TWI581808B - 蝴蝶蘭活性萃取物、其製備方法及其應用 - Google Patents

Description

蝴蝶蘭活性萃取物、其製備方法及其應用

本發明提供一種蘭花萃取物及其萃取方法，而該蘭花萃取物具有美白功能、抗氧化以及抗皺(抗老化)的功效。

請提供參考資料

正常皮膚的顏色取決於：1、皮膚中各種色素的含量與分佈狀況；2、皮膚血液中血紅蛋白氧化還原的比例；3、皮膚的厚度以及光線在皮膚表面的散射。由於外界環境的影響(紫外線、污染的空氣)，不正確的生活方式(不正確的美容、劣質的化妝品、電子顯示幕的輻射)，人體皮膚的衰老(免疫能力下降、微循環消失、代謝能力降低)都會引起皮膚產生色素沉積、色素分佈不均、皮膚失去光澤產生暗啞。黑色素細胞(Melanocytes)位於皮膚基底層細胞內，為單細胞的分泌器官，其細胞呈圓形，黑色素細胞由長而分支的管狀突起，這些突起在表皮細胞中穿梭。黑色素於表皮的深層內形成，並向皮膚的表面移行，但黑色素細胞本體並不會跟著移行，而是由角質細胞負責轉移黑色素的工作，角質細胞將這些黑色素轉至皮膚的表面，以形成天然的保護屏障。

曬太陽或者暴露在紫外光下會促進黑色素細胞內酪胺酸酶活性，而增加黑色素產生，皮膚經由黑色素的合成路徑(Raper-Mason pathway，第2圖)，產生自發性化學反應與酵素催化作用而形成黑色素。黑色素為一種高分子的複合體，當皮膚被紫外線照射時，黑色素細胞內的酪胺酸酶(tyrosinase)會被活化，加速催化細胞內酪胺酸(tyrosine)氧化為二羥基苯基丙胺酸(dihydroxyphenylalanine，簡稱DOPA)，而二羥基苯基丙胺酸(DOPA)再由酪胺酸酶催化為多巴醌(dopachrome)，黑色素的生合成路徑牽 涉到藉由酪胺酸酶的酪胺酸催化羥基化為L-3,4-二羥基苯基丙胺酸(L-3,4-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA)及L-DOPA轉變為多巴醌(dopachrome)；而多巴醌是經由氧化反應轉變為黑色素，透過一系列的氧化反應，由多巴醌形成真黑色素(eumelanin)。

酪胺酸酶(tyrosinase)為一種含銅離子的多酚氧化酶，由黑色素細胞合成，其活性會因為來源不同而有所不同，酪胺酸酶與酪胺酸(tyrosine)的活性鍵結位置有三處活性中心銅離子，現今研究有關抑制酪胺酸酶活性的機轉上，主要有兩種方式：(1)酪胺酸酶之去活化：此反應機轉主要是因為酵素分子結構上帶有銅離子，抑制物藉以利用類似銅螯合劑(copper-chelating agent)的方式來螯合銅離子或與銅離子相互競爭，藉以減少銅離子之結合力，進而降低酪胺酸酶之活性，以阻斷黑色素生成機制，此抑制類型最具代表的成分為麴酸(kojic acid)。(2)競爭性取代酪胺酸酶受質：此反應機轉為抑制物與酪胺酸或多巴等受質相互競爭和酪胺酸酶進行反應，導致與酪胺酸酶作用的受質減少，而減少黑色素形成，此競爭性取代受質類型最具代表的成分包括對苯二酚(hydroquinone)、熊果素(arbutin)等。

美白是最受亞洲女性重視的化粧保養品功能之一。傳統上，評估化粧品原料是否具有美白的潛力，主要有下列幾種模式：

(1)酪胺酸酶是否受到抑制：由於酪胺酸酶是黑色素形成的重要酵素，因此若此酵素受到抑制，則黑色素的形成可能減少(第2圖)。

(2)老鼠的黑色素瘤細胞系統(B16 cell line)：由於原料(或成分)要能有效抑制酪胺酸酶，則該成分作用機制的前提上需能進入細胞方能達此效果。因此亦有學者以老鼠的黑色素瘤細胞系統(B16 cell line)做為模式，探討成分是否具有抑制黑色素細胞生長或者抑制黑色素形成之美白潛力。但B16細胞系為黑色素細胞之腫瘤細胞系，其黑色素產生的量以及成分對B16細胞所能達到的抑制效果，往往與健康人的皮膚系統不同。

(3)初代培養(primary culture)的人類黑色素細胞(human melanocyte)：由於是人類的黑色素細胞的初代培養，因此最接近人體真實的皮膚細胞系統。通常會以無害的成分最大劑量(例如可維持95%細胞存活 的成分濃度)進行對黑色素細胞產生黑色素是否可以達成抑制效果做為美白篩選的測試。

多數情況下以上三種模式均能看到有明顯美白效果的成分並不多；如有此種效果，則顯示該成分確實具有較佳之美白潛力。

各國主管機關在審核新的化粧品功能原料是否准用時，對原料的安全評估結果亦極為重視。化粧品新原料需要做的安全性評估傳統上是以動物實驗的方式來進行，其中最重要且基本的為皮膚刺激性、皮膚腐蝕性以及皮膚致敏性測試等。但歐盟於2013年7月開始實施禁用動物試驗(animal ban)，規定以動物測試之產品禁止販售(Marketing ban)，所以國際間在替代動物實驗(Alternative testing)已經開始投入大量的金錢和時間，致力開發替代動物實驗之方法，亦即以所謂的3D人類仿生皮膚組織及OECD所認可的實驗方法來進行化粧品原料的安全評估測試。本研究率先引進德國的3D human skin tissue進行化粧品原料的皮膚刺激性(OECD 439)以及皮膚腐蝕性測試(OECD 431)。另亦以人體臨床測試加做皮膚致敏性的測試，並驗證3D skin的皮膚刺激性和皮膚腐蝕性測試結果。

由於需兼顧功能成分之安全性和有效性，因此目前衛生署以正面表列之方式公告可使用的美白成分及其濃度，這些成分包括麴酸(kojic acid)、熊果素(arbutin)、鞣花酸(ellagic acid)及洋甘菊抽取物(chamomile ET)等，詳見下第1表。由第1表來看，可使用之美白成分並不算多，且酸類物質多半含有局部使用之刺激感。近年由於日本佳麗寶公司使用杜鵑花醇造成消費者白斑症的問題，因此尋找安全又有效、且具有實質上的應用性的美白化粧品原料、甚至同時具有美白以外其他功能特性的化粧品新原料，就成了許多業者研究的目標。

本案發明人經多年研究，發現特定蘭花(蝴蝶蘭屬)經過特殊之萃取製程，其萃取物同時具有抑制酪胺酸酶的活性、抗氧化力以及抗皺(抗老化)能力。此萃取物至少涵蓋三種結構類似之黃酮類，在酪胺酸酶、老鼠B16黑色素細胞、以及人類初代培養之黑色素細胞、以及人體實驗都看到美白之效果，同時經生化與分子生物學之分析，亦發現其具有抗氧化和抗皺(抗老化)的效果。此特定蘭花可以基源鑑定的方式分辨其與其他蘭花之差異。

萃取製程全程可以低溫、水相的綠色製程，得到同時具有數個功能特性之活性萃取物，其為具有特定之黃酮類結構之結晶或含有此黃酮類之活性萃取液。該活性萃取物具酪胺酸酶抑制能力，並同時具備抑制黑色素細胞產生黑色素的能力、以及抗氧化和抗皺(抗老化)的效果，在體外細胞實驗及人體實驗均證實其安全性，具有實際的商品應用性。

本發明之目的即在於提供一種蘭花萃取物，其中該蘭花為蝴 蝶蘭屬，其係由下列步驟所製備而得：(1)萃取：將該蘭花與一溶劑以重量比例為0.5：1~10：1，進行混合粉碎或者破壁得到一蘭花漿；其中該溶劑包含至少一者為水或醇類(醇類，例如：乙醇、丙醇、丁醇)或其混合物；(2)固液分離：將步驟(1)之該蘭花漿進行固液分離，將雜質去除，留下液態為一蘭花濾液；(3)活性劃分：將步驟(2)之該濾液以『分子篩』薄膜製程純化，得到一蘭花萃取篩分液；(4)濃縮：將步驟(3)之該篩分液以『分子篩』薄膜製程濃縮，或者其他真空或蒸煮方式進行部分濃縮，得到活性沉澱物與具活性之液態活性萃取液。

為達成前述發明目的，其中該蝴蝶蘭係選自蝴蝶蘭屬Sogo Yukidian種「旭東威士忌」(Phalaenopsis Sogo Yukidian ’Shiuh-Dong Whishkey’)，該蘭花為行政院農業委員會植物品種權證書品種權字第A00595號，源自於青山蘭花生物科技有限公司。

為達成前述發明目的，其中該步驟(1)中該蘭花與該溶劑較佳為以重量比例5：1的方式進行打漿。

為達成前述發明目的，其中該步驟(2)中固液分離溫度0~60℃。

為達成前述發明目的，其中該該步驟(2)中固液分離0~35℃。

為達成前述發明目的，其中該步驟(2)固液分離時可使用離心法或過濾法，過濾材料為矽藻土、珍珠岩、濾紙、濾布及濾心(0.1~5μm)至少一者。

為達成前述發明目的，其中該步驟(3)之活性劃分，及步驟(4)之濃縮之薄膜製程採兩段步驟：第一段採用無機陶瓷膜或有機複合膜；第二段採用納米濾膜或逆滲透膜。其中該無機陶瓷膜包含氧化鋁膜、氧化鋯膜或氧化鍗。其中該有機複合膜包含聚碸膜、醋酸纖維膜、聚四氟乙烯膜、聚丙烯膜。其中該納米濾膜或逆滲透膜可為單一薄膜或複合薄膜，其中該薄膜材質包含複合膜(TFM,thin film membrane)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚碸(PS)、聚醚碸(PES)及聚丙烯腈(PAN)至少一種，其中該薄膜分離之壓力為150-400psi，最佳壓力為200-300psi。

為達成前述發明目的，其中該步驟(4)之活性沉澱物結構鑑定係以核磁共振(NMR)及質譜儀(MS)進行化學結構之分析鑑定。

本發明之另一目的係在於提供一種醫藥組合物，包含一有效量之如前項所述之蘭花萃取濃縮液、沉澱物(化合物)或其組合及其藥學上可接受之賦形劑。

本發明之另一目的係在於提供一種蘭花萃取物用於製備具美白功能的藥物的用途，其中該蘭花萃取物為前項所述之蘭花活性萃取濃縮液、沉澱物或其組合；其中該蘭花萃取物係用於製備抑制酪胺酸酶的美白藥物或活性成分；其中該蘭花萃取物係用於製備抑制黑色素形成的美白藥物或活性成分。

本發明之另一目的係在於提供一種蘭花萃取物用於製備治療自由基引起疾病的藥物的用途，其中該蘭花萃取物為前項所述之蘭花萃取濃縮液、沉澱物或其組合；其中該蘭花萃取物係用於製備快速清除自由基的藥物或活性成分。

本發明之另一目的係在於提供一種蘭花萃取物用於製備抗皺(抗老化)藥物的用途，其中該蘭花萃取物為前述之蘭花萃取濃縮液、沉澱物或其組合；其中該蘭花萃取物係用於製備治療膠原蛋白缺乏所引起疾病的藥物或活性成分；其中該蘭花萃取物係用於製備抑制基質金屬蛋白酶的抗皺(抗老化)藥物或活性成分；其中該蘭花萃取物係用於製備抑制膠原蛋白酶的抗皺(抗老化)藥物或活性成分；其中該蘭花萃取物係用於製備抑制彈性蛋白酶的抗皺(抗老化)藥物或活性成分。

本發明之另一目的係在於提供一種蘭花活性萃取物，其中該蘭花為蝴蝶蘭屬，其係由下列步驟所製備而得：(1)萃取：將該蘭花與一溶劑以重量比例為0.5：1~10：1，進行混合粉碎或者破壁得到一蘭花漿；其中該溶劑包含至少一者為水或醇類(醇類，例如：乙醇、丙醇、丁醇)或其混合物；(2)固液分離：將步驟(1)之該蘭花漿進行固液分離，將雜質去除，留下液態為一蘭花濾液。

本發明之另一目的係在於提供一種蘭花活性萃取物，其中該蘭花為蝴蝶蘭屬，其係由下列步驟所製備而得：(1)萃取：將該蘭花與一溶 劑以重量比例為0.5：1~10：1，進行混合粉碎或者破壁得到一蘭花漿；其中該溶劑包含至少一者為水或醇類(醇類，例如：乙醇、丙醇、丁醇)或其混合物；(2)固液分離：將步驟(1)之該蘭花漿進行固液分離，將雜質去除，留下液態為一蘭花濾液；(3)活性劃分：將步驟(2)之該濾液以『分子篩』薄膜製程純化，得到一蘭花萃取篩分液；(4)濃縮：將步驟(3)之該篩分液以『分子篩』薄膜製程濃縮，或者其他真空或蒸煮方式進行部分濃縮，得到活性沉澱物與具活性之液態活性萃取液。

本發明之另一目的係在於提供一種製備蘭花活性萃取物的方法，其中該蘭花為蝴蝶蘭屬，包含下列步驟：(1)萃取：將該蘭花與一溶劑以重量比例為0.5：1~10：1，進行混合粉碎或者破壁得到一蘭花漿；其中該溶劑包含至少一者為水或醇類(醇類，例如：乙醇、丙醇、丁醇)或其混合物；(2)固液分離：將步驟(1)之該蘭花漿進行固液分離，將雜質去除，留下液態為一蘭花濾液；(3)活性劃分：將步驟(2)之該濾液以『分子篩』薄膜製程純化，得到一蘭花萃取篩分液；(4)濃縮：將步驟(3)之該篩分液以『分子篩』薄膜製程濃縮，或者其他真空或蒸煮方式進行部分濃縮，得到活性沉澱物與具活性之液態活性萃取液。

110‧‧‧取一蘭花花朵

120‧‧‧將蘭花與一溶劑進行混合粉碎或者破壁

130‧‧‧進行固液分離

140‧‧‧進行活性劃分

150‧‧‧進行濃縮

160‧‧‧得到活性沉澱物與液態活性萃取液

第1圖為蘭花萃取步驟流程。

第2圖藉由酪胺酸酶(tyrosinase)合成黑色素的路徑(Raper-Mason pathway)。

第3圖為蘭花萃取物之沉澱物1H-NMR分析圖譜(Varian 500)(A)；以及13C-NMR分析圖譜(Varian 500)(B)。

第4圖為蘭花沉澱物之質譜儀(mass spectrometry,MS)分析結果(A)；以及標準品(Apigenin-6-ribosido-7-glucoside)之質譜儀(mass spectrometry,MS)分析結果(B)。

第5圖為蘭花沉澱物之質譜儀(mass spectrometry,MS)分析結果(A)；以及標準品(Saponarin)之質譜儀(mass spectrometry,MS)分析結果(B、 C)。

第6圖為蘭花沉澱物之質譜儀(mass spectrometry,MS)分析結果(A)；以及標準品(Apigenin 7-glucoside)之質譜儀(mass spectrometry,MS)分析結果(B)。

第7圖為蘭花萃取濃縮液進行體外皮膚腐蝕性試驗結果(A)；以及蘭花萃取濃縮液進行體外皮膚刺激性試驗結果(B)。

第8圖為蘭花萃取濃縮液經不同濃度之乙醇與水萃取後，總多酚的含量(gallic acid equivalent，GAE)。

第9圖為蘭花萃取濃縮液經不同濃度之乙醇與水萃取後，DPPH自由基清除率(A)；蘭花萃取濃縮液與BHT之自由基清除率(B)；蘭花、蘭葉萃取濃縮液與ABTS之自由基清除能力(C)。

第10圖為蘭花萃取濃縮液經不同濃度之乙醇與水萃取後，進行酪胺酸酶抑制率評估(A)；為不同種蘭花不同步驟之蘭花萃取濃縮液(物)，以水萃取測試酪胺酸酶抑制率(B)；為蘭花、蘭葉萃取濃縮液測試酪胺酸酶抑制能力(C)。

第11圖為蘭花萃取濃縮液或沉澱物經不同濃度之乙醇與水萃取後，其黑色素細胞抑制黑色素實驗結果。

第12圖A至H為不同的旭東威士忌蘭花萃取液對HMC-4細胞進行細胞存活率實驗的結果。

第13圖不同的旭東威士忌蘭花萃取液抑制黑色素表現之試驗結果，其中M254為M254培養基，M2為M2培養基，KA為麴酸(Kojic acid)。

第14圖為蘭花萃取濃縮液測試抗皺(抗老化)能力。

本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。

如本文中所使用，術語“萃取物”係指藉由萃取作用所製備之產物。該萃取物可以溶於溶劑中之溶液形式呈現，或萃取物可為不含或大體上不含溶劑之濃縮物或精華呈現。如下文進一步所述，萃取物亦可調 配於醫藥組合物或食品中。術語萃取物可為自特定萃取步驟或一系列萃取步驟獲得之單一萃取物，或萃取物亦可為自獨立萃取步驟獲得之萃取物的組合。因此，該等經合併之萃取物亦涵蓋於術語“萃取物”。

如本文所用“原料”通常係指植物原材料，包含單獨的整個植物或植物之一個或多個組成部分之組合，包含葉、根(包括但不限於主根、尾根、及纖維根)、莖、皮、漿果、種子、及花，其中該植物或組成部分可包含原始、經乾燥、經蒸煮、經加熱或以其他方式經物理加工以利於加工之材料，其可進一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式經加工以影響該植物材料之大小及實體完整性之材料。術語「原料」可用於表示用於額外萃取製程之材料來源之萃取產物。

另外，於本發明可為一皮膚外用劑組合物，組成除上述蘭花萃取物以外，基劑可依需要適宜添加用於一般化粧品及醫藥品等皮膚外用劑所用的成分，例如保濕劑、抗氧化劑、油性成分、紫外線吸收劑、界面活性劑、增黏劑、醇類、粉末成分、色劑、水性成分、水、各種皮膚營養劑等。亦可適宜地添加其他依地酸二鈉、依地酸三鈉、檸檬酸鈉、聚磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡萄糖酸等的金屬阻斷劑；咖啡因、丹寧酸、維拉帊米(verapamil)、胺甲環酸及其衍生物、甘草萃取物、甘草素、火棘果實之熱水萃取物、各種生藥、乙酸生育酚酯、甘草酸及其衍生物或其鹽等的藥劑；維生素C、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡糖苷、熊果苷、麴酸等的其他美白劑；葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等的糖類等。

本發明的皮膚外用劑組合物係例如軟膏、乳霜、乳液、藥水、面膜(pack)、浴用劑、霜劑等皮膚外用劑型，只要是用於習知皮膚外用劑組合物者均可而不特別規定其劑型。

術語「治療」、「治療中」及其類術語係指延緩、改善、減少或逆轉目前正折磨著患者之該病症或該病症相關之任何症狀的方法以及預防該病症或其任何正出現之症狀的方法。

術語「藥學上可接受」意謂物質或組合物必須與調配物之其他成份相容，且對患者無害。

術語「藥學上可接受之賦形劑」，如本文中所用者，意指諳 於此技者所知可與蘭花萃取物的物理和化學特性相容之任何生理學惰性，藥理學上不活性之物質。藥學上可接受之賦形劑包括，但不限於，聚合物、樹脂、增塑劑、填料、潤滑劑、稀釋劑、黏合劑、崩解劑、溶劑、共一溶劑、界面活性劑、防腐劑、甜味劑、調味劑、藥學級的染料或顏料、及黏度劑。

術語「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」為一種固體或液體組成物，其形式、濃度和純度程度適合投予給病患(如人類或動物病患)，在施予之後，其可誘發所欲生理變化。醫藥組成物為無菌及非發熱性者(non-pyrogenic)。

如本文所用術語「有效量」係指產生期望生物反應所必需之量。如彼等業內普通技術者可理解，複合物或生物活性劑之有效量可視諸如下列等因素而變化：期望生物終點、擬遞送生物活性劑、囊封基質之組成、目標組織等等。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。本發明所用之蘭花、原料、生物材料皆市售易於取得，下列僅為示例可取得之管道。

實施例一蘭花萃取液萃取方法

蘭花的萃取方法，步驟如第1圖所示，取蘭花為蝴蝶蘭屬Sogo Yukidian種「旭東威士忌」(Phalaenopsis Sogo Yukidian’Shiuh-Dong Whishkey’，以下簡稱旭東威士忌)，該蘭花為行政院農業委員會植物品種權證書品種權字第A00595號，以下列步驟所製備而得：

(1)萃取：將該蘭花與一溶劑以重量比例為0.5：1~10：1，較佳為5：1；時間為3~60分鐘，較佳為10分鐘；溫度為0~60℃，較佳為0~35℃；可利用超音波、研磨等萃取方式進行提取，較佳為超音波，進行混合粉碎或者破壁得到一蘭花漿；該溶劑為水、醇類或醇類水溶液，其中該醇類為乙醇、丙醇、或丁醇。

(2)固液分離：將步驟(1)所萃取之蘭花漿進行脫漿，脫漿時間為20~60分鐘，較佳為30~40分鐘；溫度0~60℃，較佳為0~35℃；以離心、壓榨等方式脫漿，較佳為離心1000~3000rpm；最佳為離心1500~2000 rpm。留下液態為一蘭花粗萃取液，拋棄花渣；

(3)粗濾：將步驟(2)之該蘭花粗萃取液進行粗過濾，粗過濾時可使用矽藻土、珍珠岩、濾紙、濾布或濾心，較佳為使用矽藻土、珍珠岩及濾心(0.1~5μm)搭配使用，得到一粗濾液；

(4)活性劃分：將步驟(3)之該粗濾液以『分子篩』薄膜製程純化，薄膜分兩段分離；第一段：薄膜採孔徑0.04~1μm的無機陶瓷膜(氧化鋁膜、氧化鋯膜、氧化鍗等無機陶瓷膜)或有機複合膜(聚碸膜(PS)、醋酸纖維膜、聚四氟乙烯膜、聚丙烯膜等有機複合膜)，較佳薄膜孔徑為0.04μm。分離細小微粒，留下滲透液。第二段：薄膜採納米濾膜(nanofiltration membrane,NF)或逆滲透膜，截留分子量100~1000 MW，最佳截留分子量150 MW。其中該薄膜可為有機之單一或複合膜，材質為包含有複合膜(TFM,thin film membrane)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚碸(PS)、聚醚碸(PES)、聚丙烯腈(PAN)等；其中該薄膜分離之壓力為150-400psi，最佳壓力為200-300psi。分離多餘的水分及有機物，得到活性沉澱物與具活性之液態活性萃取液，即為一蘭花萃取濃縮液；

(5)過濾：將步驟(4)之該蘭花萃取濃縮液過濾後，得到活性沉澱物。沉澱物經水洗、乾燥得一白色-黃色結晶物，再以DMSO為溶劑，經1H-NMR(第3圖A)以脈衝序列(Pulse Sequence)為s2pul、25℃、relax.Delay 1.0秒、脈衝(pulse)45℃、Acq.時間3.000秒、寬(Width)8000.0Hz、52 repetitions、Observe H1,499.8789802MHz、Line broadening 0.1Hz、FT size 65536、總時間4分16秒；與13C-NMR(第3圖B)，以脈衝序列(Pulse Sequence)為s2pul、25℃、relax.Delay 0.5秒、脈衝(pulse)40℃、Acq.時間1.042秒、寬(Width)31446.5Hz、896 repetitions、Observe C13,125.6946696MHz、Decouple H1,499.8814989MHz、Power 36dB、Line broadening 1.0Hz、FT size 131072、總時間50分50秒。分析後，初步認為是黃酮類化合物。

由質譜儀(mass spectrometry，MS)分析上述蘭花沉澱物中的結構，發現該蘭花沉澱物為一黃酮類(flavone)的組合物；該組合物大部分是接雙醣的flavone，也有少部分為接單醣的flavone。

該組合物中的主要結構至少包括： i. C₂₆H₂₈O₁₄：MW：564，為接雙醣(ribosido和glucoside)的flavone，是組合物中含量高的成分，可推定為Apigenin-6-ribosido-7-glucoside(第4圖(A)蘭花沉澱物和第4圖(B)標準品Apigenin-6-ribosido-7-glucoside)；ii. C₂₇H₃₀O₁₅：MW：594，為接雙醣(2個glucoside)的flavone，是組合物中含量高的成分，可推定為Saponarin(第5圖(A)蘭花沉澱物和(B、C)標準品Saponarin)；iii. C₂₁H₂₀O₁₀：MW：432，為接單醣(1個glucoside)的flavone，是組合物中含量較少的成分，可推定為Apigenin 7-glucoside(第6圖(A)蘭花沉澱物和(B)標準品Apigenin 7-glucoside)。

實施例二蘭花萃取液之皮膚刺激及敏感性測試

A.蘭花萃取液無皮膚刺激性及腐蝕性-細胞測試

參照皮膚腐蝕性標準試驗in vitro Skin Corrosion：Reconstructed Human Epidermis(RHE)Test Method(版本4.3，2012/11)(OECD 431)，及參照皮膚刺激性標準試驗in vitro Skin Irritation：Reconstructed Human Epidermis Test Method(版本3.1，2012/11)(OECD 439)，以購自德國CellSystems^®的epiCS^®的3D上皮細胞組進行試驗。

根據上述OECD431與OECD439的標準方法進行體外皮膚腐蝕性/刺激性測試。體外腐蝕性試驗中，以水作為負向對照組、氫氧化鉀為正向對照組，旭東威士忌之蘭花萃取濃縮液(EW-DK)，即為步驟(4)濃縮後以孔徑0.04μm的PS膜，並以截留分子量為150 MW的TFM膜，得到蘭花萃取濃縮液，經OECD 431體外腐蝕試驗判定為無皮膚腐蝕性(第7圖A)。體外刺激性試驗中，以杜氏磷酸缓沖液(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)作為負向對照組、5% SDS溶液作為正向對照組。旭東威士忌之蘭花萃取濃縮液經epiCS^®之體外刺激性試驗判定為無皮膚刺激性(第7圖B)。

B.蘭花萃取液無眼睛刺激性之試驗-細胞測試

本實施例利用濃度為5.7%及6.7%的旭東威士忌蘭花萃取濃縮液，以子宮頸癌細胞(HeLa細胞)來進行眼睛刺激性之試驗；該旭東威士忌蘭花萃取濃縮液係利用實施例一中步驟(4)之薄膜分離步驟，以孔徑0.04μm的PS膜， 並再以截留分子量為150MW的TFM膜來獲得，最後再以紅外線水分計測試固含量濃度分別為6.7wt%與5.7wt%的萃取濃縮液，直接進行試驗。

其中眼睛刺激性測試的方法如下：解凍保存於液體氮中的人的子宮頸癌細胞，並於含有5% FBS的MEM培養基中培養直到可以用來做實驗所需要的細胞數量。由10,000μg/mL，以含5% FBS的MEM培基10倍連續稀釋成5個濃度之實驗用料。當細胞足夠用於實驗時，以胰蛋白酶收集細胞後，將細胞接種入96孔微孔盤中(以下以盤表示)個孔中，進行3天前培養。用培基調整旭東威士忌蘭花萃取濃縮液(實驗用料)直到適合實驗的濃度後，加入盤中，再培養48小時。

將培養基從盤中移除，用磷酸鹽緩衝液(PBS)洗淨後，置換入含有MTT的培養基(以下以MTT表示)，培養2小時；從盤中移除MTT，以PBS(-)洗淨後，加入含鹽酸之異丙醇，將細胞內生成的Formazan dye萃取出來，確認Formazan dye被均勻萃取出後，於570nm測吸光度，並算出細胞存活率為50%時的實驗用料濃度(EC₅₀)。本實驗進行2次，取平均值進行評估。

試驗結果顯示濃度為5.7%及6.7%的旭東威士忌蘭花萃取濃縮液無眼睛刺激性(第2表)

第3表為不同濃度之旭東威士忌蘭花萃取濃縮液對細胞存活率的影響。

C.蘭花萃取液無皮膚刺激及敏感性之試驗-人體測試

該試驗是由AMA實驗室(AMA LABORATORIES,INC.)以旭東威士忌蘭花萃取液對52為不同性別及不同年齡的受試者來進行測試，受試者為年齡介於18-69歲間之9位男性與43位女性，其中包括38位高家索人(Caucasian)、12位西班牙裔(Hispanic)及2位亞洲裔(Asian)；每一位受試者分別接受9次之測試，該測試結果如第4表所示(AMA實驗室報告之參考編號為：MS12.RIPT.M6496OP50.FEN.REV.2)；該結果顯示旭東威士忌蘭花萃取液對皮膚不具刺激性及致敏性；其中該旭東威士忌蘭花萃取濃縮液係利用實施例一中步驟(4)之濃縮步驟，以孔徑0.04μm的PS膜，並再以截留分子量為150MW的TFM膜來獲得。

其中C：表示高家索人，H：表示西班牙裔，A：表示亞洲裔；F：女性，M：男性；9次受測反應中之數值若為0則表示沒有任何反應(no evidence of effect)，Dc表示測試中斷，受試者未現身受測試；得分中之N/A表示因測試中斷，所以無法計算其得分。根據上表，52位受測者中，僅有2位因為個人因素中斷實驗，其餘50未受測者均無產生任何皮膚刺激性(skin irritation)或者過敏性反應(skin sensitization)。顯見該蘭花濃 縮萃取液的皮膚安全性。

實施例三 蘭花萃取液總多酚含量

實驗方法：(1)測試碳酸鈉對沒食子酸吸收光譜的影響，取0.25mL的1,000μg/mL沒食子酸(gallic acid)，0.5mL的20%、2%、0.2%、0.02%、0.002%及0.0002%的碳酸鈉，加4.25mL的蒸餾水，在常溫下反應25分鐘後，以分光光度計於200-800nm偵測吸光度。沒食子酸終濃度為50μg/mL。(2)添加Folin-Ciocalteu試劑與碳酸鈉的順序對沒食子酸量測的影響以修改Folin-Ciocalteu方法測試方法，取0.25mL的沒食子酸及同體積的Folin-Ciocalteu試劑、0.5mL 20%碳酸鈉及4mL的蒸餾水，沒食子酸的最終濃度為0、20、60及100μg/mL。在常溫下反應25分鐘後，以分光光度計於730nm偵測吸光度。

實驗利用水或不同20、40、60、80、100%濃度乙醇進行萃取，步驟同實施例一，旭東威士忌萃取至實施例一步驟(3)的粗濾液實驗結果從第8圖中可以發現，蘭花以不同濃度乙醇萃取後總多酚含量數據顯示，水相萃取較醇相萃取可以得到出更高含量的多酚類，通常總多酚含量高者抗氧化力較強。

實施例四蘭花萃取液具抗氧化功能評估

實驗方法：清除DPPH自由基能力測定，取2ml之0.2g/ml之試驗樣品，以及5mg/ml之2,6-二第三丁基對甲酚(BHT)乙醇溶液，分別加入新鮮配製2.5×10^-4M α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH)之乙醇溶液0.5ml，均勻混合避光靜置30分鐘後，UV-VIS設定掃描區段400nm-700nm，測其517nm之吸光值，計算其清除率，吸光值愈低表示清除能力愈強。以上實驗均進行三重複。清除自由基能力EC₅₀測定依照實驗一測得之實驗數據，分別取清除率前三名不同濃度試驗樣品測其清除率，依照不同試驗樣品所需的適當濃度，試驗樣品乙醇溶液2ml，加入新鮮配製2.5×10^-4M濃度DPPH 0.5ml，均勻混合避光靜置30分鐘後，UV-Vis設定掃描區段400nm-700nm，測其517nm之吸光值。以上實驗均進行三重複。以濃度為y軸、清除率為x軸分別繪製測試樣品之檢量線並計算清除率50%之EC₅₀濃度。旭東威士忌蘭花萃取濃縮液(EW-DK)的濃度，即為實施例一步驟(4)濃 縮後以孔徑0.04μm的PS膜，並以截留分子量為150MW的TFM膜，得到蘭花萃取濃縮液，是採用紅外線水分計測試其固含量，取2mg/ml作為一致的濃度。

實驗結果從第9圖A可知，DPPH自由基清除率測試印證了總多酚含量檢測結果，蘭花以水相萃取，擁有較強的自由基清除能力，同時也具有較高的總多酚含量。同時第9圖B顯示，取蘭花萃取濃縮液與BHT(2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol)比較抗氧化能力，可以發現相較於BHT，蘭花萃取濃縮液可以非常快速的清除自由基，達到短時間內抗氧化的效果。另外，第9圖C顯示，對於ABTS(2,2'-azino-bis[3-ethylbenz thiazoline-6-sulphonic acid])自由基清除能力結果，IC₅₀顯示可達成自由基清除能力的結果，蘭花萃取濃縮液相較於蘭葉萃取濃縮液更具有自由基清除的能力。

實施例五 蘭花萃取液具美白功能-抑制酪胺酸酶

A.抑制酪胺酸酶測試-不同濃度乙醇萃取

酵素功能性測定方式是利用酵素進行黑色素形成過程中生成物dopachrome的形成含量決定酵素功能性，dopachrome在UV/VIS波長475nm有吸收，由酵素功能性抑制率可以觀察到此化合物使否具備減少黑色素生成的能力。1.測試溶液980μl含有0.8mM L-tyrosine與0.9M phosphate buffer(pH6.8)均勻混合後，靜置室溫10分鐘。2.將440.5unit的酪胺酸酶及測試樣品10μl迅速混合，並且以UV/VIS波長475nm測定3分鐘吸收變化。酪胺酸酶抑制率(%)={(對照組-實驗組)/對照組}×100%。

旭東威士忌蘭花以0~100%乙醇為萃取溶劑，以實施例一步驟(2)方法萃取的蘭花濾液，使用紅外線水分計測試其含量，取2mg/ml作為一致的濃度。實驗結果如第10圖A所示，6種測試樣品進行抑制酪胺酸酶功能性評估，由結果顯示第一、二批次的4種測試樣品(60%、40%、20%乙醇及水相)，均達到75%以上酪胺酸酶抑制率。(註：80%乙醇因為造成體外試管測試時酪胺酸酶變性，因此結果不計)。與衛生署核可的之美白成分功能相比(本實驗採用3mM之熊果素)，蘭花濾液對於酪胺酸酶的抑制，在低濃度的蘭花濾液即顯現出良好的效果，並且經由兩個批次實驗，具再現 性，顯示蘭花萃取液具有優秀的美白功能性潛力。

B.抑制酪胺酸酶測試-不同品種不同步驟之萃取液(物)

詳細各種蘭花與不同步驟之萃取液(物)，皆以水為萃取溶劑萃取，差異從步驟(3)開始，以紅外線水分計測試其固含量，取2mg/ml作為一致的濃度。如下表5所列。

實驗結果如第10圖B所示，分析同屬不同種的旭東威士忌與美人，均具有抑制酪胺酸酶功能，以旭東威士忌的功能性較佳；但比較不同屬不同種青山大紅袍，數據顯示青山大紅袍的萃取液，無抑制酪胺酸酶功能。所以均是蝴蝶蘭，但依不同品種，有不一樣的功能性強弱差異。

C.抑制酪胺酸酶測試-花與葉的功效

旭東威士忌蘭花與蘭葉，利用水萃取後，至步驟(4)濃縮中以孔徑0.04μm的PS膜，得到蘭花、蘭葉萃取濃縮液，以紅外線水分計測試其固含量，取2mg/ml作為一致的濃度，測試酪胺酸酶抑制情形。

實驗結果如第10圖C所示，IC₅₀顯示可達成抑制酪胺酸酶的結果，蘭花萃取濃縮液相較於蘭葉萃取濃縮液更具有抑制酪胺酸酶的活性能力。

實施例六

A.蘭花萃取液具美白功能-抑制老鼠黑色素瘤細胞產生黑色素

實驗方法為1. 將老鼠黑色素瘤細胞(B16)培養在6-well培養盤，加入DMEM(含10% FBS)培養液放置在37℃、5% CO₂培養箱中，隔天在培養液中加入不同濃度的測試劑。2.將不同濃度的測試劑加入培養液中培養3天，以PBS清洗細胞再加入適量trypsin/EDTA靜置3分鐘，待細胞與培養皿分開後，將細胞取出並以PBS清洗，離心5000rpm 5分鐘。3.離心後去掉上清液，加入PBS並與細胞沉澱物緩慢混合均勻，離心5000rpm 5分鐘。4.步驟3再重複一次。5.最後將上清液去除，並將細胞沉澱物加入1ml的1N NaOH緩慢打散細胞，使其均勻分佈在NaOH溶液中。6.離心3000rpm 10分鐘，取1ml上清液測UV/VIS波長405nm吸收。7.測定得到的數值除以存活細胞數，作為黑色素含量測定實驗結果。

新鮮蘭花抑制老鼠黑色素瘤細胞產生黑色素，旭東威士忌蘭花利用不同濃度溶劑萃取(水、20%乙醇、80%乙醇、100%乙醇)，至步驟(2)的蘭花濾液(品項1-4)、至步驟(4)濃縮後以孔徑0.04μm的PS膜，並以截留分子量為150MW的TFM膜得到蘭花萃取濃縮液；再經過分離取得之活性沉澱物(品項5)、熊果素5mM(品項6)、對照組(品項7，1%DMSO)，皆 以紅外線水分計測試其固含量，取2mg/ml作為一致的濃度，如下第6表所列。

實驗結果如第11圖所示，由老鼠黑色素瘤細胞抑制黑色素實驗結果顯示，熊果素、蘭花乙醇萃取液、蘭花水相白色結晶均具有明顯抑制黑色素瘤細胞(B16)的效果。

B.蘭花萃取液具美白功能-抑制人類初代培養(primary culture)之黑色素細胞(HMC-4)產生黑色素實驗方法為以不同的旭東威士忌蘭花萃取液，於人類初代培養(primary culture)之黑色素細胞(HMC-4)上進行抑制黑色素表現之試驗；而於進行抑制黑色素表現之試驗前，先以不同的旭東威士忌蘭花萃取液對HMC-4細胞進行細胞存活率(cell viability)的實驗，然後以細胞存活率大於95%的最大測試劑量(濃度)進行抑制黑色素表現之試驗。

第7表以及第8表為抑制黑色素表現之試驗中所使用的旭東威士忌蘭花萃取液的不同劑量與萃取方法，第12圖A-H為第7表以及第8表中各旭東威士忌蘭花萃取液對HMC-4細胞進行細胞存活率實驗的結果，第13圖則為不同的旭東威士忌蘭花萃取 液抑制黑色素表現之試驗結果；由第13圖可知所有受測試旭東威士忌蘭花萃取液劑量雖以細胞存活率大於95%的最大測試劑量(濃度)進行抑制黑色素表現之試驗，然該濃度之萃取液皆可抑制黑色素之表現。

表8抑制黑色素表現之試驗中所使用的旭東威士忌蘭花萃取液的劑量與萃取方法

實施例七 蘭花萃取液具抗皺(抗老化)功效

一、基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)

MMP-1(基質金屬蛋白酶-1，Matrix Metalloproteinase-1)是通稱的膠原蛋白分解酶的一種，也就是說MMP-1負責真皮組織的膠原蛋白降解。本實施例利用旭東威士忌步驟(4)濃縮後以孔徑0.04μm的PS膜，並再以截留分子量為150MW的TFM膜，得到蘭花萃取濃縮液。以紅外線水分計測試固含量濃度分別為重量百分比6.7%與5.7%，直接進行試驗。

實驗結果如第14圖所示，其中該抗皺(抗老化)功效測試方法及步驟為：

1.將儲存於液態氮之二倍體纖維母細胞(TIG-118，Normal human diploid fibroblasts)解凍，並以含5% FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)的MEM培養基(Minimum Essential Medium)培養至實驗所需之足夠細胞數。

2.在進行預備試驗之前確認待測試物質不會對細胞(TIG-118)產生毒性之濃度後，並且從最適宜正式測試時之最高(大)濃度稀釋2倍，一共得做成3個濃度(1%、0.5%、0.25%)作為測試濃度。

3.將上述步驟1中實驗所需之足夠細胞以胰蛋白酶處理取得後，並接種於35mm培養皿中(使其細胞密度為50,000細胞/mL)。

4.然後該接種於35mm培養皿之細胞於培養24小時後，將培養液去除，以步驟2稀釋好含測試物質之試驗溶液取代，再繼續培養24小時後，抽取細胞mRNA(提取試劑組：RNeasy Mini kit,Qiagen)，以即時定量聚合酶連鎖反應(Quantitative real-time PCR)分析MMP-1的基因表現量。

Real-time PCR分析之條件：使用設備：ABI PRISM 7900HT,Applied Biosystems Co.,Ltd.

PCR溫度條件為：

Stagel：42℃ 5min,95℃ 10sec(lcycle)

Stage2：95℃ 5sec,60℃ 34sec(40cycle)

Stage3：95℃ 15sec,60℃ 1min,95℃ 15sec(lcycle)

二、彈性蛋白酶(elastase)

皮膚彈性的減少和真皮層中彈性纖維(elastic fibers)的捲曲會使得皮膚形成皺紋，而彈性蛋白酶(elastase)抑製劑可抑制彈性蛋白酶的活性，防止皮膚彈性纖維的損傷，從而有助於減輕皺紋的形成。

本實施例利用濃度為5%及1%的旭東威士忌蘭花萃取濃縮液，將其分別以Tris-鹽酸緩衝液進行稀釋，共計分別做成5種濃度，進行彈性蛋白酶的活性抑制的測試(第9表)，其中5%及1%的旭東威士忌蘭花萃取濃縮液皆有非常好之彈性蛋白酶的活性抑制率。同時並做5%及1%之旭 東威士忌蘭花萃取濃縮液抑制彈性蛋白酶的IC₅₀的測試(第10表)。其中該旭東威士忌蘭花萃取濃縮液係利用實施例一中步驟(4)之濃縮步驟，以孔徑0.04μm的PS膜，並再以截留分子量為150MW的TFM膜來獲得。

其中該彈性蛋白酶活性抑制測試的方法如下：將不同濃度的旭東威士忌蘭花萃取濃縮液、酵素液(elastase溶液)、基質溶液(N-Succiny-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilide)混合，於37℃加溫15分鐘後，於415nm測吸光度，並按下列算式算出彈性蛋白酶的活性抑制率。

A：空白溶液反應後的吸光度

B：實驗溶液反應後的吸光度

A0、B0：代替酵素液，用Tris-鹽酸緩衝液時的吸光度

三、膠原蛋白酶(collagenase)

膠原蛋白酶會降解皮膚中的膠原蛋白，進而造成皮膚產生皺紋及老化，而膠原蛋白酶抑制劑可以抑制膠原蛋白酶，防止皮膚產生皺紋 及老化。本實施例利用濃度為5.7%及6.7%的旭東威士忌蘭花萃取濃縮液，將其分別以檸檬酸緩衝液2倍連續稀釋成5種濃度，進行膠原蛋白酶的活性抑制的測試(第11表)，其中100%濃度之5.7%及6.7%的旭東威士忌蘭花萃取濃縮液具有最佳之膠原蛋白酶的活性抑制率；其中該旭東威士忌蘭花萃取濃縮液係利用實施例一中步驟(4)之濃縮步驟，以孔徑0.04μm的PS膜，並再以截留分子量為150MW的TFM膜來獲得，最後再以紅外線水分計測試固含量濃度分別為6.7%與5.7%的萃取濃縮液，直接進行試驗。

其中該膠原蛋白酶活性抑制測試的方法如下：將不同濃度的旭東威士忌蘭花萃取濃縮液、胜肽溶液(Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH)混合，於37℃下加温後，加入酵素液(collagenase)，再於37℃反應後，加入0.1M Tris buffer(含有20mM CaCl2,pH7.1)停止反應，加入乙酸乙酯、於3,000rpm離心分離。於320nm測乙酸乙酯層的吸光度、按下列算式計算膠原蛋白酶活性抑制率(%)。

A：空白溶液反應後的吸光度

B：實驗溶液反應後的吸光度

A₀、B₀：以精製水代替酵素液時的吸光度

實施例八 蘭花萃取液於人體之護膚功效測試

本實施例利用旭東威士忌步驟(4)濃縮後以孔徑0.04μm的PS膜，並再以截留分子量為150MW的TFM膜，得到蘭花萃取濃縮液。以紅外線水分計測試固含量濃度分別為1.0%，直接進行試驗。對31位不同年齡、性別之受測者在台大醫院進行人體皮膚功效測試，並於測試兩週後分析其結果。

在這次影像測試所評估的四種斑點指標，包括：可見斑點、紫外線色斑、棕色斑及紅色斑；其中可見斑點為標準白光下肉眼可看到的黑色斑點；紫外線色斑為使用365nm紫外光攝影下看到的黑色斑點(紫外線攝影會突顯肉眼看不到的斑點部份)；棕色斑為使用RBX偏光專利技術所模擬得到的皮膚深層斑點評估；紅色斑為使用RBX偏光專利技術所模擬得到的皮膚紅色斑點評估；而表中數值多寡代表數量的多少而分值比例代表檢測項目的特徵程度(密度)。

於使用兩週後沒有受測者發生不良反應及不適感。測試結果如第12表及第13表所示，該結果發現在可見斑、棕色斑及紅色斑數目在使用兩週後有統計上的下降趨勢，但在特徵程度(密度)部份則沒有統計上的差異，且在使用兩週之分析結果可看到具有減少黑色素斑數量(可見斑及深層斑)及減少紅色斑數量的效果。

發明利用青山蘭花培育的獨特品種白色蝴蝶蘭(即蝴蝶蘭屬Sogo Yukidian種旭東威士卡蘭花)，經萃取後在抑制酪胺酸酶、抑制老鼠B16黑色素細胞及人類HMC-4細胞產生黑色素及人體等實驗中，顯示有良好的美白能力，同時也具有抗皺(抗老化)、抗老化能力，且經多種細胞實驗、體外測試及人體實驗後，均證實安全無腐蝕刺激性、亦無皮膚致敏性。本研究團隊研究植物活性多年，能在多種系統(酵素、動物細胞系統、人類初代皮膚細胞之系統、以及臨床實驗)均驗證美白之效果的活性成分、且溫和無刺激的成分極為少見。由此可見此原料與製程之優異性。

製程方面，萃取液經由薄膜處理後，除了可實現量產，並可以得到分離純化濃縮的效果。濃縮後的蝴蝶蘭萃取液，會產生大量的沉澱物，收集後經研究分析，該沉澱物屬於三種結構類似之黃酮化合物群組。萃取液及沈澱物具有良好的美白能力、抗皺(抗老化)能力以及抗氧化力。此製程屬於綠色製程，並不產生毒性有機溶劑、且製程放大容易、亦可連結微生物管控，產出衛生安全的活性萃取濃縮液進而可沈澱獲得之黃酮活 性化合物。

經嘗試其他不同屬的蘭花，無酪胺酸酶抑制能力；而與另一同屬的蝴蝶蘭相比，雖均具酪胺酸酶抑制能力，但以此白花品種抑制能力較佳。本專利所使用的製程及試劑，均允許使用於化粧保養品。

上述多項功效，實屬充分符合新穎性、進步性及商業應用性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。

110‧‧‧取一蘭花花朵

120‧‧‧將蘭花與一溶劑進行混合萃取

130‧‧‧進行固液分離

140‧‧‧進行活性劃分

150‧‧‧進行濃縮

160‧‧‧得到活性沉澱物與液態活性萃取液

Claims (23)

1. 一種蘭花萃取物，其中該蘭花為蝴蝶蘭屬，其係由下列步驟所製備而得：(1)萃取：將該蘭花與一溶劑以重量比例為0.5：1~10：1，進行混合粉碎或者破壁得到一蘭花漿，該溶劑為水、醇類或醇類水溶液，其中該醇類為乙醇、丙醇、或丁醇；(2)固液分離：將步驟(1)萃取之蘭花漿進行固液分離，將雜質去除，留下液態為一蘭花濾液；(3)活性劃分：將步驟(2)所分離之濾液以分子篩薄膜製程純化，得到一蘭花萃取篩分液；(4)濃縮：將步驟(3)純化之篩分液以分子篩薄膜製程濃縮，或者其他真空或蒸煮方式進行部分濃縮，得到活性沉澱物與具活性之液態活性萃取液；其中該活性劃分步驟之分子篩薄膜係為納米薄膜(nanofiltration membrane)，可以截留分子量大於150之萃取物；其中該蝴蝶蘭係選自蝴蝶蘭屬Sogo Yukidian種「旭東威士忌」。
2. 如申請專利範圍第1項所述之蘭花萃取物，其中該步驟(1)中該蘭花與該溶劑較佳重量比例為5：1。
3. 如申請專利範圍第1項所述之蘭花萃取物，其中該步驟(2)中固液分離溫度為0~60℃。
4. 如申請專利範圍第1項所述之蘭花萃取物，其中該該步驟(2)中固液分離較佳溫度為0~35℃。
5. 如申請專利範圍第1項所述之蘭花萃取物，其中該步驟(2)固液分離時 可使用離心法或過濾法，其中過濾法之過濾材料為矽藻土、珍珠岩及濾心至少一者，該濾心孔徑大小介於0.1~5微米。
6. 如申請專利範圍第1項所述之蘭花萃取物，其中該步驟(3)之活性劃分，及步驟(4)之濃縮之薄膜製程採兩段步驟：第一段採用無機陶瓷膜或有機複合膜；第二段採用納米濾膜(NF,nanofiltration membrane)或逆滲透膜。
7. 如申請專利範圍第6項所述之蘭花萃取物，其中該無機陶瓷膜包含氧化鋁膜、氧化鋯膜或氧化鍗膜。
8. 如申請專利範圍第6項所述之蘭花萃取物，其中該有機複合膜包含聚碸膜、醋酸纖維膜、聚四氟乙烯膜、聚丙烯膜。
9. 如申請專利範圍第6項所述之蘭花萃取物，其中該納米濾膜或逆滲透膜可為單一薄膜或複合薄膜，其中該薄膜材質包含複合膜(TFM,thin film membrane)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚碸(PS)、聚醚碸(PES)及聚丙烯腈(PAN)至少一種。
10. 如申請專利範圍第1項所述之蘭花萃取物，其中該步驟(4)之沉澱物可進一步進行結構鑑定，結構鑑定係以核磁共振(NMR)及質譜儀(MS)進行分析鑑定。
11. 一種醫藥組合物，包含一有效量之申請專利範圍第1項所述之蘭花萃取物及其藥學上可接受之賦形劑。
12. 一種蘭花萃取物用於製備美白組合物的用途，其中該蘭花萃取物如申請專利範圍第1項所述。
13. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中該美白係指抑制酪胺酸酶。
14. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中該美白係指抑制黑色素。
15. 一種蘭花萃取物用於製備抗氧化藥物的用途，其中該蘭花萃取物如申請專利範圍第1項所述。
16. 一種如申請專利範圍第15項所述之用途，其中該抗氧化係指清除自由基。
17. 一種蘭花萃取物用於製備抗皺與抗老化藥物的用途，其中該蘭花萃取物如申請專利範圍第1項所述。
18. 如申請專利範圍第17項所述之用途，其中該抗皺與抗老化藥物係指抑制膠原蛋白降解。
19. 如申請專利範圍第18項所述之用途，其中該抑制膠原蛋白降解係指抑制基質金屬蛋白酶。
20. 如申請專利範圍第18項所述之用途，其中該抑制膠原蛋白降解係指抑制膠原蛋白酶。
21. 如申請專利範圍第18項所述之用途，其中該抑制膠原蛋白降解係指抑制彈性蛋白酶。
22. 一種蘭花萃取物，其中該蘭花為蝴蝶蘭屬，其係由下列步驟所製備而得：(1)萃取：將該蘭花與一溶劑以重量比例為0.5：1~10：1，進行混合粉碎或者破壁得到一蘭花漿，該溶劑為水、醇類或醇類水溶液，其中該醇類為乙醇、丙醇、或丁醇；(2)固液分離：將步驟(1)萃取之蘭花漿進行固液分離，將雜質去除，留下液態為一蘭花濾液；(3)活性劃分：將步驟(2)分離之濾液以分子篩薄膜製程純化，得到一蘭花萃取篩分液； (4)濃縮：將步驟(3)純化之篩分液以分子篩薄膜製程濃縮，或者其他真空或蒸煮方式進行部分濃縮，得到活性沉澱物與具活性之液態活性萃取液；(5)結晶：將步驟(4)之該蘭花活性萃取液過濾後，得到該活性沉澱物；該活性沉澱物經水洗、乾燥得一白色-黃色結晶物；其中該活性劃分步驟之分子篩薄膜係為納米薄膜(nanofiltration membrane)，可以截留分子量大於150之萃取物；其中該蝴蝶蘭係選自蝴蝶蘭屬Sogo Yukidian種「旭東威士忌」。
23. 一種製備蘭花萃取物的方法，其中該蘭花為蝴蝶蘭屬，包含下列步驟：(1)萃取：將該蘭花與一溶劑以重量比例為0.5：1~10：1，進行混合粉碎或者破壁得到一蘭花漿，該溶劑為水、醇類或醇類水溶液，其中該醇類為乙醇、丙醇、或丁醇；(2)固液分離：將步驟(1)萃取之蘭花漿進行固液分離，將雜質去除，留下液態為一蘭花濾液；(3)活性劃分：將步驟(2)分離之濾液以分子篩薄膜製程純化，得到一蘭花萃取篩分液；(4)濃縮：將步驟(3)純化之篩分液以分子篩薄膜製程濃縮，或者其他真空或蒸煮方式進行部分濃縮，得到活性沉澱物與具活性之液態活性萃取液；其中該活性劃分步驟之分子篩薄膜係為納米薄膜(nanofiltration membrane)，可以截留分子量大於150之萃取物；其中該蝴蝶蘭係選自蝴蝶蘭屬Sogo Yukidian種「旭東威士忌」。