性感冒病毒株/分離株或亞型 的j木或抑制流行性感冒結合活體外或活體内細胞。在另 —貫施例中，人# 人類、人源化或嵌合抗體減少流行性感冒病 卞 X s 一或多種流行性感冒病毒株/分離株或亞型之流 行性感冒症主疋& μ n 两背蛋白質之數量。在另一實施例中，人類 '人 、或欢合抗體抑制或阻礙流行性感冒病毒滴度或一或多 種流行性咸π 欲目病母株/分離株或亞型之流行性感冒病毒蛋 白質之數番& 的^加。在另一實施例_，人類、人源化或嵌 I05723.doc ⑤ -19- 1377212 合抗體保濩病患不受一或多種流行性感冒病毒株/分離株 或亞型感染或降低病患受一或多種流行性感冒病毒株/分 離株或亞型感染之易感性。在另一實施例中，人類、人源 化或嵌合抗體減少與受一或多種流行性感冒病毒株/分離 株或亞型感染相關之一或多種症狀或併發症（例如發冷、 發熱、咳嗽、喉嚨痛 '鼻塞、鼻竇炎、鼻感染、竇感染、 身體疼痛、頭痛、疲勞、肺炎、支氣管炎、耳部感染、耳 痛或死亡）之擴展、嚴重強度、頻率、持續時間或概率。 在各種態樣十，將人類、人源化或嵌合抗體全身投予（例 如靜脈内注-射、皮下注射、靜脈内輸注、肌内注射）或局 部投予病患之黏膜組織（例如鼻腔、竇、喉嚨、喉、食 道、耳或耳道）或肺。在各種態樣中，流行性感冒為流行 性感冒A，且流行性感冒A病毒株係選自A/pR/8/34(HiNi) 或A/HK/1/68(H3N2)病毒株/分離株或亞型如Hlm、 H2N2、H3N2、H5N1、H9N2、H2N1、H4N6、H6N2、 H7N2 、 H7N3 、 H4N8 、 H5N2 、 H2N3 、 H11N9 、 H3N8 、 H1N2、HUN2、H11N9、H7N7、H2N3、H6N1、H13N6、 H7N1、H11N1、H7N2 或 H5N3。 亦提供表現本發明之人類、人源化及嵌合抗體之宿主細 胞。細胞包括（但不限於）細菌、酵母、植物、動物（例如哺 乳動物細胞如融合瘤細胞株及CHO細胞株）以及諸如表現 本發明之人類、人源化或嵌合抗體之非人類動物及植物之 全部生物體。宿主細胞可用以產生視情況隨後可分離或純 化之抗體。 I05723.doc ㊈ •20· /212 个货π之坑體（包括其子序列/片权及變 異體）之核酸。在特定實施例中，核酸可編竭如實例】中所 提出之重鏈序列或輕鏈序列（例如SEQ ID N〇s:34、35及 37)及其子序列（例如可變重鏈或輕鏈序列）。核酸包括用於 核酸之選殖或其它基因操作或用於在溶液中、在細胞中或 在任意生物體中表規夕._ m 衣現之载體。因此核酸可用以在 (例如活體外轉譯）、在 在活體外或活體内細胞中產生視情況
匕後可分離或純化之抗體。 亦提供包括本發明之抗體之組合組合物。在一實施例 組合物-包括結合流行性感w M2蛋白f之人類、人 化或嵌合抗體及一抗病毒劑。 ’、 f剞在另一實施例中，組合物包 行性感fM2蛋白f之人類、人源化或嵌合抗體 (例:流行性感冒感染相關之一或多種症狀或併發症 染、竇二、發熱、咳f、喉嚨痛、鼻塞、鼻竇炎、鼻感 '*、身體疼痛、頭痛、疲勞、肺炎、支氣管炎、 邛感染、耳痛或死亡）的藥劑。 劑本發明之抗體及醫藥學上可接受之載劑或賦形 ㈣ 物。在一實施例中，載劑適用於全身性、區 。佳與或局部性地投予病患之黏膜組織（例如鼻腔、竇、 喉°4、'^、食道）或肺。 亦：供包括一或多種本發明之抗體之套組。在一實施例 或亞型成汰括用於&或多種流行性感冒病毒株/分離株 :4卞之病患的机仃性感冒病毒感染之治療(預防或 療卜抑制、預防、降低對其之易感性，或減少與其相 I05723.doc -21 - 1377212 關之一或多種症狀或併發症之擴展、嚴重度、頻率、持續 時間或概率的說明書。在另一實施例中，套組包括一製造 物件如氣霧器、噴霧器或擠壓瓶或適用於吸入或鼻部投予 病患之其它傳遞構件。在另一實施例中，套組或製造物件 包括抗病毒劑（例如抗體或藥物）或一抑制與流行性感冒感 染相關之一或多種症狀或併發症的藥劑。
提供用於治療病患的流行性感f感染之方法。在—實施 例中，方法包括將治療病患的流行性感冒感染有效劑量之 特異結合流行性感冒M2之人類、人源化或嵌合抗體投予 病患。在各種態樣中’將該抗體在病患感染的大體上同時 或在其之後铋藥’即治療。在另一態樣中，抗體提供治療 =益。在各種態樣十，治療效益包括減少或降低流行性感 冒感染之一或多種症狀或併發症的擴展、嚴重度、頻率、 持續時間或概率、病毒滴度、病毒複製或—或多種流行性 感冒病毒株之病毒蛋白質的數量。可減少或降低之流行性 感冒感染的症狀或併發症包括（例如）發冷、發熱、咳嗽、 侯月I痛鼻塞、鼻寶炎、鼻感染、寶感染、身體疼痛、頭 痛疲$肺犬、支氣管炎、耳部感染、耳痛或死亡。在 另l樣中，治療效益包括促進或加快病患自流行性感冒 感染癌·癒。 亦提ί、抑制病患受—或多種流行性感冒病毒株或分離株 感染之方法。在一實施例中，方法包括將抑制病患受感染 或降低病患受一或多種流行性感冒病毒株或分離株的流行 性感冒感染之易感性的有效劑量之特異結合流行性感冒 I05723.doc (¾) •22· 1377212
M2之人類、人源化或嵌合抗體投予病患。在各種態樣中 將抗體在病患感染之前（預防）、大體上同時或之後投藥》 在另一態樣中，抗體提供治療效益。在各種態樣中，治療 效益包括減少或減低流行性感冒感染之一或多種症狀或併 發症（發冷、發熱、咳嗷、喉嚨痛、鼻塞、鼻竇炎、鼻感 染、竇感染、身體疼痛、頭痛、疲勞、肺炎、支氣管炎、 耳部感染、耳痛或死亡）之發作或擴展、嚴重度、頻率、 持續時間或概率、病毒滴度或一或多種流行性感冒病毒株 或分離株之病毒蛋白質的數量，或病患受—或多種流行性 感冒病毒株或分離株感染之易感性。
進一步提供阻礙病患流行性感冒病毒滴度、病毒複製、 病毒增殖或流行性感冒病毒蛋白質之數量增加的方法。在 一實施例甲’方法包括將阻礙病患流行性感冒病毒滴度、 病毒複製或一或多種流行性感冒病毒株或分離株之流行性 感冒病毒蛋白質的數量增加有效劑量之特異結合流行性感 冒M2的人類、人源化或嵌合抗體投予病患。 額外地提供保護病患不受感染或降低病患受一或多種流 仃性感冒病毒株/分離株或亞型之感染之易感性的方法， 即預防方法。在-實施例中，方法包括將保護病患不受感 木或降低病患文一或多種流行性感冒病毒株/分離株或亞 型感染之易感性的有效劑量之特異結合流行性感冒Μ2之 人類、人源化或嵌合抗體投予病患。在一態樣中，保護包 括減少或降低流行性感f感染或與流行性感f感染相關之 -或多種症狀或併發症（例如發冷、發熱、咳嗽、喉嚨 105723.doc (§) -23、 1377212 痛、鼻基、鼻竇炎、鼻感染、竇感染、身體疼痛、頭痛、 疲勞 '肺炎、支氣管炎、耳部感染、耳痛或死亡）。 本發明之方法可以具有藉由表示為第Z3G1號（ATCC寄存 號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13日，美國菌種保藏 中心 ’ Manassas ， VA ， USA)及第 Z3G3 號 (Z3_16,25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004 年 3
月1 3日’美國威種保藏中心，Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）所產生的抗體之結合特異 性或結合親和力之抗體實施。在投予病患之前抗體可包括 於醫藥學上可接受之載劑或賦形劑中。包括投予病患之方 法包括全身、區域或局部傳遞。
包括治療/預防、診斷/偵測及純化/分離之本發明方法可 應用於任意流行性感冒病毒株/分離株或亞型或病毒株/分 離株或亞型之組合。在各種實施例中，流行性感冒為流行 性感冒A且流行性感冒a係選自如a/PR/8/34(H1N1)或 A/HK/1/6 8(H3N2)病毒株/分離株或其它亞型如H1N1、 H2N2、H3N2、H5N1、H9N2、H2N1、H4N6、H6N2、 H7N2 、 H7N3 、 H4N8 、 H5N2 、 H2N3 、 H11N9 、 H3N8 、 H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、H2N3、H6N1、H13N6、 H7N1、H11N1、H7N2及 H5N3。 提供產生人類M2抗體之方法。在一實施例中，方法包 括將M2或其免疫原性子序列/片段投予能表現人類免疫球 蛋白之動物（例如非人類動物）；篩選表現人類M2抗體之動 物’選擇產生人類M2抗體之動物；自產生人類M2抗體之 105723.doc (S) -24- 1377212
動物分離抗體；及測定該人類M2抗體是否結合於m2。在 另一實施例中，方法包括將M2或其免疫原性子序列/片段 投予能表現人類免疫球蛋白之動物（例如非人類動物）；篩 選表現人類M2抗體之動物；選擇產生人類M2抗體之動 物；自產生人類M2抗體之動物分離脾細胞；將該等脾細 胞與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤；及篩選表現人類M2 抗體之融合瘤。在各種態樣中，M2或其免疫原性子序列/ 片段包括M2細胞外/胞外域（M2e)或由其組成。在額外態樣 中’ M2e包括與LLTEVETPIR(SEQ ID Ν0:1)相同或大體上 相同之人類M2抗體之最小結合序列。在其他態樣中，M2e 包括為LLTEVETPIR(SEQ ID N0:1)的最小結合序列。
在另一.實施例中，方法包括提供產生人類M2抗體之動 物（例如非人類動物）或細胞；及自該動物或細胞分離抗 體。在另一實施例中，方法包括提供產生人類M2抗體之 動物（例如非人類動物）；自該產生人類M2抗體之動物分離 脾細胞’將该專脾細胞與骨趙瘤細胞融合以產生融合瘤； 及篩選表現人類M2抗體之融合瘤。在各種態樣中，動物 或細胞表現具有藉由表示為第Z3G1號（ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13日，美國菌種保藏中心， Manassas，VA，USA)及第 Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC 寄存 號第PTA-5968號；寄存於2004年3月13日，美國菌種保藏 中心，Manassas，VA，USA)之融合瘤或cH〇細胞株所產 生的抗體之結合特異性或與其相同或大體上相同之結合親 和力或抗流行性感冒病毒活性的抗體。在額外態樣中，動 I05723.doc •25· 1377212
物或細胞表現具有M2細胞外域之結合特異性的抗體，該 M2細胞外域包括與LLTEVETPIR(SEQ ID N0:1)相同或大 體上相同之最小結合序列。在其他態樣中，動物或細胞表 現具有M2細胞外域之結合特異性之抗體，該M2細胞外域 包括為LLTEVETPIR(SEQ ID N0:1)之最小結合序列。在額 外態樣中，動物或細胞表現結合於以下任意序列内之最小 結合序列的抗體：SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID N0:2) 、 SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD(SEQ ID
N0:3)、SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD(SEQ ID N0:4)、
SLPTEVETP-IRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID N0:5) 、 SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID N0:6) SLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:7) SLLTEVETPIRKEWGCNCSDSSD(SEQ ID N0:8) > SLLTEVETLIRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:9) SLLTEVETLTKNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:10) SLLTEVETPIRSEWGCRYNDSSD(SEQ ID N0:11) SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:12) SLLTEVETHTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:13) SLLTEVKTPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:14) 、 SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:15) SLLTEVETPTRDGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:16) SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:17) SLLTEVETPTRNGWECKCNDSSD(SEQ ID N0:18) SLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:19) I05723.doc -26- ⑤ 1377212 SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD(SEQ ID SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID SLLTEVETPTRNGWECRCNDSSD(SEQ ID SLLTEVETPIRKGWECNCSDSSD(SEQ ID SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD(SEQ ID SLLTGVETHTRNGWGCKCSDSSD(SEQ ID SLLPEVETHTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:26) 【實施方式】
NO:20)、 N0:21) 、 NO:22)、 NO:23) 、 NO:24) 、 NO:25)及 本發明至少部分基於人類、人源化及嵌合抗M2單株抗 體。幾種本發明之抗體具有抗基於不同流行性感冒A病毒 株之各種M2細胞外域序列的廣泛反應性。本發明之人類 抗M2單株抗體之被動傳遞在預防（病毒感染之前）與治療 (病毒感染之後）小鼠流行性感冒模型中均可保護動物不受 致命劑量的流行性感冒A/HK/1/68之激發。因此本發明之 抗體適用於治療廣泛系列的流行性感冒病毒株或分離株。 此外，本發明之人類抗體很少可能因反覆投藥而誘發超敏 性且更多可能在病患（例如人類）之體内保留較長一段時 間。 因此根據本發明提供特異結合於流行性感冒M2蛋白質 之人類、人源化及嵌合抗體。在一實施例中，提供特異結 合於流行性感冒蛋白質M2細胞外/胞外域（M2e)之人類、人 源化或嵌合抗體。在特定態樣中，M2e包含胺基酸序列 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID N0:2)、其一部 分或其胺基酸變異體（例如胺基酸取代、插入、缺失或添 105723.doc •27· ⑤ 1377212 加），如（例如）SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD(SEQ ID N0:3)。在特定態樣中，M2e含有選自以下之胺基酸取 代：SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD(SEQ ID N0:3)、
SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD(SEQ ID N0:4) SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID N0:5) SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID N0:6) SLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:7) SLLTEVETPIRKEWGCNCSDSSD(SEQ ID N0:8) SLLTEVETLIRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:9) SLLTEVETLTKNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:10) SLLTEVETPIRSEWGCRYNDSSD(SEQ ID N0:11) > SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:12) SLLTEVETHTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:13) SLLTEVKTPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:14) SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:15) SLLTEVETPTRDGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:16) SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:17) SLLTEVETPTRNGWECKCNDSSD(SEQ ID N0:18) SLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:19) SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD(SEQ ID NO:20) SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID N0:21) SLLTEVETPTRNGWECRCNDSSD(SEQ ID NO:22) > SLLTEVETPIRKGWECNCSDSSD(SEQ ID NO:23) SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD(SEQ ID NO:24) I05723.doc -28 ·
1377212 SLLTGVETHTRNGWGCKCSDSSD(SEQ ID NO:25)及 SLLPEVETHTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:26)。 術語"抗體”係指分別經由重鏈及輕鏈可變域（VH及Vd結 合於其它分子（抗原）之蛋白質。"抗體''係指任意多株或單 株免疫球蛋白分子，如IgM、IgG、IgA、IgE、IgD及其任 意亞類，如IgG,、IgG2、IgG3、IgG4等。除非文中另有說 明，否則術語''抗體'’亦意謂免疫球蛋白分子之功能性片段
或子序列，如（例如）Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、scFv及 sdFv °
術語” M2抗體”或”抗M2抗體”意謂特異結合於流行性感 冒M2蛋白質如M2細胞外/胞外域（M2e)之多株或單株抗 體。特異結合為其對存在於M2蛋白質内之抗原決定部位 具有選擇性。也就是說，與不同於M2之蛋白質的結合是 這樣的以致於該結合不會顯著干擾M2之偵測，除非該等 其它蛋白質具有與M2蛋白質内相似或相同之抗原決定部 位或最小結合序列以致被M2抗體識別。使用此項技術中 已知之檢定可將選擇性結合區別於非選擇性結合。 當用作本發明組合物之變體（例如抗體、經修飾之形 式、子序列、編碼其之核酸等）時，術語”經分離”意謂該等 組合物係藉由人類製得或至少部分與其天然存在之活體内 環境分離。通常，經分離之組合物大體上不含通常本質上 與其相關之一或多種物質，例如一或多種蛋白質、核酸、 脂質、碳水化合物、細胞膜。術語"經分離”不排除替代性 實體形式，如多肽多聚體、轉譯後修飾（例如磷酸化、醣 I05723.doc -29-
1377212 基化）或衍生形式。 當"經分離"之組合物（如抗體）不含大多數或所有通常本 質上與其相關之物質時亦可為”大體上純因此亦為大 體上純之經分離抗體不包括存在於數百萬其它序列中之多 肽或多核苷酸’如（例如）抗體庫之抗體或基因庫或①^^八庫 中之核酸。"大體上純"之分子可與一或多種其它分子結 合。因此，"大體上純"不排除組合物為之組合。
本發明之示Ι&性M2抗體表示為第Z3G1號（ATCC寄存號 第ΡΤΑ-5967號；寄存於2004年3月13日’美國菌種保藏中 心，Manassas，VA，USA)及第 Z3G3 號（Ζ3.16.25.1)(ATCC 寄存號第PTA-5968號；寄存於2004年3月13曰，美國菌種 保藏中心，Manassas，VA，USA)。示範性重鏈序列及輕 鏈序列為實例1中提出之胺基酸序列（例如SEQ ID NOs:34、35及 37)。
如本文中所使用’當關於抗體使用時術語"單株"係指基 於、獲得自或衍生自單一純系（包括任意真核、原核或嗤 菌體純系）之抗體。因此"單株"抗體在本文中為結構上定 義’而非由產生其之方法定義》如本文中所使用，給予產 生抗體之融合瘤或其它細胞株（例如CHO)之特定名稱、數 予或其它編號如第Z3G1號、N547、L66及C40G1亦可用以 指代抗體。 當關於抗體使用時術語”人類"意謂抗體之胺基酸序列為 完全人類。因此”人類M2抗體"或"人類抗河2抗體"係指特 異結合於M2之具有人類免疫球蛋白胺基酸序列即人類重 105723.doc •30· ⑤ 1377212 鏈及輕鏈可變區及恆定區之抗體。也就是說，所有抗體胺 基酸為人類或存在於人類抗體中。因此，例如可藉由以存 在於人類抗體中之胺基酸殘基取代非人類胺基酸殘基使非 人類之抗體變為完全人類。存在於人類抗體中之胺基酸殘 基、CDR區圖譜及人類抗體一致殘基為此項技術中已知
(參見例如 Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 4版，U.S. Department of Health and Human Services. Public Health Service (1987);及 Chothia 及 Lesk ’ J. Mol· Biol· 186:65 1 (1987))。基於22段已知人類
Vh ΠΙ序列之調查的人類Vh亞群ΙΠ之一致序列及基於3〇段 已知人類κ I序列的調查之人類yL κ鏈亞群I之一致序列描 述於 Padlan Mol. Immunol. 31:169 (1994);及 Padlan Mol. Immunol. 28:489 (1991)中。因此人類抗體包括其中一或多 種胺基酸殘基已被一或多種存在於其它人類抗體中之胺基 酸取代的抗體。
當關於抗體使用時術語”人源化"意謂抗體之胺基酸序列 具有在受體人類免疫球蛋白分子中特異結合於想要的抗原 (例如M2)之一或多種判定區（CDR)之非人類胺基酸殘基（例 如小鼠、大鼠、山羊、兔等）及在FV構架區（FR)中之一或 多種人類胺基酸殘基（其為位於CDR側面的胺基酸殘基）。 免疫球蛋白之人類構架區殘基可被相應非人類殘基置換。 因此人類構架區中之殘基可被來自非人類CDR供體抗體之 相應殘基取代（例如）以改變（通常為改良）抗原親和力或特 異性。此外，人源化抗體可包括既非在人類抗體中亦非在 i05723.doc ⑤ 31 1377212 供體CDR或構架序列中發現之殘基。例如，可預測在人類 抗體或供體非人類抗體中未發現之在特定位置的構架取代 以改良人類抗體在彼位置之結合親和力或特異性。基於分 2模型之抗體構架及CDR取代為此項技術中所熟知，例如 1曰由CDR與構架殘基之相2作用t模型以鑑別對抗原結合 及序列對比而言重要之構架殘基以鑑別在特定位置之不尋 丰的構架殘基（參見例如美國專利第5,585,〇89號；及 Lechmann等人，Nature 332:323 (1988))。除受體人類免 疫球蛋白分子及構架區胺基酸殘基可為除任意人類殘基之 外的任意靈-長類胺基酸殘基（例如猿、長臂猿、大猩猩、 黑猩猩、猩猩、獼猴）之外，此項技術中被稱作"靈長類化” 之抗體係在如本文中所使用之"人源化"之含義中。 如本文中所使用，當關於抗體使用時術語”嵌合"及其文 法變異形式意謂抗體之胺基酸序列含有衍生自、獲得或分 離自或基於兩種或兩種以上不同種之一或多個部分。也就 是說’例如’ 一部分抗體可為人類（例如恆定區）且另一部 分抗體可為非人類（例如鼠科重鏈或輕鏈可變區）^因此， 嵌合抗體為其中抗體之不同部分具有不同種來源之分子。 不同於人源化抗體’嵌合抗體在抗體之任意區可具有不同 種序列。 如本文中所使用，術語"M2n、"M2蛋白質"、"M2序列" 及Μ 2域係指分離自、基於或存在於任意天然存在或人工 產生之流行性感冒病毒株或分離株中之全部或一部分M2 蛋白質序列（例如子序列如細胞外域）。因此術語M2及其類 105723.doc -32- 1377212 似表達包括藉由病毒生命週期過程中之突變所產生之或回 應於選擇性壓力（例如藥物治療、宿主細胞向性膨脹或傳 染等）所產生之天然存在的M2序列變異體以及重組或合成 產生之M2序列。M2e係用以指M2序列之細胞外部分或”胞 外域π。 術語"M2肽”係指全長M2蛋白質之細胞外胺基酸序列或 胞 外域 （M2e)。 示範性 M2e 係 由序 列
SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID N0:2)組成。 額 外 示範性 M2e 序列係 由 以 下 組成 SLLTEVETP-IRNEWECRCNGSSD(SEQ ID N0:4) 、 SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID N0:5) SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID N0:6) SLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:7) 、 SLLTEVETPIRKEWGCNCSDSSD(SEQ ID N0:8) SLLTEVETLIRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:9) SLLTEVETLTKNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:10) SLLTEVETPIRSEWGCRYNDSSD(SEQ ID N0:11) SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:12) Λ SLLTEVETHTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:13) \ SLLTEVKTPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:14) ·> SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:15) SLLTEVETPTRDGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:16) Λ SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:17) SLLTEVETPTRNGWECKCNDSSD(SEQ ID N0:18) 105723.doc -33 - ⑤ 1377212
SLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD(SEQ ID SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID SLLTEVETPTRNGWECRCNDSSD(SEQ ID SLLTEVETPIRKGWECNCSDSSD(SEQ ID SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD(SEQ ID SLLTGVETHTRNGWGCKCSDSSD(SEQ ID SLLPEVETHTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:26)
如本文中所述，本發明之M2抗體包括具有κ或λ輕鏈序 列（如天然存在之抗體中之任一全長）、其混合物（即κ及λ鏈 序列之融合）及其子序列/片段之抗體。天然存在之抗體分 子含有兩條Κ：及兩條λ輕鏈。Κ與λ輕鏈之間的主要不同之處 在怪定區之序列中。
N0:19)、 NO:20)、 N0:21)、 NO:22)、 NO:23) 、 NO:24)、 NO:25)及 本發明之M2抗體可屬於任意抗體類或亞類^ IgG之示範 性亞類為IgG,、IgG2、IgG3及IgG4。本發明之抗體包括具 有抗體依賴性細胞調節之細胞毒性（ADCC)及補體調節之 細胞毒性（CDC)活性中的一種或兩種之抗體，期望其用於 有效治療或預防治療流行性感冒A(即殺滅受流行性感冒A 感染之細胞或流行性感冒A病毒）。IgG亞類IgG!之示範性 M2抗體（Z3G1，ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004 年3月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)顯 示ADCC與CDC兩種活性（參見（例如）實例5)。 本發明之M2抗體包括具有本文中所示範之M2抗體的結 合特異性的抗體，例如具有表示為第Z3G1號（ATCC寄存號 I05723.doc -34 - 1377212 第PTA-5967號；寄存於2004年3月13日，美國菌種保藏中
心，Manassas，VA，USA)及第 Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第PTA-5968號；寄存於2004年3月13日，美國菌種 保藏中心’ Manassas，VA ’ USA)之抗體之結合特異性的 抗體。在一態樣中，M2抗體具有如任意第Z3G1號（ATCC 寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13曰，美國菌種 保藏中心，Manassas ’ VA ’ USA)或第Z3G3號 (Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004 年 3 月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)所提 出之重（Η)或輕（L)鏈序列或其子序列，其限制條件為抗體 之重鏈或輕鏈序列或子序列具有第Z3G1號（ATCC寄存號第 PTA-5 967號；寄存於2004年3月13日，美國菌種保藏中 心，Manassas，VA，USA)或第 Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第PTA-5968號；寄存於2004年3月13日，美國菌種 保藏中心，Manassas，VA，USA)之結合特異性。
當關於抗體使用時術語''結合特異性"意謂抗體特異結合 於與參照抗體相同之抗原決定部位（antigenic epitope)之全 部或一部分。因此，具有表示為Z3G1之抗體之結合特異 性的M2抗體特異結合於與表示為Z3G1之M2抗體相同的抗 原決定部位之全部或一部分。因此，提供結合於與藉由表 示為第Z3G1號（ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年 3月13曰，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第 Z3G3號（Z3.16.25.1)(ATCC寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004年3月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA， 105723.doc -35- 1377212 USA)之細胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）所產生的抗體相 同之抗原決定部位或該相同之抗原決定部位的一部分之抗 體。
抗原決定部位之一部分意謂抗原決定部位之子序列或一 部分°例如’若抗原決定部位包括8個相鄰胺基酸，則抗 原決定部位之子序列及（由此）一部分可為在該8胺基酸序列 抗原決定部位内之7個或更少的胺基酸。此外，若抗原決 定部位包括非相鄰胺基酸序列，如並非互相鄰近但由於蛋 白質折疊而形成抗原決定部位之5胺基酸序列及8胺基酸序 列’則抗原诀定部位之子序列及（由此）一部分可單獨為該5 胺基酸序列或該8胺基酸序列。
具有本文中所示範M2抗體之相同或大體上相同之結合 特異性的抗體與第Z3G^(ATCC寄存號第pTA_5967號；寄 存於2004年3月13曰’美國菌種保藏中心，Manassas， ¥八’118八）及第2303號（23.16.25.1)(八丁(：(：寄存號第？丁八-5968號；寄存於2004年3月13曰，美國菌種保藏中心，
Manassas ’ VA ’ USA)之結合競爭。具有本文中所示範M2 抗體之結合特異性的本發明之抗體可藉由此項技術中已知 之用於測定競爭性結合之任意方法（例如本文中所揭示之 免疫檢定）而特徵化。由於該等抗體之結合親和力可不同 於示範性抗體（即具有更強或更弱親和力），因此該等抗體 可在其競爭結合於M2之能力方面有變化。該等具有更強 或更弱親和力之抗體可具有與示範性抗體相同或大體上相 同之結合特異性。在特定實施例中，抗體以至少95%、至 105723.doc •36· 1377212 少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少 65%、至少60%、至少55%、至少50%、至少45%、至少 40%、至少35%或至少30%或更少競爭性地抑制結合。
在特定實施例中，具有與藉由表示為第Z3G1號（ATCC寄 存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13曰，美國菌種保 藏中心，Manassas ， VA ， USA)及第 Z3G3 號 (Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004 年 3 月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）所產生的抗體相同之結合 特異性之抗韹結合於藉由表示為第Z3G1號（ATCC寄存號第 PTA-5967號；寄存於2004年3月13日，美國菌種保藏中 心，Manassas，VA，USA)及第 Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第PTA-5968號；寄存於2004年3月13日，美國菌種 保藏中心，]Manassas，VA，USA)之細胞株（例如融合瘤或 CHO細胞株）所產生的抗體與其結合之至少一段M2變異序 列。在額外特定實施例中，具有與藉由表示為第Z3G1號 (ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13曰，美 國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第Z3G3號 (Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004 年 3 月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）所產生的抗體大體上相同 之結合特異性的抗體結合於或弱結合於藉由表示為第 Z3G1號（ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13 曰，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第Z3G3 105723.doc -37- ⑤ 1377212 號（Z3.16.25.1)(ATCC寄存號第PTA-5968號；寄存於2004年 3月13曰’美國顏種保藏中心，Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）所產生的抗體與其結合之 至少5至10、10至15、15至20、20至25或更多段的M2變異 序列。在其他特定實施例中，具有與藉由表示為第Z3G1 號（ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13曰， 美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第Z3G3號 (Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2〇〇4 年 3
月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）所產生的抗體大體上相同 之結合特異性的抗體結合於或弱結合於藉由表示為第
Z3G1號（ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13 曰，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC寄存號第PTA-5968號；寄存於2004年 3月13日’美國菌種保藏中心，]yianassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）所產生的抗體與其結合之 至少10至丨5、丨5至2〇、2〇至25碑更多段的M2變異序列， 但並不結合於或僅弱結合於抗M2抗體L66、N547、C40G1 或14C2抗體與其結合之M2序列。 抗原決足部位通常為短胺基酸序列’例如長度為約5至 1 5個胺基酸。如實例3中所提出可鑑別抗原決定部位。用 於鑑別抗原決定部位之系統技術亦在此項技術中已知並在 (例如）美國專利第4,708,871號中有所描述。簡言之，可合 成衍生自M2抗原（例如]yi2e)之一組重疊募肽並使其結合於 I05723.doc • 38 · 1377212
大頭針（pins)之固相陣列，每一大頭針上有唯一的寡肽。 大頭針之陣列可包含一 96-孔微量滴定盤，使一人同時檢 定例如結合於抗M2單株抗體之全部96段寡肽。或者，可 購得嗟菌體呈現肽庫套組（New England BioLabs)用於抗原 決定部位定位。使用該等方法，可測定連續胺基酸之每一 可能子集的结合親和力以鑑別結合特殊抗體之抗原決定部 位。當抗原決定部位長度肽序列用以使動物具有免疫性時 亦可藉由推理鑑別抗原決定部位，自該等動物可獲得結合 於該肽序列之抗體。亦可使用此項技術中已知之電腦程式 如BEPITOPE預測連續的抗原決定部位（Odorico等人，】· Mol. Recognit. 16:20 (2003))。 Z3 G 1之M2 e之示範性抗原決定部位係在胺基酸序 歹 |J LLTE VETPIR(SEQ ID ΝΟ:1)内。Z3G1之示範性抗
原決定部位亦在以下胺基 酸 序列内 SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD(SEQ ID NO:3) SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD(SEQ ID NO:4) SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO:5) 、 SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID NO:6) SLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:7) SLLTEVETPIRKEWGCNCSDSSD(SEQ ID N0:8) 、 SLLTEVETLIRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:9) > SLLTEVHTLTKNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO:10) SLLTEVETPIRSEWGCRYNDSSD(SEQ ID NO:ll) 、 SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID N0:12) 、 I05723.doc -39-
1377212
SLLTEVETHTRNGWECKCSDSSD(SEQ
SLLTEVKTPTRNGWECKCSDSSD(SEQ
SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ
SLLTEVETPTRDGWECKCSDSSD(SEQ
SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD(SEQ
SLLTEVETPTRNGWECKCNDSSD(SEQ
SLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD(SEQ
SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD(SEQ
SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ
SLLTEVETP-TRNGWECRCNDSSD(SEQ
SLLTEVETPIRKGWECNCSDSSD(SEQ
SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD(SEQ
SLLTGVETHTRNGWGCKCSDSSD(SEQ
SLLPEVETHTRNGWGCRCSDSSD(SEQ
ID N0:13)、 ID N0:14)、 ID N0:15)、 ID N0:16)、 ID N0:17)、 ID N0:18)、 ID N0:19)、 ID NO:20)、 ID N0:21)、 ID NO:22)、 ID NO:23) 、 ID NO:24)、 ID NO:25)及 ID NO:26) ° 如本文中所使用，當關於M2肽使用時術語"最小結合序 列”意謂對於抗M2抗體結合於M2肽而言最少需要的M2肽 之相鄰胺基酸序列（例如SEQ ID NO: 1)。最小結合序列係 藉由產生各種由N-末端截短之M2肽及C-末端截短之M2肽 組成的肽並基於實例3中所述之方法量測結合於該等肽之 抗體而測定"因此最小結合序列代表對於結合於肽的抗體 而言最少需要之M2肽内之序列的N-末端及C-末端邊界。 如實例3中所揭示，Z3G1之示範性最小結合序列包括 LLTEVETPIR(SEQ ID ΝΟ:1)。 最小結合序列（MBS)含有M2抗體互補位與其結合之足以 105723.doc • 40- ⑤ 1377212 調節抗M2抗體結合之抗原決定部位的全部或一部分。調 節抗體結合之抗原決定部位含有最小結合序列内之相鄰或 非相鄰3-4或更多段胺基酸序列。
術語"相同之最小結合序列"意謂抗體之最小結合序列與 參照抗體之最小結合序列相同。因此，具有與表示為 Z3G1之抗體相同的最小結合序列之M2抗體特異結合於與 表示為Z3G1之M2抗體相同的最小結合序列。術語"大體上 相同之最小結合序列"及其文法變異形式意謂與參照抗體 之最小結合序列相比在N-末端及/或C-末端具有單一胺基 酸添加或缺失之抗體的最小結合序列。因此，具有與表示 為Z3G1之抗體大體上相同之最小結合序列的M2抗體特異 結合於相對於表示為Z3G1之M2抗體之最小結合序列而言 在N-末端及/或C-末端具有單一胺基酸添加或缺失的最小 結合序列。
作為結合於相同或大體上相同之最小結合序列之抗體之 非限制性說明，Z3G1之最小結合序列為LLTEVETPIR(SEQ ID NChl)。因此，具有與Z3G1相同之最小結合序列之抗體 將具有LLTEVETPIR(SEQ ID NO: 1)最小結合序列。Z3G1 之大體上相同之最小結合序列可為（例如）LTEVETPI (SEQ ID NO:27) ' LLTEVETPI(SEQ ID NO:28) ' SLLTEVETPIR (SEQ ID NO:29)、LLTEVETPIRN(SEQ ID NO:30)、 LTEVETPIR(SEQIDNO:31)等。因此，結合於與Z3G1大體 上相同之最小結合序列之抗體可因此結合於（例如） LTEVETPI (SEQ ID NO:27) ' LLTEVETPI(SEQ ID NO:28) ' 105723.doc •41
1377212 SLLTEVETPIR(SEQ ID NO:29)、LLTEVETPIRN(SEQ ID 1^0:3 0)、[丁£¥£丁？111(8£(^10>10:31)等之任一。因此本發 明提供具有與本文中所示範之抗M2抗體Z3G1相同或大體 上相同之最小結合序列之抗體。
為獲得具有與另一抗M2抗體相同或大體上相同之最小 結合序列的抗M2抗體，使用習知之競爭結合檢定篩選為 抗體結合於M2肽而競爭之抗體。如實例3中所述選出具有 與參照抗體相同或大體上相同之最小結合序列的經篩選之 抗體。如Z3G 1之非限制性實例，第一步，使用競爭結合 檢定在抗M2抗體中篩選出結合於M2肽時與Z3G1競爭之抗 體。在第二步中，根據結合於與Z3G1相同或大體上相同 之最小結合序列即LLTEVETPIR(SEQ ID N0:1)最小結合序 列或大體上相同之最小結合序列（例如）LTEVETPI (SEQ ID NO:27)、LLTEVETPI(SEQ ID NO:28)、SLLTEVETPIR
(SEQ ID NO:29)、LLTEVETPIRN(SEQ ID NO:30)、 LTEVETPIR(SEQ ID N0:3 1)等之能力選擇與結合於M2之 Z3G1競爭的抗體。 本發明之M2抗體亦包括與本文中所示範之M2抗體具有 相同結合親和力且具有大體上相同結合親和力之人類、人 源化及嵌合抗體。例如，本發明之M2抗體可具有比參照 抗體高或低2-5、5-10、10-100、100-1 000 或 1000-10,000 倍 之親和力或在該等範圍内之任意數值或範圍或值之親和 力。因此，在額外實施例中，本發明提供與表示為第 Z3G1號（ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13 I05723.doc • 42· 1377212 日’美國囷種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC寄存號第PTA-5968號；寄存於2004年 3月13曰’美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)的抗 體具有相同結合親和力且具有大體上相同結合親和力之 M2抗體’其限制條件為其重鏈或輕鏈序列或子序列具有
第Z3G1號（ATCC寄存號第PTA-5967號；寄存於2〇〇4年3月 13曰，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第 Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004年3月13曰’美國菌種保藏中心，Manassas，VA， USA)之結合特異性。
結合親和力可藉由締合（Ka)及解離（Kd)速率測定。平衡 親和力常數（K)為Ka/Kd之比。如本文中所使用，當關於抗 體結合親和力使用時術語”相同"意謂解離常數（Kd)在參照 抗體之約1至100倍内（比參照抗體高卜丨㈧倍之親和力或比 參照抗體低1 - 100倍之親和力，或在該等範圍内之任意數 值或範圍或值）β當關於抗體結合親和力使用時術語"大體 上相同意謂解離常數（Kd)在參照抗體之約5至5000倍内（比 參照抗體高5-5000倍之親和力或比參照抗體低5_5〇〇〇倍之 親和力）。當關於締合常數（Ka)使用時術語"相同”在參照抗 體之約1至1〇〇倍内（在比參照抗體之締合常數（Ka)高11〇〇 倍或低ι-loo倍内）。當關於締合常數（Ka)使用時術語”大體 上相同’’意謂締合常數在比參照抗體之締合常數（Ka)高或低 約5至5000倍内（比參照抗體高5_5〇〇〇倍或低5_5〇〇〇倍）。 當抗體具有較小親和力時結合親和力之至少一部分可為 105723.doc •43- 1377212 (例如）丨·3 倍、1·5 倍、2_5 倍、5_1〇 倍、515 倍、ι〇·ΐ5 倍、 15-20 倍、20-25 倍、25-30倍、30-50 倍、50-100倍、ι〇〇_ 5〇〇倍、500-1000倍、1000-5000倍、或更小（例如Kd)或該 等範圍内之任意數值或值之範圍。當抗體具有較大親和力 時結合親和力之至少一部分可為（例如H-3倍、Id倍、2·5
倍、5-10倍、5-15倍、10-15倍、15-20倍、20-25倍、25-30 倍、30-50倍、50-100倍、100-500倍、500-1000倍、1〇〇〇_ 5〇〇〇倍、或更大（例如Kd)或該等範圍内之任意數值或值之 締合（Ka)及解離（Kd)速率可使用表面電漿共振（SPR)量測 (Rich 及 Myszka ’ Curr. Opin. Biotechnol. 1 1:54 (2000); Englebienne’ Analyst. 123:1599 (1998))» 用於實時读測及 監控結合速率之儀器及方法為已知並可購得（BiaC〇re 2000， Biacore AB，Upsala，Sweden ;及 Malmqvist，
Biochem. Soc. Trans. 27:335 (1999))。可將本文中所提出 之示範性抗體2Kd值定義為受A/PR/8/34或A/HK/1/68感染 之MDCK細胞表面上之M2抗原上使半（50%)結合位點飽和 所需要之抗體濃度。 本發明中所包括之額外抗體具有表示為第Z3 G1號（ATCC 寄存號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13日，美國菌種 保藏中心，Manassas ， VA ， USA)及第Z3G3號 (Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004 年 3 月13日’美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)的抗 體之結合特異性及解離常數（Kd)低於5xl0·2 M、10_2 Μ、 I05723.doc -44- 1377212 5x10· Μ、ΙΟ 3 Μ、5xl〇·4 Μ、ΙΟ·4 Μ、5xl〇·5 Μ、ΙΟ·5 Μ ' 5x10 Μ ' 10 6 Μ ' 5χ10*7 Μ ' 1〇'7 Μ > 5χ1〇'8 Μ ' ΙΟ'8 Μ、5χ10·9 Μ、ΙΟ·9 Μ、5χ1(Γ10 Μ、ΙΟ-10 Μ、5x1ο.1丨 Μ、 10 Μ、5x1 〇 12 Μ、1 Ο·12 Μ、5x10-13 Μ、1 (Γ13 μ、5x1 Ο·14 Μ、10·丨4 Μ、5x10_丨5 Μ及1〇·丨5 Μ之對M2之結合親和力。 本發明中進一步所包括之抗體結合於表示為第23(}1號
(ATCC寄存號第ΡΤΑ-5967號；寄存於2004年3月13日，美 國菌種保臧中心’ Manassas，VA，USA)及第Z3G3號 (Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2〇〇4 年 3 月13日，美-國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)的抗 體與其結合之抗原決定部位^額外抗體具有如藉由基於細 胞之ELISA檢定所測定低於20至3〇、1 〇至2 〇、〇 5至 1.0、0.1 至 0_5 或低於 0.1 pg/mi(例如 〇 〇5至〇 1(ig/ml)之Ec5〇 以抑制MDCK細胞受流行性感冒a病毒感染。
本發明之人類M2抗體包括具有本文中所示範m2抗體之 一或多種抗流行性感冒活性（例如抑制活體外或活體内細 胞感染流行性感冒病毒、抑制流行性感冒病毒增殖或複 製、減少與流行性感冒病毒感染相關之一或多種症狀或併 發症、降低對流行性感冒病毒感染之易感性、加快自流行 性感冒病毒感染疾癒等）的至少一部分之抗體。因此，在 額外實施例中’本發明提供具有表示為第Z3G丨號（ATCC寄 存號第ΡΤΑ-5967號；寄存於2004年3月13曰，美國菌種保 藏中心，Manassas，VA，USA)或第 Z3G3 號（Ζ3.16·25」） (ATCC寄存號第ΡΤΑ-5 968號；寄存於2004年3月13曰，美 105723.doc -45· ⑤ 1377212 國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)的抗體之一或多 種抗流行性感冒活性之至少一部分的M2抗體。
當用於將抗體與參照抗體進行對比時術語"活性"意謂該 抗體具有該參照抗體之活性例如結合親和力（例如Kd)、片 合特異性或抗流行性感冒活性的至少一部分。因此具有表 示為Z3G1之M2抗體之活性的抗體具有表示為以⑴之河之抗 體之一或多種活性之至少一部分。術語"至少一部分"意謂 抗體可具有較少活性但抗體保留至少可量測或可债測數量 的參照M2抗體之活性，例如對M2之至少部分結合親和 力、至少部令抗流行性感冒活性等。具有本文中所示範之 M2抗體之一或多種抗流行性感冒活性的至少一部分之本 發明人類M2抗體亦可具有高於參照抗體（如本文中所示範 之M2抗體）之活性》
具有示範性人類Μ 2抗體活性之抗體可藉由本文中所揭 示或此項技術中已知之各種方法鑑別。例如，使用採用平 板結合M2肽作為包被抗原之結合檢定（EUSa)、對受病毒 感染之MDCK細胞上之厘2蛋白質進行之結合檢定（基於細 胞之ELISA)及採用M2肽特異抑制抗體結合於受病毒感染 之MDCK細胞上之M2(M2e)。額外檢$包括採用流行性感 冒病毒之活體外細胞傳染檢定（Zebedee等人，了
62:2762(刪））以及如實例卜3及4中所提出之活體内動Z 檢定。 產生人類多株及單株抗體之方法為本文中所揭示及此項 技術中已知。例如，如本文中所揭示結合於klh或BSA之 105723 d〇C -46- ⑤ 1377212 蛋白質、M2肽及M2SG肽的混合物係用以賦予轉人類染色 體 2KM小鼠 TM(W〇 02/43478)或 HAC小鼠（W0 02/092812)
免疫性。小鼠TM或HAC小鼠表現人類免疫球蛋白基 因。使用習知之融合瘤技術’自對M2抗原為高度回應者 之經免疫之小鼠分離出脾細胞並使之與骨髓瘤細胞融合。 獲得單株抗體（表示為第以⑴號），其與M2肽及/或M2-BSA 結合物反應，但並不結合於BSA或KLH載劑《用於產生人 類抗體之技術之概述係描述於Lonberg及Huszar(Int. Rev.
Immunol· 1 3:65 (1 995))中。例如在美國專利第5,939,598號
中描述具有-一或多種人類免疫球蛋白基因（1^或λ)但不表現 内源免疫球蛋白之轉基因動物。描述用於產生人類多株抗 體及人類單株抗體之額外方法（參見，例如Kuroiwa等人， Nat. Biotechnol. 20:889 (2002) ； WO 98/24893 ； WO 92/01047 ; WO 96/34096 ; WO 96/33735 ;美國專利第 5,4 1 3,923 號；第 5,625,126 號；第 5,633,425 號；第 5,569,825 號；第 5,661,016 號；第 5,545,806 號；第 5,814,318 號；第 5,885,793 號；第 5,916,771 號及第 5,939,598號）。
M2單株抗體亦可使用其它技術包括融合瘤、重組及噬 菌體呈現技術或其組合而容易地產生（參見美國專利第 4,902,6 14 號、第 4,543,439 號及第 4,411，993 號；亦參見 Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press，Kennett、McKearn及 Bechtol(編），1980 及 Harlow 等人，Antibodies: A I05723.doc -47- 1377212
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版’ 1988)。該方法中額外可使用之適當技術包括m2親 和純化、非變性凝膠純化、HPLC或RP-HPLC、關於蛋白 質A柱之純化或該等技術之任意組合。抗體同型可使用 ELISA檢定測定’例如，人類。可使用吸附小鼠ig之抗人 類Ig而被鑑別。
可使用多種此項技術中已知之技術將抗體人源化，包括 例如CDR-移植（EP 239,400 ; W0 91/09967 ;美國專利第 5,225,5 39號；第5,530，101號及第5,585,089號）、鑲飾或再 做面層（EP- 592,106 ; EP 519,596 ; Padlan，Molecular Immunol. 28:489 (1991) ; Studnicka 等人，Protein
Engineering 7:805 (1994) ; Roguska 等人，Proc. Nat，l. Acad· Sci. USA 91:969 (1994))及鏈改組（美國專利第 5,565,332 號）。人類一致序列（Padlan，Mol. Immunol. 31:169 (1994)及Padlan，Mol. Immunol. 28:489 (1991))先前 已用於將抗禮人源化（Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)及 Presta等人，J. Immunol. 151:2623 (1993)) 〇 用於產生嵌合抗體之方法為此項技術中已知（例如 Morrison, Science 229:1202 (1985) ； Oi 等人，
BioTechniques 4:214 (1986) ; Gillies 等人，J. Immunol. Methods 125:191 (1989)及美國專利第 5,807,715 號；第 4,816,567 號及第 4,816,397 號）。例如在 Munro，Nature 312:597 (1984) ; Neuberger等人，Nature 312:604 (1984); 105723.doc -48- ⑧ 1377212
Sharon等人，Nature 309:364 (1984) ; Morrison等人，Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 8 1:685 1 (1984) ; Boulianne等人， Nature 312:643 (1984) ; Capon 等人，Nature 337:525 (1989)及 Traunecker等人，Nature 339:68 (1989)中描述其 中來自一種物種之抗體的可變域取代另一物種之可變域的 嵌合抗體。
適用於產主抗體之M2蛋白質可藉由任意此項技術中已 知之多種標準蛋白質純化或重組表現技術產生。例如， M2可藉由標準肽合成技術如固相合成產生。一部分蛋白 質可含有胺基酸序列如T7標記或聚組胺酸序列以促進經表 現或經合成M2之純化。M2可表現於細胞中且可純化藉由 該等細胞產生之蛋白質。可藉由重組方法使M2蛋白質表 現為更大蛋白質之一部分。
適用於產生免疫反應之M2的形式包括全長M2之肽子序 列如M2e(例如通常長度為4至5個胺基酸或更長）。M2之額 外幵/式包括含M2之製品或萃取物、部分純化之m2以及表 現M2之細胞或病毒或該等表現細胞或病毒之製品。 可被免疫之動物包括小鼠、兔、大鼠、綿羊、奶牛或公 牛、山羊或天竺鼠；該等動物包括經基因修飾以包括人類 【gG基因丨0C1之動物。因此該等動物可用以產生如本發明之 人頒抗體。此外，為提高免疫反應，可使M2與另一蛋白 貝如卵/月蛋白或匙孔螺血氰蛋白（KLH)、曱狀腺球蛋白及 皮傷風頌毋素偶合或與佐劑如福氏（Freund,s)完全或不完全 佐劑混合。初始及任意視情況之後來免疫可通過腹腔内、 >05723^ -49- 1377212 肌内、眼内或皮下途徑。後來免疫可採用相同或不同濃度 的M2抗原製品且可採用規律或不規律間隔。 因此在另一實施例中’本發明提供產生人類M2抗體之 方法，抗體包括具有一或多種抗流行性感冒活性如抑制流 行性感冒病毒感染、複製、增殖或滴度或抑制病毒複製、 • 增殖或滴度增加或減少與流行性感冒感染相關之一或多種 ' 症狀或併發症之擴展、嚴重度、頻率 '持續時間或概率或 對感染之易感性’或具有抵抗各種流行性感冒病毒株或分 ’離株之廣泛反應性之抗體。在-實施例中，方法包括將 M2或其免疫原性片段投予能表現人類免疫球蛋白之動物 (例如小鼠、奶牛或公牛）；篩選表現人類M2抗體之動物； 選擇產生人類M2抗體之動物；自該產生人類]^2抗體之動 物分離抗體；及測定人類]^2抗體是否結合於M2。在另一 只她例中，方法包括將人類M2或其免疫原性片段投予能 表現人類免疫球蛋白之動物（例如小鼠、奶牛或公牛）；自 ^生人類M2抗體之小鼠分離脾細胞；將該等脾細胞與骨 $瘤細胞融合以產生融合瘤；及篩選表現具有抗流行性感 _舌丨生之人類M2抗體的融合瘤。 - 實♦月進步提供已經過修飾之人類M2抗體。修飾之 、 括抗體之一或多種胺基醆取代、添加或缺失，其限 审’J條彳來& 妗人親’、’、經修飾之抗體具有未經修飾M2抗體之活性例如 力特異性或抗流行性感冒活性等的全部或至少 一部分^ 特定實例為藉由（例如）取代重鏈恆定區將本發明 1〇5723.d〇c ⑤ •50· 1377212 之抗體改變為具有不同同型或亞類（參見（例如）實例2) β M2抗體Ζ3之Ig亞類的自IgG3至IgG,i改變導致抗流行性感 冒活性之改良。因此，修飾包括自抗體丟失胺基酸序列之 小區及大區且以另一胺基酸序列取代經缺失之區，不論該 序列長度比經缺失之區更長或更短。
本發明中所包括之M2抗體之額外修飾為抗體衍生物， 即任意類型分子共價連接於抗體。抗體衍生物之特定實例 包括已藉由保護/阻斷基團而_基化、乙醯化、鱗酸化、 酿胺化、甲醯化、泛素化及衍生之抗體及任意大量化學修 飾0 - 除以D-型胺基酸取代天然存在之l-胺基酸之外，胺基酸 取代可以相同胺基酸進行。因此修飾包括取代L_胺基酸之 一或多種D-胺基酸或取代L-胺基酸之d·胺基酸的混合物。 修飾進一步包括結構及功能類似物，例如具有合成或非天 然胺基酸或胺基酸類似物及衍生形式之肽模擬物。
修飾包括環狀結構如分子之胺基與羧基末端之間的末端 至末端醯胺鍵或分子内或分子間的二硫鍵。多肽可在活體 外或活體内經修飾（例如轉譯後修飾）以包括（例如）糖殘 基、鱗酸酯基、泛素、脂肪酸、脂質等。 修飾包括參照組合物之活性或功能（例如特異結合於 M2)。可使用此項技術中已知之方法製備具有經改變之特 欲（如提高的結合親和力）之經修飾抗體，舉例而言如，親 和力成熟技術可用以改良抗體結合親和力（us 2 004/0162413 A1 ;美國專利第 6,656,467號、第 6,531，580 I05723.doc . ⑤ 1377212 號、第 6,590,079號及第 5,955,358號；Fiedler等人，protein Eng. 15:93 1 (2002) ; Pancook 等人 ’ Hybrid. Hybridomics 20:383 (2001) ; Daugherty 等人，Protein Eng. 11:825 (1998) ; Wu等人，Proc. Nat'l Acad· Sci. USA 95:6037 ( 1998);及 Osbourn 等人，Immunotechnology 2:181 (1996)) 〇
經修飾之蛋白質可具有胺基酸取代、添加或缺失（例如u 3、3-5、5-10或更多個殘基）。在一特定非限制性實例中， 取代為保守型胺基酸取代。 胺基酸取代可為保守型或非保守型且可在抗體之恆定區 或可變區内。可能可容許恆定區或可變區内之一個或一些 保守型胺基酸取代。高可變區内之多個胺基酸之非保守型 取代有可能會影響結合活性、特異性或抗體功能或活性。 區域突變性分析可用以預測CDR及FR域中之特異取代之 影響（Shapiro等人，J Immunol. 163:259 (1999))。簡言之，
序列對比說明位於Ig内含子DNA内之二及三核苷酸序列中 之突變性層次，其預測或多或少可突變之區。定量結構-活性關係（QSAR)可用以鑑別抗體識別域之性質及（由此）參 與配位體結合之胺基酸。基於QSAR之預測模型又可用以 預測突變之影響。例如’突變對抗體與其抗原相互作用之 締合及解離速率的影響已用以建構動力學常數（Ka及Kd)之 定量預測模型，其又可用以預測其它突變對抗體之影響 (De Genst等人，J Biol. Chem. 277:29897 (2002))。 為鑑別保留未經替代抗體之至少一部分結合活性、特異 I05723.doc -52- 性或抗體功能或活性的抗體，可檢定取代之影響。例如， 可檢定高可變區中之胺基酸取代對結合活性或特異性或抗 叫行性感冒活性之影響。只要經取代之抗體保留參照抗體 (例如未經修飾之人類M2抗體）的至少一部分結合親和力' 結合特異性或抗流行性感冒活性則可包括該等具有胺基酸 取代之抗體。 保寸型取代”意謂藉由一生物上、化學上或結構上相似 之殘基置換一種胺基酸。生物上相似意謂該取代與生物活 t生（例如特異結合於M2)相容》結構上相似意謂胺基酸具有 相似長度（如丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸）或相似大小之側 鏈。化學相似性意謂殘基帶有相同電荷或同為親水性或疏 水性。特定非限制性實例包括一疏水性殘基（如異白胺 酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸）取代另一疏水性殘基， 或一極性殘基取代另一極性殘基，如精胺酸取代離胺酸、 麩胺酸取代天冬胺酸或麵醯胺酸取代天冬醯胺酸、絲胺酸 取代酥胺酸。 經修飾之抗體包括與表示為第Z3G1號之單株抗體的序 列 50-100〇/〇 或 50。/〇、60。/。、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98〇/〇、99¾或更高同一性之胺基酸序 列。同一性可遍及蛋白質之定義區域（區或域）。 術浯"同一性π及其文法變異形式意謂兩個或兩個以上參 照實體相同◊因此，若兩段抗體序列相同則其含有相同的 胺基酸序列。"具有同一性之區域、區或域”意謂兩個或兩 個以上參照實體之一部分相同。因此，若兩段抗體序列在 I05723.doc -53 - 1377212 一或多個序列區範圍内相同則其在該等區内共享同一性。 術語"實質上同一性"意謂該同一性結構上或功能上是顯著 的。也就是說，即使分子不同但該同一性應使得分子結構 上相同或具有至少一種相同功能（例如特異結合於M2)。
由於結構上與功能上相關蛋白質之間的序列保守之數量 變化，因而實質上同一性之序列同一性的數量將取決於蛋 白質、區及彼區之任意功能。對於具有實質上同一性之蛋 白質而言儘管可存在少達30%的序列同一性，然而通常存 在更高例如 50%、60%、75%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%的與參照序列之同一性。對於核酸序列而言， 50%的序列同一性或更高通常構成實質上的同源，但又可 視對比區及其功能（若有）而改變。
兩段序列之間的同一性程度可使用此項技術中已知之電 腦程式及數學演算法確定。該等計算序列同一性（同源）百 分比之演算法通常解釋說明在對比區範圍内之序列缺口及 不匹配。例如BLAST(例如BLAST 2·0)搜尋演算法（參見例 如 Altschul 等人 ’ J. Mol. Biol. 215:403 (1990)，藉由NCBI 公開獲得）具有如下示範性搜尋參數：不匹配-2 ;缺口開 5 ;缺口延伸2。對於多肽序列對比而言，BLASTP演算法 通常結合計分矩陣如PAM 100、PAM 250、BLOSUM 62或 BLOSUM 50 使用。FASTA(例如 FASTA2 及 FASTA3)及 SSEARCH序列對比程式亦用以定量同一性之程度（pearson 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson，Methods Mol Biol. 132:185 (2000);及 Smith 等 105723.doc -54- ⑤ 1377212 人，J. Mol. Biol· 147:195 (1981))。亦已開發出使用基於 德洛内（Delaunay)之拓撲繪圖用於定量蛋白質結構相似性 的程式（Bostick 等人，Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)) 〇
本發明之人類單株M2抗體包括如本文中所提出之子序 列（例如片段）及修飾形式（例如序列變異體）^在特定實施 例中，人類M2抗體子序列包括Fab、Fab，及F(ab')2、Fd、 單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵接之Fvs(sdFv)及％或 Vh域片段。在特定態樣中，Fab ' Fab1及F(ab，）2、Fd、單 鍵Fvs(scFv>、單鏈抗體、二硫鍵接之Fvs(sdFv)&Vi^VH 域子序列具有與參照M2抗體（例如全長或未經修飾之m2抗 體）相同之結合親和力 '大體上相同之結合親和力、相同 之結合特異性或一或多種抗流行性感冒活性，例如在抑制 居體外或活體内細胞感染流行性感冒中之功效。個別M2 結合抗體子序列可組合。例如，VL或VH子序列之組合可藉 由連接子序列連接因而形成Vl_Vh嵌合體。單鏈Fvs(scFv) 子序列之組合可藉由連接子序列連接因而形成 合體。包括單鏈抗體之M2結合抗體子序列包括單獨或與 其它子序列之全部或一部分組合之可變區，以及以下區域 中之一或多種：鉸鏈區、CHi'CH2及CH3域。亦包括可變 區與鉸鏈區、CH,、CH2及CH3域之任意組合的抗原結合子 序歹|J。 本發明之M2抗體子序列（例如Fab、Fab'、F(ab，）2、Fd、 scFv、sdFv及VL4 VH)可藉由抗體之蛋白質水解例如藉由 I05723.doc -55 - © 整個抗體之胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化而製備。當指本發 明之抗體時術語|，功能子序列"及，，功能片段"係指保留完整 參照抗體之一或多種功能或活性之至少一部分的一部分抗 體。 藉由以胃蛋白酶的酶裂解而產生之抗體片段提供表示為 F(ab )2之5 S片奴。可使用硫醇還原劑使此片段進一步裂解 產生3.5S Fab1單價片段。或者，制胃蛋白酶的酶裂解直 接產生兩個單價Fab，片段及Fc片段（參見例如美國專利第 4,036,945 號及第 4,331，647 號；及 Edelman等人，Methods
Enymol. 1:422 ( 1967))。亦可使用其它裂解抗體之方法’ 如分離重鏈以形成單價輕-重鏈片段，進一步裂解片段或 其它酶法或化學法。基因技術包括在宿主細胞如c〇s細胞 或大腸埃希氏菌（E. coli)中表現M2抗體基因之全部或一部 分。重組伤主細胞可合成完整或單一抗體鏈，如scFv(參 見例如 Whitlow 等人 ’ In: Meth〇ds: a Compani〇n t〇
Methods in Enzymology 2:97 (1991)、Bird等人，Science 242:423 (1988);及美國專利第4,946,778號單鏈Fvs及 抗體可如美國專利第4,946,778號及第5,258,498號；Hust〇n 等人，Methods Enzymol. 203:40 (199〇; ShufA，Proc· Natl. Acad. Sci. USA 90:7995 (1993);及 Skerra 等人， Science 240:1038 (1988)中所述製備。 本發明中所包括之M2抗體之額外修飾為抗體添加/插 入。例如添加可為任意類型分子與抗體之共價或非共價連 接。抗體添加之特定實例包括藉由保護/阻斷基團之醣基 I05723.doc • 56· 1377212 化 '乙醯化、磷酸化、醯胺化、甲醯化、泛素化及衍生化 作用及任意大量化學修飾。 添加進一步包括融合（嵌合）多肽序列，其為具有通常不 存在於參照天然（野生型）序列中之一或多種分子的胺基酸 序列’該參照序列共價連接於該胺基酸序列❹特定實例為 產生多特異性抗體之另一抗體的胺基酸序列。
具有胺基酸添加之經修飾M2抗體的另一特定實例為其 中連接第二不同序列（即不同功能域）之抗體，該第二不同 序列給予該抗體不同或補充的功能。例如，胺基酸標記 (如T7)或聚姐胺酸可連接於M2抗體以促進m2或流行性感 冒病毒之純化或偵測。另一實例為連接於M2抗體之抗病 毒劑以將感染有流行性感冒之細胞作為乾使其病毒殺滅、 增殖：抑制、複製抑制等。因此，在其它實施例中本發明提 供M2抗體及不同域，其中該域給予該抗體不同功能，即 不同功能域。
不同功能域並非限制於胺基酸殘基。因此，不同功能域 可由任意多種不同類型的小的或大的功能部分組成。該等 4分包括核酸、肽、碳水化合物、脂質或小的有機化合 物，如藥物（例如抗病毒劑）、金屬（金、銀）等。 可將連接子序列插入抗體序列與不同功能域之間使得兩 種實體至少部分地保留不同功能或活性。連接子序列可具 有一或多種性質，包括柔性構形、無能力形成有序二級結 構或可促進任—域或與任一域相互作用之疏水性或帶電荷 特徵。彈性蛋白質區中通常發現之胺基酸包括GW、Am及 I05723.doc ⑧ •57· 1377212 〜。其它如Thr及Ala之近"生胺基酸亦可用於連接子序 列令。連接子序列之長度可變化而不會顯著影響該融合蛋 白質之功能或活性（參見例如美國專利第M87,329幻。連 接子進-步包括化學部分及結合劑，如磺基琥始醯亞胺 基衍生物（石黃基-SMCC、績基_SMPB)、辛二酸二號㈣亞 胺酉曰（DSS)、戊二酸二琥ίό醯亞胺酯（dsg)及酒石酸二號轴 醯亞胺酯（DST)。
不同功能域之額外實例為可偵測之標記。因此在另一實 施例令本發明提供經可请測標記之人類M2抗體。 可偵測標記之特定實例包括螢光團、發色團、放射性同 位素（例如s 、P 、1丨25)、電子緻密試劑、酶、配位體及 又體酶通吊藉由其活性而摘測。例如，辣根過氧化物酶 通常藉由其將如3,3.’，5,5_|_四甲基聯苯胺（TMB)之底物轉化 為可定量之藍色顏料之能力而偵測。配位體可結合其它可 結合抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素的之分子（如生物 素），及可結合蛋白質A之IgG。 應瞭解M2抗體可具有兩種或兩種以上變化形式、修飾 形式或標記。例如，單株抗體可偶合於生物素以根據抗生 物素蛋白以及广25標記偵測其存在因此其提供可偵測訊 號。其它變更及可能性對一般技術者為顯而易見且被認為 在本發明之範疇内。 本發明進一步提供編碼本發明之人類M2抗體之核酸， 包括經修飾之形式、子序列/片段、嵌合體等。在特定實 施例中，核酸編碼表示為第Z3G1號（ATCC寄存號第ρτΑ_ ⑴ 5723.doc •58· 1377212 5967號；寄存於2〇〇4年3月Π日’美國菌種保藏中心，
Manassas’ VA，USA)及第 Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC 寄存 號第PTA-5968號；寄存於2004年3月13日，呈剧—仏 美國菌種保藏 中心，Manassas，VA，USA)之完整鏈或單鏈]^2抗體。在 額外實施例核酸編碼實例1中所提出之完整鏈或單鍵 (SEQ ID NOs:34 ' 35及 37)。
術語”核酸”或"多核苷酸"可互換用以指代所有形式的核 酸’包括去氧核糖核酸（DNA)及核糖核酸（RNA)。核酸可 為雙鏈、單鏈或三鏈、線性或環狀。核酸包括基因組 DNA、cDNA及反義。RNA核酸可為經剪接或未經剪接之 mRNA ' rRNA、tRNA或反義。本發明之核酸包括天然存 在的、合成的核酸，以及核苷酸類似物及衍生物。該等經 改變或經修飾之多核苷酸包括提供例如核酸酶抗性之類似 物。
核酸可為任意長度。例如’任一第Z3G1號（ATCC寄存號 第PTA-5967號；寄存於2004年3月13曰，美國菌種保藏中 心 ’ Manassas，VA，USA)或第 Z3G3 號（Z3.1 6.25.1 )(ATCC 寄存號第PTA-5968號；寄存於2004年3月13曰，美國菌種 保藏中心，]Vianassas，VA，USA)中之子序列，其編碼具 有一或多種抗流行性感冒活性之蛋白質。在一特定實施例 中’核酸包括如實例1中所提出之重鏈序列及輕鏈序列 (SEQ ID NOs:32、33及36)。在另一特定實施例中，核酸 編碼如實例1中所提出之重鏈序列及輕鏈序列（SEQ ID N〇s:34、35及 37)。 I05723.doc •59· 1377212 由於遺傳碼之簡併，因而核酸包括關於編碼第Z3G丨號 (ATCC寄存號第ρΤΑ·5967號；寄存於2004年3月13日，美 國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)及第Z3G3號 (Z3.丨6.25.1)(ATCC寄存號第PTA-5968號；寄存於2〇〇4年3 月1 3曰’美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)之序 列為簡併的序列、其子序列及如本文中所提出之經修飾形 式。
核醆可使用任意多種熟知之標準選殖及化學合成方法而 製備且可藉由定點突變或其它熟習此項技術之人已知之重 組技術而有-意地改變。多核苷酸之純度可藉由定序、凝膠 電泳及其類似方法測定。 可將本發明之核酸插入其中該核酸之表現受本文中稱作 "表現序列盒"之，|表現控制元件，’影響或調節之核酸構造 内。術語”表現控制元件”係指調節或影響核酸序列表現之
一或多種核酸序列元件，表現控制 等核酸序列連接。表現控制元件可 質的基因前面的啟動子、強化子、 子、起始密碼子（例如ATG)。 70件可操作地與該或該 包括（如適當）編碼蛋白 轉錄終止子、基因靜止 保忭地連接 …〜丨丁仅则级核駸序 之=錄及（如適當）轉譯。術語，，可操作地連接”係指並 之」參考兀件係處於允許其以其所想要的方式起作用 “糸中。表現控制元件通常在基 亦可為内含的。 並列但
現控制元件包括原構性地活化轉錄 之元件，其為誘導 *05723.doc © •60· 1377212 性（即需要外部訊號以活化）或去阻遏性（即需要訊號以關閉 轉錄’當該訊號不再存在時轉錄被活化或"去阻遏"）。本發 明之表現序列盒中亦包括足以提供對於特異細胞型或組織 而5為可控制之基因表現的控制元件（即级織特異性控制 兀件）。通常，該等元件位於編碼序列之上游或下游（即5, 及3’）。啟動子通常位於編碼序列之藉由重組dNa或合 成技術所產生之啟動子可用以為本發明之多核苷酸之轉錄
作準備。"啟動子"意謂足以指引（direct)轉錄之最小序列元 件。 可將本發明之核酸插入質體内用於在宿主細胞内繁殖且 必要時用於隨後的基因操作。質體為可在宿主細胞内穩定 繁殖之核酸·，質體可視情況含有表現控制元件以使編碼 M2抗體之核酸的表現驅入宿主細胞中。本文中所使用之 載體與質體同義且亦可包括表現控制元件用於在宿主細胞 内之表現。質體及載體通常含有至少一複製起點用於在細 φ 胞及啟動子内繁殖。因此質體及載體適用於編碼M2抗體 之核酸的基因操作、製備河2抗體或反義及在（例如）宿主細 胞或生物體内表現M2抗體。 編碼抗體重鏈及輕鏈之可變區或編碼全長抗體重鏈及輕 鏈的核酸可自融合瘤分離。可將經分離之核酸插入適當表 現載體，並導入可經培養用於重組M2抗體之製備的適當 宿主細胞如酵母或CHO細胞中。 細菌系統啟動子包括T7及誘導性啟動子如噬菌體入之 pL· Plac、PtrP、ptac(ptrp-lac雜交啟動子）及四環素反應啟 105723.doc -61· 1377212
動子。昆蟲細胞系統啟動子包括原構性或誘導性啟動子 (例如蛻皮激素）。哺乳動物細胞原構性啟動子包括SV4〇、 RSV、牛乳頭狀瘤病毒（BPV)及其它病毒啟動子或衍生自 哺乳動物細胞基因組之誘導性啟動子（例如金屬硫蛋白Η A 啟動子；熱休克啟動子）或衍生自哺乳動物病毒的啟動子 (例如腺病毒晚期啟動子；誘導性小鼠乳腺腫瘤病毒長末 端重複序列）。或者，反轉錄病毒基因組可經基因修飾用 於引入及指引M2抗體在適當宿主細胞内之表現。 表現系統進一步包括設計用於活體内使用之載體。特定 非限制性實-例包括腺病毒載體（美國專利第5,700,470及 5,731，172號）、腺相關載體（美國專利第5,604,090號）、單 純疱疹病毒載體（美國專利第5,501，979號）、反轉錄病毒載 體（美國專利第 5,624,820、5,693,508及 5,674,703號）、BPV 載體（美國專利第5,719,054號）及CMV載體（美國專利第 5,561，063 號）。
酵母載體包括原構性及誘導性啟動子（參見例如Ausubel 等人，在 Current Protocols in Molecular Biology，第 2 卷，第 13 章，Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience 出版，1988 中；Grant 等人，Methods in Enzymology， 153:516 (1987)，Wu & Grossma 編；Bitter Methods in Enzymology，152:673 (1987)，Berger & Kimmel 編，
Acad. Press, N.Y.;及 Strathern 等人，The Molecular
Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) Cold Spring Harbor Press出版，第I及II卷）。可使用原構性酵母啟動子 105723.doc 62 ⑤ 1377212 如ADH或LEU2或誘導性啟動子如GAL(R. Rothstein在： DNA Cloning，A Practical Approach，第 11卷，第 3章， D.M. Glover編 ’ IRL Press，Wash.，D.C.，1986)。（例如） 經由同源重挺促進外來核酸序列整合於酵母染色體中之載 體為此項技術中已知。當插入之多核苷酸對於更習知之載 體為太長（例如超過約1 2 kb)時通常可使用酵母人工染色體 (YAC)。
亦提供包括編碼人類M2抗體之核酸的宿主細胞。在一 貫施例中’宿主細胞為原核細胞。在另一實施例中，宿主 細胞為真核鈿胞。在各種態樣中，真核細胞為酵母或哺乳 動物（例如人類、靈長類等）細胞。
如本文中所使用，”宿主細胞"為將可繁殖、轉錄或編碼 表現M2抗體之核酸導入其中之細胞。該術語亦包括宿主 細胞之任意子代或次純系。由於可存在複製及增殖過程中 發生的突變因而子代細胞及次純系不必等同於親代細胞。 然而’該等細胞被認為是本發明之宿主細胞。 宿主細胞包括（但不限於）微生物如細菌及酵母；及植 物、昆蟲及哺乳動物細胞。例如，提供以重組噬菌體核 酉文、貝體核酸或黏質體核酸表現載體轉化之細菌；以重組 酵母表現載體轉化之酵母；以重組病毒表現載體（例如花 椰菜肷紋病毒’ CaMV ;煙草嵌紋病毒，tmv)感染或以重 組質體表現載體（例如丁丨質體）轉化之植物細胞系統；以重 組病毒表現載體（例如桿狀病毒）感染之昆蟲細胞系統；及 以重組病毒表現載體（例如反轉錄病毒、腺病毒、牛痘病 I05723.doc •63 - 1377212 毋）感染之動物細胞系統’或設計用於穩定表現之經轉化 的動物細胞系統。 表現載體亦可含有給予選擇性壓力以抗性之可選擇標記 或可鑑別標記（例如β_半乳糖苷酶），因此使具有載體之細 胞可被選擇、生長及擴展。或者，可選擇標記可位於第二 載體上’該第二載體與含有本發明之多核苷酸的第一載體 共轉染入伯主細胞内。
選擇系統包括（但不限於）可分別用於、hgprt-或aprt-細胞中之單純疱疹病毒胸苷激酶基因（Wigler等人，Ceil 1 1:223 (1 97-7))、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因 (Szybalska 等人，Pr〇c. Natl. Acad· Sci. USA 48:2026 (1962))及腺α票岭碟酸核糖基轉移酶（L〇Wy等人，Cell 22:8 1 7 ( 1980))基因。此外，抗代謝物抗性可用作選擇下列 基因之基礎：給予抗性於甲胺喋呤之dhfr(〇，Hare等人，
Proc· Natl· Acad· Sci. USA 78:1527 (1981));給予抗性於 黴酚酸之gpt 基因（Mulligan等人，Proc. Natl: Acad. Sci. USA 78:2072 (1981));給予抗性於胺基糖苷G-418之新黴 素基因（Colberre-Garapin 等人，J. Mol. Biol. 150:1(198 1));嘌呤黴素；及給予抗性於潮黴素之潮黴素 基因（Santerre等人，Gene 30:147 (1984))。額外可選擇之 基因包括允許細胞使用吲哚代替色胺酸之trpB、允許細胞 使用组胺醇代替組胺酸之hisD(Hartman等人，Pr〇c. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988));及給予抗性於鳥胺酸脫 羧酶抑制劑（2-(二氟甲基）-DL-烏胺酸）DFMO之〇DC(烏胺 I05723.doc -64- ⑤ 1377212 酸脫缓 8$)(McConlogue (1987)在 Current Communications in Molecular Biology - Cold Spring Harbor Laboratory 中）。 用於治療病患的流行性感冒病毒感染之方法包括將治療 病患的流行性感冒病毒感染之有效劑量之特異結合流行性 感冒M2蛋白質的人類、人源化或嵌合抗體投予病患。抗 體可在病患感染前投藥（即預防）、在病患感染的大體上同 時投藥或在病患感染後投藥（即治療）。 本發明之方法包括向病患提供治療效益，例如減少或降 低與流行性感冒病毒感染相關之一或多種症狀或併發症之 擴展、嚴重度、頻率、持續時間或概率、減少或抑制病毒 滴度、病毒複製、病毒增殖或-或多種流行性感冒病毒株 或分離株之病毒蛋白質數量的增加，或穩定病況（即阻礙 或抑制與流行性《冒病毒感染相目之症狀或併發症的惡化 或感染的擴展）。其擴展、嚴重度、頻率、持續時間或概 率可減少或降低之與流行性感冒病毒感染相關的症狀或併 發症包括（例如）發冷、發熱、咳嗽、喉嚨痛、鼻塞、鼻竇
=鼻感染、竇感染、身體疼痛、頭痛、疲勞、肺炎、I 氣管炎、耳感染或耳痛。治療效益亦可包括減少病患對流 ，冒病毒感染之易感性或促進或加快病患自流行性感 自病毒感染疼癒。 在—實施例中’方法包括將抑制病患的病毒感染或降低 病患對受-或多種流行性感冒病毒株/分離株或亞型病毒 感染之易感性的有效劑量之特異結合流行性感冒病毒M2 105723.doc ⑤ 1377212 之人θ Λ源化或嵌合抗體投予病患。在各種態樣中，抗 體在病患感染前投藥（預防）、在病患感染的大H上同時投 藥或在病患感染後投藥(治療)。抗體可提供包括以下之治 療"^ （例如）減少或降低流行性感冒病毒感染之-或多
種症狀或併發症（你f如路A 如發冷、發熱、咳嗷、喉嚨痛、鼻 泰、鼻竇炎、鼻感.·九 . T纹木、竇感染、身體疼痛、頭痛、疲勞、 肺大纟R官炎、耳感染或耳痛)之擴展、嚴重度、頻
率、持續時間或概率’病毒滴度或一或多種流行性感冒病 毋株/分離株或亞·^A% JrfT .—
Xi之病毒蛋白質之數量或病患對受一或 多種流行性感？病毒株/分離株或亞型❹之易感性。
進-步提供治療效益及由此用於阻礙或抑制病患的流行 性感冒病毒滴度、病毒複製、病毒增殖或流行性感冒病毒 蛋白質之數量增加之方法。在—實施例中，方法包括將阻 礙病患的流行性感冒病毒滴度、病毒複製或_或多種流行 性感冒病毒株/分離株或亞型的流行性感冒病毒蛋白質之 數量增加有效劑量之特異結合流行性感冒M2的人類、人 源化或嵌合抗體投予病患。 額外提供保護病患不受感染、降低病患對感染之易感性 及促進或加快病患自受一或多種流行性感冒病毒株/分離 株或亞型感染痊癒之方法。在一實施例中，方法包括將保 護病患不受感染、降低病患對病毒感染之易感性或促進或 加快病患自受一或多種流行性感冒病毒病毒株/分離株或 亞型病毒感染痊癒有效劑量之特異結合流行性感冒M2之 人類、人源化或嵌合抗體投予病患。 • 66· 105723.doc ⑤ 1377212
本發明之方法可以具有藉由表示為第Z3G1號（ATCC寄存 號第PTA-5967號；寄存於2004年3月13日，美國菌種保藏 中心，Manassas ， VA ， USA)或第 Z3G3 號 (Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第 PTA-5968 號；寄存於 2004 年 3 月13日，美國菌種保藏中心，Manassas，VA，USA)之細 胞株（例如融合瘤或CHO細胞株）所產生之抗體的結合特異 性或相同或大體上相同之結合親和力之任意抗體來實施。 本發明之方法可以識別表示為第Z3G1號（ATCC寄存號第 PTA-5 967號；寄存於2 004年3月13日，美國菌種保藏中 心，Manassas，VA，USA)或第 Z3G3 號（Z3.16.25.1)(ATCC 寄存號第PTA-5968號；寄存於2004年3月13日，美國菌種 保藏中心，Manassas，VA，USA)之抗體與其結合之相同 抗原決定部位或相同或大體上相同最小結合序列的任意抗 體來實施。
包括治療、診斷及純化/分離方法之本發明方法可適用 於任意流行性感冒病毒株/·分離株或亞型或病毒株/分離株 或亞型之組合。流行性感冒病毒株之特定非限制性實例為 A/PR/8/3 4(HlNl)或 A/HK/1/68(H3N2)病毒株 / 分離株或亞 型，如 H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H9N2、H2N1、 H4N6、H6N2 、H7N2、H7N3、H4N8、H5N2、H2N3、 H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、H2N3、 H6N1、H13N6、H7N1、H11N1、H7N2 或 H5N3。 本發明之人類、人源化及嵌合M2抗體可單獨使用或與 具有抗流行性感冒活性例如抑制流行性感冒病毒感染、複 I05723.doc -67- 1377212 製、增殖或減少與流行性感冒病毒感染相關之一或多種症 &或併發症之擴展、嚴重度、頻率、持續時間或概率之治 療劑組合使用。該等組合之實例包括含有兩種或兩種以上 具有不同結合特異性、結合親和力或抑制活體外或活體内 細胞的流行性感冒病毒感染之功效的不同M2抗體之混合 單株或混合多株抗體。因此’提供包括M2抗體之組合組 合物以及根據本發明方法使用該等組合之方法。
包括治療流行性感冒或與流行性感f病毒感染相關之病 症或併發症的本發明方法有可能會導致改良病患之病況、 減少與流行性感冒病毒感染相關之一或多種症狀或併發症 之擴展、嚴重度、頻率、持續時間或概率，或降低病患之 症狀發展或招致感染之風險例如對流行性感冒病毒感染之
易感性0因此改良句；f壬_ Λ' P 括 次夕種經降低或減少之病毒增 殖、複製或滴度或與流行性感冒病毒感染相關之症狀或併 發症。改良亦包括減少或消除對用於治療患有流行性感冒 病毋感木或與丁性感冒病毒感染相關之症狀或併發症的 病患或處於上述風險中的、戌电+ lju 甲的病％、之抗病毒樂物或其它藥劑之 需要、投藥頻率或數量。 改良不必完全消除與流行性感冒病毒感染相關之任意或 f部症狀或併發症。更確切地說，治療可為任意客觀或主 觀可里利或可<貞測之抗流行性感冒病毒效果或改良。因 此田在短的或長的持續時間（小時、天、週、月等）期間 病心病况或相關症狀或併發症中存在逐漸增加的改良或部 刀減辁，或存在病況惡化或擴展的抑制（穩定一或多種症 I05723.doc -68- 137721.2 狀或併發症）時，則達成滿意的臨床終點。 “在’、中改良為想要的結果（如提供如本文中所提出之客 觀=主觀欢盈用於流行性感冒病毒之病患的預防性或治療 “ ’口療)之本發明方法申’抗體可以足夠或有效劑量投 . 藥]如本文_所使用，”足夠劑量”或，，有效劑量"係指以單 ‘ d里或夕^里、單獨或與—或多種其它治療、治療法或治 療月丨(例如藥物)組合在具有任意可量測或可偵測程度之給 定病患中或對於任意持續時間（例如分鐘、小時、天、 月、年或經治癒）而言提供長期或短期可偵測反應、想要 的結果或有利效果之數量。 足夠劑量或有效劑量可（但不必）以單獨投藥提供且可（但 不必)單獨或與另-化合物、藥劑、治療或治療法組合投 藥。此外，若以單劑量或多劑量給藥而無第二化合物、藥 劑、治療或治療法則足夠劑量或有效劑量不必為足夠或有 效’原因是多於或超過該等劑量之額外劑量、數量或持續 φ 時間或額外藥物、藥劑、治療或治療法可包括於其中以在 給定病患中為有效或足夠。另外，足夠劑量或有效劑量不 必在每一及每個經預防地或治療地治療之病患中有效，也 不必在給定組或群中之經治療病患之大多數中有效。足夠 ' 劑量或有效劑量意謂在特定病患而非在一組或—般人群中 足夠或有效。如同對該等方法而言為典型的，某些病患將 顯示出對治療方法之更多或更少反應。 適於治療之病患包括患有流行性感冒病毒感染或處於其 風險中之病患。目標病患亦包括處於與流行性感冒相關之 105723.doc -69- 1377212 症狀或併發症發展的風險中之病患。因此本發明方法商 於治療處於流行性感冒病毒感染或與流行性感冒病毒感巧 相關之併發症風險中之病患。因此包括預防方法。
••預防”及其文法變異形式意謂一根據本發明之方法，其 中在流行性感冒感染（或相關症狀）表現或發作之前接觸 投藥或活體内傳遞至病患，因此其可消除、阻礙、抑制 降低或減少流行性感冒感染之症狀發展的概率或易或性。 如本文中所提出且為此項技術中已知，預防之目標病串可 處於增加的流行性感冒感染之風險（概率或易感性）中。
處於風險-中之適於治療之病患包括曝露於具有流行性残 冒病毒之其他病患的病患’或流行性感冒病毒感染之風險 由於病毒傳染性或細胞向性、免疫學易感性（例如免疫功 能不全病患）或環境因素之改變而增加的病患。處於風險 中之適於治療之病患因此包括曝露於野外或農業環境（例 如家禽農場）中之烏的病患或處於曝露於該等鳥之風險中 的病患，該等烏可感染有流行性感冒或為流行性感冒之載 體或可未感染有流行性感冒或非流行性感冒之載體。 —2抗體可根據該等方&以單劑量或多齊丨量例如每天、 母週、每月或每年或在約i至1〇週之間或長達適當時間一 或多次投藥（例如）以減少與流行性感f病毒感染相關之一 或多種症狀或併發症之擴展、嚴重度、頻率、持續時間或 概率。劑量可視以下因素而改變：治療是否為預防性或治 療I·生的、正治療之病症或併發症之擴展、i重度、頻率、 持續時間或概率、治療直接抵抗之流行性感冒分離株/病 I05723.doc • 70- 1377212 毒株或亞型之類型、所想要的臨床終點、預先或同時治 療、病患之總的健康情況、年齡、性別或種族及熟練人員 應瞭解之其它因素。熟練人員應瞭解可影響為達成預防效 益或治療效益提供足夠劑量所需要之劑量及時序的因素。
通常，為達成治療性治療，]^2抗體將在病患曝露於流 行性感冒或與其接觸後24-：72小時内或在與病毒感染相關 之一或多種症狀發展後24_48小時内投藥。為達成預防性 療，M2抗體可在曝露於流行性感冒或與其接觸之週 (例如2-3週）内投藥^量可根據經驗確定、使用動物疾病 模^•或視It況在人類臨床試驗巾確定。初始研究劑量可基 所提出之動物研究，對於重量約30公克之小鼠而 5扠藥劑ϊ軏圍為每隻動物在約1〇_l〇〇〇 Μ之間。劑量可 根據病患之質量加以調冑，例如每公斤約10-50料、50_ 1 〇 〇 Μ· g、1 0 0 - 5 〇 〇 μ g、5 〇 〇 1 〇 η 則丄，000 ^、1-5 mg、5·10 mg、 10-20 mg、2〇·50 m 或争客 g次更夕母小時、每天、每週、每月 5母兩次、三次、四次或更多次。 投藥劑量、頻率 之杯立㈠ ^持續％間可因感染狀況或治療或療法 之4思不良副作用所指示按 及有 饮比例丨日加或減少。亦認為足夠 ^ _ --Λ ^ ., 条Μ 1、頻率或持續時間為導致 方 &療或治療法或方幸 術語”病魚”们^ 的彼等。 係$曰動物，捐受 (猿、長臂猿、大S輝、，，.，、礼動物如非人類靈長類 心農場動物(家禽如二：：、：：猴”家畜(狗及 豬）、實驗私 ""馬奶牛、山羊、綿羊、 ；I驗動物（小氣、 丁 Π 丁 昧兔、天竺鼠）及人類。病患包 I05723.doc 1377212 括動物疾病模型例如本文中所示範之流行性感冒感染之小 鼠模型。 本發明之M2多株及單株抗體（包括其經修飾之形式、變 異體及子序列/片段及编碼M2抗體之核酸）可併入醫藥組合 物中。該等醫藥組合物適用於活體内或活體外投予病患。
抗體可在投予病患之前包括於醫藥學上可接受之載劑或 賦形劑中。如本文中所使用，術語"醫藥學上可接受••及 "生理學上可接受"意謂適用於一或多種投藥途徑、活體内 傳遞或接觸之生物學上可接受之調配物，氣體、液體或固 體或其混合物。該等調配物包括與醫藥投藥或活體内接觸 或傳遞相容之溶劑（水性或非水性）、溶液（水性或非水 性）、乳液（例如水包油或油包水型）、懸浮液、糖漿、酒 劑、为散液及懸浮液介質、塗層物質、等張劑及吸收促進 劑或吸收延緩劑。水性及非水性溶劑、溶液及懸浮液可包 括懸浮劑及增稍劑。該等醫藥學上可接受之載劑包括錠劑 (包膜或未包膜）、膠囊（硬或軟）、微珠、散劑、顆粒及晶 體。補充的活性化合物(例如防腐劑、抗細菌劑、抗病毒 劑及抗真菌劑）亦可併入該等組合物中。 可將醫藥組合物調配成與特定投藥途徑相容。因此，醫 藥組σ物。括適用於藉由各種途徑投藥之載劑、稀釋劑或 賦形劑。可視情況調配組合物之用於接觸或活體内傳遞之 投藥的示範性途經包括呼吸道系統u H呼吸、插 管、肺内滴注)、口服、口腔、肺内、直腸、子宮内、皮 内、局部、皮膚、非經腸、舌下、皮下、血管内、賴内、 105723.doc -72. 1377212 關:。内、腔内、經皮、電離子透入、眼内、眼 (巴op内htha丨m,c、opUcaU、靜脈内、肌内、腺内、器官内、淋 鼻及滴注調配物通常包括活性成份（化合物或寧劑） 況與一或多種防腐劑或等張劑 物調節至與鼻黏膜相容之。H值及=:通常將該等調配 H.甘 夂寺張狀態。溶劑可僅包括 =其：為水與一或多種其它組份(例如乙醇)之混合物。
^㈤大乙㈣量為高至約7(Κ75體積％。剩餘體積可由 水或一或多種其它溶劑以各種比例組成。 適用於非經腸投藥之調配物包含活性化合物之水溶液及 非水溶液、懸浮液或乳液，其製品通常為無菌且可盥五人 所欲之接受者之血液等張。非限制性說明實例包括水、睡 水、右旋糖、果糖、乙醇、動物油、植物油或合成油。 對於經黏膜或經皮投藥（例如局部接觸）而言，醫藥組合 物中jT包括渗透劑。渗透劑為此項技術中已知且包括 如)/月潔齊卜膽汁鹽及梭鏈孢酸衍生物用於經黏膜投藥。 ^於經皮投藥而言，可將活性成份調配成如此項技術中通 书已知之氣霧劑、噴霧、軟膏、油膏、凝膠或乳霜。對於 與皮膚接觸而言’醫藥組合物通常可包括軟膏、乳霜、洗 劑、糊狀物、凝勝、喷霧、氣霧劑或油。可使用之載劑包 才士林、羊毛月曰、聚乙二醇、醇、經皮滲透促進劑及其 組合。 可將共溶劑及佐劑加至調配物中。共溶劑之非限制性實 例3有羥基或其它極性基團，例如醇類，如異丙醇；二醇 I05723.doc ⑤ •73 - 1377212 類’如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、二醇鍵；甘由& 乳伸乙基醇類及聚氧伸乙基脂肪酸g旨類。佐劑…，令 界面活性劑如大豆卵磷脂及油酸； 歹1 醇三油酸酉旨；及聚乙料嘻咬嗣。糖^曰’如山梨糖 補充的活性化合物（例如防腐劑、抗氧化劑、包 物劑及生物穩定劑之抗菌劑，如抗 4 直喆翱囷劑抗病毒劑及抗 真囷劍)亦可併入該等組合物中。因此醫藥組合物可包括
防腐劑、抗氧化劑及抗菌劑。 防腐劑可用以抑制微生物生長或提高活性成份之穩定性 2此延長醫廣調配物之存放期。適當之防腐劑為此項技術 且包括（例如）EDTA、EGTA、潔爾滅（benzalkonium 加〇响或苯甲酸或苯甲酸鹽如苯f酸納。抗氧化劑包括 ⑼壞血I維生素A、維生素£、生育盼及相似維生 素或維生素原。 抗菌劑或化合物直接或間接抑制、減少、延緩、中斷、 肖除彳τ止壓製或阻礙党病原性或非病原性微生物體的 污染或病原性或非病原性微生物體之生長、傳染、複製、 增殖、繁殖。抗菌劑之種類包括抗細菌劑、抗病毒劑、抗 真菌劑及抗寄生蟲劑。抗菌劑包括殺滅或破壞（殺害）或抑 制（干擾）焚微生物體的污染或微生物體之生長、傳染、複 製、增殖、繁殖之藥劑及化合物。 示範丨生抗，‘田菌劑（抗生素）包括青黴素（penicillin)(例如青 徵素G、氨节西林（ampicilHn) '二甲氧苯青黴素 (methlClHin)、苯甲異噁哇青黴素（oxacillin)及阿莫西林 I05723.doc •74· ⑤ 1377212 (amoxici丨lin))、頭抱菌素（cephalosporin)(例如頭抱經胺节 (cefadroxil)、頭抱雷特（ceforanid)、頭孢0ί 肪（cefotaxime) 及頭抱曲松（ceftriaxone))、四環素（tetracycline)(例如強力 黴素（doxycycline)、氣四環素（chlortetracycline)、二甲胺 四環素（minocycline)及四環素（tetracycline))、胺基糖苷（例 如胺基經丁基卡那黴素（amikacin)、慶大黴素 (gentamycin)、卡那徽素（kanamycin)、新黴素
(neomycin)、鏈黴素（streptomycin)、奈替米星 (netilmicin) 巴龍徽素（paromomycin)及托普黴素 (tobramycin))、大環内醋（例如阿奇黴素（azithr〇mycin)、克 拉徽素（clarithromycin)及紅黴素（erythromycin))、氟啥諾 酮（flu〇r〇quin〇l〇ne)(例如環丙沙星（c丨pr〇fl〇xacin)、洛美沙 星（lomefloxacin)及諾氟沙星（n〇rn〇xacin))及其它抗生素包 括氣黴素（chloramphenicol)、氣林可黴素（cHndamycin)、 環絲胺酸、異煙肼、利福平（rifampin)、萬古黴素
(犠comycin)、胺曲南（aztre〇nam)、克拉維酸（cUvuUnic acid)、伊米配能（imipenem)、多黏菌素（p〇lymyxin)、桿菌 肽（bacitracin)兩性黴素（amphotericin)及制黴菌素 (nystatin) ° 抗病毒劑之特定非限制性種類包括逆轉錄酶抑制劑； 白酶抑制劑；嶋酶抑制劑；糖或骑蛋白合成抑制劑 結構蛋白合成抑制劑；…似物；及病毒成熟抑制倒 抗病毒劑之特定非限制性實例包括奈韋拉平（nevirapine 地拉韋定（ — di吟依法韋倫（‘γ叫、沙 I05723.doc ⑤ -75. 1377212
(saquinavir)、利托那韋（rit〇navir)、茚地那韋（indinavir)、 奈非那韋（nelfinavir)、安普那韋（amprenavir)、齊多夫定 (zidovudine)(AZT)、司他夫定（stavudine)(d4T)、拉米夫定 (larnivudine)(3TC)、去經肌苦（didanosine)(DDI)、紮西他 濱（zalcitabine)(ddC)、阿巴卡韋（abacavir)、阿昔洛韋 (acyclovir)、噴昔洛韋（penciclovir)、伐西洛韋 (valacyclovir)、更昔洛韋（ganciclovir)、1，-0-°夫 °南核糖基-1，2,4-三唑-3羧醯胺、9->2-羥基-乙氧基甲基鳥嘌呤、金剛 烧胺、5-埃-2 ^脫氧尿皆、三氟胸芽、干擾素及腺嗓+阿 拉伯糖苷。-
適用於本發明之組合物及方法的醫藥調配物及傳遞系統 為此項技術中已知（參見例如Remington: The Sc丨ence and Practice of Pharmacy (2003)第 20版，Mack Publishing Co. · Easton，PA ； Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)第 18版，Mack Publishing Co.，Easton，PA ; The Merck Index (1996)第 12 版，Merck Publishing Group， Whitehouse > NJ ； Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms ( 1993) > Technonic Publishing Co.，Inc.， Lancaster ， Pa. ； Ansel 及 Stoklosa ， Pharmaceutical
Calculations (2001)第 11 版，Lippincott Williams & Wilkins，Baltimore，MD ;及 Poznansky 等人，Drug Delivery Systems (1980) > R. L· Juliano 編，Oxford， N.Y.，第 253-3 1 5 頁）。 為易於投藥及劑量之均一性，可將抗體及其醫藥組合物 105723.doc •76· ⑤ 包裴於單位劑型（膠囊、口 3鍵、扁膠劑、含片或錠劑） r。如本文令所使用， 彳d 1係指適合作為整體劑量用 於待&療之病患的物理上 ..ga ^ 雕欺之早位，母一單位含有視情 况與4樂载劑（賦形劑、稀 — 褅釋劑、媒劑或填充劑）締合之預 疋數置的活性成份，冬 田 或夕種劑量投藥時預測產生想 果·(例如預防或治療效果）。單位劑型亦包括（例如） 及J瓶’其可包括冷来乾燥或康乾狀態之組合物；蛊
困液體載劑（例如）可在投藥或活體内傳遞之前加入。單位 劑型額：地包括(例如)具有液體組合物置於其中之安親及 ^瓦。早位谢型進一步包括用於經皮投藥之組合物，如適 。於保持與σ人所欲之接受者的表皮接觸達經延長或短暫 ^門&之貼片。個別單位劑型可包括於多劑量套組或容 ::中4易於杈藥及劑量之均一性可將醫藥調配物包裝於 單一或多個單位劑型中。 本七月提仏包含包裝於適當包裝材料中的M2抗體、編 碼M2抗體之核酸及其醫藥調配物之套組。套組通常包括 私籤或包括5玄等組份之描述或本文中之該等組份之活體 外、活體内或活體外使用說明書之包裝插頁。套組可含有 σ亥等、’且h例如單獨或與抗病毒齊|或藥物組合之兩種或兩種 以上人類M2抗體的集合。 術語"包裝材料”係指包裹套組之組份的物理構造。包裝 材料可保持組份無菌且可由通常用於該等目的之材料（例 如紙、波紋織維、玻璃、塑料、羯、安瓶、小瓶、管等） 製得。 I05723.doc 77· /ζιζ ' 括知織或插頁。標籤或插頁包括》印 刷品"例如紙或紙板，Α p 合）八、次’…且伤、套組或包裝材料（例如 ,，戈附者於含有套組組份之安瓿、管或小 瓶。標籤或插頁可額外地包 一 軟碟、硬碟，)、光： 碟(例如 磲）先碟如 CD-或 DVD-ROM/RAM、 P3磁可或電子儲存媒體（如RAM及R〇M)^哕等 之混：物(如磁/光储存媒體、几梅媒體或記憶型卡二 標籤或插頁可# # 4gt μ I i 貝』匕括鑑別本文中一或多種組份、劑量、活 I·生成伤之床樂理學(包括作用機制、藥物動力學及藥效 學)之資訊。-標籤或插頁可包括鑑別製造商資訊、批號、 製造商地址及日期之資訊。 標籤_頁可包括關於套組組份可心之病況、病症或 疾病之貝。fl。&籤或插頁可包括對於臨床醫生或病患在一 方法或治療方案或治療法中使用一或多種套組組份之說明 θ °兒月書可包括劑量、頻率或持續時間，及用於實施本 文所述任思方4、治療方案或治療法之說明：示範性說明 =女本文中所k出或此項技術中已知之用於治療流行 性=冒感染的說明書。因此本發明之套組可額外地包括用 於實施本文中所描述之任意本發明方法（包括治療、偵 測、監控或診斷方法）的標籤或說明書。因此（例如）套組可 包括具有如本文中所提出之一或多種抗流行性感冒活性的 人類M2抗體以及在本發明之治療方法中投予抗體的說明 書。 標籤或插頁可包括關於組份可提供之任意效益（如預防 '05723.doc -78 · 1377212 效ϋ或治療效益）之資句 p黎—4 一 ^ 貝讯払氧或插頁可包括關於潛在的 不利副作用之資訊，如告誠病患或臨床醫生何處使用特定 組合物為不合適之有關情況。當病患已經、將要或正在服 用-或多種可與該組合物不相容之其它藥物或病患已經、 W要或正在經受與組合物不相容之另—治療方案或治療法 時亦可發生不利副作用，且因此說明書可包括關於該等不 相容性之資訊。 本發明套組可額外地包括生長培養基（例如用於產生Μ 2 抗體之細胞株）、緩衝劑或防腐劑或穩定劑於含有人類、 人源化或嵌-合M2抗體之醫藥調配物中。套組之每一組份 可封閉於各別容器内且所有各種容器可在單個包裝内。可 將本發明之套組设計為用於冷藏。可將本發明套組進一步 设计為含有產生人類、人源化或嵌合]^2抗體之融合瘤或 其匕伯主細胞（例如CH〇細胞）。套組中之該等細胞可在適 當儲存條件下保存直至準備使用該等細胞。例如，包括一 ^ 或多種融合瘤或其它細胞之套組可含有適當之細胞儲存介 ㊂（例如10-20% DMSO於組織培養生長培養基如DMEM、 α-ΜΕΜ等中）因此可使該等細胞融化及生長。 本發明之人類、人源化及嵌合M2抗體適用於分離、偵 測或純化M2多肽。該等方法包括使懷疑含有Μ2(於溶液 中、於固相、活體外或活體内、或於一完整細胞或生物體 内）之樣本與M2抗體在允許結合及偵測M2存在或純化經結 合M2蛋白質的條件下接觸。 因此本發明亦提供在測試樣本中偵測Μ2或流行性感冒 105723.doc •79· 病毒之方法。在一眘夂钇/Xl rU 貫&例中’方法包括使含有或懷疑含有 M2或流行性感冒病表夕样士 病甘之樣本與人類M2抗體在允許偵測樣 本中之M2的條件下㈣及測定M2是否存在於該測試樣本 中M2或"“丁性感冒病毒之債測可藉由習知方法如免疫 沈漏I、西方墨點法、勞游細敏 充疫組織化學染色法或流式細胞儀及 ELIS A進行。 Μ 2及流行性威罝、忘主μ a目病毋價測方法適用於診斷方案中用於 偵測M2及"“了性感冒病毒。例如當流行性感冒病毒之增 加或降低的3里與流行性感冒感染之發展、擴展或消退相 關：’本發-明抗體可用以偵測Μ2或流行性感冒病毒中之 任心增加或降低。*匕外，當想要在降低Μ。或流行性感冒 病毋3里之冶療法之後監控Μ2或流行性感冒病毒的含量 日寸，本發明坑體可用以在治療之前、過程中或之後在長時 間或短時間内偵測Μ 2或流行性感冒病毒含量之該增加或 降低。 因此本發明亦提供用於偵測病患（含有生物流體、細胞 或組織或器官樣本如活組織檢查）之測試樣本中M2或流行 I·生感目病毒之存在的方法。在一實施例中，方法包括使獲 自病患之含有或懷疑含有Μ2或流行性感冒病毒之樣本與 人颏M2或流行性感冒病毒抗體在允許偵測Μ2或流行性感 冒病毒的條件下接觸及測定M2或流行性感冒病毒是否存 在於來自病患之測試樣本中。 人連、人源化及欲合M2抗體亦可用以監控m2或流行性 感_病毒之存在從而用於病患之診斷或跟蹤治療，或用以 I05723.doc 1377212 里測病患中M2之活體内含量。例如，使懷疑含有M2或流 行性感冒病秦之唾液與如上所述之M2抗體在允許結合發 生的條件下培養，偵測M2或流行性感冒病毒之存在。 除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術 。。具有本發明所屬之此項技術t 一般技術者通常理解的相 同s義。儘會相似或相當於本文中所描述之方法及材料可
用於本發明之實務或測試中，然而適當之方法及.材料描述 於本文中。 本文中所引用之所有申請案、公告、專利及其它參照 案、GenBa吆引文&ATCc引文的全文以引用的方式併入本 文中。在衝突情況中，專利說明書（包括定義）將控制。 如本文中所使用，除非文中另外清楚地說明，否則單數 形I式，'及"該"包括複數個對象。因此，例如，對" 體之。主釋包括複數個該等抗體且對”抗流行性感冒活性或
月匕之主釋可包括對一或多種活性或功能之註釋，等等 諸如此類。 本文中所使用，除非文中另外清楚地說明，否則所有 數值或數字㈣包括在該等範圍内之整數及在範圍内之值 或王數之分數。因此，例如，對90-100%之範圍之註釋包 括 91%、92%、93%、94%、95。/。、96%、97% 等以及 91.1%、91.2%、9,.3%、914%、915% 等、921%、 92.2%、92.3%、92.4〇/〇、92 5〇/笙埜 h 2 ·5 /°等，荨等諸如此類。 通常使用肯定語言在本文中揭示本發明以描述大量實施 例。本發明亦具體包括其中全部或部分排除特定標的物如 I05723.doc 1377212 物質或材料、方法步驟及條件、方案、 bh ^ X , π #王序、檢定或分析 的貝她例。因此，即使就本發明所 匕括之而S本發明通 承未表現於本文中，然而未明顧地 仍揭示於本文中。 ㈣地包括於本發明中之態樣 已描述本發明之大量實施例。然而，應瞭解可做出不脫 離本發明之實質及範相各種修改H以下實例係用 以說明而非限”請專利範圍中所述之本發明之範脅。
實例 實例1 此實例描述各種材料及方法。 肽合成及肽-BSA結合物之生成：M2(SEq ID N〇:2 ’表 4)及 M2SG(SEQ ID N0:3，表 4)肽係由 a & A Labs LLC(San Diego’ CA)合成。每一肽之純度藉由HpL(：測定為超過 95%。列為SEQ ID N0:2之序列（M2)為許多流行性感冒八病 毒株中所見之流行性感冒病毒基質M2蛋白質的細胞外23-胺基酸肽之典型序列。根據製造商之說明書li由EDC結合 套組（PIERCE Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)使該等 兩種狀結合至牛血清白蛋白（BSA，Sigma，St. Louis， MO)。結合BS A之M2及M2SG肽用於使小鼠免疫》
用於人類坑M2抗體之抗原決定部位測定及結合特異性 研究的肽之胺基酸序列係列於表4及表7中。基於列於基因 庫（GenBank)資料庫中的變異流行性感冒A病毒株中所鑑別 之M2變異蛋白質之序列資訊，設計用於分析結合特異性 之M2變異肽類似物》M2類似肽及經截短之M2肽係藉由A 105723.doc -82- 1377212 & A Labs LLC(San Diego，CA)合成。 小鼠：包含含有人類免疫球蛋白區之人類染色體片段的 人類轉染色體小鼠（WO 02/43478、WO 02/092812、Ishida 及 Lonberg，IBC's 11th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2000);及 Kataoka，S. IBC's 13th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2002))為購自 Kirin Brewery Co.，Ltd.(Japan)。C57BL/6J小鼠為購自位於Bar Harbor， ME之 Jackson Laboratories 0
免疫：將M2-BSA及M2SG_BSA(1 : 1比例於PBS(磷酸鹽 緩衝鹽水，-GIBCO BRL，Rockville，MD)中）與相等體積 的完全福氏佐劑（CFA)(Sigma，St. Louis，MO)混合且製備 乳液。以20 gg的在CFA中之混合物以皮下方式使小鼠免疫 並在第21天以相同數量的在不完全福氏佐劑（IFA)(Sigma， St· Louis，MO)中之M2-BSA與M2SG-BSA的混合物皮下使 小鼠加強免疫，並隨後在第42天以RIBI(Corixa， Hamilton，MT)第3次腹腔内注射。在融合前3天進行最後 的1〇 Mg的無佐劑之M2肽之腹腔内及靜脈内注射。 ELISA :抗體滴度及抗體特異性以及藉由融合瘤產生之 抗體為藉由ELISA測定。簡言之，將50 μΐ的以碳酸鹽緩衝 液（pH 9.6)溶解之濃度為1 gg/ml之M2-BSA或M2肽塗在96-孔平底板（Nunc，Denmark)上在4。(：下隔夜或在37°C下歷經 1小時。在以PBS/0.1% Tween 20洗滌2次之後，在37°C下使 板充滿 PBS/l% BSA(Sigma，St. Louis，MO)歷時 30 min ，將抗體或血清加至孔中並在37°C下將該等板培養1 105723.doc -83 - (5) 1377212 小時。洗滌4次後，將經稀釋之HRP結合之山羊抗人類免 疫球蛋白γ鍵特異抗體（Jackson Immunoresearch
Laboratory，West Grove，PA)加至孔中並在 37°C 下培養 1 小時。洗滌4次後，加入TMB底物溶液（DAKO，CA)並在 室溫下培養30 min。藉由微定量盤式讀數器在450 nm下量 測光密度。
同型ELISA :藉由融合瘤產生之抗體的同型係藉由 ELISA測定。簡言之’將50 μΐ的以碳酸鹽緩衝液（pH 9.6) 溶解之濃度為1 pg/ml之M2-BSA或M2肽塗在96-孔平底板 (Nunc，Denmark)上在4°C下隔夜或在37°C下歷經1小時。 在以PBS/0.1°/〇 Tween 20洗蘇2次之後，在室溫下使板充滿 PBS/1% BSA(Sigma，St. Louis，MO)歷時 1 小時，將抗體 加至孔中並在室溫下將該等板培養1小時。洗滌3次後，將 任一經稀釋之HRP結合之小鼠抗人類4〇丨' IgG2、IgG3& IgG4重鍵偵測抗體（Zymed，San Francisco，CA)加至孔中 並在室溫下培養1小時。洗滌3次後，加入TMB底物溶液 (DAKO，CA)並在室溫下培養30 min。藉由微定量盤式讀 數器在450 nm下量測光密度。 基於感染流行性感冒A病毒之細胞的ELISA :將在含有 1%非必需胺基酸、2 mM L-麩醯胺酸、100 U/ml青黴素及 100 pg/ml硫酸鏈黴素、1 mM丙酮酸鈉之 MEM(cMEM)(InVitrogen，Carlsbad，CA)中之濃度為 1 ·5χ105個細胞/mL之MDCK細胞（Madin-Darby犬腎上皮細 胞；ATCC，Rockville，MD)塗於96-孔平底板（Falcon®)中 105723.doc -84- ⑤ 1377212
且每孔150 μΐ並在7% C02下培養48小時。48小時後以PBS 將該板洗滌兩次並採用定期旋渦以30 μΐ的10倍TCID50流 行性感冒 Α 病毒（A/PR/8/34 或 Α/ΗΚ/1/68 ; ATCC， Rockville，MD)在室溫下感染該板30分鐘。感染後，以 PBS洗滌該板1次並加入1 50 μΐ的在最低必須培養基 (Invitrogen Corp，CA)中之 1 pg/mL胰蛋白酶（經 TPCK處 理 ’ Worthington，Biochem. Corp.)並將該板培養27小時。 感染後，將細胞單層以PBS/1% FCS(GIBCO BRL， Rockvme ’ MD)洗滌3次並在室溫下使其充滿PBS/1% BSA/ 5% FCS歷經30 min。將抗體稀釋並在每一孔中加入5〇 μ1 並在室溫下培養45 min。洗滌4次後，將HRP結合之兔抗人 類免疫球蛋白Ύ鏈抗體（DAKO，Denmark)稀釋1 : 3000並在 每一孔中加入50 μΐ並在室溫下培養該板3〇 min。洗滌5次 後，加入100 μΐ的含有1 mM左旋σ米嗤（Levamisole)溶液 (Vector Laboratories lnc_ Burlingame，CA)tTMB 底物
(DAKO，Denmark)並在室溫下培養該等板15 min。將5〇 μ1 的上清液轉移至含有100 μΐ終止溶液（1Ν H2S04)之新的96-孔板（Nimc ’ Denmark)並藉由微定量盤式讀數器在45〇 nm 下f測光密度（OD)。如前述（SeUe等人，Nature 328:395 (1987))計算每一抗體之EC5p解離常數（Kd)定義為使受 A/PR/8/34或A/HK/1/68感染2MDCK細胞表面上之M2抗原 上之半（50%)結合位點飽和所需要的抗體濃度。 基於感染流行性感冒A病毒之細胞中之肽競爭的 ELISA ··如上所述製備感染病毒iMDCK細胞。將M2肽與 105723.doc -85· ⑧ 1377212
抗M2抗體混合並在室溫下培養30 min。培養後，將50 μΐ 的肽與抗體之混合物加入細胞中並在室溫下培養30 min。 洗滌4次後，將HRP結合之兔抗人類免疫球蛋白γ鏈抗體 (DAKO，Denmark)稀釋1 : 3000並在每一孑L中力口入50 μΐ並 在室溫下培養該板30 min。洗滌5次後，加入100 μΐ的含有 1 mM 左旋味嗤溶液（Vector Laboratories Inc. Burlingame，CA)之 TMB 底物（DAKO，Denmark)並在室溫 下培養該等板15 min。將50 μΐ的上清液轉移至含有100 μΐ 終止溶液（IN H2SO4)之新的96-孔板（Nunc，Denmark)並藉 由微定量盤-式讀數器在450 nm下量測光密度。
融合瘤製備：選擇具有最高抗體滴度之小鼠用於製備單 株抗體。採集脾並採用50% PEG(Boehringer Mannheim， Indianapolis，IN)使單細胞懸浮液與骨髓瘤細胞株（8?2/0-Ag 14)(ATCC，Rockville，MD)按 3 : 1 比例融合。使融合物 在最佳密度下塗於96-孔板上並在完全RPMI-10培養基 (RPMI 1640以及10% FCS、1%非必需胺基酸、2 mM L-麩 醯胺酸、5 0 μΜ 2-ME、100 U/ml 青黴素及 100 pg/ml 硫 酸鏈黴素）中在5% C02、3 7°C培養箱中培養。藉由ELISA 篩選每一融合物之約2000個融合瘤生長孔。將陽性結合於 M2肽之細胞轉移至24孔板並進行4輪限制性稀釋以獲得單 株抗體。藉由基於感染流行性感冒A病毒之細胞的ELISA 進一步確定抗M2單株抗體。 抗體純化：為進行抗體純化，使融合瘤與融合瘤-SFM(GIBCO BRL ， Rockville ， MD)在 Integra 系統 105723.doc -86- ⑤ 1377212
(INTEGRA Bioscience，Inc. Ijamsville，MD)中培養。使 用蛋白質A-瓊脂糖快速流動凝膠（Amersham Pharmacia Cat#17-0618-02，Uppsala，Sweden)自培養基純化人類單 株抗體。簡言之，將含有對於柱容量而言適當數量抗體之 經調節培養基以0.22 μιη盤式過遽器（Minisarto-plus， Sartorius Cat#17822，Gettingen，Germany)過濾並裝至以 磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)平衡之2.0 ml蛋白質Α·瓊脂糖快速流 動柱上。以超過40 ml的PBS洗滌該柱並以pH 3.6之0.1 Μ Gly-HCM、0.15 M NaCl溶離抗體。在初始1.0 ml溶離緩衝 液通過之後-，以5.0 ml/管之體積收集3個單獨的溶離部分 並立即以250 μΐ的pH 8.0之1 M Tris-HCl中和。重複此純化 程序直至所有經調節之培養基經處理。以人類IgG-特異性 ELISA測定抗體濃度並混合所有含有抗體之部分並以離心 濃縮器（Vivaspin 20，30,000 MWCO : Sartorius Cat#VS2022， Gettingen，Germany)濃縮。
為移除熱原質，使經濃縮之樣本緩衝交換於pH 6.6之20 mM磷酸鈉中並裝至0.5 ml以相同緩衝液平衡之SP-瓊脂糖 HP柱（Amersham Pharmacia，Cat#17-1087-01，Uppsala， Sweden)上。藉由首先使樣本通過串聯連接於SP-瓊脂糖HP 柱之2 ml Q-填脂糖快速流動柱（Amersham Pharmacia， Cat#17-0510-01，Uppsala，Sweden)來移除熱原質。實施 後，移除Q-瓊脂糖快速流動柱並以範圍為〇至0.5 Μ氣化鈉 的線性梯度溶離抗體。在280 nm下偵測抗體並將含有抗體 之部分混合。樣本以離心濃縮器濃縮並藉由使用NAP25脫 105723.doc -87- ⑤ 1377212 鹽柱（Amersham Pharmacia，Cat#17-0852-02，Uppsala， Sweden)緩衝交換於PBS中。藉由人類1gG特異性^18八確 定抗體濃度之數量。根據鱟變形細胞溶菌液（Limulus
Amebocyte Lysate)(LAL)檢定（Associates of Cape Cod’
Inc.，Falmouth，MA)，樣本之熱原質含罝經測疋為小於 0.13 EU/mg蛋白質。
人類抗M2抗體（Z3)基因之分離：藉由離心作用收集產生 Z3抗體（同型：IgG3)之經培養的融合瘤細胞（113Z-3)。按 製造商之說明書使用RNeasy套組（QIAGEN Inc. ’ Valencia，CA)自該等細胞純化總RNA(140叫）。SMART RACE cDNA擴增套組（Clontech Co·，Ltd.，Palo Alto， C A)用於自作為來源之融合瘤細胞的總RNA選殖免疫球蛋 白基因之可變區之cDNA。簡言之，藉由逆轉錄酶自2微克 的RNA製備第一鏈cDNA。將此cDNA用作模板用於聚合酶 鏈反應（PCR)以擴增含有前導序列之重鏈及輕鏈的可變區 及一部分恆定區（分別為Hv及Lv)。反應如下：2.5 U KOD-Plus-DNA 聚合酶（TOYOBO，Tokyo，Japan) ; 0.2 μΜ 引子 用於一端（用於重鏈：IgGlp，用於輕鏈：LCR276，參見 表2) ; IX通用引子混合物A用於另一端（UMP引子混合物A 連接於SMART RACE套組）；每一 dNTP混合物200 μΜ ; 1 mM MgS〇4 ; KOD-Plus-緩衝液（最終漢度為lx);及cDNA 模板。 熱循環程式為94°C5分鐘，及隨後94°C5秒及68°C10秒以 及在72°C下延伸3 min之30個循環。在乙醇沈澱及隨後的 I05723.doc -88- ⑤ 1377212 瓊脂糖凝膠電泳之後收集經擴增之DNA片段，並藉由 QIAquick凝膠萃取套組（Qiagen Co.，Ltd. ’ Germany)純 化。使用 Zero B丨unt TOPO PCR 選殖套組（Invitrogen， Carlsbad，CA)將Hv及Lv之經純化DNA片段整合於PCR 4 Blunt-TOPO載體中，並將每一構建質體轉化入大腸埃希氏 菌（E. coli)並隨後選殖。使用特異性引子（Hv : M13F、 M13R及 hh-4，Lv : M13F、M13R及 LCR88，參見表 2)分析 構建質體中每一插入物（Hv及Lv)的核苷酸序列。
分別來自8個獨立純系之Hv與Lv之核苷酸序列為完全相 同。基於獲-自Lv之序列，設計募核苷酸引子、Z3LP5BGL 及Z3LP3ERI(表2)。藉由PCR使用第一鏈cDNA作為模板， Z3LP5BGL及Z3LP3ERI作為弓丨子以及KOD -Plus· DNA聚合 酶獲得包括可變區與恆定區之編碼全長ORF之輕鏈cDNA 序列（Lvc)。Hv及Lv之核苷酸及胺基酸序列顯示如下。
Z3重鏈可變區（Hv)之cDNA之核苷酸序列（自起始密碼子 (ATG)至可變區之末端）- ATGGACTGGA CCTGG AGCAT CCTTTTCTTG GTGGCAGCAG CAACAGGTGC CCACTCCCAG 60 GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC 120 TGCA AGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC TATGGTATCA GCTGGGTGCG ACAGGCCCCT 180 GG ACAAGGGC TTGAGTGG AT GGG ATGG ATC AGCGCTTACA ATGGTAACAC AAACTATGCA 240 CAGAAGCTCC AGGGCAGAGT CACCATGACC ACAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG 300 GAGCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG GGCAGCAGCT 360 GGCGGATACT TCCAGCACTG GGGCCAGGGC ACCCTGGTCA CCGTCTCCTC A 411 (SEQ ID NO:32) Z3輕鏈可變區及恆定區（Lvc)之cDNA之核苷酸序列（自起 I05723.doc -89- ⑤ 1377212 始密碼子（ATG)至恆定區（下劃線）之末端）-
ATGGCCAGCT TCCCTCTCCT CCTCACCCTC CTCACTCACT GTGCAGGGTC CTGGGCCCAG 60 TCTGTGCTGA CTCAGCCACC CTCAGCGTCT GGGACCCCCG GGCAGAGGGT CACCATCTCT 120 TGTTCTGG AA GC AACTCCAA CATCGG AAGT AAAACTGTAA ACTGGTACCA GCAGCTCCCA180 GGAACGGCCC CCAAACTCCT CATCTCTAGT AATAATCAGC GGCCCTCAGG GGTCCCTGAC 240 CG ATTCTCTG GCTCCAAGTC TGGCACCTCA GCCTCCCTGG CCATCAGTGG GCTCCAGTCT 300 GAGGATGAGG CTGATTATTA CTGTGCAGCATGGGATGACA GCCTGAATGG TGTGGTAITC 360 GGCGGAGGGA CCAAGCTGAC CGTCCTAGGT CAGCCCAAGG CTGCCCCCTC GGTCACTCTG 420 TTCCCACCCT CCTCTG AGG A GCTTCAAGCC AAC AAGGCC A C ACTGGTGTG TCTCATAAGT 480 G ACTTCTACC CGGGAGCCGT GACAGTGGCC TGGAAGGCAG ATAGCAGCCC CGTCAAGGCG 540 GG AGTGGAGA CCACCACACC CTCCAAACAA AGCAACAACA AGTACGCGGC CAGCAGCTAC 600 CTG AGCCTG A CGCCTG AGCA GTGG AAGTCC CACAAAAGCT ACAGCTGCCA GGTCACGCAT 660 G A AGGG AGCA CCGTGG AG AA GACAGTGGCC CCTAC AGAAT GTTCATAG 708 (SEQ ID NO:33) Z3重鏈可變區（Hv)之cDNA之胺基酸序列（前導序列（粗 體）及可變區）-
MDWTWSILFL VAAATGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTS YGISWVRQAP 60 GQGLEWMGWI SAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYM ELRSLRSDDTAVYYCARAAA120 GGYFQHWGQGTLVTVSS 137 (SEQ IDN0:34) Z3輕鏈可變區及恆定區（Lvc)之cDNA之胺基酸序列（前導 序列（粗體）、可變區及恆定區（下劃線））-
MASFPLLLTL LTHCAGSWAQ SVLTQPPSAS GTPGQRVTIS CSGSNSNIGS KTVNWYQQLP60 GTAPKLLISS NNQRPSGVPD RFSGSKSGTS ASLAISGLQS EDEADYYCAA WDDSLNGVW 120 GGGTKLTVLG QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA180 GVETTTPSKQ SNNKYAASSY LSLTPEQWKS HKSYSCQVTH EGSTVEKTVA PTECS 235 (SEQ ID •90 · I05723.doc 1377212 NO:35) 同型改變之人類抗M2抗體（乙3-4〇1型）之表現載體的產 生：構建IgG,同型交換之Z3抗體（原始同型為Ig(j3)之表現 載體。簡s之，分別設計含有5'-BglII及3'-EcoRI限制性酶
敏感突出位點（overhang site)之寡核苷酸引子Z3LP5BGL及 Z3LP3ERI(表2)以藉由PCR擴增輕鏈（lvc)之全長。使用第 一鏈cDNA作為模板，Z3LP5BGL及Z3LP3ERI作為引子以 及KOD —Plus- DNA聚合酶進行PCRe藉由BgUI及以❹則消 化PCR產物之後，將718_bp片段次選殖於以Bgm及 EcoRI(8.6 kb(千鹼基）DNA片段）預先消化之表現載體 (IDEC Pharmaceuticals，San Diego > CA > N5KG1-Val Lark(N5KG丨之經修飾之載體，美國專利第6,〇〇1，358號）) 中。分析經分離之構造（N5L3G1-Z3_LF)之插入物的核普 酸序列，並測定輕鏈（Lvc)之全長〇RF之存在》插入物 (Lvc)之DNA序列與Z3之輕鏈可變區序列（Lv)及人類人免疫 球蛋白輕鏈恆定區IGLC3(基因庫入藏登記（GenBank Accession)NG_000002 :染色體22上之智人免疫球蛋白λ基 因座）相同。 作為第2步，將Ην插入N5L3G1-Z3_LF DNA載體中，具 體如下：DNA載體藉由兩種DNA限制性酶Nhel及Sail消 化’並隨後去磷酸化。分離9.2千鹼基DNA片段（片段A)。 與輕鏈構造相似’設計用於Hv之PCR的引子使之具有針對 Ην之兩端内之該等限制性酶的敏感區。引子為Z3hp5SAL 及Ζ3ΗΡ3ΝΗΕ(表2)，並將Ην之構造質體用作模板。將Ην I05723.doc ⑤ 1377212 之經純化PCR擴增產物次選殖於pGEM®-T Easy載體系統 申。確定經次選殖構造内之插入物的核苷酸序列。藉由兩 種限制性酶Nhel及Sail消化質體DNA，並分離0.44千鹼基 DNA插入物（片段B)並在瓊脂糖凝膠電泳後將其純化。
採用T4 DNA連接酶將兩種DNA片段A及B連接，並將經 連接之構造（N5LG1_M2_Z3)電穿孔進入大腸埃希氏菌ΔΗ5 菌株中以產生轉化體。選擇陽性大腸埃希氏菌轉化體。純 化此表現載體並使用特異性引子（SEQ ID ΝΟ··46-49，表2) 確定Lvc與Ην區之核苷酸序列。在該過程中未引入突變。 將Z3G1之-重鏈之全長ORF的核苷酸及胺基酸序列說明如 下。Z3G1之輕鏈之全長ORF的核苷酸及胺基酸序列為與上 述Ζ3之Lvc之彼等相同。 Z3G 1重鏈可變區及恆定區之cDNA之核苷酸序列（自起始 密碼子（ATG)至恆定區（下劃線）之末端）-
ATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGC
AGCAACAGGTGCCCACTCCCAGGTTCAGCTGGTGCAGT
CTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAG
GTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATG
GTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTG
AGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAACACAA
ACTATGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCA
CAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGG
AGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCG
AGGGCAGCAGCTGGCGGATACTTCCAGCACTGGGGCCA I05723.doc -92- ⑤ 1377212
GGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG
GCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAG
CACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGT
CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG
GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT
CCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC
AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGC
ACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA
GCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAAT
CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGC
ACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC
CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGA
CCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC
ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGA
CGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG
CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC
AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCC
CAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG
GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA
TCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG
ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCG
CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACA
ACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGG I05723.doc -93 · 1377212 CTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO:36) Z3G1重鏈可變區及恆定區之cDNA之胺基酸序列（前導序 列（粗體）、可變區及恆定區（下劃線）)-
MDWTWSILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASV KVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGN TNYAQKLQGRYTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCA RAAAGGYFQHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO:37) 105723.doc -94- ⑤ 1377212 表1:合成之 DNA 引子（SEQIDNOS:38-51) 编號 名稱 序列5'至3' 長度 (SEQID NO:38) IgGlp TCITGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG 31-mer (SEQ ID NO:39) LCR276 GGGGCCACTGTCTTCTCCACGGTGCTC 27-mer (SEQID N〇:40) hh-4 GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG 23-mer (SEQID NO:41) LCR88 CACGGCTCCCGGGTAGAAGTCACT 24-mer (SEQ ID NO:42) M13F GTAAAACGACGGCCAGTG 18-mer (SEQ ID NO:43) MI3R CAGGAAACAGCTATGAC 17-mer (SEQ ID NO:44) Z3HP5SAL AGAGAGAGAGGTCGACCCAC CATGGACTGG ACCTGGAGCA TCCTTTT 47-mer (SEQID NO:45) Z3HP3NHE GAGAGAGAGG CTAGCTGAGG AGACGGTGAC CAGGGTG 37-mer (SEQ ID NO:46) Z3LP5BGL AGAGAGAGAG ATCTCACCAT GGCCAGCTTC CCTCTCCTCCT 41-mer (SEQID NO:47) Z3LP3ERI AGAGAGAGAGGAATTCCTATGAACATTCTGTA GGGGCCACTGTC 44-mer (SEQ ID NO:48) SEQU1783 GGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA 27-mer (SEQ ID NO:49) SEQU4618 TCTATATAAGCAGAGCTGGGTACGTCC 27-mer (SEQ ID NO:50) IgG2pG134 TGCACGCCGCTGGTCAGGGCGCCTGAGTTCC 31-mer (SEQ ID NO:51) LC3F81 TCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGC 27-mer
來自CHO細胞之重组人類抗M2抗體之製備：為製備
重組抗體，將含有抗M2抗體之N5LG1_M2_Z3載體電穿 孔進入中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞，ATCC #CRL-9096)之宿主細胞dhfr缺陷型病毒株中並自經轉染之細胞 之上清液分離重組抗體。簡言之，藉由DNA限制性酶 AscI將10微克的經純化DNA表現载體N5LG1_M2_Z3線 性化，並使用Bio Rad電穿孔儀（350 V，500 pF)將DNA 轉染於CHO細胞之4 X 106個細胞中。將經轉染之細胞接 種於96孔培養板中，並在培養基中培養採用
Geneticin(Gibco-BRL)選擇含有DNA載體之CHO細胞。 選擇幾批穩定轉染物系之後，藉由ELISA篩選高的人類 105723.doc •95- ⑤ 1377212
IgG產生者，並用於重組抗體之製備。 重組抗趙蛋白質之分離及純化：表現重組抗體之Ch〇 細胞在補充加有2 mM楚醯胺酸、1〇〇單位/mi青徵素、 100 pg/ml鏈黴素及次黃嘌呤與胸苷（HT)補充物p : 100)(Invitrogen)之不含血清的Εχ·細胞325-PE培養基 (JRH Bioscience，Co.，Ltd·)中在 5〇/〇 C02、37。(：培養箱
中培養。將20升培養物上清液用於抗體蛋白質之純化， 具體如下：將上清液施用至MabSelect蛋白質A柱 (Amersham Pharmacia Biotech，Co.，Ltd.)。使用構酸
鹽緩衝鹽·水（PBS)以使抗體吸附至蛋白質a，並使用20 mM擰檬酸鋼緩衝液及5〇 mM氣化鈉（pH 2.7)用於溶離。 藉由加入50 mM磷酸鈉緩衝液（ρΗ 7·0)將溶離部分之pH 值調節至pH 5.5。在藉由加入1.5倍體積的Milli-Q級水 (MiUipore，Bedford，MA)使裝載材料之電導率調節至< 4 ms/cm之後，使樣本首先通過與一連串〇·5 ml SP-瓊脂 糖 HP 柱（Amersham Pharmacia，Cat# 1 7-1087-01 > Uppsala，Sweden)連接之2 ml Q-瓊脂糖快速流動柱 (Amersham Pharmacia，Cat# 17-05 10-01 » Uppsala >
Sweden)。該等步驟之後，移除Q_瓊脂糖快速流動柱並 以PBS溶離抗體。 藉由以Super Cup 1〇〇 Capsule膜過濾器（0.22 μπι直徑 孔尺寸）過濾使經純化之抗體除菌。藉由分光光度法在 280 nm下量測使經純化抗體之濃度，其中1 mg/ml的蛋 白質在280 nm下顯示為1.4 〇D。自20升CHO細胞培養物 105723.doc •96- ⑤ 1377212 上清液純化出重組Z3G1抗體（41 mg)。根據鱟變形細胞 溶菌液（LAL)檢定，熱細胞單一測試（Pyrocell Single Test)(SEIKAGAKU Corp.，Tokyo，Japan)測定樣本之熱 原質含量為小於0.1 EU/mg蛋白質。
病毒分離及滴度量測：為進行病毒分離，在感染後不 同天數移除受感染之小鼠肺，將其冷凍於液氮中並在預 先稱重之管中稱重。藉由減去管重量來計算實際的肺重 量並以重量（公克）對體積（mL)比為1 : 10之比例加入PBS 並隨後使用 Fisher TissueMiser(Fisher Scientific， Pittsburgh，PA)均質化。樣本採用Centra GP8R離心機 (International Equipment Company，Needham Heights， MA)在3000 rpm下離心5分鐘以移除細胞碎片。將含有 病毒粒子之上清液等分並冷殊於液氮中。將病毒健存 於-80°C下。
藉由溶菌斑檢定法（plaque assay)量測病毒滴度。簡言 之，採用定期旋渦以總體積100 μΐ的病毒在PBS中之10 倍稀釋液感染該6孔平底板中之融合MDCK細胞單層30 分鐘。該等單層以PBS洗滌1次並以含有1%非必需胺基 酸、2 mM L-鼓醢胺酸' 100 U/ml青徽素及100 pg/ml硫 酸鍵徽素、1 mM 丙酮酸納（GIBCO BRL，Rockville, MD) 及1 pg/ml的騰蛋白酶（經TPCK處理，Worthington， Biochem. Corp·，Lakewood，NJ)之 MEM 中之 46°C 預升 溫的0.9%超純瓊脂糖（Invitrogen，Carlsbad，CA)覆蓋於 其上。使細胞在3 7°C、5% C02培養箱中培養。在感染 105723.doc •97- (I) 1377212 後3天内觀察溶菌斑並以10%甲醛溶液中之0.1%結晶紫 染色。計數溶菌斑數。 實例2 此實例描述人類及嵌合M2單株抗體之特徵。此實例 亦描述表明抗M2人類單株抗體Z3G1具有廣效性M2結合 光譜且能高度親和結合之資料。
使用重組技術，採用Z3 Fab及重組IgGl型Z3(Z3G1)之 CHO表現系統將Z3之同型轉變為IgGl。用以產生Z3G1 抗體之方法為如實例1中所述。 Z3G1以與原始Z3相似之方式特異結合於M2肽及M2-BSA結合物，但並不結合於BSA、KLH(用於免疫之載 劑）或mGAD(衍生自小鼠麩胺酸脫羧酶之合成無關肽， 胺基酸246至266)。 表2 : Z3G1對M2特異 mAbs M2肽* 受感染細胞上之M2 BSA 氺氺 OVA KLH mGAD*** C40G1 + + - - - L66 + + - - - N547 + + - - - - Z3G1 + + - - - - * : M2蛋白 質之最常見的細 胞外部分； 序列為
SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID ΝΟ:1) ** ··表現於受A/PR/8/34及A/HK/1/68感染之MDCK細胞 上之M2 *** :衍生自小鼠GAD之合成肽，位於246至266位置 + :陽性定義為OD45Q nm比對照抗體或無抗體高2倍以上 I05723.doc •98- 1377212
藉由基於細胞之ELISA進一步確定Z3G1之結合特異 性。Z3G1識別表現於受流行性感冒病毒感染之MDCK細 胞上之M2蛋白質的細胞外/胞外域（M2e)(表2)。此外， 當加入M2肽時，結合於受病毒感染細胞之Z3G1抗體受 到特異性抑制（圖1)。因此，Z3G1對M2肽特異且亦對表 現於受流行性感冒A病毒感染之MDCK細胞之表面上的 M2蛋白質特異。如藉由基於細胞之ELISA所測定， Z3G 1之結合親和力比三種其它人類單株抗M2抗體 (C40G1、N547及L66)稍大，如藉由相對較低的Kd值所 反映（表3)。 表3 :人類抗M2抗體中之親和力對比
Abs 亞類 輕鏈使用 Kd(xl0.yM)* 受PR8感染 Kd(xl0'y Μ)* 受ΗΚ1感染 Z3G1 IgG丨 λ 0.497 ± 0.030 0.488 ± 0.070 C40G1 IgG丨 Κ 0.519 ±0.033 0.542 ± 0.063 N547 IgG, λ 1.047 ±0.165 1.219 ±0.061 L66 IgG, λ 0.563 ± 0.099 0.531 ±0.048 表3中兩種病毒株即A/PR/8/3 4及A/PR/1/68之M2序列
的細胞外/胞外域相差一單個胺基酸：在A/PR/8/34病毒 株中之M2的細胞外部分中之位置20將天冬胺酸取代為 甘胺酸。衍生自A/HK/1/68之序列（已被稱作M2e)在大多 數流行性感冒病毒株中為共用（Neirynck等人，Nature
Med. 5:1 157 (1999)) 〇 Z3G1抗體識別表現於受兩種病毒株感染之MDCK細胞 上的M2e蛋白質（表3)。此結論藉由表5(Z3G1抗體+結合 於M2及M2G，M2及M2G之序列參見表4)中所說明之肽 105723.doc -99- ⑤ 1377212 ELISA資料支持。該等結果表明Z3識別表現於受該等兩 種不同病毒株感染之MDCK細胞上的M2與M2G蛋白質。 抗體第Z3G1、N547、L66、C40G1號之反應性可相比 於Z3G1之稍更佳的結合親和力（Kd)(表3)。如所期望， 同型匹配之無關人類抗HSA抗體（抗人類血清白蛋白）未 顯示任意反應性（圖1)。 表4 : M2變異/突變肽之序列
M2 肽 序列
M2 M2SG M2EG M2P -M2G M2DLTGS M2KNS M2LGS M2LTKGS M2SY M2TGEKS M2HTGEKS M2KTGEKS M2LTGS M2TDGEKS M2TGS M2TGEK M2LTGEKS M2K M2FG M2TGE M2KGENS M2TES M2GHTGKS M2PHTGS
SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD SLLTEYETPIRNEWECRCNGSSD SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD SLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD SLLTEVETPIRKEWGCNCSDSSD SLLTEVETLIRNGWGCRCSDSSD SLLTEVETLTKNGWGCRCSDSSD SLLTEVETPIRSEWGCRYNDSSD SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD SLLTEVETHTRNGWECKCSDSSD SLLTEYKTPTRNGWECKCSDSSD SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD SLLTEVETPTRDGWECKCSDSSD SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD SLLTEVETPTRNGWECKCNDSSD SLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD SLLTEVETPTRNGWECRCNDSSD SLLTEVETPERKGWECNCSDSSD SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD SLLTGVETHTRNGWGCKCSDSSD SLLPEVETHTRNGWGCRCSDSSD SEQIDNO (SEQIDN0:2) (SEQ ID N0:3) (SEQ ID N0:4) (SEQ ID N0:5) (SEQ ID N0:6) (SEQ ID N0:7) (SEQIDN0:8) (SEQ ID N0:9) (SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19) (SEQIDNO:20) (SEQIDNO:21) (SEQ ID NO:22) (SEQ ID NO:23) (SEQ ID NO:24) (SEQIDNO:25) (SEQ ID NO:26) 下劃線粗體字符為與SEQ ID NO:2之M2序列相比之突變區。 使用已在流行性感冒A病毒株中報導之25種不同的M2 肽（SEQ ID NOs:2-26，表4)以ELISA檢定分析抗M2抗體 對突變M2肽之結合活性。研究中使用人類抗M2抗體第 I05723.doc -100- ⑤ 1377212 Z3G1、C40G1、L66、N547 及小鼠 14C2 抗體（Affinity Bioreagents，Golden，CO) 0
表5中之結果表明Z3G1結合於幾乎所有的M2突變體 (除了 M2GHTGKS及M2PHTGS)其也結合於野生型M2 肽。甚至對於與野生型M2肽在6個胺基酸位置不同之 M2LTGEKS亦為如此。然而L66及N547顯示相對減少的 對M2突變體M2P、M2LGS及M2FG之結合，Z3G1結合於 M2P、M2LGS 及 M2FG 之每一個。此外，C40G1 及 14C2 表現出對 M2LGS 、 M2LTKGS 、 M2HTGEKS 、 M2KTGEKS 、 M2LTGS 、 M2TGEK 、 M2LTGEKS 及 M2TGE無結合活性或減少的結合活性，但Z3G1抗體結 合於所有的該等變異/突變M2肽。該等證明Z3G1以高親 和力結合於不同的M2突變肽之結果表明Z3G1具有比 L66、N547及C40G1更廣泛的結合M2e序列之範圍。因 此Z3G 1抗體可適用於治療具有不同M2序列之流行性感 冒A病毒的各種病毒株/分離株及亞型^ 表5 :抗M2抗體對M2肽之交叉反應性* M2類似物 Z3G1 L66 N547 C40G1 14C2** M2 + + + + + M2SG + + + + + M2EG + + + + + M2P + + + M2G + + + + + M2DLTGS 十 W + + W M2KNS 十 + + + + M2LGS + W W W _ M2LTKGS + + + M2SY + + + + + M2TGEKS + + + + _ M2HTGEKS + + + M2TGEKS 十 + 十 - I05723.doc -101 - 1377212 M2類似物 Z3G1 L66 N547 C40G1 14C2** M2LTGS 十 + + - - M2TDGEKS 十 + + + - M2TGS + + + W + M2TGEK + + + W - M2LTGEKS + + + W - M2K + 十 + + + M2FG + W W + + M2TGE + + + W - M2KGENS + + + - + M2TES + + + W M2GHTGKS - + + - - M2PHTGS W 十 + - • 與結合於野生型M2肽（SEQ ID NO: 1)相比之百分比：
< 10% ： -10-50% : W(弱） > 5 0% ： * +。 ** 14C2為抗M2肽之可購得之小鼠單株抗體。 表6:抗M2抗體結合於來自最近禽流感爆發之M2肽變異 體
禽流感 年份 亞型 M2變異體 Z3G1 L66 N547 C40G1 14C2 香港 1997 H5N1 M2DLTGS + W + + W M2LTKGS + + + - - M2LTGS + 十 + - 香港 1999 H9N2 M2LTGEKS + + + W - 東南亞 2004/2005 H5N1 M2TES + + + + W
最近爆發的禽類流行性感冒A病毒株之M2e序列衍生 自http://www.flu. lanl.gov/上之疾病控制中心（CDC)流行 性感冒A資料庫，如表4及6乍所示。M2DLTGS、 M2LTKGS及M2LTGS序歹丨J衍生自在1997年作為對人類廣 泛流行的威脅出現之禽類H5N 1流行性感冒A病毒，且 M2LTGEKS及M2TES分另'J令亍生自1999年及2004年爆|务之 禽類流行性感冒A病毒。所有三種該等病毒株為高病原 105723.doc -102- ⑧ 1377212 性並在人類中導致高死亡率（Suzuki，Biol. Pharm. Bull. 28:399 (2005) ; Katz，Avian Dis. 47(增刊 3):914 (2 003))。為鑑別可治療該等潛在廣泛流行感染之人類抗 體，研究人類抗M2抗體第Z3G1、L66、N547及C40G1 號對該等5種M2e變異肽之結合（表6)。
如表6中所示，Z3G1及N547結合於所有5種M2e變異 肽也結合於野生型M2肽。L66較好結合於除M2DLTGS 之外之大多數變異體。然而，C40G1不結合於M2LTKGS 及M2LTGS，且僅弱結合於M2LTGEKS。作為參照，小 鼠單株抗-M2抗體14C2僅弱結合於M2DLTGS及M2TES， 且未結合於M2LTKGS、M2LTGS 及 M2LTGEKS。
該等結果表明Z3G1以及L66及N547可提供治療廣泛流 行的H5N1及H9N2威脅及其它潛在的禽類流行性感冒爆 發之有力的策略。該等結果亦表明Z3G1以及L66及N547 能夠結合於廣泛範圍的在流行性感冒A病毒株中所發現 之M2e肽。CDC流行性感冒A資料庫之進一步分析表明 某些M2e序列在人類與禽類流行性感冒之間·佔優勢。雖 然野生型M2(SEQ ID NO:2)佔優勢地表現於人類流行性 感冒A病毒株中，但M2TES通常表現於禽類病毒株中。 由於Z3G1、L66、N5 47及C40G1可結合於M2TES，因而 該等人類抗M2抗體可為大多數禽類流行性感冒病毒株/ 分離株及亞型之有潛力的治療藥。 實例3 此實例包括的資料表明藉由Z3G1識別之不同於藉由 I05723.doc • 103 - ⑤ 1377212 人類抗M2單株抗體L66、N547及C40G1識別之彼等的抗 原決定子。使用具有M2 N-末端及C-末端截短之各種肽 繪製抗.體之最小結合序列（表7及8)。每一抗體之抗原決 定部位在最小結合序列内。
資料表明N547之抗原決定子（即抗原決定部位）在胺基 酸序列 LLTEVETPIRNEWGC(SEQ ID NO:52)内；藉由 L66識別之抗原決定部位在胺基酸序列 SLLTEVETPIRNEWGC (SEQ ID NO:53)内；及藉由 C40G1識別之抗原決定部位在胺基酸序列TPIRNE(SEQ ID NO:54-)内。 藉由ELISA觀察到C40G1、L66及N547與N-末端12-胺基酸肽（NM12，SEQ ID NO:69)不結合或結合較差（表 7)。相反，Z3 G 1較好結合於NM12。對一連串N-末端肽 進行進一步研究，陽性結合於Μ 1 6( 1 6-mer)但陰性結合 於其它截短表明Z3G1容許自N-末端缺失1個胺基酸（即 位置1的絲胺酸）。
Z3G1顯示顯著結合於NM11，然而該抗體並未可偵測 地結合於NM 1 0。將兩者結合考慮，Z3 G1抗體之最小結 合序列經測定為LLTEVETPIR(SEQ ID N0:1) ’表明藉由 Z3G1識別之抗原決定部位在序列LLTEVETPIR(SEQ ID N0:1)内。資料亦表明抗體Z3G1識別與N547、L66及 C40G 1抗體之彼等抗原決定部位不同之抗原決定部位。 I05723.doc .104- ⑤ 1377212 表7:抗M2單株抗體對M2截短之肽的結合活性
胺基酸序列 ELISA (OD450)* Z3G1 L66 N547 C40G1 M2 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD 2.45 1.04 1.26 2.38 1 M16 LLTEVETPIRNEWGCR 1.73 0.27 1.68 1.75 55 M15 LTEVETPIRNEWGCR 0.05 0.20 0.18 1.93 56 M12 VETPIRNEWGCR 0.05 0.19 0.14 1.95 57 CM17 ETPIRNEWGCRCNDSSD 0.05 0.14 0.14 3.01 58 CM16 TPIRNEWGCRCNDSSD 0.05 0.13 0.13 1.41 59 CM15 PIRNEWGCRCNDSSD 0.05 0.13 0.15 0.10 60 CM14 IRNEWGCRCNDSSD 0.05 0.13 0.13 0.10 61 CM13 RNEWGCRCNDSSD 0.06 0.15 0.16 0.11 62 CM12 NEWGCRCNDSSD 0.05 0.16 0.14 0.11 63 NM17 SLLTEVETPIRNEWGCR 2.48 1.92 2.22 2.18 64 NM16 SLLTEVETPIRNEWGC 2.38 2.52 2.78 2.17 65 NM15 SLLTEVETPIRNEWG 1.75 0.28 0.33 2.67 66 NM14 SLLTEVETPIRNEW 2.00 0.16 0.16 1.93 67 NM13 SLLTEVETPIRNE 0.13 0.17 0.16 1.82 68 NM12 SLLTEVETPIRN 1.32 0.12 0.16 0.16 69 NM11 SLLTEVETPIR 0.69 0.17 0.15 0.15 29 NM10 SLLTEVETPI 0.09 0.16 0.14 0.11 70 NM9 SLLTEVETP 0.06 0.16 0.13 0.13 71 NM8 SLLTEVET 0.06 0.18 0.15 0.10 72 NM7 SLLTEVE 0.05 0.18 0.14 0.09 73 * ； 所有抗體以10 Mg/ml使用。 表8 :抗M2抗體之最小結合序列 抗體 最小結合序列 SEQ ID NO L66 SLLTEVETPIRNEWG 74 C40G1 TPIRNE 54 N547 LLTEVETPIRNEWG 75 Z3G1 LLTEVETPIR 1 實例4 此實例描述的幾種動物研究表明在感染有流行性感冒 病毒之前投予本發明M2單株抗體可保護動物不受隨後 105723.doc -105- ⑤ 1377212 之病毒之致命激發。 抗M2單株抗趙用於小鼠中之流行性感冒a病毒感染模 型之預防治療（病毒感染之前）的活體内功效：
為#估抗M2人類羊株抗體在動物中之功效，將抗體 第Z3G1號以100、30及10 μ g/小鼠之劑量腹腔内投予雌 性C57BL/6J小鼠（6-8週齡）。抗體投藥1天之後，使經麻 痺之小鼠（15 μΐ/g的Avertin(l : 1重量體積比的2,2,2三潰 乙醇：第三戊醇）Sigma，St. Louis，MO)以鼻内方式感 染30 μ1(3.2倍的MLD50)致命劑量的流行性感冒 A/HK/1/^8(CDC ’ Atlanta ’ GA)。作為對照，自 ΚΜ小氣 TM產生之同型匹配人類單株抗HSA IgGl抗體以1〇〇 μ§/ 小鼠（Kirin Brewery Co.，Ltd.，Japan)之劑量使用。每 天觀察小鼠達23天觀察是否存活。在那一時間後殺死存 活小鼠並移除肺用於組織學分析。
經抗M2抗體第Z3G1號治療之小鼠甚至在低至1 〇 gg/ 小鼠之劑量下亦受到顯著保護（圖2)。在觀察之23天時 間段内10隻小鼠中有10隻（100%)仍活著。相反，在對照 組中，10隻小鼠中有9隻（90%)在感染後22天内死亡（圖2)。 小鼠流行性感冒A病毒感染模型中之藉由溶菌斑檢定 所量測的Z3G1對病毒複製之活體内抑制： 使經麻痺之雌性C57BL/6J小鼠（6〜8週齡）以鼻内方式 感染30 μΐ的亞致命劑量的流行性感冒a/HK/1/68(CDC , Atlanta ’ GA)。如上述使用Avertin進行麻瘁。在第2、 5、7、9、11天移除受感染之小鼠肺以藉由溶菌斑檢定 105723.doc -106- ⑤ 1377212 來測定病毒滴度。為測定抗M2單株抗體對流行性感冒 病毒之預防治療的功效，在病毒感染1天之前投予3〇 的Z3G1。使用同型匹配之抗HSA IgGl抗體作為對照。
圖3中之結果表明在感染後2天在以Z3G1治療之小鼠 中未偵測到病毒。相反，在感染後2天在經同型對照物 (HSA)治療之小鼠中觀察到肺中病毒為3 95 χ 1〇4 pfu/g。在感染後5天，在經Z3Gls療之小鼠肺中之病毒 以2 12 pfu/g存在。相反，在感染後5天在經對照物（Hs A) 治療之小鼠肺中之病毒滴度增加至45 χ 1〇4 pfu/g。因 此’ Z3G4治療導致病毒滴度減少約1〇〇〇至1〇 〇〇〇倍。 在感染後7天病毒滴度下降且在感染後丨丨天病毒實際上 清除，此可能由於病毒之基於宿主適應免疫性之清除。 資料證明抗M2抗體Z3G1有效抑制活體内流行性感冒病 毒複製。 實例5
此實例的研究描述表明本發明之M2單株抗體具有補 體依賴性細胞毒性及抗體依賴性細胞調節之細胞毒性。 抗M2抗體之補體依賴性細胞毒性（CDC)活性： 由於M2蛋白質在受感染之細胞表面上高度表現，因 此抗M2抗體保護宿主不受流行性感冒a感染之機制之一 為激活補體，其增強調理作用並溶解受感染的細胞因而 殺死病毒並阻礙活體内病毒繁殖。因此研究抗M2抗體 對活體外流行性感冒A病毒感染之細胞的補體依賴性細 胞毒性。 105723.doc _ 10*7 - ⑤ 1377212
將在補充有10%胎牛血清（FBS)之含有20 mM L-麩醯 胺酸、10 mM丙酮酸鈉、1000單位/mL青黴素-鏈黴素、 MEM維生素溶液、MEM依格（Eagle)非必需胺基酸 (Invitrogen，Carlsbad，CA)之完全最低必需培養基 (cMEM)中的MDCK細胞以2.5xl05個細胞/mL及150 μΐ/孔 塗於96孔平底板（Falcon®)上並在7% C02、37°C下培養 24小時》24小時後，以PBS將該板洗滌兩次並採用定期 旋渦以30 μΐ/孔的10倍TCID50流行性感冒A病毒 (A/PR/8/34 ; ATCC，Rockville，MD)在室溫下感染該板 30分鐘。-感染後，以PBS洗滌該板1次並加入150 μΐ的在 cMEM中之1 pg/mL胰蛋白酶（經TPCK處理， Worthington，Biochem. Corp·)並將該板在 7% C02' 37 °C下培養26小時。細胞單層隨後以最低必需培養基 (MEM)洗滌3次。使抗體在填充緩衝液（與用於基於細胞 之ELISA相同之緩衝液）中稀釋至想要的濃度並在每一孔 中加入50 μΐ並在室溫下培養30 min。培養後，孔以 MEM 洗滌 1次。將 100 pL 的 Low Tox Μ 兔補體（Cedarlane Lab Limited - Accurate，Hornby，Ontario，CANADA) 在1 mL的MEM中復原並進一步稀釋至1 : 1 〇隨後加入細 胞中。在37°C下培養1小時後，細胞單層以MEM洗滌3 次，並使用CellTiter 96® AQueous—溶液細胞增殖檢定 (Promega ’ Madison，WI)根據製造商之說明書測定活細 胞數。活細胞數越多則在495 nm下之光密度越高。 如圖4中所示，當細胞藉由清潔劑（Triton X-100)溶解 105723.doc -108- ⑤ 1377212 時光密度低於0.2。將此看作顯示最大致死能力之陽性 對照。同型對照人類抗體（HSA)在任意濃度下不能溶解 受流行性感冒A病毒感染之MDCK細胞。相反，研究中 的所有人類抗M2抗體（Z3G1、L66、N547及C40G1)以劑 量依賴性方式溶解受病毒感染之MDCK細胞。在1 pg/mL下所有抗體均溶解細胞，且觀察到接近最大致死 能力之溶解細胞效果為在10 pg/mL劑量下。
抗M2抗體之抗體依賴性細胞調節之細胞毒性（ADCC) 活性： 抗M2抗體結合之受流行性感冒A病毒感染的細胞可藉 由稱為自然殺傷細胞（NK細胞）之專門非T、非B淋巴細 胞殺死。結合抗體之靶細胞受到NK細胞之破壞被稱作 抗體依賴性細胞調節之細胞毒性（ADCC)，且為抗M2抗 體可保護宿主不受流行性感冒A病毒感染之另一機制。
將MDCK細胞以0.25xl05個細胞/mL含有10% FBS之 cMEM及150 μΐ/孔塗於96孔平底板（Falcon®)並在7% C02、37°C下培養24小時。24小時後，以PBS將該板洗 滌兩次並採用定期旋渦以30 μΐ/孔的10倍TCID50流行性 感冒 Α病毒（A/PR/8/34 ; ATCC，Rockville，MD)在室溫 下感染該板30分鐘。感染後，以PBS洗滌該板1次並加 入1 50 μΐ的在cMEM中之1 pg/mL騰蛋白酶（經TPCK處 理，Worthington，Biochem. Corp.)並將該板在 7% C02、3 7°C下培養22小時。細胞單層隨後以填充緩.衝液 洗蘇3次。加入在填充緩衝液中5 pg/mL之抗體，50 μΐ/ 105723.doc -109 - ⑤ 1377212
孔並在室溫下培養30 min。培養後，孔以填充緩衝液洗 滌1次，並使用MACS純化系統（Miltenyi Biotec，Inc.， Auburn，C A)根據製造商之說明書純化來自普通人類外 周血液之NK細胞。將以200 ng/mL的溶於含有RPMI 1640 (不含驗紅）（Invitrogen，Carlsbad，CA)之 10% 低 Ig FCS中之人類IL-2預培養的NK細胞以不同細胞數加入孔 中。藉由CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢定系統 (Promega，Madison，WI)根據製造商之說明書測定細胞 溶解。
當0.5 X 105個NK細胞存在時，研究中的所有人類抗 M2抗體（Z3G1、L66、N547及C40G1)可溶解約50%的受 病毒感染之MDCK細胞。相反，採用IgG,同型對照抗體 (HSA)觀察到僅25%細胞溶解。注意到由於經活化之NK 細胞可溶解受病毒感染之細胞及非自身細胞（如MDCK 細胞）因而在對照組中觀察到此25%的未塗佈抗體之靶細 胞溶解。然而，當靶細胞結合於抗M2抗體時，細胞溶 解可增加至50%。因此所有4種人類抗M2抗體均具有 ADCC活性。 實例6 此實例包括的研究表明抗M2人類單株抗體Z3G1之預 防及治療活性。此實例亦包括的研究表明抗M2人類單 株抗體Z3G1在猴中即便有毒性亦為極少。 抗M2人類單株抗體Z3G1對NK細胞去除（免疫功能不 全）之動物中的流行性感冒A病毒感染之活體内預防效果 -110- 105723.doc 1377212
NK細胞去除：為使NK細胞去除，以100 pg的已知在 NK細胞中特異表現之PK136(ATCC，Manassas，VA)(抗 NK1.1抗原之小鼠單株IgG2a抗體）治療C57BL/6J小鼠。 同型匹配之抗體（純系C44，ATCC)用作對照。在感染前 2及5天與感染後1及4天給予抗體。3次注射抗NK1.1抗 體或對照抗體之後，每一組中有1隻小鼠死亡，並收集 淋巴結、脾及外周血液。在藉由紅血球溶解緩衝液 (Sigma ’ St Louis ’ MO)溶解紅血球之後製備單細胞懸 浮液並在.用抗Fc受體抗體（來自eBioscience之純系 2.4G2)填充20分鐘之後以DX5 FITC及CD3 PE(eBioscience，San Diego，CA)或適當之同型對照物 於冰上染色45分鐘。以含有2% FCS、10 mM EDTA、 0.05% NaN3之PBS洗蘇2次，並以PBS洗蘇1次，以4%多 聚甲搭固定細胞30分鐘並隨後藉由流式細胞儀分析。 DX5為小鼠中之NK細胞標記。基於懸浮液細胞總數中
DX5陽性細胞的數目計算存在於每一組織中之nk細胞 的百分比。 NK細胞去除之小鼠中之流行性感冒人感染的抗肘之抗 體治療：在病毒感染前i天將抗M2抗體Z3G1以1〇〇 yg/ 小鼠之劑量腹腔内投藥。作為對照，將同型匹配之人類 單株抗人類血清白蛋白（HSA)IgG1抗體以100 μ§/小鼠投 藥。為達成病毒感染，以15 ：i重量體 積比的2,2,2三溴乙醇與第三戊醇，Sigma，St· Louis， MO)麻痺小鼠並以鼻内方式對其投予％ _命劑量（3.2 105723.doc ⑤ -111- 1377212 倍的 MLD50)的流行性感冒 A/HK/1/68(CDC，Atlanta， GA)。隨後每天觀察小鼠達23天觀察是否存活。 如表9中所示，與以同型對照抗體治療之小鼠相比在 以抗NK 1.1抗體治療之小鼠中分析之所有3種組織中NK 細胞之百分比均減少。代表NK細胞之DX5陽性細胞在 淋巴結中自0·93%下降至0.02%，在脾中自1.74%下降至 0.52%及在外周血液中自3.45%下降至0.75%。該等結果 表明藉由以抗ΝΚ 1.1抗體治療可有效去除ΝΚ細胞。
表9 : DX5 +細胞在以抗ΝΚ1.1抗體治療之小鼠及以同型對 照抗體治療之小鼠中的百分比 淋巴結(％) 脾(％) 外周血液(％) 經同型對照抗體治療之小鼠 0.93 1.74 3.45 經抗NK1.1抗體治療之小鼠 0.02 0.52 0.75 抗M2抗體Z3G1對ΝΚ去除之小鼠流行性感冒Α感染的 保護作用
100 pg/小鼠之劑量的抗M2抗體Z3G1在NK細胞去除 (Z3G1/NK-)或非去除（Z3G1/NK+)條件下均保護小鼠不 受A/HK/1/68感染；然而不論NK細胞去除或未去除，同 型對照抗HSA抗體均不保護小鼠不受病毒感染（圖6 ; HSA/NK-及 HSA/NK+)。在 Z3G1/NK-及 Z3G1/NK+ 組 中，在觀察之23天時間段内分別為7隻中有6隻及8隻中 有6隻小鼠存活。在該等兩組之間觀察到無統計學上的 差別（p>0.05，藉由Kaplan Meier存活分析）。相反，在 HSA/ΝΚ-及HSA/NK+組中分別為8隻小鼠中有1隻及8隻 105723.doc -112· ⑤ 1377212 小鼠中有0隻存活。受感染之小鼠在經Z3Gi治療與經抗 HS Α治療之組之間的存活時間的變化在νκ去除與非去 除條件下均為統計學上顯著的（p<〇 〇〇丨）。 已報導關於包含偶合至HBc(肝炎B核顆粒）的M2細胞 外部分之疫苗（稱為M2 HBc)效果的報導（Jegerlehner等 人，J. Immunol· 172:5598 (2004))。該等作者報導對 Νκ
細胞去除條件中之感染具疫苗效果降低。此外，該等作 者報導當NK細胞去除時獲自經接種疫苗M2-HBc之小鼠 的血清之被動轉移不會保護小鼠不受致命的流行性感冒 A激發。該等結果表明M2-HBc疫苗對流行性感冒a感染 之保s蒦效果主要藉由NK細胞調節。相反，即使在nk細 胞去除條件中抗M2抗體Z3G1仍可有效保護小鼠不受致 命的流行性感冒A激發。該等結果表明抗m2人類單株抗 體Z3G1在免疫功能不全病患如NK細胞功能可遭損害之 癌症患者十可為有效。該等結果亦表明採用抗M2抗體 Z3G1之被動免疫療法可提供與疫苗相比更優的抗流行 性感冒A感染之保護。 抗M2抗體Z3G1對小鼠流行性感冒A感染之治療效果 將經麻痺之小鼠（15 μΐ/g的Avertin(l : 1重量體積比的 2,2,2三溴乙醇與第三戊醇））（Sigma，St. Louis，MO)以 鼻内方式感染30 μ1(3.2倍的MLD50)致命劑量的流行性 感冒A/HK/1/68(CDC，Atlanta，GA)。在病毒感染後1天 以200、100及30 pg/小鼠之劑量將Z3G1腹腔内投予雌性 C5 7BL/6 J小鼠（6〜8週齡）。作為對照，同型匹配之人類 -113- 105723.doc 單株抗HSA IgGl抗體以200叩/小氣之劑量投藥。每天 觀察小鼠達23天觀察是否存活。 資料顯示於圖7中。在對照抗hs A IgG 1組中，8隻小 鼠中有7隻在感染後第n天死亡。相反，在以2〇〇 μβ/小 鼠的Z3G1治療之組中8隻小鼠中有7隻在感染後第丨i天 仍存活且8隻小鼠中有4隻在第23天仍存活。在該段時間 期間存活率在對照組與經200 Mg/小鼠的Z3G1治療之組 之間的變化在統計學上顯著的（p<〇 〇2，藉由KapUn Meyer存活分析）。在100 μβ/小鼠之劑量下，8隻小鼠中 有7隻及8隻小鼠中有3隻分別在第u天及第23天仍存 活，但與對照組（p = 〇.〇68)相比此差別並非為統計學上顯 著的。在30 pg/小鼠之劑量下，8隻小鼠中有3隻及8隻 小鼠中有1隻分別在第11天及第2 3天仍存活，且與對照 組相比在經治療之組中未見保護作用。該等結果表明即 使在流行性感冒感染之後投予抗體時，抗M2抗體Z3G1 對>’ιΐ·行性感| A感染仍具有治療效果。 單劑量Z3G1在獼猴中之毒性研究： 為評估Z3G1之毒性’藉由靜脈内輸注經約45分鐘以 3 0 mg/kg之單劑量將抗體投予兩獼猴。研究動物3週， 其後將其解剖。作為對照，將媒劑PBS給予兩猴。與對 照組相比以30 mg/kg的Z3G1治療並不會有意義地改變臨 床觀察結果，如食物消耗及體重。抗體對血液學參數及 血清化學性質不會有特定影響，表明在臨床病理中亦無 有意義的改變《將兩者結合考慮，基於所測試之參數如 105723.doc •114· 1377212 血清化學性質、金液學、食物消耗、體重、總病理或組 織病理，以30 mg/kg的Z3G1單一靜脈内治療獼猴未顯示 任意可察覺之毒性。顯示出Z3G1具有良好的耐受性。 【圖式簡單說明】 圖1顯示結合於受A/PR/8/34感染之細胞表面上的M2 之抗體第Z3G1號受到可溶性M2肽而非無關蛋白質BSA 之特異抑制。結合於受A/PR/8/34感染之MDCK細胞的抗 體藉由ELISA量測。
圖2顯示藉由投予M2抗體Z3G1(100 pg、30 pg或10 Mg/小鼠）或以100 Mg/小鼠投予同型對照抗體（HSA)來預 防保護動物使其避免流行性感冒病毒感染誘發之死亡。 Z3G1或HSA為在感染致命劑量的A/HK/1/68之前1天投 藥。自感染後1至23天量測存活率。
圖3顯示投予M2抗體Z3G1對抑制受感染動物之肺中病 毒複製的預防效果。在感染亞致命劑量的A/HK/1/68之 前1天以30 Mg/小氣投予Z3G1或HSA(同型對照）。藉由溶 菌斑檢定在指示時間點量測肺病毒滴度。 圖4顯示與對照抗體（HSA)相比抗M2抗體Z3G1、 L66、N547及C40G1之補體依賴性細胞毒性（CDC)活 性。 圖5顯示與對照抗體（HSA)相比抗M2抗體Z3G1、 L66、N547及C40G1之抗體依賴性細胞調節之細胞毒性 (ADCC)活性。 圖6顯示M2抗體Z3G1保護NK去除之小鼠不受致命劑 105723.doc -115- ⑤ 1377212 量的A/HK/1/68激發。在感染致命劑量的A/HK/1/68之前 1天以100 Mg/小鼠之劑量將抗M2抗體Z3G1或同型對照 抗體（HSA)投予NK細胞去除（NK)或非去除（NK+)小鼠。 自感染後1至23天觀察存活率。
圖7顯示M2抗體Z3G1以治療法保護小鼠不受致命劑量 的A/HK/1/68激發。在感染致命劑量的A/HK/1/68之後1 天以200 pg、100 pg或30 pg /小鼠之劑量將抗M2抗體 Z3G1投予小鼠或以200 pg/小鼠之劑量將同型對照抗體 (HSA)投予小鼠。自感染後1至23天觀察存活率。
105723.doc -116- ⑤

Claims (1)

1377212 第094143278號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(101年4 % 1. 2 4. 5. 6. 申請專利範圍： t…_ 外域中 之抗原決定部位之經分離抗體，其中該抗體結合於胺基 酸序歹ijLLTEVETPIR(SEQ ID ΝΟ:1)内之抗原決定部位， 其中該抗體之重鏈可變區序列之胺基酸序列為SEQ ID NO:34之胺基酸殘基20至137，且其中輕鏈可變區序列之 胺基酸序列為SEQ ID ΝΟ··35之胺基酸殘基20至130。 如請求項1之抗體，其中該抗體之重鏈可變及恆定區序 列為SEQ ID ΝΟ:37之胺基酸殘基20至467，且其中輕鏈可 變及恆定區序列為SEQ ID ΝΟ:35之胺基酸殘基20至235。 如請求項1之抗體，其中該抗體由寄存為BCRC 960252之 CHO細胞或寄存為BCRC 960253之融合瘤所產生。 一種宿主細胞，其表現如請求項1至3中任一項之抗體。 一種核酸，其編碼如請求項1至3中任一項之抗體。 一種組合物，其包含如請求項1至3中任一項之抗體及抗
病毒劑。 # 7. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至3中任一項之抗體 及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。 - 8. 一種套組，其包含如請求項1至3中任一項之抗體及用於 - 治療、抑制、預防病患受一或多種流行性感冒病毒株或 分離株感染或降低病患受一或多種流行性感冒病毒株或 分離株感染的易感性之說明書。 9.如請求項1至3中任一項之抗體，其係用於治療病患之流 行性感冒病毒感染。 105723-1010420.doc 1377212 第094143278號專利申請案 中文圖式替換頁(101年4月）
100g 604020 (％)齋坭桦 —Z3G1JNK- ......HSA^iK- _ _ Z3G1 相K+ -HSA/NK+ ο δ 10 15 20 25 感染後天數 (Β|6 l05723-fig-1010420.doc 1377212 第094143278號專利申請案 中文圖式替換頁（101年4月） 100 η o o o o 8 6 4 2 (％)#胺蚱
以年^月彡曰修正替換頁 —Z3G1 200 ug ---·Ζ301 100 uq -Z3G1 30 ug ……HSA 200 ug 15 20 25 感染後天數 圖7 105723-fig-1010420.doc
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