TWI444195B - Anti-avian influenza virus agents and products containing anti-avian influenza virus agents - Google Patents

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TWI444195B
TWI444195B TW098134195A TW98134195A TWI444195B TW I444195 B TWI444195 B TW I444195B TW 098134195 A TW098134195 A TW 098134195A TW 98134195 A TW98134195 A TW 98134195A TW I444195 B TWI444195 B TW I444195B
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Description

抗禽流感病毒藥劑及含有抗禽流感病毒藥劑之製品
本發明係關於抗禽流感病毒藥劑及含有抗禽流感病毒藥劑之製品。
禽流感病毒係以感染鳥類為主之A型流感病毒之總稱，以野生水禽類作為自然宿主。禽流感病毒中，有感染雞、鵪鶉、火雞等家禽而引起高病原性感染症者，此等高病原性之禽流感病毒成為世界養雞產業的威脅。
雖然現在正進行預防禽流感病毒感染之疫苗之開發研究(例如專利文獻1)，但尚無可完全預防禽流感病毒感染之疫苗。因此，發生禽流感病毒感染時之實際對策是立即宰殺從發生地點半徑數公里範圍內之家禽。又，關於為禽流感病毒亞型之一之H5N1亞型病毒對於人類之感染，曾有因大量接觸該病毒或因宿主之體質而感染之病例報告。
[專利文獻1]日本特表2008-515906號公報
本發明係基於發明人深入研究之結果，發現源自芭樂萃取物之成分具有抗禽流感病毒作用，其目的為提供具有優異抗禽流感病毒作用之抗禽流感病毒藥劑及含有抗禽流感病毒藥劑之製品。
為了達成前述目的，在本發明之一態樣中，提供一種抗禽流感病毒藥劑，其含有使一芭樂萃取物於特定條件下藉由高速液相層析(HPLC)進行分離時所得到之成分，該芭樂萃取物係藉由使用以水及親水性有機溶劑中至少一種作為主成分之萃取溶劑從芭樂萃取而得。該特定條件包含：使用內徑20mm且長度250mm之ODS管柱；於芭樂萃取物投入ODS管柱後至15分鐘之期間，使用甲醇濃度為20%之水-甲醇混合物作為移動相，之後於其投入後15~30分鐘之期間，使用甲醇濃度為40%之水-甲醇混合物作為移動相；且移動相之流速為10mL/分鐘。該抗禽流感病毒藥劑含有於芭樂萃取物投入ODS管柱後至20分鐘之期間從管柱洗提出來之成分作為有效成分。
在本發明之另一態樣中，前述特定條件進一步包含：於芭樂萃取物投入ODS管柱後30~45分鐘之期間，使用甲醇濃度為60%之水-甲醇混合物作為移動相；並提供一種抗禽流感病毒藥劑，其含有於芭樂萃取物投入ODS管柱後20~35分鐘之期間從管柱洗提出來之成分作為有效成分。
在本發明之再一態樣中，提供一種含有抗禽流感病毒藥劑之製品，其含有前述禽流感病毒藥劑之任一種。
藉由本發明，可提供具有優異抗禽流感病毒作用之抗禽流感病毒藥劑以及含有抗禽流感病毒藥劑之製品。
以下詳細說明本發明之一實施態樣。
本實施態樣所相關之抗禽流感病毒藥劑含有使一芭樂萃取物於特定條件下藉由HPLC進行分離時於特定洗提時間之期間所得到之成分作為有效成分，其中該芭樂萃取物係藉由使用特定萃取溶劑從芭樂(Psidium Guajava Linn)萃取而得。
芭樂在日本亦稱作番石榴，係屬於桃金孃科番石榴屬之熱帶地方原產常綠小喬木。芭樂天然生長在，例如，加勒比海沿岸、美國中部、南美北部、東南亞；在日本，則栽培於沖繩等溫暖地方。
就芭樂萃取物於萃取時所使用之萃取原料而言，可使用芭樂之所有器官或各器官之構成要素。萃取原料中，可使用芭樂之單獨器官或其構成要素，也可將芭樂之二種以上器官或其構成要素混合使用。但是，為了得到抗禽流感病毒作用優異之芭樂萃取物，萃取原料以至少包含芭樂之葉或莖者為較佳。
係將下列狀態之萃取原料供應至萃取操作：以採收時原本之狀態，或採收後經破碎、粉碎或磨碎之狀態，或採收後經乾燥之狀態，或採收及乾燥後經破碎、粉碎或磨碎之狀態，或採收後經破碎、粉碎或磨碎後使之乾燥之狀態。為了有效率地進行萃取，以將萃取原料破碎為較佳。又，為了得到抗禽流感病毒作用優異之芭樂萃取物，萃取原料以新鮮葉子為較佳。
從萃取原料萃取出芭樂萃取物之時所使用之萃取溶劑係以水及親水性有機溶劑中至少一種作為主成分。易言之，水及親水性有機溶劑中至少一種於萃取溶劑中之存在比率(體積%)為最高。萃取溶劑中水或親水性有機溶劑之含量係以50體積%以上為較佳，以70體積%以上為更佳。在萃取溶劑含有水及親水性有機溶劑二者之情況，水含量與親水性有機溶劑含量之合計量係以50體積%以上為較佳，以70體積%以上為更佳。
就萃取溶劑中所含之親水性有機溶劑之例子而言，可列舉甲醇、乙醇等低碳醇；丙酮；乙酸乙酯。萃取溶劑可單獨含有一種親水性有機溶劑，也可含有複數種親水性有機溶劑。又，在萃取溶劑中可含有少量水及親水性溶劑以外之溶劑；亦可溶解有，例如，有機鹽、無機鹽、緩衝劑、乳化劑。
芭樂萃取物之萃取可藉由將萃取原料浸漬於萃取溶劑中規定的時間而進行。此時，如需要，可將萃取溶劑攪拌、加溫或加壓。一般而言，若提高萃取溫度，可縮短萃取所需要之時間。例如，在1~2氣壓之壓力下，若為常溫，費時10日完成萃取；若為50~130℃之溫度，在0.05~2小時，或0.1~0.3小時內完成萃取。萃取條件，可視萃取原料之狀態、萃取溶劑之種類而適當地變更。
為了從萃取原料所萃取出之芭樂萃取物中分離除去萃取原料之殘渣，進行固液分離。固液分離係藉由如過濾或離心之公知方法進行。
藉由固液分離除去固形分後之芭樂萃取物接著於特定條件下，藉由高速液相層析進行分離。該高速液相層析分離係採用內徑20mm且長度250mm之ODS管柱。在ODS管柱中充填經碳數為18之十八基矽烷基表面修飾之化學結合型多孔性球狀矽膠(silica gel)以作為固定相。該ODS管柱可為，例如，YMC公司製之SH-343-5(矽膠之粒徑為5μm及細孔徑為12nm)。在移動相中可使用水與甲醇之混合溶液。該混合溶液之甲醇濃度，係於該芭樂萃取物投入ODS管柱後，依照第一圖(a)之曲線圖中所示之梯度曲線，每經過規定時間即階段地變化。具體而言，混合溶液之甲醇濃度，於將於芭樂萃取物投入ODS管柱後至15分鐘(0至15分鐘)之期間為20%；之後於其投入後15~30分鐘之期間為40%；投入後30~45分鐘之期間為60%。將移動相之流速設定成10mL/分鐘。管柱溫度係以室溫(25℃)為較佳。
本實施態樣之抗禽流感病毒藥劑含有：於芭樂萃取物投入ODS管柱後至20分鐘(0至20分鐘)之第一期間從管柱洗提出來之成分，或於其投入後20~35分鐘之第二期間從管柱洗提出來之成分作為有效成分。抗禽流感病毒藥劑可為於第一期間或第二期間從管柱洗提出來之洗提液本身，亦可為將該洗提液藉由凍結乾燥等公知之乾燥處理予以粉末化者。又，將第一期間所得到之洗提液粉末化所成之物為茶褐色且略具黏性；另一方面，將第二期間所得到之洗提液粉末化所成之物為茶褐色且乾燥。
抗禽流感病毒藥劑適用於以發揮抗禽流感病毒作用為目的之製品。就該含有抗禽流感病毒藥劑之製品而言，可列舉如，醫療用劑(含有藥劑)、洗淨劑、化妝品、醫療用機器、衛生材料、衛生用品及飲食品。就前述醫療用劑而言，可列舉如醫藥品。就前述洗淨劑而言，可列舉如洗滌用柔軟劑、洗滌用漂白劑、肥皂、入浴劑、洗劑、洗髮精、牙粉。就前述化妝品而言，可列舉如洗臉肥皂、洗手肥皂、護手霜、香水、化妝水、乳液、美容液、美容霜、口紅、脣膏、妝粉。就前述醫療用機器而言，可列舉如面罩、包帶、紗布、手套、傷口貼布、棉球、診斷用機械器具、手術用機械器具、治療用機械器具、醫院用機械器具、牙科用機械器具、醫療用補助器具、矯正器具。就前述衛生材料而言，可列舉如紗布、脫脂棉、不織布、棉棒。就前述衛生用品而言，可列舉如加濕器、空調機、空氣清淨機。就前述飲食品而言，可列舉如健康飲料、健康食品。又，前述醫療用劑及前述化妝品中亦包括：含漱藥或喉糖、喉噴劑、藥用肥皂、消毒液等醫藥部外品。
含有抗禽流感病毒藥劑之醫藥品或醫藥部外品之投與法可為經口投與、血管內投與、經皮投與等之方法。醫藥品及醫藥部外品之劑型並無特殊限定，但可為例如散劑、粉劑、顆粒劑、錠劑、膠囊劑、丸劑、栓劑、液劑、注射劑、塗布劑。又，在不損及本發明之目的之範圍內，可在醫藥品及醫藥部外品中配入賦形劑、基劑、乳化劑、溶劑、安定劑等添加劑。
含有抗禽流感病毒藥劑之飲食品可藉由在任意的食品原料或飲料原料中添加抗禽流感病毒藥劑而製造得出。飲食品可加工成如粉末狀、錠劑狀、顆粒狀、液狀(飲料等)、膠囊狀、糖漿、糖果之形態，而作為健康食品製劑、營養補助食品使用。就飲食品之具體例而言，可列舉運動飲料；從茶葉或草藥萃取出之茶類飲料；牛奶或優酪乳等乳製品；含有果膠或角叉菜膠(carrageenan)等膠化劑之食品；硬糖或軟糖、膠質軟糖(gummi)等糖果；口香糖；葡萄糖或蔗糖、果糖、乳糖、糊精等糖類；香料；甜菊或阿斯巴甜；糖醇等甜味劑；含有植物性油脂及動物性油脂等油脂之飲料或食品。在不損及本發明目的之範圍內，可在飲食品中添加基材、賦形劑、添加劑、副原料、增量劑等添加劑。
在禽流感病毒中，根據血凝素(hemagglutinin)及神經胺酸酶(neuraminidase)之種類而存在H5N3、H5N1、H5N7、H5N2、H7N3等複數種亞型，但本實施態樣之抗禽流感病毒藥劑對於任一種禽流感病毒皆適用。
依照本實施態樣，可得到下述結果。
本實施態樣之抗禽流感病毒藥劑具有優異的抗禽流感病毒作用。因此，抗禽流感病毒藥劑可用於治療感染禽流感病毒之家畜(包含家禽)或人類，以及預防健康家畜(包含家禽)或人類之禽流感病毒感染。亦即，抗禽流感病毒藥劑可作為禽流感的預防劑或治療劑。
本實施態樣之抗禽流感病毒藥劑係源自天然植物芭樂之萃取物，所以安全性高。
前述實施態樣亦可如下文所述加以變更。
抗禽流感病毒藥劑可為於第一期間(將於芭樂萃取物投入ODS管柱後至20分鐘)或第二期間(於其投入後之20~35分鐘)從管柱洗提出來之洗提液經聚乙烯基聚吡咯啶酮(polyvinylpolypyrrolidone，PVPP)處理之物。在該情況下，可除去吸著於聚乙烯基聚吡咯啶酮之成分。
接著，列舉實施例而具體地說明本發明。
<抗禽流感病毒藥劑之調製>
將1公斤之芭樂新鮮葉子裁成約1cm見方大小，於室溫下浸漬於10L之含有3：7之乙醇及水的乙醇水溶液中共計10日。之後，將其過濾而得之濾液濃縮及乾燥，得到65.1g之粉末狀芭樂萃取物。將該芭樂萃取物中之6.5g溶於50mL之含有2：1之甲醇及水的甲醇水溶液中。將所得溶液於3000rpm離心15分鐘。之後，將上清液用Advantec公司製之孔徑0.80μm之乙酸纖維素過濾器(DISMIC-25CS080AN)過濾，回收濾液以作為分取用樣品。之後，將分取用樣品於以下條件藉由高速液相層析進行分離。
(藉由高速液相層析進行分離之條件)
管柱：YMC公司製之SH-343-5(管柱之內徑20mm及長度250mm，矽膠之粒徑5μm及細孔徑12nm)
移動相：於分取用樣品投入管柱後至15分鐘(0至15分鐘)之期間，係甲醇濃度為20%之水-甲醇混合物；於其投入後之15至30分鐘期間，係甲醇濃度為40%之水-甲醇混合物；於其投入後之30至45分鐘期間，係甲醇濃度為60%之水-甲醇混合物；於其投入後之45至50分鐘期間，係100%甲醇(參照第一圖(a))。
移動相之流速：10mL/分鐘
管柱溫度：室溫(25℃)
檢測波長：255nm
此時所得到之HPLC圖譜示於第一圖(b)中。得到6個洗提時間(即從分取用樣品投入管柱算起之時間)不同的洗提分。更具體而言，係於分取用樣品投入管柱後至20分鐘(0至20分鐘)之期間、於其投入後之20至35分鐘期間、於其投入後之35至39分鐘期間、於其投入後之39至41分鐘期間、於其投入後之41至43分鐘期間、於其投入後之43至50分鐘期間，分別回收從管柱洗提出來之洗提液，將所得到之6個洗提分濃縮及乾燥，得到表1所示之6種粉末A至F。
將粉末A至F分別溶於乙醇水溶液(10至90%)並使濃度成為0.5% w/v，以調製成樣品A至F。又，對於先前所得到之粉末狀芭樂萃取物，同樣地亦將其溶於乙醇水溶液(10至90%)並使濃度成為0.5% w/v，以調製成樣品Mx。樣品A至F及樣品Mx於下述條件下藉由高速液相層析進行分析。
(藉由高速液相層析之分析之條件)
管柱：Imtakt公司製之Cadenza CD-C18(CD006：內徑4.6mm x長度250mm，粒徑3μm)
移動相：於樣品投入管柱後至10分鐘(0至10分鐘)之期間，係甲醇濃度為10%且醋酸濃度為5%之水-醋酸-甲醇混合物；於其投入後之10至20分鐘期間，係甲醇濃度從10%直線地緩慢增加至35%的水-醋酸-甲醇混合物；於其投入後之20~40分鐘期間，係甲醇濃度為35%且醋酸濃度為5%之水-醋酸-甲醇混合物；於其投入後之40~50分鐘期間，係甲醇濃度從35%直線地緩慢增加至100%的水-醋酸-甲醇混合物；於其投入後之50~60分鐘期間，係100%甲醇(參照第二圖(a))。
移動相之流速：0.6mL/分鐘
管柱溫度：40℃
檢測波長：MaxPlot(190-800nm)、250nm、280nm
此時所得之HPLC圖譜示於第二圖(b)至第二圖(d)及第三圖(a)至第三圖(d)。更具體而言，第二圖(b)展現樣品Mx之HPLC圖譜，第二圖(c)展現樣品A之HPLC圖譜，第二圖(d)展現樣品B之HPLC圖譜，第三圖(a)展現樣品C之HPLC圖譜，第三圖(b)展現樣品D之HPLC圖譜，第三圖(c)展現樣品E之HPLC圖譜，第三圖(d)展現樣品F之HPLC圖譜。
＜關於抗禽流感病毒作用之試驗＞
以下述順序進行前述樣品A至F以及樣品Mx之抗禽流感病毒作用之評估。
首先，將MDCK細胞(源自狗腎臟上皮之細胞)在使用MEM7%FBS培養基之96孔培養盤中，於37℃之CO2 培育器中培養2日，以使MDCK細胞形成單層。又，將禽流感病毒(H5N3:A/Duck/313/4/78病毒)之貯存原液用無血清培養基(SF-MEM)稀釋，作成0.7HAU之病毒液。然後，將病毒液分別與樣品A至F及樣品Mx各用無血清培養基(SF-MEM)稀釋25倍、100倍、400倍、1600倍、6400倍、25600倍(接種時之2倍濃度)而得之同量稀釋液混合，於4℃放置1小時製成病毒檢體混合液。將各病毒檢體混合液100μL接種於96孔培養盤內形成為單層之MDCK細胞上，在34℃之CO2 培育器內進行感染處理。1小時後除去病毒檢體混合液，同時用無血清培養基(SF-MEM)洗淨培養盤上之培養細胞。
之後，將樣品A至F及樣品Mx各用含有2.5μL乙醯基胰蛋白酶(acetyltrypsin)之無血清培養基(SF-MEM)稀釋50倍、200倍、800倍、3200倍、12800倍、51200倍。將所得各稀釋液100μL加至MDCK細胞之盤孔(cell)中，該MDCK細胞已於先前接種有相同濃度且含源自芭樂萃取物之成分之病毒檢體混合液；然後將培養盤放入34℃之CO2 培育器內。18小時後，在各盤孔中加入50μL甲醇，於室溫放置1分鐘使MDCK細胞固定化。之後，將各盤孔用無血清培養基(SF-MEM)洗淨。接著在各盤孔中加入抗核蛋白單株抗體(4E6)並於室溫放置45分鐘後，將各盤孔用無血清培養基(SF-MEM)洗淨。之後，在各盤孔中加入以抗小鼠IgG標記之β-半乳糖苷酶(0.1% Block Ace)，並於室溫放置45分鐘。
接著，在各盤孔中加入40μM之MU(4-甲基傘形酮)-Gal((4-methylumbelliferone)-Gal)(含有50μM之MgCl2 )，並保持於37℃45分鐘。此時，抗小鼠IgG標記之β-半乳糖苷酶以MU-Gal作為基質，產生螢光性的MU(4-甲基傘形酮)。之後，在各盤孔中加入100mM之碳酸鈉緩衝液(pH 10.6)使反應停止，再藉由測定MU之產生量來間接地測定感染細胞之病毒量。MU產生量之測定，係採用螢光檢測器於激發波長355nm、螢光波長(檢測波長)460nm進行測定。根據該測定結果，得出「病毒檢體混合液中源自芭樂萃取物之成分之濃度與所測得之螢光強度之關係」之曲線圖示於第四圖(a)及第四圖(b)中。又，算出各樣品之50%有效濃度(EC50 )並將結果示於表2中。
如表2所示，確認含有芭樂萃取物之樣品Mx具有高抗禽流感病毒作用。又，由於樣品A至F之中，樣品A及樣品B顯示高抗禽流感病毒作用，所以確認芭樂萃取物所具有之抗禽流感病毒作用之主體為粉末A及粉末B。
＜有關聚乙烯基聚吡咯啶酮處理之試驗＞
對於樣品A及樣品B，檢驗聚乙烯基聚吡咯啶酮(polyvinylpolypyrrolidone，PVPP)處理所引起之抗流感病毒作用變化。PVPP具有吸著如單寧(tannin)等聚合多元酚之作用；藉由進行PVPP處理，可以除去樣品A及樣品B所含之大部分多元酚。
首先各在1mL樣品A及樣品B中添加5.0g/L之PVPP並攪拌。於10000rpm離心5分鐘後，將其上清液用Advantec公司製之孔徑0.80μm乙酸纖維素濾器(DISMIC-25CS080AN)過濾，並回收濾液。對於如此所得之經PVPP處理之樣品A及樣品B，以及未經PVPP處理之樣品A及樣品B，以下述方法評估抗禽流感病毒作用。
首先，將MDCK細胞(源自狗腎臟上皮之細胞)在使用MEM7%FBS培養基之24孔培養盤中，於37℃之CO2 培育器中培養2日，使MDCK細胞形成單層。又，將禽流感病毒(H5N3:A/Duck/313/4/78病毒)之貯存原液用無血清培養基(SF-MEM)稀釋，作成0.7HAU之病毒液。然後，將經PVPP處理之樣品A及樣品B以及未經PVPP處理之樣品A及樣品B分別用無血清培養基(SF-MEM)稀釋200倍，將所得之各稀釋樣品用無血清培養基(SF-MEM)稀釋25倍、100倍、400倍、1600倍、6400倍、25600倍(接種時之2倍濃度)，然後與同量的病毒液混合。將所得的病毒檢體混合液放置於冰上1小時。之後，將各病毒檢體混合液200μL接種於24孔培養盤內形成為單層之MDCK細胞上，並在34℃之CO2 培育器內進行感染處理。
1小時後除去病毒檢體混合液，同時用無血清培養基(SF-MEM)洗淨培養盤上之培養細胞。之後，在各盤孔中重疊一層含0.75%瓊脂糖(agarose)之MEM培養基，並在34℃之CO2 培育器內培養3日。然後，在各盤孔中添加含有5：1之乙醇與醋酸之乙醇-醋酸溶液並靜置一夜，以使感染停止並固定MDCK細胞。之後，除去重疊的培養基層，並用純水及0.1%Triton-PBS溶液洗淨各盤孔，再使一級抗體與二級抗體反應。然後，用染色液(DEPDA、4CN檸檬酸緩衝液、H2 O2 )處理各盤孔，計算顯現青色之溶斑(plaque)數目並評估禽流感病毒感染之抑制率。將其結果示於表3中。
如表3所示，經PVPP處理之樣品A及樣品B之病毒抑制率未降低。該結果顯示樣品A及樣品B當中展現抗禽流感病毒作用之成分可能不是聚合多元酚(如單寧)之。因此，可有效地藉由PVPP之處理來除去展現抗禽流感病毒作用之成分以外之成分，以提高展現抗禽流感病毒作用之成分之含有率。
[第一圖]第一圖(a)係展現在芭樂萃取物之高速液相層析分離中所使用之移動相的梯度曲線圖；第一圖(b)係展現藉由芭樂萃取物之高速液相層析分離所得之HPLC圖譜。
[第二圖]第二圖(a)係展現在樣品A至F及樣品Mx之高速液相層析分析中所使用之移動相的梯度曲線圖；第二圖(b)係在樣品Mx之高速液相層析分析中所得之HPLC圖譜；第二圖(c)係在樣品A之高速液相層析分析中所得之HPLC圖譜；第二圖(d)係在樣品B之高速液相層析分析中所得之HPLC圖譜。
[第三圖]第三圖(a)係在樣品C之高速液相層析分析中所得之HPLC圖譜；第三圖(b)係在樣品D之高速液相層析分析中所得之HPLC圖譜；第三圖(c)係在樣品E之高速液相層析分析中所得之HPLC圖譜；第三圖(d)係在樣品F之高速液相層析分析中所得之HPLC圖譜。
[第四圖]第四圖(a)及第四圖(b)係展現病毒檢體混合液中源自芭樂萃取物之成分濃度與所測得之螢光強度的關係圖。

Claims (8)

  1. 一種抗禽流感病毒藥劑，其特徵為含有使一芭樂萃取物於特定條件下藉由高速液相層析進行分離時所得到之成分；其中該芭樂萃取物係使用以水及親水性有機溶劑中至少一種作為主成分之萃取溶劑從芭樂之葉萃取而得；而該特定條件包含：使用內徑20mm且長度250mm之ODS管柱；於芭樂萃取物投入ODS管柱後至15分鐘之期間，使用甲醇濃度為20%之水-甲醇混合物作為移動相，之後於其投入後15至30分鐘之期間，使用甲醇濃度為40%之水-甲醇混合物作為移動相，且移動相之流速為10mL/分鐘；該抗禽流感病毒藥劑含有該芭樂萃取物投入ODS管柱後至20分鐘之期間從管柱洗提出來、且不會吸著於聚乙烯基聚吡咯啶酮(polyvinylpolypyrrolidone)之成分作為有效成分。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗禽流感病毒藥劑，其中該抗禽流感病毒藥劑當中於芭樂萃取物投入ODS管柱後至20分鐘之期間從管柱所洗提出來之成分係藉由聚乙烯基聚吡咯啶酮加以處理。
  3. 一種抗禽流感病毒藥劑，其特徵為含有使一芭樂萃取物於特定條件下藉由高速液相層析進行分離時所得到之成分；其中該芭樂萃取物係使用以水及親水性有機溶劑中至少一種作為主成分之萃取溶劑從芭樂之葉萃取而得；而該特定條件包含：使用內徑20mm且長度250mm之ODS管柱；於芭樂萃取物投入ODS管柱後至15分鐘之期間，使用甲醇濃度為20%之水-甲醇混合物作為移動相，之後於其投入後15至30分鐘之期間，使用甲醇濃度為40%之水-甲醇混合物作為移動相，再之後於其投入後30至45分鐘之期間，使用甲醇濃度為60%之水-甲醇混合物作為移動相，且移動相之流速為10mL/分鐘；該抗禽流感病毒藥劑含有該芭樂萃取物投入ODS管柱後20至35分鐘之期間從管柱洗提出來、且不會吸著於聚乙烯基聚吡咯啶酮之成分作為有效成 分。
  4. 如申請專利範圍第3項之抗禽流感病毒藥劑，其中該抗禽流感病毒藥劑當中於芭樂萃取物投入ODS管柱後20至35分鐘之期間從管柱所洗提出來之成分係藉由聚乙烯基聚吡咯啶酮加以處理。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗禽流感病毒藥劑，其係作為禽流感之治療劑使用。
  6. 如申請專利範圍第5項之抗禽流感病毒藥劑，其中該禽流感為H5N3型。
  7. 一種如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗禽流感病毒藥劑之用途，其係用於製造禽流感之治療劑。
  8. 一種含有抗禽流感病毒藥劑之製品，其特徵為含有如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗禽流感病毒藥劑。
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