KR101243219B1 - 울릉도 특산 나물 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 주름개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 곰취, 미역취 및 삼나물의 추출물 또는 이의 발효추출물을 함유하는 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과를 갖는 조성물로서 인체에 대한 부작용이나 독성이 없으며, 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과를 나타내, 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과를 나타내는 화장료 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

울릉도 특산 나물 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 주름개선용 조성물{Skin whitening and anti-wrinkle composition comprising a fermented plant extract in Ulleung island}

본 발명은 울릉도 특산 나물 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 주름개선용 조성물에 관한 것이다.

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현대인들은 자외선, 스트레스 등의 여러 가지 내외적인 요인에 의해 각종 피부 트러블 유발로 기미, 주근깨, 피부 색소 침착 등의 피부 노화 현상을 촉진한다(Voegeli, R. 1996. Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, 51-58.). 피부의 색소 침착은 멜라닌 색소의 생합성에서 tyrosinase 효소를 비롯하여 DHICA oxidase(TRP-1)등의 L-tyrosine을 DOPA(3,4-dihydroxyphenyla-lanine)으로 DOPA에서 DOPA quinone으로 초기반응을 조절하는 것으로 알려져 있다(Aroca, P., et al. 1993. Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, 25650-25655.). 이를 바탕으로 티로시나제(tyrosinase) 효소의 활성을 저해하여 멜라닌 생합성의 억제에 영향을 미칠 수 있는 천연물 탐색에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 결과 어성초 추출물을 이용하여 티로시나제(tyrosinase) 유전자 발현 억제 효과(Chin, J. E., et al. 2005. Effects of Houttuynia cordata extracts on tyrosinse gene expression. J. Korean Soc Food Sci Nutr 34, 1284-1288.) 등 천연물을 활용한 연구가 활발히 이뤄지고 있다. 그 외 현재 알려져 있는 항산화 및 미백원료는 아르부틴(Arbutin), 코지산(Kojic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid) 등의 물질이 대표적이고 상백피, 닥나무, 감초 등의 식물 추출물이 널리 알려져 있다.

환경의 파괴로 인한 자외선 증가 및 각종 산화성 물질의 증가는 피부 손상과 단백질의 합성능 저하를 유발할 수 있다. 이러한 피부 세포의 손상이나 기능 저하는 피부 탄력의 감소, 피부 주름살의 증가, 기미와 주근깨 생성 등 피부 미용에 치명적인 현상들을 유발한다. 피부 탄력성은 진피조직의 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 히알루론산(hyaluronic acid) 등에 의해 유지되며, 콜라겐(collagen)을 합성하는 섬유아세포(fibroblast)는 핵심적인 역할을 한다(1). 섬유아세포 기능은 각종 성장인자(growth factor) 뿐만 아니라 케라티노사이트(keratinocyte)나 멜라노사이트(melanocyte)와 같은 피부 세포들에서 분비되는 싸이토카인(cytokine)에 의해서도 조절된다(2-3). 정상적인 상태에서 유리되는 케라티노사이트의 TGF-β, TβRII, SGad3는 피부 섬유아세포(dermal fibroblast)로부터 프로콜라겐(procollagen), 피브릴린(fibrillin-1), 트로포엘라스틴(tropoelastin)의 발현을 증가시켜 콜라겐 생성을 증가시키며, MMPs의 발현을 억제하여 콜라겐 분해를 억제하는 것으로 보고되었다(4-5).

UV에 의해 케라티노사이트가 손상되면 TGF-β(transforming growth factor) 외에도 TNF-α(tumor necrosis factor), PGE₂(prostaglandin E₂), α-MSH(melanocyte stimulating hormone), GSF(granulocyte stimulating factor), IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-8, IL-10 등의 유리가 유발한다(6-7). 이중 α-MSH와 PGE₂는 멜라노사이트를 자극하여 멜라닌 생성을 촉진하여, 이 멜라닌은 피부 세포의 항산화 작용을 증강시켜 피부세포가 자외선으로 인해 손상되는 것을 방어하게 한다(8). IL-1, TNF-α(tumor necrosis factor) 등은 fibroblast에 작용하여 procollagen 발현을 억제하며, MMP-1 (martrix metalloproteinase-1), MMP-2, MMP-3, 히알루로니다아제(hyaluronidase)등의 활성을 증가시켜 콜라겐 분해를 촉진하게 된다(9-10).

또한, UV에 의해 직접적으로 섬유아세포 (fibroblast)가 상해를 받는 경우에도 콜라겐 관련 유전자는 억제되고 분해에 관련되는 MMPs류 발현은 촉진되어 주름살은 증가하게 된다. 따라서, 진피 섬유아세포 (dermal fibroblast)의 증식과 콜라겐 합성을 증가시키거나, MMPs을 억제하는 것은 주름살을 생성을 억제하는 수단이 될 수 있다.

울릉특산 약용식물은 높은 산 깊은 계곡에서 비바람을 맞으며 자란 산나물은 외부로부터 자신을 보호하기 위해 여러 가지 방어 물질을 만들어 낸다. 이러한 방어 물질이 사람에게 영양 또는 약의 효능을 제공한다. 특히, 울릉도의 산나물은 토양, 기후 등 재배환경이 좋아 일본이나 중국 등 동남아시아에 비해 약효가 훨씬 뛰어나다고 한다. 주로 인체에 좋은 플라보노이드, 카테킨, 항암활성 성분 등이 많이 들어 있어 해독, 지혈, 신장염 등에 효험이 있는 것으로 알려져 있다.

곰취(LiguLaria fischeri)는 국화과의 여러해살이풀로서 취나물로 다뤄지는 풀 가운데서는 가장 큰 잎을 가지고 있다. 항염증작용에 의하여 폐장의 화농성 염증, 관절염 등 여러 가지 염증에 효과를 나타낸다. 곰취의 생장점이 되는 어린잎에는 다른 식물에 비해 비타민 C가 아주 풍부하다. 충분한 비타민 C의 섭취는 감기 예방에 효과적이며, 곰취의 풍부한 비타민 C의 함유와 높은 레티놀 함량으로 인해 미백에도 효과가 탁월한 것이 밝혀졌다(Hwang, B. Y., Lee, J. H., Koo, T. H. Kim, H. S., Hong, Y. S., RO, J. S., Lee, K. S. and Lee, J. J. 2002. Furanoligularenone, an eremophilane form Ligularia fischeri, inhibits the LPS-induced production of nitric oxide and prostaglandin E2 in macrophage Raw264.7. PlantaMed.68,101-105.).

미역취(Solidago virga - aurea L. var . asiatica Nakai)는 국화과 식물이며, caffeic acid, rutin, astragalin, chlorogenic, quercetin, tannin, saponin, flavonoid 등 특수 성분이 함유되어 있어 항균, 항암, 항산화 효과가 있으며, 세포재생의 기능이 있어 피부에 건선이 있는 사람이 미역취 달인 물로 환부를 자주 씻으면 효험이 있다(Kim, T. J. 1997. Flower growing in the wild flower of Korean.Kunkil media. Seoul, Korea. p 38.).

삼나물(Aruncus dioicus var.)은 장미과에 속하며 다년생 숙근초로서 울릉군 산야에서 자생한다. 주성분은 사포닌, 살리실알데히드, 스파린, 인회분, 지질, 비타민 A, 칼슘 등이 함유되어 있으며, 기능성 물질인 flavonoid 및 polyphenol 등이 있어 유해 산소를 막아주는 항산화, 항암, 면역증진, 간기능 강화 등에 효과가 있다.(Lee, C. B. 2003. Coloured flora of Korea. Hyangmoonsa, Seoul. pp515-516.).

또한 발효란 미생물이 어떤 물질을 분해하고 변형시키는 과정을 말하며, 그 과정을 통해 미생물이 또 다른 물질을 생산해 내기도 한다. 우유에 발효균(미생물)을 넣어 두면 요구르트가 되고, 포도즙이 자체 발효되면서 포도주가 되듯이 발효과정을 거치면 유효성분이 분해되어, 그 미생물의 수가 증가하고 새로운 물질이 생겨난다.

이런 과정을 화장품에 적용시킨 것이 바로 발효 화장품이며, 피부에 좋은 물질을 미생물로 발효 시킨 후 얻은 대사산물을 화장품에 이용하는 것이다. 화장품 중에는 양을 많이 쓰면 독성이 생기거나, 혹은 분자 크기가 피부 세포의 틈새보다 커서 피부에 깊숙이 침투되지 못한 채 제 기능을 발휘하지 못하는 경우가 있는데, 발효화장품은 이러한 문제점들을 해결해 준다. 발효를 통해 독성 성분들을 분해 및 변화시켜 그 독성을 최소화하고, 피부에 친숙한 물질로 변환시켜 적은 양으로도 피부에 큰 효능을 발휘할 수 있다.

이에 본 발명자들은 울릉도 특산 곰취, 미역취 및 삼나물을 혼합 추출 및 발효하여 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과 등과 같은 생리활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 곰취, 미역취 및 삼나물로 구성된 울릉도 특산 나물의 추출물 또는 이의 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 곰취, 미역취 및 삼나물의 추출물 또는 이의 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 곰취, 미역취 및 삼나물의 건조 혼합중량비(%)는 1~10 : 1~10 : 1~10(w/w)(%), 바람직하게는 1~5 : 1~5 : 1~5(w/w)(%)임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 상기 발효추출물은 25 내지 50℃, 바람직하게는, 33 내지 40℃ 온도 범위의 증류수에 담긴 나물 부피의 1 내지 50%(v/v), 바람직하게는 1 내지 10%(v/v)의 유산균, 바람직하게는 비피도 박테리움 속 균주, 보다 바람직하게는, bifidobacterium bifidum(ATCC 11863) 균을 1일 내지 1주일, 바람직하게는 12시간 내지 72시간, 보다 바람직하게는 36시간 내지 56시간 동안 발효를 시킨 후에 상층액과 발효된 시료를 따로 분리하여 발효된 발효물을 정제수를 포함한 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로리드, 헥산 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 아세톤 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 및 아세톤 30 내지 90% 혼합용매로 추출하여 수득된 발효 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로리드, 헥산 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 아세톤 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 및 아세톤 30 내지 90% 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.

상기 화장료 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이의 제형을 포함한다.

이하, 본 발명의 추출물 및 발효추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 추출물은 곰취, 미역취 및 삼나물을 각각 세척, 건조 및 세절하고, 상기 시료 총 중량의 약 1배 내지 200배(w/w), 바람직하게는 10배 내지 100배(w/w)의 정제수를 포함한 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로리드, 헥산 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 아세톤 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 및 아세톤 30 내지 90% 혼합용매를 가하여 12시간 내지 1주일, 바람직하게는 24시간 내지 72시간 동안, 10℃ 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는, 냉침추출법을 수행하여 추출물을 수득하는 제 2단계; 상기에서 얻은 추출물을 여과포로 여과하고 필터 여과하여 여과물을 얻는 제 3단계의 제조공정을 통하여 본 발명의 추출물을 수득할 수 있다.

또한 본 발명의 발효 추출물은 곰취, 미역취 및 삼나물을 각각 세척, 건조 및 세절하고, 25 내지 50℃, 바람직하게는, 33 내지 40℃ 온도 범위의 증류수에 담긴 나물 부피의 1 내지 50%(v/v), 바람직하게는 1 내지 10%(v/v)의 유산균, 바람직하게는 비피도 박테리움 속 균주, 보다 바람직하게는, bifidobacterium bifidum(ATCC 11863)균을 1일 내지 1주일, 바람직하게는 12시간 내지 72시간, 보다 바람직하게는 36시간 내지 56시간 동안 발효를 시킨 후에 상층액과 발효된 시료를 따로 분리하여 발효된 발효 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 추출물 총 중량의 약 1배 내지 200배(w/w), 바람직하게는 10배 내지 100배(w/w)의 정제수를 포함한 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로리드, 헥산 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 아세톤 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 및 아세톤 30 내지 90% 혼합용매를 가하여 12시간 내지 1주일, 바람직하게는 24시간 내지 72시간 동안, 10℃ 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는, 냉침추출법을 수행하여 추출물을 수득하는 제 2단계; 상기에서 얻은 추출물을 여과포로 여과하고 필터 여과하여 여과물을 얻는 제 3단계의 제조공정을 통하여 본 발명의 발효 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 수득한 추출물 또는 이의 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 추출방법에 의해 얻어진 추출물은 강력한 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과를 나타냈음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과를 갖는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.00001 내지 50% 중량%(w/w), 바람직하게는, 0.0001 내지 20% 중량%(w/w), 보다 바람직하게는 0.1 내지 10% 중량%(w/w)으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 조성물은 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과를 갖는 화장품에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이 등과 같은 화장품류 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E(d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산 dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE(폴리옥시에틸렌) 솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP(폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.01 내지 5 % 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.01 내지 3 % 중량 백분율로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 곰취, 미역취 및 삼나물의 추출물 또는 이의 발효추출물을 함유하는 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과를 갖는 조성물은 인체에 대한 부작용이나 독성이 없으며, 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과를 나타내, 항산화, 항염증, 미백 및 주름억제 효과를 나타내는 화장료 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물의 추출 과정과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액 수득과정 이고,
도 2는 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액의 전자공여능을 나타낸 도이고,
도 3은 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액의 Superoxide anion radical 소거능을 나타낸 도이고,
도 4는 Xanthine-oxidase에서 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액의 저해율을 나타낸 도이며,
도 5는 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액의 astringent 활성의 비교를 나타낸 도이고,
도 6은 melanoma cell(B16F10)에서 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액의 세포 생존능을 나타낸 도이고,
도 7은 fibroblast cell(CCD-986sk)에서 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액의 세포 생존능을 나타낸 도이며,
도 8은 macrophase cell(Raw264.7)에서 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액의 세포 생존능을 나타낸 도이며,
도 9은 tyrosinase에서 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액의 저해율을 나타낸 도이고,
도 10는 melanoma cell(B16F10)에서 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액의 멜라닌 합성 저해를 나타낸 도이며,
도 11는 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물의 tyrosinase 단백질 B16F10 세포의 복용량 의존성 억제 유발을 나타낸 도이고,
도 12은 발효상등액의 tyrosinase 단백질 B16F10 세포의 복용량 의존성 억제 유발을 나타낸 도이고,
도 13은 아세톤 추출 발효액의 tyrosinase 단백질 B16F10 세포의 복용량 의존성 억제 유발을 나타낸 도이고,
도 14은 elastase에서 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액의 저해율을 나타낸 도이고,
도 15는 collagenase에서 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액의 저해율을 나타낸 도이며,
도 16는 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물의 MMP-3 단백질 CCD-986sk cell의 복용량 의존성 억제 유발을 나타낸 도이고,
도 17은 발효상등액의 MMP-3 단백질 CCD-986sk cell의 복용량 의존성 억제 유발을 나타낸 도이고,
도 18은 아세톤 추출 발효액의 MMP-3 단백질 CCD-986sk cell의 복용량 의존성 억제 유발을 나타낸 도이고,
도 19는 Raw 264.7 cell 내에서 nitric oxide의 생성에서 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물과 발효상등액 및 아세톤 추출 발효액의 효과를 나타낸 도이고,
도 20은 울릉 식물 복합(곰취, 미역취, 삼나물) 추출물의 Raw 264.7 cell iNOS 단백질의 복용량 의존성 억제 유발을 나타낸 도이며,
도 21은 발효상등액의 Raw 264.7cell iNOS 단백질의 복용량 의존성 억제 유발을 나타낸 도이며,
도 22는 아세톤 추출 발효액의 Raw 264.7 cell iNOS 단백질의 복용량 의존성 억제 유발을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 식물추출물의 제조

울릉웰빙식품에서 구입한 곰취(LiguLaria fischeri), 미역취(Solidago virga-aurea L.var. asiatica Nakai) 및 삼나물(Aruncus dioicus var.) 각각 100g을 70% 아세톤을 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상층액과 침전물을 분리하는 과정을 3회 반복하여 수득된 추출물을 250 메쉬 여과포(NBC inc. 38T05221-06)로 여과한 다음 용매휘발을 위해 감압 농축기(BUCHI Rotavapor R-210)로 농축을 하고 동결건조기(LABCONCO, USA)를 이용하여 울릉도 식물 복합(곰취, 미역취 및 삼나물)추출물(이하, ‘LSA-A’라 함) 13.5g을 수득하여 하기 실험예의 시료로 사용하였다(도 1 참조).

실시예 2. 발효식물추출물의 제조

울릉웰빙식품에서 구입한 곰취(LiguLaria fischeri), 미역취(Solidago virga-aurea L.var.asiatica Nakai) 및 삼나물(Aruncus dioicus var.) 각각 100g을 37℃의 증류수를 시료가 잠길 정도로만 넣은 뒤, 전체 볼륨의 5%의 균(bifidobacterium bifidum, ATCC 11863)을 접종하여 손으로 교반시켰다. 37℃에서 48시간동안 발효를 시킨 후에 상층액과 발효된 시료를 따로 분리하여 발효된 시료를 상기 실시예 1에 개시된 방법으로 다시 70% 아세톤 추출을 하였다. 각 추출물들은 원심 분리 및 여과, 농축 후 동결건조하여 울릉도 식물 복합 발효상등액(이하, ‘FS’라 함) 8.9g, 울릉도 식물 복합 발효액 아세톤 추출물(이하, ‘FA’라 함) 12.8g을 각각 수득하여 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.

참고예 1. 시약 및 기기

1-1. 항산화능 및 항염증 측정 시약

항산화능과 항염증 측정 실험에 사용된 시약인 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH), xanthine, xanthine oxidase, nitro blue tetrazolium(NBT) 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

1-2. 미백 및 주름억제 효과 측정 시약

미백 및 주름억제 효과 측정에 사용된 시약인 mushroom tyrosinase, L-3,4-dihydroxyphenyl-alanine(L-DOPA), porcine pancreas elastase(PPE), N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanilide, collagenase 및 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 콜라겐 생합성 측정에 사용된 시약은 procollagen type ⅠC-peptide EIA kit(Takara-Bio Inc. Japan)을 구입하여 사용하였다.

1-3. 세포 생존율 측정에 사용된 세포주 및 시약

세포 생존율 측정에 사용된 세포주는 melanoma 세포인 B16F10과 fibroblast 세포인 CCD-986sk, macrophage 세포인 Raw 264.7을 Korean Cell Line Bank(KCLB)에서 구입하여 사용하였다. 세포 생존율 측정 시약은 DMEM(DuLbecco's Modified Eagle Medium), fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin, trypsin 250, 0.4% trypan blue stain은 Gibco BRL Co.(Grand Island, USA) 및 Haemacytometer(Marienfeld, Germany)에서 구입하여 사용하였으며, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl- tetrazoliumbromide (MTT)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

1-4. 실험에 사용된 기기

생리활성 실험에 사용된 기기는 UV/VIS spectrophotometer(Hitachi, Japan), rotary vacuum evaporator(Tokyo, Rikakikai Co. Japan), centrifuge(Hitachi, Japan), freeze drier(Ilsin, Korea), microscope(Olympus, Japan), CO₂ incubator(Hanbaek Scientific Co. Korea), pH meter(Metrohm, Switzerland), BOD incubator(Hanbaek Co. Korea), autoclave(Hanbaek Scientific Co. Korea), ELISA reader(Bio Rad, Japan)를 사용하였으며, 화장품 안정성 실험에 사용된 기기는 pH meter(Metrohm 691, Metrohm Ltd. Herisau, Switzerland), brookfield viscometer (Brookfield LVDV-Ⅱ⁺, Brookfield Engineering Laboratories, Inc., Middleboro, MA. USA), homo mixer(Tokushu Kika Kogyo Co. Japan), agi mixer(Young Hana Tect. Korea), hot plate(Young Hana Tech. Korea) 등을 사용하여 측정하였다.

실험예 1. 항산화 효과실험

상기 실시예에서 수득한 시료들의 항산화효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

1-1. 전자공여능 측정

상기 실시예에서 수득한 시료들의 전자공여능(EDA: electron donating ability)에 대한 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 실시하였다(Blois MS. Antioxidant determination by the use of a stable free radical.Aster glehni . 1958;26:1199-1120).

각 시료용액 2mL에 0.2mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 1mL 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 하기 수학식 1을 이용하여 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

울릉도 특산 약용작물 추출물, 발효 추출물의 전자 공여능을 측정한 결과, 도 2와 같이 나타내었다. 울릉도 추출물 결과 50μg/mL에서 60% 이상의 효능을 나타내었고, 발효 상등액의 경우 500μg/mL에서 50% 이상의 낮은 효능을 보였지만 발효 후 추출물의 결과 50μg/mL에서 60% 이상의 효능을 나타내었으며 1000μg/mL의 경우 Vit. C보다 우수한 효과를 확인 할 수 있었다(도 2 참조).

1-2. Superoxide anion radical 소거 능 측정

상기 실시예에서 수득한 시료들의 Superoxide anion radical 소거 능에 대한 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 실시하였다(Fridovich, I Quantitative Aspects of the Production of Superoxide Anion Radical by Milk Xanthine Oxidase. J. Biol. Chem.1970;245:4053-4057).

Superoxide anion radical소거 능은 nitrobuLe tetrazolium(NBT) 환원방법에 의해 측정하였다. 각 시료 용액 0.1mL와 0.1M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.4mL에 xanthine(0.4mM)을 녹인 기질액 0.4mL과 NBT(0.24mM)를 첨가하고 xanthine oxidase (0.2U/mL) 0.1mL를 가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1N HCl 1mL를 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 Superoxide anion radical의 양을 560nm에서 흡광도를 측정하고 하기 수학식 2를 이용하여 계산하였다.

울릉도 특산 약용작물 추출 및 발효의 Superoxide anion radical소거 능을 측정한 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 추출물의 경우 10μg/mL에서 20% 이상의 높은 저해능을 나타내었다. 이것은 양성대조군인 Vit.C와 같은 효능을 나타내었지만 100μg/mL, 500μg/mL, 1000μg/mL의 농도에서는 각각 32%, 44%, 57%의 비교적 낮은 저해능을 나타내었다. 발효 후 추출물의 경우 100μg/mL, 500μg/mL, 1000μg/mL의 농도에서 42%, 52%, 67%의 저해능을 나타냄으로써 발효 전 보다 발효 후 추출물이 높은 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

1-3. Xanthnie oxide 저해활성능 측정

상기 실시예에서 수득한 시료들의 Xanthine oxidase 소거 능에 대한 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 실시하였다(Stirpe F, Della Corte E. The regulation of rat liver xanthine oxidase. Conversion in vitro of the enzyme activity from dehydrogenase (type D) to oxidase (type O). J. Biol. Chem. 1969;244(14):3855-3863).

Xanthine oxidase 저해활성은 각 시료 용액 0.1mL와 0.1M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.6mL에 xanthine(2mM)을 녹인 기질액 0.2mL을 첨가하고 xanthine oxidase (0.2U/mL) 0.1mL를 가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1N HCl 1mL를 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 xanthine oxidase의 양을 292nm에서 흡광도를 측정하고 하기 수학식 3을 이용하여 계산하였다.

울릉도 특산 약용작물 추출 및 발효의 Xanthine oxidase소거 능을 측정한 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 1000μg/mL의 농도에서 대조군인 Vit.C의 저해 효능에 가까운 62% 이상의 높은 저해능을 나타내었다. 이는 발효 전 추출물 58%, 발효 상등액 39%에 비하여 가장높은 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

실험예 2. 수렴 효과실험

상기 실시예에서 수득한 시료들의 수렴효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다(JT Lee, YS Jeong, BJ An. Physiological activity of Salicornia herbacea and its application for cosmetic materials.Aster glehni 2002;17(2):51-60.).

피부 단백질과 유사한 혈액 단백질(hemoglobin)을 사용하여, 원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈 용액을 1:1로 넣어서 진탕 혼합한 다음 1,500rpm에서 3분간 원심분리 후 576nm에서 흡광도를 측정하였다. Astringent 활성 측정은 하기 수학식 4를 이용하여 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

울릉도 추출물의 astringent 활성을 측정한 결과 도 5와 같이 나타내었다. 울릉도 추출물과 발효 후 추출물의 경우 5,000μg/mL에서 100% 이상의 높은 활성을 나타내었으며 positive control인 tannin과 유사한 효과를 나타내었다(도 5 참조).

실험예 3. MTT assay 에 의한 세포 생존율 측정실험

상기 실시예에서 수득한 시료들의 MTT assay에 의한 세포 생존율 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다(Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB. Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Aster glehni . 1987; 47(4):936-942.).

본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin/streptomycin(100U/mL)을 첨가한 DuLbeco's modified eagle ‘s medium(DMEM) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.

각 세포주[melanoma(B16F10), fibroblast(CCRF S-180), macrophage(Raw 264.7) cell]을 96 well plate에 0.6~8×10³cells/well이 되게 0.18mL 분주하고, 시료를 농도별로 조제하여 0.02mL 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02mL를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO:Ethanol(1:1) 0.15mL를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 하기 수학식 5를 이용하여 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

울릉도 추출, 발효 상등, 발효 후 추출물에 의한 melanoma 세포의 생존율을 확인한 결과 도 6과 같이 나타내었다. 울릉도 추출, 발효 상등, 발효 후 추출물의 경우 1,000μg/mL 이하에서 약간의 세포독성은 나타났지만, 그 수치가 미비해 울릉도 추출, 발효 상등, 발효 후 추출물의 영향을 적게 받는 것으로 나타났으며, 울릉도 추출, 발효 상등, 발효 후 추출물의 경우도 100μg/mL 이하에서는 세포 생존률을 나타내고 있어, 울릉도 추출, 발효 상등, 발효 후 추출물에의 세포독성이 적은 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

Fibroblast cell(CCD-986sk)의 생존율 측정 울릉도 추출물, 발효 상등, 발효 후 추출물에 의한 fibroblast 세포의 생존율을 확인한 결과 도 18과 같이 울릉도 추출물, 발효 상등, 발효 후 추출물 100μg/mL 이하에서 20.0% 이하의 세포독성을 나타내었다. 독성 결과로부터 western blot을 하기 위한 세포 실험 농도를 울릉도 추출물, 발효 상등, 발효 후 추출물은 100μg/mL 이하로 저해율을 측정 하였다(도 7 참조).

또한 울릉도 특산 약용 작물에 의한 macrophage 세포의 독성을 MTT assay에 의해 확인한 결과를 도 7에 나타내었다. 울릉도 추출물과 발효 상등액, 발효 후 추출물이 lipopolysaccharide(LPS)로 유도된 nitiric oxide의 생성을 감소시킨 것인지, 화합물의 세포 독성으로 인한 cell popuLation의 저하에서 기인하는 것인지를 측정한 결과, 정상세포군(LPS 무처리군)에 비하여 울릉도 추출물, 발효 상등액, 발효 후 70% 추출물의 경우 1μg/mL, 10μg/mL, 100μg/mL에서 세포 증식을 나타내었지만 1000μg/mL의 경우 세포가 감소하는 것을 확인함으로써 1000μg/mL의 농도에서는 독성이 나타남을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

실험예 4. 미백효과 측정실험

상기 실시예에서 수득한 시료들의 미백효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

4-1. Tyrosinase 저해활성 측정

Tyrosinase 저해활성 측정은 문헌에 개시된 방법에 따라 측정하였다(Yagi A, Kanbara T, Morinobu N. The effect of tyrosinase inhibition for aloe. Aster glehni 1986;3981:517-519.).

반응구는 0.175M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 0.5mL에 10mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.2mL 및 시료용액 0.1mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase(110U/mL, Sigma Co, Mo, USA) 0.2mL을 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 하기 수학식 6을 이용하여 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

이렇게 피부 내에서 멜라닌 중합체 생합성을 효과적으로 저해할 수 있는 tyrosinase 저해활성을 측정하기 위하여 mushroom 유래의 tyrosinase 저해 활성 측정 결과는 도 8에 나타내었다. 울릉도 추출물과 발효 후 추출물의 경우 1000μg/mL에서 각각 울릉도 추출물은 33% 저해율, 발효 후 추출물은 45%의 저해율을 나타내었다. tyrosinase의 저해 활성 또한 발효 후 추출물이 울릉도 추출물보다 높은 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 9 참조).

4-2. 멜라닌생합성 저해 활성 측정

피부 멜라노마 세포로부터의 melanin 생합성 저해 측정은 Hosoi 등(23)의 방법에 따라 측정하였다. DMEM 배지로 배양된 멜라노마 세포를 100mm culture dish에 2×10⁶cell/dish가 되게 분주하고 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 2mL 첨가하고, 48시간 후에 인산완충액(pH 7.4)으로 세척하였다. 그 다음 0.25M trypsin-EDTA 용액으로 세포를 탈착한 후 수확한 세포를 1×10⁶세포 당 1mL의 5% TCA로 처리하고, 2,500rpm으로 2회 원심분리한 후 분리된 melanin을 인산완충액으로 세척한 뒤 ether:ethanol(1:3) 1mL를 가하여 2회 원심분리 한 후 ether 1mL로 세척 건조시켰다. 건조된 melanin에 1N NaOH를 1mL 가하여 80℃에서 1시간 반응시킨 후 분광 광도계 405nm에서 흡광도를 측정하였다. Melanin 생합성 저해는 하기 수학식 7을 이용하여 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

울릉도 추출물, 발효 후 추출물의 경우 100μg/mL에서 41.0%, 29.0%의 멜라닌 저해 효과를 나타내었으며, 발효 후 추출물의 경우 100μg/mL에서 56.5%의 효과를 나타내어 멜라닌 저해 효과가 높은 것으로 나타났으며, 도 10에서 보듯이 control에 비해 농도가 높아질수록 melanoma 세포의 색이 옅어짐을 확인할 수 있었다(도 10 참조).

4-3. Western blot 을 이용한 tyrosinase 활성 측정

미백 관련 protein인 tyrosinase활성을 보기 위하여 melanoma cell인 B16F10 cell suspension을 100π tissue cuLture dish에 각 well당 2x10⁴ cells/ml cell로 가한 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 울릉도 아세톤 추출물, 발효 상등액, 발효 후 아세톤 추출물을 농도별(10μg/mL, 100μg/mL)로 처리한 배지로 24시간 배양한 후 또 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. lysis buffer (RIPA buffer 10ml에 complete mini 1 tab를 가함) 100μL로 용해해서 4℃ 12,000rmp에서 20분간 원심 분리 하였다. 상층액 만을 모아 새 튜브로 옮긴다. 단백질 정량을 하거나 또는 차후 사용하기 위해 -20℃에 보관한다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 정량하여 20μL의 단백질을 10%의 SDS-PAGE 상에서 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer(5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 10분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 tyrosinase(Santacruz, 1:1000), GAPDH(Santacruz 1:1000) 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 washing한 뒤 암실에서 ECL(Millipore)용액으로 반응시키고 X-ray film에 노출시켜 각각의 band를 Las4000 image analyzer(Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 band를 정량화하였다.

울릉도 특산물이 melanin 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 울릉도 추출물, 발효 상등, 발효 후 추출물을 농도별로 10μg/mL, 100μg/mL 처리한 후 24시간 뒤에 tyrosinase protein 발현을 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. 도 11-13에서 보는 바와 같이 추출물을 처리하지 않은 B16F10군에서는 각 전사인자의 단백질 발현이 증가하였지만, 울릉도 추출물, 발효 상등, 발효 후 추출물을 농도별로 10μg/mL, 100μg/mL을 처리한 B16F10군에서는 tyrosinase protein의 발현이 처리하지 않은 군보다 감소하였다. 특히, 발효 상등액에 비해 울릉도 추출물, 발효 후 추출물의 경우 각 전사 인자의 단백질 발현량이 50% 가까이 저해하는 것을 확인할 수 있었다(도 11-13 참조).

실험예 5. 주름개선 효과 측정실험

상기 실시예에서 수득한 시료들의 주름개선 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

5-1. Elastase 저해활성 측정

Elastase 저해활성 측정은 문헌에 개시된 방법에 따라 측정하였다(Cannell RJP, Kellan SJ, Owsianks AM, Walker JM. Results of a large scale screen of microalgae for the production of protease inhibitors. Aster glehni. 1988;54(1):10-14.).

기질로서 N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanilide(Sigma Co, Mo, USA)를 사용하여 37℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5mL씩 시험관에 취하고, 50mM tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase(2.5U/mL)용액 0.5mL을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanilide(0.5mg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. Elastase 저해활성은 하기 수학식 8을 이용하여 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

이러한 주름 생성과 관련된 elastase 저해 활성을 측정한 결과 도 14에서 나타내었다. 울릉도 추출물과 발효 후 추출물 모두 50μg/mL에서 20%이상의 저해율을 나타내었으며 100μg/mL, 500μg/mL, 1000μg/mL에서는 발효 후 추출물의 경우 45%, 71%, 85%의 저해율을 가지며 울릉도 추출물보다 2배에 가까운 저해율을 가짐을 확인할 수 있었다(도 14 참조).

5-2. Collagenase 저해활성 측정

Collagenase 저해활성 측정은 문헌에 개시된 방법에 따라 측정하였다(WE, Heindrich HG. Zur quantitativen bestimmung der collagenase. Aster glehni 1963;333:149-151.)

즉 반응구는 0.1M tris-HCl buffer(pH 7.5)에 4mM CaCl₂를 첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(0.3mg/mL(Sigma Co, Mo, USA)를 녹인 기질액 0.25mL 및 시료용액 0.1mL의 혼합액에 collagenase(0.2mg/mL(Sigma Co, Mo, USA)) 0.15mL를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% citric acid 0.5mL을 넣어 반응을 정지시킨 후, ethyl acetate 1.5mL을 첨가하여 320nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 하기 수학식 9를 이용하여 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

울릉도 특산 약용작물의 collagenase 저해 활성을 도 15와 같이 측정하였다. 울릉도 추출물과 발효 후 추출물의 경우 500μg/mL에서 50% 이상의 높은 저해율을 보였으며 특히 발효 후 추출물의 경우 1000μg/mL에서 93% 저해율을 나타냄으로 positive control인 catechin과 비슷한 저해율을 가지는 우수한 효과를 나타내었다(도 15 참조).

5-3. Western blot 을 이용한 MMP -3 활성 측정

주름 관련 protein인 MMP-3 활성을 보기 위하여 fibroblast 세포인 CCD-986sk 세포를 suspension을 100π tissue cuLture dish에 각 well당 2x10⁴ cells/ml cell로 가한 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화시켰다. 배지를 제거한 후 울릉도 아세톤 추출물, 발효 상등액, 발효 후 아세톤 추출물을 농도별(10μg/mL, 100μg/mL)로 처리한 배지로 24시간 배양한 후 또다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. lysis buffer(RIPA buffer 10ml에 complete mini 1 tab를 가함) 100μL로 용해해서 4℃ 12,000rmp에서 20분간 원심 분리하였다. 상층액만을 모아 새 튜브로 옮긴다. 단백질 정량을 하거나 또는 차후 사용하기 위해 -20℃에 보관한다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 Bradford assay로 정량하여 20μL의 단백질을 10%의 SDS-PAGE사에서 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 semi dry transfer cell 기기(Bio Rad)를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer(5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 10분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 MMP-3(santacruz, 1:1000), GAPDH(Santacruz 1:1000) 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 washing한 뒤 암실에서 ECL(Millipore)용액으로 반응시키고 X-ray film에 노축시켜 각각의 band를 Las4000 image analyzer(Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 band를 정량화하였다.

이러한 주름과 관계 되어진 인자인 MMP-3 단백질 발현을 측정해 본 결과, 도 16-18와 같이 울릉도 추출물, 발효 후 추출물 모두 100μg/mL에서 50% 가까운 저해율을 나타내었다(도 16-18 참조).

실험예 6. 항염 효과 측정실험

상기 실시예에서 수득한 시료들의 항염효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

6-1. Nitric oxide 저해활성 측정

Nitric oxide(NO) 측정은 cell의 supernatant에서의 nitric oxide(NO)의 량을 nitrite and nitrate로서 측정을 문헌에 기재된 방법을 이용하여 수행하였다(Salvemini, D., Milko, T. P., Masferrer, J. L., Seibert, K., Currie, M. G. and Needleman, P. Nitric oxide activates cyclooxygenase enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993;(90) 7236-7240).

Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent(Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 2×10⁶개의 cell을 confluence가 80%일 때, PBS로 2번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 lipopolysacchride(LPS) 10μg/mL을 control군을 뺀 모든 well에 다 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 시료를 농도별로 처리하여 실험하였다. NO 생성량은 시간별로 supernatant를 모아 griess reagent(Sigma Co, Mo, USA)로 10분간 반응시킨 후에 540nm에서 흡광도로 측정하고 하기 수학식 10을 이용하여 계산하였다.

Raw264.7 cell의 NO 생성억제 정도를 측정하기 위하여 울릉도 특산 약용 작물을 농도별로 세포에 처리하여 생성되는 NO량을 측정한 결과 도 19과 같이 나타내었다. LPS처리군은 LPS무처리군에 비하여 270% NO발현을 나타내었으며, 울릉도 추출물, 발효 상등액, 발효 후 추출물 모두 NO발현을 억제하였으며 특히, 발효 후 추출물의 경우 180%까지 억제함을 확인할 수 있었다(도 19 참조).

6-2. Western blot 을 이용한 iNOS protein 활성 측정

iNOS protein 활성 측정을 문헌에 기재된 방법을 이용하여 수행하였다(Salvemini, D., Milko, T. P., Masferrer, J. L., Seibert, K., Currie, M. G. and Needleman, P. Nitric oxide activates cyclooxygenase enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993;(90) 7236-7240).

iNOS protein 활성 측정을 확인하기 위하여 대식세포주인 Raw264.7 세포를 suspension을 100π tissue cuLture dish에 각 well당 2x10⁴ cells/ml cell로 가한 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화시켰다. 배지를 제거한 후 울릉도 아세톤 추출물, 발효 상등액, 발효 후 아세톤 추출물을 농도별(10μg/mL, 100μg/mL)로 처리한 배지로 24시간 배양한 후 또다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. lysis buffer(RIPA buffer 10ml에 complete mini 1 tab를 가함) 100μL로 용해해서 4℃ 12,000rmp에서 20분간 원심 분리하였다. 상층액만을 모아 새 튜브로 옮긴다. 단백질 정량을 하거나 또는 차후 사용하기 위해 -20℃에 보관한다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 Bradford assay로 정량하여 20μL의 단백질을 10%의 SDS-PAGE 상에서 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 semi dry transfer cell 기기(Bio Rad)를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer(5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 10분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 iNOS(BD Biosience 1:1000), GAPDH(Santacruz 1:1000) 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 washing한 뒤 암실에서 ECL(Millipore)용액으로 반응시키고 X-ray film에 노출시켜 각각의 band를 MolecuLar Imager(Bio-Rad)를 이용하여 band를 정량화 하였다.

울릉도 특산물 발효 전 추출물과 발효 상등액, 발효 후 추출물 각각의 화합물이 iNOS를 저해에 효과가 있는지 알아보기 위하여 RAW 264.7 cell에 LPS (10μg/μL)을 처리하고 1시간 뒤, 발효 전 추출물과 발효 상등액, 발효 후 추출물을 농도별로 10μg/mL, 100μg/mL 처리한 후 24시간 배양한 후 iNOS protein의 발현 변화를 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. LPS는 Gram 음성 세균의 세포벽 물질로서 면역 세포 등을 자극하여 NO 생성을 상승적으로 증가시킨다고 하였다. 그 결과 도 20-22와 같이 LPS를 처리하지 않은 Normal군에서는 iNOS protein 발현이 거의 나타나지 않았지만, LPS를 처리한 군에서는 산화적 스트레스가 유발되어 염증 반응을 매개하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 iNOS protein 발현이 130kDa에서 상당 수준으로 나타났다. 대조적으로 울릉도 추출물, 발효 후 추출물 모두 농도별로 10μg/mL, 100μg/mL을 처리했을 때 LPS에 의해 증가된 iNOS protein 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다. 특히 발효 후 추출물의 경우 LPS처리 군에 비해 50% 이상의 억제율을 보이므로 발효 후 추출물이 LPS로 유발된 NO 생성과 iNOS 발현을 억제함으로써 항염증 반응에 관여할 것으로 사료 되었다(도 20-22 참조).

이하, 본 발명의 제형예로서 크림, 맛사지크림, 로션, 스킨로션, 에센스, 팩, 클렌징폼의 제형을 예시하고 있으나, 본 발명의 화장품 조성물을 포함하는 제형은 이에 한정되는 것은 아니다.

제형예 1. 크림조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 2. 맛사지크림 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 용해 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 3. 로션 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합 유화한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 4. 스킨로션 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 5. 에센스 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 6. 팩 조성물

수상과 에탄올상을 각각 분산 용해하여 혼합시킨 후 실온으로 냉각한다.

제형예 7. 클렌징폼 조성물

수상과 오일상을 각각 분산 용해하여 혼합 검화한 후 실온으로 냉각한다.

Claims (5)

1~10 : 1~10 : 1~10(w/w)(%)의 건조 혼합중량비(%)로 혼합한 곰취, 미역취 및 삼나물를 25 내지 50℃의 온도 범위의 증류수에 담긴 나물 부피의 1 내지 50%(v/v)의 유산균을 1일 내지 1주일 동안 발효를 시킨 후에 상층액과 발효된 시료를 따로 분리하여 발효된 발효 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 추출물 총 중량의 10배 내지 100배(w/w)의 정제수를 포함한 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로리드, 헥산 또는 이들의 혼합용매를 가하여 12시간 내지 1주일, 10℃ 내지 50℃에서 냉침추출법을 수행하여 추출물을 수득하는 제 2단계; 상기에서 얻은 추출물을 여과포로 여과하고 필터 여과하여 여과물을 얻는 제 3단계의 제조공정을 통하여 수득된 곰취, 미역취 및 삼나물 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 주름억제 효과를 갖는 화장료 조성물.

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제 1항에 있어서
상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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