TWI473621B - 供治療和診斷流感用之組成物和方法 - Google Patents

供治療和診斷流感用之組成物和方法 Download PDF

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Description

供治療和診斷流感用之組成物和方法 相關申請案
本申請案主張臨時專利申請案USSN 60/987,353(2007年11月12日提出申請)、USSN 60/987,355(2007年11月12日提出申請)、USSN 61/053,840(2008年5月16日提出申請)及USSN 61/095,208(2008年9月8日提出申請)之權益，該等申請案之內容各自以參照方式整體納入本文。
本發明大致上關於流感感染之治療、診斷及監測。本發明特別關於鑑別流感基質2蛋白專一性抗體之方法及彼等之製造及用途。該等抗體可用於供預防及治療流感和供診斷及監測流感感染之醫藥組成物。
流感病毒在美國每年感染5%至20%之人口並且導致30,000至50,000人死亡。雖然流感疫苗是預防感染之主要方法，不過在美國也可取得四種抗病毒藥物：金剛胺(amantadine)、金剛乙胺(rimantadine)、奧斯他偉(oseltamivir)及札那米韋(zanamivir)。自2005年12月起，只有奧斯他偉(克流感(TAMIFLUTM ))被建議用於治療A型流感，因為該病毒之M2蛋白的胺基酸取代導致病毒對金剛胺及金剛乙胺之抗性增加。
A型流感病毒感染所造成之疾病的特徵在於其循環特性。抗原漂移及抗原轉換導致每年出現不同的A型病毒株。除此之外，高度致病性毒株進入一般族群之威脅已經引起對流感感染之新穎治療的需求。大部分中和抗體係以血球凝集素及神經胺酸酶蛋白質之多形性區為標靶。因此，該種中和性單株抗體據推測僅能以一或少數毒株為標靶。近來的研究重點在於相對不變異之基質2(M2)蛋白。以M2為標靶之中和性單株抗體將可能是所有A型流感病毒株之適當治療。
M2蛋白被發現以同型四聚體之形式形成離子通道，且被認為有助於病毒脫去外膜以進入細胞。在感染後，M2可被大量發現於該細胞之表面。接著M2蛋白被包含至病毒感染顆粒(virion)外膜中，在其中僅佔總外膜蛋白之約2%。M2細胞外結構域(M2e)係由在細胞外所展示之胺基端的2至24個胺基酸所組成之短肽。目前的抗M2單株抗體係以此線性序列為標靶。因此，這些抗體可能無法展現與細胞表現之M2(包括天然M2上之構型決定簇)結合的所欲特性。
因此，該領域中存在盼望已久之需求係與細胞表現之M2及天然M2上之構型決定簇結合之新穎抗體。
 發明摘要
本發明提供專一性拮抗M2e之完全人單株抗體。可隨意選擇的是，該抗體係自人捐贈者之B細胞分離。示範性單株抗體包括此處所述之8i10、21B15或23K12。或者，該單株抗體係與8i10、21B15或23K12之相同表位結合之抗體。該等抗體在此處分別被稱為huM2e抗體。該huM2e抗體具有下列一或多項特徵：a)與流感病毒之基質2外結構域(M2e)多肽的細胞外結構域中之表位結合；b)與經A型流感感染之細胞結合；或c)與A型流感病毒結合。
huM2e抗體所結合之表位係M2多肽之非線性表位。較佳的是，該表位包含M2e多肽之胺基端區域。更佳的是，該表位完全或部分地包括胺基酸序列SLLTEV(SEQ ID NO：42)。最佳的是，該表位包含M2e多肽根據SEQ ID NO：1編號之位置2、5及6之胺基酸。位置2之胺基酸係絲胺酸；位置5之胺基酸係蘇胺酸；且位置6之胺基酸係麩胺酸。
huM2e抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO：44或50之胺基酸序列，且該輕鏈可變區具有SEQ ID NO：46或52之胺基酸序列。較佳的是，該3個重鏈CDR包括與胺基酸序列NYYWS(SEQ ID NO：72)、FIYYGGNTKYNPSLKS(SEQ ID NO：74)、ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)、SNYMS(SEQ ID NO：103)、VIYSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO：105)、CLSRMRGYGLDV(SEQ ID NO：107)(以卡巴方法測定)或ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)、CLSRMRGYGLDV(SEQ ID NO：107)、GSSISN(SEQ ID NO：109)、FIYYGGNTK(SEQ ID NO：110)、GSSISN(SEQ ID NO：111)、GFTVSSN(SEQ ID NO：112)、VIYSGGSTY(SEQ ID NO：113)(以柯西亞方法測定)具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高一致性之胺基酸序列且該3個輕鏈CDR包括與胺基酸序列RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)、QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)、RTSQSISSYLN(SEQ ID NO：92)、AASSLQSGVPSRF(SEQ ID NO：94)、QQSYSMPA(SEQ ID NO：96)(以卡巴方法測定)或RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)、QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)、RTSQSISSYLN(SEQ ID NO：92)、AASSLQSGVPSRF(SEQ ID NO：94)、QQSYSMPA(SEQ ID NO：96)(以柯西亞方法測定)具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高一致性之胺基酸序列。該抗體結合M2e。
M2e抗體之重鏈係源自種系V(可變)基因諸如舉例來說IgHV4或IgHV3種系基因。
本發明之M2e抗體包括由人IgHV4或IgHV3種系基因序列所編碼之可變重鏈(VH )區。IgHV4種系基因序列係顯示於例如登錄號L10088、M29812、M95114、X56360及M95117。IgHV3種系基因序列係顯示於例如登錄號X92218、X70208、Z27504、M99679及AB019437。本發明之M2e抗體包括由與IgHV4或IgHV3種系基因序列至少80%同源之核酸序列所編碼之VH 區。較佳的是，該核酸序列與IgHV4或IgHV3種系基因序列具有至少90%、95%、96%、97%之同源性，且更佳的是與IgHV4或IgHV3種系基因序列具有至少98%、99%之同源性。該M2e抗體之VH 區與由IgHV4或IgHV3種系基因序列所編碼之VH 區的胺基酸序列具有至少80%之同源性。較佳的是，該M2e抗體之VH 區的胺基酸序列與由IgHV4或IgHV3種系基因序列所編碼之胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%之同源性，且更佳的是與由IgHV4或IgHV3種系基因序列所編碼之序列具有至少98%、99%之同源性。
本發明之M2e抗體亦包括由人IgKV1種系基因序列所編碼之可變輕鏈(VL )區。人IgKV1 VL 種系基因序列係顯示於例如登錄號X59315、X59312、X59318、J00248及Y14865。或者，該M2e抗體包括由與IgKV1種系基因序列至少80%同源之核酸序列所編碼之VL 區。較佳的是，該核酸序列與IgKV1種系基因序列具有至少90%、95%、96%、97%之同源性，且更佳的是與IgKV1種系基因序列具有至少98%、99%之同源性。該M2e抗體之VL 區與由IgKV1種系基因序列所編碼之VL 區的胺基酸序列具有至少80%之同源性。較佳的是，該M2e抗體之VL 區的胺基酸序列與由IgKV1種系基因序列所編碼之胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%之同源性，且更佳的是與由IgKV1種系基因序列所編碼之序列具有至少98%、99%之同源性。
本發明之另一態樣提供一種包括如本發明之huM2e抗體之組成物。在不同態樣中，該組成物另包含抗病毒藥、病毒進入抑制劑或病毒黏附抑制劑。該抗病毒藥舉例來說係神經胺酸酶抑制劑、HA抑制劑、唾液酸抑制劑或M2離子通道抑制劑。該M2離子通道抑制劑舉例來說係金剛胺(amantadine)或金剛乙胺(rimantadine)。該神經胺酸酶抑制劑舉例來說係札那米韋(zanamivir)或磷酸奧斯他偉(oseltamivir phosphate)。在另一態樣中，該組成物另包含第二抗A型流感抗體。
在另一態樣中，本發明之huM2e抗體係可操作地連接於治療劑或可偵測標記。
此外，本發明提供藉由對個體投予huM2e抗體以刺激免疫反應、治療、預防或減輕流感病毒感染之徵候之方法。
可隨意選擇的是，對該個體另外投予第二劑，諸如但不限於流感病毒抗體、抗病毒藥(諸如神經胺酸酶抑制劑、HA抑制劑、唾液酸抑制劑或M2離子通道抑制劑)、病毒進入抑制劑或病毒黏附抑制劑。該M2離子通道抑制劑舉例來說係金剛胺(amantadine)或金剛乙胺(rimantadine)。該神經胺酸酶抑制劑舉例來說係札那米韋(zanamivir)或磷酸奧斯他偉(oseltamivir phosphate)。該個體罹患或易於發生流感病毒感染，諸如舉例來說自體免疫性疾病或發炎性疾患。
在另一態樣中，本發明提供於暴露流感病毒之前或之後對個體投予本發明之huM2e抗體之方法。舉例來說，本發明之huM2e抗體係用於治療或預防頑固性流感感染。該huM2e抗體係以足以促進病毒廓清或清除經A型流感感染之細胞之劑量投予。
本發明亦包括一種測定病患體內存在流感病毒感染之方法，該方法藉由使取自該病患之生物性樣本與huM2e抗體接觸；偵測與該生物性樣本結合之抗體之量；及比較該生物性樣本所結合之抗體之量與對照值。
本發明另提供一種包含huM2e抗體之診斷性套組。
本發明之其他特徵及優點將顯而易見且包含於以下之詳細說明及申請專利範圍請求項。
本發明之詳細說明
本發明提供專一性拮抗基質2(M2)多肽之細胞外結構域的完全人單株抗體。該等抗體在此處分別被稱為huM2e抗體。
M2係96個胺基酸之跨膜蛋白質，其以同型四聚體之形式存在於流感病毒及病毒感染細胞之表面上。M2包含23個胺基酸之胞外結構域(M2e)，該胞外結構域在A型流感毒株之間具有高度保留性。在1918年大流行毒株之後M2e很少發生胺基酸改變，因此M2e係流感治療中引人注意之標靶。在先前試驗中，對M2胞外結構域(M2e)具專一性之單株抗體係得自以對應M2e線性序列之肽所進行之免疫接種。相反的，本發明提供一種藉以在細胞系中表現全長M2之新穎方法，因此允許鑑別與此細胞表現之M2e結合之人抗體。該huM2e抗體已被顯示可與M2轉染細胞上之構型決定簇結合，亦與流感感染細胞上或病毒本身上之天然M2結合。該huM2e抗體不與線性M2e肽結合，但是它們可與數種亦在cDNA轉染細胞系所表現之天然M2變異體結合。因此，本發明允許鑑別及產製對非常廣泛範圍之A型流感病毒株展現新穎專一性之人單株抗體。這些抗體可被診斷性地用於鑑別A型流感感染及治療性地用於治療A型流感感染。
本發明之huM2e抗體具有下列一或多項特徵：該huM2e抗體a)與流感病毒之基質2(M2)多肽的胞外結構域中之表位結合；b)與經A型流感感染之細胞結合；及/或c)與A型流感病毒(意即病毒感染顆粒(viron))結合。本發明之huM2e抗體透過免疫效應機制諸如ADCC清除流感感染細胞，並藉由與流感病毒結合以增進直接病毒清除。本發明之huM2e抗體與M2e多肽之胺基端區域結合。較佳的是，本發明之huM2e抗體與其中N端甲硫胺酸殘基不存在之M2e多肽的胺基端區域結合。示範性M2e序列包括該些於下表1所列之序列。
在一實施態樣中，本發明之huM2e抗體與M2e結合，該M2e完全或部分包括當根據SEQ ID NO：1編號時M2e位置2至位置7之胺基酸殘基。舉例來說，本發明之huM2e抗體完全或部分地與胺基酸序列SLLTEVET(SEQ ID NO：41)結合。最佳的是，本發明之huM2e抗體完全或部分地與胺基酸序列SLLTEV(SEQ ID NO：42)結合。較佳的是，本發明之huM2e抗體與該M2e蛋白之非線性表位結合。舉例來說，該huM2e抗體與包含該M2e多肽當根據SEQ ID NO：1編號時之位置2、5及6之表位結合，其中a)位置2之胺基酸係絲胺酸；b)位置5之胺基酸係蘇胺酸；且c)位置6之胺基酸係麩胺酸。與此表位結合之示範性huM2e單株抗體係此處所描述之8I10、21B15或23K12抗體。
該8I10抗體包括由以下SEQ ID NO：43顯示之核酸序列所編碼之重鏈可變區(SEQ ID NO：44)，及由SEQ ID NO：45顯示之核酸序列所編碼之輕鏈可變區(SEQ ID NO：46)。
在下列序列中，包含如柯西亞等人(Chothia,C. et al.)(1989,Nature,342：877-883)所定義之CDR的胺基酸係以劃底線表示，而該些由卡巴等人(Kabat E.A. et al.)(1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edit.,NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services)所定義者係以粗體字強調。
8I10抗體之重鏈CDR具有如卡巴定義之下列序列：NYYWS(SEQ ID NO：72)、FIYYGGNTKYNPSLKS(SEQ ID NO：74)及ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)。8I10抗體之輕鏈CDR具有如卡巴定義之下列序列：RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)及QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)。
8I10抗體之重鏈CDR具有如柯西亞定義之下列序列：GSSISN(SEQ ID NO：109)、FIYYGGNTK(SEQ ID NO：110)及ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)。8I10抗體之輕鏈CDR具有如柯西亞定義之下列序列：RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)及QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)。
該21B15抗體包含包括重鏈可變區(SEQ ID NO：44)及輕鏈可變區(SEQ ID NO：46)之抗體，該重鏈可變區由以下SEQ ID NO：47顯示之核酸序列編碼，且該輕鏈可變區由SEQ ID NO：48顯示之核酸序列編碼。
在下列序列中，包含如柯西亞等人(Chothia et al.,1989)所定義之CDR的胺基酸係以劃底線表示，而該些由卡巴等人(Kabat et al.,1991)所定義者係以粗體字強調。
21B15抗體之重鏈CDR具有如卡巴定義之下列序列：NYYWS(SEQ ID NO：72)、FIYYGGNTKYNPSLKS(SEQ ID NO：74)及ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)。21B15抗體之輕鏈CDR具有如卡巴定義之下列序列：RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)及QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)。
21B15抗體之重鏈CDR具有如柯西亞定義之下列序列：GSSISN(SEQ ID NO：111)、FIYYGGNTK(SEQ ID NO：110)及ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)。21B15抗體之輕鏈CDR具有如柯西亞定義之下列序列：RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)及QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)。
該23K12抗體包含包括重鏈可變區(SEQ ID NO：50)及輕鏈可變區(SEQ ID NO：52)之抗體，該重鏈可變區由以下SEQ ID NO：49顯示之核酸序列編碼，且該輕鏈可變區由SEQ ID NO：51顯示之核酸序列編碼。
在下列序列中，包含如柯西亞等人(Chothia et al.,1989)所定義之CDR的胺基酸係以劃底線表示，而該些由卡巴等人(Kabat et al.,1991)所定義者係以粗體字強調。
23K12抗體之重鏈CDR具有如卡巴定義之下列序列：SNYMS(SEQ ID NO：103)、VIYSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO：105)及CLSRMRGYGLDV(SEQ ID NO：107)。23K12抗體之輕鏈CDR具有如卡巴定義之下列序列：RTSQSISSYLN(SEQ ID NO：92)、AASSLQSGVPSRF(SEQ ID NO：94)及QQSYSMPA(SEQ ID NO：96)。
23K12抗體之重鏈CDR具有如柯西亞定義之下列序列：GFTVSSN(SEQ ID NO：112)、VIYSGGSTY(SEQ ID NO：113)及CLSRMRGYGLDV(SEQ ID NO：107)。23K12抗體之輕鏈CDR具有如柯西亞定義之下列序列：RTSQSISSYLN(SEQ ID NO：92)、AASSLQSGVPSRF(SEQ ID NO：94)及QQSYSMPA(SEQ ID NO：96)。
本發明之HuM2e抗體亦包括包含與SEQ ID NO：44或49之胺基酸序列具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高一致性之重鏈可變胺基酸序列及與SEQ ID NO：46或52之胺基酸序列具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高一致性之輕鏈可變胺基酸之抗體。
或者，該單株抗體係與8I10、21B15或23K12之相同表位結合之抗體。
M2e抗體之重鏈係源自種系V(可變)基因諸如舉例來說IgHV4或IgHV3種系基因。
本發明之M2e抗體包括由人IgHV4或IgHV3種系基因序列所編碼之可變重鏈(VH )區。IgHV4種系基因序列係顯示於例如登錄號L10088、M29812、M95114、X56360及M95117。IgHV3種系基因序列係顯示於例如登錄號X92218、X70208、Z27504、M99679及AB019437。本發明之M2e抗體包括由與IgHV4或IgHV3種系基因序列至少80%同源之核酸序列所編碼之VH 區。較佳的是，該核酸序列與IgHV4或IgHV3種系基因序列具有至少90%、95%、96%、97%之同源性，且更佳的是與IgHV4或IgHV3種系基因序列具有至少98%、99%之同源性。該M2e抗體之VH 區與由IgHV4或IgHV3VH 種系基因序列所編碼之VH 區的胺基酸序列具有至少80%之同源性。較佳的是，該M2e抗體之VH 區的胺基酸序列與由IgHV4或IgHV3種系基因序列所編碼之胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%之同源性，且更佳的是與由IgHV4或IgHV3種系基因序列所編碼之序列具有至少98%、99%之同源性。
本發明之M2e抗體亦包括由人IgKV1種系基因序列所編碼之可變輕鏈(VL )區。人IgKV1 VL 種系基因序列係顯示於例如登錄號X59315、X59312、X59318、J00248及Y14865。或者，該M2e抗體包括由與IgKV1種系基因序列至少80%同源之核酸序列所編碼之VL 區。較佳的是，該核酸序列與IgKV1種系基因序列具有至少90%、95%、96%、97%之同源性，且更佳的是與IgKV1種系基因序列具有至少98%、99%之同源性。該M2e抗體之VL 區與由IgKV1種系基因序列所編碼之VL 區的胺基酸序列具有至少80%之同源性。較佳的是，該M2e抗體之VL 區的胺基酸序列與由IgKV1種系基因序列所編碼之胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%之同源性，且更佳的是與由IgKV1種系基因序列所編碼之序列具有至少98%、99%之同源性。
除非另外加以定義，本發明所使用之科學性及技術性用語應具有該領域之一般技藝人士所通常了解之意義。另外，除非其他的文字要求，單數用語應包括複數意義且複數用語應包括單數意義。一般來說，與此處所描述之細胞及組織培養、分子生物學及蛋白質與寡或多核苷酸化學和雜交有關所使用之命名法及技術係該領域所廣為週知且經常使用者。標準技術係用於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉形(例如電穿孔法、脂轉染法(lipofection))。酶反應及純化技術係根據製造商之說明或如該領域經常完成或此處所描述之方式進行。除非特別相反地說明，本發明之實施將採用屬於該領域之技藝範圍內之病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學及重組DNA技術之習知方法，許多這些方法係於下描述以達說明之目的。該等技術係於文獻中徹底地解釋。參見例如Sambrook,et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd Edition,1989);Maniatis et al. Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982);DNA Cloning：A Practical Approach,vol. I & II(D. Glover,ed.);Oligonucleotide Synthesis(N. Gait,ed.,1984);Nucleic Acid Hybridization(B. Hames & S. Higgins,eds.,1985);Transcription and Translation(B. Hames & S. Higgins,eds.,1984);Animal Cell Culture(R. Freshney,ed.,1986);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)。
與此處所述之分析化學、合成有機化學及醫學和藥理化學有關所使用之命名法和實驗室方法及技術係該領域所廣為週知且經常使用者。標準技術係用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調製及遞送和病患治療。
下列定義有助於了解本發明：此處所使用之用語「抗體」(Ab)包括單株抗體、多株抗體、多重特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要它們展現所欲之生物活性。用語「免疫球蛋白」(Ig)在此處可與「抗體」交換使用。
「經分離之抗體」係指已與彼之天然環境中之成份分離及/或自其中收集之抗體。彼之天然環境中之污染成份係可干擾該抗體之診斷或治療用途之物質，可能包括酶、荷爾蒙及其他蛋白質性或非蛋白質性溶解物。在較佳之實施態樣中，該抗體係經純化至：(1)以洛里法(Lowry method)測定之超過95%之抗體重量，最佳為超過99%之重量；(2)藉由使用轉杯式定序儀足以獲得至少15個N端或內部胺基酸序列殘基之程度；或(3)藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍或較佳之銀染色所顯示之均質性。經分離之抗體包括在重組細胞內之原位抗體，因為該抗體之天然環境中之至少一種成份將不會存在。然而，一般來說，經分離之抗體將以至少一個純化步驟製備。
基本的四鏈抗體單位係由二個相同的輕鏈(L)和二個相同的重鏈(H)所組成之異型四聚體糖蛋白。IgM抗體係由5個基本的異型四聚體單位與稱為J鏈之額外多肽所組成，因此包含10個抗原結合位，同時分泌型IgA抗體可經聚合以形成包含2至5個基本四鏈單位與J鏈之多價集合體。以IgG為例，該四鏈單位通常約為150,000道耳頓。各L鏈係以一個共價雙硫鍵與H鏈連接，然而二個H鏈係由取決於該H鏈同型之一或多個雙硫鍵彼此連接。每條H鏈及L鏈亦具有規則間隔之鏈內雙硫鍵。各H鏈在N端具有一個可變結構域(VH )及隨後如各α及γ鏈中之3個固定結構域(CH )及如μ及ε同型中之4個CH 結構域。各L鏈在N端具有一個可變結構域(VL )，其後為位於另一端之一個固定結構域(CL )。VL 係與VH 對齊，且CL 係與重鏈之第一固定結構域(CH 1)對齊。特定胺基酸殘基被認為形成輕鏈與重鏈可變結構域之間的介面。該VH 及VL 對(The pairing of a VH and VL )共同形成單一抗原結合位。有關不同類型之抗體的結構與性質參見例如Basic and Clinical Immunology,8th edition,Daniel P. Stites,Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(eds.),Appleton ＆ Lange,Norwalk,Conn.,1994之第71頁及第6章。
來自任何脊椎動物之L鏈可根據彼等之固定結構域(CL )的胺基酸序列，被分成二種明顯不同的類型，稱為κ及λ。根據重鏈之固定結構域(CH )的胺基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同類型或同型(isotype)。共有五種類型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它們分別具有稱為α、δ、ε、γ和μ之重鏈。該γ和α類型進一步根據CH 序列及功能上之相對次要差異被分成亞型，例如人表現下列亞型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
用語「可變」係指抗體間之V結構域的特定區段有廣泛不同的序列。該V結構域介導抗原結合且定義特定抗體與彼之特定抗原的專一性。然而，該可變性並非均勻地分布在可變結構域之110個胺基酸跨距中。相反的，該V區係由稱為骨架區(FR)之15至30個胺基酸之相對不變異之片段，以及分隔該等骨架區之稱為「超變異區」之具有極度變異性之更短區域所組成，該些超變異區之長度各為9至12個胺基酸。天然重鏈及輕鏈之可變結構域各包含大部分採取β-摺板構型之四個FR，該四個FR係由三個形成連接該β-摺板結構之環，且在一些情況中形成該β-摺板結構之部分的超變異區所連接。各鏈中之超變異區係藉由FR而被近距離地拉在一起，且與來自另一鏈之超變異區形成抗體之抗原結合位(參見Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。固定結構域並不直接涉及抗體與抗原之結合，但是展現多種效應功能，諸如抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)中之抗體參與。
此處所使用之用語「超變異區」係指抗體中負責與抗原結合之胺基酸殘基。超變異區通常包含源自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如當根據卡巴編號系統編號時，大約在VL 之殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)附近，以及大約在VH 之31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)附近；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))；及/或該些源自「超變異環」之殘基(例如當根據柯西亞編號系統編號時，在VL 之殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)以及在VH 之殘基26-32(H1)、52-56(H2)及95-101(H3)；Chothia and Lesk,J. Mol. Biol. 196：901-917(1987))；及/或該些源自「超變異環」/CDR之殘基(例如當根據IMGT編號系統編號時，在VL 之殘基27-38(L1)、56-65(L2)及105-120(L3)以及在VH 之殘基27-38(H1)、56-65(H2)及105-120(H3)；Lefranc,M.P. et al. Nucl. AcidsRes. 27：209-212(1999),Ruiz,M. et al. Nucl. Acids Res. 28：219-221(2000))。可隨意選擇的是，該抗體在下列一或多點具有對稱之插入：當根據AHo編號時，VL 之28、36(L1)、63、74-75(L2)及123(L3)以及VH 之28、36(H1)、63、74-75(H2)及123(H3)；Honneger,A. and Plunkthun,A.J. Mol. Biol. 309：657-670(2001)。
「種系核酸殘基」係指天然發生於種系基因中之編碼固定或可變區之核酸殘基。「種系基因」係發現於生殖細胞(意即預定變成卵或精子之細胞)中之DNA。「種系突變」係指已發生於生殖細胞或單細胞階段之接合子中的特定DNA之可遺傳改變，且當傳遞至後代時，該突變被併入身體之每一個細胞中。種系突變與體突變相反，體突變係由單一體細胞獲得。在一些情況中，種系DNA序列中編碼可變區之核苷酸係經突變(例如體突變)且被不同之核苷酸取代。
此處所使用之用語「單株抗體」係指自實質上同源抗體之族群所獲得之抗體，意即除了可能少量存在之可能天然發生之突變以外，該個別抗體包含一致之族群。單株抗體具高度專一性，其係以單一抗原部位為目標。另外，和包括拮抗不同決定簇(表位)之不同抗體的多株抗體製劑不同的是，各單株抗體係以抗原上之單一決定簇為目標。除了彼等之專一性之外，單株抗體具有可在不受其他抗體污染下合成的優點。修飾語「單株」不應被視為需要藉由任何特定之方法產製抗體。舉例來說，本發明所使用之單株抗體可藉由最早由柯勒等人(Kohler et al.,Nature 256：495(1975))所描述之雜交瘤方法製備，或可在細菌、真核動物或植物細胞中利用重組DNA方法製備(參見例如美國專利號4,816,567)。該「單株抗體」亦可利用例如Clackson et al.,Nature 352：624-628(1991)及Marks et al.,J. Mol. Biol.,222：581-597(1991)所描述之技術自噬菌體抗體庫分離。
此處之單株抗體包括「嵌合」抗體，其中該重鏈及/或輕鏈之一部份係與源自特定物種之抗體中的對應序列相同或同源或屬於特定抗體類型或亞型，然而該鏈(多個鏈)之其餘部份係與源自另一物種之抗體中的對應序列相同或同源或屬於另一抗體類型或亞型，以及該等抗體之片段，只要它們展現所欲之生物活性(參見美國專利號4,816,567；及Morrison et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA,81：6851-6855(1984))。本發明提供源自人抗體之可變結構域抗原結合序列。因此，此處主要感興趣之嵌合抗體包括具有一或多個人抗原結合序列(例如CDR)且包含一或多個源自非人抗體之序列(例如FR或C區序列)的抗體。此外，此處主要感興趣之嵌合抗體包括該些包含一種抗體類型或亞型之人可變結構域抗原結合序列及源自另一抗體類型或亞型之另一序列(例如FR或C區序列)之抗體。此處感興趣之嵌合抗體亦包括該些包含與此處所描述之序列相關或源自不同物種諸如非人靈長動物(例如舊世界猴、猿等)之可變結構域抗原結合序列之抗體。嵌合抗體亦包括靈長動物化及人化抗體。
另外，嵌合抗體可能包含不見於接受者抗體或捐贈者抗體中之殘基。這些修飾係用來進一步改善抗體之表現。其他細節參見Jones et al.,Nature 321：522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332：323-329(1988)及Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2：593-596(1992)。
「人化」抗體通常被認為是具有自非人來源導入之一或多個胺基酸殘基之人抗體。該些非人胺基酸殘基通常被稱為「輸入」殘基，其通常取自「輸入」可變結構域。人化通常根據溫特(Winter)及同僚之方法(Jones et al.,Nature,321：522-525(1986);Reichmann et al.,Nature,332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239：1534-1536(1988))，藉由以輸入超變異區序列取代人抗體之該對應序列加以進行。因此該「人化」抗體係嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中實質上少於完整之人可變結構域已被該源自非人物種之對應序列所取代。
「人抗體」係僅包含存在於由人所天然產製之抗體中之序列的抗體。然而，此處所使用之人抗體可能包含不見於天然發生之人抗體中的殘基或修飾，包括該些此處所描述之修飾及變異序列。這些修飾及變異序列通常被用來進一步改善或增進抗體表現。
「完整」抗體係指包含抗原結合位以及CL 和至少重鏈固定結構域CH 1、CH 2及CH 3之抗體。該固定結構域可能是天然序列固定結構域(例如人天然序列固定結構域)或彼等之胺基酸序列變異體。較佳的是，完整抗體具有一或多種效應功能。
「抗體片段」包含完整抗體之一部份，較佳為該完整抗體之抗原結合或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2 及Fv片段；雙價抗體(diabodies)；線性抗體(參見美國專利號5,641,870；Zapata et al.,Protein Eng. 8(10)：1057-1062[1995])；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多重特異性抗體。
抗體之「功能性片段或類似物」一語係指具有與全長抗體共同之定性生物活性的化合物。舉例來說，抗IgE抗體之功能性片段或類似物係可與IgE免疫球蛋白結合以防止或實質上減低該分子能與高親和性受體Fcε RI結合之能力。
以木瓜酶消化抗體產製二個相同的抗原結合片段(稱為「Fab」片段)及一個殘餘的「Fc」片段(該命名反應其容易結晶化之能力)。Fab片段係由整個L鏈及H鏈的可變區結構域(VH )和一重鏈的第一固定結構域(CH 1)組成。每個Fab片段就抗原結合而言係單價，也就是其具有單一抗原結合位。以胃蛋白酶處理抗體產生大致對應二個以雙硫鍵連接之Fab片段的單一大型F(ab’)2 片段，其具有雙價抗原結合活性且仍能與抗原交聯。Fab’片段與Fab片段不同之處在於，Fab’在CH 1結構域之羧基端具有額外數個殘基，包括一或多個源自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab’-SH在此係指其中固定結構域之半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基團之Fab’。F(ab’)2 抗體片段原本係經產製為其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab’片段之對。其他抗體片段之化學偶合亦為已知。
「Fc」片段包含由雙硫鍵連在一起之二個H鏈的羧基端部份。抗體之效應功能係由Fc區之序列決定，該區亦為特定細胞種類上之Fc受體(FcR)所辨識之部份。
「Fv」係包含完整抗原辨識及抗原結合位之最小抗體片段。此片段係由一個重鏈可變區結構域及一個輕鏈可變區結構域以緊密、非共價連接所形成之二聚體組成。從這二個結構域之摺疊產生6個超變異環(H鏈及L鏈各形成3個環)，使得胺基酸殘基得以供抗原結合且將抗原結合專一性授予抗體。然而，即使是單一可變結構域(或Fv之一半，其僅包含3個對抗原具專一性之CDR)亦具有辨識及結合抗原之能力，只是其親和性相較於完整結合位為低。
「單鏈Fv」亦縮寫為「sFv」或「scFv」係指包含連接成單一多肽鏈之VH 及VL 抗體結構域的抗體片段。較佳的是，該sFv多肽另包含介於VH 及VL 結構域之間的多肽連接子，該連接子使得sFv得以形成供抗原結合之所欲結構。有關sFv之回顧性文獻參見Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994);Borrebaeck 1995,如下所述。
用語「雙價抗體」係指藉由建構在VH 及VL 結構域之間具有短連接子(約5至10個殘基)之sFv片段(見上段)所製備之小型抗體片段，以使得達成V結構域之鏈間但非鏈內配對，導致雙價片段也就是具有2個抗原結合位之片段。雙專一性雙價抗體係2個「交叉」sFv片段之異型二聚體，其中該二個抗體之VH 及VL 結構域係存在於不同多肽鏈上。雙價抗體係於例如EP 404,097;WO 93/11161及Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90：6444-6448(1993)中更清楚地描述。
如此處所使用，經「內化」之抗體係指當與哺乳動物細胞上之抗原(例如細胞表面多肽或受體)結合時被細胞攝入(意即進入細胞)之抗體。該經內化之抗體當然包括抗體片段、人或嵌合抗體及抗體共軛物。就特定治療應用而言，活體內內化係被考慮的。經內化之抗體分子的數量將足以或適當地殺滅細胞或抑制彼之生長，特別是經感染之細胞。根據該抗體或抗體共軛物之效價，在一些情況中，攝取單一抗體分子進入細胞中足以殺滅該抗體結合之目標細胞。舉例來說，特定毒素具高度殺滅功效，因此內化與抗體共軛之一分子之毒素足以殺滅該感染細胞。
如此處所使用，抗體被稱為對抗原「具免疫專一性」、「具專一性」或「專一性地結合」，若該抗體和抗原以可偵測之量反應，較佳為親和常數Ka 大於或等於約104 M-1 ，或大於或等於約105 M-1 ，大於或等於約106 M-1 ，大於或等於約107 M-1 ，或大於或等於108 M-1 。抗體對彼之同源(cognate)抗原之親和性亦經常以解離常數KD 表示，在特定實施態樣中，HuM2e抗體與M2e專一性地結合，如果其以小於或等於10-4 M、小於或等於約10-5 M、小於或等於約10-6 M、小於或等於10-7 M、或小於或等於10-8 M之KD 結合。抗體之親和性可利用習知技術輕易地測定，例如該些由Scatchard et al.(Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51：660(1949))所描述者。
抗體與抗原、細胞或彼之組織之結合特性通常利用免疫偵測方法測量及檢測，包括舉例來說免疫螢光基底測定法，諸如免疫組織化學(IHC)及/或螢光活化細胞分選法(FACS)。
具有指定抗體之「生物性特徵」之抗體係具備該抗體之一或多種生物性特徵之抗體，該生物性特徵能使其與其他抗體區別。舉例來說，在特定實施態樣中，具有指定抗體之生物性特徵之抗體將與該指定抗體所結合之相同表位結合及/或與該指定抗體具有共同之效應功能。
用語「拮抗劑」抗體係以最廣泛的意義被使用，包括部份或完全阻斷、抑制或中和其所專一性結合之表位、多肽或細胞的生物活性之抗體。鑑別拮抗劑抗體之方法可能包含使被候選拮抗劑抗體專一性結合之多肽或細胞與該候選拮抗劑抗體接觸，並測量正常與該多肽或細胞有關之一或多種生物活性之可偵測變化。
「抑制感染細胞生長之抗體」或「生長抑制性」抗體係指與感染細胞結合且導致該感染細胞可測量之生長抑制之抗體，該感染細胞表現或能表現被抗體結合之M2e表位。相較於適當之對照物，較佳之生長抑制性抗體抑制超過20%、較佳自約20%至約50%、且甚至更佳超過50%(例如自約50%至約100%)之感染細胞生長，該對照物通常為未經測試抗體處理之感染細胞。生長抑制可在細胞培養中之抗體濃度約0.1至30微克/毫升或約0.5nM至200nM時被測量，其中生長抑制係於感染細胞暴露於該抗體後1至10天測定。活體內感染細胞之生長抑制測定可利用該領域已知之各種方式測定。若投予約1微克/公斤至約100毫克/公斤體重之抗體導致感染細胞之百分比或感染細胞總數在第一次投予該抗體之約5天至3個月以內降低，較佳為在約5天至30天以內降低，則該抗體在活體內具生長抑制性。
「誘發細胞凋亡」之抗體係指誘發計畫性細胞死亡之抗體，細胞死亡係由膜聯蛋白V(annexin V)結合、DNA段裂(fragmentation)、細胞萎縮、內質網擴張、細胞段裂及/或形成膜囊泡(稱為細胞凋亡體)所測定。該細胞較佳為感染細胞。多種方法可被取得以用於評估與細胞凋亡有關之細胞事件。舉例來說，磷脂醯絲胺酸(PS)轉位可由膜聯蛋白結合測量；DNA段裂可透過DNA階梯現象(laddering)評估；及核/染色質濃縮還有DNA段裂可藉由亞二倍體細胞之任何增加加以評估。較佳的是，在膜聯蛋白結合試驗中誘發細胞凋亡之抗體係導致相較於未經處理之細胞約2至50倍、較佳約5至50倍、且最佳約10至50倍膜聯蛋白結合誘發之抗體。
抗體「效應功能」係指該些可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)的生物活性，且隨抗體同型而異。抗體效應功能之實例包括Clq結合及補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合、抗體依賴性細胞媒介細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)及B細胞活化。
「抗體依賴性細胞媒介細胞毒性」或「ADCC」係指一種形式之細胞毒性，其中分泌型Ig與存在特定細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)結合使這些細胞毒性效應細胞能專一性地與抗原攜帶標靶細胞結合，接著以細胞毒素殺滅該標靶細胞。該抗體「武裝」該細胞毒性細胞，且為該殺滅作用所需。媒介ADCC之主要細胞NK細胞僅表現FcγRIII，然而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現摘列於Ravetch and Rinet,Annu. Rev. Immunol 9：457-92(1991)第464頁表3中。要評估感興趣分子之ADCC活性，可進行活體外(in vitro )ADCC試驗，諸如美國專利第5,500,362號或美國專利第5,821,337號中所描述者。可用於該試驗之效應細胞包括週邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。二者擇一或另外地，感興趣分子之ADCC活性可於活體內(in vivo )評估，例如於諸如Clynes et al.,PNAS(USA)95：652-656(1998)中所揭示之動物模型。
「Fc受體」或「FcR」描述與抗體之Fc區結合之受體。在特定實施態樣中，該FcR係天然序列之人FcR。另外，較佳之FcR係與IgG抗體結合之受體(γ受體)且包括Fcγ RI、Fcγ RII及Fcγ RIII亞型之受體，包括該等受體之等位變異體及可選擇的剪切形式。Fcγ RII受體包括Fcγ RIIA(「活化受體」)及Fcγ RIIB(「抑制受體」)，該等受體具有類似之胺基酸序列，而主要差異在於彼等之細胞質結構域。活化受體Fcγ RIIA在其細胞質結構域中包含免疫受體酪胺酸基底之活化模體(ITAM)。抑制受體Fcγ RIIB在其細胞質結構域中包含免疫受體酪胺酸基底之抑制模體(ITIM)。(見回顧文獻M.in Daeron,Annu. Rev. Immunol. 15：203-234(1997))。FcR係於Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol 9：457-92(1991);Capel et al.,Immunomethods 4：25-34(1994)及de Haas et al.,J. Lab. Clin. Med. 126：330-41(1995)中回顧。其他FcR包括該些將於未來鑑別者被包含在此處之用語「FcR」中。該用語亦包括新生兒受體FcRn，該受體負責轉運母體IgG至胎兒(Guyer et al.,J. Immunol. 117：587(1976)and Kim et al.,J. Immunol. 24：249(1994))。
「人效應細胞」係表現一或多種FcR且執行效應功能之白血球。較佳的是，該等細胞表現至少Fcγ RIII且執行ADCC效應功能。媒介ADCC之人白血球之實例包括PBMC、NK細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性細胞；較佳者為PBMC及NK細胞。該等效應細胞可自天然來源例如自血液分離。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指補體存在時之標靶細胞溶解。典型補體途徑之活化係始於該補體系統之第一成分(Clq)與(適當亞型之)抗體之結合，該抗體係與彼等之同源抗原結合。為了評估補體活化，可進行例如Gazzano-Santoro et al.,J. Immunol. Methods 202：163(1996)所述之CDC試驗。
用語「A型流感」及「A型流感病毒」係指屬於病毒之正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)之一屬(genus)。A型流感病毒僅包括一個種(species)，即造成禽類、人類、豬及馬之流感之A型流感病毒。所有A型流感病毒亞型之毒株已自野生禽類分離，但是不常造成疾病。某些A型流感病毒之分離株造成家禽及人(但罕見)之嚴重疾病。
就治療感染之目的而言，「哺乳動物」係指任何哺乳動物，包括人、家畜、農場動物、動物園動物、競賽動物或寵物動物，諸如犬、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔等。較佳的是，該哺乳動物係人。
「治療(treating)」或「治療(treatment)」或「減輕(alleviation)」係指治療性治療及預防性(prophylactic or preventative)處理二者；其中之目的係預防或減緩(減輕)該標的病理狀況或疾患。該些需要治療者包括該些已經罹患該疾患者以及該些易於罹患該疾患者或該些欲預防該疾患者。個體或哺乳動物係經成功地「治療」感染，如果在根據本發明之方法接受治療量之抗體後，該病患顯示可觀察及/或可測量之下列一或多項之減少或不存在：感染細胞之數量減少或感染細胞不存在；經感染之總細胞百分比下降；及/或一或多種與該特定感染有關之徵候經緩解至若干程度；發病率及死亡率下降；及生活品質改善。上述用於評估成功治療及改善疾病之參數可輕易地藉由醫師所熟悉之例行程序測量。
用語「治療有效量」係指能有效「治療」個體或哺乳動物之疾病或疾患之抗體或藥物的量。見前述有關「治療」之定義。
「慢性」投予係指以利急性模式相反之連續模式投予該劑，以在延長的時間期間維持最初治療效用(活性)。「間歇」投予係指具循環性質而非連續進行不中斷之治療。
與一或多種其他治療劑「組合」投予包括依任何順序同時(同步)且連續地投予。
此處所使用之「載體」包括當細胞或哺乳動物暴露於彼所使用之劑量及濃度時不具毒性之醫藥上可接受之載體、賦形劑或穩定劑。生理上可接受之載體通常是含水pH緩衝溶液。生理上可接受之載體實例包括緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮；胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、雙糖及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑諸如EDTA；糖醇諸如甘露醇或山梨醇；鹽形成反離子諸如鈉；及/或非離子性介面活性劑諸如TWEENTM 、聚乙二醇(PEG)及PLURONICSTM 。
此處所使用之用語「細胞毒性劑」係指抑制或防止細胞功能及/或造成細胞破壞之物質。該用語係意圖包括放射性同位素(例如At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 及Lu之放射性同位素)、化學治療劑例如甲胺喋呤(methotrexate)、甲烯土黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(諸如長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、阿黴素(doxorubicin)、黴法蘭(melphalan)、絲裂黴素C、氯芥苯丁酸、正定黴素(daunorubicin)或其他插入劑、酶及彼之片段諸如核分解酶、抗生素及毒素諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包括彼等之片段及/或變異體，及如下揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。其他細胞毒性劑於下描述。
此處所使用之「生長抑制劑」係指不論在活體外或活體內抑制細胞生長之化合物或組成物。生長抑制劑之實例包括阻斷細胞週期進行之劑，諸如誘發G1期停滯及M期停滯之劑。典型的M期阻斷劑包括長春花生物鹼(諸如長春新鹼(vincristine)、長春瑞濱(vinorelbine)及長春鹼(vinblastine))、紫杉烷(taxane)及拓撲異構酶II抑制劑諸如阿黴素(doxorubicin)、表阿黴素(epirubicin)、正定黴素(daunorubicin)、依扥泊苷(etoposide)及博來黴素(bleomycin)。該些停止G1期之劑亦涉及S期停滯，例如DNA烷化劑諸如它莫西芬(tamoxifen)、強體松(prednisone)、氮烯唑胺(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、甲胺喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)及阿糖胞苷(ara-C)。其他資訊可見於The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn and Israel,eds.,Chapter 1, entitled“Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”by Murakami et al. (W B Saunders：Philadelphia,1995)，特別是第13頁。紫杉烷(太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西紫杉醇(docetaxel))均係源自紫杉樹之抗癌藥。源自歐洲紫杉之多西紫杉醇(TAXOTERETM ，羅納普朗克羅爾(Rhone-Poulenc Rorer)公司)係太平洋紫杉醇(TAXOL，必治妥施貴寶(Bristol-Myers Squibb)公司)之半合成類似物。太平洋紫杉醇及多西紫杉醇增進微管從微管蛋白二聚體之聚合且藉由防止去聚合化以穩定微管，此導致抑制細胞之有絲分裂。
此處所使用之「標記」係指可偵測之化合物或組成物，其直接或間接地與抗體共軛以產生「經標記之」抗體。該標記本身為可偵測(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶標記之例中酶催化可偵測之受質化合物或組成物之化學改變。
此處所使用之用語「表位標籤」係指一種嵌合多肽，其包含與「多肽標籤」融合之多肽。該多肽標籤具有足夠之殘基以提供能產製拮抗彼之抗體之表位，同時又夠短而不至於干擾彼所融合之多肽的活性。較佳之多肽標籤亦相當獨特，以使該抗體實質上不與其他表位交叉反應。適當之多肽標籤通常具有至少6個胺基酸殘基且通常介於約8至50個胺基酸殘基(較佳為介於約10至20個胺基酸殘基)。
此處所定義之「小分子」具有低於約500道爾頓之分子量。
用語「核酸」及「多核苷酸」在此處可交換使用，係指單股或雙股RNA、DNA或混合聚合物。多核苷酸可能包括基因組序列、基因組外及質體序列及表現或經適應以表現多肽之更小工程化基因區段。
「經分離之核酸」係實質上與其他基因組DNA序列以及自然伴隨天然序列之蛋白質或複合物諸如核糖體及聚合酶分開之核酸。該用語包含已自其天然發生環境中移除之核酸序列，且包括重組或經選殖之DNA分離物及化學合成之類似物或由異源性系統生物合成之類似物。實質上純的核酸包括分離形式之核酸。當然，這係指原本分離之核酸且不排除稍後由人工添加至該經分離之核酸之基因或序列。
用語「多肽」係以其習知之意義使用，意即胺基酸序列。多肽不限於特定長度之產物。肽、寡肽及蛋白質均包括在多肽之定義中，且該些用語在此處可被交換使用除非另外特別說明。此用語亦不代表或排除多肽之表現後修飾，舉例來說糖基化、乙醯化、磷酸化及類似作用，還有該領域已知之天然發生及非天然發生之其他修飾。多肽可為完整蛋白質或彼之子序列。本發明所感興趣之特定多肽係包含CDR且能與抗原或經A型流感感染之細胞結合之胺基酸子序列。
「經分離之多肽」係指已被鑑別且與彼之天然環境中之成份分離及/或自其中收集之多肽。在較佳之實施態樣中，該經分離之多肽將被純化至(1)以洛里法(Lowry method)測定之超過95%之多肽重量，最佳為超過99%之重量；(2)藉由使用轉杯式定序儀足以獲得至少15個N端或內部胺基酸序列殘基之程度；或(3)藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍或較佳為銀染色所顯示之均質性。經分離之多肽包括在重組細胞內之原位多肽，因為該多肽之天然環境中之至少一種成份將不會存在。然而，一般來說，經分離之多肽將以至少一個純化步驟製備。
「天然序列」多核苷酸係與源自天然之多核苷酸具有相同核苷酸序列之多核苷酸。「天然序列」多肽係與源自天然(例如源自任何物種)之多肽(例如抗體)具有相同胺基酸序列之多肽。該等天然序列多核苷酸及多肽可自天然中分離或可藉由重組或合成方法產製。
此處所使用之用語多核苷酸「變異體」係指與此處所特別揭示之多核苷酸具有一或多個取代、缺失、添加及/或插入之典型差異的多核苷酸。該變異體可為天然發生或經合成產製，舉例來說藉由修飾本發明之一或多個多核苷酸序列及如此處所述及/或使用任何該領域所廣為週知之數種技術以評估該編碼多肽之一或多種生物活性。
此處所使用之用語多肽「變異體」係指與此處所特別揭示之多肽具有一或多個取代、缺失、添加及/或插入之典型差異的多肽。該變異體可為天然發生或經合成產製，舉例來說藉由修飾本發明上述之一或多個多肽序列及如此處所述及/或使用任何該領域所廣為週知之數種技術以評估該多肽之一或多種生物活性。
修飾可發生於本發明之多核苷酸及多肽之結構中，且仍能獲得編碼具有所欲特徵之變異體或衍生性多肽之功能性分子。當想要改變多肽之胺基酸序列以產製本發明之多肽之相等物或甚至經改善之變異物或部份時，該領域之技藝人士通常將改變該編碼DNA序列之一或多個密碼子。
舉例來說，蛋白質結構中之特定胺基酸可能被其他胺基酸取代而不顯著喪失彼與其他多肽(例如抗原)或細胞結合之能力。由於蛋白質之生物功能活性係由蛋白質之結合能力與特性所定義，因此可在蛋白質序列和當然彼之基礎DNA編碼序列中進行特定胺基酸序列取代，仍能獲得具有類似特性之蛋白質。因此可以考慮在該揭示之組成物的肽序列或編碼該肽之對應DNA序列中進行各種改變而不顯著喪失彼等之生物利用性或活性。
在許多情況中，多肽變異體將包含一或多個保留性取代。「保留性取代」係指其中胺基酸被另一具有類似特性之胺基酸所取代之取代，因此肽化學領域之技藝人士將預期該多肽之二級結構及水合特性實質上並未改變。
在進行該類改變時，可考慮胺基酸之水合指數。胺基酸水合指數在賦予蛋白質交互性生物功能上之重要性係為該領域所普遍暸解(Kyte and Doolittle,1982)。一般認為胺基酸之相對水合特性導致該形成蛋白質之二級結構，因此定義該蛋白質與其他分子例如酶、受質、受體、DNA、抗體、抗原及該類似物之交互作用。每種胺基酸根據其疏水性及帶電特性被指定水合指數(Kyte and Doolittle,1982)。這些數值為異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺酸(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
該領域已知的是，特定胺基酸可能被其他具有類似水合指數或分數之胺基酸取代，仍導致具有類似生物活性之蛋白質，也就是仍能獲得生物功能性相等蛋白質。在進行該些改變時，較佳的是其水合指數在±2以內之胺基酸取代，特別較佳的是該些在±1以內者，及甚至特別更佳的是該些在±0.5以內者。該領域亦了解的是，類似胺基酸之取代可根據親水性有效地進行。美國專利第4,554,101號陳述，由鄰近胺基酸之親水性所決定之蛋白質的最高局部平均親水性係與該蛋白質之生物特性有關。
如美國專利第4,554,101號中所詳述，下列親水性數值已被指定給胺基酸殘基：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺酸(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。應了解的是，胺基酸可被另一具有類似親水性數值之胺基酸取代，且仍能獲得生物相等性特別是免疫相等性蛋白質。在該等改變中，較佳的是其親水性數值在±2以內之胺基酸取代，特別較佳的是該些在±1以內者，甚至特別更佳的是該些在±0.5以內者。
如上所述，胺基酸取代因此大致係根據胺基酸側鏈取代基之相對類似性而定，舉例來說，彼等之疏水性、親水性、電荷、大小及類似特性。考慮前述各種特徵之示範性取代係該領域之技藝人士所廣為週知且包括：精胺酸與離胺酸；麩胺酸與天冬胺酸；絲胺酸與蘇胺酸；麩醯胺酸與天冬醯胺酸；及纈胺酸、白胺酸與異白胺酸。
胺基酸取代可能另外根據殘基之極性、帶電性、可溶性、疏水性、親水性及/或兩親(amphipathic)特性之類似性加以進行。舉例來說，帶負電之胺基酸包括天冬胺酸與麩胺酸；帶正電之胺基酸包括離胺酸與精胺酸；及具有類似親水性數值之不帶電極性頭基團之胺基酸包括白胺酸、異白胺酸與纈胺酸；甘胺酸與丙胺酸；天冬醯胺酸與麩醯胺酸；及絲胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸與酪胺酸。其他可能代表保留性改變之胺基酸群組包括：(1)丙胺酸、脯胺酸、甘胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸；(2)半胱胺酸、絲胺酸、酪胺酸、蘇胺酸；(3)纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸；(4)離胺酸、精胺酸、組胺酸；及(5)苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、組胺酸。變異體亦可能或可選擇的包含非保留性改變。在較佳之實施態樣中，變異體多肽與天然序列之差異在於5個或少於5個胺基酸之取代、缺失或添加。變異體亦可能(或可選擇的)舉例來說藉由缺失或添加對該多肽之免疫原性、二級結構及水合特性具有最小影響之胺基酸加以修飾。
多肽可能包含蛋白質N末端之信號(或前導)序列，該序列共轉譯或後轉譯地引導該蛋白質之轉移。該多肽亦可能與連接子或其他序列共軛以方便合成、純化或鑑定該多肽(例如poly-His)，或增進該多肽與固態支持物之結合。舉例來說，多肽可能與免疫球蛋白Fc區共軛。
當比較多核苷酸及多肽序列時，若以如下所述之最高對應性排比，而二個序列中之核苷酸或胺基酸序列係為相同，則該二個序列被稱為「一致」。兩個序列之間的比較通常藉由在比較窗中比較序列加以進行，以識別及比較具有序列相似性之局部區域。此處所使用之「比較窗」係指至少約20個、通常為30個至約75個、或40個至約50個連續位置之區段，其中當二個序列係經最佳排比後，序列可與具有相同連續位置數量之參照序列比較。
供比較之序列的最佳排比可使用雷斯基(Lasergene)生物資訊套裝軟體中之邁佳來(Megalign)程式(威斯康辛州麥迪遜市DNASTAR公司)利用內建參數進行。此程式具體化下列參考文獻所述之數種排比計畫：Dayhoff,M.O.(1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff,M.O.(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol. 5,Suppl. 3,pp. 345-358;Hein J.(1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645Methods in Enzymology vol. 183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA;Higgins,D.G. and Sharp,P.M.(1989)CABIOS 5 ：151-153;Myers,E.W. and Muller W.(1988)CABIOS 4 ：11-17;Robinson,E.D.(1971)Comb. Theor. 11 ：105;Santou,N.,Nes,M.(1987)Mol. Biol. Evol. 4 ：406-425;Sneath,P.H.A. and Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy ,Freeman Press,San Francisco,CA;Wilbur,W.J. and Lipman,D.J.(1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730。
可選擇的是，供比較之最佳序列的排比可藉由史密斯和華特曼(Smith and Waterman)(1981)Add. APL. Math 2：482之區域一致性運算法、藉由尼德曼和文施(Needleman and Wunsch)(1970)J. Mol. Biol. 48：443之一致性排比運算法、藉由皮爾森和李普曼(Pearson and Lipman)(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：2444之尋找類似性方法、藉由這些運算法之電腦化實現(威斯康辛基因學套裝軟體中之GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA，基因學電腦集團公司(Genetics Computer Group(GCG))，威斯康辛州麥迪遜市科學大道575號)、或藉由檢視加以進行。
適合用於測定序列一致性及序列相似性百分比之運算法的較佳實例為BLAST及BLAST 2.0運算法，彼等分別於Altschul et al.(1977)Nucl. Acids Res. 25：3389-3402及Altschul et al.(1990)J. Mol. Biol. 215：403-410中描述。BLAST及BLAST 2.0可利用例如此處所述之參數，以測定本發明之多核苷酸及多肽之序列一致性百分比。執行BLAST分析之軟體透過美國國家生物技術資料中心(National Center for Biotechnology Information)開放大眾使用。
在一說明性實例中，核苷酸序列之累計得分可利用參數M(匹配殘基對之獎勵得分；一定＞0)及N(誤配殘基之罰分；一定＜0)計算。當累計排比總分從彼之最高達到值減少X之量；該累計總分因為累積一或多個負值殘基排比而變成0或負值；或到達任一序列之末端時，往命中字(word hits)各方向之擴展被停止。BLAST運算法參數W、T及X決定該排比之靈敏度及速度。BLASTN程式(用於核苷酸序列)使用之參數預設值為字長(W)11，期望值(E)10，及BLOSUM62計分矩陣(見Henikoff and Henikoff(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915)排比，(B)50，期望值(E)10，M=5，N=-4及雙股之比較。
就胺基酸序列而言，可使用計分矩陣以計算累計得分。當累計排比總分從彼之最高達到值減少X之量；該累計總分因為累積一或多個負值殘基排比而變成0或負值；或到達任一序列之末端時，往命中字(word hits)各方向之擴展被停止。BLAST運算法參數W、T及X決定該排比之靈敏度及速度。
在一方法中，「序列一致性百分比」係透過至少20個位置之比較窗藉由比較二個最佳排比序列加以決定，其中在比較窗中多核苷酸或多肽序列之部分相較於參照序列(其不包含添加或缺失)可能包含20%或低於20%、通常為5%至15%、或10%至12%之添加或缺失(意即空格)以達該二個序列之最佳排比。百分比之計算係藉由測定二個序列中發生一致之核酸鹼基或胺基酸殘基之位置的數目，以產生匹配位置之數目，將該匹配位置之數目除以參照序列之位置總數(意即窗之大小)，並將該結果乘以100以得到序列一致性百分比。
「同源性」係指在排比序列及導入空格(若需要)以達最高同源性百分比後，在多核苷酸或多肽序列變異體與非變異體序列中一致之殘基的百分比。在特定實施態樣中，多核苷酸及多肽變異體與此處所述之多核苷酸或多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%之多核苷酸或多肽同源性。
「載體(vector)」包括穿梭及表現載體。一般來說，質體建構物亦將包括分別供複製及選擇細菌中之質體之複製起點(例如Co1E1複製起點)及可選擇標記(例如安比西林(ampicillin)或四環素抗性)。「表現載體」係指包含必要控制序列或調節元件以供抗體(包括本發明之抗體片段)於細菌或真核細胞中表現之載體。適當之載體於下揭示。
如本說明書及附加之申請專利範圍請求項中所使用，單數形式之「一」(a,an)及「該」(the)包括複數之提及物(references)除非文章另外清楚說明。
本發明包括包含本發明之多肽之HuM2e抗體，該HuM2e抗體包括該些由實施例1所述之多核苷酸序列所編碼之多肽及實施例1及2所述之胺基酸序列，及彼等之片段及變異體。在一實施態樣中，該抗體係此處稱為8i10、21B15或23K12之抗體。相較於未經感染之相同細胞類型之對照細胞，這些抗體優先地結合或專一性地結合經A型流感感染之細胞。
在特定實施態樣中，本發明之抗體與M2蛋白結合。在特定實施態樣中，本發明提供與僅存在於天然構型意即在細胞中表現之M2e內之表位結合之HuM2e抗體。在特定實施態樣中，這些抗體無法與經分離之M2e多肽專一性結合，例如23個胺基酸殘基之M2e片段。應了解的是，這些抗體辨識該M2肽之非線性(意即構型)表位。
這些在M2蛋白質(特別是M2e)內之專一性構型表位可被用來作為疫苗以預防個體發生流感感染。
如該領域之技藝人士將瞭解的，此處對抗體之一般描述及製備及使用該相同抗體之方法亦適用於個別抗體多肽組成份及抗體片段。
本發明之抗體可為多株或單株抗體。然而在較佳之實施態樣中，該些抗體為單株抗體。在特定實施態樣中，本發明之抗體係全人抗體。產製多株及單株抗體之方法係該領域所知，且一般性地描述於例如美國專利第6,824,780號。本發明之抗體通常利用該領域可取得之載體及方法經重組產製，於下另外描述。人抗體亦可由活體外經活化之B細胞產製(見美國專利第5,567,610及5,229.275號)。
人抗體亦可於基因轉殖動物(例如小鼠)中製備，該基因轉殖動物能產製整套人抗體而不產製內源性免疫球蛋白時。舉例來說，已被描述的是在嵌合及種系突變小鼠中之抗體重鏈連接區(JH )基因同合子缺失導致完全抑制內源性抗體產製。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉移至該種系突變小鼠導致受到抗原刺激時產製人抗體。見例如Jakobovits et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90：2551(1993);Jakobovits et al.,Nature,362：255-258(1993);Bruggemann et al.,Year in Immuno.,7：33(1993);美國專利號5,545,806,5,569,825,5,591,669(所有皆屬於建法(GenPharm)公司)；美國專利號5,545,807及WO 97/17852。該動物可能經基因工程化以產製包含本發明之多肽之人抗體。
在特定實施態樣中，本發明之抗體係包含源自人及非人來源序列之嵌合抗體。在特定實施態樣中，這些嵌合抗體係經人化或靈長動物化(primatizedTM )。實際上，人化抗體通常是其中一些超變異區殘基及可能一些FR殘基被源自齧齒動物抗體之類似位置的殘基所取代之人抗體。
在本發明之情況中，嵌合抗體亦包括完全人抗體，其中該人超變異區或一或多個CDR被保留，但是一或多個其他序列之區已被來自非人動物之對應序列所取代。
當抗體係意圖供人治療之用途時，很重要的是選擇欲用於製備嵌合抗體之非人重鏈及輕鏈序列，以降低抗原性及人抗非人抗體反應。另外重要的是，嵌合抗體維持對抗原之高結合親和性及其他有利之生物特性。為了達成此目的，根據較佳之方法，嵌合抗體係藉由使用親代人及非人序列之三維模型對親代序列及各種概念性嵌合產物進行分析以製備。免疫球蛋白之三維模型通常可獲得且係該領域之技藝人士所熟悉。說明及展示經選擇之候選免疫球蛋白序列之可能的三維構型結構之電腦程式係可取得的。檢視這些展示能對殘基在該候選免疫球蛋白序列之功能上的可能作用進行分析，也就是分析會影響候選免疫球蛋白與彼之抗原結合之能力的殘基。利用這種方式，可自接受者及輸入序列選擇及組合FR殘基，以達成該所欲之抗體特徵諸如提高對目標抗原之親和性。一般來說，超變異區殘基係直接且最為實質地涉及影響抗原結合。
如上所述，抗體(或免疫球蛋白)可根據重鏈之固定區中的胺基酸序列差異被分成五種不同類型。在給定類型內之所有免疫球蛋白具有非常類似之重鏈固定區。這些差異可藉由序列試驗或更常藉由血清學方法(意即使用以這些差異為目標之抗體)偵測。本發明之抗體或彼之片段可為任何類型，因此可能具有γ、μ、α、δ或ε重鏈。γ鏈可能為γ1、γ2、γ3或γ4；α鏈可能為α1或α2。
在較佳之實施態樣中，本發明之抗體或彼之片段係IgG。IgG被認為是最多變之免疫球蛋白，因為其能進行所有免疫球蛋白分子之功能。IgG係血清中主要的Ig，且係唯一可穿越胎盤之Ig類型。IgG亦能固定補體，但IgG4亞型則否。巨噬細胞、單核細胞、PMN及一些淋巴細胞具有IgG之Fc區的Fc受體。不是所有亞型都同樣良好地結合，IgG2及IgG4不與Fc受體結合。與PMN、單核細胞及巨噬細胞上之Fc受體結合的結果使該細胞可更佳地內化抗原。IgG係增進吞噬作用之調理素。IgG與其他細胞類型上之Fc受體結合導致其他功能之活化。本發明之抗體可能為任何IgG亞型。
在另一較佳之實施態樣中，本發明之抗體或彼之片段係IgE。IgE是最不常見之血清Ig，因為甚至在與抗原交互作用之前，其已與嗜鹼細胞及肥胖細胞上之Fc受體非常緊密地結合。由於IgE與嗜鹼細胞及肥胖細胞結合，因此與過敏反應有關。過敏原與細胞上之IgE結合導致釋放各種造成過敏徵候之藥理媒介物。IgE在寄生蟲性蠕蟲疾病中亦有作用。嗜酸細胞具有IgE之Fc受體，且嗜酸細胞與IgE包被之蠕蟲結合導致殺滅該寄生蟲。IgE不固定補體。
在多種實施態樣中，本發明之抗體或彼之片段包含κ或λ之可變輕鏈。λ鏈可為任何亞型，包括例如λ1、λ2、λ3及λ4。
如上所述，本發明另提供包含本發明之多肽之抗體片段。在特定情況中，使用抗體片段而非完整抗體具有好處。舉例來說，較小之片段大小允許快速廓清，且可能導致促進進入特定組織，諸如實質腫瘤。抗體片段之實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2 及Fv片段；雙價抗體(diabodies)；線性抗體；單鏈抗體；及由抗體片段形成之多重特異性抗體。
多種技術已被發展以用於產製抗體片段。傳統上，該些片段係源自完整抗體之蛋白溶解消化(見例如Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992);and Brennan et al.,Science,229：81(1985))。然而，這些片段現在可藉由重組宿主細胞直接產製。Fab、Fv及ScFv抗體片段均可在大腸桿菌中表現及由大腸桿菌分泌，因此允許輕易地大量產製這些片段。Fab’-SH片段可直接從大腸桿菌收集，並經化學偶合以形成F(ab’)2 片段(Carter et al.,Bio/Technology 10：163-167(1992))。根據另一方法，F(ab’)2 片段可直接自重組宿主細胞培養分離。包含救援受體結合表位殘基之活體內半衰期延長之Fab及F(ab’)2 片段係於美國專利第5,869,046號中描述。其他用於產製抗體片段之技術將為技藝人士所顯而易見。
在其他實施態樣中，首選抗體係單鏈Fv片段(scFv)。見WO 93/16185；美國專利第5,571,894及5,587,458號。Fv及sFv係唯一具有完整結合位置但不含固定區之片段。因此，它們適用於降低活體內使用期間之非專一性結合。sFv融合蛋白可被建構以使效應蛋白融合於sFv之胺基或羧基端。見Antibody Engineering,ed. Borrebaeck，同上 。該抗體片段亦可為例如美國專利5,641,870中所描述之「線性抗體」。該線性抗體片段可為單特異性或雙特異性。
在特定實施態樣中，本發明之抗體係雙特異性或多重特異性。雙特異性抗體係對至少二種不同表位具有結合專一性之抗體。示範性雙特異性抗體可與單一抗原之二個不同的表位結合。其他該等抗體可能組合第一抗原結合位與對第二抗原之結合位。或者，抗M2e臂可能與另一臂組合，該臂與白血球上之刺激分子諸如T細胞受體分子(例如CD3)或IgG之Fc受體(Fcγ R)諸如Fcγ RI(CD64)、Fcγ RII(CD32)及Fcγ RIII(CD16)結合，以使細胞防禦機制被專注及侷限在該經感染之細胞。雙特異性抗體亦可被用來將細胞毒性劑侷限於該經感染之細胞。這些抗體具有M2e結合臂及與細胞毒性劑(例如皂草毒蛋白(saporin)、抗干擾素α、長春花生物鹼、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、甲胺喋呤或放射線活性同位素半抗原)結合之臂。雙特異性抗體可被製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2 雙特異性抗體)。WO 96/16673描述雙特異性抗ErbB2/抗Fcγ RIII抗體，美國專利第5,837,234號揭示雙特異性抗EtbB2/抗Fc γ RI抗體。雙特異性抗ErbB2/Fc α抗體係顯示於WO 98/02463。美國專利第5,821,337號揭示雙特異性抗ErbB2/抗CD3抗體。
製備雙特異性抗體之方法係該領域所知。傳統產製全長雙特異性抗體係根據二個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中該二鏈具有不同之專一性(Millstein et al.,Nature,305：537-539(1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))產製10種不同抗體分子之可能混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。該正確分子之純化通常藉由親和性層析步驟進行，但是親和性層析法比較複雜且產物之產出率低。類似方法係揭示於WO 93/08829及Traunecker et al.,EMBO J.,10：3655-3659(1991)。
根據不同的方法，具有所欲結合專一性(抗體-抗原結合位)之抗體可變結構域係與免疫球蛋白固定結構域序列融合。較佳的是，該融合係與Ig重鏈之固定結構域，該固定結構域包含至少部份之絞鏈區、CH 2區及CH 3區。較佳的是使包含輕鏈鍵結所需之位置的第一重鏈固定區(CH 1)存在於該融合之至少一者。編碼免疫球蛋白重鏈融合及若需要之免疫球蛋白輕鏈之DNA被插入分開之表現載體，且對適當之宿主細胞共轉染。在用於建構之不等比例的三個多肽鏈提供最佳產量之該所欲雙特異性抗體的實施態樣中，此提供調整三個多肽片段之相互比例的高度靈活性。然而，當以相等比例表現至少兩個多肽鏈導致高產量，或當該比例對所欲鏈組合之產量不具顯著影響時，有可能在單一個表現載體中插入兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列。
在此方法之較佳實施態樣中，該雙特異性抗體係由一臂具有第一結合專一性之雜交免疫球蛋白重鏈及另一臂之雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合專一性)所組成。研究發現，此種不對稱結構有利於分離該所欲之雙特異性化合物與非所欲之免疫球蛋白鏈組合，因為免疫球蛋白輕鏈僅存在於該雙特異性分子之一半提供簡單之分離方法。此方法係揭示於WO 94/04690。其他產製雙特異性抗體之細節見例如Suresh et al.,Methods in Enzymology,121：210(1986)。
根據美國專利第5,731,168號所描述之另一方法，在抗體分子對之間的介面可經工程化以最大化自重組細胞培養所收集之異二聚體之百分比。該較佳之介面包含至少一部份之CH 3結構域。在此方法中，來自第一抗體分子之介面的一或多個小胺基酸側鏈被較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)取代。與大型側鏈之大小一致或類似之補償「腔室」係藉由以較小之胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)取代大胺基酸側鏈以在第二抗體分子之介面上產生。此提供一種使異二聚體之產量增加以超過非所欲之終產物諸如同型二聚體之機制。
雙特異性抗體包括交聯或「異源共軛」抗體。舉例來說，異源共軛之抗體之一可為與抗生物素蛋白偶合，另一與生物素偶合。該等抗體已被提議舉例來說用於使免疫系統細胞以非所欲細胞為標靶(美國專利號4,676,980)及用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。異源共軛抗體可利用任何方便之交聯方法製備。適當之交聯劑及數種交聯技術係該領域所廣為週知且於美國專利第4,676,980號中揭示。
自抗體片段製備雙特異性抗體之技術亦已於文獻中描述。舉例來說，雙特異性抗體可利用化學連結法製備。Brennan et al.,Science,229：81(1985)描述一種將完整抗體經蛋白溶解分裂以產製F(ab’)2 片段之方法。這些片段在二硫醇複合劑亞砷酸鈉存在下被還原，以穩定鄰二硫醇且防止分子間雙硫鍵之形成。該經產製之Fab’片段接著被轉換成硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。Fab’-TNB衍生物之一接著藉由巰基乙胺還原被再轉換成Fab’-硫醇，並與等莫耳量之另一Fab’-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產製之雙特異性抗體可被用來作為選擇性固定酶之劑。
近來的研究進展已可自大腸桿菌直接收集Fab’-SH片段，該片段可經化學偶合以形成雙特異性抗體。Shalaby et al.,J. Exp. Med.,175：217-225(1992)描述完全人化雙特異性抗體F(ab’)2 分子之產製。每個Fab’片段係自大腸桿菌分開分泌，並於活體外進行直接化學偶合以形成雙特異性抗體。如此形成之雙特異性抗體能與過度表現ErbB2受體之細胞及正常人T細胞結合，同時誘發人細胞毒性淋巴細胞對人乳房腫瘤目標之溶解作用。
各種直接自重組細胞培養製備及分離雙特異性抗體片段之技術亦已被描述。舉例來說，雙特異性抗體已利用白胺酸拉鍊產製。Kostelny et al.,J. Immunol.,148(5)：1547-1553(1992)。來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鍊肽係藉由基因融合以與二個不同抗體之Fab’部分連結。該抗體同型二聚體在絞鏈區被還原以形成單體，接著被再氧化以形成抗體異二聚體。此方法亦可被利用以產製抗體同型二聚體。由Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA,90：6444-6448(1993)所描述之「雙價抗體(diabody)」技術已提供一種用於製備雙特異性抗體片段之替代機制。該些片段包含藉由連接子與VL 連接之VH ，該連接子過短使得在同一鏈上之該二個結構域之間無法配對。因此，一片段之VH 及VL 結構域被迫與另一片段之互補VL 及VH 結構域配對，藉此形成二個抗原結合位。另一種藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體製備雙特異性抗體片段之策略亦已被報告。見Gruber et al.,J. Immunol.,152：5368(1994)。
具有超過2價之抗體被考慮。舉例來說，可製備三特異性抗體(Tutt et al.,J. Immunol. 147：60(1991))。相較於雙價抗體，多價抗體被表現該些抗體所結合之抗原之細胞更快速地內化(及/或分解)。本發明之抗體可為具有三個或超過三個抗原結合位之多價抗體(例如四價抗體)，該些抗體可輕易地藉由重組表現編碼該抗體之多肽鏈的核酸而產製。該多價抗體可包含二聚化結構域及三或多個抗原結合位。該較佳之二聚化結構域包含Fc區或絞鏈區(或由Fc區或絞鏈區組成)。在此情況中，該抗體將包含Fc區及3個或超過3個在Fc區胺基端之抗原結合位。此處較佳之多價抗體包含3個至約8個抗原結合位(或由3個至約8個抗原結合位組成)，但較佳為4個。該多價抗體包含至少一個多肽鏈(及較佳2個多肽鏈)，其中該多肽鏈包含2個或超過2個可變結構域。舉例來說，該多肽鏈可能包含VD1-(X1)n -VD2-(X2)n -Fc，其中VD1係第一可變結構域，VD2係第二可變結構域，Fc係Fc區之一個多肽鏈，X1及X2代表胺基酸或多肽，且n係0或1。舉例來說，該多肽鏈可能包含：VH-CH1-可塑性連接子-VH-CH1-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。此處之多價抗體較佳地另外包含至少2個(及較佳4個)輕鏈可變結構域多肽。此處之多價抗體可能舉例來說包含自約2個至約8個輕鏈可變結構域多肽。此處考慮之輕鏈可變結構域多肽包含輕鏈可變結構域及可隨意選擇的另包含CL 結構域。
本發明之抗體另包括單鏈抗體。
在特定實施態樣中，本發明之抗體係內化抗體。
此處所述之抗體的胺基酸序列修飾被考慮。舉例來說，可能想要增進抗體之結合親和性及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由在編碼該抗體或彼之鏈的多核苷酸中導入適當之核苷酸改變，或藉由肽合成加以製備。該修飾包括舉例來說自該抗體之胺基酸序列刪除及/或插入及/或取代殘基。可進行任何刪除、插入及取代之組合以形成最終抗體，只要該最終建構體具有所欲之特徵。胺基酸改變亦可能改變抗體之轉譯後過程，諸如改變糖基化位置之數量或位置。上述有關本發明之多肽的任何變異及修飾被包括於本發明之抗體。
一種用於鑑別抗體中之特定殘基或區域係為較佳之突變誘發位置之有效方法稱為如Cunningham and Wells in Science,244：1081-1085(1989)所述之「丙胺酸掃描突變誘發」。在該方法中，殘基或目標殘基之群組被識別(例如帶電殘基諸如精胺酸、天冬胺酸、組胺酸、離胺酸及麩胺酸)且被中性或帶負電胺基酸取代(最佳為丙胺酸或聚丙胺酸)，以改變該胺基酸與PSCA抗原之交互作用。該些顯示對取代具功能敏感性之胺基酸位置接著藉由在該取代位置導入額外或其他變異加以精製。因此，雖然導入胺基酸序列變異之位置係經預先測定，該突變本身之特性不需被預先測定。舉例來說，要分析在給定位置之突變的表現，在標靶密碼子或區域進行丙胺酸掃描或隨機突變誘發，並對該經表現之抗-抗體變異體篩選所欲活性。
胺基酸序列導入包括長度介於一個殘基至包含上百個或更多殘基之多肽的胺基及/或羧基端融合，以及序列內導入單一或多重胺基酸殘基。末端導入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或與細胞毒性多肽融合之抗體。抗體之其他導入性變異包括在抗體之N或C端融合酶(例如ADEPT)或增加該抗體之血清半衰期之多肽。
另一類型之變異係胺基酸取代變異。這些變異在該抗體分子中具有至少一個被不同殘基取代之胺基酸殘基。取代性突變誘發最感興趣之位置包括超變異區，但是FR改變亦被考慮。保留性及非保留性取代被考慮。
抗體之生物特性的實質修飾係藉由選擇彼等在維持下列之效果上顯著不同的取代加以完成：(a)取代區域之多肽骨架之結構，例如片狀或螺旋構型，(b)標靶位置之分子的帶電或疏水性，或(c)側鏈之主體。
任何與維持抗體之適當構型無關之半胱胺酸殘基亦可被取代，通常由絲胺酸取代，以增進該分子之氧化穩定性及防止異常交聯。相反的，半胱胺酸鍵可被加入抗體以增進彼之穩定性(特別是當該抗體係抗體片段諸如Fv片段)。
一種取代變異體之類型係關於取代親代抗體之一或多個超變異區殘基。一般來說，經選擇以供進一步發展之該形成之變異體相較於彼等之產製來源之親代抗體，將具有改善之生物特性。一種產製該取代變異體之方便方法涉及使用噬菌體展示之親和性成熟。簡言之，數個超變異區位置(例如6-7個位置)係經突變以產製各位置所有可能的胺基取代。如此產製之該抗體變異體係以單價方式自絲狀噬菌體之顆粒以融合於各顆粒內所包裝之M13的基因III產物展示。該經噬菌體展示之變異體接著如此處所揭示地篩選彼等之生物活性(例如結合親和性)。為了鑑別供修飾之候選超變異區位置，可進行丙胺酸篩選突變誘發以鑑別與抗原結合顯著相關之超變異區殘基。可選擇或額外地，分析抗原-抗體複合物之結晶結構可能有利於鑑別抗體與抗原或經感染之細胞之間的接觸點。如此處所詳述之技術，該接觸殘基及鄰近殘基係取代的候選殘基。當該變異體經產製後，該變異體之群組進行如此處所述之篩選，在一或多個相關試驗中具有優異特性之抗體可被選擇以供進一步發展。
另一種類型之抗體胺基酸變異體改變該抗體原始之糖基化模式。改變係指刪除一或多個見於該抗體中之碳水化合物基團，及/或添加一或多個不存在於該抗體中之糖基化位置。
抗體之糖基化通常不是N連接就是O連接。N連接係指碳水化合物基團連接於天冬醯胺酸殘基之側鏈。天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸之三肽序列係供碳水化合物基團與天冬醯胺酸側鏈酶連接之辨識序列，其中X係除脯胺酸以外之任何胺基酸。因此，多肽中有任何該等三肽序列之存在產生可能之糖基化位置。O連接糖基化係指連接糖類N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一於羥胺基酸，最常見的是絲胺酸或蘇胺酸，雖然5-羥脯胺酸或5-羥離胺酸亦可被使用。
在抗體中加入糖基化位置可藉由改變胺基酸序列，以使其包含一或多個上述之三肽序列(供N連接糖基化位置)而方便地完成。該改變亦可藉由在原始抗體之序列加入一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或以一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代而完成(O連接糖基化位置)。
本發明之抗體的效應功能係經修飾，例如以增進該抗體之抗原依賴性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。這可藉由導入一或多個胺基酸取代於該抗體之Fc區。可選擇或額外地，半胱胺酸殘基可被導入Fc區，藉此允許此區形成鏈間雙硫鍵。如此產製之同型二聚抗體可能具有改善之內化能力及/或增加之補體媒介性細胞殺滅及抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)。見Caron et al.,J. Exp Med. 176：1191-1195(1992)及Shopes,B. J. Immunol. 148：2918-2922(1992)。具有增進之抗感染活性之同型二聚抗體亦可能利用如Wolff et al.,Cancer Research 53：2560-2565(1993)所述之異雙官能基交聯劑製備。可選擇的是，抗體可經工程化以具有雙Fc區且可能藉此具有增進之補體溶解及ADCC能力。見Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
為了增加抗體之血清半衰期，舉例來說可如美國專利第5,739,277號所述，導入救援受體結合表位於抗體(特別是抗體片段)。此處所使用之用語「救援受體結合表位」係指IgG分子(例如IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 )之Fc區的表位，該表位負責增加IgG分子之活體內血清半衰期。
本發明之抗體亦可能經修飾以包括表位標籤或標記，例如以用於純化或診斷應用。本發明亦關於免疫共軛物之治療，該免疫共軛物包含與抗癌劑諸如細胞毒性劑或生長抑制劑共軛之抗體。可用於產製該等免疫共軛物之化學治療劑已於上描述。
抗體與一或多種小分子毒素諸如卡利奇黴素(calicheamicin)、類美坦素(maytansinoids)、新月毒素(trichothene)、CC1065及該些毒素具有毒素活性之衍生物之共軛物亦於此處考慮。
在一較佳之實施態樣中，本發明之抗體(全長或片段)係與一或多種類美坦素分子共軛。類美坦素係有絲分裂抑制劑，其藉由抑制微管蛋白之聚合化而作用。美坦素最早分離自東非洲灌木齒葉美坦木(Maytenus serrata)(美國專利第3,896,111號)。後來發現特定微生物亦產製類美坦素，諸如美坦素醇(maytansinol)及C-3美坦素醇酯(C-3 maytansinol esters)(美國專利第4,151,042號)。合成性美坦素醇及彼之衍生物及類似物係揭示於例如美國專利號4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。
為了增進彼等之治療指數，美坦素及類美坦素已與專一性結合腫瘤細胞抗原之抗體共軛。包含類美坦素之免疫共軛物及彼等之治療用途係揭示於例如美國專利號5,208,020、5,416,064及歐洲專利EP 0 425 235 B1。Liu et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)描述免疫共軛物，該免疫共軛物包含與拮抗人結直腸癌之單株抗體C242連接之類美坦素DM1。該共軛物被發現對結腸癌培養細胞具有高度細胞毒性，且在活體內腫瘤生長試驗中顯示抗腫瘤活性。
抗體-類美坦素共軛物係在不顯著降低抗體或類美坦素分子之生物活性下，藉由化學連接抗體與類美坦素分子製備。與每個抗體分子共軛之平均3至4個類美坦素分子顯示增進對目標細胞之細胞毒性之療效，但不負面影響該抗體之功能或可溶性，即使一分子之毒素/抗體也被預期相較於使用裸抗體可增進細胞毒性。類美坦素係該領域所廣為週知，可利用已知技術合成或自天然來源分離。適當之類美坦素係揭示於例如美國專利第5,208,020號及上述之其他專利及非專利出版物。較佳之類美坦素係美坦素醇及芳香環或美坦素醇分子之其他位置經修飾之美坦素醇類似物，諸如各種美坦素醇酯。
許多該領域已知之連接基團被用於製備抗體共軛物，包括舉例來說該些揭示於美國專利第5,208,020號或EP專利0 425 235 B1及Chari et al.,Cancer Research 52：127-131(1992)。該連接基團包括如上述專利所揭示之雙硫基團、硫醚基團、酸不耐性基團、光不耐性基團、肽酶不耐性基團或酯酶不耐性基團，較佳係雙硫及硫醚基團。
免疫共軛物可利用各種雙官能性蛋白偶合劑製備，諸如N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺-4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸鹽、二亞胺環硫丁烷(IT)、亞胺酸酯(imidoesters)之雙官能基衍生物(諸如己二亞胺二甲酯HCL)、活性酯之雙官能基衍生物(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺)、醛之雙官能基衍生物(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝苯)。特別較佳之偶合劑包括提供雙硫鍵之N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.,Biochem. J. 173：723-737(1978))及N-琥珀醯亞胺-4-(2-吡啶硫代)戊酸酯(SPP)。舉例來說，蓖麻毒蛋白(ricin)免疫毒素可如Vietta et al.,Science 238：1098(1987)所述製備。碳14標記之1-異硫氰酸芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於共軛放射性核苷酸與抗體之示範性螯合劑。見WO94/11026。連接物可為幫助細胞毒性藥物於細胞中釋放之「可分裂之連接物」。舉例來說，可使用酸不耐性連接物(Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
另一感興趣之免疫共軛物包含與一或多個卡利奇黴素(calicheamicin)分子共軛之抗體。抗生素卡利奇黴素家族能在次皮莫耳之濃度下產生雙股DNA斷裂。要製備卡利奇黴素家族之共軛物，見美國專利號5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296(皆屬美國氰胺公司(American Cyanamid Company)所有)。可與抗體共軛之另一藥物係QFA，其係抗葉酸劑。卡利奇黴素及QFA二者具有細胞內作用部位，但無法輕易地跨越細胞膜。因此，透過抗體媒介性內化使細胞攝取這些劑能大幅增進彼等之細胞毒性效應。
可與本發明之抗體共軛之其他劑之實例包括BCNU、鏈脲佐菌素(streptozocin)、長春新鹼(vincristine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、美國專利號5,053,394、5,770,710中描述總稱為LL-E33288複合物之劑之家族，以及埃斯培拉黴素(esperamicin)(美國專利第5,877,296號)。
可被使用之酶活性毒素及彼之片段包括例如白喉毒素A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(源自綠膿桿菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-次黃嘌呤(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素(curcin) 、巴豆素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲裂膠素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及新月毒素(trichothecenes)。見例如WO 93/21232。
本發明另包括在抗體及具核分解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA內核酸酶諸如去氧核糖核酸酶；DNase)之間形成的免疫共軛物。
為了選擇性破壞經感染之細胞，該抗體包括高放射性原子。多種放射性同位素可被取得以用於產製放射性共軛之抗PSCA抗體。實例包括At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素。當該共軛物係用於診斷時，其可能包含用於閃爍造影試驗之放射性原子，例如tc99m 或I123 ，或用於核磁共振(NMR)造影(亦稱為磁共振造影(MRI))之自旋標記，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
該放射性或其他標記係利用已知方法納入共軛物中。舉例來說，肽可經生物合成法或可藉由化學胺基酸合成法利用適當之關於例如以氟-19取代氫之胺基酸前驅物合成。標記諸如tc99m 、I123 、Re186 、Re188 及In111 可經由肽中之半胱胺酸殘基連接。釔-90可經由離胺酸殘基連接。碘化法(IODOGEN method)(Fraker et al.(1978)Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)可被用於納入碘-123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”(Chatal,CRC Press 1989)詳細描述其他方法。
可選擇的是，包含該抗體與細胞毒性劑之融合蛋白藉由例如重組技術或肽合成法製備。DNA之長度可能包含編碼該二部份共軛物之個別區域，該些區域可能彼此相鄰或被編碼連接肽之區分開，該連接肽不破壞該共軛物之所欲特性。
本發明之抗體亦可被用於抗體依賴性酶媒介性前藥治療(ADEPT)，該治療藉由將抗體與前藥活化酶共軛，而由該酶將前藥(例如肽基化學治療劑，見WO81/01145)轉換成活性抗癌藥物(見例如WO 88/07378及美國專利第4,975,278號)。
用於ADEPT之免疫共軛物之酶成分包括任何可作用在前藥以使該前藥轉換成更具活性之細胞毒性形式之酶。可用於本發明之方法中的酶包括但不限於可將含磷酸鹽前藥轉換成游離藥物之鹼性磷酸酶；可將含硫酸鹽前藥轉換成游離藥物之芳基硫酸酯酶；可將非毒性5-氟胞嘧啶轉換成抗癌藥5-氟尿嘧啶之胞嘧啶去胺酶；可將含肽前藥轉換成游離藥物之蛋白酶，諸如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、枯草溶菌素(subtilisin)、羧基肽酶及組織蛋白酶(cathepsin)(諸如組織蛋白酶B及L)；可用於轉換包含D-胺基酸取代基之前藥之D-丙胺醯基羧基肽酶；可用於將糖基化前藥轉換成游離藥物之碳水化合物裂解酶，諸如β-半乳糖苷酶及神經胺酸酶；可用於將具有β-內醯胺之藥物衍生物轉換成游離藥物之β-內醯胺酶；及可用於將在彼等之胺基氮上以苯氧乙醯或苯乙醯基團衍生之藥物分別轉換成游離藥物之青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶。可選擇的是，在該領域中亦稱為「催化性抗體(abzymes)」之具有酶活性之抗體可被用於將本發明之前藥轉換成游離活性藥物(見例如Massey,Nature328：457-458(1987))。抗體-催化性抗體共軛物可如此處所述被製備以用於遞送該催化性抗體至經感染之細胞族群。
本發明之酶可藉由該領域所廣為週知之技術與抗體共價結合，諸如使用如上討論之異雙官能性交聯劑。可選擇的是，與本發明之酶的至少一個功能活性部份連接之包含至少本發明之抗體的抗原結合區之融合蛋白可利用該領域廣為週知之重組DNA技術建構(見例如Neuberger et al.,Nature,312：604-608(1984))。
抗體之其他修飾在此被考慮。舉例來說，該抗體可與多種非蛋白性聚合物之一連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物。該抗體亦可被包封於藉由例如凝聚技術或藉由界面聚合化所製備之微膠囊(例如分別於羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(異丁烯酸甲酯)微膠囊)中、於膠體藥物遞送系統中(例如脂質體、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米微囊)或於巨乳化液中。該等技術係揭示於Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th edition,Oslo,A.,Ed.,(1980)。
此處所揭示之抗體亦被調製成免疫脂質體。「脂質體」是一種由各種類型之脂質、磷脂質及/或介面活性劑所組成之小型囊泡，其可用於遞送藥物至哺乳動物。脂質體之成分通常排列為雙層形成物，類似生物性膜之脂質排列。包含該抗體之脂質體係以該領域已知之方法製備，諸如Epstein,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82：3688(1985);Hwang et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77：4030(1980)；美國專利號4,485,045、4,544,545及1997年10月23日所公開之WO97/38731中所述。具有增進循環時間之脂質體係揭露於美國專利第5,013,556號。
特別有用之脂質體可藉由逆相蒸發方法以包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生性磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組成物產製。脂質體被擠壓通過定義孔徑大小之濾網以產生具有所欲直徑之脂質體。本發明之抗體之Fab’片段可經由如Martin et al.,J. Biol. Chem. 257：286-288(1982)所述之雙硫鍵交換反應與脂質體共軛。化學治療劑係可隨意選擇地被包含於脂質體內。見Gabizon et al.,J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)。
本發明之抗體或彼之片段可能具有多種生物性或功能性特徵中之任一項。在特定實施態樣中，這些抗體係A型流感專一性或M2蛋白專一性抗體，表示相較於正常對照細胞，它們分別與A型流感或彼之M2蛋白專一性地結合或優先性地結合。在特定實施態樣中，該抗體係HuM2e抗體，表示相較於正常對照細胞，它們與M2e蛋白專一性地結合，較佳係與該M2e結構域之表位結合，該表位僅存在於細胞所表現之M2蛋白或存在於病毒上。
在特定實施態樣中，本發明之抗體係拮抗劑抗體，其部份或完全阻斷或抑制其所專一性或優先性結合之多肽或細胞的生物活性。在其他實施態樣中，本發明之抗體係生長抑制性抗體，其部份或完全阻斷或抑制其所結合之經感染之細胞的生長。在另一實施態樣中，本發明之抗體誘發細胞凋亡。在另一實施態樣中，本發明之抗體誘發或促進抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性或補體依賴性細胞毒性。
鑑別及產製對流感病毒具專一性之抗體之方法
本發明提供鑑別HuM2e抗體之新穎方法，如實施例4所說明。這些方法可被輕易地調整以鑑別對細胞表面上由感染性劑所表現之其他多肽或甚至對感染性劑本身之表面上所表現之多肽具專一性之抗體。
一般來說，該方法包括自已感染感染性劑或經感染性劑免疫接種之病患收集血清樣本。這些血清樣本接著經過篩選以鑑別該些包含對特定多肽具專一性之抗體的樣本，該特定多肽係與感染性劑相關，諸如舉例來說專一性表現於經感染性劑感染之細胞表面上，但不表現於未經感染之細胞上的多肽。在特定實施態樣中，該血清樣本之篩選係藉由使該樣本與已經轉染表現載體之細胞接觸，該表現載體表現經感染之細胞表面上所表現之多肽。
當病患之血清被鑑別為包含對感興趣之感染性劑多肽具專一性之抗體，取自該相同病患之單核及/或B細胞被用於鑑別產製該抗體之細胞或彼之選殖株，利用此處所述或該領域可獲得之任何方法。一旦產製該抗體之B細胞被鑑別，編碼該抗體之可變區或彼之片段之cDNA可利用標準RT-PCR載體及對保留性抗體序列具專一性之引子選殖，並經次選殖至用於重組產製該對感興趣之感染性劑多肽具專一性之單株抗體之表現載體。
在一實施態樣中，本發明提供一種鑑別與經A型流感感染之細胞專一性結合之抗體的方法，該方法包含：使A型流感病毒或表現M2蛋白之細胞與取自已被A型流感感染之病患的生物性樣本接觸；測定生物性樣本中與該細胞結合之抗體之量；及比較該測定量與對照值，其中若該測定值至少高出對照值2倍，顯示該抗體專一性結合經A型流感感染之細胞。在多種實施態樣中，表現M2蛋白之細胞係經A型流感病毒感染之細胞或已經轉染表現該M2蛋白之多核苷酸之細胞。或者，該細胞可能表現部分之M2蛋白，該部分之M2蛋白包括M2e結構域及足以使該蛋白維持與該細胞相關且該M2e結構域係以當存在於全長M2蛋白內時之相同方式存在於該細胞表面上之額外M2序列。製備M2表現載體及轉染適當細胞之方法(包括該些於此處所描述者)可被輕易地完成，因為M2序列可公開取得。見例如流感序列資料庫(Influenza Sequence Database,IDS)(全球資訊網flu.lanl.gov，描述於Macken et al.,2001,“The value of a database in surveillance and vaccine selection” in Options for the Control of Influenza IV. A.D.M.E.,Osterhaus ＆ Hampson(Eds.),Elsevier Science,Amsterdam,pp. 103-106)及基因組研究所(The Institute for Genomic Research,TIGR)之微生物序列中心(Microbial Sequencing Center,MSC)(全球資訊網tigr.org/msc/infl_a_virus.shtml)。
上述之M2e表現細胞或病毒被用於篩選取自A型流感感染病患之生物性樣本，利用標準生物學技術決定優先性結合表現M2多肽之細胞之抗體的存在。舉例來說，在特定實施態樣中，該抗體可能經標記，並利用例如FMAT或FACS分析偵測與細胞相關之標記之存在。在特定實施態樣中，該生物性樣本係血液、血清、血漿、支氣管灌洗液或唾液。本發明之方法可利用高通量技術進行。
經鑑別之人抗體接著可被進一步特徵化。舉例來說，在M2e蛋白內為抗體結合所必須或足夠之特定構型表位可利用例如經表現之M2e多肽之定點突變加以測定。這些方法可被輕易地調整以鑑定與表現於細胞表面上之任何蛋白質結合之人抗體。另外，這些方法可被調整以測定抗體與病毒本身而非與表現重組M2e或經病毒感染之細胞之結合。
編碼抗體、彼之可變區或彼之抗原結合片段之多核苷酸序列可被次選殖至表現載體以供重組產製HuM2e抗體。在一實施態樣中，這可藉由下列完成：自包含該經鑑別之HuM2e抗體之病患的血清取得單核細胞；自該單核細胞產製B細胞選殖株；誘導該B細胞成為抗體產製漿細胞；及篩選由該漿細胞所產製之上清液以決定其是否包含HuM2e抗體。一旦鑑別出產製HuM2e抗體之B細胞選殖株後，進行逆轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)以選殖編碼該HuM2e抗體之可變區或彼之部分之DNA。這些序列接著被次選殖至適用於重組產製人HuM2e抗體之表現載體中。結合專一性可藉由測定該重組抗體與表現M2e多肽之細胞結合之能力而加以證實。
在此處所述之方法的特定實施態樣中，自週邊血液或淋巴結分離之B細胞係根據例如彼等為CD19陽性而加以分選，並以例如每孔最低單細胞專一性接種於例如96、384或1536孔槽格式。這些細胞係經誘發以分化成抗體產製細胞，例如漿細胞，收集並利用例如FMAT或FACS分析法測定該培養上清液與在表面表現該感染性劑多肽之細胞的結合。陽性孔槽接著進行全孔RT-PCR以擴增由該子漿細胞株所表現之IgG分子的重鏈及輕鏈可變區。所形成之編碼該重鏈及輕鏈可變區或彼等之部分之PCR產物被次選殖至人抗體表現載體以供重組表現。該形成之重組抗體接著被測定以證實彼等之原始結合專一性，且可能進一步測試與該感染劑之各種分離株之泛專一性。
因此，在一實施態樣中，鑑別HuM2e抗體之方法係如下進行。首先，全長或大約全長M2 cDNA被轉染至表現M2蛋白之細胞系。第二，測試個別人血漿或血清樣本中與該細胞表現之M2結合之抗體。最後，源自血漿或血清陽性個體之單株抗體與該相同之細胞表現M2之結合係經特徵化。進一步定義該單株抗體之精準專一性可在此時進行。
這些方法可被實行以鑑別各種不同之HuM2e抗體，包括(a)對線性M2e肽中之表位、(b)對M2e之多重變異體中之共同表位、(c)對M2同型四聚體之構型決定簇及(d)對M2同型四聚體之多重變異體之共同構型決定簇具專一性之抗體。最後一類特別受人注意，因為此專一性係可能對所有流感A型毒株皆具專一性。
根據該領域可取得及此處所述之方法，編碼本發明之HuM2e抗體或彼之部分之多核苷酸可自表現HuM2e抗體之細胞分離，包括使用對人抗體多肽之保留區具專一性之引子，利用聚合酶連鎖反應擴增。舉例來說，輕鏈及重鏈可變區可能根據WO 92/02551；美國專利第5,627,052號或Babcook et al.,Proc .Natl .Acad .Sci .USA 93：7843-48(1996)中所述之分子生物技術自B細胞選殖。在特定實施態樣中，編碼IgE分子之重鏈及輕鏈可變區二者之所有或部分的多核苷酸被次選殖及定序，該IgE分子係由表現該HuM2e抗體之子漿細胞株表現。該編碼多肽之序列可由多核苷酸序列輕易地測定。編碼本發明之多肽之經分離之多核苷酸可被次選殖至表現載體，以利用該領域已知及此處所描述之方法重組產製本發明之抗體及多肽。
抗體(或彼之片段)與M2e或經感染之細胞或組織之結合特性通常可利用免疫偵測方法測定及評估，包括例如免疫螢光基底測定法，諸如免疫組織化學法(IHC)及/或螢光活化細胞分選法(FACS)。免疫測定方法可能包括對照組及方法以測定抗體是否與源自一或多種特定A型流感菌株之M2e專一性結合，且不辨識或與正常對照細胞交叉反應。
在預先篩選血清以鑑別產製拮抗感染性劑或彼之多肽例如M2之抗體的病患之後，本發明之方法通常包括自先前得自病患或個體之生物性樣本分離或純化B細胞。該病患或個體目前或先前可能被診斷或疑似罹患特定感染疾病，或該病患或個體可能被認為不具特定疾病或感染。一般來說，該病患或個體係哺乳動物，在特定實施態樣中係人。該生物性樣本可能為任何包含B細胞之樣本，包括但不限於淋巴結或淋巴結組織、胸膜滲液、週邊血液、腹水、腫瘤組織或腦脊髓液(CSF)。在多種實施態樣中，B細胞係自不同類型之生物性樣本分離，諸如受特定疾病或感染影響之生物性樣本。然而，應了解的是，任何包含B細胞之生物性樣本可被用於本發明之任何實施態樣。
經分離後，B細胞被誘導以產製抗體，例如藉由在支持B細胞增生或發展成漿細胞(plasmacyte)、漿母細胞(plasmablast)或漿細胞(plasma cell)之條件下培養B細胞。該抗體接著經過篩選，通常利用高通量技術，以鑑別與目標抗原例如特定組織、細胞、感染性劑或多肽專一性結合之抗體。在特定實施態樣中，被該抗體結合之特定抗原例如細胞表面多肽係未知的，然而在其他實施態樣中，被該抗體專一性結合之抗原係已知的。
根據本發明，B細胞可能藉由該領域已知且可取得之任何裝置自生物性樣本例如腫瘤、組織、週邊血液或淋巴結樣本分離。B細胞通常由FACS根據彼等之表面上所存在之B細胞特異性標記例如CD19、CD138及/或表面IgG分選。然而，該領域中已知之其他方法可被採用，諸如例如使用CD19磁珠或IgG特異性磁珠之管柱及隨後自該管柱溶離以純化。然而，利用任何標記之B細胞磁性分離可能導致特定B細胞流失。因此，在特定實施態樣中，該經分離之細胞並不經過分選，而是將自腫瘤分離之Ficoll純化單核細胞以適當或所欲數量之特異性直接接種於每個孔槽。
為了鑑別產製感染性劑專一性抗體之B細胞，該B細胞通常以低密度(例如每孔單細胞專一性，每孔1至10個細胞、每孔10至100個細胞、每孔1至100個細胞、每孔少於10個細胞、或每孔少於100個細胞)接種於例如96、384或1536孔槽格式之多孔或微滴定盤。當B細胞剛開始以超過每孔1個細胞之密度被接種，本發明之方法可能包括後續將細胞稀釋於鑑別為產製抗原專一性抗體之孔槽中之步驟，直到每孔達到單細胞專一性，如此有利於鑑別產製抗原專一性抗體之B細胞。細胞上清液或彼之部分及/或細胞可能經冷凍儲存以供未來測試及後續抗體多核苷酸之收集。
在特定實施態樣中，該B細胞係於有利於B細胞產製抗體之條件下培養。舉例來說，該B細胞可能在有利於B細胞增生及分化以產生抗體產製之漿母細胞(plasmablast)、漿細胞(plasmacyte)或漿細胞(plasma cell)的條件下培養。在特定實施態樣中，該B細胞係於B細胞分裂原存在時培養，諸如脂多糖(LPS)或CD40配位體。在一特定實施態樣中，B細胞係藉由與飼養細胞及/或其他B細胞活化劑諸如CD40配位體一起培養以分化為抗體產製細胞。
細胞培養上清液或得自該上清液之抗體可利用該領域中之例行方法包括該些於此處描述之方法測試彼等與目標抗原結合之能力。在特定實施態樣中，培養上清液係利用高通量方法測定與目標抗原結合之抗體之存在。舉例來說，B細胞可於多孔微滴定盤中培養，如此可以使用自動化孔盤操作機以同時採樣多個細胞上清液並測定與目標抗原結合之抗體之存在。在特定實施態樣中，抗原係與微球(例如順磁或乳膠球)結合以幫助捕捉抗體/抗原複合物。在其他實施態樣中，抗原及抗體係經螢光標記(不同標記)並進行FACS分析以鑑別與目標抗原結合之抗體之存在。在一實施態樣中，抗體結合係利用FMATTM 分析及儀器(加州福斯特市應用生物系統(Applied Biosystems)公司)測定。FMATTM 是一種供高通量篩選之螢光巨共軛焦平台，該混合-讀取、非放射性分析使用活細胞或微球。
在多種實施態樣中，就抗體與特定目標抗原(例如生物性樣本諸如經感染之組織或細胞或感染性劑)相較於與對照樣本(例如生物性樣本諸如未經感染之細胞或不同的感染性劑)之結合的比較而言，若相較於與對照樣本結合之量，超過至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍之抗體與特定目標抗原結合，該抗體被認為優先地與特定目標抗原結合。
編碼抗體鏈、彼之可變區或彼之片段之多核苷酸可利用該領域可取得之任何裝置自細胞分離。在一實施態樣中，多核苷酸係利用聚合酶連鎖反應(PCR)分離，例如以該領域可取得之例行程序使用與重鏈或輕鏈編碼多核苷酸序列或彼之互補序列專一性結合之寡核苷酸引子的逆轉錄PCR(RT-PCR)。在一實施態樣中，陽性孔槽進行全孔RT-PCR以擴增由該子漿細胞株所表現之IgG分子的重鏈及輕鏈可變區。這些PCR產物可能經定序。
所形成之編碼該重鏈及輕鏈可變區或彼等之部分之PCR產物接著被次選殖至人抗體表現載體，並根據該領域之例行成程序重組表現(見例如美國專利第7,112,439號)。此處所描述之編碼腫瘤特異性抗體或彼之片段之核酸分子可能根據各種廣為週知之核酸剪切、連接、轉形及轉染程序中之任何程序加以繁殖及表現。因此，在特定實施態樣中，抗體片段之表現較佳係於原核宿主細胞，諸如大腸桿菌(Escherichia coli )(見例如Pluckthun et al.,Methods Enzymol. 178：497-515(1989))。在特定其他實施態樣中，抗體或彼之抗原結合片段之表現較佳係於真核宿主細胞，包括酵母菌(例如啤酒釀母菌(Saccharomyces cerevisiae )、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )及巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris ))；動物細胞(包括哺乳動物細胞)；或植物細胞。適當動物細胞之實例包括但不限於骨髓瘤、COS、CHO或雜交瘤細胞。植物細胞之實例包括菸草、玉米、大豆及米細胞。藉由該領域之一般技藝人士所知之方法及根據本發明之揭示，核酸載體可能被設計以於特定宿主系統中表現外來序列，接著編碼腫瘤特異性抗體(或彼之片段)之多核苷酸序列可能被插入。調節元件將根據特定宿主而異。
一或多個包含編碼可變區及/或固定區之多核苷酸之複製性表現載體可被製備及用於轉形適當細胞系，舉例來說非產製型骨髓瘤細胞系諸如鼠NSO細胞系，或其中將產製抗體之細菌諸如大腸桿菌。為了獲得有效之轉錄及轉譯，各載體中之多核苷酸序列應包括適當之調節序列，特別是與該可變結構域序列可操作地連接之啟動子及前導序列。以此方式產製抗體之特定方法係一般所廣為週知及例行使用。舉例來說，分子生物程序係由沙布魯克等人(Sambrooket al .)描述(Molecular Cloning,A Laboratory Manual, 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989；亦見Sambrook et al.,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,(2001))。雖然不是必要，在特定實施態樣中，編碼重組抗體之多核苷酸之區可能經定序。DNA定序可如聖格等人(Sangeret al .)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74：5463(1997))及安森國際(Amersham International)plc定序手冊中所述進行，並包括對彼之改進。
在特定實施態樣中，該形成之重組抗體或彼之片段接著可經測定以證實彼等之原始專一性，且可能進一步利用例如相關之感染性劑測定泛專一性。在特定實施態樣中，根據此處所描述之方法鑑別或產製之抗體係經由抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)或細胞凋亡測定細胞殺滅作用及/或彼之內化之能力。
多核苷酸
在其他態樣中，本發明提供多核苷酸組成物。在較佳之實施態樣中，這些多核苷酸編碼本發明之多肽，例如與A型流感、M2或M2e結合之抗體的可變鏈之區。本發明之多核苷酸係單股(編碼或反義)或雙股之DNA(基因組、cDNA或合成性)或RNA分子。RNA分子包括但不限於HnRNA分子(其包含內含子且以一對一之方式對應DNA分子)及mRNA分子(其不包含內含子)。可選擇或額外地，編碼或非編碼序列係存在於本發明之多核苷酸內。亦可選擇或額外地，多核苷酸係與本發明之其他分子及/或支持物質連接。本發明之多核苷酸係使用於例如雜交試驗以偵測A型流感抗體於生物性樣本中之存在及重組產製本發明之多肽。
因此，根據本發明之另一態樣，本發明提供包括一些或所有實施例1所述之多核苷酸序列、實施例1所述之多核苷酸序列之互補序列及實施例1所述之多核苷酸序列之簡併變異序列之多核苷酸組成物。在特定較佳之實施態樣中，此處所述之多核苷酸序列編碼(相較於未經感染之正常對照細胞)能優先與A型流感感染細胞結合之多肽，包括具有如實施例1或2所述之序列的多肽。另外，本發明包括所有編碼本發明之任何多肽之多核苷酸。
在其他相關之實施態樣中，本發明提供與圖1所示之序列具高度一致性之多核苷酸變異體，例如使用此處所述之方法測定時(例如使用標準參數之BLAST分析)，相較於本發明之多核苷酸序列，該些包含至少70%序列一致性，較佳至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高之序列一致性之變異體。該領域之技藝人士將了解考慮到密碼子簡併性、胺基酸類似性、閱讀框位置及該類似條件，這些數值可經適當調整以決定由二個核苷酸序列所編碼之蛋白質的對應一致性。
一般來說，多核苷酸變異體包含一或多個取代、添加、缺失及/或插入，較佳的是由該變異多核苷酸所編碼之多肽的免疫原結合特性相較於由此處具體列示之多核苷酸序列所編碼之多肽不實質地降低。在其他實施態樣中，本發明提供包含各種長度之與一或多個此處所揭示之序列相同或互補之相鄰序列片段之多核苷酸片段。舉例來說，本發明所提供之多核苷酸包含此處所揭示之一或多個序列之至少約10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多個以及所有介於其間之中間長度之相鄰核苷酸。此處所使用之用語「中間長度」係意圖描述任何在該引用數值之間的長度，諸如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括所有從200至500；500至1000之整數及該類似數。
在本發明之另一實施態樣中，本發明提供能在中度至高度嚴謹度條件下與此處所提供之多核苷酸序列或彼之片段或彼之互補序列雜交之多核苷酸組成物。雜交技術係分子生物學領域所廣為週知。為了說明之目的，用於測定本發明之多核苷酸與其他多核苷酸雜交之適當中度嚴謹度條件包括在5倍SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)之溶液中預先清洗；於50℃至65℃之5倍SSC中隔夜雜交；接著於65℃各以含有0.1% SDS之2倍、0.5倍及0.2倍SSC清洗20分鐘兩次。該領域之技藝人士將瞭解，雜交之嚴謹度可被輕易地操縱，諸如藉由改變雜交溶液之鹽含量及/或進行雜交時之溫度。舉例來說，在另一實施態樣中，適當之高度嚴謹度雜交條件包括該些如上述之條件，除了雜交溫度增加至例如60至65℃或65至70℃。
在較佳之實施態樣中，由該多核苷酸變異體或片段所編碼之多肽具有和由天然多核苷酸所編碼之多肽相同的結合專一性(意即專一或優先地與相同表位或A型流感毒株結合)。在特定較佳之實施態樣中，上述之多核苷酸例如多核苷酸變異體、片段及雜交序列編碼具有此處具體描述之多肽序列之至少約50%、較佳至少約70%及更佳至少約90%之結合活性之多肽。
本發明之多核苷酸或彼之片段(不論該編碼序列本身之長度)可能與其他DNA序列組合，諸如啟動子、聚腺苷酸化信號、額外之限制酶位點、多重選殖位點、其他編碼區段及該類似物，因此彼等之整體長度可能非常不同。幾乎任何長度之核酸片段皆被採用，總長度較佳地被限制以方便製備及用於所意圖之重組DNA計畫。舉例來說，全長約10,000、約5000、約3000、約2000、約1000、約500、約200、約100、約50個鹼基對長度及該類似長度(包括所有中間長度)之說明性多核苷酸區段係包括於本發明之許多實施方式中。
該領域之一般技藝人士將瞭解的是，由於基因密碼簡併之結果，有多種核苷酸序列編碼此處所描述之多肽。這些多核苷酸中有些攜帶與任何天然基因之核苷酸序列最低之同源性。然而，編碼本發明之多肽但因為密碼子使用上的差異而不同之多核苷酸特別被本發明所考慮。另外，包含此處所提供之多核苷酸序列之基因的等位基因係屬於本發明之範圍內。等位基因係因為一或多個突變，諸如核苷酸之缺失、添加及/或取代而被改變之內源性基因。該形成之mRNA及蛋白質可能但不一定具有改變之結構或功能。等位基因可利用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)加以識別。
在本發明之特定實施態樣中，對該揭示之多核苷酸序列進行突變誘發以改變該編碼多肽之一或多種特性，諸如彼之結合專一性或結合強度。突變誘發之技術係該領域所廣為週知，且被廣泛地使用以產生多肽及多核苷酸之變異體。突變誘發方式諸如定點突變誘發係經採用以製備此處所述之多肽的變異體及/或衍生物。藉由此方法，透過編碼多肽序列之潛在多核苷酸之突變誘發對該多肽序列進行特定修飾。這些技術提供一種製備及測試序列變異體之直接方式，舉例來說在納入前述一或多項之考慮後藉由在多核苷酸中導入一或多個核苷酸序列改變。定點突變誘發允許透過使用包括該所欲突變之核苷酸序列之特定寡核苷酸序列以及足夠數量之鄰近核苷酸以產製突變物，此提供足夠大小及序列複雜性之引子序列以在被跨越之缺失交界(deletion junction)之二側形成穩定之二倍體。突變係於經選擇之多核苷酸序列中進行以改善、改變、降低、修飾或以其他方式改變該多核苷酸本身之特性，及/或改變該編碼多肽之特性、活性、組成物、穩定性或一級序列。
在本發明之其他實施態樣中，此處所提供之多核苷酸序列被用來作為核酸雜交之探針或引子，例如作為PCR引子。該核酸探針專一性雜交感興趣序列之能力使它們能偵測給定樣本中互補序列之存在。然而，其他用途亦包含於本發明中，諸如利用序列資訊製備突變物引子，或用於製備其他基因建構物之引子。因此，本發明中包括與此處所揭示之15個核苷酸長度連續序列具有相同或互補之序列的至少約15個核苷酸長度連續序列之序列區域的核酸區段特別有用。較長之一致或互補連續序列例如該些約20、30、40、50、100、200、500、1000(包括所有中間長度)包括全長序列及所有介於之間之長度亦使用於特定實施態樣中。
與此處所揭示之多核苷酸序列一致或互補之具有由10至14個、15至20個、30個、50個或甚至100至200個核苷酸等(亦包括中間長度)之連續核苷酸片段所組成之序列區域的多核苷酸分子特別被考慮作為雜交探針以用於例如南方及北方墨漬法，及/或作為引子以用於例如聚合酶連鎖反應(PCR)。片段之總長以及該互補片段之大小最終依賴該特定核酸區段之所欲用途或應用而定。較小片段通常被用於雜交實施態樣，其中該連續互補區域之長度可能不同，諸如介於約15至約100個核苷酸，但較大之連續互補片段亦可根據希望偵測之互補序列長度而被使用。
使用長度約15至25個核苷酸之雜交探針允許形成穩定且具選擇性之二倍分子。但是為了增加該雜交物之穩定性及選擇性，並藉此改善所獲得之專一性雜交分子之品質及程度，具有超過12個鹼基長度片段之連續互補序列之分子通常係較佳的。具有15至25個連續核苷酸或甚至當需要時更長之基因互補片段之核酸分子通常係較佳的。
雜交探針係選自此處所揭示之任何序列之任何部分。所需要的只是檢視希望被用來作為探針或引子之自約15至25個核苷酸長度、至多包括全長序列之此處所示之序列或該等序列之任何連續部份。探針及引子序列之選擇受到許多因素影響。舉例來說，可能希望採用朝向總序列末端之引子。
本發明之多核苷酸或彼之片段或變異體可輕易地利用例如化學裝置直接合成該片段加以製備，如自動化寡核苷酸合成儀所經常進行之方式。同時，片段可藉由應用核酸再生技術諸如美國專利第4,683,202號之PCRTM 技術，藉由將經選擇之序列導入重組載體以供重組產製，及藉由分子生物學領域之技藝人士所廣為週知之其他重組DNA技術加以獲得。
載體、宿主細胞及重組方法
本發明提供包含本發明之核酸之載體及宿主細胞，以及用於產製本發明之多肽之重組技術。本發明之載體包括該些能在任何種類之細胞或有機體內複製之載體，包括例如質體、噬菌體、黏質體(cosmids)及袖珍染色體(mini chromosomes)。在多種實施態樣中，包含本發明之多核苷酸之載體係適合繁殖或複製該多核苷酸之載體，或適合表現本發明之多肽之載體。該等載體係該領域所知且可自商業取得。
本發明之多核苷酸係經完整合成或接著加以組合之部分合成，並利用例行之分子及細胞生物學技術插入載體，包括例如利用適當之限制位點及限制酶將多核苷酸次選殖至線性載體。本發明之多核苷酸係經聚合酶連鎖反應擴增，使用與該多核苷酸之各股互補之寡核苷酸引子。這些引子亦包括限制酶切割位點以幫助次選殖至載體。可複製之載體成份通常包括但不限於下列一或多項：信號序列、複製起點及一或多種標誌或可選擇之基因。
為了表現本發明之多肽，編碼該多肽之核苷酸序列或功能相等物被插入適當之表現載體，意即包含轉錄及轉譯該插入之編碼序列之必要元件之載體。利用該領域之技藝人士所廣為週知之方法建構表現載體，該表現載體包含編碼感興趣之多肽之序列及適當之轉錄及轉譯控制元件。這些方法包括活體外重組DNA技術、合成技術，及活體內基因重組。該等技術係描述於例如Sambrook,J.,et al.(1989) Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.及Ausubel,F.M. et al.(1989) Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley ＆ Sons,New York. N.Y.。
各種表現載體/宿主系統被用於包含及表現多核苷酸序列。這些包括但不限於微生物，諸如經重組噬菌體(bacteriophage)、質體或黏質體DNA表現載體轉形之細菌；經酵母菌表現載體轉形之酵母菌；經病毒表現載體(例如桿狀病毒(baculovirus))感染之昆蟲細胞系統；經病毒表現載體(例如花菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus,CaMV)；菸草嵌紋病毒(tobacco mosaic virus,TMV))或細菌表現載體(例如Ti或pBR322質體)轉形之植物細胞系統；或動物細胞系統。在一實施態樣中，表現感興趣之單株抗體之基因的可變區係利用核苷酸引子自雜交瘤細胞擴增。這些引子係由該領域之一般技藝人士合成，或可購自商業銷售來源(見例如斯壯特基(Stratagene)公司(加州拉荷亞)，該公司銷售供擴增鼠及人可變區之引子)。該引子係用於擴增重鏈或輕鏈可變區，該些重鏈或輕鏈可變區接著被分別插入載體諸如ImmunoZAPTM H或ImmunoZAPTM L(斯壯特基(Stratagene)公司)。這些載體接著被導入大腸桿菌、酵母菌或哺乳動物細胞系統以供表現。大量包含VH 及VL 結構域融合之單鏈蛋白質係利用這些方法產製(見Bird et al.,Science 242：423-426(1988))。
存在於表現載體中之「控制元件」或「調節序列」係指該些載體中非轉譯之區域，例如增強子、啟動子、5’及3’非轉譯區，該些區域與宿主細胞性蛋白質交互作用以進行轉錄及轉譯。該些元件之強度及專一性可能有所不同。依據所使用之載體系統及宿主，使用任何數量之適當轉錄及轉譯元件，包括組成性及誘發性啟動子。
適用於真核宿主之啟動子實例包括phoa啟動子、β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶啟動子、色胺酸(trp)啟動子系統及雜交啟動子諸如tac啟動子。然而，其他已知之細菌性啟動子是合適的。用於細菌性系統中之啟動子通常亦包含與編碼該多肽之DNA可操作地連接之夏恩-達卡諾(Shine-Dalgarno)序列。誘發性啟動子諸如PBLUESCRIPT噬菌體之雜交lacZ啟動子(加州拉荷亞斯壯特基(Stratagene)公司)或PSPORT1質體(馬里蘭州蓋瑟斯堡吉可(Gibco BRL)公司)及該類似物被使用。
多種用於真核細胞之啟動子序列係已知且任何皆可根據本發明被使用。幾乎所有真核細胞基因在距離轉錄開始之位置上游約25至30個鹼基之處具有富含AT之區域。另一在許多基因之轉錄起點上游70至80個鹼基處所發現之序列係CNCAAT區域，其中N可能是任何核苷酸。大部分真核基因之3’端係AATAAA序列，其可能是添加聚腺苷酸尾至該編碼序列3’端之信號。所有這些序列適合被插入真核表現載體中。
在哺乳動物細胞系統中，來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒之啟動子通常係較佳的。在哺乳動物宿主細胞中載體之多肽表現係藉由例如得自病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨大病毒(CMV)、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及最佳之猿猴病毒40(SV40)之基因組之啟動子，源自異源性哺乳動物啟動子例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，及源自熱休克啟動子所控制，只要該等啟動子相容於該宿主細胞系統。若需要產製包含多份序列之細胞系，該序列編碼多肽，以SV40或EBV為基礎之載體可與適當之可選擇標誌被有利地使用。適當之表現載體實例係pcDNA-3.1(加州卡斯白市英維特基公司(Invitrogen))，其包括CMV啟動子。
多種以病毒為基礎之表現系統可被用於哺乳動物細胞以表現多肽。舉例來說，當腺病毒被用來作為表現載體時，編碼感興趣多肽之序列可能與腺病毒轉錄/轉譯複合體連接，該轉錄/轉譯複合體係由晚期啟動子及三聯前導序列組成。在病毒基因組之非必要性E1或E3區中插入可用於獲得能在經感染之宿主細胞中表現該多肽之活病毒(Logan,J. and Shenk,T.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81：3655-3659)。此外，轉錄增強子諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV)增強子可被用於增加哺乳動物宿主細胞之表現。
在細菌性系統中，多種表現載體中之任一者的選擇係根據該表現多肽之所欲用途。舉例來說，當需要大量時，引導可被輕易純化之融合蛋白高度表現之載體被使用。該等載體包括但不限於多功能性大腸桿菌選殖及表現載體諸如BLUESCRIPT(斯壯特基(Stratagene)公司)，其中編碼該感興趣多肽之序列可與載體中β-半乳糖苷酶之胺基端甲硫胺酸及後續7個殘基之序列符合讀框地連接以產生雜交蛋白；pIN載體(Van Heeke,G. and S.M. Schuster(1989)J. Biol. Chem. 264：5503-5509)；及該類似物。pGEX載體(威斯康辛州麥迪遜市普羅麥加(Promega)公司)亦被用於表現外源性多肽為具有麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之融合蛋白。通常，該等融合蛋白係可溶的，且可藉由吸附麩胱甘肽-洋菜球然後在游離麩胱甘肽存在時溶離以輕易地自溶解細胞純化。該系統所製備之蛋白質被設計為包括肝素、凝血酶或第XA因子蛋白酶切割位點，因此感興趣之選殖多肽可任意地自該GST基團釋放。
在酵母菌啤酒釀母菌(Saccharomyces cerevisiae )中，數種包含組成性或誘發性啟動子諸如α因子、醇氧化酶及PGH之載體被使用。其他用於酵母菌宿主之適當啟動子序列實例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖解酶之啟動子，諸如烯醇酶(enolase)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶及葡萄糖激酶。回顧文獻見Ausubel et al.(同上)及Grant et al.(1987)Methods Enzymol. 153：516-544。其他具有轉錄受生長條件控制之額外優點的誘發性酵母菌啟動子包括醇脫氫酶2、異構細胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酶、與氮代謝有關之降解酶、重金屬蛋白質、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶的啟動子區域。用於酵母菌表現之適當載體及啟動子另描述於EP 73,657。酵母菌增強子亦可被有利地與酵母菌啟動子一起使用。
在使用植物表現載體之情況中，編碼多肽序列之表現係由數種啟動子中之任一者驅動。舉例來說，病毒啟動子諸如CaMV之35S及19S啟動子係被單獨或與源自TMV之Ω前導序列組合使用(Takamatsu,N.(1987)EMBO J. 6：307-311)。或者，植物啟動子諸如RUBISCO之小型次單位或熱休克啟動子被使用(Coruzzi,G. et al.(1984)EMBO J. 3：1671-1680;Broglie,R. et al.(1984) Science 224：838-843;and Winter,J.,et al.(1991)Results Probl. Cell Differ. 17：85-105)。這些建構物可藉由直接DNA轉形或病原體媒介性轉染被導入植物細胞。該等技術係描述於多篇公眾可得之回顧文獻(見例如Hobbs,S. or Murry,L.E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)McGraw Hill,New York,N.Y.;pp.191-196)。
昆蟲系統亦可被用於表現感興趣之多肽。舉例來說，在一個該系統中，加州苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus,AcNPV)係用來作為載體以於草地夜蛾(Spodoptera frugiperda )細胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia )幼蟲中表現外源基因。編碼該多肽之序列備選殖至該病毒之非必要區，諸如多角體蛋白基因，並受到多角體蛋白啟動子之控制。成功插入多肽編碼序列使該多角體蛋白基因被不活化，並產生缺乏外膜蛋白之重組病毒。該重組病毒接著被用於感染例如草地夜蛾(S. frugiperda )細胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia )幼蟲，其中該感興趣之多肽被表現(Engelhard,E.K. et al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. 91：3224-3227)。
特定起始信號亦被使用以達更有效地轉譯編碼感興趣多肽之序列。該信號包括ATG起始密碼子及相鄰序列。當編碼該多肽之序列、彼之起始密碼子及上游序列被插入適當之表現載體時，不需要額外之轉錄或轉譯控制信號。然而，當只有編碼序列或彼之部分被插入時，應提供外源性轉譯控制信號包括ATG起始密碼子。另外，該起始密碼子係符合正確閱讀框以確保該插入之多核苷酸被正確地轉譯。外源性轉譯元件及起始密碼子係包括天然及合成之各種來源。
編碼本發明之多肽之DNA的轉錄通常藉由在載體中插入增強子序列而增加。許多增強子序列係為已知，包括例如該些在編碼球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素之基因中所鑑別者。然而，一般係使用源自真核細胞病毒之增強子。實例包括在SV40複製起點之晚期側的增強子(鹼基對100-270)、細胞巨大病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒複製起點之晚期側的增強子及腺病毒增強子。有關活化真核細胞啟動子之增強元件亦見Yaniv,Nature 297：17-18(1982)。該增強子被剪切至載體之多肽編碼序列之5’或3’側之位置，但較佳係位於啟動子之5’側。
在真核宿主細胞(酵母菌、真菌、昆蟲、植物、動物、人或源自其他多細胞有機體之有核細胞)中使用之表現載體通常亦包含終止轉錄及穩定mRNA所需之序列。該些序列通常得自真核或病毒DNA或cDNA之5’未轉譯區，偶而得自3’未轉譯區。這些區域包含在編碼抗PSCA抗體之mRNA的未轉譯部分被轉錄為聚腺苷酸片段之核苷酸區段。一個有用之轉錄終止成分係牛生長荷爾蒙聚腺苷酸區域。見WO94/11026及該文所揭示之表現載體。
用於選殖或表現此處之載體中之DNA的適當宿主細胞係真核細胞、酵母菌、植物或如上述之更高等真核細胞。用於此目的之適當原核細胞實例包括真細菌(eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如腸內細菌科(Enterobacteriaceae )諸如埃希氏菌屬(Escherichia )例如大腸桿菌(E. cοli )、腸桿菌屬(Enterobacter )、歐文氏菌屬(Erwinia )、克雷白氏菌屬(Klebsiella )、變形桿菌屬(Proteus )、沙門氏菌屬(Salmonella )例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium )、沙雷氏菌屬(Serratia )例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans )及志賀氏菌屬(Shigella )，以及芽孢桿菌屬(Bacillus )諸如枯草桿菌(B. subtilis )及地衣型芽孢桿菌(B. licheniformis )(例如1989年4月12日公開之DD 266,710所揭示之地衣型芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(Pseudomonas )諸如綠膿桿菌(P. aeruginosa )及鏈黴菌屬(Streptomyces )。一較佳之大腸桿菌選殖宿主係大腸桿菌294株(ATCC 31,446)，不過其他菌株諸如大腸桿菌B株、大腸桿菌X1776株(ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110株(ATCC 27,325)係適合的。這些實例係說明性而非限制性。
啤酒釀母菌(Saccharomyces cerevisiae )或俗稱麵包酵母菌係最常使用之低等真核宿主微生物。然而，多種其他屬、種及株亦為經常可得且在此處使用，諸如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )、克魯維酵母菌(Kluyveromyces )宿主諸如乳酸克魯維酵母菌(K. lactis )、脆壁克魯維酵母菌(K. fragilis )(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母菌(K. bulgaricus )(ATCC 16,045)、魏氏克魯維酵母菌(K. wickeramii )(ATCC 24,178)、瓦特克魯維酵母菌(K. waltii )(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母菌(K. drosophilarum )(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母菌(K. thermotolerans )及馬克斯克魯維酵母菌(K. marxianus )；耶氏酵母屬(Yarrowia )(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(Pichi apastoris )(EP 183,070)；假絲酵母屬(Candida )；里氏木黴(Trichoderma reesei )(EP 244,234)；粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa )；許旺酵母屬(Schwanniomyces )諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis )；及絲狀真菌諸如例如鏈孢黴屬(Neurospora )、青黴菌屬(Penicillium )、彎頸黴屬(Tolypocladium )及麴菌屬(Aspergillus )宿主諸如小巢狀麴菌(A. nidulans )及黑色麴菌(A. niger )。
在特定實施態樣中，宿主細胞菌株係根據彼等調節該插入序列之表現或以所欲方式處理該表現蛋白質之能力選擇。該多肽之修飾包括但不限於乙醯化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化及醯基化。切割「前原(prepro)」形式蛋白質之轉譯後處理亦被用於幫助正確插入、摺疊及/或作用。具有特定細胞機器(cellular machinery)及特徵機制以供該等轉譯後活性之不同的宿主細胞諸如CHO、COS、HeLa、MDCK、HEK293及WI38係經選擇以確保正確修飾及處理外來蛋白質。
特別適應以表現抗體或彼之片段之方法及試劑亦為該領域所知且可被取得，包括該些於例如美國專利號4816567及6331415所述者。在多種實施態樣中，抗體重鏈及輕鏈或彼之片段係自相同或分開之表現載體表現。在一實施態樣中，二鏈均在相同細胞表現，藉此有助於形成功能性抗體或彼之片段。
全長抗體、抗體片段及抗體融合蛋白係於細菌中產製，特別是當不需要糖基化及Fc效應功能時，諸如當該治療性抗體係與細胞毒性劑(例如毒素)共軛且該免疫共軛物本身顯示破壞經感染之細胞之有效性。在細菌中表現抗體片段及多肽見例如美國專利號5,648,237、5,789,199及5,840,523，其描述轉譯起始區(TIR)及最佳化表現及分泌之信號序列。在表現後，該抗體係自可溶組份中之大腸桿菌細胞團分離，並可根據同型以經例如蛋白A或G管柱純化。最終純化可利用類似用於純化例如CHO細胞中表現之抗體的方法進行。
用於表現糖基化多肽及抗體之適當宿主細胞係源自多細胞有機體。無脊椎細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。數種桿狀病毒株及變異體及源自宿主諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda )(蛾)、埃及斑蚊(Aedes aegypti )(蚊)、白斑蚊(Aedes albopicitus )(蚊)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )(果蠅)及家蠶(Bombyx mori )之對應允許昆蟲宿主細胞已被鑑別。多種用於轉染之病毒株係可公開取得，例如加州苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒之L-1變異株及家蠶NPV之Bm-5株，該些病毒係如本發明此處所述之病毒被使用，特別是用於轉染草地夜蛾細胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、牽牛花、蕃茄及菸草之植物細胞培養亦被用來作為宿主。
在脊椎動物細胞之培養(組織培養)中繁殖抗體多肽及彼之片段之方法係包含於本發明。用於本發明之方法中之哺乳動物宿主細胞系實例為經SV40轉形之猴腎CV1細胞系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚胎腎細胞系(293細胞或經次選殖以於懸浮培養中生長之293細胞，Graham et al.,J. Gen Virol. 36：59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO,Urlaub et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216(1980))；鼠賽托利(sertoli)細胞(TM4,Mather,Biol. Reprod. 23：243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人子宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2,HB 8065)；鼠乳腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TR1細胞(Mather et al.,Annals N.Y. Acad. Sci. 383：44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人肝腫瘤細胞系(Hep G2)。
宿主細胞係經上述供產製多肽之表現或選殖載體轉形，並於習知營養培養基中培養，該習知營養培養基經調整以適用於誘導啟動子、選擇轉形物或擴增編碼該所欲序列之基因。
為了能長期、高產量地產製重組蛋白質，穩定表現一般係較佳的。舉例來說，穩定表現感興趣之多核苷酸之細胞系係利用包含病毒複製起點及/或在相同或分開載體上之內源性表現元件及可選擇標誌基因之表現載體轉形。在導入載體後，允許細胞於豐富培養基中生長1至2天，然後將細胞轉換至選擇性培養基。可選擇標誌之目的係授予對選擇之抗性，且其存在允許該成功表現導入序列之細胞之生長及收集。穩定轉形細胞之抗性株係利用適合該細胞種類之組織培養技術增生。
多種選擇系統被用於收集經轉形之細胞系。這些包括但不限於分別用於tk- 及aprt- 細胞之單純皰疹病毒胸苷激酶基因(Wigler,M. et al.(1977)Cell 11：223-32)及腺嘌呤轉磷酸糖激酶基因(Lowy,I. et al.(1990)Cell 22：817-23)。同樣的，對抗代謝物、抗生素或除草劑之抗藥性被用來作為選擇基礎；舉例來說，dhfr，其授予對甲胺喋呤之抗藥性(Wigler,M. et al.(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. 77：3567-70)；npt，其授予對胺基糖苷類、新黴素及G-418之抗藥性(Colbere-Garapin,F. et al.(1981)J. Mol. Biol. 150：1-14)；及als或pat，彼等分別授予對氯磺隆(chlorsulfuron)及磷絲菌素乙醯轉移酶(phosphinothricin acetyltransferase)(Murry,同上)。其他可選擇之基因已被描述。舉例來說，trpB允許細胞利用吲哚取代色胺酸，hisD允許細胞利用組胺醇(histinol)取代組胺酸(Hartman,S.C. and R.C. Mulligan(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85：8047-51)。使用肉眼可見之標誌已受到歡迎，該類標誌如花青素、β-尿苷酸酶及彼之受質GUS、螢光素酶及彼之受質螢光素被廣泛地使用，不僅用於鑑別轉形物，同時亦用於定量可歸因於特定載體系統之暫時性或穩定性蛋白質表現量(Rhodes,C.A. et al.(1995)Methods Mol. Biol. 55：121-131)。
雖然標誌基因表現之存在/不存在顯示感興趣基因亦存在，但彼之存在及表現仍需被證實。舉例來說，如果編碼多肽之序列被插入標誌基因序列之內，包含該序列之重組細胞被鑑別為不具有標誌基因功能。或者，標誌基因與多肽編碼序列被串聯放置在單一啟動子之控制下。因應誘導或選擇之標誌基因表現通常表示亦表現該串聯基因。可選擇的是，包含及表現所欲多核苷酸序列之宿主細胞可由該領域之技藝人士所知之各種方法鑑別。這些方法包括但不限於DNA-DNA或DNA-RNA雜交及蛋白質生物測定或免疫測定技術，包括例如用於偵測及/或定量核酸或蛋白質之以膜、溶液或晶片為基礎之技術。
利用對多核苷酸編碼產物具專一性之多株或單株抗體偵測及測量該產物之表現的各種方法係該領域所知。非限制性實例包括酶連接免疫吸附測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)及螢光激活細胞分選法(FACS)。利用對給定多肽上之二個非干擾表位具反應性之單株抗體所進行之二位點、單株基底免疫分析在某些應用上係較佳，但亦可採用競爭性結合分析法。這些及其他測定法係描述於Hampton,R. et al.(1990;Serological Methods,a Laboratory Manual,APS Press,St Paul. Minn.)及Maddox,D.E. et al.(1983;J. Exp. Med. 158：1211-1216)及他處。
各種標記及共軛技術係為該領域之技藝人士所知，且被用於各種核酸及胺基酸分析中。產製經標記之雜交或PCR探針以偵測與多核苷酸有關之序列之方式包括使用經標記之核苷酸之寡標記、缺口轉譯(nick translation)、末端標記或PCR擴增。或者，該序列或彼之任何部分被選殖至載體以產製mRNA探針。該載體係該領域所知，可自商業購得，且藉由添加適當之RNA聚合酶諸如T7、T3或SP6及經標記之核苷酸以用於在活體外合成RNA探針。這些程序係利用各種商業購得之套組進行。所使用之適當報告分子或標記包括但不限於放射性核種、酶、螢光劑、化學發光劑或發色劑以及受質、輔因子、抑制劑、磁性顆粒及該類似物。
由重組細胞產製之多肽係經分泌或被包含於細胞內係根據所使用之序列及/或載體而定。包含本發明之多核苷酸之表現載體係經設計以包含經原核或真核細胞膜直接分泌該編碼多肽之信號序列。
在特定實施態樣中，本發明之多肽係經產製為另包括有助於可溶性蛋白純化之多肽結構域的融合多肽。該等純化促進結構域包括但不限於金屬螯合肽諸如允許利用固定化金屬純化之組胺酸-色胺酸模組、允許利用固定化免疫球蛋白純化之蛋白A結構域，及在FLAGS擴展/親和性純化系統(華盛頓州西雅圖安進(Amgen)公司)中所使用之結構域。在該純化結構域及該編碼多肽之間納入可切割之連接子序列諸如該些對第XA因子或腸激酶(加州聖地牙哥英維斯基(Invitrogen)公司)具專一性者以用來幫助純化。示範性表現載體提供表現包含感興趣之多肽及編碼在硫氧還蛋白或腸激酶切割位點之前的6個組胺酸殘基之核酸的融合蛋白。該組胺酸殘基有助於利用IMIAC(固定化金屬離子親和性色層分析法)純化如Porath,J. et al.(1992,Prot. Exp. Purif. 3：263-281)所述，而該腸激酶切割位點提供自該融合蛋白純化該所欲多肽之方法。有關用於產製融合蛋白之載體的討論係提供於Kroll,D.J. et al.(1993;DNA Cell Biol. 12：441-453)。
在特定實施態樣中，本發明之多肽係與異源性多肽融合，該異源性多肽可能是信號序列或在該成熟蛋白質或多肽之N端具有特定切割位點之其他多肽。被優先選擇之異源性信號序列係被該宿主細胞所辨識及處理(意即被信號肽酶切割)之序列。在原核宿主細胞中，該信號序列係選自例如鹼性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱穩定性腸毒素II前導序列。在酵母菌分泌中，該信號序列係選自例如酵母菌轉化酶前導序列、α因子前導序列(包括啤酒釀母菌或克魯維酵母菌之α因子前導序列)、酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌(C. albicans )葡糖澱粉酶前導序列或如WO 90/13646中所述之信號。在哺乳動物細胞表現中，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列例如單純皰疹gD信號。
當使用重組技術時，該多肽或抗體係產製於細胞內、周漿間隙(periplasmic space)中，或直接分泌至培養基。若該多肽或抗體係於細胞內產製，第一步驟是將不論是宿主細胞或溶解片段之顆粒殘渣藉由例如離心或超過濾移除。Carter et al.,Bio/Technology 10：163-167(1992)描述將分泌至大腸桿菌周漿間隙之抗體分離之方法。簡言之，在醋酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)存在下使細胞團溶解約30分鐘。藉離心移除細胞殘渣。當該多肽或抗體係經分泌至培養基中時，首先利用商業購得之蛋白質濃縮過濾器例如阿密康(Amicon)或密理博(Millipore)派利康(Pellicon)超過濾單位，將取自該表現系統之上清液大致濃縮。可隨意選擇的是，上述之任何步驟可包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF以抑制蛋白溶解，抗生素可被包括以防止伺機污染物生長。
自細胞製備之多肽或抗體組成物係利用例如羥磷灰石層析法、膠體電泳法、透析及親和層析法純化，其中親和層析法係較佳之純化技術。蛋白A作為親和配位體之適當性依存在於該多肽或抗體中之任何免疫球蛋白Fc結構域之物種及同型而定。蛋白A被用於純化以人γ1、γ2或γ4重鏈為基底之抗體或彼之片段(Lindmark et al.,J. Immunol. Meth. 62：1-13(1983))。蛋白G被建議用於所有鼠同型及人γ3(Guss et al.,EMBO J. 5：1567-1575(1986))。最常用於連接該親和配位體之基質為洋菜糖，但亦可使用其他基質。機械穩定性基質諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯相較於洋菜糖可使流速更快及處理時間更短。當該多肽或抗體包含CH 3結構域時，可利用Bakerbond ABXTM 樹脂(紐澤西州菲立普保JT貝克(J. T. Baker)公司)純化。其他蛋白質純化技術諸如離子交換管柱分餾、乙醇沉澱法、逆相HPLC、矽管柱層析法、肝素瓊脂糖(SEPHAROSETM )層析法、陰離子或陽離子交換樹脂層析法(諸如聚天冬胺酸管柱)、色層集焦法(chromatofocusing)、SDS-PAGE及硫酸銨沉澱法亦可根據所欲收集之多肽或抗體使用。在經過任何初步純化步驟之後，包含該感興趣之多肽或抗體及污染物之混合物進行低pH疏水交互作用層析法，使用pH介於約2.5至4.5之溶離緩衝液，較佳地在低鹽濃度(例如自約0至0.25M鹽)下進行。
醫藥組成物
本發明另包括醫藥調製劑，該醫藥調製劑包含所欲純度之本發明之多肽、抗體或調節劑及醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remingion’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A. Ed.(1980))。在特定實施態樣中，醫藥調製劑之製備是為了增進該多肽或抗體在儲存期間之穩定性，例如呈凍乾調製劑或含水溶液之形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者不具毒性，包括例如緩衝劑諸如醋酸鹽、Tris、磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八基二甲基芐基氯化銨、六甲氯胺、氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨、酚醇、丁醇或苄醇、烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮；胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合劑諸如EDTA；等張劑諸如海藻糖及氯化鈉；糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；介面活性劑諸如聚山梨醇酯；鹽形成反離子諸如鈉；金屬複合物(例如鋅蛋白質複合物)；及/或非離子性介面活性劑諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。在特定實施態樣中，該治療性調製劑較佳地包含濃度介於5至200毫克/毫升，更佳介於10至100毫克/毫升之多肽或抗體。
此處之調製劑亦包含一或多種額外之治療劑，該治療劑適用於治療特定適應症例如欲治療之感染或防止非所欲之副作用。較佳的是，該額外之治療劑具有與本發明之多肽或抗體互補之活性，且二者不會彼此不良影響。舉例來說，除了本發明之多肽或抗體之外，額外或第二抗體、抗病毒劑、抗感染劑及/或心臟保護劑被加入該調製劑。該等分子係適合以有效達成所欲目的之量存在於該醫藥調製劑。
該活性成分例如本發明之多肽及抗體及其他治療劑亦可被包封於微膠囊中，該等微膠囊藉由例如膠質凝聚技術或藉由界面聚合作用製備，舉例來說，分別於膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米膠囊)或於巨乳化液中之羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊。該等技術係揭示於Remingion’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A. Ed.(1980)。
持續釋放製劑係經製備。適當之持續釋放製劑實例包括但不限於含有該抗體之固相疏水性聚合物之半透性基質，該基質係呈形狀物件(例如膜或微膠囊)。持續釋放基質之非限制性實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美國專利號3,773,919)、L-麩胺酸及γ乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所組成之注射型微球)、及聚-D-(-)-3-羥丁酸。
欲用於活體內投予之調製劑較佳為無菌。這可輕易地藉由經無菌過濾膜之過濾達成。
診斷性用途
相較於正常對照細胞及組織，本發明之抗體及彼之片段及治療性組成物專一性地結合或優先性地結合經感染之細胞或組織。因此，這些A型流感抗體被用於偵測在病患、生物性樣本或細胞族群中之經感染之細胞或組織，利用各種診斷及預後方法中之任何方法，包括該些於此處描述者。抗M2e專一性抗體偵測經感染之細胞之能力係依彼之結合專一性而定，這可輕易地藉由測定彼與經感染之細胞或組織結合之能力決定，而該經感染之細胞或組織係取自不同病患及/或來自不同A型流感毒株感染之病患。診斷方法通常涉及使取自病患之生物性樣本諸如血液、血清、唾液、尿液、痰、細胞抹拭樣本、或組織活體檢查樣本與A型流感例如HuM2e抗體接觸，並測定相較於對照樣本或預先測定之臨界值，該抗體是否優先性地結合該樣本，藉以顯示該經感染之細胞之存在。在特定實施態樣中，相較於適當之正常對照細胞或組織樣本，超過至少2倍、3倍或5倍之HuM2e抗體與經感染之細胞結合。預先測定之臨界值係由例如在受檢測之生物性樣本進行診斷性測定時所使用之相同條件下，將與數個不同之適當對照樣本結合之HuM2e抗體之量平均以決定。
經結合之抗體係利用此處所描述及該領域已知之方法偵測。在特定實施態樣中，本發明之診斷性方法係利用與可偵測標記例如螢光團共軛之HuM2e抗體進行，以促進該經結合之抗體之偵測。然而，這也可利用二次偵測HuM2e抗體之方法進行。這些方法包括例如RIA、ELISA、沉澱法、凝集法、補體固定及免疫螢光法。
在特定方法中，該HuM2e抗體係經標記。該標記被直接偵測。被直接偵測之示範性標記包括但不限於放射性標記及螢光色素。可選擇或額外地，標記係必須經過反應或衍生化以被偵測之基團，諸如酶。同位素標記之非限制性實例為99 Tc、14 C、131 I、125 I、3 H、32 P及35 S。所使用之螢光物質包括但不限於例如螢光素及彼之衍生物、若丹明(rhodamine)及彼之衍生物、金黃胺(auramine)、丹醯(dansyl)、傘型酮(umbelliferone)、螢蟲光素(luciferin)、2,3-二氫酞嗪二酮(2,3-dihydrophthalazinediones)、辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、溶菌酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶。
酶標記係利用任何目前所使用之比色、分光光度、螢光分光光度或氣體定量技術偵測。在這些方法中被使用之許多酶係為已知，且為本發明之方法所使用。非限制性實例為過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-尿苷酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、尿素酶、葡萄糖氧化酶加過氧化酶、半乳糖氧化酶加過氧化酶及酸性磷酸酶。
抗體係藉由已知方法被標示該等標記。舉例來說，偶合劑諸如醛類、碳二醯亞胺、二順丁烯二醯亞胺、亞胺酸酯、琥珀醯亞胺、雙重氮聯苯胺(bid-diazotized benzadine)及該類似物係用於以上述之螢光素、化學發光劑及酶標記標示抗體。酶通常利用架橋分子諸如碳二醯亞胺、過碘酸鹽、二異氰酸酯、戊二醛及該類似物與抗體組合。各種標示技術係描述於Morrison,Methods in Enzymology 32b,103(1974)、Syvanen et al.,J. Biol. Chem. 284,3762(1973)及Bolton and Hunter,Biochem J. 133,529(1973)。
利用此處所提供之代表性檢測法，本發明之HuM2e抗體能鑑別受到A型流感感染及未受A型流感感染之病患，並能測定病患是否受到感染。根據一方法，生物性樣本係得自疑似受到A型流感感染或已知受到A型流感感染之病患。在較佳之實施態樣中，該生物性樣本包括源自該病患之細胞。該樣本係在例如足以允許該HuM2e抗體與存在樣本中之經感染細胞結合之時間及條件下與HuM2e抗體接觸。舉例來說，該樣本係與HuM2e抗體接觸10秒、30秒、1分鐘、5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、6小時、12小時、24小時、3天或介於之間之任何時間點。該結合之HuM2e抗體之量係經測定並與對照值比較，該對照值可能是例如預先測定之值或自正常組織樣本測定之值。相較於對照樣本，與病患樣本結合之抗體量增加表示經感染之細胞存在於病患樣本中。
在相關之方法中，得自病患之生物性樣本係在足以允許HuM2e抗體與經感染之細胞結合之時間及條件下與該抗體接觸。經結合之抗體接著被偵測，該經結合之抗體之存在表示該樣本包含經感染之細胞。當HuM2e抗體不以可偵測之量與正常細胞結合時，此實施態樣特別有用。不同的HuM2e抗體具有不同的結合及專一性特徵。根據這些特徵，特定HuM2e抗體被用於偵測一或多種A型流感毒株之存在。舉例來說，特定抗體僅與一或數種流感病毒株專一性結合，然而其他抗體與所有或大部分不同的流感病毒株結合。僅對一個A型流感毒株具專一性之抗體被用於鑑別該感染株。
在特定實施態樣中，與經感染之細胞結合之抗體較佳地產生一項信號，顯示感染存在於被偵測該感染之至少約20%之病患，更佳為至少約30%之病患。可選擇或額外地，該抗體產生陰性信號，顯示感染不存在於未被偵測該感染之至少約90%之個體。每個抗體符合上述定義；然而，本發明之抗體被組合使用以增進靈敏度。
本發明亦包括用於進行使用本發明之抗體之診斷及預後測定之套組。本發明之套組包括適當之容器，該容器包含經標記或未經標記形式之本發明之HuM2e抗體。此外，當抗體係以適用於間接結合測定之經標記形式供應時，該套組另包括用於進行該適當間接測定之試劑。舉例來說，該套組依據該標記之性質包括一或多個包含酶受質或衍生性劑之適當容器。對照樣本及/或說明亦被包括。
治療性/預防性用途
被動性免疫接種已被證實為預防及治療病毒性疾病之有效且安全的策略。(見Keller et al.,Clin. Microbiol. Rev. 13：602-14(2000)；Casadevall,Nat. Biotechnol. 20：114(2002)；Shibata et al.,Nat. Med. 5：204-10(1999)；及igarashi et al.,Nat. Med. 5：211-16(1999)；各以參照方式納入此處)。使用人單株抗體之被動免疫接種提供緊急預防及治療流感之立即治療策略。
相較於未經感染之正常對照細胞及組織，本發明之HuM2e抗體及彼之片段及治療性組成物專一性地結合或優先性地結合經感染之細胞。因此，這些HuM2e抗體被用於選擇性地以病患、生物性樣本或細胞族群中之經感染之細胞或組織為標靶。鑒於這些抗體之感染專一性結合特性，本發明提供調節(例如抑制)經感染之細胞生長之方法、殺滅經感染之細胞之方法及誘發經感染之細胞之細胞凋亡之方法。這些方法包括使經感染之細胞與本發明之HuM2e抗體接觸。這些方法係於活體外(in vitro ,ex vivo )及活體內進行。
在多種實施態樣中，本發明之抗體本身即具有治療活性。可選擇或額外地，本發明之抗體係與細胞毒性劑或生長抑制劑共軛，例如放射性同位素或毒素，該細胞毒性劑或生長抑制劑係用於治療被該抗體所結合或接觸之經感染之細胞。
在一實施態樣中，本發明提供治療或預防病患感染之方法，該方法包括提供本發明之HuM2e抗體給被診斷為A型流感感染、有發生A型流感感染之風險或疑似受到A型流感感染之病患之步驟。本發明之方法被用於感染之第一線治療、追蹤治療或復發或頑固性感染之治療。使用本發明之抗體之治療係獨立治療。或者，使用本發明之抗體之治療係組合治療計畫之一成分或期，在該計畫中一或多種額外之治療劑亦被用於治療該病患。
有流感病毒相關疾病或疾患風險之個體包括接觸經感染之人或以一些其他方式暴露於流感病毒之病患。投予預防性劑可發生於流感病毒相關疾病或疾患之徵候特徵表現之前，以使疾病或疾患被預防或可選擇的延緩其進展。
在多種態樣中，投予huM2e係實質上與個體之感染同時或在個體之感染之後，也就是治療性治療。在另一態樣中，該抗體提供治療性好處。在多種態樣中，治療性好處包括減輕或降低一或多種流感感染之徵候或併發症之進展、嚴重性、頻率、期間或可能性、病毒力價、病毒複製或一或多種流感毒株之病毒蛋白質之量。在另一態樣中，治療性好處包括加速或促進個體自流感感染恢復。
本發明進一步提供預防個體之流感病毒力價、病毒複製、病毒增生或流感病毒蛋白質之量增加之方法。在一實施態樣中，方法包括對個體投予一量之huM2e抗體，該量能有效預防個體中之一或多種流感毒株或分離株之流感病毒力價、病毒複製或流感病毒蛋白質之量增加。
本發明另外提供保護個體免受感染或降低個體對一或多種流感毒株/分離株或亞型感染之感受性之方法，意即預防性方法。在一實施態樣中，方法包括對個體投予一量之專一性結合流感M2之huM2e抗體，該量能有效保護個體免受一或多種流感毒株/分離株或亞型之感染，或有效降低個體對一或多種流感毒株/分離株或亞型感染之感受性。
可隨意選擇的是，對該個體另外投予第二劑，諸如但不限於流感病毒抗體、抗病毒藥(諸如神經胺酸酶抑制劑、HA抑制劑、唾液酸抑制劑或M2離子通道抑制劑)、病毒進入抑制劑或病毒黏附抑制劑。該M2離子通道抑制劑舉例來說係金剛胺(amantadine)或金剛乙胺(rimantadine)。該神經胺酸酶抑制劑舉例來說係札那米韋(zanamivir)或磷酸奧斯他偉(oseltamivir phosphate)。
可被減輕或降低之流感感染徵候或併發症包括舉例來說畏寒、發燒、咳嗽、喉嚨痛、鼻塞、鼻竇阻塞、鼻腔感染、鼻竇感染、身體痛、頭痛、疲倦、肺炎、支氣管炎、耳感染、耳痛或死亡。
在人及非人病患之活體內治療方面，該病患通常被投予或提供包括本發明之HuM2e抗體之醫藥調製劑。當用於活體內治療時，本發明之抗體係以治療有效量(意即清除或降低病患之病毒負擔之量)被投予給病患。該抗體係根據已知方法諸如靜脈內投予例如快速濃注或在一段時間內連續輸注、肌肉內、腹腔內、腦脊髓腔內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、局部或吸入途徑投予至人病患。該抗體可能以非經腸投予至可能的話之標靶細胞部位或經靜脈投予。在特定實施態樣中，經靜脈或皮下投予抗體係較佳的。本發明之治療性組成物係經系統性、非經腸或局部性投予至病患或個體。
就非經腸投予而言，該抗體與醫藥上可接受之非經腸載劑被調製成單位劑量注射形式(溶液、懸浮液、乳化液)。該載劑之實例為水、鹽水、林格氏液、葡萄糖溶液及5%人血清白蛋白。非含水載劑諸如固定油及油酸乙酯亦被使用。脂質體被用來作為載劑。該載劑包含少量添加劑諸如增進等張性及化學穩定性之物質，例如緩衝劑及保存劑。該抗體通常以約1毫克/毫升至10毫克/毫升之濃度被調製於該載劑中。
該劑量及投藥計畫依可由醫師輕易決定之各種因素而定，諸如該感染之特性及與該抗體共軛之特定細胞毒性劑或生長抑制劑(當使用時)之特徵例如彼之治療指數、病患及病患病史。一般來說，對病患投予治療有效量之抗體。在特定實施態樣中，該投予之抗體的量係介於約0.1毫克/公斤至約50毫克/公斤之病患體重。根據感染之種類及嚴重性，約0.1毫克/公斤至約50毫克/公斤體重(例如0.1-15毫克/公斤/劑量)之抗體係不論藉由例如一或多次分開投予或連續輸注對病患投予之起始候選劑量。此治療之進展藉由習知之方法及檢測並根據醫師或其他該領域之技藝人士已知之標準輕易地監測。
在一特定實施態樣中，包括與細胞毒性劑共軛之抗體的免疫共軛物係投予至病患。較佳的是，該免疫共軛物被細胞內化，導致該免疫共軛物在殺滅其所結合之細胞上的治療療效增加。在一實施態樣中，該細胞毒性劑干擾經感染之細胞中的核酸或以其為標靶。該細胞毒性劑之實例係如上述且包括但不限於類美坦素(maytansinoids)、卡利奇黴素(calicheamicin)、核糖核酸酶及DNA內核酸酶。
其他治療性計畫係與本發明之HuM2e抗體之投予組合。該組合投予包括共同投予、使用分開之調製劑或單一醫藥調製劑及以任何順序之連續投予，其中較佳的是有一段二種(或所有)活性劑同時展現彼等之生物活性之時間。較佳的是該組合治療導致增效之治療效應。
在特定實施態樣中，所欲的是組合投予本發明之抗體與另一抗體，該另一抗體係以與感染性劑有關之另一抗原為標靶。
除了對病患投予抗體蛋白質之外，本發明提供藉由基因治療投予抗體之方法。該投予編碼該抗體之核酸係包含於「投予治療有效量之抗體」之表述中。見例如PCT專利申請案公開號WO96/07321關於使用基因治療以產生細胞內抗體。
在另一實施態樣中，本發明之抗M2e抗體被用於測定結合抗原例如構型表位之結構，該構型表位之結構接著被用於透過例如化學模型及SAR方法以發展具有或模擬該結構之疫苗。該疫苗可另外被用於預防A型流感感染。
所有上述之美國專利、美國專利申請案公開號、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及本申請案中所提及及/或申請書資料表所列示之非專利出版物係以參照方式整體納入此處。
實施例1：利用表現重組M2e蛋白之細胞篩選及特徵化存在人血漿中之M2e專一性抗體
在病患血清中對M2具專一性且能與A型流感感染細胞及流感病毒本身結合之完全人單株抗體如下述被鑑定。
在細胞系中表現M2
包含M2全長cDNA之表現建構物被轉染至293細胞，該M2全長cDNA對應見於流感病毒亞型H3N2中之衍生M2序列。
該M2cDNA係由下列多核苷酸序列及SEQ ID NO：53所編碼：
細胞表面表現M2係利用抗M2e肽專一性單株抗體14C2加以證實。源自A/香港/483/1997(HK483)及A/越南/1203/2004(VN1203)之二種其他M2變異體被用於後續分析，彼等之表現係利用本發明之M2e專一性單株抗體測定，因為14C2之結合可能被M2e中之多種胺基酸取代所廢除。
篩選週邊血液中之抗體
測試超過120個個體血漿樣本中與M2結合之抗體。沒有一個樣本顯示對M2e肽之專一性結合。然而，10%之血漿樣本包含與293-M2 H3N2細胞系專一性結合之抗體。這表示該些抗體可被歸類為與M2同型四聚體之構型決定簇結合，及與M2同型四聚體之多種變異體之構型決定簇結合；彼等無法與線性M2e肽專一性結合。
抗M2單株抗體之特徵化
經由這種方法鑑別之人單株抗體證實與M2同型四聚體上之構型表位結合。這些抗體與原始293-M2轉染細胞以及另外二種細胞表現之M2變異體結合。除了與M2e肽結合之外，14C2單株抗體證實對M2變異序列更具敏感性。另外，14C2不輕易地與流感病毒感染顆粒結合，但是構型專一性抗M2單株抗體可與該感染顆粒結合。
這些結果證實，本發明之方法提供自對流感之正常人免疫反應中鑑別M2單株抗體，而不需以M2進行特異性免疫接種。若用於免疫治療，這些完全人單株抗體相較於人化鼠抗體具有較佳之病患耐受潛力。此外，和14C2及與線性M2e肽結合之傑明尼生物科學(Gemini Biosciences)單株抗體不同的是，本發明之單株抗體與M2之構型表位結合，且不僅對經A型流感毒株感染之細胞具專一性，亦對病毒本身具專一性。本發明之單株抗體的另一項優點是，它們各自與到目前為止所測試之所有M2變異體結合，表示它們並不限於特定線性胺基酸序列。
實施例2：鑑別M2專一性抗體
將表現3種如實施例1所述之在人血清中被鑑別之單株抗體的單核或B細胞稀釋成選殖族群，並誘導以產製抗體。篩選含抗體上清液與293 FT細胞之結合，該293 FT細胞係以源自流感毒株流感亞型H3N2之全長M2E蛋白穩定轉染。顯示陽性染色/結合之上清液利用293 FT細胞(經源自流感毒株流感亞型H3N2之全長M2E蛋白穩定轉染)和僅經載體轉染之對照細胞再度篩選。
接著自上清液顯示陽性結合之B細胞孔槽中救援選殖該抗體之可變區。在293 FT細胞進行暫時轉染以重建及產製這些抗體。經重建之抗體上清液係經篩選與如上述經全長M2E蛋白穩定轉染之293FT細胞之結合，以鑑別該經救援之抗M2E抗體。3種不同的抗體被鑑別：8i10、21B15及23K12。第四個額外之抗體株14C2藉由救援篩選被分離。然而其並不獨特，和8i10株具有完全相同之序列，雖然來自與8i10株不同之捐贈者。
這些抗體之κ及γ可變區之序列提供於下。
8i10株：
抗M28i10株之κ輕鏈可變區係經選殖為HindIII至BsiWl之片段(見下)，其係由下列多核苷酸序列SEQ ID NO：54(上)及SEQ ID NO：55(下)所編碼：
8i10κ輕鏈可變區之轉譯係如下列之多核苷酸序列(如上，SEQ ID NO：54上)及胺基酸序列(如下，對應SEQ ID NO：56)所示：
8i10κ輕鏈可變區之胺基酸序列如下所示，並列出特定結構域(CDR序列根據卡巴(Kabat)方法定義)：
下列為被選殖至表現載體pcDNA3.1之8i10κ輕鏈可變區之實例，該表現載體pcDNA3.1已包含κ輕鏈固定區(上方多核苷酸序列對應SEQ ID NO：65，下方多核苷酸序列對應SEQ ID NO：66，胺基酸序列對應如上所示之SEQ ID NO：56)。黑色鹼基代表pcDNA3.1載體序列，藍色鹼基代表該經選殖之抗體序列。此處所述之抗體亦被選殖至表現載體pCEP4。
8i10之γ重鏈可變區係經選殖為HindIII至Xhol之片段，其係由下列多核苷酸序列及SEQ ID NO：67(上)及SEQ ID NO：68(下)所編碼：
8i10γ重鏈可變區之轉譯係如下列多核苷酸序列(如上，SEQ ID NO：67上)及胺基酸序列(如下，對應SEQ ID NO：69)所示：
8i10γ重鏈可變區之胺基酸序列如下所示，並列出特定結構域(CDR序列根據卡巴方法定義)：
下列為被選殖至表現載體pcDNA3.1之8i10γ重鏈可變區之實例，該表現載體pcDNA3.1已包含γ重鏈固定區(上方多核苷酸序列對應SEQ ID NO：78，下方多核苷酸序列對應SEQ ID NO：79，胺基酸序列對應如上所示之SEQ ID NO：69)。黑色鹼基代表pcDNA3.1載體序列，藍色鹼基代表該經選殖之抗體序列。
γ重鏈之骨架區4(FR4)通常以二個絲胺酸(SS)結束，因此完整之骨架區4應為WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：80)。該選殖γ重鏈固定區及γ重鏈可變區之載體中的Xho1接受位點及該Xho1位點之一個下游額外鹼基提供最後的鹼基，以編碼骨架區4之最後一個胺基酸。然而，原始載體不調整當Xho1位點(CTCGAG,SEQ ID NO：81)被產生且在Xho1位點下游包含“A”核苷酸所產生之靜默突變，這造成骨架區4末端之胺基酸改變：從絲胺酸變精胺酸(S變R)之取代存在於所有工作γ重鏈株。因此，完整之骨架區4讀成WGQGTLVTVSR(SEQ ID NO：82)。未來建構物係經產生，其中在Xho1位點下游之鹼基係“C”核苷酸。因此，用於選殖γ重鏈可變區序列之Xho1位點的產生在選擇性實施態樣中係靜默突變，且將骨架區4胺基酸序列恢復成正當之WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：80)。這適用於此處所描述之所有M2γ重鏈株。
21B15株：
抗M2株21B15之κ輕鏈可變區係經選殖為HindIII至BsiW1之片段，其係由下列多核苷酸序列及SEQ ID NO：83及SEQ ID NO：84所編碼：
21B15κ輕鏈可變區之轉譯係如下列之多核苷酸序列(如上，SEQ ID NO：83上)及胺基酸序列(如下，對應SEQ ID NO：56)所示：
21B15κ輕鏈可變區之胺基酸序列如下所示，並列出特定結構域(CDR序列根據卡巴方法定義)：
用於選殖κ輕鏈可變區之引子跨越多變性之區且在彼之設計上具有擺動鹼基位置。因此，在骨架區4中可能發生D或E胺基酸。在一些情況中，救援抗體之此位置之胺基酸可能不是在B細胞中所產製之原始親代胺基酸。在大部分之κ輕鏈中，該位置係E。在上述之選殖株中(21B15)，在骨架區4中觀察到D(D I K R T)(SEQ ID NO：84)。然而，觀察其周圍之胺基酸，這可能是引子產生的結果且可能是人為現象。源自B細胞之天然抗體在此位置可能具有E。
21B15之γ重鏈可變區係經選殖為HindIII至Xho1之片段，其係由下列多核苷酸序列及SEQ ID NO：85(上)及SEQ ID NO：86(下)所編碼：
21B15γ重鏈可變區之轉譯係如下列多核苷酸序列(如上，SEQ ID NO：87上)及胺基酸序列(如下，對應SEQ ID NO：69)所示：
21B15γ重鏈可變區之胺基酸序列如下所示，並列出特定結構域(CDR序列根據卡巴方法定義)：
23K12株：
抗M2株23K12之κ輕鏈可變區係經選殖為HindIII至BsiW1之片段(見下)，其係由下列多核苷酸序列SEQ ID NO：88(上)及SEQ ID NO：89(下)所編碼：
23K12κ輕鏈可變區之轉譯係如下列之多核苷酸序列(如上，SEQ ID NO：90上)及胺基酸序列(如下，對應SEQ ID NO：91)所示：
23K12κ輕鏈可變區之胺基酸序列如下所示，並列出特定結構域(CDR序列根據卡巴方法定義)：
23K12之γ重鏈可變區係經選殖為HindIII至Xhol之片段，其係由下列多核苷酸序列SEQ ID NO：97(上)及SEQ ID NO：98(下)所編碼：
23K12γ重鏈可變區之轉譯係如下列多核苷酸序列(如上，SEQ ID NO：99上)及胺基酸序列(如下，對應SEQ ID NO：100)所示：
23K12γ重鏈可變區之胺基酸序列如下所示，並列出特定結構域(CDR序列根據卡巴方法定義)：
實施例3：鑑別保留性抗體可變區
排比三種抗體之κ輕鏈及γ重鏈可變區以如下所示鑑別保留性區域及殘基。
三株之κ輕鏈可變區的胺基酸序列排比：
三株之γ重鏈可變區的胺基酸序列排比：
8I10及21B15株來自二個不同的捐贈者，但是它們具有完全相同之γ重鏈，而κ輕鏈之差異只有1個位在骨架區1之位置4的胺基酸(胺基酸M與V，見上)(排除κ輕鏈之骨架區4中的D與E擺動位置)。
抗體可變區之序列比較顯示8i10株之重鏈係源自IgHV4種系序列且該輕鏈係源自IgKV1種系序列。
抗體可變區之序列比較顯示21B15株之重鏈係源自IgHV4種系序列且該輕鏈係源自IgKV1種系序列。
抗體可變區之序列比較顯示23K12株之重鏈係源自IgHV3種系序列且該輕鏈係源自IgKV1種系序列。
實施例4：M2抗體之產製及特徵化
上述抗體係藉由較大規模之暫時轉染293 PEAK細胞以毫克量產製。未經純化之抗體粗上清液被用在ELISA板上以檢測抗體與流感A/波多黎各/8/1932(PR8)之結合，並與對照抗體14C2之結合比較，對照抗體14C2亦藉由大規模暫時轉染產製。抗M2重組人單株抗體與流感病毒結合，但是對照抗體則否(圖9)。
亦在經PR8病毒感染之MDCK細胞上測試抗體之結合(圖10)。對照抗體14C2及三個抗M2e株：8I10、21BI5及23K12，所有均顯示對PR8感染細胞表面上所表現之M2蛋白之專一性結合。未經感染之細胞上未觀察到結合。
利用蛋白A管柱自上清液純化抗體。使用濃度為每毫升1微克之純化抗體進行FACS分析，以測定抗體與在細胞表面上表現M2蛋白之暫時轉染293 PEAK細胞的結合。測量與轉染試劑對照(mock)轉染細胞及暫時轉染流感亞型H3N2、A/V/越南/1203/2004(VN1203)或A/香港/483/1997(HK483)M2蛋白之細胞的結合。抗體14C2被用來作為陽性對照。未染色及二級抗體單獨對照可用來決定背景值。三株抗體均被觀察到對M2蛋白轉染細胞專一性染色。另外，三株抗體均與高病原性毒株A/越南/1203/2004及A/香港/483/1997 M2蛋白非常緊密的結合，然而陽性對照14C2與H3N2 M2蛋白緊密結合、與A/越南/1203/2004 M2蛋白微弱結合及不結合A/香港/483/1997 M2蛋白。見圖11。
抗體21B15、23K12及8I10與穩定表現M2蛋白之293-HEK細胞表面結合，但不與載體轉染細胞結合(見圖1)。此外，這些抗體之結合不被5毫克/毫升24聚物M2肽之存在所競爭，然而拮抗線性M2肽所產製之對照嵌合鼠V區/人IgG1κ14C2抗體(hu14C2)被M2肽完全抑制(見圖1)。這些資料證實，這些抗體與存在細胞或病毒表面上所表現之M2e的構型表位結合，而非線性M2e肽。
實施例5：人抗流感單株抗體與病毒之結合
UV不活化之A型流感病毒(A/PR/8/34)(應用生物技術(Applied Biotechnologies)公司)以1.2微克/毫升被接種於每孔包含25微升PBS之384孔MaxiSorp板(紐克(Nunc)公司)並於4℃培養隔夜。該板接著以PBS清洗三次，每孔加入50微升含1%脫脂奶粉之PBS封閉，接著於室溫中培養1小時。在第二次PBS清洗後，按所示濃度加入三次單株抗體，於室溫中培養該板1小時。經另一次PBS清洗後，在每孔加入25微升與辣根過氧化酶(HRP)共軛之羊抗人IgG Fc(皮爾斯(Pierce)公司)之1/5000 PBS/1%牛奶稀釋液，該板靜置於室溫中1小時。在最後一次PBS清洗後，每孔加入25微升之HRP受質1-StepTM Ultra-TMB-ELISA(皮爾斯公司)，在室溫中之暗處進行反應。該反應以每孔25微升之1N H2 SO4 停止，在SpectroMax Plus孔板讀取儀上讀取450奈米之吸光值(A450)。資料經正常化至10微克/毫升之單株抗體8I10結合之吸光值。結果顯示於圖2A及2B。
實施例6：人抗流感單株抗體與全長M2變異體之結合
M2變異體(包括該些在活體內具有高病原性表現型者)係經選擇以進行分析。序列見圖3A。
M2 cDNA建構物被暫時轉染至HEK293細胞並經以下分析：為了以FACS分析暫時轉染細胞，用0.5毫升之細胞解離緩衝液(英維斯基(Invitrogen)公司)處理10公分組織培養板上之細胞並加以收集。以含有1% FBS、0.2% NaN3 (FACS緩衝液)之PBS清洗細胞，並將細胞重懸於0.6毫升添加100微克/毫升兔IgG之FACS緩衝液中。各轉染株係與所示之單株抗體以1微克/毫升於0.2毫升FACS緩衝液中混合，使每樣本中含有5x105 至5x106 個細胞。以FACS緩衝液清洗細胞三次，將各樣本重懸於0.1毫升包含1微克/毫升alexafluor(AF)647-抗人IgG H＆L(英維斯基公司)之緩衝液中。再次清洗細胞，在FACSCanto儀(貝克頓迪更生(Becton-Dickenson)公司)上進行流式細胞分析。該資料係表現為M2-D20暫時轉染細胞之平均螢光百分比。變異體結合之資料代表2個試驗。丙胺酸突變之資料係來自3個不同試驗之平均讀數及標準誤差。結果顯示於圖3B及3C。
實施例7：丙胺酸掃描突變誘發以評估M2結合
為了評估抗體結合位置，以丙胺酸取代如定點突變誘發所示之各個胺基酸位置。
以M2 cDNA建構物暫時轉染HEK293細胞，如實施例6所述進行分析。結果顯示於圖4A及4B。圖8顯示該表位係位於M2多肽之胺基端的高度保留區。如圖4A、4B及圖8所示，該表位包括M2多肽之位置2之絲胺酸、位置5之蘇胺酸及位置6之麩胺酸。
實施例8：表位封閉
為了決定單株抗體8110及23K12是否與相同位置結合，代表流感毒株A/HK/483/1997序列之M2蛋白被穩定地表現於CHO(中國倉鼠卵巢)細胞系DG44。細胞係經細胞解離緩衝液(英維斯基公司)處理及收集。以含有1% FBS、0.2% NaN3 (FACS緩衝液)之PBS清洗細胞，並將細胞以107 細胞/毫升重懸於添加100微克/毫升兔IgG之FACS緩衝液中。細胞與10微克/毫升之單株抗體(或2N9對照物)於4℃預先結合1小時，接著以FACS緩衝液清洗。直接共軛之AF647-8I10或AF647-23K12(以AlexaFluor647蛋白質標記套組(英維斯基公司)標記)接著以1微克/毫升被用於染色3個預先封閉之細胞樣本(每個樣本含106 個細胞)。流式細胞分析如前述在FACSCanto儀上進行。資料係來自3個不同試驗之平均讀數及標準誤差。結果係顯示於圖5。
實施例9：人抗流感單株抗體與M2變異體及截短M2肽之結合
單株抗體8i10及23K12與其他M2肽變異體之交叉反應係以ELISA分析。肽序列係顯示於圖6A及6B。此外，類似之ELISA試驗係用於決定M2截短肽之結合活性。
簡言之，各肽以2微克/毫升被覆著於每孔包含25微升PBS緩衝液之384孔平底板(紐克(Nunc)公司)並於4℃隔夜培養。清洗該板三次，並於室溫中以1%奶粉/PBS封閉1小時。經過三次清洗後，加入單株抗體滴定液並於室溫中培養1小時。清洗三次後，在每孔加入經稀釋之HRP共軛之羊抗人免疫球蛋白FC專一性(皮爾斯公司(Pierce))。在室溫中培養該板1小時，並清洗三次。每孔加入25微升之1-StepTM Ultra-TMB-ELISA(皮爾斯公司)，在室溫中之暗處進行反應。該反應以每孔25微升之1N H2 SO4 停止，在SpectroMax Plus孔板讀取儀上讀取450奈米之吸光值(A450)。結果顯示於圖6A及6B。
實施例10：活體內評估人抗流感單株抗體防護致死性病毒攻毒之能力
測試抗體23K12及8I10保護小鼠以免受到高病原性禽流感毒株之致死性病毒攻毒之能力。
BALB/c母鼠被隨機分配至5組，每組10隻。在感染前一天(第-1(負1)天)及後二天(第+2(正2)天)，經腹腔內注射給予200微升200微克之抗體。在第0(零)天，經鼻腔給予30微升體積之大約LD90(致死劑量90)之A/越南/1203/04流感病毒。從感染後第1天至第28天觀察存活率。結果顯示於圖7。
其他實施態樣
雖然本發明之特定實施態樣已在此描述以達例證之目的，仍可進行各種修飾而不背離本發明之精神及範圍。因此，本發明除了該隨附之請求項之外並不受限制。
雖然本發明已與彼之詳細說明會同闡述，前述說明係意圖舉例說明而非限制由該隨附請求項之範圍所界定之本發明之範圍。其他態樣、優點及修飾是在以下請求項之範圍內。
此處提及之專利及科學性文獻建構該領域之技藝人士可獲得之知識。所有此處所引述之美國專利及已公開或未公開之美國專利申請案係以參照方式納入。所有此處所引述之公開之外國專利及專利申請案係以參照方式納入此處。此處所引述之以登記號顯示之Genebank及NCBI登記係以參照方式納入此處。所有其他此處所引述之公開文獻、文件、手稿及科學性文獻係以參照方式納入此處。
雖然本發明已藉由彼之較佳實施態樣具體顯示及說明，該領域之技藝人士將了解的是，可在其中進行各種形式及細節之改變而不背離該隨附之請求項所包含之本發明之範圍。
圖1顯示本發明之3種抗體及對照抗體hu14C2與轉染M2表現建構物或對照載體之293-HEK細胞的結合，該結合係於游離M2肽存在或不存在時進行。
圖2A及B顯示人單株抗體與流感A/波多黎各/8/32之結合。
圖3A之表顯示M2變異體之細胞外結構域的胺基酸序列。
圖3B及C之柱形圖顯示人抗流感單株抗體與圖3A所示之M2變異體之結合。
圖4A及B之柱形圖顯示人抗流感單株抗體與經丙胺酸篩選突變誘發之M2肽的結合。
圖5為一系列之柱形圖，該些柱形圖顯示單株抗體8i10及23K12與代表流感毒株A/HK/483/1997序列之M2蛋白的結合，該M2蛋白係由CHO細胞株DG44穩定表現。
圖6A之表顯示抗M2抗體與變異M2肽之交叉反應結合。
圖6B之表顯示M2抗體與截短M2肽之結合活性。
圖7顯示以人抗流感單株抗體治療之流感感染小鼠的存活。
圖8說明抗M2抗體與M2e之N端中的高度保留區結合。
圖9顯示源自粗上清液之抗M2 rHMAb株在ELISA中與流感病毒結合，但是對照抗M2e單株抗體14C2不輕易地結合病毒。
圖10的一系列照片顯示抗M2 rHMAb與經流感感染之細胞結合。MDCK細胞被流感A/PR/8/32感染或不感染，在24小時後測試來自粗上清液之抗體之結合。資料係自FMAT片掃描器收集。
圖11顯示來自粗上清液之抗M2 rHMAb株與流感亞型H3N2、HK483及VN1203 M2蛋白轉染細胞結合。編碼對應流感毒株H3N2、HK483及VN1203之全長M2 cDNA之質體，以及mock對照質體被暫時轉染至293細胞。測試14C2、8i10、23K12及21B15單株抗體與轉染細胞之結合，使用經AF647共軛之抗人IgG二級抗體偵測。顯示的是經FACS分析後，經結合之特定單株抗體之平均螢光強度。

Claims (24)

  1. 一種經分離之抗基質2外結構域(M2e)抗體或彼之抗原結合片段，其中該抗體包含：(a)VH CDR1區，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：72或103；(b)VH CDR2區，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：74或105；(c)VH CDR3區，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：76或107；(d)VL CDR1區，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：59或92；(e)VL CDR2區，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：61或94；及(f)VL CDR3區，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63或96。
  2. 一種經分離之抗基質2外結構域(M2e)抗體，其中該抗體包含下列之區：包含胺基酸序列NYYWS(SEQ ID NO：72)之VH CDR1區、包含胺基酸序列FIYYGGNTKYNPSLKS(SEQ ID NO：74)之VH CDR2區、包含胺基酸序列ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)之VH CDR3區、包含胺基酸序列RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)之VL CDR1區、包含胺基酸序列AASGLQS(SEQ ID NO：61)之VL CDR2區及包含胺基酸序列QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)之VL CDR3區。
  3. 一種經分離之抗基質2外結構域(M2e)抗體，其中該抗體包含下列之區：包含胺基酸序列SNYMS(SEQ ID NO：103)之VH CDR1區、包含胺基酸序列VIYSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO：105)之VH CDR2區、包含胺基酸序列CLSRMRGYGLDV(SEQ ID NO：107)之VH CDR3區、包含胺基酸序列RTSQSISSYLN(SEQ ID NO：92)之VL CDR1區、包含胺基酸序列AASSLQSGVPSRF(SEQ ID NO：94)之VL CDR2區及包含胺基酸序列QQSYSMPA(SEQ ID NO：96)之VL CDR3區。
  4. 一種完全經分離之人單株抗基質2外結構域(M2e)抗體，其包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：44之重鏈序列及包含胺基酸序列SEQ ID NO：46之輕鏈序列，或b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：50之重鏈序列及包含胺基酸序列SEQ ID NO：52之輕鏈序列。
  5. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其結合表位，該表位完全或部分地包括胺基酸序列SLLTEV(SEQ ID NO：42)。
  6. 如申請專利範圍第2至4項中任一項之抗體，其結合表位，該表位完全或部分地包括胺基酸序列SLLTEV(SEQ ID NO：42)。
  7. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第1至6項中任一項之抗體。
  8. 如申請專利範圍第7項之組成物，其另包含抗病毒藥、病毒進入抑制劑或病毒黏附抑制劑。
  9. 如申請專利範圍第8項之組成物，其中該抗病毒藥係神經胺酸酶抑制劑、HA抑制劑、唾液酸抑制劑或M2離子通道抑制劑。
  10. 如申請專利範圍第9項之組成物，其中該M2離子通道抑制劑係金剛胺(amantadine)或金剛乙胺(rimantadine)。
  11. 如申請專利範圍第9項之組成物，其中該神經胺酸酶抑制劑係札那米韋(zanamivir)或磷酸奧斯他偉(oseltamivir phosphate)。
  12. 如申請專利範圍第7項之組成物，其另包含第二抗A型流感抗體。
  13. 如申請專利範圍第7項之組成物，其中該抗體係可操作地連接治療劑或可偵測標記。
  14. 一種如申請專利範圍第7項之組成物於製造藥劑之用途，該藥劑係用於刺激個體之免疫反應。
  15. 一種如申請專利範圍第7項之組成物於製造藥劑之用途，該藥劑係用於治療或預防個體之流感病毒感染。
  16. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該藥劑另包含抗病毒藥、病毒進入抑制劑或病毒黏附抑制劑。
  17. 如申請專利範圍第16項之用途，其中該抗病毒藥係神經胺酸酶抑制劑、HA抑制劑、唾液酸抑制劑或M2離子通道抑制劑。
  18. 如申請專利範圍第17項之用途，其中該M2離子通道抑制劑係金剛胺或金剛乙胺。
  19. 如申請專利範圍第17項之用途，其中該神經胺酸酶抑制劑係札那米韋(zanamivir)或磷酸奧斯他偉(oseltamivir phosphate)。
  20. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該藥劑另包含第二抗A型流感抗體。
  21. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該藥劑係於暴露流感病毒之前或之後投予。
  22. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該藥劑係以足以促進病毒廓清或清除經A型流感感染之細胞之劑量投予。
  23. 一種活體外測定病患體內存在流感病毒感染之方法，該方法包含下列步驟：(a)使取自該病患之生物性樣本與如申請專利範圍第1項之抗體接觸；(b)偵測與該生物性樣本結合之抗體之量；及(c)比較與該生物性樣本結合之抗體之量與對照值，藉此決定流感病毒是否存在於該病患體內。
  24. 一種診斷性套組，該套組包含如申請專利範圍第1項之抗體。
TW98138407A 2008-11-12 2009-11-12 供治療和診斷流感用之組成物和方法 TWI473621B (zh)

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