KR101672026B1

KR101672026B1 - 항-조류 인플루엔자 바이러스제, 및 항-조류 인플루엔자 바이러스제를 함유하는 제품

Info

Publication number: KR101672026B1
Application number: KR1020117009575A
Authority: KR
Inventors: 슈이치 후쿠모토; 켄지 쿠마가이; 야스오 스즈키; 농럭 스리윌라이자로엔
Original assignee: 가부시키가이샤 포카코포레이션
Priority date: 2008-10-08
Filing date: 2009-10-08
Publication date: 2016-11-02
Also published as: EP2340844A1; JP5558360B2; US8603548B2; TWI444195B; CN102170890A; CN102170890B; JPWO2010041702A1; WO2010041702A1; US20110195135A1; KR20110065534A; TW201014597A; EP2340844A4

Abstract

본 발명은 활성 성분으로서, 주로 물 및 친수성 유기 용매 중 적어도 하나를 포함하는 추출 용매로 구아바로부터 추출된 구아바 추출물이 특정 조건하에서 HPLC에 의해 분류화될 때 얻어지는 성분을 함유하는 항-조류 인플루엔자 바이러스제를 제공하는 것이다. 상기 특정 조건은 ODS 칼럼의 사용, 구아바 추출물을 상기 칼럼에 적용한 후 15 분까지 이동상으로서 20%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 15 내지 30분의 후속 기간 동안 이동상으로서 40%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용을 포함한다. 또한, 상기 특정 조건은 구아바 추출물을 칼럼에 적용한 후 30 내지 45분 동안 이동상으로서 60%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용을 더 포함한다. 상기 항-조류 인플루엔자 바이러스제에 포함된 성분은 구아바 추출물을 칼럼에 적용한 후, 20분까지 또는 20 내지 35 분의 후속 기간에 칼럼으로부터 용출된다.

Description

항-조류 인플루엔자 바이러스제, 및 항-조류 인플루엔자 바이러스제를 함유하는 제품{ANTI-AVIAN INFLUENZA VIRUS AGENT, AND PRODUCT CONTAINING ANTI-AVIAN INFLUENZA VIRUS AGENT}

본 발명은 항-조류 인플루엔자 바이러스제 및 항-조류 인플루엔자 바이러스제를 함유하는 제품에 관한 것이다.

조류 인플루엔자 바이러스는 주로 새를 감염시키는 인플루엔자 A 바이러스의 속명(generic name)이고 야생 물새는 이의 자연 숙주이다. 몇몇 조류 인플루엔자 바이러스는 닭, 메추라기 및 칠면조와 같은 가금류를 감염시켜 높은 병원성 감염을 일으킨다. 치킨 산업은 이러한 고도의 병원성 조류 인플루엔자 바이러스로부터 세계적인 위협에 직면하고 있다.

조류 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하기 위한 백신의 개발 및 연구를 실시하고 있지만(예를 들어, 특허 문헌 1 참조), 조류 인플루엔자 바이러스 감염을 완전히 예방할 수 있는 백신은 현재 없다. 따라서, 조류 인플루엔자 바이러스 감염이 실제로 발생했을 때 취할 수 있는 실제 조치는 발생 위치로부터 수 킬로미터 반경 내의 가금류를 바로 말살하는 것일 것이다. 조류 인플루엔자 바이러스의 아형인 H5N1 아형 바이러스의 감염은 많은 양의 바이러스와 접촉을 하거나, 숙주의 특이적 성향에 의해 인간에게도 발생될 수 있음이 보고되었다.

특허 문헌 1: 일본 특허공개번호 제2008-515906호

본 발명의 발명자들은 다양한 연구를 수행하였고 그 결과, 구아바 추출물로부터 유래한 성분은 항-조류 인플루엔자 바이러스 효과를 가짐을 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견을 기반으로 얻어졌다, 본 발명의 목적은 우수한 항-조류 인플루엔자 바이러스 효과를 갖는 항-조류 인플루엔자 바이러스제 및 항-조류 인플루엔자 바이러스제-함유 제품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 측면은 활성 성분으로서, 주로 물 및 친수성 유기 용매 중 적어도 하나를 포함하는 추출 용매로 구아바로부터 추출된 구아바 추출물이 특정 조건하에서 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)에 의해 분류화될 때 얻어지는 성분을 함유하는 항-조류 인플루엔자 바이러스제를 제공한다. 상기 특정 조건은 20 mm의 내부 반경 및 250 mm의 길이의 ODS 칼럼의 사용, 구아바 추출물을 상기 ODS 칼럼에 적용한 후 15 분이 되는 동안 이동상으로서 20%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 15 내지 30분의 후속 기간 동안 이동상으로서 40%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 및 10 mL/분의 속도로 통과되는 이동상을 포함한다. 항-조류 인플루엔자 바이러스제에 함유된 성분은 구아바 추출물을 칼럼에 적용한 후 20 분 내에 ODS 칼럼으로부터 용출된다.

본 발명의 다른 측면은 활성 성분으로서, 구아바 추출물을 칼럼에 적용한 후 20 내지 35분 내에 ODS 칼럼으로부터 용출되는 성분을 함유하는 항-조류 인플루엔자 바이러스제를 제공하는 것이고, 여기서 상기 특정 조건은 구아바 추출물을 ODS 칼럼에 적용한 후 30 내지 45 분의 기간 동안 이동상으로서 60%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용을 더 포함한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 기술된 항-조류 인플루엔자 바이러스제 중 하나를 포함하는 항-조류 인플루엔자 바이러스제-함유 제품을 제공하는 것이다.

본 발명은 우수한 항-조류 인플루엔자 바이러스 효과를 갖는 항-조류 인플루엔자 바이러스제 및 항-조류 인플루엔자 바이러스제-함유 제품을 제공한다.

도 1(a)는 고성능 액체크로마토그래피에 의한 구아바 추출물의 분류를 위해 사용된 이동상의 구배 곡선을 나타내는 그래프이다;
도 1(b)는 고성능 액체크로마토그래피에 의한 구아바 추출물의 분류로부터 얻어지는 HPLC 차트이다;
도 2(a)는 샘플 A 내지 F 및 샘플 Mx의 고성능 액체크로마토그래피 분석을 위해 사용된 이동상의 구배 곡선을 나타내는 그래프이다;
도 2(b)는 샘플 Mx의 고성능 액체크로마토그래피 분석으로부터 얻어지는 HPLC 차트이다;
도 2(c)는 샘플 A의 고성능 액체크로마토그래피 분석으로부터 얻어지는 HPLC 차트이다;
도 2(d)는 샘플 B의 고성능 액체크로마토그래피 분석으로부터 얻어지는 HPLC 차트이다;
도 3(a)는 샘플 C의 고성능 액체크로마토그래피 분석으로부터 얻어지는 HPLC 차트이다;
도 3(b)는 샘플 D의 고성능 액체크로마토그래피 분석으로부터 얻어지는 HPLC 차트이다;
도 3(c)는 샘플 E의 고성능 액체크로마토그래피 분석으로부터 얻어지는 HPLC 차트이다;
도 3(d)는 샘플 F의 고성능 액체크로마토그래피 분석으로부터 얻어지는 HPLC 차트이다; 및
도 4(a) 및 4(b)는 바이러스 샘플 혼합물 내의 구아바 추출물 성분의 농도 및 측정된 형광 강도 사이의 관계를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 일 구현예가 상세히 설명될 것이다.

상기 구현예에 따른 항-조류 인플루엔자 바이러스제는 활성 성분으로서, 특정 추출 용매로 구아바 (Psidium Guajava Linn)로부터 추출된 구아바 추출물이 특정 조건하에서 고성능 액체크로마토그래피에 의해 분류될 때, 특정 용출 시간 내에 얻어지는 성분을 포함한다.

일본의 반지로(banjiro) 또는 반자쿠로(banzakuro)로도 불리는 구아바는 열대 지역이 원산지인 미르타케아 종(Myrtaceae)의 구아바(genus Psidium)에 속하는 작은 상록수(evergreen tree)이다. 구아바는 예를 들어, 캐리비안 해안을 따라, 중앙아메리카, 남아메리카의 북부 및 동남아시아에 자연 발생적으로 성장하고, 일본의 오키나와와 같은 따뜻한 지역에서는 재배된다.

구아바 추출물의 추출을 위해 사용될 원료로서 구아바의 임의의 기관 또는 구아바의 임의의 기관의 성분이 사용될 수 있다. 추출용 원료는 구아바의 단일 기관 또는 이의 성분일 수 있거나, 구아바의 2 또는 그 이상의 기관 또는 이의 성분의 혼합물일 수 있다. 항-조류 인플루엔자 바이러스 효과에 있어서 우수한 구아바 추출물을 얻기 위하여 바람직하게는 추출용 원료는 적어도 구아바의 잎 또는 줄기를 포함한다.

추출용 원료는 수확 상태에서, 수확 후 찧거나, 분쇄하거나, 또는 가는 상태에서, 수확 후 건조되는 상태에서, 수확 및 건조 후 찧거나, 분쇄하거나, 또는 가는 상태에서, 또는 수확 후 찧거나, 분쇄하거나, 또는 갈은 다음 건조되는 상태에서 추출이 수행된다. 추출을 효과적으로 수행하기 위하여 추출용 원료를 찧는 것이 바람직하다. 항-조류 인플루엔자 바이러스 효과가 우수한 구아바 추출물을 얻기 위하여 추출용 원료는 원료 잎이 바람직하다.

추출용 원료로부터 구아바 추출물을 추출하기 위해 사용되는 추출 용매는 물 및 친수성 유기 용매 중 적어도 하나를 주로 포함한다. 즉, 물 및 친수성 유기 용매 중 적어도 하나는 추출 용매에서 가장 높은 비율(부피%)로 존재한다. 추출 용매 내의 물 또는 친수성 유기 용매의 함량은 바람직하게는 50 부피% 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 70 부피% 또는 그 이상이다. 추출 용매가 물 및 친수성 유기 용매 둘 다를 포함하는 경우, 물 및 친수성 유기 용매의 총 함량은 바람직하게는 50 부피% 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 70 부피% 또는 그 이상이다.

추출 용매에 포함된 친수성 유기 용매의 예는 메탄올 및 에탄올과 같은 저급 알코올, 아세톤, 및 에틸 아세테이트를 포함한다. 추출 용매는 하나의 친수성 유기 용매만을 포함하거나 또는 둘 또는 그 이상의 친수성 유기 용매를 포함할 수 있다. 추출 용매는 물 및 친수성 유기 용매 이 외, 소량의 용매를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유기염, 무기염, 버퍼, 또는 유화제가 추출 용매에 용해될 수 있다.

구아바 추출물의 추출은 적합한 시간 동안 추출 용매 내에 추출용 원료를 담금으로 인해 수행된다. 이때, 필요에 따라, 추출 용매를 교반, 가열 또는 압력화할 수 있다. 일반적으로, 추출 온도를 상승할 경우, 추출에 필요한 시간은 감소한다. 예를 들어, 1 내지 2 대기압 하에서 상온에서의 추출은 약 10일 정도 소요되나, 50 내지 130℃의 온도에서는 단지 0.05 내지 2 시간 또는 0.1 내지 0.3 시간 소요된다. 추출 조건은 추출용 원료의 조건 또는 추출 용매의 종류에 따라 적당하게 변경될 수 있다.

추출용 원료로부터 추출된 구아바 추출물은 추출용 원료의 잔여물을 분리 및 제거하기 위하여 고-액 분리를 수행할 수 있다. 고-액 분리는 예를 들어, 여과 또는 원심분리와 같은 공지의 방법이 수행된다.

고-액 분리에 의해 고체가 제거된 후, 구아바 추출물은 특정 조건하에서 고성능 액체크로마토그래피에 의한 분류를 수행한다. 20 mm의 내부 반경 및 250 mm의 길이를 갖는 ODS 칼럼이 고성능 액체크로마토그래피에 의한 분류에 사용된다. ODS 칼럼은 고체상, 즉, 화학적으로 결합된 구형의 다공성 실리카겔로 충전되고, 여기서 상기 실리카겔의 표면은 18개의 탄소원자를 갖는 옥타데실실일기(octadecylsilyl group)로 개질된다. ODS 칼럼은, 예를 들어, YMC Co., Ltd.에 의해 제조되는 SH-343-5 (실리카겔 입자 크기는 5 ㎛, 및 슬릿 반경은 12 nm임)일 수 있다. 물 및 메탄올의 혼합된 용액은 이동상으로서 사용된다. 구아바 추출물을 상기 ODS 칼럼에 적용한 후, 상기 혼합된 용액의 메탄올 농도는 도 1(a)의 그래프의 구배 곡선을 따라 각각의 미리 정해진 시간의 경과로 단계별로 변화한다. 구체적으로, 혼합된 용액 내의 메탄올 농도는 구아바 추출물을 상기 ODS 칼럼에 적용한 후, 15분까지의 기간(0 내지 15 분) 동안 20%이고, 15 내지 30 분의 후속 기간 동안은 40%이고, 및 30 내지 45 분의 후속 기간 동안은 60%이다. 이동상의 유동 속도는 10 mL/분으로 설정된다. 칼럼 온도는 바람직하게는 상온(25℃)이다.

본 구현예의 항-조류 인플루엔자 바이러스제는 활성 성분으로서, 구아바 추출물을 칼럼에 적용한 후 20분까지의 첫 번째 기간에 ODS 칼럼으로부터 용출되는 성분 또는 20 내지 35 분의 이 후 두 번째 기간에 ODS 칼럼으로부터 용출되는 성분을 포함한다. 항-조류 인플루엔자 바이러스제는 상기 첫 번째 기간 또는 상기 두 번째 기간에 칼럼으로부터 용출되는 용출액 자체일 수 있거나, 또는 상기 용출액을 동결건조와 같은 공지의 건조처리에 의해 분말화하여 얻은 제품일 수 있다. 상기 첫 번째 기간의 용출액을 분말화하여 얻은 제품은 붉은 갈색이며 약간 끈적하나, 상기 두 번째 기간의 용출액을 분말화하여 얻은 제품은 붉은 갈색의 분말이다.

항-조류 인플루엔자 바이러스제는 항-조류 인플루엔자 바이러스 효과를 나타내려는 목적으로 사용되는 제품에 응용될 수 있다. 항-조류 인플루엔자 바이러스제-함유 제품과 같은 예는 약제 (의약품 포함), 청정제, 화장품, 의료장치, 위생물질, 위생제품, 식품, 및 음료를 포함한다. 약제의 예는 약물을 포함한다. 청정제의 예는 세탁 유연제, 세탁 표백제, 비누, 목욕제, 세제, 샴푸, 및 치약을 포함한다. 화장품의 예는 세안용 비누, 핸드용 비누, 핸드 크림, 향수, 로션, 밀크 로션, 미용 에센스, 미용 크림, 립스틱, 립크림 및 얼굴용 파우더를 포함한다. 의료장치의 예는 마스크, 반창고, 붕대, 장갑, 접착 플라스터, 면봉, 진단용 기기 및 장치, 수술용 기기 및 장치, 치료용 기기 및 장치, 병원용 기기 및 장치, 치과용 기기 및 장치, 보조 의료기기 및 교정기를 포함한다. 위생물질의 예는 붕대, 탈지면, 부직포 및 면봉을 포함한다. 위생제품의 예는 가습기. 에어컨, 및 공기 청정기를 포함한다. 식품 및 음료의 예는 건강 음료 및 건강 식품을 포함한다. 약제 및 화장품의 예는 또한 구강 청결제, 편도선 정제(throat lozenges), 편도선 스프레이, 의료용 비누 및 방부제와 같은 의약외품(quasi-drug)도 포함한다.

항-조류 인플루엔자 바이러스제를 포함하는 약물 및 의약외품은 경구 투여, 혈관내 투여 또는 경피 투여와 같은 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 약물 및 의약외품의 제형은 구체적으로 제한되지 않고, 약물 및 의약외품은 예를 들어, 분말, 미분제(dust formulation), 과립제, 정제, 캡슐, 환제, 좌약, 용액, 주사제, 또는 도포제일 수 있다. 약물 및 의약외품은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 부형제, 기본 물질, 유화제, 용매, 및 안정화제와 같은 부형제를 포함할 수 있다.

항-조류 인플루엔자 바이러스제를 포함하는 식품 및 음료는 항-조류 인플루엔자 바이러스제를 임의의 식품 물질 또는 음료 물질에 첨가함으로써 제조된다. 식품 및 음료는 예를 들어, 분말, 정제, 과립제, 액체 (마실 수 있는 제제 등), 캡슐, 시럽, 및 캔디의 형태로 가공되고, 건강 식품 및 건강 보조식품으로서 사용될 수 있다. 식품 및 음료의 구체적 예는 스포츠 음료, 잎, 허브 등으로부터 추출된 차 음료, 우유 및 요구르트와 같은 유제품, 펙틴 및 카라기난와 같은 교화제 (gelatinizing agent)를 함유하는 식품, 하드 캔디, 소프트 캔디 및 쫀득한 단 것(gummy sweets)과 같은 캔디, 츄잉 검, 및 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스 및 덱스트린과 같은 사카라이드, 향미제, 스테비아, 아스파르테임 및 당알코올과 같은 감미료, 식물성 오일 및 지방 및 동물성 오일 및 지방과 같은 오일 및 지방을 포함하는 식품 및 음료를 포함한다. 식품 및 음료는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 기본 물질, 부형제, 첨가제, 부원료 및 증량제(extender)를 함유할 수 있다.

조류 인플루엔자 바이러스는 혈구응집소(hemagglutinin) 및 뉴라미니다아제(neuraminidase)의 종류에 따라 H5N3, H5N1, H5N7, H5N2, 및 H7N3와 같은 아형으로 분리되고, 본 구현예의 항-조류 인플루엔자 바이러스제는 조류 인플루엔자 바이러스의 임의의 종류에 대해서 사용될 수 있다.

본 구현예에 따라, 다음의 장점을 얻을 수 있다.

본 구현예의 항-조류 인플루엔자 바이러스제는 우수한 항-조류 인플루엔자 바이러스 효과를 가진다. 따라서, 항-조류 인플루엔자 바이러스제는 조류 인플루엔자 바이러스에 감염된 가금을 포함한 가축 및 인간의 치료 및 가금을 포함한 가축 및 인간의 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방을 위해 사용될 수 있다. 즉, 항-조류 인플루엔자 바이러스제는 조류 인플루엔자의 예방용 또는 치료용 약제로서 유용하다.

본 구현예의 항-조류 인플루엔자 바이러스제는 천연 식물인 구아바로부터의 추출물이므로, 본 구현예의 항-조류 인플루엔자 바이러스제는 높은 수준의 안정성을 갖는다.

상기 기술된 구현에는 하기 기술된 바와 같이 변경될 수 있다.

항-조류 인플루엔자 바이러스제는 ODS 칼럼으로부터 첫 번째 기간 (구아바 추출물을 칼럼에 적용한 후, 20분까지) 내에 또는 두 번째 기간(이 후 20 내지 35분의 기간) 내에 용출된 용출물을 폴리비닐폴리피롤리돈 (PVPP)으로 처리하여 얻은 제품일 수 있다. 이 경우, 폴리비닐폴리피롤리돈에 흡수된 성분은 제거될 수 있다.

이하, 본 발명은 실시예를 참조로 하여 보다 구체적으로 설명될 것이다.

<항-조류 인플루엔자 바이러스제의 제조>

1 kg의 원료 구아바 잎을 약 1cm²의 크기의 조각으로 자르고, 10 L의 에탄올 및 물을 3:7의 비율로 포함하는 에탄올 수용액에 상온에서 10일 동안 담근다. 그 후, 상기 용액을 여과하여 얻은 여과액을 농축 및 건조하여 65.1 g의 분말의 구아바 추출물를 얻었다. 구아바 추출물에서 6.5 g을 50 mL의 메탄올 및 물을 2:1의 비율로 포함하는 메탄올 수용액에 용해시킨다. 결과의 용액을 3000 rpm에서 15분 동안 원심분리시킨다. 그 후, 상청액을 Advantec MFS Inc.에 의해 제조되는 0.80 ㎛의 기공 크기를 갖는 셀룰로스 아세테이트 필터(DISMIC-25CS080AN)를 통해 여과시키고, 여과액을 분리용 샘플로 수집하였다. 그 후, 분리용 샘플을 다음의 조건하에서 고성능 액체크로마토그래피에 의한 분류를 수행하였다:

(고성능 액체크로마토그래피에 의한 분류의 조건)

칼럼: YMC Co., Ltd.에 의해 제조되는 SH-343-5 (칼럼의 내부 반경 및 길이는 각각 20 mm 및 250 mm이였고, 5 ㎛의 실리카겔 입자 크기, 및 12 nm의 슬릿 반경)

이동상: 분리용 샘플을 칼럼에 적용한 후 15 분 (0 내지 15 분)까지의 기간 동안 20%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물, 15 내지 30 분의 후속 기간 동안 40%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물, 30 내지 45분의 후속 기간 동안 60%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물, 및 45 내지 50 분의 후속 기간 동안 100%의 메탄올(도 1(a) 참조)

이동상의 유동 속도: 10 mL/분

칼럼 온도: 상온 (25℃)

검출 파장: 255 nm

이때 얻어진 HPLC 차트는 도 1(b)에서 보여준다. 6개의 분획은 분리용 샘플을 칼럼에 적용한 후 상이한 시간, 즉, 상이한 용출 시간에 얻어졌다. 보다 구체적으로, 분리용 샘플을 칼럼에 적용한 후, 20 분 (0 내지 20 분)까지의 기간에, 20 내지 35 분의 후속 기간에, 35 내지 39 분의 후속 기간에, 39 내지 41 분의 후속 기간에, 41 내지 43 분의 후속 기간에, 43 내지 50 분의 후속 기간에 칼럼으로부터 용출되는 용출액을 각각 수집하였고, 6개의 얻어진 분획은 농축 및 건조되어 표 1에서 보여주는 바와 같이 A 내지 F의 6개의 분말을 수득하였다.

분말	용출시간 (분)	수율 (mg)
A	0 - 20	2796
B	20 - 35	780
C	35 - 39	11
D	39 - 41	135
E	41 - 43	157
F	43 - 50	33

분말 A 내지 F는 0.5% w/v의 농도에서 에탄올 수용액 (10 내지 90%) 내에 용해되어 샘플 A 내지 F를 제조하였다. 마찬가지로, 상기 수득한 분말의 구아바 추출물을 0.5% w/v의 농도에서 에탄올 수용액 (10 내지 90%) 내에 용해하여 샘플 Mx를 제조하였다. 샘플 A 내지 F 및 샘플 Mx는 다음의 조건하에서 고성능 액체크로마토그래피에 의해 분석을 수행하였다:

(고성능 액체크로마토그래피에 의한 분석 조건)

칼럼: Imtakt사에 의해 제조되는 Cadenza CD-C18 (CD006: 내부 반경 4.6 mm, 길이 250 mm, 및 입자 크기 3 ㎛)

이동상: 샘플을 칼럼에 적용한 후, 10 분 (0 내지 10 분)까지 10%의 메탄올 농도 및 5%의 아세트산 농도를 갖는 물-아세트산-메탄올 혼합물, 10 내지 20 분의 후속 기간 동안 10% 내지 35%의 선형적으로 서서히 증가되는 메탄올 농도를 갖는 물-아세트산-메탄올 혼합물, 20 내지 40 분의 후속 기간 동안 35%의 메탄올 농도 및 5%의 아세트산 농도를 갖는 물-아세트산-메탄올 혼합물, 40 내지 50 분의 후속 기간 동안 35% 내지 100%의 선형적으로 서서히 증가되는 메탄올 농도를 갖는 물-아세트산-메탄올 혼합물, 및 50 내지 60 분의 후속 기간 동안 100%의 메탄올(도 2(a) 참조)

이동상의 유동 속도: 0.6 mL/분

칼럼 온도: 40℃

검출 파장: MaxPlot (190 내지 800 nm), 250 nm, 280 nm

상기 분석에서 얻어진 HPLC 차트는 도 2(b) 내지 2(d) 및 도 3(a) 내지 3(d)에서 보여준다. 보다 구체적으로, 도 2(b)는 샘플 Mx의 HPLC 차트, 도 2(c)는 샘플 A의 HPLC 차트, 도 2(d)는 샘플 B의 HPLC 차트, 도 3(a)는 샘플 C의 HPLC 차트, 도 3(b)는 샘플 D의 HPLC 차트, 도 3(c)는 샘플 E의 HPLC 차트, 및 도 3(d)는 샘플 F의 HPLC 차트를 보여준다.

<항-조류 인플루엔자 바이러스 효과 테스트>

상기 기술된 샘플 A 내지 F 및 샘플 Mx의 항-조류 인플루엔자 바이러스 효과는 하기 기재된 과정에 의해 평가되었다.

먼저, MDCK 세포 (개의 신장 상피세포)는 7% FBS를 포함하는 MEM 배지를 이용하여 96-웰 배양 플레이트 상에서 37℃의 CO₂ 인큐베이터에서 2일 동안 배양하여 단층(monolayer)의 MDCK 세포를 형성하였다. 조류 인플루엔자 바이러스 (H5N3: A/Duck/313/4/78 바이러스)의 모액을 무혈청 배지 (SF-MEM)로 희석하여 0.7 HAU의 바이러스 감염용액을 제조하였다. 바이러스 감염용액을 각각의 샘플 A 내지 F 및 샘플 Mx을 무혈청 배지 (SF-MEM)로 25-배, 100-배, 400-배, 1600-배, 6400-배, 및 25600-배(감염 시 농도의 두배)로 희석하여 얻은 동일한 양의 각각의 희석된 용액과 혼합하였다. 상기 혼합물을 4℃에 1시간 동안 방치하여 바이러스 샘플 혼합물을 제조하였다. 100 μL의 각각의 바이러스 샘플 혼합물을 96-웰 배양 플레이트 상에서 단층으로 성장한 MDCK 세포 내에 적용하고, 감염처리를 34℃의 CO₂ 인큐베이터에서 수행하였다. 1시간 후, 바이러스 샘플 혼합물을 제거하고 배양 플레이트 상의 배양된 세포를 무혈청 배지 (SF-MEM)로 세척하였다.

그 후, 각각의 샘플 A 내지 F 및 샘플 Mx을 2.5 μL의 아세틸 트립신을 포함하는 무혈청 배지 (SF-MEM)로 50-배, 200-배, 800-배, 3200-배, 12800-배, 및 51200-배로 희석하였다. 100 μL의 각각의 희석된 용액을 상기와 같은 농도의 구아바 추출물-유래된 성분을 포함하는 바이러스 샘플 혼합물을 적용한 MDCK 세포에 첨가하였다. 배양 플레이트를 34℃의 CO₂ 인큐베이터에 위치하였다. 18시간 때, 50μL의 메탄올을 각 세포에 첨가하고 배양 플레이트를 1분 동안 상온에 두어 MDCK 세포를 고정화하였다. 그 후, 세포를 무혈청 배지 (SF-MEM)로 세척하였다. 항-핵단백질 모노클로날 항체(anti-nucleoprotein-monoclonal antibody, 4E6)를 각각의 세포에 첨가하고, 배양 플레이트를 상온에서 45분 동안 두었다. 각각의 세포를 그 후 무혈청 배지 (SF-MEM)로 세척하였다. 그 후, 항-마우스 IgG-표지된-β-갈락토시다아제 (0.1% Block Ace)를 각각의 세포에 첨가하고, 배양 플레이트를 상온에 45분 동안 두었다.

그 후, 40 μM 4-메틸움벨리페론 (MU)-Gal (50 μM MgCl₂를 포함하는)를 각각의 세포에 첨가하고, 배양 플레이트를 37℃에서 45분 동안 유지하였다. 이때, 항-마우스 IgG-표지된-β-갈락토시다아제는 기재로서 MU-Gal을 이용하여 형광성의 4-메틸움벨리페론 (MU)를 생성한다. 그 후, 100 mM 탄산나트륨 버퍼 (pH 10.6)를 각각의 세포에 첨가하여 반응을 종료시키고, 세포를 감염한 바이러스의 양을 생성된 MU의 양을 측정하여 간접적으로 측정하였다. 생성된 MU의 양은 형광 검출기를 사용하여 355 nm의 여기 파장(excitation wavelength) 및 460 nm의 형광 파장 (검출 파장)에서 측정하였다. 바이러스 샘플 혼합물 내의 구아바 추출물-유래된 성분의 농도와 상기 측정 결과를 기반으로 얻어진 형광 강도와의 관계를 보여주는 그래프를 도 4(a) 및 4(b)에 나타내었다. 50%의 효과가 관찰되는 농도 (EC₅₀)는 각각의 샘플에 대해 계산되었다. 결과는 표 2에 나타내었다.

샘플	EC₅₀(%w/v)
A	3.28 ×10^-5
B	3.52 ×10^-5
C	26.22 ×10^-5
D	33.52 ×10^-5
E	22.31 ×10^-5
F	29.64 ×10^-5
Mx	5.37 ×10^-5

표 2에서 보여주는 바와 같이, 구아바 추출물을 포함하는 샘플 Mx는 높은 항-인플루엔자 바이러스 효과를 가짐이 확인되었다. 또한, 샘플 A 및 B가 샘플 A 내지 F 중 특히 높은 항-인플루엔자 바이러스 효과를 나타내기 때문에, 분말 A 및 B가 구아바 추출물에 의해 항-인플루엔자 바이러스 효과를 나타내는데 있어서 중요한 역할을 함이 확인되었다.

<폴리비닐폴리피롤리돈의 처리 테스트>

샘플 A 및 B를 폴리비닐폴리피롤리돈 (PVPP)으로 처리한 후, 항-인플루엔자 바이러스 효과의 변화를 실험하였다. PVPP는 타닌과 같은 공중합된 폴리페놀을 흡수하는 작용을 하고, 대부분의 샘플 A 및 B에 함유된 폴리페놀은 PVPP 처리에 의해 제거된다.

먼저, 5.0 g/L의 PVPP를 1 mL의 각각의 샘플 A 및 B에 첨가하고, 혼합물을 교반하였다. 상기 혼합물을 10000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 Advantec MFS Inc.에 의해 제조되는 0.80 ㎛의 기공 크기를 갖는 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과하여 여과액을 수집하였다. 상기에서 기술한 바와 같이 수득한 PVPP-처리된 샘플 A 및 B 및 PVP-비처리된 샘플 A 및 B를 다음의 방법에 의해 항-인플루엔자 바이러스 효과에 대해서 비교하였다.

먼저, MDCK 세포 (개의 신장 상피세포)는 7% FBS를 포함하는 MEM 배지를 이용하여 24-웰 배양 플레이트 상에서 37℃의 CO₂ 인큐베이터에서 2일 동안 배양하여 단층(monolayer)의 MDCK 세포를 형성하였다. 조류 인플루엔자 바이러스 (H5N3: A/Duck/313/4/78 바이러스)의 모액을 무혈청 배지 (SF-MEM)로 희석하여 0.7 HAU의 바이러스 감염용액을 제조하였다. PVPP-처리된 샘플 A 및 B 및 PVP-비처리된 샘플 A 및 B를 무혈청 배지 (SF-MEM)로 200-배로 희석하고, 각각의 얻어진 희석 샘플을 무혈청 배지 (SF-MEM)로 추가로 25-배, 100-배, 400-배, 1600-배, 6400-배, 및 25600-배 (감염 시의 농도의 2배)로 희석하여, 같은 양의 바이러스 감염용액과 혼합하였다. 결과의 혼합물을 얼음 상에 1시간 동안 두었다. 그 후, 200 μL의 각각의 바이러스 샘플 혼합물을 24-웰 배양 플레이트 상에서 단층으로 성장한 MDCK 세포 내에 적용하고, 감염처리를 34℃의 CO₂ 인큐베이터에서 수행하였다.

1시간 때, 바이러스 샘플 혼합물을 제거하고, 배양 플레이트 상의 배양된 세포를 무혈청 배지 (SF-MEM)로 세척하였다. 그 후, 0.75% 아가로스-함유 MEM 배지를 상기 세포 상에 중첩시키고, 세포를 34℃의 CO₂ 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 그 후, 5:1 비율의 에탄올 및 아세트산을 함유하는 에탄올-아세트산 용액을 각각의 세포에 첨가하고, 배양 플레이트를 밤새도록 둔 후, 감염을 종료시키고 MDCK 세포를 고정화하였다. 그 후, 중첩된 배지를 제거하고, 세포를 순수 및 0.1% 트리톤 PBS 용액으로 세척한 후, 1차 항체 및 2차 항체와 반응시켰다. 그 후, 세포를 염색용액 (DEPDA, 4CN 시트레이트 버퍼, H₂O₂)으로 처리하고, 파란색으로 염색된 플라크의 수를 세어 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 억제 속도를 평가하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

샘플	바이러스 감염 억제속도 (%)
PVPP-비처리된 샘플 A	92.1
PVPP-처리된 샘플 A	95.1
PVPP-비처리된 샘플 B	99.7
PVPP-처리된 샘플 B	100

표 3에서 보여주는 바와 같이, 샘플 A 및 B의 바이러스 감염 억제속도는 PVPP의 처리로 인해 감소되지 않았다. 이러한 결과는 항-조류 인플루엔자 바이러스 효과를 나타내는 샘플 A 및 B에 함유된 성분이 타닌과 같은 공중합된 폴리페놀이 아닐 수 있음을 제안한다. 따라서, PVPP의 처리는 항-조류 인플루엔자 바이러스 효과를 나타내는 성분이 아닌 성분을 제거하기에 효과적이므로, 항-조류 인플루엔자 바이러스 효과를 나타내는 성분의 양을 증가시킨다.

Claims

활성 성분으로서, 추출 용매 내의 물 또는 친수성 유기 용매의 함량이 50 부피% 또는 그 이상이거나, 물 및 친수성 유기 용매의 총 함량이 50 부피% 또는 그 이상인 추출 용매로 구아바로부터 추출된 구아바 추출물이 특정 조건하에서 고성능 액체크로마토그래피에 의해 분류화될 때 얻어지는 성분으로서,
폴리비닐폴리피롤리돈(polyvinyl polypyrrolidone)에 흡수되지 않는 성분을 함유하는 항-조류 인플루엔자 바이러스제, 여기서 상기 특정 조건은 20 mm의 내부 반경 및 250 mm의 길이의 ODS 칼럼의 사용, 구아바 추출물을 상기 ODS 칼럼에 적용한 후 15분이 되는 동안 이동상으로서 20부피%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 15 내지 30분의 후속 기간 동안 이동상으로서 40부피%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 및 10 mL/분의 속도로 통과되는 이동상을 포함하고, 여기서, 상기 항-조류 인플루엔자 바이러스제에 포함된 성분은 구아바 추출물을 상기 ODS 칼럼에 적용한 후 20분 내에 ODS 칼럼으로부터 용출된다.
제 1 항에 있어서, 구아바 추출물을 칼럼에 적용한 후 20분 내에 ODS 칼럼으로부터 용출되는 상기 항-조류 인플루엔자 바이러스제에 함유된 상기 성분을 폴리비닐폴리피롤리돈으로 처리하는 항-조류 인플루엔자 바이러스제.
활성 성분으로서, 추출 용매 내의 물 또는 친수성 유기 용매의 함량이 50 부피% 또는 그 이상이거나, 물 및 친수성 유기 용매의 총 함량이 50 부피% 또는 그 이상인 추출 용매로 구아바로부터 추출된 구아바 추출물이 특정 조건하에서 고성능 액체크로마토그래피에 의해 분류화될 때 얻어지는 성분으로서, 폴리비닐폴리피롤리돈(polyvinyl polypyrrolidone)에 흡수되지 않는 성분을 함유하는 항-조류 인플루엔자 바이러스제, 여기서 상기 특정 조건은 20 mm의 내부 반경 및 250 mm의 길이의 ODS 칼럼의 사용, 구아바 추출물을 상기 ODS 칼럼에 적용한 후 15분이 되는 동안 이동상으로서 20부피%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 15 내지 30분의 후속 기간 동안 이동상으로서 40부피%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 30 내지 45분의 후속 기간 동안 이동상으로서 60부피%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 및 10 mL/분의 속도로 통과되는 이동상을 포함하고, 여기서, 상기 항-조류 인플루엔자 바이러스제에 함유된 상기 성분은 구아바 추출물을 칼럼에 적용한 후 20 내지 35분의 기간에 ODS 칼럼으로부터 용출된다.
제 3 항에 있어서,
구아바 추출물을 칼럼에 적용한 후 20 내지 35분 내에 ODS 칼럼으로부터 용출되는 상기 항-조류 인플루엔자 바이러스제에 함유된 상기 성분을 폴리비닐폴리피롤리돈으로 처리하는 항-조류 인플루엔자 바이러스제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항-조류 인플루엔자 바이러스제는 조류 인플루엔자의 예방 및 치료용 약제로 사용되는 항-조류 인플루엔자 바이러스제.
제 5 항에 있어서,
상기 조류 인플루엔자는 H5N3 또는 H5N1 스트레인인 항-조류 인플루엔자 바이러스제.
추출 용매 내의 물 또는 친수성 유기 용매의 함량이 50 부피% 또는 그 이상이거나, 물 및 친수성 유기 용매의 총 함량이 50 부피% 또는 그 이상인 추출 용매로 구아바로부터 추출하여 구아바 추출물을 얻는 단계;
상기 구아바 추출물을 특정 조건하에서 고성능 액체크로마토그래피에 의해 분류화하여 성분을 얻는 단계,
여기서 상기 특정 조건은 20 mm의 내부 반경 및 250 mm의 길이의 ODS 칼럼의 사용, 구아바 추출물을 상기 ODS 칼럼에 적용한 후 15분이 되는 동안 이동상으로서 20부피%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 15 내지 30분의 후속 기간 동안 이동상으로서 40부피%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 및 10 mL/분의 속도로 통과되는 이동상을 포함하고, 여기서, 항-조류 인플루엔자 바이러스제에 포함되는 성분은 구아바 추출물을 상기 ODS 칼럼에 적용한 후 20분 내에 ODS 칼럼으로부터 용출되고, 또는
여기서 상기 특정 조건은 20 mm의 내부 반경 및 250 mm의 길이의 ODS 칼럼의 사용, 구아바 추출물을 상기 ODS 칼럼에 적용한 후 15분이 되는 동안 이동상으로서 20부피%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 15 내지 30분의 후속 기간 동안 이동상으로서 40부피%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 30 내지 45분의 후속 기간 동안 이동상으로서 60부피%의 메탄올 농도를 갖는 물-메탄올 혼합물의 사용, 및 10 mL/분의 속도로 통과되는 이동상을 포함하고, 여기서, 항-조류 인플루엔자 바이러스제에 포함되는 상기 성분은 구아바 추출물을 칼럼에 적용한 후 20 내지 35분의 기간에 ODS 칼럼으로부터 용출되고;
상기 용출된 성분을 폴리비닐폴리피롤리돈(polyvinyl polypyrrolidone)으로 처리하여 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 항-조류 인플루엔자 바이러스제의 유효성분을 얻는 단계; 및
상기 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 항-조류 인플루엔자 바이러스제를 유효성분으로 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는
조류 인플루엔자의 예방 및 치료용 약제를 제조하는 방법.
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